TW202317767A - 環狀rna組合物及方法 - Google Patents
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Abstract
本發明描述環狀RNA以及相關組合物及方法。在一些實施例中,本發明之環狀RNA包含第I組內含子片段、間隔子、IRES、雙螺旋體形成區及表現序列。在一些實施例中,該表現序列編碼抗原。在一些實施例中,當與線性RNA相比時,本發明之環狀RNA具有改善的表現、功能穩定性、免疫原性、製造簡易性及/或半衰期。在一些實施例中,當與現有RNA環化方法相比時,本發明之方法及構築體造成改善的環化效率、剪接效率及/或純度。
Description
習知基因療法涉及使用DNA來將所需遺傳資訊插入宿主細胞中。引入細胞中之DNA通常整合至一或多個經轉染細胞之基因體中達至一定程度,從而允許所引入之遺傳物質在宿主中有持久作用。儘管對該持續作用可存在相當大的效益,但外源DNA整合至宿主基因體中亦可能會具有許多不利作用。舉例而言,將所引入之DNA插入完整基因中,從而導致阻礙或甚至完全消除內源基因功能之突變係可能的。因此,用DNA進行之基因療法可能會導致所治療宿主中之重要基因功能減弱,諸如消除必需酶或不利地減少必需酶之產生或中斷對細胞生長調控至關重要之基因,從而導致不受調控或癌細胞增殖。另外,在習知基於DNA之基因療法之情況下,必需包括強啟動子序列用於所需基因產物之有效表現,此同樣可能會造成對細胞中正常基因表現之調控發生非所需變化。基於DNA之遺傳物質將引起對非所需抗DNA抗體之誘導,此繼而可能會觸發可能致死的免疫反應亦係可能的。使用病毒載體之基因療法途徑亦可能會導致不良的免疫反應。在一些情況下,病毒載體可甚至會整合至宿主基因體中。另外,臨床級病毒載體之產生亦為昂貴且耗時的。亦可能難以控制使用病毒載體靶向遞送所引入之遺傳物質。因此,儘管已針對使用病毒載體遞送分泌蛋白評估了基於DNA之基因療法(美國專利第6,066,626號;美國公開案第US2004/0110709號),但此等途徑可能出於此等各種原因而受到限制。
與DNA形成對比,使用RNA作為基因療法試劑實質上更安全,此係因為RNA不涉及穩定整合至經轉染細胞之基因體中之風險,因此消除了對所引入遺傳物質將破壞必需基因之正常運作或造成導致不利或致癌作用之突變的擔憂,且不需要外來啟動子序列用於經編碼蛋白之有效轉譯,從而同樣避免了可能的不利副作用。另外,mRNA進入核中以執行其功能並非必要的,而DNA必須克服此主要障礙。
環狀RNA可用於設計及產生RNA之穩定形式。RNA分子環化為RNA結構及功能研究提供優勢,尤其在易於以非活性構形發生摺疊之分子的情況下(Wang及Ruffner,1998)。環狀RNA亦可尤其引起關注且可用於活體內應用,尤其在基於RNA之基因表現控制及包括蛋白質替代療法及疫苗接種之治療法的研究領域中。
在本發明之前,存在三種主要的用於製造活體外環化RNA之技術:夾板介導之方法、經排列內含子-外顯子方法及RNA連接酶介導之方法。然而,現有方法受到可環化RNA大小限制,因此其治療應用受到限制。本發明藉由提供經由工程改造DNA模板序列來製造及最佳化環化RNA、前驅體線性RNA及最終的環狀RNA之方法及組合物以及使用本發明環狀RNA治療有需要個體之方法來解決此需要。
本文描述前驅體RNA、環狀RNA及相關組合物及方法。
在一個態樣中,本文提供前驅體RNA聚核苷酸,其按以下次序包含:a. 5'增強型內含子元件,b. 5'增強型外顯子元件,c.核心功能元件,d. 3'增強型外顯子元件,及e. 3'增強型內含子元件,其中核心功能元件按以下次序包含:i.轉譯起始元件(TIE),ii.編碼元件,及iii.視情況,終止密碼子或終止卡匣。
在一個態樣中,本文提供前驅體RNA聚核苷酸,其按以下次序包含:a. 5'增強型內含子元件,b. 5'增強型外顯子元件,c.核心功能元件,d. 3'增強型外顯子元件,及e. 3'增強型內含子元件,其中核心功能元件按以下次序包含:i.編碼區,ii.視情況,終止密碼子或終止卡匣,及iii.轉譯起始元件(TIE)。
在一個態樣中,本文提供前驅體RNA聚核苷酸,其按以下次序包含:a. 5'增強型內含子元件,b. 5'增強型外顯子元件,c.核心功能元件,d. 3'增強型外顯子元件,及e. 3'增強型內含子元件,其中核心功能元件包含非編碼元件。
在一些實施例中,TIE包含非轉譯區(UTR)或其片段、適體複合物或其片段、或其組合。
在一些實施例中,UTR或其片段衍生自病毒或真核信使RNA。在一些實施例中,UTR或其片段包含病毒內部核糖體進入位點(IRES)或真核IRES。在一些實施例中,核心功能元件包含兩個或更多個IRES。在一些實施例中,核心功能元件包含TIE、編碼元件、終止序列、視情況間隔子、TIE、編碼元件及終止序列,其中TIE包含IRES。在一些實施例中,IRES包含選自SEQ ID NO: 1-2983及3282-3287之序列或其片段。在一些實施例中,IRES包含選自SEQ ID NO: 75、77、137、532、566、582、648、680、693、752、785、787、791、793、820、823、839、840、843、852、857、861、862、863、864、871、874、876、922、959、983、984、1015、1017、1023、1026、1031、1041、1047、1059、1068、1134、1168、1169、1171、1177、1178、1179、1180、1189、1192、1193、1198、1216、1218、1230、1263、1276、1280、1282、1284、1287、1346、1354、1364、1367、1370、1432、1438、1440、2285、2465、2601、2615、2616、2617、2618、2627、2667、2681、2742、2746、2758、2777、2778、3282、3283、3286及3287之序列或其片段。在一些實施例中,與野生型病毒IRES或真核IRES相比,該IRES包含一或多個經修飾核苷酸。
在一些實施例中,IRES能夠便於由前驅體RNA編碼之蛋白質於細胞中表現。在一些實施例中,IRES能夠便於蛋白質表現,以使得蛋白質之表現量與使用對照IRES時相當或比其高。在一些實施例中,對照IRES包含SEQ ID NO: 3282之序列。在一些實施例中,IRES衍生自腸病毒、脊病毒(Kobuvirus)、副腸孤病毒(Parechovirus)或心病毒。在一些實施例中,IRES衍生自腸病毒或脊病毒。
在一些實施例中,細胞為肌管。在一些實施例中,IRES衍生自博匹病毒(Bopivirus)、奧西病毒(Oscivirus)、亨尼病毒(Hunnivirus)、帕塞里病毒(Passerivirus)、密斯齊病毒(Mischivirus)、脊病毒、腸病毒、心病毒、薩利病毒(Salivirus)、拉博病毒(Rabovirus)、副腸孤病毒、加利病毒(Gallivirus)或斯西尼病毒(Sicinivirus)。在一些實施例中,IRES衍生自亨尼病毒(Hunnivirus)、帕塞里病毒、脊病毒、博匹病毒或腸病毒。在一些實施例中,IRES衍生自腸病毒I、腸病毒F、腸病毒E、腸病毒J、腸病毒C、腸病毒A、腸病毒B、愛知病毒(Aichivirus) B、副腸孤病毒A、心病毒F、心病毒B或心病毒E。在一些實施例中,IRES包含選自SEQ ID NO: 137、580、785、791、820、922、1041、1047、1068、1168、1169、1171、1177、1178、1179、1180、1189、1192、1263、1276、1280、1282、1284、1287、1354、1356、1432、1436、1439、1440、2285、2667、2746、2777、2778、3283及3284之序列。
在一些實施例中,細胞為肝細胞。在一些實施例中,IRES衍生自腸病毒、博匹病毒、密斯齊病毒、加利病毒、奧西病毒、心病毒、脊病毒、拉博病毒、薩利病毒、副腸孤病毒、亨尼病毒、鳥取病毒(Tottorivirus)、帕塞里病毒、科薩病毒(Cosavirus)或斯西尼病毒。在一些實施例中,IRES衍生自腸病毒、密斯齊病毒、脊病毒、博匹病毒或加利病毒。在一些實施例中,IRES衍生自腸病毒B、腸病毒A、腸病毒D、腸病毒J、腸病毒C、鼻病毒B、腸病毒H、腸病毒I、腸病毒E、腸病毒F、愛知病毒B、愛知病毒A、副腸孤病毒A、心病毒F、心病毒E或心病毒B。在一些實施例中,IRES包含選自SEQ ID NO: 137、580、648、693、752、785、791、793、820、823、839、840、861、862、863、876、922、959、983、984、1015、1017、1023、1026、1031、1041、1047、1059、1068、1134、1168、1169、1171、1177、1178、1179、1180、1189、1192、1193、1198、1216、1263、1276、1280、1282、1284、1287、1346、1354、1356、1432、1436、1438、1439、1440、2285、2777、2778、3283及3284之序列。
在一些實施例中,細胞為T細胞。在一些實施例中,IRES衍生自帕塞里病毒、博匹病毒、亨尼病毒、密斯齊病毒、腸病毒、脊病毒、拉博病毒、鳥取病毒、薩利病毒、心病毒、副腸孤病毒、美格瑞病毒(Megrivirus)、青蔥X病毒(Allexivirus)或山巴病毒(Shanbavirus)。在一些實施例中,IRES衍生自帕塞里病毒、亨尼病毒、密斯齊病毒、腸病毒或脊病毒。在一些實施例中,IRES衍生自腸病毒I、腸病毒D、腸病毒C、腸病毒A、腸病毒J、腸病毒H、愛知病毒B、副腸孤病毒A或心病毒B。在一些實施例中,IRES包含選自SEQ ID NO: 77、787、793、820、839、840、843、852、857、861、862、863、864、871、874、876、959、1193、1216、1284、1287、1346、1356、1364、1432、1438、1440、2667、2681、2742、2746、2758、3283及3284之序列。
在一些實施例中,適體複合物或其片段包含天然或合成適體序列。在一些實施例中,適體複合物或其片段包含選自SEQ ID NO: 3266-3268之序列。在一些實施例中,適體複合物或其片段包含超過一種適體。
在一些實施例中,TIE包含UTR及適體複合物。在一些實施例中,UTR位於適體複合物上游。在一些實施例中,TIE進一步包含輔助元件。在一些實施例中,輔助元件包含miRNA結合位點或其片段、限制位點或其片段、RNA編輯模體或其片段、郵遞密碼(zip code)元件或其片段、RNA運輸元件或其片段、或其組合。在一些實施例中,輔助元件包含針對IRES異側作用因子(ITAF)之結合域。在一些實施例中,結合域包含聚A區、聚C區、聚AC區、聚嘧啶束或其組合或變異體。在一些實施例中,ITAF包含聚(rC)結合蛋白1 (PCBP1)、PCBP2、PCBP3、PCBP4、poly(A)結合蛋白1 (PABP1)、聚嘧啶束結合蛋白(PTB)、阿爾戈瑙特蛋白家族(Argonaute protein family)成員、HNRNPK (異質核核糖核蛋白K蛋白),或La蛋白,或其片段或組合。
在一些實施例中,編碼元件包含編碼治療性蛋白之序列。在一些實施例中,治療性蛋白包含嵌合蛋白。在一些實施例中,嵌合蛋白包含嵌合抗原受體(CAR)、T細胞受體(TCR)、B細胞受體(BCR)、免疫細胞活化或抑制性受體、重組融合蛋白、嵌合突變蛋白或融合蛋白、或其組合。在一些實施例中,治療性蛋白包含抗體、奈米抗體、非抗體蛋白、免疫調節性配位體、受體、結構蛋白、生長因子配位體或受體、激素或激素受體、轉錄因子、檢查點抑制劑或促效劑、Fc融合蛋白、抗凝劑、凝血因子、伴護蛋白、抗微生物蛋白、結構蛋白、生物化學酶、緊密型連結蛋白、粒線體壓力反應蛋白、細胞骨架蛋白、金屬結合蛋白或小分子。在一些實施例中,免疫調節性配位體包含干擾素、細胞介素、趨化因子或介白素。在一些實施例中,結構蛋白為通道蛋白或核孔蛋白。
在一些實施例中,非編碼元件包含超過一個非編碼元件。在一些實施例中,非編碼元件之長度包含50至15,000個核苷酸。
在一些實施例中,核心功能元件包含終止序列。在一些實施例中,終止序列位於3'增強型外顯子元件之5'端。在一些實施例中,終止序列為終止密碼子。在一些實施例中,終止序列為終止卡匣。在一些實施例中,終止卡匣包含於一或多個框架中之一或多個終止密碼子。在一些實施例中,各框架包含終止密碼子。在一些實施例中,各框架包含兩個或更多個終止密碼子。
在一些實施例中,5'增強型內含子元件包含3'內含子片段。在一些實施例中,3'內含子片段進一步包含3'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第一核苷酸或第一核苷酸及第二核苷酸。在一些實施例中,3'內含子片段位於5'增強型內含子元件之3'端。在一些實施例中,第I組內含子包含或衍生自細菌噬菌體、病毒載體、胞器基因體、核rDNA基因。在一些實施例中,核rDNA基因包含衍生自真菌、植物或藻類之核rDNA基因或其片段。
在一些實施例中,5'增強型內含子元件包含位於5'端之前導非轉譯序列。在一些實施例中,前導非轉譯序列包含間隔子。在一些實施例中,前導非轉譯序列包含轉錄起始位點之最後一個核苷酸。在一些實施例中,前導非轉譯序列包含1至100個額外核苷酸。
在一些實施例中,5'增強型內含子元件包含5'親和序列。在一些實施例中,5'親和序列包含聚A、聚AC或聚嘧啶序列。在一些實施例中,5'親和序列包含10至100個核苷酸。在一些實施例中,5'增強型內含子元件包含5'外部間隔子序列。在一些實施例中,5'外部間隔子序列位於5'親和序列與3'內含子片段之間。在一些實施例中,5'外部間隔子序列之長度為約6至60個核苷酸。在一些實施例中,5'外部間隔子序列包含以下或由以下組成:選自SEQ ID NO: 3094-3152之序列。
在一些實施例中,5'增強型內含子元件按以下次序包含:a.前導非轉譯序列;b. 5'親和序列;c. 5'外部間隔子序列;及d.包括3'第I組內含子剪接位點之第一核苷酸的3'內含子片段;其中前導非轉譯序列包含轉錄起始位點之最後一個核苷酸、及1至100個核苷酸。
在一些實施例中,5'增強型內含子元件按以下次序包含:a.前導非轉譯序列;b. 5'外部間隔子序列;c. 5'親和序列;及d.包括3'第I組剪接位點之第一核苷酸的3'內含子片段;其中前導非轉譯序列包含轉錄起始位點之最後一個核苷酸、及1至100個核苷酸。
在一些實施例中,5'增強型內含子元件按以下次序包含:a.前導非轉譯序列;b. 5'親和序列;c. 5'外部間隔子序列;及d.包括3'第I組內含子剪接位點之第一核苷酸及第二核苷酸的3'內含子片段;其中該前導非轉譯序列包含轉錄起始位點之最後一個核苷酸、及1至100個核苷酸;且其中該5'增強型外顯子元件包含缺乏3'第I組剪接位點二核苷酸之第二核苷酸的3'外顯子片段。
在一些實施例中,5'增強型內含子元件按以下次序包含:a.前導非轉譯序列;b. 5'外部間隔子序列;c. 5'親和序列;及d.包括3'第I組剪接位點之第一核苷酸及第二核苷酸的3'內含子片段;其中前導非轉譯序列包含轉錄起始位點之最後一個核苷酸、及1至100個核苷酸;且其中該5'增強型外顯子元件包含缺乏3'第I組剪接位點二核苷酸之第二核苷酸的3'外顯子片段。
在一些實施例中,5'增強型外顯子元件包含3'外顯子片段。在一些實施例中,3'外顯子片段進一步包含3'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第二核苷酸。在一些實施例中,3'外顯子片段包含1至100個衍生自天然外顯子之天然核苷酸。在一些實施例中,天然外顯子衍生自含有第I組內含子之基因或其片段。在一些實施例中,天然外顯子衍生自念珠藻屬(anabaena)細菌、T4噬菌體病毒、托沃特噬菌體(twort bacteriophage)、鳥類眼原蟲(tetrahymena)或固氮弧菌屬(azoarcus)細菌。
在一些實施例中,5'增強型外顯子元件包含位於3'外顯子片段下游之5'內部間隔子序列。在一些實施例中,5'內部間隔子序列之長度為約6至60個核苷酸。在一些實施例中,5'內部間隔子序列包含以下或由以下組成:選自SEQ ID NO: 3094-3152之序列。
在一些實施例中,5'增強型外顯子元件按以下次序包含:a.包括3'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第二核苷酸的3'外顯子片段;及b. 5'內部間隔子序列,其中3'外顯子片段包含1至100個衍生自天然外顯子之天然核苷酸。
在一些實施例中,5'增強型外顯子元件按以下次序包含:a. 3'外顯子片段;及b. 5'內部間隔子序列,其中3'外顯子片段包含1至100個衍生自天然外顯子之天然核苷酸;且其中5'增強型內含子元件包含含有3'第I組剪接位點二核苷酸之第一核苷酸及第二核苷酸的3'內含子片段。
在一些實施例中,3'增強型外顯子元件包含5'外顯子片段。在一些實施例中,5'外顯子片段包含5'第I組內含子片段之第一核苷酸。在一些實施例中,5'外顯子片段進一步包含1至100個衍生自天然外顯子之核苷酸。在一些實施例中,天然外顯子衍生自含有第I組內含子之基因或其片段。
在一些實施例中,3'增強型外顯子元件包含3'內部間隔子序列。在一些實施例中,3'內部間隔子序列位於終止序列與5'外顯子片段之間。在一些實施例中,3'內部間隔子之長度為約6至60個核苷酸。在一些實施例中,3'內部間隔子包含以下或由以下組成:選自SEQ ID NO: 3094-3152之序列。
在一些實施例中,3'增強型外顯子元件包含:a. 3'內部間隔子序列;及b.包括5'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第一核苷酸的5'外顯子片段,其中5'外顯子片段包含1至100個衍生自天然外顯子之核苷酸。
在一些實施例中,3'增強型外顯子元件包含:a. 3'內部間隔子序列;及b. 5'外顯子片段,其中5'外顯子片段包含1至100個衍生自天然外顯子之核苷酸;其中該3'增強型內含子元件包含含有5'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第一核苷酸及第二核苷酸的5'內含子片段。
在一些實施例中,3'增強型內含子元件包含5'內含子片段。在一些實施例中,5'內含子片段包含5'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第二核苷酸。
在一些實施例中,3'增強型內含子元件包含位於5'內含子之3'端之尾隨非轉譯序列。在一些實施例中,尾隨非轉譯序列包含3至12個核苷酸。
在一些實施例中,3'增強型內含子片段包含3'外部間隔子序列。在一些實施例中,3'外部間隔子序列位於5'內含子片段與尾隨非轉譯序列之間。在一些實施例中,3'外部間隔子序列之長度為6至60個核苷酸。在一些實施例中,3'外部間隔子序列包含以下或由以下組成:選自SEQ ID NO: 3094-3152之序列。
在一些實施例中,3'增強型內含子元件包含3'親和序列。在一些實施例中,3'親和序列位於3'外部間隔子序列與尾隨非轉譯序列之間。在一些實施例中,3'親和序列包含聚A、聚AC或聚嘧啶序列。在一些實施例中,親和序列包含10至100個核苷酸。
在一些實施例中,5'增強型內含子元件進一步包含5'外部雙螺旋體序列;其中3'增強型內含子元件進一步包含3'外部雙螺旋體序列。在一些實施例中,5'外部雙螺旋體序列與3'外部雙螺旋體序列彼此完全或部分互補。在一些實施例中,5'外部雙螺旋體序列包含完全合成或部分合成核苷酸。在一些實施例中,3'外部雙螺旋體序列包含完全合成或部分合成核苷酸。在一些實施例中,3'外部雙螺旋體序列為約6至約50個核苷酸。在一些實施例中,5'外部雙螺旋體序列為約6至約50個核苷酸。
在一些實施例中,5'增強型外顯子元件進一步包含5'內部雙螺旋體序列;其中3'增強型外顯子元件進一步包含3'內部雙螺旋體序列。在一些實施例中,5'內部雙螺旋體序列與3'內部雙螺旋體序列彼此完全或部分互補。在一些實施例中,5'內部雙螺旋體序列包含完全合成或部分合成核苷酸。在一些實施例中,3'內部雙螺旋體序列包含完全合成或部分合成核苷酸。在一些實施例中,3'內部雙螺旋體序列為約6至約19個核苷酸。在一些實施例中,5'內部雙螺旋體序列為約6至約19個核苷酸。
在一些實施例中,3'增強型內含子片段按以下次序包含:a.包括5'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第二核苷酸的5'內含子片段;b. 3'外部間隔子序列;及c. 3'親和序列。
在一些實施例中,3'增強型內含子片段按以下次序包含:a.包括5'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第一核苷酸及第二核苷酸的5'內含子片段;b. 3'外部間隔子序列;及c. 3'親和序列,其中3'增強型外顯子元件包含缺乏5'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第一核苷酸的5'外顯子片段。
在一些實施例中,所提供之前驅體RNA聚核苷酸按以下次序包含:a.前導非轉譯序列;b. 5'親和序列;c. 5'外部雙螺旋體序列;d. 5'間隔子序列;e. 3'內含子片段;f. 3'外顯子片段;g. 5'內部雙螺旋體序列;h. 5'內部間隔子序列;i.轉譯起始元件;j.編碼元件;k.終止序列;l. 3'內部間隔子序列;m. 3'內部雙螺旋體序列;n. 5'外顯子片段;o. 5'內含子片段;p. 3'外部雙螺旋體序列;q. 3'親和序列;及r.尾隨非轉譯序列。
在一些實施例中,所提供之前驅體RNA聚核苷酸按以下次序包含:a.前導非轉譯序列;b. 5'親和序列;c. 5'外部間隔子序列;d. 3'內含子片段;e. 3'外顯子片段;f. 5'內部雙螺旋體序列;g. 5'內部間隔子序列;h.非編碼元件;i. 3'內部間隔子序列;j. 3'內部雙螺旋體序列;k. 5'外顯子片段;l. 5'內含子片段;m. 3'外部間隔子序列;n. 3'親和序列;及o.尾隨非轉譯序列。
在一些實施例中,所提供之前驅體RNA聚核苷酸按以下次序包含:a.前導非轉譯序列;b. 5'親和序列;c. 5'外部間隔子序列;d. 3'內含子片段;e. 3'外顯子片段;f. 5'內部雙螺旋體序列;g. 5'內部間隔子序列;h.轉譯起始元件;i.編碼元件;j.終止序列;k. 3'內部間隔子序列;l. 3'內部雙螺旋體序列;m. 5'外顯子片段;n. 5'內含子片段;o. 3'外部間隔子序列;及p. 3'親和序列。
在一些實施例中,所提供之前驅體RNA聚核苷酸按以下次序包含:a.前導非轉譯序列;b. 5'親和序列;c. 5'外部間隔子序列;d. 3'內含子片段;e. 3'外顯子片段;f. 5'內部間隔子序列;g.轉譯起始元件;h.編碼元件;i.終止序列;j. 3'內部間隔子序列;k. 5'外顯子片段;l. 5'內含子片段;m. 3'外部間隔子序列;及n. 3'親和序列。
在一些實施例中,所提供之前驅體RNA聚核苷酸按以下次序包含:a.前導非轉譯序列;b. 5'親和序列;c. 5'外部間隔子序列;d. 3'內含子片段;e. 3'外顯子片段;f. 5'內部間隔子序列;g.非編碼元件;h. 3'內部間隔子序列;i. 5'外顯子片段;j. 5'內含子片段;k. 3'外部間隔子序列;l. 3'親和序列;及m.尾隨非轉譯序列。
在一些實施例中,所提供之前驅體RNA聚核苷酸按以下次序包含:a.前導非轉譯序列;b. 5'親和序列;c. 5'外部雙螺旋體序列;d. 5'間隔子序列;e. 3'內含子片段;f. 3'外顯子片段;g. 5'內部雙螺旋體序列;h. 5'內部間隔子序列;i.終止序列;j.編碼元件;k.轉譯起始元件;l. 3'內部間隔子序列;m. 3'內部雙螺旋體序列;n. 5'外顯子片段;o. 5'內含子片段;p. 3'外部雙螺旋體序列;q. 3'親和序列;及r.尾隨非轉譯序列。
在一些實施例中,編碼元件包含兩個或更多個蛋白質編碼區。在一些實施例中,前驅體RNA聚核苷酸包含編碼於第一表現序列與第二表現序列之間的蛋白水解裂解位點或核糖體卡頓(stuttering)元件之聚核苷酸序列。在一些實施例中,核糖體卡頓元件為自裂解間隔子。在一些實施例中,前驅體RNA聚核苷酸包含編碼2A核糖體卡頓肽之聚核苷酸序列。
在一些實施例中,核心功能元件包含兩個或更多個內部核糖體進入位點(IRES)。在一些實施例中,核心功能元件包含TIE、編碼元件、終止序列、視情況間隔子、TIE、編碼元件及終止序列,其中TIE包含IRES。
本文亦提供由本文所提供之前驅體RNA聚核苷酸產生之環狀RNA聚核苷酸。在一些實施例中,前驅體RNA聚核苷酸係自包含PCR產物、線性化質體、非線性化質體、線性化微型環、非線性化微型環、病毒載體、黏質體、ceDNA或人工染色體之載體或DNA轉錄。在一些實施例中,環狀RNA聚核苷酸由天然核苷酸組成。在一些實施例中,蛋白質編碼或非編碼序列經密碼子最佳化。在一些實施例中,環狀RNA聚核苷酸之長度為約0.1至約15千鹼基。在一些實施例中,環狀RNA聚核苷酸經最佳化而缺乏至少一個存在於等效預最佳化聚核苷酸中之微小RNA結合位點。在一些實施例中,環狀RNA聚核苷酸經最佳化而缺乏至少一個存在於等效預最佳化聚核苷酸中之RNA編輯敏感位點。在一些實施例中,環狀RNA聚核苷酸在人類活體內治療作用持續時間為至少20小時。在一些實施例中,環狀RNA聚核苷酸具有功能性半衰期至少6小時。在一些實施例中,環狀RNA聚核苷酸在人類細胞中之治療作用持續時間長於或等於包含相同表現序列之等效線性RNA聚核苷酸之治療作用持續時間。在一些實施例中,環狀RNA聚核苷酸在人類活體內治療作用持續時間長於具有相同表現序列之等效線性RNA聚核苷酸之活體內治療作用持續時間。
本文亦提供製造轉譯起始元件(TIE)之方法,其包含:a.獲得病毒非轉譯區(UTR);b.確定UTR能夠結合至起始因子及/或藉由使序列進行缺失來起始轉譯之功能單元;c.移除UTR之非功能單元;及視情況修飾UTR之端。在一些實施例中,對UTR之端之修飾為病毒UTR之約1%至75%。在一些實施例中,UTR之功能單元係藉由自UTR之5'端及3'端之缺失掃描或跨UTR長度之突變掃描以鑑別重要區域來確定。
本文亦提供包含本文所提供之環狀RNA聚核苷酸、奈米粒子及視情況可操作地連接至奈米粒子之靶向部分的醫藥組合物。在一些實施例中,奈米粒子為脂質奈米粒子、核-殼奈米粒子、生物可降解奈米粒子、生物可降解脂質奈米粒子、聚合物奈米粒子、聚合複合體(polyplex)或生物可降解聚合物奈米粒子。在一些實施例中,醫藥組合物包含靶向部分,其中靶向部分介導受體介導之胞吞作用、胞內體融合,或直接融合至所選細胞群體或組織之選定細胞中,在細胞分離或純化不存在下。在一些實施例中,醫藥組合物包含可操作地連接至奈米粒子之靶向部分。在一些實施例中,靶向部分為小分子、scFv、奈米抗體、肽、環狀肽、二環狀肽或三環狀肽、微型抗體、聚核苷酸適體、經工程改造之骨架蛋白、重鏈可變區、輕鏈可變區或其片段。在一些實施例中,組合物中少於1重量%之聚核苷酸為雙股RNA、DNA夾板(splints)、DNA模板或三磷酸化RNA。在一些實施例中,醫藥組合物中少於1重量%之聚核苷酸及蛋白質為雙股RNA、DNA夾板、DNA模板、三磷酸化RNA、磷酸酶蛋白、蛋白質連接酶、RNA聚合酶及加帽酶(capping enzymes)。
本文亦提供包含本文所提供之環狀RNA聚核苷酸及脂質體、樹狀體、碳水化合物載劑、聚醣奈米物質、細胞間橋(fusome)、胞泌體或其組合的醫藥組合物。
本文亦提供包含本文所提供之環狀RNA聚核苷酸及醫藥鹽、緩衝劑、稀釋劑或其組合之醫藥組合物。
本文亦提供治療有需要個體之方法,其包含投與治療有效量之包含本文所提供之環狀RNA聚核苷酸、奈米粒子及視情況可操作地連接至奈米粒子之靶向部分的組合物。在一些實施例中,靶向部分為小分子、scFv、奈米抗體、肽、環狀肽、二環狀肽或三環狀肽、微型抗體、重鏈可變區、經工程改造之骨架蛋白、輕鏈可變區或其片段。在一些實施例中,奈米粒子為脂質奈米粒子、核-殼奈米粒子或生物可降解奈米粒子。在一些實施例中,奈米粒子包含一或多種陽離子型脂質、可離子化脂質或聚β-胺基酯。在一些實施例中,奈米粒子包含一或多種非陽離子型脂質。在一些實施例中,奈米粒子包含一或多種經PEG修飾之脂質、聚麩胺酸脂質或玻糖醛酸脂質。在一些實施例中,奈米粒子包含膽固醇。在一些實施例中,奈米粒子包含二十碳四烯酸、白三烯或油酸。在一些實施例中,該組合物包含靶向部分,其中靶向部分選擇性介導受體介導之胞吞作用至所選細胞群體之細胞中,在細胞選擇或純化不存在下。在一些實施例中,奈米粒子包含超過一種環狀RNA聚核苷酸。在一些實施例中,個體患有選自由以下組成之群之癌症:急性骨髓白血病(AML);齒槽橫紋肌肉瘤;B細胞惡性病;膀胱癌(bladder cancer) (例如膀胱癌(bladder carcinoma));骨癌;腦癌(例如神經管胚細胞瘤及多形性神經膠質母細胞瘤);乳癌;肛門癌、肛管癌或肛門直腸癌;眼癌;肝內膽管癌;關節癌;頸癌;膽囊癌;胸膜癌;鼻癌、鼻腔癌或中耳癌;口腔癌;外陰癌;慢性淋巴球性白血病;慢性骨髓癌;結腸癌;食道癌、子宮頸癌;纖維肉瘤;腸胃類癌瘤;頭頸癌(例如頭頸鱗狀細胞癌);霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma);下咽癌;腎癌;喉頭癌;白血病;液體腫瘤;脂肪瘤;肝癌;肺癌(例如非小細胞肺癌、肺腺癌及小細胞肺癌);淋巴瘤;間皮瘤;肥胖細胞瘤;黑色素瘤;多發性骨髓瘤;鼻咽癌;非霍奇金淋巴瘤;慢性B淋巴球性白血病;毛細胞白血病;伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma);卵巢癌;胰臟癌;腹膜癌;胃系膜癌;腸系膜癌;咽癌;前列腺癌;直腸癌;腎癌;皮膚癌;小腸癌;軟組織癌;實體腫瘤;滑液肉瘤;胃癌;畸胎瘤;睾丸癌;甲狀腺癌;及輸尿管癌。在一些實施例中,個體患有選自以下之自體免疫病症:硬皮病、格雷氏病(Grave's disease)、克羅恩氏病(Crohn's disease)、休格連氏病(Sjogren's disease)、多發性硬化症、橋本氏病(Hashimoto's disease)、乾癬、重症肌無力、自體免疫多內分泌病變症候群、I型糖尿病(TIDM)、自體免疫胃炎、自體免疫葡萄膜視網膜炎、多發性肌炎、結腸炎、甲狀腺炎及以人類狼瘡為代表之全身性自體免疫疾病。
本文亦提供包含本文所提供之環狀RNA聚核苷酸或醫藥組合物的真核細胞。在一些實施例中,真核細胞為人類細胞。在一些實施例中,真核細胞為免疫細胞。在一些實施例中,真核細胞為T細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞、嗜中性球或嗜鹼性球。
本文亦提供包含本文所提供之環狀RNA聚核苷酸的原核細胞。
在另一態樣中,本文提供純化環狀RNA之方法,其包含使結合至固體表面之寡核苷酸與親和序列雜交。
在一些實施例中,親和序列之一或多個複本存在於前驅體RNA中。在一些實施例中,前驅體RNA為本文所描述之前驅體。在一些實施例中,環狀RNA為本文所描述之環狀RNA。在一些實施例中,親和序列在形成環狀RNA期間移除。在一些實施例中,該方法包含將環狀RNA與前驅體RNA分離。
在一些實施例中,親和序列包含聚A序列。在一些實施例中,與親和序列雜交之寡核苷酸為去氧胸苷寡核苷酸。在一些實施例中,親和序列包含專用結合位點(DBS)。在一些實施例中,DBS包含以下核苷酸序列:TATAATTCTACCCTATTGAGGCATTGACTA (SEQ ID NO: 3269)。在一些實施例中,與親和序列雜交之寡核苷酸包含與DBS互補之序列。
在另一態樣中,本文提供純化環狀RNA之方法,其包含:a.使包含線性RNA及環狀RNA之組合物與較環狀RNA優先結合至線性RNA之結合劑接觸;及b.將結合至結合劑之RNA與不結合至結合劑之RNA分離。
在一些實施例中,結合劑結合至固體載體。在一些實施例中,固體載體包含瓊脂糖、瓊脂糖衍生之樹脂、纖維素、纖維素纖維、磁珠、高通量微量滴定盤、非瓊脂糖樹脂、玻璃表面、聚合物表面或其組合。在一些實施例中,固體載體包含瓊脂糖或纖維素。
在一些實施例中,結合劑包含與存在於線性RNA中且不存在於環狀RNA中之序列互補的寡核苷酸。在一些實施例中,結合劑包含與存在於線性RNA中且不存在於環狀RNA中之序列100%互補的寡核苷酸。在一些實施例中,存在於線性RNA中且不存在於環狀RNA中之序列為親和序列。在一些實施例中,存在於線性RNA中且不存在於環狀RNA中之序列包含聚A序列。在一些實施例中,結合劑包含含有聚去氧胸苷序列之寡核苷酸。在一些實施例中,存在於線性RNA中且不存在於環狀RNA中之序列包含DBS序列。在一些實施例中,DBS序列包含以下核苷酸序列:TATAATTCTACCCTATTGAGGCATTGACTA (SEQ ID NO: 3269)。在一些實施例中,存在於線性RNA中且不存在於環狀RNA中之序列之長度為10至150個核苷酸。在一些實施例中,存在於線性RNA中且不存在於環狀RNA中之序列之長度為10至70個核苷酸。在一些實施例中,存在於線性RNA中且不存在於環狀RNA中之序列之長度為20至30個核苷酸。在一些實施例中,存在於線性RNA中且不存在於環狀RNA中之序列存在於線性RNA中之兩個位置。在一些實施例中,存在於線性RNA中且不存在於環狀RNA中之序列在轉錄線性RNA期間編碼至線性RNA中。在一些實施例中,存在於線性RNA中且不存在於環狀RNA中之序列係以酶添加至線性RNA中。在一些實施例中,線性RNA不包含甲基鳥苷酸帽。在一些實施例中,線性RNA包含前驅體RNA或其片段。
在一些實施例中,前驅體RNA為本文所描述之前驅體RNA或其片段。在一些實施例中,前驅體RNA係使用活體外轉錄(IVT)產生。在一些實施例中,片段包含內含子。在一些實施例中,線性RNA包含提前終止之RNA或由失敗性轉錄形成之RNA。
在一些實施例中,環狀RNA包含本文所描述之環狀RNA。在一些實施例中,環狀RNA係使用包含剪接前驅體RNA之方法產生。在一些實施例中,存在於線性RNA中且不存在於環狀RNA中之序列在剪接期間截除。在一些實施例中,環狀RNA之大小為少於6千鹼基。
在一些實施例中,分離包含自固體載體移除未結合RNA。在一些實施例中,移除包含自固體載體溶離未結合RNA。
在一些實施例中,該方法包含加熱該組合物。在一些實施例中,該方法包含緩衝液交換。在一些實施例中,緩衝液交換係在接觸之前執行。在一些實施例中,緩衝液交換係在分離之後執行。在一些實施例中,緩衝液交換係在接觸之前執行,且所得緩衝液包含大於1 mM單價鹽。在一些實施例中,單價鹽為NaCl或KCl。在一些實施例中,所得緩衝液包含Tris。在一些實施例中,所得緩衝液包含EDTA。在一些實施例中,緩衝液交換係在分離之後執行交換成儲存緩衝液,其中儲存緩衝液包含1 mM pH 6.5檸檬酸鈉。在一些實施例中,該方法包含在分離之後過濾環狀RNA。
相關申請案之交互參考
本申請案主張2021年6月10日申請之美國臨時申請案第63/209,271號及2022年2月18日申請之美國臨時申請案第63/311,923號之權益及優先權,該等案中之各者之內容出於所有目的特此以全文引用之方式併入。
本發明尤其提供用於治療自體免疫病症、缺陷疾病或癌症之基於環狀RNA療法之方法及組合物。特定言之,本發明提供藉由以有效劑量及投與間隔向需要治療之個體投與包含編碼至少一種治療性蛋白之環狀RNA的組合物來治療自體免疫病症、缺陷疾病或癌症以使得相關疾病或病症之至少一種症狀或特徵的強度、嚴重程度或頻率降低或發作延遲的方法。
如本文所揭示,改良之環狀RNA療法以及相關組合物及方法尤其允許提高之環狀RNA穩定性、表現及延長之半衰期。在一些實施例中,本發明之環狀RNA係自包含增強型內含子元件、增強型外顯子元件及核心功能元件之線性RNA聚核苷酸構築體轉錄。在一些實施例中,增強型內含子元件包含允許最佳環化之剪接後第I組內含子片段、間隔子、雙螺旋體序列、親和序列及獨特的非轉譯序列。在一些實施例中,增強型外顯子元件包含外顯子片段、間隔子及雙螺旋體序列以幫助環化過程且用於維持環化後環狀RNA之穩定性。在相同實施例內,核心功能元件包括用於轉譯起始元件(TIE)之蛋白質轉譯的必需元件、編碼或非編碼元件及終止序列(例如終止密碼子或終止卡匣)。共同地,包含編碼元件之增強型內含子元件、增強型外顯子元件及核心功能元件提供用於編碼治療性蛋白之最佳環狀RNA聚核苷酸。在一個實施例中,包含非編碼元件之增強型內含子元件、增強型外顯子元件及核心功能元件提供作為輔助件之用於觸發免疫系統之最佳環狀RNA聚核苷酸。
本文亦揭示用於製造環狀RNA之DNA模板(例如載體)。在一些實施例中,DNA模板包含3'增強型內含子片段、3'增強型外顯子片段、核心功能元件、5'增強型外顯子片段及5'增強型內含子片段。在一些實施例中,此等元件按以上次序位於DNA模板中。
額外實施例包括環狀RNA聚核苷酸,包括使用本文所提供之DNA模板製造之環狀RNA聚核苷酸(例如包含3'增強型外顯子元件、核心功能元件及5'增強型外顯子元件之環狀RNA);包含該環狀RNA之組合物、包含該環狀RNA之細胞、使用及製造該DNA模板、環狀RNA、組合物及細胞之方法。
在一些實施例中,本文提供包含將本文所提供之環狀RNA聚核苷酸投與至用於療法或適用蛋白質生產之細胞中的方法。在一些實施例中,該方法有利於提供在真核細胞內部產生由於環狀RNA對核糖核酸酶之抗性而具有比線性RNA長之半衰期的所需多肽。
當與等效線性RNA相比時,環狀RNA聚核苷酸不具有核酸外切酶介導之降解所需之自由端,從而使其對RNA降解之若干機制具有抗性且授予延長之半衰期。環化可允許一般受短半衰期影響之RNA聚核苷酸穩定化且可在各種應用中改善外源性mRNA之總體功效。在一實施例中,以蛋白質合成評估,本文所提供之環狀RNA聚核苷酸在真核細胞(例如哺乳動物細胞,諸如人類細胞)中具有功能性半衰期至少20小時(例如至少80小時)。
本發明之各種態樣在以下章節中加以詳細描述。章節之使用不意欲限制本發明。各章節可適用於本發明之任何態樣。在本申請案中,除非另外陳述,否則「或」之使用意謂「及/或」。
1. 定義
據稱線性核酸分子具有「
5' 端 (5'-terminus/5' end)」及「
3' 端 (3'-terminus/3' end)」,此係因為在取代基單核苷酸之糖部分之5'碳及3'碳處存在核酸磷酸二酯鍵聯。將與5'碳存在新鍵聯之聚核苷酸之末端核苷酸為其5'端核苷酸。將與3'碳存在新鍵聯之聚核苷酸之末端核苷酸為其3'端核苷酸。如本文所使用之「
末端核苷酸 (terminal nucleotide)」為3'端或5'端末端位置處之核苷酸。
如本文所使用之術語「
3' 第 I 組內含子片段 (3'group I intron fragment)」係指與包括剪接位點二核苷酸及視情況一連串天然外顯子序列之天然第I組內含子之3'近端具有75%或更高類似性的序列。如本文所使用之術語「
5' 第 I 組內含子片段 (5' group I intron fragment)」係指與包括剪接位點二核苷酸及視情況一連串天然外顯子序列之天然第I組內含子之5'近端具有75%或更高類似性的序列。如本文所使用之術語「
排列位點 ( permutation site )」係指其中在內含子排列之前進行切割之第I組內含子中之位點。此切割產生3'及5'第I組內含子片段,該等片段經排列以處於待環化之一連串前驅體RNA之任一側面上。
除非上下文另外清楚地指示,否則如本文所使用之單數形式「
一 (a/an)」及「
該 (the)」包括複數個提及物。因此,舉例而言,提及「細胞(cell)」包括兩個或更多個細胞之組合或細胞總培養物;提及「聚核苷酸(polynucleotide)」包括作為實用物質之該聚核苷酸之許多複本。
除非明確陳述或自上下文顯而易見,否則如本文所使用之術語「
約 (about)」應理解為在此項技術中之正常公差範圍內,例如在平均值之2個標準差內。「約」可理解為在陳述值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%或0.01%內。除非另外自上下文明顯可見,否則本文所提供之所有數值皆由術語「約」修飾。
如本文所使用之「
親和序列 (affinity sequence)」或「
親和標籤 (affinity tag)」為出於輔助聚核苷酸序列純化之目的含有重複集合之核苷酸的在一(1)個核苷酸至數百或數千個核苷酸範圍內之聚核苷酸序列之區域。舉例而言,親和序列可包含但不限於聚A或聚AC序列。在一些實施例中,親和標籤用於在本文中稱為「親和純化」之純化方法中,其中結合劑與包含親和標籤之分子的選擇性結合便於與不包含親和標籤之分子進行分離。在一些實施例中,親和純化方法為「負向選擇」純化方法,其中選擇性結合且移除諸如線性RNA之不合需要之物種,且將諸如環狀RNA之合乎需要之物種溶離且與不合需要之物種分離。
如本文所使用之「
抗腫瘤作用 (anti-tumor effect)」係指可呈現為以下之生物作用:腫瘤體積減小、腫瘤細胞數目減少、腫瘤細胞增殖減少、轉移灶數目減少、總存活期或無惡化存活期延長、預期壽命延長或與腫瘤相關之各種生理症狀改善。抗腫瘤作用亦可指預防腫瘤出現,例如疫苗。
「
抗原 (antigen)」係指引起免疫反應或能夠與抗體或抗原結合分子結合之任何分子。免疫反應可涉及抗體產生或特異性免疫勝任細胞活化或兩者。熟習此項技術者將容易理解,任何巨分子,包括實際上所有蛋白質或肽均可充當抗原。抗原可經內源性表現,亦即經基因體DNA表現,或可以重組方式表現。抗原可對諸如癌細胞之某一組織具有特異性,或其可經廣泛表現。另外,較大分子之片段可充當抗原。在一些實施例中,抗原為腫瘤抗原。
「
抗原結合分子 (antigen binding molecule)」、「
抗原結合部分 (antigen binding portion)」或「
抗體片段 (antibody fragment)」係指特異性結合至所需抗原之任何分子。在一些實施例中,抗原結合分子包含抗體或抗體樣分子之抗原結合部分(例如CDR)。抗原結合分子可包括抗原互補決定區(CDR)。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、dAb、線性抗體、scFv抗體及由抗原結合分子形成之多特異性抗體。肽體(亦即包含肽結合域之Fc融合分子)為適合的抗原結合分子之另一實例。在一些實施例中,抗原結合分子結合至腫瘤細胞上之抗原。在一些實施例中,抗原結合分子結合至與過度增生性疾病有關之細胞上之抗原或結合至病毒性或細菌性抗原。在一些實施例中,抗原結合分子結合至BCMA。在另外實施例中,抗原結合分子為特異性結合至抗原之抗體片段,包括其互補決定區(CDR)中之一或多者。在另外實施例中,抗原結合分子為單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中,抗原結合分子包含高親和性多聚體或由高親和性多聚體組成。
術語「
抗體 (antibody)」(Ab)包括但不限於特異性結合至抗原之醣蛋白免疫球蛋白。一般而言,抗體可包含藉由二硫鍵互連之至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈或其抗原結合分子。各H鏈可包含重鏈可變區(在本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區可包含三個恆定域,亦即CH1、CH2及CH3。各輕鏈可包含輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區可包含一個恆定域,亦即CL。VH區及VL區可進一步再分成高變區,該等高變區稱為互補決定區(CDR),其穿插有稱為構架區(FR)之更保守區。各VH及VL可包含三個CDR及四個FR,其自胺基端至羧基端按以下次序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。Ab之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合,該等宿主組織或因子包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分。抗體可包括例如單株抗體、以重組方式產生之抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人類抗體、經工程改造之抗體、人類化抗體、嵌合抗體、免疫球蛋白、合成抗體、包含兩個重鏈及兩個輕鏈分子之四聚抗體、抗體輕鏈單體、抗體重鏈單體、抗體輕鏈二聚體、抗體重鏈二聚體、抗體輕鏈-抗體重鏈對、胞內抗體、抗體融合物(在本文中有時稱為「抗體結合物」)、異結合抗體、單域抗體、單價抗體、單鏈抗體或單鏈可變片段(scFv)、駱駝化抗體、親和抗體、Fab片段、F(ab')2片段、二硫鍵連接之可變片段(sdFv)、抗個體基因型(抗Id)抗體(包括例如抗抗Id抗體)、微型抗體、域抗體、合成抗體(在本文中有時稱為「抗體模擬物」)及以上任一者之抗原結合片段。在一些實施例中,本文所描述之抗體係指多株抗體群體。
免疫球蛋白可衍生自包括但不限於IgA、分泌性IgA、IgG及IgM之通常已知之同型中的任一者。IgG子類亦為熟習此項技術者熟知,且包括但不限於人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。「同型」係指由重鏈恆定區基因編碼之Ab類或子類(例如IgM或IgG1)。術語「抗體(antibody)」包括例如天然存在之Ab及非天然存在之Ab;單株Ab及多株Ab;嵌合Ab及人類化Ab;人類Ab或非人類Ab;完全合成Ab;及單鏈Ab。非人類Ab可藉由重組方法人類化以降低其在人類免疫原性。在未明確陳述之情況下且除非上下文另外指示,否則術語「抗體」亦包括前述免疫球蛋白中任一者之抗原結合片段或抗原結合部分,且包括單價及二價片段或部分、及單鏈Ab。
通常使用多種CDR定義:Kabat編號、Chothia編號、AbM編號或contact編號。AbM定義為由Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體使用之兩者之間的折衷。contact定義係基於可用複合晶體結構之分析。術語「Kabat編號(Kabat numbering)」及類似術語在此項技術中公認且係指編號抗體或其抗原結合分子之重鏈及輕鏈可變區中之胺基酸殘基的系統。在某些態樣中,抗體之CDR可根據Kabat編號系統確定(參見例如Kabat EA及Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391,及Kabat EA等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, 美國健康與人類服務部(U.S. Department of Health and Human Services), NIH公開案第91-3242號)。使用Kabat編號系統,抗體重鏈分子內之CDR通常存在於以下處:胺基酸位置31至35,其可視情況在35後包括一或兩個額外胺基酸(在Kabat編號方案中稱為35A及35B) (CDR1);胺基酸位置50至65 (CDR2);及胺基酸位置95至102 (CDR3)。使用Kabat編號系統,抗體輕鏈分子內之CDR通常存在於以下處:胺基酸位置24至34 (CDR1);胺基酸位置50至56 (CDR2);及胺基酸位置89至97 (CDR3)。在一特定實施例中,本文所描述之抗體之CDR已根據Kabat編號方案確定。在某些態樣中,抗體之CDR可根據Chothia編號方案確定,Chothia編號方案係指免疫球蛋白結構環之位置(參見例如Chothia C及Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196:901-917;Al-Lazikani B等人, (1997), J Mol Biol 273:927-948;Chothia C等人, (1992), J Mol Biol 227:799-817;Tramontano A等人, (1990), J Mol Biol 215(1):175-82;及美國專利第7,709,226號)。通常,當使用Kabat編號規約時,Chothia CDR-H1環存在於重鏈胺基酸26至32、33或34,Chothia CDR-H2環存在於重鏈胺基酸52至56,且Chothia CDR-H3環存在於重鏈胺基酸95至102,而Chothia CDR-L1環存在於輕鏈胺基酸24至34,Chothia CDR-L2環存在於輕鏈胺基酸50至56,且Chothia CDR-L3環存在於輕鏈胺基酸89至97。在使用Kabat編號規約進行編號時,Chothia CDR-HI環末端視環之長度而在H32與H34之間變化(此係因為Kabat編號方案將插入置於H35A及H35B;若既不存在35A,亦不存在35B,則環末端處於32;若僅存在35A,則環末端處於33;若35A與35B均存在,則環末端處於34)。在一特定實施例中,本文所描述之抗體之CDR已根據Chothia編號方案確定。
如本文所使用之術語「
可變區 (variable region)」或「
可變域 (variable domain)」可互換地使用且在此項技術中常見。可變區通常指抗體之一部分,一般指輕鏈或重鏈之一部分,通常指成熟重鏈中約胺基端110至120個胺基酸及成熟輕鏈中約90至115個胺基酸,其序列在抗體間廣泛不同且用於特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。序列中之可變性集中於稱為互補決定區(CDR)之彼等區域中,而可變域中更高度保守區稱為構架區(FR)。在不希望受任何特定機制或理論束縛之情況下,咸信輕鏈及重鏈之CDR主要負責抗體與抗原之相互作用及特異性。在一些實施例中,可變區為人類可變區。在一些實施例中,可變區包含嚙齒類或鼠CDR及人類構架區(FR)。在特定實施例中,可變區為靈長類(例如非人類靈長類)可變區。在一些實施例中,可變區包含嚙齒類或鼠CDR及靈長類(例如非人類靈長類)構架區(FR)。術語「
VL」及「
VL 域 ( VL domain )」可互換地使用以指代抗體或其抗原結合分子之輕鏈可變區。術語「
VH」及「
VH 域 (VH domain)」可互換地使用以指代抗體或其抗原結合分子之重鏈可變區。
如本文所使用之術語「
恆定區 (constant region)」及「
恆定域 (constant domain)」可互換且具有此項技術中常見之含義。恆定區為抗體部分,例如不直接參與抗體與抗原之結合但可展現諸如與Fc受體之相互作用之各種效應功能的輕鏈及/或重鏈之羧基端部分。免疫球蛋白分子之恆定區之胺基酸序列一般比免疫球蛋白可變域更保守。
如本文所使用之「
適體 (aptamer)」一般指單個已確定序列之寡核苷酸或該等核苷酸之混合物,其中混合物保留特異性結合至目標分子(例如真核起始因子、40S核糖體、聚C結合蛋白、聚A結合蛋白、聚嘧啶束結合蛋白、阿爾戈瑙特蛋白家族、異質核核糖核蛋白K及La以及相關RNA-結合蛋白)的特性。因此,如本文所使用之「適體」指示如上文所定義之核苷酸之單個序列及複數個序列。術語「適體」意欲指能夠結合至蛋白質或其他分子之單股或雙股核酸。一般而言,適體較佳包含約10至約100個核苷酸,較佳約15至約40個核苷酸,更佳約20至約40個核苷酸,此係因為落入此等範圍內之長度之寡核苷酸易於藉由習知技術來製備。視情況而言,適體可進一步包含實現特異性結合所必需之最少大致6個核苷酸,較佳10個且更佳14或15個核苷酸。
如本文所使用之「
自體免疫 (autoimmunity)」經定義為針對非感染性自身抗原之持久性及進行性免疫反應,該等非感染性自身抗原不同於來自侵入且存留於哺乳動物及人類內之細菌、病毒、真菌或寄生生物體的感染性非自身抗原。自體免疫病況包括硬皮病、格雷氏病、克羅恩氏病、休格連氏病、多發性硬化症、橋本氏病、乾癬、重症肌無力、自體免疫多內分泌病變症候群、I型糖尿病(TIDM)、自體免疫胃炎、自體免疫葡萄膜視網膜炎、多發性肌炎、結腸炎及甲狀腺炎以及以人類狼瘡為代表之全身性自體免疫疾病。如本文所使用之「
自體抗原 ( autoantigen )」或「
自身抗原 ( self-antigen )」係指為哺乳動物原生且在該哺乳動物中具有免疫原性之抗原或抗原決定基。
術語「
自體 (autologous)」係指衍生自同一個體之任何物質,該個體中稍後再引入該物質。舉例而言,本文所描述之經工程改造之自體細胞療法(eACT™)方法涉及自患者收集淋巴球,接著工程改造淋巴球以表現例如CAR構築體,且接著投與回至同一患者。術語「
同種異體 ( allogeneic )」係指衍生自一個個體之任何物質,該物質接著引入相同物種之另一個體中,例如同種異體T細胞移植。
「
結合親和力 (Binding affinity)」一般指在分子(例如抗體)之單個結合位點與該分子之結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用總和的強度。除非另外指示,否則如本文所使用之「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間的1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(K
D或K
d)表示。親和力可以此項技術中已知之多種方式加以量測及/或表現,包括但不限於平衡解離常數(K
D)及平衡締合常數(K
A或K
a)。K
D由k
off/k
on之商計算,而K
A由k
on/k
off之商計算。k
on係指例如抗體與抗原之締合速率常數,且k
off係指例如抗體與抗原之解離。k
on及k
off可藉由諸如BIACORE®或KinExA之一般熟習此項技術者已知之技術加以測定。
如本文所使用之術語「免疫特異性結合(immunospecifically binds)」、「免疫特異性辨識(immunospecifically recognizes)」、「特異性結合(specifically binds)」及「特異性辨識(specifically recognizes)」在抗體之情況下為類似術語,且係指結合至抗原(例如抗原決定基或免疫複合體)之分子,因為熟習此項技術者理解該結合。舉例而言,以例如免疫分析、BIACORE®、KinExA 3000儀器(Sapidyne Instruments,Boise,ID)或此項技術中已知之其他分析測定,特異性結合至抗原之分子可一般以較低親和力結合至其他肽或多肽。在一特定實施例中,特異性結合至一抗原之分子結合至該抗原的K
A為該分子結合至另一抗原時之K
A的至少2個對數級、2.5個對數級、3個對數級、4個或更多個對數級。
如本文所使用之「
雙順反子 RNA (bicistronic RNA)」係指包括編碼兩個不同蛋白質之兩個表現序列的聚核苷酸。此等表現序列可藉由編碼諸如蛋白酶裂解位點之可裂解肽的核苷酸序列間隔開。其亦可藉由核糖體跳躍元件間隔開。
「
癌症 (cancer)」係指特徵在於異常細胞在體內不受控生長之各種疾病廣泛群組。不受調控細胞分裂及生長導致形成侵入鄰近組織且亦可能會經由淋巴系統或血流轉移至身體之遠端部分的惡性腫瘤。「癌症」或「癌症組織」可包括腫瘤。可藉由本文所揭示之方法治療之癌症之實例包括但不限於免疫系統癌症,包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤及其他白血球惡性病。在一些實施例中,本文所揭示之方法可用於減小衍生自例如以下之腫瘤的腫瘤大小:骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌、睾丸癌、子宮癌、多發性骨髓瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、轉化型濾泡性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病、急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL) (包括非T細胞ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、兒童實體腫瘤、淋巴球性淋巴瘤、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊髓軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤;環境誘發型癌症,包括石棉誘發型癌症;其他B細胞惡性病;及該等癌症之組合。在一些實施例中,本文所揭示之方法可用於減小衍生自例如以下之腫瘤之腫瘤大小:肉瘤及癌瘤、纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、軟組織肉瘤及其他肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細胞癌、肺癌、結腸直腸癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌(例如胰臟腺癌、結腸腺癌、卵巢腺癌、肺腺癌、乳腺癌、胃腺癌、前列腺腺癌、子宮頸腺癌或食道腺癌)、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓質癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝腫瘤、膽管癌、絨毛膜癌、威耳姆氏腫瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睾丸腫瘤、膀胱癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、腎盂癌、CNS腫瘤(諸如神經膠質瘤、星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠細胞瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤及視網膜母細胞瘤)。特定癌症可能對化學或輻射療法有反應,或癌症可能為難治癒的。難治癒癌症係指手術干預不可改善之癌症,且癌症起初對化學或輻射療法無反應或癌症隨時間推移變得無反應。
如本文所使用之術語「
環狀 RNA (circRNA)」、「
環狀聚核糖核苷酸 (circular polyribonucleotide)」、「
環狀 RNA (circular RNA)」、「
環化 RNA (circularized RNA)」及「
oRNA」可互換地使用且係指經由共價鍵形成環狀結構之聚核糖核苷酸。如本文所使用之該等術語亦包括包含環狀RNA之製備物。
如本文所使用之術語「
環化效率 (circularization efficiency)」係指與所得環狀聚核糖核苷酸之線性起始物質相比一定量之所得環狀聚核糖核苷酸之形成速率的量度。
聚核苷酸構築體中之表現序列可藉由使得由表現序列編碼之多肽能夠在轉譯後由細胞分開表現之「
裂解位點」序列間隔開。「
自裂解肽」係指以下肽:在兩個鄰接胺基酸之間無肽鍵之情況下經轉譯,或起作用以使得當產生包含蛋白質及自裂解肽之多肽時,其緊接著經裂解或分離成不同且離散的第一多肽及第二多肽而不需要任何外部裂解活性。
如本文所使用之「
編碼元件 (coding element)」、「
編碼序列 (coding sequence)」、「
編碼核酸 (coding nucleic acid)」或「
編碼區 (coding region)」為位於表現序列內且編碼一或多種蛋白質或多肽(例如治療性蛋白)之區域。如本文所使用之「
非編碼元件 (noncoding element)」、「
非編碼序列 (noncoding sequence)」、「
非編碼核酸 (non-coding nucleic acid/noncoding nucleic acid)」為位於表現序列內之區域。但此序列自身不編碼蛋白質或多肽,但可具有其他調控功能,包括但不限於允許總聚核苷酸充當特異性細胞之生物標記物或輔助件。
如本文所使用之「
保守 (conservative)」胺基酸取代為其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換之取代。此項技術中已界定具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。此等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β分支側鏈之胺基酸(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳族側鏈之胺基酸(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。在一些實施例中,抗體或其抗原結合分子之(多個) CDR內或(多個)構架區內之一或多個胺基酸殘基可經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換。
如本文所使用之「
共刺激性配位體 (costimulatory ligand)」包括特異性結合T細胞上之同源共刺激性分子之抗原呈現細胞上之分子。共刺激性配位體之結合提供介導T細胞反應之信號,該T細胞反應包括但不限於增殖、活化、分化及其類似反應。共刺激性配位體誘導除初級信號以外由刺激性分子,例如藉由使T細胞受體(TCR)/CD3複合物與負載有肽之主要組織相容複合物(MHC)分子結合提供的信號。共刺激性配位體可包括但不限於3/TR6、4-1BB配位體、結合鐸樣受體之促效劑或抗體、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD30配位體、CD40、CD7、CD70、CD83、疱疹病毒侵入介體(HVEM)、人類白血球抗原G (HLA-G)、ILT4、免疫球蛋白樣轉錄物(ILT) 3、誘導性共刺激性配位體(ICOS-L)、細胞間黏附分子(ICAM)、與B7-H3特異性結合之配位體、淋巴毒素β受體、I類MHC鏈相關蛋白A (MICA)、I類MHC鏈相關蛋白B (MICB)、OX40配位體、PD-L2或計劃性死亡(PD) L1。共刺激性配位體包括不限於與存在於T細胞上之共刺激性分子特異性結合之抗體,諸如但不限於4-1BB、B7-H3、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD7、ICOS、與CD83特異性結合之配位體、淋巴球功能相關抗原1 (LFA-1)、自然殺手細胞受體C (NKG2C)、OX40、PD-1或腫瘤壞死因子超家族成員14 (TNFSF14或LIGHT)。
「
共刺激性分子 (costimulatory molecule)」為T細胞上之同源結合搭配物,其與共刺激性配位體特異性結合,由此藉由T細胞介導諸如但不限於增殖之共刺激性反應。共刺激性分子包括但不限於4-1BB/CD137、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD 33、CD 45、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD134、CD137、CD154、CD16、CD160 (BY55)、CD 18、CD19、CD19a、CD2、CD22、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3 (α;β;δ;ε;γ;ζ)、CD30、CD37、CD4、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD5、CD64、CD69、CD7、CD80、CD83配位體、CD84、CD86、CD8α、CD8β、CD9、CD96 (Tactile)、CD1-la、CDl-lb、CDl-lc、CDl-ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fc γ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、ICOS、Ig α (CD79a)、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、IT GAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、LIGHT、LIGHT (腫瘤壞死因子超家族成員14;TNFSF14)、LTBR、Ly9 (CD229)、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1 (CD1 la/CD18)、I類MHC分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX40、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴球性活化分子、SLAM (SLAMF1;CD150;IPO-3)、SLAMF4 (CD244;2B4)、SLAMF6 (NTB-A;Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF、TNFr、TNFR2、鐸配位體受體、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6或其片段、截短體或組合。
如本文所使用之「
共刺激性信號 (costimulatory signal)」係指與諸如TCR/CD3連接之初級信號組合引起諸如但不限於關鍵分子之增殖及/或上調或下調之T細胞反應的信號。
如本文所使用,若抗原與第一結合分子、抗體或其抗原結合分子之間的相互作用阻斷、限制、抑制或以其他方式減弱參考結合分子、參考抗體或其抗原結合分子與抗原相互作用之能力,則抗原結合分子、抗體或其抗原結合分子與參考抗體或其抗原結合分子「
交叉競爭 (cross-compete)」。交叉競爭可為完全的,例如結合分子與抗原之結合完全阻斷參考結合分子結合抗原之能力,或其可為部分的,例如結合分子與抗原之結合減弱參考結合分子結合抗原之能力。在一些實施例中,與參考抗原結合分子交叉競爭之抗原結合分子結合與參考抗原結合分子相同或重疊的抗原決定基。在其他實施例中,與參考抗原結合分子交叉競爭之抗原結合分子結合與參考抗原結合分子不同的抗原決定基。可使用許多類型之競爭性結合分析來判定一個抗原結合分子是否與另一抗原結合分子競爭,例如:固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(Stahli等人, 1983, Methods in Enzymology 9:242-253);固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (Kirkland等人, 1986, J. Immunol. 137:3614-3619);固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(Harlow及Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press);使用1-125標記之固相直接標記RIA (Morel等人, 1988, Molec. Immunol. 25:7-15);固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (Cheung等人, 1990, Virology 176:546-552);及直接標記RIA (Moldenhauer等人, 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82)。
如本文所使用之「
細胞介素 (cytokine)」係指響應於與特異性抗原之接觸而由一個細胞釋放之非抗體蛋白,其中細胞介素與第二細胞相互作用以介導第二細胞中之反應。細胞介素可由細胞內源性表現,或投與個體。細胞介素可由包括巨噬細胞、B細胞、T細胞、嗜中性球、樹突狀細胞、嗜酸性球及肥大細胞之免疫細胞釋放以傳播免疫反應。細胞介素可在接受者細胞中誘導各種反應。細胞介素可包括恆定細胞介素、趨化因子、促炎性細胞介素、效應子及急性期蛋白。舉例而言,包括介白素(IL) 7及IL-15之恆定細胞介素促進免疫細胞存活及增殖,且促炎性細胞介素可促進發炎反應。恆定細胞介素之實例包括但不限於IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-15及干擾素(IFN) γ。促炎性細胞介素之實例包括但不限於IL-1a、IL-1b、IL-6、IL-13、IL-17a、IL-23、IL-27、腫瘤壞死因子(TNF)-α、TNF-β、纖維母細胞生長因子(FGF) 2、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、可溶性細胞間黏附分子1 (sICAM-1)、可溶性血管黏附分子1 (sVCAM-1)、血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D及胎盤生長因子(PLGF)。效應子之實例包括但不限於顆粒酶A、顆粒酶B、可溶性Fas配位體(sFasL)、TGF-β、IL-35及穿孔蛋白。急性期蛋白之實例包括但不限於C反應蛋白(CRP)及血清澱粉樣蛋白A (SAA)。
「
共同投與 (co-administering)」意謂在時間上充分接近地投與本文所提供之治療劑以及一或多種額外治療劑以使得本文所提供之治療劑可增強一或多種額外治療劑之作用,或反之亦然。
如本文所使用之術語「
共同調配 (co-formulate)」係指包含兩種或更多種核酸或一核酸及其他活性藥物物質之奈米粒子調配物。通常,比率為等莫耳或以兩種或更多種核酸或核酸及其他活性藥物物質之比例量測量定義。
如本文所使用之術語「
去氧核糖核酸 (deoxyribonucleic acid)」及「
DNA」意謂由去氧核糖核苷酸構成之聚合物。如本文所使用之術語「
核糖核酸 (ribonucleic acid)」及「
RNA」意謂由核糖核苷酸構成之聚合物。
如本文所使用之術語「
DNA 模板 (DNA template)」係指能夠轉錄線性RNA聚核苷酸之DNA序列。舉例而言但不意欲為限制的,DNA模板可包括DNA載體、PCR產物或質體。
如本文所使用之術語「
雙螺旋 (duplexed)」、「
雙股 (double-stranded)」及「
雜交 (hybridized)」可互換地使用且係指藉由使含有互補序列之核酸之兩個單股雜交而形成雙股核酸。兩個單股核酸之序列可完全互補或部分互補。在一些實施例中,本文所提供之核酸可為完全雙股或部分雙股的。在大多數情況下,基因體DNA為雙股的。
如本文所使用,當兩個「
雙螺旋體序列 (duplex sequences)」、「
雙螺旋體形成序列 (duplex forming sequences)」、「
雙螺旋體區 (duplex region)」、「
雙螺旋體形成區 (duplex forming regions)」、「
同源臂 (homology arms)」或「
同源區 (homology regions)」與彼此之反向互補序列共有充分位準之序列一致性以充當雜交反應之受質時,兩個區域彼此完全或部分互補(complement/complementary)。在一些實施例中,兩個雙螺旋體形成序列在熱力學上有利於在序列特異性相互作用中交叉配對。如本文所使用,當聚核苷酸序列與反向互補序列或「互補」序列一致或共有序列一致性時,其具有「
同源性」。同源區與對應體同源區之反向互補序列之間的序列一致性百分比可為允許進行雜交之任何序列一致性百分比。在一些實施例中,本文所揭示之聚核苷酸之內部雙螺旋體形成區能夠與另一內部雙螺旋體形成區形成雙螺旋體,且不與外部雙螺旋體形成區形成雙螺旋體。
如本文所使用之術語「
編碼 (encode)」廣泛地指藉以使用聚合巨分子中之資訊來導引不同於第一分子之第二分子產生的任何方法。第二分子可具有不同於第一分子之化學性質的化學結構。舉例而言,DNA模板(例如DNA載體)可編碼RNA聚核苷酸;前驅體RNA聚核苷酸(例如線性前驅體RNA聚核苷酸)可編碼成熟RNA聚核苷酸(例如環狀RNA聚核苷酸)。
如本文所使用之「內源性(endogenous)」意謂物質為生物系統(例如生物體、組織或細胞)原生,亦即天然地起源於該生物系統。舉例而言,在一些實施例中,「內源性聚核苷酸」通常在細胞或組織中表現。在一些實施例中,若諸如活化轉錄或轉譯之啟動子或增強子序列之控制序列已經由重組技術改變,則聚核苷酸仍視為內源性的。如本文所使用之術語「
異源性 (heterologous)」意謂來自除天然存在之序列以外之任何來源。
如本文所使用之「
核酸內切酶位點 (endonuclease site)」係指聚核苷酸內能夠由核酸內切酶蛋白辨識及裂解之一連串核苷酸。
「
真核起始因子 (eukaryotic initiation factor)」或「
eIF」係指用於裝配起始真核轉譯所需之起始tRNA、40S及60S核糖體亞單元的蛋白質或蛋白複合物。
如本文所使用之「
抗原決定基 (epitope)」為此項技術中之術語且係指抗原中可與抗體特異性結合之局部化區。抗原決定基可為例如多肽之相鄰胺基酸(線性或相鄰抗原決定基),或抗原決定基可例如由一或多個多肽之兩個或更多個非相鄰區域聚集在一起得到(構形、非線性、非連續或非相鄰抗原決定基)。在一些實施例中,與抗體結合之抗原決定基可以例如NMR光譜法、X射線繞射結晶學研究、ELISA分析、氫/氘交換耦聯質譜法(例如液相層析電噴霧質譜法)、基於陣列之寡肽掃描分析及/或突變誘發定位(例如定點突變誘發定位)確定。對於X射線結晶學,結晶可使用此項技術中之已知方法中之任一者實現(例如Giege R等人, (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4):339-350;McPherson A (1990) Eur J Biochem 189:1-23;Chayen NE (1997) Structure 5:1269-1274;McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303)。抗體:抗原晶體可使用熟知的X射線繞射技術來加以研究,且可使用電腦軟體來加以優化,該電腦軟體諸如X-PLOR (Yale University, 1992, 由Molecular Simulations公司發行;參見例如Meth Enzymol (1985)第114及115卷, 編者Wyckoff HW等人;美國專利公開案第2004/0014194號),及BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60;Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, 編者Carter CW;Roversi P等人, (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323)。
如本文所使用之術語「
表現序列 (expression sequence)」係指編碼例如肽或多肽之產物或調控核酸或非編碼核酸之核酸序列。例示性編碼肽或多肽之表現序列可包含複數個核苷酸三分體,該複數個核苷酸三分體中之各者可編碼胺基酸且稱為「
密碼子」。
如本文所使用之「
融合蛋白 (fusion protein)」為具有至少兩個由已連接以轉錄單一肽之單獨基因編碼之域的蛋白質。
術語「
經基因工程改造 (genetically engineered)」或「
經工程改造 (engineered)」係指修飾細胞基因體之方法,包括但不限於:使編碼區或非編碼區或其一部分缺失或插入編碼區或其一部分。在一些實施例中,經修飾細胞為可獲自患者或供體之例如T細胞之淋巴球。細胞可經修飾以表現併入細胞基因體中之諸如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之外源性構築體。
「
免疫反應 (immune response)」係指免疫系統之細胞(例如T淋巴球、B淋巴球、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、樹突狀細胞及嗜中性球)及由此等細胞中之任一者或肝產生之可溶性巨分子(包括抗體、細胞介素及補體)的作用,該作用對脊椎動物身體之侵入病原體、感染病原體之細胞或組織、癌細胞或其他異常細胞、或在自體免疫或病理性發炎之情況下的正常人類細胞或組織引起選擇性靶向、結合、損害、破壞及/或消除。
如本文所使用之術語「
免疫原性 (immunogenic)」或「
免疫刺激性 (immunostimulatory)」係指誘導針對物質之免疫反應之潛能。當生物體或某一類型之免疫細胞之免疫系統暴露於免疫原性物質時,可誘導免疫反應。術語「
非免疫原性 (non-immunogenic)」係指不具有或不存在高於可偵測臨限值之針對物質之免疫反應。當生物體或某一類型之免疫細胞之免疫系統暴露於非免疫原性物質時,未偵測到免疫反應。在一些實施例中,當以免疫原性分析量測時,如本文所提供之非免疫原性環狀聚核糖核苷酸不誘導高於預定臨限值之免疫反應。在一些實施例中,當生物體或某一類型之免疫細胞之免疫系統暴露於如本文所提供之非免疫原性環狀聚核糖核苷酸時,未偵測到先天性免疫反應。在一些實施例中,當生物體或某一類型之免疫細胞之免疫系統暴露於如本文所提供之非免疫原性環狀聚核糖核苷酸時,未偵測到適應性免疫反應。
如本文所使用之「
內部核糖體進入位點 (internal ribosome entry site)」或「
IRES」係指能夠在不存在典型RNA帽結構之情況下起始多肽轉譯之大小範圍為10 nt至1000 nt或更大之RNA序列或結構元件。IRES長度通常為約500 nt至約700 nt。
「
經分離 (isolated)」或「
經純化 (purified)」一般指分離物質(例如在一些實施例中為化合物、聚核苷酸、蛋白質、多肽、聚核苷酸組合物或多肽組合物)以使得物質占其所駐存之樣本相當大百分比(例如大於1%、大於2%、大於5%、大於10%、大於20%、大於50%或更大,通常多達約90%-100%)。在某些實施例中,實質上經純化之組分占樣本至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。在額外實施例中,實質上經純化之組分占樣本約80%-85%或90%-95%、95%-99%、96%-99%、97%-99%或95%-100%。用於純化所關注之聚核苷酸及多肽之技術為此項技術中熟知的且包括例如離子交換層析法、親和層析法及根據密度之沈降。一般而言,當物質相對於樣本之其他組分以大於其天然存在之量的量存在於樣本中時,純化該物質。
如本文所使用之「
前導非轉譯序列 (leading untranslated sequence)」為位於聚核苷酸序列之最上5'端之在1個核苷酸至數百個核苷酸範圍內之聚核苷酸序列之區域。序列可為確定的或可為隨機的。前導非轉譯序列為非編碼的。如本文所使用之「
末端非轉譯序列 (terminal untranslated sequence)」為位於聚核苷酸序列之最下3'端之在1個核苷酸至數百個核苷酸範圍內之聚核苷酸序列之區域。序列可為確定的或可為隨機的。末端非轉譯序列為非編碼的。
如本文所使用之術語「
淋巴球 (lymphocyte)」包括自然殺手(NK)細胞、T細胞或B細胞。NK細胞為一種類型之表示先天性免疫系統之主要組分的細胞毒性(cytotoxic/cell toxic)淋巴球。NK細胞抑制腫瘤及感染病毒之細胞。其經由細胞凋亡或計劃性細胞死亡之過程起作用。其稱為「自然殺手」,此係因為其不需要進行活化來殺滅細胞。T細胞在細胞介導之免疫(無抗體參與)中起主要作用。T細胞受體(TCR)將T細胞與其他淋巴球類型加以區分。作為免疫系統之特殊器官的胸腺為用於T細胞成熟之一級位點。存在許多類型之T細胞,包括:輔助T細胞(例如CD4+細胞)、細胞毒性T細胞(亦稱為TC、細胞毒性T淋巴球、CTL、T殺手細胞、細胞溶解T細胞、CD8+ T細胞或殺手T細胞)、記憶T細胞((i)如原生細胞之幹記憶細胞(TSCM)為CD45RO−、CCR7+、CD45RA+、CD62L+ (L-選滯蛋白)、CD27+、CD28+及IL-7Ra+,但亦表現大量CD95、IL-2R、CXCR3及LFA-1,且展示記憶細胞特有之許多功能屬性);(ii)中樞記憶細胞(TCM)表現L-選滯蛋白及CCR7,其分泌IL-2,但不分泌IFNγ或IL-4,及(iii)然而,效應記憶細胞(TEM)不表現L-選滯蛋白或CCR7,但產生如IFNγ及IL-4之效應細胞介素)、調控T細胞(Treg、抑制因子T細胞或CD4+CD25+或CD4+ FoxP3+調控性T細胞)、自然殺手T細胞(NKT)及γ δ T細胞。另一方面,B細胞在體液免疫(有抗體參與)中起主要作用。B細胞製造抗體,能夠充當抗原呈現細胞(APC)且在藉由抗原相互作用進行活化之後變成記憶B細胞及漿細胞,兩者均為短壽命的及長壽命的。在哺乳動物中,未成熟B細胞形成於骨髓中。
如本文所使用之「
miRNA 位點 (miRNA site)」係指聚核苷酸內能夠形成具有天然miRNA序列之至少8個核苷酸之雙螺旋體的一連串核苷酸。
如本文所使用之「
新抗原 (neoantigen)」係指產生於經表現蛋白質中之腫瘤特異性突變之一類腫瘤抗原。
術語「
核苷酸 (nucleotide)」係指核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、其經修飾形式或其類似。核苷酸包括包含例如腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤之嘌呤及其衍生物及類似物以及例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶之嘧啶及其衍生物及類似物的物種。核苷酸類似物包括在鹼基、糖及/或磷酸酯之化學結構中具有修飾之核苷酸,該等修飾包括但不限於5'位嘧啶修飾、8'位嘌呤修飾、胞嘧啶環外胺處之修飾及5-溴-尿嘧啶取代;及2'位糖修飾,包括但不限於經糖修飾之核糖核苷酸,其中2'-OH經諸如H、OR、R、鹵基、SH、SR、NH
2、NHR、NR
2或CN之基團置換,其中R為如本文所定義之烷基部分。核苷酸類似物亦意圖包括:具有鹼基之核苷酸,諸如肌苷、Q核苷、黃嘌呤;糖,諸如2'-甲基核糖;非天然磷酸二酯鍵,諸如甲基膦酸酯、硫代磷酸酯及肽鍵。核苷酸類似物包括5-甲氧基尿苷、1-甲基假尿苷及6-甲基腺苷。
本文所揭示之所有核苷酸序列可表示RNA序列或對應DNA序列。應理解,將DNA中之去氧胸苷(dT或T)轉錄成RNA中之尿苷(U)。因此,在核苷酸序列中,「T」及「U」在本文中可互換地使用。
術語「
核酸 (nucleic acid)」及「
聚核苷酸 (polynucleotide)」在本文中可互換地使用以描述由例如去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之核苷酸構成的例如大於約2個鹼基、大於約10個鹼基、大於約100個鹼基、大於約500個鹼基、大於1000個鹼基或多達約10,000或更多個鹼基之任何長度的聚合物,且可以酶或以合成方式產生(例如如美國專利第5,948,902號及其中引用之參考文獻中所描述),其可與天然存在之核酸以與兩種天然存在之核酸之方式類似的序列特異性方式雜交,例如可參與華特生-克里克鹼基配對(Watson-Crick base pairing)相互作用。「寡核苷酸(oligonucleotide)」為包含少於1000個核苷酸之聚核苷酸,諸如包含少於500個核苷酸或少於100個核苷酸之聚核苷酸。天然存在之核酸包含核苷酸,包括含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶之核苷酸(分別為G、C、A、T及U)。如本文所使用之「聚A」意謂由包含腺嘌呤之核苷酸組成之聚核苷酸或聚核苷酸之一部分。如本文所使用之「聚T」意謂由包含胸腺嘧啶之核苷酸組成之聚核苷酸或聚核苷酸之一部分。如本文所使用之「聚AC」意謂由包含腺嘌呤或胞嘧啶之核苷酸組成之聚核苷酸或聚核苷酸之一部分。
如本文所使用之術語「
核糖體跳躍元件 (ribosomal skipping element)」係指能夠使得自一個RNA分子轉譯產生兩個肽鏈之編碼短肽序列之核苷酸序列。儘管不希望受理論束縛,但假設核糖體跳躍元件藉由以下起作用:(1)終止第一肽鏈之轉譯及再起始第二肽鏈之轉譯;或(2)由核糖體跳躍元件編碼之肽序列中之肽鍵藉由經編碼肽之內部蛋白酶活性或藉由環境(例如胞溶質)中之另一蛋白酶進行裂解。
如本文所使用之術語「
序列一致性 (sequence identity)」係指序列在比較窗內基於逐個核苷酸或逐個胺基酸一致的程度。因此,「序列一致性百分比(percentage of sequence identity)」可藉由以下來計算:在比較窗內比較兩個經最佳比對序列,測定在兩個序列中出現一致核酸鹼基(例如A、T、C、G、I)或一致胺基酸殘基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys及Met)的位置數以得到匹配位置數,將匹配位置數除以比較窗中之位置總數(亦即窗大小),及將結果乘以100以得到序列一致性百分比。包括與本文所描述之參考序列中之任一者具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸及多肽,通常其中多肽變異體維持參考多肽之至少一種生物活性。
如本文所使用之「
間隔子 (spacer)」係指分離沿聚核苷酸序列之兩個其他元件之在1個核苷酸至數百或數千個核苷酸範圍內之聚核苷酸序列之區域。序列可為確定的或可為隨機的。間隔子通常為非編碼的。在一些實施例中,間隔子包括雙螺旋體區。
如本文所使用之術語「
剪接位點 (splice site)」係指部分或完全包括於第I組內含子中且在其間磷酸二酯鍵在RNA環化期間裂解之二核苷酸。
如本文關於RNA使用之「
結構化 (structured)」係指藉由RNAFold軟體或類似預測工具預測用於形成具有自身序列或相同RNA分子中之其他序列之結構(例如髮夾環)的RNA序列。如本文關於RNA使用之「
非結構化 (unstructured)」係指不藉由RNA結構預測工具預測用於形成具有自身序列或相同RNA分子中之其他序列之結構(例如髮夾環)的RNA序列。在一些實施例中,非結構化RNA可使用核酸酶保護分析進行功能性表徵。
如本文所使用之術語「
治療性蛋白 (therapeutic protein)」係指當以經轉譯核酸形式直接或間接地投與個體時具有治療性、診斷性及/或預防性作用及/或引發所需生物作用及/或藥理作用之任何蛋白質。
「
轉錄 (transcription)」意謂使用DNA分子作為模板,由RNA聚合酶形成或合成RNA分子。本發明就用於轉錄之RNA聚合酶而言不受限制。舉例而言,在一些實施例中,可使用T7型RNA聚合酶。
「
轉譯 (translation)」意謂基於RNA模板,由核糖體形成多肽分子。如本文所使用之術語「
轉譯效率 (translation efficiency)」係指自核糖核苷酸轉錄物產生蛋白質或肽之速率或量。在一些實施例中,轉譯效率可表示為每既定量之編碼蛋白質或肽之轉錄物的所產生蛋白質或肽之量。
如本文所使用之術語「
轉染 (transfect/transfection)」係指將一或多種經囊封物質(例如核酸及/或聚核苷酸)胞內引入細胞中,或較佳引入目標細胞中。術語「
轉染效率 (transfection efficiency)」係指藉由引入進行轉染之目標細胞中及/或由進行轉染之目標細胞表現而吸收之該經囊封物質(例如聚核苷酸)之相對量。在一些實施例中,轉染效率可藉由轉染後目標細胞所產生之報導聚核苷酸產物之量進行估計。在一些實施例中,轉移媒劑具有高轉染效率。在一些實施例中,轉移媒劑具有至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%轉染效率。
如本文所使用之「
轉移媒劑 (transfer vehicle)」包括一般意欲結合包括核酸之生物活性劑投與使用之標準醫藥載劑、稀釋劑、賦形劑及其類似中之任一者。在本發明之某些實施例中,轉移媒劑(例如脂質奈米粒子)經製備以囊封一或多種物質或治療劑(例如環狀RNA)。將所需治療劑(例如環狀RNA)併入轉移媒劑中之過程在本文中稱為「裝載」或「囊封」(Lasic等人, FEBS Lett., 312: 255-258, 1992)。裝載或囊封有轉移媒劑之物質(例如環狀RNA)可完全或部分位於轉移媒劑之內部空間中,轉移媒劑之雙層膜內,或與轉移媒劑之外表面締合。
如本文所使用之術語「
治療 (treat)」及「
預防 (prevent)」以及源自其之字語不一定暗示100%或完全治療或預防。更確切而言,一般熟習此項技術者辨識為具有潛在效益或治療作用之治療或預防之程度不同。藉由本文所揭示之方法提供之治療或預防可包括治療或預防疾病之一或多種病況或症狀。此外,出於本文之目的,「預防」可涵蓋延遲疾病或其症狀或病況之發作。
αβ TCR之α鏈及β鏈一般視為各自具有兩個域或區域,亦即可變域/區域及恆定域/區域。可變域由串連可變區及連接區組成。因此,在本說明書及申請專利範圍中,術語「
TCR α 可變域 ( TCR alpha variable domain )」係指串連TRAV區及TRAJ區,且術語TCR α恆定域係指胞外TRAC區或C端經截短TRAC序列。同樣,術語「
TCR β 可變域 ( TCR beta variable domain )」係指串連TRBV區及TRBD/TRBJ區,且術語TCR β恆定域係指胞外TRBC區或C端經截短TRBC序列。
如本文所使用之術語「
上游 (upstream)」及「
下游 (downstream)」係指聚核苷酸序列中例如核苷酸、序列元件之遺傳密碼之相對位置。在一些實施例中,在RNA聚核苷酸中,上游朝向聚核苷酸之5'端且下游朝向3'端。在一些實施例中,在DNA聚核苷酸中,上游朝向用於所論述基因之編碼股之5'端且下游朝向3'端。
如本文所使用之「
疫苗 (vaccine)」係指用於為疾病預防及/或治療產生免疫之組合物。因此,疫苗為包含抗原且意欲用於人類或動物中以用於在投與人類或動物之後產生特定防禦及保護性物質之藥劑。
A.
脂質定義
如本文所使用之片語「
生物可降解脂質 (biodegradable lipid)」或「
可降解脂質 (degradable lipid)」係指在宿主環境中按數分鐘、數小時或數天之次序分解,從而理想地使其具有較低毒性且不可能隨時間推移積聚於宿主中之多種脂質物種中的任一者。脂質之常見修飾尤其包括酯鍵及二硫鍵以提高脂質之生物可降解性。
如本文所使用之片語「
生物可降解 PEG 脂質 (biodegradable PEG lipid)」或「
可降解 PEG 脂質 (degradable PEG lipid)」係指其中在宿主環境中按數分鐘、數小時或數天之次序自脂質裂解PEG分子,從而理想地使其具有較低免疫原性之多種脂質物種中的任一者。PEG脂質之常見修飾尤其包括酯鍵及二硫鍵以提高脂質之生物可降解性。
如本文所使用之術語「
陽離子型脂質 (cationic lipid)」或「
可離子化脂質 (ionizable lipid)」係指在諸如生理pH 4之選定pH下攜帶淨正電荷且在諸如生理pH 7之其他pH下攜帶中性電荷之多種脂質物種中的任一者。
如本文所使用之術語「
PEG」意謂任何聚乙二醇或其他聚伸烷基醚聚合物。
如本文中一般定義,「
PEG-OH 脂質 (PEG-OH lipid)」(在本文中亦稱為「羥基-聚乙二醇化脂質」)為具有脂質上之一或多個羥基(-OH)之聚乙二醇化脂質。
如本文所使用之「
磷脂 (phospholipid)」為包括磷酸酯部分及一或多個諸如不飽和脂肪酸鏈之碳鏈的脂質。
如本文所使用之術語「
結構脂質 (structural lipid)」係指固醇以及含有固醇部分之脂質。如本文所定義之「
固醇 ( sterols )」為由類固醇組成之類固醇子組。
當在本文中用以描述本發明之化合物(例如脂質)時,術語「
頭基 (head-
group)」及「
尾基 (tail-group)」且特定言之包含於該等化合物中之官能基係為了易於提及而使用以描述該等化合物或一或多個官能基相對於其他官能基的定向。舉例而言,在某些實施例中,親水性頭基(例如鈲)與可裂解官能基(例如二硫鍵基團)結合(例如藉由氫鍵、凡得瓦爾力(van der Waals' force)、離子相互作用及共價鍵中之一或多者),繼而與疏水性尾基(例如膽固醇)結合。在某些實施例中,本文所揭示之化合物包含例如至少一個親水性頭基及至少一個疏水性尾基,其各自結合至至少一個可裂解基團,藉此使得該等化合物具有兩親媒性。
如本文所使用之術語「
兩親媒性 (amphiphilic)」意謂溶解於極性環境(例如水)及非極性環境(例如脂質)中之能力。舉例而言,在某些實施例中,本文所揭示之化合物(例如脂質)包含至少一個親脂性尾基(例如膽固醇或C
6 - 20烷基)及至少一個親水性頭基(例如咪唑),其各自結合至可裂解基團(例如二硫鍵)。
如本文所使用之術語「
親水性 (hydrophilic)」用於在定性術語中指示官能基偏好水且通常該等基團可溶於水。舉例而言,本文揭示包含結合至一或多個親水性基團(例如親水性頭基)之可裂解基團(例如二硫鍵(S-S)基)的化合物(例如可離子化脂質),其中該等親水性基團包含以下或選自由以下組成之群:咪唑、鈲、胺基、亞胺、烯胺、視情況經取代之烷胺基(例如烷胺基,諸如二甲胺基)及吡啶基。
如本文所使用之術語「
疏水性 (hydrophobic)」用於在定性術語中指示官能基避開水且通常該等基團不可溶於水。在某些實施例中,包含本文所揭示之化合物之部分的官能基中之至少一者本質上為疏水性的(例如包含諸如膽固醇之天然存在之脂質的疏水性尾基)。舉例而言,本文揭示包含結合至一或多個疏水性基團之可裂解官能基(例如二硫鍵(S-S)基)的化合物(例如可離子化脂質),其中該等疏水性基團可包含以下或可選自以下:一或多種天然存在之脂質,諸如膽固醇、視情況經取代之可變飽和或不飽和C
6-C
20烷基及/或視情況經取代之可變飽和或不飽和C
6-C
20醯基。
如本文所使用之術語「
脂質體 (liposome)」一般指由以一或多個球形雙層排列之脂質(例如兩親媒性脂質)構成的囊泡。該等脂質體可為單層或多層囊泡,該等囊泡具有由親脂性物質形成之膜及含有待遞送至一或多個目標細胞、組織及器官之經囊封環狀RNA的水性內部。
如本文所使用之片語「
脂質奈米粒子 (lipid nanoparticle)」係指包含一或多種陽離子型脂質或可離子化脂質、穩定脂質、結構脂質及輔助脂質之轉移媒劑。
在某些實施例中,本文所描述之組合物包含一或多種脂質體或脂質奈米粒子。可用於形成所考慮之脂質體及脂質奈米粒子之適合的脂質(例如可離子化脂質)之實例包括本文所揭示之化合物(例如HGT4001、HGT4002、HGT4003、HGT4004及/或HGT4005)中的一或多者。該等脂質體及脂質奈米粒子亦可包含諸如以下之額外可離子化脂質:C12-200、DLin-KC2-DMA及/或HGT5001、輔助脂質、結構脂質、經PEG修飾之脂質、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK-E12、ICE、HGT5000、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA、DMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、HGT4003及其組合。
在一些實施例中,本文所揭示之例如可離子化脂質之脂質包含一或多個可裂解基團。術語「裂解(cleave)」及「可裂解(cleavable)」在本文中用於意謂於本發明官能基中或與本發明官能基鄰接之原子之間的一或多個化學鍵(例如共價鍵、氫鍵、凡得瓦爾力及/或離子相互作用中之一或多者)在暴露於選定條件後(例如在暴露於酶條件後)斷裂(例如水解)或能夠斷裂。在某些實施例中,可裂解基團為二硫鍵官能基,且在特定實施例中為能夠在暴露於選定生物條件(例如胞內條件)後裂解之二硫鍵基。在某些實施例中,可裂解基團為能夠在暴露於選定生物條件後裂解之酯官能基。舉例而言,二硫鍵基可以酶或藉由水解、氧化或還原反應裂解。在裂解該二硫鍵官能基之後,可釋放與其結合之一或多個官能部分或官能基(例如頭基及/或尾基中之一或多者)。例示性可裂解基團可包括但不限於二硫鍵基、酯基、醚基及其任何衍生物(例如烷基及芳基酯)。在某些實施例中,可裂解基團不為酯基或醚基。在一些實施例中,可裂解基團與一或多個官能部分或官能基(例如至少一個頭基及至少一個尾基)結合(例如藉由氫鍵、凡得瓦爾力、離子相互作用及共價鍵中之一或多者結合)。在某些實施例中,官能部分或官能基中之至少一者為親水性的(例如包含咪唑、鈲、胺基、亞胺、烯胺、視情況經取代之烷胺基及吡啶基中之一或多者的親水性頭基)。
B.
