KR20080113261A

KR20080113261A - 수용체 티로신 키나제 ａｌｋ의 세포외 도메인에 결합하는 항체

Info

Publication number: KR20080113261A
Application number: KR1020087026220A
Authority: KR
Inventors: 아드리안 아우프 데어 마우어; 페터 리히틀렌; 알시데 바르베리스
Original assignee: 에스바테크 아게
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2007-04-27
Publication date: 2008-12-29
Also published as: US9512411B2; CA2650822C; EP2013236A1; NZ572248A; RU2008146922A; KR101457228B1; CA2650822A1; RU2460540C2; JP5431920B2; MX2008013705A; US8945563B2; DK2013236T3; EP2013236B1; US20150203829A1; CN101443361A; CN101443361B; PL2013236T3; AU2007246144A1; US7902340B2; WO2007124610A1

Abstract

본 발명은 인간 ALK (역형성 림프종 키나제)에 특이적인 항체, 특히, scFv, 그를 코딩하는 핵산, 그의 생산 방법 및 약제로서 또는 진단용으로서 그의 용도에 관한 것이다. 상기 항체는 종양 또는 암, 특히, 아교모세포종의 국소 치료에 적합하다.

인간 ALK 단백질, 세포외 도메인, 항체, 아교모세포종

Description

수용체 티로신 키나제 ＡＬＫ의 세포외 도메인에 결합하는 항체{ANTIBODIES BINDING TO THE EXTRACELLULAR DOMAIN OF THE RECEPTOR TYROSINE KINASE ALK}

관련 정보

본 출원은 2006년 4월 28일 출원된 미국 가특허 출원 번호 제60/795,831호 (그의 내용 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 대한 우선권을 주장한다.

본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 있는 모든 특허, 특허 출원 및 참고 문헌의 내용 전문이 본원에서 참고로 인용된다.

ALK (역형성 림프종 키나제; CD246)는 수용체 티로신 키나제(RTK) 계열의 일원이다. ALK는 상기 계열의 전형적인 일원으로서, 이는 본질적으로 3개의 도메인: 하나의 LDL-수용체 부류 A 도메인과 2개의 MAM 도메인 (MAM: 메프린(Meprin), A5 항원, 단백질 티로신 포스파타제 μ)을 함유하는 세포외 리간드-결합 도메인 (aa 19-1038), 막횡단 도메인 (aa 1039-1059), 및 티로신 키나제 도메인을 함유하는 세 포질 도메인 (aa 1060-1620)으로 구성된 I형 막횡단 단백질이다. 신호 펩티드는 초기 단백질 (aa 1-18)의 N-말단에 존재하는 것으로, 이는 분비시 절단된다.

전장의 인간 및 마우스 ALK는 1997년 2개의 독자적인 집단에 의해서 클로닝되었다 (문헌 ([Iwahara 1997]; [Morris 1997])). ALK는 백혈구 티로신 키나제(LTK)로 명명되는 RTK와 고도로 유사하며, 이는 인슐린 수용체 상위계열에 속한다. ALK는 LKT와 그들의 중복 영역에 있어서 57% aa 동일성 및 71% aa 유사성을 나타낸다 (문헌 [Morris 2001]). ALK는 고도로 N-글리코실화되고 21개 추정 N-글리코실화 부위를 함유한다. 아미노산 687 내지 1034는 LTK와 유의적인 유사성 (50% aa 동일성)을 갖는다. 그러나, N-말단에 인접해 있는 686 aa 서열은 공지된 어떤 단백질과도 상동성을 보이지 않지만, 단, LDL 수용체에서도 발견되는 극히 짧은 서열은 예외로 한다 (문헌 [Duyster 2001]/SWISSPROT). 추가로, aa 264-427 및 aa 478-636에 2개의 MAM 도메인 (Meprin, A5 항원, 단백질 티로신 포스파타제 μ)을 함유한다. 이들 도메인은 세포-대-세포 상호작용에 연루된 다양한 부착 단백질 사이에 널리 퍼져있는 바, 부착 기능을 갖는 것으로 여겨진다 (문헌 [De Juan 2002]). 추가로, 아미노산 396-406에 상응하는 ALK 추정 리간드에 대한 결합 부위가 존재한다 (문헌 [Stoica 2001]; 하기 참조). 뮤린 ALK의 키나제 도메인의 아미노산 서열은 인간 ALK와 98% aa-동일성, 마우스 LTK와 78% 동일성, 마우스 ros와 52%, 인간 인슐린-유사 성장 인자 수용체와 47% 및 인간 인슐린 수용체와 46%를 나타낸다 (문헌 ([Iwahara 1997]; [Ladanyi 2000])). 현재까지는 ALK의 어떤 스플라이스 변이체도 기술된 바 없다. 그러나, ALK는 대개 염색체 전위와 관련된다 (하 기 참조).

ALK 유전자는 약 315 kb에 걸쳐 있고, 26개의 엑손을 갖는다. 유전자 대부분은 약 170 kb에 걸쳐 있는 2개의 거대 인트론으로 구성된다. ALK 전사체의 길이는 6.5 kb이다 (문헌 [Kutok 2002]). 모리스(Morris)에 따라, cDNA는 6226 bp에 걸쳐 있다 (문헌 [Morris 2001]).

마우스에서 ALK 발현은 배아발생 동안 대략적으로 발달 단계 E11에서 시작되며, 이는 신경계에서 발현되는 신생아 발달기 때에 유지된다. 성인에서 그의 생리학적 발현은 낮은 수준으로 CNS의 특정 뉴런 (신경 세포 및 아교 세포, 및 가능하게는 내피 세포) 영역으로 제한된다 (문헌 ([Morris 1997]; [Duyster 2001]; [Stoica 2001])). 실제로, ALK의 양은 출생후 기간에는 감소한다 (문헌 [Morris 2001]). 그의 발현 패턴에 기초하여, 뇌 발달에 있어 상기 수용체의 역할이 제안되었다 (문헌 [Duyster 2001]). ALK의 신경-제한 발현은, ALK가 향신경성 인자에 대한 수용체로서 역할을 한다는 것을 제안한다 (하기 참조). 이와 일관되게, ALK의 발현 패턴이 뉴로트로핀 수용체의 TRK 계열을 코딩하는 유전자와 중복된다 (문헌 [Morris 2001]). 그러나, ALK 넉아웃 마우스는 어떤 뚜렷한 표현형도 나타내지 않았는데 (데이타 미공개), 이는 TRK 계열의 일원 또는 다른 향신경성 수용체와의 일부 기능상의 중복성 때문일 수 있다. 특히, 조혈 조직은 검출할 수 있는 정도의 ALK 발현을 나타내지 않는다 (하기 참조) (문헌 [Morris 2001]).

ALK에 대하여 유력한 리간드 2개, "플레이오트로핀"(PTN) 및 "미드카인"(MK)이 최근 기술되었다 (문헌 ([Stoica 2001]; [Duyster 2001]; [Stoica 2002]). 파 지 디스플레이 펩티드 라이브러리를 스크리닝하기 위해 정제된 인간 플레이오트로핀 단백질을 사용함으로써 PTN-ALK 상호작용을 동정하였다. 이러한 방법에 의해 그의 세포외 도메인에 존재하는 ALK의 서열 (aa 396-406)을 동정하였다. 중요하게는, 이러한 서열은, ALK와 가장 밀접한 관계를 갖는 RTK인 LTK와 공유되지 않는다. 이러한 리간드-결합 영역은 또한 초파리에 존재하는 ALK의 잠재적인 상동체에 보존된다 (문헌 [Loren 2001]). ALK는 PTN 결합시 신속하게 인산화된다 (문헌 [Bowden 2002]). 게다가, ALK는 세포 배양물에서 플레이오트로핀에 의해 자극을 받는 것으로 보였다. 이는 플레이오트로핀이 갖는 병적 관련성에서 볼 때 플레이오트로핀/ALK 상호작용을 특히 관심의 대상이 될 수 있도록 한다 (문헌 [Stoica 2001]). ALK가 결여된 세포주는 또한 플레이오트로핀에 대한 성장 반응을 나타내지 못했으며, 그 반대의 경우에도 마찬가지다 (문헌 [Stoica 2001]). 생체내에서 다양한 고형 종양을 앓는 환자의 혈청내 플레이오트로핀 수준은 상승되어 있는 것으로 입증되었고, 동물 연구를 통해 플레이오트로핀이 종양 성장의 원인이 되는 것으로 제안되었다 (문헌 [Stoica 2001]). 종양 성장에서 속도-제한 혈관형성 인자로서 PTN의 역할은 동물 모델에서 잘 확립되어 있다 (문헌 [Choudhuri 1997]). 1996년 츠베이코(Czubayko) 등 (문헌 [Czubayko 1996])은 리보자임 표적 접근법을 사용하여 PTN을 조절함으로써 종양 혈관형성에서, 아포프토시스 및 전이의 예방에서 PTN의 중요성을 입증하였다. 마우스에서 혈청내 PTN 수준 측정은 종양 크기와의 뚜렷한 상관관계를 입증하였다. PTN은 예로서, 흑색종 및 췌장암과 같이 가장 침습성인 인간 암 유형들 중 몇몇에서 중요한 역할을 함으로써, ALK 저해제의 유력한 추가 적용에 관한 흥미로운 가능성을 제공한다 (문헌 ([Weber 2000]; [Stoica 2001])). 인간 환자 중 췌장암 환자 (n = 41; P<.0001) 및 결장암 환자 (n = 65; P = .0079)에서 혈청내 플레이오트로핀 수준이 상승한 것으로 밝혀졌다. 건강한 개체의 경우, PTN은 출생전후기 기관 발달시 및 성인의 선택적 뉴런 및 아교 세포 군집에서 엄격하게 조절되는 방식으로 발현된다.

몇몇 암 세포주에서 발견된 PTN 및 ALK의 공발현은 그들이 성장 자극의 자가조절 루프를 형성할 수 있다는 것을 나타낸다 (문헌 [Stoica 2001]). 이러한 모든 데이타에도 불구하고, 문헌들은 PTN의 효과가 ALK 단독에 의해 및/또는 기타 미확인 PTN 수용체에 의해 매개되는지 여부는 여전히 확실치 않음을 전하고 있다 (문헌 [Duyster 2001]). 2개 이상의 다른 유력한 PTN 수용체: 수용체 티로신 포스파타제 RPTPβ 및 황산헤파란 프로테오글리칸 N-신데칸이 제안되었다. 그러나, RPTPβ는 PTN/ALK 신호전달의 신호전달 조절제로서 작용할 수 있고, N-신데칸은 리간드에 대한 샤페론으로서 작용할 수 있다 (문헌 [Bowden 2002]).

최근 미드카인(MK)이라 불리는 것으로서, 플레이오트로핀과 관련된 또다른 분비 성장 인자가 ALK에 대한 제2 리간드로서 확인되었다. PTN과 유사하게, MK의 결합 및 활성화 기능 (예컨대, 세포 배양물에서 반고형 한천배지 콜로니 형성 유도)은 ALK-ECD에 대하여 생성된 것인 동일 항체에 의해 차단될 수 있다 (문헌 [Stoica 2001]). 플레이오트로핀과 유사하게, 미드카인은 그의 생리학적 발현이 성인의 정상 조직에서는 매우 제한되어 있긴 하지만, 다수의 종양에서 상향조절되어 있다 (문헌 [Stoica 2002]). 47개의 방광 종양 샘플 분석에 따르면, MK 발현은 정상적인 방광 조직과 비교하여 유의적으로 (약 4배) 증진되어 있는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 뚜렷한 과발현은 불량한 환자 생존율과 상관관계에 있다 (문헌 [O'Brien 1996]).

그러나, ALK에 대한 MK의 친화도는 플레이오트로핀의 친화도보다 약 5배 낮다 (문헌 [Stoica 2002]). 흥미롭게도, 플레이오트로핀과 같이, 리보자임을 통해 ALK를 저해하는 것 또한 세포 배양물에서 MK의 효과를 저해한다 (문헌 [Stoica 2002]). 본 연구의 연구원들은 또한 PTK/MK/ALK 경로를 저해하는 것이, 예를 들면, 아교모세포종 및 췌장암과 같이 몇몇은 지금까지 매우 제한된 치료 옵션을 가졌던 각종 질환 치료에 대하여 매우 관심있는 가능성을 펼칠 것이라는 결론에 이르게 되었다 (문헌 [Stoica 2002]).

건강한 개체에서, ALK mRNA 발현은 신생아기 동안 최고조에 이르게 되고, 이는 성인의 신경계 중 몇몇 선택된 부위에서 유지된다. 최근 ALK 단백질 발현이 또한 뉴런 및 아교 세포에 결합되어 있는 내피 세포에서 검출되었다. 플레이오트로핀에 대하여 기술된 악성 활성들 중 적어도 일부는 ALK를 통해 매개된다는 증거는 리보자임 표적 접근법에 의해 ALK의 발현이 고갈된 실험으로부터 도출되었다. 그러한 ALK 고갈이 항-아포프토시스 단백질 Akt의 플레이오트로핀-자극 인산화를 방해하였고, 이종이식편을 받은 마우스의 생존 기간을 연장시켰다. 실제로, 종양 이식편에서 아포프토시스 세포수는 ALK 발현이 고갈되었을 때 유의적으로 증가하였다 (문헌 [Powers 2002]).

