KR20210094509A - 재조합 점액종 바이러스 및 이의 용도 - Google Patents

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제프 키에페
라몬 모레노
스파이로 무스
에릭 바르티
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무스크 파운데이션 포 리서치 디벨롭먼트
시스템즈 온콜로지, 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 면역 체크포인트 단백질의 가용성 형태를 발현하도록 조작된 재조합 종양 용해성 바이러스를 제공한다. 특정 측면에서, 종양 용해성 바이러스는 점액종 바이러스와 같은 복제 능력이 있는 바이러스이다. 면역 체크포인트 단백질의 가용성 형태를 발현하는 재조합 종양 용해성 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법이 또한 제공된다.

Description

재조합 점액종 바이러스 및 이의 용도
본 출원은 2018년 8월 16일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/718,990호; 2018년 10월 4일에 출원된 제62/741,404호; 2018년 11월 2일에 출원된 제62/754,622호; 및 2019년 3월 4일에 출원된 제62/813,375호의 이익을 주장하고, 이들 각각의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 국립 보건원(National Institute of Health)이 수여하는 보조금 번호 5R01CA194090하에 정부의 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 발명에 대한 특정 권리를 갖고 있다.
1. 분야
본 개시는 일반적으로 분자 생물학 및 의학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 개시는 PD1 또는 TIM3과 같은 면역 체크포인트(immune checkpoint) 단백질을 발현하는 종양 용해성 바이러스에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
다양한 유형의 암을 치료하기 위해 사용되는 현재의 치료법은 암 세포를 중독시키거나 사멸시키는 역할을 하는 경향이 있다. 불행히도, 암 세포에 독성이 있는 치료법은 전형적으로 건강한 세포에도 독성이 있는 경향이 있다. 더욱이, 종양의 이질적인 특성은 암에 대한 효과적인 치료가 여전히 찾기 힘든 주된 이유 중 하나이다. 화학 요법 및 방사선 요법과 같은 현재 주류 요법은 협소한 독성 치료 창 내에서 사용되는 경향이 있다. 이러한 유형의 요법은 다양한 유형의 종양 세포와 이러한 치료법을 투여할 수 있는 제한된 창으로 인해 이용 가능성이 제한된다. 현재 개발되고 있는 최신 항암 요법은 건강한 세포에 대한 독성을 더 적게 하여 건강한 세포를 영향을 받지 않은 상태로 남기면서 종양 세포를 선택적으로 표적화하고자 시도한다.
전이성 흑색종(metastatic melanoma)은 5년 생존율이 16%인 공격적인 질환이며, 대부분의 표준 화학 요법에 불량하게 반응한다. 인터페론 및 인터류킨 2(IL-2)는 모두 흑색종 치료용으로 미국 식품 의약국(FDA)의 승인을 받았다. 둘 다 항종양 면역 반응을 자극함으로써 그들의 이익을 중재한다. 그러나, 독성 및 낮은 반응율로 인해 사용이 크게 제한되었다. 미국 식품 의약국(FDA)에서 승인한 제1 면역 체크포인트 억제제(immune-checkpoint inhibitor)는 세포 독성 T-림프구 항원(CTLA)-4을 차단하고, 결과적으로 2011년 전이성 흑색종을 치료하기 위해 PD-1 경로를 차단하는 완전 인간 면역글로불린 G1 모노클로날 항체인 이필리무맙이었다. 프로그램된 세포사 단백질(programmed cell death protein) 1 리간드 1(PDL1 또는 PD-L1) 및 PDL2가 흑색종 세포, T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포에 의해 발현된다는 발견은 프로그램된 세포사 단백질 1(PD1 또는 PD-1)-특이적 항체(예: 니볼루맙 및 펨브롤리주맙(Pembrolizumab))의 개발로 이어진다.
따라서, PD1 경로 차단은 흑색종을 넘어서 항암 약물 개발에서 주요 초점이되었다. 신장 세포 암종 환자에게 혜택을 주는 것 외에도, 비소 세포 폐암을 포함하여 면역 요법에 민감한 것으로 간주되지 않은 기존 종양 환자에게 이로운 것으로 보고되었다. 그러나, 이러한 면역 요법과 관련된 독성으로 인해 여전히 제한이 있다. 따라서, 고효능과 저독성의 최적의 균형으로 PD1 경로를 차단하기 위해 면역 요법이 필요하다.
암 치료에서 면역 체크포인트 억제는 여러 다른 유형의 암 치료에 효과적인 것으로 나타났다. 그러나, 모든 암 세포가 동일하게 반응하는 것은 아니다. 또한, 독성과 개별적 체크포인트 억제제에 대한 내성 발달이 문제가 된다(참조: Pardoll, 2012; Topalian et al., 2015). 앞서 언급한 단점을 해결하려면 면역 체크포인트 억제제에 대한 개선이 필요하다.
암 치료를 위한 또 다른 유망한 치료 접근법은 종양 용해성 바이러스의 사용이다. 종양 용해성 바이러스 자체 및 다른 요법과 조합된 치료는 직접적인 종양 세포 독성을 유발하고 종양 세포에 대한 면역 세포의 활성화를 강화한다. 종양 용해성 바이러스는 단백질을 발현시켜 그들이 더욱 효과적이도록 하기 위해 '무장'할 수도 있다는 점에서 신규성을 갖고 있다(참조: Kaufman el al., 2015).
최근 연구는 점액종 바이러스를 조작하여 PD1 체크포인트 분자(checkpoint molecule)의 인간 세포외 부분을 발현함으로써 종양 용해성 바이러스와 면역 체크포인트 억제제를 조합하는 효능을 실험적으로 보여주었다(참조: Bartee et al., 2017). PD1은 종양 세포 상의 PDL1에 결합하는 T 세포 상의 막 단백질이다. 이 상호작용은 PD1을 통한 신호전달을 유발하여 종양 세포를 향한 T 세포의 활성화를 억제하여 종양 세포를 면역 세포 제거로부터 보호한다(참조: Pardoll, 2012). 종양 세포의 감염시, 세포외 PD1 단백질(vPD1)을 발현하는 점액종 바이러스의 종양에의 직접 주사를 통해 종양 상의 PDL1과 T-세포 상의 PD1의 상호작용이 국소적으로 억제된다. 이것은 세포외 PD1 단백질이 종양 세포 PDL1에 직접 결합하여 T 세포 PD1이 PDL1에 결합하는 것을 차단하여 T 세포 면역 활성화 및 항종양 효과를 유도함으로써 발생한다.
종양 미세환경에 존재하는 다른 주요 억제 경로는 종양 세포에 의해 발현되는 다양한 TIM3 리간드(GAL9, 포스파티딜 세린 및 HMGB1 포함)가 항종양 T 또는 NK 세포 상의 TIM3에 결합하여 면역 세포 고갈을 초래하는 TIM3 체크포인트이다. 이 경로를 극복하기 위한 현재 방법은 TIM3-GAL9 상호작용을 차단하는 항체의 전신 주사를 포함하지만; 이러한 전신 치료는 비용이 많이 들고, 시간 소모적이며 낮은 반응율과 현저한 독성과 관련이 있다. 따라서, 면역 체크포인트를 억제하는 개선된 방법에 대한 충족되지 않은 요구가 있다.
본 개시의 특정 구현예는 (a) 프로그램된 세포사 단백질 1(PD1 또는 PD-1)의 가용성 형태, 및 임의로 (b) 인터류킨 2(IL-2) 또는 인터류킨 12(IL-12) 또는 인터류킨 15(IL-15)를 인코딩(encoding)하는 하나 이상의 발현 카세트(expression cassette)를 포함하는 재조합 종양 용해성 바이러스(recombinant oncolytic virus)를 포함하는 방법 및 조성물을 제공하고, 여기서 상기 바이러스는 복제 수행능력(replication competent)이 있다. 일부 측면에서, 가용성 PD1은 인간 PD1의 세포외 영역을 포함한다. 특정 측면에서, 인간 PD1의 세포외 영역은 서열번호 4를 포함한다. 일부 측면에서, 인간 PD1의 세포외 영역은 서열번호 4와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 특정 측면에서, 인간 IL-12 서열은 서열번호 7 및 8을 포함한다. 일부 측면에서, 인간 IL-12는 서열번호 7 및 8과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 특정 측면에서, 인간 IL-2 서열은 서열번호 6을 포함한다. 일부 측면에서, 인간 IL-2는 서열번호 6과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 특정의 다른 측면에서, 가용성 PD1에 대한 항-PD1 항체의 억제 결합을 감소시킴으로써 항-PD1 항체와의 병용 요법의 효과를 향상시키기 위해 가용성 PD1의 돌연변이된(mutated) 또는 돌연변이체(mutant) 버전이 제공된다. 특정 측면에서, 돌연변이체 인간 가용성 PD1 서열은 서열번호 5를 포함한다. 일부 측면에서, 인간 PD1의 세포외 영역은 서열번호 5와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
본 개시의 특정 구현예는 PD1의 돌연변이된 가용성 형태를 인코딩하는 발현 카세트를 포함하는 재조합 종양 용해성 바이러스를 포함하는 방법 및 조성물을 제공하며, 여기서 상기 바이러스는 복제 능력이 있다. 일부 측면에서, 돌연변이된 가용성 PD1은 인간 PD1의 세포외 영역을 포함한다. 특정 측면에서, 인간 PD1의 세포외 영역은 서열번호 5를 포함한다. 일부 측면에서, 인간 PD1의 세포외 영역은 서열번호 5와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
특정 측면에서, IL-12는 막관통 도메인(transmembrane domain)에 융합된다. 예를 들어, 일부 측면에서, IL-12는 CD28, CD8a 또는 CD137의 막관통 도메인에 융합될 수 있다. 추가의 측면에서, IL-12는 막 고정 단백질에 결합하는 폴리펩티드에 융합될 수 있다. IL-12와의 융합을 위한 막관통 단백질 및 이를 위한 방법은, 예를 들어, 문헌(Cheng et al. 2008)(본원에 참조로 포함됨)에 제공된다. 일부 특정 측면에서, IL-12는 서열번호 12에 의해 인코딩되는 막관통 도메인에 융합된다. 일부 측면에서, 종양 용해성 바이러스는 서열번호 13과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열에 의해 인코딩된다.
본 개시의 추가의 구현예는 가용성 형태의 T-세포 면역글로불린(immunoglobulin) 및 뮤신-도메인 함유-3(TIM3)을 인코딩하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 재조합 종양 용해성 바이러스를 제공한다. 특정 측면에서, 가용성 TIM3은 뮤린(murine) 또는 인간 TIM3의 세포외 영역을 포함한다.
추가의 구현예에서, (a) GAL9의 과발현(overexpression)에 대해 대상체를 테스트(test)하는 단계; 및 (b) GAL9 발현이 증가된 대상체에게 종양 용해성 바이러스 또는 가용성 형태의 TIM3을 인코딩하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 재조합 종양 용해성 바이러스의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 특정 측면에서, 대상체는 증가된 GAL9 발현을 나타내는 암을 갖는다.
특정 측면에서, 하나 이상의 발현 카세트는 바이러스 프로모터(viral promoter)의 제어하에 있을 수 있다. 일부 측면에서, 바이러스 프로모터는 합성 초기/후기 폭스바이러스(poxvirus) 프로모터이다. 예를 들어, 일부 측면에서, 합성 초기/후기 폭스바이러스 프로모터는 서열번호 20의 서열(AAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATA)과 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일하다.
일부 측면에서, 바이러스는 점액종 바이러스, 레오바이러스, 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease virus), 홍역 바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스, 랍도바이러스(rhapdovirus), 피코르나바이러스, 콕사키바이러스(coxsackievirus) 및 파르보바이러스(parvovirus)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 측면에서, 종양 용해성 바이러스는 점액종 바이러스이다. 일부 측면에서, 가용성 형태의 TIM3 또는 PD1의 세포외 영역, 예를 들어, 돌연변이된 PD1 및/또는 IL-12, 또는 IL-2 발현 카세트(들)는 바이러스 M153R 개방 판독 프레임(open reading frame)에서 점액종 게놈 내에 통합된다. 예를 들어, 일부 측면에서, 세포외 IL-12 발현 작제물이 바이러스 M153R 대신 삽입된다. 추가의 측면에서, PD1(세포외 도메인) 발현 작제물은 바이러스 M135 이후에 또는 바이러스 M135와 M136 사이에 삽입된다. 추가의 측면에서, PD1 및 IL-12 둘 다를 위한 발현 작제물은 바이러스 M153 대신에 또는 바이러스 M135와 M136 사이에 삽입될 수 있다.
추가의 구현예에서, 본원에 제공된 종양 용해성 바이러스의 약제학적 조성물이 제공되며, 상기 약제학적 조성물은 가용성 형태의 PD1, 예를 들어, 돌연변이된 PD1을 인코딩하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 재조합 종양 용해성 바이러스(예: 상기 구현예의 재조합 종양 용해성 바이러스) 및 임의로 IL-12 또는 IL-2를 포함한다. 추가의 측면에서, 재조합 종양 용해성 바이러스는 가용성 형태의 TIM3을 인코딩하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 약제학적 조성물은 가용성 형태의 TIM3 또는 가용성 형태의 PD1, 예를 들어, 돌연변이된 PD1을 인코딩하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 재조합 종양 용해성 바이러스, 및 임의로 IL-12 또는 IL-2를 포함한다.
일부 측면에서, 질환은 전이성 암과 같은 암이다. 특정 측면에서, 암은 프로그램된 사멸-리간드(programmed death-ligand) 1(PDL1)의 증가된 발현을 갖는다. 따라서, 일부 측면에서, 구현예에 따르는 치료를 위한 대상체는 PDL1을 발현하는 암을 갖는 것으로 결정된 대상체이다. 다른 측면에서, 암은 PDL1의 증가된 발현을 갖지 않는다. 예를 들어, 암은 흑색종(melanoma), 신장암(kidney cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 두경부암(head and neck cancer), 뇌암(brain cancer), 백혈병(leukemia), 전립선암(prostate cancer), 방광암(bladder cancer) 및 난소암(ovarian cancer)일 수 있다. 특히, 암은 흑색종이다. 일부 측면에서, 흑색종은 전이성 흑색종이다. 일부 측면에서, 암은 폐로 전이되었다.
특정 측면에서, 종양 용해성 바이러스는 동맥내, 정맥내, 복강내 또는 종양내로 투여된다. 일부 측면에서, 종양 용해성 바이러스는 2회 이상 투여된다.
일부 측면에서, 종양 용해성 바이러스의 투여는 가용성 형태 TIM3 또는 가용성 PD1(예: 돌연변이된 PD1), 예를 들어, 약 20-40kDa, 예를 들어, 약 30kDa의 단백질의 발현을 초래한다. 특정 측면에서, 발현된 가용성 PD1(예: 돌연변이된 PD1)은 글리코실화된다. 특정 측면에서, 가용성 PD1(예: 돌연변이된 PD1)의 발현은 투여 후 장기간, 예를 들어, 투여 후 적어도 3-5일, 특히 적어도 6-14일 동안 지속된다. 특정 측면에서, 가용성 PD1의 발현은 본질적으로 치료되는 대상체의 종양에 국한된다.
특정 측면에서, 종양 용해성 바이러스의 투여는 탈모증(alopecia)을 유발하지 않거나 기껏해야 경미한 수준의 탈모증을 초래한다.
일부 측면에서, 치료 방법은 대상체에게 적어도 제2 항암 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 제2 항암 요법은 재조합 바이러스와 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 예를 들어, 제2 항암 요법은 면역 조절제(immunomodulator)일 수 있다. 다른 측면에서, 제2 항암 요법은 화학 요법, 면역 요법, 방사선 요법, 유전자 요법, 수술, 호르몬 요법, 항혈관신생 요법(anti-angiogenic therapy) 및 사이토카인 요법으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 제2 항암 요법은 T 세포, 예를 들어, CD8+ T 세포(예: CD25+/CD69hiCD8+ T 세포)의 투여를 포함한다. 일부 측면에서, 면역 요법은 면역 체크포인트 억제제 요법이다. 특정 측면에서, 면역 체크포인트 억제제 요법은 PD1, PDL1 또는 CTLA4에 대한 항체를 사용한 치료를 포함한다. 특정 측면에서, 항체는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙 또는 이필리무맙이다. 바람직한 측면에서, 치료 방법은 PD1에 대한 항체를 사용한 치료를 포함한다. 특히 바람직한 측면에서, 치료는 펨브롤리주맙을 사용한 치료를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 (a) PDL1의 과발현에 대해 대상체를 테스트하는 단계; 및 (b) PDL1의 발현이 증가된 대상체에게 가용성 PD1(예: 돌연변이된 PD1)을 인코딩하는 발현 카세트를 포함하는 재조합 종양 용해성 바이러스를 포함하는 본원에 제공된 종양 용해성 바이러스의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 질환은 전이성 암과 같은 암이다. 특정 측면에서, 암은 프로그램된 사멸-리간드 1(PDL1)의 증가된 발현을 갖는다. 다른 측면에서, 암은 PDL1의 증가된 발현을 갖지 않는다. 예를 들어, 암은 흑색종, 신장암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 두경부암, 뇌암, 백혈병, 전립선암, 방광암 및 난소암이다. 특히, 암은 흑색종이다. 일부 측면에서, 흑색종은 전이성 흑색종이다. 일부 측면에서, 암은 폐로 전이되었다.