化學物質定義
當描述可包括化合物及其醫藥學上可接受之鹽、含有該等化合物之醫藥組合物及使用該等化合物及組合物之方法的本發明時,除非另外指示,否則以下術語(若存在)具有以下含義。亦應理解,當在本文中描述時,下文所定義之部分中之任一者可經各種取代基取代,且各別定義意欲將該等經取代部分包括在其下文所闡述之範疇內。除非另外陳述,否則術語「經取代(substituted)」應如下文所闡述來定義。應進一步理解,術語「基團(group/radical)」在本文中使用時可視為可互換的。
本文所描述之化合物亦可包含一或多個同位素取代。舉例而言,H可呈任何同位素形式,包括
1H、
2H (D或氘)及
3H (T或氚);C可呈任何同位素形式,包括
12C、
13C及
14C;O可呈任何同位素形式,包括
16O及
18O;F可呈任何同位素形式,包括
18F及
19F;及其類似。
當列舉值之範圍時,其意欲涵蓋在該範圍內之各值及子範圍。舉例而言,「C
1-6烷基(C
1-6alkyl)」意欲涵蓋C
1、C
2、C
3、C
4、C
5、C
6、C
1-6、C
1-5、C
1-4、C
1-3、C
1-2、C
2-6、C
2-5、C
2-4、C
2-3、C
3-6、C
3-5、C
3-4、C
4-6、C
4-5及C
5-6烷基。
如本文所使用之術語「
烷基 (alkyl)」係指直鏈及分支鏈C
1-40烴(例如C
6-20烴),且包括飽和烴及不飽和烴。在某些實施例中,烷基可包含一或多個環狀烷基及/或一或多個諸如氧、氮或硫之雜原子,且可視情況經取代基(例如烷基、鹵基、烷氧基、羥基、胺基、芳基、醚、酯或醯胺中之一或多者)取代。在某些實施例中,所考慮之烷基包括(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯。使用諸如「C
6-20」之名稱意欲指具有所敍述範圍之碳原子之烷基(例如直鏈或分支鏈且包括烯烴及烷基)。在一些實施例中,烷基具有1至10個碳原子(「C
1-10烷基」)。在一些實施例中,烷基具有1至9個碳原子(「C
1-9烷基」)。在一些實施例中,烷基具有1至8個碳原子(「C
1-8烷基」)。在一些實施例中,烷基具有1至7個碳原子(「C
1-7烷基」)。在一些實施例中,烷基具有1至6個碳原子(「C
1-6烷基」)。在一些實施例中,烷基具有1至5個碳原子(「C
1-5烷基」)。在一些實施例中,烷基具有1至4個碳原子(「C
1-4烷基」)。在一些實施例中,烷基具有1至3個碳原子(「C
1-3烷基」)。在一些實施例中,烷基具有1至2個碳原子(「C
1-2烷基」)。在一些實施例中,烷基具有1個碳原子(「C
1烷基」)。C
1-6烷基之實例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、戊基、己基及其類似。
如本文所使用之「
烯基 (alkenyl)」係指具有2至20個碳原子、一或多個碳-碳雙鍵(例如1、2、3或4個碳-碳雙鍵)及視情況一或多個碳-碳參鍵(例如1、2、3或4個碳-碳參鍵)之直鏈或分支鏈烴基(「C
2-20烯基」)。在某些實施例中,烯基不含任何參鍵。在一些實施例中,烯基具有2至10個碳原子(「C
2-10烯基」)。在一些實施例中,烯基具有2至9個碳原子(「C
2-9烯基」)。在一些實施例中,烯基具有2至8個碳原子(「C
2-8烯基」)。在一些實施例中,烯基具有2至7個碳原子(「C
2-7烯基」)。在一些實施例中,烯基具有2至6個碳原子(「C
2-6烯基」)。在一些實施例中,烯基具有2至5個碳原子(「C
2-5烯基」)。在一些實施例中,烯基具有2至4個碳原子(「C
2-4烯基」)。在一些實施例中,烯基具有2至3個碳原子(「C
2-3烯基」)。在一些實施例中,烯基具有2個碳原子(「C
2烯基」)。一或多個碳-碳雙鍵可為內部的(諸如在2-丁烯基中)或末端的(諸如在1-丁烯基中)。C
2-4烯基之實例包括乙烯基(C
2)、1-丙烯基(C
3)、2-丙烯基(C
3)、1-丁烯基(C
4)、2-丁烯基(C
4)、丁二烯基(C
4)及其類似。C
2-6烯基之實例包括前述C
2-4烯基以及戊烯基(C
5)、戊二烯基(C
5)、己烯基(C
6)及其類似。烯基之額外實例包括庚烯基(C
7)、辛烯基(C
8)、辛三烯基(C
8)及其類似。
如本文所使用之「
炔基 (alkynyl)」係指具有2至20個碳原子、一或多個碳-碳參鍵(例如1、2、3或4個碳-碳參鍵)及視情況一或多個碳-碳雙鍵(例如1、2、3或4個碳-碳雙鍵)之直鏈或分支鏈烴基(「C
2-20炔基」)。在某些實施例中,炔基不含任何雙鍵。在一些實施例中,炔基具有2至10個碳原子(「C
2-10炔基」)。在一些實施例中,炔基具有2至9個碳原子(「C
2-9炔基」)。在一些實施例中,炔基具有2至8個碳原子(「C
2-8炔基」)。在一些實施例中,炔基具有2至7個碳原子(「C
2-7炔基」)。在一些實施例中,炔基具有2至6個碳原子(「C
2-6炔基」)。在一些實施例中,炔基具有2至5個碳原子(「C
2-5炔基」)。在一些實施例中,炔基具有2至4個碳原子(「C
2-4炔基」)。在一些實施例中,炔基具有2至3個碳原子(「C
2-3炔基」)。在一些實施例中,炔基具有2個碳原子(「C
2炔基」)。一或多個碳-碳參鍵可為內部的(諸如在2-丁炔基中)或末端的(諸如在1-丁炔基中)。C
2-4炔基之實例包括但不限於乙炔基(C
2)、1-丙炔基(C
3)、2-丙炔基(C
3)、1-丁炔基(C
4)、2-丁炔基(C
4)及其類似。C
2-6烯基之實例包括前述C
2-4炔基以及戊炔基(C
5)、己炔基(C
6)及其類似。炔基之額外實例包括庚炔基(C
7)、辛炔基(C
8)及其類似。
如本文所使用之「
伸烷基 (alkylene)」、「
伸烯基 (alkenylene)」及「
伸炔基 (alkynylene)」分別指烷基、烯基及炔基之二價基。當提供用於特定「伸烷基」、「伸烯基」及「伸炔基」之一定範圍或數目之碳時,應理解,該範圍或數目係指直鏈碳二價鏈中之碳的範圍或數目。「伸烷基」、「伸烯基」及「伸炔基」可經如本文所描述之一或多個取代基取代或未經取代。
如本文所使用之術語「
烷氧基 (alkoxy)」係指經由氧原子連接至另一部分之烷基(-O(烷基))。非限制性實例包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基及丁氧基。
如本文所使用之術語「
芳基 (aryl)」係指在環部分中含有六至十個碳之芳族基團(例如單環、雙環及三環結構)。芳基可視情況經由可用碳原子取代且在某些實施例中可包括一或多個諸如氧、氮或硫之雜原子。在一些實施例中,芳基具有六個環碳原子(「C
6芳基」;例如苯基)。在一些實施例中,芳基具有十個環碳原子(「C
10芳基」;例如萘基,諸如1-萘基及2-萘基)。
術語「
環烷基 (cycloalkyl)」係指具有3-12、3-8、4-8或4-6個碳之單價飽和環狀、雙環或橋連環狀(例如金剛烷基)烴基,在本文中例如稱為「C
4-8環烷基」,衍生自環烷。例示性環烷基包括但不限於環己烷、環戊烷、環丁烷及環丙烷。
如本文所使用之「
氰基 (cyano)」係指-CN。
如本文所使用之「
雜芳基 (heteroaryl)」係指在芳環系統中提供有環碳原子及1-4個環雜原子之5-10員單環或雙環4n+2芳環系統(例如在環狀陣列中共有6或10個電子)之基團,其中各雜原子獨立地選自氮、氧及硫(「5-10員雜芳基」)。在含有一或多個氮原子之雜芳基中,價數准許時,連接點可為碳或氮原子。雜芳基雙環系統可在一或兩個環中包括一或多個雜原子。「雜芳基」包括其中如上文所定義之雜芳基環與一或多個碳環基或雜環基稠合之環系統,其中連接點處於雜芳基環上,且在該等情況下,環成員之編號繼續指代雜芳基環系統中環成員之編號。「雜芳基」亦包括其中如上文所定義之雜芳基環與一或多個芳基稠合之環系統,其中連接點處於芳基或雜芳基環上,且在該等情況下,環成員之編號指代稠合(芳基/雜芳基)環系統中環成員之編號。於其中一個環不含雜原子之雙環雜芳基(例如吲哚基、喹啉基、咔唑基及其類似)中,連接點可處於任一環上,亦即,帶有雜原子之環(例如2-吲哚基)或不含雜原子之環(例如5-吲哚基)。
如本文所使用之「
雜環基 (heterocyclyl)」或「
雜環 (heterocyclic)」係指具有環碳原子及1至4個環雜原子之3至10員非芳環系統之基團,其中各雜原子獨立地選自氮、氧、硫、硼、磷及矽(「3-10員雜環基」)。在含有一或多個氮原子之雜環基中,價數准許時,連接點可為碳或氮原子。雜環基可為單環(「單環雜環基」)或稠合、橋連或螺環系統,諸如雙環系統(「雙環雜環基」),且可為飽和的或可為部分不飽和的。雜環基雙環系統可在一或兩個環中包括一或多個雜原子。「雜環基」亦包括其中如上文所定義之雜環基環與一或多個碳環基稠合之環系統,其中連接點處於碳環基或雜環基環上;或其中如上文所定義之雜環基與一或多個芳基或雜芳基稠合之環系統,其中連接點處於雜環基環上,且在該等情況下,環成員之編號繼續指代雜環基環系統中環成員之編號。術語「雜環(heterocycle)」、「雜環基(heterocyclyl)」、「雜環基環(heterocyclyl ring)」、「雜環基(heterocyclic group)」、「雜環部分(heterocyclic moiety)」及「雜環基(heterocyclic radical)」可互換地使用。
如本文所使用之術語「
鹵基 (halo)」及「
鹵素 (halogen)」係指選自氟(fluorine/fluoro,F)、氯(chlorine/chloro,Cl)、溴(bromine/bromo,Br)及碘(iodine/iodo,I)之原子。在某些實施例中,鹵基為氟或氯。
如本文所使用之「
側氧基 (oxo)」係指-C=O。
一般而言,術語「
經取代 (substituted)」不論前面是否存在術語「視情況(optionally)」均意謂存在於基團上之至少一個氫(例如碳或氮原子)經可允許取代基置換,該可允許取代基例如在取代後產生穩定化合物,例如不能自發地經歷諸如藉由重排、環化、消除或其他反應進行之轉化之化合物的取代基。除非另外指示,否則「經取代」基團在該基團之一或多個可取代位置處具有取代基,且當任何既定結構中超過一個位置經取代時,在各位置處之取代基相同或不同。
如本文所使用之「
醫藥學上可接受之鹽 (pharmaceutically acceptable salt)」係指在合理醫學判斷之範疇內適用於與人類及低等動物之組織接觸而無異常毒性、刺激、過敏反應及其類似且與合理效益/風險比相稱之彼等鹽。醫藥學上可接受之鹽在此項技術中眾所周知。舉例而言,Berge等人在J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1-19中詳細描述了醫藥學上可接受之鹽。本發明化合物之醫藥學上可接受之鹽包括衍生自適合的無機酸及有機酸以及無機鹼及有機鹼之醫藥學上可接受之鹽。醫藥學上可接受之無毒酸加成鹽之實例為用諸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸及過氯酸之無機酸或用諸如乙酸、草酸、順丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、丁二酸或丙二酸之有機酸及藉由使用諸如離子交換之此項技術中所使用之其他方法形成之胺基鹽。其他醫藥學上可接受之鹽包括己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、甲酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、葡糖酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽及其類似。衍生自適當的鹼之醫藥學上可接受之鹽包括鹼金屬、鹼土金屬、銨及N+(C1-4烷基)4鹽。代表性鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽及其類似。適當時,另外的醫藥學上可接受之鹽包括使用諸如鹵離子、氫氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低碳數烷基磺酸根及芳基磺酸根之相對離子形成之無毒銨、四級銨及胺陽離子。
在典型實施例中,本發明意欲涵蓋本文所揭示之化合物及該等化合物之醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之酯、互變異構形式、多晶型物及前驅藥。在一些實施例中,本發明包括本文所描述之化合物之醫藥學上可接受之加成鹽、醫藥學上可接受之酯、加成鹽之溶劑合物(例如水合物)、互變異構形式、多晶型物、對映異構體、對映異構體混合物、立體異構體或立體異構體混合物(純的或呈外消旋或非外消旋混合物形式)。
本文所描述之化合物可包含一或多個不對稱中心,且因此可以各種異構形式,例如對映異構體及/或非對映異構體存在。舉例而言,本文所描述之化合物可呈個別對映異構體、非對映異構體或幾何異構體之形式,或可呈立體異構體混合物,包括外消旋混合物及富集一或多種立體異構體之混合物之形式。可藉由包括手性高壓液相層析法(HPLC)及手性鹽形成及結晶之熟習此項技術者已知之方法自混合物中分離出異構體;或可藉由不對稱合成來製備較佳異構體。參見例如Jacques等人,Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981); Wilen等人,Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962);及Wilen, Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions第268頁(E.L. Eliel編, Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972)。本發明另外涵蓋呈實質上不含其他異構體之個別異構體形式及可替代地呈各種異構體之混合物形式的本文所描述之化合物。
在某些實施例中,該等化合物(例如可離子化脂質)及該等化合物為其組分之轉移媒劑(例如脂質奈米粒子)展現增強(例如提高)之轉染一或多種目標細胞之能力。因此,本文亦提供轉染一或多種目標細胞之方法。該等方法一般包含使一或多種目標細胞與本文所揭示之化合物及/或醫藥組合物接觸以使得一或多種目標細胞經囊封於其中之環狀RNA轉染的步驟。
應理解,本文所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的,且不意欲為限制性的。除非明確陳述或自上下文顯而易見,否則如本文所使用之術語「或(or)」應理解為包括性的。除非本文及本說明書剩餘部分之下文中定義,否則本文所使用之所有技術及科學術語皆具有與一般熟習本發明所涉及技術者通常所理解之含義相同的含義。
2. DNA模板、前驅體RNA及環狀RNA
根據本發明,本文所提供之DNA模板(例如包含3'增強型內含子元件、3'增強型外顯子元件、核心功能元件、5'增強型外顯子元件及5'增強型內含子元件)之轉錄引起能夠環化之前驅體線性RNA聚核苷酸形成。在一些實施例中,此DNA模板包含載體、PCR產物、質體、微型環DNA、黏質體、人工染色體、互補DNA (cDNA)、染色體外DNA (ecDNA)或其中之片段。在某些實施例中,微型環DNA可為線性化或非線性化的。在某些實施例中,質體可為線性化或非線性化的。在一些實施例中,DNA模板可為單股的。在其他實施例中,DNA模板可為雙股的。在一些實施例中,DNA模板包含完全或部分病毒、細菌或真核載體。
如本文所提供,本發明包含共有與在前驅體線性RNA聚核苷酸剪接之前的前驅體線性RNA聚核苷酸相同之序列的DNA模板(例如3'增強型內含子元件、3'增強型外顯子元件、核心功能元件及5'增強型外顯子元件、5'增強型內含子元件)。在一些實施例中,該線性前驅體RNA聚核苷酸經歷剪接,從而引起在環化過程期間移除3'增強型內含子元件及5'增強型內含子元件。在一些實施例中,所得環狀RNA聚核苷酸不具有3'增強型內含子片段及5'增強型內含子片段,但維持3'增強型外顯子片段、核心功能元件及5'增強型外顯子元件。
在一些實施例中,當在存在一或多種鳥苷核苷酸或核苷(例如GTP)及二價陽離子(例如Mg
2+)之情況下培育時,前驅體線性RNA聚核苷酸環化。在一些實施例中,3'增強型外顯子元件、5'增強型外顯子元件及/或核心功能元件完全或部分促進前驅體線性RNA聚核苷酸之環化以形成本文所提供之環狀RNA聚核苷酸。
在某些實施例中,本文所提供之環狀RNA係在細胞內部產生。在一些實施例中,在細胞質中藉由噬菌體RNA聚合酶或在核中藉由宿主RNA聚合酶II使用DNA模板(例如在一些實施例中使用本文所提供之載體)轉錄前驅體RNA且隨後環化。
在某些實施例中,將本文所提供之環狀RNA注射至動物(例如人類)中以使得由環狀RNA分子編碼之多肽在動物內部表現。
在一些實施例中,本文所提供之DNA (例如載體)、線性RNA (例如前驅體RNA)及/或環狀RNA聚核苷酸之長度在300與10000、400與9000、500與8000、600與7000、700與6000、800與5000、900與5000、1000與5000、1100與5000、1200與5000、1300與5000、1400與5000及/或1500與5000個核苷酸之間。在一些實施例中,聚核苷酸之長度為至少300 nt、400 nt、500 nt、600 nt、700 nt、800 nt、900 nt、1000 nt、1100 nt、1200 nt、1300 nt、1400 nt、1500 nt、2000 nt、2500 nt、3000 nt、3500 nt、4000 nt、4500 nt或5000 nt。在一些實施例中,聚核苷酸之長度不超過3000 nt、3500 nt、4000 nt、4500 nt、5000 nt、6000 nt、7000 nt、8000 nt、9000 nt或10000 nt。在一些實施例中,本文所提供之DNA、線性RNA及/或環狀RNA聚核苷酸之長度為約300 nt、400 nt、500 nt、600 nt、700 nt、800 nt、900 nt、1000 nt、1100 nt、1200 nt、1300 nt、1400 nt、1500 nt、2000 nt、2500 nt、3000 nt、3500 nt、4000 nt、4500 nt、5000 nt、6000 nt、7000 nt、8000 nt、9000 nt或10000 nt。
在一些實施例中,本文所提供之環狀RNA具有比包含相同表現序列之mRNA高之功能穩定性。在一些實施例中,本文所提供之環狀RNA具有比包含相同表現序列、5moU修飾、經最佳化UTR、帽及/或聚A尾之mRNA高之功能穩定性。
在一些實施例中,本文所提供之環狀RNA聚核苷酸具有功能性半衰期至少5小時、10小時、15小時、20小時、30小時、40小時、50小時、60小時、70小時或80小時。在一些實施例中,本文所提供之環狀RNA聚核苷酸具有功能性半衰期5-80小時、10-70小時、15-60小時及/或20-50小時。在一些實施例中,本文所提供之環狀RNA聚核苷酸之功能性半衰期比編碼相同蛋白質之等效線性RNA聚核苷酸之功能性半衰期長(例如長至少1.5倍、長至少2倍)。在一些實施例中,可經由功能蛋白合成偵測來評估功能性半衰期。
在一些實施例中,本文所提供之環狀RNA聚核苷酸之半衰期為至少5小時、10小時、15小時、20小時、30小時、40小時、50小時、60小時、70小時或80小時。在一些實施例中,本文所提供之環狀RNA聚核苷酸之半衰期為5-80小時、10-70小時、15-60小時及/或20-50小時。在一些實施例中,本文所提供之環狀RNA聚核苷酸之半衰期比編碼相同蛋白質之等效線性RNA聚核苷酸之半衰期長(例如長至少1.5倍、長至少2倍)。在一些實施例中,環狀RNA聚核苷酸或其醫藥組合物在人類細胞中具有長於或等於預定臨限值之功能性半衰期的功能性半衰期。在一些實施例中,藉由功能蛋白分析來測定功能性半衰期。舉例而言,在一些實施例中,藉由活體外螢光素酶分析來測定功能性半衰期,其中經1、2、3、4、5、6、7或14天每1、2、6、12或24小時量測表現環狀RNA聚核苷酸之人類細胞(例如HepG2)培養基中之高斯螢光素酶(GLuc)活性。在其他實施例中,藉由活體內分析來測定功能性半衰期,其中經1、2、3、4、5、6、7或14天每1、2、6、12或24小時量測患者血清或組織樣本中之由環狀RNA聚核苷酸之表現序列編碼之蛋白質的含量。在一些實施例中,預定臨限值為包含與環狀RNA聚核苷酸相同的表現序列之參考線性RNA聚核苷酸之功能性半衰期。
在一些實施例中,本文所提供之環狀RNA可具有比等效線性mRNA高之表現幅度,例如在向細胞投與RNA之後24小時具有比等效線性mRNA高之表現幅度。在一些實施例中,本文所提供之環狀RNA具有比包含相同表現序列、5moU修飾、經最佳化UTR、帽及/或聚A尾之mRNA高之表現幅度。
在一些實施例中,當暴露於生物體或某一類型之免疫細胞之免疫系統時,本文所提供之環狀RNA可具有比等效mRNA低之免疫原性。在一些實施例中,當暴露於生物體或某一類型之免疫細胞之免疫系統時,本文所提供之環狀RNA與細胞介素之調節型生產相關。舉例而言,在一些實施例中,與包含相同表現序列之mRNA相比,本文所提供之環狀RNA在暴露於生物體或某一類型之免疫細胞之免疫系統時與IFN-β1、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ及/或TNFα之生產減少相關。在一些實施例中,與包含相同表現序列之mRNA相比,本文所提供之環狀RNA在暴露於生物體或某一類型之免疫細胞之免疫系統時與較少IFN-β1、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ及/或TNFα轉錄物誘導相關。在一些實施例中,本文所提供之環狀RNA具有比包含相同表現序列之mRNA低之免疫原性。在一些實施例中,本文所提供之環狀RNA具有比包含相同表現序列、5moU修飾、經最佳化UTR、帽及/或聚A尾之mRNA低之免疫原性。
在某些實施例中,本文所提供之環狀RNA可按原樣轉染至細胞中,或可在細胞中以DNA載體形式轉染及轉錄。可經由新增聚合酶或由轉染至細胞中之核酸編碼之聚合酶或較佳地經由內源性聚合酶自經轉染DNA載體轉錄環狀RNA。
A.
增強型內含子元件及增強型外顯子元件
本文所提供之聚核苷酸可包含一或多個增強型內含子元件及/或一或多個增強型外顯子元件。在一些實施例中,增強型內含子元件及增強型外顯子元件可包含間隔子、雙螺旋體區、親和序列、內含子片段、外顯子片段及/或各種非轉譯元件。增強型內含子元件或增強型外顯子元件內之此等序列經排列以使環化或蛋白質表現最佳化。
a. 間隔子
在一些實施例中,所提供之聚核苷酸(例如DNA模板、前驅體RNA聚核苷酸或環狀RNA聚核苷酸)包含一或多個間隔子。在某些實施例中,聚核苷酸包含第一(5')間隔子及/或第二(3')間隔子。在一些實施例中,聚核苷酸(例如DNA模板或前驅體線性RNA聚核苷酸)包含增強型內含子元件中之一或多個間隔子。在一些實施例中,聚核苷酸(例如DNA模板、前驅體線性RNA聚核苷酸或環狀RNA聚核苷酸)包含增強型外顯子元件中之一或多個間隔子。在某些實施例中,聚核苷酸包含3'增強型內含子片段中之間隔子及5'增強型內含子片段中之間隔子。在某些實施例中,聚核苷酸包含3'增強型外顯子片段中之間隔子及5'增強型外顯子片段中之另一間隔子以輔助環化或蛋白質表現,此係因為在總序列中產生對稱性。
在一些實施例中,包括3'第I組內含子片段與核心功能元件之間的間隔子可在彼等區域中保存二級結構,此係藉由防止其相互作用來進行,因此提高了剪接效率。在一些實施例中,第一間隔子(在3'第I組內含子片段與核心功能元件之間)及第二間隔子(在兩個表現序列與核心功能元件之間)包含額外鹼基配對區,該等鹼基配對區經預測與彼此鹼基配對且不與第一雙螺旋體區及第二雙螺旋體區鹼基配對。在其他實施例中,第一間隔子(在3'第I組內含子片段與核心功能元件之間)及第二間隔子(在核心功能元件中之一者與5'第I組內含子片段之間)包含額外鹼基配對區,該等鹼基配對區經預測與彼此鹼基配對且不與第一雙螺旋體區及第二雙螺旋體區鹼基配對。在一些實施例中,該間隔子鹼基配對使第I組內含子片段彼此極為貼近,從而進一步提高剪接效率。另外,在一些實施例中,第一雙螺旋體區與第二雙螺旋體區之間的鹼基配對組合及第一間隔子與第二間隔子之間的單獨鹼基配對促進形成含有藉由鹼基配對之鄰接區域側接之第I組內含子片段的剪接氣泡。典型間隔子為具有以下品質中之一或多者之相鄰序列:1)經預測避免干擾例如IRES、表現序列、適體或內含子之近端結構;2)長度為至少7 nt且不長於100 nt;3)位於3'內含子片段之後且與其鄰接及/或位於5'內含子片段之前且與其鄰接;及4)含有以下中之一或多者:a)長度為至少5 nt之非結構化區、b)長度為至少5 nt之與包括另一間隔子之遠端序列的鹼基配對區及c)長度為至少7 nt之範疇限於間隔子之序列的結構化區。間隔子可具有若干區域,包括非結構化區、鹼基配對區、髮夾/結構化區及其組合。在一實施例中,間隔子具有GC含量高之結構化區。在一實施例中,間隔子內之區域與同一間隔子內之另一區域鹼基配對。在一實施例中,間隔子內之區域與另一間隔子內之區域鹼基配對。在一實施例中,間隔子包含一或多個髮夾結構。在一實施例中,間隔子包含一或多個具有4至12個核苷酸之主幹及2至10個核苷酸之環圈的髮夾結構。在一實施例中,存在3'第I組內含子片段與核心功能元件之間的額外間隔子。在一實施例中,此額外間隔子防止IRES之結構化區或TIE之適體干擾3'第I組內含子片段之摺疊,或降低此情況出現之程度。在一些實施例中,5'間隔子序列之長度為至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30個核苷酸。在一些實施例中,5'間隔子序列之長度不超過100、90、80、70、60、50、45、40、35或30個核苷酸。在一些實施例中,5'間隔子序列之長度在5與50、10與50、20與50、20與40及/或25與35個核苷酸之間。在某些實施例中,5'間隔子序列之長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。在一個實施例中,5'間隔子序列為聚A序列。在另一實施例中,5'間隔子序列為聚AC序列。在一個實施例中,間隔子包含約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100% 聚AC含量。在一個實施例中,間隔子包含約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%聚嘧啶(C/T或C/U)含量。
b. 雙螺旋體區
在一些實施例中,所提供之聚核苷酸(例如本文所提供之DNA模板、前驅體線性RNA聚核苷酸或環狀RNA聚核苷酸)包含一或多個雙螺旋體區。在一些實施例中,聚核苷酸包含第一(5')雙螺旋體區及第二(3')雙螺旋體區。在某些實施例中,聚核苷酸包含位於3'增強型內含子片段內之5'外部雙螺旋體區及位於5'增強型內含子片段內之3'外部雙螺旋體區。在一些實施例中,聚核苷酸包含位於3'增強型外顯子片段內之5'內部雙螺旋體區及位於5'增強型外顯子片段內之3'內部雙螺旋體區。在一些實施例中,聚核苷酸包含5'外部雙螺旋體區、5'內部雙螺旋體區、3'內部雙螺旋體區及3'外部雙螺旋體區。
在某些實施例中,第一雙螺旋體區及第二雙螺旋體區可形成完美或不完美的雙螺旋體。因此,在某些實施例中,第一雙螺旋體區及第二雙螺旋體區之至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%可與彼此鹼基配對。在一些實施例中,預測雙螺旋體區與RNA中之非預期序列(例如非雙螺旋體區序列)具有小於50% (例如小於45%、小於40%、小於35%、小於30%、小於25%)之鹼基配對。在一些實施例中,包括於前驅體RNA股之末端上且與第I組內含子片段鄰接或非常接近之該等雙螺旋體區使第I組內含子片段彼此極為接近,從而提高了剪接效率。在一些實施例中,雙螺旋體區之長度為3至100個核苷酸(例如長度為3-75個核苷酸、長度為3-50個核苷酸、長度為20-50個核苷酸、長度為35-50個核苷酸、長度為5-25個核苷酸、長度為9-19個核苷酸)。在一些實施例中,雙螺旋體區之長度為約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。在一些實施例中,雙螺旋體區之長度為約9至約50個核苷酸。在一個實施例中,雙螺旋體區之長度為約9至約19個核苷酸。在一些實施例中,雙螺旋體區之長度為約20至約40個核苷酸。在某些實施例中,雙螺旋體區之長度為約30個核苷酸。
在其他實施例中,聚核苷酸不包含任何雙螺旋體區來使轉譯或環化最佳化。
c. 親和序列
如本文所提供,所提供之聚核苷酸(例如DNA模板、前驅體線性RNA聚核苷酸或環狀RNA聚核苷酸)可包含親和序列(或親和標籤)。在一些實施例中,親和標籤位於3'增強型內含子元件中。在一些實施例中,親和標籤位於5'增強型內含子元件中。在一些實施例中,兩個(3'及5')增強型內含子元件各自包含親和標籤。在一個實施例中,3'增強型內含子元件之親和標籤為5'增強型內含子元件中作為親和標籤之長度。在一些實施例中,3'增強型內含子元件之親和標籤為與5'增強型內含子元件中之親和標籤相同之序列。在一些實施例中,置放親和序列以使oligo-dT純化最佳化。
在一些實施例中,存在於前驅體線性RNA聚核苷酸中之一或多個親和標籤在環化後移除。參見例如
圖 97A及
圖 97B。在一些實施例中,在執行RNA環化之後將親和標籤添加至殘餘線性RNA中。在一些此等實施例中,將親和標籤以酶添加至線性RNA中。一或多個親和標籤存在於線性RNA中且其不存在於環狀RNA中可便於進行環狀RNA純化。在一些實施例中,使用負向選擇或親和純化方法執行該純化。在一些實施例中,使用優先或特異性結合至親和標籤之結合劑執行該純化。
在一些實施例中,親和標籤包含聚A序列。在一些實施例中,聚A序列之長度為至少15、30或60個核苷酸。在一些實施例中,包含聚A序列之親和標籤存在於前驅體線性RNA中之兩個位置。在一些實施例中,一或兩個聚A序列之長度為15-50個核苷酸。在一些實施例中,一或兩個聚A序列之長度為20-25個核苷酸。在一些實施例中,(多個) 聚A序列在環化後移除。因此,諸如與固體表面(例如樹脂)結合之去氧胸苷寡核苷酸(oligo(dT))的與聚A序列雜交之寡核苷酸可用於將環狀RNA與其前驅體RNA分離。
在一些實施例中,親和標籤包含不存在於環狀RNA產物中之序列。在一些此等實施例中,不存在於環狀RNA產物中之序列為專用結合位點(DBS)。在一些實施例中,DBS為非結構化序列,亦即不形成諸如髮夾環、相鄰dsRNA區或三螺旋體之限定結構元件的序列。在一些實施例中,DBS序列形成無規螺旋(random coil)。在一些實施例中,DBS包含至少25% GC含量、至少50% GC含量、至少75% GC含量或至少100% GC含量。在一些實施例中,DBS包含至少25% AC含量、至少50% AC含量、至少75% AC含量或100% AC含量。在一些實施例中,DBS之長度為至少15、30或60個核苷酸。在一些實施例中,包含DBS之親和標籤存在於前驅體線性RNA中之兩個位置。在一些實施例中,DBS序列之長度各自獨立地為15-50個核苷酸。在一些實施例中,DBS序列之長度各自獨立地為20-25個核苷酸。
在一些實施例中,(多個) DBS序列在環化後移除。因此,可使用包含寡核苷酸之結合劑以便於進行環狀RNA純化,該等寡核苷酸包含與DBS互補之序列。舉例而言,結合劑可包含與結合至固體表面(例如樹脂)之DBS互補之寡核苷酸。
在一些實施例中,藉由連接將親和序列或諸如生物素之其他類型之親和柄(affinity handle)添加至線性RNA中。在一些實施例中,使包含寡核苷酸之親和序列與線性RNA連接。在一些實施例中,使結合至親和柄之寡核苷酸與線性RNA連接。在一些實施例中,使包含與親和序列或親和柄連接之線性RNA及不包含親和序列或親和柄之環狀RNA的溶液與包含結合至與親和序列互補之寡核苷酸或結合至親和柄之結合搭配物的固體載體的結合劑接觸,以使得線性RNA結合至結合劑,且自固體載體溶離或分離環狀RNA。
用於本文所描述之環狀RNA之任何純化方法可包含一或多個緩衝液交換步驟。在一些實施例中,在活體外轉錄(IVT)之後且在額外純化步驟之前執行緩衝液交換。在一些此等實施例中,對IVT反應溶液進行緩衝液交換成包含Tris之緩衝液。在一些實施例中,對IVT反應溶液進行緩衝液交換成包含大於1 mM或大於10 mM一或多種諸如NaCl或KCl之單價鹽且視情況包含EDTA之緩衝液。在一些實施例中,在環狀RNA純化完成之後執行緩衝液交換。在一些實施例中,在IVT之後且在環狀RNA純化之後執行緩衝液交換。在一些實施例中,在環狀RNA純化之後執行之緩衝液交換包含將環狀RNA交換成水或儲存緩衝液。在一些實施例中,儲存緩衝液包含1 mM pH 6.5檸檬酸鈉。
在某些實施例中,3'增強型內含子元件包含前導非轉譯序列。在一些實施例中,前導非轉譯序列為3'增強型內含子片段之5'端。在一些實施例中,前導非轉譯序列包含轉錄起始位點(TSS)之最後一個核苷酸。在一些實施例中,TSS選自病毒、細菌或真核DNA模板。在一個實施例中,前導非轉譯序列包含TSS之最後一個核苷酸、及0至100個額外核苷酸。在一些實施例中,TSS為末端間隔子。在一個實施例中,在RNA T7聚合酶轉譯後,前導非轉譯序列含有5'端之鳥苷。
在某些實施例中,5'增強型內含子元件包含尾隨非轉譯序列。在一些實施例中,5'尾隨非轉譯序列位於5'增強型內含子元件之3'端。在一些實施例中,尾隨非轉譯序列為部分限制消化序列。在一個實施例中,尾隨非轉譯序列完全或部分為用於使DNA模板線性化之限制消化位點。在一些實施例中,限制消化位點完全或部分來自天然病毒、細菌或真核DNA模板。在一些實施例中,尾隨非轉譯序列為末端限制位點片段。
d. 增強型內含子片段
在一些實施例中,3'增強型內含子元件及5'增強型內含子元件各自包含內含子片段。在某些實施例中,3'內含子片段為與包括3'剪接位點二核苷酸之天然第I組內含子之3'近端片段至少75%同源(例如至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源)的相鄰序列。通常,5'內含子片段為與包括5'剪接位點二核苷酸之天然第I組內含子之5'近端片段至少75%同源(例如至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源)的相鄰序列。在一些實施例中,3'內含子片段包括3'第I組剪接位點二核苷酸之第一核苷酸。在一些實施例中,5'內含子片段包括5'第I組剪接位點二核苷酸之第一核苷酸。在其他實施例中,3'內含子片段包括3'第I組內含子片段剪接位點二核苷酸之第一核苷酸及第二核苷酸;且5'內含子片段包括3'第I組內含子片段二核苷酸之第一核苷酸及第二核苷酸。
e. 增強型外顯子片段
在某些實施例中,所提供之聚核苷酸(例如DNA模板、線性前驅體RNA聚核苷酸或環狀RNA聚核苷酸)包含增強型外顯子片段。在一些實施例中,遵循5'至3'次序,3'增強型外顯子元件位於核心功能元件之上游。在一些實施例中,遵循5'至3'次序,5'增強型內含子元件位於核心功能元件之下游。
根據本發明,3'增強型外顯子元件及5'增強型外顯子元件各自包含外顯子片段。在一些實施例中,3'增強型外顯子元件包含3'外顯子片段。在一些實施例中,5'增強型外顯子元件包含5'外顯子片段。在某些實施例中,如本文所提供,3'外顯子片段及5'外顯子片段各自包含第I組內含子片段及外顯子序列之1至100個核苷酸。在某些實施例中,3'內含子片段為與包括3'剪接位點二核苷酸之天然第I組內含子之3'近端片段至少75%同源(例如至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源)的相鄰序列。通常,5'第I組內含子片段為與包括5'剪接位點二核苷酸之天然第I組內含子之5'近端片段至少75%同源(例如至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源)的相鄰序列。在一些實施例中,3'外顯子片段包含3'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第二核苷酸及外顯子序列之1至100個核苷酸。在一些實施例中,5'外顯子片段包含5'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第一核苷酸及外顯子序列之1至100個核苷酸。在一些實施例中,外顯子序列包含部分或完全天然存在之外顯子序列,該天然存在之外顯子序列來自病毒、細菌或真核DNA載體。在其他實施例中,外顯子序列進一步包含合成、經基因修飾(例如含有經修飾核苷酸)或其他經工程改造之外顯子序列。
在一個實施例中,在3'內含子片段包含3'第I組剪接位點二核苷酸之兩個核苷酸且5'內含子片段包含5'第I組剪接位點二核苷酸之兩個核苷酸的情況下,位於5'增強型外顯子元件及3'增強型外顯子元件內之外顯子片段不包含第I組剪接位點二核苷酸。
f. 增強型內含子元件及增強型外顯子元件之例示性排列
舉例而言且不意欲為限制性的,在一些實施例中,3'增強型內含子元件按以下5'至3'次序包含:前導非轉譯序列、5'親和標籤、視情況5'外部雙螺旋體區、5'外部間隔子及3'內含子片段。在相同實施例中,3'增強型外顯子元件按以下5'至3'次序包含:3'外顯子片段、視情況5'內部雙螺旋體區、視情況5'內部雙螺旋體區及5'內部間隔子。在相同實施例中,5'增強型外顯子元件按以下5'至3'次序包含:3'內部間隔子、視情況3'內部雙螺旋體區及5'外顯子片段。在再相同實施例中,3'增強型內含子元件按以下5'至3'次序包含:5'內含子片段、3'外部間隔子、視情況3'外部雙螺旋體區、3'親和標籤及尾隨非轉譯序列。
B.
核心功能元件
在一些實施例中,所提供之聚核苷酸(例如DNA模板、線性前驅體RNA聚核苷酸或環狀RNA聚核苷酸)包含核心功能元件。在一些實施例中,核心功能元件包含編碼元件或非編碼元件。在某些實施例中,核心功能元件可含有編碼元件及非編碼元件。在一些實施例中,核心功能元件進一步包含在編碼元件或非編碼元件上游之轉譯起始元件(TIE)。在一些實施例中,核心功能元件包含終止元件。在一些實施例中,終止元件位於TIE及編碼元件下游。在一些實施例中,終止元件位於編碼元件下游,但位於TIE上游。在某些實施例中,在編碼元件包含非編碼區之情況下,核心功能元件不具有TIE及/或終止元件。
a. 編碼元件或非編碼元件
在一些實施例中,本文所提供之聚核苷酸包含編碼元件或非編碼元件或兩者之組合。在一些實施例中,編碼元件包含表現序列。在一些實施例中,編碼元件編碼至少一種治療性蛋白。
在一些實施例中,所提供之環狀RNA編碼兩種或更多種多肽。在一些實施例中,環狀RNA為雙順反子RNA。編碼兩種或更多種多肽之序列可藉由核糖體跳躍元件或編碼蛋白酶裂解位點之核苷酸序列間隔開。在某些實施例中,核糖體跳躍元件編碼明脈扁刺蛾(thosea-asigna)病毒2A肽(T2A)、豬捷申病毒(porcine teschovirus)-1 2A肽(P2A)、口蹄疫病毒2A肽(F2A)、馬鼻炎A病毒2A肽(E2A)、細胞質多角體病毒2A肽(BmCPV 2A)或家蠶軟化病病毒(flacherie vims of B. mori) 2A肽(BmIFV 2A)。
b. 轉譯起始元件(TIE)
如本文所提供,在一些實施例中,核心功能元件包含至少一個轉譯起始元件(TIE)。TIE經設計以允許經編碼蛋白之轉譯效率。因此,僅包含非編碼元件之最佳核心功能元件不具有任何TIE。在一些實施例中,包含一或多個編碼元件之核心功能元件將進一步包含一或多個TIE。
在一些實施例中,TIE包含非轉譯區(UTR)。在某些實施例中,本文所提供之TIE包含內部核糖體進入位點(IRES)。包括IRES准許自環狀RNA轉譯一或多個開放閱讀框架(例如形成表現序列之開放閱讀框架)。IRES元件吸引真核核糖體轉譯起始複合物且促進轉譯起始。參見例如Kaufman等人, Nuc. Acids Res. (1991) 19:4485-4490;Gurtu等人, Biochem. Biophys. Res. Comm. (1996) 229:295-298;Rees等人, BioTechniques (1996) 20: 102-110;Kobayashi等人, BioTechniques (1996) 21 :399-402;及Mosser等人, BioTechniques 1997 22 150-161。
i. 天然TIE:病毒及真核/細胞內部核糖體進入位點(IRES)
多個IRES序列可用且包括衍生自廣泛多種病毒之序列,諸如:小核糖核酸病毒,諸如腦心肌炎病毒(EMCV) UTR之前導序列(Jang等人, J. Virol. (1989) 63: 1651-1660)、脊髓灰質炎前導序列、A型肝炎病毒前導序列、C型肝炎病毒IRES、人類鼻病毒2型IRES (Dobrikova等人, Proc. Natl. Acad. Sci. (2003) 100(25): 15125- 15130)、來自口蹄疫病毒之IRES元件(Ramesh等人, Nucl. Acid Res. (1996) 24:2697-2700)、梨形鞭毛蟲病毒IRES (Garlapati等人, J. Biol. Chem. (2004) 279(5):3389-3397)及其類似。
不同IRES序列具有不同的驅動蛋白質表現之能力,且任何特定經鑑別或預測之IRES序列驅動自線性mRNA或環狀RNA構築體進行之蛋白質表現的能力未知且不可預測。在某些實施例中,可基於病毒序列中之序列位置在生物資訊學上鑑別潛在IRES序列。然而,該等序列之活性先前未經表徵。如本文中所證實,該等IRES序列可視細胞類型而定,例如在T細胞、肝細胞或肌肉細胞中具有不同的蛋白質表現能力。在一些實施例中,本文所描述之新穎IRES序列可在特定細胞類型中具有與先前所描述之EMCV IRES序列相比增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或100倍之表現。
在一些實施例中,為了驅動蛋白質表現,所提供之環狀RNA包含可操作地連接至蛋白質編碼序列之IRES。在一些實施例中,IRES包含選自SEQ ID NO: 1-2983及3282-3287之序列或其片段。在一些實施例中,IRES包含與選自SEQ ID NO: 1-2983及3282-3287之序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列。在一些實施例中,本文所揭示之環狀RNA包含與選自SEQ ID NO: 1-2983及3282-3287之序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之IRES序列。在一些實施例中,本文所揭示之環狀RNA包含選自SEQ ID NO: 1-2983及3282-3287之IRES序列或其片段。本文揭示用於例如藉由將IRES之5'端及/或3'端截短,向IRES添加間隔子5',將6個核苷酸5'修飾至轉譯起始位點(Kozak序列),修飾替代性轉譯起始位點且產生嵌合/雜交IRES序列來提高或降低IRES活性的對IRES及輔助序列之修飾。在一些實施例中,本文所揭示之環狀RNA中之IRES序列相對於原生IRES包含此等修飾中之一或多者(例如SEQ ID NO: 1-2983及3282-3287)。
在一些實施例中,IRES為阿里病毒(Aalivirus)、埃魯里病毒(Ailurivirus)、安匹病毒(Ampivirus)、安那提病毒(Anativirus)、口瘡病毒(Aphthovirus)、艾誇瑪病毒(Aquamavirus)、禽肝病毒(Avihepatovirus)、阿維斯病毒(Avisivirus)、布斯匹病毒(Boosepivirus)、博匹病毒(Bopivirus)、卡斯利病毒(Caecilivirus)、心病毒(Cardiovirus)、科薩病毒(Cosavirus)、克拉赫利病毒(Crahelivirus)、克羅希病毒(Crohivirus)、丹尼匹病毒(Danipivirus)、地西匹病毒(Dicipivirus)、迪雷薩匹病毒(Diresapivirus)、腸病毒、馬鼻病毒、菲利匹病毒(Felipivirus)、菲匹病毒(Fipivirus)、加利病毒(Gallivirus)、格魯赫利病毒(Gruhelivirus)、格魯索匹病毒(Grusopivirus)、哈卡病毒(Harkavirus)、海密匹病毒(Hemipivirus)、肝病毒、亨尼病毒(Hunnivirus)、脊病毒、昆薩吉病毒(Kunsagivirus)、林尼匹病毒(Limnipivirus)、利夫匹病毒(Livupivirus)、盧多匹病毒(Ludopivirus)、馬拉加西病毒(Malagasivirus)、馬蘇匹病毒(Marsupivirus)、美格瑞病毒(Megrivirus)、密斯齊病毒(Mischivirus)、莫薩病毒(Mosavirus)、木匹病毒(Mupivirus)、密羅匹病毒(Myrropivirus)、奧利病毒(Orivirus)、奧西病毒(Oscivirus)、帕拉博病毒、副腸孤病毒、帕西病毒(Pasivirus)、帕塞里病毒(Passerivirus)、佩馬匹病毒(Pemapivirus)、珀西病毒(Poecivirus)、波塔米匹病毒(Potamipivirus)、派勾賽匹病毒(Pygoscepivirus)、拉博病毒(Rabovirus)、拉菲病毒(Rafivirus)、拉吉達匹病毒(Rajidapivirus)、羅赫利病毒(Rohelivirus)、羅沙病毒(Rosavirus)、沙科布病毒(Sakobuvirus)、薩利病毒(Salivirus)、薩佩洛病毒(Sapelovirus)、塞尼卡病毒(Senecavirus)、山巴病毒(Shanbavirus)、斯西尼病毒(Sicinivirus)、西馬匹病毒(Symapivirus)、捷申病毒、托爾奇病毒(Torchivirus)、鳥取病毒(Tottorivirus)、震顫病毒(Tremovirus)、特羅匹病毒(Tropivirus)、C型肝炎病毒、佩吉病毒(Pegivirus)、瘟疫病毒(Pestivirus)、黃病毒(Flavivirus) IRES。
在一些實施例中,IRES為以下之IRES序列:陶拉症候群(Taura syndrome)病毒、錐鼻蟲(Triatoma)病毒、蒂勒氏腦脊髓炎(Theiler's encephalomyelitis)病毒、猴病毒40、入侵紅火蟻(Solenopsis invicta)病毒1、稻麥蚜(Rhopalosiphum padi)病毒、網狀內皮細胞增生病病毒、人類脊髓灰白質炎病毒1、斯氏珀蝽(Plautia stali)腸病毒、克什米爾蜂(Kashmir bee)病毒、人類鼻病毒2、玻璃葉蟬(Homalodisca coagulata)病毒-1、1型人類免疫缺乏病毒、虱P病毒、C型肝炎病毒、A型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人類腸病毒71、馬類鼻炎病毒、茶尺蠖(Ectropis obliqua)小核糖核酸樣病毒、腦心肌炎病毒、果蠅C病毒、人類柯薩奇病毒(coxsackievirus) B3、十字花科菸草花葉病毒(Crucifer tobamovirus)、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹瀉病毒1、黑蜂王台病毒(Black Queen Cell Virus)、蚜蟲致死性麻痹病毒、禽類腦脊髓炎病毒、急性蜂麻痹病毒、木槿黃化輪斑病毒(Hibiscus chlorotic ringspot virus)、典型豬瘟病毒、人類FGF2、人類SFTPA1、人類AML1/RUNX1、果蠅觸角足(Drosophila antennapedia)、人類AQP4、人類AT1R、人類BAG-1、人類BCL2、人類BiP、人類c-IAPl、人類c-myc、人類eIF4G、小鼠NDST4L、人類LEF1、小鼠HIF1 α、人類n.myc、小鼠Gtx、人類p27kipl、人類PDGF2/c-sis、人類p53、人類Pim-1、小鼠Rbm3、果蠅reaper、犬類Scamper、果蠅Ubx、人類UNR、小鼠UtrA、人類VEGF-A、人類XIAP、無毛果蠅(Drosophila hairless)、釀酒酵母TFIID、釀酒酵母YAP1、菸草蝕刻病毒、蕪菁皺縮病毒(turnip crinkle virus)、EMCV-A、EMCV-B、EMCV-Bf、EMCV-Cf、EMCV pEC9、小雙節RNA病毒(Picobirnavirus)、HCV QC64、人類科薩病毒E/D、人類科薩病毒F、人類科薩病毒JMY、鼻病毒NAT001、HRV14、HRV89、HRVC-02、HRV-A21、薩利病毒A SH1、薩利病毒FHB、薩利病毒NG-J1、人類副腸孤病毒1、克羅希病毒B、Yc-3、羅沙病毒M-7、山巴病毒A、帕西病毒A、帕西病毒A 2、埃可病毒(Echovirus) E14、人類副腸孤病毒5、愛知病毒(Aichi Virus)、A型肝炎病毒HA16、霍匹病毒(Phopivirus)、CVA10、腸病毒C、腸病毒D、腸病毒J、人類佩吉病毒2、GBV-C GT110、GBV-C K1737、GBV-C Iowa、佩吉病毒A 1220、帕西病毒A 3、薩佩洛病毒(Sapelovirus)、羅沙病毒B、巴昆沙病毒(Bakunsa Virus)、震顫病毒A、豬帕西病毒1、PLV-CHN、帕西病毒A、斯西尼病毒、C型肝炎病毒K、C型肝炎病毒A、BVDV1、邊界病(Border Disease)病毒、BVDV2、CSFV-PK15C、SF573雙順反子病毒、湖北小核糖核酸樣病毒、CRPV、薩利病毒A BN5、薩利病毒A BN2、薩利病毒A 02394、薩利病毒A GUT、薩利病毒A CH、薩利病毒A SZ1、薩利病毒FHB、CVB3、CVB1、埃可病毒7、CVB5、EVA71、CVA3、CVA12、EV24、或eIF4G適體。
在一些實施例中,IRES包含完全或部分真核或細胞IRES。在某些實施例中,IRES來自人類基因,其中人類基因為ABCF1、ABCG1、ACAD10、ACOT7、ACSS3、ACTG2、ADCYAP1、ADK、AGTR1、AHCYL2、AHI1、AKAP8L、AKR1A1、ALDH3A1、ALDOA、ALG13、AMMECR1L、ANGPTL4、ANK3、AOC3、AP4B1、AP4E1、APAF1、APBB1、APC、APH1A、APOBEC3D、APOM、APP、AQP4、ARHGAP36、ARL13B、ARMC8、ARMCX6、ARPC1A、ARPC2、ARRDC3、ASAP1、ASB3、ASB5、ASCL1、ASMTL、ATF2、ATF3、ATG4A、ATP5B、ATP6V0A1、ATXN3、AURKA、AURKA、AURKA、AURKA、B3GALNT1、B3GNTL1、B4GALT3、BAAT、BAG1、BAIAP2、BAIAP2L2、BAZ2A、BBX、BCAR1、BCL2、BCS1L、BET1、BID、BIRC2、BPGM、BPIFA2、BRINP2、BSG、BTN3A2、C12orf43、C14orf93、C17orf62、C1orf226、C21orf62、C2orf15、C4BPB、C4orf22、C9orf84、CACNA1A、CALCOCO2、CAPN11、CASP12、CASP8AP2、CAV1、CBX5、CCDC120、CCDC17、CCDC186、CCDC51、CCN1、CCND1、CCNT1、CD2BP2、CD9、CDC25C、CDC42、CDC7、CDCA7L、CDIP1、CDK1、CDK11A、CDKN1B、CEACAM7、CEP295NL、CFLAR、CHCHD7、CHIA、CHIC1、CHMP2A、CHRNA2、CLCN3、CLEC12A、CLEC7A、CLECL1、CLRN1、CMSS1、CNIH1、CNR1、CNTN5、COG4、COMMD1、COMMD5、CPEB1、CPS1、CRACR2B、CRBN、CREM、CRYBG1、CSDE1、CSF2RA、CSNK2A1、CSTF3、CTCFL、CTH、CTNNA3、CTNNB1、CTNNB1、CTNND1、CTSL、CUTA、CXCR5、CYB5R3、CYP24A1、CYP3A5、DAG1、DAP3、DAP5、DAXX、DCAF4、DCAF7、DCLRE1A、DCP1A、DCTN1、DCTN2、DDX19B、DDX46、DEFB123、DGKA、DGKD、DHRS4、DHX15、DIO3、DLG1、DLL4、DMD UTR、DMD ex5、DMKN、DNAH6、DNAL4、DUSP13、DUSP19、DYNC1I2、DYNLRB2、DYRK1A、ECI2、ECT2、EIF1AD、EIF2B4、EIF4G1、EIF4G2、EIF4G3、ELANE、ELOVL6、ELP5、EMCN、ENO1、EPB41、ERMN、ERVV-1、ESRRG、ETFB、ETFBKMT、ETV1、ETV4、EXD1、EXT1、EZH2、FAM111B、FAM157A、FAM213A、FBXO25、FBXO9、FBXW7、FCMR、FGF1、FGF1、FGF1A、FGF2、FGF2、FGF-9、FHL5、FMR1、FN1、FOXP1、FTH1、FUBP1、G3BP1、GABBR1、GALC、GART、GAS7、胃泌素、GATA1、GATA4、GFM2、GHR、GJB2、GLI1、GLRA2、GMNN、GPAT3、GPATCH3、GPR137、GPR34、GPR55、GPR89A、GPRASP1、GRAP2、GSDMB、GSTO2、GTF2B、GTF2H4、GUCY1B2、HAX1、HCST、HIGD1A、HIGD1B、HIPK1、HIST1H1C、HIST1H3H、HK1、HLA-DRB4、HMBS、HMGA1、HNRNPC、HOPX、HOXA2、HOXA3、HPCAL1、HR、HSP90AB1、HSPA1A、HSPA4L、HSPA5、HYPK、IFFO1、IFT74、IFT81、IGF1、IGF1R、IGF1R、IGF2、IL11、IL17RE、IL1RL1、IL1RN、IL32、IL6、ILF2、ILVBL、INSR、INTS13、IP6K1、ITGA4、ITGAE、KCNE4、KERA、KIAA0355、KIAA0895L、KIAA1324、KIAA1522、KIAA1683、KIF2C、KIZ、KLHL31、KLK7、KRR1、KRT14、KRT17、KRT33A、KRT6A、KRTAP10-2、KRTAP13-3、KRTAP13-4、KRTAP5-11、KRTCAP2、LACRT、LAMB1、LAMB3、LANCL1、LBX2、LCAT、LDHA、LDHAL6A、LEF1、LINC-PINT、LMO3、LRRC4C、LRRC7、LRTOMT、LSM5、LTB4R、LYRM1、LYRM2、MAGEA11、MAGEA8、MAGEB1、MAGEB16、MAGEB3、MAPT、MARS、MC1R、MCCC1、METTL12、METTL7A、MGC16025、MGC16025、MIA2、MIA2、MITF、MKLN1、MNT、MORF4L2、MPD6、MRFAP1、MRPL21、MRPS12、MSI2、MSLN、MSN、MT2A、MTFR1L、MTMR2、MTRR、MTUS1、MYB、MYC、MYCL、MYCN、MYL10、MYL3、MYLK、MYO1A、MYT2、MZB1、NAP1L1、NAV1、NBAS、NCF2、NDRG1、NDST2、NDUFA7、NDUFB11、NDUFC1、NDUFS1、NEDD4L、NFAT5、NFE2L2、NFE2L2、NFIA、NHEJ1、NHP2、NIT1、NKRF、NME1-NME2、NPAT、NR3C1、NRBF2、NRF1、NTRK2、NUDCD1、NXF2、NXT2、ODC1、ODF2、OPTN、OR10R2、OR11L1、OR2M2、OR2M3、OR2M5、OR2T10、OR4C15、OR4F17、OR4F5、OR5H1、OR5K1、OR6C3、OR6C75、OR6N1、OR7G2、p53、P2RY4、PAN2、PAQR6、PARP4、PARP9、PC、PCBP4、PCDHGC3、PCLAF、PDGFB、PDZRN4、PELO、PEMT、PEX2、PFKM、PGBD4、PGLYRP3、PHLDA2、PHTF1、PI4KB、PIGC、PIM1、PKD2L1、PKM、PLCB4、PLD3、PLEKHA1、PLEKHB1、PLS3、PML、PNMA5、PNN、POC1A、POC1B、POLD2、POLD4、POU5F1、PPIG、PQBP1、PRAME、PRPF4、PRR11、PRRT1、PRSS8、PSMA2、PSMA3、PSMA4、PSMD11、PSMD4、PSMD6、PSME3、PSMG3、PTBP3、PTCH1、PTHLH、PTPRD、PUS7L、PVRIG、QPRT、RAB27A、RAB7B、RABGGTB、RAET1E、RALGDS、RALYL、RARB、RCVRN、REG3G、RFC5、RGL4、RGS19、RGS3、RHD、RINL、RIPOR2、RITA1、RMDN2、RNASE1、RNASE4、RNF4、RPA2、RPL17、RPL21、RPL26L1、RPL28、RPL29、RPL41、RPL9、RPS11、RPS13、RPS14、RRBP1、RSU1、RTP2、RUNX1、RUNX1T1、RUNX1T1、RUNX2、RUSC1、RXRG、S100A13、S100A4、SAT1、SCHIP1、SCMH1、SEC14L1、SEMA4A、SERPINA1、SERPINB4、SERTAD3、SFTPD、SH3D19、SHC1、SHMT1、SHPRH、SIM1、SIRT5、SLC11A2、SLC12A4、SLC16A1、SLC25A3、SLC26A9、SLC5A11、SLC6A12、SLC6A19、SLC7A1、SLFN11、SLIRP、SMAD5、SMARCAD1、SMN1、SNCA、SNRNP200、SNRPB2、SNX12、SOD1、SOX13、SOX5、SP8、SPARCL1、SPATA12、SPATA31C2、SPN、SPOP、SQSTM1、SRBD1、SRC、SREBF1、SRPK2、SSB、SSB、SSBP1、ST3GAL6、STAB1、STAMBP、STAU1、STAU1、STAU1、STAU1、STAU1、STK16、STK24、STK38、STMN1、STX7、SULT2B1、SYK、SYNPR、TAF1C、TAGLN、TANK、TAS2R40、TBC1D15、TBXAS1、TCF4、TDGF1、TDP2、TDRD3、TDRD5、TESK2、THAP6、THBD、THTPA、TIAM2、TKFC、TKTL1、TLR10、TM9SF2、TMC6、TMCO2、TMED10、TMEM116、TMEM126A、TMEM159、TMEM208、TMEM230、TMEM67、TMPRSS13、TMUB2、TNFSF4、TNIP3、TP53、TP53、TP73、TRAF1、TRAK1、TRIM31、TRIM6、TRMT1、TRMT2B、TRPM7、TRPM8、TSPEAR、TTC39B、TTLL11、TUBB6、TXLNB、TXNIP、TXNL1、TXNRD1、TYROBP、U2AF1、UBA1、UBE2D3、UBE2I、UBE2L3、UBE2V1、UBE2V2、UMPS、UNG、UPP2、USMG5、USP18、UTP14A、UTRN、UTS2、VDR、VEGFA、VEGFA、VEPH1、VIPAS39、VPS29、VSIG10L、WDHD1、WDR12、WDR4、WDR45、WDYHV1、WRAP53、XIAP、XPNPEP3、YAP1、YWHAZ、YY1AP1、ZBTB32、ZNF146、ZNF250、ZNF385A、ZNF408、ZNF410、ZNF423、ZNF43、ZNF502、ZNF512、ZNF513、ZNF580、ZNF609、ZNF707或ZNRD1。
ii. 合成TIE:適體複合物、經修飾核苷酸、IRES變異體及其他經工程改造之TIE
如本文所考慮,在某些實施例中,轉譯起始元件(TIE)包含合成TIE。在一些實施例中,合成TIE包含能夠起始線性RNA或環狀RNA聚核苷酸轉譯之適體複合物、合成IRES或其他經工程改造之TIE。
在一些實施例中,一或多個適體序列能夠結合至真核起始因子之組分以增強或起始轉譯。在一些實施例中,適體可用於藉由促進特異性真核起始因子(eIF) (例如WO 2019/081383 A1中之適體能夠結合至真核起始因子4F (eIF4F))來增強活體內及活體外轉譯。在一些實施例中,適體或適體複合物可能夠結合至EIF4G、EIF4E、EIF4A、EIF4B、EIF3、EIF2、EIF5、EIF1、EIF1A、40S核糖體、PCBP1 (聚C結合蛋白)、PCBP2、PCBP3、PCBP4、PABP1 (聚A結合蛋白)、PTB、阿爾戈瑙特蛋白家族、異質核核糖核蛋白K (HNRNPK)或La蛋白。
c. 終止序列
在某些實施例中,核心功能元件包含終止序列。在一些實施例中,終止序列包含終止密碼子。在一個實施例中,終止序列包含終止卡匣。在一些實施例中,終止卡匣包含至少2個終止密碼子。在一些實施例中,終止卡匣包含至少2個終止密碼子之框架。在相同實施例中,終止卡匣中之終止密碼子之框架各自包含1、2或更多個終止密碼子。在一些實施例中,終止卡匣包含LoxP或RoxStopRox、或frt側接之終止卡匣。在相同實施例中,終止卡匣包含lox-終止-lox終止卡匣。
C.
變異體
在某些實施例中,所提供之聚核苷酸(例如DNA模板、前驅體RNA聚核苷酸或環狀RNA聚核苷酸)包含經修飾核苷酸及/或經修飾核苷。在一些實施例中,經修飾核苷為m
5C (5-甲基胞苷)。在另一實施例中,經修飾核苷為m
5U (5-甲基尿苷)。在另一實施例中,經修飾核苷為m
6A (N
6-甲基腺苷)。在另一實施例中,經修飾核苷為s
2U (2-硫尿苷)。在另一實施例中,經修飾核苷為Ψ (假尿苷)。在另一實施例中,經修飾核苷為Um (2'-O-甲基尿苷)。在其他實施例中,經修飾核苷為m
1A (1-甲基腺苷);m
2A (2-甲基腺苷);Am (2'-O-甲基腺苷);ms
2m
6A (2-甲硫基-N
6-甲基腺苷);i
6A (N
6-異戊烯基腺苷);ms
2i6A (2-甲硫基-N
6異戊烯基腺苷);io
6A (N
6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷);ms
2io
6A (2-甲硫基-N
6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷);g
6A (N
6-甘胺醯基胺甲醯基腺苷);t
6A (N
6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷);ms
2t
6A (2-甲硫基-N
6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷);m
6t
6A (N
6-甲基-N
6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷);hn
6A (N
6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基腺苷);ms
2hn
6A (2-甲硫基-N
6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基腺苷);Ar(p) (2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯));I (肌苷);m
1I (1-甲基肌苷);m
1Im (1,2'-O-二甲基肌苷);m
3C (3-甲基胞苷);Cm (2'-O-甲基胞苷);s
2C (2-硫胞苷);ac
4C (N
4-乙醯基胞苷);f
5C (5-甲醯基胞苷);m
5Cm (5,2'-O-二甲基胞苷);ac
4Cm (N
4-乙醯基-2'-O-甲基胞苷);k
2C (立西啶);m
1G (1-甲基鳥苷);m
2G (N
2-甲基鳥苷);m
7G (7-甲基鳥苷);Gm (2'-O-甲基鳥苷);m
2 2G (N
2,N
2-二甲基鳥苷);m
2Gm (N
2,2'-O-二甲基鳥苷);m
2 2Gm (N
2,N
2,2'-O-三甲基鳥苷);Gr(p) (2'-O-核糖基鳥苷(磷酸酯));yW (懷俄丁苷);o
2yW (過氧基懷俄丁苷);OHyW (羥基懷俄丁苷);OHyW* (欠修飾之羥基懷俄丁苷);imG (懷俄苷);mimG (甲基懷俄苷);Q (Q核苷);oQ (環氧Q核苷);galQ (半乳糖苷基-Q核苷);manQ (甘露糖基-Q核苷);preQ
0(7-氰基-7-去氮鳥苷);preQ
1(7-胺甲基-7-去氮鳥苷);G
+(古嘌苷);D (二氫尿苷);m
5Um (5,2'-O-二甲基尿苷);s
4U (4-硫尿苷);m
5s
2U (5-甲基-2-硫尿苷);s
2Um (2-硫基-2'-O-甲基尿苷);acp
3U (3-(3-胺基-3-羧丙基)尿苷);ho
5U (5-羥基尿苷);mo
5U (5-甲氧基尿苷);cmo
5U (尿苷5-氧基乙酸);mcmo
5U (尿苷5-氧基乙酸甲酯);chm
5U (5-(羧基羥甲基)尿苷));mchm
5U (5-(羧基羥甲基)尿苷甲酯);mcm
5U (5-甲氧基羧甲基尿苷);mcm
5Um (5-甲氧基羰甲基-2'-O-甲基尿苷);mcm
5s
2U (5-甲氧基羰甲基-2-硫尿苷);nm
5S
2U (5-胺甲基-2-硫尿苷);mnm
5U (5-甲胺基甲基尿苷);mnm
5s
2U (5-甲胺基甲基-2-硫尿苷);mnm
5se
2U (5-甲胺基甲基-2-硒基尿苷);ncm
5U (5-胺甲醯基甲基尿苷);ncm
5Um (5-胺甲醯基甲基-2'-O-甲基尿苷);cmnm
5U (5-羧甲基胺甲基尿苷);cmnm
5Um (5-羧甲基胺甲基-2'-O-甲基尿苷);cmnm
5s
2U (5-羧甲基胺甲基-2-硫尿苷);m
6 2A (N
6,N
6-二甲基腺苷);Im (2'-O-甲基肌苷);m
4C (N
4-甲基胞苷);m
4Cm (N
4,2'-O-二甲基胞苷);hm
5C (5-羥甲基胞苷);m
3U (3-甲基尿苷);cm
5U (5-羧甲基尿苷);m
6Am (N
6,2'-O-二甲基腺苷);m
6 2Am (N
6,N
6,O-2'-三甲基腺苷);m
2,7G (N
2,7-二甲基鳥苷);m
2,2,7G (N
2,N
2,7-三甲基鳥苷);m
3Um (3,2'-O-二甲基尿苷);m
5D (5-甲基二氫尿苷);f
5Cm (5-甲醯基-2'-O-甲基胞苷);m
1Gm (1,2'-O-二甲基鳥苷);m
1Am (1,2'-O-二甲基腺苷);τm
5U (5-牛磺酸甲基尿苷);τm
5s
2U (5-牛磺酸甲基-2-硫尿苷);imG-14 (4-去甲基懷俄苷);imG2 (異懷俄苷);或ac
6A (N
6-乙醯基腺苷)。
在一些實施例中,經修飾核苷可包括選自以下之群之化合物:吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫尿苷、4-硫基-假尿苷、2-硫基-假尿苷、5-羥基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫基-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫基-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氫尿苷、二氫假尿苷、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫基-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、5-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙醯基胞苷、5-甲醯基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羥甲基胞苷、1-甲基-假異胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假異胞苷、2-硫基-胞苷、2-硫基-5-甲基-胞苷、4-硫基-假異胞苷、4-硫基-1-甲基-假異胞苷、4-硫基-1-甲基-1-去氮-假異胞苷、1-甲基-1-去氮-假異胞苷、澤布拉林(zebularine)、5-氮雜-澤布拉林、5-甲基-澤布拉林、5-氮雜-2-硫基-澤布拉林、2-硫基-澤布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷、2-胺基嘌呤、2, 6-二胺基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮-2-胺基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2-胺基嘌呤、7-去氮-2,6-二胺基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、N6-甘胺醯基胺甲醯基腺苷、N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、2-甲硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、懷俄苷、懷俄丁苷、7-去氮-鳥苷、7-去氮-8-氮雜-鳥苷、6-硫基-鳥苷、6-硫基-7-去氮-鳥苷、6-硫基-7-去氮-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷、6-硫基-7-甲基-鳥苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基鳥苷、N2-甲基鳥苷、N2,N2-二甲基鳥苷、8-側氧基-鳥苷、7-甲基-8-側氧基-鳥苷、1-甲基-6-硫基-鳥苷、N2-甲基-6-硫基-鳥苷及N2,N2-二甲基-6-硫基-鳥苷。在另一實施例中,修飾獨立地選自由5-甲基胞嘧啶、假尿苷及1-甲基假尿苷組成之群。
在一些實施例中,經修飾核糖核苷包括5-甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、1-甲基-假尿苷、N6-甲基腺苷及/或假尿苷。在一些實施例中,該等經修飾核苷提供額外穩定性及對免疫活化之抗性。
在特定實施例中,聚核苷酸可經密碼子最佳化。經密碼子最佳化序列可為其中編碼多肽之聚核苷酸中之密碼子已經取代以便增強多肽之表現、穩定性及/或活性的序列。影響密碼子最佳化之因素包括但不限於以下中之一或多者:(i)兩種或更多種生物體或基因或以合成方式構築之偏倚台之間的密碼子偏倚變化,(ii)生物體、基因或基因集內之密碼子偏倚程度變化,(iii)包括密碼子之情形之系統變化,(iv)根據密碼子之解碼tRNA的密碼子變化,(v)根據整體或三重峰之一個位置中之GC%的密碼子變化,(vi)與例如天然存在之序列之參考序列的類似性程度變化,(vii)密碼子頻率截止值變化,(viii)自DNA序列轉錄之mRNA之結構特性,(ix)關於作為密碼子取代集設計之基礎之DNA序列之功能的先前知識,及/或(x)用於各胺基酸之密碼子集之系統變化。在一些實施例中,經密碼子最佳化聚核苷酸可使核糖核酸酵素碰撞減至最少及/或限制表現序列與核心功能元件之間的結構干擾。
3. 有效負載物
在一些實施例中,表現序列編碼治療性蛋白。在一些實施例中,治療性蛋白選自下表中所列之蛋白質。
有效負載物 | 序列 | 目標細胞/ 器官 | 較佳遞送配方 |
CD19 CAR | 序列309-314中之任一者 | T細胞 | (50 mol %) DSPC (10 mol %) β-穀固醇(28.5% mol %) 膽固醇(10 mol %) PEG DMG (1.5 mol %) |
BCMA CAR* | MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPASLAVSLGERATINCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDAAIYYCLQSRIFPRTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSINWVRQAPGQGLEWMGWINTETREPAYAYDFRGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDYSYAMDYWGQGTLVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 3270) *BCMA CAR可選自美國專利申請案US 2021/0128618A1中所揭示之抗BCMA CAR中之任一者 | T細胞 | (50 mol %) DSPC (10 mol %) β-穀固醇(28.5% mol %) 膽固醇(10 mol %) PEG DMG (1.5 mol %) |
MAGE-A4 TCR | TCR α鏈: KNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTIMTFSENTKSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVNHSGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQKPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS (SEQ ID NO: 3271) TCR β鏈: DVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASSFLMTSGDPYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRAD (SEQ ID NO: 3272) | T細胞 | (50 mol %) DSPC (10 mol %) β-穀固醇(28.5% mol %) 膽固醇(10 mol %) PEG DMG (1.5 mol %) |
NY-ESO TCR | TCRα胞外序列 MQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVHPY (SEQ ID NO: 3273) TCRβ胞外序列 MGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVL (SEQ ID NO: 3274) | T細胞 | (50 mol %) DSPC (10 mol %) β-穀固醇(28.5% mol %) 膽固醇(10 mol %) PEG DMG (1.5 mol %) |
EPO | APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR (SEQ ID NO: 3275) | 腎或骨髓 | |
PAH | MSTAVLENPGLGRKLSDFGQETSYIEDNCNQNGAISLIFSLKEEVGALAKVLRLFEENDVNLTHIESRPSRLKKDEYEFFTHLDKRSLPALTNIIKILRHDIGATVHELSRDKKKDTVPWFPRTIQELDRFANQILSYGAELDADHPGFKDPVYRARRKQFADIAYNYRHGQPIPRVEYMEEEKKTWGTVFKTLKSLYKTHACYEYNHIFPLLEKYCGFHEDNIPQLEDVSQFLQTCTGFRLRPVAGLLSSRDFLGGLAFRVFHCTQYIRHGSKPMYTPEPDICHELLGHVPLFSDRSFAQFSQEIGLASLGAPDEYIEKLATIYWFTVEFGLCKQGDSIKAYGAGLLSSFGELQYCLSEKPKLLPLELEKTAIQNYTVTEFQPLYYVAESFNDAKEKVRNFAATIPRPFSVRYDPYTQRIEVLDNTQQLKILADSINSEIGILCSALQKIK (SEQ ID NO: 3257) | 肝細胞 | (50 mol %) DSPC (10 mol %) 膽固醇(38.5% mol %) PEG-DMG (1.5%) 或 MC3 (50 mol %) DSPC (10 mol %) 膽固醇(38.5% mol %) PEG-DMG (1.5%) |
CPS1 | LSVKAQTAHIVLEDGTKMKGYSFGHPSSVAGEVVFNTGLGGYPEAITDPAYKGQILTMANPIIGNGGAPDTTALDELGLSKYLESNGIKVSGLLVLDYSKDYNHWLATKSLGQWLQEEKVPAIYGVDTRMLTKIIRDKGTMLGKIEFEGQPVDFVDPNKQNLIAEVSTKDVKVYGKGNPTKVVAVDCGIKNNVIRLLVKRGAEVHLVPWNHDFTKMEYDGILIAGGPGNPALAEPLIQNVRKILESDRKEPLFGISTGNLITGLAAGAKTYKMSMANRGQNQPVLNITNKQAFITAQNHGYALDNTLPAGWKPLFVNVNDQTNEGIMHESKPFFAVQFHPEVTPGPIDTEYLFDSFFSLIKKGKATTITSVLPKPALVASRVEVSKVLILGSGGLSIGQAGEFDYSGSQAVKAMKEENVKTVLMNPNIASVQTNEVGLKQADTVYFLPITPQFVTEVIKAEQPDGLILGMGGQTALNCGVELFKRGVLKEYGVKVLGTSVESIMATEDRQLFSDKLNEINEKIAPSFAVESIEDALKAADTIGYPVMIRSAYALGGLGSGICPNRETLMDLSTKAFAMTNQILVEKSVTGWKEIEYEVVRDADDNCVTVCNMENVDAMGVHTGDSVVVAPAQTLSNAEFQMLRRTSINVVRHLGIVGECNIQFALHPTSMEYCIIEVNARLSRSSALASKATGYPLAFIAAKIALGIPLPEIKNVVSGKTSACFEPSLDYMVTKIPRWDLDRFHGTSSRIGSSMKSVGEVMAIGRTFEESFQKALRMCHPSIEGFTPRLPMNKEWPSNLDLRKELSEPSSTRIYAIAKAIDDNMSLDEIEKLTYIDKWFLYKMRDILNMEKTLKGLNSESMTEETLKRAKEIGFSDKQISKCLGLTEAQTRELRLKKNIHPWVKQIDTLAAEYPSVTNYLYVTYNGQEHDVNFDDHGMMVLGCGPYHIGSSVEFDWCAVSSIRTLRQLGKKTVVVNCNPETVSTDFDECDKLYFEELSLERILDIYHQEACGGCIISVGGQIPNNLAVPLYKNGVKIMGTSPLQIDRAEDRSIFSAVLDELKVAQAPWKAVNTLNEALEFAKSVDYPCLLRPSYVLSGSAMNVVFSEDEMKKFLEEATRVSQEHPVVLTKFVEGAREVEMDAVGKDGRVISHAISEHVEDAGVHSGDATLMLPTQTISQGAIEKVKDATRKIAKAFAISGPFNVQFLVKGNDVLVIECNLRASRSFPFVSKTLGVDFIDVATKVMIGENVDEKHLPTLDHPIIPADYVAIKAPMFSWPRLRDADPILRCEMASTGEVACFGEGIHTAFLKAMLSTGFKIPQKGILIGIQQSFRPRFLGVAEQLHNEGFKLFATEATSDWLNANNVPATPVAWPSQEGQNPSLSSIRKLIRDGSIDLVINLPNNNTKFVHDNYVIRRTAVDSGIPLLTNFQVTKLFAEAVQKSRKVDSKSLFHYRQYSAGKAA (SEQ ID NO: 3276) | 肝細胞 | (50 mol %) DSPC (10 mol %) 膽固醇(38.5% mol %) PEG-DMG (1.5%) 或 MC3 (50 mol %) DSPC (10 mol %) 膽固醇(38.5% mol %) PEG-DMG (1.5%) |
Cas9 | MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG (SEQ ID NO: 3277) | 免疫細胞 | (50 mol %) DSPC (10 mol %) β-穀固醇(28.5% mol %) 膽固醇(10 mol %) PEG DMG (1.5 mol %) |
ADAMTS13 | AAGGILHLELLVAVGPDVFQAHQEDTERYVLTNLNIGAELLRDPSLGAQFRVHLVKMVILTEPEGAPNITANLTSSLLSVCGWSQTINPEDDTDPGHADLVLYITRFDLELPDGNRQVRGVTQLGGACSPTWSCLITEDTGFDLGVTIAHEIGHSFGLEHDGAPGSGCGPSGHVMASDGAAPRAGLAWSPCSRRQLLSLLSAGRARCVWDPPRPQPGSAGHPPDAQPGLYYSANEQCRVAFGPKAVACTFAREHLDMCQALSCHTDPLDQSSCSRLLVPLLDGTECGVEKWCSKGRCRSLVELTPIAAVHGRWSSWGPRSPCSRSCGGGVVTRRRQCNNPRPAFGGRACVGADLQAEMCNTQACEKTQLEFMSQQCARTDGQPLRSSPGGASFYHWGAAVPHSQGDALCRHMCRAIGESFIMKRGDSFLDGTRCMPSGPREDGTLSLCVSGSCRTFGCDGRMDSQQVWDRCQVCGGDNSTCSPRKGSFTAGRAREYVTFLTVTPNLTSVYIANHRPLFTHLAVRIGGRYVVAGKMSISPNTTYPSLLEDGRVEYRVALTEDRLPRLEEIRIWGPLQEDADIQVYRRYGEEYGNLTRPDITFTYFQPKPRQAWVWAAVRGPCSVSCGAGLRWVNYSCLDQARKELVETVQCQGSQQPPAWPEACVLEPCPPYWAVGDFGPCSASCGGGLRERPVRCVEAQGSLLKTLPPARCRAGAQQPAVALETCNPQPCPARWEVSEPSSCTSAGGAGLALENETCVPGADGLEAPVTEGPGSVDEKLPAPEPCVGMSCPPGWGHLDATSAGEKAPSPWGSIRTGAQAAHVWTPAAGSCSVSCGRGLMELRFLCMDSALRVPVQEELCGLASKPGSRREVCQAVPCPARWQYKLAACSVSCGRGVVRRILYCARAHGEDDGEEILLDTQCQGLPRPEPQEACSLEPCPPRWKVMSLGPCSASCGLGTARRSVACVQLDQGQDVEVDEAACAALVRPEASVPCLIADCTYRWHVGTWMECSVSCGDGIQRRRDTCLGPQAQAPVPADFCQHLPKPVTVRGCWAGPCVGQGTPSLVPHEEAAAPGRTTATPAGASLEWSQARGLLFSPAPQPRRLLPGPQENSVQSSACGRQHLEPTGTIDMRGPGQADCAVAIGRPLGEVVTLRVLESSLNCSAGDMLLLWGRLTWRKMCRKLLDMTFSSKTNTLVVRQRCGRPGGGVLLRYGSQLAPETFYRECDMQLFGPWGEIVSPSLSPATSNAGGCRLFINVAPHARIAIHALATNMGAGTEGANASYILIRDTHSLRTTAFHGQQVLYWESESSQAEMEFSEGFLKAQASLRGQYWTLQSWVPEMQDPQSWKGKEGT (SEQ ID NO: 3278) | 肝細胞 | (50 mol %) DSPC (10 mol %) 膽固醇(38.5% mol %) PEG-DMG (1.5%) 或 MC3 (50 mol %) DSPC (10 mol %) 膽固醇(38.5% mol %) PEG-DMG (1.5%) |
FOXP3 | MPNPRPGKPSAPSLALGPSPGASPSWRAAPKASDLLGARGPGGTFQGRDLRGGAHASSSSLNPMPPSQLQLPTLPLVMVAPSGARLGPLPHLQALLQDRPHFMHQLSTVDAHARTPVLQVHPLESPAMISLTPPTTATGVFSLKARPGLPPGINVASLEWVSREPALLCTFPNPSAPRKDSTLSAVPQSSYPLLANGVCKWPGCEKVFEEPEDFLKHCQADHLLDEKGRAQCLLQREMVQSLEQQLVLEKEKLSAMQAHLAGKMALTKASSVASSDKGSCCIVAAGSQGPVVPAWSGPREAPDSLFAVRRHLWGSHGNSTFPEFLHNMDYFKFHNMRPPFTYATLIRWAILEAPEKQRTLNEIYHWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCFVRVESEKGAVWTVDELEFRKKRSQRPSRCSNPTPGP (SEQ ID NO: 3187) | 免疫細胞 | (50 mol %) DSPC (10 mol %) β-穀固醇(28.5% mol %) 膽固醇(10 mol %) PEG DMG (1.5 mol %) |
IL-10 | SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 3181) | 免疫細胞 | (50 mol %) DSPC (10 mol %) β-穀固醇(28.5% mol %) 膽固醇(10 mol %) PEG DMG (1.5 mol %) |
IL-2 | APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT (SEQ ID NO: 3177) | 免疫細胞 | (50 mol %) DSPC (10 mol %) β-穀固醇(28.5% mol %) 膽固醇(10 mol %) PEG DMG (1.5 mol %) |
在一些實施例中,表現序列編碼治療性蛋白。在一些實施例中,表現序列編碼例如IL-12p70、IL-15、IL-2、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-β、IL-10、TGF-β、IL-4或IL-35之細胞介素或其功能片段。在一些實施例中,表現序列編碼免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中,表現序列編碼促效劑(例如TNFR家族成員,諸如CD137L、OX40L、ICOSL、LIGHT或CD70)。在一些實施例中,表現序列編碼嵌合抗原受體。在一些實施例中,表現序列編碼抑制性受體促效劑(例如PDL1、PDL2、半乳糖凝集素-9、VISTA、B7H4或MHCII)或抑制性受體(例如PD1、CTLA4、TIGIT、LAG3或TIM3)。在一些實施例中,表現序列編碼抑制性受體拮抗劑。在一些實施例中,表現序列編碼一或多個TCR鏈(α鏈及β鏈或γ鏈及δ鏈)。在一些實施例中,表現序列編碼分泌T細胞或免疫細胞接合子(例如,靶向例如CD3、CD137或CD28之雙特異性抗體,諸如BiTE;及腫瘤表現蛋白,例如CD19、CD20或BCMA等)。在一些實施例中,表現序列編碼轉錄因子(例如
FOXP3、
HELIOS、
TOX1或
TOX2)。在一些實施例中,表現序列編碼免疫抑制性酶(例如IDO或CD39/CD73)。在一些實施例中,表現序列編碼GvHD (例如抗HLA-A2 CAR-Treg)。
在一些實施例中,聚核苷酸編碼由經超過一種基因編碼之亞單元構成的蛋白質。舉例而言,蛋白質可為異二聚體,其中蛋白質之各鏈或亞單元經單獨基因編碼。超過一種環狀RNA分子係在轉移媒劑中遞送且各環狀RNA編碼蛋白質之單獨亞單元係可能的。可替代地,單一環狀RNA可經工程改造以編碼超過一個亞單元。在某些實施例中,編碼個別亞單元之單獨環狀RNA分子可在單獨轉移媒劑中投與。
A.
抗原辨識受體a. 嵌合抗原受體(CAR)
在一些實施例中,所提供之RNA聚核苷酸編碼一或多種嵌合抗原受體(CAR或CAR-T)。CAR為經基因工程改造之受體。此等經工程改造之受體可經由如本文所描述之環狀RNA插入免疫細胞中且由免疫細胞表現,該等免疫細胞包括T細胞。在CAR之情況下,單一受體可經程式化以辨識特異性抗原且當結合至抗原時活化免疫細胞以攻擊及破壞帶有該抗原之細胞。當此等抗原存在於腫瘤細胞上時,表現CAR之免疫細胞可靶向且殺滅腫瘤細胞。在一些實施例中,由聚核苷酸編碼之CAR包含(i)特異性結合至目標抗原之抗原結合分子、(ii)鉸鏈域、跨膜域及胞內域及(iii)活化域。
在一些實施例中,本發明之CAR之定向包含與共刺激域及活化域串聯之抗原結合域(諸如scFv)。共刺激域可包含胞外部分、跨膜部分及胞內部分中之一或多者。在其他實施例中,多個共刺激域可以串聯方式利用。
i. 抗原結合域
CAR可經工程改造以藉由併入與該靶向抗原相互作用之抗原結合分子來結合至抗原(諸如細胞表面抗原)。在一些實施例中,抗原結合分子為其抗體片段,例如一或多個單鏈抗體片段(scFv)。scFv為具有連接在一起之抗體之重鏈及輕鏈之可變區的單鏈抗體片段。參見美國專利第7,741,465號及第6,319,494號以及Eshhar等人, Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131-136。scFv保留親本抗體與目標抗原特異性相互作用之能力。scFv可用於嵌合抗原受體,此係因為其可經工程改造以連同其他CAR組分一起表現為單鏈之一部分。同上。亦參見Krause等人, J. Exp. Med., 第188卷, 第4期, 1998 (619-626);Finney等人, Journal of Immunology, 1998, 161: 2791-2797。應瞭解,抗原結合分子通常含於CAR之胞外部分內以使得其能夠辨識且結合至所關注之抗原。對超過一個所關注之目標具有特異性之雙特異性CAR及多特異性CAR經考慮在本發明之範疇內。
在一些實施例中,抗原結合分子包含單鏈,其中重鏈可變區及輕鏈可變區係藉由連接子連接。在一些實施例中,VH位於連接子之N端且VL位於連接子之C端。在其他實施例中,VL位於連接子之N端且VH位於連接子之C端。在一些實施例中,連接子包含至少約5個、至少約8個、至少約10個、至少約13個、至少約15個、至少約18個、至少約20個、至少約25個、至少約30個、至少約35個、至少約40個、至少約45個、至少約50個、至少約60個、至少約70個、至少約80個、至少約90個或至少約100個胺基酸。
在一些實施例中,抗原結合分子包含奈米抗體。在一些實施例中,抗原結合分子包含DARPin。在一些實施例中,抗原結合分子包含能夠特異性結合至目標蛋白之抗運載蛋白或其他合成蛋白。
在一些實施例中,CAR包含對選自以下之群之抗原具有特異性之抗原結合域:CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、C型凝集素樣分子-1、CD33、表皮生長因子受體變異體III (EGFRvIII)、神經節苷脂G2 (GD2)、神經節苷脂GD3、TNF受體家族成員成熟B細胞(BCMA)、Tn抗原((Tn Ag)或(GaINAca-Ser/Thr))、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)、Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)、腫瘤相關醣蛋白72 (TAG72)、CD38、CD44v6、癌胚抗原(CEA)、上皮細胞黏附分子(EPCAM)、B7H3 (CD276)、KIT (CD117)、介白素-13受體亞單元α-2、間皮素、介白素11受體α (IL-11Ra)、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、蛋白酶絲胺酸21、血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)、路易斯(Lewis)(Y)抗原、CD24、血小板源生長因子受體β (PDGFR-β)、階段特異性胚抗原-4 (SSEA-4)、CD20、葉酸受體α、HER2、HER3、細胞表面相關黏蛋白1 (MUC1)、表皮生長因子受體(EGFR)、神經細胞黏附分子(NCAM)、前列腺酶、前列腺酸磷酸酶(PAP)、突變延長因子2 (ELF2M)、蝶素B2、纖維母細胞活化蛋白α (FAP)、胰島素樣生長因子1受體(IGF-I受體)、碳酸酐酶IX (CAIX)、β型蛋白酶體(前體、巨蛋白因子)亞單元9 (LMP2)、醣蛋白100 (gp100)、由斷點叢集區(BCR)及阿貝爾森鼠(Abelson murine)白血病病毒致癌基因同源物1 (Abl) (bcr-abl)組成之致癌基因融合蛋白、酪胺酸酶、蝶素A型受體2 (EphA2)、海藻糖基GM1、唾液酸基路易斯黏附分子(sLe)、神經節苷脂GM3、轉麩醯胺酸酶5 (TGS5)、高分子量黑色素瘤相關抗原(HMWMAA)、鄰乙醯基-GD2神經節苷脂(OAcGD2)、葉酸受體β、腫瘤內皮標記物1 (TEM1/CD248)、腫瘤內皮標記物7相關(TEM7R)、密連蛋白6 (CLDN6)、促甲狀腺激素受體(TSHR)、G蛋白偶合受體C類第5組成員D (GPRC5D)、染色體X開放閱讀框架61 (CXORF61)、CD97、CD179a、未分化淋巴瘤激酶(ALK)、聚唾液酸、胎盤特異性1 (PLAC1)、globoH糖基神經醯胺(GloboH)之六醣部分、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、尿溶蛋白2 (UPK2)、A型肝炎病毒細胞受體1 (HAVCR1)、腎上腺素受體β 3 (ADRB3)、泛連接蛋白3 (PANX3)、G蛋白偶合受體20 (GPR20)、淋巴球抗原6複合物基因座K 9 (LY6K)、嗅覺受體51E2 (OR51E2)、TCR γ替代閱讀框架蛋白(TARP)、威爾姆氏腫瘤(Wilms tumor)蛋白(WT1)、癌抗原/睾丸抗原1 (NY-ESO-1)、癌抗原/睾丸抗原2 (LAGE-1a)、MAGE家族成員(包括MAGE-A1、MAGE-A3及MAGE-A4)、位於染色體12p上之ETS易位變異基因6 (ETV6-AML)、精子蛋白17 (SPA17)、X抗原家族成員1A (XAGE1)、結合血管生成素之細胞表面受體2 (Tie 2)、黑色素瘤癌睾丸抗原-1 (MAD-CT-1)、黑色素瘤癌睾丸抗原-2 (MAD-CT-2)、Fos相關抗原1、腫瘤蛋白p53 (p53)、p53突變體、前列腺蛋白、存活素、端粒酶、前列腺癌腫瘤抗原-1、T細胞辨識之黑色素瘤抗原1、大鼠肉瘤(Ras)突變體、人類端粒酶逆轉錄酶(hTERT)、肉瘤易位斷點、黑色素瘤細胞凋亡抑制劑(ML-IAP)、ERG (跨膜蛋白酶絲胺酸2 (TMPRSS2) ETS融合基因)、N-乙醯基葡糖胺基-轉移酶V (NA17)、成對盒蛋白Pax-3 (PAX3)、雄激素受體、週期素B1、v-myc禽類髓細胞組織增生病毒致癌基因神經母細胞瘤源性同源物(MYCN)、Ras同源物家族成員C (RhoC)、酪胺酸酶相關蛋白2 (TRP-2)、細胞色素P450 1B1 (CYP1B1)、CCCTC-結合因子(鋅指蛋白)樣、T細胞辨識之鱗狀細胞癌抗原3 (SART3)、成對盒蛋白Pax-5 (PAX5)、前頂體素結合蛋白sp32 (OY-TES1)、淋巴球特異性蛋白酪胺酸激酶(LCK)、A激酶錨蛋白4 (AKAP-4)、滑液肉瘤、X斷點2 (SSX2)、高級醣化最終產物之受體(RAGE-1)、腎普遍存在物1 (RU1)、腎普遍存在物2 (RU2)、豆莢蛋白、人類乳頭狀瘤病毒E6 (HPV E6)、人類乳頭狀瘤病毒E7 (HPV E7)、腸羧基酯酶、突變熱休克蛋白70-2 (mut hsp70-2)、CD79a、CD79b、CD72、白血球相關免疫球蛋白樣受體1 (LAIR1)、IgA受體之Fc片段(FCAR或CD89)、白血球免疫球蛋白樣受體亞家族A成員2 (LILRA2)、CD300分子樣家族成員f (CD300LF)、C型凝集素域家族12成員A (CLEC12A)、骨髓基質細胞抗原2 (BST2)、含EGF樣模組之黏蛋白樣激素受體樣2 (EMR2)、淋巴球抗原75 (LY75)、磷脂肌醇蛋白聚醣-3 (GPC3)、Fc受體樣5 (FCRL5)、MUC16、5T4、8H9、ανβθ整合素、αvβ6整合素、α胎蛋白(AFP)、B7-H6、ca-125、CA9、CD44、CD44v7/8、CD52、E-鈣黏蛋白、EMA (上皮膜抗原)、上皮醣蛋白-2 (EGP-2)、上皮醣蛋白-40 (EGP-40)、ErbB4、上皮腫瘤抗原(ETA)、葉酸結合蛋白(FBP)、激酶插入域受體(KDR)、k-輕鏈、L1細胞黏附分子、MUC18、NKG2D、致癌胎兒抗原(h5T4)、腫瘤抗原/睾丸抗原1B、GAGE、GAGE-1、BAGE、SCP-1、CTZ9、SAGE、CAGE、CT10、MART-1、免疫球蛋白λ樣多肽1 (IGLL1)、B型肝炎表面抗原結合蛋白(HBsAg)、病毒衣殼抗原(VCA)、早期抗原(EA)、EBV核抗原(EBNA)、HHV-6 p41早期抗原、HHV-6B U94潛伏抗原、HHV-6B p98晚期抗原、細胞巨大病毒(CMV)抗原、大T抗原、小T抗原、腺病毒抗原、呼吸道融合病毒(RSV)抗原、血球凝集素(HA)、神經胺糖酸苷酶(NA)、1型副流感抗原、2型副流感抗原、3型副流感抗原、4型副流感抗原、人類間質肺炎病毒(HMPV)抗原、C型肝炎病毒(HCV)核心抗原、HIV p24抗原、人類T細胞親淋巴性病毒(HTLV-1)抗原、梅克爾細胞(Merkel cell)多瘤病毒小T抗原、梅克爾細胞多瘤病毒大T抗原、卡堡氏肉瘤(Kaposi sarcoma)相關疱疹病毒(KSHV)溶解核抗原及KSHV潛伏核抗原。在一些實施例中,抗原結合域包含選自SEQ ID NO: 3165-3176之胺基酸序列。
ii. 鉸鏈 / 間隔子域
在一些實施例中,本發明之CAR包含鉸鏈或間隔子域。在一些實施例中,鉸鏈/間隔子域可包含經截短鉸鏈/間隔子域(THD),THD域為完整鉸鏈/間隔子域(「CHD」)之截短型式。在一些實施例中,胞外域來自或衍生自以下(例如包含以下全部或以下之片段):ErbB2、血型醣蛋白A (GpA)、CD2、CD3 δ、CD3 ε、CD3 γ、CD4、CD7、CD8a、CD8[T CDl la (IT GAL)、CDl lb (IT GAM)、CDl lc (ITGAX)、CDl ld (IT GAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD28T、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A (B細胞抗原受體複合物相關α鏈)、CD79B (B細胞抗原受體複合物相關β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (0X40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3-zeta)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRT AM)、CD357 (TNFRSF18)、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)、LFA-1 (CDl la/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2R β、IL-2R γ、IL-7R α、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配位體、Fc γ受體、1類MHC分子、2類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白、細胞介素受體、整合素、活化NK細胞受體、鐸配位體受體及其片段或組合。鉸鏈或間隔子域可衍生自天然來源或合成來源。
在一些實施例中,鉸鏈或間隔子域位於抗原結合分子(例如scFv)與跨膜域之間。在此定向中,鉸鏈/間隔子域提供抗原結合分子與CAR表現於其上之細胞膜表面之間的距離。在一些實施例中,鉸鏈或間隔子域來自或衍生自免疫球蛋白。在一些實施例中,鉸鏈或間隔子域選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、IgM之鉸鏈/間隔子區或其片段。在一些實施例中,鉸鏈或間隔子域包含、來自或衍生自CD8 α之鉸鏈/間隔子區。在一些實施例中,鉸鏈或間隔子域包含、來自或衍生自CD28之鉸鏈/間隔子區。在一些實施例中,鉸鏈或間隔子域包含CD8 α之鉸鏈/間隔子區之片段或CD28之鉸鏈/間隔子區之片段,其中該片段為小於整個鉸鏈/間隔子區之任何片段。在一些實施例中,CD8 α鉸鏈/間隔子區之片段或CD28鉸鏈/間隔子區之片段包含不包括CD8 α鉸鏈/間隔子區或CD28鉸鏈/間隔子區之N端或C端或兩者處之至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個或至少20個胺基酸的胺基酸序列。
iii. 跨膜域
本發明之CAR可進一步包含跨膜域及/或胞內信號傳導域。跨膜域可經設計以與CAR之胞外域融合。其可類似地與CAR之胞內域融合。在一些實施例中,使用與CAR中之域中之一者天然締合之跨膜域。在一些情況下,跨膜域可經選擇或修飾(例如藉由胺基酸取代)以避免該等域結合至相同或不同表面膜蛋白之跨膜域,從而使與受體複合物中之其他成員之相互作用減至最少。跨膜域可衍生自天然來源或合成來源。在來源為天然來源之情況下,域可衍生自任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。
跨膜區可衍生自(亦即包含)受體酪胺酸激酶(例如ErbB2)、血型醣蛋白A (GpA)、4-1BB/CD137、活化NK細胞受體、免疫球蛋白、B7-H3、BAFFR、BFAME (SEAMF8)、BTEA、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3 δ、CD3 ε、CD3 γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96 (Tactile)、CD1 la、CD1 lb、CD1 lc、CD1 Id、CDS、CEACAM1、CRT AM、細胞介素受體、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fc γ受體、GADS、GITR、HVEM (EIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Ig α (CD79a)、IE-2R β、IE-2R γ、IE-7R α、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、IT GAD、ITGAE、ITGAE、IT GAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、EAT、LFA-1、LFA-1、與CD83特異性結合之配位體、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9 (CD229)、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1;CDl-la/CD18)、1類MHC分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、計劃性死亡-1 (PD-1)、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴球性活化分子(SLAM蛋白)、SLAM (SLAMF1;CD150;IPO-3)、SLAMF4 (CD244;2B4)、SLAMF6 (NTB-A;Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF受體蛋白、TNFR2、TNFSF14、鐸配位體受體、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6或其片段、截短體或組合。
在一些實施例中,適合的胞內信號傳導域包括但不限於活化巨噬細胞/骨髓細胞受體CSFR1、MYD88、CD14、TIE2、TLR4、CR3、CD64、TREM2、DAP10、DAP12、CD169、DECTIN1、CD206、CD47、CD163、CD36、MARCO、TIM4、MERTK、F4/80、CD91、C1QR、LOX-1、CD68、SRA、BAI-1、ABCA7、CD36、CD31、乳鐵蛋白或其片段、截短體或組合。
在一些實施例中,受體酪胺酸激酶可衍生自(例如包含)胰島素受體(InsR)、胰島素樣生長因子I受體(IGF1R)、胰島素受體相關受體(IRR)、血小板源生長因子受體α (PDGFRa)、血小板源生長因子受體β (PDGFRfi)、KIT原致癌基因受體酪胺酸激酶(Kit)、群落刺激因子1受體(CSFR)、fms相關酪胺酸激酶3 (FLT3)、fms相關酪胺酸激酶1 (VEGFR-1)、激酶插入域受體(VEGFR-2)、fms相關酪胺酸激酶4 (VEGFR-3)、纖維母細胞生長因子受體1 (FGFR1)、纖維母細胞生長因子受體2 (FGFR2)、纖維母細胞生長因子受體3 (FGFR3)、纖維母細胞生長因子受體4 (FGFR4)、蛋白酪胺酸激酶7 (CCK4)、神經營養受體酪胺酸激酶1 (trkA)、神經營養受體酪胺酸激酶2 (trkB)、神經營養受體酪胺酸激酶3 (trkC)、受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)、受體酪胺酸激酶樣孤兒受體2 (ROR2)、肌肉相關受體酪胺酸激酶(MuSK)、MET原致癌基因受體酪胺酸激酶(MET)、巨噬細胞刺激性1受體(Ron)、AXL受體酪胺酸激酶(Axl)、TYR03蛋白酪胺酸激酶(Tyro3)、MER原致癌基因酪胺酸激酶(Mer)、具有免疫球蛋白樣及EGF樣域之酪胺酸激酶1 (TIE1)、TEK受體酪胺酸激酶(TIE2)、EPH受體A1 (EphAl)、EPH受體A2 (EphA2)、(EPH受體A3) EphA3、EPH受體A4 (EphA4)、EPH受體A5 (EphA5)、EPH受體A6 (EphA6)、EPH受體A7 (EphA7)、EPH受體A8 (EphA8)、EPH受體A10 (EphAlO)、EPH受體B1 (EphBl)、EPH受體B2 (EphB2)、EPH受體B3 (EphB3)、EPH受體B4 (EphB4)、EPH受體B6 (EphB6)、ret原致癌基因(Ret)、受體樣酪胺酸激酶(RYK)、盤狀域受體酪胺酸激酶1 (DDR1)、盤狀域受體酪胺酸激酶2 (DDR2)、c-ros致癌基因1、受體酪胺酸激酶(ROS)、細胞凋亡相關酪胺酸激酶(Lmrl)、狐猴酪胺酸激酶2 (Lmr2)、狐猴酪胺酸激酶3 (Lmr3)、白血球受體酪胺酸激酶(LTK)、ALK受體酪胺酸激酶(ALK)或絲胺酸/蘇胺酸/酪胺酸激酶1 (STYK1)。
iv. 共刺激域
在某些實施例中,CAR包含共刺激域。在一些實施例中,共刺激域包含4-1BB (CD137)、CD28或兩者及/或胞內T細胞信號傳導域。在一較佳實施例中,共刺激域為人類CD28、人類4-1BB或兩者,且胞內T細胞信號傳導域為人類CD3 ζ。4-1BB、CD28、CD3 ζ可分別占小於整個4-1BB、CD28或CD3 ζ。嵌合抗原受體可併有共刺激(信號傳導)域以提高其效力。參見美國專利第7,741,465號及第6,319,494號以及Krause等人及Finney等人(同前文獻),Song等人, Blood 119:696-706 (2012);Kalos等人, Sci Transl. Med. 3:95 (2011);Porter等人, N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011);及Gross等人, Amur. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016)。
在一些實施例中,共刺激域包含SEQ ID NO: 3162或3164之胺基酸序列。
v. 胞內信號傳導域
本文所揭示之經工程改造T細胞之胞內(信號傳導)域可向活化域提供信號傳導,該活化域隨後活化免疫細胞之正常效應功能中之至少一者。T細胞之效應功能例如可為細胞溶解活性或輔助活性,該輔助活性包括細胞介素分泌。
在一些實施例中,適合的胞內信號傳導域包括(例如包含)但不限於4-1BB/CD137、活化NK細胞受體、免疫球蛋白、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD 19a、CD2、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3 δ、CD3 ε、CD3 γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96 (Tactile)、CD1 la、CD1 lb、CD1 lc、CD1 1d、CDS、CEACAM1、CRT AM、細胞介素受體、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fc γ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、Ig α (CD79a)、IL-2R β、IL-2R γ、IL-7R α、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、與CD83特異性結合之配位體、LIGHT、LTBR、Ly9 (CD229)、Lyl08、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1;CDl-la/CD18)、1類MHC分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、計劃性死亡-1 (PD-1)、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴球性活化分子(SLAM蛋白)、SLAM (SLAMF1;CD150;IPO-3)、SLAMF4 (CD244;2B4)、SLAMF6 (NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TNF受體蛋白、TNFR2、TNFSF14、鐸配位體受體、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6或其片段、截短體或組合。
CD3為原生T細胞上之T細胞受體之元件,且已展示為CAR中之重要胞內活化元件。在一些實施例中,CD3為CD3 ζ。在一些實施例中,活化域包含與SEQ ID NO: 3163之多肽序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之胺基酸序列。
b. T細胞受體(TCR)
在一些實施例中,所提供之環狀RNA聚核苷酸編碼T細胞受體。使用國際免疫遺傳學(IMGT) TCR命名法對TCR進行描述,且將TCR與TCR序列之IMGT公共資料庫建立鏈接。原生α-β異二聚TCR具有α鏈及β鏈。大致地,各鏈可包含可變區、連接區及恆定區,且β鏈通常亦含有在可變區與連接區之間的短多樣性區,但此多樣性區常常視為連接區之一部分。各可變區可包含嵌入框架序列中之三個互補決定區(CDR),一個為命名為CDR3之高變區。存在若干類型之α鏈可變(Vα)區及若干類型之β鏈可變(Vβ)區,該等區域係藉由其框架、CDR1及CDR2序列及藉由部分界定之CDR3序列區分開。Vα類型以IMGT命名法藉由獨特TRAV編號提及。因此,「TRAV21」界定具有獨特框架及CDR1及CDR2序列以及由在TCR間保存之胺基酸序列部分界定、但亦包括在TCR間變化之胺基酸序列之CDR3序列的TCR Vα區。以相同方式,「TRBV5-1」界定具有獨特框架及CDR1及CDR2序列、但僅具有部分界定之CDR3序列的TCR Vβ區。
TCR之連接區類似地由獨特IMGT TRAJ及TRBJ命名法定義,且恆定區由IMGT TRAC及TRBC命名法定義。
β鏈多樣性區以IMGT命名法藉由縮寫TRBD提及,且如所提到,串連TRBD/TRBJ區常常一起視為連接區。
由IMGT命名法定義之獨特序列為廣泛已知的且可接近在TCR領域中工作之序列。舉例而言,其可見於IMGT公共資料庫中。「T cell Receptor Factsbook」, (2001) LeFranc及LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8亦揭示由IMGT命名法定義之序列,但由於其公開日期及隨之而來的時滯,其中之資訊有時需要參照IMGT資料庫加以確認。
原生TCR以異二聚αβ或γδ形式存在。然而,先前已展示由αα或ββ同二聚體組成之重組TCR結合至肽MHC分子。因此,本發明之TCR可為異二聚αβ TCR或可為αα或ββ同二聚TCR。
為了用於授受性療法中,αβ異二聚TCR可例如經轉染為具有細胞質域及跨膜域之全長鏈。在某些實施例中,本發明之TCR可在各別恆定域之殘基之間具有引入的二硫鍵,如例如WO 2006/000830中所描述。
本發明之TCR,尤其α-β異二聚TCR,可包含α鏈TRAC恆定域序列及/或β鏈TRBC1或TRBC2恆定域序列。α鏈及β鏈恆定域序列可藉由截短或取代加以修飾以使TRAC之外顯子2之Cys4與TRBC1或TRBC2之外顯子2之Cys2之間的原生二硫鍵缺失。(多個) α鏈及/或β鏈恆定域序列亦可藉由用半胱胺酸殘基取代TRAC之Thr 48及TRBC1或TRBC2之Ser 57加以修飾,該等半胱胺酸在TCR之α恆定域與β恆定域之間形成二硫鍵。
結合親和力(與平衡常數K
D成反比)及結合半衰期(表示為T½)可藉由任何適當的方法來測定。應瞭解,使TCR之親和力加倍引起K
D減半。T½經計算為ln 2除以解離速率(koff)。因此,使T½加倍引起koff減半。通常量測TCR之可溶性形式,亦即經截短以移除細胞質域及跨膜域殘基之彼等形式的TCR K
D及koff值。因此,應理解,若該TCR之可溶性形式具有該等特徵,則既定TCR對親本TCR具有改善之結合親和力及/或結合半衰期。較佳地,使用相同分析方案量測既定TCR之結合親和力或結合半衰期若干次,例如3次或更多次,且取結果平均值。
因為本發明之TCR在授受性療法中具有效用,因此本發明包括呈現本發明之TCR之非天然存在之細胞及/或經純化之細胞及/或經工程改造之細胞,尤其T細胞。存在多種適用於用編碼本發明之TCR之核酸(諸如DNA、cDNA或RNA)轉染T細胞之方法(參見例如Robbins等人, (2008) J Immunol. 180: 6116-6131)。表現本發明之TCR之T細胞將適用於基於授受性療法之癌症治療,該等癌症諸如胰臟癌及肝癌。如熟習此項技術者已知,存在可進行授受性療法之多種適合的方法(參見例如Rosenberg等人, (2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299-308)。
如此項技術中熟知,本發明之TCR在由經轉染細胞表現時可進行轉譯後修飾。醣化為一種該修飾,可包含寡醣部分與TCR鏈中之確定胺基酸之共價連接。舉例而言,天冬醯胺酸殘基或絲胺酸/蘇胺酸殘基為用於寡醣連接之熟知位置。特定蛋白質之醣化狀態視多種因素而定,該等因素包括蛋白質序列、蛋白質構形及某些酶之可用性。此外,醣化狀態(亦即寡醣類型、共價鍵聯及連接總數)可能會影響蛋白質功能。因此,當產生重組蛋白時,控制醣化常常為合乎需要的。經轉染TCR之醣化可藉由經轉染基因之突變加以控制(Kuball J等人(2009), J Exp Med 206(2):463-475)。該等突變亦涵蓋於本發明中。
TCR可對以下之群中之抗原具有特異性:MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-A13、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、BAGE-1、RAGE-1、LB33/MUM-1、PRAME、NAG、MAGE-Xp2 (MAGE-B2)、MAGE-Xp3 (MAGE-B3)、MAGE-Xp4 (AGE-B4)、酪胺酸酶、腦肝醣磷酸化酶、Melan-A、MAGE-C1、MAGE-C2、NY-ESO-1、LAGE-1、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1、CT-7、α-輔肌動蛋白-4、Bcr-Abl融合蛋白、Casp-8、β-連環蛋白、cdc27、cdk4、cdkn2a、coa-1、dek-can融合蛋白、EF2、ETV6-AML1融合蛋白、LDLR-海藻糖基轉移酶AS融合蛋白、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-2及Mum-3、neo-PAP、I類肌凝蛋白、OS-9、pml-RARa融合蛋白、PTPRK、K-ras、N-ras、丙糖磷酸異構體、GnTV、Herv-K-mel、Lage-1、Mage-C2、NA-88、Lage-2、SP17及TRP2-Int2、(MART-I)、gp100 (Pmel 17)、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、p15(58)、CEA、NY-ESO (LAGE)、SCP-1、Hom/Mel-40、p53、H-Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、艾司坦巴爾病毒(Epstein Barr virus)抗原、EBNA、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原E6及E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-連環蛋白、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、13HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3 (CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733 (EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB\170K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90 (Mac-2結合蛋白\親環素C相關蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP及TPS。
c. B細胞受體(BCR)
在一些實施例中,所提供之環狀RNA聚核苷酸編碼一或多種B細胞受體(BCR)。BCR (或B細胞抗原受體)為在B細胞表面上形成I型跨膜蛋白之免疫球蛋白分子。BCR能夠在辨識特異性抗原之後將活化信號傳輸至B細胞中。在B細胞與抗原結合之前,BCR將保持在未經刺激或「靜止」階段。抗原與BCR之結合引起信號傳導,從而引發體液免疫反應。
BCR由成熟B細胞表現。此等B細胞與免疫球蛋白(Ig)一起作用以辨識病原體且對其加標籤。典型BCR包含膜結合型免疫球蛋白(例如mIgA、mIgD、mIgE、mIgG及mIgM)以及相關及Igα/Igβ (CD79a/CD79b)異二聚體(α/β)。此等膜結合型免疫球蛋白為由兩個相同重鏈及兩個輕鏈組成之四聚體。在BCR內,膜結合型免疫球蛋白能夠藉由跨質膜之信號傳輸而響應於抗原結合,從而引起B細胞活化且因此引起純系擴增及特異性抗體產生(Friess M等人(2018), Front. Immunol. 2947(9))。Igα/Igβ異二聚體負責將信號轉導至細胞內部。
Igα/Igβ異二聚體信號傳導依賴於位於異二聚體之胞溶質尾中之各者上基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)之存在。ITAM包含藉由9-12個胺基酸(例如酪胺酸、白胺酸及/或纈胺酸)間隔開之兩個酪胺酸殘基。在抗原結合後,BCR之ITAM之酪胺酸藉由Src-家族酪胺酸激酶Blk、Fyn或Lyn變得磷酸化(Janeway C等人, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Science, 第5版2001))。
d. 其他嵌合蛋白
除上文所提供之嵌合蛋白以外,環狀RNA聚核苷酸可編碼此項技術中可用之各種數目之其他嵌合蛋白。嵌合蛋白可包括重組融合蛋白、嵌合突變蛋白或其他融合蛋白。
B.