MK에 대하여 기술된 악성 활성이 ALK를 통해 매개된다는 증거는 ALK ECD에 대한 단일클론 항체를 사용한 실험으로부터 도출되었다. 2개의 항-ALK ECD 항체로부터 1:25의 하이브리도마 세포 희석 상등액을 가하면 반고형 한천 배지에서 SW-13 세포의 콜로니 형성은 유의적으로 감소한다 (문헌 [Stoica 2002]). 10개의 상이한 세포주를 분석한 결과, PTN에 대한 성장 반응 능력은 ALK mRNA 발현과 상관관계에 있었다는 것이 밝혀졌다 (하기 세포주가 PTN에 반응하였고, ALK mRNA를 발현하는 것으로 나타났다: HUVEC, NTH3T3, SW-13, Colo357, ME-180, U87, MD-MB 231; 문헌 [Stoica 2001]). 흥미롭게도, 몇몇 암 세포주 (Colo357 췌장암, Hs578T 유방암 및 U87 아교모세포종)에서 PTN과 ALK가 공-발현되는데, 이는 PTN과 ALK이 성장 자극의 자가조절 루프를 형성한다는 것을 나타낸다 (문헌 [Stoica 2001]).

흥미롭게도, PTN과 MK, 둘 모두 항-아포프토시스 bcl-2 단백질의 전사를 상향조절하는 것으로 나타났다 (문헌 [Stoica 2002]). 추가로, 활성화된 Akt (비정상적인 신호전달의 주요한 하류 표적)는 bad라 불리는 전-아포프토시스 인자를 인산화시킴으로써 bcl-x1로부터 해리시키는데, 이는 bad로부터 유리되었을 때에는 시토크롬 c의 유리를 차단함으로써 아포프토시스를 억제시킬 수 있다 (참고 문헌으로 [Bowden 2002] 참조).

ALK의 비정상적인 발현이 여러 암 발병에 관여할 수 있다. 그러나, 처음에는 소위 대세포 역행성 림프종(ALCL)이라 불리는 고악성 비호지킨 림프종(NHL)의 하위군과 관련이 있었다. 비호지킨 림프종은 림프 기관의 각종 세포로부터 생긴 클론 신생물을 나타낸다.

ALCL의 원발성 전신 임상적 아형을 갖는 대부분의 환자는 t2, 5 전위를 가지 며, 이는 뉴클레오포스민(NPM)의 N-말단을 ALK의 C-말단에 연결시키는 융합 단백질을 발현한다. 상기 융합물은 ALK의 aa 1058-1620에 융합된 NPM의 aa 1-117로 구성되며, 염색체 손상은 ALK의 TM과 막근접 도메인을 코딩하는 엑손들 사이에 위치하는 인트론에 위치한다 (문헌 [Duyster 2001]). NPM-ALK는 680aa 단백질을 코딩하는, 2040 bp의 ORF를 함유하는 전사체이다 (문헌 [Morris 2001]). 이는 911 bp에 걸쳐 있는 NPM의 인트론 4 및 2094 bp에 걸쳐 있는 ALK의 인트론 16에 있는 파손부분에 상응한다 (문헌 [Kutok 2002]). 이러한 융합 단백질내 ALK 서열은 ALCL을 초래하는 단백질에 필요한 최소 서열일 가능성이 가장 높다 (문헌 [Duyster 2001]). 역융합물 (ALK-NPM)은 발현되지 않고, 적어도 림프계 세포에서는 발현되지 않는다 (문헌 [Kutok 2002]). 야생형 NPM 단백질은 편재된 발현을 나타내고, 세포질로부터 핵으로 단백질을 운반하는 단백질 운반체로서의 기능을 한다. 사실상, NPM은, NLS를 함유하고, 핵 단백질에 결합하며, 세포질/핵 수송에 관여하는 염색체 5 상에서 코딩되는 38 kDa 핵 단백질이다 (문헌 [Duyster 2001]). NPM은 가장 풍부한 핵소체 단백질이며, 보통은 육합체로서 존재한다 (문헌 [Morris 2001]). NPM은 보통 자가-올리고중합화 (육합체) 뿐만 아니라, NPM-ALK와의 이종-올리고중합화를 된다는 것이 가장 중요하다 (문헌 [Duyster 2001]). 2;5 전위를 통해 염색체 5 상의 강한 NPM 프로모터의 제어하에서 염색체 2 상에 티로신 키나제를 코딩하는 ALK 유전자 부위가 놓임으로써 키메라성 NPM-ALK 단백질 (p80)이 영구적으로 발현하게 된다 (문헌 [Duyster 2001]). 그러므로, ALK 키나제는 세포 유형 (림프계) 및 세포 구획 (핵/핵 및 세포질), 둘 모두에 있어서 탈조절화되어 있고, 이소성(ectopic)이 다 (문헌 [Ladanyi 2000]). NPM의 국소화 (세포질 또는 핵)가 림프종형성에 대한 NPM의 효과에는 어떤 영향도 주지 않는 것으로 보인다 (문헌 [Duyster 2001]). 결과의 비정상적인 티로신 키나제 활성은 세포내 표적의 구성적 인산화를 통해 악성 형질전환을 유발한다. 덜 공통적인 각종의 다른 ALK 융합 단백질이 ALCL과 관련이 있다. 모든 변이체는 ALK 티로신 키나제 도메인의 발현을 조절하는 대체 프로모터에 ALK 티로신 키나제 도메인이 연결되어 있는 것을 나타낸다.

약 92%의 원발성 신경모세포종 세포에서, 및 몇몇 횡문근육종에서 전장의 ALK 또한 발현한다고 보고되었다 (문헌 [Lamant 2000]). 그러나, 현재까지 ALK 발현과 종양 생물 상태 사이의 상관관계에 대해서는 입증된 바 없다. 이들 종양에서 내인적으로 인산화된 ALK의 유의적인 수준과 관련된 증거가 부족하다는 점도 함께 미루어 볼 때 상기의 사실은 신경모세포종에서의 ALK 발현이 원발성 암유발성 역할보다는 미성숙 신경 세포에서 ALK의 정상적인 발현을 반영하고, 이들 종양에서의 ALK는 구성적으로 인산화되지 않는 바, 이들 종양에서 ALK에 대한 중요한 역할에 관한 의문을 제기한다 (문헌 ([Duyster 2001[; [Pulford 2001])). 그럼에도 불구하고, 신경모세포종-유래의 세포주에서 유전자 증식에 기인한 ALK의 과발현 및 구성적 인산화를 밝혀낸 미야케(Miyake) 등에 의해 제안된 바 (문헌 [Miyake 2002]), ALK 신호전달은 적어도 몇몇 신경모세포종에서는 중요할 수 있다. 그러나, 다른 신경모세포종-유래의 세포주는 ALK의 구성적 활성화를 나타내지 않는 바, 이로써 ALK의 일반적인 병리학적 관여성에 대한 논쟁을 벌이고 있다 (문헌 ([Dirks 2002]; [Pulford 2004])).

가장 흥미롭게도, 매우 제한된 치료학적 옵션을 제공하는 고도의 악성 뇌종양인 다형성 아교모세포종의 성장에 ALK가 중요한 것으로 보인다 (문헌 [Powers 2002]). 이들 파괴적인 종양에서 PTEN, p53 및 INK4a-ARF의 손실 또는 돌연변이를 비롯한 다수의 유전자 변경이 발생하는 것으로 나타났다. 추가로, RTK 신호전달은 이들 종양의 성장과 발생에 있어 특히 중요한 역할을 하며, PDGF, HGF, NGF 및 VEGF와 같은 다양한 성장 인자를 과발현시키는데, 이는 자가조절 RTK 신호전달 루프를 시사한다. 파워(Powers)와 동료들은 아교모세포종 환자의 종양 샘플에서 ALK의 mRNA 및 단백질 발현을 나타낸 반면, 인접해 있는 정상의 뇌 조직에서는 신호가 검출되지 않았다 (문헌 [Powers 2002]). 추가로, 인간 U87MG 아교모세포종 세포 (환자로부터 유래된 것이며, 아교모세포종에서 종양형성 및 신호전달을 연구하기 위한 잘-특징화된 모델 시스템을 나타냄)은 이종이식 연구에서 ALK-의존적인 항-아포프토시스 행태를 나타낸다. ALK가 리보자임을 사용함으로써 이들 종양 세포에서 고갈될 때, 이들 종양 세포를 주사한 마우스는 야생형 종양 세포를 주사했을 때보다도 2배 이상 더 오래 생존하고, 이들 종양 세포는 현저히 증가한 아포프토시스를 나타낸다. 따라서, ALK 및 그의 리간드(들)는 생체내에서 U87MG 세포의 종양 성장에 관한 속도-제한적인 필수 생존 신호를 제공한다 (문헌 [Powers 2002]). 이러한 발견은 ALK 신호전달을 저해하는 것이 아교모세포종 환자의 수명을 연장시키는 유망한 접근법이 될 수 있다는 것을 나타낸다.

다형 아교모세포종이 단연 가장 보편적이며 악성인 원발성 아교 종양이며, 그의 발병률은 약 2,100,000/y이다 (연간 미국 및 서유럽에서 약 15,000개의 사례 ). 이는 우선적으로 대뇌 반구에 영향을 미치지만, 뇌줄기(주로 어린이의 경우) 또는 척수에도 영향을 미칠 수 있다. 종양은 새로 소견을 나타낼 수 있거나 (원발성 아교모세포종), 보다 낮은 등급의 성상세포종으로부터 발달할 수 있다 (속발성 아교모세포종). 원발성 및 속발성 아교모세포종은 거의 분자상의 중복을 나타내지 않고, 분자 수준으로 상이한 질환 단위를 구성한다. 그들 모두는 p53, EGFR, MDM2, PDGF, PTEN, p16, RB의 질환을 비롯한 다수의 유전적 이상을 함유한다.

지난 25년간 요법에 있어 현저한 진보는 이루어지지 않았다. 요법은 단지 완화 요법이며, 이는 수명을 3개월 내지 1년 연장시킬 수 있다. 환자는 보통 느리게 진행되는 신경 결함, 예컨대, 운동성 약화, 두개내압 증상, 예컨대, 두통, 구역, 구토, 인지 장애, 또는 발작을 보인다. 성격 변화 역시 조기 징후가 될 수 있다. 아교모세포종의 병인은 알려져 있지 않고, 가족성 사례는 1% 미만으로 나타난다. 확인된 유일의 일관되는 위험 인자는 석유화학 물질에 대한 노출이다. 진단은 주로 연상 연구 (CT, NMR) 및 생검에 의해 이루어진다. 대부분의 아교모세포종의 병기를 완전하게 구분하는 것은 실용적이지도 않고 가능한 것도 아닌데, 이는 이들 종양의 경계 구분이 뚜렷하지 않기 때문이다. 오히려 국소적으로 침습하고, 조밀한 백질대를 따라 퍼지는 것과 같은 잘 알려진 경향을 나타낸다. 근치적 치료가 불가능한 첫번째 이유는 진단시 종양은 국소적으로 제어할 수 없는 범위에 존재하기 때문이다. 1차 화학요법제는 카무스틴 (알킬화제) 및 시스플라티늄이지만, 환자 중 40%만이 일부 반응을 나타낸다.

아교모세포종에 있어 ALK의 역할에 관해 일부는 여전히 불확실하지만, 상기 질환은 ALK-유도 약물에 대한 다양한 접근법을 제공한다. 사실상, 이러한 파괴적인 질환의 경우에는 현 요법 옵션에서의 작은 개선일지라도 막대한 의료적 수요로서 작용할 것이다. 아교모세포종 세포가 전장의 ALK를 발현하기 때문에 이 암을 치료하기 위해서는 ALK가 소분자 키나제 저해제에 대해서 뿐만 아니라, 항체 및/또는 예로서, scFvs와 같은 항체 단편에 대한 표적으로서, 즉, 종양 세포의 아포프토시스를 유도하는 표적으로서 고려될 수 있다는 것에 주목하는 하는 것이 중요하다. scFvs가 CNS로 효율적으로 전달될 수 있다면 (구획화에 기인하여 신속하게 제거되지는 않지만, IgGs와 비교하여 scFvs의 크기가 보다 작기 때문에 종양으로 보다 잘 침투될 수 있음), 아교모세포종이 CNS로 엄격하게 국소화된다는 것은 scFvs의 이용을 뒷받침한다. 항체 및/또는 항체 단편은 ALK의 리간드-결합 서열 (aa 396-406), 또는 수용체의 세포외 부분 중 다른 부분에 대한 것일 수 있다.