특정 측면에서, 종양 용해성 바이러스는 동맥내, 정맥내, 복강내 또는 종양내로 투여된다. 일부 측면에서, 종양 용해성 바이러스는 2회 이상 투여된다.
일부 측면에서, 종양 용해성 바이러스의 투여는 가용성 형태의 TIM3 또는 가용성 PD1, 예를 들어, 돌연변이 PD1, 예를 들어, 약 20-40kDa, 예를 들어, 약 30kDa의 단백질의 발현을 초래한다. 특정 측면에서, 발현된 가용성 PD1은 글리코실화된다. 특정 측면에서, 가용성 TIM3 또는 가용성 PD1의 발현은 투여 후 장기간, 예를 들어, 투여 후 적어도 3-5일 동안, 특히 투여 후 적어도 6-14일 동안 지속된다. 특정 측면에서, 가용성 TIM3 또는 PD1의 발현은 본질적으로 치료되는 대상체의 종양에 국한된다. 특정 측면에서, 종양 용해성 바이러스의 투여는 탈모증을 일으키지 않거나 기껏해야 경미한 수준의 탈모증을 초래한다.
일부 측면에서, 치료 방법은 대상체에게 적어도 제2 항암 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 제2 항암 요법은 재조합 바이러스와 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 예를 들어, 제2 항암 요법은 면역 조절제일 수 있다. 다른 측면에서, 제2 항암 요법은 화학 요법, 면역 요법, 방사선 요법, 유전자 요법, 수술, 호르몬 요법, 항혈관신생 요법 또는 사이토카인 요법이다. 일부 측면에서, 제2 항암 요법은 T 세포, 예를 들어, CD8+ T 세포(예: CD25+/CD69hiCD8+ T 세포)의 투여를 포함한다. 일부 측면에서, 면역 요법은 면역 체크포인트 억제제 요법이다. 특정 측면에서, 면역 체크포인트 억제제 요법은 PD1, PDL1 또는 CTLA4에 대한 항체를 사용한 치료를 포함한다. 특정 측면에서, 항체는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙 또는 이필리무맙이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 특정 성분과 관련하여 "본질적으로 없는"은 특정 성분 중 어느 것도 의도적으로 조성물로 제형화되지 않고/않거나 오염물로서만 또는 미량으로 존재함을 의미하기 위해 본원에 사용된다. 따라서, 조성물의 임의의 의도하지 않은 오염으로 인한 특정 성분의 총량은 0.05% 훨씬 미만이다. 가장 바람직한 것은 특정 성분의 양이 표준 분석 방법으로 검출될 수 없는 조성물이다.
본원 명세서에 사용된 바와 같이, 단수형("a" 또는 "an")은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원 청구범위(들)에 사용된 바와 같이, "포함하는"이라는 단어와 함께 사용될 때, 단수형("a" 또는 "an")은 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 대체물만을 지칭하거나 대체물이 상호 배타적인 것으로 명시적으로 지시되지 않는 한 "및/또는"을 의미하기 위해 사용되지만, 본 개시는 대체물 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지지한다. 본원에 사용된 "다른"은 적어도 두 번째 이상을 의미할 수 있다.
본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "약(about)"은 값이 장치에 대한 고유의 오차 변동, 값을 결정하는 데 사용되는 방법 또는 연구 대상체 사이에 존재하는 변동을 포함함을 나타내기 위해 사용된다.
본 개시의 다른 목적, 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 개시의 바람직한 구현예를 나타내면서 단지 예시로서 제공된다는 것을 이해해야 하는데, 이는 본 개시의 사상 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이기 때문이다.
다음의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 개시의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 개시는 본원에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1- 재조합 바이러스 게놈 구조의 개략도.
도 2- 피하 B16F10(B16F10 PD1L-KO) 반대측 이종 이식 모델에서 vPD1-IL2 효능 연구.
도 3- 피하 B16F10(B16F10 PD1L-KO) 반대측 이종 이식 모델에서 vPD1-IL12 효능 연구.
도 4- 피하 B16F10(B16F10 PD1L-KO) 반대측 이종 이식 모델에서 vPD1-IL15 효능 연구.
도 5- 피하 B16F10(B16F10 PD1L-KO) 반대측 이종 이식 모델에서 vPD1-IL18 효능 연구.
도 6- 생체내 SC 반대측 모델. 출발 종양 크기.
도 7- 생체내 SC 반대측 모델. 치료 결과가 제시된다. 연구는 vPD1/IL12 작제물이 테스트된 다른 작제물보다 우수했음을 입증한다.
도 8- PD-1의 엑토도메인에서 C'D 루프(loop)의 서열 정렬. 인간 PD-1(hPD-1)의 2차 구조 요소는 정렬 상단에 표시되고, 뮤린 PD-1(mPD-1)의 구조 요소는 하단에 표시된다.
도 9- 가용성 TIM3 점액종 바이러스를 사용한 요법을 묘사하는 개략도.
도 10: MYXV 요법은 CD8+ T 세포 및 NK 세포에서 TIM3을 유도한다. 바이러스 치료 개시 6일 후 표시된 면역학적 하위집합에 대한 TIM3 발현 분석.
도 11a-11c: TIM3 차단은 흑색종의 MYXV 치료를 개선한다. SQ B16/F10 종양은 지시된 바와 같이 처리되었다. (a) 출발 용적의 퍼센트로서 종양 용적. 가시성 종양의 완전한 박멸은 흰색 원으로 표시된다. (b) 동물의 전체 생존. (c) 동물에서 관찰된 탈모증의 예.
도 12a-12d: vTIM3은 감염된 세포로부터 가용성 TIM3을 분비한다. (a) vGFP 및 vTIM3의 게놈 구조의 개략도. (b) B16/F10 세포에서 새로운 바이러스의 생산. (c) 감염 24시간 후 세포 생존력을 분석하는 MTT 검정. (d) TIM3 도입유전자의 발현.
도 13a-13c: vTIM3은 감소된 독성을 갖는 병용 요법의 효능을 복제한다. (a) 출발 용적의 퍼센트로서 종양 용적. 가시성 종양의 완전한 박멸은 흰색 원으로 표시된다. (b) 동물의 전체 생존. (c) 지시된 요법으로 처리된 동물에서 관찰된 평균 탈모증 점수.
도 14a-14b: TIM3에서 돌연변이 생성. (a) TIM3 도입유전자에 대해 제안된 돌연변이의 개략도. (b) 새로 생성된 재조합 vTIM3 돌연변이체 바이러스로부터 돌연변이된 TIM3의 발현. GAL9 돌연변이체는 글리코실화의 손실로 인해 더 낮은 MW에서 실행된다는 것에 주의한다.
도 15a-15c: (a) 마우스 연구를 묘사하는 개략도. (b) 시간 경과에 따르는 개별 종양 성장. (c) 전체 생존.
도 16a-b: vPD1은 국소화된 종양에 대해서는 유효하지만, 전이성 종양에는 유효하지 않다. 단일(a) 또는 반대측(b) B16/F10 종양이 동계 마우스에서 확립되었다. 이어서, 왼쪽 옆구리의 종양은 대조군 바이러스 (vGFP) 또는 vPD1로 처리되었다. 반대측 모델의 오른쪽 옆구리의 종양은 처리되지 않은 채로 남겨졌다. 이어서, 개별 종양의 반응성과 전체 생존을 모니터링했다.
도 17a-17d: 가용성 PD1 및 IL12를 모두 발현하는 MYXV는 전이성 질환에 대해 매우 효과적이다. (a) 가용성 PD1 및 전염증성 사이토카인을 모두 발현하는 바이러스의 게놈 구조. 반대측 LLC 종양이 동계 마우스에서 확립되었다. 이어서, 왼쪽 옆구리의 종양은 지시된 바와 같이 처리되었고, 오른쪽 옆구리의 종양은 처리되지 않은 채 남겨졌다. 이어서, (b) 개별 종양의 반응성 및 (c) 전체 생존을 모니터링했다. (d) 상기와 같이 처리된 벌키(bulky)한 반대측 LLC 종양을 지닌 마우스의 사진.
도 18a-18c: vPDl/IL12는 전이성 폐암에 효과적이다. (a) 반대측 LLC 종양이 동계 마우스에서 확립되었다. 이어서, 왼쪽 옆구리의 종양은 지시된 바와 같이 처리되었고, 오른쪽 옆구리의 종양은 처리되지 않은 채 남겨졌다. 이어서, (b) 개별 종양의 반응성 및 (c) 전체 생존을 모니터링했다.
도 19a-19c: vPDl/IL12는 전이성 흑색종에 효과적이다. (a) 반대측 B16/F10 종양이 동계 마우스에서 확립되었다. 이어서, 왼쪽 옆구리의 종양은 지시된 바와 같이 처리되었고, 오른쪽 옆구리의 종양은 처리되지 않은 채 남겨졌다. 이어서, (b) 개별 종양의 반응성 및 (c) 전체 생존을 모니터링했다.
도 20a-20c: vPDl/IL12는 자발적 전이성 유방암에 효과적이다. (a) 단일 4T1 종양이 동계 마우스에서 확립되었고, 확립 및 전이되도록 허용되었다. 이어서, 원발성 종양을 지시된 바와 같이 처리했다. 이어서, (b) 개별 종양의 반응성 및 (c) 전체 생존을 모니터링했다.
종양 미세환경에 존재하는 두 가지 주요 억제 경로는 종양 세포에서 발현된 PDL1이 항종양 T 세포 상의 PD1에 결합하여 T 세포 고갈을 초래하는 PD1-PDL1 체크포인트 및 TIM3 체크포인트이다. 이러한 경로를 극복하기 위한 현재의 방법은 PD1-PDL1 또는 TIM3-GAL9 상호작용을 차단하는 항체의 전신 주사를 포함하지만; 이러한 전신 치료는 비용이 많이 들고 시간 소모적이며 낮은 반응율과 현저한 독성과 관련이 있다.
본 개시의 특정 구현예는 암에서 PD1-PDL1 또는 TIM3 경로를 표적화하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 측면에서, IL-2 또는 IL-12와 함께 인간 PD1 단백질 또는 TIM3 단백질의 세포외 부분을 발현하도록 조작된 재조합 종양 용해성 바이러스가 제공된다. 특정 측면에서, 종양 용해성 바이러스는 점액종 바이러스와 같은 복제 능력이 있는 바이러스이다. 특히, PD1 또는 TIM3 및 IL-2 또는 IL-12의 세포외 영역은 복제에 필요하지 않은 바이러스 게놈의 영역으로 통합되는 하나 이상의 발현 카세트에 의해 인코딩될 수 있다. 현재 연구에서, 종양 용해성 바이러스는 종양 용해성 바이러스 요법 동안 결과를 크게 개선할 수 있는 종양 억제를 제공했다.
따라서, 본 개시의 추가의 구현예는 PD1 또는 TIM3의 가용성 형태를 발현하는 재조합 종양 용해성 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공하고, IL-2 또는 IL-12가 또한 제공된다. 따라서, 본 개시의 본 측면은 낮은 독성 및 높은 반응율로 사이토카인 요법과 병용하여 PD1-PDL1 또는 TIM3-GAL9 경로를 표적화하는 요법을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
I. 정의
본원에 사용된 용어 "종양 용해성 바이러스"는 시험관내 또는 생체내에서 암성 또는 과증식성 세포 내에서 선택적으로 복제하고 성장을 늦추거나 사멸을 유도할 수 있는 반면, 정상 세포에는 영향을 미치지 않거나 최소한의 영향을 미치는 바이러스를 지칭한다. 예시적인 종양 용해성 바이러스는 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus; VSV), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus; NDV), 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus; HSV), 레오바이러스(reovirus), 홍역 바이러스(measles virus), 레트로바이러스(retrovirus), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 신비스 바이러스(Sinbis virus), 우두 바이러스(vaccinia virus) 및 아데노바이러스(adenovirus)를 포함한다.
"프로모터"는 전사의 개시 및 속도가 제어되는 핵산 서열의 영역인 제어 서열이다. 그것은 핵산 서열의 특이적 전사를 개시하기 위해 RNA 폴리머라제 및 기타 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전적 요소를 함유할 수 있다. "작동 가능하게 배치된", "작동 가능하게 연결된", "제어하에" 및 "전사 제어하에"라는 문구는 프로모터가 핵산 서열과 관련하여 그 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하기 위해 올바른 기능적 위치 및/또는 배향에 있음을 의미한다.
용어 "선천적 면역" 또는 "선천적 면역 반응"은 미생물 또는 거대 분자 등과 같은 특정 환경 항원에 노출되기 전 또는 노출과 무관하게 존재하는 면역학적 및 비면역학적 모두의 숙주 방어의 레퍼토리(repertoire)를 지칭한다. 예를 들어, 항원에 대한 최초 숙주 면역 반응은 선천적 면역계를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "면역원" 또는 "항원"은 대상체에 도입될 때 면역계에 의해 인식되고 면역 반응을 유발할 수 있는 제제를 지칭한다. 특정 구현예에서, 생성된 면역 반응은 선천적 세포 면역 반응이고, 본 개시의 재조합 종양 용해성 바이러스는 선천적 세포 면역 반응을 억제하거나 감소시킬 수 있다.
본원에 사용된 문구 "유효량"은 이의 수령인에게 유익한 효과를 부여하기에 충분히 높은 농도를 제공하기에 충분한 용량을 지칭한다. 임의의 특정 대상체에 대한 특정 치료적 유효 용량 수준은 치료되는 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 화합물의 클리어런스 비율(rate of clearance), 치료 기간, 화합물과 조합하여 사용되거나 동시에 사용되는 약물, 대상체의 연령, 체중, 성별, 식이 및 일반적인 건강 상태, 및 의학 기술 및 과학 분야에서 익히 공지된 유사 인자에 의존할 것이다.
본원에 사용된 용어 "감염 다중도"(MOI)는 세포당 첨가되는 감염성 바이러스 입자의 수를 의미한다.
II. 종양 용해성 바이러스
A. 종양 용해성 바이러스 플랫폼
한 측면에서, 본 개시는 일반적으로 재조합의 복제 능력이 있는 종양 용해성 바이러스에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, PD1 또는 T1M3을 인코딩하는 이종 핵산 서열을 갖는 재조합 종양 용해성 바이러스가 제공된다. 본 개시의 방법에 따라 투여될 수 있는 종양 용해성 바이러스는, 제한 없이, 아데노바이러스(예: 델타-24, 델타-24-RGD, ICOVIR-5, ICOVIR-7, Onyx-0l5, ColoAdl, H101, AD5/3-D24-GMCSF), 레오바이러스, 단순 포진 바이러스(HSV; OncoVEX GMCSF), 뉴캐슬병 바이러스, 홍역 바이러스, 레트로바이러스(예: 인플루엔자 바이러스), 폭스바이러스(예: 코펜하겐, 웨스턴 리저브, 와이에스 균주를 포함한 우두 바이러스), 점액종 바이러스, 랍도바이러스(예: 수포성 구내염 바이러스(VSV)), 피코르나바이러스(예: 세네카 밸리 바이러스; SVV-001), 콕사키바이러스 및 파르보바이러스를 포함한다.
하나의 구현예에서, 재조합 종양 용해성 바이러스는 점액종 바이러스를 포함한다. 점액종 바이러스(MYVX)는 폭스바이러스 과의 구성원이며, 레포리폭스바이러스 속(genus Leporipoxvirus)의 원형이다. 그것은 점액종증이라는 치명적인 질환을 일으키는 유럽 토끼(오릭톨라구스 쿠니쿨러스(Oryctolagus cuniculus))와 덜 심각한 질환을 유발하는 2개의 북미 종인 실빌라구스 아우두본니(Sylvilagus audubonni)와 실빌라구스 누탈리(Sylvilagus nuttalli)에 대해서만 병원성이다. 점액종 바이러스는 숙주 세포의 세포질에서만 복제되며, 이의 게놈은 171개의 개방 판독 프레임을 인코딩한다(참조: Smallwood et al, 2010). 이러한 유전자 중 다수는 숙주 방어 메커니즘을 방해하거나 조절할 수 있는 단백질을 인코딩하며, 일부는 임상 환경에서 가능성을 보여준다.