免疫調節性配位體
在一些實施例中,環狀RNA聚核苷酸編碼免疫調節性配位體。在某些實施例中,免疫調節性配位體可為免疫刺激性的;而在其他實施例中,免疫調節性配位體可為免疫抑制性的。
a. 細胞介素:干擾素、趨化因子、介白素、生長因子及其他者
在一些實施例中,環狀RNA聚核苷酸編碼細胞介素。在一些實施例中,細胞介素包含趨化因子、干擾素、介白素、淋巴激素及腫瘤壞死因子。趨化因子為在急性發炎及慢性發炎中由各種細胞類型產生之移動且活化白血球之趨化性細胞介素。干擾素包含經由TLR刺激而響應於特異性胞外分子來誘導之一系列分泌α-螺旋細胞介素(Borden, Molecular Basis of Cancer (第四版) 2015)。介白素為由白血球表現之細胞介素。
IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-27β、IFNγ及/或TGFβ1之描述及/或胺基酸序列提供於本文中及以寄存編號:P60568 (IL-2)、P29459 (IL-12A)、P29460 (IL-12B)、P13232 (IL-7)、P22301 (IL-10)、P40933 (IL-15)、Q14116 (IL-18)、Q14213 (IL-27β)、P01579 (IFNγ)及/或P01137 (TGFβ1)提供於www.uniprot.org資料庫。
C.
轉錄因子
調控性T細胞(Treg)在維持恆定、控制發炎反應之幅度及持續時間及預防自體免疫反應及過敏反應中至關重要。
一般而言,認為Treg主要參與抑制免疫反應,部分充當針對免疫系統之「自檢查」以預防過度反應。特定言之,Treg參與維持對自身抗原、諸如花粉或食物之無害藥劑之耐受性及消除自體免疫疾病。
Treg存在於整個身體,包括但不限於腸道、皮膚、肺及肝中。另外,Treg細胞亦可存在於身體之某些區室中,不直接暴露於諸如脾、淋巴結及甚至脂肪組織之外部環境。此等Treg細胞群體中之各者已知或疑似具有一或多個獨特特點,且額外資訊可發現於Lehtimaki及Lahesmaa, Regulatory T cells control immune responses through their non-redundant tissue specific features, 2013, FRONTIERS IN IMMUNOL., 4(294): 1-10中,該文獻之揭示內容特此全部併入。
通常,已知Treg需要TGF-β及IL-2用於適當的活化及發育。表現充足量之IL-2受體(IL-2R)之Treg依賴於由經活化T細胞產生之IL-2。已知Treg產生IL-10及TGF-β,兩者均為強效的免疫抑制性細胞介素。另外,已知Treg抑制抗原呈現細胞(APC)刺激T細胞之能力。一個用於APC抑制之建議機制係經由經Foxp3+ Treg表現之CTLA-4。據認為,CTLA-4可結合至APC上之B7分子且阻斷此等分子或藉由引起內化而將其移除,從而導致B7之可用性降低且無法提供用於免疫反應之充分共刺激。關於Treg之起源、分化及功能之額外論述可發現於Dhamne等人, Peripheral and thymic Foxp3+ regulatory T cells in search of origin, distinction, and function, 2013, Frontiers in Immunol., 4 (253): 1-11中,該文獻之揭示內容特此全部併入。
D.
檢查點抑制劑及促效劑
如本文所提供,在某些實施例中,環狀RNA之編碼元件編碼一或多種檢查點抑制劑或促效劑。
在一些實施例中,免疫檢查點抑制劑為以下之抑制劑:計劃性死亡-配位體1 (PD-L1,亦稱為B7-H1、CD274)、計劃性死亡1 (PD-1)、CTLA-4、PD-L2 (B7-DC、CD273)、LAG3、TIM3、2B4、A2aR、B7H1、B7H3、B7H4、BTLA、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD80、CD86、CD137、CD160、CD226、CD276、DR3、GAL9、GITR、HAVCR2、HVEM、IDO1、IDO2、ICOS (誘導性T細胞共刺激因子)、KIR、LAIR1、LIGHT、MARCO (具有成膠結構之巨噬細胞受體)、PS (磷脂醯絲胺酸)、OX-40、SLAM、TIGHT、VISTA、VTCN1或其任何組合。在一些實施例中,免疫檢查點抑制劑為IDO1、CTLA4、PD-1、LAG3、PD-L1、TIM3或其組合之抑制劑。在一些實施例中,免疫檢查點抑制劑為PD-L1之抑制劑。在一些實施例中,免疫檢查點抑制劑為PD-1之抑制劑。在一些實施例中,免疫檢查點抑制劑為CTLA-4之抑制劑。在一些實施例中,免疫檢查點抑制劑為LAG3之抑制劑。在一些實施例中,免疫檢查點抑制劑為TIM3之抑制劑。在一些實施例中,免疫檢查點抑制劑為IDO1之抑制劑。
如本文所描述,至少在一個態樣中,本發明涵蓋免疫檢查點拮抗劑之使用。該等免疫檢查點拮抗劑包括諸如細胞毒性T淋巴球抗原4 (CTLA-4)、計劃性細胞死亡蛋白1 (PD-1)、計劃性死亡-配位體1 (PDL-1)、淋巴球活化基因3 (LAG-3)及T細胞免疫球蛋白及黏蛋白域3 (TIM-3)之免疫檢查點分子之拮抗劑。CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3或TIM-3之拮抗劑分別干擾CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3或TIM-3功能。該等CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3及TIM-3之拮抗劑可包括分別特異性結合至CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3及TIM-3且抑制及/或阻斷生物活性及功能之抗體。
E.
其他者
在一些實施例中,在編碼元件中之一或多者內經編碼之有效負載物為激素、FC融合蛋白、抗凝劑、凝血因子、與缺陷及遺傳病相關之蛋白質、伴護蛋白、抗微生物蛋白、酶(例如代謝酶)、結構蛋白(例如通道或核孔蛋白)、蛋白質變異體、小分子、抗體、奈米抗體、經工程改造之非身體抗體或其組合。
4. 額外輔助元件(序列元件)
如本發明中所描述,聚核苷酸(例如環狀RNA聚核苷酸、線性RNA聚核苷酸及/或DNA模板)可進一步包含輔助元件。在某些實施例中,此等輔助元件可包括於環狀RNA、線性RNA聚核苷酸及/或DNA模板之序列內以用於增強環化、轉譯或兩者。在某些實施例中,輔助元件為以特異性定位於各別聚核苷酸之增強型內含子元件、增強型外顯子元件或核心功能元件之間或之內的序列。舉例而言但不意欲為限制性的,輔助元件包括IRES異側作用因子區、miRNA結合位點、限制位點、RNA編輯區、結構元件或序列元件、顆粒位點、郵遞密碼元件、RNA運輸元件或如此項技術中發現之增強、促進環狀RNA聚核苷酸內經編碼之蛋白質之環化及/或轉譯的另一特殊序列。
A.
IRES 異側作用因子
在某些實施例中,輔助元件包含IRES異側作用因子(ITAF)區。在一些實施例中,IRES異側作用因子區經由結合至PCBP1-PCBP4 (聚C結合蛋白)、PABP1 (聚A結合蛋白)、PTB (聚嘧啶束結合蛋白)、阿爾戈瑙特蛋白家族、HNRNPK (異質核核糖核蛋白K蛋白)或La蛋白來調節轉譯起始。在一些實施例中,IRES異側作用因子區包含聚A、聚C、聚AC或聚嘧啶束。
在一些實施例中,ITAF區位於核心功能元件內。在一些實施例中,ITAF區位於TIE內。
B.
miRNA 結合位點
在某些實施例中,輔助元件包含miRNA結合位點。在一些實施例中,miRNA結合位點位於5'增強型內含子元件、5'增強型外顯子元件、核心功能元件、3'增強型外顯子元件及/或3'增強型內含子元件內。
在一些實施例中,其中miRNA結合位點位於增強型內含子元件或增強型外顯子元件內之間隔子內。在某些實施例中,miRNA結合位點包含總間隔子區。
在一些實施例中,5'增強型內含子元件及3'增強型內含子元件各自包含相同的miRNA結合位點。在另一實施例中,5'增強型內含子元件之miRNA結合位點包含與3'增強型內含子元件在核苷酸長度方面不同之miRNA結合位點。在一個實施例中,5'增強型外顯子元件及3'增強型外顯子元件包含相同的miRNA結合位點。在其他實施例中,5'增強型外顯子元件及3'增強型外顯子元件包含在核苷酸長度方面不同之miRNA結合位點。
在一些實施例中,miRNA結合位點彼此鄰近位於環狀RNA聚核苷酸、線性RNA聚核苷酸前驅體及/或DNA模板內。在某些實施例中,miRNA結合位點中之一者之第一核苷酸跟隨第二miRNA結合位點之最後一個核苷酸,亦即第一核苷酸。
在一些實施例中,miRNA結合位點位於核心功能元件之轉譯起始元件(TIE)內。在一個實施例中,miRNA結合位點位於內部核糖體進入位點(IRES)之前、尾隨其定位或位於其內。在另一實施例中,miRNA結合位點位於適體複合物之前、尾隨其定位或位於其內。
在環狀RNA分子內併入miRNA序列可准許編碼序列在核心功能元件內之組織特異性表現。舉例而言,在意欲在免疫細胞中表現蛋白質之環狀RNA中,可能需要在諸如肝或腎之組織中引起表現抑制之miRNA結合序列。該等miRNA結合序列可基於miRNA之細胞或組織表現進行選擇。
由miRNA命名法定義之獨特序列為廣泛已知的且可接近在微小RNA領域中工作之序列。舉例而言,其可見於miRDB公共資料庫中。
5. 聚核苷酸生產
本文所提供之DNA模板可使用分子生物學之標準技術製造。舉例而言,本文所提供之載體之各種元件可使用重組方法,諸如藉由自細胞篩檢cDNA及基因體庫或藉由自已知包括聚核苷酸之DNA模板衍生聚核苷酸來獲得。
本文所提供之DNA模板之各種元件亦可基於已知序列以合成方式產生而非選殖。完整序列可由重疊寡核苷酸裝配,該等寡核苷酸係藉由標準方法製備且裝配至完整序列中。參見例如Edge, Nature (1981) 292:756;Nambair等人, Science (1984) 223 : 1299;及Jay等人, J. Biol. Chem. (1984) 259:631 1。
因此,特定核苷酸序列可自具有所需序列之DNA模板獲得,或在適當時完全或部分使用諸如定點突變誘發及聚合酶鏈反應(PCR)技術之此項技術中已知之各種寡核苷酸合成技術來合成。一種獲得編碼所需DNA模板元件之核苷酸序列之方法係藉由使在習知自動化聚核苷酸合成器中產生之互補集合之重疊合成寡核苷酸黏合,接著與適當的DNA連接酶連接且經由PCR擴增已連接之核苷酸序列。參見例如Jayaraman等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:4084-4088。另外,可使用寡核苷酸定向合成(Jones等人, Nature (1986) 54:75-82)、預先存在之核苷酸區之寡核苷酸定向突變誘發(Riechmann等人, Nature (1988) 332:323-327及Verhoeyen等人, Science (1988) 239: 1534-1536)及使用T4 DNA聚合酶之有間隙寡核苷酸之酶填充(Queen等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 10029-10033)。
本文所提供之前驅體RNA可藉由在准許轉錄由DNA模板編碼之前驅體RNA之條件下培育本文所提供之DNA模板來產生。舉例而言,在一些實施例中,前驅體RNA係藉由在准許活體外轉錄之條件下將本文所提供之DNA模板與可相容RNA聚合酶一起培育來合成,該DNA模板包含在其5'雙螺旋體序列及/或表現序列上游之RNA聚合酶啟動子。在一些實施例中,DNA模板在細胞內部藉由噬菌體RNA聚合酶培育或在細胞核中藉由宿主RNA聚合酶II培育。
在某些實施例中,本文提供藉由使用本文所提供之DNA模板作為模板(例如本文所提供之具有位於5'雙螺旋體區上游之RNA聚合酶啟動子之載體)執行活體外轉錄來產生前驅體RNA的方法。
在某些實施例中,所得前驅體RNA可用於藉由在存在鎂離子及鳥苷核苷酸或核苷之情況下在發生RNA環化之溫度下(例如在20℃與60℃之間)對其進行培育來產生環狀RNA (例如本文所提供之環狀RNA聚核苷酸)。
因此,在某些實施例中,本文提供製造環狀RNA之方法。在某些實施例中,該方法包含藉由使用本文所提供之載體(例如5'增強型內含子元件、5'增強型外顯子元件、核心功能元件、3'增強型外顯子元件及3'增強型內含子元件)作為模板進行轉錄(例如失控轉錄(run-off transcription))合成前驅體RNA,且在存在二價陽離子(例如鎂離子)及GTP之情況下培育所得前驅體RNA以使得其環化以形成環狀RNA。在一些實施例中,本文所揭示之前驅體RNA能夠在不存在鎂離子及GTP之情況下及/或在不進行與鎂離子及GTP一起培育之步驟之情況下進行環化。已發現,環狀RNA具有相對於對應mRNA降低之免疫原性,此至少部分因為mRNA含有免疫原性5'帽。當自某些啟動子(例如T7啟動子)轉錄DNA載體以產生前驅體RNA時,應理解,前驅體RNA之5'端為G。為了降低含有低含量之污染物線性mRNA之環狀RNA組合物的免疫原性,可在轉錄期間提供相對於GTP過量之GMP以使得大部分轉錄物含有無法加帽之5' GMP。因此,在一些實施例中,轉錄係在存在過量GMP之情況下進行。在一些實施例中,進行轉錄,其中GMP濃度與GTP濃度之比率在約3:1至約15:1,例如約3:1至約10:1、約3:1至約5:1、約3:1、約4:1或約5:1範圍內。
在一些實施例中,包含環狀RNA之組合物已經純化。環狀RNA可藉由諸如管柱層析法、凝膠過濾層析法及粒徑排阻層析法之此項技術中常用之任何已知方法來純化。在一些實施例中,純化包含以下步驟中之一或多者:磷酸酶處理、HPLC粒徑排阻純化及核糖核酸酶R消化。在一些實施例中,純化按次序包含以下步驟:核糖核酸酶R消化、磷酸酶處理及HPLC粒徑排阻純化。在一些實施例中,純化包含逆相HPLC。在一些實施例中,經純化組合物含有比未經純化RNA少之雙股RNA、DNA夾板、三磷酸化RNA、磷酸酶蛋白、蛋白質連接酶、加帽酶及/或帶切口RNA。在一些實施例中,環狀RNA之純化包含本文所描述之親和純化或負向選擇方法。在一些實施例中,環狀RNA之純化包含使用與線性RNA中之序列互補、但不與環狀RNA中之序列互補的寡核苷酸將線性RNA與環狀RNA分離。在一些實施例中,經純化組合物之免疫原性低於未經純化組合物之免疫原性。在一些實施例中,暴露於經純化組合物之免疫細胞產生比暴露於未經純化組合物之免疫細胞少的TNFα、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ及/或例如IFN-β1之1型干擾素。
6. 轉移媒劑及其他遞送機制之概述
A.
可離子化脂質
在某些實施例中,本文揭示可用作轉移媒劑之組分以便於或增強環狀RNA至一或多個目標細胞之遞送及釋放(例如藉由滲透該等目標細胞之脂質膜或與其融合)的可離子化脂質。在某些實施例中,可離子化脂質包含一或多個可裂解官能基(例如二硫鍵),該一或多個可裂解官能基允許例如化合物之親水性官能頭基與親脂性官能尾基解離(例如在暴露於氧化、還原或酸性條件後),藉此便於一或多個目標細胞之脂質雙層中進行相變。
在一些實施例中,可離子化脂質為如國際專利申請案PCT/US2018/058555中所描述之脂質。
在一些實施例中,陽離子型脂質具有下式:
其中:
R
1與R
2相同或不同且獨立地為視情況經取代之C
10-C
24烷基、視情況經取代之C
10-C
24烯基、視情況經取代之C
10-C
24炔基或視情況經取代之C
10-C
24醯基;
R
3與R
4相同或不同且獨立地為視情況經取代之C
1-C
6烷基、視情況經取代之C
2-C
6烯基或視情況經取代之C
2-C
6炔基,或R
3及R
4可連接而形成視情況經取代之具有4至6個碳原子及1或2個選自氮及氧之雜原子的雜環;
R
5不存在或存在且當存在時為氫或C
1-C
6烷基;m、n及p相同或不同且獨立地為0或1,其限制條件為m、n及p不同時為0;q為0、1、2、3或4;且
Y與Z相同或不同且獨立地為O、S或NH。
在一個實施例中,R
1及R
2各自為亞麻油基,且胺基脂質為二亞麻油基胺基脂質。
在一個實施例中,胺基脂質為二亞麻油基胺基脂質。
在各種其他實施例中,陽離子型脂質具有以下結構:
或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體、前驅藥或立體異構體,其中:
R
1及R
2各自獨立地選自由H及C
1-C
3烷基組成之群;且
R
3及R
4各自獨立地為具有約10至約20個碳原子之烷基,其中R
3及R
4中之至少一者包含至少兩個不飽和位點。
在一些實施例中,R
3及R
4各自獨立地選自十二碳二烯基、十四碳二烯基、十六碳二烯基、亞麻油基及二十碳二烯基。在一實施例中,R
3及R
4兩者均為亞麻油基。在一些實施例中,R
3及/或R
4可包含至少三個不飽和位點(例如R
3及/或R
4可為例如十二碳三烯基、十四碳三烯基、十六碳三烯基、次亞麻基及二十碳三烯基)。
在一些實施例中,陽離子型脂質具有以下結構:
或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體、前驅藥或立體異構體,其中:
R
1及R
2各自獨立地選自H及C
1-C
3烷基;
R
3及R
4各自獨立地為具有約10至約20個碳原子之烷基,其中R
3及R
4中之至少一者包含至少兩個不飽和位點。
在一個實施例中,R
3與R
4相同,舉例而言,在一些實施例中,R
3及R
4兩者均為亞麻油基(C
18烷基)。在另一實施例中,R
3與R
4不同,舉例而言,在一些實施例中,R
3為十四碳三烯基(C
14烷基)且R
4為亞麻油基(C
18烷基)。在一較佳實施例中,(多種)本發明之陽離子型脂質為對稱的,亦即R
3與R
4相同。在另一較佳實施例中,R
3及R
4兩者均包含至少兩個不飽和位點。在一些實施例中,R
3及R
4各自獨立地選自十二碳二烯基、十四碳二烯基、十六碳二烯基、亞麻油基及二十碳二烯基。在一實施例中,R
3及R
4兩者均為亞麻油基。在一些實施例中,R
3及/或R
4包含至少三個不飽和位點且各自獨立地選自十二碳三烯基、十四碳三烯基、十六碳三烯基、次亞麻基及二十碳三烯基。
在各種實施例中,陽離子型脂質具有下式:
或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體、前驅藥或立體異構體,其中:
X
aa為具有式-NR
N-CR
1R
2-C(C=O)-之D-胺基酸殘基或L-胺基酸殘基、或肽或具有式-{NR
N-CR
1R
2-C(C=O)}
n-之胺基酸殘基之肽,其中n為2至20之整數;
R
1在各次出現時獨立地為非氫或經取代或未經取代之胺基酸側鏈;
R
2及R
N在各次出現時獨立地為氫、由碳、氧、氮、硫及氫原子或前述者之任何組合組成且具有1至20個碳原子之有機基團、C
(1-5)烷基、環烷基、環烷基烷基、C
(1-5)烯基、C
(1-5)炔基、C
(1-5)烷醯基、C
(1-5)烷醯基氧基、C
(1-5)烷氧基、C
(1-5)烷氧基-C
(1-5)烷基、C
(1-5)烷氧基-C
(1-5)烷氧基、C
(1-5)烷基-胺基-C
(1-5)烷基-、C
(1-5)二烷基-胺基-C
(1-5)烷基-、硝基-C
(1-5)烷基、氰基-C
(1-5)烷基、芳基-C
(1-5)烷基、4-聯苯-C
(1-5)烷基、羧基或羥基;
Z為-NH-、-O-、-S-、-CH
2S-、-CH
2S(O)-或由1-40個選自氫、碳、氧、氮及硫原子之原子組成之有機連接子(較佳地,Z為-NH-或-O-);
R
x及R
y獨立地為(i)衍生自例如磷脂、醣脂、三醯甘油、甘油磷脂、鞘脂、神經醯胺、神經鞘磷脂、腦苷脂或神經節苷脂之脂質(其可為天然存在的或合成的)之親脂性尾,其中尾視情況包括類固醇;(ii)選自氫、羥基、胺基及有機保護基之胺基酸端基;或(iii)經取代或未經取代之C
(3-22)烷基、C
(6-12)環烷基、C
(6-12)環烷基-C
(3-22)烷基、C
(3-22)烯基、C
(3-22)炔基、C
(3-22)烷氧基或C
(6-12)-烷氧基C
(3-22)烷基。
在一些實施例中,R
x及R
y中之一者為如上文所定義之親脂性尾且另一者為胺基酸端基。在一些實施例中,R
x及R
y兩者均為親脂性尾。
在一些實施例中,R
x及R
y中之至少一者間雜有一或多個生物可降解基團(例如-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-S-S-、-C(O)(NR
5)-、-N(R
5)C(O)-、-C(S)(NR
5)-、-N(R
5)C(O)-、-N(R
5)C(O)N(R
5)-、-OC(O)O-、-OSi(R
5)
2O-、-C(O)(CR
3R
4)C(O)O-、-OC(O)(CR
3R
4)C(O)-或
。
在一些實施例中,R
11為C
2-C
8烷基或烯基。
在一些實施例中,R
5在各次出現時獨立地為H或烷基。
在一些實施例中,R
3及R
4在各次出現時獨立地為H、鹵素、OH、烷基、烷氧基、-NH
2、烷胺基或二烷胺基;或R
3及R
4連同其直接連接之碳原子一起形成環烷基。在一些特定實施例中,R
3及R
4在各次出現時獨立地為H或C
1-C
4烷基。
在一些實施例中,R
x及R
y各自獨立地具有一或多個碳-碳雙鍵。
在一些實施例中,陽離子型脂質為以下中之一者:
,
或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體、前驅藥或立體異構體,其中:
R
1及R
2各自獨立地為烷基、烯基或炔基,其中之各者可視情況經取代;
R
3及R
4各自獨立地為C
1-C
6烷基,或R
3及R
4一起形成視情況經取代之雜環。
在一個實施例中,陽離子型脂質為DLin-K-DMA。在一個實施例中,陽離子型脂質為DLin-KC2-DMA (上文之DLin-K-DMA,其中n為2)。
在一個實施例中,陽離子型脂質具有以下結構:
,
或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體、前驅藥或立體異構體,其中:
R
1及R
2在各次出現時各自獨立地為視情況經取代之C
10-C
30烷基、視情況經取代之C
10-C
30烯基、視情況經取代之C
10-C
30炔基或視情況經取代之C
10-C
30醯基;
R
3為H、視情況經取代之C
2-C
10烷基、視情況經取代之C
2-C
10烯基、視情況經取代之C
2-C
10烷二基、烷基雜環、烷基磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、烷基二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、烷胺、羥烷基、ω-胺烷基、ω-(經取代)胺烷基、ω-磷烷基、ω-硫代磷烷基、視情況經取代之聚乙二醇(PEG,mw為100-40K)、視情況經取代之mPEG (mw為120-40K)、雜芳基或雜環或連接子配位體,舉例而言,在一些實施例中,R
3為(CH
3)
2N(CH
2)
n-,其中n為1、2、3或4;
E為O、S、N(Q)、C(O)、OC(O)、C(O)O、N(Q)C(O)、C(O)N(Q)、(Q)N(CO)O、O(CO)N(Q)、S(O)、NS(O)
2N(Q)、S(O)
2、N(Q)S(O)
2、SS、O═N、芳基、雜芳基、環狀基或雜環,例如-C(O)O,其中-為與R
3之連接點,且
Q為H、烷基、ω-胺烷基、ω-(經取代)胺烷基、ω-磷烷基或ω-硫代磷烷基。
在一個特定實施例中,如實施例1、2、3、4或5之陽離子型脂質具有以下結構:
或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體、前驅藥或立體異構體,其中:
E為O、S、N(Q)、C(O)、N(Q)C(O)、C(O)N(Q)、(Q)N(CO)O、O(CO)N(Q)、S(O)、NS(O)
2N(Q)、S(O)
2、N(Q)S(O)
2、SS、O═N、芳基、雜芳基、環狀基或雜環;
Q為H、烷基、ω-胺烷基、ω-(經取代)胺烷基、ω-磷烷基或ω-硫代磷烷基;
R
1及R
2及R
x在各次出現時各自獨立地為H、視情況經取代之C
1-C
10烷基、視情況經取代之C
10-C
30烷基、視情況經取代之C
10-C
30烯基、視情況經取代之C
10-C
30炔基、視情況經取代之C
10-C
30醯基或連接子-配位體,其限制條件為R
1、R
2及R
x中之至少一者不為H;
R
3為H、視情況經取代之C
1-C
10烷基、視情況經取代之C
2-C
10烯基、視情況經取代之C
2-C
10炔基、烷基雜環、烷基磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、烷基二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、烷胺、羥烷基、ω-胺烷基、ω-(經取代)胺烷基、ω-磷烷基、ω-硫代磷烷基、視情況經取代之聚乙二醇(PEG,mw為100-40K)、視情況經取代之mPEG (mw為120-40K)、雜芳基或雜環或連接子配位體;且
n為0、1、2或3。
在一個實施例中,如實施例1、2、3、4或5之陽離子型脂質具有式I結構:
或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體、前驅藥或立體異構體,其中:
L
1或L
2中之一者為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)
X-、-S-S-、-C(=O)S-、SC(=O)-、-NR
aC(=O)-、-C(=O)NR
a-、NR
aC(=O)NR
a-、-OC(=O)NR
a-或-NR
aC(=O)O-,且L
1或L
2中之另一者為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)
X-、-S-S-、-C(=O)S-、SC(=O)-、-NR
aC(=O)-、-C(=O)NR
a-、NR
aC(=O)NR
a-、-OC(=O)NR
a-或-NR
aC(=O)O-或直接鍵;
R
a為H或C
1-C
12烷基;
R
1a及R
1b在各次出現時獨立地為(a) H或C
1-C
12烷基;或(b) R
1a為H或C
1-C
12烷基,且R
1b連同其所結合之碳原子與鄰接R
1b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵;
R
2a及R
2b在各次出現時獨立地為(a) H或C
1-C
12烷基,或(b) R
2a為H或C
1-C
12烷基,且R
2b連同其所結合之碳原子與鄰接R
2b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵;
R
3a及R
3b在各次出現時獨立地為(a) H或C
1-C
12烷基,或(b) R
3a為H或C
1-C
12烷基,且R
3b連同其所結合之碳原子與鄰接R
3b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵;
R
4a及R
4b在各次出現時獨立地為(a) H或C
1-C
12烷基,或(b) R
4a為H或C
1-C
12烷基,且R
4b連同其所結合之碳原子與鄰接R
4b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵;
R
5及R
6各自獨立地為甲基或環烷基;
R
7在各次出現時獨立地為H或C
1-C
12烷基;
R
8及R
9各自獨立地為未經取代之C
1-C
12烷基;或R
8及R
9連同其所連接之氮原子一起形成包含一個氮原子之5員、6員或7員雜環;
a及d各自獨立地為0至24之整數;
b及c各自獨立地為1至24之整數;
e為1或2;且
x為0、1或2。
在式I之一些實施例中,L
1及L
2獨立地為-O(C=O)-或-(C=O)O-。
在式I之某些實施例中,R
1a、R
2a、R
3a或R
4a中之至少一者為C
1-C
12烷基,或L
1或L
2中之至少一者為-O(C=O)-或-(C=O)O-。在其他實施例中,R
1a及R
1b在a為6時不為異丙基或在a為8時不為正丁基。
在式I之再另外實施例中,R
1a、R
2a、R
3a或R
4a中之至少一者為C
1-C
12烷基,或L
1或L
2中之至少一者為-O(C=O)-或-(C=O)O-;且
R
1a及R
1b在a為6時不為異丙基或在a為8時不為正丁基。
在式I之其他實施例中,R
8及R
9各自獨立地為未經取代之C
1-C
12烷基;或R
8及R
9連同其所連接之氮原子一起形成包含一個氮原子之5員、6員或7員雜環。
在式I之某些實施例中,L
1或L
2中之任一者可為-O(C=O)-或碳-碳雙鍵。L
1及L
2可各自為-O(C=O)-或可各自為碳-碳雙鍵。
在式I之一些實施例中,L
1或L
2中之一者為-O(C=O)-。在其他實施例中,L
1及L
2兩者均為-O(C=O)-。
在式I之一些實施例中,L
1或L
2中之一者為-(C=O)O-。在其他實施例中,L
1及L
2兩者均為-(C=O)O-。
在式I之一些其他實施例中,L
1或L
2中之一者為碳-碳雙鍵。在其他實施例中,L
1及L
2兩者均為碳-碳雙鍵。
在式I之再其他實施例中,L
1或L
2中之一者為-O(C=O)-且L
1或L
2中之另一者為-(C=O)O-。在更多實施例中,L
1或L
2中之一者為-O(C=O)-且L
1或L
2中之另一者為碳-碳雙鍵。在又更多實施例中,L
1或L
2中之一者為-(C=O)O-且L
1或L
2中之另一者為碳-碳雙鍵。
應理解,如整個本說明書中所使用,「碳-碳」雙鍵係指以下結構中之一者:
其中R
a及R
b在各次出現時獨立地為H或取代基。舉例而言,在一些實施例中,R
a及R
b在各次出現時獨立地為H、C
1-C
12烷基或環烷基,例如H或C
1-C
12烷基。
在其他實施例中,式I脂質化合物具有下式(Ia):
。
在其他實施例中,式I脂質化合物具有下式(Ib):
。
在又其他實施例中,式I脂質化合物具有下式(Ic):
。
在式I脂質化合物之某些實施例中,a、b、c及d各自獨立地為2至12之整數或4至12之整數。在其他實施例中,a、b、c及d各自獨立地為8至12或5至9之整數。在一些某些實施例中,a為0。在一些實施例中,a為1。在其他實施例中,a為2。在更多實施例中,a為3。在又其他實施例中,a為4。在一些實施例中,a為5。在其他實施例中,a為6。在更多實施例中,a為7。在又其他實施例中,a為8。在一些實施例中,a為9。在其他實施例中,a為10。在更多實施例中,a為11。在又其他實施例中,a為12。在一些實施例中,a為13。在其他實施例中,a為14。在更多實施例中,a為15。在又其他實施例中,a為16。
在式I之一些其他實施例中,b為1。在其他實施例中,b為2。在更多實施例中,b為3。在又其他實施例中,b為4。在一些實施例中,b為5。在其他實施例中,b為6。在更多實施例中,b為7。在又其他實施例中,b為8。在一些實施例中,b為9。在其他實施例中,b為10。在更多實施例中,b為11。在又其他實施例中,b為12。在一些實施例中,b為13。在其他實施例中,b為14。在更多實施例中,b為15。在又其他實施例中,b為16。
在式I之一些更多實施例中,c為1。在其他實施例中,c為2。在更多實施例中,c為3。在又其他實施例中,c為4。在一些實施例中,c為5。在其他實施例中,c為6。在更多實施例中,c為7。在又其他實施例中,c為8。在一些實施例中,c為9。在其他實施例中,c為10。在更多實施例中,c為11。在又其他實施例中,c為12。在一些實施例中,c為13。在其他實施例中,c為14。在更多實施例中,c為15。在又其他實施例中,c為16。
在式I之一些某些其他實施例中,d為0。在一些實施例中,d為1。在其他實施例中,d為2。在更多實施例中,d為3。在又其他實施例中,d為4。在一些實施例中,d為5。在其他實施例中,d為6。在更多實施例中,d為7。在又其他實施例中,d為8。在一些實施例中,d為9。在其他實施例中,d為10。在更多實施例中,d為11。在又其他實施例中,d為12。在一些實施例中,d為13。在其他實施例中,d為14。在更多實施例中,d為15。在又其他實施例中,d為16。
在式I之一些其他各種實施例中,a與d相同。在一些其他實施例中,b與c相同。在一些其他特定實施例中,a與d相同且b與c相同。
式I中a與b之總和及c與d之總和為可變化以獲得具有所需特性之式I脂質的因素。在一個實施例中,a及b經選擇以使得其總和為在14至24範圍內之整數。在其他實施例中,c及d經選擇以使得其總和為在14至24範圍內之整數。在另一實施例中,a與b之總和同c與d之總和相同。舉例而言,在一些實施例中,a與b之總和及c與d之總和兩者均為可在14至24範圍內之相同整數。在再更多實施例中,a、b、c及d經選擇以使得a與b之總和及c與d之總和為12或更大。
在式I之一些實施例中,e為1。在其他實施例中,e為2。
式I之R
1a、R
2a、R
3a及R
4a處之取代基不受特定限制。在某些實施例中,R
1a、R
2a、R
3a及R
4a在各次出現時為H。在某些其他實施例中,R
1a、R
2a、R
3a及R
4a中之至少一者為C
1-C
12烷基。在某些其他實施例中,R
1a、R
2a、R
3a及R
4a中之至少一者為C
1-C
8烷基。在某些其他實施例中,R
1a、R
2a、R
3a及R
4a中之至少一者為C
1-C
6烷基。在一些前述實施例中,C
1-C
8烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、三級丁基、正己基或正辛基。
在式I之某些實施例中,R
1a、R
1b、R
4a及R
4b在各次出現時為C
1-C
12烷基。
在式I之另外實施例中,R
1b、R
2b、R
3b及R
4b中之至少一者為H,或R
1b、R
2b、R
3b及R
4b在各次出現時為H。
在式I之某些實施例中,R
1b連同其所結合之碳原子與鄰接R
1b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。在前述者之其他實施例中,R
4b連同其所結合之碳原子與鄰接R
4b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。
在前述實施例中,式I之R
5及R
6處之取代基不受特定限制。在某些實施例中,R
5或R
6中之一或兩者為甲基。在某些其他實施例中,R
5或R
6中之一或兩者為環烷基,例如環己基。在此等實施例中,環烷基可經取代或未經取代。在某些其他實施例中,環烷基經C
1-C
12烷基,例如三級丁基取代。
在式I之前述實施例中,R
7處之取代基不受特定限制。在某些實施例中,至少一個R
7為H。在一些其他實施例中,R
7在各次出現時為H。在某些其他實施例中,R
7為C
1-C
12烷基。
在式I之某些其他前述實施例中,R
8或R
9中之一者為甲基。在其他實施例中,R
8及R
9兩者均為甲基。
在式I之一些不同實施例中,R
8及R
9連同其所連接之氮原子一起形成5員、6員或7員雜環。在前述者之一些實施例中,R
8及R
9連同其所連接之氮原子一起形成5員雜環,例如吡咯啶基環。
在實施例3之一些實施例中,第一陽離子型脂質及第二陽離子型脂質各自獨立地選自式I脂質。
在各種不同實施例中,式I脂質具有下表1中所闡述之結構中之一者。
表 1 :代表性式I脂質
在一些實施例中,如實施例1、2、3、4或5之陽離子型脂質具有式II結構:
或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體、前驅藥或立體異構體,其中:
L
1或L
2中之一者為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)
X-、-S-S-、-C(=O)S-、SC(=O)-、-NR
aC(=O)-、-C(=O)NR
a-、NR
aC(=O)NR
a-、-OC(=O)NR
a-或-NR
aC(=O)O-,且L
1或L
2中之另一者為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)
X-、-S-S-、-C(=O)S-、SC(=O)-、-NR
aC(=O)-、-C(=O)NR
a-、NR
aC(=O)NR
a-、-OC(=O)NR
a-或-NR
aC(=O)O-或直接鍵;
G
1為C
1-C
2伸烷基、-(C=O)-、-O(C=O)-、-SC(=O)-、-NR
aC(=O)-或直接鍵;
G
2為-C(=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)S-、-C(=O)NR
a-或直接鍵;
G
3為C
1-C
6伸烷基;
R
a為H或C
1-C
12烷基;
R
1a及R
1b在各次出現時獨立地為:(a) H或C
1-C
12烷基;或(b) R
1a為H或C
1-C
12烷基,且R
1b連同其所結合之碳原子與鄰接R
1b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵;
R
2a及R
2b在各次出現時獨立地為:(a) H或C
1-C
12烷基;或(b) R
2a為H或C
1-
12烷基,且R
2b連同其所結合之碳原子與鄰接R
2b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵;
R
3a及R
3b在各次出現時獨立地為:(a) H或C
1-C
12烷基;或(b) R
3a為H或C
1-C
12烷基,且R
3b連同其所結合之碳原子與鄰接R
3b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵;
R
4a及R
4b在各次出現時獨立地為:(a) H或C
1-C
12烷基;或(b) R
4a為H或C
1-C
12烷基,且R
4b連同其所結合之碳原子與鄰接R
4b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵;
R
5及R
6各自獨立地為H或甲基;
R
7為C
4-C
20烷基;
R
8及R
9各自獨立地為C
1-C
12烷基,或R
8及R
9連同其所連接之氮原子一起形成5員、6員或7員雜環,
a、b、c及d各自獨立地為1至24之整數;且
x為0、1或2。
在式(II)之一些實施例中,L
1及L
2各自獨立地為-O(C=O)-、-(C=O)O-或直接鍵。在其他實施例中,G
1及G
2各自獨立地為-(C=O)-或直接鍵。在一些不同實施例中,L
1及L
2各自獨立地為-O(C=O)-、-(C=O)O-或直接鍵;且G
1及G
2各自獨立地為-(C=O)-或直接鍵。
在式(II)之一些不同實施例中,L
1及L
2各自獨立地為-C(=O)-、-O-、-S(O)
X-、-S-S-、-C(=O)S-、-SC(=O)-、-NR
a-、-NR
aC(=O)-、-C(=O)NR
a-、-NR
aC(=O)NR
a、-OC(=O)NR
a-、-NR
aC(=O)O-、-NR
aS(O)
xNR
a-、-NR
aS(O)
x-或-S(O)
xNR
a-。
在式(II)之其他前述實施例中,脂質化合物具有下式(IIA)或(IIB)中之一者:
。
在式(II)之一些實施例中,脂質化合物具有式(IIA)。在其他實施例中,脂質化合物具有式(IIB)。
在式(II)之前述實施例中之任一者中,L
1或L
2中之一者為-O(C=O)-。舉例而言,在一些實施例中,L
1及L
2中之各者為-O(C=O)-。
在式(II)之一些不同實施例中,L
1或L
2中之一者為-(C=O)O-。舉例而言,在一些實施例中,L
1及L
2中之各者為-(C=O)O-。
在式(II)之不同實施例中,L
1或L
2中之一者為直接鍵。如本文所使用之「直接鍵(direct bond)」意謂基團(例如L
1或L
2)不存在。舉例而言,在一些實施例中,L
1及L
2中之各者為直接鍵。
在式(II)之其他不同實施例中,對於R
1a及R
1b之至少一次出現,R
1a為H或C
1-C
12烷基,且R
1b連同其所結合之碳原子與鄰接R
1b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。
在式(II)之再其他不同實施例中,對於R
4a及R
4b之至少一次出現,R
4a為H或C
1-C
12烷基,且R
4b連同其所結合之碳原子與鄰接R
4b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。
在式(II)之更多實施例中,對於R
2a及R
2b之至少一次出現,R
2a為H或C
1-C
12烷基,且R
2b連同其所結合之碳原子與鄰接R
2b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。
在式(II)之其他不同實施例中,對於R
3a及R
3b之至少一次出現,R
3a為H或C
1-C
12烷基,且R
3b連同其所結合之碳原子與鄰接R
3b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。
在式(II)之各種其他實施例中,脂質化合物具有下式(IIC)或(IID)中之一者:
或
其中e、f、g及h各自獨立地為1至12之整數。
在式(II)之一些實施例中,脂質化合物具有式(IIC)。在其他實施例中,脂質化合物具有式(IID)。
在式(IIC)或(IID)之各種實施例中,e、f、g及h各自獨立地為4至10之整數。
在式(II)之某些實施例中,a、b、c及d各自獨立地為2至12之整數或4至12之整數。在其他實施例中,a、b、c及d各自獨立地為8至12或5至9之整數。在一些某些實施例中,a為0。在一些實施例中,a為1。在其他實施例中,a為2。在更多實施例中,a為3。在又其他實施例中,a為4。在一些實施例中,a為5。在其他實施例中,a為6。在更多實施例中,a為7。在又其他實施例中,a為8。在一些實施例中,a為9。在其他實施例中,a為10。在更多實施例中,a為11。在又其他實施例中,a為12。在一些實施例中,a為13。在其他實施例中,a為14。在更多實施例中,a為15。在又其他實施例中,a為16。
在式(II)之一些實施例中,b為1。在其他實施例中,b為2。在更多實施例中,b為3。在又其他實施例中,b為4。在一些實施例中,b為5。在其他實施例中,b為6。在更多實施例中,b為7。在又其他實施例中,b為8。在一些實施例中,b為9。在其他實施例中,b為10。在更多實施例中,b為11。在又其他實施例中,b為12。在一些實施例中,b為13。在其他實施例中,b為14。在更多實施例中,b為15。在又其他實施例中,b為16。
在式(II)之一些實施例中,c為1。在其他實施例中,c為2。在更多實施例中,c為3。在又其他實施例中,c為4。在一些實施例中,c為5。在其他實施例中,c為6。在更多實施例中,c為7。在又其他實施例中,c為8。在一些實施例中,c為9。在其他實施例中,c為10。在更多實施例中,c為11。在又其他實施例中,c為12。在一些實施例中,c為13。在其他實施例中,c為14。在更多實施例中,c為15。在又其他實施例中,c為16。
在式(II)之一些某些實施例中,d為0。在一些實施例中,d為1。在其他實施例中,d為2。在更多實施例中,d為3。在又其他實施例中,d為4。在一些實施例中,d為5。在其他實施例中,d為6。在更多實施例中,d為7。在又其他實施例中,d為8。在一些實施例中,d為9。在其他實施例中,d為10。在更多實施例中,d為11。在又其他實施例中,d為12。在一些實施例中,d為13。在其他實施例中,d為14。在更多實施例中,d為15。在又其他實施例中,d為16。
在式(II)之一些實施例中,e為1。在其他實施例中,e為2。在更多實施例中,e為3。在又其他實施例中,e為4。在一些實施例中,e為5。在其他實施例中,e為6。在更多實施例中,e為7。在又其他實施例中,e為8。在一些實施例中,e為9。在其他實施例中,e為10。在更多實施例中,e為11。在又其他實施例中,e為12。
在式(II)之一些實施例中,f為1。在其他實施例中,f為2。在更多實施例中,f為3。在又其他實施例中,f為4。在一些實施例中,f為5。在其他實施例中,f為6。在更多實施例中,f為7。在又其他實施例中,f為8。在一些實施例中,f為9。在其他實施例中,f為10。在更多實施例中,f為11。在又其他實施例中,f為12。
在式(II)之一些實施例中,g為1。在其他實施例中,g為2。在更多實施例中,g為3。在又其他實施例中,g為4。在一些實施例中,g為5。在其他實施例中,g為6。在更多實施例中,g為7。在又其他實施例中,g為8。在一些實施例中,g為9。在其他實施例中,g為10。在更多實施例中,g為11。在又其他實施例中,g為12。
在式(II)之一些實施例中,h為1。在其他實施例中,h為2。在更多實施例中,h為3。在又其他實施例中,h為4。在一些實施例中,h為5。在其他實施例中,h為6。在更多實施例中,h為7。在又其他實施例中,h為8。在一些實施例中,h為9。在其他實施例中,h為10。在更多實施例中,h為11。在又其他實施例中,h為12。
在式(II)之一些其他各種實施例中,a與d相同。在一些其他實施例中,b與c相同。在一些其他特定實施例中,且a與d相同且b與c相同。
式(II)中a與b之總和及c與d之總和為可變化以獲得具有所需特性之脂質的因素。在一個實施例中,a及b經選擇以使得其總和為在14至24範圍內之整數。在其他實施例中,c及d經選擇以使得其總和為在14至24範圍內之整數。在另一實施例中,a與b之總和同c與d之總和相同。舉例而言,在一些實施例中,a與b之總和及c與d之總和兩者均為可在14至24範圍內之相同整數。在再更多實施例中,a、b、c及d經選擇以使得a與b之總和及c與d之總和為12或更大。
式(II)之R
1a、R
2a、R
3a及R
4a處之取代基不受特定限制。在一些實施例中,R
1a、R
2a、R
3a及R
4a中之至少一者為H。在某些實施例中,R
1a、R
2a、R
3a及R
4a在各次出現時為H。在某些其他實施例中,R
1a、R
2a、R
3a及R
4a中之至少一者為C
1-C
12烷基。在某些其他實施例中,R
1a、R
2a、R
3a及R
4a中之至少一者為C
1-C
8烷基。在某些其他實施例中,R
1a、R
2a、R
3a及R
4a中之至少一者為C
1-C
6烷基。在一些前述實施例中,C
1-C
8烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、三級丁基、正己基或正辛基。
在式(II)之某些實施例中,R
1a、R
1b、R
4a及R
4b在各次出現時為C
1-C
12烷基。
在式(II)之另外實施例中,R
1b、R
2b、R
3b及R
4b中之至少一者為H,或R
1b、R
2b、R
3b及R
4b在各次出現時為H。
在式(II)之某些實施例中,R
1b連同其所結合之碳原子與鄰接R
1b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。在前述者之其他實施例中,R
4b連同其所結合之碳原子與鄰接R
4b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。
在前述實施例中,式(II)之R
5及R
6處之取代基不受特定限制。在某些實施例中,R
5或R
6中之一者為甲基。在其他實施例中,R
5或R
6中之各者為甲基。
在前述實施例中,式(II)之R
7處之取代基不受特定限制。在某些實施例中,R
7為C
6-C
16烷基。在一些其他實施例中,R
7為C
6-C
9烷基。在一些此等實施例中,R
7經-(C=O)OR
b、-O(C=O)R
b、-C(=O)R
b、-OR
b、-S(O)
xR
b、-S-SR
b、-C(=O)SR
b、-SC(=O)R
b、-NR
aR
b、-NR
aC(=O)R
b、-C(=O)NR
aR
b、-NR
aC(=O)NR
aR
b、-OC(=O)NR
aR
b、-NR
aC(=O)OR
b、-NR
aS(O)
xNR
aR
b、-NR
aS(O)
xR
b或-S(O)
xNR
aR
b取代,其中:R
a為H或C
1-C
12烷基;R
b為C
1-C
15烷基;且x為0、1或2。舉例而言,在一些實施例中,R
7經-(C=O)OR
b或-O(C=O)R
b取代。
在式(II)之一些前述實施例中,R
b為分支鏈C
1-C
16烷基。舉例而言,在一些實施例中,R
b具有以下結構中之一者:
。
在式(II)之某些其他前述實施例中,R
8或R
9中之一者為甲基。在其他實施例中,R
8及R
9兩者均為甲基。
在式(II)之一些不同實施例中,R
8及R
9連同其所連接之氮原子一起形成5員、6員或7員雜環。在前述者之一些實施例中,R
8及R
9連同其所連接之氮原子一起形成5員雜環,例如吡咯啶基環。在前述者之一些不同實施例中,R
8及R
9連同其所連接之氮原子一起形成6員雜環,例如哌𠯤基環。
在實施例3之某些實施例中,第一陽離子型脂質及第二陽離子型脂質各自獨立地選自式II脂質。
在前述式(II)脂質之再其他實施例中,G
3為C
2-C
4伸烷基,例如C
3伸烷基。在各種不同實施例中,脂質化合物具有下表2中所闡述之結構中之一者。
表 2 :代表性式(II)脂質
在一些其他實施例中,如實施例1、2、3、4或5之陽離子型脂質具有式III結構:
或其醫藥學上可接受之鹽、前驅藥或立體異構體,其中:
L
1或L
2中之一者為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)
X-、-S-S-、-C(=O)S-、SC(=O)-、-NR
aC(=O)-、-C(-O)NR
a-、NR
aC(=O)NR
a-、-OC(=O)NR
a-或-NR
aC(=O)O-,且L
1或L
2中之另一者為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)
X-、-S-S-、-C(=O)S-、SC(=O)-、-NR
aC(=O)-、-C(=O)NR
a-、NR
aC(=O)NR
a-、-OC(=O)NR
a-或-NR
aC(=O)O-或直接鍵;
G
1及G
2各自獨立地為未經取代之C
1-C
12伸烷基或C
1-C
12伸烯基;
G
3為C
1-C
24伸烷基、C
1-C
24伸烯基、C
3-C
8伸環烷基、C
3-C
8伸環烯基;
R
a為H或C
1-C
12烷基;
R
1及R
2各自獨立地為C
6-C
24烷基或C
6-C
24烯基;
R
3為H、OR
5、CN、-C(=O)OR
4、-OC(=O)R
4或-NR
5C(=O)R
4;
R
4為C
1-C
12烷基;
R
5為H或C
1-C
6烷基;且
x為0、1或2。
在式(III)之一些前述實施例中,脂質具有下式(IIIA)或(IIIB)中之一者:
其中:
A為3至8員環烷基或伸環烷基環,
R
6在各次出現時獨立地為H、OH或C
1-C
24烷基;
n為在1至15範圍內之整數。
在式(III)之一些前述實施例中,脂質具有式(IIIA),且在其他實施例中,脂質具有式(IIIB)。
在式(III)之其他實施例中,脂質具有下式(IIIC)或(IIID)中之一者:
其中y及z各自獨立地為在1至12範圍內之整數。
在式(III)之前述實施例中之任一者中,L
1或L
2中之一者為-O(C=O)-。舉例而言,在一些實施例中,L
1及L
2中之各者為-O(C=O)-。在前述任一者之一些不同實施例中,L
1及L
2各自獨立地為-(C=O)O-或-O(C=O)-。舉例而言,在一些實施例中,L
1及L
2中之各者為-(C=O)O-。
在式(III)之一些不同實施例中,脂質具有下式(IIIE)或(IIIF)中之一者:
。
在式(III)之一些前述實施例中,脂質具有下式(IIIG)、(IIIH)、(IIII)或(IIIJ)中之一者:
。
在式(III)之一些前述實施例中,n為在2至12,例如2至8或2至4範圍內之整數。舉例而言,在一些實施例中,n為3、4、5或6。在一些實施例中,n為3。在一些實施例中,n為4。在一些實施例中,n為5。在一些實施例中,n為6。
在式(III)之一些其他前述實施例中,y及z各自獨立地為在2至10範圍內之整數。舉例而言,在一些實施例中,y及z各自獨立地為在4至9或4至6範圍內之整數。
在式(III)之一些前述實施例中,R
6為H。在其他前述實施例中,R
6為C
1-C
24烷基。在其他實施例中,R
6為OH。
在式(III)之一些實施例中,G
3未經取代。在其他實施例中,G
3經取代。在各種不同實施例中,G
3為直鏈C
1-C
24伸烷基或直鏈C
1-C
24伸烯基。
在式(III)之一些其他前述實施例中,R
1或R
2或兩者為C
6-C
24烯基。舉例而言,在一些實施例中,R
1及R
2各自獨立地具有以下結構:
,
其中:
R
7a及R
7b在各次出現時獨立地為H或C
1-C
12烷基;且
a為2至12之整數,
其中R
7a、R
7b及a各自經選擇以使得R
1及R
2各自獨立地包含6至20個碳原子。舉例而言,在一些實施例中,a為在5至9或8至12範圍內之整數。
在式(III)之一些前述實施例中,R
7a在至少一次出現時為H。舉例而言,在一些實施例中,R
7a在各次出現時為H。在前述者之其他不同實施例中,R
7b在至少一次出現時為C
1-C
8烷基。舉例而言,在一些實施例中,C
1-C
8烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、三級丁基、正己基或正辛基。
在式(III)之不同實施例中,R
1或R
2或兩者具有以下結構中之一者:
。
在式(III)之一些前述實施例中,R
3為OH、CN、-C(=O)OR
4、-OC(=O)R
4或-NHC(=O)R
4。在一些實施例中,R
4為甲基或乙基。
在實施例3之一些特定實施例中,第一陽離子型脂質及第二陽離子型脂質各自獨立地選自式III脂質。
在各種不同實施例中,式(III)之所揭示實施例中之任一者之陽離子型脂質(例如陽離子型脂質、第一陽離子型脂質、第二陽離子型脂質)具有下表3中所闡述之結構中之一者。
表 3 : 代表性式 (III) 化合物 在一個實施例中,如實施例1、2、3、4或5中任一例之陽離子型脂質具有式(IV)結構:
或其醫藥學上可接受之鹽、前驅藥或立體異構體,其中:
G
1或G
2中之一者在各次出現時為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)
y-、-S-S-、-C(=O)S-、SC(=O)-、-N(R
a)C(=O)-、-C(=O)N(R
a)-、-N(R
a)C(=O)N(R
a)-、-OC(=O)N(R
a)-或-N(R
a)C(=O)O-,且G
1或G
2中之另一者在各次出現時為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)
y-、-S-S-、-C(=O)S-、-SC(=O)-、-N(R
a)C(=O)-、-C(=O)N(R
a)-、-N(R
a)C(=O)N(R
a)-、-OC(=O)N(R
a)-或-N(R
a)C(=O)O-或直接鍵;
L在各次出現時為~O(C=O)-,其中~表示與X之共價鍵;
X為CR
a;
當n為1時,Z為烷基、環烷基或包含至少一個極性官能基之單價部分;或當n大於1時,Z為伸烷基、伸環烷基或包含至少一個極性官能基之多價部分;
R
a在各次出現時獨立地為H、C
1-C
12烷基、C
1-C
12羥烷基、C
1-C
12胺烷基、C
1-C
12烷胺基烷基、C
1-C
12烷氧基烷基、C
1-C
12烷氧基羰基、C
1-C
12烷基羰氧基、C
1-C
12烷基羰氧基烷基或C
1-C
12烷基羰基;
R在各次出現時獨立地為:(a) H或C
1-C
12烷基;或(b) R連同其所結合之碳原子與鄰接R及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵;
R
1及R
2在各次出現時分別具有以下結構:
;
a
1及a
2在各次出現時獨立地為3至12之整數;
b
1及b
2在各次出現時獨立地為0或1;
c
1及c
2在各次出現時獨立地為5至10之整數;
d
1及d
2在各次出現時獨立地為5至10之整數;y在各次出現時獨立地為0至2之整數;且
n為1至6之整數,
其中各烷基、伸烷基、羥烷基、胺烷基、烷胺基烷基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷基羰氧基、烷基羰氧基烷基及烷基羰基視情況經一或多個取代基取代。
在式(IV)之一些實施例中,G
1及G
2各自獨立地為-O(C=O)-或-(C=O)O-。
在式(IV)之其他實施例中,X為CH。
在式(IV)之不同實施例中,a
1+ b
1+ c
1之總和或a
2+ b
2+ c
2之總和為12至26之整數。
在式(IV)之再其他實施例中,a
1及a
2獨立地為3至10之整數。舉例而言,在一些實施例中,a
1及a
2獨立地為4至9之整數。
在式(IV)之各種實施例中,b
1及b
2為0。在不同實施例中,b
1及b
2為1。
在式(IV)之更多實施例中,c
1、c
2、d
1及d
2獨立地為6至8之整數。
在式(IV)之其他實施例中,c
1及c
2在各次出現時獨立地為6至10之整數,且d
1及d
2在各次出現時獨立地為6至10之整數。
在式(IV)之其他實施例中,c
1及c
2在各次出現時獨立地為5至9之整數,且d
1及d
2在各次出現時獨立地為5至9之整數。
在式(IV)之更多實施例中,當n為1時,Z為烷基、環烷基或包含至少一個極性官能基之單價部分。在其他實施例中,Z為烷基。
在前述式(IV)之各種實施例中,R在各次出現時獨立地為:(a) H或甲基;或(b) R連同其所結合之碳原子與鄰接R及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。在某些實施例中,各R為H。在其他實施例中,至少一個R連同其所結合之碳原子與鄰接R及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。
在式(IV)化合物之其他實施例中,R
1及R
2獨立地具有以下結構中之一者:
。
在式(IV)之某些實施例中,該化合物具有以下結構中之一者:
。
在再不同實施例中,如實施例1、2、3、4或5之陽離子型脂質具有式(V)結構:
或其醫藥學上可接受之鹽、前驅藥或立體異構體,其中:
G
1或G
2中之一者在各次出現時為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)
y-、-S-S-、-C(=O)S-、SC(=O)-、-N(R
a)C(=O)-、-C(=O)N(R
a)-、-N(R
a)C(=O)N(R
a)-、-OC(=O)N(R
a)-或-N(R
a)C(=O)O-,且G
1或G
2中之另一者在各次出現時為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)
y-、-S-S-、-C(=O)S-、-SC(=O)-、-N(R
a)C(=O)-、-C(=O)N(R
a)-、-N(R
a)C(=O)N(R
a)-、-OC(=O)N(R
a)-或-N(R
a)C(=O)O-或直接鍵;
L在各次出現時為~O(C=O)-,其中~表示與X之共價鍵;
X為CR
a;
當n為1時,Z為烷基、環烷基或包含至少一個極性官能基之單價部分;或當n大於1時,Z為伸烷基、伸環烷基或包含至少一個極性官能基之多價部分;
R
a在各次出現時獨立地為H、C
1-C
12烷基、C
1-C
12羥烷基、C
1-C
12胺烷基、C
1-C
12烷胺基烷基、C
1-C
12烷氧基烷基、C
1-C
12烷氧基羰基、C
1-C
12烷基羰氧基、C
1-C
12烷基羰氧基烷基或C
1-C
12烷基羰基;
R在各次出現時獨立地為:(a) H或C
1-C
12烷基;或(b) R連同其所結合之碳原子與鄰接R及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵;
R
1及R
2在各次出現時分別具有以下結構:
;
R'在各次出現時獨立地為H或C
1-C
12烷基;
a
1及a
2在各次出現時獨立地為3至12之整數;
b
1及b
2在各次出現時獨立地為0或1;
c
1及c
2在各次出現時獨立地為2至12之整數;
d
1及d
2在各次出現時獨立地為2至12之整數;
y在各次出現時獨立地為0至2之整數;且
n為1至6之整數,
其中a
1、a
2、c
1、c
2、d
1及d
2經選擇以使得a
1+c
1+d
1之總和為18至30之整數,且a
2+c
2+d
2之總和為18至30之整數,且其中各烷基、伸烷基、羥烷基、胺烷基、烷胺基烷基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷基羰氧基、烷基羰氧基烷基及烷基羰基視情況經一或多個取代基取代。
在式(V)之某些實施例中,G
1及G
2各自獨立地為-O(C=O)-或-(C=O)O-。
在式(V)之其他實施例中,X為CH。
在式(V)之一些實施例中,a
1+c
1+d
1之總和為20至30之整數,且a
2+c
2+d
2之總和為18至30之整數。在其他實施例中,a
1+c
1+d
1之總和為20至30之整數,且a
2+c
2+d
2之總和為20至30之整數。在式(V)之更多實施例中,a
1+ b
1+c
1之總和或a
2+ b
2+ c
2之總和為12至26之整數。在其他實施例中,a
1、a
2、c
1、c
2、d
1及d
2經選擇以使得a
1+c
1+d
1之總和為18至28之整數,且a
2+c
2+d
2之總和為18至28之整數。
在式(V)之再其他實施例中,a
1及a
2獨立地為3至10之整數,例如4至9之整數。
在式(V)之又其他實施例中,b
1及b
2為0。在不同實施例中,b
1及b
2為1。
在式(V)之某些其他實施例中,c
1、c
2、d
1及d
2獨立地為6至8之整數。
在式(V)之不同其他實施例中,當n為1時,Z為烷基或包含至少一個極性官能基之單價部分;或當n大於1時,Z為伸烷基或包含至少一個極性官能基之多價部分。
在式(V)之更多實施例中,當n為1時,Z為烷基、環烷基或包含至少一個極性官能基之單價部分。在其他實施例中,Z為烷基。
在式(V)之其他不同實施例中,R在各次出現時獨立地為:(a) H或甲基;或(b) R連同其所結合之碳原子與鄰接R及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。舉例而言,在一些實施例中,各R為H。在其他實施例中,至少一個R連同其所結合之碳原子與鄰接R及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。
在更多實施例中,各R'為H。
在式(V)之某些實施例中,a
1+c
1+d
1之總和為20至25之整數,且a
2+c
2+d
2之總和為20至25之整數。
在式(V)之其他實施例中,R
1及R
2獨立地具有以下結構中之一者:
。
在式(V)之更多實施例中,該化合物具有以下結構中之一者:
。
在式(IV)或(V)之前述實施例中之任一者中,n為I。在式(IV)或(V)之其他前述實施例中,n大於1。
在式(IV)或(V)之更多前述實施例中之任一者中,Z為包含至少一個極性官能基之單價或多價部分。在一些實施例中,Z為包含至少一個極性官能基之單價部分。在其他實施例中,Z為包含至少一個極性官能基之多價部分。
在式(IV)或(V)之更多前述實施例中之任一者中,極性官能基為羥基、烷氧基、酯、氰基、醯胺、胺基、烷胺基、雜環基或雜芳基官能基。
在式(IV)或(V)之前述實施例中之任一者中,Z為羥基、羥烷基、烷氧基烷基、胺基、胺烷基、烷胺基、烷胺基烷基、雜環基或雜環基烷基。
在式(IV)或(V)之一些其他實施例中,Z具有以下結構:
其中:
R
5及R
6獨立地為H或C
1-C
6烷基;
R
7及R
8獨立地為H或C
1-C
6烷基,或R
7及R
8連同其所連接之氮原子一起連接而形成3-7員雜環;且
x為0至6之整數。
在式(IV)或(V)之再不同實施例中,Z具有以下結構:
其中:
R
5及R
6獨立地為H或C
1-C
6烷基;
R
7及R
8獨立地為H或C
1-C
6烷基,或R
7及R
8連同其所連接之氮原子一起連接而形成3-7員雜環;且
x為0至6之整數。
在式(IV)或(V)之再不同實施例中,Z具有以下結構:
其中:
R
5及R
6獨立地為H或C
1-C
6烷基;
R
7及R
8獨立地為H或C
1-C
6烷基,或R
7及R
8連同其所連接之氮原子一起連接而形成3-7員雜環;且
x為0至6之整數。
在式(IV)或(V)之一些其他實施例中,Z為羥烷基、氰基烷基或經一或多個酯基或醯胺基取代之烷基。
舉例而言,在式(IV)或(V)之前述實施例中之任一者中,Z具有以下結構中之一者:
。
在式(IV)或(V)之其他實施例中,Z-L具有以下結構中之一者:
。
在其他實施例中,Z-L具有以下結構中之一者:
。
在再其他實施例中,X為CH且Z-L具有以下結構中之一者:
。
在各種不同實施例中,如實施例1、2、3、4或5中任一例之陽離子型脂質具有下表4中所闡述之結構中之一者。
表 4 :代表性式(IV)或(V)化合物
在一個實施例中,陽離子型脂質為具有以下結構(VI)之化合物:
或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體、前驅藥或立體異構體,其中:
L
1及L
2各自獨立地為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)
x-、-S-S-、-C(=O)S-、-SC(=O)-、-NR
aC(=O)-、-C(=O)NR
a-、-NR
aC(=O)NR
a-、-OC(=O)NR
a-、-NR
aC(=O)O-或直接鍵;
G
1為C
1-C
2伸烷基、-(C=O)-、-O(C=O)-、-SC(=O)-、-NR
aC(=O)-或直接鍵;
G
2為-C(=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)S-、-C(=O)NR
a-或直接鍵;
G
3為C
1-C
6伸烷基;
R
a為H或C
1-C
12烷基;
R
1a及R
1b在各次出現時獨立地為:(a) H或C
1-C
12烷基;或(b) R
1a為H或C
1-C
12烷基,且R
1b連同其所結合之碳原子與鄰接R
1b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵;
R
2a及R
2b在各次出現時獨立地為:(a) H或C
1-C
12烷基;或(b) R
2a為H或C
1-C
12烷基,且R
2b連同其所結合之碳原子與鄰接R
2b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵;
R
3a及R
3b在各次出現時獨立地為:(a) H或C
1-C
12烷基;或(b) R
3a為H或C
1-C
12烷基,且R
3b連同其所結合之碳原子與鄰接R
3b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵;
R
4a及R
4b在各次出現時獨立地為:(a) H或C
1-C
12烷基;或(b) R
4a為H或C
1-C
12烷基,且R
4b連同其所結合之碳原子與鄰接R
4b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵;
R
5及R
6各自獨立地為H或甲基;
R
7為H或C
1-C
20烷基;
R
8為OH、-N(R
9)(C=O)R
10、-(C=O)NR
9R
10、-NR
9R
10、-(C=O)OR
11或-O(C=O)R
11,其限制條件為當R
8為-NR
9R
10時,G
3為C
4-C
6伸烷基,
R
9及R
10各自獨立地為H或C
1-C
12烷基;
R
11為芳烷基;
a、b、c及d各自獨立地為1至24之整數,且
x為0、1或2,
其中各烷基、伸烷基及芳烷基視情況經取代。
在結構(VI)之一些實施例中,L
1及L
2各自獨立地為-O(C=O)-、-(C=O)O-或直接鍵。在其他實施例中,G
1及G
2各自獨立地為-(C=O)-或直接鍵。在一些不同實施例中,L
1及L
2各自獨立地為-O(C=O)-、-(C=O)O-或直接鍵;且G
1及G
2各自獨立地為-(C=O)-或直接鍵。
在結構(VI)之一些不同實施例中,L
1及L
2各自獨立地為-C(=O)-、-O-、-S(O)
x-、-S-S-、-C(=O)S-、-SC(=O)-、-NR
a-、-NR
aC(=O)-、-C(=O)NR
a-、-NR
aC(=O)NR
a、-OC(=O)NR
a-、-NR
aC(=O)O-、-NR
aS(O)
xNR
a-、-NR
aS(O)
x-或-S(O)
xNR
n-。
在結構(VI)之其他前述實施例中,該化合物具有以下結構(VIA)或(VIB)中之一者:
。
在一些實施例中,該化合物具有結構(VIA)。在其他實施例中,該化合物具有結構(VIB)。
在結構(VI)之前述實施例中之任一者中,L
1或L
2中之一者為-O(C=O)-。舉例而言,在一些實施例中,L
1及L
2中之各者為-O(C=O)-。
在前述任一者之一些不同實施例中,L
1或L
2中之一者為-(C=O)O-。舉例而言,在一些實施例中,L
1及L
2中之各者為-(C=O)O-。
在結構(VI)之不同實施例中,L
1或L
2中之一者為直接鍵。如本文所使用之「直接鍵」意謂基團(例如L
1或L
2)不存在。舉例而言,在一些實施例中,L
1及L
2中之各者為直接鍵。
在前述者之其他不同實施例中,對於R
1a及R
1b之至少一次出現,R
1a為H或C
1-C
12烷基,且R
1b連同其所結合之碳原子與鄰接R
1b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。
在結構(VI)之再其他不同實施例中,對於R
4a及R
4b之至少一次出現,R
4a為H或C
1-C
12烷基,且R
4b連同其所結合之碳原子與鄰接R
4b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。
在結構(VI)之更多實施例中,對於R
2a及R
2b之至少一次出現,R
2a為H或C
1-C
12烷基,且R
2b連同其所結合之碳原子與鄰接R
2b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。
在前述任一者之其他不同實施例中,對於R
3a及R
3b之至少一次出現,R
3a為H或C
1-C
12烷基,且R
3b連同其所結合之碳原子與鄰接R
3b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。
應理解,「碳-碳」雙鍵係指以下結構中之一者:
其中R
c及R
d在各次出現時獨立地為H或取代基。舉例而言,在一些實施例中,R
c及R
d在各次出現時獨立地為H、C
1-C
12烷基或環烷基,例如H或C
1-C
12烷基。
在各種其他實施例中,該化合物具有以下結構(VIC)或(VID)中之一者:
其中e、f、g及h各自獨立地為1至12之整數。
在一些實施例中,該化合物具有結構(VIC)。在其他實施例中,該化合物具有結構(VID)。
在結構(VIC)或(VID)化合物之各種實施例中,e、f、g及h各自獨立地為4至10之整數。
在其他不同實施例中,
或兩者獨立地具有以下結構中之一者:
。
在前述者之某些實施例中,a、b、c及d各自獨立地為2至12之整數或4至12之整數。在其他實施例中,a、b、c及d各自獨立地為8至12或5至9之整數。在一些某些實施例中,a為0。在一些實施例中,a為1。在其他實施例中,a為2。在更多實施例中,a為3。在又其他實施例中,a為4。在一些實施例中,a為5。在其他實施例中,a為6。在更多實施例中,a為7。在又其他實施例中,a為8。在一些實施例中,a為9。在其他實施例中,a為10。在更多實施例中,a為11。在又其他實施例中,a為12。在一些實施例中,a為13。在其他實施例中,a為14。在更多實施例中,a為15。在又其他實施例中,a為16。
在結構(VI)之一些實施例中,b為1。在其他實施例中,b為2。在更多實施例中,b為3。在再其他實施例中,b為4。在一些實施例中,b為5。在其他實施例中,b為6。在更多實施例中,b為7。在再其他實施例中,b為8。在一些實施例中,b為9。在其他實施例中,b為10。在更多實施例中,b為11。在再其他實施例中,b為12。在一些實施例中,b為13。在其他實施例中,b為14。在更多實施例中,b為15。在再其他實施例中,b為16。
在結構(VI)之一些實施例中,c為1。在其他實施例中,c為2。在更多實施例中,c為3。在再其他實施例中,c為4。在一些實施例中,c為5。在其他實施例中,c為6。在更多實施例中,c為7。在再其他實施例中,c為8。在一些實施例中,c為9。在其他實施例中,c為10。在更多實施例中,c為11。在再其他實施例中,c為12。在一些實施例中,c為13。在其他實施例中,c為14。在更多實施例中,c為15。在再其他實施例中,c為16。
在結構(VI)之一些某些實施例中,d為0。在一些實施例中,d為1。在其他實施例中,d為2。在更多實施例中,d為3。在再其他實施例中,d為4。在一些實施例中,d為5。在其他實施例中,d為6。在更多實施例中,d為7。在再其他實施例中,d為8。在一些實施例中,d為9。在其他實施例中,d為10。在更多實施例中,d為11。在再其他實施例中,d為12。在一些實施例中,d為13。在其他實施例中,d為14。在更多實施例中,d為15。在再其他實施例中,d為16。
在結構(VI)之一些實施例中,e為1。在其他實施例中,e為2。在更多實施例中,e為3。在再其他實施例中,e為4。在一些實施例中,e為5。在其他實施例中,e為6。在更多實施例中,e為7。在再其他實施例中,e為8。在一些實施例中,e為9。在其他實施例中,e為10。在更多實施例中,e為11。在再其他實施例中,e為12。
在結構(VI)之一些實施例中,f為1。在其他實施例中,f為2。在更多實施例中,f為3。在再其他實施例中,f為4。在一些實施例中,f為5。在其他實施例中,f為6。在更多實施例中,f為7。在再其他實施例中,f為8。在一些實施例中,f為9。在其他實施例中,f為10。在更多實施例中,f為11。在再其他實施例中,f為12。
在結構(VI)之一些實施例中,g為1。在其他實施例中,g為2。在更多實施例中,g為3。在再其他實施例中,g為4。在一些實施例中,g為5。在其他實施例中,g為6。在更多實施例中,g為7。在再其他實施例中,g為8。在一些實施例中,g為9。在其他實施例中,g為10。在更多實施例中,g為11。在再其他實施例中,g為12。
在結構(VI)之一些實施例中,h為1。在其他實施例中,e為2。在更多實施例中,h為3。在再其他實施例中,h為4。在一些實施例中,e為5。在其他實施例中,h為6。在更多實施例中,h為7。在再其他實施例中,h為8。在一些實施例中,h為9。在其他實施例中,h為10。在更多實施例中,h為11。在再其他實施例中,h為12。
在結構(VI)之一些其他各種實施例中,a與d相同。在一些其他實施例中,b與c相同。在一些其他特定實施例中,a與d相同且b與c相同。
a與b之總和及c與d之總和為可變化以獲得具有所需特性之脂質的因素。在一個實施例中,a及b經選擇以使得其總和為在14至24範圍內之整數。在其他實施例中,c及d經選擇以使得其總和為在14至24範圍內之整數。在另一實施例中,a與b之總和同c與d之總和相同。舉例而言,在一些實施例中,a與b之總和及c與d之總和兩者均為可在14至24範圍內之相同整數。在再更多實施例中,a、b、c及d經選擇以使得a與b之總和及c與d之總和為12或更大。
R
1a、R
2a、R
3a及R
4a處之取代基不受特定限制。在一些實施例中,R
1a、R
2a、R
3a及R
4a中之至少一者為H。在某些實施例中,R
1a、R
2a、R
3a及R
4a在各次出現時為H。在某些其他實施例中,R
1a、R
2a、R
3a及R
4a中之至少一者為C
1-C
12烷基。在某些其他實施例中,R
1a、R
2a、R
3a及R
4a中之至少一者為C
1-C
8烷基。在某些其他實施例中,R
1a、R
2a、R
3a及R
4a中之至少一者為C
1-C
6烷基。在一些前述實施例中,C
1-C
8烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、三級丁基、正己基或正辛基。
在前述者之某些實施例中,R
1a、R
1b、R
4a及R
4b在各次出現時為C
1-C
12烷基。
在前述者之另外實施例中,R
1b、R
2b、R
3b及R
4b中之至少一者為H,或R
1b、R
2b、R
3b及R
4b在各次出現時為H。
在前述者之某些實施例中,R
1b連同其所結合之碳原子與鄰接R
1b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。在前述者之其他實施例中,R
4b連同其所結合之碳原子與鄰接R
4b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。
在前述實施例中,R
5及R
6處之取代基不受特定限制。在某些實施例中,R
5或R
6中之一者為甲基。在其他實施例中,R
5或R
6中之各者為甲基。
在前述實施例中,R
7處之取代基不受特定限制。在某些實施例中,R
7為C
6-C
16烷基。在一些其他實施例中,R
7為C
6-C
9烷基。在一些此等實施例中,R
7經-(C=O)OR
b、-O(C=O)R
b、-C(=O)R
b、-OR
b、-S(O)
xR
b、-S-SR
b、-C(=O)SR
b、-SC(=O)R
b、-NR
aR
b、-NR
aC(=O)R
b、-C(=O)NR
aR
b、-NR
aC(=O)NR
aR
b、-OC(=O)NR
aR
b、-NR
aC(=O)OR
b、-NR
aS(O)
xNR
aR
b、-NR
aS(O)
xR
b或-S(O)
xNR
aR
b取代,其中:R
a為H或C
1-C
12烷基;R
b為C
1-C
15烷基;且x為0、1或2。舉例而言,在一些實施例中,R
7經-(C=O)OR
b或-O(C=O)R
b取代。
在結構(VI)之各種前述實施例中,R
b為分支鏈C
3-C
15烷基。舉例而言,在一些實施例中,R
b具有以下結構中之一者:
。
在某些實施例中,R
8為OH。
在結構(VI)之其他實施例中,R
8為-N(R
9)(C=O)R
10。在一些其他實施例中,R
8為-(C=O)NR
9R
10。在再更多實施例中,R
8為-NR
9R
10。在一些前述實施例中,R
9及R
10各自獨立地為H或C
1-C
8烷基,例如H或C
1-C
3烷基。在更特定的此等實施例中,C
1-C
8烷基或C
1-C
3烷基未經取代或經羥基取代。在其他此等實施例中,R
9及R
10各自為甲基。
在結構(VI)之又更多實施例中,R
8為-(C=O)OR
11。在一些此等實施例中,R
11為苯甲基。
在結構(VI)之又更特定實施例中,R
8具有以下結構中之一者:
。
在前述化合物之再其他實施例中,G
3為C
2-C
5伸烷基,例如C
2-C
4伸烷基、C
3伸烷基或C
4伸烷基。在一些此等實施例中,R
8為OH。在其他實施例中,G
2不存在,且R
7為C
1-C
2伸烷基,諸如甲基。
在各種不同實施例中,該化合物具有下表5中所闡述之結構中之一者。
表 5.代表性結構(VI)陽離子型脂質
在一個實施例中,陽離子型脂質為具有以下結構(VII)之化合物:
或其醫藥學上可接受之鹽、前驅藥或立體異構體,其中:
X及X'各自獨立地為N或CR;
Y及Y'各自獨立地不存在、為-O(C=O)-、-(C=O)O-或NR,其限制條件為:
a) 當X為N時,Y不存在;
b) 當X'為N時,Y'不存在;
c) 當X為CR時,Y為-O(C=O)-、-(C=O)O-或NR;且
d) 當X
1為CR時,Y'為-O(C=O)-、-(C=O)O-或NR,
L
1及L
1'各自獨立地為-O(C=O)R
1、-(C=O)OR
1、-C(=O)R
1、-OR
1、-S(O)
zR
1、-S-SR
1、-C(=O)SR
1、-SC(=O)R
1、-NR
aC(=O)R
1、-C(=O)NR
bR
c、-NR
aC(=O)NR
bR
c、-OC(=O)NR
bR
c或-NR
aC(=O)OR
1;
L
2及L
2'各自獨立地為-O(C=O)R
2、-(C=O)OR
2、-C(=O)R
2、-OR
2、-S(O)
ZR
2、-S-SR
2、-C(=O)SR
2、-SC(=O)R
2、-NR
dC(=O)R
2、-C(=O)NR
eR
f、-NR
dC(=O)NR
eR
f、-OC(=O)NR
eR
f、-NR
dC(=O)OR
2或與R
2之直接鍵;
G
1、G
1 '、G
2及G
2 '各自獨立地為C
2-C
12伸烷基或C
2-C
12伸烯基;
G
3為C
2-C
24伸雜烷基或C
2-C
24伸雜烯基;
R
a、R
b、R
d及R
e在各次出現時獨立地為H、C
1-C
12烷基或C
2-C
12烯基;
R
c及R
f在各次出現時獨立地為C
1-C
12烷基或C
2-C
12烯基;
R在各次出現時獨立地為H或C
1-C
12烷基,
R
1及R
2在各次出現時獨立地為分支鏈C
6-C
24烷基或分支鏈C
6-C
24烯基;
z為0、1或2,且
其中除非另外規定,否則各烷基、烯基、伸烷基、伸烯基、伸雜烷基及伸雜烯基獨立地經取代或未經取代。
在結構(VII)之其他不同實施例中:
X及X'各自獨立地為N或CR;
Y及Y'各自獨立地不存在或為NR,其限制條件為:
a) 當X為N時,Y不存在;
b) 當X'為N時,Y'不存在;
c) 當X為CR時,Y為NR;且
d) 當X'為CR時,Y'為NR,
L
1及L
1'各自獨立地為-O(C=O)R
1、-(C=O)OR
1、-C(=O)R
1、-OR
1、-S(O)
ZR
1、-S-SR
1、-C(=O)SR
X、-SC(=O)R
1、-NR
aC(=O)R
1、-C(=O)NR
bR
c、-NR
aC(=O)NR
bR
c、-OC(=O)NR
bR
c或-NR
aC(O)OR
1;
L
2及L
2'各自獨立地為-O(C=O)R
2、-(C=O)OR
2、-C(=O)R
2、-OR
2、-S(O)
ZR
2、-S-SR
2、-C(=O)SR
2、-SC(=O)R
2、-NR
dC(=O)R
2、-C(=O)NR
eR
f、-NR
dC(=O)NR
eR
f、-OC(=O)NR
eR
f、-NR
dC(=O)OR
2或與R
2之直接鍵;
G
1、G
1 '、G
2及G
2 '各自獨立地為C
2-C
12伸烷基或C
2-C
12伸烯基;
G
3為C
2-C
24環氧烷或C
2-C
24伸烯基氧化物;
R
a、R
b、R
d及R
e在各次出現時獨立地為H、C
1-C
12烷基或C
2-C
12烯基;
R
c及R
f在各次出現時獨立地為C
1-C
12烷基或C
2-C
12烯基;
R在各次出現時獨立地為H或C
1-C
12烷基;
R
1及R
2在各次出現時獨立地為分支鏈C
6-C
24烷基或分支鏈C
6-C
24烯基;
z為0、1或2,且
其中除非另外規定,否則各烷基、烯基、伸烷基、伸烯基、環氧烷及伸烯基氧化物獨立地經取代或未經取代。
在結構(VII)之一些實施例中,G
3為C
2-C
24環氧烷或C
2-C
24伸烯基氧化物。在某些實施例中,G
3未經取代。在其他實施例中,G
3經取代,例如經羥基取代。在更特定實施例中,G
3為C
2-C
12環氧烷,舉例而言,在一些實施例中,G
3為C
3-C
7環氧烷,或在其他實施例中,G
3為C
3-C
12環氧烷。
在結構(VII)之其他實施例中,G
3為C
2-C
24伸烷基胺基或C
2-C
24伸烯基胺基,例如C
6-C
12伸烷基胺基。在一些此等實施例中,G
3未經取代。在其他此等實施例中,G
3經C
1-C
6烷基取代。
在結構(VII)之一些實施例中,X及X
'各自為N,且Y及Y
'各自不存在。在其他實施例中,X及X
'各自為CR,且Y及Y
'各自為NR。在一些此等實施例中,R為OH。
在結構(VII)之某些實施例中,X及X
'各自為CR,且Y及Y
'各自獨立地為-O(C=O)-或-(C=O)O-。
在結構(VII)之一些前述實施例中,該化合物具有以下結構(VIIA)、(VIIB)、(VIIC)、(VIID)、(VITE)、(VIIF)、(VIIG)或(VIIH)中之一者:
,
其中R
d在各次出現時獨立地為H或視情況經取代之C
1-C
6烷基。舉例而言,在一些實施例中,R
d為H。在其他實施例中,R
d為C
1-C
6烷基,諸如甲基。在其他實施例中,R
d為經取代之C
1-C
6烷基,諸如經-O(C=O)R、-(C=O)OR、-NRC(=O)R或-C(=O)N(R)
2取代之C
1-C
6烷基,其中R在各次出現時獨立地為H或C
1-C
12烷基。
在結構(VII)之一些前述實施例中,L
1及L
1'各自獨立地為-O(C=O)R
1、-(C=O)OR
1或-C(=O)NR
bR
c;且L
2及L
2'各自獨立地為-O(C=O)R
2、-(C=O)OR
2或-C(=O)NR
eR
f。舉例而言,在一些實施例中,L
1及L
1'各自為-(C=O)OR
1,且L
2及L
2'各自為-(C=O)OR
2。在其他實施例中,L
1及L
1'各自為-(C=O)OR
1,且L
2及L
2'各自為-C(=O)NR
eR
f。在其他實施例中,L
1及L
1'各自為-C(=O)NR
bR
c,且L
2及L
2'各自為-C(=O)NR
eR
f。
在前述者之一些實施例中,G
1、G
1'、G
2及G
2'各自獨立地為C
2-C
8伸烷基,例如C
4-C
8伸烷基。
在結構(VII)之一些前述實施例中,R
1或R
2在各次出現時各自獨立地為分支鏈C
6-C
24烷基。舉例而言,在一些實施例中,R
1及R
2在各次出現時獨立地具有以下結構:
,
其中:
R
7a及R
7b在各次出現時獨立地為H或C
1-C
12烷基;且
a為2至12之整數,
其中R
7a、R
7b及a各自經選擇以使得R
1及R
2各自獨立地包含6至20個碳原子。舉例而言,在一些實施例中,a為在5至9或8至12範圍內之整數。
在結構(VII)之一些前述實施例中,R
7a在至少一次出現時為H。舉例而言,在一些實施例中,R
7a在各次出現時為H。在前述者之其他不同實施例中,R
7b在至少一次出現時為C
1-C
8烷基。舉例而言,在一些實施例中,C
1-C
8烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、三級丁基、正己基或正辛基。
在結構(VII)之不同實施例中,R
1或R
2或兩者在各次出現時獨立地具有以下結構中之一者:
。
在結構(VII)之一些前述實施例中,當R
b、R
c、R
e及R
f存在時,其各自獨立地為C
3-C
12烷基。舉例而言,在一些實施例中,當R
b、R
c、R
e及R
f存在時,其為正己基,且在其他實施例中,當R
b、R
c、R
e及R
f存在時,其為正辛基。
在結構(VII)之各種不同實施例中,陽離子型脂質具有下表6中所闡述之結構中之一者。
表 6.代表性結構(VII)陽離子型脂質
在一個實施例中,陽離子型脂質為具有以下結構(VIII)之化合物:
或其醫藥學上可接受之鹽、前驅藥或立體異構體,其中:
X為N,且Y不存在;或X為CR,且Y為NR;
L
1為-O(C=O)R
1、-(C=O)OR
1、-C(=O)R
1、-OR
1、-S(O)
xR
1、-S-SR
1、-C(=O)SR
1、-SC(=O)R
1、-NR
aC(=O)R
1、-C(=O)NR
bR
c、-NR
aC(=O)NR
bR
c、-OC(=O)NR
bR
c或-NR
aC(=O)OR
1;
L
2為-O(C=O)R
2、-(C=O)OR
2、-C(=O)R
2、-OR
2、-S(O)
xR
2、-S-SR
2、-C(=O)SR
2、-SC(=O)R
2、-NR
dC(=O)R
2、-C(=O)NR
eR
f、-NR
dC(=O)NR
eR
f、-OC(=O)NR
eR
f、-NR
dC(=O)OR
2或與R
2之直接鍵;
L
3為-O(C=O)R
3或-(C=O)OR
3;
G
1及G
2各自獨立地為C
2-C
12伸烷基或C
2-C
12伸烯基;
G
3為C
1-C
24伸烷基、C
2-C
24伸烯基、C
1-C
24伸雜烷基或C
2-C
24伸雜烯基;
R
a、R
b、R
d及R
e各自獨立地為H或C
1-C
12烷基或C
1-C
12烯基;
R
c及R
f各自獨立地為C
1-C
12烷基或C
2-C
12烯基;
各R獨立地為H或C
1-C
12烷基;
R
1、R
2及R
3各自獨立地為C
1-C
24烷基或C
2-C
24烯基;且
x為0、1或2,且
其中除非另外規定,否則各烷基、烯基、伸烷基、伸烯基、伸雜烷基及伸雜烯基獨立地經取代或未經取代。
在結構(I)之更多實施例中:
X為N,且Y不存在;或X為CR,且Y為NR;
L
1為-O(C=O)R
1、-(C=O)OR
1、-C(=O)R
1、-OR
1、-S(O)
XR'、-S-SR
1、-C(=O)R
1、-SC(=O)R
1、-NR
aC(=O)R
1、-C(=O)NR
bR
c、-NR
aC(=O)NR
bR
c、-OC(=O)NR
bR
c或-NR
aC(=O)OR
1;
L
2為-O(C=O)R
2、-(C=O)OR
2、-C(=O)R
2、-OR
2、-S(O)
XR
2、-S-SR
2、-C(=O)SR
2、-SC(=O)R
2、-NR
dC(=O)R
2、-C(=O)NR
eR
f、-NR
dC(=O)NR
eR
f、-OC(=O)NR
eR
f、-NR
dC(=O)OR
2或與R
2之直接鍵;
L
3為-O(C=O)R
3或-(C=O)OR
3;
G
1及G
2各自獨立地為C
2-C
12伸烷基或C
2-C
12伸烯基;
當X為CR且Y為NR時,G
3為C
1-C
24伸烷基、C
2-C
24伸烯基、C
1-C
24伸雜烷基或C
2-C
24伸雜烯基;且當X為N且Y不存在時,G
3為C
1-C
24伸雜烷基或C
2-C
24伸雜烯基;
R
a、R
b、R
d及R
e各自獨立地為H或C
1-C
12烷基或C
1-C
12烯基;
R
c及R
f各自獨立地為C
1-C
12烷基或C
2-C
12烯基;
各R獨立地為H或C
1-C
12烷基;
R
1、R
2及R
3各自獨立地為C
1-C
24烷基或C
2-C
24烯基;且
x為0、1或2,且
其中除非另外規定,否則各烷基、烯基、伸烷基、伸烯基、伸雜烷基及伸雜烯基獨立地經取代或未經取代。
在結構(I)之其他實施例中:
X為N且Y不存在,或X為CR且Y為NR;
L
1為-O(C=O)R
1、-(C=O)OR
1、-C(=O)R
1、-OR
1、-S(O)
XR
1、-S-SR
1、-C(=O)SR
1、-SC(=O)R
1、-NR
aC(=O)R
1、-C(=O)NR
bR
c、-NR
aC(=O)NR
bR
c、-OC(=O)NR
bR
c或-NR
aC(=O)OR
1;
L
2為-O(C=O)R
2、-(C=O)OR
2、-C(=O)R
2、-OR
2、-S(O)
XR
2、-S-SR
2、-C(=O)SR
2、-SC(=O)R
2、-NR
dC(=O)R
2、-C(=O)NR
eR
f、-NR
dC(=O)NR
eR
f、-OC(=O)NR
eR
f、-NR
dC(=O)OR
2或與R
2之直接鍵;
L
3為-O(C=O)R
3或-(C=O)OR
3;
G
1及G
2各自獨立地為C
2-C
12伸烷基或C
2-C
12伸烯基;
G
3為C
1-C
24伸烷基、C
2-C
24伸烯基、C
1-C
24伸雜烷基或C
2-C
24伸雜烯基;
R
a、R
b、R
d及R
e各自獨立地為H或C
1-C
12烷基或C
1-C
12烯基;
R
c及R
f各自獨立地為C
1-C
12烷基或C
2-C
12烯基;
各R獨立地為H或C
1-C
12烷基;
R
1、R
2及R
3各自獨立地為分支鏈C
6-C
24烷基或分支鏈C
6-C
24烯基;且
x為0、1或2,且
其中除非另外規定,否則各烷基、烯基、伸烷基、伸烯基、伸雜烷基及伸雜烯基獨立地經取代或未經取代。
在結構(VIII)之某些實施例中,G
3未經取代。在更特定實施例中,G
3為C
2-C
12伸烷基,舉例而言,在一些實施例中,G
3為C
3-C
7伸烷基,或在其他實施例中,G
3為C
3-C
12伸烷基。在一些實施例中,G
3為C
2或C
3伸烷基。
在結構(VIII)之其他實施例中,G
3為C
1-C
12伸雜烷基,例如C
1-C
12胺基伸烷基。
在結構(VIII)之某些實施例中,X為N且Y不存在。在其他實施例中,X為CR且Y為NR,例如在一些此等實施例中,R為H。
在結構(VIII)之一些前述實施例中,該化合物具有以下結構(VIIIA)、(VIIIB)、(VIIIC)或(VIIID)中之一者:
。
在結構(VIII)之一些前述實施例中,L
1為-O(C=O)R
1、-(C=O)OR
1或-C(=O)NR
bR
c,且L
2為-O(C=O)R
2、-(C=O)OR
2或-C(=O)NR
eR
f。在其他特定實施例中,L
1為-(C=O)OR
1且L
2為-(C=O)OR
2。在前述實施例中之任一者中,L
3為-(C=O)OR
3。
在結構(VIII)之一些前述實施例中,G
1及G
2各自獨立地為C
2-C
12伸烷基,例如C
4-C
10伸烷基。
在結構(VIII)之一些前述實施例中,R
1、R
2及R
3各自獨立地為分支鏈C
6-C
24烷基。舉例而言,在一些實施例中,R
1、R
2及R
3各自獨立地具有以下結構:
其中:
R
7a及R
7b在各次出現時獨立地為H或C
1-C
12烷基;
且
a為2至12之整數,
其中R
7a、R
7b及a各自經選擇以使得R
1及R
2各自獨立地包含6至20個碳原子。舉例而言,在一些實施例中,a為在5至9或8至12範圍內之整數。
在結構(VIII)之一些前述實施例中,R
7a在至少一次出現時為H。舉例而言,在一些實施例中,R
7a在各次出現時為H。在前述者之其他不同實施例中,R
7b在至少一次出現時為C
1-C
8烷基。舉例而言,在一些實施例中,C
1-C
8烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、三級丁基、正己基或正辛基。
在結構(VIII)之一些前述實施例中,X為CR,Y為NR,且R
3為C
1-C
12烷基,諸如乙基、丙基或丁基。在一些此等實施例中,R
1及R
2各自獨立地為分支鏈C
6-C
24烷基。
在結構(VIII)之不同實施例中,R
1、R
2及R
3各自獨立地具有以下結構中之一者:
。
在結構(VIII)之某些實施例中,R
1及R
2及R
3各自獨立地為分支鏈C
6-C
24烷基,且R
3為C
1-C
24烷基或C
2-C
24烯基。
在結構(VIII)之一些前述實施例中,R
b、R
c、R
e及R
f各自獨立地為C
3-C
12烷基。舉例而言,在一些實施例中,R
b、R
c、R
e及R
f為正己基,且在其他實施例中,R
b、R
c、R
e及R
f為正辛基。
在結構(VIII)之各種不同實施例中,該化合物具有下表7中所闡述之結構中之一者。
表 7.代表性結構(VIII)陽離子型脂質
在一個實施例中,陽離子型脂質為具有以下結構(IX)之化合物:
或其醫藥學上可接受之鹽、前驅藥或立體異構體,其中:
L
1為-O(C=O)R
1、-(C=O)OR
1、-C(=O)R
1、-OR
1、-S(O)
XR
1、-S-SR
1、-C(=O)SR
1、-SC(=O)R
1、-NR
aC(=O)R
1、-C(=O)NR
bR
c、-NR
aC(=O)NR
bR
c、-OC(=O)NR
bRR
c或-NR
aC(=O)OR
1;
L
2為-O(C=O)R
2、-(C=O)OR
2、-C(=O)R
2、-OR
2、-S(O)
XR
2、-S-SR
2、-C(=O)SR
2、-SC(=O)R
2、-NR
dC(=O)R
2、-C(=O)NR
eR
f、-NR
dC(=O)NR
eR
f、- OC(=O)NR
eR
f、-NR
dC(=O)OR
2或與R
2之直接鍵;
G
1及G
2各自獨立地為C
2-C
12伸烷基或C
2-C
12伸烯基;
G
3為C
1-C
24伸烷基、C
2-C
24伸烯基、C
3-C
8伸環烷基或C
3-C
8伸環烯基;
R
a、R
b、R
d及R
e各自獨立地為H或C
1-C
12烷基或C
1-C
12烯基;
R
c及R
f各自獨立地為C
1-C
12烷基或C
2-C
12烯基;
R
1及R
2各自獨立地為分支鏈C
6-C
24烷基或分支鏈C
6-C
24烯基;
R
3為-N(R
4)R
5;
R
4為C
1-C
12烷基;
R
3為經取代之C
1-C
12烷基,且
x為0、1或2,且
其中除非另外規定,否則各烷基、烯基、伸烷基、伸烯基、伸環烷基、伸環烯基、芳基及芳烷基獨立地經取代或未經取代。
在結構(XI)之某些實施例中,G
3未經取代。在更特定實施例中,G
3為C
2-C
12伸烷基,舉例而言,在一些實施例中,G
3為C
3-C
7伸烷基,或在其他實施例中,G
3為C
3-C
12伸烷基。在一些實施例中,G
3為C
2或C
3伸烷基。
在結構(IX)之一些前述實施例中,該化合物具有以下結構(IX A):
其中y及z各自獨立地為在2至12範圍內之整數,例如2至6、4至10之整數,或例如4或5。在某些實施例中,y與z各自相同且選自4、5、6、7、8及9。
在結構(IX)之一些前述實施例中,L
1為-O(C=O)R
1、-(C=O)OR
1或-C(=O)NR
bR
c,且L
2為-O(C=O)R
2、-(C=O)OR
2或-C(=O)NR
eR
f。舉例而言,在一些實施例中,L
1及L
2分別為-(C=O)OR
1及-(C=O)OR
2。在其他實施例中,L
1為-(C=O)OR
1且L
2為-(C=O)NR
eR
f。在其他實施例中,L
1為-C(=O)NR
bR
c且L
2為-C(=O)NR
eR
f。
在前述者之其他實施例中,該化合物具有以下結構(IXB)、(IXC)、(IXD)或(IXE)中之一者:
。
在一些前述實施例中,該化合物具有結構(IXB),在其他實施例中,該化合物具有結構(IXC),且在再其他實施例中,該化合物具有結構(IXD)。在其他實施例中,該化合物具有結構(IXE)。
在前述者之一些不同實施例中,該化合物具有以下結構(IXF)、(IXG)、(IXH)或(IXJ)中之一者:
其中y及z各自獨立地為在2至12範圍內之整數,例如2至6之整數,例如4。
在結構(IX)之一些前述實施例中,y及z各自獨立地為在2至10、2至8、4至10或4至7範圍內之整數。舉例而言,在一些實施例中,y為4、5、6、7、8、9、10、11或12。在一些實施例中,z為4、5、6、7、8、9、10、11或12。在一些實施例中,y與z相同,而在其他實施例中,y與z不同。
在結構(IX)之一些前述實施例中,R
1或R
2或兩者為分支鏈C
6-C
24烷基。舉例而言,在一些實施例中,R
1及R
2各自獨立地具有以下結構:
,
其中:
R
7a及R
7b在各次出現時獨立地為H或C
1-C
12烷基;且
a為2至12之整數,
其中R
7a、R
7b及a各自經選擇以使得R
1及R
2各自獨立地包含6至20個碳原子。舉例而言,在一些實施例中,a為在5至9或8至12範圍內之整數。
在結構(IX)之一些前述實施例中,R
7a在至少一次出現時為H。舉例而言,在一些實施例中,R
7a在各次出現時為H。在前述者之其他不同實施例中,R
7b在至少一次出現時為C
1-C
8烷基。舉例而言,在一些實施例中,C
1-C
8烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、三級丁基、正己基或正辛基。
在結構(IX)之不同實施例中,R
1或R
2或兩者具有以下結構中之一者:
。
在結構(IX)之一些前述實施例中,R
b、R
c、R
e及R
f各自獨立地為C
3-C
12烷基。舉例而言,在一些實施例中,R
b、R
c、R
e及R
f為正己基,且在其他實施例中,R
b、R
c、R
e及R
f為正辛基。
在結構(IX)之前述實施例中之任一者中,R
4為經取代或未經取代之甲基、乙基、丙基、正丁基、正己基、正辛基或正壬基。舉例而言,在一些實施例中,R
4未經取代。在其他實施例中,R
4經一或多個選自由-OR
g、-NR
gC(=O)R
h、-C(=O)NR
gR
h、-C(=O)R
h、-OC(=O)R
h、-C(=O)OR
h及-OR
iOH組成之群之取代基取代,其中:
R
g在各次出現時獨立地為H或C
1-C
6烷基;
R
h在各次出現時獨立地為C
1-C
6烷基;且
R
i在各次出現時獨立地為C
1-C
6伸烷基。
在結構(IX)之其他前述實施例中,R
5為經取代之甲基、乙基、丙基、正丁基、正己基、正辛基或正壬基。在一些實施例中,R
5為經取代之乙基或經取代之丙基。在其他不同實施例中,R
5經羥基取代。在再更多實施例中,R
5經一或多個選自由-OR
g、-NR
gC(=O)R
h、-C(=O)NR
gR
h、-C(=O)R
h、-OC(=O)R
h、-C(=O)OR
h及-OR
iOH組成之群之取代基取代,其中:
R
g在各次出現時獨立地為H或C
1-C
6烷基;
R
h在各次出現時獨立地為C
1-C
6烷基;且
R
i在各次出現時獨立地為C
1-C
6伸烷基。
在結構(IX)之其他實施例中,R
4為未經取代之甲基,且R
5為經取代之甲基、乙基、丙基、正丁基、正己基、正辛基或正壬基。在一些此等實施例中,R
5經羥基取代。
在結構(IX)之一些其他特定實施例中,R
3具有以下結構中之一者:
。
在結構(IX)之各種不同實施例中,陽離子型脂質具有下表8中所闡述之結構中之一者。
表 8.代表性結構(IX)陽離子型脂質
在一個實施例中,陽離子型脂質為具有以下結構(X)之化合物:
或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體、前驅藥或立體異構體,其中:
G
1為-OH、-NR
3R
4、-(C=O)NR
5或-NR
3(C=O)R
5;
G
2為-CH
2-或-(C=O)-;
R在各次出現時獨立地為H或OH;
R
1及R
2各自獨立地為分支鏈、飽和或不飽和C
12-C
36烷基;
R
3及R
4各自獨立地為H或直鏈或分支鏈、飽和或不飽和C
1-C
6烷基;
R
5為直鏈或分支鏈、飽和或不飽和C
1-C
6烷基;且
n為2至6之整數。
在一些實施例中,R
1及R
2各自獨立地為分支鏈、飽和或不飽和C
12-C
30烷基、C
12-C
20烷基或C
15-C
20烷基。在一些特定實施例中,R
1及R
2各自為飽和的。在某些實施例中,R
1及R
2中之至少一者為不飽和的。
在結構(X)之一些前述實施例中,R
1及R
2具有以下結構:
。
在結構(X)之一些前述實施例中,該化合物具有以下結構(XA):
其中:
R
6及R
7在各次出現時獨立地為H或直鏈或分支鏈、飽和或不飽和C
1-C
14烷基;
a及b各自獨立地為在1至15範圍內之整數,
其限制條件為R
6及a以及R
7及b各自獨立地經選擇以使得R
1及R
2分別各自獨立地為分支鏈、飽和或不飽和C
12-C
36烷基。
在一些前述實施例中,該化合物具有以下結構(XB):
其中:
R
8、R
9、R
10及R
11各自獨立地為直鏈或分支鏈、飽和或不飽和C
4-C
12烷基,其限制條件為R
8及R
9以及R
10及R
11各自獨立地經選擇以使得R
1及R
2分別各自獨立地為分支鏈、飽和或不飽和C
12-C
36烷基。在(XB)之一些實施例中,R
8、R
9、R
10及R
11各自獨立地為直鏈或分支鏈、飽和或不飽和C
6-C
10烷基。在(XB)之某些實施例中,R
8、R
9、R
10及R
11中之至少一者為不飽和的。在(XB)之其他某些特定實施例中,R
8、R
9、R
10及R
11中之各者為飽和的。
在一些前述實施例中,該化合物具有結構(XA),且在其他實施例中,該化合物具有結構(XB)。
在一些前述實施例中,G
1為-OH,且在一些實施例中,G
1為-NR
3R
4。舉例而言,在一些實施例中,G
1為-NH
2、-NHCH
3或-N(CH
3)
2。在某些實施例中,G
1為-(C=O)NR
5。在某些其他實施例中,G
1為-NR
3(C=O)R
5。舉例而言,在一些實施例中,G
1為-NH(C=O)CH
3或-NH(C=O)CH
2CH
2CH
3。
在結構(X)之一些前述實施例中,G
2為-CH
2-。在一些不同實施例中,G
2為-(C=O)-。
在結構(X)之一些前述實施例中,n為在2至6範圍內之整數,舉例而言,在一些實施例中,n為2、3、4、5或6。在一些實施例中,n為2。在一些實施例中,n為3。在一些實施例中,n為4。
在結構(X)之某些前述實施例中,R
1、R
2、R
3、R
4及R
5中之至少一者未經取代。舉例而言,在一些實施例中,R
1、R
2、R
3、R
4及R
5各自未經取代。在一些實施例中,R
3經取代。在其他實施例中,R
4經取代。在再更多實施例中,R
5經取代。在某些特定實施例中,R
3及R
4中之各者經取代。在一些實施例中,R
3、R
4或R
5上之取代基為羥基。在某些實施例中,R
3及R
4各自經羥基取代。
在結構(X)之一些前述實施例中,至少一個R為OH。在其他實施例中,各R為H。
在結構(X)之各種不同實施例中,該化合物具有下表9中所闡述之結構中之一者。
表 9.代表性結構(X)陽離子型脂質
在實施例1、2、3、4或5中之任一例中,LNP進一步包含中性脂質。在各種實施例中,陽離子型脂質與中性脂質之莫耳比在約2:1至約8:1範圍內。在某些實施例中,中性脂質以在5至10莫耳%、5至15莫耳%、7至13莫耳%或9至11莫耳%範圍內之濃度存在於前述LNP中之任一者中。在某些特定實施例中,中性脂質以約9.5、10或10.5莫耳%之濃度存在。在一些實施例中,陽離子型脂質與中性脂質之莫耳比在約4.1:1.0至約4.9:1.0、約4.5:1.0至約4.8:1.0或約4.7:1.0至4.8:1.0範圍內。在一些實施例中,總陽離子型脂質與中性脂質之莫耳比在約4.1:1.0至約4.9:1.0、約4.5:1.0至約4.8:1.0或約4.7:1.0至4.8:1.0範圍內。
用於實施例1、2、3、4或5中任一例中之例示性中性脂質包括例如二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯乙醇胺(POPE)及二油醯基磷脂醯乙醇胺4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-l甲酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)、16-O-單甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、l-硬脂醯基-2-油醯基磷脂醯乙醇胺(SOPE)及l,2-二反油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。在一個實施例中,中性脂質為1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3磷酸膽鹼(DSPC)。在一些實施例中,中性脂質選自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE及SM。在一些實施例中,中性脂質為DSPC。
在實施例1、2、3、4或5中之各種實施例中,所揭示之脂質奈米粒子中之任一者包含類固醇或類固醇類似物。在某些實施例中,類固醇或類固醇類似物為膽固醇。在一些實施例中,類固醇以在39至49莫耳%、40至46莫耳%、40至44莫耳%、40至42莫耳%、42至44莫耳%或44至46莫耳%範圍內之濃度存在。在某些特定實施例中,類固醇以40、41、42、43、44、45或46莫耳%之濃度存在。
在某些實施例中,陽離子型脂質與類固醇之莫耳比在1.0:0.9至1.0:1.2或1.0:1.0至1.0:1.2範圍內。在一些此等實施例中,陽離子型脂質與膽固醇之莫耳比在約5:1至1:1範圍內。在某些實施例中,類固醇以在32至40莫耳%類固醇範圍內之濃度存在。
在某些實施例中,總陽離子型脂質與類固醇之莫耳比在1.0:0.9至1.0:1.2或1.0:1.0至1.0:1.2範圍內。在一些此等實施例中,總陽離子型脂質與膽固醇之莫耳比在約5:1至1:1範圍內。在某些實施例中,類固醇以在32至40莫耳%類固醇範圍內之濃度存在。
在實施例1、2、3、4或5中之一些實施例中,LNP進一步包含聚合物結合脂質。在實施例1、2、3、4或5中之各種其他實施例中,聚合物結合脂質為聚乙二醇化脂質。舉例而言,一些實施例包括聚乙二醇化二醯基甘油(PEG-DAG),諸如1-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯基甘油(PEG-DMG);聚乙二醇化磷脂醯乙醇胺(PEG-PE);PEG丁二酸酯二醯基甘油(PEG-S-DAG),諸如4-O-(2',3'-二(十四醯氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG);聚乙二醇化神經醯胺(PEG-cer);或PEG二烷氧基丙基胺基甲酸酯,諸如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)胺基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)胺基甲酸酯。
在各種實施例中,聚合物結合脂質以在1.0至2.5莫耳%範圍內之濃度存在。在某些特定實施例中,聚合物結合脂質以約1.7莫耳%之濃度存在。在一些實施例中,聚合物結合脂質以約1.5莫耳%之濃度存在。
在某些實施例中,陽離子型脂質與聚合物結合脂質之莫耳比在約35:1至約25:1範圍內。在一些實施例中,陽離子型脂質與聚合物結合脂質之莫耳比在約100:1至約20:1範圍內。
在某些實施例中,總陽離子型脂質(亦即第一陽離子型脂質及第二陽離子型脂質之總和)與聚合物結合脂質之莫耳比在約35:1至約25:1範圍內。在一些實施例中,總陽離子型脂質與聚合物結合脂質之莫耳比在約100:1至約20:1範圍內。
在實施例1、2、3、4或5中之一些實施例中,當聚乙二醇化脂質存在時,其具有下式(XI):
或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體或立體異構體,其中:
R
12及R
13各自獨立地為含有10至30個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烷基鏈,其中烷基鏈視情況間雜有一或多個酯鍵;且
w具有在30至60範圍內之平均值。
在一些實施例中,R
12及R
13各自獨立地為含有12至16個碳原子之直鏈飽和烷基鏈。在其他實施例中,平均w在42至55範圍內,例如,平均w為42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55。在一些特定實施例中,平均w為約49。
在一些實施例中,聚乙二醇化脂質具有下式(XIa):
其中平均w為約49。
在實施例1、2、3、4或5中之一些實施例中,核酸選自反義RNA及信使RNA。舉例而言,信使RNA可用於例如藉由轉譯免疫原性蛋白來誘導免疫反應(例如作為疫苗)。
在一實施例中,轉移媒劑包含美國專利公開案第20190314524號中所描述之脂質或可離子化脂質。
本發明之一些實施例提供核酸-脂質奈米粒子組合物,其包含在本文中描述為表10中所列之結構的新穎陽離子型脂質中之一或多者,該等陽離子型脂質提供增加之核酸活性及改善之活體內組合物耐受性。
在一個實施例中,可離子化脂質具有以下結構(XII):
,
或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體、前驅藥或立體異構體,其中:
L
1或L
2中之一者為—O(C═O)—、—(C═O)O—、—C(═O)—、—O—、—S(O)
x—、—S—S—、—C(═O)S—、SC(═O)—、—NR
aC(═O)—、—C(═O)NR
a—、NR
aC(═)NR
a—、—OC(═O)NR
a—或—NR
aC(═O)O—,且L
1或L
2中之另一者為—O(C═O)—、—(C═O)O—、—C(═O)—、—O—、—S(O)
x—、—S—S—、—C(═O)S—、SC(═O)—、—NR
aC(═O)—、—C(═O)NR
a—、NR
aC(═O)NR
a—、—OC(═O)NR
a—或—NR
aC(═O)O—或直接鍵;
G
1及G
2各自獨立地為未經取代之C
1-C
12伸烷基或C
1-C
12伸烯基;
G
3為C
1-C
24伸烷基、C
1-C
24伸烯基、C
3-C
8伸環烷基、C
3-C
8伸環烯基;
R
a為H或C
1-C
12烷基;
R
1及R
2各自獨立地為C
6-C
24烷基或C
6-C
24烯基;
R
3為H、OR
5、CN、—C(═O)OR
4、—OC(═O)R
4或—NR
5C(═O)R
4;
R
4為C
1-C
12烷基;
R
5為H或C
1-C
6烷基;且
x為0、1或2。
在一些實施例中,可離子化脂質具有以下結構(XIIA)或(XIIB)中之一者:
其中:
A為3至8員環烷基或伸環烷基環;
R
6在各次出現時獨立地為H、OH或C
1-C
24烷基;且
n為在1至15範圍內之整數。
在一些實施例中,可離子化脂質具有結構(XIIA),且在其他實施例中,可離子化脂質具有結構(XIIB)。
在一些實施例中,L
1或L
2中之一者為—O(C═O)—。舉例而言,在一些實施例中,L
1及L
2中之各者為—O(C═O)—。在前述任一者之一些不同實施例中,L
1及L
2各自獨立地為—(C═O)O—或—O(C═O)—。舉例而言,在一些實施例中,L
1及L
2中之各者為—(C═O)O—。
在一些實施例中,n為在2至12,例如2至8或2至4範圍內之整數。舉例而言,在一些實施例中,n為3、4、5或6。在一些實施例中,n為3。在一些實施例中,n為4。在一些實施例中,n為5。在一些實施例中,n為6。
在一些實施例中,y及z各自獨立地為在2至10範圍內之整數。舉例而言,在一些實施例中,y及z各自獨立地為在4至9或4至6範圍內之整數。
在一些實施例中,R
6為H。在其他實施例中,R
6為C
1-C
24烷基。在其他實施例中,R
6為OH。
在一些實施例中,G
3未經取代。在其他實施例中,G
3經取代。在各種不同實施例中,G
3為直鏈C
1-C
24伸烷基或直鏈C
1-C
24伸烯基。
在一些實施例中,R
1或R
2或兩者為C
6-C
24烯基。舉例而言,在一些實施例中,R
1及R
2各自獨立地具有以下結構:
其中:
R
7a及R
7b在各次出現時獨立地為H或C
1-C
12烷基;且
a為2至12之整數,
其中R
7a、R
7b及a各自經選擇以使得R
1及R
2各自獨立地包含6至20個碳原子。
在一些實施例中,a為在5至9或8至12範圍內之整數。
在一些實施例中,R
7a在至少一次出現時為H。舉例而言,在一些實施例中,R
7a在各次出現時為H。在其他不同實施例中,R
7b在至少一次出現時為C
1-C
8烷基。舉例而言,在一些實施例中,C
1-C
8烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、三級丁基、正己基或正辛基。
在一些實施例中,R
3為—OH、—CN、—C(═O)OR
4、—OC(═O)R
4或—NHC(═O)R
4。在一些實施例中,R
4為甲基或乙基。
在一些實施例中,可離子化脂質為式(1)化合物:
式(1),
其中:
各n獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15;且
L
1及L
3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*,其中「*」指示與R
1或R
3之連接點;
R
1及R
3各自獨立地為視情況經一或多個選自以下之取代基取代之直鏈或分支鏈C
9-C
20烷基或C
9-C
20烯基:側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺烷基、胺烷基、烷胺基烷基、二烷胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔烴、烷氧基、胺基、二烷胺基、胺烷基羰基胺基、胺基羰基烷胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷基氧基羰基、胺基羰基、胺烷基胺基羰基、烷胺基烷胺基羰基、二烷胺基烷胺基羰基、雜環基烷胺基羰基、(烷胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷胺基烷基羰基、二烷胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基。
在一些實施例中,R
1與R
3相同。在一些實施例中,R
1與R
3不同。
在一些實施例中,R
1及R
3各自獨立地為分支鏈飽和C
9-C
20烷基。在一些實施例中,R
1及R
3中之一者為分支鏈飽和C
9-C
20烷基,且另一者為非分支鏈飽和C
9-C
20烷基。在一些實施例中,R
1及R
3各自獨立地選自由以下組成之群:
。
在一些實施例中,R
2可如國際專利公開案第WO2019/152848 A1號中所描述,該案以全文引用之方式併入本文中。
用於以上化合物及組合物之製備方法在本文中描述於下文及/或在此項技術中已知。
熟習此項技術者應瞭解,在本文所描述之方法中,中間化合物之官能基可能需要由適合的保護基保護。該等官能基包括例如羥基、胺基、巰基及羧酸。用於羥基之適合的保護基包括例如三烷基矽基或二芳基烷基矽基(例如三級丁基二甲基矽基、三級丁基二苯基矽基或三甲基矽基)、四氫哌喃基、苯甲基及其類似。用於胺基、甲脒基及胍基之適合的保護基包括例如三級丁氧基羰基、苯甲氧基羰基及其類似。用於巰基之適合的保護基包括例如-C(O)-R'' (其中R''為烷基、芳基或芳烷基)、對甲氧基苯甲基、三苯甲基及其類似。用於羧酸之適合的保護基包括例如烷基、芳基或芳烷基酯。保護基可根據熟習此項技術者已知且如本文所描述之標準技術添加或移除。保護基之使用詳細描述於例如Green, T. W.及P. G. M. Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis (1999), 第3版, Wiley中。如熟習此項技術者將瞭解,保護基亦可為諸如王氏樹脂(Wang resin)、林克樹脂(Rink resin)或2-氯三苯甲基氯化物樹脂之聚合物樹脂。
熟習此項技術者亦應瞭解,儘管本發明化合物之該等受保護衍生物可能不具有同樣的藥理學活性,但其可投與哺乳動物且此後在體內代謝,從而形成具有藥理學活性之本發明化合物。因此,該等衍生物可描述為前驅藥。本發明化合物之所有前驅藥包括在本發明之範疇內。
此外,以游離鹼或游離酸形式存在之所有本發明化合物可藉由熟習此項技術者已知之方法用適當的無機鹼或有機鹼或無機酸或有機酸處理而轉化成其醫藥學上可接受之鹽。本發明化合物之鹽亦可藉由標準技術轉化成其游離鹼或游離酸形式。
A1係購買或根據此項技術中已知之方法製備。A1與二醇A2在適當縮合條件(例如DCC)下反應,產生酯/醇A3,隨後其可經氧化(例如用PCC)成醛A4。A4與胺A5在還原性胺化條件下反應,產生式(1)化合物。
諸如使用保護基對以上反應流程進行修改,可產生其中R
1與R
3不同之化合物。對以上反應流程使用保護基以及其他修改方法將容易地為一般熟習此項技術者顯而易見。
應理解,熟習此項技術者可能夠藉由類似方法或藉由將熟習此項技術者已知之其他方法組合來製造此等化合物。亦應理解,熟習此項技術者應能夠藉由使用適當的起始材料且修改合成參數來製造本文中未具體說明之其他式(1)化合物。一般而言,起始材料可自諸如Sigma Aldrich、Lancaster Synthesis公司、Maybridge、Matrix Scientific、TCI及Fluorochem USA等之來源獲得,或根據熟習此項技術者已知之來源合成(參見例如Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 第5版(Wiley, 2000年12月)),或如本發明中所描述來製備。
在一些實施例中,如式(2)中所使用,R
1及R
2如式(1)中所定義。
在一些實施例中,如式(2)中所使用之R
1及/或R
2可如國際專利公開案第WO2015/095340 A1號中所描述,該案以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中,如式(2)中所使用之R
1可如國際專利公開案第WO2019/152557 A1號中所描述,該案以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中,式(3-1)、(3-2)或(3-3)中之各R
1相同。
在一些實施例中,如式(3-1)、(3-2)或(3-3)中所使用之R
2可如國際專利公開案第WO2019/152848A1號中所描述,該案以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中,如式(5)中所使用,R
4及R
5分別如式(1)中之R
1及R
3一般定義。在一些實施例中,如式(5)中所使用,R
4及R
5可如國際專利公開案第WO2019/191780 A1號中所描述,該案以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中,可離子化脂質為式(6)化合物:
式(6)
其中:
各n獨立地為0-15之整數;
L
1及L
3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*,其中「*」指示與R
1或R
3之連接點;
R
1及R
2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C
9-C
20烷基或C
9-C
20烯基:側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺烷基、胺烷基、烷胺基烷基、二烷胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔烴、烷氧基、胺基、二烷胺基、胺烷基羰基胺基、胺基羰基烷胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷基氧基羰基、胺基羰基、胺烷基胺基羰基、烷胺基烷胺基羰基、二烷胺基烷胺基羰基、雜環基烷胺基羰基、(烷胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷胺基烷基羰基、二烷胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基;
R
3選自由以下組成之群:
R
4為直鏈或分支鏈C
1-C
15烷基或C
1-C
15烯基。
在一些實施例中,R
1與R
2相同。在一些實施例中,R
1與R
2不同。
在一些實施例中,本發明之可離子化脂質係選自表10a。在一些實施例中,可離子化脂質為表10a中之脂質26。在一些實施例中,可離子化脂質為表10a中之脂質27。在一些實施例中,可離子化脂質為表10a中之脂質53。在一些實施例中,可離子化脂質為表10a中之脂質54。在一些實施例中,可離子化脂質為表10a中之脂質45。在一些實施例中,可離子化脂質為表10a中之脂質46。在一些實施例中,可離子化脂質為表10a中之脂質137。在一些實施例中,可離子化脂質為表10a中之脂質138。在一些實施例中,可離子化脂質為表10a中之脂質139。在一些實施例中,可離子化脂質為表10a中之脂質128。在一些實施例中,可離子化脂質為表10a中之脂質130。
在一些實施例中,可離子化脂質具有β-羥胺頭基。在一些實施例中,可離子化脂質具有γ-羥胺頭基。
在一些實施例中,本發明之可離子化脂質為選自表10b之脂質。在一些實施例中,本發明之可離子化脂質為來自表10b之脂質15。在一實施例中,可離子化脂質描述於美國專利公開案第US20170210697A1號中。在一實施例中,可離子化脂質描述於美國專利公開案第US20170119904A1號中。
表 10b
在一些實施例中,轉移媒劑包含脂質A、脂質B、脂質C及/或脂質D。在一些實施例中,包括脂質A、脂質B、脂質C及/或脂質D會改善囊封及/或胞內體逃逸。在一些實施例中,脂質A、脂質B、脂質C及/或脂質D描述於國際專利申請案PCT/US2017/028981中。
在一些實施例中,可離子化脂質為脂質A,其為十八9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯,亦稱為(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,44雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。脂質A可描繪為:
。
脂質A可根據WO2015/095340 (例如第84-86頁)合成,該案以全文引用之方式併入。
脂質B可根據WO2014/136086 (例如第107-09頁)合成,該案以全文引用之方式併入。
在一些實施例中,可離子化脂質為脂質C,其為2-((4-(((3- (二甲胺基)丙氧基)羰基)氧基)十六醯基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-雙(十八-9,12-二烯酸酯)。脂質C可描繪為:
。
脂質C及脂質D可根據WO2015/095340合成,該案以全文引用之方式併入。
在一些實施例中,可離子化脂質描述於美國專利公開案第20190321489號中。在一些實施例中,可離子化脂質描述於國際專利公開案WO 2010/053572中,該案以引用之方式併入本文中。在一些實施例中,可離子化脂質為描述於WO 2010/053572之第[00225]段之C12-200。
若干可離子化脂質已描述於文獻中,其中許多為市售的。在某些實施例中,該等可離子化脂質包括於本文所描述之轉移媒劑中。在一些實施例中,使用可離子化脂質N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨或「DOTMA」。(Felgner等人Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987);美國專利第4,897,355號)。DOTMA可單獨調配或可與中性脂質、二油醯基磷脂醯乙醇胺或「DOPE」或其他陽離子型脂質或非陽離子型脂質組合至脂質奈米粒子中。其他適合的陽離子型脂質包括例如:如2012年3月29日申請之美國臨時專利申請案61/617,468 (以引用之方式併入本文中)中所描述之可離子化陽離子型脂質,諸如(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-15,18-二烯-1-胺(HGT5000)、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-4,15,18-三烯-1-胺(HGT5001)及(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-5,15,18-三烯-1-胺(HGT5002)、C12-200 (描述於WO 2010/053572中)、2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧戊環-4-基)-N,N-二甲基乙胺(DLinKC2-DMA)) (參見WO 2010/042877;Semple等人, Nature Biotech. 28:172-176 (2010))、2-(2,2-二((9Z,2Z)-十八-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧戊環-4-基)-N,N-二甲基乙胺(DLin-KC2-DMA)、3-(1H-咪唑-4-基)丙酸(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-十四氫-1H-環戊并[a]菲-3-基酯(ICE)、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-15,18-二烯-1-胺(HGT5000)、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-4,15,18-三烯-1-胺(HGT5001)、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-5,15,18-三烯-1-胺(HGT5002)、5-羧基精胺基甘胺酸-二(十八基)醯胺(DOGS)、2,3-二油基氧基-N-[2(精胺-甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙胺鎓(DOSPA) (Behr等人Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989);美國專利第5,171,678號;第5,334,761號)、1,2-二油醯基-3-二甲基銨-丙烷(DODAP)、1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷或(DOTAP)。所考慮之可離子化脂質亦包括1,2-雙芳氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DSDMA)、1,2-二油基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DODMA)、1,2-二亞麻油基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二次亞麻油基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DLenDMA)、N-二油基-N,N-二甲基氯化銨(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DMRIE)、3-二甲胺基-2-(膽固-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(順式,順式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5'-(膽固-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧雜戊烯氧基)-3-二甲基-1-(順式,順式-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油基氧基苯甲胺(DMOBA)、1,2-N,N'-二油基胺甲醯基-3-二甲胺基丙烷(DOcarbDAP)、2,3-二亞麻油醯基氧基-N,N-二甲基丙胺(DLinDAP)、1,2-N,N'-二亞麻油基胺甲醯基-3-二甲胺基丙烷(DLincarbDAP)、1,2-二亞麻油醯基胺甲醯基-3-二甲胺基丙烷(DLinCDAP)、2,2-二亞麻油基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-DMA)、2,2-二亞麻油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-XTC2-DMA)或GL67或其混合物。(Heyes, J.等人, J Controlled Release 107: 276-287 (2005);Morrissey, D V.等人, Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005);PCT公開案WO2005/121348A1)。本發明亦考慮使用基於膽固醇之可離子化脂質調配轉移媒劑(例如脂質奈米粒子)。可使用單獨或與其他脂質組合之該等基於膽固醇之可離子化脂質。適合的基於膽固醇之可離子化脂質包括例如DC-膽固醇(N,N-二甲基-N-乙基甲醯胺基膽固醇)及1,4-雙(3-N-油胺基-丙基)哌𠯤(Gao等人, Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991);Wolf等人BioTechniques 23, 139 (1997);美國專利第5,744,335號)。
亦考慮諸如基於二烷胺基之脂質、基於咪唑之脂質及基於鈲之脂質的陽離子型脂質。舉例而言,亦考慮可離子化脂質3-(1H-咪唑-4-基)丙酸(3S,10R, 13R, 17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-十四氫-1H-環戊并[a]菲-3-基酯(ICE)之使用,如國際申請案第PCT/US2010/058457號中所揭示,該案以引用之方式併入本文中。
亦考慮諸如基於二烷胺基之脂質、基於咪唑之脂質及基於鈲之脂質的可離子化脂質。舉例而言,某些實施例係關於包含如由下文結構(XIII)表示之一或多種基於咪唑之可離子化脂質,例如咪唑膽固醇酯或「ICE」脂質3-(1H-咪唑-4-基)丙酸(3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-十四氫-1H-環戊并[a]菲-3-基酯的組合物。在一實施例中,用於遞送環狀RNA之轉移媒劑可包含如由結構(XIII)表示之一或多種基於咪唑之可離子化脂質,例如咪唑膽固醇酯或「ICE」脂質3-(1H-咪唑-4-基)丙酸(3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2, 3, 4, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-十四氫-1H-環戊并[a]菲-3-基酯。
在不希望受特定理論束縛之情況下,咸信基於咪唑之陽離子型脂質ICE之融合性與藉由咪唑基團促進之胞內體破裂有關,該ICE具有相對於傳統的可離子化脂質而言低之pKa。胞內體破裂繼而促進滲透膨脹及脂質體膜破裂,接著將裝載於其中之(多種)核酸內容物轉染或胞內釋放至目標細胞中。
基於咪唑之可離子化脂質的特徵亦在於其毒性相對於其他可離子化脂質而言降低。
在一些實施例中,可離子化脂質由美國專利公開案第20190314284號描述。在某些實施例中,可離子化脂質藉由結構3、4、5、6、7、8、9或10 (例如HGT4001、HGT4002、HGT4003、HGT4004及/或HGT4005)描述。在某些實施例中,一或多個可裂解官能基(例如二硫鍵)允許例如化合物之親水性官能頭基與親脂性官能尾基解離(例如在暴露於氧化、還原或酸性條件後),藉此便於一或多個目標細胞之脂質雙層中進行相變。舉例而言,當轉移媒劑(例如脂質奈米粒子)包含結構3-10之脂質中之一或多者時,一或多個目標細胞之脂質雙層中之相變便於將環狀RNA遞送至一或多個目標細胞中。
在某些實施例中,可離子化脂質藉由結構(XIV)描述,
其中:
R
1選自由以下組成之群:咪唑、鈲、胺基、亞胺、烯胺、視情況經取代之烷胺基(例如烷胺基,諸如二甲胺基)及吡啶基;
R
2選自由結構XV及結構XVI組成之群;
其中R
3及R
4各自獨立地選自由以下組成之群:視情況經取代之可變飽和或不飽和C
6-C
20烷基及視情況經取代之可變飽和或不飽和C
6-C
20醯基;且其中n為零或任何正整數(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十或更大)。在某些實施例中,R
3及R
4各自為視情況經取代之多不飽和C
18烷基,而在其他實施例中,R
3及R
4各自為未經取代之多不飽和C
18烷基。在某些實施例中,R
3及R
4中之一或多者為(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯。
本文亦揭示包含結構XIV化合物之醫藥組合物,其中R
1選自由以下組成之群:咪唑、鈲、胺基、亞胺、烯胺、視情況經取代之烷胺基(例如烷胺基,諸如二甲胺基)及吡啶基;其中R
2為結構XV;且其中n為零或任何正整數。本文進一步揭示包含結構XIV化合物之醫藥組合物,其中R
1選自由以下組成之群:咪唑、鈲、胺基、亞胺、烯胺、視情況經取代之烷胺基(例如烷胺基,諸如二甲胺基)及吡啶基;其中R
2為結構XVI;其中R
3及R
4各自獨立地選自由以下組成之群:視情況經取代之可變飽和或不飽和C
6-C
20烷基及視情況經取代之可變飽和或不飽和C
6-C
20醯基;且其中n為零或任何正整數。在某些實施例中,R
3及R
4各自為視情況經取代之多不飽和C
18烷基,而在其他實施例中,R
3及R
4各自為未經取代之多不飽和C
18烷基(例如十八-9,12-二烯)。
在某些實施例中,R
1基團或頭基為極性或親水性基團(例如咪唑、鈲及胺基中之一或多者)且藉助於二硫鍵(S-S)可裂解連接子基團結合至R
2脂質基團,例如如結構XIV中所描繪。其他所考慮之可裂解連接子基團可包括包含與例如烷基(例如C
1至C
10烷基)結合(例如共價結合)之一或多個二硫鍵(S-S)連接子基團的組合物。在某些實施例中,R1基團藉助於C
1-C
20烷基共價結合至可裂解連接子基團(例如其中n為一至二十),或可替代地可直接結合至可裂解連接子基團(例如其中n為零)。在某些實施例中,二硫鍵連接子基團在活體外及/或活體內可裂解(例如以酶可裂解或在暴露於酸性或還原條件後可裂解)。
在某些實施例中,本發明係關於具有結構XVII之化合物5-(((10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊并[a]菲-3-基)二硫基)甲基)-1H-咪唑(在本文中稱為「HGT4001」)。
在某些實施例中,本發明係關於具有結構XVIII之化合物1-(2-(((3S,10R,13R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊并[a]菲-3-基)二硫基)乙基)胍(在本文中稱為「HGT4002」)。
在某些實施例中,描述為結構3-10之化合物為可離子化脂質。
化合物且特定言之描述為結構3-8之基於咪唑之化合物(例如HGT4001及HGT4004)的特徵在於其尤其相對於傳統的可離子化脂質而言降低之毒性。在一些實施例中,本文所描述之轉移媒劑包含一或多種基於咪唑之可離子化脂質化合物以使得該等醫藥組合物或脂質體組合物中之其他毒性更高之可離子化脂質的相對濃度可降低或以其他方式消除。
可離子化脂質包括國際專利申請案PCT/US2019/025246及美國專利公開案2017/0190661及2017/0114010中所揭示之可離子化脂質,該等案以全文引用之方式併入本文中。可離子化脂質可包括選自下表12、13、14或15a之脂質。
表 12 表 13 表 14 表 15a
在某些實施例中,用於遞送環狀RNA之轉移媒劑組合物包含胺脂質。在某些實施例中,可離子化脂質為胺脂質。在一些實施例中,胺脂質描述於國際專利申請案PCT/US2018/053569中。
在一些實施例中,胺脂質為脂質E,其為十八-9, 12-二烯酸(9Z, 12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。
脂質E可根據WO2015/095340 (例如第84-86頁)合成。在某些實施例中,胺脂質為脂質E之等效物。
在某些實施例中,胺脂質為脂質E之類似物。在某些實施例中,脂質E類似物為脂質E之縮醛類似物。在特定轉移媒劑組合物中,縮醛類似物為C4-C12縮醛類似物。在一些實施例中,縮醛類似物為C5-C12縮醛類似物。在額外實施例中,縮醛類似物為C5-C10縮醛類似物。在另外實施例中,縮醛類似物係選自C4、C5、C6、C7、C9、C10、C11及C12縮醛類似物。
適用於本文所描述之例如脂質奈米粒子之轉移媒劑中的胺脂質及其他生物可降解脂質為活體內生物可降解的。本文所描述之胺脂質具有低毒性(例如在動物模型中在大於或等於10 mg/kg之量下耐受而無副作用)。在某些實施例中,包括胺脂質之轉移媒劑包括其中在8、10、12、24或48小時或3、4、5、6、7或10天內至少75%胺脂質自血漿清除的轉移媒劑。
生物可降解脂質包括例如WO2017/173054、WO2015/095340及WO2014/136086之生物可降解脂質。
脂質清除率可以熟習此項技術者已知之方法量測。參見例如Maier, M.A.等人Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics. Mol. Ther. 2013, 21(8), 1570-78。
包含胺脂質之轉移媒劑組合物可引起清除率增加。在一些實施例中,清除率為脂質清除率,例如自血液、血清或血漿清除脂質之速率。在一些實施例中,清除率為RNA清除率,例如自血液、血清或血漿清除環狀RNA之速率。在一些實施例中,清除率為自血液、血清或血漿清除轉移媒劑之速率。在一些實施例中,清除率為自諸如肝組織或脾組織之組織清除轉移媒劑之速率。在某些實施例中,高清除率會產生無顯著副作用之安全分佈。胺脂質及生物可降解脂質可減少循環中及組織中之轉移媒劑積聚。在一些實施例中,循環中及組織中之轉移媒劑積聚減少會產生無顯著副作用之安全分佈。
脂質可視其所處之介質之pH而離子化。舉例而言,在弱酸性介質中,諸如胺脂質之脂質可經質子化且因此帶有正電荷。相反地,在弱鹼性介質中,諸如在其中pH為大致7.35之血液中,諸如胺脂質之脂質可不經質子化且因此不帶電荷。
脂質帶有電荷之能力與其固有pKa有關。在一些實施例中,本發明之胺脂質可各自獨立地具有在約5.1至約7.4範圍內之pKa。在一些實施例中,本發明之生物可用脂質可各自獨立地具有在約5.1至約7.4範圍內之pKa。舉例而言,本發明之胺脂質可各自獨立地具有在約5.8至約6.5範圍內之pKa。pKa在約5.1至約7.4範圍內之脂質有效用於活體內遞送貨物,例如遞送至肝。此外,已發現,pKa在約5.3至約6.4範圍內之脂質有效用於活體內遞送,例如遞送至腫瘤中。參見例如WO2014/136086。
b 含有二硫鍵之脂質
在一些實施例中,可離子化脂質描述於美國專利9,708,628中。
X
1中之R
4為具有1-6個碳原子之烷基,其可為直鏈、分支鏈或環狀的。烷基較佳具有1-3之碳數。具有1-6個碳原子之烷基之特定實例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、二級丁基、異丁基、三級丁基、戊基、異戊基、新戊基、三級戊基、1,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、環己基及其類似。R
4較佳為甲基、乙基、丙基或異丙基,最佳為甲基。
X
2中之s為1或2。當s為1時,X
2為吡咯啶鎓基團,且當s為2時,X
2為哌啶鎓基團。s較佳為2。儘管X
2之結合方向不受限制,但X
2中之氮原子較佳結合至R
1a及R
1b。
X
a可與X
b相同或不同,且X
a較佳為與X
b相同之基團。
n
a及n
b各自獨立地為0或1,較佳為1。當n
a為1時,R
3a經由Y
a及R
2a結合至X
a,且當n
a為0時,採用R
3a-X
a-R
1a-S-結構。類似地,當n
b為1時,R
3b經由Y
b及R
2b結合至X
b,且當n
b為0時,採用R
3b-X
b-R
1b-S-結構。
n
a可與n
b相同或不同,且n
a較佳與n
b相同。
R
1a及R
1b各自獨立地為具有1-6個碳原子之伸烷基,其可為直鏈或分支鏈的,較佳為直鏈的。具有1-6個碳原子之伸烷基之特定實例包括亞甲基、伸乙基、三亞甲基、伸異丙基、四亞甲基、伸異丁基、五亞甲基、伸新戊基及其類似。R
1a及R
1b各自較佳為亞甲基、伸乙基、三亞甲基、伸異丙基或四亞甲基,最佳為伸乙基。
R
1a可與R
1b相同或不同,且R
1a較佳為與R
1b相同之基團。
R
2a及R
2b各自獨立地為具有1-6個碳原子之伸烷基,其可為直鏈或分支鏈的,較佳為直鏈的。具有1-6個碳原子之伸烷基之實例包括敍述為用於R
1a或R
1b之具有1-6個碳原子之伸烷基之實例的伸烷基。R
2a及R
2b各自較佳為亞甲基、伸乙基、三亞甲基、伸異丙基或四亞甲基。
當X
a及X
b各自為X
1時,R
2a及R
2b較佳為三亞甲基。當X
a及X
b各自為X
2時,R
2a及R
2b較佳為伸乙基。
R
2a可與R
2b相同或不同,且R
2a較佳為與R
2b相同之基團。
Y
a及Y
b各自獨立地為酯鍵、醯胺鍵、胺基甲酸酯鍵、醚鍵或脲鍵,較佳為酯鍵、醯胺鍵或胺基甲酸酯鍵,最佳為酯鍵。儘管Y
a及Y
b之結合方向不受限制,但當Y
a為酯鍵時,R
3a-CO-O-R
2a-結構為較佳的,且當Y
b為酯鍵時,R
3b-CO-O-R
2b-結構為較佳的。
Y
a可與Y
b相同或不同,且Y
a較佳為與Y
b相同之基團。
R
3a及R
3b各自獨立地為固醇殘基、脂溶性維生素殘基或具有12-22個碳原子之脂族烴基,較佳為脂溶性維生素殘基或具有12-22個碳原子之脂族烴基,最佳為脂溶性維生素殘基。
固醇殘基之實例包括膽固醇基(膽固醇殘基)、膽固烷醇基(cholestaryl) (膽固烷醇殘基)、豆固醇基(豆固醇殘基)、β-穀固醇基(β-穀固醇殘基)、羊毛固醇基(羊毛固醇殘基)及麥角固醇基(麥角固醇殘基)及其類似。固醇殘基較佳為膽固醇基或膽固烷醇基。
可使用衍生自脂溶性維生素之殘基以及衍生自藉由將作為脂溶性維生素中之官能基的羥基、醛或羧酸適當地轉化成其他反應性官能基而獲得之衍生物的殘基作為脂溶性維生素殘基。關於具有羥基之脂溶性維生素,舉例而言,羥基可藉由與丁二酸酐、戊二酸酐及其類似反應而轉化成羧酸。脂溶性維生素之實例包括視黃酸、視黃醇、視黃醛、麥角固醇、7-去氫膽固醇、促鈣醇、膽鈣化醇、二氫麥角鈣化醇、二氫速留醇、生育酚、參雙鍵生殖酚及其類似。脂溶性維生素之較佳實例包括視黃酸及生育酚。
具有12-22個碳原子之脂族烴基可為直鏈或分支鏈的,較佳為直鏈的。脂族烴基可為飽和或不飽和的。在不飽和脂族烴基之情況下,脂族烴基一般含有1-6個、較佳1-3個、更佳1-2個不飽和鍵。儘管不飽和鍵包括碳-碳雙鍵及碳-碳參鍵,但其較佳為碳-碳雙鍵。脂族烴基之碳數較佳為12-18,最佳為13-17。儘管脂族烴基包括烷基、烯基、炔基及其類似,但其較佳為烷基或烯基。具有12-22個碳原子之脂族烴基之特定實例包括十二基、十三基、十四基、十五基、十六基、十七基、十八基、十九基、二十基、二十一基、二十二基、十二烯基、十三烯基、十四烯基、十五烯基、十六烯基、十七烯基、十八烯基、十九烯基、二十烯基、二十一烯基、二十二烯基、癸二烯基、十三碳二烯基、十四碳二烯基、十五碳二烯基、十六碳二烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、二十碳二烯基、二十一碳二烯基、二十二碳二烯基、十八碳三烯基、二十碳三烯基、二十碳四烯基、二十碳五烯基、二十二碳六烯基、異硬脂基及其類似。具有12-22個碳原子之脂族烴基較佳為十三基、十四基、十七基、十八基、十七碳二烯基或十八碳二烯基,尤其較佳為十三基、十七基或十七碳二烯基。
在一個實施例中,使用衍生自脂肪酸、脂族醇或脂族胺之具有12-22個碳原子之脂族烴基。當R
3a(或R
3b)衍生自脂肪酸時,Y
a(或Y
b)為酯鍵或醯胺鍵,且脂肪酸衍生之羰基碳包括於Y
a(或Y
b)中。舉例而言,當使用亞麻油酸時,R
3a(或R
3b)為十七碳二烯基。
R
3a可與R
3b相同或不同,且R
3a較佳為與R
3b相同之基團。
在一個實施例中,X
a與X
b相同,n
a與n
b相同,R
1a與R
1b相同,R
2a與R
2b相同,R
3a與R
3b相同,且Y
a與Y
b相同。
在一個實施例中,
X
a及X
b各自獨立地為X
1,
R
4為具有1-3個碳原子之烷基,n
a及n
b各自為1,
R
1a及R
1b各自獨立地為具有1-6個碳原子之伸烷基,
R
2a及R
2b各自獨立地為具有1-6個碳原子之伸烷基,
Y
a及Y
b各自為酯鍵或醯胺鍵,且
R
3a及R
3b各自獨立地為具有12-22個碳原子之脂族烴基。
在一個實施例中,
X
a及X
b各自為X
1,
R
4為具有1-3個碳原子之烷基,n
a及n
b各自為1,
R
1a及R
1b各自為具有1-6個碳原子之伸烷基,
R
2a及R
2b各自為具有1-6個碳原子之伸烷基,
Y
a及Y
b各自為酯鍵或醯胺鍵,
R
3a及R
3b各自為具有12-22個碳原子之脂族烴基,
X
a與X
b相同,
R
1a與R
1b相同,
R
2a與R
2b相同,且
R
3a與R
3b相同。
在一個實施例中,
X
a及X
b各自為X
1,
R
4為甲基,n
a及n
b各自為1,
R
1a及R
1b各自為伸乙基,
R
2a及R
2b各自為三亞甲基,
Y
a及Y
b各自為—CO—O—,且
R
3a及R
3b各自獨立地為具有13-17個碳原子之烷基或烯基。
在一個實施例中,
X
a及X
b各自為X
1,
R
4為甲基,n
a及n
b各自為1,
R
1a及R
1b各自為伸乙基,
R
2a及R
2b各自為三亞甲基,
Y
a及Y
b各自為—CO—O—,
R
3a及R
3b各自為具有13-17個碳原子之烷基或烯基,且
R
3a與R
3b相同。
在一個實施例中,
X
a及X
b各自獨立地為X
1,
R
4為具有1-3個碳原子之烷基,n
a及n
b各自為1,
R
1a及R
1b各自獨立地為具有1-6個碳原子之伸烷基,
R
2a及R
2b各自獨立地為具有1-6個碳原子之伸烷基,
Y
a及Y
b各自為酯鍵或醯胺鍵,且
R
3a及R
3b各自獨立地為脂溶性維生素殘基(例如視黃酸殘基、生育酚殘基)。
在一個實施例中,
X
a及X
b各自為X
1,
R
4為具有1-3個碳原子之烷基,n
a及n
b各自為1,
R
1a及R
1b各自為具有1-6個碳原子之伸烷基,
R
2a及R
2b各自為具有1-6個碳原子之伸烷基,
Y
a及Y
b各自為酯鍵或醯胺鍵,
R
3a及R
3b各自為脂溶性維生素殘基(例如視黃酸殘基、生育酚殘基),
X
a與X
b相同,
R
1a與R
1b相同,
R
2a與R
2b相同,且
R
3a與R
3b相同。
在一個實施例中,
X
a及X
b各自為X
1,
R
4為甲基,n
a及n
b各自為1,
R
1a及R
1b各自為伸乙基,
R
2a及R
2b各自為三亞甲基,
Y
a及Y
b各自為—CO—O—,且
R
3a及R
3b各自獨立地為脂溶性維生素殘基(例如視黃酸殘基、生育酚殘基)。
在一個實施例中,
X
a及X
b各自為X
1,
R
4為甲基,n
a及n
b各自為1,
R
1a及R
1b各自為伸乙基,
R
2a及R
2b各自為三亞甲基,
Y
a及Y
b各自為—CO—O—,
R
3a及R
3b各自為脂溶性維生素殘基(例如視黃酸殘基、生育酚殘基),且
R
3a與R
3b相同。
在一個實施例中,
X
a及X
b各自獨立地為X
2,
t為2,
R
1a及R
1b各自獨立地為具有1-6個碳原子之伸烷基,
R
2a及R
2b各自獨立地為具有1-6個碳原子之伸烷基,
Y
a及Y
b各自為酯鍵,且
R
3a及R
3b各自獨立地為脂溶性維生素殘基(例如視黃酸殘基、生育酚殘基)或具有12-22個碳原子之脂族烴基(例如具有12-22個碳原子之烷基)。
在一個實施例中,
X
a及X
b各自獨立地為X
2,
t為2,
R
1a及R
1b各自獨立地為具有1-6個碳原子之伸烷基,
R
2a及R
2b各自獨立地為具有1-6個碳原子之伸烷基,
Y
a及Y
b各自為酯鍵,
R
3a及R
3b各自獨立地為脂溶性維生素殘基(例如視黃酸殘基、生育酚殘基)或具有12-22個碳原子之脂族烴基(例如具有12-22個碳原子之烷基),
X
a與X
b相同,
R
1a與R
1b相同,
R
2a與R
2b相同,且
R
3a與R
3b相同。
在一個實施例中,
X
a及X
b各自獨立地為X
2,
t為2,
R
1a及R
1b各自為伸乙基,
R
2a及R
2b各自獨立地為具有1-6個碳原子之伸烷基,
Y
a及Y
b各自為酯鍵,
R
3a及R
3b各自獨立地為脂溶性維生素殘基(例如視黃酸殘基、生育酚殘基)或具有12-22個碳原子之脂族烴基(例如具有12-22個碳原子之烷基),
X
a與X
b相同,
R
2a與R
2b相同,且
R
3a與R
3b相同。
本發明之脂質可具有-S-S-(二硫)鍵。用於此類化合物之生產方法包括例如:一種包括以下之方法:產生
R
3a—(Y
a—R
2a)n
a—X
a—R
1a—SH及
R
3b—(Y
b—R
2b)n
b—X
b—R
1b—SH,及
使其進行氧化(偶合),得到含有-S-S-之化合物;一種包括以下之方法:使必需部分依序鍵結至含有-S-S-鍵之化合物,最終獲得本發明化合物;及其類似。較佳為後一方法。
後一方法之特定實例示於下文中,其不應解釋為限制。
起始化合物之實例包括含-S-S-鍵之雙末端羧酸、雙末端羧酸酯、雙末端胺、雙末端異氰酸酯、雙末端醇、具有諸如MsO (甲磺酸酯基)及其類似之離去基之雙末端醇、具有諸如pNP (對硝基苯基碳酸酯基)及其類似之離去基之雙末端碳酸酯。
舉例而言,當產生含有用於X
a及X
b之X
1或X
2的化合物時,使含有-S-S-鍵之化合物(1)之雙末端官能基與具有-NH-基團及一個官能基在末端之化合物(2)中的-NH-基團反應,使化合物(2)中不促成該反應之末端官能基與含有R
3之化合物(3)中之官能基反應,由此可獲得含有-S-S-鍵、R
1a及R
1b、X
a及X
b、R
2a及R
2b、Y
a及Y
b以及R
3a及R
3b之本發明化合物。
在化合物(1)與化合物(2)之反應中,可使用諸如碳酸鉀、碳酸鈉、三級丁醇鉀及其類似之鹼催化劑作為催化劑,或可在無催化劑之情況下執行該反應。較佳地,使用碳酸鉀或碳酸鈉作為催化劑。
相對於化合物(1),催化劑之量為0.1-100莫耳當量、較佳0.1-20莫耳當量、更佳0.1-5莫耳當量。相對於化合物(1),待裝之化合物(2)之量為1-50莫耳當量、較佳1-10莫耳當量。
待用於化合物(1)與化合物(2)之反應之溶劑無特別限制,只要其為不抑制反應之溶劑或水溶液。舉例而言,可提及乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、苯、甲苯及其類似。其中,甲苯及氯仿為較佳。
反應溫度為-20℃至200℃、較佳0℃至80℃、更佳20℃至50℃,且反應時間為1-48小時、較佳2-24小時。
當使化合物(1)與化合物(2)之反應產物與化合物(3)反應時,可使用諸如碳酸鉀、碳酸鈉、三級丁醇鉀及其類似之鹼催化劑或諸如PTS (對甲苯磺酸)、MSA (甲磺酸)及其類似之酸催化劑,如用於化合物(1)與化合物(2)之反應的催化劑,或可在無催化劑之情況下執行該反應。
另外,可藉由使用諸如DCC (二環己基碳化二亞胺)、DIC (二異丙基碳化二亞胺)、EDC (1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽)及其類似之縮合劑使化合物(1)與化合物(2)之反應產物與化合物(3)直接反應。可替代地,可用縮合劑處理化合物(3)以一次轉化成酸酐及其類似,之後使其與化合物(1)與化合物(2)之反應產物反應。
相對於化合物(1)與化合物(2)之反應產物,待裝填之化合物(3)之量為1-50莫耳當量、較佳1-10莫耳當量。
待使用之催化劑係根據待反應之官能基適當地選擇。
相對於化合物(1),催化劑之量為0.05-100莫耳當量、較佳0.1-20莫耳當量、更佳0.2-5莫耳當量。
待用於化合物(1)與化合物(2)之反應產物同化合物(3)之反應的溶劑不受特定限制,只要其為不抑制反應之溶劑或水溶液即可。舉例而言,可提及乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、苯、甲苯及其類似。其中,甲苯及氯仿為較佳的。
反應溫度為0℃至200℃、較佳0℃至120℃、更佳20℃至50℃,且反應時間為1小時-48小時、較佳2-24小時。
藉由上文所提及之反應獲得之反應產物可藉由一般純化方法,例如用水洗滌、矽膠管柱層析法、結晶、再結晶、液-液萃取、再沈澱、離子交換管柱層析法及其類似來適當地純化。
c. 結構XXIII脂質
在一些實施例中,可離子化脂質描述於美國專利9,765,022中。
在結構XXIII中,親水性及視情況帶正電頭為
其中R
a、R
a'、R
a''及R
a'''中之各者獨立地為H、C
1-C
20單價脂族基、C
1-C
20單價雜脂族基、單價芳基或單價雜芳基,且Z為C
1-C
20二價脂族基、C
1-C
20二價雜脂族基、二價芳基或二價雜芳基;B為C
1-C
24單價脂族基、C
1-C
24單價雜脂族基、單價芳基、單價雜芳基或
R
1及R
4中之各者獨立地為鍵、C
1-C
10二價脂族基、C
1-C
10二價雜脂族基、二價芳基或二價雜芳基;R
2及R
5中之各者獨立地為鍵、C
1-C
20二價脂族基、C
1-C
20二價雜脂族基、二價芳基或二價雜芳基;R
3及R
6中之各者獨立地為C
1-C
20單價脂族基、C
1-C
20單價雜脂族基、單價芳基或單價雜芳基;作為疏水性尾之
及亦作為疏水性尾之
中之各者具有8至24個碳原子;且作為連接子之X及亦作為連接子之Y中之各者獨立地為
其中m、n、p、q及t中之各者獨立地為1-6;W為O、S或NR
c;直接連接至R
1、R
2、R
4或R
5之L
1、L
3、L
5、L
7及L
9中之各者獨立地為鍵、O、S或NR
d;L
2、L
4、L
6、L
8及L
10中之各者獨立地為鍵、O、S或NR
e;V為OR
f、SR
g或NR
hR
i;且R
b、R
c、R
d、R
e、R
f、R
g、R
h及R
i中之各者獨立地為H、OH、C
1-
10氧基脂族基、C
1-C
10單價脂族基、C
1-C
10單價雜脂族基、單價芳基或單價雜芳基。
上文所描述之脂質樣化合物之子集包括以下脂質樣化合物,其中A為
,R
a及R
a'中之各者獨立地為C
1-C
10單價脂族基、C
1-C
10單價雜脂族基、單價芳基或單價雜芳基;且Z為C
1-C
10二價脂族基、C
1-C
10二價雜脂族基、二價芳基或二價雜芳基。
本發明之一些脂質樣化合物之特點在於R
1及R
4中之各者獨立地為C
1-C
6(例如C
1-C
4)二價脂族基或C
1-C
6(例如C
1-C
4)二價雜脂族基,R
2及R
3之總碳數為12-20 (例如14-18),R
5及R
6之總碳數亦為12-20 (例如14-18),且X及Y中之各者獨立地為
。
仍在本發明之範疇內的為含有由蛋白質及生物可還原化合物形成之奈米複合物的醫藥組合物。在此醫藥組合物中,奈米複合物之粒度為50至500 nm;生物可還原化合物含有二硫鍵疏水性部分、親水性部分及連接二硫鍵疏水性部分與親水性部分之連接子;且蛋白質經由非共價相互作用、共價鍵或兩者結合至生物可還原化合物。
在某些實施例中,二硫鍵疏水性部分為含有一或多個-S-S-基團及8至24個碳原子之雜脂族基;親水性部分為含有一或多個親水性基團及1-20個碳原子之脂族或雜脂族基,親水性基團中之各者為胺基、烷胺基、二烷胺基、三烷胺基、四烷基銨、羥胺基、羥基、羧基、羧酸酯、胺基甲酸酯、碳醯胺、碳酸酯、磷酸酯、亞磷酸酯、硫酸酯、亞硫酸酯或硫代硫酸酯;且連接子為O、S、Si、C
1-C
6伸烷基、
,其中變數定義於上文。
在一些實施例中,如以上結構XXIII中所示,本發明之脂質樣化合物包括(i)親水性頭A;(ii)疏水性尾R
2-S-S-R
3;及(iii)連接子X。視情況而言,此等化合物含有第二疏水性尾R
5-S-S-R
6及第二連接子Y。
結構XXIII之親水性頭含有一或多個例如羥基、羰基、羧基、胺基、硫氫基、磷酸酯、醯胺、酯、醚、胺基甲酸酯、碳酸酯、碳醯胺及磷酸二酯之親水性官能基。此等基團可形成氫鍵且視情況帶正電或帶負電。
其他實例包括Akinc等人, Nature Biotechnology, 26, 561-69 (2008)及Mahon等人, 美國專利申請公開案2011/0293703中所描述之親水性頭。
結構XXIII之疏水性尾為含有二硫鍵及8-24個碳原子之飽和或不飽和、直鏈或分支鏈、非環狀或環狀、芳族或非芳族烴部分。碳原子中之一或多者可經諸如N、O、P、B、S、Si、Sb、Al、Sn、As、Se及Ge之雜原子置換。尾視情況經上文所描述之一或多個基團取代。含有此二硫鍵之脂質樣化合物可為生物可還原的。
結構XXIII之連接子連接親水性頭與疏水性尾。連接子可為例如O、S、Si、胺基、伸烷基、酯、醯胺、胺基甲酸酯、碳醯胺、碳酸酯、磷酸酯、亞磷酸酯、硫酸酯、亞硫酸酯及硫代硫酸酯之任何親水性或疏水性、極性或非極性化學基團。實例包括:
。
結構XXIII之脂質樣化合物可藉由此項技術中熟知之方法來製備。參見Wang等人, ACS Synthetic Biology, 1, 403-07 (2012);Manoharan等人, 國際專利申請公開案WO 2008/042973;及Zugates等人, 美國專利8,071,082。下文所示之途徑例示此等脂質樣化合物之合成:
。
L
a、L
a'、L及L'中之各者可為L
1-L
10中之一者;W
a及W
b中之各者獨立地為W或V;且R
a及R
1-R
6以及L
1-L
10、W及V定義於上文。
在此例示性合成途徑中,使胺化合物,亦即化合物D與溴化物E1及E2反應以形成化合物F,隨後使其與G1及G2兩者偶合,獲得最終產物,亦即化合物H。此化合物(上文所示)中之雙鍵中之一或兩者可還原成一或兩個單鍵以獲得不同的結構XXIII之脂質樣化合物。
其他本發明之脂質樣化合物可使用其他適合的起始材料經由上文所描述之合成途徑及此項技術中已知之其他合成途徑來製備。上文所闡述之方法可包括用於添加或移除適合的保護基以便最終允許合成脂質樣化合物之(多個)額外步驟。另外,可按替代順序或次序執行各種合成步驟以得到所需材料。可用於合成可適用的脂質樣化合物之合成化學轉換及保護基方法(保護及去保護)係此項技術中已知的,包括例如R. Larock, Comprehensive Organic Transformations (第2版, VCH Publishers 1999);P. G. M. Wuts及T. W. Greene, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis (第4版, John Wiley and Sons 2007);L. Fieser及M. Fieser, Fieser and Fieser' s Reagents for Organic Synthesis (John Wiley and Sons 1994);及L. Paquette編, Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis (第2版, John Wiley and Sons 2009)及其後續版本。某些脂質樣化合物可含有非芳族雙鍵及一或多個不對稱中心。因此,其可以外消旋體及外消旋混合物、單一對映異構體、個別非對映異構體、非對映異構體混合物及順式或反式異構體形式存在。考慮所有該等異構體形式。
如上文所提及,此等脂質樣化合物可用於遞送醫藥劑。可藉由活體外分析初步篩檢其在遞送醫藥劑中之功效,且隨後藉由動物實驗及臨床試驗進行確認。其他方法亦將對一般熟習此項技術者顯而易見。
不受任何理論束縛,結構XXIII之脂質樣化合物便於藉由形成例如奈米複合物及微米粒子之複合物來遞送醫藥劑。此類脂質樣化合物之帶正電或帶負電親水性頭結合至醫藥劑之帶相反電荷之部分,且其疏水性部分結合至醫藥劑之疏水性部分。任一結合可為共價或非共價的。
上文所描述之複合物可使用諸如Wang等人, ACS Synthetic Biology, 1, 403-07 (2012)之公開案中所描述之程序來製備。一般而言,其係藉由在諸如乙酸鈉緩衝液或磷酸鹽緩衝鹽水(「PBS」)之緩衝液中培育脂質樣化合物及醫藥劑而獲得。
i. 親水性基團
在某些實施例中,選定親水性官能基或部分可改變或以其他方式賦予化合物或該化合物為其組分之轉移媒劑以特性(例如藉由改善該化合物為其組分之脂質奈米粒子的轉染效率)。舉例而言,在本文所揭示之化合物中併入鈲作為親水性頭基可促進該等化合物(或該等化合物為其組分之轉移媒劑)與一或多個目標細胞之細胞膜的融合,藉此增強例如該等化合物之轉染效率。已假設,來自親水性鈲部分之氮形成六員環過渡態,此將穩定性授予至相互作用且因此允許經囊封材料之細胞吸收。(Wender等人, Adv. Drug Del. Rev. (2008) 60: 452-472。) 類似地,將一或多個胺基或部分併入所揭示之化合物中(例如作為頭基)可進一步促進藉由採用該等胺基之融合性來使目標細胞之胞內體/溶酶體膜破裂。此不僅基於組合物之胺基之pKa,且亦基於胺基進行六方相變且與目標細胞表面,亦即囊泡膜融合之能力。(Koltover等人Science (1998) 281: 78-81。) 咸信所得物會促進囊泡膜破裂及脂質奈米粒子內容物釋放至目標細胞中。
類似地,在某些實施例中,將例如咪唑作為親水性頭基併入本文所揭示之化合物中可用以促進例如囊封於本發明之轉移媒劑(例如脂質奈米粒子)中之內容物的胞內體或溶酶體釋放。該增強之釋放可藉由質子-海綿介導之破裂機制及/或增強之融合機制中之一或兩者來達成。質子-海綿機制係基於化合物且特定言之該化合物之官能部分或基團緩衝胞內體酸化之能力。此可藉由該化合物或構成該化合物之官能基中之一或多者(例如咪唑)之pKa來操縱或以其他方式控制。因此,在某些實施例中,例如本文所揭示之基於咪唑之化合物(例如HGT4001及HGT4004)的融合性與胞內體破裂特性相關,該等特性由該等咪唑基團促進,該等咪唑基團具有相對於其他傳統的可離子化脂質而言低之pKa。該等胞內體破裂特性繼而促進滲透膨脹及脂質體膜破裂,接著將裝載或囊封於其中之聚核苷酸物質轉染或胞內釋放至目標細胞中。此現象可適用於除咪唑部分以外具有所需pKa概況之各種化合物。該等實施例亦包括基於多氮之官能基,諸如基於多元胺、多肽(組胺酸)及氮之樹突狀結構。
例示性可離子化脂質及/或陽離子型脂質描述於國際PCT專利公開案WO2015/095340、WO2015/199952、WO2018/011633、WO2017/049245、WO2015/061467、WO2012/040184、WO2012/000104、WO2015/074085、WO2016/081029、WO2017/004143、WO2017/075531、WO2017/117528、WO2011/022460、WO2013/148541、WO2013/116126、WO2011/153120、WO2012/044638、WO2012/054365、WO2011/090965、WO2013/016058、WO2012/162210、WO2008/042973、WO2010/129709、WO2010/144740、WO2012/099755、WO2013/049328、WO2013/086322、WO2013/086373、WO2011/071860、WO2009/132131、WO2010/048536、WO2010/088537、WO2010/054401、WO2010/054406、WO2010/054405、WO2010/054384、WO2012/016184、WO2009/086558、WO2010/042877、WO2011/000106、WO2011/000107、WO2005/120152、WO2011/141705、WO2013/126803、WO2006/007712、WO2011/038160、WO2005/121348、WO2011/066651、WO2009/127060、WO2011/141704、WO2006/069782、WO2012/031043、WO2013/006825、WO2013/033563、WO2013/089151、WO2017/099823、WO2015/095346及WO2013/086354以及US專利公開案US2016/0311759、US2015/0376115、US2016/0151284、US2017/0210697、US2015/0140070、US2013/0178541、US2013/0303587、US2015/0141678、US2015/0239926、US2016/0376224、US2017/0119904、US2012/0149894、US2015/0057373、US2013/0090372、US2013/0274523、US2013/0274504、US2013/0274504、US2009/0023673、US2012/0128760、US2010/0324120、US2014/0200257、US2015/0203446、US2018/0005363、US2014/0308304、US2013/0338210、US2012/0101148、US2012/0027796、US2012/0058144、US2013/0323269、US2011/0117125、US2011/0256175、US2012/0202871、US2011/0076335、US2006/0083780、US2013/0123338、US2015/0064242、US2006/0051405、US2013/0065939、US2006/0008910、US2003/0022649、US2010/0130588、US2013/0116307、US2010/0062967、US2013/0202684、US2014/0141070、US2014/0255472、US2014/0039032、US2018/0028664、US2016/0317458及US2013/0195920中,所有該等案之內容以全文引用之方式併入本文中。國際專利申請案WO 2019/131770亦以全文引用之方式併入本文中。
B.
穩定化脂質
穩定化脂質或表面穩定化脂質可用於增強LNP之結構。如本文所考慮之穩定化脂質可為經聚乙二醇(PEG)改質之磷脂。亦考慮在本文所描述之脂質體及醫藥組合物中使用及包括經聚乙二醇(PEG)改質之磷脂及衍生脂質,諸如衍生神經醯胺(PEG-CER),包括N-辛醯基-神經鞘胺醇-1-[丁二醯基(甲氧基聚乙二醇)-2000] (C8 PEG-2000神經醯胺),較佳與本文所揭示之化合物及脂質中之一或多者的組合。所考慮之經PEG改質之脂質包括但不限於與具有(多個) C6-C20長度之烷基鏈之脂質共價連接的長度為至多5 kDa之聚乙二醇鏈。在一些實施例中,本發明之組合物及方法中所採用之經PEG改質之脂質為1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(2000 MW PEG)「DMG-PEG2000」。將經PEG改質之脂質添加至脂質遞送媒劑中可防止複雜聚集,且亦可提供用於延長循環壽命且增加脂質-聚核苷酸組合物遞送至目標組織之方式(Klibanov等人, (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237),或其可經選擇以快速交換出活體內調配物(參見美國專利第5,885,613號)。特別適用之可交換脂質為具有較短醯基鏈(例如C14或C18)之PEG-神經醯胺。本發明之經PEG改質之磷脂及衍生脂質可占脂質體脂質奈米粒子中存在之總脂質的約0%至約20%、約0.5%至約20%、約1%至約15%、約4%至約10%或約2%之莫耳比。
在一實施例中,經PEG改質之脂質描述於國際專利申請案第PCT/US2019/015913號中,該案以全文引用之方式併入本文中。在一實施例中,轉移媒劑包含一或多種經PEG改質之脂質。
經PEG改質之脂質之非限制性實例包括經PEG改質之磷脂醯乙醇胺及磷脂酸、PEG-神經醯胺結合物(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)、經PEG改質之二烷基胺及經PEG改質之1,2-二醯基氧基丙-3-胺。在一些另外實施例中,經PEG改質之脂質可為例如PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE。
在一些再另外實施例中,經PEG改質之脂質包括但不限於1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[胺基(聚乙二醇)] (PEG-DSPE)、PEG-二硬脂基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕櫚油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二醯基甘油醯胺(PEG-DAG)、PEG-二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-l,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。
在各種實施例中,經PEG改質之脂質亦可稱為「聚乙二醇化脂質」或「PEG-脂質」。
在一個實施例中,PEG-脂質選自由以下組成之群:經PEG改質之磷脂醯乙醇胺、經PEG改質之磷脂酸、經PEG改質之神經醯胺、經PEG改質之二烷基胺、經PEG改質之二醯基甘油、經PEG改質之二烷基甘油及其混合物。
在一些實施例中,PEG-脂質之脂質部分包括長度為約C
14至約C
22、較佳約C
14至約C
16之脂質部分。在一些實施例中,例如mPEG-NH
2之PEG部分之大小為約1000、約2000、約5000、約10,000、約15,000或約20,000道爾頓。在一個實施例中,PEG-脂質為PEG2k-DMG。
在一個實施例中,本文所描述之脂質奈米粒子可包含經非可擴散PEG改質之脂質。非可擴散PEG之非限制性實例包括PEG-DSG及PEG-DSPE。
PEG-脂質為此項技術中已知的,諸如美國專利第8,158,601號及國際專利公開案第WO2015/130584 A2號中所描述之PEG-脂質,該等案以全文引用之方式併入本文中。
在各種實施例中,本文所描述之脂質(例如PEG-脂質)可如國際專利公開案第PCT/US2016/000129號所描述進行合成,該案以全文引用之方式併入。
脂質奈米粒子組合物之脂質組分可包括一或多種諸如PEG或經PEG改質之脂質的包含聚乙二醇之分子。該等物種可替代地稱為聚乙二醇化脂質。PEG脂質為經聚乙二醇改質之脂質。PEG脂質可選自包括以下之非限制性群:經PEG改質之磷脂醯乙醇胺、經PEG改質之磷脂酸、經PEG改質之神經醯胺、經PEG改質之二烷基胺、經PEG改質之二醯基甘油、經PEG改質之二烷基甘油及其混合物。舉例而言,PEG脂質可為PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂質。
在一個實施例中,可用於本發明之PEG脂質可為國際公開案第WO2012099755號中所描述之聚乙二醇化脂質,該案之內容以全文引用之方式併入本文中。本文所描述之此等例示性PEG脂質中之任一者可經改質以在PEG鏈上包含羥基。在某些實施例中,PEG脂質為PEG-OH脂質。在某些實施例中,PEG-OH脂質在PEG鏈上包括一或多個羥基。在某些實施例中,PEG-OH或羥基-聚乙二醇化脂質在PEG鏈之末端包含-OH基團。各可能性代表本發明之獨立實施例。
在一些實施例中,PEG脂質為式(P1)化合物:
或其鹽或異構體,其中:
r為在1與100之間的整數;
R為C
10-40烷基、C
10-40烯基或C
10-40炔基;且視情況而言,R之一或多個亞甲基獨立地經C
3-10伸碳環基、4至10員伸雜環基、C
6-10伸芳基、4至10員伸雜芳基、-N(R
N)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(R
N)-、-NR
NC(O)-、-NR
NC(O)N(R
N)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R
N)-、-NR
NC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(=NR
N)-、-C(=NR
N)N(R
N)-、-NR
NC(=NR
N)-、-NR
NC(=NR
N)N(R
N)-、-C(S)-、-C(S)N(R
N)-、-NR
NC(S)-、-NR
NC(S)N(R
N)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)
2-、-S(O)
2O-、-OS(O)
2O-、-N(R
N)S(O)-、-S(O)N(R
N)-、-N(R
N)S(O)N(R
N)-、-OS(O)N(R
N)-、-N(R
N)S(O)O-、-S(O)2-、-N(R
N)S(O)2-、-S(O)
2N(R
N)-、-N(R
N)S(O)
2N(R
N)-、-OS(O)
2N(R
N)-或-N(R
N)S(O)
2O-置換;且
R
N在各情況下獨立地為氫、C
1-6烷基或氮保護基。
在一些實施例中,本文所描述之轉移媒劑(例如LNP)包含一或多種非陽離子型輔助脂質。在一些實施例中,輔助脂質為磷脂。在一些實施例中,輔助脂質為磷脂替代物或置換物。在一些實施例中,磷脂或磷脂替代物可為例如一或多種飽和或(多)不飽和磷脂或磷脂替代物或其組合。一般而言,磷脂包含磷脂部分及一或多種脂肪酸部分。
磷脂部分可選自例如由以下組成之非限制性群:磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、磷脂醯絲胺酸、磷脂酸、2-溶血磷脂醯膽鹼及神經鞘磷脂。
脂肪酸部分可選自例如由以下組成之非限制性群:月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、α-次亞麻油酸、芥子酸、植烷酸、花生酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二烷酸、二十二碳五烯酸及二十二碳六烯酸。
磷脂包括但不限於甘油磷脂,諸如磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、磷脂醯甘油及磷脂酸。磷脂亦包括磷神經脂質,諸如神經鞘磷脂。
在一些實施例中,輔助脂質為1,2-二硬脂醯基-177-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)類似物、DSPC替代物、油酸或油酸類似物。
在一些實施例中,輔助脂質為非磷脂醯膽鹼(PC)兩性離子脂質、DSPC類似物、油酸、油酸類似物或DSPC替代物。
在一些實施例中,輔助脂質描述於PCT/US2018/053569中。適用於本發明之脂質組合物中之輔助脂質包括例如各種中性、不帶電或兩性離子脂質。該等輔助脂質較佳與本文所揭示之化合物及脂質中之一或多者組合使用。輔助脂質之實例包括但不限於5-十七基苯-1,3-二醇(間苯二酚)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、磷酸膽鹼(DOPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、磷脂醯膽鹼(PLPC)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DAPC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、卵磷脂醯膽鹼(EPC)、二月桂醯基磷脂醯膽鹼(DLPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、1-肉豆蔻醯基-2-棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(MPPC)、1-棕櫚醯基-2-肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(PMPC)、1-棕櫚醯基-2-硬脂醯基磷脂醯膽鹼(PSPC)、1,2-二花生醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DBPC)、1-硬脂醯基-2-棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(SPPC)、1,2-二(二十)碳烯醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DEPC)、棕櫚醯油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、溶血磷脂醯基膽鹼、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二亞油醯基磷脂醯膽鹼、二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、棕櫚醯油醯基磷脂醯乙醇胺(POPE)、溶血磷脂醯乙醇胺及其組合。在一個實施例中,輔助脂質可為二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)或二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)。在另一實施例中,輔助脂質可為二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)。輔助脂質用於穩定且改善轉移媒劑之處理。該等輔助脂質較佳與例如本文所揭示之可離子化脂質中之一或多者的其他賦形劑組合使用。在一些實施例中,當與可離子化脂質組合使用時,輔助脂質可占脂質奈米粒子中存在之總脂質的5%至約90%或約10%至約70%之莫耳比。
D.
結構性脂質
在一實施例中,結構性脂質描述於國際專利申請案PCT/US2019/015913中。
本文所描述之轉移媒劑包含一或多種結構性脂質。將結構性脂質併入脂質奈米粒子中可幫助減少粒子中其他脂質之聚集。結構性脂質可包括但不限於膽固醇、糞固醇、麥角固醇、菜子固醇、番茄次鹼、蕃茄鹼、熊果酸、α-生育酚及其混合物。在某些實施例中,結構性脂質為膽固醇。在某些實施例中,結構性脂質包括膽固醇及皮質類固醇(諸如普賴蘇穠(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、普賴蘇(prednisone)及氫皮質酮(hydrocortisone))或其組合。
在一些實施例中,結構性脂質為固醇。在某些實施例中,結構性脂質為類固醇。在某些實施例中,結構性脂質為膽固醇。在某些實施例中,結構性脂質為膽固醇類似物。在某些實施例中,結構性脂質為α-生育酚。
本文所描述之轉移媒劑包含一或多種結構性脂質。將結構性脂質併入例如脂質奈米粒子之轉移媒劑中可幫助減少粒子中其他脂質之聚集。在某些實施例中,結構性脂質包括膽固醇及皮質類固醇(諸如普賴蘇穠、地塞米松、普賴蘇及氫皮質酮)或其組合。
在一些實施例中,結構性脂質為固醇。結構性脂質可包括但不限於固醇(例如植物固醇或動物固醇)。
在某些實施例中,結構性脂質為類固醇。舉例而言,固醇可包括但不限於膽固醇、β-穀固醇、糞固醇、麥角固醇、穀固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、麥角固醇、番茄次鹼、蕃茄鹼、熊果酸或α-生育酚。
在一些實施例中,轉移媒劑包括有效量之例如膽固醇類似物或胺基脂質或其組合之免疫細胞遞送增效脂質,當存在於例如脂質奈米粒子之轉移媒劑中時,相對於不具有免疫細胞遞送增效脂質之轉移媒劑,該脂質可藉由增強細胞締合及/或吸收、內化、胞內遷移及/或加工及/或胞內體逃逸而起作用,及/或可增強免疫細胞之辨識及/或與免疫細胞之結合。因此,儘管不意欲受任何特定機制或理論束縛,但在一個實施例中,本發明之結構性脂質或其他免疫細胞遞送增效脂質結合至C1q,或促進包含該脂質之轉移媒劑與C1q之結合。因此,對於用於將核酸分子遞送至免疫細胞之本發明之轉移媒劑的活體外用途,使用包括C1q之培養條件(例如使用包括血清之培養基或向無血清培養基添加外源性C1q)。對於本發明之轉移媒劑之活體內用途,對C1q之需求由內源性C1q供應。
在各種實施例中,脂質奈米粒子(LNP)可用作轉移媒劑以遞送所揭示之環狀RNA (例如遞送至一或多個目標細胞)。
本文所描述之脂質奈米粒子(LNP)之形成可藉由此項技術中已知之任何方法實現。舉例而言,如美國專利公開案第US2012/0178702 A1號中所描述,該案以全文引用之方式併入本文中。脂質奈米粒子組合物及其製造方法之非限制性實例描述於例如Semple等人(2010) Nat. Biotechnol. 28:172-176;Jayarama等人(2012), Angew. Chem. Int. Ed., 51:8529-8533;及Maier等人(2013) Molecular Therapy 21, 1570-1578 (該等文獻中之各者之內容以全文引用之方式併入本文中)中。
在一個實施例中,LNP調配物可藉由例如國際專利公開案第WO 2011/127255號或第WO 2008/103276號中所描述之方法來製備,該等案中之各者之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一個實施例中,本文所描述之LNP調配物可包含多陽離子型組合物。作為非限制性實例,多陽離子型組合物可為選自美國專利公開案第US2005/0222064 A1號之式1-60之組合物,該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一個實施例中,脂質奈米粒子可藉由美國專利公開案第US2013/0156845 A1號及國際專利公開案第WO2013/093648 A2號或第WO2012/024526 A2號中所描述之方法來調配,該等案中之各者以全文引用之方式併入本文中。
在一個實施例中,本文所描述之脂質奈米粒子可在無菌環境中藉由美國專利公開案第US2013/0164400 A1號中所描述之系統及/或方法來製造,該案以全文引用之方式併入本文中。
在一個實施例中,LNP調配物可在諸如美國專利第8,492,359號中所描述之核酸-脂質粒子之奈米粒子中調配,該案以全文引用之方式併入本文中。
奈米粒子組合物可視情況包含一或多個包衣。舉例而言,可將奈米粒子組合物調配於具有包衣之膠囊、膜或錠劑中。包括本文所描述之組合物的膠囊、膜或錠劑可具有任何有用的大小、抗拉強度、硬度或密度。
在一些實施例中,本文所描述之脂質奈米粒子可使用包含微流體混合器之方法合成。例示性微流體混合器可包括但不限於:狹縫交叉指形微混合器,包括但不限於由Precision Nanosystems (Vancouver, BC, Canada)、Microinnova (Allerheiligen bei Wildon, Austria)製造之狹縫交叉指形微混合器;及/或交錯式人字形微混合器(SHM) (Zhigaltsev, I.V.等人(2012) Langmuir. 28:3633-40;Belliveau, N.M.等人Mol. Ther. Nucleic. Acids. (2012) 1:e37;Chen, D.等人J. Am. Chem. Soc. (2012) 134(16):6948-51;該等文獻中之各者以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中,包含SHM之LNP產生方法進一步包含混合至少兩個輸入流,其中混合係藉由微觀結構誘導之混雜平流(MICA)發生。根據此方法,流體流流過以人字形圖案存在之通道,從而引起旋轉流動且使流體圍繞彼此摺疊。此方法亦可包含用於流體混合之表面,其中表面在流體循環期間改變定向。使用SHM產生LNP之方法包括美國專利公開案第US2004/0262223 A1號及第US2012/0276209 A1號中所揭示之方法,該等案中之各者以全文引用之方式併入本文中。
在一個實施例中,脂質奈米粒子可使用微混合器調配,微混合器諸如但不限於來自Institut fur Mikrotechnik Mainz公司(Mainz Germany)之狹縫交叉指形微結構化混合器(SIMM-V2)或標準狹縫交叉指形微混合器(SSIMM)或Caterpillar (CPMM)或衝擊噴流(IJMM)。在一個實施例中,使用微流體技術產生脂質奈米粒子(參見Whitesides (2006) Nature. 442: 368-373;及Abraham等人(2002) Science. 295: 647-651;該等文獻中之各者以全文引用之方式併入本文中)。作為一非限制性實例,受控微流體調配物包括在微通道中以低雷諾數(Reynolds number)混合穩定壓力驅動流之被動方法(參見例如Abraham等人(2002) Science. 295: 647651;該文獻以全文引用之方式併入本文中)。
在一個實施例中,本發明之環狀RNA可在使用微混合器晶片產生之脂質奈米粒子中調配,微混合器晶片諸如但不限於來自Harvard Apparatus (Holliston, MA)、Dolomite Microfluidics (Royston, UK)或Precision Nanosystems (Van Couver, BC, Canada)之微混合器晶片。微混合器晶片可用於以分流及重組合機制快速混合兩個或更多個流體流。
在一個實施例中,脂質奈米粒子之直徑可為約10 nm至約100 nm,諸如但不限於約10 nm至約20 nm、約10 nm至約30 nm、約10 nm至約40 nm、約10 nm至約50 nm、約10 nm至約60 nm、約10 nm至約70 nm、約10 nm至約80 nm、約10 nm至約90 nm、約20 nm至約30 nm、約20 nm至約40 nm、約20 nm至約50 nm、約20 nm至約60 nm、約20 nm至約70 nm、約20 nm至約80 nm、約20 nm至約90 nm、約20 nm至約100 nm、約30 nm至約40 nm、約30 nm至約50 nm、約30 nm至約60 nm、約30 nm至約70 nm、約30 nm至約80 nm、約30 nm至約90 nm、約30 nm至約100 nm、約40 nm至約50 nm、約40 nm至約60 nm、約40 nm至約70 nm、約40 nm至約80 nm、約40 nm至約90 nm、約40 nm至約100 nm、約50 nm至約60 nm、約50 nm至約70 nm、約50 nm至約80 nm、約50 nm至約90 nm、約50 nm至約100 nm、約60 nm至約70 nm、約60 nm至約80 nm、約60 nm至約90 nm、約60 nm至約100 nm、約70 nm至約80 nm、約70 nm至約90 nm、約70 nm至約100 nm、約80 nm至約90 nm、約80 nm至約100 nm及/或約90 nm至約100 nm。在一個實施例中,脂質奈米粒子之直徑可為約10 nm至500 nm。在一個實施例中,脂質奈米粒子之直徑可大於100 nm、大於150 nm、大於200 nm、大於250 nm、大於300 nm、大於350 nm、大於400 nm、大於450 nm、大於500 nm、大於550 nm、大於600 nm、大於650 nm、大於700 nm、大於750 nm、大於800 nm、大於850 nm、大於900 nm、大於950 nm或大於1000 nm。各可能性代表本發明之獨立實施例。
在一些實施例中,奈米粒子(例如脂質奈米粒子)之平均直徑為10-500 nm、20-400 nm、30-300 nm或40-200 nm。在一些實施例中,奈米粒子(例如脂質奈米粒子)之平均直徑為50-150 nm、50-200 nm、80-100 nm或80-200 nm。
在一些實施例中,本文所描述之脂質奈米粒子之直徑可為小於0.1 µm至至多1 mm,諸如但不限於小於0.1 µm、小於1.0 µm、小於5 µm、小於10 µm、小於15 µm、小於20 µm、小於25 µm、小於30 µm、小於35 µm、小於40 µm、小於50 µm、小於55 µm、小於60 µm、小於65 µm、小於70 µm、小於75 µm、小於80 µm、小於85 µm、小於90 µm、小於95 µm、小於100 µm、小於125 µm、小於150 µm、小於175 µm、小於200 µm、小於225 µm、小於250 µm、小於275 µm、小於300 µm、小於325 µm、小於350 µm、小於375 µm、小於400 µm、小於425 µm、小於450 µm、小於475 µm、小於500 µm、小於525 µm、小於550 µm、小於575 µm、小於600 µm、小於625 µm、小於650 µm、小於675 µm、小於700 µm、小於725 µm、小於750 µm、小於775 µm、小於800 µm、小於825 µm、小於850 µm、小於875 µm、小於900 µm、小於925 µm、小於950 µm、小於975 µm。
在另一實施例中,LNP之直徑可為約1 nm至約100 nm、約1 nm至約10 nm、約1 nm至約20 nm、約1 nm至約30 nm、約1 nm至約40 nm、約1 nm至約50 nm、約1 nm至約60 nm、約1 nm至約70 nm、約1 nm至約80 nm、約1 nm至約90 nm、約5 nm至約from 100 nm、約5 nm至約10 nm、約5 nm至約20 nm、約5 nm至約30 nm、約5 nm至約40 nm、約5 nm至約50 nm、約5 nm至約60 nm、約5 nm至約70 nm、約5 nm至約80 nm、約5 nm至約90 nm、約10 nm至約50 nM、約20 nm至約50 nm、約30 nm至約50 nm、約40 nm至約50 nm、約20 nm至約60 nm、約30 nm至約60 nm、約40 nm至約60 nm、約20 nm至約70 nm、約30 nm至約70 nm、約40 nm至約70 nm、約50 nm至約70 nm、約60 nm至約70 nm、約20 nm至約80 nm、約30 nm至約80 nm、約40 nm至約80 nm、約50 nm至約80 nm、約60 nm至約80 nm、約20 nm至約90 nm、約30 nm至約90 nm、約40 nm至約90 nm、約50 nm至約90 nm、約60 nm至約90 nm及/或約70 nm至約90 nm。各可能性代表本發明之獨立實施例。
奈米粒子組合物可為相對均質的。多分散性指數可用於指示奈米粒子組合物之均質性,例如奈米粒子組合物之粒度分佈。小(例如小於0.3)多分散性指數一般指示窄粒度分佈。奈米粒子組合物之多分散性指數可為約0至約0.25,諸如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些實施例中,奈米粒子組合物之多分散性指數可為約0.10至約0.20。各可能性代表本發明之獨立實施例。
奈米粒子組合物之ζ電位可用於指示組合物之動電位。舉例而言,ζ電位可描述奈米粒子組合物之表面電荷。具有相對低之正或負電荷之奈米粒子組合物一般為合乎需要的,此係因為更多高電荷物種可能會不合需要地與細胞、組織及體內其他元件相互作用。在一些實施例中,奈米粒子組合物之ζ電位可為約-20 mV至約+20 mV、約-20 mV至約+15 mV、約-20 mV至約+10 mV、約-20 mV至約+5 mV、約-20 mV至約0 mV、約-20 mV至約-5 mV、約-20 mV至約-10 mV、約-20 mV至約-15 mV、約-20 mV至約+20 mV、約-20 mV至約+15 mV、約-20 mV至約+10 mV、約-20 mV至約+5 mV、約-20 mV至約0 mV、約0 mV至約+20 mV、約0 mV至約+15 mV、約0 mV至約+10 mV、約0 mV至約+5 mV、約+5 mV至約+20 mV、約+5 mV至約+15 mV或約+5 mV至約+10 mV。各可能性代表本發明之獨立實施例。
治療劑之囊封效率描述在製備之後經囊封或以其他方式與奈米粒子組合物締合之治療劑相對於所提供之初始量的量。囊封效率合乎需要地較高(例如接近100%)。可例如藉由將在用一或多種有機溶劑或洗滌劑分解奈米粒子組合物之前及之後的含有奈米粒子組合物之溶液中之治療劑的量進行比較來量測囊封效率。可使用螢光以量測溶液中之游離治療劑(例如核酸)之量。對於本文所描述之奈米粒子組合物,治療劑之囊封效率可為至少50%,例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中,囊封效率可為至少80%。在某些實施例中,囊封效率可為至少90%。各可能性代表本發明之獨立實施例。在一些實施例中,脂質奈米粒子之多樣性值小於0.4。在一些實施例中,脂質奈米粒子在中性pH下具有淨中性電荷。在一些實施例中,脂質奈米粒子之平均直徑為50-200 nm。
脂質奈米粒子調配物之特性可受包括但不限於以下之因素影響:陽離子型脂質組分之選擇、陽離子型脂質之飽和度、非陽離子型脂質組分之選擇、非陽離子型脂質之飽和度、結構性脂質組分之選擇、聚乙二醇化性質、所有組分之比率及諸如尺寸之生物物理學參數。如本文所描述,PEG脂質組分之純度對LNP之特性及效能亦至關重要。
F.