생리학적 조건하에 건강한 조직에서 ALK의 발현이 극도로 제한된다는 것은 ALK가 이들 종양의 발병에 관여하는지 여부와는 상관없이, ALK를 발현하는 종양이 방사성 또는 독소-표지된 항체 및/또는 항체 단편을 사용하는 질환 치료법에 대한 탁월한 표적이 될 수 있다는 것을 지시하는 것이다. 아교모세포종 세포 이외에, 흑색종 세포주 및 유방암종 세포주에서 고도로 유의적으로 (구성적으로 인산화되지 않고) ALK가 발현하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Dirks 2002]). ALK의 세포외 도메인 중 상당 부분이 인간 프로테옴에서 다소 독특한 것으로 보인다는 사실이 상기 접근법을 고도로 특이적인 것으로 만든다.

WO9515331/US5529925는 인간 t(2;5) 림프종에서 일어나는 t(2;5) (p23;q35) 염색체 전위 이벤트시에 재배열되는 인간 핵산 서열을 클로닝하고 서열 분석하는 것에 관해 개시한다. 상기 재배열을 통해 서열이 염색체 5q35 상의 핵소체 인단백질 유전자 (NPM 유전자)로부터 염색체 2p23 상의, 종전에 미확인되었던 단백질 티로신 키나제 유전자 (이하, ALK 유전자)로 놓인다는 것을 밝혀졌다. 융합 유전자 및 융합 단백질 (각각 NPM/ALK 융합 유전자 또는 단백질)의 서열 또한 개시되었다.

전장의 ALK 서열은 발명의 명칭이 "Human ALK Protein Tyrosine Kinase"인 US5770421에서 특허받았다. 추가로, 발명의 명칭이 "Method of detecting a chromosomal rearrangement involving a breakpoint in the ALK or WPM gene"인 특허 US6174674B1은 환자 샘플에서 NPM-ALK 융합 서열을 검출하는 프라이머를 개시한다. 발명의 명칭이 "ALK protein tyrosine kinase/receptor and ligands thereof"인 또다른 특허 출원, US6696548에는 ALK의 특이 서열에 결합하는 ALK 리간드 및 항체를 검출하기 위한 ALK의 용도가 개시되어 있다. 이는 또한 단리된 ALK 폴리펩티드에 결합할 수 있는 제제를 확인하는 방법도 개시한다.

WO0196394/US20020034768은 플레이오트로핀의 수용체로서의 ALK를 개시한다. US20040234519는 항-플레이오트로핀 항체를 개시하고, WO2006020684는 플레이오트로핀 검출을 기술한다.

그러므로, 시험관내 및 생체내에서 인간 ALK 단백질에 결합하는, 안정적이고 가용성인 항체 또는 항체-유도체를 제공하는 것이 본 발명의 일반적인 목표이다. 가장 바람직하게, 항체는 ALK의 리간드-결합 도메인 (아미노산 396-406)에 대해 특이적으로 표적화되고, 따라서, ALK에 대한 Kd가 약 170 pM인 MK의 생물학적 효과 뿐만 아니라, ALK에 대한 Kd가 약 20-30 pM인 PTN의 생물학적 효과, 둘 모두를 차단하게 될 것이다 (문헌 ([Stoica 2002]; [Stoica 2001])). 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 scFv 항체 또는 Fab 단편이다. 하기에서 용어 항체는 전장의 항체 뿐만 아니라, 다른 항체 유도체도 포함한다.

이에, 설명되어 감에 따라서 보다 쉽게 자명해지게 될 본 발명의 상기와 같은 목표 및 추가의 다른 목표를 이행하기 위해서 상기 항체는 서열 번호: 2의 서열과 50% 이상의 동일성을 갖는 서열의 가변 중쇄 CDR3을 포함한다는 특징으로 상기 항체를 명시한다. 바람직하게, 서열 동일성은 60%, 65%, 75%, 85% 이상이거나, 더욱 바람직하게, 92% 이상이다. 가장 바람직하게, 상기 항체는 서열 번호: 2의 서열의 VH CDR3을 갖는다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합부는 ALK 단백질의 특정 에피토프에 특이적으로 결합한다. 그러한 에피토프는 예를 들면, ALK 단백질의 아미노산 1-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-900, 900-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 또는 1500-1620, 또는 임의의 그 사이에, 그의 부분 또는 범위에 존재한다. 하나의 실시태양에서, 항체 또는 그의 항원 결합부는 아미노산 잔기 391±3 내지 406±3 (서열 번호: 91은 인간 ALK 단백질의 아미노산 잔기 388 내지 409를 나타낸다), 바람직하게, ALK 단백질(서열 번호: 1)의 아미노산 391-406 (서열 번호: 1)에 걸쳐 있는 영역을 포함하거나, 본질적으로 그로 구성되거나, 상기 영역의 단편을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 명시된 범위가 뚜렷한 경계를 갖는 것으로 간주되지 않아야 하되, 항체 또는 그의 항원 결합부는 ALK의 리간드-결합 도메인에 밀접하게 위치하는 영역 또는 상기 도메인 내의 영역에 결합하거나 부분적으로 결합할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 바람직하게, 항체 또는 항체-유도체는 10 내지 20개의 아미노산 길이의 ALK 단백질의 에피토프에 결합한다.

또다른 실시태양에서, 항체 또는 그의 항원 결합부는 약 10 x 10^-6 M 미만의 K_D로 ALK 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 특정 실시태양에서, 항체 또는 그의 항원 결합부는 적어도 약 10 x 10^-7 M, 적어도 약 10 x 10^-8 M, 적어도 약 10 x 10^-9 M, 적어도 약 10 x 10^-10 M, 적어도 약 10 x 10^-11 M, 또는 적어도 약 10 x 10^-12 M의 K_D로또는 더욱더 바람직한 K_D로 ALK 단백질 (또는 그의 단편)에 특이적으로 결합한다.

다양한 다른 실시태양에서, 항체 또는 그의 항원 결합부는 서열 번호: 4에 제시된 가변 중쇄 영역 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 이상, 또는 더욱 바람직하게 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함한다.

다른 실시태양에서, 항체 또는 그의 항원 결합부는 서열 번호: 5에 제시된 가변 경쇄 영역 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 이상, 또는 더욱 바람직하게 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함한다.

추가의 다른 실시태양에서, 항체 또는 그의 항원 결합부는 서열 번호: 4에 제시된 가변 중쇄 영역 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 이상, 또는 더욱 바람직하게 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호: 5에 제시된 가변 경쇄 영역 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 이상, 또는 더욱 바람직하게 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역, 둘 모두를 포함한다.

특정의 다른 실시태양에서, 항체 또는 그의 항원 결합부는 ESBA521의 항체 또는 항체 유도체가 결합하는 에피토프 (서열 번호: 19)와 중복되고/거나, ALK 단백질 또는 그의 일부와 결합하는 것에 대해 ESBA521의 항체 또는 항체 유도체와 경쟁하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 관련 실시태양에서, 항체 또는 그의 항원 결합부는 ALK 단백질의 잔기 391-406 (서열 번호: 1) 또는 그의 일부를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다.

항체 또는 그의 항원 결합부의 가변 중쇄 및 경쇄 영역은 전형적으로 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 이는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 포함한다. 특정 실시태양에서, 가변 중쇄 CDR은 ESBA521 항체의 CDR과 80%, 85%, 90%, 95% 이상, 또는 더욱 바람직하게 100% 동일하다. 다른 특정 실시태양에서, 가변 경쇄 CDR은 ESBA521 항체의 가변 경쇄 영역의 CDR과 80%, 85%, 90%, 95% 이상, 또는 더욱 바람직하게 100% 동일하다.

따라서, 본 발명의 특정 항체 또는 단편은 ESBA521 항체의 가변 중쇄 영역의 CDR과 80%, 85%, 90%, 95% 이상, 또는 더욱 바람직하게 100% 동일한 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 ESBA521 항체의 가변 경쇄 영역의 CDR과 80%, 85%, 90%, 95% 이상, 또는 더욱 바람직하게 100% 동일한 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함한다.

항체 또는 그의 항원 결합부의 가변 중쇄 영역은 또한 ESBA521 항체의 가변 중쇄 영역의 CDR과 80%, 85%, 90%, 95% 이상, 또는 더욱 바람직하게 100% 동일한 CDR 3개 모두 및/또는 ESBA521 항체의 가변 경쇄 영역의 CDR과 80%, 85%, 90%, 95% 이상, 또는 더욱 바람직하게 100% 동일한 CDR 3개 모두를 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 실시태양에서, 항체 또는 그의 항원 결합부는 (a) 인간 VH 유전자 (예컨대, H3형)에 의해 코딩되거나, 그로부터 유래된 (즉, 그의 산물인) 중쇄 가변 영역을 포함하고/거나; (b) 인간 V 카파 또는 람다 유전자 (예컨대, 람다1형)에 의해 코딩되거나, 그로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함한다.

본 발명의 항체는 효과기 도메인, (예컨대, Fc 도메인)을 포함하는 전장의 항체, 예를 들면, 단일클론 항체 뿐만 아니라, 항체 일부 또는 단편, 예로서, 단일 쇄 항체 및 Fab 단편을 포함한다. 항체는 또한 각종 치료제 (예컨대, 항암제, 화학요법제, 또는 독소) 및/또는 표지 (예컨대, 방사선표지)에 연결될 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호: 22와 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상, 또는 더욱 바람직하게, 99% 이상 동일한 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는, 단리된 핵산을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 서열 번호: 21과 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상, 또는 더욱 바람직하게, 99% 이상 동일한 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는, 단리된 핵산을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 상기 핵산 중 임의의 것을 단독으로 또는 조합으로 (예컨대, 하나 이상의 벡터로부터 발현되는 것으로) 포함하는 발현 벡터 뿐만 아니라, 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 특징으로 한다.

본 발명의 항체를 발현하는 적합한 숙주 세포는 각종 진핵세포, 예컨대, 효모 세포, 포유동물 세포, 예컨대, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0 세포, 골수종 세포, 또는 식물 세포를 포함한다. 본 발명의 분자는 또한 원핵 세포, 예컨대, E. 콜라이(E. coli)에서 발현될 수 있다.

본 발명은 또한 숙주 세포에서 항체를 코딩하는 핵산 (예컨대, 항체의 항원 결합 영역 일부를 코딩하는 핵산)을 발현시킴으로써 항체 또는 그의 항원 결합부를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 추가의 또다른 측면에서, 본 발명은 상기 언급한 핵산을 포함하는 하이브리도마 또는 트랜스펙토마를 특징으로 한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 ALK 단백질의 에피토프, 바람직하게는, PTN 리간드 결합 도메인의 에피토프, 더욱 바람직하게는, 아미노산 잔기 391±3 내지 406±3 (인간 ALK 단백질의 아미노산 잔기 388 내지 409를 제시하는 서열 번호: 91 참조), 가장 바람직하게, 아미노산 391-406 (서열 번호: 1)에 걸쳐 있는 영역을 포함하거나, 본질적으로 그로 구성되거나, 상기 영역의 단편을 포함하는 항원을 제공한다. 항원은 항-ALK 항체를 상승시키거나, 그의 존재를 스크리닝하거나, 검출하는데 사용될 수 있고, 또는 능동 면역요법에서 제제로서, 즉, 백신으로서 사용될 수 있다.

백신으로서의 항원은 단독으로 사용될 수 있거나, 적절한 애주번트 또는 합텐과 조합하여, 예를 들면, 화학적으로 또는 유전자적으로 혼합되거나 접합되어 사용될 수 있다. 능동 면역요법용으로 사용될 때 항원은 또한 수동 면역요법과 조합하여, 예를 들면, 본원에 개시된 임의의 항-ALK 항체와 함께 사용될 수 있거나, 항-ALK 항체의 단일클론 또는 다중클론 제제, 예컨대, 양성혈청반응 기증자로부터 유래된 혈청 감마글로불린과 함께 조합하여 사용될 수 있다.

또다른 실시태양에서, 항체 분자 (또는 VL 및 VH 결합 영역)는 완전히 인간의 것이다. 인간을 인간 단일클론 항체로 치료하는 것이 여러 장점을 제공한다. 예를 들면, 항체는 비인간 항체보다 인간에서 면역원성이 더 작을 수 있다. 상기 요법은 또한 항체가 암 부위 (ALK가 발현된 부위)에 도달하자마자 ALK는 불활성화될 수 있기 때문에 빠르다. 그러므로, 관련 실시태양에서, 항체는 scFv 항체, 즉, ESBA521 또는 ESBA521의 VL 및/또는 VH 영역(들) (또는 그의 CDR; 예컨대, VL CDR3 (서열 번호:3) 및/또는 VH CDR3 (서열 번호: 2))을 포함하는 항체이다.

인간 항체는 또한 비인간 항체보다 더욱 효과적으로 인간에서 적절한 부위로 국소화된다. 추가로, 상기 치료법은 ALK에 대하여 특이적이고, 재조합성이고, 고도로 정제된 것이며, 종래 요법과는 달리 외래 물질로 오염될 수 있는 가능성을 피할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 항체 및 항체-유도체는 화학적 합성법에 의해 생산될 수 있다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 예로서, 미드카인(MK) 및/또는 플레이오트로핀(PTN)과 같은 ALK의 리간드와 경쟁하여 상기 리간드에 의해 매개되는 ALK-신호전달을 차단함으로써 대상자에서 신생물을 예방할 수 있는 암 치료용 (또는 암 치료에 적합한 약제 제조용) 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 단독으로, 또는 당업계에서 인정받은 항암제, 예를 들면, 메토트렉세이트 등과 함께 조합하여 투여될 수 있다.