폭스바이러스 과의 다른 구성원과 마찬가지로, 점액종 바이러스 게놈은 단일 이중 가닥 DNA(dsDNA)로 구성되며, 이의 중앙 부분은 폭스바이러스 속 구성원 사이에서 보존되는 약 100개의 필수 유전자를 인코딩한다. 말단 역전된 반복체 내에서 맵핑(mapping)되는 12개의 유전자 각각 2개의 사본을 포함한 나머지 유전자는 숙주 방어 메커니즘을 방해하고 조절하는 단백질을 인코딩한다. 이들 단백질 중 다수는 숙주 세포 유전자와 서열 유사성을 공유하여, 공진화 경로를 시사한다(참조: Johnston and McFadden, 2003). 바이러스수용체(viroceptor)라고 불리는 일부는 분비되어, 예를 들어, TNF와 같은 특정 리간드에 결합할 수 있다. 비로킨(virokine)으로 공지된 다른 것들도 분비되어 숙주 면역 억제제를 모방하는 반면, 비로미티게이터(viromitigator)는 세포자멸사(apoptosis)를 억제하는 숙주 범위 인자로 기능한다(참조: Johnston and McFadden, 2003; Kerr and McFadden, 2002). 이러한 특성은 여러 치료 환경에서 점액종 바이러스에 가능한 유용성을 제공한다. 점액종 바이러스 인코딩된 면역조절 단백질 중 하나인 Serp-1은 급성 불안정성 관상 동맥 증후군(예: 불안정 협심증 및 작은 심장 발작)에 대한 임상 시험 중이다. 토끼 감마 인터페론을 억제하는 분비된 당 단백질인 점액종 바이러스의 M-T7 단백질은 또한 동맥에 대한 풍선 혈관형성술 손상(balloon angioplasty injury)의 토끼 모델에서 염증 반응을 억제하는 것으로 나타났고(참조: Liu et al, 2000), 다양한 다른 면역조절 단백질은 항염증 또는 항면역 치료제로 개발될 수 있다.
점액종 바이러스는 다양한 그룹의 조직에서 유래된 다양한 인간 암 세포주를 생산적으로 감염시키는 것으로 나타났으며(참조: Sypula et al., 2004), 따라서 다양한 암에 대한 치료에 유용한 종양 용해성 바이러스로서 발전할 가능성이 있다. 야생형 점액종 바이러스는 결핍된 선천적 항바이러스 반응을 갖는 인간 세포를 포함하는 세포, 예를 들어, 본원에 완전히 참조로 포함된 출원 PCT/CA2004/000341에 기재된 바와 같이, 인터페론에 비반응성인 세포를 선택적으로 감염시키고 사멸할 수 있다. 또한, 점액종 바이러스는 숙주 면역 반응을 회피하고 방해하는 데 능숙하며, 다양한 임상 환경에서 치료제로 사용될 수 있는 면역조절 단백질의 공급원으로 작용할 수 있다(참조: Lucas and McFadden, 2004). 또한, 점액종 바이러스는 인간에서 감염성은 아니지만, 정상적인 인간 세포가 아닌 다수의 인간 암 세포주를 생산적으로 감염시킬 수 있고, 또한 인간 신경교종 마우스 모델에서 생존 시간을 증가시키는 것으로 나타났다. 이러한 특성은 점액종 바이러스가 항염증성 또는 항면역 요법 또는 종양 용해성 제제를 포함하여 다양한 임상 환경에서 실행 가능한 치료제인 것으로 입증될 수 있음을 시사한다.
점액종 바이러스는 골수종, 흑색종, 교모세포종, 췌장암 등을 포함한 다양한 악성 종양에 대한 종양 용해 가능성을 확립했다. 이 바이러스는 두 가지 다른 메커니즘을 통해 항종양 효과를 나타내는 것으로 생각된다. 첫째, 바이러스는 종양 세포를 직접 감염시키고 사멸한다. 둘째, 종양 세포의 바이러스 감염은 2차 항종양 면역 반응을 유도한다. 이러한 메커니즘의 조합은 원발성 종양의 탈벌크화(debulking)에 효과적이지만, 종종 종양 미세환경 내의 면역 억제로 인해 장기적인 치료를 생성하지 못한다.
본 개시의 점액종 바이러스는 항종양 활성을 향상시키기 위해 약화될 수 있다. 예를 들어, 점액종 바이러스는 하나 이상의 유전자를 불활성화하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 특히, 기능성 M135R을 발현하지 않는 점액종 바이러스는 종양 용해성 연구를 포함하여 결핍된 선천적 항바이러스 반응을 갖는 세포의 치료에 유용한데, 이는 이 바이러스가 이상한 봉쇄 전략(unusual containment strategy)이 치료받고 있는 환자에 필요하기 때문에 종양 용해성 바이러스 요법에 더 안전한 대안을 제공하기 때문이다(미국 특허 제20090035276호, 본원에 참조로 포함됨). 특정 측면에서, 점액종 바이러스는 SG33 균주와 같은 점액종 바이러스의 약화된 균주이다(미국 특허 출원 제 8613915호, 본원에 참조로 포함됨). 본 개시에 따라 사용될 수 있는 약화된 점액종 바이러스는 특히 유전자 M151R, M152R, M153R, M154L, M156R 및 M001R 중 하나 이상의 결실에 의해, 바람직하게는 유전자 M008.1R, M008R, M007R, M006R, M005R, M004.1R, M004R, M003.2R, M003.1R 및 M002R 중 하나 이상의 추가 결실에 의해 악성 야생형 점액종 바이러스로부터 수득될 수 있다.
점액종 바이러스는 부착성 세포 및 현탁 배양물을 포함한 다수의 세포주에서 증식할 수 있으며, 최소한의 정제가 필요하다. 예를 들어, 점액종 바이러스는 RK13(토끼 신장 상피), BHK-21(아기 햄스터 신장), BGMK(버팔로 녹색 원숭이 신장), Vero(아프리카 녹색 원숭이 신장 상피), BSC-40(아프리카 녹색 원숭이 신장) 및 CV-1(아프리카 녹색 원숭이 신장 섬유아세포) 세포를 포함한 다수의 세포주에서 성장할 수 있다. 시험관내 및 생체내 모두의 작업에 적합한 스톡을 제공하기 위해서는 최소한의 정제가 필요하다. 점액종 바이러스의 스톡을 증식, 정제 및 정량화하기 위한 프로토콜은 당업계에 공지되어 있다(참조: Smallwood et al., 2010, 본원에 참조로 포함됨).
B. 재조합 종양 용해성 바이러스
재조합 바이러스는 재조합 바이러스를 생성하기 위해 당업계에 공지된 절차에 의해 작제될 수 있다. PD1, 예를 들어, 돌연변이체 PD1, 또는 TIM3을 인코딩하는 발현 카세트는 바이러스 복제에 필수적이지 않은 영역에서 종양 용해성 바이러스의 게놈에 삽입된다. 예를 들어, 발현 카세트는 M135와 M136 개방 판독 프레임 사이와 같은 유전자간 영역에서 점액종 바이러스에 통합될 수 있다. 재조합 바이러스는 서열번호 3에 제시된 인간 PD1의 세포외 부분의 뉴클레오티드 서열(예: 뉴클레오티드 서열의 전장)과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함할 수 있다. 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 코돈 최적화를 통해 재조합 바이러스에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 발현 카세트는 가용성 TIM3(서열번호 11) 또는 서열번호 11)과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 인코딩할 수 있다.
일반적 재조합으로 공지되기도 한 상동성 재조합(HR)은 뉴클레오티드 서열이 DNA의 두 개의 유사하거나 동일한 가닥 사이에서 교환되는 모든 형태의 생명체에서 사용되는 유전적 재조합 유형이다. 이 기술은 1980년대 중반부터 포유류 세포에서 게놈 공학을 위한 표준 방법이었다. 이 과정에는 여러 단계의 물리적 파괴와 최종적인 DNA의 재결합이 포함된다. 이 과정은 DNA에서 잠재적으로 치명적인 이중 가닥 절단을 복구하는 데 가장 널리 사용된다. 또한, 상동성 재조합은 진핵 생물이 정자와 난자와 같은 생식 세포를 만드는 과정인 감수 분열 동안 DNA 서열의 새로운 조합을 생성한다. 이러한 새로운 DNA 조합은 집단이 시간이 지남에 따라 변화하는 환경 조건에 진화적으로 적응할 수 있도록 하는 자손의 유전적 변이를 나타낸다. 상동성 재조합은 또한 상이한 균주와 박테리아 및 바이러스 종 사이에서 유전 물질을 교환하기 위한 수평적 유전자 전달에 사용된다. 상동성 재조합은 또한 표적 유기체에 유전적 변화를 도입하기 위한 분자 생물학의 기술로서 사용된다.
본 개시에 유용한 벡터에 포함된 발현 카세트는 바람직하게는 단백질-코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 진핵생물 전사 프로모터를 (5'에서 3' 방향으로) 함유한다. 프로모터의 비제한적 예는 초기 또는 후기 바이러스 프로모터, 예를 들어, SV40 초기 또는 후기 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 급 초기 프로모터(immediate early promoter), 라우스 육종 바이러스(RSV) 초기 프로모터; 진핵 세포 프로모터, 예를 들어, 베타 액틴 프로모터(Ng, 1989; Quitsche et al., 1989), GADPH 프로모터(Alexander et al., 1988, Ercolani et al., 1988), 메탈로티오네인 프로모터(Karin et al., 1989; Richards et al., 1984); 및 연쇄 반응 요소 프로모터, 예를 들어, 사이클릭 AMP 반응 요소 프로모터(cre), 혈청 반응 요소 프로모터(sre), 포르볼 에스테르 프로모터(TPA) 및 최소한 TATA 박스 근처의 반응 요소 프로모터(tre)를 포함한다. 인간 성장 호르몬 프로모터 서열(예를 들어, Genbank, 수탁 번호 X05244, 뉴클레오티드 283-341에 기재된 인간 성장 호르몬 최소 프로모터) 또는 마우스 유선 종양 프로모터(ATCC, Cat. 번호 ATCC 45007에서 입수 가능)를 사용하는 것도 가능하다. 특정 예는 합성 초기/후기(sE/L) 폭스바이러스 프로모터(참조: 예를 들어, 서열번호 10에 대한 작제물의 프로모터)일 수 있다.
발현 카세트를 세포에 도입한 다음, 이를 변형되지 않은 종양 용해성 바이러스로 감염시켜 재조합 바이러스를 생산한다. 발현 카세트의 세포로의 도입은 본원에 기재된 바와 같이 또는 당업자에게 공지된 바와 같이 세포의 형질 전환을 위한 핵산 전달을 위한 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 생체외 형질 감염(Wilson et al., 1989, Nabel et al, 1989); 미세 주사(Harland and Weintraub, 1985; 미국 특허 제5,789,215호, 본원에 참조로 포함됨)를 포함한 주사(미국 특허 제5,994,624호, 제5,981,274호, 제5,945,100호, 제5,780,448호, 제5,736,524호, 제5,702,932호, 제5,656,610호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호, 각각은 본원에 참조로 포함됨); 전기 천공(미국 특허 제5,384,253호, 본원에 참조로 포함됨; Tur-Kaspa et al, 1986; Potter et al, 1984); 인산칼슘 침전(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); DEAE-덱스트란에 이어 폴리에틸렌 글리콜의 사용(Gopal, 1985); 직접 음파 부하(Fechheimer et al, 1987); 리포좀 매개 형질 감염(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991) 및 수용체 매개 형질 감염(Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988); 미소 발사체 충격(PCT 출원 제WO 94/09699호 및 제95/06128호; 미국 특허 제5,610,042호; 제5,322,783호, 제5,563,055호 제5,550,318호, 제5,538,877호 및 제5,538,880호, 각각이 본원에 참조로 포함됨); 탄화규소 섬유에 의한 교반(Kaeppler et al., 1990; 미국 특허 제5,302,523호 및 제5,464,765호, 각각 본원에 참조로 포함됨); 아그로박테리움(Agrobacterium) 매개 형질 전환(미국 특허 제5,591,616호 및 제5,563,055호, 각각 본원에 참조로 포함됨); 건조/억제 매개 DNA 흡수(Potrykus et al., 1985), 및 이러한 방법의 임의의 조합에 의한 DNA의 직접 전달을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들과 같은 기술의 적용을 통해, 세포 기관(들), 세포(들), 조직(들) 또는 유기체(들)는 안정하게 또는 일시적으로 형질전환될 수 있다.
이어서, 재조합 바이러스는, 예를 들어, 선택 가능한 마커(marker)에 의해 세포로부터 정제된다. 이러한 마커는 동정 가능한 변화를 세포에 부여하여 발현 벡터를 함유하는 세포의 용이한 동정을 가능하게 한다. 일반적으로, 선택 마커는 선택을 허용하는 특성을 부여하는 마커이다. 양성 선택 마커(positive selection marker)는 마커의 존재가 이의 선택을 허용하는 것인 반면, 음성 선택 마커는 그 존재가 선택을 방해하는 것이다. 양성 선택 마커의 예는 약물 내성 마커이다. 일반적으로, 약물 선택 마커의 포함은 형질 전환체의 클로닝 및 동정에 도움이 되고, 예를 들어, 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여하는 유전자는 유용한 선택 마커이다. 조건의 구현에 따라 형질 전환체의 식별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커 외에도, 비색 분석에 기초하는 GFP와 같은 스크리닝 가능한 마커를 포함한 다른 유형의 마커도 또한 고려된다. 대안적으로, 단순 포진 바이러스와 같은 음성 선택 마커로서 스크리닝 가능한 효소, 티미딘 키나제(tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)가 사용될 수 있다. 사용되는 마커는 유전자 산물을 인코딩하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한 중요하지 않은 것으로 간주된다. 예를 들어, 재조합 종양 용해성 바이러스는 태그되지 않을 수 있거나, 형광 단백질, 예를 들어, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 토마토 레드(tdRed) 또는 기타 형광 단백질을 발현할 수 있다. 선택 및 스크리닝 가능한 마커의 추가 예는 당업자에게 익히 공지되어 있다.
시험관내 및 생체내 점액종 복제를 위한 형광 마커로서 기능하는 토마토 레드 형광(tdTr)을 발현하는 도입유전자는 문헌(참조: Liu el al. (2009) J. Virology 83: 5933-5938)에 기재되어 있다. 리우(Liu)는 tdTr(vMyx-IL-15-tdTr)에 융합된 IL-15를 발현하는 믹소바이러스(myxovirus)가 상당히 약화되어 토끼에서 치명적인 점액종증(myxomatosis)을 유발하지 못함을 관찰했다. 이 작제물은 IL-15를 분비하고 정상적인 바이러스 복제를 지원했다. 따라서, 리우(Liu)는 vMyx-IL-15-tdTr이 종양 용해성 바이러스 요법의 생체내 동물 연구의 안전한 후보였고, tdTr이 재조합 믹소바이러스에 사용하기에 적합한 마커라고 결론지었다.
필요에 따라서, 하나 이상의 유전적 요소, 예를 들어, 형광 마커를 발현하는 도입유전자는 Flp 재조합효소 또는 Cre-lox 재조합 기반 시스템과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 바이러스 트랜스포존으로부터 절제될 수 있다.
C. PD1
PD-1 및 CD279(분화 클러스터 279)로서 공지되기도 한 프로그램된 세포사 단백질 1은 면역계를 하향 조절하여 인체 세포에 대한 면역계의 반응을 조절하고 T 세포 염증 활성을 억제하여 자기 내성을 촉진시키는 데 역할을 하는 세포 표면에서 발견되는 단백질이다. 이것은 자가 면역 질환을 예방하지만 면역계가 암 세포를 사멸시키는 것을 방지할 수도 있다.
인간 PD-1의 세포외 도메인의 아미노산 서열은 Uniprot 수탁 번호 Q15116, 서열번호 4에서 발견되며, 길이는 168개 아미노산이며, 이는 상이한 신호 서열에 의해 대체될 수 있거나, 분비를 지시하기 위해 필요하지 않는 경우, 본 개시의 PD-1 서열로부터 생략될 수 있는 20개 아미노산 신호 서열을 포함한다.
PD-1은 면역 체크포인트이며, 두 가지 메커니즘을 통해 자가 면역을 방지한다. 첫째, 그것은 림프절에서 항원 특이적 T 세포의 세포자멸사(프로그램된 세포사)을 촉진한다. 둘째, 그것은 조절 T 세포(항염증성, 억제성 T 세포)에서 세포자멸사를 감소시킨다. PD-1을 차단하는 새로운 부류의 약물인 PD-1 억제제는 면역 계를 활성화하여 종양을 공격하고, 특정 유형의 암을 치료하는 데 사용된다.
인간의 PD-1 단백질은 PDCD1 유전자에 의해 인코딩된다. PD-1은 면역글로불린 상과(superfamily)에 속하는 세포 표면 수용체이며, T 세포 및 pro-B 세포에서 발현된다. PD-1은 두 리간드 PD-L1 및 PD-L2에 결합한다. PD-1은 268개 아미노산의 유형 I 막 단백질이다. PD-1은 T 세포 조절제의 확장된 CD28/CTLA-4 계열의 구성원이다. 단백질의 구조는 세포외 IgV 도메인에 이어 막관통 영역과 세포내 꼬리를 포함한다. 세포내 꼬리는 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프와 면역수용체 티로신 기반 스위치 모티프에 위치한 2개의 인산화 부위를 함유하며, 이는 PD-1이 T-세포 수용체 TCR 신호를 부정적으로 조절함을 시사한다. 이것은 리간드 결합시 PD-1의 세포질 꼬리에 대한 SHP-1 및 SHP-2 포스파타제의 결합과 일치한다. 또한, PD-1 결찰은 T 세포 수용체 하향 조절을 유발하는 E3-유비퀴틴 리가제 CBL-b 및 c-CBL을 상향 조절한다. PD-1은 활성화된 T 세포, B 세포 및 대식세포의 표면에서 발현되며, 이는 CTLA-4와 비교하여 PD-1이 면역 반응을 더 광범위하게 부정적으로 조절함을 시사한다.