用於製備脂質奈米粒子 (LNP) 調配物之方法
在一個實施例中,脂質奈米粒子調配物可藉由國際公開案第WO2011127255號或WO2008103276號中所描述之方法來製備,該等案中之各者以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中,脂質奈米粒子調配物可如國際公開案第WO2019131770號中所描述,該案以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中,環狀RNA係根據美國專利申請案15/809,680中所描述之方法來調配。在一些實施例中,本發明提供將環狀RNA囊封於轉移媒劑中之方法,其包含以下步驟:使脂質成形為預成形之轉移媒劑(亦即在不存在RNA之情況下形成),且隨後將預成形之轉移媒劑與RNA組合。在一些實施例中,與在無預先形成脂質奈米粒子之步驟之情況下(例如將脂質直接與RNA組合)製備之相同RNA調配物相比,新穎調配方法產生在活體外及活體內均具有較高效力(肽或蛋白質表現)及較高功效(生物學上相關之終點改善)以及潛在較好的耐受性之RNA調配物。
對於RNA之某些陽離子型脂質奈米粒子調配物,為了達成RNA之高度囊封,必須加熱於緩衝液(例如檸檬酸鹽緩衝液)中之RNA。在彼等過程或方法中,在調配過程(亦即,加熱單獨組分)之前需要進行加熱,此係因為調配後(奈米粒子形成後)加熱並不會提高脂質奈米粒子中RNA之囊封效率。相比之下,在本發明之新穎方法之一些實施例中,加熱RNA之次序似乎不影響RNA囊封百分比。在一些實施例中,不需要在調配過程之前或之後對包含預先形成之脂質奈米粒子之溶液、包含RNA之溶液及包含經脂質奈米粒子囊封之RNA之混合溶液中的一或多者進行加熱(亦即維持在周圍溫度下)。
RNA可提供於待與脂質溶液混合之溶液中,以使得RNA可囊封於脂質奈米粒子中。適合的RNA溶液可為任何含有待以各種濃度囊封之RNA之水溶液。舉例而言,適合的RNA溶液可含有濃度為或大於約0.01 mg/ml、0.05 mg/ml、0.06 mg/ml、0.07 mg/ml、0.08 mg/ml、0.09 mg/ml、0.1 mg/ml、0.15 mg/ml、0.2 mg/ml、0.3 mg/ml、0.4 mg/ml、0.5 mg/ml、0.6 mg/ml、0.7 mg/ml、0.8 mg/ml、0.9 mg/ml或1.0 mg/ml之RNA。在一些實施例中,適合的RNA溶液可含有濃度在約0.01-1.0 mg/ml、0.01-0.9 mg/ml、0.01-0.8 mg/ml、0.01-0.7 mg/ml、0.01-0.6 mg/ml、0.01-0.5 mg/ml、0.01-0.4 mg/ml、0.01-0.3 mg/ml、0.01-0.2 mg/ml、0.01-0.1 mg/ml、0.05-1.0 mg/ml、0.05-0.9 mg/ml、0.05-0.8 mg/ml、0.05-0.7 mg/ml、0.05-0.6 mg/ml、0.05-0.5 mg/ml、0.05-0.4 mg/ml、0.05-0.3 mg/ml、0.05-0.2 mg/ml、0.05-0.1 mg/ml、0.1-1.0 mg/ml、0.2-0.9 mg/ml、0.3-0.8 mg/ml、0.4-0.7 mg/ml或0.5-0.6 mg/ml範圍內之RNA。
通常,適合的RNA溶液亦可含有緩衝劑及/或鹽。一般而言,緩衝劑可包括HEPES、Tris、硫酸銨、碳酸氫鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、磷酸鉀或磷酸鈉。在一些實施例中,緩衝劑之適合濃度可在約0.1 mM至100 mM、0.5 mM至90 mM、1.0 mM至80 mM、2 mM至70 mM、3 mM至60 mM、4 mM至50 mM、5 mM至40 mM、6 mM至30 mM、7 mM至20 mM、8 mM至15 mM或9 mM至12 mM範圍內。
例示性鹽可包括氯化鈉、氯化鎂及氯化鉀。在一些實施例中,RNA溶液中鹽之適合濃度可在約1 mM至500 mM、5 mM至400 mM、10 mM至350 mM、15 mM至300 mM、20 mM至250 mM、30 mM至200 mM、40 mM至190 mM、50 mM至180 mM、50 mM至170 mM、50 mM至160 mM、50 mM至150 mM或50 mM至100 mM範圍內。
在一些實施例中,適合的RNA溶液之pH可在約3.5-6.5、3.5-6.0、3.5-5.5、3.5-5.0、3.5-4.5、4.0-5.5、4.0-5.0、4.0-4.9、4.0-4.8、4.0-4.7、4.0-4.6或4.0-4.5範圍內。
可使用各種方法製備適用於本發明之RNA溶液。在一些實施例中,RNA可直接溶解於本文所描述之緩衝溶液中。在一些實施例中,可藉由在與用於囊封之脂質溶液混合之前將RNA儲備溶液與緩衝溶液混合來產生RNA溶液。在一些實施例中,可藉由在即將與用於囊封之脂質溶液混合之前將RNA儲備溶液與緩衝溶液混合來產生RNA溶液。
根據本發明,脂質溶液含有適合於形成用於囊封RNA之轉移媒劑之脂質的混合物。在一些實施例中,適合的脂質溶液為基於乙醇的。舉例而言,適合的脂質溶液可含有溶解於純乙醇(亦即100%乙醇)中之所需脂質之混合物。在另一實施例中,適合的脂質溶液為基於異丙醇的。在另一實施例中,適合的脂質溶液為基於二甲亞碸的。在另一實施例中,適合的脂質溶液為包括但不限於乙醇、異丙醇及二甲亞碸之適合溶劑之混合物。
適合的脂質溶液可含有各種濃度之所需脂質之混合物。在一些實施例中,適合的脂質溶液可含有總濃度在約0.1-100 mg/ml、0.5-90 mg/ml、1.0-80 mg/ml、1.0-70 mg/ml、1.0-60 mg/ml、1.0-50 mg/ml、1.0-40 mg/ml、1.0-30 mg/ml、1.0-20 mg/ml、1.0-15 mg/ml、1.0-10 mg/ml、1.0-9 mg/ml、1.0-8 mg/ml、1.0-7 mg/ml、1.0-6 mg/ml或1.0-5 mg/ml範圍內之所需脂質之混合物。
G.
脂質體
在某些實施例中,脂質體或其他脂質雙層囊泡揭示於本文中且可用作組分或整個轉移媒劑以便於或增強環狀RNA至一或多個目標細胞之遞送及釋放。脂質體之特徵通常在於具有藉由一或多個形成微觀袋或囊泡之雙層之膜與外部介質螯合的內部空間。脂質體之雙層膜通常由包含在空間上分離之疏水性域或親水性域之脂質,亦即合成或天然來源之兩親媒性分子形成(Lasic, D及Papahadjopoulos, D.編Medical Applications of Liposomes. Elsevier, Amsterdam, 1998)。
在一些實施例中,環狀RNA經囊封,或脂質體可使用包括但不限於機械分散、溶劑分散及/或洗滌劑移除之各種方法來製備。此等方法中之各者包括乾燥來自有機溶劑之脂質、將脂質分散於水性介質中、調整脂質體之大小及純化脂質體懸浮液之步驟(Gomez等人, ACS Omega. 2019. 4(6): 10866-10876)。各種其他脂質體製備方法可見於Akbarzadeh等人, Nanoscale Res Lett. 2013; 8(1): 102中。在一些實施例中,環狀RNA可被動地裝載(亦即,環狀RNA在脂質體形成期間經囊封)或主動地裝載(亦即,在脂質體形成之後)。
在一些實施例中,本文所揭示之脂質體可包含一或多個雙層。在某些實施例中,脂質體可包含多層囊泡或單層囊泡。
在某些實施例中,如本文所描述之脂質體包含天然衍生之磷脂或經工程改造之磷脂。在一些實施例中,脂質體可進一步包含有助於整個脂質體結構之穩定性的PEG-脂質。包括但不限於皮質類固醇及其他類固醇之其他改善可用於幫助維持脂質體之結構及穩定性。
H.
樹狀體
在某些實施例中,用於轉運環狀RNA之轉移媒劑包含樹狀體。「樹狀體」之使用描述了轉移媒劑之建築模體。在一些實施例中,樹狀體包括但不限於含有內部核心及一或多個自內部核心延伸或連接出之層(亦即,產生件)。在一些實施例中,產生件可含有一或多個分支點及連接至最外產生件之末端基之外表面。在某些實施例中,分支點可大部分為單分散的且含有圍繞內部核心建構之對稱分支單元。
樹狀體之合成可包含發散方法、彙集生長、超核心及分支單體生長、雙重指數生長、樂高化學(lego chemistry)、點擊化學及此項技術中可用之其他方法(Mendes L.等人, Molecules. 2017. 22 (9): 1401進一步描述此等方法)。
I.
基於聚合物之遞送
在某些實施例中,如本文所描述,用於環狀RNA聚核苷酸之轉移媒劑包含聚合物奈米粒子。在一些實施例中,聚合物奈米粒子包括奈米膠囊及奈米球。在一些實施例中,奈米膠囊由聚合殼包圍之油性核心構成。在一些實施例中,環狀RNA含於核心內且聚合殼控制環狀RNA之釋放。另一方面,奈米球包含連續聚合物網,其中環狀RNA保留或吸收至表面上。在一些實施例中,由於陽離子與帶負電核酸及細胞膜存在有利的靜電相互作用,因此使用陽離子型聚合物來囊封環狀RNA。
聚合物奈米粒子可藉由各種方法製備。在一些實施例中,聚合物奈米粒子可藉由奈米沈澱、乳化技術、溶劑蒸發、溶劑擴散、反向鹽析或此項技術中可用之其他方法來製備。
J.
聚合物 - 脂質雜交體
在某些實施例中,如本文所描述,用於環狀RNA聚核苷酸之轉移媒劑包含聚合物-脂質雜交體奈米粒子(LPHNP)。在一些實施例中,LPHNP包含包膜於脂質雙層內之聚合物核心。在一些實施例中,聚合物核心囊封環狀RNA聚核苷酸。在一些實施例中,LPHNP進一步包含外部脂質雙層。在某些實施例中,此外部脂質雙層包含PEG-脂質、輔助脂質、膽固醇或此項技術中已知有助於基於脂質之奈米粒子中之穩定性的其他分子。最接近聚合物核心之脂質雙層減少LPHNP形成期間經包覆環狀RNA之損失且藉由防止水自轉移媒劑外部擴散至聚合物核心中來避免聚合物核心降解(Mukherjee等人, In J. Nanomedicine. 2019; 14: 1937-1952)。
存在各種研發及調配LPHNP之方法。在某些實施例中,使用此項技術中可用之一步法或兩步法研發LPHNP。在一些實施例中,用於形成LPHNP之一步法係經由奈米沈澱或乳化-溶劑蒸發進行。在某些實施例中,兩步法包括奈米沈澱、乳化-溶劑蒸發、高壓均質化或此項技術中可用之其他方法。
K.
基於肽之遞送
在某些實施例中,可使用基於肽之遞送機制轉運環狀RNA。在一些實施例中,基於肽之遞送機制包含脂蛋白。基於待遞送藥物之大小,脂蛋白可為低密度脂蛋白(LDL)或高密度脂蛋白(HDL)。如US8734853B2中所見,高密度脂蛋白能夠在活體內及活體外轉運核酸。
在特定實施例中,脂質組分包括膽固醇。在更多特定實施例中,脂質組分包括膽固醇與膽固醇油酸酯之組合。
HDL-核酸粒子可具有任何大小,但在特定實施例中,粒子具有約100埃至約500埃之分子大小。在更多特定實施例中,粒子具有約100埃至約300埃之分子大小。大小可視併入粒子中之核酸組分之大小而定。
HDL-核酸粒子可具有廣泛範圍之分子量。重量視併入粒子中之核酸之大小而定。舉例而言,在一些實施例中,粒子具有在約100,000道爾頓至約1,000,000道爾頓之間的分子量。在更多特定實施例中,粒子具有在約100,000道爾頓至約500,000道爾頓之間的分子量。在特定實施例中,粒子具有在約100,000道爾頓至約300,000道爾頓之間的分子量。
本發明之HDL-核酸粒子可藉由不同方法製造。舉例而言,核酸(例如siRNA)可藉由將核酸與由相鄰帶正電胺基酸構成之肽或多肽合併來中和。舉例而言,如上文所論述,胺基酸序列可包括2個或更多個相鄰離胺酸殘基。胺基酸序列之正電荷中和帶負電核酸分子。隨後,可使用Lacko等人(2002年)所描述之方法將核酸囊封於HDL粒子中。
L.
碳水化合物載劑
在某些實施例中,可使用碳水化合物載劑或糖-奈米膠囊轉運環狀RNA聚核苷酸。在某些實施例中,碳水化合物載劑包含經糖裝飾之奈米粒子、肽結合型樹狀體及醣結合型樹狀體、基於多醣之奈米粒子及此項技術中可用之其他基於碳水化合物之載劑。如本文所描述,碳水化合物分子之併入可經由合成方式進行。
在一些實施例中,碳水化合物載劑包含多醣。此等多醣可由目標細胞之微生物細胞壁製成。舉例而言,已展示碳水化合物載劑包含甘露聚糖碳水化合物成功地遞送mRNA (Son等人, Nano Lett. 2020. 20(3): 1499-1509)。
M.
經聚醣裝飾之奈米粒子 / 醣奈米粒子
在某些實施例中,如本文所提供,用於環狀RNA之轉移媒劑為醣奈米粒子(醣NP)。如此項技術中已知,醣奈米粒子含有包含金、氧化鐵、半導體奈米粒子或其組合之核心。在一些實施例中,使用碳水化合物使醣奈米粒子功能化。在某些實施例中,醣奈米粒子包含碳奈米管或石墨烯。在一個實施例中,醣奈米粒子包含基於多醣之醣NP (例如基於幾丁聚醣之醣NP)。在某些實施例中,醣奈米粒子為醣樹狀體。
N.
基於胞泌體、細胞間橋及胞器之遞送系統
在某些實施例中,如本文所提供,經由使用作為一種類型之胞外囊泡之胞泌體轉移環狀RNA。胞泌體天然地由各種類型之細胞分泌且用作用於各種形式之貨物的轉運囊泡。在遞送期間,胞泌體可含有且保護特異性mRNA、調節性微小RNA、脂質及蛋白質(Luan等人, Acta Pharmacologica Sinica. 2017. 38:754-763)。胞泌體可天然地為30 nm至125 nm。
在一些實施例中,胞泌體可部分由免疫細胞製造。如Haney等人中所示,使用免疫細胞衍生之胞泌體能夠避免單核吞噬細胞(J Control Release. 2015. 207:18-30)。在一些實施例中,胞泌體可為樹突狀細胞、巨噬細胞、T細胞、B細胞或衍生自另一免疫細胞。如WO/2021/041473A1中所見,各種形式之不同長度之RNA可經由胞泌體遞送進行轉運,胞泌體遞送包括信使RNA (mRNA)、微小RNA (miRNA)、長基因間非編碼RNA (lincRNA)、長非編碼RNA (lncRNA)、非編碼RNA (ncRNA)、非信使RNA (nmRNA)、小RNA (sRNA)、小非信使RNA (smnRNA)、DNA損傷反應RNA (DD RNA)、胞外RNA (exRNA)、小核RNA (snRNA)、小核仁RNA (snoRNA)及前驅體信使RNA (pre-mRNA)。
在其他實施例中,轉移媒劑可包含完全或部分細胞間橋。在一些實施例中,細胞間橋衍生自生殖系胞囊之內質網。在某些實施例中,生殖系胞囊係來自果蠅卵巢。
O.
微針、電穿孔、連續泵及基因槍
在某些實施例中,環狀RNA聚核苷酸可使用非細胞且實際上經由機械遞送機制來轉運。在一些實施例中,此遞送方法包括微針、電穿孔、連續泵及/或基因槍。
已研發出各種用於將核酸微針送至特定細胞集合中之方法及設備。跨生物組織遞送生物材料之方法已由Kodgule等人描述且教示於例如US 2011/0196308中,該案之內容以全文引用之方式併入本文中。根據Kodgule,將多個含有治療性活性成分之生物可降解微針併入遞送蛋白質、碳水化合物、核酸分子、脂質及其他醫藥活性成分或其組合之裝置中。
藉由無針注射及電穿孔皮內遞送生物活性劑已由Hoffmann等人描述且教示於例如US 7171,264中,該案之內容以全文引用之方式併入本文中。根據Hoffmann,將一或多個無針注射器併入電穿孔裝置中,且無針注射與電穿孔之組合足以將藥劑引入皮膚、肌肉或黏膜中之細胞中。在某些實施例中,電穿孔係經由連續流微流體電穿孔進行。
P.
醫藥鹽、緩衝劑及溶液
在一些實施例中,具有環狀RNA聚核苷酸之轉移媒劑為溶液或包含鹽之稀釋劑或緩衝劑。
7. 蛋白質與IRES之組合
在某些實施例中,如本文所提供,由環狀RNA聚核苷酸編碼之有效負載物可經由使用轉譯起始元件(TIE)內之特異性內部核糖體進入位點(IRES)最佳化。在一些實施例中,環狀RNA內之IRES特異性可顯著增強編碼元件內經編碼之特異性蛋白質的表現。
8. 靶向
A.
靶向方法
本發明亦考慮藉由被動及主動靶向方式差別靶向目標細胞及組織。被動靶向現象利用活體內轉移媒劑天然分佈模式而不依賴於使用額外賦形劑或用於增強目標細胞辨識轉移媒劑之方式。舉例而言,經受網狀內皮系統細胞之吞噬作用之轉移媒劑可能會積聚於肝或脾中,且因此可提供用於被動地導引組合物至該等目標細胞之遞送的方式。
可替代地,本發明考慮活性靶向,其涉及使用可結合(共價或非共價)至轉移媒劑以促進該轉移媒劑在某些目標細胞或目標組織處之定位的靶向部分。舉例而言,靶向可藉由在轉移媒劑中或轉移媒劑上包括一或多個內源性靶向部分以促進分佈至目標細胞或組織來介導。目標組織辨識靶向部分有效地促進轉移媒劑及/或其內容物在目標細胞及組織中之組織分佈及細胞吸收(例如在轉移媒劑中或轉移媒劑上包括脂蛋白元-E靶向配位體促進了轉移媒劑之辨識及與由肝細胞表現之內源性低密度脂蛋白受體的結合)。如本文所提供,該組合物可包含能夠增強該組合物對目標細胞之親和力的部分。靶向部分可在調配期間或調配後連接至脂質粒子之外部雙層。此等方法為此項技術中所熟知的。另外,一些脂質粒子調配物可採用諸如PEAA、血球凝集素、其他脂肽(參見美國專利申請案序列號08/835,281及60/083,294,該等案以引用之方式併入本文中)及可用於活體內及/或胞內遞送之其他構件的促融聚合物。在其他一些實施例中,本發明之組合物展現改善之轉染功效,及/或展現增強之針對所關注目標細胞或組織之選擇性。因此,考慮包含一或多個能夠增強組合物及其核酸內容物針對目標細胞或組織之親和力之部分(例如肽、適體、寡核苷酸、維生素或其他分子)的組合物。適合的部分可視情況結合或連接至轉移媒劑之表面。在一些實施例中,靶向部分可跨越轉移媒劑之表面或囊封於轉移媒劑內。適合的部分係基於其物理、化學或生物特性(例如目標細胞表面標記物或構件之選擇性親和力及/或辨識)來進行選擇。細胞特異性目標位點及其對應靶向配位體可廣泛變化。選擇適合的靶向部分以使得採用目標細胞之獨特特徵,因此允許組合物區分目標細胞與非目標細胞。舉例而言,本發明之組合物可包括選擇性增強對肝細胞之辨識或對肝細胞之親和力(例如藉由受體介導之對該等表面標記物之辨識及與該等表面標記物之結合)的表面標記物(例如脂蛋白元-B或脂蛋白元-E)。舉例而言,預期使用半乳糖作為靶向部分將本發明之組合物導引至實質肝細胞,或可替代地,預期使用含有糖殘基之甘露糖作為靶向配位體將本發明之組合物導引至肝內皮細胞(例如含有可優先結合至肝細胞中存在之去唾液酸醣蛋白受體之糖殘基的甘露糖)。(參見Hillery A M等人「Drug Delivery and Targeting: For Pharmacists and Pharmaceutical Scientists」 (2002) Taylor & Francis公司。) 因此,已結合至轉移媒劑中存在之部分(例如脂質奈米粒子)之該等靶向部分之呈現促進目標細胞及組織中本發明之組合物的辨識及吸收。適合的靶向部分之實例包括一或多種肽、蛋白質、適體、維生素及寡核苷酸。
在特定實施例中,轉移媒劑包含靶向部分。在一些實施例中,靶向部分將受體介導之胞吞作用選擇性介導至特定細胞群體中。在一些實施例中,靶向部分能夠結合至T細胞抗原。在一些實施例中,靶向部分能夠結合至NK、NKT或巨噬細胞抗原。在一些實施例中,靶向部分能夠結合至選自CD3、CD4、CD8、PD-1、4-1BB及CD2之群之蛋白質。在一些實施例中,靶向部分為單鏈Fv (scFv)片段、奈米抗體、肽、基於肽之大環、微型抗體、重鏈可變區、輕鏈可變區或其片段。在一些實施例中,靶向部分選自T細胞受體模體抗體、T細胞α鏈抗體、T細胞β鏈抗體、T細胞γ鏈抗體、T細胞δ鏈抗體、CCR7抗體、CD3抗體、CD4抗體、CD5抗體、CD7抗體、CD8抗體、CD11b抗體、CD11c抗體、CD16抗體、CD19抗體、CD20抗體、CD21抗體、CD22抗體、CD25抗體、CD28抗體、CD34抗體、CD35抗體、CD40抗體、CD45RA抗體、CD45RO抗體、CD52抗體、CD56抗體、CD62L抗體、CD68抗體、CD80抗體、CD95抗體、CD117抗體、CD127抗體、CD133抗體、CD137 (4-1BB)抗體、CD163抗體、F4/80抗體、IL-4Rα抗體、Sca-1抗體、CTLA-4抗體、GITR抗體GARP抗體、LAP抗體、顆粒酶B抗體、LFA-1抗體、運鐵蛋白受體抗體及其片段。在一些實施例中,靶向部分為淋巴球上之胞外酶之小分子結合劑。胞外酶之小分子結合劑包括A2A抑制劑CD73抑制劑、CD39或腺苷受體A2aR及A2bR。潛在小分子包括AB928。
在一些實施例中,轉移媒劑如以下中所描述經調配及/或靶向:Shobaki N, Sato Y, Harashima H. Mixing lipids to manipulate the ionization status of lipid nanoparticles for specific tissue targeting. Int J Nanomedicine. 2018;13:8395-8410. 公佈於2018年12月10日。在一些實施例中,轉移媒劑由3種脂質類型構成。在一些實施例中,轉移媒劑由4種脂質類型構成。在一些實施例中,轉移媒劑由5種脂質類型構成。在一些實施例中,轉移媒劑由6種脂質類型構成。
B.
目標細胞
在需要將核酸遞送至免疫細胞之情況下,免疫細胞代表目標細胞。在一些實施例中,本發明之組合物在差別基礎上轉染目標細胞(亦即,不轉染非目標細胞)。亦可製備用於優先靶向包括但不限於T細胞、B細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞之各種目標細胞的本發明之組合物。
在一些實施例中,目標細胞缺乏所關注之蛋白質或酶。舉例而言,在需要將核酸遞送至肝細胞之情況下,肝細胞代表目標細胞。在一些實施例中,本發明之組合物在差別基礎上轉染目標細胞(亦即,不轉染非目標細胞)。亦可製備用於優先靶向包括但不限於以下之各種目標細胞的本發明之組合物:肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、內皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神經細胞(例如腦膜細胞、星形細胞、運動神經元細胞、背根節細胞及前角運動神經元細胞)、感光受體細胞(例如桿狀體及錐體)、視網膜色素上皮細胞、分泌細胞、心臟細胞、脂肪細胞、血管平滑肌細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、β細胞、腦垂體細胞、滑液襯裡細胞、卵巢細胞、睾丸細胞、纖維母細胞、B細胞、T細胞、網狀紅血球、白血球、顆粒球及腫瘤細胞。
可製備用於優先分佈至諸如心臟、肺、腎、肝及脾中之目標細胞的本發明之組合物。在一些實施例中,本發明之組合物分佈至肝或脾之細胞中以便於包含於其中之環狀RNA之遞送及隨後肝之細胞(例如肝細胞)或脾之細胞(例如免疫細胞)對該環狀RNA之表現。靶向細胞可充當能夠產生且全身排出功能性蛋白質或酶之生物「儲集器」或「儲槽」。因此,在本發明之一個實施例中,轉移媒劑可靶向肝細胞或免疫細胞及/或在遞送時優先分佈至肝或脾之細胞。在一實施例中,在轉染目標肝細胞或免疫細胞之後,媒劑中所裝載之環狀RNA經轉譯,且產生、排出及全身分佈功能性蛋白質產物。在其他實施例中,除肝細胞以外之細胞(例如肺、脾、心臟、眼或中樞神經系統之細胞)可充當用於蛋白質產生之儲槽位置。
在一個實施例中,本發明之組合物促進個體之一或多種功能性蛋白質及/或酶之內源性產生。在本發明之一實施例中,轉移媒劑包含編碼缺陷型蛋白質或酶之環狀RNA。在該等組合物分佈至目標組織且隨後轉染該等目標細胞後,可在活體內轉譯裝載至轉移媒劑(例如脂質奈米粒子)中之外源性環狀RNA以產生由外源性投與之環狀RNA編碼之功能性蛋白質或酶(例如個體所缺乏之蛋白質或酶)。因此,本發明之組合物利用個體轉譯外源性或以重組方式製備之環狀RNA以產生經內源性轉譯之蛋白質或酶且藉此產生(且在適用時分泌)功能性蛋白質或酶的能力。經表現或轉譯之蛋白質或酶之特徵亦可在於活體內包括天然轉譯後修飾,該等修飾通常可能不存在於以重組方式製備之蛋白質或酶中,藉此進一步降低經轉譯之蛋白質或酶之免疫原性。
投與編碼缺陷型蛋白質或酶之環狀RNA避免了對將核酸遞送至目標細胞內之特定胞器的需要。更確切而言,在轉染目標細胞且將核酸遞送至目標細胞之細胞質後,可轉譯轉移媒劑之環狀RNA內容物且表現功能性蛋白質或酶。
在一些實施例中,環狀RNA包含一或多個miRNA結合位點。在一些實施例中,環狀RNA包含一或多個由miRNA辨識之miRNA結合位點,該miRNA存在於一或多個非目標細胞或非目標細胞類型(例如庫弗細胞(Kupffer cell)或肝細胞)中且不存在於一或多個目標細胞或目標細胞類型(例如肝細胞或T細胞)中。在一些實施例中,環狀RNA包含一或多個由miRNA辨識之miRNA結合位點,與一或多個目標細胞或目標細胞類型(例如肝細胞或T細胞)相比,該miRNA以增加之濃度存在於一或多個非目標細胞或非目標細胞類型(例如庫弗細胞或肝細胞)中。認為miRNA藉由與RNA分子內之互補序列配對而起作用,從而引起基因靜默。
在一些實施例中,本發明之組合物在差別基礎上轉染目標細胞或分佈至目標細胞(亦即,不轉染非目標細胞)。亦可製備用於優先靶向包括但不限於以下之各種目標細胞的本發明之組合物:肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、內皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神經細胞(例如腦膜細胞、星形細胞、運動神經元細胞、背根節細胞及前角運動神經元細胞)、感光受體細胞(例如桿狀體及錐體)、視網膜色素上皮細胞、分泌細胞、心臟細胞、脂肪細胞、血管平滑肌細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、β細胞、腦垂體細胞、滑液襯裡細胞、卵巢細胞、睾丸細胞、纖維母細胞、B細胞、T細胞、網狀紅血球、白血球、顆粒球及腫瘤細胞。
9. 醫藥組合物
在某些實施例中,本文提供包含本文所提供之治療劑的組合物(例如醫藥組合物)。在一些實施例中,治療劑為本文所提供之環狀RNA聚核苷酸。在一些實施例中,治療劑為本文所提供之載體。在一些實施例中,治療劑為包含本文所提供之環狀RNA或載體之細胞(例如人類細胞,諸如人類T細胞)。在某些實施例中,該組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中,本文所提供之組合物包含本文所提供之治療劑以及其他醫藥活性劑或藥物,該等醫藥活性劑或藥物諸如能夠靶向B細胞抗原之消炎藥物或抗體,例如抗CD20抗體,例如利妥昔單抗。
就醫藥組合物而言,醫藥學上可接受之載劑可為習知使用之醫藥學上可接受之載劑中的任一者,且僅受諸如溶解度及缺乏與(多種)活性劑之反應性之化學物理考慮因素以及投與途徑之限制。本文所描述之例如媒劑、佐劑、賦形劑及稀釋劑之醫藥學上可接受之載劑為熟習此項技術者所熟知且公眾容易獲得。較佳地,醫藥學上可接受之載劑為對(多種)治療劑呈化學惰性之載劑及在使用條件下無有害副作用或毒性之載劑。
載劑選擇將部分由特定治療劑以及用於投與治療劑之特定方法決定。因此,存在本文所提供之醫藥組合物之各種適合的調配物。
在某些實施例中,醫藥組合物包含防腐劑。在某些實施例中,適合的防腐劑可包括例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉及氯苄烷銨。視情況而言,可使用兩種或更多種防腐劑之混合物。防腐劑或其混合物通常以總組合物之約0.0001重量%至約2重量%之量存在。
在一些實施例中,醫藥組合物包含緩衝劑。在一些實施例中,適合的緩衝劑可包括例如檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸、磷酸鉀及各種其他酸及鹽。可視情況使用兩種或更多種緩衝劑之混合物。緩衝劑或其混合物通常以總組合物之約0.001重量%至約4重量%之量存在。
在一些實施例中,醫藥組合物中治療劑之濃度可變化,例如低於約1重量%,或至少約1重量%、2重量%、3重量%、4重量%、5重量%、6重量%、7重量%、8重量%、9重量%、10重量%、15重量%、20重量%、25重量%、30重量%、35重量%、40重量%、45重量%或約50重量%或更高,且可根據所選擇之特定投與模式主要藉由流體體積及黏度來進行選擇。
以下用於經口、氣霧劑、非經腸(例如皮下、靜脈內、動脈內、肌內、皮內、腹膜內及鞘內)及局部投與之調配物僅為例示性的且決不為限制性的。可使用超過一種途徑來投與本文所提供之治療劑,且在某些情況下,特定途徑可提供比另一途徑更直接且更有效之反應。
適合於經口投與之調配物可包含以下或由以下組成:(a)液體溶液,諸如有效量之溶解於諸如水、鹽水或橙汁之稀釋劑中之治療劑;(b)膠囊、藥囊、錠劑、口含錠及糖衣錠,其各自含有預定量之活性成分,呈固體或顆粒形式;(c)散劑;(d)於適當液體中之懸浮液;及(e)適合的乳液。液體調配物可包括諸如水及例如乙醇、苯甲醇及聚乙烯醇之醇的稀釋劑,伴隨或不伴隨添加醫藥學上可接受之界面活性劑。膠囊形式可為含有例如界面活性劑、潤滑劑及惰性填充劑,諸如乳糖、蔗糖、磷酸鈣及玉米澱粉之普通硬殼或軟殼明膠類型。錠劑形式可包括以下中之一或多者:乳糖、蔗糖、甘露糖醇、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、海藻酸、微晶纖維素、阿拉伯膠、明膠、瓜爾膠、膠態二氧化矽、交聯羧甲纖維素鈉、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、硬脂酸及其他賦形劑、著色劑、稀釋劑、緩衝劑、崩解劑、濕潤劑、防腐劑、調味劑以及其他藥理學上可相容之賦形劑。口含錠形式可包含具有調味劑之治療劑,調味劑通常為蔗糖、阿拉伯膠或黃蓍。除此項技術中已知之該等賦形劑之外,片劑亦可包含含有惰性基質之治療劑,惰性基質諸如明膠及甘油或蔗糖及阿拉伯膠、乳液、凝膠及其類似。
適用於非經腸投與之調配物包括可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使調配物與預期接受者血液等張之溶質的水性及非水性等張無菌注射溶液;及可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑之水性及非水性無菌懸浮液。在一些實施例中,本文所提供之治療劑可在含生理學上可接受之稀釋劑之醫藥載劑中投與,諸如無菌液體或液體混合物,包括水;鹽水;水性右旋糖及相關糖溶液;醇,諸如乙醇或十六醇;二醇,諸如丙二醇或聚乙二醇;二甲亞碸、甘油;縮酮,諸如2,2-二甲基-1,3-二氧戊環-4-甲醇;醚;聚(乙二醇) 400;油;脂肪酸;脂肪酸酯或甘油酯或乙醯化脂肪酸甘油酯,伴隨或不伴隨添加醫藥學上可接受之界面活性劑,諸如皂或洗滌劑;懸浮劑,諸如果膠、卡波姆(carbomer)、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素;或乳化劑及其他醫藥佐劑。
在一些實施例中,可用於非經腸調配物中之油包括石油、動物油、植物油或合成油。油之特定實例包括花生、大豆、芝麻、棉籽、玉米、橄欖、石蠟脂及礦物油。用於非經腸調配物中之適合的脂肪酸包括油酸、硬脂酸及異硬脂酸。油酸乙酯及肉豆蔻酸異丙酯為適合的脂肪酸酯之實例。
用於非經腸調配物之某些實施例中之適合的皂包括脂肪鹼金屬、銨及三乙醇胺鹽,且適合的洗滌劑包括(a)陽離子型洗滌劑,諸如二甲基二烷基鹵化銨及烷基吡啶鎓鹵化物;(b)陰離子型洗滌劑,諸如烷基、芳基及烯烴磺酸鹽、烷基、烯烴、醚及單甘油酯硫酸鹽及磺基丁二酸鹽;(c)非離子型洗滌劑,諸如脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇醯胺及聚氧化乙烯聚丙烯共聚物;(d)兩性洗滌劑,諸如烷基-β-胺基丙酸鹽及2-烷基-咪唑啉四級銨鹽;及(e)其混合物。
在一些實施例中,非經腸調配物含有例如約0.5重量%至約25重量%呈溶液態之治療劑。可使用防腐劑及緩衝劑。為了將注射部位處之刺激減至最少或消除刺激,該等組合物可含有一或多種親水親油平衡值(hydrophile-lipophile balance,HLB)為例如約12至約17之非離子型界面活性劑。該等調配物中界面活性劑之數量將通常例如在約5重量%至約15重量%範圍內。適合的界面活性劑包括諸如去水山梨醇單油酸酯之聚乙二醇去水山梨醇脂肪酸酯及藉由將環氧丙烷與丙二醇縮合而形成之環氧乙烷與疏水性鹼之高分子量加合物。非經腸調配物可呈現於諸如安瓿或小瓶之單位劑量或多劑量密封容器中,且可在冷凍乾燥(凍乾)條件下儲存,僅需要在即將使用之前添加例如注射用水之無菌液體賦形劑。即用型注射溶液及懸浮液可由先前所描述之種類之無菌散劑、顆粒及錠劑製備。
在某些實施例中,本文提供可注射調配物。關於可注射組合物之有效醫藥載劑之要求為一般熟習此項技術者所熟知的(參見例如Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott公司, Philadelphia, PA, Banker及Chalmers編, 第238-250頁(1982),及ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 第4版, 第622-630頁(1986))。
在一些實施例中,本文提供局部調配物。在本文所提供之某些實施例之情形下,包括可用於經皮藥物釋放之局部調配物的局部調配物適用於施用至皮膚。在一些實施例中,可將單獨或與其他適合的組分組合之治療劑製成經由吸入投與之氣霧劑調配物。可將此等氣霧劑調配物置於諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣及其類似之可接受之加壓推進劑中。亦可諸如在噴霧器或霧化器中將其調配為用於非按壓製劑之藥品。該等噴霧調配物亦可用於噴塗黏膜。
在某些實施例中,可將本文所提供之治療劑調配為諸如環糊精包合複合物之包合複合物或脂質體。脂質體可用於使治療劑靶向特定組織。脂質體亦可用於延長治療劑之半衰期。許多方法可用於製備脂質體,如例如Szoka等人, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9, 467 (1980)及美國專利4,235,871、4,501,728、4,837,028及5,019,369中所描述。
在一些實施例中,本文所提供之治療劑係在定時釋放型、延遲釋放型或持續釋放型遞送系統中調配以使得組合物之遞送在使所治療之部位致敏之前發生且遞送時間足以使所治療之部位致敏。該等系統可避免治療劑之重複投與,藉此提高個體及醫師之便利性,且可尤其適用於本文所提供之某些組合物實施例。在一個實施例中,本發明之組合物經調配以使得其適用於其中所含之環狀RNA的延長釋放。可適宜地以延長之給藥間隔向個體投與該等延長釋放型組合物。舉例而言,在一個實施例中,一天兩次、每天或每隔一天向個體投與本發明之組合物。在一實施例中,一週兩次、一週一次、每十天、每兩週、每三週、每四週、一月一次、每六週、每八週、每三個月、每四個月、每六個月、每八個月、每九個月或每年向個體投與本發明之組合物。
在一些實施例中,由本發明聚核苷酸編碼之蛋白質係由目標細胞產生達持續時間量。舉例而言,蛋白質可在投與之後產生超過一小時、超過四小時、超過六小時、超過12小時、超過24小時、超過48小時或超過72小時。在一些實施例中,多肽在投與之後約六小時以峰值位準表現。在一些實施例中,多肽表現至少持續在治療位準下。在一些實施例中,多肽在投與之後至少以治療位準表現超過一小時、超過四小時、超過六小時、超過12小時、超過24小時、超過48小時或超過72小時。在一些實施例中,多肽可在患者組織(例如肝或肺)中以治療位準偵測到。在一些實施例中,可偵測多肽含量係來自在投與之後經超過一小時、超過四小時、超過六小時、超過12小時、超過24小時、超過48小時或超過72小時之時間段的環狀RNA組合物之連續表現。
在某些實施例中,由本發明聚核苷酸編碼之蛋白質以高於正常生理位準之位準產生。與對照相比,蛋白質含量可增加。在一些實施例中,對照為正常個體或正常個體群體中之多肽之基線生理含量。在其他實施例中,對照為在缺乏相關蛋白質或多肽之個體中或在缺乏相關蛋白質或多肽之個體群體中之多肽之基線生理含量。在一些實施例中,對照可為向其投與組合物之個體中相關蛋白質或多肽之正常含量。在其他實施例中,對照為在其他治療性干預後,例如在直接注射對應多肽後,在一或多個可比時間點之多肽之表現量。
在某些實施例中,由本發明聚核苷酸編碼之蛋白質之含量可在投與之後3天、4天、5天或1週或更長時間偵測到。可在組織(例如肝或肺)中觀測到含量增加之蛋白質。
在一些實施例中,該方法產生由本發明聚核苷酸編碼之蛋白質之持續循環半衰期。舉例而言,可偵測到蛋白質達長於經由皮下注射蛋白質或編碼蛋白質之mRNA觀測到之半衰期的小時數或天數。在一些實施例中,蛋白質之半衰期為1天、2天、3天、4天、5天或1週或更長時間。
許多類型之釋放遞送系統為可獲得的且為一般熟習此項技術者所已知。其包括基於聚合物之系統,諸如聚(乳酸交酯-乙交酯)、共聚草酸鹽、聚己內酯、聚酯醯胺、聚原酸酯、聚羥基丁酸及聚酸酐。含有前述聚合物之藥物之微膠囊描述於例如美國專利5,075,109中。遞送系統亦包括非聚合物系統,該等非聚合物系統為包括以下之脂質:諸如膽固醇之固醇、膽固醇酯及脂肪酸;或中性脂肪,諸如單酸甘油酯、二酸甘油酯及三酸甘油酯;水凝膠釋放系統;矽橡膠(sylastic)系統;基於肽之系統;蠟塗層;使用習知結合劑及賦形劑之壓縮錠劑;部分融合之植入物;及其類似。特定實例包括但不限於:(a)侵蝕系統,其中含有呈於基質內之形式之反應性組合物,諸如美國專利4,452,775、4,667,014、4,748,034及5,239,660中所描述之侵蝕系統;及(b)擴散系統,其中活性組分以受控速率自聚合物滲透,諸如美國專利3,832,253及3,854,480中所描述。另外,可使用基於泵之硬體遞送系統,其中一些適於植入。
在一些實施例中,治療劑可直接或經由鍵聯部分間接結合至靶向部分。用於使治療劑與靶向部分結合之方法為此項技術中已知的。參見例如Wadwa等人, J, Drug Targeting 3:111 (1995)及美國專利5,087,616。
在一些實施例中,將本文所提供之治療劑調配為儲槽形式以使得治療劑釋放至投與其之身體中之方式相對於體內時間及位置而言為受控的(參見例如美國專利4,450,150)。治療劑之儲槽形式可為例如包含治療劑及諸如聚合物之多孔或無孔材料的植入式組合物,其中治療劑經該材料及/或無孔材料降解物囊封或擴散在整個該材料及/或無孔材料降解物中。隨後,將儲槽植入體內所需位置中,且以預定速率自植入物中釋放治療劑。
10. 治療方法
A.
治療區域及相關疾病 / 病症
在某些態樣中,本文提供治療及/或預防例如自體免疫病症或癌症之病況之方法。
在某些實施例中,本文所提供之治療劑與一或多種額外治療劑共同投與(例如,在同一醫藥組合物中或在單獨醫藥組合物中)。在一些實施例中,可首先投與本文所提供之治療劑,且可其次投與一或多種額外治療劑,或反之亦然。可替代地,本文所提供之治療劑及一或多種額外治療劑可同時投與。
在一些實施例中,個體為哺乳動物。在一些實施例中,本文所提及之哺乳動物可為任何哺乳動物,包括但不限於嚙齒目哺乳動物,諸如小鼠及倉鼠;或兔形目哺乳動物,諸如兔。哺乳動物可來自食肉目,包括貓科動物(貓)及犬科動物(犬)。哺乳動物可來自偶蹄目,包括牛科動物(母牛)及豬科動物(豬);或奇蹄目,包括馬科動物(馬)。哺乳動物可為靈長目、四足猴目或猴目(猴)或類人猿目(人類及猿)。較佳地,哺乳動物為人類。
實例
Wesselhoeft等人(2019) RNA Circularization Diminishes Immunogenicity and Can Extend Translation Duration In vivo. Molecular Cell. 74(3), 508-520及Wesselhoeft等人(2018) Engineering circular RNA for Potent and Stable Translation in Eukaryotic Cells. Nature Communications. 9, 2629係以全文引用之方式併入。
參照以下實例進一步詳細描述本發明,但本發明不意欲限於以下實例。此等實例涵蓋圖解之任何及所有變化,旨在向一般熟習此項技術者提供如何製造及使用本發明之完整揭示內容及描述,且不意欲限制視為本發明之物質的範疇。
實例 1
實例
1A
:
外部雙螺旋體區允許使用經排列內含子外顯子
(PIE)
環化策略來環化長前驅體
RNA
。
將含有全長腦心肌炎病毒(EMCV) IRES之1.1 kb序列、高斯螢光素酶(GLuc)表現序列及經排列內含子-外顯子(PIE)構築體之兩個短外顯子片段插入T4噬菌體之胸苷酸合成酶(Td)基因中之經排列第I組催化性內含子中之3'內含子與5'內含子之間。藉由失控轉錄來合成前驅體RNA。藉由在存在鎂離子及GTP之情況下加熱前驅體RNA來嘗試環化,但未獲得剪接產物。
設計完美互補的9個核苷酸長之雙螺旋體區及19個核苷酸長之雙螺旋體區,且添加在前驅體RNA之5'端及3'端。以前驅體RNA帶之消失評估,對於9個核苷酸雙螺旋體區,添加此等同源臂將剪接效率自0%提高至16%,且對於19個核苷酸雙螺旋體區,提高至48%。
用核糖核酸酶R處理剪接產物。跨經核糖核酸酶R處理之剪接反應物之推定剪接接合點的定序顯露已連接之外顯子,且用靶向寡核苷酸之核糖核酸酶H消化經核糖核酸酶R處理之剪接反應物產生單帶,此與經核糖核酸酶H消化之線性前驅體產生之雙帶形成對比。此表明環狀RNA為含有9個或19個核苷酸長之外部雙螺旋體區之前驅體RNA之剪接反應的主要產物。
實例
1B
:
保存
IRES
及
PIE
剪接位點之二級結構之間隔子提高環化效率。
設計一系列間隔子且將其插入3' PIE剪接位點與IRES之間。此等間隔子經設計以保存或破壞IRES、3' PIE剪接位點及/或5'剪接位點中之內含子序列內之二級結構。添加經設計以保存二級結構之間隔子序列產生87%剪接效率,而添加破壞性間隔子序列不產生可偵測剪接。
實例 2
實例
2A
:
除外部雙螺旋體區之外的內部雙螺旋體區產生剪接氣泡且允許轉譯若干表現序列。
將間隔子設計為非結構化的、不與內含子及IRES序列同源且含有間隔子-間隔子雙螺旋體區。將此等間隔子插入含有外部雙螺旋體區、EMCV IRES及用於高斯螢光素酶(總長度:1289 nt)、螢火蟲螢光素酶(2384 nt)、eGFP (1451 nt)、人類紅血球生成素(1313 nt)及Cas9核酸內切酶(4934 nt)之表現序列的構築體中之5'外顯子與IRES之間以及3'外顯子與表現序列之間。達成所有5種構築體之環化。利用T4噬菌體及念珠藻屬內含子進行之構築體環化大致等同。較短序列之環化效率較高。為了量測轉譯,將各構築體轉染至HEK293細胞中。以發光量測,經高斯螢光素酶及螢火蟲螢光素酶轉染之細胞產生穩健反應,在經紅血球生成素環狀RNA轉染之細胞之培養基中可偵測到人類紅血球生成素,且自經EGFP環狀RNA轉染之細胞觀測到EGFP螢光。與僅sgRNA對照相比,將Cas9環狀RNA與針對GFP之sgRNA共同轉染至組成性表現GFP之細胞中在至多97%之細胞中產生剝蝕螢光。
實例
2B
:
使用
CVB3 IRES
增加蛋白質產量。
製造具有內部雙螺旋體區及外部雙螺旋體區以及不同的含有高斯螢光素酶或螢火蟲螢光素酶表現序列之IRES的構築體。在轉染後24小時以發光量測HEK293細胞上清液中之蛋白質產量。在兩種情況下,柯薩奇病毒B3 (CVB3) IRES構築體產生大部分蛋白質。
實例
2C
:
使用
聚
A
或
聚
AC
間隔子增加蛋白質產量。
將三十個核苷酸長之聚A或聚AC間隔子添加在具有各IRES之構築體中之IRES與剪接接合點之間,從而產生實例2B中之蛋白質。在轉染後24小時以發光量測HEK293細胞上清液中之高斯螢光素酶活性。相比於不具有間隔子之對照構築體,兩種間隔子均改善每一構築體中之表現。
實例 3
經環狀
RNA
轉染之
HEK293
或
HeLa
細胞產生比經相當的未經修飾或經修飾線性
RNA
轉染之
HEK293
或
HeLa
細胞多的蛋白質。
將經HPLC純化之編碼高斯螢光素酶之環狀RNA (CVB3-GLuc-pAC)與典型未經修飾之加5'甲基鳥苷帽及加3' 聚A尾之線性GLuc mRNA及市售的經核苷修飾(假尿苷、5-甲基胞嘧啶)之線性GLuc mRNA (來自Trilink)進行比較。在轉染後24小時量測發光,此顯露環狀RNA在HEK293細胞中產生比未經修飾線性mRNA多811.2%之蛋白質,且產生比經修飾mRNA多54.5%之蛋白質。在HeLa細胞中獲得類似結果及經最佳化之編碼人類紅血球生成素之環狀RNA與經5-甲氧基尿苷修飾之線性mRNA的比較結果。
經6天收集發光資料。在HEK293細胞中,與未經修飾線性mRNA之43小時及經修飾線性mRNA之45小時相比,環狀RNA轉染產生80小時蛋白質生產半衰期。在HeLa細胞中,與未經修飾線性mRNA之44小時及經修飾線性mRNA之49小時相比,環狀RNA轉染產生116小時蛋白質生產半衰期。環狀RNA在兩種細胞類型中在其壽命內產生比未經修飾線性mRNA及經修飾線性mRNA兩者實質上多之蛋白質。
實例 4
實例
4A
:
藉由核糖核酸酶消化、
HPLC
純化及磷酸酶處理純化環狀
RNA
會降低免疫原性。
經完全純化之環狀
RNA
的免疫原性顯著低於未經純化或經部分純化之環狀
RNA
的免疫原性。蛋白質表現穩定性及細胞活力視細胞類型及環狀
RNA
純度而定。
用以下轉染人類胎腎293 (HEK293)細胞及人類肺癌A549細胞:
a. 未經純化GLuc環狀RNA剪接反應產物,
b. 剪接反應物之核糖核酸酶R消化產物,
c. 剪接反應物之核糖核酸酶R消化及HPLC純化產物,或
d. 剪接反應物之核糖核酸酶消化、HPLC純化及磷酸酶處理產物。
與未經轉染對照相比,剪接反應物之核糖核酸酶R消化不足以阻止A549細胞中之細胞介素釋放。
與未經純化剪接反應物相比,新增HPLC純化亦不足以阻止細胞介素釋放,但介白素-6 (IL-6)顯著減少且干擾素-α1 (IFNα1)顯著增加。
在HPLC純化之後及在核糖核酸酶R消化之前新增磷酸酶處理大大減少所評估之所有經上調細胞介素在A549細胞中之表現。分泌單核球趨化蛋白1 (MCP1)、IL-6、IFNα1、腫瘤壞死因子α (TNFα)及IFNγ誘導蛋白-10 (IP-10)下降至不可偵測或未經轉染之基線位準。
HEK293細胞中不存在實質性細胞介素釋放。當經較高純度環狀RNA轉染時,A549細胞具有提高之GLuc表現穩定性及細胞活力。經完全純化之環狀RNA具有與經轉染293細胞之穩定性表現型類似的穩定性表現型。
實例
4B
:
環狀
RNA
不產生顯著免疫原性且不為
RIG-I
配位體。
用以下轉染A549細胞:
a. 未經純化環狀RNA,
b. 高分子量(線性及環狀串連) RNA,
c. 環狀(帶切口) RNA,
d. 經純化環狀RNA之早期溶離份(與帶切口RNA峰重疊較多),
e. 經純化環狀RNA之晚期溶離份(與帶切口RNA峰重疊較少),
f. 在環化期間截除之內含子,或
g. 媒劑(亦即,未經轉染對照)。
單獨地合成前驅體RNA,且由於難以自剪接反應物獲得適當地純之線性前驅體RNA,因此以剪接位點缺失突變體(DS)形式將該前驅體RNA純化。量測各情況下之細胞介素釋放及細胞活力。
觀測到響應於存在於剪接反應物內之大部分物種以及前驅體RNA的穩健IL-6、RANTES及IP-10釋放。早期環狀RNA溶離份引發與其他非環狀RNA溶離份相當之細胞介素反應,此指示即使相對少之數量之線性RNA污染物亦能夠在A549細胞中誘導實質性細胞免疫反應。晚期環狀RNA溶離份不引發超過未經轉染對照之細胞介素反應的細胞介素反應。對於晚期環狀RNA溶離份,轉染後36小時之A549細胞活力與所有其他溶離份相比顯著較大。
分析在用晚期環狀RNA HPLC溶離份、前驅體RNA或未經純化剪接反應物轉染A549細胞後之RIG-I及IFN-β1轉錄物誘導。對於晚期環狀RNA溶離份,RIG-I及IFN-β1轉錄物誘導與前驅體RNA及未經純化剪接反應物相比較弱。單獨剪接反應物之核糖核酸酶R處理不足以去除此效應。向環狀RNA中添加極少數量之RIG-I配位體3p-hpRNA誘導實質性RIG-I轉錄。在HeLa細胞中,經核糖核酸酶R消化之剪接反應物之轉染誘導RIG-I及IFN-β1,但經純化環狀RNA並不如此。總體而言,與A549細胞相比,HeLa細胞對污染性RNA物種之敏感性較低。
監測在用剪接反應物或經完全純化之環狀RNA轉染A549細胞後前8小時內之RIG-I、IFN-β1、IL-6及RANTES轉錄物誘導的時程實驗不顯露針對環狀RNA之暫態反應。經純化環狀RNA類似地未能在RAW264.7鼠巨噬細胞中誘導促炎性轉錄物。
用含有EMCV IRES及EGFP表現序列之經純化環狀RNA轉染A549細胞。此未能產生促炎性轉錄物之實質性誘導。此等資料表明,剪接反應物之非環狀組分負責先前研究中所觀測到之免疫原性,且環狀RNA不為RIG-I之天然配位體。
實例 5
環狀
RNA
避免
TLR
偵測。
用多個線性或環狀RNA構築體轉染TLR 3、7及8報導細胞株,且量測分泌胚胎鹼性磷酸酶(SEAP)。
藉由使內含子及同源臂序列缺失來構築線性化RNA。隨後,用磷酸酶(在加帽之後的加帽RNA之情況下)處理線性RNA構築體且藉由HPLC將其純化。
所嘗試之轉染中無一者在TLR7報導細胞中產生反應。藉由加帽線性化RNA、聚腺苷酸化線性化RNA、帶切口環狀RNA HPLC溶離份及早期環狀RNA溶離份活化TLR3及TLR8報導細胞。晚期環狀RNA溶離份及m1ψ-mRNA不在任何細胞株中引起TLR介導之反應。
在第二實驗中,使用以下兩種方法線性化環狀RNA:在存在鎂離子之情況下熱處理環狀RNA及DNA寡核苷酸引導之核糖核酸酶H消化。兩種方法均產生大部分全長線性RNA及少量完整環狀RNA。用環狀RNA轉染TLR3、7及8報導細胞,藉由熱降解環狀RNA,或藉由核糖核酸酶H降解環狀RNA,且在轉染後36小時量測SEAP分泌。TLR8報導細胞分泌響應於經降解環狀RNA之兩種形式的SEAP,但針對環狀RNA轉染不產生比模擬物轉染大之反應。對於降解或完整條件,在TLR3及TLR7報導細胞中未觀測到活化,儘管藉由經活體外轉錄之線性化RNA活化TLR3。
實例 6
未經修飾環狀
RNA
產生相比於線性
RNA
增加之持續活體內蛋白質表現。
向小鼠進行注射,且用未經修飾及經m1ψ修飾之人類紅血球生成素(hEpo)線性mRNA及環狀RNA轉染HEK293細胞。等莫耳轉染m1ψ-mRNA及未經修飾環狀RNA在HEK293細胞中產生穩健蛋白質表現。與GLuc線性mRNA及環狀RNA相比,hEpo線性mRNA及環狀RNA在等重量轉染HEK293及A549細胞後展現類似的相對蛋白質表現模式及細胞活力。
在小鼠中,在將hEpo環狀RNA或線性mRNA注射至內臟脂肪中之後,在血清中偵測到hEpo。在注射未經修飾環狀RNA之後偵測到之hEpo比在注射未經修飾mRNA或m1ψ-mRNA之後偵測到之hEpo衰變更慢,且在注射後42小時仍存在。在注射未經純化環狀RNA剪接反應物或未經修飾線性mRNA後,血清hEpo快速減少。注射未經純化剪接反應物產生在血清中可偵測到之細胞介素反應,對於包括經純化環狀RNA之其他RNA未觀測到該細胞介素反應。
實例 7
環狀
RNA
可活體內或活體外經由脂質奈米粒子有效地遞送。
將經純化環狀RNA調配至具有可離子化類脂質cKK-E12之脂質奈米粒子(LNP)中(Dong等人, 2014年;Kauffman等人, 2015年)。該等粒子形成具有與含有市售的經5moU修飾之對照線性mRNA之粒子之平均大小、多分散性指數及囊封效率類似的平均大小、多分散性指數及囊封效率的均勻多層結構。
當囊封於LNP中且添加至HEK293細胞中時,經純化hEpo環狀RNA展現比5moU-mRNA大之表現。LNP-RNA在HEK293細胞中之表現穩定性與藉由轉染劑遞送之RNA之表現穩定性類似,5moU-mRNA及環狀RNA之略微延遲之衰變除外。未經修飾環狀RNA及5moU-mRNA均未能活體外活化RIG-I/IFN-β1。
在小鼠中,藉由局部注射將LNP-RNA遞送至內臟脂肪組織或靜脈內遞送至肝。在兩種情況下遞送後6小時,環狀RNA之血清hEpo表現較低、但與5moU-mRNA之血清hEpo表現相當。在脂肪注射未經修飾LNP-環狀RNA之後偵測到之血清hEpo比在脂肪注射LNP-5moU-mRNA之後偵測到之血清hEpo衰變更慢,其中血清中存在之表現衰變延遲與活體外標註之表現衰變延遲類似,但在靜脈內注射LNP-環狀RNA或LNP-5moU-mRNA之後的血清hEpo以大致相同速率衰變。在此等情況中之任一者下,血清細胞介素或局部RIG-I、TNFα或IL-6轉錄物誘導未增加。
實例 8
HEK293
、
HepG2
及
1C1C7
細胞中
IRES
之表現及功能穩定性。
使包括念珠藻屬內含子/外顯子區、高斯螢光素酶表現序列及不同IRES之構築體環化。使用脂染胺MessengerMax將100 ng各環化反應物單獨地轉染至20,000個HEK293細胞、HepG2細胞及1C1C7細胞中。在24小時後評估各上清液中之發光作為蛋白質表現之量度。在HEK293細胞中,包括克羅希病毒B、薩利病毒FHB、愛知病毒、薩利病毒HG-J1及腸病毒J IRES之構築體在24小時產生最高程度的發光(圖1A)。在HepG2細胞中,包括愛知病毒、薩利病毒FHB、EMCV-Cf及CVA3 IRES之構築體在24小時產生高發光(圖1B)。在1C1C7細胞中,包括薩利病毒FHB、愛知病毒、薩利病毒NG-J1及薩利病毒A SZ-1 IRES之構築體在24小時產生高發光(圖1C)。
觀測到較大IRES在24小時產生較高發光之趨勢。較短總序列長度傾向於提高環化效率,因此選擇高表現及相對短之IRES可產生改良之構築體。在HEK293細胞中,使用克羅希病毒B IRES之構築體產生最高發光,尤其與類似長度之其他IRES相比(圖2A)。針對IRES大小繪製之IRES構築體在HepG2及1C1C7細胞中之表現係在圖2B及圖2C中。
經3天量測選定IRES構築體在HepG2及1C1C7細胞中之功能穩定性。在用100 ng各環化反應物轉染20,000個細胞,接著進行完全培養基置換之後每24小時量測上清液中分泌高斯螢光素酶之發光。薩利病毒A GUT及薩利病毒FHB在HepG2細胞中展現最高功能穩定性,且薩利病毒N-J1及薩利病毒FHB在1C1C7細胞中產生最穩定表現(圖3A及圖3B)。
實例 9
Jurkat
細胞中
IRES
之表現及功能穩定性。
使2組包括念珠藻屬內含子/外顯子區、高斯螢光素酶表現序列及先前測試之IRES子集之構築體環化。用1 µg各環化反應物電穿孔60,000個Jurkat細胞。在電穿孔後24小時量測上清液中分泌高斯螢光素酶之發光。將CVB3 IRES構築體包括於兩組中以用於組間比較及與先前確定之IRES功效的比較。CVB1及薩利病毒A SZ1 IRES構築體在24 h產生最高程度的表現。資料可見於圖4A及圖4B中。
經3天量測各輪經電穿孔Jurkat細胞中IRES構築體之功能穩定性。在用1 µg各環化反應物電穿孔60,000個細胞,接著進行完全培養基置換之後每24小時量測上清液中分泌高斯螢光素酶之發光(圖5A及圖5B)。
薩利病毒A SZ1及薩利病毒A BN2 IRES構築體具有與其他構築體相比高之功能穩定性。
實例 10
Jurkat
細胞中環狀
RNA
及線性
RNA
之表現、功能穩定性及細胞介素釋放。
使包括念珠藻屬內含子/外顯子區、高斯螢光素酶表現序列及薩利病毒FHB IRES之構築體環化。包括高斯螢光素酶表現序列及~150 nt 聚A尾(例如SEQ ID NO: 3279)且經修飾以用5-甲氧基尿苷(5moU)置換100%尿苷之mRNA為市售的且購自Trilink。已展示5moU核苷酸修飾改善mRNA穩定性及表現(Bioconjug Chem. 2016年3月16日;27(3):849-53)。量測且比較Jurkat細胞中經修飾mRNA、環化反應物(不純)及藉由粒徑排阻HPLC純化之環狀RNA (純)的表現(圖6A)。在用1 µg各RNA物種電穿孔60,000個細胞之後24小時量測上清液中分泌高斯螢光素酶之發光。
在用1 μg各RNA物種電穿孔60,000個細胞,接著進行完全培養基置換之後每24小時量測上清液中分泌高斯螢光素酶之發光。經3天之Jurkat細胞中經修飾mRNA及環狀RNA之功能穩定性資料比較結果係在圖6B中。
在用1 µg上文所描述之各RNA物種及3p-hpRNA (作為已知RIG-I促效劑之5'三磷酸酯髮夾RNA)電穿孔60,000個Jurkat細胞之後18小時量測IFNγ (圖7A)、IL-6 (圖7B)、IL-2 (圖7C)、RIG-I (圖7D)、IFN-β1 (圖7E)及TNFα (圖7F)轉錄物誘導。
實例 11
單核球及巨噬細胞中環狀
RNA
及線性
RNA
之表現。
使包括念珠藻屬內含子/外顯子區、高斯螢光素酶表現序列及薩利病毒FHB IRES之構築體環化。包括高斯螢光素酶表現序列及~150 nt 聚A尾(例如SEQ ID NO: 3279)且經修飾以用5-甲氧基尿苷(5moU)置換100%尿苷之mRNA購自Trilink。量測人類原代單核球(圖8A)及人類原代巨噬細胞(圖8B)中環狀mRNA及經修飾mRNA之表現。在用1 µg各RNA物種電穿孔60,000個細胞之後24小時量測上清液中分泌高斯螢光素酶之發光。亦在電穿孔人類原代巨噬細胞之後4天量測發光且每24小時量測培養基變化(圖8C)。在各情況下,發光差異為統計學上顯著的(p < 0.05)。
實例 12
原代
T
細胞中
IRES
之表現及功能穩定性。
使包括念珠藻屬內含子/外顯子區、高斯螢光素酶表現序列及先前測試之IRES子集之構築體環化,且藉由粒徑排阻HPLC純化反應產物。用1 µg各環狀RNA電穿孔150,000個原代人類CD3+ T細胞。在電穿孔後24小時量測上清液中分泌高斯螢光素酶之發光(圖9A)。愛知病毒及CVB3 IRES構築體在24小時具有最高程度的表現。
亦在電穿孔3天之後每24小時量測發光以便比較各構築體之功能穩定性(圖9B)。具有薩利病毒A SZ1 IRES之構築體為最穩定的。
實例 13
原代
T
細胞及
PBMC
中環狀
RNA
及線性
RNA
之表現及功能穩定性。
使包括念珠藻屬內含子/外顯子區、高斯螢光素酶表現序列及薩利病毒A SZ1 IRES或薩利病毒FHB IRES之構築體環化。包括高斯螢光素酶表現序列及~150 nt 聚A尾(例如SEQ ID NO: 3279)且經修飾以用5-甲氧基尿苷(5moU)置換100%尿苷之mRNA且購自Trilink。量測人類原代CD3+ T細胞中薩利病毒A SZ1 IRES經HPLC純化之環狀mRNA及經修飾mRNA之表現。量測人類PBMC中薩利病毒FHB經HPLC純化之環狀mRNA、未經純化環狀mRNA及經修飾mRNA之表現。在用1 µg各RNA物種電穿孔150,000個細胞之後24小時量測上清液中分泌高斯螢光素酶之發光。原代人類T細胞之資料係在圖10A及圖10B中,且PBMC之資料係在圖10C中。在各情況下,經純化環狀RNA與未經純化環狀RNA或線性RNA之間的表現差異為顯著的(p < 0.05)。
在經3天電穿孔之後每24小時量測原代T細胞上清液中分泌高斯螢光素酶之發光以便比較構築體功能穩定性。資料示於圖10B中。在第2天及第3天對於原代T細胞之經純化環狀RNA與線性RNA之間的來自第1天量測之相對發光差異為顯著的。
實例 14
利用念珠藻屬內含子中之排列位點之環化效率。
產生包括CVB3 IRES、高斯螢光素酶表現序列、念珠藻屬內含子/外顯子區、間隔子、內部雙螺旋體區及同源臂之RNA構築體。以HPLC量測使用傳統的念珠藻屬內含子排列位點及P9中之5個連續排列位點的構築體環化效率。P9中之5個連續排列位點之HPLC層析圖示於圖11A中。
量測各種排列位點處之環化效率。環化效率經定義為以下中之各者之HPLC層析圖曲線下面積:環狀RNA/(環狀RNA+前驅體RNA)。各排列位點處之環化效率之分級定量係在圖11B中。選擇3個排列位點(指示於圖11B中)用於進一步研究。
藉由活體外轉錄(IVT)環化此實例中之環狀RNA,隨後經由旋轉管柱將其純化。若包括與Mg
2+及鳥苷核苷酸一起培育之額外步驟,則所有構築體之環化效率可能較高;然而,去除此步驟允許用於環狀RNA構築體之間的比較及其最佳化。此位準之最佳化尤其可用於維持大RNA構築體,諸如編碼嵌合抗原受體之大RNA構築體的高環化效率。
實例 15
替代性內含子之環化效率。
產生含有可變物種來源之經排列第1組內含子或排列位點及包括CVB3 IRES、高斯螢光素酶表現序列、間隔子、內部雙螺旋體區及同源臂之若干恆定元件的前驅體RNA。環化資料可見於圖12中。圖12A展示解析前驅體、環狀RNA及內含子之層析圖。圖12B提供隨內含子構築體而變之基於圖12A中所示之層析圖之環化效率的分級定量。
藉由活體外轉錄(IVT)環化此實例中之環狀RNA,隨後進行旋轉管柱純化。若包括與Mg
2+及鳥苷核苷酸一起培育之額外步驟,則所有構築體之環化效率可能較高;然而,去除此步驟允許用於環狀RNA構築體之間的比較及其最佳化。此位準之最佳化尤其可用於維持大RNA構築體,諸如編碼嵌合抗原受體之大RNA構築體的高環化效率。
實例 16
利用同源臂呈現或長度之環化效率。
產生包括CVB3 IRES、高斯螢光素酶表現序列、念珠藻屬內含子/外顯子區、間隔子及內部雙螺旋體區之RNA構築體。測試具有30 nt 25% GC同源臂或不具有同源臂的呈現3個念珠藻屬內含子排列位點之構築體(「NA」)。在無與Mg
2+一起培育之步驟之情況下使此等構築體環化。量測且比較環化效率。資料可見於圖13中。各不具有同源臂之構築體之環化效率較高。圖13A提供環化效率之分級定量;圖13B提供解析前驅體、環狀RNA及內含子之層析圖。
對於3個排列位點中之各者,產生具有10 nt、20 nt及30 nt臂長度以及25%、50%及75% GC之構築體。量測此等構築體之剪接效率且與不具有同源臂之構築體進行比較(圖14)。剪接效率經定義為游離內含子相對於剪接反應物中之總RNA的比例。
圖15A (左側)含有展示強同源臂對改善之剪接效率之貢獻的HPLC層析圖。左上:75% GC含量、10 nt同源臂。中左:75% GC含量、20 nt同源臂。左下:75% GC含量、30 nt同源臂。
圖15A (右側)展示指示在環狀RNA峰上呈現為肩之與增加之切口配對的提高之剪接效率的HPLC層析圖。右上:75% GC含量、10 nt同源臂。中右:75% GC含量、20 nt同源臂。右下:75% GC含量、30 nt同源臂。
圖15B (左側)展示經假設展現改善之環化效率的排列位點與同源臂之選定組合。
圖15B (右側)展示經假設展現改善之環化效率、經大腸桿菌聚A聚合酶處理的排列位點與同源臂之選定組合。
藉由活體外轉錄(IVT)環化此實例中之環狀RNA,隨後進行旋轉管柱純化。若包括與鳥苷核苷酸一起之額外Mg
2+培育步驟,則所有構築體之環化效率可能較高;然而,去除此步驟允許用於環狀RNA構築體之間的比較及其最佳化。此位準之最佳化尤其可用於維持大RNA構築體,諸如編碼嵌合抗原受體之大RNA構築體的高環化效率。
實例 17
編碼嵌合抗原受體之環狀
RNA
。
使包括念珠藻屬內含子/外顯子區、Kymriah嵌合抗原受體(CAR)表現序列及CVB3 IRES之構築體環化。用500 ng環狀RNA電穿孔100,000個人類原代CD3+ T細胞且與穩定地表現GFP及螢火蟲螢光素酶之Raji細胞共同培養24小時。效應物:目標比(E:T比)為0.75:1。對100,000個人類原代CD3+ T細胞進行模擬物電穿孔且作為對照共同培養(圖16)。
對100,000個人類原代CD3+ T細胞組進行模擬物電穿孔或用1 µg環狀RNA對其進行電穿孔,隨後與穩定地表現GFP及螢火蟲螢光素酶之Raji細胞共同培養48小時。E:T比為10:1 (圖17)。
以螢火蟲發光偵測測定Raji目標細胞之比溶解率定量(圖18)。將經模擬物電穿孔或經編碼不同CAR序列之環狀RNA電穿孔之100,000個人類原代CD3+ T細胞與穩定地表現GFP及螢火蟲螢光素酶之Raji細胞共同培養48小時。比溶解率%經定義為1-[CAR條件發光]/[模擬物條件發光]。E:T比為10:1。
實例 18
Jurkat
細胞及靜止人類
T
細胞中環狀
RNA
及線性
RNA
之表現及功能穩定性。
使包括念珠藻屬內含子/外顯子區、高斯螢光素酶表現序列及先前測試之IRES子集之構築體環化,且藉由粒徑排阻HPLC純化反應產物。用1 µg環狀RNA或5moU-mRNA電穿孔150,000個Jurkat細胞。在電穿孔後24小時量測上清液中分泌高斯螢光素酶之發光(圖19A左側)。用1 µg環狀RNA或5moU-mRNA電穿孔150,000個靜止原代人類CD3+ T細胞(刺激後10天)。在電穿孔後24小時量測上清液中分泌高斯螢光素酶之發光(圖19A右側)。
在電穿孔、接著為完全培養基置換之後每24小時量測上清液中分泌高斯螢光素酶之發光。功能穩定性資料示於圖19B中。在各情況下,環狀RNA具有比線性RNA更高程度的功能穩定性,其中Jurkat細胞中之差異更明顯。
實例 19
經線性
RNA
或不同環狀
RNA
構築體電穿孔之細胞之
IFN-
β
1
、
RIG-I
、
IL-2
、
IL-6
、
IFN
γ
及
TNF
α
轉錄物誘導。
使包括念珠藻屬內含子/外顯子區、高斯螢光素酶表現序列及先前測試之IRES子集之構築體環化,且藉由粒徑排阻HPLC純化反應產物。用1 µg環狀RNA、5moU-mRNA或免疫刺激性陽性對照聚肌苷:胞嘧啶電穿孔150,000個CD3+人類T細胞。在電穿孔後18小時量測IFN-β1 (圖20A)、RIG-I (圖20B)、IL-2 (圖20C)、IL-6 (圖20D)、IFN-γ (圖20E)及TNF-α (圖20F)轉錄物誘導。
實例 20
經不同量之環狀
RNA
或線性
RNA
電穿孔的表現
CAR
之細胞對目標細胞之比溶解率及
IFN
γ
轉錄物誘導
;
在不同
E:T
比下之表現
CAR
之細胞對目標細胞及非目標細胞之比溶解率。
使包括念珠藻屬內含子/外顯子區、抗CD19 CAR表現序列及CVB3 IRES之構築體環化,且藉由粒徑排阻HPLC純化反應產物。將經模擬物電穿孔或經不同數量之編碼抗CD19 CAR序列之環狀RNA電穿孔的150,000個人類原代CD3+ T細胞與穩定地表現GFP及螢火蟲螢光素酶之Raji細胞以2:1之E:T比共同培養12小時。以螢火蟲發光偵測測定Raji目標細胞之比溶解率(圖21A)。比溶解率%經定義為1-[CAR條件發光]/[模擬物條件發光]。在電穿孔後24小時量測IFNγ轉錄物誘導(圖21B)。
對150,000個人類原代CD3+ T細胞進行模擬物電穿孔或用500 ng編碼抗CD19 CAR序列之環狀RNA或m1ψ-mRNA對其進行電穿孔,隨後與穩定地表現螢火蟲螢光素酶之Raji細胞以不同E:T比共同培養24小時。以螢火蟲發光偵測測定Raji目標細胞之比溶解率(圖22A)。比溶解率經定義為1-[CAR條件發光]/[模擬物條件發光]。
亦將表現CAR之T細胞與穩定地表現螢火蟲螢光素酶之Raji或K562細胞以不同E:T比共同培養24小時。以螢火蟲發光偵測測定Raji目標細胞或K562非目標細胞之比溶解率(圖22B)。比溶解率%經定義為1-[CAR條件發光]/[模擬物條件發光]。
實例 21
經編碼
CAR
之環狀
RNA
或線性
RNA
電穿孔之
T
細胞對目標細胞之比溶解率。
使包括念珠藻屬內含子/外顯子區、抗CD19 CAR表現序列及CVB3 IRES之構築體環化,且藉由粒徑排阻HPLC純化反應產物。用各自編碼靶向CD19之CAR的500 ng環狀RNA或等莫耳數量之m1ψ-mRNA電穿孔人類原代CD3+ T細胞。經7天將Raji細胞以10:1之E:T比添加至CAR-T細胞培養物中。在1、3、5及7天量測兩種構築體之比溶解率% (圖23)。
實例 22
表現抗
CD19 CAR
或抗
BCMA CAR
之
T
細胞對
Raji
細胞之比溶解率。
使包括念珠藻屬內含子/外顯子區、抗CD19或抗BCMA CAR表現序列及CVB3 IRES之構築體環化,且藉由粒徑排阻HPLC純化反應產物。用500 ng環狀RNA電穿孔150,000個原代人類CD3+ T細胞,隨後以2:1之E:T比與Raji細胞共同培養。在電穿孔後12小時量測比溶解率% (圖24)。
實例 23
表現抗原之環狀
RNA
及線性
RNA
之表現、功能穩定性及細胞介素轉錄物誘導。
使包括一或多個抗原表現序列之構築體環化,且藉由粒徑排阻HPLC純化反應產物。用環狀RNA或mRNA電穿孔抗原呈現細胞。
經由ELISA量測活體外抗原生產。視情況而言,在電穿孔之後每24小時量測抗原生產。在用編碼抗原之環狀RNA或線性RNA電穿孔抗原呈現細胞之後18小時量測細胞介素轉錄物誘導或釋放。所測試之細胞介素可包括IFN-β1、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ、RANTES及TNFα。
使用經純化環狀RNA、經純化環狀RNA加反義環狀RNA以及未經純化環狀RNA量測活體外抗原生產及細胞介素誘導以便尋找最佳地保留表現及免疫刺激之比率。
實例 24
動物模型中之活體內抗原及抗體表現。
為了評估編碼抗原之環狀RNA促進活體內抗原表現及抗體生產之能力,經由肌內注射將遞增劑量之編碼一或多種抗原之RNA引入小鼠中。
向小鼠注射一次,28天後收集血液,隨後再次注射,且其後14天收集血液。經由ELISA量測針對所關注之抗原的中和抗體。
實例 25
感染防護。
為了評估編碼抗原之環狀RNA防護或治癒感染之能力,經由肌內注射將編碼病毒(諸如流感)之一或多種抗原的RNA引入小鼠中。
小鼠接受初始注射及編碼一或多種抗原之環狀RNA的加強注射。藉由經2週之體重減輕及死亡率測定諸如流感之病毒防護。
實例 26
實例
26A
:
化合物合成
代表性本發明之可離子化脂質之合成描述於PCT申請案PCT/US2016/052352、PCT/US2016/068300、PCT/US2010/061058、PCT/US2018/058555、PCT/US2018/053569、PCT/US2017/028981、PCT/US2019/025246、PCT/US2018/035419、PCT/US2019/015913及具有公開號20190314524、20190321489及20190314284之美國申請案中,該等案中之各者之內容以全文引用之方式併入本文中。
實例
26B
:
化合物合成
代表性本發明之可離子化脂質之合成描述於美國專利公開案第US20170210697A1號中,該案之內容以全文引用之方式併入本文中。
實例 27
器官之蛋白質表現
產生編碼FLuc之環狀RNA或線性RNA且將其裝載至具有以下調配物之轉移媒劑中:50%由
表示之可離子化脂質10b-15、10% DSPC、1.5% PEG-DMG、38.5%膽固醇。以0.2 mg/kg向CD-1小鼠給藥,且在6小時(活體IVIS)及24小時(活體IVIS及離體IVIS)量測發光。量測肝、脾、腎、肺及心臟之總通量(所關注之區域上之光子/秒) (圖25及圖26)。
實例 28
脾中之表現分佈
產生編碼GFP之環狀RNA或線性RNA且將其裝載至具有以下調配物之轉移媒劑中:50%由
表示之可離子化脂質10b-15、10% DSPC、1.5% PEG-DMG、38.5%膽固醇。向CD-1小鼠投與該調配物。在脾細胞上運行流動式細胞測量術以測定跨細胞類型之表現分佈。
實例 29
實例
29A
:
產生奈米粒子組合物
為了研究用於將環狀RNA遞送至細胞之安全且有效的奈米粒子組合物,製備且測試一系列調配物。具體言之,使奈米粒子組合物之脂質組分中之特定成分及其比率最佳化。
可在1個流體流中或用諸如微流體及兩個流體流之T-接面混合之混合方法製造奈米粒子,其中之一者含有環狀RNA且另一者具有脂質組分。
藉由將可離子化脂質、視情況輔助脂質(諸如DOPE、DSPC或油酸,可獲自Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL)、PEG脂質(諸如1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇,亦稱為PEG-DMG,可獲自Avanti Polar Lipids、Alabaster,AL)及結構性脂質(諸如膽固醇)合併來製備呈約例如40或50 mM於例如乙醇之溶劑中之濃度的脂質組合物。將溶液冷藏儲存在例如-20℃下。將脂質合併,得到所需莫耳比(參見例如下表17a及表17b),且用水及乙醇稀釋至例如在約5.5 mM與約25 mM之間的最終脂質濃度。
表 17a
調配物編號 | 描述 |
1 | 將C12-200、DOPE、膽固醇及DMG-PEG2K (40:30:25:5)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地由1 mg/mL儲備液製備環狀RNA之緩衝水溶液(10 mM檸檬酸鹽/150 mM NaCl,pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪,得到最終的於20%乙醇中之懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液,用1×PBS (pH 7.4)透濾,濃縮且儲存於2-8℃下。 |
2 | 將DODAP、DOPE、膽固醇及DMG-PEG2K (18:56:20:6)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地由1 mg/mL儲備液製備EPO環狀RNA之緩衝水溶液(10 mM檸檬酸鹽/150 mM NaCl,pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪,得到最終的於20%乙醇中之懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液,用1×PBS (pH 7.4)透濾,濃縮且儲存於2-8℃下。最終濃度=1.35 mg/mL EPO環狀RNA (經囊封)。Z平均值=75.9 nm (Dv(50)=57.3 nm;Dv(90)=92.1 nm)。 |
3 | 將HGT4003、DOPE、膽固醇及DMG-PEG2K (50:25:20:5)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地由1 mg/mL儲備液製備環狀RNA之緩衝水溶液(10 mM檸檬酸鹽/150 mM NaCl,pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪,得到最終的於20%乙醇中之懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液,用1×PBS (pH 7.4)透濾,濃縮且儲存於2-8℃下。 |
4 | 將ICE、DOPE及DMG-PEG2K (70:25:5)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地由1 mg/mL儲備液製備環狀RNA之緩衝水溶液(10 mM檸檬酸鹽/150 mM NaCl,pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪,得到最終的於20%乙醇中之懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液,用1×PBS (pH 7.4)透濾,濃縮且儲存於2-8℃下。 |
5 | 將HGT5000、DOPE、膽固醇及DMG-PEG2K (40:20:35:5)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地由1 mg/mL儲備液製備EPO環狀RNA之緩衝水溶液(10 mM檸檬酸鹽/150 mM NaCl,pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪,得到最終的於20%乙醇中之懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液,用1×PBS (pH 7.4)透濾,濃縮且儲存於2-8℃下。最終濃度=1.82 mg/mL EPO mRNA (經囊封)。Z平均值=105.6 nm (Dv(50)=53.7 nm;Dv(90)=157 nm)。 |
6 | 將HGT5001、DOPE、膽固醇及DMG-PEG2K (40:20:35:5)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地由1 mg/mL儲備液製備EPO環狀RNA之緩衝水溶液(10 mM檸檬酸鹽/150 mM NaCl,pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪,得到最終的於20%乙醇中之懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液,用1×PBS (pH 7.4)透濾,濃縮且儲存於2-8℃下。 |
7 | 將HGT5001、DOPE、膽固醇及DMG-PEG2K (35:16:46.5:2.5)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地由1 mg/mL儲備液製備EPO環狀RNA之緩衝水溶液(10 mM檸檬酸鹽/150 mM NaCl,pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪,得到最終的於20%乙醇中之懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液,用1×PBS (pH 7.4)透濾,濃縮且儲存於2-8℃下。 |
8 | 將HGT5001、DOPE、膽固醇及DMG-PEG2K (40:10:40:10)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地由1 mg/mL儲備液製備EPO環狀RNA之緩衝水溶液(10 mM檸檬酸鹽/150 mM NaCl,pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪,得到最終的於20%乙醇中之懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液,用1×PBS (pH 7.4)透濾,濃縮且儲存於2-8℃下。 |
9 | 將LP-01、DSPC、膽固醇及DMG-PEG2K (45:9:44:2)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地由1 mg/mL儲備液製備FLuc、hEPO、微小肌縮蛋白、微型肌縮蛋白或肌縮蛋白環狀RNA之緩衝水溶液(50 mM乙酸鈉,pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪,得到最終的於25%乙醇中之懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液,用1×PBS (pH 7.4)透濾,濃縮且儲存於2-8℃下。 |
10 | 將LP-01、DSPC、膽固醇及DMG-PEG2K以及乙基月桂醯基精胺酸之DMSO溶液(38.25:7.65:37.4:1.7:15)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地由1 mg/mL儲備液製備FLuc、hEPO、微小肌縮蛋白、微型肌縮蛋白或肌縮蛋白環狀RNA之緩衝水溶液(50 mM Bis-Tris,pH 7.0)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪,得到最終的於25%乙醇中之懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液,用1×PBS (pH 7.4)透濾,濃縮且儲存於2-8℃下。 |
11 | 將SM-102、DSPC、膽固醇及DMG-PEG2K (50:10:38.5:1.5)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地由1 mg/mL儲備液製備FLuc、hEPO、微小肌縮蛋白、微型肌縮蛋白或肌縮蛋白環狀RNA之緩衝水溶液(6.25 mM乙酸鈉,pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪,得到最終的於25%乙醇中之懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液,用1×PBS (pH 7.4)透濾,濃縮且儲存於2-8℃下。 |
12 | 將SM-102、DSPC、膽固醇及DMG-PEG2K以及乙基月桂醯基精胺酸之DMSO溶液(42.5:8.5:32.73:1.275:15)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地由1 mg/mL儲備液製備FLuc、hEPO、微小肌縮蛋白、微型肌縮蛋白或肌縮蛋白環狀RNA之緩衝水溶液(20 mM乙酸鈉,pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪,得到最終的於25%乙醇中之懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液,用1×PBS (pH 7.4)透濾,濃縮且儲存於2-8℃下。 |
在一些實施例中,轉移媒劑具有如表17a中所描述之調配物。
表 17b
組成(mol%) | 組分 |
40:20:38.5:1.5 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
45:15:38.5:1.5 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
50:10:38.5:1.5 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
55:5:38.5:15 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
60:5:33.5:1.5 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
45:20:33.5:1.5 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
50:20:28.5:1.5 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
55:20:23.5:1.5 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
60:20:18.5:1.5 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
40:15:43.5:1.5 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
50:15:33.5:1.5 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
55:15:28.5:1.5 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
60:15:23.5:1.5 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
40:10:48.5:1.5 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
45:10:43.5:1.5 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
55:10:33.5:1.5 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
60:10:28.5:1.5 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
40:5:53.5:1.5 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
45:5:48-5:1.5 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
50:5:43.5:1.5 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
40:20:40:0 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
45:20:35:0 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
50:20:30:0 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
55:20:25:0 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
60:20:20:0 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
40:15:45:0 | 化合物:磷脂:植物固醇*: PEG-DMG |
在一些實施例中,轉移媒劑具有如表17b中所描述之調配物。
對於包括環狀RNA之奈米粒子組合物,將呈0.1 mg/ml濃度之環狀RNA於去離子水中之溶液在例如pH在3與4之間的50 mM檸檬酸鈉緩衝液之緩衝液中稀釋以形成儲備溶液。可替代地,將呈0.15 mg/ml濃度之環狀RNA於去離子水中之溶液在例如pH在3與4.5之間的6.25 mM乙酸鈉緩衝液之緩衝液中稀釋以形成儲備溶液。
藉由將脂質溶液與包括環狀RNA之溶液以在約5:1與約50:1之間的脂質組分與環狀RNA wt:wt比合併來製備包括環狀RNA及脂質組分之奈米粒子組合物。使用例如基於NanoAssemblr微流體之系統以在約10 ml/min與約18 ml/min之間或在約5 ml/min與約18 ml/min之間的流動速率將脂質溶液快速注射至環狀RNA溶液中,產生水與乙醇比在約1:1與約4:1之間的懸浮液。
可藉由透析處理奈米粒子組合物以移除乙醇且達成緩衝液交換。使用Slide-A-Lyzer卡匣(Thermo Fisher Scientific公司,Rockford,IL)以磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) pH 7.4以為主要產物體積200倍之體積透析調配物兩次,其中分子量截止值為10 kDa或20 kDa。隨後,在4℃下透析調配物隔夜。經由0.2 μm無菌過濾器(Sarstedt,Nümbrecht,Germany)將所得奈米粒子懸浮液過濾至玻璃小瓶中且用卷邊密封件密封。一般獲得0.01 mg/ml至0.15 mg/ml奈米粒子組合物溶液。
上文所描述之方法誘導奈米沈澱及粒子形成。
可使用包括但不限於T-接面及直接注射之替代性方法以達成相同奈米沈澱。B.奈米粒子組合物表徵
可使用Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments有限公司,Malvern,Worcestershire,UK)以測定含奈米粒子組合物之測定粒度之1×PBS及測定ζ電位之15 mM PBS的粒度、多分散性指數(PDI)及ζ電位。
可使用紫外線可見光譜法以測定奈米粒子組合物中之環狀RNA之濃度。將100 μL含經稀釋調配物之1×PBS添加至900 μL甲醇與氯仿之4:1 (v/v)混合物中。在混合後,在DU 800分光光度計(Beckman Coulter,Beckman Coulter公司,Brea,CA)上記錄例如在230 nm與330 nm之間的溶液之吸光度譜。可基於組合物中所使用之環狀RNA之消光係數及在例如260 nm之波長下的吸光度與在例如330 nm之波長下的基線值之間的差異來計算奈米粒子組合物中之環狀RNA的濃度。
可使用QUANT-IT™ RIBOGREEN® RNA分析(Invitrogen Corporation Carlsbad,CA)以評估奈米粒子組合物對環狀RNA之囊封。將樣本在TE緩衝溶液(10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA,pH 7.5)中稀釋至大致5 μg/mL或1 μg/mL之濃度。將50 μL經稀釋樣本轉移至聚苯乙烯96孔盤中,且將50 μL TE緩衝液或50 μL之2%-4% Triton X-100溶液添加至孔中。將盤在37℃溫度下培育15分鐘。將RIBOGREEN®試劑在TE緩衝液中1:100或1:200稀釋,且將100 μL此溶液添加至各孔中。可使用螢光盤讀取器(Wallac Victor 1420多標記計數器;Perkin Elmer,Waltham,MA)量測在例如約480 nm之激發波長及例如約520 nm之發射波長下之螢光強度。自樣本中之各者之螢光值減去空白試劑之螢光值,且藉由將完整樣本(不添加Triton X-100)之螢光強度除以破裂樣本(由添加Triton X-100造成)之螢光值來測定游離環狀RNA百分比。
實例
29B
:
活體內調配物研究
為了監測各種奈米粒子組合物如何有效地將環狀RNA遞送至靶向細胞,製備不同的包括環狀RNA之奈米粒子組合物且投與嚙齒動物群體。向小鼠靜脈內、肌內、動脈內或瘤內投與單次劑量,包括具有脂質奈米粒子調配物之奈米粒子組合物。在一些情況下,可使小鼠吸入劑量。劑量大小可在0.001 mg/kg至10 mg/kg範圍內,其中對於小鼠之各1 kg體重,10 mg/kg描述包括10 mg含環狀RNA之奈米粒子組合物的劑量。亦可採用包括PBS之對照組合物。
在將奈米粒子組合物投與小鼠後,可藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)、生物發光成像或其他方法量測特定調配物之劑量遞送概況、劑量反應及毒性以及其劑量。亦可評估蛋白質表現之時程。用於評估之自嚙齒動物收集之樣本可包括血液及組織(例如來自肌內注射部位之肌肉組織及內部組織);樣本收集可涉及處死動物。
藉由投與包括環狀RNA之組合物誘導之較高位準之蛋白質表現將指示較高環狀RNA轉譯及/或奈米粒子組合物環狀RNA遞送效率。因為不認為非RNA組分會影響轉譯機制本身,因此較高位準之蛋白質表現可能指示相對於其他奈米粒子組合物較高的由給定奈米粒子組合物進行之環狀RNA遞送效率或其之不存在。
實例 30
奈米粒子組合物表徵
可使用Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments有限公司,Malvern,Worcestershire,UK)以測定含轉移媒劑組合物之測定粒度之1×PBS及測定ζ電位之15 mM PBS的粒度、多分散性指數(PDI)及ζ電位。
可使用紫外線可見光譜法以測定轉移媒劑組合物中之治療劑及/或預防劑(例如RNA)之濃度。將100 μL含經稀釋調配物之1×PBS添加至900 μL甲醇與氯仿之4:1 (v/v)混合物中。在混合後,在DU 800分光光度計(Beckman Coulter,Beckman Coulter公司,Brea,CA)上記錄例如在230 nm與330 nm之間的溶液之吸光度譜。可基於組合物中所使用之治療劑及/或預防劑之消光係數及在例如260 nm之波長下之吸光度與在例如330 nm之波長下之基線值之間的差異來計算轉移媒劑組合物中之治療劑及/或預防劑的濃度。
對於包括RNA之轉移媒劑組合物,可使用QUANT-IT™ RIBOGREEN® RNA分析(Invitrogen Corporation Carlsbad,CA)以評估轉移媒劑組合物對RNA之囊封。將樣本在TE緩衝溶液(10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA,pH 7.5)中稀釋至大致5 μg/mL或1 μg/mL之濃度。將50 μL經稀釋樣本轉移至聚苯乙烯96孔盤中,且將50 μL TE緩衝液或50 μL之2%-4% Triton X-100溶液添加至孔中。將盤在37℃溫度下培育15分鐘。將RIBOGREEN®試劑在TE緩衝液中1:100或1:200稀釋,且將100 μL此溶液添加至各孔中。可使用螢光盤讀取器(Wallac Victor 1420多標記計數器;Perkin Elmer,Waltham,MA)量測在例如約480 nm之激發波長及例如約520 nm之發射波長下之螢光強度。自樣本中之各者之螢光值減去空白試劑之螢光值,且藉由將完整樣本(不添加Triton X-100)之螢光強度除以破裂樣本(由添加Triton X-100造成)之螢光值來測定游離RNA百分比。
實例 31
T
細胞
靶向
為了使轉移媒劑靶向T細胞,使例如抗CD8抗體之T細胞抗原結合劑與轉移媒劑之表面偶合。在存在含EDTA之PBS之情況下用過量DTT輕度還原抗T細胞抗原抗體以暴露游離鉸鏈區硫醇。為了移除DTT,使抗體通過去鹽管柱。使用異雙功能交聯劑SM(PEG)24以使抗體錨定至裝載環狀RNA之轉移媒劑之表面(胺基存在於PEG脂質之頭基中,藉由DTT產生抗體上之游離硫醇基,SM(PEG)24在胺與硫醇基之間交聯)。首先,將轉移媒劑與過量SM(PEG)24一起培育且離心以移除未反應之交聯劑。隨後,將經活化轉移媒劑與過量經還原抗T細胞抗原抗體一起培育。使用離心過濾裝置移除未結合抗體。
實例 32
使用
RV88
之含有
RNA
之轉移媒劑。
在此實例中,使用2-D渦旋微流體晶片用陽離子型脂質RV88合成含有RNA之轉移媒劑以遞送環狀RNA。
表 18a
材料及儀器 | 供應商 | 目錄號 |
1M Tris-HCl. pH 3.0.無菌 | Teknova | T1080 |
5M氯化鈉溶液 | Teknova | S0250 |
QB檸檬酸鹽緩衝液. pH 6.0 (100 mM) | Teknova | Q2446 |
不含核酸酶之水 | Ambion | AM9937 |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML |
RV88 | GVK bio | |
DS PC | Lipoid | 556500 |
膽固醇 | Sigma | C3045-5G |
PEG2K | Avanti Polar Lipids | 880150 |
乙醇 | Acros Organic | 615090010 |
5 mL硼矽酸鹽玻璃小瓶 | Thermo Scientific | ST5-20 |
PD MiniTrap G-25去鹽管柱 | GE Healthcare | VWR目錄 號95055-984 |
Quant-iT RiboGreen RNA分析套組 | Molecular Probes/ Life Technolog ies | R11490 |
黑色96孔微量盤 | Greiner | 655900 |
RV88、DSPC及膽固醇全部在硼二氧化矽小瓶中在乙醇中以10 mg/ml之濃度製備。脂質14:0-PEG2K PE亦在硼二氧化矽玻璃小瓶中以4 mg/ml之濃度製備。藉由音波處理含脂質之乙醇2 min來達到呈儲備濃度之脂質之溶解。隨後,在迴轉式傾斜振盪器設置上在170 rpm下在37℃下加熱溶液10 min。接著,在26℃下平衡小瓶最少45 min。隨後,藉由添加如表18b中所示之體積之儲備脂質來混合脂質。接著,用乙醇調節溶液以使得最終脂質濃度為7.92 mg/ml。
表 18b
組成 | MW | % | 奈莫耳 | mg | 儲備液 (mg/ml) | µ1 | 乙醇(µl) |
RV88 | 794 2 | 40% | 7200 | 5.72 | 10 | 571.8 | 155.3 |
DSPC | 790.15 | 10% | 1800 | 1.42 | 10 | 142.2 | |
膽固醇 | 386.67 | 48% | 8640 | 3.34 | 10 | 334.1 | |
PEG2K | 2693.3 | 2% | 360 | 0.97 | 4 | 242 4 |
將RNA製備為具有75 mM pH 6.0檸檬酸鹽緩衝液及1.250 mg/ml濃度之RNA的儲備溶液。隨後,用75 mM pH 6.0檸檬酸鹽緩衝液將RNA濃度調節至0.1037 mg/ml,平衡至26℃。接著,將溶液在26℃下培育最少25 min。
用乙醇清潔微流體腔室,且藉由用RNA溶液裝載注射器且用乙醇脂質裝載另一注射器來製備neMYSIS注射泵。兩個注射器均經裝載且處於neMESYS軟體之控制下。隨後,將溶液以2之水相與有機相比及22 ml/min之總流動速率(對於RNA為14.67 ml/min且對於脂質溶液為7.33 ml/min)施用至混合晶片。兩個泵同步地啟動。以4×1 ml溶離份收集自微流體晶片流動之混合器溶液,其中第一溶離份作為廢料被丟棄。藉由使用G-25微型去鹽管柱將含有RNA-脂質體之殘餘溶液交換為10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA pH 7.5。在緩衝液交換之後,分別經由DLS分析及Ribogreen分析表徵材料大小及RNA入陷。
實例 33
使用
RV94
之含有
RNA
之轉移媒劑。
在此實例中,使用2-D渦旋微流體晶片用陽離子型脂質RV94合成含有RNA之脂質體以遞送環狀RNA。
表 19
材料及儀器 | 供應商 | 目錄號 |
1M Tns-HCI, pH 8.0,無菌 | Teknova | T1080 |
5M氯化鈉溶液 | Teknova | S0250 |
QB檸檬酸鹽緩衝液,pH 6.0 (100 mM) | Teknova | Q2446 |
不含核酸酶之水 | Ambion | AM9937 |
Triton X-WO | Sig ma-Aid rich | T8787-100ML |
RV94 | GVKbio | |
DSPC | Lipoid | 556500 |
膽固醇 | Sigma | C3045-5G |
PEG2K | Avanti Polar Lipids | 800150 |
乙醇 | Acres Organic | 615090010 |
5 mL硼矽酸鹽玻璃小瓶 | Thermo Scientific | ST5-20 |
PD MiniTrap G-25去鹽管柱 | GE Healthcare | VWR目錄 號95055-984 |
Quant-iT RiboGreen RNA分析套組 | Molecular Probes/Life Technologies | R11490 |
黑色96孔微量盤 | Greiner | 655900 |
如實例32中一般,使用表19中提名之材料量將脂質製備為7.92 mg/ml之最終脂質濃度。
表 20
組成 | MW | % | 奈莫耳 | mg | 儲備液 (mg/ml) | μl | 乙醇 (μl) |
RV94 | 808 22 | 40% | 2880 | 2.33 | 10 | 232.8 | 155.3 |
DSPC | 790.15 | 10% | 720 | 0.57 | 10 | 56.9 | |
膽固醇 | 386.67 | 48% | 3456 | 1.34 | 10 | 133.6 | |
PEG2K | 2693.3 | 2% | 144 | 0.39 | 4 | 97.0 |
將環狀RNA水溶液製備為具有75 mM pH 6.0檸檬酸鹽緩衝液、1.250 mg/ml環狀RNA之儲備溶液。隨後,用75 mM pH 6.0檸檬酸鹽緩衝液將RNA濃度調節至0.1037 mg/ml,平衡至26℃。接著,將溶液在26℃下培育最少25 min。
用乙醇清潔微流體腔室,且藉由用RNA溶液裝載注射器且用乙醇脂質裝載另一注射器來製備neMYSIS注射泵。兩個注射器均經裝載且處於neMESYS軟體之控制下。隨後,將溶液以2之水相與有機相比及22 ml/min之總流動速率(對於RNA為14.67 ml/min且對於脂質溶液為7.33 ml/min)施用至混合晶片。兩個泵同步地啟動。以4×1 ml溶離份收集自微流體晶片流動之混合器溶液,其中第一溶離份作為廢料被丟棄。如上文所描述,藉由使用G-25微型去鹽管柱將含有環狀RNA-轉移媒劑之殘餘溶液交換為10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA pH 7.5。在緩衝液交換之後,分別經由DLS分析及Ribogreen分析表徵材料大小及RNA入陷。脂質體之生物物理學分析示於表21中。
表 21
實例 34
樣本 名稱 | N:P 比 | TFR | 比率 | RNA 囊封 量 | RNA 囊封產率 | 大小 | |
ml/min | (水相/有機相) | (µg/ml) | % | d nm | PDI | ||
SAM- RV94 | 8 | 22 | 2 | 31.46 | 86.9 | 113.1 | 0.12 |
用於管線中混合之一般方案。
製備個別儲備溶液及單獨儲備溶液—一者含有脂質且另一者含有環狀RNA。藉由溶解於90%乙醇中來製備含有所需脂質或脂質混合物、DSPC、膽固醇及PEG脂質之脂質儲備液。殘餘10%為低pH檸檬酸鹽緩衝液。脂質儲備液之濃度為4 mg/mL。此檸檬酸鹽緩衝液之pH可在pH 3與pH 5之間的範圍內,此視所採用之脂質之類型而定。環狀RNA亦以4 mg/mL之濃度溶解於檸檬酸鹽緩衝液中。製備5 mL各儲備溶液。
儲備溶液為完全清澈的,且在與環狀RNA合併之前確保脂質完全溶解。可加熱儲備溶液以完全溶解脂質。該過程中所用之環狀RNA可為未經修飾或經修飾寡核苷酸,且可與諸如膽固醇之親脂性部分結合。
藉由將各溶液泵送至T-接面來合併個別儲備液。使用雙頭Watson-Marlow泵以同時控制兩個物料流之啟動及終止。將1.6 mm聚丙烯管進一步精簡至0.8 mm管以便增大線性流動速率。將聚丙烯管線(ID = 0.8 mm)連接至T-接面之任一側。對於4.1 mm
3之所得體積,聚丙烯T具有1.6 mm之線性邊緣。將聚丙烯管線之大端(1.6 mm)中之各者置放於含有經溶解脂質儲備液或經溶解環狀RNA之試管中。在T-接面之後,將單一管置放在合併流離開之處。隨後,將管延伸至具有2×體積之PBS之容器中,快速攪拌該容器。泵之流動速率係在300 rpm或110 mL/min之設定下。移除乙醇且藉由透析交換為PBS。接著,使用離心或透濾將脂質調配物濃縮至適當工作濃度。
C57BL/6小鼠(Charles River Labs,MA)經由尾部靜脈注射接受鹽水或經調配之環狀RNA。在投與後之各種時間點,藉由眶後放血收集血清樣本。使用顯色分析(Biophen FVTI,Aniara公司,OH)測定樣本中之因子VII蛋白之血清含量。為了測定因子VII之肝RNA含量,處死動物,且收取肝且在液氮中速凍。自冷凍組織製備組織溶解物,且使用分支鏈DNA分析(QuantiGene分析,Panomics,CA)定量因子VII之肝RNA含量。
在C57BL/6小鼠中靜脈內(彈丸)注射後48小時評估經FVTI siRNA治療之動物中之FVII活性。遵循製造商說明書以微量盤規模使用市售的用於測定血清或組織中之蛋白質含量之套組量測FVII。針對未經治療之對照小鼠測定FVII減少,且結果表示為殘餘FVII %。在各新穎脂質體組合物之篩檢中使用兩個劑量位準(0.05 mg/kg及0.005 mg/kg FVII siRNA)。
實例 36
使用預先形成之囊泡的環狀
RNA
調配物。
使用預先形成之囊泡方法製造含有陽離子型脂質之轉移媒劑。將陽離子型脂質、DSPC、膽固醇及PEG-脂質分別以40/10/40/10之莫耳比溶解於乙醇中。將脂質混合物添加至水性緩衝液(50 mM檸檬酸鹽,pH 4)中且混合,分別達到30% (vol/vol)及6.1 mg/mL之最終乙醇及脂質濃度,且在擠出之前使其在室溫下平衡2 min。在22℃下使用Lipex擠出機(Northern Lipids,Vancouver,BC)經由兩個堆疊的80 nm孔徑過濾器(Nuclepore)擠出水合脂質直至以Nicomp分析測定,獲得70-90 nm之囊泡直徑。對於不形成小囊泡之陽離子型脂質混合物,用較低pH緩衝液(50 mM檸檬酸鹽,pH 3)水合脂質混合物以使DSPC頭基上之磷酸酯基質子化幫助形成穩定的70-90 nm囊泡。
將FVII環狀RNA (溶解於含有30%乙醇之50 mM檸檬酸鹽pH 4水溶液中)添加至囊泡中,以~5 mL/min之速率預平衡至35℃且混合。在達成0.06 (wt wt)之最終目標環狀RNA/脂質比之後,將混合物在35℃下再培育30 min以允許囊泡再組構及FVII RNA囊封。隨後,移除乙醇,且藉由透析或切向流透濾用PBS (155 mM NaCl、3 mM Na2HP04、1 mM KH2P04,pH 7.5)置換外部緩衝液。在移除未經囊封RNA之後使用粒徑排阻旋轉管柱或離子交換旋轉管柱測定最終經囊封環狀RNA與脂質比。
實例 37
實例
37A
:
經工程改造之環狀
RNA
表現三特異性抗原結合蛋白
環狀RNA經設計以包括:(1) 3'後剪接第I組內含子片段;(2)內部核糖體進入位點(IRES);(3)三特異性抗原結合蛋白編碼區;及(4) 3'同源區。三特異性抗原結合蛋白區經構築以產生結合至例如GPC3之目標抗原的例示性三特異性抗原結合蛋白。
實例
37B
:
產生
scFv CD3
結合域
人類CD3ε鏈典型序列為Uniprot寄存編號P07766。人類CD3γ鏈典型序列為Uniprot寄存編號P09693。人類CD3δ鏈典型序列為Uniprot寄存編號P043234。經由諸如親和成熟之已知技術產生針對CD3ε、CD3γ或CD3δ之抗體。在使用鼠抗CD3抗體作為起始物質之情況下,需要人類化鼠抗CD3抗體用於臨床環境,其中小鼠特異性殘基可在接受本文所描述之三特異性抗原結合蛋白治療之個體中誘導人類抗小鼠抗原(HAMA)反應。藉由使來自鼠抗CD3抗體之CDR區接枝至適當的人類生殖系受體構架上,視情況包括對CDR及/或構架區進行其他修飾來實現人類化。
因此,使用人類或人類化抗CD3抗體產生用於三特異性抗原結合蛋白之CD3結合域之scFv序列。獲得編碼人類或人類化VL域及VH域之DNA序列,且視情況最佳化構築體之密碼子以用於在來自智人之細胞中表現。其中VL域及VH域在scFv中呈現之次序為變化的(亦即,VL-VH或VH-VL定向),且「G4S」(SEQ ID NO: 3280)亞單元(G4S) 3 (SEQ ID NO: 3281)之三個複本連接可變域以產生scFv域。抗CD3 scFv質體構築體可具有視情況Flag、His或其他親和標籤,且電穿孔至HEK293或其他適合的人類或哺乳動物細胞株中且純化。驗證分析包括利用FACS之結合分析、使用Proteon之動力學分析及表現CD3之細胞染色。
實例
37C
:
產生
scFv
磷脂醯肌醇蛋白聚糖
-3 (GPC3)
結合域
磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3 (GPC3)為存在於肝細胞癌上、但不存在於健康正常肝組織上之細胞表面蛋白中之一者。常常觀測到其在肝細胞癌中增加且與HCC患者之不良預後相關。已知其活化Wnt信號傳導。已產生包括MDX-1414、HN3、GC33及YP7之GPC3抗體。
與以上用於產生與CD3之scFv結合域之方法類似地產生結合至GPC-3或另一目標抗原的scFv。
實例
37D
:
活體外表現三特異性抗原結合蛋白
使用CHO細胞表現系統(Flp-In®,Life Technologies),其為CHO-K1中國倉鼠卵巢細胞(ATCC、CCL-61)之衍生物(Kao及Puck, Proc. Natl. Acad Sci USA 1968; 60(4):1275-81)。根據Life Technologies提供之標準細胞培養物方案繼代培養黏附細胞。
為了適應在懸浮液中生長,自組織培養物燒瓶剝離細胞且置於無血清培養基中。將適應懸浮液之細胞低溫保存在具有10% DMSO之培養基中。
藉由轉染適應懸浮液之細胞來產生穩定地表現分泌三特異性抗原結合蛋白之重組CHO細胞株。在選擇抗生素潮黴素B期間,一週兩次量測活細胞密度,且將細胞離心且以0.1×10
6個活細胞/毫升之最大密度再懸浮於新鮮選擇培養基中。在選擇2-3週之後回收穩定地表現三特異性抗原結合蛋白之細胞池,此時將細胞轉移至振盪燒瓶中之標準培養基中。藉由執行蛋白質凝膠電泳或流動式細胞測量術確認重組分泌蛋白之表現。將穩定細胞池低溫保存在含有DMSO之培養基中。
在具有經穩定地轉染之CHO細胞株之10天饋料批式培養物中藉由分泌至細胞培養物上清液中產生三特異性抗原結合蛋白。10天後以通常> 75%之培養物活力收取細胞培養物上清液。每隔一天自生產培養物收集樣本,且評估細胞密度及活力。在收取之日,在進一步使用之前,藉由離心及真空過濾清除細胞培養物上清液。
藉由SDS-PAGE分析細胞培養物上清液中之蛋白質表現力價及產物完整性。
實例
37E
:
純化三特異性抗原結合蛋白
在兩步程序中自CHO細胞培養物上清液純化三特異性抗原結合蛋白。使構築體在第一步驟中進行親和層析,接著在第二步驟中在Superdex 200上進行製備型粒徑排阻層析(SEC)。對樣本進行緩衝液交換且藉由超過濾濃縮至>1 mg/mL之典型濃度。分別藉由SDS PAGE在還原及非還原條件下、接著為使用抗(半衰期延長域)或抗個體遺傳型抗體之免疫墨點法以及藉由分析性SEC評估最終樣本之純度及均質性(通常>90%)。將經純化蛋白質以等分試樣儲存於-80℃下直至使用。
實例 38
具有半衰期延長域之經工程改造之環狀
RNA
之表現具有與不具有半衰期延長域之經工程改造之環狀
RNA
之表現相比改善的藥物動力學參數
以0.5 mg/kg彈丸注射肌內方式向食蟹獼猴投與在實例23之環狀RNA分子上編碼之三特異性抗原結合蛋白。另一食蟹獼猴組接受大小相當的具有與CD3及GPC-3之結合域、但不具有半衰期延長域之在環狀RNA分子上編碼之蛋白質。第三組及第四組分別接受具有CD3及半衰期延長域結合域之在環狀RNA分子上編碼之蛋白質及具有GPC-3及半衰期延長域之蛋白質。兩種由環狀RNA編碼之蛋白質與三特異性抗原結合蛋白大小相當。各測試組由5隻猴組成。在指定時間點獲取血清樣本,連續稀釋,且使用與CD3及/或GPC-3之結合ELISA測定蛋白質濃度。
使用測試品血漿濃度執行藥物動力學分析。當針對給藥後時間繪製時,各測試品之群組平均血漿資料符合多指數概況。藉由具有彈丸輸入及分佈及消除階段之一級速率常數的標準二室模型擬合資料。用於最佳擬合用於靜脈內投與之資料之一般方程式為:c(t)=Ae
~at+Be
~pt,其中對應地,c(t)為時間t之血漿濃度,A及B為Y軸上之截距,且a及β為分佈及消除階段之表觀一級速率常數。a-相為初始清除率相位且反映蛋白質至動物之全部細胞外液中之分佈,而衰變曲線之第二或β-相部分代表真血漿清除率。用於擬合該等方程式之方法為此項技術中所熟知的。舉例而言,A=D/V(a-k21)/(a-p)、B=D/V(p-k21)/(a-p)以及a及β (對於α>β)為以下二次方程式之根: r