본 발명의 항체 및/또는 ALK 백신은 단독으로, 또는 공지된 치료제, 예컨대, 항암제, 예컨대, 메토트렉세이트 등과 함께 조합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 자명해질 것이다.

하기의 발명의 상세한 설명을 고려하면, 본 발명이 더욱 잘 이해될 것이고, 상기한 것 이외의 목적이 자명해질 것이다. 그러한 기재는 첨부된 도면을 참고하며 설명된다.

도 1은 사용된 인간 ALK 단백질의 개략도를 나타낸다. PTN 결합 부위 (빗금친 부분)중 16 아미노산 펩티드가 scFv 결합체에 대한 2개의 하이브리드 스크린에서 에피토프로서 사용된다.

도 2는 2차 결합체로서 ESBA521 및 3차 결합체로서의 scFv 세트 (표 1 참조)를 수득하기 위한 VH CDR3, VL CDR 3 및 VH CDR 2 일부의 단계적인 무작위화를 나타낸다. X는 임의의 아미노산 잔기를 나타낸다.

도 3은 개선된 scFv의 결합 특징을 상기 scFv가 유래된 프레임워크의 것과 비교하는 ELISA 실험을 나타낸다.

도 4는 ESBA521 (좌측 패널) 및 다중클론 ALK 특이 항체 (우측 패널)로 일시적으로 형질감염된 HeLa 세포의 면역염색을 나타낸다. 중간에 있는 패널은 광학 현미경으로 시각화된 동일 세포이다.

도 5는 ESBA512를 개선된 3차 결합체와 비교하는 ELISA 실험을 나타낸다.

본 발명이 보다 쉽게 이해될 수 있도록 하기 위해 먼저 특정 용어를 정의한다.

정의

"ALK" 및 "Alk-1"이라는 용어는 막관통 단백질 티로신 키나제(PTK)/수용체인 ALK (역형성 림프종 키나제) 유전자에 의해 코딩되는 인간 ALK 단백질을 포함한다.

"항체"라는 용어는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합부," "항원 결합 폴리펩티드," 또는 "면역-결합체") 또는 단일 쇄를 지칭한다. "항체"는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질, 또는 그의 항원 결합부를 지칭한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 V_H로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 V_L로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. V_H 및 V_L 영역은 추가로 프레임워크 영역(FR)으로 명명되는 보다 보존적인 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명되는 초가변성 영역으로 세분될 수 있다. V_H 및 V_L은 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된, 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역글로불린이 면역계의 다양한 세포 (예컨대, 효과기 세포) 및 전통적 보체계의 제1 성분 (C1q)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 결합하는 것을 매개할 수 있다.

항체의 "항원-결합부" (또는 간단하게 "항체 일부")라는 용어는 항원 (예컨대, ALK)에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 실행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원-결합부"라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) V_L, V_H, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')₂ 단편; (iii) V_H 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 단일 암(arm)을 갖는 항체의 V_L 및 V_H 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) V_H 도메인으로 구성된 단일 도메인 또는 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 (vii) 합성 링커에 의해 임의로 연결될 수 있는 2 이상의 단리된 CDR의 조합물을 포함한다. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인인 V_L 및 V_H가 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이는 V_L 및 V_H 영역이 쌍을 이루어 1가 분자 (단일 쇄 Fv(scFv))를 형성하는 재조합 방법을 사용하여 V_L 및 V_H를 단일 단백질로서 제조할 수 있는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다 (예컨대, 문헌 ([Bird et al. (1988) Science 242:423-426]; 및 [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]) 참조). 그러한 단일 쇄 항체 또한 항체의 "항원-결합부"라는 용어에 포함시키고자 한다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상의 기법을 사용하여 수득되고, 상기 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 그 유용성에 대하여 스크리닝된다. 항원-결합부는 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 온전한 면역글로불린의 효소 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다. 항체는 상이한 이소형, 예를 들면, IgG (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 하위유형), IgA1, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM 항체일 수 있다.

"프레임워크"라는 용어는 더욱 분기된 CDR 영역 사이에 존재하는 당업계에서 인정받은 항체 가변 영역 일부를 지칭한다. 그러한 프레임워크 영역은 전형적으로 프레임워크 1부터 4 (FR1, FR2, FR3, 및 FR4)로 지칭되며, 중쇄 또는 경쇄 항체 가변 영역에서 발견되는 3개의 CDR이 항원-결합 표면을 형성할 수 있도록, 상기 CDR을 3차원 공간에서 유지시키는 스캐폴드를 제공한다. 그러한 프레임워크는 또한 더욱 분기된 CDR을 제시하는 것을 지원하기 때문에 스캐폴드로서도 지칭될 수 있다. 면역글로불린 상위계열, 예로서, 앙키린 반복부 및 섬유결합소의 다른 CDR 및 프레임워크가 항원 결합 분자로서 사용될 수 있다 (예를 들면, 미국 특허 번호 제6,300,064호, 제6,815,540호 및 미국 공개 번호 제20040132028호도 참조).

"에피토프" 또는 "항원 결정기"라는 용어는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원상의 부위 (예컨대, ALK, 예를 들면, 인간 ALK-1의 아 미노산 잔기 391-406 (예컨대, 서열 번호: 1 참조))를 지칭한다. 에피토프는 전형적으로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 독특한 공간 구조로 포함한다. 예컨대, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)]을 참조한다.

"특이적 결합," "선택적 결합," "선택적으로 결합한다," 및 "특이적으로 결합한다"라는 용어는 소정의 항원상의 에피토프에 항체 결합하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 대략 10^-7 M 미만, 예로서, 대략 10^-8 M, 10^-9 M, 10^-10 M 미만, 또는 그보다 낮은 친화도 (K_D)로 결합한다.

"K_D"라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다. 전형적으로, 본 발명의 항체는 예를 들어, 비아코어(BIACORE) 기기로 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술을 사용하여 측정된 바, 대략 10^-7 M 미만, 예로서, 대략, 10^-8 M, 10^-9 M, 10^-10 M 미만, 또는 그보다 낮은 해리 평형 상수(K_D)로 결합한다.

"ALK를 중화시킨다," "ALK를 저해한다," 및 "ALK를 차단한다"라는 용어는 상호교환적으로 사용되는 것으로, 이는 ALK가 하나 이상의 표적 리간드와 상호하지 못하도록 하고, 예를 들면, 신호 전달을 일으키지 못하도록 하는 본 발명의 항체의 능력을 지칭한다.

"핵산 분자"라는 용어는 DNA 분자 및 RNA 분자를 지칭한다. 핵산 분자는 싱글-스트랜드 또는 더블-스트랜드일 수 있지만, 더블-스트랜드 DNA가 바람직하다. 핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적으로 관련되도록 배치될 때 "작동가능하게 연결된 것이다." 예를 들면, 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 준다면 이는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다.

핵산의 경우, "실질적인 상동성"이라는 용어는 2개의 핵산, 또는 그의 지정 서열을 최적으로 정렬하고 비교하였을 때, 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 포함하여, 약 80% 이상의 뉴클레오티드, 보통 약 90% 내지 95% 이상, 및 더욱 바람직하게, 약 98% 내지 99.5% 이상의 뉴클레오티드에서 동일한 것을 지시한다. 별법으로, 실질적인 상동성이란 선택적 혼성화 조건하에서 스트랜드의 보체에 상기 세그먼트들이 혼성화할 때 존재한다. 그러한 혼성화 조건은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면 하기 문헌 [Sambook et al.]에 기재되어 있다.

두 서열 사이의 동일성(%)은 두 서열을 최적으로 정렬하기 위해서는 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여 두 서열이 공유하는 동일한 위치의 갯수에 따른 함수이다. 서열 비교 및 두 서열 사이의 동일성(%) 측정은 하기의 비제한적인 예에 기술된 수학적 알고리즘을 사용함으로써 달성될 수 있다.

두 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성(%)은 NWSgapdna을 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지로 GAP 프로그램을 사용함으로써 측정될 수 있다. CMP 매트릭스 및 갭 가중치 40, 50, 60, 70, 또는 80 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6. 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성(%)은 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 벌점 = 12 및 갭 벌점 = 4를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)으로 혼입된, E. 마이어스 및 W. 밀러(E. Meyers and W. Miller) (문헌 (CABIOS, 4:11-17 (1989))]의 알고리즘을 사용하여 측정될 수 있다. 추가로, 두 아미노산 서열 사이의 동일성(%)은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 = 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4, 및 길이 가중치 = 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램으로 혼입된 니들만 및 운쉬 (Needleman and Wunsch)(문헌 [J. Mol. Biol. (48) :444-453 (1970)]) 알고리즘을 사용하여 측정될 수 있다.

본 발명의 핵산 및 단백질 서열을 "질의 서열 (query sequence)"로 사용하여 공용 데이터베이스를 검색함으로써, 예컨대 관련 서열을 동정할 수 있다. 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et a.1. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다. NBLAST 프로그램으로 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행하여 (점수 = 100, 단어길이 = 12), 본 발명의 핵산 분자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. XBLAST 프로그램으로 BLAST 단백질 검색을 수행하여 (점수 = 50, 단어길이 = 3), 본 발명의 단백질 분자와 상동성이 있는 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적의 갭 허용 정렬을 얻기 위해, Gapped BLAST를 문헌 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우, 각 프로그램 (예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 서열 번호들에 제시되어 있는 서열의 "보존적 서열 변형," 즉, 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 또는 아미노산 서열을 함유하는 항체의 항원에 대한 결합을 폐기시키지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형을 포함한다. 그러한 보존적 서열 변형은 뉴클레오티드 및 아미노산의 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 예를 들면, 변형은 당업계에 공지된 표준 기법, 예로서, 부위-지정 돌연변이유발법 및 PCR-매개 돌연변이유발법에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산의 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 계열은 당업계에 정의되어 있다. 이러한 계열은 염기성 측쇄 (예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄 (예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 인간 항-ALK 항체에서 예측된 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 계열의 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 항원 결합을 소거시키지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산의 보존적 치환을 동정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (예컨대, 문헌 ([Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993)]; [Kobayashi et al. Protein Eng. 12 (10):879-884 (1999)]; 및 [Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)]) 참조).

별법으로, 또다른 실시태양에서, 돌연변이는 예로서, 포화 돌연변이유발법에 의해 항-ALK 항체 코딩 서열을 전체 또는 그 일부를 따라 무작위적으로 도입되고, 생성된 변형된 항-ALK 항체를 결합 활성에 대하여 스크리닝할 수 있다. "공통 서열"은 관련 서열 계열에서 가장 흔하게 나타나는 아미노산 (또는 뉴클레오티드)로부터 형성된 서열이다 (예컨대, 문헌 [Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987] 참조). 단백질 계열에서, 공통 서열내 각각의 위치는 상기 계열내 상기 위치에서 가장 흔하게 나타나는 아미노산이 차지한다. 2개의 아미노산이 균등하게 흔하게 나타나는 경우, 어느 하나가 공통 서열에 포함될 수 있다.

본원에서 제공되는 표 및 도면을 참고로 하여, 인간 ALK-1 단백질의 에피토프 390-406에 대해 반응성인 항체의 가변 영역 CDR의 아미노산 서열을 최적으로 배열하여 항체 중쇄/경쇄 가변 영역 CDR(들)에 대한 공통 서열을 유도할 수 있다.

"벡터"라는 용어는 이것이 연결된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 한가지 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 결찰될 수 있는 환형의 더블 스트랜드 DNA를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈에 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포 (예컨대, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터)에서 자가 복제할 수 있다. 기타 벡터 (예컨대, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포로의 도입시 숙주 세포의 게놈내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다.

"숙주 세포"라는 용어는 발현 벡터가 그 내로 도입되는 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 세균, 미생물, 식물 또는 동물 세포를 포함할 수 있다. 형질전환되기 쉬운 세균으로는 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae)의 일원, 예로서, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 살로넬라(Salmonella)의 균주; 바실라세아에 (Bacillaceae)의 일원, 예로서, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis); 뉴모코쿠스(Pneumococcus); 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 및 헤모필러스 인플루엔재(Haemophilus influenzae)를 포함한다. 적합한 미생물로는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다. 적합한 동물 숙주 세포주는 CHO (차이니즈 햄스터 난소 세포주) 및 NSO 세포를 포함한다.

"치료하다," "치료하는," 및 "치료"라는 용어는 본원에 기술된 치료학적 또는 예방학적 조치를 지칭한다. "치료" 방법은 질병 또는 재발성 질병을 예방하거나, 치유하거나, 지연시키거나, 그의 중증도를 감소시키거나, 그의 하나 이상의 증상을 호전시키기 위해, 또는 본 치료를 받지 못한 경우에 예측되는 생존 기간을 넘어선 기간으로 대상자의 생존 기간을 연장시키기 위하여 예를 들면, ALK-매개 질병을 앓는 대상자, 또는 결국에는 상기 질병에 걸릴 수 있는 대상자와 같이 치료를 필요로 하는 대상자에게 본 발명의 항체를 투여하는 것을 사용한다.