PD-1은 B7 패밀리의 구성원인 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2를 갖는다. PD-L1 단백질은 LPS 및 GM-CSF 치료에 대한 반응으로 대식세포 및 수지상 세포(DC)에서, TCR 및 B 세포 수용체 신호전달시 T 세포 및 B 세포에서 상향 조절되는 반면, 휴지 마우스에서, PD-L1 mRNA는 심장, 폐, 흉선, 비장 및 신장에서 검출될 수 있다. PD-L1은 IFN-γ에 의한 치료시 PA1 골수종, P815 비만 세포종 및 B16 흑색종을 포함한 거의 모든 뮤린 종양 세포주에서 발현된다. PD-L2 발현은 더 제한적이며, 주로 DC 및 몇 개의 종양주에 의해 발현된다.
몇 가지 증거는 PD-1 및 이의 리간드가 면역 반응을 부정적으로 조절한다는 것을 시사한다. PD-1 녹아웃 마우스는 각각 C57BL/6 및 BALB/c 배경에서 루푸스 유사 사구체신염(glomerulonephritis) 및 확장된 심근병증을 발생시키는 것으로 나타났다. 시험관내에서, 항-CD3 자극 T 세포를 PD-L1-Ig로 치료하면 T 세포 증식 및 IFN-γ 분비를 감소시킨다. IFN-γ는 T 세포 염증 활성을 촉진하는 주요 전염증 사이토카인이다. 감소된 T 세포 증식은 또한 약화된 IL-2 분비와 상관 관계가 있었고, 함께 이들 데이터는 PD-1이 T 세포 반응을 부정적으로 조절함을 시사한다.
유전자 도입(Tg) CD4+ 및 CD8+ T 세포를 발현하는 PD-L1 형질 감염된 DC 및 PD-1을 사용한 실험은 CD8+ T 세포는 PD-L1에 의한 억제에 더 민감하다는 것을 시사하지만, 이는 TCR 신호전달의 강도에 의존할 수 있다. CD8+ T 세포 반응을 부정적으로 조절하는 역할과 일치하여, 만성 감염의 LCMV 바이러스 벡터 모델을 사용하여, Rafi Ahmed의 그룹은 PD-1-PD-L1 상호작용이 바이러스 특이적 CD8+ T 세포의 효과기 기능의 활성화, 확장 및 획득을 억제하고, 이는 PD-1-PD-L1 상호작용을 차단함으로써 역전될 수 있다는 것을 보여주었다.
종양 세포에서 PD-L1의 발현은 효과기 T 세포에 대한 PD-1의 관여를 통해 항종양 활성을 억제한다. 종양에서 PD-L1의 발현은 식도암, 췌장암 및 기타 유형의 암에서 생존 감소와 상관 관계가 있으며, 이 경로를 면역 요법의 표적으로 강조한다. 단핵구에서 발현되고 단핵구 활성화시 상향 조절되는 PD-1을 이의 리간드 PD-L1에 의해 유발하면 CD4 T-세포 기능을 억제하는 IL-10 생산을 유도한다.
마우스에서, 이 유전자의 발현은 항-CD3 항체가 주입되고 많은 수의 흉선 세포가 세포자멸사를 겪을 때 흉선에서 유도된다. BALB/c 배경에서 자란 이 유전자가 결핍된 마우스는 확장성 심근병증이 발생하고 울혈성 심부전(congestive heart failure)으로 사망했다. 이러한 연구는 이 유전자 산물이 T 세포 기능에 중요할 수 있으며, 자가 면역 질환의 예방에 기여할 수 있음을 시사한다. CD8+ T 세포에서 PD1의 과발현은 T 세포 고갈의 지표 중 하나이다(예: 만성 감염 또는 암에서).
PD1의 1차 리간드인 PD-L1은 여러 암에서 고도로 발현되므로, 암 면역 회피(cancer immune evasion)에서 PD1의 역할은 잘 확립되어 있다. 면역계를 강화하는 PD-1을 표적화하는 모노클로날 항체가 암 치료용으로 개발되고 있다. 많은 종양 세포는 면역 억제성 PD-1 리간드인 PD-L1을 발현하고, PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용의 억제는 시험관내 T 세포 반응을 향상시키고, 전임상 항종양 활성을 매개할 수 있다. 이는 면역 체크포인트 차단으로 공지되어 있다.
항-CTLA4 치료제와 함께 항-PD1 둘 다를 사용하는 병용 요법이 체크포인트 억제 분야 내에서 중요한 종양 치료로서 부상했다. PD1 및 CTLA4 항체의 조합은 다양한 암의 치료에서 어느 하나의 항체 단독보다 더 효과적인 것으로 나타났다. 두 항체의 효과는 중복되는 것으로 나타나지 않는다. 항-CTLA4 치료는 강화된 항원 특이적 T 세포 의존 면역 반응을 유도하는 반면, 항-PD-1은 암 세포를 용해시키는 CD8+ T 세포 능력을 재활성화하는 것으로 보인다.
임상 시험에서, 병용 요법은 항-CTLA4 치료로 인한 독성 수준이 증가함에도 불구하고 단일 공동-억제 차단에 비반응성인 환자에서 종양 크기를 줄이는 데 효과적인 것으로 나타났다. PD1과 CTLA4의 조합은 종양 조직에 적극적으로 침투하는 최대 10배 더 많은 수의 CD8+ T 세포를 유도했다. 저자들은 더 높은 수준의 CD8+ T 세포 침윤이 항-CTLA-4가 CD4 T 세포의 T 조절제 세포로의 전환을 억제하고 항-PD-1에 의한 T 조절 억제를 추가로 감소시켰기 때문이라고 가정했다. 이 조합은 암의 크기를 감소시키는 종양에 대한 보다 강력한 염증 반응을 촉진했다. 가장 최근에, FDA는 2015년 10월에 항-CTLA4(이필리무맙) 및 항-PD1(니볼루맙) 둘 다와의 병용 요법을 승인했다.
항-PD1 치료에 대해 종양 수용성이도록 하는 데 필요한 분자 인자 및 수용체는 아직 공지되지 않았다. 암 세포의 표면에서 PD-L1 발현은 중요한 역할을 한다. PD-L1 양성 종양은 병용 치료에 반응할 가능성이 2배 더 높았다. 그러나, PD-L1 음성 종양을 갖는 환자는 또한 항-PD1에 대한 반응이 제한되어 PD-L1 발현이 요법의 효과의 절대적인 결정 요인이 아님을 입증한다.
종양에서 더 높은 돌연변이 부담은 항-PD1 치료의 더 큰 효과와 상관관계가 있다. 임상 시험에서, 항-PD1 치료로 혜택을 받은 환자는 요법에 반응하지 않은 환자보다 평균 돌연변이 수가 더 높은 중앙값을 갖는 흑색종, 방광암 및 위암과 같은 암을 앓았다. 그러나, 더 높은 종양 부담과 PD-1 면역 차단의 임상적 효과 사이의 상관 관계는 여전히 불확실하다.
D. IL-12
인터류킨 12(IL-12)는 항원 자극에 반응하여 수지상 세포, 대식세포, 호중구 및 인간 B-림프아구성 세포(NC-37)에 의해 자연적으로 생성되는 인터류킨이다. IL-12는 4개의 알파 나선의 묶음으로 구성된다. 그것은 2개의 개별 유전자, IL-12A(p35) 및 IL-12B(p40)에 의해 인코딩된 이종이량체 사이토카인이다. 활성 이종이량체('p70'으로 지칭됨)와 p40의 동종이량체는 단백질 합성 후에 형성된다. 인간 IL-12 알파 서브유닛의 아미노산 서열은 Uniprot 수탁 번호 P29459, 서열번호 7에서 발견되고, 길이가 219개 아미노산이며, 이는 상이한 신호 서열로 대체되거나, 분비를 지시하기 위해 필요하지 않을 때 본 발명의 IL-12 알파 서브유닛 서열에서 생략될 수 있는 22개 아미노산 신호 서열을 포함한다. 인간 IL-12 베타 서브유닛의 아미노산 서열은 Uniprot 수탁 번호 P29460, 서열번호 8에서 발견되며, 길이가 328개 아미노산이고, 이는 상이한 신호 서열로 대체되거나, 분비를 지시하기 위해 필요하지 않을 때 본 발명의 IL-12 베타 서브유닛 서열에서 생략될 수 있는 22개 아미노산 신호 서열을 포함한다. IL-12 알파 및 베타 서브유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 코돈 최적화를 통해 재조합 바이러스에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다.
특정 구현예에서, IL-12 알파 서브유닛 및 IL-12 베타 서브유닛은 단일 DNA 작제물로부터의 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 이러한 경우에, 바람직하게는 발현된 융합 단백질의 N-말단에서 단일 신호 펩티드만 필요하다. 이러한 경우에, 가요성 링커 펩티드(flexible linker peptide)를 사용하여 IL-12 알파 서브유닛과 IL-12 베타 서브유닛을 연결할 수 있다. 적합한 링커 펩티드 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, (GGGS)n을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 4이다.
IL-12는 나이브 T 세포의 Thl 세포로의 분화에 관여한다. 그것은 T 세포의 성장과 기능을 자극할 수 있는 T 세포 자극 인자로서 공지되어 있다. 그것은 T 세포와 자연 살해(NK) 세포로부터 인터페론-감마(IFN-γ)와 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)의 생성을 자극하고, IFN-γ의 IL-4 매개 억제를 감소시킨다. IL-12를 생산하는 T 세포는 IL-12 활성과 관련된 공동수용체 CD30을 갖고 있다.
IL-12는 자연 살해 세포와 T 림프구의 활성에 중요한 역할을 한다. IL-12는 NK 세포 및 CD8+ 세포 독성 T 림프구의 세포 독성 활성의 향상을 매개한다. 또한 NK 세포에서 IL-2와 IL-12의 신호전달 사이에 연관성이 있는 것으로 보인다. IL-2는 2개의 IL-12 수용체, IL-12R-β1 및 IL-12R-β2의 발현을 자극하여 NK 세포에서 IL-12 신호전달에 관여하는 중요한 단백질의 발현을 유지한다. 향상된 기능적 반응은 IFN-γ 생산 및 표적 세포의 사멸에 의해 입증된다.
IL-12는 또한 항혈관신생 활성을 가지며, 이는 새로운 혈관 형성을 차단할 수 있음을 의미한다. 그것은 인터페론 감마의 생산을 증가시킴으로써 이를 수행하며, 이는 차례로 유도성 단백질 10(IP-10 또는 CXCL10)이라고 칭명되는 케모카인의 생산을 증가시킨다. 이어서, IP-10은 이 항혈관신생 효과를 매개한다. 면역 반응을 유도하는 능력과 이의 항혈관신생 활성으로 인해 가능한 항암 약물로서 IL-12를 테스트하는 데 관심이 있었다. 그러나, 현재까지 테스트된 종양에서 실질적인 활성을 갖는 것으로 나타나지 않았다. IL-12와 질환 건선 및 염증성 장 질환 사이의 치료에 유용할 수 있는 연관성이 있다.
IL-12는 IL-12 수용체에 결합하며, 이는 IL-12Rβ1 및 IL-12Rβ2에 의해 형성된 이종이량체 수용체이다. IL-12Rβ2는, 활성화된 T 세포에서 발견되고 Thl 세포 발달을 촉진하는 사이토카인에 의해 자극되고 Th2 세포 발달을 촉진하는 것들에 의해 억제되기 때문에, IL-12 기능에서 중요한 역할을 하는 것으로 간주된다. 결합시, IL-12R-β2는 티로신 인산화되고, 키나제, Tyk2 및 Jak2에 대한 결합 부위를 제공한다. 이러한 키나제는 T 세포 및 NK 세포에서 IL-12 신호전달에 관여하는 STAT4와 같은 중요한 전사 인자 단백질을 활성화하는 데 중요한다. 이 경로는 JAK-STAT 경로로서 공지되어 있다.
IL-12는 자가 면역과 관련이 있다. 자가 면역 질환을 앓고 있는 사람에게 IL-12를 투여하면 자가 면역 현상을 악화시키는 것으로 나타났다. 이는 Thl 면역 반응의 유도에서 이의 핵심적인 역할에 기인하는 것으로 믿어진다. 대조적으로, IL-12 유전자는 마우스에서 녹아웃되거나 IL-12 특이적 항체에 의한 마우스의 치료는 질환을 완화시켰다.
인터류킨 12(IL-12)는 활성화된 항원 제시 세포(수지상 세포, 대식세포)에 의해 생성된다. 그것은 Thl 반응의 발달을 촉진하고, T 및 NK 세포에 의한 IFNγ 생산의 강력한 유도 인자이다.
바실러스 칼메트-게랭(Bacillus Calmette-Guerin) 및 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 감염을 앓고 있는 어린이는 IL-12 p40 서브유닛 유전자 내에 큰 동형 접합성 결실을 갖는 것으로 밝혀져 활성화된 수지상 세포 및 식세포에 의한 기능적 IL-12 p70 사이토카인의 발현을 방해한다. 그 결과, 소아 림프구에 의한 IFNγ 생산이 현저하게 손상되었다. 이것은 IL-12가 미코박테리아 및 살모넬라와 같은 세포내 박테리아에 대한 보호 면역에 필수적임을 시사했다.
IL-12에 대한 수용체가 림프구에 의한 IFNγ 생산에 중요하다는 관찰에 의해 이러한 아이디어가 뒷받침된다. 중증 특발성 미코박테리아 및 살모넬라 감염을 앓고 있는 7명의 비관련 환자의 T 및 NK 세포는 IL-12로 자극했을 때 IFNγ를 생성하지 못했다. 환자들은 그렇지 않으면 건강했다. 그들은 IL-12 수용체 β1 쇄에 돌연변이를 갖는 것으로 밝혀져 세포외 도메인에서 조기 정지 코돈을 초래하고, 이 사이토카인에 대한 무반응성을 초래하고, 숙주 방어에서 IL-12의 중요한 역할을 다시 입증한다.
만성 점막 피부 칸디다증(chronic mucocutaneous candidiasis)을 유발하는 결함있는 Thl 및 Thl7 면역 반응은 IL-12 신호전달 경로에서 더 하류의 돌연변이로 인해 발생한다. 이 형질은 IL-12 또는 IL-23 수용체 관련 Jak2 및 Tyk2 활성에 대한 반응으로 인터페론-γ, IL-17 및 IL-22의 낮은 생산과 관련된 STAT1 유전자의 돌연변이에 맵핑되었다.
E. IL-2
인터류킨-2(IL-2)는 면역계에서 사이토카인 신호전달 분자의 일종인 인터류킨이다. 그것은 면역을 담당하는 백혈구(백혈구, 종종 림프구)의 활성을 조절하는 단백질이다. IL-2는 미생물 감염에 대한 신체의 자연적인 반응의 일부이며, 이물질("비-자기")과 "자기"를 구별한다. IL-2는 림프구에 의해 발현되는 IL-2 수용체에 결합하여 이의 효과를 매개한다. 인간 IL-2의 아미노산 서열은 Uniprot 수탁 번호 P60568, 서열번호 6에서 발견되며, 길이가 153개 아미노산이며, 이는 상이한 신호 서열로 대체되거나, 분비를 지시하기 위해 필요하지 않은 경우 본 발명의 IL-2 서열에서 생략될 수 있는 20개 아미노산 신호 서열을 포함한다. IL-2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 코돈 최적화를 통해 재조합 바이러스에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 유용한 IL-2는 서열번호 9의 고친화성 변이체 IL-2 아미노산 서열이며, 이는 20개 아미노산 신호 서열을 포함하며, 이는 상이한 신호 서열로 대체될 수 있고, 또한 C-말단 His 태그도 함유한다[참조: Levin et al. (2012) Nature 484: 529-533]. IL-2의 기능에 필요하지 않은 경우, 신호 서열 및 His 태그 중 하나 또는 둘 모두가 생략될 수 있다.
IL-2는 각 구성원이 4개의 알파 나선 다발을 갖는 사이토카인 계열의 구성원이고; 상기 계열은 또한 IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21을 포함한다. IL-2는 알파, 베타 및 감마라고 하는 3개의 쇄로 구성된 복합체인 IL-2 수용체를 통해 신호를 보낸다. 감마 쇄는 모든 계열 구성원에 의해 공유된다.