2+(k12+k21+k10)r+k21k10=0,其使用以下評估參數:V=分佈體積,k10=消除速率,k12=自腔室1至腔室2之轉移速率且k21=自腔室2至腔室1之轉移速率,且D=投與劑量。
資料分析:使用KaleidaGraph (KaleidaGraph™ 3.09版版權1986-1997. Synergy Software. Reading, Pa.)製作濃度相對於時間概況圖。報導為小於可報導值(LTR)之值不包括於PK分析中且不以圖形方式呈現。藉由腔室分析使用WinNonlin軟體(WinNonlin® Professional 3.1版WinNonlin™版權1998-1999. Pharsight公司. Mountain View, Calif)測定藥物動力學參數。如Ritschel W A及Kearns G L, 1999, EST: Handbook Of Basic Pharmacokinetics Including Clinical Applications, 第5版, American Pharmaceutical Assoc., Washington, D C中所描述計算藥物動力學參數。
預期在實例23之環狀RNA分子上編碼之三特異性抗原結合蛋白具有與不具有半衰期延長域之蛋白質相比改善之藥物動力學參數,諸如消除半衰期延長。
實例 39
三特異性抗原結合蛋白之細胞毒性
在實例23之環狀RNA分子上編碼之三特異性抗原結合蛋白介導對GPC-3+目標細胞之T細胞依賴性細胞毒性時對其進行活體外評估。
在存在實例23之三特異性抗原結合蛋白之情況下將經螢光標記之GPC3目標細胞與作為效應細胞之隨機供體或T細胞之經分離PBMC一起培育。在37℃下在含濕氣培育箱中培育4 h之後,在光譜螢光計中測定螢光染料自目標細胞至上清液中之釋放。在無實例23之三特異性抗原結合蛋白之情況下培育之目標細胞及藉由在培育結束時添加皂素而完全溶解之目標細胞分別充當陰性對照及陽性對照。
基於所量測之殘餘活目標細胞,根據下式計算比細胞溶解百分比:[1-(活目標(樣本)數目/活目標(自發性)數目)] × 100%。藉由非線性回歸/4參數邏輯擬合使用GraphPad軟體計算S形劑量反應曲線及EC50值。藉由4參數邏輯擬合分析,使用Prism軟體,使用所獲得之給定抗體濃度之溶解值計算S形劑量反應曲線。
實例 40
合成可離子化脂質
40.1
合成
((3-(2-
甲基
-1H-
咪唑
-1-
基
)
丙基
)
氮烷二基
)
雙
(
己烷
-6,1-
二基
)
雙
(2-
己基癸酸酯
)(
脂質
10a-27
)
及
((3-(1H-
咪唑
-1-
基
)
丙基
)
氮烷二基
)
雙
(
己烷
-6,1-
二基
)
雙
(2-
己基癸酸酯
))(
脂質
10a-26
)
在與冷凝器連接之100 mL圓底燒瓶中,將3-(1
H-咪唑-1-基)丙-1-胺(100 mg,0.799 mmol)或3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(0.799 mmol)、2-己基癸酸6-溴己酯(737.2 mg,1.757 mmol)、碳酸鉀(485 mg,3.515 mmol)及碘化鉀(13 mg,0.08 mmol)在乙腈(30 mL)中混合,且將反應混合物加熱至80℃達48 h。將混合物冷卻至室溫且經由矽藻土墊過濾。用乙酸乙酯稀釋濾液。在用水、鹽水洗滌之後,且經無水硫酸鈉乾燥。蒸發溶劑,且藉由急驟層析法(SiO
2: CH
2Cl
2= 100%至10%甲醇於CH
2Cl
2中)純化粗殘餘物,且獲得無色油產物(92 mg,15%)。
((3-(1H- 咪唑 -1- 基 ) 丙基 ) 氮 烷二基 ) 雙 ( 己烷 -6,1- 二基 ) 雙 (2- 己基癸酸酯 ))之分子式為
C
50H
95N
3O
4 且分子量(M
w)為801.7。
藉由LC-MS執行脂質10a-26表徵。圖27A-C展示脂質10a-26表徵。圖27A展示針對脂質10a-26所觀測到之質子NMR。圖27B為脂質10a-26之代表性LC/MS跡線,其中示出總離子及UV層析圖。
40.2
合成
脂質
22-S14
40.2.1
合成
2-(
十四基硫基
)
乙
-1-
醇
在25℃下向2-硫基乙醇(5.40 g,69.11 mmol,4.82 mL,0.871
eq)於乙腈(200 mL)中之混合物中添加1
-溴十四烷(22 g,79.34 mmol,23.66 mL,1
eq)及碳酸鉀(17.55 g,126.95 mmol,1.6
eq)。將反應混合物升溫至40℃且攪拌12小時。TLC (乙酸乙酯/石油醚= 25/1,R
f= 0.3,以I
2染色)展示起始材料已完全消耗且產生新的主斑點。過濾反應混合物,且用乙腈(50 mL)洗滌濾餅,且隨後真空濃縮濾液,得到殘餘物,藉由矽膠管柱(乙酸乙酯/石油醚= 1/100至1/25)將其純化,獲得呈白色固體狀之2-(十四基硫基)乙-1-醇(14 g,產率64.28%)。
1H NMR (ET36387-45-P1A, 400 MHz, 氯仿-
d) δ 0.87 - 0.91 (m, 3 H) 1.27 (s, 20 H) 1.35 - 1.43 (m, 2 H) 1.53 - 1.64 (m, 2 H) 2.16 (br s, 1 H) 2.49 - 2.56 (m, 2 H) 2.74 (t,
J= 5.93 Hz, 2 H) 3.72 (br d,
J= 4.89 Hz, 2 H)。圖28展示對應的核磁共振(NMR)譜。
40.2.2
合成丙烯酸
2-(
十四基硫基
)
乙酯
在0℃下在氮氣下向2-(十四基硫基)乙-1-醇(14 g,51.00 mmol,1 eq)於二氯甲烷(240 mL)中之溶液中逐滴添加三乙胺(7.74 g,76.50 mmol,10.65 mL,1.5 eq)及丙-2-烯醯氯(5.54 g,61.20 mmol,4.99 mL,1.2 eq)。將反應混合物升溫至25℃且攪拌12小時。TLC (乙酸乙酯/石油醚= 25/1,Rf = 0.5,以I
2染色)展示起始材料已完全消耗且產生新的主斑點。真空濃縮反應溶液,得到粗製物,藉由矽膠管柱(乙酸乙酯/石油醚= 1/100至1/25)將其純化,獲得呈無色油狀之丙烯酸2-(十四基硫基)乙酯(12 g,產率71.61%)。
1H NMR (ET36387-49-P1A, 400 MHz, 氯仿-
d) δ 0.85 - 0.93 (m, 3 H) 1.26 (s, 19 H) 1.35 - 1.43 (m, 2 H) 1.53 - 1.65 (m, 2 H) 2.53 - 2.62 (m, 2 H) 2.79 (t,
J= 7.03 Hz, 2 H) 4.32 (t,
J= 7.03 Hz, 2 H) 5.86 (dd,
J= 10.39, 1.47 Hz, 1 H) 6.09 - 6.19 (m, 1 H) 6.43 (dd,
J= 17.30, 1.41 Hz, 1 H)。圖29展示對應的核磁共振(NMR)譜。
40.2.3
合成
雙
(2-(
十四基硫基
)
乙基
) 3,3'-((3-(2-
甲基
-1H-
咪唑
-1-
基
)
丙基
)
氮
烷二基
)
二丙酸酯
(
脂質
22-S14)
向燒瓶中裝填3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(300 mg,2.16 mmol)及丙烯酸2-(十四基硫基)乙酯(1.70 g,5.17 mmol)。將淨反應混合物加熱至80℃且攪拌48小時。TLC (乙酸乙酯,R
f= 0.3,以I
2染色,添加一滴氫氧化銨)展示起始材料已完全消耗且形成新的主斑點。將反應混合物用二氯甲烷(4 mL)稀釋且藉由矽膠管柱(石油醚/乙酸乙酯= 3/1至0/1,添加0.1%氫氧化銨)純化,得到呈無色油狀之雙(2-(十四基硫基)乙基) 3,3'-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)二丙酸酯(501 mg,產率29.1%)。
1H NMR (ET36387-51-P1A, 400 MHz, 氯仿-
d) δ 0.87 (t,
J= 6.73 Hz, 6 H) 1.25 (s, 40 H) 1.33 - 1.40 (m, 4 H) 1.52 - 1.61 (m, 4 H) 1.81 - 1.90 (m, 2 H) 2.36 (s, 3 H) 2.39 - 2.46 (m, 6 H) 2.53 (t,
J= 7.39 Hz, 4 H) 2.70 - 2.78 (m, 8 H) 3.84 (t,
J= 7.17 Hz, 2 H) 4.21 (t,
J= 6.95 Hz, 4 H) 6.85 (s, 1 H) 6.89 (s, 1 H)。圖30展示對應的核磁共振(NMR)譜。
40.3
合成雙
(2-(
十四基硫基
)
乙基
) 3,3'-((3-(1H-
咪唑
-1-
基
)
丙基
)
氮烷二基
)
二丙酸酯
(
脂質
93-S14
)
向燒瓶中裝填3-(1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(300 mg,2.40 mmol,1
eq)及丙烯酸2-(十四基硫基)乙酯(1.89 g,5.75 mmol,2.4
eq)。將淨反應混合物加熱至80℃且攪拌48小時。TLC (乙酸乙酯,R
f= 0.3,以I
2染色,添加一滴氫氧化銨)展示起始材料已完全消耗且形成新的主斑點。將反應混合物用二氯甲烷(4 mL)稀釋且藉由矽膠管柱(石油醚/乙酸乙酯= 1/20 - 0/100,添加0.1%氫氧化銨)純化,得到呈無色油狀之雙(2-(十四基硫基)乙基) 3,3'-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)二丙酸酯(512 mg,產率27.22%)。
1H NMR (ET36387-54-P1A, 400 MHz, 氯仿-
d) δ 0.89 (t,
J= 6.84 Hz, 6 H) 1.26 (s, 40 H) 1.34 - 1.41 (m, 4 H) 1.58 (br t,
J= 7.50 Hz, 4 H) 1.92 (t,
J= 6.62 Hz, 2 H) 2.36 - 2.46 (m, 6 H) 2.55 (t,
J= 7.50 Hz, 4 H) 2.75 (q,
J= 6.84 Hz, 8 H) 3.97 (t,
J= 6.95 Hz, 2 H) 4.23 (t,
J= 6.95 Hz, 4 H) 6.95 (s, 1 H) 7.06 (s, 1 H) 7.51 (s, 1 H)。圖31展示對應的核磁共振(NMR)譜。
40.4
合成
8-((3-(2-
甲基
-1H-
咪唑
-1-
基
)
丙基
)(8-(
壬氧基
)-8-
側氧基辛基
)
胺基
)
辛酸十七
-9-
基酯
(
脂質
10a-54
)
向8-溴辛酸(
2)
(18.6 g,83.18 mmol)及壬-1-醇(
1)
(10 g,69.32 mmol)於CH
2Cl
2(500 mL)中之混合物中添加DMAP (1.7 g,13.86 mmol)、DIPEA (48 mL,277.3 mmol)及EDC (16 g,83.18 mmol)。將反應物在室溫下攪拌隔夜。在濃縮反應混合物之後,將粗殘餘物溶解於乙酸乙酯(500 mL)中,用1N HCl、飽和NaHCO
3、水及鹽水洗滌。使有機層經無水Na
2SO
4乾燥。蒸發溶劑,且藉由急驟層析法(SiO
2:己烷= 100%至30% EtOAc/己烷)純化粗殘餘物,且獲得無色油產物
3(9 g,37%)。
向8-溴辛酸(
2)
(10 g,44.82 mmol)及十七-9-醇(
4)
(9.6 g,37.35 mmol)於CH
2Cl
2(300 mL)中之混合物中添加DMAP (900 mg,7.48 mmol)、DIPEA (26 mL,149.7 mmol)及EDC (10.7 g,56.03 mmol)。將反應物在室溫下攪拌隔夜。在濃縮反應混合物之後,將粗殘餘物溶解於乙酸乙酯(300 mL)中,用1N HCl、飽和NaHCO
3、水及鹽水洗滌。使有機層經無水Na
2SO
4乾燥。蒸發溶劑,且藉由急驟層析法(SiO
2:己烷= 100%至30% EtOAc/己烷)純化粗殘餘物,且獲得無色油產物
5(5 g,29%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl
3):
δppm 4.86 (m, 1H), 3.39 (t,
J= 7.0 Hz, 2H), 2.27 (t,
J= 7.6 Hz, 2H), 1.84 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.5-1.4 (m, 8H),1.35-1.2 (m, 26H) 0.87 (t,
J= 6.7 Hz, 6H)。
在與冷凝器連接之100 mL圓底燒瓶中,將8-溴辛酸十七-9-基酯(
5)
(860 mg,1.868 mmol)及3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(
6)
(1.3 g,9.339 mmol)在乙醇(10 mL)中混合。將反應混合物加熱至回流隔夜。MS (APCI)展示預期產物。將混合物冷卻至室溫且濃縮。藉由急驟層析法(SiO
2: CH
2Cl
2= 100%至10%甲醇+1%NH
4OH於CH
2Cl
2中)純化粗殘餘物,且獲得無色油產物
7(665 mg,69%)。
在與冷凝器連接之100 mL圓底燒瓶中,將8-((3-(2-甲基-1
H-咪唑-1-基)丙基)胺基)辛酸十七-9-基酯(
7)
(665 mg,1.279 mmol)及8-溴辛酸壬酯(
3)
(536 mg,1.535 mmol)在乙醇(10 mL)中混合,隨後添加DIPEA (0.55 mL,3.198 mmol)。將反應混合物加熱至回流隔夜。MS (APCI)及TLC (10%MeOH+1%NH
4OH於CH
2Cl
2中)均展示產物及一些未反應的起始材料。將混合物冷卻至室溫且濃縮。藉由急驟層析法(SiO
2: CH
2Cl
2= 100%至10%甲醇+1%NH
4OH於CH
2Cl
2中)純化粗殘餘物,且獲得無色油(170 mg,17%)。
根據以上方案合成脂質10a-53。反應條件與脂質10a-54相同,不同之處在於3-(1H-咪唑-1-基)丙-1-胺作為咪唑胺。
40.6
合成
8-((3-(1H-
咪唑
-1-
基
)
丙基
)(8-(
壬氧基
)-8-
側氧基辛基
)
胺基
)
辛酸十七
-9-
基酯
(
脂質
10a-45
)
向8-溴辛酸(
2)
(10 g,44.82 mmol)
及十七-9-醇(
1)
(9.6 g,37.35 mmol)於CH
2Cl
2(300 mL)中之混合物中添加DMAP (900 mg,7.48 mmol)、DIPEA (26 mL,149.7 mmol)及EDC (10.7 g,56.03 mmol)。將反應物在室溫下攪拌隔夜。在濃縮反應混合物之後,將粗殘餘物溶解於乙酸乙酯(300 mL)中,用1N HCl、飽和NaHCO
3、水及鹽水洗滌。使有機層經無水Na
2SO
4乾燥。蒸發溶劑,且藉由急驟層析法(SiO
2:己烷= 100%至30% EtOAc/己烷)純化粗殘餘物,且獲得無色油產物
3(5 g,29%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl
3):
δppm 4.86 (m, 1H), 3.39 (t,
J= 7.0 Hz, 2H), 2.27 (t,
J= 7.6 Hz, 2H), 1.84 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.5-1.4 (m, 8H),1.35-1.2 (m, 26H) 0.87 (t,
J= 6.7 Hz, 6H)。
在與冷凝器連接之100 mL圓底燒瓶中,將8-溴辛酸十七-9-基酯(
3)
(1 g,2.167 mmol)及3-(1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(
4)
(1.3 mL,10.83 mmol)在乙醇(10 mL)中混合。將反應混合物加熱至回流隔夜。MS (APCI)展示預期產物。將混合物冷卻至室溫且濃縮。藉由急驟層析法(SiO
2: CH
2Cl
2= 100%至10%甲醇+1%NH
4OH於CH
2Cl
2中)純化粗殘餘物,且獲得無色油產物
6(498 mg,45%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl
3):
δppm 7.47 (s, 1H), 7.04 (s, 1H), 6.91 (s, 1H), 4.85 (m, 1H), 4.03 (t,
J= 7.0 Hz, 2H), 2.56 (dd,
J= 14.5, 7.4 Hz, 4H), 2.27 (t,
J= 7.4 Hz, 2H), 1.92 (m, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.48 (m, 6H), 1.30-1.20 (m, 31H), 0.86 (t,
J= 6.6 Hz, 6H). MS (APCI
+): 506.4 (M+1)。
向8-溴辛酸(
2)
(18.6 g,83.18 mmol)及壬-1-醇(
8)
(10 g,69.32 mmol)於CH
2Cl
2(500 mL)中之混合物中添加DMAP (1.7 g,13.86 mmol)、DIPEA (48 mL,277.3 mmol)及EDC (16 g,83.18 mmol)。將反應物在室溫下攪拌隔夜。在濃縮反應混合物之後,將粗殘餘物溶解於乙酸乙酯(500 mL)中,用1N HCl、飽和NaHCO
3、水及鹽水洗滌。使有機層經無水Na
2SO
4乾燥。蒸發溶劑,且藉由急驟層析法(SiO
2:己烷= 100%至30% EtOAc/己烷)純化粗殘餘物,且獲得無色油產物
9(9 g,37%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl
3):
δppm 4.05 (t,
J= 7.0 Hz, 2H), 3.39 (t,
J= 7.0 Hz, 2H), 2.29 (t,
J= 7.6 Hz, 2H), 1.84 (m, 2H), 1.62-1.56 (m, 6H), 1.40-1.20 (m, 16H), 0.87 (t,
J= 6.7 Hz, 3H)。
在與冷凝器連接之100 mL圓底燒瓶中,將8-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)胺基)辛酸十七-9-基酯(
6) (242 mg,0.478 mmol)及8-溴辛酸壬酯9 (200 mg,0.574 mmol)在乙醇(10 mL)中混合,隨後添加DIPEA (0.2 mL,1.196 mmol)。將反應混合物加熱至回流隔夜。MS (APCI)及TLC (10%MeOH+1%NH4OH於CH
2Cl
2中)均展示產物及一些未反應的起始材料。將混合物冷卻至室溫且濃縮。藉由急驟層析法(SiO
2: CH
2Cl
2= 100%至10%甲醇+1%NH
4OH於CH
2Cl
2中)純化粗殘餘物,且獲得無色油(35 mg,10%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 7.46 (s, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 4.85 (m, 1H), 4.04 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 4.01 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.38 (m, 6H), 2.27 (t, J = 3.8 Hz, 4H), 1.89 (m, 2H), 1.60-1.58 (m, 12H), 1.48 (m, 6H), 1.30-1.20 (m, 47H), 0.87 (t, J = 7.1 Hz, 9H). MS (APCI+): 774.6 (M+1)。
根據以上方案合成脂質10a-46。反應條件與脂質10a-45相同,不同之處在於3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙-1-胺作為咪唑胺。
1H NMR (300 MHz, CDCl
3):
δppm 6.89 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 4.86 (m, 1H), 4.04 (t,
J= 6.8 Hz, 2H), 3.85 (t,
J= 7.4 Hz, 2H), 2.38-2.36 (m, 9H), 2.28 (m, 4H), 1.82 (m, 2H), 1.72-1.56 (m, 12H), 1.48 (m, 4H), 1.30-1.20 (m, 46H), 0.86 (t,
J= 6.6 Hz, 9H). MS (APCI
+): 789.7 (M+1)。
40.8
合成
8-((3-(1H-
咪唑
-1-
基
)
丙基
)(8-
側氧基
-8-(
十一
-3-
基氧基
)
辛基
)
胺基
)
辛酸十七
-9-
基酯
(
脂質
10a-137)
向8-溴辛酸(
2) (10 g,44.82 mmol)及十七-9-醇(
1) (9.6 g,37.35 mmol)於CH
2Cl
2(300 mL)中之混合物中添加DMAP (900 mg,7.48 mmol)、DIPEA (26 mL,149.7 mmol)及EDC (10.7 g,56.03 mmol)。將反應物在室溫下攪拌隔夜。在濃縮反應混合物之後,將粗殘餘物溶解於乙酸乙酯(300 mL)中,用1N HCl、飽和NaHCO
3、水及鹽水洗滌。使有機層經無水Na
2SO
4乾燥。蒸發溶劑,且藉由急驟層析法(SiO
2:己烷= 100%至30% EtOAc/己烷)純化粗殘餘物,且獲得無色油產物
3(5 g,29%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.86 (m, 1H), 3.39 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.27 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.84 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.5-1.4 (m, 8H),1.35-1.2 (m, 26H) 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 6H)。
在與冷凝器連接之100 mL圓底燒瓶中,將8-溴辛酸十七-9-基酯(
3)
(1 g,2.167 mmol)及3-(1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(
4)
(1.3 mL,10.83 mmol)在乙醇(10 mL)中混合。將反應混合物加熱至回流隔夜。MS (APCI)展示預期產物。將混合物冷卻至室溫且濃縮。藉由急驟層析法(SiO
2: CH
2Cl
2= 100%至10%甲醇+1%NH
4OH於CH
2Cl
2中)純化粗殘餘物,且獲得無色油產物
6(498 mg,45%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl
3):
δppm 7.47 (s, 1H), 7.04 (s, 1H), 6.91 (s, 1H), 4.85 (m, 1H), 4.03 (t,
J= 7.0 Hz, 2H), 2.56 (dd,
J= 14.5, 7.4 Hz, 4H), 2.27 (t,
J= 7.4 Hz, 2H), 1.92 (m, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.48 (m, 6H), 1.30-1.20 (m, 31H), 0.86 (t,
J= 6.6 Hz, 6H). MS (APCI
+): 506.4 (M+1)。
在0℃冰水浴處向壬醛(
10)
(5 g,35.2 mmol)於無水THF (100 mL)中之混合物中逐滴添加乙基溴化鎂(47 mL,42.2 mmol,0.9M於THF中)。將反應物在室溫下攪拌隔夜。將反應物用冰淬滅且用乙酸乙酯(500 mL)稀釋,用1N HCl、飽和NaHCO
3、水及鹽水洗滌。使有機層經無水Na
2SO
4乾燥。蒸發溶劑,且藉由急驟層析法(SiO
2:己烷= 100%至50% EtOAc/己烷)純化粗殘餘物,且獲得無色油產物
11(4 g,66%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl
3):
δppm 3.52 (m, 1H), 1.56-1.3 (m, 4H), 1.3-1.20 (m, 12H), 0.93 (t,
J= 7.4 Hz, 3H), 0.87 (t,
J= 7.4 Hz, 3H)。
向8-溴辛酸(
2)
(6.2 g,27.9 mmol)及十一-3-醇(
11) (4 g,23.2 mmol)於CH
2Cl
2(100 mL)中之混合物中添加DMAP (567.2 mg,4.64 mmol)、DIPEA (16.2 mL,92.9 mmol)及EDC (6.7 g,34.8 mmol)。將反應物在室溫下攪拌隔夜。在濃縮反應混合物之後,將粗殘餘物溶解於乙酸乙酯(500 mL)中,用1N HCl、飽和NaHCO
3、水及鹽水洗滌。使有機層經無水Na
2SO
4乾燥。蒸發溶劑,且藉由急驟層析法(SiO
2:己烷= 100%至30% EtOAc/己烷)純化粗殘餘物,且獲得無色油產物
12(7.3 g,83%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl
3):
δppm 4.80 (m, 1H), 3.39 (t,
J= 6.8 Hz, 2H), 2.28 (t,
J= 7.7 Hz, 2H), 1.84 (m, 2H), 1.6-1.35 (m, 8H), 1.35-1.2 (m, 16H), 0.87 (t,
J= 7.4 Hz, 6H)。
在與冷凝器連接之100 mL圓底燒瓶中,將8-((3-(1
H-咪唑-1-基)丙基)胺基)辛酸十七-9-基酯(
6)
(242 mg,0.478 mmol)及8-溴辛酸十一-3-基酯(
12) (200 mg,0.574 mmol)在乙醇(10 mL)中混合,隨後添加DIPEA (0.2 mL,1.196 mmol)。將反應混合物加熱至回流隔夜。MS (APCI)及TLC (10%MeOH+1%NH
4OH於CH
2Cl
2中)均展示產物及一些未反應的起始材料。將混合物冷卻至室溫且濃縮。藉由急驟層析法(SiO
2: CH
2Cl
2= 100%至10%甲醇+1%NH
4OH於CH
2Cl
2中)純化粗殘餘物,且獲得無色油(35 mg,10%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 7.45 (s, 1H), 7.04 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 4.82 (m, 2H), 3.97 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.35 (m, 6H), 2.27 (t, J = 3.8 Hz, 4H), 1.89 (m, 2H), 1.60-1.48 (m, 14H), 1.30-1.20 (m, 50H), 0.87 (m, 12H). MS (APCI+): 802.8。
根據以上方案合成脂質10a-138。反應條件與脂質10a-137相同,不同之處在於3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙-1-胺作為咪唑胺。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 6.89 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 4.82 (m, 2H), 3.86 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.38-2.3 (m, 9H), 2.27 (t, J = 3.8 Hz, 4H), 1.84 (m, 2H), 1.60-1.37 (m, 14H), 1.30-1.20 (m, 50H), 0.87 (m, 12H). MS (APCI+): 816.8 (M+1)。
40.10
合成
(((2-(2-
甲基
-1H-
咪唑
-1-
基
)
乙基
)
氮烷二基
)
雙
(
己烷
-6,1-
二基
)
雙
(2-
己基癸酸酯
(
脂質
10a-139
)
向2-己基癸酸(
1)
(102 g,0.398 mol)及6-溴-1-己醇(
2)
(60 g,0.331 mol)於CH
2Cl
2(1 L)中之混合物中添加DMAP (8.1 g,66 mmol)、DIPEA (230 mL,1.325 mol)及EDC (76 g,0.398 mol)。將反應物在室溫下攪拌隔夜。在濃縮反應混合物之後,將粗殘餘物溶解於乙酸乙酯(1 L)中,用1N HCl、飽和NaHCO
3、水及鹽水洗滌。使有機層經無水Na
2SO
4乾燥。蒸發溶劑,且藉由急驟層析法(SiO
2:己烷= 100%至30% EtOAc/己烷)純化粗殘餘物,且獲得無色油產物
3(67 g,48%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl
3):
δppm 4.06 (t,
J= 6.6 Hz, 2H), 3.4 (t,
J= 6.8 Hz, 2H), 2.3 (m, 1H), 1.86 (m, 2H), 1.64 (m, 2H), 1.5-1.4 (m, 2H),1.35-1.2 (m, 26H) 0.87 (t,
J= 6.7 Hz, 6H)。
在與冷凝器連接之100 mL圓底燒瓶中,將2-己基癸酸6-溴己酯(
3)
(1.2 g,2.87 mmol)及3-(1
H-咪唑-1-基)丁-1-胺(
7) (2 g,14.37 mmol)在乙醇(20 mL)中混合。將反應混合物加熱至回流隔夜。MS (APCI)展示預期產物。將混合物冷卻至室溫且濃縮。藉由急驟層析法(SiO
2: CH
2Cl
2= 100%至10%甲醇+1%NH
4OH於CH
2Cl
2中)純化粗殘餘物,且獲得無色油產物
7a(626 mg,46%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl
3):
δppm 7.51 (s, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.93 (s, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.04 (t,
J= 6.6 Hz, 2H), 2.6-2.4 (m, 4H), 2.29 (m, 1H), 1.94 (td,
J= 14, 6.8 Hz, 2H), 1.64-1.56 (m, 4H), 1.47 (s, 3H), 1.42-1.20 (m, 29H), 0.86 (m, 6H). MS (APCI
+): 478.8 (M+1)。
在與冷凝器連接之100 mL圓底燒瓶中,將2-己基癸酸6-((3-(1
H-咪唑-1-基)丁基)胺基)己酯(
7a)
(626 mg,1.31 mmol)及2-己基癸酸6-溴己酯(
3)
(550 mg,1.31 mmol)在乙醇(20 mL)中混合,隨後添加DIPEA (0.6 mL,3.276 mmol)。將反應混合物加熱至回流隔夜。MS (APCI)及TLC (10%MeOH+1%NH
4OH於CH
2Cl
2中)均展示產物及未反應的起始材料
7a。將混合物冷卻至室溫且濃縮。藉由急驟層析法(SiO
2: CH
2Cl
2= 100%至10%甲醇+1%NH
4OH於CH
2Cl
2中)純化粗殘餘物,且藉由C18逆相層析法(H
2O = 95%至0.1% TFA/CH
3CN = 100%)進一步純化所獲得之產物,獲得無色油(TFA鹽) (140 mg,13%)。
1H-NMR (300 MHz, CDCl
3): δ 6.87 (s, 1H), 6.83 (s, 1H), 4,05 (t,
J= 6.7 Hz, 4H), 3.84 (t,
J= 6.9 Hz, 2H), 2.66 (t,
J= 6.9 Hz, 2H), 2.45-2.20 (m, 6H), 2.37 (s, 3H), 1.65-1.50 (m, 8H), 1.5-1.1 (m, 56H), 0.86 (t,
J= 6.5 Hz, 12H). MS (APCI
+): 802.6 (M+1)。
根據以上方案合成脂質10a-130。反應條件與脂質10a-139相同,不同之處在於3-(1
H-咪唑-1-基)丁基胺作為咪唑胺。
根據以上方案合成脂質10a-128。反應條件與脂質10a-139相同,不同之處在於1-甲基-1
H-咪唑-2-基)甲基胺作為咪唑胺。
1H-NMR (300 MHz, CDCl
3): δ 6.89 (d,
J= 1.4 Hz, 1H), 6.81 (d,
J= 1.4 Hz, 1H), 4,03 (t,
J= 6.7 Hz, 4H), 3.68 (s, 3H), 3.62 (s, 2H), 2.45-2.20 (m, 6H), 1.65-1.50 (m, 8H), 1.5-1.35 (m, 8H), 1.35-1.10 (m, 48H), 0.86 (t,
J= 6.5 Hz, 12H). MS (APCI
+): 787.6 (M+1)。
實例 41
具有環狀
RNA
之脂質奈米粒子調配物
使用Precision Nanosystems Ignite儀器用『NextGen』混合腔室形成脂質奈米粒子(LNP)。將含有呈16:1:4:1或62:4:33:1莫耳比之重量比之可離子化脂質10a-26、DSPC、膽固醇及DSPE-PEG 2000 (Avanti Polar Lipids公司)的乙醇相與含有環狀RNA及25 mM乙酸鈉緩衝液pH 5.2之水相合併。使用3:1水與乙醇混合比。隨後,在1 L水中透析所調配之LNP且經18小時交換2次。使用0.2 µm過濾器過濾經透析LNP。在活體內給藥之前,將LNP稀釋於PBS中。藉由動態光散射測定LNP大小。使用Malvern Panalytical Zetasizer Pro量測具有1 mL含20 µg/mL LNP之PBS (pH 7.4)的光析槽以獲得Z平均值。記錄Z平均值及多分散性指數。
41.1
調配脂質
10a-26
及
10a-27
使用Precision Nanosystems Ignite儀器用『NextGen』混合腔室形成脂質奈米粒子(LNP)。將含有呈16:1:4:1或62:4:33:1莫耳比之重量比之可離子化脂質10a-26或脂質10a-27、DOPE、膽固醇及DSPE-PEG 2000 (Avanti Polar Lipids公司)的乙醇相與含有環狀RNA及25 mM乙酸鈉緩衝液pH 5.2之水相合併。使用3:1水與乙醇混合比。隨後,在1 L水中透析所調配之LNP且經18小時交換2次。使用0.2 µm過濾器過濾經透析LNP。在活體內給藥之前,將LNP稀釋於PBS中。藉由動態光散射測定LNP大小。使用Malvern Panalytical Zetasizer Pro量測具有1 mL含20 µg/mL LNP之PBS (pH 7.4)的光析槽以獲得Z平均值。記錄Z平均值及多分散性指數。
41.2
調配脂質
10a-53
及
10a-54
使用Precision Nanosystems Ignite儀器用『NextGen』混合腔室形成脂質奈米粒子(LNP)。將含有呈50:10:38.5:1.5莫耳比之可離子化脂質10a-53或10a-54、DOPE、膽固醇及DSPE-PEG 2000 (Avanti Polar Lipids公司)的乙醇相與含有環狀RNA及25 mM乙酸鈉緩衝液pH 5.2之水相合併。使用3:1水與乙醇混合比。隨後,在1 L 1×PBS中透析所調配之LNP且經18小時交換2次。使用0.2 µm過濾器過濾經透析LNP。在活體內給藥之前,將LNP稀釋於PBS中。藉由動態光散射測定LNP大小。使用Malvern Panalytical Zetasizer Pro量測具有1 mL含20 µg/mL LNP之PBS (pH 7.4)的光析槽以獲得Z平均值。記錄Z平均值及多分散性指數。
使用Malvern Panalytical Zetasizer Pro量測LNP ζ電位。將最終粒子濃度為400 µg/mL之含有200 μL粒子水溶液及800 µL經蒸餾不含核糖核酸酶之水的混合物裝載至zetasizer毛細管單元中以用於分析。
使用Ribogreen分析測定RNA囊封。將奈米粒子溶液以2 µg/mL之理論環狀RNA濃度稀釋於tris-乙二胺四乙酸(TE)緩衝液中。製造在2 µg/mL至0.125 µg/mL範圍內之稀釋於TE緩衝液中之標準環狀RNA溶液。將粒子及標準品添加至所有孔中且執行第二次培育(37℃,在350 rpm下,持續3分鐘)。使用SPECTRAmax® GEMINI XS微量盤光譜螢光計量測螢光。使用標準曲線計算各粒子溶液中之環狀RNA濃度。自在經溶解粒子與未經溶解粒子之間偵測到之環狀RNA比計算囊封效率。
表 22a.LNP表徵
表 22b.LNP表徵
實例 42
可離子化脂質 | 大小 (nm) | PDI | 囊封效率(%) | ζ 資料 電位(mV) |
22-S14 | 88 | 0.09 | 96 | 3.968 |
93-S14 | 119 | 0.02 | 96 | -6.071 |
脂質10a-26 | 86 | 0.08 | 92 | -15.24 |
可離子化脂質 | Z- 平均值(nm) | PDI | RNA 入陷(%) |
22-S14 | 64 | 0.05 | 97 |
93-S14 | 74 | 0.04 | 95 |
脂質10a-26 | 84 | 0.04 | 96 |
活體內分析
向在22-25 g範圍內之雌性CD-1或雌性c57BL/6J小鼠靜脈內給藥0.5 mg/kg RNA。注射後六小時,向小鼠腹膜內注射200 µL呈15 mg/mL濃度之D-螢光素。注射後5分鐘,使用異氟醚麻醉小鼠,且置放於IVIS光譜活體內成像系統(Perkin Elmer)內部,其中背側向上。脂質22-S14、93-S14、脂質10a-26之全身總IVIS通量呈現於圖32A中。10分鐘注射後,掃描小鼠之發光。使小鼠安樂死且在注射螢光素25分鐘內提取器官以掃描肝、脾、腎、肺及心臟中之發光。使用Living Images (Perkin Elmer)軟體分析影像(圖33A-B、圖34A-B、圖35A-B)。繪製所關注區域以獲得通量及平均輻射輝度且分析蛋白質表現之生物分佈(圖32A-B)。
圖32A繪示與用脂質22-S14及93-S14製造之LNP相比自具有脂質10a-26 LNP之螢光素酶環狀RNA觀測到之增大的全身總通量。圖32B展示組織之離體IVIS分析,其進一步突出顯示脂質10a-26之增加之總體表現,同時維持在脂質22-S14及93-S14之情況下觀測到之所需脾與肝比,儘管有經設計以改善表現之顯著結構變化。此等資料突出顯示與先前報導之脂質相比藉由脂質10a-26獲得之改善。
亦用囊封於用脂質10b-15或脂質10a-53或10a-54形成之LNP中的環狀RNA執行如上文所描述之類似分析。圖36A-C展示組織之離體IVIS分析,其分別突出顯示脂質10b-15、10a-53及10a-54之總體表現,同時維持所需脾與肝比,儘管有經設計以改善表現之顯著結構變化。圖36D展示PBS對照之結果。此等資料展現與諸如93-S14及22-S14之先前報導之脂質相比藉由脂質10b-15、10a-53及10a-54獲得之改善。
實例 43
遞送螢光素酶
用囊封螢火蟲螢光素酶
(f.luc)環狀RNA之脂質奈米粒子(LNP)轉染人類周邊血液單核細胞(PBMC) (Stemcell Technologies)且檢驗其之螢光素酶表現。將來自兩個不同供體之PBMC與五種不同的含有編碼螢火蟲螢光素酶之環狀RNA之LNP組合物(200 ng)一起在37℃下在RPMI、2%人類血清、IL-2 (10 ng/mL)及50 μM BME中活體外培育。在無LNP之情況下培育之PBMC用作陰性對照。24小時後,使細胞溶解且基於生物發光(Promega BrightGlo)分析螢火蟲螢光素酶表現。
代表性資料呈現於圖37A及圖37B中,該等圖展示測試LNP能夠將環狀RNA遞送至原代人類免疫細胞中,從而引起蛋白質表現。
實例 44
活體外遞送綠色螢光蛋白
(GFP)
或嵌合抗原受體
(CAR)
用囊封GFP之LNP轉染人類PBMC (Stemcell Technologies)且藉由流動式細胞測量術進行檢驗。將來自五個不同供體之PBMC (PBMC A-E)與一種含有編碼GFP或CD19-CAR之環狀RNA之LNP組合物(200 ng)一起在37℃下在RPMI、2%人類血清、IL-2 (10 ng/mL)及50 μM BME中活體外培育。在無LNP之情況下培育之PBMC用作陰性對照。在LNP培育後24、48或72小時之後,分析細胞之CD3、CD19、CD56、CD14、CD11b、CD45、可固定活-死及有效負載物(GFP或CD19-CAR)。
代表性資料呈現於圖38A及圖38B中,該等圖展示測試LNP能夠將環狀RNA遞送至原代人類免疫細胞中,從而引起蛋白質表現。
實例 45
多個
IRES
變異體可介導鼠
CD19 CAR
活體外表現
多個編碼抗鼠CD19 CAR之環狀RNA構築體含有獨特IRES序列且經脂質體轉染至1C1C7細胞株中。在脂質體轉染之前,使1C1C7細胞在完全RPMI中擴增若干天。一旦細胞擴增至適當數目,則用四種不同環狀RNA構築體對1C1C7細胞進行脂質體轉染(Invitrogen RNAiMAX)。24小時後,將1C1C7細胞與經His標記之重組鼠CD19 (Sino Biological)蛋白一起培育,隨後用二級抗His抗體染色。之後,經由流動式細胞測量術分析細胞。
代表性資料呈現於圖39中,其展示源自指定病毒(赤背條鼠(apodemus agrarius)小核糖核酸病毒、山羊脊病毒、帕拉博病毒及薩利病毒)之IRES能夠驅動抗小鼠CD19 CAR在鼠T細胞中表現。
實例 46
鼠
CD19 CAR
介導腫瘤細胞活體外殺滅
將編碼抗小鼠CD19 CAR之環狀RNA電穿孔至鼠T細胞中以評估CAR介導之細胞毒性。對於電穿孔,使用ThermoFisher之氖氣轉染系統用編碼抗小鼠CD19 CAR之環狀RNA電穿孔T細胞,隨後靜置隔夜。對於細胞毒性分析,將經電穿孔T細胞與Fluc+目標細胞及非目標細胞以1:1比率在含有10% FBS、IL-2 (10 ng/mL)及50 μM BME之完全RPMI中共同培養且在37℃下培育隔夜。在共同培養後24小時,使用螢光素酶分析系統量測細胞毒性(Promega Brightglo螢光素酶系統)以偵測Fluc+目標細胞及非目標細胞之溶解。所示值係相對於未經轉染之模擬物信號來計算。
代表性資料呈現於圖40中,其展示由環狀RNA表現之抗小鼠CD19 CAR在鼠T細胞中具有活體外功能性。
實例 47
用囊封編碼鼠
CD19 CAR
之環狀
RNA
的脂質功能性耗乏
B
細胞
向C57BL/6J小鼠注射用脂質10b-15形成、囊封編碼抗鼠CD19 CAR之環狀RNA的LNP。作為對照,向不同群組之小鼠注射囊封編碼螢火蟲螢光素酶(
f.Luc)之環狀RNA的脂質10b-15。每隔一天向在20-25 g範圍內之雌性C57BL.6J靜脈內注射5次0.5 mg/kg劑量之LNP。在注射之間,經由流動式細胞測量術針對可固定活/死、CD45、TCRvb、B220、CD11b及抗鼠CAR分析血液抽取。在最後一次注射後兩天,收取脾且進行處理以用於流動式細胞測量術分析。用可固定活/死、CD45、TCRvb、B220、CD11b、NK1.1、F4/80、CD11c及抗鼠CAR染色脾細胞。以接受
f.LucLNP之小鼠標準化注射抗鼠CD19 CAR LNP之小鼠之資料。
代表性資料呈現於圖41A、圖41B及圖41C中,其展示活體內由LNP遞送之環狀RNA表現之抗小鼠CD19 CAR在活體內鼠T細胞中具有功能。
實例 48
與由
mRNA
表現之
CD19 CAR
相比
,
由環狀
RNA
表現之
CD19 CAR
具有較高產量及較大細胞毒性效應
將自N端至C端包括FMC63衍生之scFv、CD8跨膜域、4-1BB共刺激域及CD3ζ胞內域的編碼抗CD19嵌合抗原受體之環狀RNA電穿孔至人類周邊T細胞中以評估表面表現及CAR介導之細胞毒性。為了進行比較,在此實驗中將經環狀RNA電穿孔之T細胞與經mRNA電穿孔之T細胞進行比較。對於電穿孔,使用市售的自供體人類PBMC進行之T細胞分離套組(Miltenyi Biotec)自人類PBMC分離CD3+ T細胞。分離之後,用抗CD3/抗CD28 (Stemcell Technologies)刺激T細胞且在37℃下在含有10% FBS、IL-2 (10 ng/mL)及50 μM BME之完全RPMI中經5天擴增。在刺激後五天,使用ThermoFisher之氖氣轉染系統用編碼抗人類CD19 CAR之環狀RNA電穿孔T細胞,且隨後靜置隔夜。對於細胞毒性分析,將經電穿孔T細胞與Fluc+目標細胞及非目標細胞以1:1比率在含有10% FBS、IL-2 (10 ng/mL)及50 μM BME之完全RPMI中共同培養且在37℃下培育隔夜。在共同培養後24小時,使用螢光素酶分析系統量測細胞毒性(Promega Brightglo螢光素酶系統)以偵測Fluc+目標細胞及非目標細胞之溶解。此外,獲取經電穿孔T細胞之等分試樣,且在分析之日進行染色以用於活-死可固定染色、CD3、CD45及嵌合抗原受體(FMC63)。
代表性資料呈現於圖42及圖43中。圖42A及圖42B展示,與由線性mRNA表現之抗人類CD19 CAR相比,由環狀RNA表現之抗人類CD19 CAR之表現量更高且長度更長。圖43A及圖43B展示,相對於由線性mRNA表現之抗人類CD19 CAR,由環狀RNA表現之抗人類CD19 CAR發揮更大的細胞毒性效應。
實例 49
由單一環狀
RNA
功能性表現兩個
CAR
將編碼嵌合抗原受體之環狀RNA電穿孔至人類周邊T細胞中以評估表面表現及CAR介導之細胞毒性。此研究之目的為評估編碼兩個CAR之環狀RNA是否可以隨機方式用2A (P2A)或IRES序列表現。對於電穿孔,商業上購買CD3+ T細胞(Cellero)且用抗CD3/抗CD28 (Stemcell Technologies)刺激,且在37℃下在含有10% FBS、IL-2 (10 ng/mL)及50 μM BME之完全RPMI中經5天擴增。在刺激後四天,使用ThermoFisher之氖氣轉染系統用編碼抗人類CD19 CAR、抗人類CD19 CAR-2A-抗人類BCMA CAR及抗人類CD19 CAR-IRES-抗人類BCMA CAR之環狀RNA電穿孔T細胞,隨後靜置隔夜。對於細胞毒性分析,將經電穿孔T細胞與表現人類CD19或BCMA抗原之Fluc+ K562細胞以1:1比率在含有10% FBS、IL-2 (10 ng/mL)及50 μM BME之完全RPMI中共同培養且在37℃下培育隔夜。在共同培養後24小時,使用螢光素酶分析系統量測細胞毒性(Promega Brightglo螢光素酶系統)以偵測Fluc+目標細胞之溶解。
代表性資料呈現於圖44中,其展示兩個CAR可由相同環狀RNA構築體功能性表現且發揮細胞毒性效應功能。
實例 50
使用
Cre
報導體小鼠進行之活體內環狀
RNA
轉染
將編碼Cre重組酶(Cre)之環狀RNA囊封至如先前所描述之脂質奈米粒子中。以0.5 mg/kg RNA向雌性6-8週齡B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J (Ai9)小鼠靜脈內給藥脂質奈米粒子。在Cre重組後,在Ai9小鼠中轉錄且轉譯螢光tdTomato蛋白,此意謂環狀RNA已遞送至tdTomato+細胞且在該等細胞中轉譯。48小時後,使小鼠安樂死且收取脾,處理成單細胞懸浮液,且用各種螢光團結合型抗體染色以用於經由流動式細胞測量術進行免疫表型分型。
圖45A展示在經用脂質10a-27或10a-26或脂質10b-15形成之LNP治療後包括總骨髓(CD11b+)、B細胞(CD19+)及T細胞(TCR-B+)之各種脾免疫細胞(CD45+,活)子集中tdTomato表現之頻率的代表性FACS圖。注射PBS之Ai9小鼠呈現背景tdTomato螢光。圖45B定量表現tdTomato之骨髓細胞、B細胞及T細胞之比例(平均值+標準偏差,n = 3),該比例等效於已成功地經Cre環狀RNA轉染之各細胞群體之比例。用脂質10a-27及10a-26製造之LNP展現與脂質93-S14相比顯著高之骨髓細胞及T細胞轉染,此突出顯示由脂質結構修飾賦予之改善。
圖45C繪示具有脂質10a-27及10a-26之表現tdTomato之額外脾免疫細胞群體之比例(平均值+標準偏差,n = 3),該等群體亦包括NK細胞(NKp46+、TCR-B-)、經典單核球(CD11b+、Ly-6G-、Ly-6C_hi)、非經典單核球(CD11b+、Ly-6G-、Ly-6C_lo)、嗜中性球(CD11b+、Ly-6G+)及樹突狀細胞(CD11c+、MHC-II+)。此等實驗表明,用脂質10a-27及10a-26及脂質10b-15製造之LNP有效地將環狀RNA遞送至小鼠中之許多脾免疫細胞子集且引起彼等細胞中成功的自環狀RNA進行之蛋白質表現。
實例 51
實例
51A
:
內置式
聚
A
序列及用於產生免疫靜默環狀
RNA
之親和純化
將聚A序列(20-30 nt)插入RNA構築體(具有內含子中之內置式聚A序列之前驅體RNA)之5'端及3'端中。參見例如圖97A。可替代地使用例如大腸桿菌聚A聚合酶或酵母聚A聚合酶轉錄後聚腺苷酸化前驅體RNA及內含子,此要求使用額外酶。
藉由活體外轉錄(IVT)環化此實例中之環狀RNA且藉由經市售oligo-dT樹脂洗滌來將其親和純化以自剪接反應物選擇性移除加聚A標籤之序列(包括游離內含子及前驅體RNA)。參見例如圖98。用含有呈不同比率之鳥苷單磷酸酯(GMP)及鳥苷三磷酸酯(GTP) (GMP:GTP = 8、12.5或13.75)的商用IVT套組(New England Biolabs)或定製IVT混合物(Orna Therapeutics)執行IVT。在一些實施例中,可優先包括呈高GMP:GTP比之GMP作為第一核苷酸,從而產生大部分加單磷酸酯帽之前驅體RNA。作為比較,可替代地藉由用Xrn1、核糖核酸酶R及去氧核糖核酸酶I處理(酶純化)來純化環狀RNA產物。參見例如圖100。
隨後,評估使用親和純化或酶純化方法製備之環狀RNA之免疫原性。簡言之,將所製備之環狀RNA轉染至A549細胞中。24小時後,使細胞溶解,且以qPCR量測相對於模擬物樣本之干擾素β-1誘導。作為三磷酸化RNA之3p-hpRNA用作陽性對照。
圖46B及圖46C以及圖99A及圖99B表明,當聚A序列包括於在剪接期間移除且存在於未經剪接前驅體分子中之元件上時,負向選擇親和純化自剪接反應物移除非環狀產物。圖46D表明,用測試IVT條件及純化方法製備之環狀RNA全部為免疫靜止的。此等結果表明,負向選擇親和純化等效於或優於用於環狀RNA純化之酶純化,且定製環狀RNA合成條件(IVT條件)可減少對GMP過量之依賴以達成最大免疫靜止。
實例
51B
:
用於環狀
RNA
生產之專用結合位點及親和純化
吾人可包括經特定設計之序列(DBS,專用結合位點)代替聚A標籤。參見例如圖47A。
可使用諸如可結合至樹脂之經特定設計之互補寡核苷酸的專用結合位點(DBS)代替聚A標籤以選擇性耗乏前驅體RNA及游離內含子。在此實例中,將示於圖47A中之諸如TATAATTCTACCCTATTGAGGCATTGACTA (SEQ ID NO: 3269)之DBS序列(30 nt)插入前驅體RNA之5'端及3'端中。轉錄RNA,且經連接至樹脂之定製互補寡核苷酸洗滌經轉錄產物。
圖47B及圖47C表明,在剪接期間移除之元件中包括所設計之DBS序列使得能夠經由負向親和純化移除剪接反應物中的未經剪接之前驅體RNA及游離內含子組分。
實例
51C
:
產生編碼肌縮蛋白之環狀
RNA
藉由活體外轉錄RNA前驅體、接著使用Xrn1、去氧核糖核酸酶1及核糖核酸酶R之混合物進行酶純化以降解殘餘線性組分來產生12 kb之12,000 nt編碼肌縮蛋白之環狀RNA。圖48表明成功地產生編碼肌縮蛋白之環狀RNA。
實例
51D
:
環狀
RNA
之負向選擇親和純化
將親和序列添加至前驅體RNA中,且藉由活體外轉錄(IVT)產生環狀RNA,如實例51A及51B中所描述。使包含與親和序列100%互補之序列的寡核苷酸結合至樹脂,或獲得市售的結合至與親和序列互補之寡核苷酸之樹脂。可將IVT反應混合物直接添加至樹脂中。可替代地,對IVT反應溶液進行緩衝液交換成包含大於1 mM一或多種諸如NaCl或KCl之單價鹽的諸如Tris緩衝液之結合緩衝液,或在將IVT反應混合物添加至樹脂中之前僅將一或多種單價鹽添加至IVT反應混合物中。隨後,藉由經樹脂洗滌包含線性RNA及環狀RNA之溶液來親和純化不包含親和序列之環狀RNA。可在此過程期間加熱溶液以便使異常雜交之序列變性。收集來自珠粒之溶離液且使用10-300 kDa之過濾臨限值將其緩衝液交換成包含1 mM檸檬酸鈉pH 6.5之水或儲存緩衝液。
實例 52
3'
內含子片段與
IRES
之間的
5'
間隔子改善環狀
RNA
表現
將在3'內含子片段與IRES之間具有不同5'間隔子之經純化環狀RNA在Jurkat細胞中之表現量進行比較。簡言之,在用250 ng各RNA電穿孔60,000個細胞之後24小時量測上清液中分泌高斯螢光素酶之發光。
另外,將在3'內含子片段與IRES之間具有不同5'間隔子之經純化環狀RNA在Jurkat細胞中之穩定性進行比較。簡言之,在用250 ng各RNA電穿孔60,000個細胞之後經2天量測上清液中分泌高斯螢光素酶之發光且以第1天表現標準化。
結果示於圖49A及圖49B中,其指示添加間隔子可增強IRES功能及所添加間隔子之序列一致性及長度的重要性。潛在解釋為間隔子恰好在IRES之前添加且可能藉由使IRES與諸如內含子片段之其他結構化元件分離摺疊而起作用。
實例 53
此實例描述山羊脊病毒IRES之5'端或3'端之缺失掃描。IRES邊界一般表徵不佳且需要經驗分析,且此實例可用於定位驅動轉譯所需之核心功能序列。簡言之,用可操作地連接至高斯螢光素酶編碼序列之經截短IRES元件產生環狀RNA構築體。經截短IRES元件具有自5'端或3'端移除之指定長度的核苷酸序列。在用RNA電穿孔原代人類T細胞之後24小時及48小時量測上清液中分泌高斯螢光素酶之發光。表現穩定性經計算為48小時時間點之表現量相對於24小時時間點之表現量的比率。
如圖50中所示,自IRES之5'端缺失超過40個核苷酸減少表現且中斷IRES功能。表現穩定性相對不受IRES元件之截短影響,但表現量實質上因自IRES之3'端缺失141個核苷酸而降低,而自3'端缺失57或122個核苷酸對表現量具有正面影響。
亦觀測到,6-核苷酸起始前序列之缺失降低螢光素酶報導體之表現量。用經典kozak序列(GCCACC)置換6-核苷酸序列不具有顯著影響,但至少維持表現。
實例 54
此實例描述包括山羊脊病毒(CKV) IRES、帕拉博病毒IRES、姬鼠小核糖核酸病毒(AP) IRES、脊病毒SZAL6 IRES、克羅希病毒B (CrVB) IRES、CVB3 IRES及SAFV IRES之選定IRES序列的修飾(例如截短)。簡言之,用可操作地連接至高斯螢光素酶編碼序列之經截短IRES元件產生環狀RNA構築體。用環狀RNA轉染HepG2細胞。在轉染後24小時及48小時評估上清液中之發光。表現穩定性經計算為48小時時間點之表現量相對於24小時時間點之表現量的比率。
如圖51中所示,截短具有視IRES之身分而變之作用,IRES之身分可視常常在IRES間不同之用於轉譯之起始機制及蛋白質因子而定。5'缺失及3'缺失可有效地合併,例如在CKV IRES之情形下。在一些情況下,添加典型Kozak序列顯著地改善表現(如同SAFV、完全相對於完全+K)或減弱表現(如同CKV、5d40/3d122相對於5d40/3d122+K)。
實例 55
此實例描述包括突變替代性轉譯起始位點之CK-739、AP-748及PV-743 IRES序列之修飾。簡言之,用可操作地連接至高斯螢光素酶編碼序列之經修飾IRES元件產生環狀RNA構築體。在用RNA轉染1C1C7細胞之後24小時及48小時量測上清液中分泌高斯螢光素酶之發光。
CUG為最常發現之替代性起始位點,但亦表徵許多其他者。此等三重峰可在起始密碼子之前存在於IRES掃描束中且可能會影響正確多肽之轉譯。產生具有序列SEQ ID NO: 3282之IRES之四個替代性起始位點突變。如圖
52中所示,CK-739 IRES中之替代性轉譯起始位點之突變影響正確多肽之轉譯,在一些情況下正面地影響,而在其他情況下負面地影響。所有替代性轉譯起始位點之突變皆降低轉譯量。
作為在起始密碼子之前的6個核苷酸之替代性Kozak序列亦可能會影響表現量。在「6 nt起始前」群組中之CK-739 IRES及第1-5號樣本中,起始密碼子上游之6-核苷酸序列分別為gTcacG、aaagtc、gTcacG、gtcatg、gcaaac及acaacc。如圖52中所示,在起始密碼子之前取代某些6-核苷酸序列影響轉譯。
亦觀測到AP-748及PV-743 IRES序列中之5'端及3'端缺失減少表現。然而,在具有長掃描束之CK-739 IRES中,轉譯相對不受掃描束中之缺失影響。
實例 56
此實例描述藉由插入5'及/或3'非轉譯區(UTR)及產生IRES雜交體進行之選定IRES序列之修飾。簡言之,用可操作地連接至高斯螢光素酶編碼序列之經修飾IRES元件產生環狀RNA構築體。在用RNA轉染HepG2細胞之後24小時及48小時量測上清液中分泌高斯螢光素酶之發光。
插入有UTR之IRES序列可包含選自SEQ ID NO: 3192-3199之序列。如圖53中所示,在IRES之3'端之後及在起始密碼子之前插入5' UTR略微增加來自山羊脊病毒(CK) IRES之轉譯,但在一些情況下,消除來自薩利病毒SZ1 IRES之轉譯。在終止卡匣右後方插入3' UTR對兩個IRES序列無影響。
用CK IRES作為基質製造雜交體CK IRES序列,其中CK IRES之特定區域經例如SZ1及AV (愛知病毒)之其他IRES序列之外觀類似結構置換。如圖53中所示,某些雜交合成IRES序列為功能性的,此指示雜交IRES可使用來自展示類似預測結構之不同IRES序列之部分來構築,同時使此等結構缺失會完全消除IRES功能。
實例 57
此實例描述藉由引入終止密碼子或卡匣變異體進行之環狀RNA之修飾。簡言之,用可操作地連接至高斯螢光素酶編碼序列、接著為可變終止密碼子卡匣之IRES元件產生環狀RNA構築體,該等卡匣包括高斯螢光素酶編碼序列之各框架中之終止密碼子及閱讀框架中之兩個終止密碼子。用環狀RNA轉染1C1C7細胞。在轉染後24小時及48小時評估上清液中之發光。
終止密碼子卡匣之序列闡述於SEQ ID NO: 3203-3209中。如圖54中所示,某些終止密碼子卡匣提高表現量,但其對表現穩定性幾乎無影響。特定言之,具有兩個框架1 (高斯螢光素酶編碼序列之閱讀框架)終止密碼子(第一者為TAA,接著為框架2終止密碼子及框架3終止密碼子)之終止卡匣有效地促進功能性轉譯。
實例 58
此實例描述藉由插入5' UTR變異體進行之環狀RNA之修飾。簡言之,用在IRES之3'端與起始密碼子之間插入有5' UTR變異體之IRES元件產生環狀RNA構築體,IRES可操作地連接至高斯螢光素酶編碼序列。用環狀RNA轉染1C1C7細胞。在轉染後24小時及48小時評估上清液中之發光。
5' UTR變異體之序列闡述於SEQ ID NO: 3197及3200-3202中。如圖
55中所示,當添加36-核苷酸非結構化/低GC間隔子序列(UTR2)時,具有典型Kozak序列之CK IRES (UTR4)更有效,此表明富含GC之Kozak序列可能會干擾核心IRES摺疊。使用具有kozak序列之較高級GC/結構化間隔子不展示相同效益(UTR3),此可能歸因於間隔子自身對IRES摺疊之干擾。在不需要間隔子之情況下使kozak序列突變成gTcacG (UTR1)將轉譯增強至與替代性Kozak+間隔子相同的位準。
實例 59
此實例描述環狀RNA中之miRNA目標位點對表現量之影響。簡言之,用可操作地連接至人類紅血球生成素(hEPO)編碼序列之IRES元件產生環狀RNA構築體,其中將2個串聯miR-122目標位點插入構築體中。用環狀RNA轉染表現miR-122之Huh7細胞。在轉染後24小時及48小時藉由夾心ELISA評估上清液中之hEPO表現。
如圖56中所示,廢止hEPO表現量,其中將miR-122目標位點插入環狀RNA中。此結果表明自環狀RNA之表現可由miRNA調節。因此,細胞類型或組織特異性表現可藉由併入細胞類型中表現之miRNA之目標位點來達成,其中重組蛋白之表現為不合需要的。
實例 60
此實例展示LNP活體外轉染人類腫瘤細胞。將SupT1細胞(人類T細胞腫瘤株)及MV4-11細胞(人類巨噬細胞腫瘤株)分別以100,000個細胞/孔及100,000個細胞/孔塗鋪在96孔盤中隔夜。隨後,將含有編碼螢火蟲螢光素酶(FLuc)之環狀RNA之LNP以200 ng RNA/孔添加至細胞中。在24小時培育之後,根據製造商說明書使用Bright-Glo螢光素酶分析系統(Promega)定量發光,且減去未經LNP治療之細胞之背景發光。
圖 57定量所量測之螢火蟲發光,此指示包含脂質10a-27之LNP (10a-27 (4.5D) LNP,參見實例70)或包含脂質10a-26之LNP (10a-26 (4.5D) LNP,參見實例70)可在人類T細胞腫瘤株及巨噬細胞腫瘤株中活體外轉染且表現環狀RNA。10a-27 (4.5D) LNP產生比10a-26 (4.5D) LNP高之發光,此表明LNP轉染至人類腫瘤細胞中之位準可能受調配物影響。
實例 61
此實例展示原代人類經活化T細胞之活體外轉染。用aCD3/aCD28刺激來自獨立供體之原代人類T細胞,且在存在人類血清及IL-2之情況下使其增殖6天。隨後,將100,000個細胞塗鋪於96孔盤中,且在存在或不存在脂蛋白元E3 (ApoE3)之情況下將含有編碼螢火蟲螢光素酶(FLuc)之環狀RNA之LNP以200 ng RNA/孔添加至細胞中。在24小時培育之後,根據製造商說明書使用Bright-Glo螢光素酶分析系統(Promega)定量發光,且減去未經LNP治療之細胞之背景發光。
圖 58展示跨4個獨立供體之所量測之螢火蟲發光,此表明所有測試LNP皆活體外轉染原代人類T細胞。含有脂質10a-27之LNP一般產生比含有脂質10a-26之LNP高的發光。此外,與10a-27 (4.5D)及10a-26 (4.5D) (分別為3.1倍及2.6倍)相比,對於10a-27 (5.7A)及10a-26 (5.7A),添加ApoE3一般增加螢光素酶表現更多(跨4個供體分別為4.4倍及9.3倍平均值)。此表明,輔助脂質、PEG脂質及可離子化脂質:磷酸酯比全部貢獻於用相同可離子化脂質製造之不同調配物的ApoE依賴性。(參見實例70之LNP調配程序,例如10a-27 (5.7A)、10a-26 (5.7A)、10a-27 (4.5D)及10a-26 (4.5D) LNP。)
實例 62
此實例表明,LNP之不同尾部化學反應在T細胞中引起不同的吸收機制。為了定量表現環狀RNA之人類T細胞之百分比,在存在或不存在ApoE3之情況下將含有eGFP環狀RNA之LNP以200 ng RNA/孔添加至經活化原代人類T細胞(如上文在
實例 61中所描述製備)中。在24小時培育之後,藉由流動式細胞測量術分析細胞,且定量活GFP+ T細胞百分比。
圖 59對2個獨立供體之GFP+ T細胞%製圖,其中5-10%細胞為用於含有脂質10a-27之LNP (10a-27 (4.5D) LNP,參見實例70)及含有脂質10a-46之LNP (10a-46 (5.7A) LNP,參見實例70)的GFP+。儘管ApoE3添加引起10a-27 (4.5D) LNP轉染增加,但其似乎不增加10a-46 (5.7A) LNP轉染,此表明脂質10a-27與10a-46之間的不同尾部化學反應可在T細胞中介導不同吸收機制。
實例 63
此實例描述Cre報導體小鼠模型中之Cre之免疫細胞表現。
向Ai9小鼠(B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J,雌性,6-8週,n = 3隻/組) i.v.注射0.5 mg/kg Cre環狀RNA LNP或PBS。在Cre重組後,Ai9小鼠轉錄且轉譯螢光報導體tdTomato;此意謂tdTomato+細胞成功地經Cre環狀RNA轉染。48小時後,使小鼠安樂死且收集其脾,且將脾手動處理成單細胞懸浮液。將脾細胞針對死細胞(活-死可固定淺綠色,Thermo)且利用抗小鼠抗體(TCR-B鏈、BV421、H57-597;CD45、BV711、30-F11;CD11b、BV785、ICRF44;NKp46、AF647、29A1.4;CD19、APC/750、6D5;TruStain FcX、93;所有抗體皆來自Biolegend)以1:200比染色。使用Attune Nxt流式細胞儀(Thermo)執行流動式細胞測量術。
脾骨髓細胞(CD11b+)、B細胞(CD19+)及T細胞(TCR-B+)中之tdTomato+細胞百分比呈現於
圖 60中。脂質10a-27與脂質10a-46之不同之處僅在於其尾部化學反應,且用脂質10a-27製造之調配物轉染比用脂質10a-46製造之調配物顯著地更多的脾免疫細胞。另外,與用Cre線性mRNA調配之LNP相比,用Cre環狀RNA調配之10a-27 (4.5D) LNP (參見實例70)轉染許多T細胞大致兩倍,此表明環狀RNA可在脾T細胞中引起與線性mRNA相比改善之蛋白質表現。
表 23.LNP表徵
實例 64
調配物 | Z- 平均值(nm) | PDI | RNA 囊封效率(%) |
10a-27 (4.5D),研究1 | 65 | 0.07 | 96 |
10a-26 (4.5D),研究1 | 74 | 0.06 | 94 |
10a-27 (4.5D),具有mCre,研究1 | 75 | 0.05 | 93 |
10a-46 (5.7A),研究2 | 86 | 0.01 | 94 |
此實例展示野生型小鼠中之mOX40L環狀RNA之免疫細胞表現。
向C57BL/6小鼠(雌性,6-8週,n = 3或4隻/組)靜脈內注射0.5 mg/kg mOX40L環狀RNA LNP或PBS。24小時後,使小鼠安樂死且收集其脾,且將脾手動處理成單細胞懸浮液。將脾細胞針對死細胞(活-死可固定淺綠色,Thermo)且利用抗小鼠抗體(TCR-B鏈、PacBlue、H57-597;CD11b、FITC、ICRF44;B220、PE、RA3-6B2;CD45、PerCP、30-F11;mOX40L、AF647、RM134L;NK1.1、APC/750、PK136;TruStain FcX、93;所有抗體皆來自Biolegend)以1:200染色。使用Attune NxT流式細胞儀(Thermo)執行流動式細胞測量術。
脾骨髓細胞(CD11b+)、T細胞(TCR-B+)及NK細胞(NK1.1+)中之mOX40L+細胞百分比呈現於
圖 61中。值得注意的是,在不同緩衝液(低張PBS、等張PBS及等張TBS)中靜脈內注射之相同調配物之間觀測到顯著不同的轉染效率。低張PBS中之10a-27 4.5D LNP在脾中引起大致14%骨髓細胞轉染、6% T細胞轉染及21% NK細胞轉染。在等張緩衝液中注射之調配物中,10a-27 DSPC 5.7A LNP在脾中展現骨髓細胞、T細胞及NK細胞轉染(分別為9%、3%及8%)。(參見實例70之LNP調配程序,例如10a-27 (4.5D) LNP及10a-27 DSPC (5.7A) LNP。)
表 24.LNP表徵
實例 65
調配物 | Z- 平均值(nm) | PDI | RNA 囊封效率(%) |
10a-27 (4.5D) | 63 | 0.02 | 93 |
10a-26 (4.5D) | 67 | 0.07 | 94 |
10a-27 DSPC (5.7A) | 82 | 0.05 | 96 |
此實例展示野生型小鼠中之mOX40L環狀RNA-LNP之單次劑量遞增。
向57BL/6小鼠(雌性,6-8週,n = 3隻/組)靜脈內注射1 mg/kg或3 mg/kg mOX40L環狀RNA LNP或緩衝液對照。24小時後,使小鼠安樂死且收集其脾,且將脾手動處理成單細胞懸浮液。將脾細胞針對死細胞(活-死可固定藍色,Thermo)染色且用抗小鼠抗體(TCR-B鏈、BV421、H57-597;CD19、BV605、6D5;CD45、BV711、30-F11;CD11b、BV785、ICRF44;CD11c、FITC、N418;CD8a、PerCP、53-6.7;mOX40L、PE、RM134L;NKp46、AF647、29A1.4;CD4、APC/750、GK1.5;TruStain FcX、93;所有抗體皆來自Biolegend)以1:200染色。使用BD FACSSymphony流式細胞儀執行流動式細胞測量術。
脾T細胞(全部為TCR-B+)、CD4+ T細胞(TCR-B+、CD4+)、CD8+ T細胞(TCR-B+、CD8a+)、B細胞(CD19+)、NK細胞(NKp46+)、樹突狀細胞(CD11c+)及其他骨髓細胞(CD11b+、CD11c-)中之mOX40L+細胞百分比示於
圖 62A及
圖 62B中,其中對應的24小時後的小鼠體重變化示於
圖 62C中。對於所有群組,在1 mg/kg及3 mg/kg中觀測到免疫細胞子集轉染中之劑量依賴性增加,10a-27 (4.5D) LNP 1×PBS組除外。在3 mg/kg劑量下,三種不同LNP (10a-27 (4.5D)於TBS中、10a-26 (4.5D)於PBS中及10a-27 DSPC (5.7A)於TBS中;參見實例70之調配程序)在脾T細胞中達成10-20% mOX40L轉染,其中在CD4+及CD8+子集中觀測到類似轉染速率。此三種調配物亦在脾中在3 mg/kg下產生大致20% B細胞、60-70%樹突狀細胞、60-70% NK細胞及30-40%其他骨髓細胞mOX40L轉染。此三種調配物在24小時在3 mg/kg單次劑量下僅引起輕微(0-3%)小鼠體重減輕,且未報導臨床觀測結果。
表 25.LNP表徵
實例 66
調配物 | Z- 平均值(nm) | PDI | RNA 囊封效率(%) |
10a-27 (4.5D) | 76 | 0.06 | 91 |
10a-26 (4.5D) | 67 | 0.01 | 88 |
10a-27 DSPC (5.7A) | 77 | 0.01 | 93 |
此實例展示小鼠中之環狀RNA-LNP CAR介導之B細胞耗乏。
在第0天、第2天、第5天、第7天及第9天向C57BL/6小鼠(雌性,6-8週,n = 5隻/組)靜脈內注射0.5 mg/kg aCD19-CAR環狀RNA LNP或對照FLuc環狀RNA LNP。在第-1天、第1天、第8天及第12天,執行頜下放血以收集血液。用ACK溶解緩衝液溶解30 µL血液且用MACS緩衝液洗滌以分離免疫細胞。在第12天,使小鼠安樂死且收集其脾,且將脾手動處理成單細胞懸浮液。為了評估血液及脾中之B細胞頻率,將此等單細胞懸浮液針對死細胞(活-死可固定淺綠色,Thermo)染色且用抗小鼠抗體(TCR-B鏈、PacBlue、H57-597;CD11b、FITC、ICRF44;B220、PE、RA3-6B2;CD45、PerCP、30-F11;TruStain FcX、93;所有抗體皆來自Biolegend)以1:200染色。使用Attune NxT流式細胞儀(Thermo)執行流動式細胞測量術。
圖 63A定量以活CD45+免疫細胞中之B220+ B細胞百分比定義之在此研究中觀測到之B細胞耗乏。在第8天及第12天(對於血液)及第12天(對於脾)將aCD19-CAR環狀RNA LNP組中之B細胞耗乏與其各別FLuc環狀RNA LNP對照進行比較。在血液中,與FLuc對照相比,aCD19-CAR 10a-27 (4.5D)及10a-26 (4.5D) LNP在第8天引起活CD45+中之B220+ %分別減少大致28%及17%。在脾中,與FLuc對照相比,aCD19-CAR 10a-27 (4.5D)及10a-26 (4.5D) LNP在第12天引起活CD45+中之B220+ %減少大致5%及9%,如
圖 63B中所示。總之,此等結果表明,CAR介導之B細胞耗乏發生於經用於脂質10a-27 (4.5D)及脂質10a-26 (4.5D)之aCD19-CAR環狀RNA LNP治療之小鼠中。
另外,
圖 63C展示此研究中小鼠之重量增益百分比。經10a-27 4.5D或10a-26 4.5D LNP治療之小鼠(5 × 0.5 mg/kg,經9天)之平均體重減輕不顯著,此表明此等LNP可在此劑量及排程下在小鼠中良好耐受。
表 26.LNP表徵
實例 67
調配物 | Z- 平均值(nm) | PDI | RNA 囊封效率(%) |
10a-27 (4.5D)、oLuc | 65 | 0.03 | 93 |
10a-27 (4.5D)、oaCD19-CAR | 74 | 0.02 | 96 |
10a-26 (4.5D)、oLuc | 71 | 0.04 | 91 |
10a-26, (4.5D)、oaCD19-CAR | 71 | 0.04 | 93 |
含有抗
CD19 CAR
之
LNP
及環狀
RNA
構築體活體內減少血液及脾中之
B
細胞。
將編碼抗CD19 CAR表現之環狀RNA構築體囊封於如上文所描述之脂質奈米粒子內。為了比較,將編碼螢光素酶表現之環狀RNA囊封於單獨的脂質奈米粒子內。
每隔一天向6至8週齡C57BL/6小鼠注射LNP溶液,在各小鼠內總計4次LNP注射。在最後一次LNP注射之後24小時,收取小鼠之脾及血液,染色且經由流動式細胞測量術進行分析。如
圖 64A及
圖 64B中所示,與經LNP-編碼螢光素酶之環狀RNA治療之小鼠相比,含有LNP-編碼抗CD19 CAR之環狀RNA構築體之小鼠引起周邊血液及脾中之CD19+ B細胞統計學上顯著地減少。
實例 68
編碼
CAR
之環狀
RNA
內所含之
IRES
序列改善
CAR
表現及
T
細胞之細胞毒性。
用200 ng含有獨特IRES及鼠抗CD19 1D3ζ CAR表現序列之環狀RNA構築體電穿孔經活化鼠T細胞。此等構築體中所含之IRES完全或部分衍生自山羊脊病毒、姬鼠小核糖核酸病毒、帕拉博病毒或薩利病毒。山羊脊病毒衍生之IRES另外經密碼子最佳化。作為對照,無IRES之含有野生型ζ小鼠CAR之環狀RNA係用於比較。在電穿孔後24小時針對CD-19 CAR對T細胞進行染色以評估表面表現且隨後與A20 Fluc目標細胞共同培養。隨後,在將T細胞與目標細胞共同培養之後24小時針對Fluc+ A20細胞之細胞毒性殺滅評估分析。
如
圖 65A、
圖 65B、
圖 65C及
圖 66中所見,獨特IRES能夠增加T細胞表現CAR蛋白之頻率及細胞表面上之CAR表現量。CAR蛋白之表現頻率及細胞表面上之CAR表現量增加引起抗腫瘤反應改善。
實例 69
原代人類
T
細胞中由環狀
RNA
構築體表現之胞溶質蛋白及表面蛋白。
環狀RNA構築體含有編碼螢光胞溶質報導體或表面抗原報導體之序列。螢光報導體包括綠色螢光蛋白、mCitrine、mWasabi、Tsapphire。表面報導體包括CD52及Thy1.1
bio。用抗CD3/抗CD28抗體活化原代人類T細胞,且在活化後6天用含有報導體序列之環狀RNA電穿孔。在電穿孔後24小時收取T細胞且經由流動式細胞測量術進行分析。用市售抗體(例如Biolegend、Miltenyi及BD)染色表面抗原。
如
圖 67A及
圖 67B中所見,胞溶質蛋白及表面蛋白可在原代人類T細胞中由編碼蛋白質之環狀RNA表現。
實例 70
含有獨特
IRES
序列之環狀
RNA
具有相比於線性
mRNA
改善之轉譯表現。
環狀RNA構築體含有獨特IRES以及用於螢火蟲螢光素酶(FLuc)之表現序列。
富集來自2個供體之人類T細胞且用抗CD3/抗CD28抗體刺激。在增殖若干天之後,收取經活化T細胞且用等莫耳之表現FLuc有效負載物之mRNA或環狀RNA電穿孔。研究包括衍生自山羊脊病毒、姬鼠小核糖核酸病毒及帕拉博病毒之IRES序列的各種IRES序列以評估7天中有效負載物表現之表現量及持久性。在7天中,用Promega Brightglo溶解T細胞以評估生物發光。
如
圖 68C、
圖 68D、
圖 68E、
圖 68F及
圖 68G中所示,與線性mRNA相比,IRES在環狀RNA內之存在可使胞溶質蛋白之轉譯及表現增加數個數量級且可改善表現。發現此種情況在多個人類T細胞供體中一致。
實例 71
實例
71A
:
LNP-
編碼抗
CD19
之環狀
RNA
介導
K562
細胞之人類
T
細胞殺滅。
環狀RNA構築體含有編碼抗CD19抗體之序列。隨後,將環狀RNA構築體囊封於脂質奈米粒子(LNP)內。
用抗CD3/抗CD28刺激人類T細胞且保持增殖多至6天。在第6天,將LNP-環狀RNA及ApoE3 (1 μg/mL)與T細胞共同培養以介導轉染。24小時後,用200 ng編碼抗CD19抗體之環狀RNA電穿孔Fluc+ K562細胞且稍後在第7天共同培養。在共同培養後48小時,經由Fluc表現針對K562細胞之CAR表現及細胞毒性殺滅評估分析。
如
圖 69A及
圖 69B中所示,存在自LNP介導之CAR活體外遞送至T細胞進行之抗CD19 CAR之T細胞表現及其以特異性抗原依賴性方式溶解經工程改造之K562細胞中之腫瘤細胞之能力。
實例
71B
:
LNP-
編碼抗
BCMA
抗體之環狀
RNA
介導
K562
細胞之人類
T
細胞殺滅。
環狀RNA構築體含有編碼抗BCMA抗體之序列。隨後,將環狀RNA構築體囊封於脂質奈米粒子(LNP)內。
用抗CD3/抗CD28刺激人類T細胞且保持增殖多至6天。在第6天,將LNP-環狀RNA及ApoE3 (1 μg/mL)與T細胞共同培養以介導轉染。24小時後,用200 ng編碼抗BCMA抗體之環狀RNA電穿孔Fluc+ K562細胞且稍後在第7天共同培養。在共同培養後48小時,經由Fluc表現針對K562細胞之CAR表現及細胞毒性殺滅評估分析。
如
圖 69B中所示,存在自LNP介導之CAR活體外遞送至T細胞進行之BCMA CAR之T細胞表現及其以特異性抗原依賴性方式溶解經工程改造之K562細胞中之腫瘤細胞之能力。
實例 72
抗
CD19 CAR T
細胞展現活體外抗腫瘤活性。
用抗CD3/抗CD28活化人類T細胞且用200 ng表現抗CD19 CAR之環狀RNA電穿孔一次。將經電穿孔之T細胞與FLuc+ Nalm6目標細胞及非目標Fluc+K562細胞共同培養以評估CAR介導之殺滅。在共同培養後24小時之後,溶解T細胞且檢驗由目標細胞及非目標細胞進行之殘餘FLuc表現以評估總計8天中之表現及表現穩定性。
如
圖 70A及
圖 70B中所示,T細胞以特異性抗原依賴性方式表現環狀RNA CAR構築體。結果亦表明與編碼CAR之線性mRNA相比改善之編碼CAR之環狀RNA的細胞毒性以及功能表面受體之遞送。
實例 73
ApoE3
介導之環狀
RNA
之有效
LNP
轉染
用抗CD3/抗CD28刺激人類T細胞且保持增殖多至6天。在第6天,在存在或不存在ApoE3 (1 µg/mL)之情況下將脂質奈米粒子(LNP)及表現綠色螢光蛋白溶液之環狀RNA與T細胞共同培養。24小時後,將T細胞針對活/死T細胞染色,且在流式細胞儀上分析活T細胞之GFP表現。
如
圖 71A、
圖 71B、
圖 71C、
圖 71D及
圖 71E中所示,有效LNP轉染可由經活化T細胞上之ApoE3介導,接著為顯著有效負載物表現。在多個供體中展現此等結果。
實例 74
實例
74A
:
脂質奈米粒子調配程序
可使用Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments有限公司,Malvern,Worcestershire,UK)以測定含轉移媒劑組合物之測定粒度之1×PBS及測定ζ電位之15 mM PBS的粒度、多分散性指數(PDI)及ζ電位。
可使用紫外線可見光譜法以測定轉移媒劑組合物中之治療劑及/或預防劑(例如RNA)之濃度。將100 μL含經稀釋調配物之1×PBS添加至900 μL甲醇與氯仿之4:1 (v/v)混合物中。在混合後,在DU 800分光光度計(Beckman Coulter,Beckman Coulter公司,Brea,CA)上記錄例如在230 nm與330 nm之間的溶液之吸光度譜。可基於組合物中所使用之治療劑及/或預防劑之消光係數及在例如260 nm之波長下之吸光度與在例如330 nm之波長下之基線值之間的差異來計算轉移媒劑組合物中之治療劑及/或預防劑的濃度。
對於包括RNA之轉移媒劑組合物,可使用QUANT-IT™ RIBOGREEN® RNA分析(Invitrogen Corporation Carlsbad,CA)以評估轉移媒劑組合物對RNA之囊封。將樣本在TE緩衝溶液(10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA,pH 7.5)中稀釋至大致5 μg/mL或1 μg/mL之濃度。將50 μL經稀釋樣本轉移至聚苯乙烯96孔盤中,且將50 μL TE緩衝液或50 μL之2%-4% Triton X-100溶液添加至孔中。將盤在37℃溫度下培育15分鐘。將RIBOGREEN®試劑在TE緩衝液中1:100或1:200稀釋,且將100 μL此溶液添加至各孔中。可使用螢光盤讀取器(Wallac Victor 1420多標記計數器;Perkin Elmer,Waltham,MA)量測在例如約480 nm之激發波長及例如約520 nm之發射波長下之螢光強度。自樣本中之各者之螢光值減去空白試劑之螢光值,且藉由將完整樣本(不添加Triton X-100)之螢光強度除以破裂樣本(由添加Triton X-100造成)之螢光值來測定游離RNA百分比。
實例
74B
:
用於
62:4:33:1
之可離子化脂質
:DOPE:
膽固醇
:DSPE-PEG(2000)
調配物比率之
RNA
囊封、總通量及活體外表現百分比。
使用呈62:4:33:1 mol%之可離子化脂質:DOPE:膽固醇:DSPE-PEG(2000)調配物比率之脂質10a-27、10a-26、10a-46或10a-45調配脂質奈米粒子,且以4.5之脂質-氮氣與磷酸酯比(N:P)囊封RNA分子。RNA表現存在於所有調配物中。脾內存在較大總通量及表現百分比,分別如
圖 72A及
圖 72B中所示。
調配物 | 可離子化脂質 | 輔助脂質 | PEG- 脂質 | 可離子化脂質 : 輔助脂質 : 膽固醇 :PEG- 脂質 (mol%) | Z- 平均值 (nm) | PDI | RNA 囊封效率 (%) |
10a-27 (4.5D) | 脂質10a-27 | DOPE | DSPE-PEG(2000) | 62:4:33:1 | 71 | 0.02 | 94 |
10a-26 (4.5D) | 脂質10a-26 | DOPE | DSPE-PEG(2000) | 62:4:33:1 | 71 | 0.04 | 92 |
10a-46 (4.5D) | 脂質10a-26 | DOPE | DSPE-PEG(2000) | 62:4:33:1 | 110 | 0.1 | 93 |
10a-45 (4.5D) | 脂質10a-25 | DOPE | DSPE-PEG(2000) | 62:4:33:1 | 157 | 0.13 | 83 |
實例
74C
:
用於
50:10:38.5:1.5
之可離子化脂質
:DOPE:
膽固醇
:DMG-PEG(2000)
調配物比率之
RNA
囊封、總通量及活體外表現百分比。
使用呈50:10:38.5:1.5 mol%之可離子化脂質:DOPE:膽固醇:DMG-PEG(2000)調配物比率之脂質10a-46或10a-45調配脂質奈米粒子,且以5.7之脂質-氮氣與磷酸酯比(N:P)囊封RNA分子。RNA表現存在於所有調配物中。脾內存在較大總通量及表現百分比,分別如
圖 72C及
圖 72D中所示。
調配物 | 可離子化脂質 | 輔助脂質 | PEG- 脂質 | 可離子化脂質 :DOPE: 膽固醇 :PEG- 脂質 (mol %) | Z- 平均值 (nm) | PDI | RNA 囊封效率 (%) |
10a-45 (5.7A) | 脂質10a-45 | DOPE | DMG-PEG(2000) | 50:10:38.5:1.5 | 74 | 0.04 | 95 |
10a-46 (5.7A) | 脂質10a-46 | DOPE | DMG-PEG(2000) | 50:10:38.5:1.5 | 84 | 0.04 | 96 |
實例 74D : 用於 50:10:38.5:1.5 之可離子化脂質 :DOPE: 膽固醇 :DMG-PEG(2000) 調配物比率或用於 35:16:46.5:2.5 之可離子化脂質 :DSPC: 膽固醇 :C
14-PEG (2000)
調配物比率之 RNA 囊封、總通量及活體外表現百分比。
使用呈50:10:38.5:1.5 mol%之可離子化脂質:DOPE:膽固醇:DMG-PEG(2000)調配物比率或呈35:16:46.5:2.5 mol%之可離子化脂質:DSPC:膽固醇:C
14-PEG (2000)調配物比率之脂質10a-45或10a-46調配脂質奈米粒子,且以5.7或4.5之脂質-氮氣與磷酸酯比(N:P)囊封RNA分子。RNA表現存在於所有調配物中。脾內存在較大總通量及表現百分比,分別如
圖 72E及
圖 72F中所示。
調配物 | 可離子化脂質 | 輔助脂質 | PEG- 脂質 | 可離子化脂質 : 輔助脂質 : 膽固醇 : PEG- 脂質 (mol %) | Z- 平均值 (nm) | PDI | RNA 囊封效率 (%) |
10a-45 DSPC (5.7E) | 脂質10a-45 | DSPC | C 14-PEG(2000) | 35:16:46.2.5 | 56 | 0.22 | 94 |
10a-46 DSPC (5.7E) | 脂質10a-46 | DSPC | C 14-PEG(2000) | 35:16:46.5:2.5 | 68 | 0.02 | 95 |
10a-46 (4.5A) | 脂質10a-46 | DOPE | DMG-PEG(2000) | 50:10:38.5:1.5 | 91 | 0.13 | 93 |
10a-46 (5.7A) | 脂質10a-46 | DOPE | DMG-PEG(2000) | 50:10:38.5:1.5 | 76 | 0.06 | 93 |
實例
74E
:
用於
62:4:33:1
之可離子化脂質
:DOPE:
膽固醇
:DSPE-PEG(2000)
調配物比率或用於
50:10:38.5:1.5
之可離子化脂質
:DSPC:
膽固醇
:DMG-PEG(2000)
調配物比率之
RNA
囊封、總通量及活體外表現百分比。
使用呈62:4:33:1 mol%之可離子化脂質:DOPE:膽固醇:DSPE-PEG(2000)調配物比率(以4.5之N:P比囊封RNA分子)或50:10:38.5:1.5 mol%之可離子化脂質:DSPC:膽固醇:DMG-PEG(2000)調配物比率(以5.7之N:P比囊封RNA分子)之脂質10a-26或10a-27調配脂質奈米粒子。RNA表現存在於所有調配物中。脾內存在較大總通量及表現百分比,分別如
圖 72G及
圖 72H中所示。
調配物 | 可離子化脂質 | 輔助脂質 | PEG- 脂質 | 可離子化脂質 : 輔助脂質 : 膽固醇 : PEG- 脂質 (mol %) | Z- 平均值 (nm) | PDI | 囊封效率 (EE) (%) |
10a-27 (4.5D) | 脂質10a-27 | DOPE | DSPE-PEG(2000) | 62:4:33:1 | 82 | 0.06 | 94 |
10a-26 (4.5D) | 脂質10a-26 | DOPE | DSPE-PEG(2000) | 62:4:33:1 | 68 | 0.08 | 91 |
10a-27 DSPC (5.7A) | 脂質10a-27 | DSPC | DMG-PEG(2000) | 50:10:38.5:1.5 | 79 | 0.06 | 96 |
10a-26 DSPC (5.7A) | 脂質10a-26 | DSPC | DMG-PEG(2000) | 50:10:38.5:1.5 | 79 | 0.05 | 93 |
實例
74F
:
用於
50:10:38.5:1.5
之可離子化脂質
:DOPE:
膽固醇
:DMG-PEG(2000)
調配物比率之
RNA
囊封、總通量及活體外表現百分比。
使用呈50:10:38.5:1.5 mol%之可離子化脂質:DSPC:膽固醇:DMG-PEG(2000)調配物比率之脂質10a-26、10a-27或10a-130及/或脂質3-III-1 (由
表示)調配脂質奈米粒子,且以5.7之N:P比囊封RNA分子。RNA表現存在於所有調配物中。肝內存在較大總通量及表現百分比,分別如
圖 72I及
圖 72J中所示。
亦計算TNS及粒子之pK
a。將5 µL之60 µg/mL 2-(對甲苯胺基)萘-6-磺酸(TNS)及5 µL之30 µg RNA/mL脂質奈米粒子與在pH 2-12範圍內之HEPES緩衝液一起添加至孔中。隨後,在室溫下振盪混合物5分鐘,且使用盤讀取器讀取螢光(激發322 nm,發射431 nm)。計算螢光信號之反曲點以測定粒子之pK
a。
調配物 | 可離子化脂質 | 輔助脂質 | PEG- 脂質 | 可離子化脂質 : 輔助脂質 : 膽固醇 :PEG- 脂質 (mol %) | Z- 平均值 | PDI | EE (%) | 濃度 (µg/mL) | pKa |
10a-27/III-1 (5.7A) | 脂質10a-27 /脂質3-III-1 3:1比 | DOPE | DMG-PEG(2000) | 50:10:38.5:1.5 | 74 | 0 | 96 | 55.8 | 7.4 |
10a-27III-1 (5.7A) | 脂質10a-27 /脂質3-III-11:3比 | DOPE | DMG-PEG(2000) | 50:10:38.5:1.5 | 85 | 0.1 | 93 | 51.9 | 6.3 |
10a-26/III-1 (5.7A) | 脂質10a-26 /脂質3-III-13:1比 | DOPE | DMG-PEG(2000) | 50:10:38.5:1.5 | 87 | 0.1 | 94 | 51.7 | 6.8 |
10a-26/III-1 (5.7A) | 脂質10a-26 /脂質3-III-11:3比 | DOPE | DMG-PEG(2000) | 50:10:38.5:1.5 | 97 | 0.1 | 90 | 53.1 | 6.2 |
10a-130 (5.7A) | 脂質10a-130 | DOPE | DMG-PEG(2000) | 50:10:38.5:1.5 | 60 | 0.1 | 89 | 53.8 | 6.7 |
實例
74G
:
用於
62:4:33:1
之可離子化脂質
:DOPE:
膽固醇
:DSPE-PEG(2000)
調配物比率或用於
50:10:38.5:1.5
之可離子化脂質
:DSPC:
膽固醇
:DMG-PEG(2000)
調配物比率之
RNA
囊封、總通量及活體外表現百分比。
使用呈62:4:33:1 mol%之可離子化脂質:DOPE:膽固醇:DSPE-PEG(2000)調配物比率(以4.5之N:P比囊封RNA分子)或50:10:38.5:1.5 mol%之可離子化脂質:DOPE:膽固醇:DMG-PEG(2000)調配物比率(以5.7之N:P比囊封RNA分子)之脂質10a-139調配脂質奈米粒子。RNA表現存在於所有調配物中。肝內存在較大總通量及表現百分比,分別如
圖 72K及
圖 72L中所示。
實例 75
調配物 | 可離子化脂質 | 輔助脂質 | PEG- 脂質 | 可離子化脂質 : 輔助脂質 : 膽固醇 :PEG- 脂質 (mol%) | Z- 平均值 (nm) | PDI | EE (%) |
10a-139 (4.5D) | 脂質10a-139 | DOPE | DSPE-PEG(2000) | 62:4:33:1 | 93 | 0.01 | 79 |
10a-139 (5.7A) | 脂質10a-139 | DSPC | DMG-PEG(2000) | 50:10:38.5:1.5 | 122 | 0.02 | 95 |
此實例說明活體外SARS-CoV2棘蛋白表現之表現。使用MessengerMax轉染劑將編碼SARS-CoV2穩定型棘蛋白之環狀RNA轉染至293細胞中。在轉染後24小時,用CR3022抗棘一級抗體及經APC標記之二級抗體染色293細胞。
圖 73A展示由活體外轉錄反應產生之大致4.5 kb編碼SARS-Cov2穩定型棘蛋白之RNA的環化效率。
圖 73B及
圖 73C展示相對於經模擬物轉染之細胞,在用MessengerMax轉染劑進行環狀RNA轉染之後293細胞上之SARS-CoV2穩定型棘蛋白表現。
圖 77A及
圖 77B展示在使用MessengerMax轉染劑進行一組含有可變IRES序列、經密碼子最佳化之編碼區及穩定SARS-CoV2棘蛋白之環狀RNA轉染之後293細胞上之SARS-CoV2穩定型棘蛋白細胞表現百分比及gMFI。
圖 77C展示MFI與百分比之間的關係。
實例 76
此實例展示在IV注射0.2 mg/kg囊封於脂質奈米粒子調配物中之環狀RNA製備物之後的活體內細胞介素反應。用作為前驅體RNA起始劑之GTP及剪接核苷酸合成之環狀RNA剪接反應物鼓動比經純化環狀RNA及線性m1ψ-mRNA大之細胞介素反應,此係歸因於在剪接反應物中存在三磷酸化5'端。量測在靜脈內注射經LNP調配之環狀RNA製備物之後6小時抽取之血液的IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p70、RANTES、TNFα含量。注射PBS之小鼠用作對照。
如
圖 74中所見,用作為前驅體RNA起始劑之GTP及剪接核苷酸合成之環狀RNA剪接反應物鼓動比經純化環狀RNA及線性m1ψ-mRNA大之細胞介素反應,此係歸因於在剪接反應物中存在三磷酸化5'端。
實例 77
此實例說明不同劑量之含有環狀RNA之脂質奈米粒子之肌內遞送。向小鼠給藥0.1 µg、1 µg或10 µg調配於脂質奈米粒子中之環狀RNA。在注射螢光素之後6小時進行全身IVIS成像(
圖 75A及
圖 75B)。在24小時進行離體IVIS成像。肝、四頭肌及腓之通量值示於
圖 75C中。
圖 76B及
圖 76C表明環狀RNA表現存在於小鼠肌肉組織中。
實例 78
此實例說明LNP調配物中之多個環狀RNA之表現。編碼hEPO或fLuc之環狀RNA構築體係在單一及混合集合之LNP中給藥。測定血清中之hEPO濃度(
圖 76A)及利用IVIS成像之總通量(
圖 76B)。結果表明,環狀RNA hEPO或fLuc構築體有效地單獨地調配或共同調配經表現蛋白質。
實例 79
實例
79A
:
肝細胞塗鋪及培養
將原代人類肝細胞(PHH)、原代小鼠肝細胞(PMH)、原代食蟹獼猴肝細胞(PCH)解凍且再懸浮於肝細胞解凍培養基(Xenotech,目錄號K8600/K8650)中,接著進行離心。丟棄上清液,且將所集結之細胞再懸浮於肝細胞平板培養基(Xenotech,目錄號K8200)中。經由血球計計數細胞,且將其以對於PHH 25,000個細胞/孔、對於PMH 25,000個細胞/孔及對於PCH 50,000個細胞/孔之密度塗鋪於100 μL塗鋪培養基中之經Bio-coat膠原蛋白-I塗佈之96孔盤上。使所塗鋪之細胞在組織培養培育箱中在37℃及5% CO
2氛圍下沈降且黏附6小時。在培育之後,檢查細胞之單層形成,之後抽吸塗鋪培養基且用100 μL培養基(Xenotech, 目錄號K8300)置換。每24小時置換培養基達實驗持續時間。
實例
79B
:
活體外篩檢原代人類、小鼠及食蟹獼猴肝細胞中之經
LNP
調配之編碼螢火蟲螢光素酶之環狀
RNA
產生包含TIE及編碼螢火蟲螢光素酶之編碼元件的環狀RNA構築體且將其轉染至LNP中。將各種濃度之用環化RNA (oRNA)調配之LNP稀釋於補充有3%胎牛血清(FBS)之肝細胞培養基(ThermoFisher,目錄號A3160401)中。自細胞抽吸培養基,之後將100 μL LNP/FBS/培養基混合物添加至細胞中。
在原代人類(
圖 90A)、小鼠(
圖 90B)及食蟹獼猴(
圖 90C)肝細胞中偵測到螢光素酶活性。在轉染後24小時,自培育箱移除盤且使其平衡至室溫達15 min。將100 µL體積之螢火蟲螢光素酶一步輝光分析工作溶液(Pierce,目錄號16196)添加至各孔中。將盤置於微量盤振盪器(ThermoFisher,目錄號S72050)上且在300 rpm下混合3 min。混合後,使盤在室溫下培育10 min。使用Varioskan或Bio-Tek Cytation5儀器讀取發光。
如
圖 90A、
圖 90B及
圖 90C中所見,當用LNP活體外轉染時含有TIE之環狀RNA能夠以劑量依賴性方式驅動來自多個物種之原代肝細胞中之螢火蟲螢光素酶蛋白質表現。
實例
79C
:
活體外篩檢多個原代人類肝細胞供體中之經
LNP
調配之編碼螢火蟲螢光素酶之環狀
RNA
產生包含TIE及編碼螢火蟲螢光素酶之編碼元件的環狀RNA構築體且將其轉染至LNP中。將各種濃度之用環化RNA (oRNA)調配之LNP稀釋於補充有3%胎牛血清(FBS)之肝細胞培養基(ThermoFisher,目錄號A3160401)中。自細胞抽吸培養基,之後將100 μl LNP/FBS/培養基混合物添加至細胞中。
在原代人類(
圖 91A)、小鼠(
圖 91B)及食蟹獼猴(
圖 91C)肝細胞中偵測到螢光素酶活性。在轉染後24小時,自培育箱移除盤且使其平衡至室溫達15 min。將100 µL體積之螢火蟲螢光素酶一步輝光分析工作溶液(Pierce,目錄號16196)添加至各孔中。將盤置於微量盤振盪器(ThermoFisher,目錄號S72050)上且在300 rpm下混合3 min。混合後,使盤在室溫下培育10 min。使用Varioskan或Bio-Tek Cytation5儀器讀取發光。
如
圖 91A、
圖 91B及
圖 91C中所見,當用LNP活體外轉染時含有TIE之環狀RNA能夠以劑量依賴性方式驅動來自多個人類供體之原代肝細胞中之螢火蟲螢光素酶蛋白質表現。
實例 80
多個人類細胞模型中用編碼
GFP
之
環狀
RNA
調配之
LNP
之
活體外表現。
產生包含TIE及編碼GFP蛋白之編碼元件的環狀RNA構築體。用環狀RNA構築體調配LNP。隨後,將各種濃度之含有環狀RNA構築體之LNP稀釋於補充有3%胎牛血清(FBS)之肝細胞培養基(ThermoFisher,目錄號A3160401)中。自細胞抽吸培養基,之後將100 μl LNP/FBS/培養基混合物添加至細胞中。
如先前所描述用經LNP調配之oRNA轉染HeLa (人類子宮頸腺癌;ATCC,目錄號CCL-2)、HEK293 (人類胎腎;ATCC,目錄號CRL-1573)及HUH7 (人類肝細胞癌;JCRB,目錄號JCRB0403)。在轉染後二十四小時,移除培養基且以胰蛋白酶處理細胞。用補充有10% FBS之PBS中和經胰蛋白酶處理之細胞,收取,且轉移至管。將管離心以集結細胞且抽吸上清液。在溶解之前,將集結粒儲存於-80℃下。為了溶解,將細胞在冰上解凍且用每孔100 μL RIPA緩衝液(Boston Bio Products,目錄BP-115)加新鮮添加之1 mM DTT及250 U/mL Benzonase (EMD Millipore,目錄號71206-3)以及由完全蛋白酶抑制劑混合液(Sigma,目錄號11697498001)組成之蛋白酶抑制劑混合物溶解。將細胞保持在冰上30分鐘,此時添加NaCl (1 M最終濃度)。使細胞溶解物充分混合且保留於冰上30 min。將全細胞提取物(WCE)離心以集結碎片。使用Bradford分析(Bio-Rad,目錄號500-0001)來評估溶解物之蛋白質含量。根據製造商方案完成Bradford分析程序。在使用之前,將提取物儲存於-20℃下。執行西方墨點法以評估GFP蛋白質含量。將全細胞提取物溶解物與勒姆利緩衝液(Laemmli buffer)混合且在95℃下變性10 min。根據製造商方案使用NuPage系統於4-12% Bis-Tris凝膠(ThermoFisher,目錄號NP0335BOX)上運行西方墨點法,接著濕轉移至0.45 µm硝化纖維素膜(ThermoFisher,目錄號LC2001)上。轉移之後,用水徹底沖洗膜且用麗春紅S (Ponceau S)溶液(Boston Bio Products,目錄號ST-180)染色以確認完成及甚至轉移。在室溫下在實驗室搖盪器上使用含5%乳粉之TBS封閉墨點30分鐘。用1× TBST (Boston BioProducts,目錄號IBB-180)沖洗墨點,且用小鼠加dylight 680標籤之抗GFP單株抗體(ThermoFisher,目錄號MA515256D680)以1:1,000於1× TBST中探測。以1:4,000在1× TBST中使用抗β-肌動蛋白或GAPDH作為內參考物(ThermoFisher,目錄號AM4302/AM4300)且同時與GFP一級抗體一起培育。將墨點密封在包中且在4℃下保持於實驗室搖盪器上隔夜。在培育之後,在1× TBST中沖洗墨點3次,各持續5分鐘,且用小鼠二級抗體(ThermoFisher,目錄號PI35519)各自以1:25,000在1× TBST中在室溫下探測30分鐘。在培育之後,在1× TBST中沖洗墨點3次,各持續5分鐘。目測墨點且使用Licor Odyssey系統加以分析。
如
圖 92中所示,當用LNP活體外轉染時含TIE之環狀RNA能夠以劑量依賴性方式在多樣人類細胞株(例如HeLa、HEK293及HUH7細胞)中表現GFP蛋白。
實例 81
原代人類肝細胞中
用
編碼
GFP
之
環狀
RNA
調配之
LNP
之
活體外表現。
產生包含TIE及編碼GFP蛋白之編碼元件的環狀RNA構築體。將各種濃度之含有環化RNA (oRNA)之LNP稀釋於補充有3%胎牛血清(FBS)之肝細胞培養基(ThermoFisher,目錄號A3160401)中。自細胞抽吸培養基,之後將100 μL LNP/FBS/培養基混合物添加至細胞中。
將原代人類肝細胞(PHH)解凍且再懸浮於肝細胞解凍培養基(Xenotech,目錄號K8600/K8650)中,接著離心。丟棄上清液,且將所集結之細胞再懸浮於肝細胞平板培養基(Xenotech,目錄號K8200)中。經由血球計計數細胞,且將其以對於PHH 25,000個細胞/孔、對於PMH 25,000個細胞/孔及對於PCH 50,000個細胞/孔之密度塗鋪於100 μl塗鋪培養基中之經Bio-coat膠原蛋白-I塗佈之96孔盤上。使所塗鋪之細胞在組織培養培育箱中在37℃及5% CO
2氛圍下沈降且黏附6小時。在培育之後,檢查細胞之單層形成,之後抽吸塗鋪培養基且用100 μL培養基(Xenotech, 目錄號K8300)置換。每24小時置換培養基達實驗持續時間。
如先前所描述用經LNP調配之oRNA轉染原代人類肝細胞。在轉染後二十四小時,移除培養基且以胰蛋白酶處理細胞。用補充有10% FBS之PBS中和經胰蛋白酶處理之細胞,收取,且轉移至管。將管離心以集結細胞且抽吸上清液。在溶解之前,將集結粒儲存於-80℃下。為了溶解,將細胞在冰上解凍且用每孔100 μL RIPA緩衝液(Boston Bio Products,目錄BP-115)加新鮮添加之1 mM DTT及250 U/ml Benzonase (EMD Millipore,目錄號71206-3)以及由完全蛋白酶抑制劑混合液(Sigma,目錄號11697498001)組成之蛋白酶抑制劑混合物溶解。將細胞保持在冰上30分鐘,此時添加NaCl (1 M最終濃度)。使細胞溶解物充分混合且保留於冰上30 min。將全細胞提取物(WCE)離心以集結碎片。使用Bradford分析(Bio-Rad,目錄號500-0001)來評估溶解物之蛋白質含量。根據製造商方案完成Bradford分析程序。在使用之前,將提取物儲存於-20℃下。執行西方墨點法以評估GFP蛋白質含量。將全細胞提取物溶解物與勒姆利緩衝液混合且在95℃下變性10 min。根據製造商方案使用NuPage系統於4-12% Bis-Tris凝膠(ThermoFisher,目錄號NP0335BOX)上運行西方墨點法,接著濕轉移至0.45 µm硝化纖維素膜(ThermoFisher,目錄號LC2001)上。轉移之後,用水徹底沖洗膜且用麗春紅S溶液(Boston Bio Products,目錄號ST-180)染色以確認完成及甚至轉移。在室溫下在實驗室搖盪器上使用含5%乳粉之TBS封閉墨點30分鐘。用1× TBST (Boston BioProducts,目錄號IBB-180)沖洗墨點,且用小鼠加dylight 680標籤之抗GFP單株抗體(ThermoFisher,目錄號MA515256D680)以1:1,000於1× TBST中探測。以1:4,000在1× TBST中使用抗β-肌動蛋白或GAPDH作為內參考物(ThermoFisher,目錄號AM4302/AM4300)且同時與GFP一級抗體一起培育。將墨點密封在包中且在4℃下保持於實驗室搖盪器上隔夜。在培育之後,在1× TBST中沖洗墨點3次,各持續5分鐘,且用小鼠二級抗體(ThermoFisher,目錄號PI35519)各自以1:25,000在1× TBST中在室溫下探測30分鐘。在培育之後,在1× TBST中沖洗墨點3次,各持續5分鐘。目測墨點且使用Licor Odyssey系統加以分析。
如
圖 93中之西方墨點法中所示,當用LNP活體內轉染時含有TIE之環狀RNA能夠成功地編碼原代人類肝細胞中之GFP蛋白。
實例 82
使用脂染胺之小鼠肌母細胞及原代人類骨骼肌肌母細胞中編碼螢火蟲螢光素酶之環狀
RNA
中之螢火蟲螢光素酶活體外表現。
環狀RNA構築體包含TIE及編碼螢火蟲螢光素酶蛋白之編碼元件。
將原代人類骨骼肌(HSkM)細胞(Lonza,目錄號20TL356514)在37℃水浴中解凍且以建議接種密度(3,000至5,000/cm
2)塗鋪在SkGM-2 BulletKit生長培養基(Lonza,目錄號CC-3245)中,且使其生長隔夜。使用ReagentPack繼代培養物試劑(Lonza,目錄號CC-5034)剝離細胞且以建議接種密度塗鋪於組織培養物級96孔盤上,且使其在組織培養培育箱中在37℃及5% CO
2氛圍下生長隔夜或在每2天更換生長培養基之情況下達到70-80%匯合度。
對於一種96孔盤反應,將0.3 µL脂染胺-3000轉染劑(Lipo3K) (ThermoFisher,目錄號L3000015)與5 µL Opti-MEM還原型血清培養基(ThermoFisher,目錄號51985091)混合。在單獨管中,根據反應,將螢火蟲螢光素酶(f.luc) oRNA (10-200 ng)與5 µL Opti-MEM及0.2 µL P3000TM增強劑試劑(ThermoFisher,目錄號L3000015)合併。將等體積之Lipo3K/Opti-MEM混合物與oRNA/Opti-MEM混合物合併且在室溫下培育15 min。將Lipo3K/oRNA混合物添加至待轉染之各孔中且在37℃及5% CO
2氛圍下置於組織培養培育箱中24小時。
24小時後,自培育箱移除轉染盤且使其平衡至室溫達15分鐘。將100 µL體積之螢火蟲螢光素酶一步輝光分析工作溶液(Pierce,目錄號16196)添加至各孔中。將盤置於微量盤振盪器(ThermoFisher,目錄號S72050)上且在300 rpm下混合3分鐘。混合後,使盤在室溫下培育10分鐘。使用Varioskan或Bio-Tek Cytation5儀器讀取發光。
如
圖 94A及
圖 94B中所示,當用脂染胺活體外轉染時包含TIE之環狀RNA能夠以劑量依賴性方式驅動來自不同物種之肌母細胞中之螢火蟲螢光素酶蛋白質表現。
實例 83
分化原代人類骨骼肌肌管中編碼螢火蟲螢光素酶之環狀
RNA
中之螢火蟲螢光素酶之活體外表現
環狀RNA構築體包含TIE及編碼螢火蟲螢光素酶蛋白之編碼元件。
將原代人類骨骼肌(HSkM)細胞(Lonza,目錄號20TL356514)在37℃水浴中解凍且以建議接種密度(3,000至5,000/cm
2)塗鋪在SkGM-2 BulletKit生長培養基(Lonza,目錄號CC-3245)中,且使其生長隔夜。使用ReagentPack繼代培養物試劑(Lonza,目錄號CC-5034)剝離細胞且以建議接種密度塗鋪於組織培養物級96孔盤上,且使其在組織培養培育箱中在37℃及5% CO
2氛圍下生長隔夜或在每2天更換生長培養基之情況下達到70-80%匯合度。一旦細胞達到70-80%匯合度,則移除生長培養基,在1×PBS (Gibco,目錄號10010023)中洗滌細胞兩次,且更換為由F-10 (1X) (Gibco,目錄號11550-043)組成、補充有2%馬血清(Gibco,目錄號26050088)及1% Pen-Strep (Gibco,目錄號15140-122)之分化培養基。每天更換培養基,持續5至6天直至幾乎所有肌母細胞融合以形成肌管。
對於一種96孔盤反應,將0.3 µL脂染胺-3000轉染劑(Lipo3K) (ThermoFisher,目錄號L3000015)與5 µL Opti-MEM還原型血清培養基(ThermoFisher,目錄號51985091)混合。在單獨管中,根據反應,將螢火蟲螢光素酶(f.luc) oRNA (10-200 ng)與5 µL Opti-MEM及0.2 µL P3000TM增強劑試劑(ThermoFisher,目錄號L3000015)合併。將等體積之Lipo3K/Opti-MEM混合物與oRNA/Opti-MEM混合物合併且在室溫下培育15 min。將Lipo3K/oRNA混合物添加至待轉染之各孔中且在37℃及5% CO
2氛圍下置於組織培養培育箱中24小時。
24小時後,自培育箱移除轉染盤且使其平衡至室溫達15分鐘。將100 µL體積之螢火蟲Luc一步輝光分析工作溶液(Pierce,目錄號16196)添加至各孔中。將盤置於微量盤振盪器(ThermoFisher,目錄號S72050)上且在300 rpm下混合3分鐘。混合後,使盤在室溫下培育10分鐘。使用Varioskan或Bio-Tek Cytation5儀器讀取發光。
如
圖 95A及
圖 95B中所示,當用脂染胺活體外轉染時包含TIE之環狀RNA能夠以劑量依賴性方式驅動多個人類供體中貫穿分化狀態之原代肌肉細胞(例如在肌母細胞及分化肌管中)中之螢火蟲螢光素酶蛋白質表現。