"ALK-매개 질병"이라는 용어는 ALK-매개 암 또는 종양과 관련된 질환 상태 및/또는 증상을 지칭한다. 일반적으로, "ALK-매개 질병"이라는 용어는 ALK의 관여를 필요로 하는 임의의 질병, 그의 증상 발병, 진행 또는 유지를 지칭한다. 대표적인 ALK-매개 질병으로는 예를 들면, 암, 특히, 아교모세포종을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"유효량" 또는 "유효 투여량"이라는 용어는 원하는 효과를 이루거나, 적어도 부분적으로 이루기 위한 충분한 양을 지칭한다. "치료학적 유효량"이라는 용어는 질환을 이미 앓은 바 있는 환자에서 질환 및 그의 합병증을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 그를 정지시키는데 충분한 양으로서 정의된다. 그러한 용도에 대한 유효량은 치료되는 질병의 중증도 및 환자 자신의 면역계의 일반적인 상태에 달라질 것이다.

"대상자"라는 용어는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 지칭한다. 예를 들면, 본 발명의 방법 및 조성물은 암, 예컨대, 아교모세포종을 앓는 대상자를 치료하는데 사용될 수 있다.

달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련인에 의해 통상적으로 이해되고 있는 것과 같은 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 발명을 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법과 재료를 하기에 기술한다. 상반되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 규정할 것이다. 추가로, 재료, 방법, 및 예는 단지 예시적인 것이며 제한하고자 하는 것은 아니다.

본 발명의 다양한 측면을 하기 하위섹션에서 추가로 상세히 기술한다. 다양한 실시태양, 선호, 및 범위는 마음대로 조합될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 추가로, 특정 실시태양에 따라 선택되는 정의, 실시태양 또는 범위가 적용될 수 없다.

본 발명은 제1 측면으로 서열 번호: 2의 서열과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열의 가변 중쇄 CDR3을 포함하는, 인간 ALK 단백질에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직하게, 서열 동일성은 60%, 70%, 75%, 80% 이상, 또는 더욱 바람직하게, 90% 이상이다. 가장 바람직하게, CDR3은 서열 번호: 2의 바로 그 서열을 갖는다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 항체는 인간 ALK 단백질에 특이적으로 결합하며, 즉, 그의 PTN 결합 부위가 인간 ALK 단백질의 PTN 결합 부위 (서열 번호: 1)와 비교하여 오직 2 아미노산 잔기만이 상이한 것인 마우스 ALK 단백질에는 본 항체가 결합하지 않는다. 3번 위치의 인간 이소류신은 상응하는 마우스 서열에서는 발린이고, 아스파테이트는 알라닌이다.

본 발명의 항체는 전장의 항체 뿐만 아니라, 항체 단편, 예를 들면, scFv 또는 Fab 단편일 수 있다. 항원 결합 단편은 당업계에 잘 알려져 있다. 바람직하게, scFv 항체가 사용된다.

중쇄 및 경쇄는 주로 항원 결합에 관여하는 3개의 CDR인, CDR1, CDR2 및 CDR3을 각각이 포함하는 것인 프레임워크 서열로 구성된다. 본 발명의 항체는 H3형 VH 도메인 및 람다1형 VL 도메인을 포함한다.

본 발명의 VH 및 VL 프레임워크는 세포내 환원 환경하에서 기능적이도록 안정적이고 가용성이다. 바람직하게는 "품질 관리 시스템(Quality control system)" (문헌 ([Auf der Maur et al., 2001]; [Auf der Maur et al. 2004]))으로서 지칭되는 효모 스크리닝 시스템에 의해 앞서 단리된 프레임워크 4.4이다. 프레임워크 서열은 예를 들면, 서열 번호: 20 (하기 참조)(여기서, 프레임워크 부분은 밑줄이 그 어져 있지 않은 곧은체로 표시되어 있는 반면, CDR 서열은 밑줄로 되어 있고, 링커는 이탤릭체로 표시되어 있다)으로부터 추론될 수 있다.

본 발명의 항체는 서열 번호: 1의 서열과 75% 이상, 바람직하게 80%, 85%, 90%, 95% 이상, 또는 가장 바람직하게 100% 동일한 서열의 16-아미노산 ALK 에피토프 펩티드에 결합할 수 있다. 이러한 서열 또한 PTN 결합 부위로 지칭되고, 전체 인간 게놈에서 독특한 서열이다. 상응하는 마우스 서열은 16개의 아미노산 중 2개가 상이한데, 즉, 각각 I 또는 D 대신 3번 위치는 V이고, 7번 위치는 A이다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 인간 ALK에는 결합하지만, 마우스 ALK에는 결합하지 않고, 즉, 인간 단백질에 대해 특이성이다. 약 잔기 391-406을 포함하거나, 이들 잔기로 구성된 ALK 에피토프는, ALK에 특이적으로 결합하여 ALK-매개 활성을 차단하거나 저해할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편을 선별하는데 있어 유일하게 적합한 것이다. 이러한 에피토프는 또한 ALK 활성을 특이적으로 차단하는 항체를 스크리닝하거나 상승시키는데 적합한다. 그러나, 이러한 에피토프, 특히, 약 잔기 391-406을 포함하거나, 이들 잔기로 구성된 에피토프는 본원에서 추가로 기술되는 것과 같은 능동 면역요법제 또는 백신으로서 사용하기에 유일하게 적합한 것이다.

본 발명의 항체는 30 nM 이하, 바람직하게, 10 nM 이하, 가장 바람직하게, 3 nM 미만의 K_d로 ALK 에피토프 펩티드에 대한 친화도를 갖는다.

본 발명의 또다른 실시태양에서, 항체는 서열 번호: 3의 서열과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열의 가변 경쇄 CDR3을 포함한다. 바람직하게, 서열 동일성 은 60%, 70%, 80%, 85% 이상, 더욱 바람직하게, 90% 이상이다. 가장 바람직하게, CDR3은 서열 번호: 3과 동일하다. 또한, 이러한 항체는 서열 번호: 1의 서열과 75% 이상, 바람직하게 80%, 85%, 90%, 95% 이상, 또는 가장 바람직하게 100%의 아미노산 동일성을 갖는 서열의 16-아미노산 ALK 에피토프 펩티드에 결합한다. 또한, 항체는 10 nM 미만, 바람직하게, 7 nM 미만의 K_d로 ALK 에피토프 펩티드에 대한 친화도를 갖는다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 항체는 서열 번호: 4의 VH 서열 및 서열 번호: 5의 VL 서열을 포함한다. 추가로, CDR 중 1개 이상에서 1개 이상의 돌연변이를 포함함으로써 약 3 nM 미만의 K_d를 특징으로 하는 보다 고도의 친화도를 얻을 수 있다. 상기 1개 이상의 돌연변이는 바람직하게, VH 및/또는 VL의 CDR1 또는 CDR2, 가장 바람직하게는 VH의 CDR2에 존재한다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시태양에서, 항체는 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 또는 서열 번호: 13의 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 가변 중쇄 CDR2를 포함한다. 바람직하게, 이들 정의된 CDR2 서열은 아미노산 잔기 AI에 후행하고, 서열 번호: 17의 서열에 선행함으로써 전체 CDR2가 정의되어 진다.

본 발명의 바람직한 항체는 서열 번호: 4의 VH 서열 및 서열 번호: 5의 VL 서열을 포함한다. scFv 항체에서, 도메인 구조는 NH₂-VL-링커-VH-COOH 또는 NH₂-VH-링커-VL-COOH일 수 있고, 바람직하게, 링커는 서열 번호: 16의 서열을 갖는다. 별법으로, 서열 번호: 4 및 5로 표시되는 가변 영역을 전장의 항체, 예컨대, IgG 또는 IgM으로 공학처리할 수 있다. 본 발명의 가변 영역과 조합하는데 적합한 불변 영역은 당업계에 공지되어 있다.

약제로서 또는 진단용 도구로서의 항체 또는 항체 유도체의 용도가 본 발명의 범주내 포함된다. 바람직하게, 암 또는 종양 치료용 약제의 생산이 고려된다. 이러한 목적을 위해, 항체는 방사선핵종 또는 방사선금속 표지를 사용하여 방사선표지될 수 있다. 이는 특히 종양 표적, 영상화, 생체분포 연구에 가치가 있다. 또한, 재조합 DNA 기술을 통해 가변 V 유전자의 코딩 영역을 변형된 독소 도메인에 유전적으로 융합시킬 수 있다. 예를 들면, scFv가 종양 마커 단백질에 대하여 특이적인 scFv-독소 융합물은 종양으로 독소를 표적화시킬 수 있는데, 여기서, 독소는 세포 독성을 일으킨다. 그러한 표적화된 요법은 종양에 세포독성제 또는 방사선핵종을 선택적으로 농축시킬 수 있어, 정상 조직에 대한 독성을 감소시킬 것이다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시태양에서, 항체는 암 또는 종양, 바람직하게 신경모세포종, 아교모세포종, 횡문근육종, 유방암종, 흑색종, 췌장암, B-세포 비호지킨 림프종, 갑상선암종, 소세포 폐암종, 망막모세포종, 유잉 육종, 전립선암, 결장암, 또는 췌장암, 바람직하게 아교모세포종, 신경모세포종 및 횡문근육종 치료를 위해 사용된다. ALK 발현 및 단백질은 다수의 연성 조직 종양에서 검출되었다 (문헌 [Li et al., 2004]). 전장의 ALK는 이들 인간 종양에서 발견되었다. 추가로, 항체는 바람직하게 국소 치료를 위해 사용된다. 아교모세포종의 국소 치료가 가장 바람직하다.

본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA 서열을 제공한다. ESBA512(서열 번호: 19)에 적합한 원핵생물 발현 벡터는 pTFT74이다 (ESBA512 코딩 서열을 포함하는 서열에 대해 서열 번호: 90 참조). 여기서, ESBA512 코딩 서열은 T7-프로모터의 제어하에 있고, 재조합 유전자 산물은 보통 봉입체상에서 정제된다. 또다른 바람직한 원핵생물 발현 벡터는, 간소화된 정제를 위해 ESBA512 서열이 his-태깅된 pAK400이다 (ESBA512 코딩 서열을 포함하는 서열에 대해 서열 번호: 89 참조). 유전자 산물은 숙주 세포에 의해 원형질내로 분비된다.

추가로, 상기 DMA 서열을 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 적합한 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게, 상기 숙주 세포는 E. 콜라이 세포이다.

본 발명의 추가의 또다른 측면은 항체가 합성될 수 있는 조건하에서 항체에 대한 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 항체를 상기 배양물로부터 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 항체 생산 방법이다.

본 발명의 추가의 또다른 측면은 서열 번호: 1의 잔기 391-406을 포함하거나, 본질적으로 그로 구성된 ALK 에피토프를 제공하는 것이다. 상기 에피토프는 항-ALK 항체 또는 그의 단편을 동정, 스크리닝, 또는 상승시키는데 적합하다. 바람직하게, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 단리된 ALK 단백질 또는 그의 단편의 잔기 391-406 (서열 번호: 1)에 특이적으로 결합할 수 있다. 더욱 바람직하게, 항체는 단일 쇄 항체(scFv), Fab 단편, IgG, 또는 IgM이다.

추가의 측면에서, 단리된 ALK 단백질 또는 그의 단편, 또는 ALK의 에피토프를 코딩하는 핵산을 포함하는 ALK 백신을 제공한다. 바람직하게, 백신은 단리된 ALK 단백질의 잔기 391-406을 포함한다. 상기 백신은 바람직하게 면역 반응을 증진시키기 위하여 담체, 애주번트, 및/또는 합텐과 함께 제제화된다.

본 발명의 서열은 하기의 것이다:

서열 번호: 1: GRIGRPDNPFRVALEY

인간 ALK 에피토프 펩티드 (ALK 단백질의 아미노산 391-406); 밑줄로 표시된 잔기는 마우스 상동체에서 상이하다.

서열 번호: 2: RDAWLDVLSDGFDY

VH의 ESBA521 CDR 3. 무작위화시킨 후 수득된 잔기를 밑줄로 표시한다.

서열 번호: 3: ATWDNDKWGVV

VL의 ESBA521 CDR 3. 무작위화시킨 후 수득된 잔기를 밑줄로 표시한다.

서열 번호: 4:

ESBA521 VH. CDR을 밑줄로 표시한다.

서열 번호: 5:

ESBA521 VL. CDR을 밑줄로 표시한다.