IL-2 수용체(IL-2R) α 서브유닛은 그의 리간드에 대해 낮은 친화성을 갖지만, (β 및 γ 서브유닛에 결합될 때) IL-2R 친화성을 100배 증가시키는 능력을 갖는다. IL-2R의 β 및 γ 서브유닛의 이종이량체화는 T 세포에서 신호전달에 필수적이다.
IL-2에 대한 유전자 발현 조절은 여러 수준에서 또는 상이한 방식으로 이루어질 수 있다. 체크포인트 중 하나는 MHC-펩티드 복합체를 인식한 후 T-림프구의 항원 수용체인 TCR 수용체를 통한 신호전달이다. 이어서, TCR로부터의 신호전달 경로는 포스포리파제-C(PLC) 의존 경로를 통해 통과한다. PLC는 3가지 주요 전사 인자와 그들의 경로를 활성화한다: NFAT, NFkB 및 AP-1. CD28로부터 공동 자극 후 IL-2 및 이들 경로의 발현의 최적 활성화가 유도된다.
동시에, Oct-1이 발현된다. 그것은 활성화에 도움이 된다. Octl은 T-림프구에서 발현되고, Oct2는 세포 활성화 후에 유도된다. NFAT는 여러 계열 구성원을 갖고, 그들 모두는 세포질에 위치하고 신호전달은 칼시뉴린(calcineurin)을 통해 통과하고, NFAT는 탈인산화되고, 따라서 핵으로 전위된다. AP-1은 이량체이며, c-Jun 및 c-Fos 단백질로 구성된다. 그것은 NFkB 및 Oct를 포함한 다른 전사 인자와 협력한다. NFkB는 CD28을 통한 공동 자극 후 핵으로 전위된다. NFkB는 이종이량체이며, IL-2 프로모터에 두개의 결합 부위가 있다.
IL-2는 주로 T 세포에 대한 직접적인 효과를 통해 면역계, 내성 및 면역의 주요 기능에 필수적인 역할을 한다. 흉선에서 T 세포가 성숙하는 경우, 그것은 특정 미성숙 T 세포의 조절 T 세포로의 분화를 촉진하여 자가 면역 질환을 예방하고, 이는 그렇지 않으면 신체의 정상적인 건강한 세포를 공격하도록 프라이밍된 다른 T 세포를 억제한다. IL-2는 또한 초기 T 세포가 또한 항원에 의해 자극될 때 T 세포의 효과기 T 세포와 기억 T 세포로의 분화를 촉진하여 신체가 감염과 싸우도록 돕는다. 그것의 발현과 분비는 엄격하게 조절되고, 면역 반응을 증가시키고 완화시키는 데 있어서 일시적인 양성 및 음성 피드백 루프(feedback loop) 모두의 일부로 기능한다. 항원-선택된 T 세포 클론(clone)의 수와 기능의 확장에 의존하는 T 세포 면역원성 기억의 발달에 있어서의 역할을 통해, 그것은 세포 매개 면역을 지속하는 데 중요한 역할을 한다.
알데스류킨(Aldesleukin)은 재조합 인터류킨-2의 한 형태이다. 그것은 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조되며, 단백질 치료제로서 판매되고, 프로류킨(Proleukin)으로 브랜드화된다. 그것은 다량의 간헐적 용량으로 암(악성 흑색종, 신장 세포 암) 치료용으로 식품 의약국(FDA)과 여러 유럽 국가에서 승인되었으며, 연속 용량으로 광범위하게 사용되었다.
인터킹(Interking)은 잔기 125에 세린을 갖는 재조합 IL-2이며, Shenzhen Neptunus에서 판매한다.
미국 및 전세계적으로 다양한 투여량의 IL-2가 사용된다. 상이한 투여량의 효율과 부작용은 종종 의견이 일치하지 않는다. 일반적으로 미국에서는 암 유형, 치료에 대한 반응 및 일반적인 환자 건강에 의해 영향을 받는 더 높은 투여량 옵션이 사용된다. 환자는 전형적으로 연속 5일 동안, 하루에 세 번 15분 동안 치료된다. 이어지는 약 10일은 환자가 치료 사이에 회복하는 데 도움이 된다. IL-2는 부작용을 적절히 모니터링할 수 있도록 하기 위해 입원 환자 기준으로 정맥내 전달된다.
저용량 섭생은 전형적으로 외래 환자를 기준으로 피하에 IL-2의 주사를 포함한다. 그것은 대안적으로, 화학요법의 전달과 유사하고 종종 이를 포함하여 1-3일에 걸쳐 입원 환자 기준으로 제공될 수 있다. 병변(lesion)내 IL-2는 일반적으로 수송 중 흑색종 전이를 치료하는 데 사용되며, 높은 완전한 반응율을 가지며, 일반적으로 내성이 좋다.
IL-2는 협소한 치료 영역(narrow therapeutic window)을 가지며, 투여 수준은 일반적으로 부작용의 심각성을 결정한다. 몇 가지 일반적인 부작용은 독감과 유사한 증상(발열, 두통, 근육 및 관절통, 피로), 메스꺼움/구토, 건조, 가려운 피부 또는 발진, 쇠약 또는 숨가쁨, 설사, 저혈압, 졸음 또는 혼란, 식욕 부진을 포함한다. 모세혈관 누출 증후군, 호흡 문제, 심각한 감염, 발작, 알레르기 반응, 심장 문제 또는 다양한 기타 가능한 합병증과 같은 더 심각하고 위험한 부작용이 때때로 나타난다.
III. 치료적 투여
또 다른 측면에서, 본 개시는 본 개시에 따르는 재조합 종양 용해성 바이러스를 종양 세포의 성장을 억제하거나 종양 세포를 사멸시키기에 충분한 감염 다중도로 투여함으로써 종양 세포의 성장을 억제하거나 사멸을 촉진하거나 흑색종과 같은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 재조합 종양 용해성 바이러스는 1회 이상, 바람직하게는 2회, 3회 또는 최대 10회 투여된다.
본 개시의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 종양 세포 또는 암의 예는 유방암(breast cancer), 난소암(ovarian cancer), 신장 세포 암종(renal cell carcinoma; RCC), 흑색종(melanoma)(예: 전이성 악성 흑색종), 전립선암(prostate cancer), 결장암(colon cancer), 폐암(lung cancer)(소세포 폐암(small cell lung cancer) 및 비소 세포 폐암(non-small cell lung cancer) 포함), 골암(bone cancer), 골육종(osteosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 평활근육종(leiomyosarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 췌장암(pancreatic cancer), 피부암(skin cancer), 섬유육종(fibrosarcoma), 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukemia; ALL)을 포함한 만성 또는 급성 백혈병(chronic or acute leukemias), 성인 T 세포 백혈병(T-ALL), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia), 급성 림프모구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 림프관육종(lymphangiosarcoma), 림프종(예: 호지킨 및 비호지킨 림프종, 림프구성 림프종, 원발성 CNS 림프종, T 세포 림프종, 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma)), 역형성 대세포 림프종(anaplastic large-cell lymphomas; ALCL), 피부 T 세포 림프종, 결절성 작은 절단 세포 림프종(nodular small cleaved-cell lymphomas), 말초 T-세포 림프종(peripheral T-cell lymphomas), 레너트 림프종(Lennert's lymphomas), 면역모세포 림프종(immunoblastic lymphomas), T-세포 백혈병/림프종(ATLL), 내모세포/중심 세포(entroblastic/centrocytic)(cb/cc) 여포성 림프종 암, B 계통의 미만성 거대 세포 림프종(diffuse large cell lymphomas of B lineage), 혈관면역모세포 림프절병증(angioimmunoblastic lymphadenopathy; AILD)-유사 T 세포 림프종 및 HIV 관련 체강 기반 림프종(HIV associated body cavity based lymphomas)), 캐슬먼병(Castleman's disease), 카포시 육종(Kaposi's Sarcoma), 혈관육종(hemangiosarcoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia) 및 기타 B-세포 림프종, 비인두 암종(nasopharangeal carcinomas), 두경부암(head or neck cancer), 점액육종(myxosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암(uterine cancer), 직장암(rectal cancer), 항문암(cancer of the anal region), 위암(stomach cancer), 고환암(testicular cancer), 자궁암, 나팔관 암종(carcinoma of the fallopian tubes), 자궁 내막 암종(carcinoma of the endometrium), 자궁경부 암종(cervical carcinoma), 질 암종(vaginal carcinoma), 외음부 암종(vulvar carcinoma), 과도 세포 암종(transitional cell carcinoma), 식도암(esophageal cancer), 악성 가스트린종(malignant gastrinoma), 소장 암(small intestine cancer), 담관 암종(cholangiocellular carcinoma), 선암(adenocarcinoma), 내분비계암(endocrine system cancer), 갑상선암(thyroid gland cancer), 부갑상선암(parathyroid gland cancer), 부신암(adrenal gland cancer), 연조직 육종, 요도, 음경암(penile cancer), 고환암, 악성 기형종(malignant teratoma), 소아 고형 종양, 방광암(bladder cancer), 신장암(kidney cancer) 또는 요관암(ureter cancer), 신장 골반의 암종, 악성 수막종(malignant meningioma), 중추 신경계(CNS)의 신생물, 종양 혈관신생, 척수 종양(spinal axis tumor), 뇌하수체 선종(pituitary adenoma), 유표피암(epidermoid cancer), 편평 세포암(squamous cell cancer), 석면에 의해 유도된 암을 포함한 환경적으로 유도된 암, 예를 들어, 중피종(mesothelioma) 및 이들 암의 조합을 포함한다. 많은 암은 PDL1(PDL1+)과 같은 면역 체크포인트 단백질을 과발현한다. 본 개시 내용의 방법은 PDL1 상태에 관계없이 종양 또는 암을 치료하는 데 사용될 수 있다.
본 개시에 따르는 종양 용해성 바이러스는 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 본 개시에 따르는 종양 용해성 바이러스는 혈관내(동맥내 또는 정맥내), 종양내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 경구, 비경구, 비내, 기관내, 경피, 척추내, 안구 또는 두개내 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 바람직하게는 동맥을 통해 또는 거주 의료 장치를 통한 재조합 종양 용해성 바이러스의 비경구 투여를 포함한다. 재조합 종양 용해성 바이러스는 종양-특이적 항원에 결합하는 항체(예: 키메라, 인간화 또는 인간 모노클로날 항체)와 같은 면역 치료제 또는 면역 조절제와 함께 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 재조합 종양 용해성 바이러스 치료는 수술(예: 종양 절제), 방사선 요법, 화학 요법 또는 면역 요법과 조합될 수 있고, 보완적 치료 전, 도중 또는 후에 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 방법은 본 발명의 점액종 바이러스에 의한 세포의 생체외 형질 도입에 이어, 세포를 포함하는 조성물의 대상체에의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 자가 조직, 즉 대상체 자신의 세포일 수 있다. 자가 조직 구현예에서, 세포는 대상체로부터 수득되고, 본 발명의 점액종 바이러스로 형질 도입되고, 성분채집과 유사한 과정으로 대상체에게 재투여될 수 있다. 바이러스를 세포로 생체외 전달하기 위한 예시적인 제형은 인산칼슘, 전기천공, 열 충격 및 다양한 리포솜 제형(즉, 지질 매개 형질 감염)과 같은 당업계에 공지된 다양한 형질 도입제의 사용을 포함할 수 있다. 리포솜은, 아래에서 더 상세히 기재된 바와 같이, 수성 유체의 분획을 포획하는 지질 이중층이다. DNA는 양이온성 리포솜의 외부 표면(전하에 의해)에 자발적으로 결합하고, 이러한 리포솜은 세포막과 상호작용한다.
특정 구현예에서, 재조합 종양 용해성 바이러스 및 면역 치료제 또는 면역 조절제는 제제가 바이러스의 활성을 방해하지 않는 방식으로 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 재조합 종양 용해성 바이러스는 동맥내, 정맥내, 복강내, 종양내 또는 이들의 임의의 조합으로 투여된다. 또 다른 구현예에서, 인터페론, 예를 들어, 인터페론-α 또는 페길화된 인터페론(pegylated interferon)은 본 개시에 따르는 재조합 종양 용해성 바이러스를 투여하기 전에 투여된다.
본 개시에 따르는 종양 용해성 바이러스는 단일 투여 또는 다중 투여로 투여될 수 있다. 바이러스는 1 x 105 플라크 형성 단위(PFU), 5 x 105 PFU, 적어도 1 x 106 PFU, 5 x 106 또는 약 5 x 106 PFU, 1 x 107, 적어도 1 x 107 PFU, 1 x 108 또는 약 1 x 108 PFU, 적어도 1 x 108 PFU, 약 또는 적어도 5 x 108 PFU, 1 x 109 또는 적어도 1 x 109 PFU, 5 x 109 또는 적어도 5 x 109 PFU, 1 x 1010 PFU 또는 적어도 1 x 1010 PFU, 5 x 1010 또는 적어도 5 x 1010 PFU, 1 x 1011 또는 적어도 1 x l011, 1 x 1012 또는 적어도 1 x 1012, 1 x 1013 또는 적어도 1 x 1013의 투여량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 약 107-1013 사이, 약 108-1013 사이, 약 109-1012 사이, 또는 약 108-1012 사이의 투여량으로 투여될 수 있다 .
A. 병용 요법
추가 요법은 암 세포의 사멸, 암 세포 성장의 억제, 혈관신생의 억제를 증가시키거나 그렇지 않으면 종양 세포의 악성 표현형의 역전 또는 감소를 개선시키기 위해 지금까지 기재된 본 개시의 임의의 방법과 조합될 수 있다. 이들 조성물은 세포를 사멸시키거나 세포의 증식을 억제하는 데 효과적인 조합된 양으로 제공될 것이다. 이 과정은 세포를 발현 작제물 및 제제(들) 또는 인자(들)와 동시에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이것은 세포를 두 제제를 포함하는 단일 조성물 또는 약리학적 제형과 접촉시키거나 세포를 2개의 별개의 조성물 또는 제형과 동시에 접촉시킴으로써 달성될 수 있고, 여기서 하나의 조성물은 종양 용해성 바이러스를 포함하고, 나머지는 제2 제제 요법을 포함한다.
대안적으로, 치료는 수 분으로부터 수 주에 이르는 간격으로 다른 제제 또는 치료에 선행하거나 후속될 수 있다. 제제가 세포에 개별적으로 적용되는 구현예에서, 일반적으로 제제가 세포에서 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있도록 각 전달 사이에 상당한 기간이 만료되지 않았음을 보장할 것이다. 이러한 경우에, 하나는 서로 약 12-24시간 이내에, 더 바람직하게는 서로 약 6-12시간 이내에 두 양식과 세포를 접촉시킬 것이며, 단지 약 12시간의 지연 시간이 가장 바람직하다고 고려된다. 일부 상황에서는, 치료 기간을 상당히 연장하는 것이 바람직할 수 있지만, 수 일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수 주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주) 내지 수 개월(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개월)이 각 투여 사이에 경과한다.
또한 어느 하나의 제제를 1회 이상 투여하는 것이 바람직할 것으로 생각할 수 있다. 다양한 조합이 이용될 수 있고, 예를 들어, 여기서 하나 이상의 종양 용해성 바이러스 치료는 제2 제제의 투여 전에 투여되거나; 제2 제제는 종양 용해성 바이러스 투여 전에 투여될 수 있다. 연속 투여는 종양 용해성 바이러스 요법 또는 제2 제제의 1회 이상의 투여를 포함할 수 있다. 다시 말하지만, 세포 사멸을 달성하기 위해, 두 제제는 세포를 사멸시키기에 효과적인 조합된 양으로 세포에 전달된다. 예를 들어, 청구된 PD1 + IL-2/IL-12 시약과 면역 조절제의 조합.
본 개시의 특정 구현예에 따르면, 일단 대상체가 반응자(responder)로서 동정되거나 이러한 요법(예: vMYX-PD1 요법)에 반응할 가능성이 있는 경우 종양 용해성 바이러스 요법과 함께 사용될 수 있는 암 치료 방법이 제공된다. 이러한 요법은 본 개시의 검정이 대상체가 점액종 바이러스와 같은 복제 능력이 있는 종양 용해성 바이러스에 의한 치료에 반응할 가능성이 없음을 나타낼 때 이용될 수 있다. 대안적으로, 이러한 요법은 대상체가 복제 능력이 있는 종양 용해성 바이러스만으로의 치료에 반응할 가능성이 없는 것으로 본 발명의 방법에 의해 동정되는 경우 아데노바이러스와 같은 복제 능력이 있는 종양 용해성 바이러스와 조합하여 사용될 수 있다.
암 환자의 약 60%는 예방적, 진단적, 병기 결정(staging), 치유적 및 완화적 수술을 포함하는 일부 유형의 수술을 받을 것이다. 치유적 수술은 본 개시의 치료, 화학 요법, 방사선 요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역 요법 및/또는 대체 요법과 같은 다른 요법과 함께 사용될 수 있는 암 치료이다.