實例 83
含有
TIE
之
環狀
RNA
之游離活體外轉譯
完成游離兔網狀紅血球活體外轉譯分析(Promega,目錄號L4540)以由各種RNA模板表徵蛋白質產物。在分析中使用線性mRNA及環狀oRNA模板,且根據製造商方案裝配反應組分。在分析之前,使RNA模板在65℃下變性3分鐘且緊接著在冰上冷卻。將所有反應組分裝配在冰上。將作為完全胺基酸混合物之Flexi兔網狀紅血球套組組分(Promega,目錄號L5061)、RNAsin TIEuclease抑制劑(Promega,目錄號N2111)及transcend tRNA (Promega,目錄號L5061)添加至經變性RNA模板中。將反應物渦旋混合且在30℃下培育60分鐘,且隨後置於冰上。
將反應混合物添加至1×樣本緩衝液(ThermoFisher,目錄號NP0007)中且在70℃下加熱15分鐘。將經變性蛋白質樣本裝載至4-12% Bis-Tris凝膠(ThermoFisher,目錄號NPO335BOX)上。完成凝膠電泳,且將凝膠濕轉移至0.45 μm硝化纖維素膜(ThermoFisher,目錄號LC2001)上。轉移後,在新鮮製造之具有0.5% Tween-20之TBS (Boston Bioproducts公司,目錄號IBB-180)中在搖盪之情況下封閉膜1小時。在搖盪之情況下以1:2,500稀釋度將膜與鏈黴抗生物素蛋白-AP (Promega,目錄號V5591)一起培育45 min。用以下四個循環沖洗膜:兩次用TBST且兩次用去離子水,每次沖洗持續1 min。將膜與Western Blue受質(Promega,目錄號S3841)一起培育45分鐘,且在水中沖洗膜且在LICOR Odyssey CLx成像系統上掃描。
如
圖 96A及
圖 96B中所示,包含TIE之環狀RNA能夠驅動游離溶解物中之蛋白質表現,與任何細胞類型無關。
圖 96A繪示由線性或環狀RNA輸入物表現螢火蟲螢光素酶。
圖 96B繪示與野生型天然序列(WT)相比利用不同密碼子最佳化(co)途徑之人類及小鼠ATP7B蛋白之表現。表現ARP7B蛋白之經密碼子最佳化之環狀RNA及表現螢火蟲螢光素酶之環狀RNA為蛋白質全長蛋白質表現提供防護。
實例 84
TIE
選擇方法
鑑別推定TIE以用於基因庫中之序列之活性評估。簡言之,鑑別核糖病毒域及長度大於1 kb之未分類病毒序列。基於推定CDS起始位點及終止位點提取5' UTR及基因間UTR,其中最小長度截止值為250 nt。亦收集反向序列用於負向有義CDS標註。對於預期不含有TIE序列之屬,隨機選擇每個屬之幾個非編碼區。揀選複製品、含> 10 nt重複序列之序列、具有XbaI位點及BamHI位點之序列及低品質序列(非acgt),隨後經由CDHit以對於叢集而言80%序列類似性截止值使序列叢集;選擇來自各叢集之代表性序列用於進一步研究。對於未分類序列或預期含有TIE之序列,選擇所有5' UTR及基因間UTR;揀選複製品、含> 10 nt重複序列之序列、具有XbaI位點及BamHI位點之序列及低品質序列(非acgt),隨後經由CDHit以對於叢集而言95% (低風險,已知IRES)序列類似性截止值使序列叢集;選擇來自各叢集之代表性序列用於進一步研究。對於兩種策略,消除短於300 nt或由於序列複雜性而不能合成之序列。
實例
85
實例
85A
:
原代人類
T
細胞中之
TIE
活性
將含有推定TIE之核酸序列在高斯螢光素酶報導體序列之起始密碼子之前插入環狀RNA (oRNA)構築體中。合成且純化含有TIE之oRNA。將經純化oRNA調配至脂質奈米粒子中。將LNP-oRNA活體外轉染至T細胞中。收取上清液且在轉染後24小時及48小時進行置換,且使用含腔腸素之偵測試劑及光度計測定由oRNA進行之高斯螢光素酶表現。在24小時之較高發光指示較高TIE功能。相對於24小時在48小時之較高發光指示歸因於TIE功能之較高oRNA穩定性。
實例
85B
:
原代人類肝細胞中之
TIE
活性
將含有推定TIE之核酸序列在高斯螢光素酶報導體序列之起始密碼子之前插入環狀RNA (oRNA)構築體中。合成且純化含有TIE之oRNA。將經純化oRNA調配至脂質奈米粒子中。將LNP-oRNA活體外轉染至肝細胞中。收取上清液且在轉染後24小時及48小時進行置換,且使用含腔腸素之偵測試劑及光度計測定由oRNA進行之高斯螢光素酶表現。在24小時之較高發光指示較高TIE功能。相對於24小時在48小時之較高發光指示歸因於TIE功能之較高oRNA穩定性。
實例
85C
:
原代人類肌管中之
TIE
活性
將含有推定TIE之核酸序列在高斯螢光素酶報導體序列之起始密碼子之前插入環狀RNA (oRNA)構築體中。合成且純化含有TIE之oRNA。將經純化oRNA調配至脂質奈米粒子中。將LNP-oRNA活體外轉染至人類肌管中。收取上清液且在轉染後24小時及48小時進行置換,且使用含腔腸素之偵測試劑及光度計測定由oRNA進行之高斯螢光素酶表現。在24小時之較高發光指示較高TIE功能。相對於24小時在48小時之較高發光指示歸因於TIE功能之較高oRNA穩定性。
實例 86
TIE
組織向性
將選定含TIE之oRNA調配至LNP中。將LNP-oRNA轉染至T細胞、肝細胞及肌管中。收取上清液且在轉染後24小時及48小時進行置換,且使用含腔腸素之偵測試劑及光度計測定由oRNA進行之高斯螢光素酶表現。在24小時之較高發光指示較高TIE功能。相對於24小時在48小時之較高發光可指示歸因於TIE功能之較高oRNA穩定性。將細胞類型間的TIE活性進行比較,且標示由TIE組織偏好造成之差異。差異可為展示組織特異性表現及促進增強之轉譯起始、降解或穩定性之TIE接合蛋白的結果。
實例 86
實例
86A
:
TIE
缺失掃描
將選定的自TIE之5'端或3'端具有進行性缺失之TIE序列在高斯螢光素酶報導體序列之起始密碼子之前插入環狀RNA (oRNA)構築體中。合成且純化含有TIE變異體之oRNA。將經純化oRNA調配至脂質奈米粒子中。將LNP-oRNA轉染至人類原代T細胞中。收取上清液且在轉染後24小時及48小時進行置換,且使用含腔腸素之偵測試劑及光度計測定由oRNA進行之高斯螢光素酶表現。在24小時之較高發光指示較高TIE功能。相對於24小時在48小時之較高發光可指示歸因於TIE功能之較高oRNA穩定性。歸因於進行性缺失之表現或穩定性減少鑑別TIE之核心功能單元。
實例
86B
:
TIE
變異體產生及鑑別
使選定的含TIE之oRNA合成質體進行易錯PCR以將隨機突變引入PCR產物中。PCR產物用作用於oRNA合成之模板。將經純化oRNA調配至LNP中且轉染至原代人類T細胞中。在轉染後6、24、48及72小時藉由HPLC自T細胞收取多核糖體溶離份。自多核糖體溶離份提取與各多核糖體溶離份締合之RNA且藉由NGS定序。分析在各時間點富集各多核糖體溶離份之TIE突變以鑑別1)維持或改善TIE之轉譯活性及/或2)改善oRNA穩定性的突變。
實例
86C
:
TIE
單變異體及多變異體驗證
將含有單獨或組合的來自實例6之推定有益TIE突變之核酸序列在高斯螢光素酶報導體序列之起始密碼子之前插入環狀RNA (oRNA)構築體中。合成且純化含有TIE變異體之oRNA。將經純化oRNA調配至脂質奈米粒子中。將LNP-oRNA轉染至人類原代T細胞中。收取上清液且在轉染後24小時及48小時進行置換,且使用含腔腸素之偵測試劑及光度計測定由oRNA進行之高斯螢光素酶表現。在24小時之較高發光指示較高TIE功能。相對於24小時在48小時之較高發光指示歸因於TIE功能之較高oRNA穩定性。
實例 87
實例
87A
:
選擇真核
TIE
選擇真核TIE。使用若干資料庫鑑別推定真核TIE。選定TIE包括長度為40-1578個核苷酸之序列且可含有或可不含有所鑑別之修飾(m6A)位點。
實例
87B
:
含有經修飾核苷酸
(m6A)
之
TIE
將含有推定TIE之核酸序列在高斯螢光素酶報導體序列之編碼區之前插入環狀RNA (oRNA)構築體中。在滴定經修飾核苷酸之情況下合成oRNA。將經純化oRNA調配至脂質奈米粒子中。將LNP-oRNA轉染至T細胞、肝細胞及肌管中。收取上清液且在轉染後24小時及48小時進行置換,且使用含腔腸素之偵測試劑及光度計測定由oRNA進行之高斯螢光素酶表現。在24小時之含有經修飾核苷酸之TIE之較高發光指示修飾對增強之功能的必要性。相對於24小時在48小時之較高發光指示含有經修飾核苷酸之TIE增強oRNA穩定性。
實例 88
經歷氧化及
/
或低氧壓力之細胞中之
TIE
表現
將含有推定TIE之核酸序列在高斯螢光素酶報導體序列之編碼區之前插入環狀RNA (oRNA)構築體中。將經純化oRNA調配至脂質奈米粒子中。用過氧化氫處理肝細胞以誘導氧化壓力或用CoCl
2處理肝細胞以誘導低氧壓力。將LNP-oRNA活體外轉染至肝細胞中(在低氧壓力、氧化壓力或未經處理下)。收取上清液且在轉染後24小時及48小時進行置換,且使用含腔腸素之偵測試劑及光度計測定由oRNA進行之高斯螢光素酶表現。在24小時之較高發光指示較高TIE功能。相對於24小時在48小時之較高發光可指示歸因於TIE功能之較高oRNA穩定性。
實例 89
作為
TIE
之
適體
將含有針對轉譯起始因子(亦即eIF4E、eIF4G、eIF4a)之適體的核酸序列在高斯螢光素酶報導體序列之編碼區之前插入環狀RNA (oRNA)構築體中。將經純化oRNA調配至脂質奈米粒子中。將LNP-oRNA轉染至肝細胞中。收取上清液且在轉染後24小時及48小時進行置換,且使用含腔腸素之偵測試劑及光度計測定由oRNA進行之高斯螢光素酶表現。在24小時之較高發光指示較高TIE功能。相對於24小時在48小時之較高發光可指示歸因於TIE功能之較高oRNA穩定性。
實例 90
串聯
TIE
將病毒、真核及/或適體TIE之選定組合在高斯螢光素酶報導體序列之編碼區之前插入環狀RNA (oRNA)構築體中。在滴定經修飾核苷酸之情況下合成oRNA。將經純化oRNA調配至脂質奈米粒子中。將LNP-oRNA轉染至T細胞、肝細胞及肌管中。收取上清液且在轉染後24小時及48小時進行置換,且使用含腔腸素之偵測試劑及光度計測定由oRNA進行之高斯螢光素酶表現。在24小時之含有多個TIE之構築體之較高發光指示TIE之協同作用。相對於24小時在48小時之較高發光可指示在一個構築體中具有多個TIE增強oRNA穩定性。
實例 91
實例
91A
:
用於增強帽非依賴性轉譯之編碼適體
已知結合至eIF4E、eIF4a及其他轉譯起始子之某些適體藉由迫使蛋白質採取非功能性構形來抑制轉譯。將含有針對轉譯起始因子(亦即eIF4E、eIF4a)之適體的核酸序列在功能TIE及高斯螢光素酶報導體序列之編碼區之前插入環狀RNA (oRNA)構築體中。將經純化oRNA調配至脂質奈米粒子中。將LNP-oRNA轉染至肝細胞中。收取上清液且在轉染後24小時及48小時進行置換,且使用含腔腸素之偵測試劑及光度計測定由oRNA進行之高斯螢光素酶表現。在24小時之較高發光指示對帽非依賴性轉譯之偏好。相對於24小時在48小時之較高發光指示歸因於對帽依賴性轉譯之抑制的較高oRNA穩定性。
實例
91B
:
用於增強帽非依賴性轉譯之編碼適體
共同轉染oRNA及適體。已知結合至eIF4E、eIF4a及其他轉譯起始子之某些適體藉由迫使蛋白質採取非功能性構形來抑制轉譯。將含有針對轉譯起始因子(亦即eIF4E、eIF4a)之適體的核酸序列與含有TIE及高斯螢光素酶報導體之編碼區之環狀RNA (oRNA)共同轉染。將經純化適體及oRNA一起調配至脂質奈米粒子中。將LNP-oRNA轉染至肝細胞中。收取上清液且在轉染後24小時及48小時進行置換,且使用含腔腸素之偵測試劑及光度計測定由oRNA進行之高斯螢光素酶表現。在24小時之較高發光指示對帽非依賴性轉譯之偏好。相對於24小時在48小時之較高發光可指示歸因於對帽依賴性轉譯之抑制的較高oRNA穩定性。
實例 92
評估環狀RNA之免疫原性。在用各種RNA製備物轉染細胞之後使用RT-cPCR來量測對作為免疫刺激標記物之RIG-1及IFNB1 RNA表現之誘導。使用包含念珠藻屬排列內含子、GLuc閱讀框架、強同源臂、5'及3'間隔子以及CVB3 IRES之RNA之活體外轉錄(IVT)及環化產生除市售3phpRNA之外的所有RNA製備物。在HeLa細胞(
圖 101A)及A594細胞(
圖 101B)中,藉由在不存在過量GMP之情況下製備之IVT反應產物及藉由陽性對照3phpRNA來誘導RIG-1及IFNB1之最高含量。
實例 93
IRES
選擇及篩檢
以計算方式自此項技術中可用之部分病毒序列及完整病毒序列中之病毒非轉譯區(例如基因庫)鑑別大致3,000個潛在內部核糖體進入位點(IRES)序列候選物。選殖各DNA模板以包括選自SEQ ID NO: 1-2983及3282-3287之IRES序列或其片段。例示性構築體包括5'增強型內含子元件、5'增強型外顯子元件、推定IRES、編碼高斯螢光素酶之編碼元件、3'增強型外顯子元件及3'增強型內含子元件。藉由活體外轉錄(IVT)由DNA模板產生經工程改造之環狀RNA (oRNA);且隨後自IVT反應物之非環狀RNA組分純化oRNA。
用脂質使經純化oRNA奈米沈澱以形成LNP-oRNA構築體。首先藉由使用Precision Nanosystems Ignite儀器用「NextGen」混合腔室產生空脂質奈米粒子來調配LNP。將含有呈45:9:44:2莫耳比之來自表10b之脂質39、DSPC、膽固醇及DMG-PEG 2000 (Avanti Polar Lipids公司,Alabaster,AL)的乙醇相與50 mM乙酸鈉緩衝液pH 4.5合併。使用3:1水與乙醇混合比。隨後,在1 L 1×PBS中透析空LNP且經18小時交換2次。隨後,在50 mM乙酸鈉緩衝液pH 4.5中將經透析之空LNP與40 μg/mL最終環狀RNA濃度混合。使用3:1水與空脂質奈米粒子混合比。LNP最終可離子化脂質與RNA磷酸酯比為6.0。
用所調配之LNP-oRNA一式三份地治療原代人類骨骼肌管、原代人類肝細胞及經活化原代人類T細胞。在轉染後48小時以發光量測評估上清液中之蛋白質表現。
由於急驟分析讀出時序,因此標準化複製品盤上之總螢光信號以控制複製品之間的盤-寬差異。將具有相對於背景具有<1.5×信號之陽性對照的盤排除在分析之外。基於空孔減去背景。以盤對照之平均值標準化各測試孔複製品。
表27提供蛋白質表現及穩定性量測結果以用於篩檢。以對照(山羊脊病毒IRES,SEQ ID NO: 3282)標準化量測數值且其表示為變化倍數。
表 27.IRES之表現及功能穩定性篩檢
實例 94 在活體外投與編碼 CD19-41BBζ 、 CD19-CD28ζ 、 HER2-41BBζ 或 HER2-CD28ζ 嵌合抗原受體 (CAR) 之環狀 RNA 之後該等 CAR 之 表現
SEQ ID NO | [Mod] 變化倍數 Myo | [Mod] T 變化倍數 | [Mod] PHH 變化倍數 | SEQ ID NO | [Mod] 變化倍數 Myo | [Mod] T 變化倍數 | [Mod] PHH 變化倍數 | SEQ ID NO | [Mod] 變化倍數 Myo | [Mod] T 變化倍數 | [Mod] PHH 變化倍數 | SEQ ID NO | [Mod] 變化倍數 Myo | [Mod] T 變化倍數 | [Mod] PHH 變化倍數 |
97 | 0.260167 | 0.353177 | 1.163467 | 672 | 0.089022 | 0.461053 | 0.683679 | 1245 | 0.209877 | 1.009418 | 2010 | 0.008014 | 0.048727 | 0.376383 | |
98 | 0.290648 | 0.677026 | 0.78802 | 673 | 0.052496 | 0.22393 | 0.290818 | 1246 | 0.689115 | 0.935799 | 2011 | 0.007678 | 0.050682 | 0.388038 | |
99 | 0.163908 | 0.27666 | 1.020326 | 674 | 0.242917 | 0.426446 | 0.671781 | 1247 | 1.206727 | 3.45224 | 2012 | 0.007658 | 0.048585 | 0.40471 | |
100 | 0.495163 | 0.48261 | 1.22777 | 675 | 0.020806 | 0.100778 | 0.254393 | 1248 | 0.997846 | 3.186952 | 2013 | 0.00776 | 0.046273 | 0.269896 | |
101 | 0.533025 | 0.852995 | 1.370347 | 676 | 0.120498 | 0.594332 | 0.557211 | 1249 | 1.03331 | 4.151541 | 2014 | 0.007967 | 0.048251 | 0.353403 | |
102 | 0.044695 | 0.030995 | 0.514093 | 677 | 0.083653 | 0.221249 | 0.399649 | 1250 | 0.526962 | 1.830667 | 2015 | 0.008137 | 0.046658 | 0.338498 | |
103 | 0.045577 | 0.039508 | 0.647085 | 678 | 0.006713 | 0.026074 | 0.284843 | 1251 | 0.038789 | 0.160427 | 2016 | 0.007733 | 0.04596 | 0.356733 | |
104 | 0.076071 | 0.168841 | 0.774536 | 679 | 0.012988 | 0.238136 | 0.251857 | 1252 | 0.529876 | 1.476753 | 2017 | 0.007571 | 0.045682 | 0.396185 | |
105 | 0.249558 | 0.329006 | 0.642043 | 680 | 0.939588 | 1.168014 | 0.89748 | 1253 | 0.148526 | 0.512689 | 2018 | 0.007836 | 0.047143 | 0.396857 | |
106 | 0.352419 | 0.648041 | 1.09325 | 682 | 0.116101 | 0.51627 | 0.411418 | 1254 | 0.171619 | 0.496272 | 2019 | 0.008556 | 0.049704 | 0.356688 | |
107 | 0.287896 | 0.937122 | 1.119079 | 683 | 0.091835 | 0.41856 | 0.330861 | 1255 | 1.440028 | 4.650389 | 2020 | 0.007647 | 0.047487 | 0.406455 | |
109 | 0.249157 | 0.626121 | 0.853308 | 684 | 0.269272 | 0.956985 | 0.388996 | 1256 | 1.246323 | 3.526473 | 2021 | 0.007659 | 0.046888 | 0.36344 | |
110 | 0.242425 | 0.513277 | 0.717483 | 685 | 0.068553 | 0.420129 | 0.219238 | 1257 | 1.630471 | 3.27436 | 2022 | 0.007575 | 0.046464 | 0.411014 | |
111 | 0.222321 | 0.465065 | 0.786969 | 686 | 0.118729 | 0.627236 | 0.408928 | 1258 | 1.175351 | 3.563138 | 2023 | 0.008 | 0.046656 | 0.392491 | |
112 | 0.371086 | 0.636962 | 0.807476 | 687 | 0.109438 | 0.486295 | 0.332833 | 1259 | 0.846546 | 1.714691 | 2024 | 0.007671 | 0.046704 | 0.343154 | |
113 | 0.317071 | 0.43731 | 0.827882 | 688 | 0.136059 | 0.604523 | 0.382106 | 1260 | 1.043862 | 0.869917 | 2026 | 0.008452 | 0.049376 | 0.408859 | |
114 | 0.05835 | 0.068124 | 0.789812 | 689 | 0.029476 | 0.230011 | 0.246326 | 1261 | 0.290872 | 0.44244 | 2027 | 0.007698 | 0.046912 | 0.328525 | |
115 | 0.050735 | 0.046932 | 0.425032 | 690 | 0.713106 | 1.287446 | 0.527058 | 1263 | 0.493679 | 0.657699 | 1.716926 | 2028 | 0.007683 | 0.046616 | 0.339399 |
116 | 0.039211 | 0.030739 | 0.529925 | 691 | 0.237497 | 0.831741 | 0.595391 | 1264 | 0.298742 | 0.443995 | 1.012966 | 2029 | 0.007666 | 0.046757 | 0.297973 |
117 | 0.042734 | 0.046123 | 0.425775 | 692 | 0.223793 | 1.114774 | 0.464139 | 1265 | 0.378744 | 0.471388 | 1.244712 | 2030 | 0.007675 | 0.046508 | 0.435685 |
118 | 0.154586 | 0.456184 | 0.666903 | 693 | 0.271839 | 2.152616 | 0.674694 | 1266 | 0.211218 | 0.327944 | 0.97188 | 2031 | 0.008134 | 0.04519 | 0.411958 |
119 | 0.198021 | 0.987593 | 0.62119 | 694 | 0.05139 | 0.613276 | 0.240255 | 1267 | 0.17315 | 0.41676 | 1.57404 | 2032 | 0.007675 | 0.045703 | 0.307964 |
120 | 0.275525 | 0.701885 | 0.489288 | 695 | 0.327666 | 1.036856 | 0.542561 | 1268 | 0.213092 | 0.396399 | 1.097609 | 2033 | 0.007603 | 0.046911 | 0.368773 |
121 | 0.627572 | 1.028933 | 0.997696 | 696 | 0.098363 | 0.604772 | 0.25928 | 1269 | 0.227781 | 0.372048 | 1.433456 | 2034 | 0.007487 | 0.046125 | 0.42095 |
122 | 0.388602 | 0.8876 | 0.832163 | 697 | 0.375897 | 0.957958 | 0.549728 | 1270 | 0.004499 | 0.018835 | 1.068802 | 2035 | 0.007824 | 0.048172 | 0.297846 |
123 | 0.039714 | 0.030111 | 0.638047 | 698 | 0.026512 | 0.225899 | 0.241871 | 1271 | 0.180553 | 0.407587 | 1.83541 | 2036 | 0.007336 | 0.048153 | 0.42074 |
125 | 0.382696 | 0.641754 | 0.649185 | 699 | 0.497694 | 1.50769 | 0.574673 | 1272 | 0.394666 | 0.599394 | 1.66783 | 2037 | 0.008092 | 0.047712 | 0.309579 |
126 | 0.057929 | 0.06647 | 0.645602 | 700 | 0.288469 | 0.915024 | 0.510727 | 1273 | 0.281898 | 0.489728 | 1.50982 | 2038 | 0.007771 | 0.046713 | 0.372379 |
127 | 0.293568 | 0.685807 | 0.674465 | 701 | 0.437509 | 1.020715 | 0.734873 | 1274 | 0.243913 | 0.319871 | 0.788908 | 2039 | 0.008147 | 0.047807 | 0.46323 |
128 | 0.489317 | 0.583675 | 1.021214 | 702 | 0.046205 | 0.476705 | 0.190078 | 1275 | 0.262209 | 0.4805 | 3.95034 | 2041 | 0.007752 | 0.046575 | 0.519016 |
129 | 0.053695 | 0.089454 | 0.668895 | 703 | 0.122863 | 0.83862 | 0.282447 | 1276 | 0.378342 | 0.610004 | 1.467933 | 2042 | 0.007808 | 0.047418 | 0.427933 |
130 | 0.040577 | 0.060757 | 0.572842 | 704 | 0.147205 | 0.901082 | 0.301388 | 1277 | 0.273883 | 0.469937 | 1.070136 | 2043 | 0.007841 | 0.048971 | 0.487233 |
131 | 0.039511 | 0.033359 | 0.53476 | 705 | 0.223074 | 0.853951 | 0.40577 | 1278 | 0.315846 | 0.734033 | 0.89974 | 2044 | 0.007751 | 0.04791 | 0.502666 |
132 | 0.039977 | 0.031182 | 0.564324 | 706 | 0.008438 | 0.033092 | 0.191812 | 1279 | 0.189246 | 0.354251 | 6.159851 | 2045 | 0.007997 | 0.04765 | 0.425789 |
133 | 0.039326 | 0.030041 | 0.541046 | 707 | 0.394494 | 0.997947 | 0.843619 | 1280 | 0.388472 | 0.494888 | 1.410746 | 2046 | 0.007681 | 0.047159 | 0.387429 |
134 | 0.046625 | 0.052943 | 0.46727 | 708 | 0.186993 | 1.051411 | 0.468843 | 1281 | 0.00514 | 0.020652 | 0.591781 | 2047 | 0.008297 | 0.04738 | 0.434821 |
136 | 0.047864 | 0.042316 | 0.428555 | 709 | 0.108893 | 0.601642 | 0.210326 | 1282 | 0.289013 | 0.482967 | 2.197797 | 2048 | 0.00876 | 0.04945 | 0.444633 |
138 | 0.372287 | 0.637832 | 0.615651 | 710 | 0.091753 | 0.734575 | 0.237951 | 1283 | 0.053841 | 0.067338 | 0.927451 | 2049 | 0.007392 | 0.046997 | 0.359452 |
139 | 0.059696 | 0.097316 | 0.520599 | 711 | 0.345755 | 1.159082 | 0.385849 | 1284 | 0.570301 | 0.633162 | 2.538618 | 2050 | 0.008459 | 0.051214 | 0.257893 |
140 | 0.16008 | 0.399455 | 0.715372 | 712 | 0.115713 | 0.513471 | 0.287018 | 1285 | 0.255977 | 0.464247 | 1.400939 | 2051 | 0.007739 | 0.048823 | 0.379033 |
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615 | 0.005705 | 0.019587 | 0.226829 | 1186 | 0.434429 | 1.954991 | 1924 | 0.002045 | 0.003803 | 0.75616 | 2540 | 0.001818 | 0.019031 | 1.121716 | |
616 | 0.006013 | 0.020573 | 0.266788 | 1187 | 0.505786 | 3.505564 | 1925 | 0.002024 | 0.003787 | 0.78207 | 2541 | 0.001778 | 0.018762 | 0.803414 | |
617 | 0.035272 | 0.094008 | 0.237734 | 1188 | 0.406861 | 2.548182 | 1926 | 0.002081 | 0.004003 | 0.919381 | 2542 | 0.00183 | 0.01897 | 0.935541 | |
618 | 0.026309 | 0.025971 | 0.242108 | 1189 | 0.4624 | 2.051662 | 1927 | 0.002087 | 0.0039 | 0.87094 | 2543 | 0.001856 | 0.018641 | 0.779233 | |
619 | 0.004687 | 0.020401 | 0.240359 | 1190 | 0.071895 | 0.226536 | 1928 | 0.002169 | 0.003842 | 0.85592 | 2544 | 0.001832 | 0.018997 | 0.936523 | |
620 | 0.00571 | 0.019825 | 0.218814 | 1191 | 0.02375 | 0.087245 | 1929 | 0.002196 | 0.003892 | 1.04674 | 2545 | 0.001818 | 0.019351 | 0.785605 | |
621 | 0.006001 | 0.020668 | 0.280146 | 1192 | 1.717893 | 7.465639 | 1930 | 0.002059 | 0.004072 | 0.758699 | 2546 | 0.001855 | 0.019618 | 1.078452 | |
622 | 0.082002 | 0.273485 | 0.335066 | 1193 | 0.542623 | 4.373519 | 1931 | 0.002018 | 0.003893 | 0.935624 | 2547 | 0.001753 | 0.019425 | 0.952274 | |
623 | 0.006029 | 0.020465 | 0.261982 | 1194 | 0.354838 | 3.577394 | 1932 | 0.00212 | 0.003782 | 0.741426 | 2548 | 0.001801 | 0.019016 | 0.883621 | |
624 | 0.140559 | 0.424388 | 0.42443 | 1195 | 0.259933 | 3.12244 | 1935 | 0.002149 | 0.003827 | 0.781431 | 2549 | 0.001932 | 0.019884 | 0.963362 | |
625 | 0.005826 | 0.019866 | 0.264531 | 1196 | 0.215423 | 2.052223 | 1936 | 0.002114 | 0.003987 | 0.983047 | 2550 | 0.001852 | 0.019493 | 0.756811 | |
626 | 0.051468 | 0.032244 | 0.306101 | 1197 | 0.526893 | 2.109184 | 1939 | 0.002105 | 0.003927 | 1.012539 | 2551 | 0.001811 | 0.018994 | 0.735339 | |
627 | 0.075104 | 0.276951 | 0.298932 | 1198 | 0.822275 | 1.940819 | 1940 | 0.002102 | 0.003894 | 0.972949 | 2552 | 0.001829 | 0.018641 | 0.751335 | |
628 | 0.005997 | 0.022048 | 0.26821 | 1199 | 2.037406 | 9.409115 | 1943 | 0.002208 | 0.003969 | 0.819485 | 2553 | 0.001842 | 0.019264 | 0.734602 | |
629 | 0.034034 | 0.401114 | 0.435605 | 1200 | 1.095359 | 5.130504 | 1944 | 0.002129 | 0.003932 | 0.90291 | 2555 | 0.001803 | 0.019524 | 0.791215 | |
630 | 0.011946 | 0.027566 | 0.254444 | 1201 | 0.157644 | 0.731059 | 1949 | 0.002939 | 0.028633 | 0.702177 | 2556 | 0.001808 | 0.019326 | 1.234156 | |
631 | 0.005914 | 0.020147 | 0.288981 | 1202 | 0.230264 | 1.923086 | 1951 | 0.00213 | 0.003953 | 0.756432 | 2557 | 0.001817 | 0.019034 | 0.844118 | |
632 | 0.037385 | 0.026122 | 0.362523 | 1204 | 0.044579 | 0.913551 | 1954 | 0.002084 | 0.003994 | 0.716999 | 2559 | 0.0018 | 0.019361 | 0.832718 | |
633 | 0.005826 | 0.019832 | 0.356419 | 1206 | 0.511955 | 1.209704 | 1955 | 0.002082 | 0.003928 | 0.924112 | 2560 | 0.001849 | 0.018958 | 1.108257 | |
634 | 0.010026 | 0.030547 | 0.206994 | 1207 | 0.046192 | 0.162052 | 1956 | 0.002151 | 0.004369 | 0.83182 | 2561 | 0.001875 | 0.019191 | 0.924327 | |
635 | 0.01508 | 0.04919 | 0.264614 | 1208 | 0.026908 | 0.124359 | 1959 | 0.002066 | 0.003906 | 0.943132 | 2562 | 0.00183 | 0.019757 | 0.913942 | |
636 | 0.296551 | 1.260655 | 0.610765 | 1209 | 0.281822 | 3.216097 | 1960 | 0.002082 | 0.003897 | 0.845987 | 2563 | 0.001766 | 0.019449 | 1.039711 | |
637 | 0.032124 | 0.375722 | 0.306647 | 1210 | 0.220147 | 2.427366 | 1962 | 0.002068 | 0.004065 | 0.677381 | 2564 | 0.001761 | 0.019642 | 0.975257 | |
638 | 0.005896 | 0.021846 | 0.271964 | 1211 | 0.111229 | 1.298379 | 1964 | 0.002309 | 0.005092 | 0.691221 | 2565 | 0.001822 | 0.018907 | 0.875283 | |
639 | 0.018881 | 0.148987 | 0.215144 | 1213 | 0.141412 | 0.865279 | 1965 | 0.002145 | 0.004599 | 1.02379 | 2566 | 0.001827 | 0.018953 | 0.804406 | |
640 | 0.018015 | 0.131161 | 0.288994 | 1214 | 0.15488 | 0.459765 | 1966 | 0.002096 | 0.003928 | 0.821807 | 2567 | 0.00182 | 0.01881 | 0.84509 | |
641 | 0.032334 | 0.02755 | 0.409355 | 1215 | 0.997818 | 3.321803 | 1967 | 0.002135 | 0.004049 | 0.784332 | 2568 | 0.001815 | 0.018919 | 0.949194 | |
642 | 0.067149 | 0.273403 | 0.35373 | 1216 | 1.025901 | 4.406269 | 1969 | 0.00258 | 0.004963 | 0.869906 | 2569 | 0.00187 | 0.018963 | 0.839079 | |
643 | 0.094609 | 0.53261 | 0.4944 | 1217 | 0.260845 | 2.930463 | 1970 | 0.002402 | 0.005499 | 0.802557 | 2570 | 0.001859 | 0.019606 | 0.843373 | |
644 | 0.006418 | 0.02472 | 0.231759 | 1218 | 0.345315 | 3.143776 | 1971 | 0.003555 | 0.00803 | 0.915366 | 2571 | 0.001771 | 0.019425 | 0.664874 | |
645 | 0.131335 | 0.734794 | 0.553125 | 1219 | 0.305255 | 1.957145 | 1972 | 0.002123 | 0.004341 | 1.002436 | 2572 | 0.001861 | 0.019316 | 0.807564 | |
646 | 0.029427 | 0.344127 | 0.390884 | 1220 | 0.172212 | 1.168102 | 1973 | 0.002093 | 0.004195 | 0.739287 | 2573 | 0.001825 | 0.018896 | 1.142032 | |
647 | 0.023863 | 0.136043 | 0.300959 | 1221 | 0.248967 | 0.814305 | 1974 | 0.002264 | 0.004213 | 1.090771 | 2574 | 0.001799 | 0.018916 | 0.733867 | |
650 | 0.010281 | 0.03014 | 0.242733 | 1222 | 0.03732 | 0.119114 | 1975 | 0.00213 | 0.004172 | 0.890328 | 2575 | 0.001848 | 0.018948 | 0.764302 | |
651 | 0.007994 | 0.028947 | 0.25194 | 1223 | 1.247387 | 3.024953 | 1976 | 0.002854 | 0.00629 | 1.03609 | 2576 | 0.001862 | 0.0189 | 0.934422 | |
652 | 0.15318 | 0.627023 | 0.43527 | 1224 | 0.024175 | 0.081463 | 1977 | 0.0022 | 0.003857 | 0.750837 | 2578 | 0.001938 | 0.019715 | 0.942217 | |
653 | 0.118823 | 0.69422 | 0.40527 | 1225 | 0.057454 | 0.455597 | 1978 | 0.002184 | 0.006424 | 0.789674 | 2579 | 0.001762 | 0.019242 | 0.986229 | |
654 | 0.105353 | 0.646828 | 0.388119 | 1226 | 0.361586 | 4.237747 | 1979 | 0.00218 | 0.004072 | 1.041609 | 2580 | 0.001771 | 0.01972 | 0.75995 | |
656 | 0.006783 | 0.02363 | 0.269316 | 1227 | 0.15804 | 1.518132 | 1980 | 0.002089 | 0.003918 | 0.742203 | 2581 | 0.001846 | 0.019138 | 0.813534 | |
657 | 0.307363 | 1.189775 | 0.605584 | 1228 | 0.015375 | 0.056146 | 1981 | 0.002022 | 0.00393 | 0.802623 | 2582 | 0.001812 | 0.018893 | 1.03767 | |
658 | 0.142732 | 0.450462 | 0.421859 | 1229 | 0.444241 | 1.249649 | 1983 | 0.00211 | 0.00387 | 0.823111 | 2583 | 0.001829 | 0.019116 | 0.974132 | |
659 | 0.22685 | 0.512994 | 0.582274 | 1230 | 0.649691 | 1.15827 | 1985 | 0.00238 | 0.005063 | 0.920921 | 2584 | 0.001881 | 0.019667 | 0.850391 | |
660 | 0.088314 | 0.402555 | 0.524885 | 1232 | 0.378509 | 0.925671 | 1987 | 0.002096 | 0.003989 | 0.820149 | 2585 | 0.002575 | 0.020133 | 1.050868 | |
661 | 0.180276 | 0.439707 | 0.530249 | 1233 | 0.325411 | 2.625939 | 1988 | 0.002196 | 0.004207 | 0.733845 | 2586 | 0.002919 | 0.020784 | 0.982573 | |
662 | 0.010698 | 0.060157 | 0.272901 | 1234 | 0.206621 | 2.051787 | 1993 | 0.002629 | 0.004548 | 0.923992 | 2587 | 0.001816 | 0.019662 | 0.675518 | |
663 | 0.161736 | 0.431703 | 0.609228 | 1235 | 0.019165 | 0.09314 | 1994 | 0.003546 | 0.013836 | 0.780026 | 2588 | 0.001816 | 0.019437 | 0.754413 | |
664 | 0.104153 | 0.348438 | 0.502663 | 1236 | 0.118642 | 1.658952 | 1996 | 0.00246 | 0.004831 | 0.793669 | 2589 | 0.001844 | 0.01968 | 0.725135 | |
665 | 0.509021 | 0.807128 | 0.717144 | 1237 | 0.017709 | 0.057603 | 1998 | 0.005897 | 0.010175 | 0.864774 | 2590 | 0.00185 | 0.020018 | 0.754455 | |
666 | 0.474224 | 0.60482 | 0.829418 | 1238 | 0.015895 | 0.043364 | 1999 | 0.002493 | 0.004889 | 0.91103 | 2591 | 0.001831 | 0.019558 | 0.900126 | |
667 | 0.04441 | 0.198916 | 0.289447 | 1239 | 0.025104 | 0.079453 | 2001 | 0.003035 | 0.009213 | 0.760895 | 2593 | 0.001894 | 0.019772 | 0.853028 | |
668 | 0.072205 | 0.466606 | 0.40305 | 1240 | 0.361175 | 2.493372 | 2004 | 0.009008 | 0.051959 | 0.315777 | 2594 | 0.003467 | 0.021701 | 0.877 | |
669 | 0.026334 | 0.185174 | 0.304685 | 1242 | 0.325351 | 1.821619 | 2006 | 0.007683 | 0.047495 | 0.479879 | |||||
670 | 0.108713 | 0.572116 | 0.361198 | 1243 | 0.411323 | 2.267424 | 2007 | 0.00815 | 0.046714 | 0.350549 | |||||
671 | 0.054216 | 0.293384 | 0.286724 | 1244 | 0.262681 | 1.368943 | 2009 | 0.007773 | 0.047424 | 0.356192 |
用抗CD3或CD28活化來自三個獨特T細胞供體之人類T細胞三天,且設定為靜置24小時。將編碼CD19-41BBζ、CD19-CD28ζ、HER2-41BBζ或HER2-CD28ζ嵌合抗原受體(CAR)之經工程改造之環狀RNA (oRNA)電穿孔至人類T細胞中。在轉染後24小時,使用螢光活化細胞分選(FACS)來量測CAR中之各者的CAR表現。
如
圖 102A及
圖 102B中所見,環狀RNA構築體能夠表現不同CAR構築體中之各者的CAR。
實例 95 在活體外轉染 CD19-41BBζ 及 CD19-CD28ζ 嵌合抗原受體 (CAR) 及細胞介素產生之後腫瘤細胞之溶解
用抗CD3或CD28活化人類T細胞三天且靜置24小時。隨後,經由電穿孔用編碼mOX40L (陽性對照)、CD19-41BBζ、CD19-CD28ζ、HER2-41BBζ或HER2-CD28ζ嵌合抗原受體(CAR)之環狀RNA轉染細胞。在電穿孔後24小時,將該等T細胞與Nalm6腫瘤細胞以1:1效應物:目標(E:T)比共同培養。在將人類T細胞與Nalm6腫瘤細胞共同培養之後24小時量測Nalm6殺滅。收集共同培養物上清液且使用Meso Scale Discovery (MSD) (Agilent Technologies,Santa Clara,CA)針對IFN-g及IL-2表現進行分析。
如
圖 103A中所見,編碼CD19-41BBζ及CD19-CD28ζ之環狀RNA使腫瘤細胞殺滅超越陽性對照、mOX40L環狀RNA,且甚至超越HER2-41BBζ及HER2-CD28ζ。與編碼HER2-41BBζ、HER2-CD28ζ或mOX40L之環狀RNA相比,編碼CD19-BBζ及CD19-28ζ之環狀RNA亦超越IFN-g及IL-2細胞介素(
圖 103B及
圖 103C)。在環狀RNA轉染之後在1:3效應物:目標(E:T)比下觀測到抗原特異性殺滅。
實例 96 在靜脈內投與 LNP- 編碼 mOX40L 之 環狀 RNA 之後人類化小鼠之血液及脾人類 T 細胞中之 mOX40L 表現
向NOG小鼠(1E7小鼠融合瘤)移植人類周邊血液單核細胞(hPBMC)。3週後,用2 mg/kg單次靜脈內劑量之囊封編碼mOx40L之環狀RNA的LNP治療小鼠。用可離子化脂質10b-15 (表10b,脂質15)、10a-27 (表10a,脂質27)或10a-26 (表10a,脂質26)調配LNP。在靜脈內投與之後24小時,分離脾細胞及周邊血液細胞,且針對mOX40L之T細胞表現進行分析。
如
圖 104A及
圖 104B中所見,在用於LNP構築體中之各者之人類化小鼠之脾及周邊血液的人類T細胞中偵測到mOX40L。所有三種構築體在脾中之表現較高。
實例 97 在靜脈內投與 LNP- 編碼抗 CD19 CAR 之 環狀 RNA 構築體之後人類化小鼠之脾中的 B 細胞 發育不全
向NOG小鼠(1E7小鼠融合瘤)移植人類周邊血液單核細胞(hPBMC),總計50-60%人類移植。在移植之後3週,用2 mg/kg單位劑量之囊封編碼抗CD19 CAR或IXPBS之環狀RNA的LNP (陰性對照)治療小鼠。在給藥後六天,分離脾細胞且經由CD19表現分析B細胞之存在。
如
圖 105中所見,當將接受LNP-環狀RNA構築體之小鼠之脾細胞(
圖 105左側)與接受陰性對照之小鼠之脾細胞(
圖 105右側)進行比較時,B細胞發育不全存在於人類化小鼠中。
實例 98 在活體外投與編碼不同 CAR 之 環狀 RNA 構築體之後的 Nalm6 殺滅
用抗CD3或抗CD28活化T細胞三天且靜置24小時。隨後,用LNP-編碼mOX40L (陽性對照)、CD19-41BBζ、CD19-CD28ζ、HER2-41BBζ或HER2-CD28ζ嵌合抗原受體(CAR)之環狀RNA治療細胞。使用可離子化脂質10b-15 (表10b,脂質15)調配LNP。藉由螢光活化細胞分選(FACS)量測CAR表現以量測平均螢光活性(MFI)。隨後,將T細胞與Nalm6腫瘤細胞共同培養。第二天量測Nalm6殺滅。
在將T細胞與Nalm6細胞共同培養之後48小時,效應物:目標(E:T)比為1:5。如
圖 106A中所見,與編碼HER2-41BBζ、HER2-CD28ζ或mOX40L之構築體(陽性對照)相比,在投與LNP-環狀RNA構築體後的Nalm6腫瘤細胞殺滅百分比對於編碼CD19-CD28ζ或CD19-41BBζ之構築體顯著地較大。
圖 106B繪示編碼CD19-28ζCAR之環狀RNA具有比編碼CD19-BBζCAR之環狀RNA大之Nalm6細胞殺滅。
實例 99
將1E6 (Nalm6-Luc)細胞移植至NSG小鼠中。3天後,離體移植經CD3/CD28處理之hPBMC。在移植後24小時,經由活體內投與2 mg/kg囊封環狀RNA構築體(編碼CD19-41BBζ CAR、CD19-CD28ζ CAR、HER2-41BBζ CAR、HER2-CD28ζ CAR或mOX40L之環狀RNA (陽性對照))之LNP或PBS (陰性對照1)或PBMC (陰性對照2))向小鼠給藥。用可離子化脂質10b-15 (表10b,脂質15)調配所有LNP。每隔一天給藥小鼠,總計5次劑量。使用IVIS成像定量隨時間推移之Nalm6腫瘤負荷。
如
圖 107中所見,用CD19-CD28ζ CAR調配之LNP與另一CAR或對照(陽性或陰性)相比在腫瘤消退中更有效。
實例 100
以計算方式自此項技術中可用之部分病毒序列及完整病毒序列中之病毒非轉譯區(例如基因庫)鑑別大致3,000個潛在內部核糖體進入位點(IRES)序列候選物。選殖各DNA模板以包括選自SEQ ID NO: 1-2983及3282-3287之IRES序列或其片段。例示性構築體包括5'增強型內含子元件、5'增強型外顯子元件、推定IRES、編碼高斯螢光素酶之編碼元件、3'增強型外顯子元件及3'增強型內含子元件。藉由活體外轉錄(IVT)由DNA模板產生經工程改造之環狀RNA (oRNA);且隨後自IVT反應物之非環狀RNA組分純化oRNA。
用脂質使經純化oRNA奈米沈澱以形成LNP-oRNA構築體。首先藉由使用Precision Nanosystems Ignite儀器用「NextGen」混合腔室產生空脂質奈米粒子來調配LNP。將含有呈45:9:44:2莫耳比之來自表10b之脂質39、DSPC、膽固醇及DMG-PEG 2000 (Avanti Polar Lipids公司,Alabaster,AL)的乙醇相與50 mM乙酸鈉緩衝液pH 4.5合併。使用3:1水與乙醇混合比。隨後,在1 L 1×PBS中透析空LNP且經18小時交換2次。隨後,在50 mM乙酸鈉緩衝液pH 4.5中將經透析之空LNP與40 μg/mL最終環狀RNA濃度混合。使用3:1水與空脂質奈米粒子混合比。LNP最終可離子化脂質與RNA磷酸酯比為6.0。
用所調配之LNP-oRNA一式三份地治療原代人類骨骼肌管(MYO)、原代人類肝細胞(PHH)及經活化原代人類T細胞(TCL)。在轉染後48小時以發光量測評估上清液中之蛋白質表現。
由於急驟分析讀出時序,因此標準化複製品盤上之總螢光信號以控制複製品之間的盤-寬差異。將具有相對於背景具有<2×信號之陽性對照的盤排除在分析之外。基於空孔減去背景。以各測試孔複製品之各別盤對照將其標準化且隨後取複製品之平均值。
表28提供蛋白質表現及穩定性量測結果以用於篩檢。以對照(山羊脊病毒IRES,SEQ ID NO: 3282)標準化量測數值且其表示為變化倍數。
可進一步分析蛋白質表現資料(表28)以鑑別例如適用於在某些細胞類型中具有所需表現量之蛋白質表現的IRES。舉例而言,根據NCBI分類資料庫將IRES序列分配至屬或物種。一些序列在可變程度之層次下保持未分類。執行以下分析:
● 評估利用分類分組之平均表現以測定其中可預期到顯著表現(對照之>10%)的分類分組。下表概述所鑑別之病毒屬及屬內滿足選擇準則之IREs數目。
● 評估分類分組之第90百分位內之平均表現以測定平均含有最高活性IRES元件之分類分組。下表概述所鑑別之病毒屬及屬內滿足選擇準則之IREs數目。
● 針對篩檢中呈現之具有超過30個物種之屬進行物種層級分類分析,且平均表現為陽性對照之>10%:腸病毒、脊病毒、副腸孤病毒、心病毒。評估第90百分位內之平均表現。下表概述所鑑別之病毒物種及物種內滿足選擇準則之IREs數目。
● 評估所有測試序列中各細胞類型中之靠前的序列。在各個別細胞類型中相對於陽性對照藉由表現選擇前~30個序列:以類似方式執行之密切相關之序列經具有略微較低效能之多樣序列置換。
o 靠前的IRES序列包括SEQ ID NO: 75、77、137、532、566、582、648、680、693、752、785、787、791、793、820、823、839、840、843、852、857、861、862、863、864、871、874、876、922、959、983、984、1015、1017、1023、1026、1031、1041、1047、1059、1068、1134、1168、1169、1171、1177、1178、1179、1180、1189、1192、1193、1198、1216、1218、1230、1263、1276、1280、1282、1284、1287、1346、1354、1364、1367、1370、1432、1438、1440、2285、2465、2601、2615、2616、2617、2618、2627、2667、2681、2742、2746、2758、2777、2778、3282、3283、3286及3287。
o 用於MYO中之蛋白質表現之靠前的IRES序列包括SEQ ID NO: 137、580、785、791、820、922、1041、1047、1068、1168、1169、1171、1177、1178、1179、1180、1189、1192、1263、1276、1280、1282、1284、1287、1354、1356、1432、1436、1439、1440、2285、2667、2746、2777、2778、3283及3284。
o 用於PPH中之蛋白質表現之靠前的IRES序列包括SEQ ID NO: 137、580、648、693、752、785、791、793、820、823、839、840、861、862、863、876、922、959、983、984、1015、1017、1023、1026、1031、1041、1047、1059、1068、1134、1168、1169、1171、1177、1178、1179、1180、1189、1192、1193、1198、1216、1263、1276、1280、1282、1284、1287、1346、1354、1356、1432、1436、1438、1439、1440、2285、2777、2778、3283及3284。
o 用於TCL中之蛋白質表現之靠前的IRES序列包括SEQ ID NO: 77、787、793、820、839、840、843、852、857、861、862、863、864、871、874、876、959、1193、1216、1284、1287、1346、1356、1364、1432、1438、1440、2667、2681、2742、2746、2758、3283及3284。
MYO | PPH | TCL | |||
屬 | IRES 數目 | 屬 | IRES 數目 | 屬 | IRES 數目 |
博匹病毒 | 3 | 腸病毒 | 690 | 帕塞里病毒 | 3 |
奧西病毒 | 4 | 博匹病毒 | 3 | 博匹病毒 | 3 |
亨尼病毒 | 6 | 密斯齊病毒 | 4 | 亨尼病毒 | 6 |
帕塞里病毒 | 3 | 加利病毒 | 2 | 密斯齊病毒 | 4 |
密斯齊病毒 | 4 | 奧西病毒 | 4 | 腸病毒 | 690 |
脊病毒 | 130 | 心病毒 | 35 | 脊病毒 | 130 |
腸病毒 | 690 | 脊病毒 | 130 | 拉博病毒 | 2 |
心病毒 | 35 | 拉博病毒 | 2 | 鳥取病毒 | 1 |
薩利病毒 | 14 | 薩利病毒 | 14 | 薩利病毒 | 14 |
拉博病毒 | 2 | 未分類杯狀病毒科 | 3 | 心病毒 | 35 |
未分類杯狀病毒科 | 3 | 副腸孤病毒 | 76 | 副腸孤病毒 | 76 |
副腸孤病毒 | 76 | 亨尼病毒 | 6 | 未分類載體 | 9 |
加利病毒 | 2 | 鳥取病毒 | 1 | 美格瑞病毒 | 17 |
斯西尼病毒 | 10 | 未分類 | 23 | 青蔥X病毒 | 1 |
帕塞里病毒 | 3 | 未分類 | 23 | ||
科薩病毒 | 10 | 奧西病毒 | 4 | ||
斯西尼病毒 | 10 | 山巴病毒 | 4 | ||
未分類載體 | 9 |
MYO | PPH | TCL | |||
屬 | IRES 數目 | 屬 | IRES 數目 | 屬 | IRES 數目 |
亨尼病毒 | 6 | 腸病毒 | 690 | 帕塞里病毒 | 3 |
帕塞里病毒 | 3 | 密斯齊病毒 | 4 | 亨尼病毒 | 6 |
脊病毒 | 130 | 脊病毒 | 130 | 密斯齊病毒 | 4 |
博匹病毒 | 3 | 博匹病毒 | 3 | 腸病毒 | 690 |
腸病毒 | 690 | 加利病毒 | 2 | 脊病毒 | 130 |
腸病毒物種 | IRES 數目 | 脊病毒物種 | IRES 數目 | 副腸孤病毒物種 | IRES 數目 | 心病毒物種 | IRES 數目 |
MYO | |||||||
腸病毒I | 1 | 愛知病毒B | 8 | 副腸孤病毒A | 48 | 心病毒F | 1 |
腸病毒F | 5 | 未分類脊病毒 | 32 | 未分類副腸孤病毒 | 19 | 未分類心病毒 | 4 |
腸病毒E | 1 | 心病毒B | 18 | ||||
腸病毒J | 5 | 心病毒E | 1 | ||||
腸病毒C | 137 | ||||||
腸病毒A | 117 | ||||||
腸病毒B | 154 | ||||||
PPH | |||||||
腸病毒B | 154 | 愛知病毒B | 8 | 副腸孤病毒A | 48 | 心病毒F | 1 |
腸病毒A | 117 | 未分類脊病毒 | 32 | 未分類副腸孤病毒 | 19 | 心病毒E | 1 |
腸病毒D | 11 | 愛知病毒A | 32 | 未分類心病毒 | 4 | ||
腸病毒J | 5 | 心病毒B | 18 | ||||
腸病毒C | 137 | ||||||
鼻病毒B | 21 | ||||||
腸病毒H | 1 | ||||||
腸病毒I | 1 | ||||||
未分類腸病毒 | 149 | ||||||
腸病毒E | 1 | ||||||
腸病毒F | 5 | ||||||
TCL | |||||||
腸病毒I | 1 | 未分類脊病毒 | 32 | 副腸孤病毒A | 48 | 未分類心病毒 | 4 |
腸病毒D | 11 | 愛知病毒B | 8 | 心病毒B | 18 | ||
腸病毒C | 137 | ||||||
腸病毒A | 117 | ||||||
腸病毒J | 5 | ||||||
未分類腸病毒 | 149 | ||||||
腸病毒H | 1 |
總體而言,鑑別數百個在oRNA中具有高度活性之新型IRES元件,其中許多比普遍存在的EMCV型IRES及/或CVB3型IRES強得多(
圖 111A-111C)。亦觀測到,即使在來自高度類似病毒之IRES之間亦可能存在顯著差異。在所有細胞類型中,極少IRES為強的。如
圖 110A及
圖 110B中所描繪,肌管及肝細胞IRES活性常常相關,而T細胞IRES活性常常不與肌管及肝細胞中之活性相關。
表 28.IRES之表現及功能穩定性篩檢
ND:未偵測
以引用之方式併入
SEQ ID NO | MYO AVG [ 變化倍數 ] | MYO STDEV [ 變化倍數 ] | PHH AVG [ 變化倍數 ] | PHH STDEV [ 變化倍數 ] | TCL AVG [ 變化倍數 ] | TCL STDEV [ 變化倍數 ] | SEQ ID NO | MYO AVG [ 變化倍數 ] | MYO STDEV [ 變化倍數 ] | PHH AVG [ 變化倍數 ] | PHH STDEV [ 變化倍數 ] | TCL AVG [ 變化倍數 ] | TCL STDEV [ 變化倍數 ] |
3282 | 1 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 1506 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0214472 | 0.0113230 |
2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1507 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0151743 | 0.0218812 |
3 | 0.0007257 | 0.0006312 | 0.0016067 | 0.0003508 | 0 | 0 | 1508 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0082973 | 0.0123163 |
4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0117764 | 0.0121685 | 1509 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0081531 | 0.0123913 |
5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0347900 | 0.0324761 | 1510 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0238213 | 0.0412598 | 1511 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0073978 | 0.0093885 |
7 | 0 | 0 | 0.0002392 | 0.0002873 | 0.0243770 | 0.0218275 | 1512 | 0.0006905 | 0.0001037 | 0.0003128 | 0.0003378 | 0.0105988 | 0.0183577 |
8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0055608 | 0.0096316 | 1513 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
9 | 0.0050209 | 0.0050966 | 0.0098061 | 0.0022326 | 0.0163004 | 0.0159090 | 1514 | 0 | 0 | 0.0007412 | 0.0006638 | 0.0276949 | 0.0149782 |
10 | 0 | 0 | 0.0003045 | 0.0004177 | 0.0683266 | 0.0380156 | 1515 | 0.0000200 | 0.0000215 | 0.0004574 | 0.0002314 | 0.0026166 | 0.0045322 |
11 | 0.0007727 | 0.0008018 | 0.0074580 | 0.0004470 | 0.0002548 | 0.0004414 | 1516 | 0 | 0 | 0.0001842 | 0.0003190 | 0.0013687 | 0.0022164 |
13 | 0 | 0 | 0.0015653 | 0.0002912 | 0.0258959 | 0.0234567 | 1517 | 0 | 0 | 0.0006197 | 0.0005449 | 0.0076199 | 0.0131981 |
15 | 0.0194108 | 0.0070272 | 0.0589347 | 0.0084655 | 0.0510777 | 0.0439756 | 1518 | 0 | 0 | 0.0002437 | 0.0004222 | 0.0019248 | 0.0033339 |
17 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0141218 | 0.0136848 | 1519 | 0 | 0 | 0.0001733 | 0.0001535 | 0.0027708 | 0.0047992 |
18 | 0 | 0 | 0.0015323 | 0.0003545 | 0.0314972 | 0.0203211 | 1520 | 0.0004964 | 0.0000165 | 0.0016507 | 0.0007970 | 0.0100196 | 0.0089848 |
19 | 0 | 0 | 0.0007075 | 0.0003451 | 0 | 0 | 1521 | 0.0000418 | 0.0000414 | 0.0000751 | 0.0000668 | 0.0072923 | 0.0126307 |
20 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0096814 | 0.0097625 | 1522 | 0.0001229 | 0.0000702 | 0.0013256 | 0.0008175 | 0.0208572 | 0.0219754 |
21 | 0.0212586 | 0.0030008 | 0.1362660 | 0.0099125 | 0.0747982 | 0.0245418 | 1523 | 0.0005071 | 0.0000569 | 0.0023354 | 0.0011011 | 0.0064428 | 0.0111592 |
22 | 0.0091365 | 0.0034231 | 0.0925952 | 0.0067153 | 0.0309040 | 0.0284601 | 1524 | 0 | 0 | 0.0004331 | 0.0005532 | 0.0050150 | 0.0058351 |
23 | 0 | 0 | 0.0008387 | 0.0004640 | 0.0024170 | 0.0041863 | 1525 | 0.0007472 | 0.0000638 | 0.0034506 | 0.0006977 | 0.0107460 | 0.0058710 |
24 | 0 | 0 | 0.0000246 | 0.0000427 | 0.0031111 | 0.0053885 | 1526 | 0.0000052 | 0.0000090 | 0.0002429 | 0.0002183 | 0.0167959 | 0.0198498 |
25 | 0.0737983 | 0.0053055 | 0.1558598 | 0.0162108 | 0.4519536 | 0.1337645 | 1527 | 0 | 0 | 0.0000853 | 0.0001477 | 0.0107912 | 0.0138687 |
26 | 0.0027586 | 0.0007225 | 0.0125235 | 0.0005036 | 0 | 0 | 1528 | 0 | 0 | 0.0001664 | 0.0002251 | 0.0029835 | 0.0051675 |
27 | 0.0186635 | 0.0040436 | 0.0989179 | 0.0085851 | 0.0244226 | 0.0253392 | 1529 | 0.0000397 | 0.0000687 | 0 | 0 | 0 | 0 |
28 | 0.0176418 | 0.0025557 | 0.1220648 | 0.0135955 | 0.1126415 | 0.0207651 | 1530 | 0.0000744 | 0.0001067 | 0.0009300 | 0.0008577 | 0.0142545 | 0.0149820 |
29 | 0 | 0 | 0.0082741 | 0.0009236 | 0.0109582 | 0.0120151 | 1532 | 0.0000333 | 0.0000289 | 0.0004763 | 0.0002133 | 0 | 0 |
30 | 0.1967132 | 0.0482465 | 0.3984421 | 0.0443954 | 0.3729583 | 0.0512158 | 1533 | 0 | 0 | 0.0002489 | 0.0002519 | 0.0061249 | 0.0106087 |
31 | 0.5881394 | 0.1231212 | 0.6943366 | 0.0609169 | 0.4862626 | 0.0380244 | 1534 | 0 | 0 | 0.0004789 | 0.0004669 | 0.0102236 | 0.0140407 |
32 | 0.2163073 | 0.0786069 | 0.3275750 | 0.0149576 | 0.0297402 | 0.0211648 | 1535 | 0.0004070 | 0.0002482 | 0.0000169 | 0.0000293 | 0.0031651 | 0.0030277 |
33 | 0.3574334 | 0.1134934 | 0.4409356 | 0.0619212 | 0.2087538 | 0.1393970 | 1536 | 0 | 0 | 0.0000278 | 0.0000482 | 0.0105381 | 0.0092746 |
34 | 0.2168290 | 0.0372754 | 0.4643626 | 0.0428027 | 0.2638304 | 0.0199095 | 1537 | 0 | 0 | 0.0001787 | 0.0003096 | 0.0019766 | 0.0032946 |
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1490 | 0.0001971 | 0.0001366 | 0.0004311 | 0.0005511 | 0.0128171 | 0.0120923 | 2971 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0034879 | 0.0060413 |
1491 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2972 | 0 | 0 | 0.0000318 | 0.0000551 | 0 | 0 |
1492 | 0.0001602 | 0.0001126 | 0.0002620 | 0.0003662 | 0.0208177 | 0.0183588 | 2973 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0539533 | 0.0421255 |
1493 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0075576 | 0.0130902 | 2974 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0047027 | 0.0081453 |
1494 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0201115 | 0.0175185 | 2975 | 0.5060688 | 0.1143204 | 0.7881679 | 0.0500019 | 0.3087274 | 0.0547200 |
1495 | 0.0009526 | 0.0004679 | 0.0019682 | 0.0017312 | 0.0018253 | 0.0019164 | 2976 | 0 | 0 | 0.0004428 | 0.0003835 | 0.0299059 | 0.0259000 |
1496 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0062954 | 0.0109039 | 2977 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0059492 | 0.0103043 |
1497 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0125662 | 0.0109712 | 2978 | 0 | 0 | 0.0000772 | 0.0001337 | 0.0163306 | 0.0282854 |
1498 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2979 | 0.0008297 | 0.0006033 | 0.0003828 | 0.0002474 | 0.0167764 | 0.0235896 |
1499 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0232621 | 0.0179497 | 2980 | 0 | 0 | 0.0005189 | 0.0003060 | 0.0306022 | 0.0398638 |
1500 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0063550 | 0.0110071 | 2981 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0605622 | 0.0638594 |
1501 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0104711 | 0.0102432 | 2982 | 0 | 0 | 0.0000294 | 0.0000509 | 0.1130838 | 0.0589247 |
1502 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0057084 | 0.0098872 | 2983 | 0 | 0 | 0.0006916 | 0.0003873 | 0.0505178 | 0.0531373 |
1503 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0137267 | 0.0120369 | 1.6864822 | 0.2023517 | 1.8296691 | 0.2622726 | 1.3533184 | 0.3489609 | |
1504 | 0.0001844 | 0.0000326 | 0 | 0 | 0.0022244 | 0.0030548 | 1.2152631 | 0.0715746 | 1.9253447 | 0.2295974 | 1.4055953 | 0.5005810 | |
1505 | 0.0007358 | 0.0001360 | 0.0005113 | 0.0004625 | 0.0178155 | 0.0111417 | 0.4541910 | 0.0455837 | 0.7196244 | 0.2152985 | 0.3611981 | 0.1391544 |
本說明書中所提及之全部公開案、專利及專利申請案皆以引用之方式併入本文中,其引用程度如同特定地且個別地指示各個別公開案、專利或專利申請案以引用之方式併入本文中一般。
8:環狀RNA
10:線性RNA聚核苷酸前驅體
20:5'增強型外顯子元件;5'增強型內含子元件
21:前導非轉譯序列
22:5'親和標籤
24:5'外部雙螺旋體區
26:5'外部間隔子
28:3'內含子片段
30:5'增強型外顯子元件;5'外顯子元件
32:3'外顯子片段
34:5'內部雙螺旋體區
36:5'內部間隔子
40:核心功能元件
42:轉譯起始元件(TIE)
43:IRES
44:適體
45:適體複合物
46:編碼元件;編碼區
47:核心功能元件;非編碼區;非編碼元件
48:終止區
50:3'增強型外顯子元件;3'外顯子元件
52:3'內部間隔子
54:3'內部雙螺旋體區
56:5'外顯子片段
60:3'增強型內含子元件
62:5'內含子片段
64:3'外部間隔子
66:3'外部雙螺旋體區
68:3'親和標籤
69:末端非轉譯序列
70:輔助元件
圖 1描繪在經包含高斯螢光素酶(
Gaussialuciferase)表現序列及各種IRES序列之環狀RNA轉染之後24小時HEK293 (
圖 1A、
圖 1D及
圖 1E)、HepG2 (
圖 1B)或1C1C7 (
圖 1C)細胞上清液中的發光。
圖 2描繪在經包含高斯螢光素酶表現序列及具有不同長度之各種IRES序列之環狀RNA轉染之後24小時HEK293 (
圖 2A)、HepG2 (
圖 2B)或1C1C7 (
圖 2C)細胞上清液中的發光。
圖 3描繪以發光量測,經3天精選IRES構築體在HepG2 (
圖 3A)或1C1C7 (
圖 3B)細胞中之穩定性。
圖 4A及
圖 4B描繪以細胞上清液中之所分泌高斯螢光素酶之發光量測,Jurkat細胞中之精選IRES構築體之蛋白質表現。
圖 5A及
圖 5B描繪以發光量測,經3天精選IRES構築體在Jurkat細胞中之穩定性。
圖 6描繪編碼高斯螢光素酶之經修飾、線性、未經純化環狀或經純化環狀RNA之24小時發光(
圖 6A)或經3天相對發光(
圖 6B)的比較。
圖 7描繪在用經修飾線性、未經純化環狀或經純化環狀RNA電穿孔Jurkat細胞之後IFNγ (
圖 7A)、IL-6 (
圖 7B)、IL-2 (
圖 7C)、RIG-I (
圖 7D)、IFN-β1 (
圖 7E)及TNFα (
圖 7F)之轉錄物誘導。
圖 8描繪人類原代單核球(
圖 8A)及巨噬細胞(
圖 8B及
圖 8C)中之編碼高斯螢光素酶之環狀RNA及經修飾線性RNA的發光比較。
圖 9描繪在用包含高斯螢光素酶表現序列及不同IRES序列之環狀RNA轉導之後原代T細胞上清液中之經3天相對發光(
圖 9A)或24小時發光(
圖 9B)。
圖 10描繪在用包含高斯螢光素酶表現序列之環狀RNA或經修飾線性RNA轉導之後原代T細胞上清液中之24小時發光(圖10A)或經3天相對發光(
圖 10B)及PBMC中之24小時發光(
圖 10C)。
圖 11描繪具有不同排列位點之RNA構築體之HPLC層析圖(
圖 11A)及環化效率(圖11B)。
圖 12描繪具有不同內含子及/或排列位點之RNA構築體之HPLC層析圖(
圖 12A)及環化效率(
圖 12B)。
圖 13描繪具有或不具有同源臂之3個RNA構築體之HPLC層析圖(
圖 13A)及環化效率(
圖 13B)。
圖 14描繪不具有同源臂或具有同源臂之3個RNA構築體之環化效率,該等同源臂具有各種長度及GC含量。
圖 15A及
圖 15B描繪展示強同源臂對提高之剪接效率之貢獻度、精選構築體中之環化效率與切口之間的關係及假設展現提高之環化效率之排列位點與同源臂組合的HPLC層析圖。
圖 16展示與表現GFP及螢火蟲螢光素酶之Raji細胞共培養之經模擬物電穿孔(左側)或經編碼CAR之環狀RNA電穿孔(右側)之T細胞的螢光影像。
圖 17展示經模擬物電穿孔(頂部)或經編碼CAR之環狀RNA電穿孔(底部)且與表現GFP及螢火蟲螢光素酶之Raji細胞共培養之T細胞的明場(左側)、螢光(中央)及重疊(右側)影像。
圖 18描繪經模擬物電穿孔或經編碼不同CAR序列之環狀RNA電穿孔之T細胞對Raji目標細胞之比溶解率。
圖 19描繪在經包含高斯螢光素酶表現序列及不同IRES序列之線性或環狀RNA轉導之後24小時Jurkat細胞(左側)或靜止原代人類CD3+ T細胞(右側)上清液中的發光(圖19A)及經3天相對發光(
圖 19B)。
圖 20描繪在用經修飾線性、未經純化環狀或經純化環狀RNA電穿孔人類CD3+ T細胞之後IFN-β1 (
圖 20A)、RIG-I (
圖 20B)、IL-2 (
圖 20C)、IL-6 (
圖 20D)、IFNγ (
圖 20E)及TNFα (
圖 20F)之轉錄物誘導。
圖 21描繪以螢火蟲發光偵測測定,經編碼CAR之環狀RNA電穿孔之人類原代CD3+ T細胞對Raji目標細胞之比溶解率(
圖 21A)及在經不同數量之編碼CAR序列之環狀或線性RNA電穿孔之後24小時IFNγ轉錄物誘導(
圖 21B)。
圖 22描繪以螢火蟲發光偵測測定,呈不同E:T比的經編碼CAR之環狀或線性RNA電穿孔之人類原代CD3+ T細胞對目標或非目標細胞之比溶解率(
圖 22A及
圖 22B)。
圖 23描繪在電穿孔後1、3、5及7天時經編碼CAR之RNA電穿孔之人類CD3+ T細胞對目標細胞之比溶解率。
圖 24描繪經編碼靶向CAR之CD19或BCMA之環狀RNA電穿孔的人類CD3+ T細胞對目標細胞之比溶解率。
圖 25描繪自給藥編碼FLuc且用50%脂質10b-15、10% DSPC、1.5% PEG-DMG及38.5%膽固醇調配之環狀RNA之CD-1小鼠收取之器官的總通量。
圖 26展示突出顯示自給藥編碼FLuc且用50%脂質10b-15、10% DSPC、1.5% PEG-DMG及38.5%膽固醇調配之環狀RNA之CD-1小鼠收取之器官的發光的影像。
圖 27描繪脂質10a-26及10a-27之分子表徵。
圖 27A展示脂質10a-26之質子核磁共振(NMR)譜。
圖 27B展示以液相層析-質譜法(LC-MS)量測之脂質10a-26之滯留時間。
圖 27C展示脂質10a-26之質譜。
圖 27D展示脂質10a-27之質子NMR譜。
圖 27E展示以LC-MS量測之脂質10a-27之滯留時間。
圖 27F展示脂質10a-27之質譜。
圖 28描繪脂質22-S14及其合成中間物之分子表徵。
圖 28A描繪2-(十四基硫基)乙-1-醇之NMR譜。
圖 28B描繪丙烯酸2-(十四基硫基)乙酯之NMR譜。
圖 28C描繪雙(2-(十四基硫基)乙基) 3,3'-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)二丙酸酯(脂質22-S14)之NMR譜。
圖 29描繪雙(2-(十四基硫基)乙基) 3,3'-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)二丙酸酯(脂質93-S14)之NMR譜。
圖 30描繪8-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)(8-(壬氧基)-8-側氧基辛基)胺基)辛酸十七烷-9-基酯(脂質10a-54)之分子表徵。
圖 30A展示脂質10a-54之質子NMR譜。
圖 30B展示以LC-MS量測之脂質10a-54之滯留時間。
圖 30C展示脂質10a-54之質譜。
圖 31描繪8-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)(8-(壬氧基)-8-側氧基辛基)胺基)辛酸十七烷-9-基酯(脂質10a-53)之分子表徵。
圖 31A展示脂質10a-53之質子NMR譜。
圖 31B展示以LC-MS量測之脂質10a-53之滯留時間。
圖 31C展示脂質10a-53之質譜。
圖 32A描繪自給藥編碼螢火蟲螢光素酶(FLuc)且用呈16:1:4:1或62:4:33:1莫耳比之重量比之所關注之可離子化脂質、DSPC、膽固醇及DSPE-PEG 2000 (Avanti Polar Lipids公司)調配之環狀RNA之CD-1小鼠收取之脾及肝的總通量。
圖 32B描繪蛋白質表現之生物分佈之平均輻射輝度。
圖 33A描繪突出顯示自給藥編碼FLuc且用呈16:1:4:1或62:4:33:1莫耳比之重量比之可離子化脂質22-S14、DSPC、膽固醇及DSPE-PEG 2000 (Avanti Polar Lipids公司)調配之環狀RNA之CD-1小鼠收取之器官的發光的影像。
圖 33B描繪給藥編碼FLuc且用呈16:1:4:1或62:4:33:1莫耳比之重量比之可離子化脂質22-S14、DSPC、膽固醇及DSPE-PEG 2000 (Avanti Polar Lipids公司)調配之環狀RNA之CD-1小鼠的全身IVIS影像。
圖 34A描繪突出顯示自給藥編碼FLuc且用呈16:1:4:1或62:4:33:1莫耳比之重量比之可離子化脂質93-S14、DSPC、膽固醇及DSPE-PEG 2000 (Avanti Polar Lipids公司)調配之環狀RNA之CD-1小鼠收取之器官的發光的影像。
圖 34B描繪給藥編碼FLuc且用呈16:1:4:1或62:4:33:1莫耳比之重量比之可離子化脂質93-S14、DSPC、膽固醇及DSPE-PEG 2000 (Avanti Polar Lipids公司)調配之環狀RNA之CD-1小鼠的全身IVIS影像。
圖 35A描繪突出顯示自給藥編碼FLuc且用呈16:1:4:1或62:4:33:1莫耳比之重量比之可離子化脂質10a-26、DSPC、膽固醇及DSPE-PEG 2000 (Avanti Polar Lipids公司)調配之環狀RNA之CD-1小鼠收取之器官的發光的影像。
圖 35B描繪給藥編碼FLuc且用呈16:1:4:1或62:4:33:1莫耳比之重量比之可離子化脂質10a-26、DSPC、膽固醇及DSPE-PEG 2000 (Avanti Polar Lipids公司)調配之環狀RNA之CD-1小鼠的全身IVIS影像。
圖 36描繪突出顯示自給藥編碼FLuc之環狀RNA之c57BL/6J小鼠收取且經囊封於用脂質10b-15 (
圖 36A)、脂質10a-53 (
圖 36B)或脂質10a-54 (
圖 36C)形成之脂質奈米粒子中之器官的發光的影像。PBS用作對照(
圖 36D)。
圖 37A及
圖 37B描繪在與含有編碼螢火蟲螢光素酶之環狀RNA之測試脂質奈米粒子一起培育24小時之後人類PBMC溶解物中之相對發光。
圖 38展示在與含有編碼GFP或CD19 CAR之環狀RNA之測試脂質奈米粒子一起培育之後人類PBMC中之GFP (
圖 38A)及CD19 CAR (
圖 38B)的表現。
圖 39描繪經包含抗鼠CD19 CAR表現序列及不同IRES序列之環狀RNA脂質體轉染之1C1C7細胞中之抗鼠CD19 CAR的表現。
圖 40展示抗鼠CD19 CAR對鼠T細胞之細胞毒性。CD19 CAR由環狀RNA編碼且由環狀RNA表現,該環狀RNA經電穿孔至鼠T細胞中。
圖 41描繪每隔一天注射囊封編碼抗鼠CD19 CAR之環狀RNA之測試脂質奈米粒子的C57BL/6J小鼠中的周邊血液(
圖 41A及
圖 41B)或脾(
圖 41C)的B細胞計數。
圖 42A及
圖 42B比較由環狀RNA表現之抗人類CD19 CAR與由線性mRNA表現之抗人類CD19 CAR的表現量。
圖 43A及
圖 43B比較由環狀RNA表現之抗人類CD19 CAR與由線性mRNA表現之抗人類CD19 CAR的細胞毒性效應。
圖 44描繪在T細胞中由單一環狀RNA表現之兩個CAR (抗人類CD19 CAR及抗人類BCMA CAR)的細胞毒性。
圖 45A展示在經用脂質10a-27或10a-26或脂質10b-15形成之LNP治療後各種脾免疫細胞子集中之tdTomato表現頻率的代表性FACS圖。
圖 45B展示等效於成功地經Cre環狀RNA轉染之各細胞群體之比例的表現tdTomato之骨髓細胞、B細胞及T細胞之比例(平均值+標準差,n = 3)的定量。
圖 45C繪示在經脂質27及26治療之後表現tdTomato之包括NK細胞、經典單核球、非經典單核球、嗜中性球及樹突狀細胞之額外脾免疫細胞群體的比例(平均值+標準差,n = 3)。
圖 46A描繪在內含子中具有內置式聚A序列之例示性RNA構築體設計。
圖 46B展示未經純化環狀RNA之層析跡線。
圖 46C展示經親和純化環狀RNA之層析跡線。圖46D展示用不同活體外轉錄(IVT)條件及純化方法製備之環狀RNA之免疫原性。(商用=商用IVT混合物;定製=定製IVT混合物;Aff=親和純化;Enz=酶純化;GMP:GTP比=8、12.5或13.75)。
圖 47A描繪具有作為用於雜交純化之聚A之替代方案的專用結合序列TATAATTCTACCCTATTGAGGCATTGACTA (SEQ ID NO: 3269)之例示性RNA構築體設計。
圖 47B展示未經純化環狀RNA之層析跡線。
圖 47C展示經親和純化環狀RNA之層析跡線。
圖 48A展示編碼肌縮蛋白之未經純化環狀RNA之層析跡線。
圖 48B展示編碼肌縮蛋白之經酶純化環狀RNA之層析跡線。
圖 49比較在3'內含子片段/5'內部雙螺旋體區與IRES之間具有不同5'間隔子之經純化環狀RNA在Jurkat細胞中之表現(
圖 49A)及穩定性(
圖 49B)。(AC=僅A及C用於間隔子序列中;UC=僅U及C用於間隔子序列中。)
圖 50展示含有指定的原始或經修飾IRES元件之環狀RNA在原代T細胞中之發光表現量及表現穩定性。
圖 51顯示含有指定的原始或經修飾IRES元件之環狀RNA在HepG2細胞中之發光表現量及表現穩定性。
圖 52展示含有指定的原始或經修飾IRES元件之環狀RNA在1C1C7細胞中之發光表現量及表現穩定性。
圖 53展示含有插入有非轉譯區(UTR)之IRES元件或雜交IRES元件之環狀RNA在HepG2細胞中之發光表現量及表現穩定性。「Scr」意謂加擾,用作對照。
圖 54展示含有IRES及可操作地連接至高斯螢光素酶編碼序列之可變終止密碼子卡匣之環狀RNA在1C1C7細胞中的發光表現量及表現穩定性。
圖 55展示含有IRES及在高斯螢光素酶編碼序列之起始密碼子前插入之可變非轉譯區(UTR)之環狀RNA在1C1C7細胞中的發光表現量及表現穩定性。
圖 56展示含有位於hEPO編碼序列下游之兩個miR-122目標位點之環狀RNA在Huh7細胞中之人類紅血球生成素(hEPO)表現量。
圖 57展示經編碼螢火蟲螢光素酶之環狀RNA活體外轉染之LNP在SupT1細胞(來自人類T細胞腫瘤株)及MV4-11細胞(來自人類巨噬細胞株)中之發光表現量。
圖 58展示基於不同輔助脂質、PEG脂質及可離子化脂質:磷酸酯比配方之含有依賴ApoE之環狀RNA的經轉染原代人類T細胞LNP的比較。
圖 59展示在存在或不存在ApoE3輔助之情況下經活化原代人類T細胞對含有編碼eGFP之環狀RNA的LNP的吸收。
圖 60展示在Cre報導體小鼠模型中含有編碼Cre螢光蛋白之環狀RNA的LNP的免疫細胞表現。
圖 61展示在靜脈內注射已經編碼mOX40L之環狀RNA轉染之LNP之後mOX40L在野生型小鼠中之免疫細胞表現。
圖 62展示經能夠表現mOX40L之環狀RNA轉染之LNP中mOX40L之單次劑量。
圖 62A及
圖 62B提供mOX40L在脾T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、B細胞、NK細胞、樹突狀細胞及其他骨髓細胞中之表現百分比。
圖 62C提供轉染後24小時小鼠體重變化。
圖 63展示小鼠中經環狀RNA靜脈內轉染之LNP對B細胞之耗乏。
圖 63A定量活CD45+免疫細胞中之B220+ B細胞之B細胞耗乏,且
圖 63B比較活CD45+免疫細胞中之B220+ B細胞之B細胞耗乏,以上係與表現螢光素酶之環狀RNA相比。
圖 63C提供經轉染細胞之B細胞重量增益。
圖 64顯示當經囊封表現抗CD19 CAR之環狀RNA之LNP治療時周邊血液(
圖 64A)及脾(
圖 64B)中之CAR表現量。抗CD20 (aCD20)及編碼螢光素酶(oLuc)之環狀RNA係用於比較。
圖 65展示抗CD19 CAR表現總頻率、細胞表面上之抗CD19 CAR表現頻率及T細胞上編碼抗CD19 CAR之IRES特異性環狀RNA對抗腫瘤反應之影響。
圖 65A展示抗CD19 CAR幾何平均螢光強度,
圖 65B展示抗CD19 CAR表現百分比,且
圖 65C展示由抗CD19 CAR執行之目標細胞溶解百分比。(CK =山羊脊病毒;AP =森鼠小核糖核酸病毒;CK* =具有密碼子最佳化之山羊脊病毒;PV =帕拉博病毒(Parabovirus);SV =薩利病毒。)
圖 66展示當經IRES特異性環狀RNA構築體治療時A20 FLuc目標細胞之CAR表現量。
圖 67展示原代人類T細胞中環狀RNA對胞溶質蛋白(
圖 67A)及表面蛋白(
圖 67B)之發光表現量。
圖 68展示當經IRES特異性環狀構築體治療時人類T細胞中之發光表現。將環狀RNA構築體中之表現與線性mRNA進行比較。
圖 68A、
圖 68B及
圖 68G提供多個供體細胞中之高斯螢光素酶表現。
圖 68C、
圖 68D、
圖 68E及
圖 68F提供多個供體細胞中之螢火蟲螢光素酶表現。
圖 69展示在涵蓋編碼針對表現螢火蟲螢光素酶之K562細胞之抗CD19或抗BCMA CAR之環狀RNA的脂質奈米粒子治療後人類T細胞中之抗CD19 CAR (
圖 69A及
圖 69B)及抗BCMA CAR (
圖 68B)表現。
圖 70展示經由以特異性抗原依賴性方式活體外電穿孔編碼抗CD19 CAR之環狀RNA進行遞送而引起的抗CD19 CAR表現量。
圖 70A展示用抗CD19 CAR進行之Nalm6細胞溶解。
圖 70B展示用抗CD19 CAR進行之K562細胞溶解。
圖 71展示藉由使用於含有LNP及表現綠色螢光蛋白(GFP)之環狀RNA的溶液中之ApoE3介導的LNP轉染。
圖 71A展示活-死結果。
圖 71B、
圖 71C、
圖 71D及
圖 71E提供多個供體之表現頻率。
圖 72A、
圖 72B、
圖 72C、
圖 72D、
圖 72E、
圖 72F、
圖 72G、
圖 72H、
圖 72I、
圖 72J、
圖 72K及
圖 72L展示不同脂質調配物之總通量及表現百分比。參見實例74。
圖 73展示編碼穩定(雙重脯胺酸突變體) SARS-CoV2棘蛋白之RNA分子之環化效率。
圖 73A展示~4.5 kb編碼SARS-CoV2棘之環狀RNA之活體外轉錄產物。
圖 73B展示在將編碼棘之環狀RNA轉染至293細胞中之後經由流動式細胞測量術進行之棘蛋白表面表現直方圖。經轉染293細胞在經CR3022一級抗體及經APC標記之二級抗體轉染之後經染色24小時。
圖 73C展示在轉染編碼棘之環狀RNA之後293細胞上之棘蛋白表面表現流動式細胞測量術圖。經轉染293細胞在經CR3022一級抗體及經APC標記之二級抗體轉染之後經染色24小時。
圖 74提供多種受控輔助策略。如圖上所指示之環狀RNA需要使用GTP作為活體外指示分子之未經純化有義環狀RNA剪接反應。3p-環狀RNA需要含有三磷酸化5'端之混合經純化有義環狀RNA以及經純化反義環狀RNA。
圖 74A展示野生型及MAVS敲除A549細胞之活體外IFN-β誘導,且
圖 74B展示針對使用指定策略產生之所調配環狀RNA的活體內細胞介素反應。
圖 75繪示含有環狀RNA構築體之LNP之肌內遞送。
圖 75A提供6小時時段後之活體全身通量,且
圖 75B提供1 µg劑量之LNP-環狀RNA構築體後6小時之全身IVIS。
圖 75C提供經24小時時段之離體表現分佈。
圖 76繪示來自單一脂質調配物之多個環狀RNA之表現。
圖 76A提供單一及混合集合之含有環狀RNA構築體之LNP的hEPO力價,而
圖 76B提供單一或混合集合之含有環狀RNA構築體之LNP的生物發光表現總通量。
圖 77繪示編碼棘SARS-CoV2蛋白之環狀RNA之SARS-CoV2棘蛋白表現。
圖 77A展示棘CoV2表現頻率;
圖 77B展示棘CoV2表現之幾何平均螢光強度(gMFI);且
圖 77C比較構築體之gMFI表現與表現頻率。
圖 78描繪線性RNA聚核苷酸前驅體(
10)之一般序列構築體。如所提供之序列係按5'增強型內含子元件(
20)、5'增強型外顯子元件(
30)、核心功能元件(
40)、3'增強型外顯子元件(
50)及3'增強型內含子元件(
60)之5'至3'次序繪示。
圖 79描繪5'增強型外顯子元件(
20)之各種例示性迭代。如所繪示,5'增強型外顯子元件(
20)之一個迭代按5'至3'次序按以下次序包含:前導非轉譯序列(
21)、5'親和標籤(
22)、5'外部雙螺旋體區(
24)、5'外部間隔子(
26)及3'內含子片段(
28)。
圖 80描繪5'增強型外顯子元件(
30)之各種例示性迭代。如所繪示,5'增強型外顯子元件(
30)之一個迭代按5'至3'次序包含:3'外顯子片段(
32)、5'內部雙螺旋體區(
34)及5'內部間隔子(
36)。
圖 81描繪核心功能元件(
40)之各種例示性迭代。如所繪示,核心功能元件(
40)之一個迭代包含TIE (
42)、編碼區(
46)及終止區(例如終止密碼子或終止卡匣) (
48)。繪示展示包含非編碼區(
40)之核心功能元件(
47)之另一迭代。
圖 82描繪3'增強型外顯子元件(
50)之各種例示性迭代。如所繪示,3'增強型外顯子元件(
50)之迭代中之一者按5'至3'次序包含:3'內部間隔子(
52)、3'內部雙螺旋體區(
54)及5'外顯子片段(
56)。
圖 83描繪3'增強型內含子元件(
60)之各種例示性迭代。如所繪示,3'增強型內含子元件(
60)之迭代中之一者按以下次序包含:5'內含子片段(
62)、3'外部間隔子(
64)、3'外部雙螺旋體區(
66)、3'親和標籤(
68)及末端非轉譯序列(
69)。
圖 84描繪轉譯起始元件(TIE) (
42)之各種例示性迭代。如在一個迭代中所繪示之TIE
(42)序列僅為IRES (
43)。在另一迭代中,TIE
(42)為適體(
44)。在兩個不同迭代中,TIE (
42)為適體
(44)及IRES (
43)組合。在另一迭代中,TIE (
42)為適體複合物
(45)。
圖 85繪示例示性線性RNA聚核苷酸前驅體
(10),其按以下5'至3'次序包含:前導非轉譯序列(
21)、5'親和標籤(
22)、5'外部雙螺旋體區
(24)、5'外部間隔子(
26)、3'內含子片段(
28)、3'外顯子片段(
32)、5'內部雙螺旋體區(
34)、5'內部間隔子(
36)、TIE (
42)、編碼元件(
46)、終止區(
48)、3'內部間隔子(
52)、3'內部雙螺旋體區
(54)、5'外顯子片段(
56)、5'內含子片段(
62)、3'外部間隔子(
64)、3'外部雙螺旋體區
(66)、3'親和標籤(
68)及末端非轉譯序列(
69)。
圖 86繪示例示性線性RNA聚核苷酸前驅體
(10),其按以下5'至3'次序包含:前導非轉譯序列(
21)、5'親和標籤(
22)、5'外部雙螺旋體區
(24) 、5'外部間隔子(
26)、3'內含子片段(
28)、3'外顯子片段(
32)、5'內部雙螺旋體區(
34)、5'內部間隔子(
36)、編碼元件(
46)、終止區(
48)、TIE (
42)、3'內部間隔子(
52)、3'內部雙螺旋體區
(54)、5'外顯子片段(
56)、5'內含子片段(
62)、3'外部間隔子(
64)、3'外部雙螺旋體區
(66)、3'親和標籤(
68)及末端非轉譯序列(
69)。
圖 87繪示例示性線性RNA聚核苷酸前驅體
(10),其按以下5'至3'次序包含:前導非轉譯序列(
21)、5'親和標籤(
22)、5'外部雙螺旋體區
(24)、5'外部間隔子(
26)、3'內含子片段(
28)、3'外顯子片段(
32)、5'內部雙螺旋體區(
34)、5'內部間隔子(
36)、非編碼元件(
47)、3'內部間隔子(
52)、3'內部雙螺旋體區
(54)、5'外顯子片段(
56)、5'內含子片段(
62)、3'外部間隔子(
64)、3'外部雙螺旋體區
(66)、3'親和標籤(
68)及末端非轉譯序列(
69)。
圖 88繪示在剪接後形成之一般環狀RNA (
8)結構。如所描繪之環狀RNA包括5'外顯子元件(
30)、核心功能元件(
40)及3'外顯子元件(
50)。
圖 89繪示輔助元件
(70)
(例如miRNA結合位點)可包括於線性RNA聚核苷酸中之各種方式。
圖 89A展示包含於間隔子區處之輔助元件(
70)之線性RNA聚核苷酸。
圖 89B展示包含位於外部雙螺旋體區與外顯子片段中之各者之間的輔助元件(
70)之線性RNA聚核苷酸。
圖 89C描繪於間隔子內之輔助元件
(70)。
圖 89D繪示位於核心功能元件內之輔助元件
(70)之各種迭代。
圖 89E繪示位於內部核糖體進入位點(IRES)內之輔助元件(
70)。
圖 90繪示在原代人類(
圖 90A)、小鼠(
圖 90B)及食蟹獼猴(
圖 90C)肝細胞中不同劑量之用編碼螢火蟲螢光素酶且具有TIE之環狀RNA調配之LNP的活體外篩檢。
圖 91A-C繪示在來自三個不同供體之原代人類肝細胞中不同劑量之用編碼螢火蟲螢光素酶且具有TIE之環狀RNA調配之LNP的活體外篩檢。
圖 92繪示在HeLa、HEK293及HUH7人類細胞模型中用編碼GFP且具有TIE之環狀RNA調配之LNP的活體外表現。
圖 93繪示在原代人類肝細胞中用編碼GFO蛋白且具有TIE之環狀RNA調配之LNP的活體外表現。
圖 94繪示在小鼠肌母細胞(
圖 94A)及原代人類肌肉肌母細胞(
圖 94B)細胞中編碼螢火蟲螢光素酶且具有TIE之環狀RNA的活體外表現。
圖 95繪示在肌母細胞及分化原代人類骨骼肌肌管中編碼螢火蟲螢光素酶且具有TIE之環狀RNA的活體外表現。
圖 95A提供與自人類供體1接收之細胞相關之資料;
圖 95B提供與自人類供體2接收之細胞相關之資料。
圖 96繪示具有可變大小之環狀RNA之游離活體外轉譯。在
圖 96A中,測試編碼螢火蟲螢光素酶之環狀RNA及編碼螢火蟲螢光素酶之線性mRNA的表現。在
圖 96B中,給予人類細胞及小鼠細胞編碼ATP7B蛋白之環狀RNA。所測試之環狀RNA中之一些經密碼子最佳化。表現螢火蟲螢光素酶之環狀RNA係用於比較。
圖 97展示例示性RNA環化過程。
圖 97A中所示之示意圖描繪自催化環化過程。簡言之,增強環化效率之含有內含子區段及輔助元件之前驅體RNA分子經歷剪接,從而產生合成環狀RNA及兩個經截除內含子/輔助序列區段(自內含子區段/片段中剪接出)。一些環化RNA (oRNA)在合成期間產生切口。
圖 97B展示例示性層析圖,該層析圖展示在粒徑排阻HPLC分析之後不同物種之峰值滯留。
圖 98描繪用於諸如oRNA之環狀RNA分子之例示性負向選擇純化方法。與存在於前驅體RNA而非oRNA中之序列(諸如內含子區段或外部輔助區)互補之寡核苷酸結合至諸如珠粒之固體載體。洗滌珠粒上之oRNA製備物;前驅體RNA、經部分剪接RNA、不完整轉錄物及剪接後內含子區段在某些緩衝液條件下結合至寡核苷酸,而oRNA及帶切口oRNA流過。收集流過物以供進一步處理。
圖 99A及
圖 99B描繪用於諸如oRNA之環狀RNA分子之例示性負向選擇純化方法。
圖 99A中所示之示意圖描繪含有oRNA及線性RNA之活體外轉錄反應產物之酶聚腺苷酸化,此引起僅線性RNA之聚腺苷酸化。在特定緩衝液條件下洗滌珠粒上結合至去氧胸苷寡核苷酸(「Oligo dT」)之線性RNA與環狀RNA之混合物。聚腺苷酸化線性RNA黏合至珠粒,而oRNA流過以供收集。
圖 99B展示在聚腺苷酸化及純化之前活體外轉錄(IVT)反應產物(左圖)及在結合緩衝液中使用大腸桿菌聚A聚合酶進行聚腺苷酸化及用oligo-dT珠粒進行純化之後溶離劑(右圖)的例示性SEC-HPLC層析圖。
圖 100A及
圖 100B描繪例示性環狀RNA酶純化方法。在此方法中,在存在過量GMP之情況下藉由IVT合成oRNA,且在該過程期間自催化地剪接oRNA。用Xrn1 (需要5'末端單磷酸酯之5'至3'核酸外切酶)及核糖核酸酶R (3'至5'核酸外切酶)消化所得反應產物以移除非環狀RNA分子。
圖 100A展示線性RNA之該Xrn1及核糖核酸酶R消化。
圖 100B展示在酶消化之前IVT反應產物(左圖)及最終以酶純化之材料(右圖)之例示性SEC-HPLC層析圖。
圖 101A及
圖 101B展示在用各種指定RNA製備物轉染細胞之後對免疫刺激標記物RIG-1及IFNB1 RNA表現之誘導。使用包含念珠藻屬排列內含子、GLuc閱讀框架、強同源臂、5'及3'間隔子以及CVB3 IRES之RNA之活體外轉錄及環化產生除市售3phpRNA之外的所有RNA製備物。使用RT-qPCR量測RIG-1及IFNB1 RNA表現。在圖101中,「IVT」指示未經純化反應混合物;「+GMP」指示其中在存在相對於GTP而言12.5倍GMP之情況下執行活體外轉錄之未經純化反應混合物;「+HPLC」指示藉由HPLC純化之反應混合物;「+HPLC/GMP」指示其中在存在相對於GTP而言12.5倍GMP之情況下執行活體外轉錄之藉由HPLC純化之反應混合物;「3phpRNA」指示包含三磷酸酯髮夾RNA (tlrl-hprna,Invivogen)之陽性對照;且「模擬物」指示不含RNA之製備物。
圖 101A展示HeLa細胞之免疫刺激,且
圖 101B展示A594細胞之免疫刺激。
圖 102A及
圖 102B展示在人類T細胞中由經由電穿孔各種編碼嵌合抗原受體之環狀RNA進行活體外遞送引起之抗CD19 CAR表現量。
圖 102A提供CD19-41BBζ、CD19-CD28ζ、HER2-41BBζ及HER2-CD28ζ CAR之人類T細胞表現之FACs分析的代表性點狀圖。
圖 102B描繪經由螢光活化細胞分選(FACS)收集之CD19-41BBζ、CD19-CD28ζ、HER2-41BBζ及HER2-CD28ζ表現之MFI的累積資料。
圖 103A-103C繪示在用編碼CD19-41BBζ及CD19-CD28ζ之環狀RNA電穿孔T細胞且隨後與腫瘤細胞一起共培養之後針對腫瘤細胞之細胞毒性反應。
圖 103A提供與表現編碼mOX40L之環狀RNA的T細胞相比在與表現編碼CD19-41BBζ、CD19-CD28ζ、HER2-41BBζ及HER2-CD28ζ CAR之oRNA的T細胞一起共培養之後腫瘤細胞之比溶解率%。
圖 103B及
圖 103C描繪在與腫瘤細胞一起共培養之後,與編碼mOX40L之環狀RNA相比分別由表現所列oRNA之T細胞分泌的以pg/mL為單位的IFN-g及IL-2細胞介素。
圖 104A及
圖 104B展示在靜脈內投與用編碼mOX40L之環狀RNA調配之LNP之後人類化小鼠之脾及周邊血液T細胞中之活體內mOX40L表現。用PBS (在該圖中指示為「媒劑」)調配LNP,或用脂質10b-15 (表10b,脂質15)、10a-27 (表10a,脂質27)或10a-26 (表10a,脂質26)調配LNP-oRNA構築體。
圖 104A描繪人類化小鼠之脾中T細胞中之mOX40L偵測。
圖 104B描繪人類化小鼠之周邊血液中T細胞中之mOX40L偵測。
圖 105繪示在靜脈內投與用編碼抗CD19嵌合抗原受體(CAR)之環狀RNA調配之LNP之後人類化小鼠中的B細胞發育不全。未經治療動物(左側)及經治療動物(右側)之周邊血液之代表性FACS點狀圖展示自靜脈內投與起6天後的B細胞百分比。
圖 106A及
圖 106B展示在與LNP-編碼CAR之oRNA或對照一起共培養之後Nalm6腫瘤細胞之殺滅% (
圖 106A)及在活體外轉染編碼CD19-41BBζ或CD19-CD28ζ CAR之LNP-環狀RNA (oRNA)之後的嵌合抗原受體(CAR)表面表現(
圖 106B)。
圖 106A繪示在共培養經LNP-編碼CD19-41BBζ CAR及CD19-CD28ζ CAR之oRNA構築體以及HER2-41BBz、HER2-CD28z或對照LNP-oRNA mOX40L轉染的T細胞之後Nalm6腫瘤細胞之殺滅。