서열 번호: 6:

AISGSGGSTYYADSVKG

ESBA521의 VH CDR 2

서열 번호: 7:

AINMKGNDRYYADSVGK

scFv 265.1의 VH CDR 2

서열 번호: 8:

AIRTNSKEYYADSVKG

scFv 43.2의 VH CDR 2

서열 번호: 9

AIKTDGNHKYYADSVKG

scFv 100.2의 VH CDR 2

서열 번호: 10:

RTDSKEQYYADSVKG

scFv 2.11의 VH CDR 2

서열 번호: 11:

ETSSGSTYYADSVKG

scFv 28.11의 VH CDR 2

서열 번호: 12:

NTGGGSTYYADSVKG

scFv 33.11의 VH CDR 2

서열 번호: 13:

NTRGQNEYYADSVKG

scFv 4.12의 VH CDR 2

서열 번호: 16

GGGGSGGGGSGGGGSSGGGS

VL 및 VH를 연결하는 링커

서열 번호: 17

YYADSVKG

ESBA521 및 그의 유도체의 CDR2의 C-말단의 절반

서열 번호: 18

DAGIAVAGTGFDY

FW4.4의 VH CDR3

서열 번호: 19

scFv ESBA521, CDR은 밑줄로 표시하고, 링커는 이탤릭체로 표시한다.

서열 번호: 20

FW4.4, CDR은 밑줄로 표시하고, 링커는 이탤릭체로 표시한다.

서열 번호: 21

ESBA521 VL의 핵산 서열

CDR은 밑줄로 표시한다.

서열 번호: 22

ESBA521 VH의 핵산 서열

CDR은 밑줄로 표시한다.

서열 번호: 23

ESBA521의 핵산 서열

CDR은 밑줄로 표시하고, 링커는 이탤릭체로 표시한다.

이에 본 발명은 실시예에 의해 추가로 기술된다:

재료 및 방법

일반적으로, 달리 명시하지 않는 한, 본 발명의 실시는 종래의 화학, 분자 생물학 기법, 재조합 DNA 기술, 면역학 기술 (특히, 예컨대, 항체 기술), 및 폴리펩티드 제조시의 표준 기법을 사용한다. 예컨대, 문헌 ([Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]; [Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996)]; [Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., IrI Pr (1996)]; [Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C. S. H. L. Press, Pub. (1999)]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992)])을 참조한다.

실험예 1: Alk-결합 scFv를 동정하는 스크리닝

항체-항원 상호작용에 관한 수많은 구조 연구에서, 중쇄의 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3)이 일반적으로 항원에 대하여 가장 많은 접촉에 기여하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 ([Chothia and Lesk, 1987]; [Chothia et al., 1985]; [Padlan, 1994])). 본 발명자들은 무작위화된 합성 CDR-H3 서열의 scFv 라이브러리 4개를 스크리닝하여 항원-결합 scFv를 직접 단리시키기 위해 본인들이 최근에 기술한 효소 2-하이브리드 항원-항체 상호작용 스크리닝 기술을 적용하였다 (문헌 [Auf der Maur et al., 2002]). 상기 4개의 라이브러리는, 가변 중쇄의 세번째 루프(VH-CDR3)내에 있는 7개의 아미노산이 무작위화된, 4개의 상이한 안정적인 인간 scFv 프레임워크에 기초한 것이다. 무작위화된 부분을 표준 PCR 클로닝 기법에 의해 도입하였다. scFv 라이브러리를 "품질 관리" (문헌 ([Auf der Maur et al., 2001]; [Auf der Maur et al., 2004]))로 불리는 효모 스크리닝 시스템에 의해 인간 티로신 수용체 키나제 역형성 림프종 키나제(ALK)의 세포외 도메인으로부터 유래된 16 아미노산 펩티드에 대하여 스크리닝하였다. 간략하면, 품질 관리 기술은 천연 인간 가변-경쇄(VL) 및 가변-중쇄(VH) 풀로부터 바람직한 생물리학적 성질, 예로서, 안정성, 용 해도 및 발현율을 갖는 VL 및 VH 조합물을 동정하기 위한 항원-비의존 세포내항체(intrabody) 선별 시스템이다. 1회차 스크리닝 이후에 4개의 scFv 라이브러리 중 1개로부터 유망하며 특이적인 결합체 하나를 단리시켰다. 이러한 특정 scFv는 프레임워크 FW4.4 라이브러리로부터 유래하였다. FW4.4 (서열 번호: 20)는 전통적 가요성 글리신-세린 링커 (GGGGS)₄에 의해서 VH3 도메인에 연결된 VL 도메인 (람다1)으로 구성된다. FW4.4의 VH CDR3은 13개의 아미노산 (DAGIAVAGTGFDY; 서열 번호: 18)을 포함한다. 라이브러리를 작제하기 위해 변성된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 표준 PCR-클로닝 방법에 의해 VH CDR3 (DAXXXXXXXGFDY)의 중심부를 무작위화하였다. 마지막 2개의 잔기 (Asp 및 Tyr)는 많은 사례에서 그의 구조가 중요하다고 입증되었기 때문에 (문헌 [Chothia and Lesk, 1987]) 고정시켰다. 나머지 잔기들은 라이브러리의 복잡성을 다루기 쉬운 크기로 유지시키기 위하여 변형시키지 않았다. scFv 라이브러리를 Gal4의 전사 활성 도메인에 대한 C-말단 융합물로서 효모 발현 벡터 (pLib1)에 클로닝하였다 (문헌 [Auf der Maur et al., 2002]).

인간 Alk의 리간드-결합 도메인(LBD)를 상호작용 스크린에 대한 항원으로서 선택하였다 (문헌 [Stoica et al., 2001]). 이러한 16 아미노산 펩티드를 DNA-결합 단백질 LexA에 대한 C-말단 융합물로서 또다른 발현 벡터 (pBait1)내로 클로닝하였다.

6개의 LexA-결합 부위의 제어하에 안정적으로 통합된 리포터 유전자 HIS3 및 lacZ를 함유하는 리포터 효모 균주 YDE173 (문헌 [Auf der Maur et al., 2002])을, Gal4 활성화 도메인에 융합된 무작위 CDR-H3 scFv 라이브러리와 함께 LexA에 융합된 Alk LBD를 발현하는 bait 벡터로 형질전환시켰다. 히스티딘은 결여되어 있고, HIS3 유전자 산물의 경쟁적 저해제인 2.5 mM 3-아미노-트리아졸(3-AT)을 함유하는 플레이트상에서 형질전환된 세포를 선별하였다. 성장한 콜로니를 6일간에 걸쳐 채취하고, 라이브러리 플라스미드를 단리시켰다. 항원-의존 유전자 활성화를 확인하기 위하여 동일한 리포터 균주를 구제된 플라스미드로 형질전환시켰다. 정량적 액체 β-갈락토시다제 분석법을 실시하여 Alk LBD, 즉, 16 아미노산 ALK 펩티드와 선별된 scFv 사이의 결합-강도를 측정하였다. 리포터 유전자 활성화가 가장 높은 scFv는 또한 ELISA에서 Alk LBD 펩티드에 대해 최대 친화도 (~31 nM)를 나타내었다 (데이타를 나타내지 않음).

ALK 결합에 기여하는 것으로 동정된 기타 VH CDR3의 서열을 하기 표 1a에 제공한다.

기타 적합한 프레임워크의 서열을 하기 표 1b에 제공한다.

실험예 2: 친화도 성숙

더 높은 친화도를 갖는 scFv를 수득하기 위해 효모에서 돌연변이유발법 및 2회차 스크리닝에 의해 상기 1차 결합체를 추가의 친화도 성숙 과정을 거치도록 하였다. 친화도 성숙을 가능하게 하면서, 1차 결합체와 Alk LBD 펩티드의 상호작용에 의해 구동되는 리포터 유전자 활성화를 감소시키기 위해 LexA Alk LBD 펩티드 융합 단백질의 발현 수준을 감소시켰다. pBait1 벡터상의 강한 액틴 프로모터를, 말단 절단됨으로써 활성은 보다 적은 버전의 ADH 프로모터 (알코올 탈수소효소)로 교환하여 pBait3을 생성하였다. 이와 같이 1차 결합체의 존재하에서 bait 발현 수준을 감소시키는 것이, 히스티딘은 결여되어 있고 5 mM 3-AT를 함유하는 플레이트상에서 성장을 저해시키는데 충분하였다. 친화도 성숙을 위한 1차 결합체의 돌연변이유발법은 가변 경쇄내의 CDR3 부분을 무작위화시킴으로써 달성되었다. 이는 상동성 재조합에 의해 효모에서 직접 실시하였다 (문헌 [Schaerer-Brodbeck and Barberis, 2004]). FW4.4의 VL CDR3은 11개의 아미노산 (서열 번호: 14: GTWDSSLSGVV)을 포함한다. 처음에 위치하는 것 2개를, 첫번째에 위치하는 것은 Gly, Ala 또는 Gln을 코딩하도록, 그리고, 두번째에 위치하는 것은 Thr, Ser 또는 Ala를 코딩하도록 부분적으로 무작위화시켰다. VL CDR3내의 5번 위치 내지 8번 위치에서는 모든 아미노산 잔기를 허용하였다. 남아있는 위치는 고정시켰다. 무작위화는 PCR에 의해 도입시켰다. 생성된 PCR 산물의 크기는 356 bp였고, 이는 프레임워크 서열 상류의 267 bp 및 하류의 27 bp와 함께 무작위화된 CDR 카세트를 포함하였다. 이러한 산물은 소위 공여체 PCR 단편이며, 이는 표적 벡터와 상동성을 갖는다. 표적 벡터는 Gal4의 활성화 도메인에 융합된 1차 결합체를 코딩하는 효모 플라스미드 (pLib1)이다. 상동성 재조합의 효율을 개선시키고, 이후 스크리닝에서 위양성(false positives)을 제거시키기 위하여 표적 벡터내 CDR-L3을 약간 변형시켰다. 독특한 SacI 제한 부위를 VL CDR3 중간 위치에 도입시킴으로써 융합 단백질의 scFv 코딩 부분에 프레임쉬프트를 일으켜 Alk LBD에 결합할 수 없는 말단 절단된 단백질을 수득하였다. 추가로, SacI 부위는 표적 벡터를 선형화할 수 있어 효모에서 재조합 효율을 증진시킨다.

말단 절단된 ADH 프로모터로부터 LexA Alk LBD를 발현하는 플라스미드 (pBait3)를 사용하여 리포터 효모 균주 YDE173을 전(pre)-형질전환시킴으로써 스크리닝에 착수하였다. 이러한 전-형질전환된 효모 세포를 능력이 있는 것으로 만들고, 선형화된 표적 벡터와, VL CDR3의 상류 및 하류에 상동성을 갖는 공여체 PCR 단편으로 공-형질전환시켰다. PCR 산물 및 표적 벡터 사이의 상동성 재조합시, 신규한 VL CDR3 서열은 표적 벡터의 상응하는 부위로 통합된다. 이러한 이벤트의 최종 결과로서 최소 VL CDR3이 무작위화된 VL CDR3으로 교환된다. 이를 통해 신규한 VL CDR3 서열을 갖는 전체적으로 기능성인 융합 단백질을 발현하는 환형 플라스미드를 재구성할 수 있는데, 이는 리포터 유전자 발현을 활성화시킬 것이며, Alk LBD 펩티드와의 상호작용시 선별 플레이트상에서 성장할 수 있을 것이다.

6일간의 관찰 기간에 걸쳐 총 119개의 클론을 선별 플레이트상에서 배양하였다. 이들 클론을 채취하고, 라이브러리 플라스미드를 단리시키고, 동일한 리포터 효모 균주로 재형질전환시켰다. Alk LBD (항원)와 친화도-성숙된 scFv 사이의 결합 강도를 측정하기 위하여 정량적 액체 β-갈락토시다제 분석법을 실시하였다. lacZ 활성화가 가장 높은 20개의 클론도 Alk LBD 펩티드를 사용하여 ELISA에서 시험하였다. 최적의 후보 물질은 약 7 nM의 K_D를 나타내었고 (도 3), 이를 ESBA521로 명명하였다.

ALK 결합에 기여하는 것으로 동정된 기타 VL CDR3 서열의 서열을 하기 표 1c에 제공한다.

실험예 3: scFv ESBA521은 인간 ALK의 막횡단 형태에 특이적으로 결합한다.

새로 동정된 scFv는 또한 살아있는 세포의 표면상에 있는 막횡단 인간 ALK 단백질을 인식할 수 있는지 여부를 시험하기 위하여 일시적으로 형질감염된 HELA 세포의 면역염색 실험을 실시하였다. ESBA521은 다중클론 항체와 유사한 방식으로 ALK 단백질과 반응한다 (도 4). 대조군 실험에서, 프레임워크 4.4 scFv는 인간 ALK와는 반응하지 않는 것으로 나타났다. 놀랍게도, ESBA521은 오직 인간 Alk 단백질과만 결합하고, 비록 마우스 항원 펩티드가 인간 펩티드 서열과 2개의 아미노산 위치에서만 상이할지라도 상응하는 마우스 단백질과는 결합하지 않는다. 대조적으로, 다중클론 ALK 항체는 인간 및 마우스 단백질, 둘 모두를 인식한다. 그러므로, ESBA521의 결합은 세포 표면에 있는 인간 ALK 단백질에 대해 특이적인 것이다.