치유적 수술은 암성 조직의 전부 또는 일부가 물리적으로 제거, 절제 및/또는 파괴되는 절제술을 포함한다. 종양 절제는 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 지칭한다. 종양 절제 외에도, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 동결 수술, 전기 수술 및 현미경 제어 수술(모스 수술)을 포함한다. 본 개시는 표재성 암, 전암 또는 부수적 양의 정상 조직의 제거와 함께 사용될 수 있다는 것이 추가로 고려된다.
특정 측면에서, 요법은 수술 전 또는 암성 세포, 조직 또는 종양의 일부 또는 전부의 절제시 종양내 주사에 의해 투여된다. 치료는 또한 관류, 직접 주사 또는 추가의 항암 요법에 의한 이러한 지역의 국소 적용으로 달성될 수 있다. 이러한 치료는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5주 마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 마다 반복될 수 있다. 이러한 치료는 다양한 투여량으로 이루어질 수 있다.
본 개시에 따라 매우 다양한 화학 요법제가 사용될 수 있다. 용어 "화학 요법"은 암을 치료하기 위한 약물의 사용을 지칭한다. "화학 요법제"는 암 치료에 투여되는 화합물 또는 조성물을 암시하기 위해 사용된다. 이러한 제제 또는 약물은 세포내에서 그들의 활동 방식, 예를 들어, 그들이 세포 주기에 영향을 미치는 지의 여부 또는 어느 단계에서 영향을 미치는지에 의해 분류된다. 대안적으로, 제제는 DNA를 직접 교차 연결하거나, DNA에 삽입되거나, 핵산 합성에 영향을 미침으로써 염색체 및 유사 분열 이상을 유도하는 능력에 따라 특성화될 수 있다. 대부분의 화학 요법제는 다음 범주에 속한다: 알킬화제, 항대사산물, 항종양 항생제, 토포 아이소머라제 억제제 및 유사 분열 억제제.
알킬화제는 게놈 DNA와 직접 상호작용하여 암 세포가 증식하는 것을 방지한다. 이 약물 범주에는 세포 주기의 모든 단계에 영향을 미치고, 만성 백혈병, 비호지킨 림프종, 호지킨병, 악성 흑색종, 다발성 골수종 및 유방, 폐 및 난소의 특정암을 치료하는 데 일반적으로 사용되는 제제가 포함된다. 그들은 질소 머스타드(nitrogen mustard), 예를 들어, 메클로레타민(질소 머스타드), 클로람부실, 사이클로포스파미드(Cytoxan®), 이포스파미드 및 멜팔란, 니트로소우레아, 예를 들어, 스트렙토조신, 카르무스틴(BCNU) 및 로무스틴, 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부설판, 트리아진, 예를 들어, 다카르브진(DTIC) 및 테모졸로미드(Temodar®), 에틸렌이민, 예를 들어, 티오테파 및 알트레타민(헥사메틸멜라민), 및 백금 약물, 예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴 및 옥살라플라틴을 포함한다.
항대사산물은 DNA 및 RNA 합성을 방해한다. 알킬화제와 달리, 그들은 S 단계 동안 세포 주기에 특이적으로 영향을 미친다. 그들은 만성 백혈병과 유방, 난소 및 위장관의 종양을 퇴치하는 데 사용되었다. 항대사물질은 5-플루오로우라실(5-FU), 6-머캅토퓨린(6-MP), 카페시타빈(Xeloda®), 클라드리빈, 클로파라빈, 시타라빈(Ara-C®), 플록수리딘, 플루다라빈, 젬시타빈(Gemzar®), 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 펜토스타틴 및 티오구아닌을 포함한다.
항종양 항생제는 항균 및 세포 독성 활성을 모두 갖는다. 이러한 약물은 또한 효소와 유사 분열을 화학적으로 억제하거나 세포막을 변경하여 DNA를 방해한다. 이러한 제제는 세포 주기의 모든 단계에서 작동하며, 다양한 암을 치료하는 데 사용된다. 대표적인 예는 다우노루비신, 독소루비신(Adriamycin®), 에피루비신, 이다루비신, 악티노마이신-D, 블레오마이신 및 미토마이신-C를 포함한다. 일반적으로, 이들 화합물은 25-100mg/kg 범위의 용량으로 볼루스 i.v. 주사로 투여된다.
토포이소머라제 억제제는 DNA 가닥을 분리하는 데 도움이 되는 효소인 토포이소머라제를 방해하여 복제될 수 있고, 특정 백혈병, 및 폐, 난소, 위장 및 기타 암을 치료하는 데 사용되고, 토포테칸, 이리노테칸, 에토포사이드(VP-16) 및 테니포사이드를 포함한다.
유사 분열 억제제, 종종 식물 알칼로이드는 세포 주기의 M 단계 동안 작용하고, 유사 분열을 예방하거나 효소가 세포 재생에 필요한 단백질을 생산하는 것을 억제한다. 대표적인 예는 탁산, 예를 들어, 파클리탁셀(Taxol®) 및 도세탁셀(Taxotere®), 에포틸론, 예를 들어, 익사베필론(Ixempra®), 빈카 알칼로이드, 예를 들어, 빈블라스틴(Velban®), 빈크리스틴(Onocovin®) 및 비노렐빈(Navelbine®) 및 에스트라무스틴(Emcyt®)을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 요법은 면역 체크포인트 억제제를 사용한 치료일 수 있다. 면역 체크포인트는 신호(예: 공동 자극 분자)를 높이거나, 신호를 낮춘다. 면역 체크포인트 차단에 의해 표적화될 수 있는 억제성 면역 체크포인트는 아데노신 A2A 수용체(A2AR), B7-H3(CD276으로서 공지되기도 함), B 및 T 림프구 감쇠 제(BTLA), 세포 독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA-4, CD152로서 공지되기도 함), 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO), 킬러-세포 면역글로불린(KIR), 림프구 활성화 유전자-3(LAG3), 프로그램된 사멸 1(PD-1), T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인(mucin-domain) 3(TIM-3) 및 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA)를 포함한다.
면역 체크포인트 억제제는 소분자, 리간드 또는 수용체의 재조합 형태와 같은 약물일 수 있거나, 특히 면역 체크포인트 단백질에 대한 인간 항체와 같은 항체일 수 있다(예: 국제 특허 공보 W02015016718; Pardoll, 2012; 둘 다 본원에 참조로 포함됨). 면역 체크포인트 단백질의 공지된 억제제 또는 이의 유사체가 사용될 수 있으며, 특히 항체의 키메라화, 인간화 또는 인간 형태가 사용될 수 있다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, 본 개시에 언급된 특정 항체에 대해 대안 및/또는 동등한 명칭이 사용될 수 있다. 이러한 대안 및/또는 동등한 명칭은 본 개시의 맥락에서 상호교환 가능하다. 예를 들어, 람브롤리주맙은 MK-3475 및 펨브롤리주맙의 대안 및 동등한 명칭으로 공지되기도 한다는 것이 공지되어 있다. 예시적인 면역 체크포인트 억제제는 PD-1 억제제, 예를 들어, 펨브롤리주맙 및 니볼루맙; PD-L1 억제제, 예를 들어, 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 두르발루맙; 및 CTLA-4 억제제, 예를 들어, 이필리무맙을 포함한다.
특정의 바람직한 구현예에서, 부가적인 항종양 효과는 점액종 vPD1을 T-세포에 대한 PD1의 차단과 직접 조합함으로써 달성될 수 있다. 임상적으로, 이것은 PDL1과의 상호작용을 차단하는 PD1에 결합하는 항체의 사용을 통해 달성될 수 있다. 개별적 면역 체크포인트 억제의 조합이 훨씬 더 나은 항종양 활성을 달성한다는 것이 임상적으로 관찰되었다(참조: Johnson and Win, 2017, 전문이 본원에 참조로 포함됨). 본 발명에 따르는 점액종 vPD1 및 항-PD1 항체를 조합하는 추가의 이점은 전이성 질환의 환경에 있을 수 있다. 종양내 주사를 통해 국소적으로 투여된 점액종 vPD1은 PK/PD 문제로 인해 전이성 질환에 최적이 아닐 수 있다.
본 발명에 따르는 종양 용해성 바이러스를 항-PD1 항체와 조합하는 것이 유망한 접근법이지만, 항-PD1 항체와 점액종 바이러스로부터 발현된 가용성 PD1의 상호작용을 통해 가능한 합병증이 발생할 수 있다. 이러한 가능성을 개선하기 위해, 2개의 임상적으로 승인된 항-PD1 항체 사이의 항체 인식을 방지하는 CD 루프에 돌연변이를 함유하는 PD1 작제물을 발현하는 점액종 바이러스가 생성되었다. 하나의 구현예에서, PD1 단백질의 위치 D85G에서의 부위 돌연변이는 PD1에 대한 항-PD1 항체 펨브롤리주맙의 결합을 완전히 폐지할 것이다(Tan et al., 2017, 전문이 본원에 참조로 포함됨; 및 Na et al., 전문이 본원에 참조로 포함됨). 따라서, 이 구현예에서, 절단된 PD1 점액종 작제물에서 CD 루프 사이에 단일 점 돌연변이(point mutation) 또는 단일 점 돌연변이의 조합을 도입하면 항-PD1 항체의 임의의 억제성 결합을 감소시킬 것이다.
다른 화학 요법제는 표적화 요법, 예를 들어, 이마티닙(Gleevec®), 게피티 닙(Iressa®), 수니티닙(Sutent®), 소라페닙(Nexavar®), 보르테조밉(Velcade®), 베바시주맙(Avastin®), 트라스투주맙(Herceptin®), 세툭시맙(Erbitux®) 및 파니투무맙(Vectibix®), 풀베스트란트(Faslodex®), 타목시펜, 토레미핀과 같은 항에스트로겐을 포함하는 호르몬 요법, 아로마타제 억제제, 예를 들어, 아나스트로졸, 엑셈스탄 및 레트로졸, 프로게스틴, 예를 들어, 메게스트롤 아세테이트, 및 고나도트로핀 방출 호르몬 및 면역 요법, 예를 들어, 약물 또는 독소(예: 방사성 핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소)에 접합될 수 있는 종양 특이적 항원에 대한 항체(예: 전립선 특이적 항원, 암 배아성 항원, 비뇨기 종양 관련 항원, 태아 항원, 티로시나제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 에스트로겐 수용체, 라미닌 수용체, erb B 및 pl55)를 포함한다.
방사선 요법으로 칭명되기도 하는 방사선 요법은 피부, 혀, 후두, 뇌, 유방 또는 자궁경부의 암과 같은 국소 고형 종양을 치료하는 데 사용될 수 있거나, 혈액 형성 세포의 암(백혈병) 및 림프계 암(림프종)을 치료하는 데 사용될 수 있는 전리 방사선(ionizing radiation)에 의한 암 및 기타 질환의 치료이다. 방사선 요법은, 제한 없이, y-선, X-선의 사용 및/또는 종양 세포에 방사성 동위 원소의 지시된 전달을 포함한다. 마이크로파 및 UV 조사와 같은 다른 형태의 DNA 손상 인자가 고려된다. X-선의 선량(dose) 범위는 장기간 동안(3-4주) 50-200뢴트겐의 1일 선량으로부터 2000-6000뢴트겐의 단일 선량까지의 범위이다.
방사선 요법은 또한 방사선 선량을 암 부위에 직접 전달하기 위한 방사선 표지 항체의 사용(예: 방사선 면역 요법, 등각 방사선 요법), 고해상도 강도 조절된 방사선 요법 및 정위 방사선 수술을 포함한다. 뇌 및 기타 종양에 대한 정위 방사선 수술(감마 나이프)은 수백 가지 상이한 각도로부터 정확하게 표적화된 감마 방사선 요법의 빔을 사용한다. 약 4 내지 5시간이 소요되는 하나의 세션만이 필요하다.
B. 약제학적 조성물
본원에 기재된 재조합 종양 용해성 바이러스는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된 약제 또는 의약으로서 투여될 수 있다. 따라서, 재조합 종양 용해성 바이러스는 의약 또는 약제학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 본 개시의 약제학적 조성물은 비경구 투여를 위한 용액 또는 동결 건조 분말로서 제형화될 수 있다. 분말은 사용 전에 적합한 희석제 또는 다른 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하여 재구성될 수 있다. 액체 제형은 완충된 등장성 수용액일 수 있다. 분말은 또한 건조한 형태로 분무할 수 있다. 적합한 희석제의 예는 정상 등장성 식염수 용액, 물 중 표준 5% 덱스트로스, 또는 완충된 나트륨 또는 암모늄 아세테이트 용액이다. 이러한 제형은 특히 비경구 투여에 적합하지만, 경구 투여용으로도 사용될 수 있거나 흡입을 위한 계량된 용량 흡입기 또는 분무기에 함유될 수 있다. 부형제, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 하이드록시 셀룰로스, 아카시아, 폴리에틸렌 글리콜, 만니톨, 염화나트륨, 나트륨 시트레이트 등을 첨가하는 것이 바람직할 수 있다.
대안적으로, 치료제는 경구 투여를 위해 캡슐화, 정제화 또는 에멀젼 또는 시럽으로 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 고체 또는 액체 담체가 첨가되어 조성물을 향상 또는 안정화시키거나, 조성물의 제조를 용이하게 할 수 있다. 고체 담체는 전분, 락토스, 황산칼슘 이수화물, 테라 알바, 마그네슘 스테아레이트 또는 스테아르산, 활석, 펙틴, 아카시아, 한천 또는 젤라틴을 포함한다. 액체 담체는 시럽, 땅콩 오일, 올리브 오일, 식염수 및 물을 포함한다. 담체는 또한 단독으로 또는 왁스와 함께 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 서방성 물질을 포함할 수 있다. 고체 담체의 양은 다양하지만, 바람직하게는 투여량 단위당 약 20mg 내지 약 1g 사이일 것이다. 약제학적 제제는 정제 형태의 경우에, 필요한 경우, 밀링(milling), 혼합, 과립화 및 압축; 또는 경질 젤라틴 캡슐 형태의 경우, 밀링, 혼합 및 충전을 포함하는 통상적인 약제 기술에 따라 제조된다. 액체 담체가 사용되는 경우, 제제는 시럽, 엘릭서, 에멀젼 또는 수성 또는 비수성 현탁액의 형태일 수 있다. 직장 투여의 경우, 본 개시 화합물은 부형제, 예를 들어, 코코아 버터, 글리세린, 젤라틴, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 조합되고, 좌제로 성형될 수 있다.
치료제는 다른 의학적으로 유용한 약물 또는 생물학적 제제를 포함하도록 제형화될 수 있다. 치료제는 또한 개시 화합물이 지시되는 질환 또는 상태에 유용한 다른 약물 또는 생물학적 제제의 투여와 함께 투여될 수 있다.
본 개시의 생물학적 또는 약제학적 조성물은 조성물을 대상체에게 투여시 그 안에 함유된 재조합 종양 용해성 바이러스가 생체 이용 가능하도록 제형화될 수 있다. 투여 후 혈청, 종양 및 기타 조직에서 재조합 종양 용해성 바이러스의 수준은 항체 기반 검정(예: ELISA)과 같은 다양한 잘 확립된 기술로 모니터링될 수 있다. 특정 구현예에서, 재조합 종양 용해성 바이러스 조성물은 비-인간 동물 또는 인간과 같은 이를 필요로 하는 대상체(예: 종양을 갖는 대상체)에 비경구 투여용으로 제형화된다. 바람직한 투여 경로는 정맥내, 동맥내, 피하, 종양내 또는 근육내를 포함한다.
적절한 제형은 당업계에 공지된 바와 같이 선택된 투여 경로에 의존한다. 예를 들어, 전신 제형은 주사, 예를 들어, 피하, 동맥내, 정맥내, 근육내, 척수강 내 또는 복강내 주사에 의한 투여용으로 설계된 것들뿐만 아니라 종양내, 경피, 경 점막, 경구, 비강내 또는 폐 투여용으로 설계된 것들을 포함하는 구현예이다. 하나의 구현예에서, 전신 또는 종양내 제형은 무균이다. 주사용 구현예에서, 본 개시의 재조합 종양 용해성 바이러스 조성물은 수용액으로, 또는 생리학적으로 적합한 용액 또는 완충액, 예를 들어, 행크스 용액, 링거 용액, 만니톨 용액 또는 생리 식염수 완충제로 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 재조합 종양 용해성 바이러스 조성물은 제형화제, 예를 들어, 현탁화제, 안정화제 또는 분산제를 함유할 수 있다. 경점막 투여용 구현예에서, 침투될 해리어(harrier)에 적합한 침투제, 가용화제 또는 연화제가 제형에 사용될 수 있다. 예를 들어, 1-도데실헥사 하이드로-2H-아제핀-2-온(Azon®), 올레산, 프로필렌 글리콜, 멘톨, 디에틸렌글리콜 에톡시글리콜 모노에틸 에테르(Transcutol®), 폴리소르베이트 폴리에틸렌소르 비탄 모노라우레이트(Tween®-20) 및 약물 7-클로로-1-메틸-5-페닐-3H-1,4-벤조디아제핀-2-온(디아제팜), 이소프로필 미리스테이트 및 당해 분야에 일반적으로 공지된 기타 이러한 침투제, 가용화제 또는 연화제가 본 개시의 임의의 조성물에 사용될 수 있다.
투여는 경로의 조합, 예를 들어, 동맥내 경로를 사용한 제1 투여 및 정맥내 또는 종양내 경로를 통한 후속 투여, 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 달성될 수 있다.
IV. 실시예
본 개시의 바람직한 구현예를 입증하기 위해 하기 실시예가 포함된다. 다음의 실시예에 개시된 기술은 본 개시의 실행에서 잘 기능하는 본 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내고, 따라서 그 실행을 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것을 당업자는 이해해야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시에 비추어, 개시되는 특정 구현예에서 많은 변화가 이루어질 수 있고 개시의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고 여전히 유사하거나 유사한 결과를 수득할 수 있음을 인식해야 한다.
실시예 1- vMYX-PD1 작제물의 생성 및 특성화
재조합 바이러스 작제물은 가용성 PD1 또는 가용성 PD1과 임의로 다양한 인터류킨으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 도 1의 대표적인 재조합 바이러스 게놈 구조의 개략도를 참조한다.
vPD1 및 돌연변이체 vPD1을 작제하기 위해, 인간 PD1의 세포외 영역(아미노산 1-168)은 다음 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 사전 작제된 주형 플라스미드(PlasmID 데이터베이스, 클론 HsCD00345685)로부터 증폭되었다.
전방 프라이머:
ATCGCCCGGGAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAACCATGCAGATCCCACAGGCGCC [서열번호 1]
역방 프라이머:
ATCGGAATTCTCAGGTTTGGAACTGGCCGGCTG [서열번호 2]
가용성 PD1 뉴클레오티드 서열:
ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCTTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACC [서열번호 3]
천연 가용성 PD1 아미노산 서열(1-168)
Ql5116 20 아미노 신호 펩티드
MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQFQT [서열번호 4]
돌연변이된 가용성 PD1 아미노산 서열(1-168)(D85G 치환은 PD1에 대한 펨브롤리주맙의 결합을 폐지한다)
20 아미노 신호 펩티드
MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDK L A AFP EG RSQP G QDCRF R VTQL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQFQT [서열번호 5]
인간 IL-2 아미노산 서열(1-153)
P60568 20 아미노 신호 펩티드
MYRMQLLSCI ALSLALVTNS APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT [서열번호 6]
인간 IL-12, 서브유닛(subunit) 알파 아미노산 서열(1-219)
P29459 22 아미노 신호 펩티드
MCPARSLLLV ATLVLLDHLS LARNLPVATP DPGMFPCLHH SQNLLRAVSN MLQKARQTLE FYPCTSEEID HEDITKDKTS TVEACLPLEL TKNESCLNSR ETSFITNGSC LASRKTSFMM ALCLSSIYED LKMYQVEFKT MNAKLLMDPK RQIFLDQNML AVIDELMQAL NFNSETVPQK SSLEEPDFYK TKIKLCILLH AFRIRAVTID RVMSYLNAS [서열번호 7]
인간 IL-12, 서브유닛 베타 아미노산 서열(1-328)
P29460 22 아미노산 신호 펩티드
MCHQQLVISW FSLVFLASPL VA IWELKKDV YVVELDWYPD APGEMVVLTC DTPEEDGITW TLDQSSEVLG SGKTLTIQVK EFGDAGQYTC HKGGEVLSHS LLLLHKKEDG IWSTDILKDQ KEPKNKTFLR CEAKNYSGRF TCWWLTTIST DLTFSVKSSR GSSDPQGVTC GAATLSAERV RGDNKEYEYS VECQEDSACP AAEESLPIEV MVDAVHKLKY ENYTSSFFIR DIIKPDPPKN LQLKPLKNSR QVEVSWEYPD TWSTPHSYFS LTFCVQVQGK SKREKKDRVF TDKTSATVIC RKNASISVRA QDRYYSSSWS EWASVPCS [서열번호 8]
고친화성 인간 IL-2 아미노산 변이체(1-164)
P60568 20 아미노 신호 펩티드
MYRMQLLSCI ALSLALVTNS APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF DPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLTAAAHHHH HHHH [서열번호 9]
도 2는 피하 B16F10(B16F10 PD1L-KO) 반대측 이종 이식 모델에서 vPD1-IL2 효능 연구를 보여준다. 도 3은 피하 B16F10(B16F10 PD1L-KO) 반대측 이종 이식 모델에서의 vPD1-IL12 효능 연구를 보여준다. 도 4는 피하 B16F10(B16F10 PD1L-KO) 반대측 이종 이식 모델에서 vPD1-IL15 효능 연구 결과를 보여준다. 마찬가지로, 도 5는 피하 B16F10(B16F10 PD1L-KO) 반대측 이종 이식 모델에서 vPD1-IL18 효능 연구 결과를 보여준다. 종합하면, IL-2와 IL-15는 종양 크기의 보통의 감소를 나타내지만, IL-12는 가장 큰 감소를 제공한다. IL-18은 최소한의 효과를 갖는 것으로 나타난다.
도 6 및 7에 제시된 바와 같이, 생체내 피하(SC) 반대쪽 마우스 모델이 다양한 바이러스 작제물을 테스트하는데 사용되었다. 왼쪽 측면(WT-B16/F10)에 2일 간격으로 세 번의 종양내 주사가 이루어졌고, 오른쪽 측면(PDL1-KO-B16/F10)은 처리되지 않았다. 주사된 종양(왼쪽)과 반대쪽 비주사된 종양(오른쪽)은 vPD1/IL12 및 vPDl/IL2 치료에 반응하는 것으로 보인다. vPD1/IL15는 또한 보통의 반응을 보인 반면, vPD/IL18은 무시할만한 효과를 나타낸다. 종합하면, IL-12는 놀랍게도 테스트된 다른 작제물보다 주사된 종양과 반대쪽 종양 모두의 크기가 더 크게 감소함을 보여준다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
도 15에 도시된 바와 같이, vPD1 단독, vILl2 단독 및 vPD1 + IL12의 조합의 효능을 평가하기 위해 마우스 연구를 수행하였다. 마우스는 양쪽 측면에 4x106 B16/F10 세포를 주사했다. 종양이 확립된 후, 더 큰 종양은 5일에 걸쳐(0일, 2일 및 4일) 표시된 바이러스의 3회 주사로 처리되었다. 전체 종양 부담이 400mm2를 초과할 때 마우스가 안락사될 때까지 종양의 성장과 마우스의 체중을 모니터링했다. vPD1 + IL12의 조합이 마우스의 종양 성장의 감소 및 전체 생존율의 증가에 가장 중요한 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다.
바이러스의 추가 개발은 IL12에 막관통 도메인의 추가를 포함한다. 막관통 도메인은 IL12가 혈액으로 누출되는 것을 방지한다.
막관통 및 세포질(cytosolic) 도메인
Figure pct00004
PD1-IL12-막관통 도메인 작제물
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
실시예 2- vMYX-TIM3 작제물의 생성
vTIM3은 변형되지 않은 점액종 바이러스(로잔 균주)를 다음의 중요한 요소를 함유하는 플라스미드인 pBS-Ml35/M136-sE/L GFP+TIM3과 상동적으로 재조합함으로써 생성되었다.
- pBluescript 플라스미드 골격
- M134/M135에 상동성인 점액종 게놈의 영역
- 컨센서스 폭스바이러스 합성 초기/후기 프로모터에 의해 구동되는 eGFP
- 제2 컨센서스 폭스바이러스 합성 초기/후기 프로모터에 의해 구동되는 뮤린 TIM3의 aal-195
- M136에 상동성인 점액종 게놈의 영역
TIM3-GFP 작제물
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
가용성 TIM3
Figure pct00012
pBS-M135/Ml36-sE/L GFP+TIM3을 BSC40 세포로 형질 감염시킨 다음, 변형되지 않은 점액종 바이러스(로잔 균주)로 감염시켰다. 세포를 72시간 동안 배양하여 M135와 M136 사이의 바이러스 게놈의 번역되지 않은 영역이 eGFP와 가용성 TIM3을 모두 발현하는 카세트로 대체된 재조합 바이러스를 생산했다(도 12a). 이어서, 재조합 바이러스를 GFP+ 클론을 선택하여 BSC40 세포에서 4중 플라크 정제하였다. 이어서, 최종 바이러스(vTIM3)의 클론성은 PCR을 사용하여 확인되었다.
vTIM3의 시험관내 특성화: vTIM3은 감염 세포로부터 가용성 PD1을 분비한다: 바이러스 감염 세포로부터 가용성 PD1의 분비는 24시간 감염 후 식염수(모의), vGFP(대조군 바이러스), 또는 vTIM3으로 감염된 B16/F10 흑색종 세포로부터 상청액을 웨스턴 블로팅하여 확인되었다. TIM3의 가용성 부분과 일치하는 강한 밴드가 vTIM3으로 감염된 세포의 상청액에서 특이적으로 관찰되었다(도 12d).
vTIM3은 시험관내에서 정상적인 복제 및 종양 용해 능력을 나타낸다: TIM3 도입유전자의 삽입이 MYXV 복제를 변경할지 여부를 결정하기 위해, 다양한 세포에서 vGFP 및 vTIM3 모두에 대해 단일 단계 성장 곡선을 수행했다. 두 바이러스가 테스트된 모든 세포 유형에서 동일한 복제를 나타내는 것으로 관찰되었다(도 12b 및 12c). TIM3 도입유전자의 분비가 감염된 세포를 직접 사멸시키는 MYXV의 능력을 변경하는지 여부를 추가로 테스트하기 위해, 다음으로 vGFP와 vTIM3이 B16/F10 흑색종 세포를 사멸시키는데 얼마나 효과적인지 질문했다. B16/F10 세포는 지시된 감염 다중도로 vGFP 또는 vTIM3으로 감염시켰다. 24시간 후, MTT 검정을 사용하여 세포 생존력을 분석하였다. vGFP 및 vTIM3 모두 시험관내에서 감염된 흑색종 세포를 사멸시키는 동일한 능력을 나타내는 것으로 관찰되었다(도 13).
생체내 흑색종에 대한 종양 용해 가능성: vTIM3이 생체내 증가된 종양 용해 능력을 나타내는지 여부를 테스트하기 위해, 확립된 흑색종 종양을 퇴행시키는 그의 능력을 마우스에서 테스트하였다. C57/B6 마우스에 5x105 B16/F10 흑색종 세포를 피하 이식하였다. 치료는 종양 세포 주입 7일 후(종양이 약 15-20mm2인 경우) 개시되었다. 치료는 7일 및 12일째에 제공된 식염수, 1x107 FFU의 vGFP, 또는 1x107 FFU의 vTIM3의 2가지 종양내 주사로 구성되었다. 이어서, 동물을 종양 크기에 대해 매일 모니터링하고, 종양이 임의의 방향으로 150mm에 도달하면 안락사시켰다. vGFP로 처리된 동물은 감소된 종양 성장을 나타냈지만, 이들 동물에서 대부분의 종양은 여전히 진행되어 최종적으로 안락사를 필요로 한다(도 13). 대조적으로, vTIM3으로 처리된 많은 마우스는 확립된 종양의 급속한 퇴행을 나타내어 7/12 동물에서 완전한 지속적 관해를 초래했다.
각 TIM3 리간드에 대해 이전에 검증된 결합 부위가 돌연변이 유발을 통해 제거된 가용성 TIM3 단백질의 변이체를 발현하는 일련의 바이러스를 작제하였다(도 14). 이들 바이러스 각각은 생체내에서 α종양 면역을 유도하고 확립된 종양을 박멸하는 능력에 대해 테스트된다. 이는 vTIM3 기반 체크포인트 차단과 관련된 메커니즘을 동정하고, 치료 효능이 개선된 차세대 vTIM3 작제물의 작제를 허용한다.
실시예 3- 전이성 질환에서 vMYX-요법
분비된 형태의 가용성 PD1(vPD1)을 발현하는 재조합 MYXV도 또한 전이성 암에 대한 활성을 결정하기 위해 연구되었다. 불행히도, vPD1은 (예를 들어, 항종양 면역 유지를 통해) 국소 질환을 근절하는데 매우 효과적이지만(예: 도 16 참조), 추가 실험은 조사되지 않은 전이성 종양에 비해 감소된 효과를 갖는다는 것을 나타냈다(참조: 도 16b). vPD1이 처리되지 않은 병변을 효과적으로 퇴행시킬 수 없기 때문에, 이 바이러스의 임상적 잠재력을 향상시키기 위해, vPD1 골격에 추가될 수 있는 추가 변형이 연구되어 전신 효능을 개선시켰다. 가용성 PD1 및 추가의 가용성 T 세포 체크포인트 단백질 또는 일련의 전염증성 사이토카인을 모두 발현하는 추가의 재조합 바이러스(참조: 도 17a). 이어서, 이러한 바이러스 각각을 클론성으로 정제하고, 표준 반대측 종양 모델에서 주사된 및 주사되지 않은 루이스 폐 암종(LLC) 모두를 퇴행시키는 능력을 테스트했다. 결과는 테스트된 분자 중, IL-12(p40/p35 융합 단백질로서 인코딩됨)의 포함(inclusion)만이 주사되지 않은 병변에 대한 vPD1 골격의 효능을 상당히 개선시켰음을 나타냈다(도 17b-c). 그러나, 인상적으로, vPD1/IL12는 거의 모든 처리된 마우스에서 주사된 병변과 주사되지 않은 병변 모두를 완전히 퇴행시킬 수 있었으며(10/12 동물에서 120일 초과 지속되는 내구성(durable) 있는 완전 반응) 거의 90%의 효과적인 '치료율'을 초래했다. 놀랍게도, 벌키한 충분히 확립된 질환이 있는 동물(350-400mm2 사이의 총 종양 부담을 나타내는 초기 '모의' 코호트 동물)에서도, vPD1/IL12에 의한 단일 종양의 치료는 처리된 종양의 완전한 제거뿐만 아니라 처리되지 않은 종양에서 상당한 퇴행을 야기할 수 있었다(도 17d). 이 연구는 vPD1/IL12 바이러스가 심지어 후기 단계 전이성 질환에 대한 강력한 임상적 잠재력을 갖는 새로운 치료제였음을 입증한다.
이 흥미로운 초기 발견을 진전시키기 위해, vPD1/IL12 바이러스의 치료 폭이 추가로 연구되었다. 이를 달성하기 위해, IL12 융합 단백질(vILl2)을 발현하는 단일 재조합 MYXV는 전이성 질환의 전임상 모델: LLC 폐암(SQ 반대쪽 종양 모델), B16/F10 흑색종(SQ 반대쪽 종양 모델), 4T1 및 삼중 음성 유방암(단일 SQ 종양이 자발적으로 폐로 전이됨)에서 이 바이러스의 효능을 vPD1 및 vPD1/IL12 모두의 효능과 비교했다. 모든 모델의 결과는 다음을 명백하게 입증했다: 1) vPD1/IL12 바이러스가 면역학적으로 '뜨거운(hot)'(LLC 및 B16/F10) 및 면역학적으로 '차가운(cold)'(4T1 및 ID8) 형태의 질환을 모두 나타내는 종양을 포함하는 다양한 범위의 상이한 악성 종양으로부터 처리된 병변과 처리되지 않은 병변을 모두 퇴행시킬 수 있었다. 2) 이 임상 효능은 어느 단일 재조합 바이러스(vPD1 또는 vIL12)에 의한 치료 후 임의의 모델에서 관찰되지 않았으며, 이는 vPD1/IL12의 치료 효과가 독특한 형태의 조합 시너지에 기인함을 나타낸다(도 18-20).
본원에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시에 비추어 과도한 실험없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 개시의 조성물 및 방법이 바람직한 구현예의 관점에서 기재되었지만, 본 개시의 개념, 정신 및 범위를 벗어나지 않고 방법 및 본원에 기재된 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형이 적용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련된 특정 제제가 본원에 기재된 제제로 치환될 수 있는 반면 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있음이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 개시의 정신, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
참고 문헌
다음의 참고 문헌은 그들이 본원에 제시된 것들에 보충적인 예시적인 절차적 또는 다른 세부 사항을 제공하는 정도로 본원에 참고로 구체적으로 포함된다.