실험예 4: VH CDR 2의 PCR 돌연변이유발에 의해 개선된 결합체의 단리

항원 결합을 추가로 개선시키기 위하여 1회차 친화도 성숙에 대해 기술된 것과 동일하되, 이 경우에는 VH의 CDR2가 PCR 돌연변이유발법에 의해 변경되고 효모 수혜자로 형질전환되는 것을 예외로 하며, 여기서, CDR2에서의 상동성 재조합은 유사한 방식으로 실시되는 2-하이브리드 접근법을 사용하는 추가 회차의 친화도 성숙에서 ESBA521를 출발 scFv로서 사용하였다. 또한, 표적 플라스미드를 선형화시킬 수 있도록 하기 위해 제한 부위를 CDR2에 도입시켰다. CDR2에 도입된 돌연변이는 표 2에 제공한다.

상기 방법 후에 수득한 단리된 scFv 중 7개가 2-3 nM 범위의 K_d로 현저히 개선된 친화도를 가지며 (도 5), 그중 최고는 28.11인 것으로 밝혀졌다.

실험예 5: 항-ALK 항체의 투여시 종양-성장 방지

플레이오트로핀에 결합하는 것으로 공지되어 있는 아미노산 (396-406) (문헌 [Stoica 2001])을 포함하는 ALK의 아미노산 391-406에 결합하는 항체 ESBA521 전구체를 선별하였다. ESBA521의 전구체의 CDR에서 추가의 아미노산을 무작위화시킴으로써, 그리고 그의 ALK 세포외 도메인(ECD)의 자연적 환경하에 함유되어 있는 391-406 아미노산 스트레치에 결합하는 결합체에 대해 선별함으로써 ESBA521을 수득하였다. 이러한 절차를 걸쳐 PTN과 결합하는 동일 부위에서 고친화도로 ALK ECD와 결합하는 항체를 수득하였다. 본 발명자들이 알고 있는 바로는 상기가 ALK의 PTN 결합 부위를 특이적으로 표적하는 최초의 단일클론 항체이다. 따라서, ESBA521이 ALK ECD에 대해 고도의 친화도를 지니므로, ALK 수용체와의 결합에 대하여 플레이오트로핀(PTN) 및 미드카인(MK)과 효율적으로 경쟁할 것으로 예측되며, 이로써, ESBA521 항체는 ALK 단백질에 결합하는 MK 및 PTN 리간드, 둘 모두를 저해시키는데 적합하다.

ALK 및 그의 리간드가 신생물, 종양 침윤 및 혈관형성에 관여하기 때문에 ALK와 그의 동족체 리간드 사이의 상호작용을 저해하는 것은 ALK-매개 종양형성을 중단시킨다.

특정 종양에 대한 ESBA521의 효과는 하기 기술하는 2개의 분석법에 의해 측정할 수 있다.

제1 분석법에서는 ALK의 암 성장 속도-제한 역할을 측정하기 위해 이종이식편 실험을 준비한다 (문헌 [Powers 2002]). 간략하면, 2000만개의 세포의 U87MG 세포 현탁액/ml 배지(10% 우태아 혈청으로 보충)를 제조한다. 이를 NU/NU 마우스에 주사하고, 생성된 종양을 측정한다. 시험 항체, 바람직하게, 전장의 항체, 더욱 바람직하게, 페길화된 항체를 도입하고, 종양 성장을 평가한다.

이에 본 발명의 바람직한 실시태양을 제시하고 기술하였지만, 본 발명이 그로 제한되는 것은 아니며, 다르게는 하기 청구의 범위의 범주내에서 다양하게 구현되고 실시될 수 있다는 것을 명백하게 이해하여야 한다.

참고 문헌

SEQUENCE LISTING <110> ESBATech AG <120> Antibodies binding to the extracellular domain of the Receptor Tyrosine Kinase ALK <130> P100661PC <150> US 60/795,831 <151> 2006-04-28 <160> 91 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Arg Ile Gly Arg Pro Asp Asn Pro Phe Arg Val Ala Leu Glu Tyr 1 5 10 15 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the heavy chain variable region of ESBA512 <400> 2 Arg Asp Ala Trp Leu Asp Val Leu Ser Asp Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of ESBA512 <400> 3 Ala Thr Trp Asp Asn Asp Lys Trp Gly Val Val 1 5 10 <210> 4 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain variable region of ESBA512 <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ala Trp Leu Asp Val Leu Ser Asp Gly Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Light chain variable region of ESBA512 <400> 5 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asp Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Gln Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asn Asp Lys 85 90 95 Trp Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Leu Gly 100 105 110 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of ESBA512 <400> 6 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 265.1 <400> 7 Ala Ile Asn Met Lys Gly Asn Asp Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gly 1 5 10 15 Lys <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 43.2 <400> 8 Ala Ile Arg Thr Asn Ser Lys Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 100.2 <400> 9 Ala Ile Lys Thr Asp Gly Asn His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of scFv 2.11 <400> 10 Arg Thr Asp Ser Lys Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 28.11 <400> 11 Glu Thr Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 33.11 <400> 12 Asn Thr Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 4.12 <400> 13 Asn Thr Arg Gly Gln Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of framework 4.4 <400> 14 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly Val Val 1 5 10 <210> 15 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> sequence of framework 5.2 <400> 15 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Leu Thr His Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Thr Ser Lys Arg Ala Thr Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asn Ser Trp Pro His 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Ala Gln Pro Gly 130 135 140 Gly Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser 145 150 155 160 Tyr Ala Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 165 170 175 Val Ala Val Ile Ser Asn Asp Gly Arg Ile Glu His Tyr Ala Asp Ala 180 185 190 Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Val 195 200 205 Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr 210 215 220 Cys Ala Arg Glu Ile Gly Ala Thr Gly Tyr Leu Asp Asn Trp Gly Gln 225 230 235 240 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker connecting VH and VL in ESBA512 <400> 16 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C-terminal half of CDR2 of ESBA521 and its derivatives. <400> 17 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the heavy chain variable sequence of framework 4.4 <400> 18 Asp Ala Gly Ile Ala Val Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Single chain antibody fragment ESBA512 <400> 19 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asp Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Gln Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asn Asp Lys 85 90 95 Trp Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Leu Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 130 135 140 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 145 150 155 160 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 165 170 175 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 180 185 190 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 195 200 205 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Trp Leu Asp Val Leu Ser Asp Gly Phe 225 230 235 240 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 20 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> scFv serving as framework <400> 20 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asp Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Gln Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 130 135 140 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 145 150 155 160 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 165 170 175 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 180 185 190 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 195 200 205 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Gly Ile Ala Val Ala Gly Thr Gly Phe 225 230 235 240 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 21 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Light chain variable region of ESBA512 <400> 21 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctccg gaagcacctc caacattggc gataattatg tatcctggta ccaacaactc 120 ccaggaacag ccccccaact cctcatttat gacaatacta aacgaccctc agggattcct 180 gaccggttct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgcg acctgggata atgataagtg gggtgtggtt 300 ttcggcggag ggaccaagct cgaggtccta ggt 333 <210> 22 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Variable region of the heavy chain of ESBA512 <400> 22 gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgcgc gcgtgatgcg 300 tggttggatg tgctttcgga tggctttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctcg 366 <210> 23 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> single chain antibody <400> 23 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctccg gaagcacctc caacattggc gataattatg tatcctggta ccaacaactc 120 ccaggaacag ccccccaact cctcatttat gacaatacta aacgaccctc agggattcct 180 gaccggttct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgcg acctgggata atgataagtg gggtgtggtt 300 ttcggcggag ggaccaagct cgaggtccta ggtggtggtg gtggttctgg tggtggtggt 360 tctggcggcg gcggctccag tggtggtgga tccgaggtgc agctggtgga gtccggggga 420 ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttt 480 agcagctatg ccatgagctg ggtccgccag gctccaggga aggggctgga gtgggtctca 540 gctattagtg gtagtggtgg tagcacatac tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc 600 atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag 660 gacacggccg tatattactg cgcgcgtgat gcgtggttgg atgtgctttc ggatggcttt 720 gactactggg gccagggaac cctggtcacc gtctcctcg 759 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the variable region of the heavy chain of framework 4.4 <400> 24 Asp Ala Gly Ile Ala Val Ala Gly Thr Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the variable region of the heavy chain of H5 SH 2.1 <400> 25 Asp Ala Lys Phe Met Ser Asp Gly Ile Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the variable region of the heavy chain of H5 SH 4.1 <400> 26 Asp Ala Trp Gly Trp Thr Ile Leu Ser Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the variable region of the heavy chain of H5 SH 5.1 <400> 27 Asp Ala Ala Tyr Met Ile Arg Tyr Glu Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the variable region of the heavy chain of H5 SH 2.3 <400> 28 Asp Ala Trp Ile Tyr Trp Ala Arg Glu Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the variable region of the heavy chain of H5 SH 3.3 <400> 29 Asp Ala Cys Met Thr Tyr Ser Arg Glu Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the variable region of the heavy chain of H5 SH 5.3 <400> 30 Asp Ala Trp Leu Asp Val Leu Ser Asp Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the variable region of the heavy chain of H5 SH 14.3 <400> 31 Asp Ala Pro Ser Val Asn Asp Arg Glu Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of WT FW4.4 <400> 32 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly Val Val 1 5 10 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-9.1 <400> 33 Ala Ala Trp Asp Ser Val Lys His Gly Val Val 1 5 10 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-21.1 <400> 34 Ala Ala Trp Asp Asn Ser Met Arg Gly Val Val 1 5 10 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-22.1 <400> 35 Ala Ala Trp Asp Thr Met Arg Tyr Gly Val Val 1 5 10 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-25.1 <400> 36 Ala Ala Trp Asp Thr Thr Arg Val Gly Val Val 1 5 10 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-27.1 <400> 37 Ala Ser Trp Asp Thr Met Leu Lys Gly Val Val 1 5 10 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-28.1 <400> 38 Ala Ser Trp Asp Thr Pro Thr Cys Gly Val Val 1 5 10 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-29.1 <400> 39 Ala Thr Trp Asp Ile Ser Arg Cys Gly Val Val 1 5 10 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-46.1 <400> 40 Ala Thr Trp Asp Thr Val Cys Ala Gly Val Val 1 5 10 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-53.1 <400> 41 Ala Thr Trp Asp Val Asp Val Phe Gly Val Val 1 5 10 <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-57.1 <400> 42 Ala Thr Trp Asp Asp Val Val Gly Gly Val Val 1 5 10 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-86.1 <400> 43 Ala Ala Trp Asp Ser Phe Tyr Asn Gly Val Val 1 5 10 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-94.1 <400> 44 Ala Ser Trp Asp Thr Leu Ile Glu Gly Val Val 1 5 10 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-107.1 <400> 45 Ala Thr Trp Asp Asn Asp Lys Trp Gly Val Val 1 5 10 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-112.1 <400> 46 Ala Ala Trp Asp Ser Thr Thr Cys Gly Val Val 1 5 10 <210> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-113.1 <400> 47 Ala Thr Trp Asp Met Trp Met Lys Gly Val Val 1 5 10 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-117.1 <400> 48 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly Val Val 1 5 10 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-118.1 <400> 49 Ala Ala Trp Asp Trp Val Leu Gly Gly Val Val 1 5 10 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 14.3-6.1 <400> 50 Ala Thr Trp Asp Asn Pro Gly Gln Gly Val Val 1 5 10 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 14.3-7.1 <400> 51 Ala Thr Trp Asp Asp Trp Val Ile Gly Val Val 1 5 10 <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 14.3-8.1 <400> 52 Ala Ser Trp Asp Asp Gln Lys Trp Gly Val Val 1 5 10 <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 14.3-9.1 <400> 53 Ala Thr Trp Asp Thr Asn Arg His Gly Val Val 1 5 10 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 14.3-12.1 <400> 54 Ala Ser Trp Asp Asp Leu His Ile Gly Val Val 1 5 10 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 14.3-13.1 <400> 55 Ala Ser Trp Asp Glu Glu Ala Trp Gly Val Val 1 5 10 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 14.3-21.1 <400> 56 Ala Thr Trp Asp Tyr Ile Lys Ile Gly Val Val 1 5 10 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 14.3-48.1 <400> 57 Ala Thr Trp Asp Thr Phe Glu Arg Gly Val Val 1 5 10 <210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 14.3-49.1 <400> 58 Ala Thr Trp Asp Ser Asn Leu Ile Gly Val Val 1 5 10 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-24.,1 <400> 59 Ala Thr Trp Asp Asn Asn Thr Cys Gly Val Val 1 5 10 <210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-3.1 <400> 60 Ala Ala Trp Asp Cys Asp Ile Asn Gly Val Val 1 5 10 <210> 61 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-8.1 <400> 61 Ala Ser Trp Asp Ser Met Lys Ile Gly Val Val 1 5 10 <210> 62 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 of the light chain variable region of 5.3-19.1 <400> 62 Ala Thr Trp Asp Cys Thr Arg Ala Gly Val Val 1 5 10 <210> 63 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv WT (ESBA521) <400> 63 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 64 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 1.1 <400> 64 Ala Ile Lys Thr Asp Gly Gln Asn Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 65 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 17.1 <400> 65 Ala Ile Arg Ser Asp Gly Asn Glu Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 66 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 35.1 <400> 66 Ala Ile Asn Thr Asn Gly Asn Glu Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 64.1 <400> 67 Ala Ile Ser Thr Asn Gly Lys Glu Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 68 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 130.1 <400> 68 Ala Ile Arg Thr Gln Ser Gln Glu Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 69 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 152.1 <400> 69 Ala Ile Lys Ser Arg Ser Gln Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 70 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 167.1 <400> 70 Ala Ile Lys Ser His Ser Gln Gln Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 71 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 214.1 <400> 71 Ala Ile Asn Ser Glu Gly Gln Gln Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 72 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 225.1 <400> 72 Ala Ile Lys Ser Lys Gly Gln Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 73 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 262.1 <400> 73 Ala Ile Arg Thr Asn Ser Glu Glu Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 265.1 <400> 74 Ala Ile Asn Met Lys Gly Asn Asp Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 75 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 43.2 <400> 75 Ala Ile Arg Thr Asn Ser Lys Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 76 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 70.2 <400> 76 Ala Ile Lys Thr Glu Ser Gln Gln Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 99.2 <400> 77 Ala Ile Asn Ser Asn Gly Lys Gln Asp Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 78 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 100.2 <400> 78 Ala Ile Lys Thr Asp Gly Asn His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 79 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 109.2 <400> 79 Ala Ile Asp Thr Lys Gly Asn Gly Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 80 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 146.2 <400> 80 Ala Ile Arg Ser Asp Ser Ser His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 81 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 173.2 <400> 81 Ala Ile Asn Thr Lys Ser Asn Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 82 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 199.2 <400> 82 Ala Ile Arg Thr Asp Ser Lys Asn Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 2.11 <400> 83 Ala Ile Arg Thr Asp Ser Lys Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 84 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 19.11 <400> 84 Ala Ile Arg Thr Asn Ser Lys Glu Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 85 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 28.11 <400> 85 Ala Ile Glu Thr Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 86 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 33.11 <400> 86 Ala Ile Asn Thr Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 87 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 4.12 <400> 87 Ala Ile Asn Thr Arg Gly Gln Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 88 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable region of the scFv 6.12 <400> 88 Ala Ile Ser Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 89 <211> 2520 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> expression vector pAK400 with the ESBA521 coding sequence <400> 89 acccgacacc atcgaatggc gcaaaacctt tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga 60 gagtcaattc agggtggtga atgtgaaacc agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc 120 cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa 180 aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc ggagctgaat tacattccca accgcgtggc 240 acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct gattggcgtt gccacctcca gtctggccct 300 gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag 360 cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa 420 tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat cattaactat ccgctggatg accaggatgc 480 cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca 540 gacacccatc aacagtatta ttttctccca tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca 600 tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc 660 ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat 720 agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct 780 gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc 840 aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg cgttggtgcg gacatctcgg tagtgggata 900 cgacgatacc gaagacagct catgttatat cccgccgtta accaccatca aacaggattt 960 tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt 1020 gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa 1080 tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt 1140 ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcggt acccgataaa agcggcttcc tgacaggagg 1200 ccgttttgtt ttgcagccca cctcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca 1260 ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa 1320 caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgaat ttctagagaa ggagatatac 1380 atatgaaata cctattgcct acggcagccg ctggattgtt attactcgcg gcccagccgg 1440 ccatggcgga ctacaaagac cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc 1500 caggacagaa ggtcaccatc tcctgctccg gaagcacctc caacattggc gataattatg 1560 tatcctggta ccaacaactc ccaggaacag ccccccaact cctcatttat gacaatacta 1620 aacgaccctc agggattcct gaccggttct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc 1680 tgggcatcac cggactccag actggggacg aggccgatta ttactgcgcg acctgggata 1740 atgataagtg gggtgtggtt ttcggcggag ggaccaagct cgaggtccta ggtggtggtg 1800 gtggttctgg tggtggtggt tctggcggcg gcggctccag tggtggtgga tccgaggtgc 1860 agctggtgga gtccggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga ctctcctgtg 1920 cagcctctgg attcaccttt agcagctatg ccatgagctg ggtccgccag gctccaggga 1980 aggggctgga gtgggtctca gctattagtg gtagtggtgg tagcacatac tacgcagact 2040 ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa 2100 tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatattactg cgcgcgtgat gcgtggttgg 2160 atgtgctttc ggatggcttt gactactggg gccagggaac cctggtcacc gtctcctcgg 2220 cctcgggggc cgatcaccat catcaccatc attagtaagc ttgacctgtg aagtgaaaaa 2280 tggcgcacat tgtgcgacat tttttttgtc tgccgtttac cgctactgcg tcacggatcc 2340 ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac 2400 cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc 2460 cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggc atccctttag ggttccgatt 2520 <210> 90 <211> 3319 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pTFT74 expression vector with ESBA521 coding sequence <400> 90 acccgacacc atcgaaatta atacgactca ctatagggag accacaacgg tttcccgaat 60 tgtgagcgga taacaataga aataattttg tttaacttta agaaggagat atatccatgg 120 cgcagtctgt gctgacgcag ccgccctcag tgtctgcggc cccaggacag aaggtcacca 180 tctcctgctc cggaagcacc tccaacattg gcgataatta tgtatcctgg taccaacaac 240 tcccaggaac agccccccaa ctcctcattt atgacaatac taaacgaccc tcagggattc 300 ctgaccggtt ctctggctcc aagtctggca cgtcagccac cctgggcatc accggactcc 360 agactgggga cgaggccgat tattactgcg cgacctggga taatgataag tggggtgtgg 420 ttttcggcgg agggaccaag ctcgaggtcc taggtggtgg tggtggttct ggtggtggtg 480 gttctggcgg cggcggctcc agtggtggtg gatccgaggt gcagctggtg gagtccgggg 540 gaggcttggt acagcctggg gggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcacct 600 ttagcagcta tgccatgagc tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggtct 660 cagctattag tggtagtggt ggtagcacat actacgcaga ctccgtgaag ggccggttca 720 ccatctccag agacaattcc aagaacacgc tgtatctgca aatgaacagc ctgagagccg 780 aggacacggc cgtatattac tgcgcgcgtg atgcgtggtt ggatgtgctt tcggatggct 840 ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc gtagtaagct tcagtcccgg 900 gcagtggatc cggctgctaa caaagcccga aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct 960 gagcaataac tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg 1020 aaaggaggaa ctatatccgg atcgagatcc ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc 1080 ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc 1140 tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct 1200 aaatcggggc atccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa 1260 acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc 1320 tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact 1380 caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg 1440 gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt 1500 tacaatttca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt 1560 ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata 1620 atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt 1680 tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc 1740 tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat 1800 ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct 1860 atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca 1920 ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg 1980 catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa 2040 cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg 2100 ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga 2160 cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg 2220 cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt 2280 tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg 2340 agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc 2400 ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca 2460 gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc 2520 atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat 2580 cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 2640 agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 2700 ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 2760 accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct 2820 tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 2880 cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 2940 gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 3000 gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 3060 gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 3120 cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 3180 tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 3240 ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 3300 ctggcctttt gctcacatg 3319 <210> 91 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Val Leu Gln Gly Arg Ile Gly Arg Pro Asp Asn Pro Phe Arg Val Ala 1 5 10 15 Leu Glu Tyr Ile Ser Ser 20