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gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240 gctttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300 cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360 tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420 gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480 aggccagccg gccagttcca aacc 504 <210> 4 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 4 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly 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actctatcta cacctggggc acttgtgcct atgtgctggg gcaagggatt ctgtccttgg 180 tcacagtgta ccaacgagtt gctcagaact gatgaaagaa atgtgacata tcagaaatcc 240 agcagatacc agctaaaggg cgatctcaac aaaggagacg tgtctctgat cataaagaat 300 gtgactctgg atgaccatgg gacctactgc tgcaggatac agttccctgg tcttatgaat 360 gataaaaaat tagaactgaa attagacatc aaagcagcca aggtcactcc agctcagact 420 gcccatgggg actctactac agcttctcca agaaccctaa ccacggagag aaatggttca 480 gagacacaga cactggtgac cctccataat aacaatggaa caaaaatttc cacatgggct 540 gatgaaatta aggactctgg agaaacgatc agaactgcta tccac 585 <210> 12 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 cttgtgctct ttggggcagg attcggcgca gtaataacag tcgtcgtcat cgttgtcatc 60 atcaaatgct tctgtaagca cagaagctgt ttcagaagaa atgaggcaag cagagaaaca 120 aacaacagcc ttaccttcgg gcctgaagaa gcattagctg aacagaccgt cttcctt 177 <210> 13 <211> 7620 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 13 agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc 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900 taaaaacgac gggactggac tttttgttta tggggaaact ctaaaaaaaa ttgtcaatta 960 aagtaactgc agatcgatcg catatgaaaa ttgaaatttt attttttttt tttggaatat 1020 aaataatggt gagcaagggc gaggaggtca tcaaagagtt catgcgcttc aaggtgcgca 1080 tggagggctc catgaacggc cacgagttcg agatcgaggg cgagggcgag ggccgcccct 1140 acgagggcac ccagaccgcc aagctgaagg tgaccaaggg cggccccctg cccttcgcct 1200 gggacatcct gtccccccag ttcatgtacg gctccaaggc gtacgtgaag caccccgccg 1260 acatccccga ttacaagaag ctgtccttcc ccgagggctt caagtgggag cgcgtgatga 1320 acttcgagga cggcggtctg gtgaccgtga cccaggactc ctccctccaa gacggcacgc 1380 tgatctacaa ggtgaagatg cgcggcacca acttcccccc cgacggcccc gtaatgcaga 1440 agaagaccat gggctgggag gcctccaccg agcgcctgta cccccgcgac ggcgtgctga 1500 agggcgagat ccaccaggcc ctgaagctga aggacggcgg ccactacctg gtggagttca 1560 agaccatcta catggccaag aagcccgtgc aactgcccgg ctactactac gtggacacca 1620 agctggacat cacctcccac aacgaggact acaccatcgt ggaacagtac gagcgctccg 1680 agggccgcca ccacctgttc ctggggcatg gcaccggcag caccggcagc ggcagctccg 1740 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gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc 5160 agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 5220 aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg 5280 cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct 5340 tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta 5400 gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt 5460 tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg 5520 ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat 5580 tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt 5640 taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta ggtggcactt 5700 ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 5760 atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 5820 tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 5880 tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 5940 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14 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Gly Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln 20 25 <210> 15 <211> 26 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro 1 5 10 15 Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln Ile Ile Gln 20 25 <210> 16 <211> 26 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 16 Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe Cys Asn Gly Tyr Ser Gln Pro 1 5 10 15 Val Arg Asp Ala Arg Phe Gln Ile Val Gln 20 25 <210> 17 <211> 26 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 17 Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Gln Glu Asp Arg Ile Glu Pro 1 5 10 15 Gly Arg Asp Arg Arg Phe Arg Val Met Arg 20 25 <210> 18 <211> 26 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 18 Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Arg Glu Asp Ser Ser Gln Pro 1 5 10 15 Gly Arg Ser Gly Arg Phe Arg Val Thr Arg 20 25 <210> 19 <211> 195 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 19 Met Gly Ser Gly Leu Thr Leu Asn Cys Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu 1 5 10 15 Leu Leu Ala Arg Ser Leu Glu Asp Gly Tyr Lys Val Glu Val Gly Lys 20 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Pro Thr Ser Gly Thr Leu 35 40 45 Val Pro Met Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Gln Ser Gln Cys Thr 50 55 60 Asn Glu Leu Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser 65 70 75 80 Ser Arg Tyr Gln Leu Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu 85 90 95 Ile Ile Lys Asn Val Thr Leu Asp Asp His Gly Thr Tyr Cys Cys Arg 100 105 110 Ile Gln Phe Pro Gly Leu Met Asn Asp Lys Lys Leu Glu Leu Lys Leu 115 120 125 Asp Ile Lys Ala Ala Lys Val Thr Pro Ala Gln Thr Ala His Gly Asp 130 135 140 Ser Thr Thr Ala Ser Pro Arg Thr Leu Thr Thr Glu Arg Asn Gly Ser 145 150 155 160 Glu Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu His Asn Asn Asn Gly Thr Lys Ile 165 170 175 Ser Thr Trp Ala Asp Glu Ile Lys Asp Ser Gly Glu Thr Ile Arg Thr 180 185 190 Ala Ile His 195 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 20 aaaattgaaa ttttattttt tttttttgga atataaata 39

Claims (95)

  1. (a) 가용성 형태의 프로그램된 세포사 단백질(programmed cell death protein) 1(PD1), 및 (b) 인터류킨 12(IL-12) 또는 인터류킨 2(IL-2)를 인코딩(encoding)하는 하나 이상의 발현 카세트(expression cassette)를 포함하는 재조합 종양 용해성 바이러스(recombinant oncolytic virus)로서, 바이러스가 복제 수행능력(replication competent)이 있는, 재조합 종양 용해성 바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 바이러스가 (a) 가용성 형태의 프로그램된 세포사 단백질 1(PD1), 및 (b) 인터류킨 12(IL-12)를 인코딩하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는, 종양 용해성 바이러스.
  3. 돌연변이체(mutant) 가용성 형태의 PD1(mutPDl) 및 임의로 인터류킨 12(IL-12) 또는 인터류킨 2(IL-2)를 인코딩하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 재조합 종양 용해성 바이러스로서, 바이러스가 복제 수행 능력이 있고, mutPDl이 항-PD1 항체에 의한 mutPD1의 인식을 방지하는, 재조합 종양 용해성 바이러스.
  4. 제3항에 있어서, 바이러스가 돌연변이체 가용성 형태의 PD1(mutPD1) 및 인터류킨 12(IL-12)를 인코딩하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는, 종양 용해성 바이러스.
  5. 제3항에 있어서, mutPD1이 항-PD1 항체에 의한 항체 인식을 방지하는 CD 루프(loop) 내에 돌연변이를 함유하는, 종양 용해성 바이러스.
  6. 제5항에 있어서, mutPD1이 D85G를 포함하는 CD 루프 내에 점 돌연변이(point mutation)를 함유하는, 종양 용해성 바이러스.
  7. 제6항에 있어서, mutPD1이 펨브롤리주맙에 의해 인식되지 않는, 종양 용해성 바이러스.
  8. 제1항 또는 제3항에 있어서, 가용성 PD1이 인간 PD1의 세포외 영역을 포함하는, 종양 용해성 바이러스.
  9. 제8항에 있어서, 인간 PD1 및 IL-2 또는 IL-12의 세포외 영역이 단일 발현 카세트에서 인코딩되는, 종양 용해성 바이러스.
  10. 제1항 또는 제3항에 있어서, 발현 카세트(들)가 하나 이상의 바이러스 프로모터(viral promoter)의 제어하에 있는, 종양 용해성 바이러스.
  11. 제10항에 있어서, 하나 이상의 바이러스 프로모터가 합성 초기/후기 폭스바이러스(poxvirus) 프로모터인, 종양 용해성 바이러스.
  12. 제11항에 있어서, 합성 초기/후기 폭스바이러스 프로모터가 서열번호 20과 적어도 90% 동일한, 종양 용해성 바이러스.
  13. 제1항 또는 제3항에 있어서, 바이러스가 점액종 바이러스, 레오바이러스, 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease virus), 홍역 바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스, 랍도바이러스(rhapdovirus), 피코르나바이러스, 콕사키바이러스(coxsackievirus) 및 파르보바이러스(parvovirus)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 종양 용해성 바이러스.
  14. 제13항에 있어서, 종양 용해성 바이러스가 점액종 바이러스인, 종양 용해성 바이러스.
  15. 제14항에 있어서, PD1, IL-2 및/또는 IL-12 발현 카세트(들)의 세포외 영역이 (i) 바이러스 M153R 개방 판독 프레임(open reading frame)에서 점액종 게놈 내로; 또는 M135 유전자와 M136 유전자 사이에 통합되는, 종양 용해성 바이러스.
  16. 제14항에 있어서, PD1의 세포외 영역이 M135 유전자와 M136 유전자 사이에 통합되는, 종양 용해성 바이러스.
  17. 제14항에 있어서, IL-12의 세포외 영역이 바이러스 M153R 개방 판독 프레임에서 점액종 게놈 내로 통합되는, 종양 용해성 바이러스.
  18. 제15항에 있어서, 마커 유전자(marker gene)를 추가로 포함하는, 종양 용해성 바이러스.
  19. 제14항에 있어서, IL-12가 막관통 도메인(transmembrane domain)에 융합되는, 종양 용해성 바이러스.
  20. 제19항에 있어서, 막관통 도메인이 서열번호 12에 의해 인코딩되는, 종양 용해성 바이러스.
  21. 제20항에 있어서, 종양 용해성 바이러스가 서열번호 13에 의해 인코딩되는, 종양 용해성 바이러스.
  22. 제1항 또는 제3항의 종양 용해성 바이러스의 약제학적 조성물.
  23. 제1항 또는 제3항의 종양 용해성 바이러스 또는 제22항의 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 질환이 암인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 암이 프로그램된 사멸-리간드(programmed death-ligand) 1(PDL1)의 증가된 발현을 갖는, 방법.
  26. 제24항에 있어서, 대상체가 증가된 PDL1을 발현하는 암을 갖는 것으로 결정된, 방법.
  27. 제24항에 있어서, 암이 PDL1의 증가된 발현을 갖지 않는, 방법.
  28. 제24항에 있어서, 암이 흑색종(melanoma), 신장암(kidney cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 두경부암(head and neck cancer), 뇌암(brain cancer), 백혈병(leukemia), 전립선암(prostate cancer), 방광암(bladder cancer) 및 난소암(ovarian cancer)인, 방법.
  29. 제24항에 있어서, 암이 흑색종인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 흑색종이 전이성 흑색종인, 방법.
  31. 제23항에 있어서, 종양 용해성 바이러스가 동맥내, 정맥내, 복강내 또는 종양내 투여되는, 방법.
  32. 제23항에 있어서, 종양 용해성 바이러스가 2회 이상 투여되는, 방법.
  33. 제23항에 있어서, 대상체에게 적어도 제2 항암 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 제2 항암 요법이 재조합 바이러스와 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 방법.
  35. 제33항에 있어서, 제2 항암 요법이 면역 조절제인, 방법.
  36. 제33항에 있어서, 제2 항암 요법이 면역 요법, 화학 요법, 방사선 요법, 유전자 요법, 수술, 호르몬 요법, 항혈관신생 요법(anti-angiogenic therapy) 또는 사이토카인 요법인, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 면역 요법이 면역 체크포인트 억제제(immune checkpoint inhibitor) 요법인, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제 요법이 PD1, PDL1, 또는 CTLA4에 대해 지시된 항체를 사용한 치료를 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 항체가 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙 또는 이필리무맙인, 방법.
  40. 제55항에 있어서, 항체가 펨브롤리주맙인, 방법.
  41. (a) PDL1의 과발현(overexpression)에 대해 대상체를 테스트하는 단계; 및
    (b) PDL1의 발현이 증가된 대상체에게 제1항 또는 제3항의 종양 용해성 바이러스의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 질환이 암인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 암이 프로그램된 사멸-리간드 1(PDL1)의 증가된 발현을 가진, 방법.
  44. 제42항에 있어서, 암이 PDL1의 증가된 발현을 갖지 않은, 방법.
  45. 제42항에 있어서, 암이 흑색종, 신장암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 두경부암, 뇌암, 백혈병, 전립선암, 방광암 및 난소암인, 방법.
  46. 제42항에 있어서, 암이 흑색종인, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 흑색종이 전이성 흑색종(metastatic melanoma)인, 방법.
  48. 제41항에 있어서, 종양 용해성 바이러스가 동맥내, 정맥내, 복강내 또는 종양내 투여되는, 방법.
  49. 제41항에 있어서, 종양 용해성 바이러스가 2회 이상 투여되는, 방법.
  50. 제41항에 있어서, 대상체에게 적어도 제2 항암 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 제2 항암 요법이 재조합 바이러스와 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 방법.
  52. 제50항에 있어서, 제2 항암 요법이 면역 조절제(immunomodulator)인, 방법.
  53. 제50항에 있어서, 제2 항암 요법이 화학 요법, 면역 요법, 방사선 요법, 유전자 요법, 수술, 호르몬 요법, 항혈관신생 요법 또는 사이토카인 요법인, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 면역 요법이 면역 체크포인트 억제제 요법인, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제 요법이 PD1, PDL1, 또는 CTLA4에 대해 지시된 항체를 사용한 치료를 포함하는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 항체가 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙 또는 이필리무맙인, 방법.
  57. 가용성 형태의 T-세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인(mucin-domain) 함유-3(TIM3)을 인코딩하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 재조합 종양 용해성 바이러스.
  58. 제57항에 있어서, 가용성 TIM3이 뮤린(murine) TIM3의 세포외 영역을 포함하는, 종양 용해성 바이러스.
  59. 제57항에 있어서, 발현 카세트(들)가 하나 이상의 바이러스 프로모터의 제어하에 있는, 종양 용해성 바이러스.
  60. 제60항에 있어서, 하나 이상의 바이러스 프로모터가 합성 초기/후기 폭스바이러스 프로모터인, 종양 용해성 바이러스.
  61. 제57항에 있어서, 바이러스가 점액종 바이러스, 레오바이러스, 단순 포진 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 홍역 바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스, 랍도바이러스, 피코르나바이러스, 콕사키바이러스 및 파르보바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 종양 용해성 바이러스.
  62. 제61항에 있어서, 종양 용해성 바이러스가 점액종 바이러스인, 종양 용해성 바이러스.
  63. 제62항에 있어서, 바이러스 M153R 개방 판독 프레임에서 점액종 게놈 내로 통합되는, 종양 용해성 바이러스.
  64. 제63항에 있어서, 마커 유전자를 추가로 포함하는, 종양 용해성 바이러스.
  65. 제64항에 있어서, 마커 유전자가 강화된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; eGFP)인, 종양 용해성 바이러스.
  66. 제57항의 종양 용해성 바이러스의 약제학적 조성물.
  67. 제57항의 종양 용해성 바이러스 또는 제66항의 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 질환이 암인, 방법.
  69. 제74항에 있어서, 암이 흑색종, 신장암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 두경부암, 뇌암, 백혈병, 전립선암, 방광암 및 난소암인, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 암이 흑색종인, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 흑색종이 전이성 흑색종인, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 종양 용해성 바이러스가 동맥내, 정맥내, 복강내 또는 종양내로 투여되는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 종양 용해성 바이러스가 2회 이상 투여되는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 대상체에게 적어도 제2 항암 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 제2 항암 요법이 재조합 바이러스와 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 제2 항암 요법이 면역 조절제인, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 제2 항암 요법이 면역 요법, 화학 요법, 방사선 요법, 유전자 요법, 수술, 호르몬 요법, 항혈관신생 요법 또는 사이토카인 요법인, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 면역 요법이 면역 체크포인트 억제제 요법인, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제 요법이 PD1, PDL1, 또는 CTLA4에 대해 지시된 항체를 사용한 치료를 포함하는, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 항체가 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙 또는 이필리무맙인, 방법.
  81. (a) GAL9의 과발현에 대해 대상체를 테스트하는 단계; 및
    (b) GAL9의 발현이 증가된 대상체에게 제57항의 종양 용해성 바이러스의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 질환이 암인, 방법.
  83. 제90항에 있어서, 암이 흑색종, 신장암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 두경부암, 뇌암, 백혈병, 전립선암, 방광암 및 난소암인, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 암이 흑색종인, 방법.
  85. 제84항에 있어서, 흑색종이 전이성 흑색종인, 방법.
  86. 제81항에 있어서, 종양 용해성 바이러스가 동맥내, 정맥내, 복강내 또는 종양내 투여되는, 방법.
  87. 제81항에 있어서, 종양 용해성 바이러스가 2회 이상 투여되는, 방법.
  88. 제81항에 있어서, 대상체에게 적어도 제2 항암 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  89. 제88항에 있어서, 제2 항암 요법이 재조합 바이러스와 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 방법.
  90. 제88항에 있어서, 제2 항암 요법이 면역 조절제인, 방법.
  91. 제88항에 있어서, 제2 항암 요법이 화학 요법, 면역 요법, 방사선 요법, 유전자 요법, 수술, 호르몬 요법, 항혈관신생 요법 또는 사이토카인 요법인, 방법.
  92. 제91항에 있어서, 면역 요법이 면역 체크포인트 억제제 요법인, 방법.
  93. 제92항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제 요법이 PD1, PDL1, 또는 CTLA4에 대해 지시된 항체를 사용한 치료를 포함하는, 방법.
  94. 제93항에 있어서, 항체가 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙 또는 이필리무맙인, 방법.
  95. 제93항에 있어서, 항체가 펨브롤리주맙인, 방법.
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