Claims

서열 번호: 2의 서열과 50% 이상의 서열 동일성, 바람직하게, 60%, 70%, 75%, 85% 이상, 더욱 바람직하게, 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열의 가변 중쇄 CDR3을 포함하며, 인간 ALK 단백질에 결합하는 항체.
제1항에 있어서, 서열 번호: 2의 서열의 가변 중쇄 CDR3을 포함하는 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 ALK 단백질에 대한 결합이 특이성인 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 단편, scFv 항체 또는 Fab 단편인 항체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, scFv 항체인 항체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, H3 VH 도메인 및 람다1 VL 도메인을 포함하는 항체.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, VH 및 VL 프레임워크가 세포내 환원 환경하에서 기능적이도록 안정적이고 가용성인 항체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임워크 4.4를 포함하는 항체.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 1의 서열과 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열의 16-아미노산 ALK 에피토프 펩티드에 결합하는 항체.
제9항에 있어서, ALK 에피토프 펩티드가 서열 번호: 1의 서열을 갖는 것인 항체.
제9항 또는 제10항에 있어서, ALK 에피토프 펩티드에 대한 친화도가 30 nM 이하, 바람직하게, 10 nM 이하, 가장 바람직하게, 3 nM 미만인 K_d를 특징으로 하는 것인 항체.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 3의 서열과 50% 이상의 서열 동일성, 바람직하게, 60%, 70%, 80%, 85% 이상, 또는 더욱 바람직하게, 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열의 가변 경쇄 CDR3을 포함하는 항체.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 3의 서열의 가변 경 쇄 CDR3을 포함하는 항체.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 1의 서열과 75% 이상, 바람직하게, 100%의 아미노산 동일성을 갖는 서열의 16-아미노산 ALK 에피토프 펩티드에 결합하는 항체.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, ALK 에피토프 펩티드에 대한 친화도가 10 nM 미만, 바람직하게, 7 nM 미만인 K_d로 제시되는 것인 항체.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 4의 VH 서열 및 서열 번호: 5의 VL 서열을 포함하는 항체.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 약 3 nM 미만의 K_d를 특징으로 하는 보다 고도의 친화도를 얻게 되는 CDR 중 1개 이상에서 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 항체.
제17항에 있어서, 돌연변이가 VH 및/또는 VL의 CDR1 또는 CDR2에 존재하는 것인 항체.
제17항에 있어서, 돌연변이 또는 돌연변이들이 VH의 CDR2에 존재하는 것인 항체.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 또는 서열 번호: 13의 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 가변 중쇄 CDR2를 포함하는 항체.
제20항에 있어서, 정의된 CDR2 서열이 아미노산 잔기 AI에 후행하고, 서열 번호: 17의 서열에 선행하는 것인 항체.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열 번호: 14의 VH 서열 및 서열 번호: 15의 VL 서열을 포함하는 것인 항체.
제5항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 구조 NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH를 포함하되, 여기서, 링커는 서열 번호: 16의 서열을 갖는 것인 항체.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 방사선표지되거나 독소-표지된 것인 항체.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 또는 진단용 도구로서의 항체.
암 또는 종양 치료용 약제의 생산을 위한 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체의 용도.
제26항에 있어서, 약제가 ALK에 대한 MK 및/또는 PTN 결합 및/또는 ALK-매개 신호전달을 저해하는데 적합한 것인 용도.
제26항 또는 제27항에 있어서, 약제가 상기 항체를 항암제, 예를 들면, 메토트렉세이트와 함께 조합하여 투여하기에 적합한 조합 약제인 용도.
제26항에 있어서, 치료가 신경모세포종, 아교모세포종, 횡문근육종, 유방암종, 흑색종, 췌장암, B-세포 NHL, 갑상선암종, 소세포 폐암종, 망막모세포종, 유잉 육종, 전립선암, 결장암, 췌장암, 지방종, 지방육종, 섬유육종, 특히, 아교모세포종, 신경모세포종 및 횡문근육종의 치료인 것인 용도.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 DNA 서열.
제30항의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터.
제31항의 발현 벡터로 형질전환된 적합한 숙주 세포, 특히, E. 콜라이(E. coli) 세포.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체가 합성될 수 있는 조건하에서 제32항의 숙주 세포를 배양하고, 항체를 상기 배양물로부터 회수하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체를 생산하는 방법.
단리된 ALK 단백질 또는 그의 단편, 또는 ALK의 에피토프를 코딩하는 핵산을 포함하는 ALK 백신.
제34항에 있어서, 단리된 ALK 단백질의 잔기 391-406을 포함하는 백신.
제34항 또는 제35항에 있어서, ALK 단백질 또는 그의 단편에 대한 면역 반응을 증진시키기 위하여 담체, 애주번트, 및/또는 합텐과 함께 제제화된, 단리된 ALK 단백질의 잔기 391-406으로 구성된 백신.
단리된 ALK 단백질 또는 그의 단편의 아미노산 잔기 391±3 내지 406±3 (서열 번호: 91), 가장 바람직하게, 아미노산 391-406 (서열 번호: 1)에 걸쳐 있는 영역의 잔기에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제37항에 있어서, 항체가 단일 쇄 항체(scFv), Fab 단편, IgG, 또는 IgM인 항체.
아미노산 잔기 391±3 내지 406±3 (서열 번호: 91), 가장 바람직하게 아미노산 391-406 (서열 번호: 1)에 걸쳐 있는 영역의 단편이거나, 상기 영역을 포함하거나, 본질적으로 그로 구성된, 항-ALK 항체 또는 그의 단편을 동정, 스크리닝, 또는 상승시키는데 적합한 ALK 에피토프.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 아미노산 잔기 391±3 내지 406±3 (서열 번호: 91), 가장 바람직하게 아미노산 391-406 (서열 번호: 1)에 걸쳐 있는 영역의 단편이거나, 상기 영역을 포함하거나, 본질적으로 그로 구성된 에피토프에 결합하는 것인 항체.