圖 106B提供經LNP-oRNA CAR構築體治療之T細胞上CAR表面表現之平均螢光強度(MFI)。
圖 107描繪在向小鼠給藥PBS、PBMC、LNP-編碼mOx40L之oRNA、LNP-編碼CD19-41BBζ (「CD19-41BBζ isCAR」)之oRNA、編碼CD19-CD28ζ (「CD19-CD28ζ isCAR」)之oRNA、LNP-編碼HER2-41BBz CAR (「HER2-41BBz isCAR」)之oRNA或LNP-編碼HER2-CD28z CAR (「HER2-CD28z isCAR」)之oRNA之後以總通量(以光子/秒為單位)量測之抗原依賴性腫瘤消退。不具有oRNA之PBS及PBMC溶液用作陰性對照。
圖 108A、
圖 108B及
圖 108C描繪肌管與肝細胞或肌管與T細胞中之IRES活性之間的相關性。各資料點指示含有於高斯螢光素酶編碼區前面之IRES之環狀RNA的平均表現值,其中各IRES包含選自SEQ ID NO: 1-2983及3282-3287之序列或其片段。以陣列格式合成含有IRES之環狀RNA且將其調配至LNP中,之後轉染至經活化原代人類T細胞、原代人類肌管及原代人類肝細胞中。以陽性對照IRES (SEQ ID NO: 3282)標準化所有資料點。
圖 109A、
圖 109B及
圖 109C描繪相對於常用IRES (EMCV、CVB3)的肝細胞(
圖 109A)、肌管(
圖 109B)及T細胞(
圖 109C)中之IRES活性。各資料點指示含有於高斯螢光素酶編碼區前面之IRES之環狀RNA的平均表現值,其中各IRES包含選自SEQ ID NO: 1-2983及3282-3287之序列或其片段。以陣列格式合成含有IRES之環狀RNA且將其調配至LNP中,之後轉染至經活化原代人類T細胞、原代人類肌管及原代人類肝細胞中。以陽性對照IRES (SEQ ID NO: 3282)標準化所有資料點。
<![CDATA[<110> 美商歐納醫療公司(ORNA THERAPEUTICS, INC.)]]> <![CDATA[<120> 環狀RNA組合物及方法]]> <![CDATA[<130> OBS-017WO]]> <![CDATA[<140>]]> <![CDATA[<141>]]> <![CDATA[<150> US 63/311,923]]> <![CDATA[<151> 2022-02-18]]> <![CDATA[<150> US 63/209,271]]> <![CDATA[<151> 2021-06-10]]> <![CDATA[<160> 3287 ]]> <![CDATA[<170> PatentIn version 3.5]]> <![CDATA[<210> 1]]> <![CDATA[<211> 367]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:人類副腸孤病毒4病毒株R12644/1999/HUN 5'UTR;及聚合蛋白質1序列]]> <![CDATA[<400> 1]]> tgaggtgtct gatgaggtgt gggaacttat tggaagtgat tacttgctgc aaagcatcct 60 attgccagcg gatcaacacc tggtgacagg tgcccctggg gccaaaagcc aaggtttaac 120 agaccctcta ggattggttt aaacctgagt agtcatggaa aatacttagt acctgccaat 180 ttggtaacag tgcaaacact agttgtaagg cccacgaagg atgcccagaa ggtacccgta 240 ggtaacaagt gacactgtgg atctgatctg gggccatcta cctctatctt ggtgaggtgg 300 ttaaaaaacg tctagtgggc caaacccagg ggggatccct ggtttccttt atcataccac 360 tatcatt 367 <![CDATA[<210> 2]]> <![CDATA[<211> 368]]> 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atcttggtga 300 cctggttaaa aaacgtctag tgggccaaac ccggggggga tccccggttt ctttttattt 360 tattaatagc att 373 <![CDATA[<210> 4]]> <![CDATA[<211> 389]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 佩吉病毒B]]> <![CDATA[<400> 4]]> ggcatgggtc cactggcgcg ctgacgaagg tgcgcgtgct ttgtaggcac ggtccacagg 60 tgtgcccact accggtgtga ataagtgggg gtctggagcg tcagacctta aacctagtgg 120 tgcctgggat cgcaacgtgg ctcacgtacg ccaacgccgc ttaaaacctt cgggacagct 180 atgcgggttg acaatggcag tgaggcgcgg caccgaccgt ggatccggaa tcggtgtgcg 240 agttccccag tcgctagccc gtaagggcaa gcatgggtcc ccccagctgg cgcagcgcta 300 catgcggcaa gaggaagaac cttcgggtga cctcgggggg aatgtccgtt ctcaatgagc 360 tgaggagcat cgcacggctc gtcgccaag 389 <![CDATA[<210> 5]]> <![CDATA[<211> 398]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 副腸孤病毒D]]> <![CDATA[<400> 5]]> ctacctatcc tacttcttgt atatcattct ttgctattaa gtagggatcc cctgctattt 60 gcaggtgtgc ttgcagtgga gctacacaac tgtggccgag gcacggctcg cccccgtgta 120 ttaggactct tttgtgccac tgttaagcgg acgtatgtca gttgagtgat atctcagtga 180 taaaccatga 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未知物描述:未分類RNA病毒ShiM-2016序列]]> <![CDATA[<400> 66]]> cccctaggat ccactggatg ttagtacact ggtatcgcgg tacctttgta cgcctgtttt 60 atatcccctt ccccgcaact ttagaagtat caaaagtacc gctcaatagc cgccacgctc 120 ccagtgtggt ttcgagcaag cacttctgtt ttcccggttg cgtcccatat gctgtgcaaa 180 cggcaaaaag ggacaatatc gttacccgct tgtatactac gggaaaccta gtaccgccat 240 tgattgtatt gagggttgcg ctcatcacct ttcccggtgt agctcaggct gatgaggctc 300 agaatccccc acaggtaact gtgtctgagc ctgcgttggc ggcctgccct cgccttatgg 360 cgtgggacgc tcactacatg acatggtgcg aagagtctac tgtgctatac aagagtcctc 420 cggcccctga atgtggataa tcctaaccac tgatcccacg tacgcaaacc agcgtgtagt 480 gggtcgtaac gcgcaagtcg gtggcggaac cgactacttt gggtgaccgt gtttccttta 540 ttacctattg aatgtttatg gtgacaattg tttgattcag ttgttaccat ttgctacatt 600 caataaccta gtgtcaaacc gattgaattg ctaca 635 <![CDATA[<210> 67]]> <![CDATA[<211> 636]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 奧西病毒A]]> <![CDATA[<400> 67]]> cctcggtccc tctttccgtc gccgcccacg acgttaaatg cggtgttgtg gtgcttaggt 60 gccacaccac tgctatttgg 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atggctaact gcttgtctta ttgcggccta 600 aggatgtcct gcaggtacct ttagataacc ttaagagact attgatctga gcaggagcca 660 aagtggtctt tcccagcttt ggttaaaaaa cgtctaagcc gcggcagggg gcgggaggcc 720 ccctttcctc ccaaaactta atattgattg t 751 <![CDATA[<210> 127]]> <![CDATA[<211> 751]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 腸病毒C]]> <![CDATA[<400> 127]]> gaaattaaaa cagctctggg gttgttccca ccccagaggc ccacgtggcg gctagtacac 60 tggtattacg gtacccttgt acgcctgttt tacacccctt tcccccgtaa cttagaagct 120 tttaaattca agttcaacag tgagtggtac aacccagtac tactatgaac aagcacttct 180 gttaccccgg tgagattgca taagctgtcc ccacggctaa aagcgattga tccgttatcc 240 gctcttgtac ttcgagaagc ccagtaaaac cttgggatcc tcgatgcgtt gcgctcaaca 300 ctcaacccca gagtgtagct tgggctgatg agtctgggca ttcctcaccg gcgacggtgg 360 tccaggctgc gttggcggcc tacctgtggc ccaaagccac aggacgctag ttgtgaacaa 420 ggtgtgaaga gcctattgag ctacaagaga gtcctccggc ccctgaatgc ggctaatccc 480 aaccacggag caggtgattg caacccagca actagcctgt cgtaacgcgc aagtctgtgg 540 cggaaccgac tactttgggt gtccgtgttt ccttttatta 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DNA]]> <![CDATA[<213> 腸病毒H]]> <![CDATA[<400> 806]]> ttaaaatagc tgctgggttg ttcccatcca gcaggcccac tgggcgtgat actctggtat 60 tgcggtacct ttgtatgcct attttacctc ccttccccct gaaacttaga agaaagaaac 120 aaacacgctc actaggtaca ctgcatccag cagtgtaatg agcaagcact tctgtttccc 180 cggaagggat atatggtacg ctgtgcaaac ggcggaaatt aatcctaccg ttaaccgccc 240 atctactccg agaagcctag tacctaattg aacttatcaa tggagttgcg ctcagcaggt 300 gaccctgacc tgccagctcc ggctgatgga cctgggcatc ccccacaggc gactgtggcc 360 caggtcgcgt ggcggccggc ccactctttt gagtgggacg ccttgataat gacaaggtgg 420 gaagagccta ttgggctagc tggtttcctc cggcctcctg aatgcggcta accctaaccc 480 cggagcatat ggtggcaacc cagccactgg tatgtcgtaa cgcgtaagtc tgggatggga 540 ccgactactt tggagagtcc gtgtttccat tattttcttt attgaatctt atggtgacaa 600 attgggagtt actcgggtga cgattgatta ttacttctga aaacgtagag atatagaatc 660 aacaca 666 <![CDATA[<210> 807]]> <![CDATA[<211> 667]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 未知物]]> <![CDATA[<220]]>>]]> <br/><![CDATA[<223> 未知物描述:未分類羅沙病毒序列]]> <br/> 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tttaactatg tttacttaag 420 catcattgac ttttgagtca acaaatacct taagtttccg ctcatctcct taccttcata 480 cgcaggccca taagcctata ttatttacct ctatttataa ttttaatcat taatctgcac 540 aattccaccg tttagacatt attagggttt ataacaacac taataattat tgtatgaaaa 600 ccagtagttc cagcgcgtcg tggcctattg acccccatac aaagttcata agaatagttt 660 tgctgttttc agtcattcat tctttccctt aaaaggtttg gtcacctata agtccagctc 720 attacatcga gtatggcaag tctgcccaac atttgttata tctgactctg gtgataataa 780 atgtggcggg ataaagttac aagtctagtt atatagacag ctttagctca aaaccccaat 840 ttcccccctt gtgtattatt attgtattat taattgtaat tatgtattta atgtaaattg 900 tacttttatc tatccaactt cttatttcaa ttttctatca agactttttt cttgtcgaaa 960 ctcaatatct 970 <![CDATA[<210> 1302]]> <![CDATA[<211> 975]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:卡爾法克斯病毒聚合蛋白質基因,部分cds.1序列]]> <![CDATA[<400> 1302]]> cacggggtta acacctcgtg cgatcttttc aaccacatat atatatattc tgggcggaat 60 attagaaaat cttgggatta tatatatgta attgatatat tgggcggaat atttgaaaat 120 cttgatatat ctcttacaaa attttgaaac caaccatttt agaataggtt tattagcgtg 180 acaaactatg cgacctgtag agaaaaatgt caaaatcaat acaaaatttt aaaatgttaa 240 aaatgtttat atatttagta aactcaagtt gaattgtgat agagaaggca agtaactacc 300 agatgactct tctcgcaaca ggattatccc agactgttgt tccagcaaat tgatggatgt 360 aaactaaatt tataatgata aatagttaag taggagaccc ttatggtact caagcttgta 420 ttaaaatttt taactataga tatgtattat tgaaatgtgt tctgtctctt atatgtacac 480 ccacgtagtc gtggtaccgc tataacgcca atcggactaa ataacaagaa tgtgaggttc 540 ctattgagat ttcaaaattt atcatattgt cacgaccaat ctctttgggt aaggacttgc 600 atggtatgcg aaaggtcgga ttgccagaat ctgcttgctg ctttctggat gtgtacacat 660 tttaatttta agatttatga tagttaattt gataatacaa ggacagtgcg ttttgtgacg 720 tgcttgtttg catctctgtc ttagatgaca ggtttctaca ctaggcgatg tgtagaagtg 780 tagacctcta atggtttggt gcatcgtgcc ccggttcttt ttcaaggctt ctccggttca 840 aagatagcgg aggacccccc tttgtaatgc agacaccatt gtggataatt tatctacaat 900 tcgaagcgat aatttttcca ttcatttttg tatctttaaa acttcttacg gagattttca 960 atattaacta gaaaa 975 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未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:薩利病毒A分離株BN-2,完整基因體.1序列]]> <![CDATA[<400> 1365]]> tatggcaggc gggcttgtgg acggcttcgg cccacccaca gcaagaatgc catcatctgt 60 cctcaccccc atgtttcccc tttctttccc tgcaaccgtt acgcttactc gcaggtgcat 120 ttgagtggtg cacgtgttga ataaacagct acactcacat gggggcgggt tttcccgccc 180 tgcggcctct cgcgaggccc acccctcccc ttcctcccat aactacagtg ctttggtagg 240 taagcatcct gatcccccgc ggaagctgct cacgtggcaa ctgtggggac ccagacaggt 300 tatcaaaggc acccggtctt tccgccttca ggagtatccc tgctagtgaa ttctagtagg 360 gctctgcttg gtgccaacct cccccaaatg cgcgctgcgg gagtgctctt ccccaactca 420 ccctagtatc ctctcatgtg tgtgcttggt cagcatatct gagacgatgt tccgctgtcc 480 cagaccagtc cagtaatgga cgggccagtg tgcgtagtcg tcttccggct tttccggcgc 540 atgtttggtg aaccggtggg gtaaggttgg tgtgcccaac gcccgtactt tggtgatacc 600 tcaagaccac ccaggaatgc cagggaggta ccccgcttca cagcgggatc tgaccctggg 660 ctaattgtct acggtggttc ttcttgcttc cacttctttc tactgttc 708 <![CDATA[<210> 1366]]> <![CDATA[<211> 484]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:薩利病毒屬分離株ETH_P14_2016聚合蛋白質基因,完整cds.1序列]]> <![CDATA[<400> 1366]]> gtgctttggc aggtaagcat cctgatcccc cgcggaagct gctcacgtgg caactgtggg 60 gacccagaca ggttatcaaa ggcacccggt ctttccgcct tcaggagtac cctcactagt 120 gaattctagt ggggctctgc ttggtgccaa cctcccccaa atgcgcgctg cgggagtgct 180 cttccccaac ccatcctagt accctctcat gtgtgtgctt ggtcagcaca tctgagacga 240 cgttccgctg tcccagacca gtccagtaat ggacgggcca gtgtgcgtag tcgtcttccg 300 gcttgtccgg cgcatgtttg gtgaaccggt ggggtaaggt tggtgtgccc aatgcccgta 360 ctttggtgat acctcaagac cacccaggaa tgccagggag gtaccccgcc tctcggcggg 420 atctgaccct gggctaattg tctacggtgg ttcttcttgc ttccactctt ttcttctgtt 480 cacg 484 <![CDATA[<210> 1367]]> <![CDATA[<211> 718]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:未分類薩利病毒序列]]> <![CDATA[<400> 1367]]> tttcgaccgc cttatggcag gcgggcttgt ggacggcttc ggcccaccca cagcaagaat 60 gccatcatct gtcctcaccc ccatttctcc cctccttccc ctgcaaccat tacgcttact 120 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ggctcccccc ccacctcgcg cggcccgagg gccgatacgc gggttggggg ggtagcgggg 60 gccggaggcc cccgcgttct agaatggtgt gatccgtcgc cgctccagcg gaaagcgggc 120 gggatctagt ggttagggtt gttcgcgtaa atcccacact agtggtacgc tcgtataacg 180 tgggagcagc cgggggggtc gacccccccc ctggcggctg ctgagcaccg gacgaagcgc 240 ggggggtgaa cgctaacccg cggcccgggc tgccaacgtt aggcacgtct tggctggaag 300 acgttaaaca cagggccccc cctcaaccct gatccgaggc cagagaccaa ggtacgccgc 360 ccttttaaag gcgttactcg tccaatagga tctctccggc gggttgtcaa accttgctgg 420 ccctggtgat ggttacggga gggggtgggg cggggagtag aagccccgcc cggcatgggg 480 gtaccaagct cggcacgccc agcacgcgtg gcgtagggga aaaatccttc gggtgacccc 540 tggtaccata aagtaattaa catgagcatg ccgctagggt gtgctttttc ttccttcctt 600 gggaaggcgg tggcacc 617 <![CDATA[<210> 2708]]> <![CDATA[<211> 617]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 格魯索匹病毒C]]> <![CDATA[<400> 2708]]> gccccgacga gtcccgtggg atacctggta cgtgccagga aaatcccacg ggactcgtcg 60 gggctttacc cctaatttca acgttggtcc acgaaacggc cgttctttct tttttcttct 120 attttcaatc ttgactccgc actgatcttt tggttctaga cacaggcgcg tttggttata 180 gagtaggatt tggatatagt tatgagaggg ttagccaacc cattctgaac cactttaagt 240 atgtcaatct gaattcatca gtaatatagc acaggaggtg gtgctgaaat attgcaagcc 300 actgttttat ttatatgaag aattcaagaa cctacttaag gtggtgatga aaaggctagg 360 tttatccata gtaatccctt gttctgaaaa ggtaatgcac agtccttagt aggatcttgg 420 gctctgcaac tggctctaaa ccgaccaatc taggtagagg cactaggtgt aggacttgcc 480 atattgtatt acaatctggt accgacaaaa tgtctggaaa ctccacactg agggtgatag 540 gggggggccc cttcacagtt gtgctactgc ttgatagagt tgcggctggt caacttagat 600 tggtataacc agtagaa 617 <![CDATA[<210> 2709]]> <![CDATA[<211> 620]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:未分類口瘡病毒序列]]> <![CDATA[<400> 2709]]> taccgcccat cccggtgtta aagggtgtaa ccacaagatg caccttcgtc ccggaagtaa 60 aacggcaatt tcacacagtt ttgcccgttt tcacgagaaa cgggacgtct gcgcacgaaa 120 cgcctgtcgc ttgaggagga cttgtacaaa cacgatctaa gcaggcctcc ccaactgaca 180 caaaccgtgc aatttggaac tccgcctggt ctttcctggt ctagaggggt gacactttgt 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tgcgaagagt ctactgcgct agttaagatt cctccggccc ctgaatgtgg 420 ctaatcctaa ccactgatcc tgtaagtaca cgccagtgcc cagcaggtcg taatgcgcaa 480 gtcggtggcg gaaccgacta ctttgggtgt ccgtgtttcc tttatttcct tattgaatgt 540 ttatggtgac aattgttgag tacagttgtt gccattattg cattctacaa acagtgaaca 600 aaccacacac caatatagca ca 622 <![CDATA[<210> 2711]]> <![CDATA[<211> 625]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:柑橘始葉蟎小核糖核酸樣病毒病毒株EKPLV.abc9,1序列]]> <![CDATA[<400> 2711]]> cctattgaga agtgaacttt cattttctat acaaagtgct atatttcgag cgacagtgta 60 aaactaaaca atagtgtaca taacttatta ctcaaaatat agttaagaca aaagtcctct 120 ggaccccagt ccagaggatc tttgtcttaa ctatattttg agtaataagt tatgtacact 180 attgtttagt tttacactgt cgctcgaaat atagcacttt gtatagaaaa tgaaagttca 240 cttctcaata ggagtatgta cttagtagat tatataacag ctgattatta ttggctgaaa 300 taatccgtaa taatcgtaag tcgattatat aagactacac gctcattttg tggttatttc 360 aaatttaaca acttttgaaa ccactttcat tttaagatgt gtgttctatt tatctagacg 420 catattcata ttcacttgtt tagtaatttc accctactaa actcgtattc acgatacgta 480 ttttccagaa ttagtttact aatgagatta tacgcattaa cattttcgtt agacttttga 540 tacatacaaa tctaaccctt gtttggtagg caagtacaac ctactggttt cccgagacct 600 atgaggggcc caataaatat gaaag 625 <![CDATA[<210> 2712]]> <![CDATA[<211> 625]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 腸病毒A]]> <![CDATA[<400> 2712]]> gctctgcaga tatcaatagc aggcatggcg cgccagtcat gtctagatca agcacttctg 60 tctccccgga tcgagtatca atagactgct agcgcggttg aaggagaaaa cgtccgttac 120 ccggctaact acttcgagaa acttagtagc atcattgaag ctgcggagtg tttcgctcag 180 cactccccca gtgtagatca ggtcgatgag tcactgcact ccccacgggc gaccgtggca 240 gtgactgcgt tggcggcctg cctatggggc aacccatagg acgctctaaa gtggacatgg 300 tgcgaagagt ctattgagct agttagtagt cctccggccc ctgaatgcgg ctaatcctaa 360 ctgcggagca catgccctca acccaggggg tggtgtgtcg taacgggcaa ctctgcagcg 420 gaaccgacta ctttgggtgt ccgtgtttct ttttattctt atattggctg cttatggtga 480 caattgagag attgttacca tatagctatt ggattggcca tccggtaacc aacagagcta 540 ttgtttacct gtttgttgga tacgtccctc 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未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:未分類禽肝病毒序列]]> <![CDATA[<400> 2714]]> ttttgaaagc cgggtgcatg catggccatt ttccagcaca ggttcagctg gtatggcatg 60 cgtgcatcga ctgcttgggg gtgtccctga cccccttaat tcaacgtcta gcccacgata 120 cgggcaccct atccaatttg tgtcccttta cctcccatgg attgacttgt attggatttg 180 gatctaaatt ggattaccct ttgtttgtgg tggttagcca accatgctct ggtgcaatgg 240 ttccatgtgt tcattctggc cacgtgccaa cctaggaggt ggtgctgaaa tatcgcaagc 300 cactagcgtt attacacttg gcctctggac acgtgggatt aattgcattc tgtacagagg 360 aaggctagtc tatgccttgg gctaatggtc ttcgttgtga aacggattac cggtagtagc 420 atcttagact accaaggttg taggtgagtg tgtggtctag agtaggcata catctgtcca 480 ggcacatgta cattgctacg attgctccag actagttcct gagggacaga tgttgtgggg 540 ggcttgggaa aaccccctta acctacactg cctgataggg tcgcggctgg tcgagtccca 600 cacactataa taccagtaga ttttcatgca 630 <![CDATA[<210> 2715]]> <![CDATA[<211> 633]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:未分類腸病毒序列]]> <![CDATA[<40]]>0> 2715]]> 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gggcctgtat 2100 aatgagctgc agaaagacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggaat gaagggcgag 2160 cgcagaagag gcaagggaca cgatggactg taccagggac tgagcaccgc caccaaggat 2220 acctatgacg ccctgcacat gcaggccctg cctccaagat aa 2262 <![CDATA[<210> 3162]]> <![CDATA[<211> 42]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 人工序列]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 人工序列描述:合成多肽]]> <![CDATA[<400> 3162]]> Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <![CDATA[<210> 3163]]> <![CDATA[<211> 112]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 人工序列]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 人工序列描述:合成多肽]]> <![CDATA[<400> 3163]]> Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu 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<![CDATA[<400> 3171]]> Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 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Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <![CDATA[<210> 3176]]> <![CDATA[<211> 215]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 人工序列]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 人工序列描述:合成多肽]]> <![CDATA[<400> 3176]]> Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 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Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu 165 170 175 Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser 180 185 190 Tyr Leu Asn Ala Ser 195 <![CDATA[<210> 3179]]> <![CDATA[<211> 306]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:IL-12B序列]]> <![CDATA[<400> 3179]]> Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr 1 5 10 15 Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu 20 25 30 Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly 35 40 45 Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly 50 55 60 Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu 65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys 85 90 95 Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys 100 105 110 Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr 115 120 125 Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln 130 135 140 Gly Val Thr 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Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <![CDATA[<210> 3182]]> <![CDATA[<211> 114]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:IL-15序列]]> <![CDATA[<400> 3182]]> Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 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Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155 <![CDATA[<210> 3184]]> <![CDATA[<211> 209]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:IL-27β序列]]> <![CDATA[<400> 3184]]> Arg Lys Gly Pro Pro Ala Ala Leu Thr Leu Pro Arg Val Gln Cys Arg 1 5 10 15 Ala Ser Arg Tyr Pro Ile Ala Val Asp Cys Ser Trp Thr Leu Pro Pro 20 25 30 Ala Pro Asn Ser Thr Ser Pro Val Ser Phe Ile Ala Thr Tyr Arg Leu 35 40 45 Gly Met Ala Ala Arg Gly His Ser Trp Pro Cys Leu Gln Gln Thr Pro 50 55 60 Thr Ser Thr Ser Cys Thr Ile Thr Asp Val Gln Leu Phe Ser Met Ala 65 70 75 80 Pro Tyr Val Leu Asn Val Thr Ala Val His Pro Trp Gly Ser Ser Ser 85 90 95 Ser Phe Val Pro Phe Ile Thr Glu His Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro 100 105 110 Glu Gly Val Arg Leu Ser Pro Leu Ala Glu Arg Gln Leu Gln Val Gln 115 120 125 Trp Glu Pro Pro Gly Ser Trp Pro Phe Pro Glu Ile Phe Ser Leu Lys 130 135 140 Tyr Trp Ile Arg Tyr Lys Arg Gln Gly Ala Ala Arg Phe His Arg Val 145 150 155 160 Gly Pro Ile Glu Ala Thr Ser Phe Ile Leu Arg Ala Val Arg Pro Arg 165 170 175 Ala Arg Tyr Tyr Val Gln Val Ala Ala Gln Asp Leu Thr Asp Tyr Gly 180 185 190 Glu Leu Ser Asp Trp Ser Leu Pro Ala Thr Ala Thr Met Ser Leu Gly 195 200 205 Lys <![CDATA[<210> 3185]]> <![CDATA[<211> 138]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:IFNγ序列]]> <![CDATA[<400> 3185]]> Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn 1 5 10 15 Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile 20 25 30 Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln 35 40 45 Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln 50 55 60 Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys 65 70 75 80 Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr 85 90 95 Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu 100 105 110 Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys 115 120 125 Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly 130 135 <![CDATA[<210> 3186]]> <![CDATA[<211> 112]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:TGFβ1序列]]> <![CDATA[<400> 3186]]> Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys 1 5 10 15 Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys 35 40 45 Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu 50 55 60 Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro 85 90 95 Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 <![CDATA[<210> 3187]]> <![CDATA[<211> 431]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:FOXP3序列]]> <![CDATA[<400> 3187]]> Met Pro Asn Pro Arg Pro Gly Lys Pro Ser Ala Pro Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 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<![CDATA[<211> 417]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:FOXP3序列]]> <![CDATA[<400> 3188]]> Met Pro Asn Pro Arg Pro Gly Lys Pro Ser Ala Pro Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gly Pro Ser Pro Gly Ala Ser Pro Ser Trp Arg Ala Ala Pro Lys Ala 20 25 30 Ser Asp Leu Leu Gly Ala Arg Gly Pro Gly Gly Thr Phe Gln Gly Arg 35 40 45 Asp Leu Arg Gly Gly Ala His Ala Ser Ser Ser Ser Leu Asn Pro Met 50 55 60 Pro Pro Ser Gln Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro Leu Val Met Val Ala 65 70 75 80 Pro Ser Gly Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His Leu Gln Ala Leu Leu 85 90 95 Gln Asp Arg Pro His Phe Met His Gln Leu Ser Thr Val Asp Ala His 100 105 110 Ala Arg Thr Pro Val Leu Gln Val His Pro Leu Glu Ser Pro Ala Met 115 120 125 Ile Ser Leu Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Gly Val Phe Ser Leu Lys 130 135 140 Ala Arg Pro Gly Leu Pro Pro Gly Ile Asn Val Ala Ser Leu Glu Trp 145 150 155 160 Val Ser Arg Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe Pro Asn Pro Ser Ala 165 170 175 Pro Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ala 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<![CDATA[<211> 207]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 人工序列]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 人工序列描述:合成多肽]]> <![CDATA[<400> 3271]]> Lys Asn Gln Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu Ile Ile Leu Glu Gly 1 5 10 15 Lys Asn Cys Thr Leu Gln Cys Asn Tyr Thr Val Ser Pro Phe Ser Asn 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Lys Gln Asp Thr Gly Arg Gly Pro Val Ser Leu Thr 35 40 45 Ile Met Thr Phe Ser Glu Asn Thr Lys Ser Asn Gly Arg Tyr Thr Ala 50 55 60 Thr Leu Asp Ala Asp Thr Lys Gln Ser Ser Leu His Ile Thr Ala Ser 65 70 75 80 Gln Leu Ser Asp Ser Ala Ser Tyr Ile Cys Val Val Asn His Ser Gly 85 90 95 Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val His 100 105 110 Pro Tyr Ile Gln Lys Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 130 135 140 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 145 150 155 160 Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 165 170 175 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala 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Asp Gly Leu Glu Ala Pro Val 755 760 765 Thr Glu Gly Pro Gly Ser Val Asp Glu Lys Leu Pro Ala Pro Glu Pro 770 775 780 Cys Val Gly Met Ser Cys Pro Pro Gly Trp Gly His Leu Asp Ala Thr 785 790 795 800 Ser Ala Gly Glu Lys Ala Pro Ser Pro Trp Gly Ser Ile Arg Thr Gly 805 810 815 Ala Gln Ala Ala His Val Trp Thr Pro Ala Ala Gly Ser Cys Ser Val 820 825 830 Ser Cys Gly Arg Gly Leu Met Glu Leu Arg Phe Leu Cys Met Asp Ser 835 840 845 Ala Leu Arg Val Pro Val Gln Glu Glu Leu Cys Gly Leu Ala Ser Lys 850 855 860 Pro Gly Ser Arg Arg Glu Val Cys Gln Ala Val Pro Cys Pro Ala Arg 865 870 875 880 Trp Gln Tyr Lys Leu Ala Ala Cys Ser Val Ser Cys Gly Arg Gly Val 885 890 895 Val Arg Arg Ile Leu Tyr Cys Ala Arg Ala His Gly Glu Asp Asp Gly 900 905 910 Glu Glu Ile Leu Leu Asp Thr Gln Cys Gln Gly Leu Pro Arg Pro Glu 915 920 925 Pro Gln Glu Ala Cys Ser Leu Glu Pro Cys Pro Pro Arg Trp Lys Val 930 935 940 Met Ser Leu Gly Pro Cys Ser Ala Ser Cys Gly Leu Gly Thr Ala Arg 945 950 955 960 Arg Ser Val Ala Cys Val Gln Leu Asp Gln Gly Gln Asp Val Glu Val 965 970 975 Asp Glu Ala Ala Cys Ala Ala Leu Val Arg Pro Glu Ala Ser Val Pro 980 985 990 Cys Leu Ile Ala Asp Cys Thr Tyr Arg Trp His Val Gly Thr Trp Met 995 1000 1005 Glu Cys Ser Val Ser Cys Gly Asp Gly Ile Gln Arg Arg Arg Asp 1010 1015 1020 Thr Cys Leu Gly Pro Gln Ala Gln Ala Pro Val Pro Ala Asp Phe 1025 1030 1035 Cys Gln His Leu Pro Lys Pro Val Thr Val Arg Gly Cys Trp Ala 1040 1045 1050 Gly Pro Cys Val Gly Gln Gly Thr Pro Ser Leu Val Pro His Glu 1055 1060 1065 Glu Ala Ala Ala Pro Gly Arg Thr Thr Ala Thr Pro Ala Gly Ala 1070 1075 1080 Ser Leu Glu Trp Ser Gln Ala Arg Gly Leu Leu Phe Ser Pro Ala 1085 1090 1095 Pro Gln Pro Arg Arg Leu Leu Pro Gly Pro Gln Glu Asn Ser Val 1100 1105 1110 Gln Ser Ser Ala Cys Gly Arg Gln His Leu Glu Pro Thr Gly Thr 1115 1120 1125 Ile Asp Met Arg Gly Pro Gly Gln Ala Asp Cys Ala Val Ala Ile 1130 1135 1140 Gly Arg Pro Leu Gly Glu Val Val Thr Leu Arg Val Leu Glu Ser 1145 1150 1155 Ser Leu Asn Cys Ser Ala Gly Asp Met Leu Leu Leu Trp Gly Arg 1160 1165 1170 Leu Thr Trp Arg Lys Met Cys Arg Lys Leu Leu Asp Met Thr Phe 1175 1180 1185 Ser Ser Lys Thr Asn Thr Leu Val Val Arg Gln Arg Cys Gly Arg 1190 1195 1200 Pro Gly Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Gly Ser Gln Leu Ala Pro 1205 1210 1215 Glu Thr Phe Tyr Arg Glu Cys Asp Met Gln Leu Phe Gly Pro Trp 1220 1225 1230 Gly Glu Ile Val Ser Pro Ser Leu Ser Pro Ala Thr Ser Asn Ala 1235 1240 1245 Gly Gly Cys Arg Leu Phe Ile Asn Val Ala Pro His Ala Arg Ile 1250 1255 1260 Ala Ile His Ala Leu Ala Thr Asn Met Gly Ala Gly Thr Glu Gly 1265 1270 1275 Ala Asn Ala Ser Tyr Ile Leu Ile Arg Asp Thr His Ser Leu Arg 1280 1285 1290 Thr Thr Ala Phe His Gly Gln Gln Val Leu Tyr Trp Glu Ser Glu 1295 1300 1305 Ser Ser Gln Ala Glu Met Glu Phe Ser Glu Gly Phe Leu Lys Ala 1310 1315 1320 Gln Ala Ser Leu Arg Gly Gln Tyr Trp Thr Leu Gln Ser Trp Val 1325 1330 1335 Pro Glu Met Gln Asp Pro Gln Ser Trp Lys Gly Lys Glu Gly Thr 1340 1345 1350 <![CDATA[<210> 3279]]> <![CDATA[<211> 150]]> <![CDATA[<212> RNA]]> <![CDATA[<213> 人工序列]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 人工]]>序列描述:合成聚核苷酸 <![CDATA[<400> 3279]]> aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 150 <![CDATA[<210> 3280]]> <![CDATA[<211> 5]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 人工序列]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 人工序列描述:合成肽]]> <![CDATA[<400> 3280]]> Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <![CDATA[<210> 3281]]> <![CDATA[<211> 15]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 人工序列]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 人工序列描述:合成肽]]> <![CDATA[<400> 3281]]> Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <![CDATA[<210> 3282]]> <![CDATA[<211> 549]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:CK1.4;山羊脊病毒變異體序列]]> <![CDATA[<400> 3282]]> gtggccacgc ccgggccacc gatacttccc ttcactcctt cgggactgtt ggggaggaac 60 acaacagggc tcccctgttt tcccattcct tccccctttt cccaacccca accgccgtat 120 ctggtggcgg caagacacac gggtctttcc ctctaaagca caattgtgtg tgtgtcccag 180 gtcctcctgc gtacggtgcg ggagtgctcc cacccaactg ttgtaagcct gtccaacgcg 240 tcgtcctggc aagactatga cgtcgcatgt tccgctgcgg atgccgaccg ggtaaccggt 300 tccccagtgt gtgtagtgcg atcttccagg tcctcctggt tggcgttgtc cagaaactgc 360 ttcaggtaag tggggtgtgc ccaatcccta caaaggttga ttctttcacc accttaggaa 420 tgctccggag gtaccccagc aacagctggg atctgaccgg aggctaattg tctacgggtg 480 gtgtttcctt tttcttttca cacaactcta ctgcgtacaa ctcactgact atccacttgc 540 tctgtcacg 549 <![CDATA[<210> 3283]]> <![CDATA[<211> 625]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:未分類小核糖核酸病毒目序列]]> <![CDATA[<400> 3283]]> attctcgggc tacggccctg gagccactcc ggctcctaaa gatttagaag tttgagcaca 60 cccgcccact agggcccccc atccaggggg gcaacgggca agcacttctg tttccccggt 120 atgatctgat aggctgtaac cacggctgaa acagagatta tcgttatccg cttcactact 180 tcgagaagcc tagtaatgat gggtgaaatt gaatccgttg atccggtgtc tcccccacac 240 cagaaactca tgatgagggt tgccatcccg gctacggcga cgtagcgggc atccctgcgc 300 tggcatgagg cctcttagga ggacggatga tatggatctt gtcgtgaaga gcctattgag 360 ctagtgtcga ctcctccgcc cccgtgaatg cggctaatcc taaccccgga gcaggtgggt 420 ccaatccagg gcctggcctg tcgtaatgcg taagtctggg acggaaccga ctactttcgg 480 gaaggcgtgt ttccatttgt tcattatttg tgtgtttatg gtgacaactc tgggtaaacg 540 ttctattgcg tttattgaga gattcccaac aattgaacaa acgagaacta cctgttttat 600 taaatttaca cagagaagaa ttaca 625 <![CDATA[<210> 3284]]> <![CDATA[<211> 630]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:未分類小核糖核酸病毒目序列]]> <![CDATA[<400> 3284]]> aacaaaaggc tacaccactt gggctacggc ccgcgccacc ttgtggcgca aagacattag 60 aagaatagca taccgcccac tagggccctg cagccagcag ggtaacgggc aagcacttct 120 gtctccccgg tagaacggta taggctgtac ccacggccga aaactgaact atcgttaccc 180 gactccgtac ttcgcaaagc ttagtaggaa actggaaagt tcgagttatt gacccggagt 240 gttcccccca ctccagaaac gcgtgatgag ggttgccacc ccgaccatgg cgacatggtg 300 ggcatccctg cgctggcacg cggcctctaa gaggataact cgctcctact ggtaaccgaa 360 gagccccgtg agctacggtt tattcctccg cctccctgaa tgcggctaat cctaacccat 420 gagcagttgc catagatcca tatggtggac tgtcgtaacg cgtaagttgt gggcggaacc 480 gactactttg ggatggcgtg tttccttgtt ttctccattt gttgttgtat ggtgacaagt 540 tatagatctc gatctatagc gtttcttgag agatttccaa acatttattc aagtcgtaca 600 attcttgtgt ttaagcagta cagtgtaacc 630 <![CDATA[<210> 3285]]> <![CDATA[<211> 653]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 薩利病毒A]]> <![CDATA[<400> 3285]]> tctgtcctca ccccatcttc ccttctttcc tgcaccgtta cgcttactcg catgtgcatt 60 gagtggtgca cgtgcttgaa caaacagcta cactcacatg ggggcgggtt ttcccgccct 120 gcggcctctc gcgaggccca cccctcccct tcctcccata actacagtgc tttggtaggt 180 aagcatcctg atcccccgcg gaagctgctc acgtggcaac tgtggggacc cagacaggtt 240 atcaaaggca cccggtcttt ccgccttcag gagtatccct gctagtgaat tctagtaggg 300 ctctgcttgg tgccaacctc ccccaaatgc gcgctgcggg agtgctcttc cccaactcac 360 cctagtatcc tctcatgtgt gtgcttggtc agcatatctg agacgatgtt ccgctgtccc 420 agaccagtcc agtaatggac gggccagtgt gcgtagtcgt cttccggctt gtccggcgca 480 tgtttggtga accggtgggg taaggttggt gtgcccaacg cccgtacttt ggtgatacct 540 caagaccacc caggaatgcc agggaggtac cccgcttcac agcgggatct gaccctgggc 600 taattgtcta cggtggttct tcttgcttcc acttctttct actgttcgcc acc 653 <![CDATA[<210> 3286]]> <![CDATA[<211> 675]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 愛知病毒A]]> <![CDATA[<400> 3286]]> cctacccaag ggttacatgg gaccatattc ctcctcccct gtaactttaa gttttgtgcc 60 cgtattcttg actccaggcg gatgttgtgt cgcccgtcct gtgaacaaac agctagacac 120 tttcctcccc tccctctggg ctgctccggc agtccactcc ctccccccag cgtaacatgc 180 cccgctggag tgatgcacct ggaagtcgtg gacgtgggtt agtaacttcg gtgaaaaccc 240 actataatga caactggttg acccccacac tcaaaggact cgagtctttc tcccttaagg 300 ctagcccggc cacatgaatt tgcagctggc aactagtgag tccaccatgt cccgcaacct 360 cggctgcgga gtgctgttcc ccaagcgtat gccttccttc tgtaagagtg cgcctggcaa 420 gcacatctga gaagtcgttc cgctgcgtcg tgccaacctg gcgacaggtg acccagtgtg 480 cgtagacttc ttccggattc gtccggctct tctctaggaa acatgcgtgt aaggttcatg 540 tgccaaagcc ctgcgcgcgg tgttcttcta ctgccctagg aatgtgccgc aggtacccct 600 acttcggtag ggatctgagc ggtagctaat tgtctacggg tagtttcatt tccatcttct 660 cttcaggtcg acatc 675 <![CDATA[<210> 3287]]> <![CDATA[<211> 675]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> 未知物]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 未知物描述:未分類小核糖核酸病毒目序列]]> <![CDATA[<400> 3287]]> accgttacgc accactcagt tggtgtttgg tggcaccaat gatggaacaa aaggctacac 60 cacttgggct acggcccgcg ccaccttgtg gcgcaaagac attagaagaa tagcataccg 120 cccactaggg ccctgcagcc agcagggtaa cgggcaagca cttctgtctc cccggtagaa 180 cggtataggc tgtacccacg gccgaaaact gaactatcgt tacccgactc cgtacttcgc 240 aaagcttagt aggaaactgg aaagttcgag ttattgaccc ggagtgttcc ccccactcca 300 gaaacgcgtg atgagggttg ccaccccgac catggcgaca tggtgggcat ccctgcgctg 360 gcacgcggcc tctaagagga taactcgctc ctactggtaa ccgaagagcc ccgtgagcta 420 cggtttattc ctccgcctcc ctgaatgcgg ctaatcctaa cccatgagca gttgccatag 480 atccatatgg tggactgtcg taacgcgtaa gttgtgggcg gaaccgacta ctttgggatg 540 gcgtgtttcc ttgttttctc catttgttgt tgtatggtga caagttatag atctcgatct 600 atagcgtttc ttgagagatt tccaaacatt tattcaagtc gtacaattct tgtgtttaag 660 cagtacagtg taagg 675
8:環狀RNA
30:5'增強型外顯子元件;5'外顯子元件
40:核心功能元件
50:3'增強型外顯子元件;3'外顯子元件
Claims (222)
- 一種前驅體RNA聚核苷酸,其按以下次序包含: a. 5'增強型內含子元件, b. 5'增強型外顯子元件, c. 核心功能元件, d. 3'增強型外顯子元件,及 e. 3'增強型內含子元件, 其中該核心功能元件按以下次序包含: i. 轉譯起始元件(TIE), ii. 編碼元件,及 iii. 視情況,終止密碼子或終止卡匣。
- 一種前驅體RNA聚核苷酸,其按以下次序包含: a. 5'增強型內含子元件, b. 5'增強型外顯子元件, c. 核心功能元件, d. 3'增強型外顯子元件,及 e. 3'增強型內含子元件 其中該核心功能元件按以下次序包含: i. 編碼區, ii. 視情況,終止密碼子或終止卡匣,及 iii. 轉譯起始元件(TIE)。
- 一種前驅體RNA聚核苷酸,其按以下次序包含: a. 5'增強型內含子元件, b. 5'增強型外顯子元件, c. 核心功能元件, d. 3'增強型外顯子元件,及 e. 3'增強型內含子元件, 其中該核心功能元件包含非編碼元件。
- 如請求項1或2之前驅體RNA聚核苷酸,其中該TIE包含非轉譯區(UTR)或其片段、適體複合物或其片段、或其組合。
- 如請求項4之前驅體RNA聚核苷酸,其中該UTR或其片段衍生自病毒或真核信使RNA。
- 如請求項5之前驅體RNA聚核苷酸,其中該UTR或其片段包含病毒內部核糖體進入位點(IRES)或真核IRES。
- 如請求項1或2之前驅體RNA聚核苷酸,其中該核心功能元件包含兩個或更多個內部核糖體進入位點(IRES)。
- 如請求項7之前驅體RNA聚核苷酸,其中該核心功能元件包含TIE、編碼元件、終止序列、視情況間隔子、TIE、編碼元件及終止序列,其中該TIE包含IRES。
- 如請求項6至8中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該IRES包含選自SEQ ID NO: 1-2983及3282-3287之序列或其片段。
- 如請求項6至9中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該IRES包含選自SEQ ID NO: 75、77、137、532、566、582、648、680、693、752、785、787、791、793、820、823、839、840、843、852、857、861、862、863、864、871、874、876、922、959、983、984、1015、1017、1023、1026、1031、1041、1047、1059、1068、1134、1168、1169、1171、1177、1178、1179、1180、1189、1192、1193、1198、1216、1218、1230、1263、1276、1280、1282、1284、1287、1346、1354、1364、1367、1370、1432、1438、1440、2285、2465、2601、2615、2616、2617、2618、2627、2667、2681、2742、2746、2758、2777、2778、3282、3283、3286及3287之序列或其片段。
- 如請求項6至8中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中與野生型病毒IRES或真核IRES相比,該IRES包含一或多個經修飾核苷酸。
- 如請求項6至11中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該IRES能夠便於該前驅體RNA編碼之蛋白質於細胞中表現。
- 如請求項12之前驅體RNA聚核苷酸,其中該IRES能夠便於該蛋白質表現,使得該蛋白質之表現量與使用對照IRES時相當或較高。
- 如請求項13之前驅體RNA聚核苷酸,其中該對照IRES包含SEQ ID NO: 3282之序列。
- 如請求項12至14中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該IRES衍生自腸病毒、脊病毒(Kobuvirus)、副腸孤病毒(Parechovirus)或心病毒(Cardiovirus)。
- 如請求項12至15中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該IRES衍生自腸病毒或脊病毒。
- 如請求項12至14中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該細胞為肌管(myotube)。
- 如請求項17之前驅體RNA聚核苷酸,其中該IRES衍生自博匹病毒(Bopivirus)、奧西病毒(Oscivirus)、亨尼病毒(Hunnivirus)、帕塞里病毒(Passerivirus)、密斯齊病毒(Mischivirus)、脊病毒、腸病毒、心病毒、薩利病毒(Salivirus)、拉博病毒(Rabovirus)、副腸孤病毒、加利病毒(Gallivirus)或斯西尼病毒(Sicinivirus)。
- 如請求項17之前驅體RNA聚核苷酸,其中該IRES衍生自亨尼病毒、帕塞里病毒、脊病毒、博匹病毒或腸病毒。
- 如請求項17之前驅體RNA聚核苷酸,其中該IRES衍生自腸病毒I、腸病毒F、腸病毒E、腸病毒J、腸病毒C、腸病毒A、腸病毒B、愛知病毒(Aichivirus) B、副腸孤病毒A、心病毒F、心病毒B或心病毒E。
- 如請求項17之前驅體RNA聚核苷酸,其中該IRES包含選自SEQ ID NO: 137、580、785、791、820、922、1041、1047、1068、1168、1169、1171、1177、1178、1179、1180、1189、1192、1263、1276、1280、1282、1284、1287、1354、1356、1432、1436、1439、1440、2285、2667、2746、2777、2778、3283及3284之序列。
- 如請求項12至14中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該細胞為肝細胞。
- 如請求項22之前驅體RNA聚核苷酸,其中該IRES衍生自腸病毒、博匹病毒、密斯齊病毒、加利病毒、奧西病毒、心病毒、脊病毒、拉博病毒、薩利病毒、副腸孤病毒、亨尼病毒、鳥取病毒(Tottorivirus)、帕塞里病毒、科薩病毒(Cosavirus)或斯西尼病毒。
- 如請求項23之前驅體RNA聚核苷酸,其中該IRES衍生自腸病毒、密斯齊病毒、脊病毒、博匹病毒或加利病毒。
- 如請求項23之前驅體RNA聚核苷酸,其中該IRES衍生自腸病毒B、腸病毒A、腸病毒D、腸病毒J、腸病毒C、鼻病毒B、腸病毒H、腸病毒I、腸病毒E、腸病毒F、愛知病毒B、愛知病毒A、副腸孤病毒A、心病毒F、心病毒E或心病毒B。
- 如請求項22之前驅體RNA聚核苷酸,其中該IRES包含選自SEQ ID NO: 137、580、648、693、752、785、791、793、820、823、839、840、861、862、863、876、922、959、983、984、1015、1017、1023、1026、1031、1041、1047、1059、1068、1134、1168、1169、1171、1177、1178、1179、1180、1189、1192、1193、1198、1216、1263、1276、1280、1282、1284、1287、1346、1354、1356、1432、1436、1438、1439、1440、2285、2777、2778、3283及3284之序列。
- 如請求項12至14中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該細胞為T細胞。
- 如請求項27之前驅體RNA聚核苷酸,其中該IRES衍生自帕塞里病毒、博匹病毒、亨尼病毒、密斯齊病毒、腸病毒、脊病毒、拉博病毒、鳥取病毒、薩利病毒、心病毒、副腸孤病毒、美格瑞病毒(Megrivirus)、青蔥X病毒(Allexivirus)或山巴病毒(Shanbavirus)。
- 如請求項28之前驅體RNA聚核苷酸,其中該IRES衍生自帕塞里病毒、亨尼病毒、密斯齊病毒、腸病毒或脊病毒。
- 如請求項28之前驅體RNA聚核苷酸,其中該IRES衍生自腸病毒I、腸病毒D、腸病毒C、腸病毒A、腸病毒J、腸病毒H、愛知病毒B、副腸孤病毒A或心病毒B。
- 如請求項27之前驅體RNA聚核苷酸,其中IRES包含選自SEQ ID NO: 77、787、793、820、839、840、843、852、857、861、862、863、864、871、874、876、959、1193、1216、1284、1287、1346、1356、1364、1432、1438、1440、2667、2681、2742、2746、2758、3283及3284之序列。
- 如請求項4之前驅體RNA聚核苷酸,其中該適體複合物或其片段包含天然或合成適體序列。
- 如請求項4之前驅體RNA聚核苷酸,其中該適體複合物或其片段包含選自SEQ ID NO: 3266-3268之序列。
- 如請求項4之前驅體RNA聚核苷酸,其中該適體複合物或其片段包含超過一種適體。
- 如請求項1或2之前驅體RNA聚核苷酸,其中該TIE包含UTR及適體複合物。
- 如請求項35之前驅體RNA聚核苷酸,其中該UTR位於該適體複合物上游。
- 如請求項1或2之前驅體RNA聚核苷酸,其中該TIE進一步包含輔助元件。
- 如請求項37之前驅體RNA聚核苷酸,其中該輔助元件包含miRNA結合位點或其片段、限制位點或其片段、RNA編輯模體或其片段、郵遞密碼(zip code)元件或其片段、RNA運輸(trafficking)元件或其片段、或其組合。
- 如請求項37之前驅體RNA聚核苷酸,其中該輔助元件包含針對IRES異側作用因子(transacting factor)(ITAF)之結合域。
- 如請求項39之前驅體RNA聚核苷酸,其中該結合域包含聚A區、聚C區、聚AC區、聚嘧啶束(tract),或其組合或變異體。
- 如請求項39之前驅體RNA聚核苷酸,其中該ITAF包含聚(rC)結合蛋白1 (PCBP1)、PCBP2、PCBP3、PCBP4、聚(A)結合蛋白1 (PABP1)、聚嘧啶束結合蛋白(PTB)、阿爾戈瑙特蛋白家族(Argonaute protein family)成員、HNRNPK (異質核核糖核蛋白K蛋白),或La蛋白,或其片段或組合。
- 如請求項1或2之前驅體RNA聚核苷酸,其中該編碼元件包含編碼治療性蛋白之序列。
- 如請求項42之前驅體RNA聚核苷酸,其中該治療性蛋白包含嵌合蛋白。
- 如請求項43之前驅體RNA聚核苷酸,其中該嵌合蛋白包含嵌合抗原受體(CAR)、T細胞受體(TCR)、B細胞受體(BCR)、免疫細胞活化或抑制性受體、重組融合蛋白、嵌合突變蛋白,或融合蛋白,或其組合。
- 如請求項42之前驅體RNA聚核苷酸,其中該治療性蛋白包含抗體、奈米抗體、非抗體蛋白、免疫調節性配位體、受體、結構蛋白、生長因子配位體或受體、激素或激素受體、轉錄因子、檢查點抑制劑或促效劑、Fc融合蛋白、抗凝劑、凝血因子、伴護蛋白、抗微生物蛋白、結構蛋白、生物化學酶、緊密型連結蛋白、粒線體壓力反應蛋白、細胞骨架蛋白、金屬結合蛋白,或小分子。
- 如請求項45之前驅體RNA聚核苷酸,其中該免疫調節性配位體包含干擾素、細胞介素、趨化因子或介白素。
- 如請求項45之前驅體RNA聚核苷酸,其中該結構蛋白為通道蛋白或核孔蛋白。
- 如請求項3之前驅體RNA聚核苷酸,其中該非編碼元件包含超過一個非編碼元件。
- 如請求項3或48之前驅體RNA聚核苷酸,其中該非編碼元件之長度包含50至15,000個核苷酸。
- 如請求項1或2中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該核心功能元件包含終止序列。
- 如請求項50之前驅體RNA聚核苷酸,其中該終止序列位於該3'增強型外顯子元件之5'端。
- 如請求項50之前驅體RNA聚核苷酸,其中該終止序列為終止密碼子。
- 如請求項50之前驅體RNA聚核苷酸,其中該終止序列為終止卡匣。
- 如請求項53之前驅體RNA聚核苷酸,其中該終止卡匣包含於一或多個框架中之一或多個終止密碼子。
- 如請求項54之前驅體RNA聚核苷酸,其中各框架包含終止密碼子。
- 如請求項54之前驅體RNA聚核苷酸,其中各框架包含兩個或更多個終止密碼子。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'增強型內含子元件包含3'內含子片段。
- 如請求項57之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'內含子片段進一步包含3'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第一核苷酸或第一核苷酸及第二核苷酸。
- 如請求項58之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'內含子片段位於該5'增強型內含子元件之3'端。
- 如請求項58之前驅體RNA聚核苷酸,其中該第I組內含子包含或衍生自細菌噬菌體、病毒載體、胞器基因體、核rDNA基因。
- 如請求項60之前驅體RNA聚核苷酸,其中該核rDNA基因包含衍生自真菌、植物或藻類之核rDNA基因或其片段。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'增強型內含子元件包含位於5'端之前導非轉譯序列。
- 如請求項62之前驅體RNA聚核苷酸,其中該前導非轉譯序列包含間隔子。
- 如請求項62之前驅體RNA聚核苷酸,其中該前導非轉譯序列包含轉錄起始位點之最後一個核苷酸。
- 如請求項64之前驅體RNA聚核苷酸,其中該前導非轉譯序列包含1至100個額外核苷酸。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'增強型內含子元件包含5'親和序列。
- 如請求項66之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'親和序列包含聚A、聚AC或聚嘧啶序列。
- 如請求項67之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'親和序列包含10至100個核苷酸。
- 如請求項1至3或57至68中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'增強型內含子元件包含5'外部間隔子序列。
- 如請求項69之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'外部間隔子序列位於該5'親和序列與該3'內含子片段之間。
- 如請求項69之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'外部間隔子序列之長度為約6至60個核苷酸。
- 如請求項69之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'外部間隔子序列包含以下或由以下組成:選自SEQ ID NO: 3094-3152之序列。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'增強型內含子元件按以下次序包含: a. 前導非轉譯序列; b. 5'親和序列; c. 5'外部間隔子序列;及 d. 包括3'第I組內含子剪接位點之第一核苷酸的3'內含子片段; 其中該前導非轉譯序列包含轉錄起始位點之最後一個核苷酸、及1至100個核苷酸。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'增強型內含子元件按以下次序包含 a. 前導非轉譯序列; b. 5'外部間隔子序列; c. 5'親和序列;及 d. 包括3'第I組剪接位點之第一核苷酸的3'內含子片段; 其中該前導非轉譯序列包含轉錄起始位點之最後一個核苷酸、及1至100個核苷酸。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'增強型內含子元件按以下次序包含: a. 前導非轉譯序列; b. 5'親和序列; c. 5'外部間隔子序列;及 d. 包括3'第I組內含子剪接位點之第一核苷酸及第二核苷酸的3'內含子片段; 其中該前導非轉譯序列包含轉錄起始位點之最後一個核苷酸、及1至100個核苷酸;且其中該5'增強型外顯子元件包含缺乏3'第I組剪接位點二核苷酸之第二核苷酸的3'外顯子片段。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'增強型內含子元件按以下次序包含: a. 前導非轉譯序列; b. 5'外部間隔子序列; c. 5'親和序列;及 d. 包括3'第I組剪接位點之第一核苷酸及第二核苷酸的3'內含子片段; 其中該前導非轉譯序列包含轉錄起始位點之最後一個核苷酸、及1至100個核苷酸;且其中該5'增強型外顯子元件包含缺乏3'第I組剪接位點二核苷酸之第二核苷酸的3'外顯子片段。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'增強型外顯子元件包含3'外顯子片段。
- 如請求項77之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'外顯子片段進一步包含3'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第二核苷酸。
- 如請求項78之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'外顯子片段包含1至100個衍生自天然外顯子之天然核苷酸。
- 如請求項79之前驅體RNA聚核苷酸,其中該天然外顯子衍生自含有第I組內含子之基因或其片段。
- 如請求項79之前驅體RNA聚核苷酸,其中該天然外顯子衍生自念珠藻屬(anabaena)細菌、T4噬菌體病毒、托沃特噬菌體(twort bacteriophage)、鳥類眼原蟲(tetrahymena)或固氮弧菌屬(azoarcus)細菌。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'增強型外顯子元件包含位於該3'外顯子片段下游之5'內部間隔子序列。
- 如請求項82之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'內部間隔子序列之長度為約6至60個核苷酸。
- 如請求項83之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'內部間隔子序列包含以下或由以下組成:選自SEQ ID NO: 3094-3152之序列。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'增強型外顯子元件按以下次序包含: a. 包括3'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第二核苷酸的3'外顯子片段;及 b. 5'內部間隔子序列, 其中該3'外顯子片段包含1至100個衍生自天然外顯子之天然核苷酸。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'增強型外顯子元件按以下次序包含: a. 3'外顯子片段;及 b. 5'內部間隔子序列, 其中該3'外顯子片段包含1至100個衍生自天然外顯子之天然核苷酸;且其中該5'增強型內含子元件包含含有3'第I組剪接位點二核苷酸之第一核苷酸及第二核苷酸的3'內含子片段。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'增強型外顯子元件包含5'外顯子片段。
- 如請求項87之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'外顯子片段包含5'第I組內含子片段之第一核苷酸。
- 如請求項87之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'外顯子片段進一步包含1至100個衍生自天然外顯子之核苷酸。
- 如請求項87之前驅體RNA聚核苷酸,其中該天然外顯子衍生自含有第I組內含子之基因或其片段。
- 如請求項1至3或87中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'增強型外顯子元件包含3'內部間隔子序列。
- 如請求項91之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'內部間隔子序列位於該終止序列與該5'外顯子片段之間。
- 如請求項91之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'內部間隔子之長度為約6至60個核苷酸。
- 如請求項91之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'內部間隔子包含以下或由以下組成:選自SEQ ID NO: 3094-3152之序列。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'增強型外顯子元件包含: a. 3'內部間隔子序列;及 b. 包括5'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第一核苷酸的5'外顯子片段, 其中該5'外顯子片段包含1至100個衍生自天然外顯子之核苷酸。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'增強型外顯子元件包含: a. 3'內部間隔子序列;及 b. 5'外顯子片段, 其中該5'外顯子片段包含1至100個衍生自天然外顯子之核苷酸;其中該3'增強型內含子元件包含含有5'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第一核苷酸及第二核苷酸的5'內含子片段。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'增強型內含子元件包含5'內含子片段。
- 如請求項97之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'內含子片段包含5'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第二核苷酸。
- 如請求項1至3或96至98中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'增強型內含子元件包含位於該5'內含子之3'端之尾隨(trailing)非轉譯序列。
- 如請求項99之前驅體RNA聚核苷酸,其中該尾隨非轉譯序列包含3至12個核苷酸。
- 如請求項1至3或96至100中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'增強型內含子片段包含3'外部間隔子序列。
- 如請求項101之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'外部間隔子序列位於該5'內含子片段與尾隨非轉譯序列之間。
- 如請求項101之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'外部間隔子序列之長度為6至60個核苷酸。
- 如請求項101之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'外部間隔子序列包含以下或由以下組成:選自SEQ ID NO: 3094-3152之序列。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'增強型內含子元件包含3'親和序列。
- 如請求項105之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'親和序列位於該3'外部間隔子序列與該尾隨非轉譯序列之間。
- 如請求項105之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'親和序列包含聚A、聚AC或聚嘧啶序列。
- 如請求項105之前驅體RNA聚核苷酸,其中該親和序列包含10至100個核苷酸。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'增強型內含子元件進一步包含5'外部雙螺旋體序列;其中該3'增強型內含子元件進一步包含3'外部雙螺旋體序列。
- 如請求項109之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'外部雙螺旋體序列與3'外部雙螺旋體序列彼此完全或部分互補。
- 如請求項109之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'外部雙螺旋體序列包含完全合成或部分合成核苷酸。
- 如請求項109之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'外部雙螺旋體序列包含完全合成或部分合成核苷酸。
- 如請求項109之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'外部雙螺旋體序列為約6至約50個核苷酸。
- 如請求項109之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'外部雙螺旋體序列為約6至約50個核苷酸。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'增強型外顯子元件進一步包含5'內部雙螺旋體序列;其中該3'增強型外顯子元件進一步包含3'內部雙螺旋體序列。
- 如請求項115之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'內部雙螺旋體序列與3'內部雙螺旋體序列彼此完全或部分互補。
- 如請求項115之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'內部雙螺旋體序列包含完全合成或部分合成核苷酸。
- 如請求項115之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'內部雙螺旋體序列包含完全合成或部分合成核苷酸。
- 如請求項115之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'內部雙螺旋體序列為約6至約19個核苷酸。
- 如請求項115之前驅體RNA聚核苷酸,其中該5'內部雙螺旋體序列為約6至約19個核苷酸。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'增強型內含子片段按以下次序包含: a. 包括5'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第二核苷酸的5'內含子片段; b. 3'外部間隔子序列;及 c. 3'親和序列。
- 如請求項1至3中任一項之前驅體RNA聚核苷酸,其中該3'增強型內含子片段按以下次序包含: a. 包括5'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第一核苷酸及第二核苷酸的5'內含子片段; b. 3'外部間隔子序列;及 c. 3'親和序列 其中該3'增強型外顯子元件包含缺乏5'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第一核苷酸的5'外顯子片段。
- 如請求項1或2之前驅體RNA聚核苷酸,其按以下次序包含: a. 前導非轉譯序列; b. 5'親和序列; c. 5'外部雙螺旋體序列; d. 5'間隔子序列; e. 3'內含子片段; f. 3'外顯子片段; g. 5'內部雙螺旋體序列 h. 5'內部間隔子序列; i. 轉譯起始元件; j. 編碼元件; k. 終止序列; l. 3'內部間隔子序列; m. 3'內部雙螺旋體序列; n. 5'外顯子片段; o. 5'內含子片段; p. 3'外部雙螺旋體序列; q. 3'親和序列;及 r. 尾隨非轉譯序列。
- 如請求項3之前驅體RNA聚核苷酸,其按以下次序包含: a. 前導非轉譯序列; b. 5'親和序列; c. 5'外部間隔子序列; d. 3'內含子片段; e. 3'外顯子片段; f. 5'內部雙螺旋體序列; g. 5'內部間隔子序列; h. 非編碼元件; i. 3'內部間隔子序列; j. 3'內部雙螺旋體序列; k. 5'外顯子片段; l. 5'內含子片段; m. 3'外部間隔子序列; n. 3'親和序列;及 o. 尾隨非轉譯序列。
- 如請求項1或2之前驅體RNA聚核苷酸,其按以下次序包含: a. 前導非轉譯序列; b. 5'親和序列; c. 5'外部間隔子序列; d. 3'內含子片段; e. 3'外顯子片段; f. 5'內部雙螺旋體序列; g. 5'內部間隔子序列; h. 轉譯起始元件; i. 編碼元件; j. 終止序列; k. 3'內部間隔子序列; l. 3'內部雙螺旋體序列; m. 5'外顯子片段; n. 5'內含子片段; o. 3'外部間隔子序列;及 p. 3'親和序列。
- 如請求項1或2之前驅體RNA聚核苷酸,其按以下次序包含: a. 前導非轉譯序列; b. 5'親和序列; c. 5'外部間隔子序列; d. 3'內含子片段; e. 3'外顯子片段; f. 5'內部間隔子序列; g. 轉譯起始元件; h. 編碼元件; i. 終止序列; j. 3'內部間隔子序列; k. 5'外顯子片段; l. 5'內含子片段; m. 3'外部間隔子序列;及 n. 3'親和序列。
- 如請求項3之前驅體RNA聚核苷酸,其按以下次序包含: a. 前導非轉譯序列; b. 5'親和序列; c. 5'外部間隔子序列; d. 3'內含子片段; e. 3'外顯子片段; f. 5'內部間隔子序列; g. 非編碼元件; h. 3'內部間隔子序列; i. 5'外顯子片段; j. 5'內含子片段; k. 3'外部間隔子序列; l. 3'親和序列;及 m. 尾隨非轉譯序列。
- 如請求項3之前驅體RNA聚核苷酸,其按以下次序包含: a. 前導非轉譯序列; b. 5'親和序列; c. 5'外部雙螺旋體序列; d. 5'間隔子序列; e. 3'內含子片段; f. 3'外顯子片段; g. 5'內部雙螺旋體序列 h. 5'內部間隔子序列; i. 終止序列; j. 編碼元件; k. 轉譯起始元件; l. 3'內部間隔子序列; m. 3'內部雙螺旋體序列; n. 5'外顯子片段; o. 5'內含子片段; p. 3'外部雙螺旋體序列; q. 3'親和序列;及 r. 尾隨非轉譯序列。
- 如請求項1或2之前驅體RNA聚核苷酸,其中該編碼元件包含兩個或更多個蛋白質編碼區。
- 如請求項129之前驅體RNA聚核苷酸,其包含編碼於第一表現序列與第二表現序列之間的蛋白水解裂解位點或核糖體卡頓(stuttering)元件之聚核苷酸序列。
- 如請求項130之前驅體RNA聚核苷酸,其中該核糖體卡頓元件為自裂解間隔子。
- 如請求項129之前驅體RNA聚核苷酸,其包含編碼2A核糖體卡頓肽之聚核苷酸序列。
- 一種環狀RNA聚核苷酸,其由如請求項1至8中任一項之前驅體RNA聚核苷酸產生。
- 如請求項133之環狀RNA聚核苷酸,其由天然核苷酸組成。
- 如請求項134之環狀RNA聚核苷酸,其中蛋白質編碼或非編碼序列經密碼子最佳化。
- 如請求項133至135中任一項之環狀RNA聚核苷酸,其中該環狀RNA聚核苷酸之長度為約0.1至約15千鹼基。
- 如請求項133至136中任一項之環狀RNA聚核苷酸,其經最佳化而缺乏至少一個存在於等效預最佳化聚核苷酸中之微小RNA結合位點。
- 如請求項133至137中任一項之環狀RNA聚核苷酸,其經最佳化而缺乏至少一個存在於等效預最佳化聚核苷酸中之RNA編輯敏感位點。
- 如請求項133至138中任一項之環狀RNA聚核苷酸,其在人類活體內治療作用持續時間為至少20小時。
- 如請求項133至139中任一項之環狀RNA聚核苷酸,其具有功能性半衰期至少6小時。
- 如請求項133至140之環狀RNA聚核苷酸,其在人類細胞中之治療作用持續時間長於或等於包含相同表現序列之等效線性RNA聚核苷酸之治療作用持續時間。
- 如請求項133至141之環狀RNA聚核苷酸,其在人類活體內治療作用持續時間長於具有相同表現序列之等效線性RNA聚核苷酸之活體內治療作用持續時間。
- 如請求項133至142中任一項之環狀RNA聚核苷酸,其中該前驅體RNA聚核苷酸係自包含PCR產物、線性化質體、非線性化質體、線性化微型環、非線性化微型環、病毒載體、黏質體、ceDNA或人工染色體之載體或DNA轉錄。
- 一種製造轉譯起始元件(TIE)之方法,其包含: a. 獲得病毒非轉譯區(UTR); b. 確定該UTR能夠結合至起始因子及/或藉由使序列進行缺失來起始轉譯之功能單元; c. 移除該UTR之非功能單元;及 d. 視情況修飾該UTR之端。
- 如請求項144之方法,其中對該UTR之該等端之修飾為病毒UTR之約1%至75%。
- 如請求項144或145之方法,其中該UTR之功能單元係藉由自該UTR之5'端及3'端之缺失掃描或跨該UTR長度之突變掃描以鑑別重要區域來確定。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項133至143中任一項之環狀RNA聚核苷酸、奈米粒子及視情況可操作地連接至該奈米粒子之靶向部分。
- 如請求項147之醫藥組合物,其中該奈米粒子為脂質奈米粒子、核-殼奈米粒子、生物可降解奈米粒子、生物可降解脂質奈米粒子、聚合物奈米粒子、聚合複合體(polyplex),或生物可降解聚合物奈米粒子。
- 如請求項147或148之醫藥組合物,其包含靶向部分,其中該靶向部分介導受體介導之胞吞作用、胞內體融合,或直接融合至所選細胞群體或組織之選定細胞中,在細胞分離或純化不存在下。
- 如請求項147至149中任一項之醫藥組合物,其包含可操作地連接至該奈米粒子之靶向部分。
- 如請求項147至150中任一項之醫藥組合物,其中該靶向部分為小分子、scFv、奈米抗體、肽、環狀肽、二環狀肽或三環狀肽、微型抗體、聚核苷酸適體、經工程改造之骨架蛋白、重鏈可變區、輕鏈可變區,或其片段。
- 如請求項147至151中任一項之醫藥組合物,其中該組合物中少於1重量%之聚核苷酸為雙股RNA、DNA夾板(splints)、DNA模板,或三磷酸化RNA。
- 如請求項147至152中任一項之醫藥組合物,其中該醫藥組合物中少於1重量%之聚核苷酸及蛋白質為雙股RNA、DNA夾板、DNA模板、三磷酸化RNA、磷酸酶蛋白、蛋白質連接酶、RNA聚合酶,及加帽酶(capping enzymes)。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項133至143中任一項之環狀RNA聚核苷酸,及脂質體、樹狀體、碳水化合物載劑、聚醣奈米物質、細胞間橋(fusome)、胞泌體(exosome),或其組合。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項133至143中任一項之環狀RNA聚核苷酸、及醫藥鹽、緩衝劑、稀釋劑、或其組合。
- 一種治療有需要個體之方法,其包含投與治療有效量之包含如請求項147至155中任一項之環狀RNA聚核苷酸、奈米粒子及視情況可操作地連接至該奈米粒子之靶向部分的組合物。
- 如請求項156之方法,其中該靶向部分為小分子、scFv、奈米抗體、肽、環狀肽、二環狀肽或三環狀肽、微型抗體、重鏈可變區、經工程改造之骨架蛋白、輕鏈可變區或其片段。
- 如請求項156至157中任一項之方法,其中該奈米粒子為脂質奈米粒子、核-殼奈米粒子,或生物可降解奈米粒子。
- 如請求項156至158中任一項之方法,其中該奈米粒子包含一或多種陽離子型脂質、可離子化脂質,或聚β-胺基酯。
- 如請求項156至159中任一項之方法,其中該奈米粒子包含一或多種非陽離子型脂質。
- 如請求項156至160中任一項之方法,其中該奈米粒子包含一或多種經PEG修飾之脂質、聚麩胺酸脂質,或玻糖醛酸脂質。
- 如請求項156至161中任一項之方法,其中該奈米粒子包含膽固醇。
- 如請求項156至162中任一項之方法,其中該奈米粒子包含二十碳四烯酸、白三烯,或油酸。
- 如請求項156至163中任一項之方法,其中該組合物包含靶向部分,其中該靶向部分選擇性介導受體介導之胞吞作用至所選細胞群體之細胞中,在細胞選擇或純化不存在下。
- 如請求項156至164中任一項之方法,其中該奈米粒子包含超過一種環狀RNA聚核苷酸。
- 如請求項156至165中任一項之方法,其中該個體患有選自由以下組成之群之癌症:急性骨髓白血病(AML);齒槽橫紋肌肉瘤;B細胞惡性病;膀胱癌(bladder cancer) (例如膀胱癌(bladder carcinoma));骨癌;腦癌(例如神經管胚細胞瘤及多形性神經膠質母細胞瘤);乳癌;肛門癌、肛管癌,或肛門直腸癌;眼癌;肝內膽管癌;關節癌;頸癌;膽囊癌;胸膜癌;鼻癌、鼻腔癌或中耳癌;口腔癌;外陰癌;慢性淋巴球性白血病;慢性骨髓癌;結腸癌;食道癌、子宮頸癌;纖維肉瘤;腸胃類癌瘤;頭頸癌(例如頭頸鱗狀細胞癌);霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma);下咽癌;腎癌;喉頭癌;白血病;液體腫瘤;脂肪瘤;肝癌;肺癌(例如非小細胞肺癌、肺腺癌及小細胞肺癌);淋巴瘤;間皮瘤;肥胖細胞瘤;黑色素瘤;多發性骨髓瘤;鼻咽癌;非霍奇金淋巴瘤;慢性B淋巴球性白血病;毛細胞白血病;伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma);卵巢癌;胰臟癌;腹膜癌;胃系膜癌;腸系膜癌;咽癌;前列腺癌;直腸癌;腎癌;皮膚癌;小腸癌;軟組織癌;實體腫瘤;滑液肉瘤;胃癌;畸胎瘤;睾丸癌;甲狀腺癌;及輸尿管癌。
- 如請求項156至166中任一項之方法,其中該個體患有選自以下之自體免疫病症:硬皮病、格雷氏病(Grave's disease)、克羅恩氏病(Crohn's disease)、休格連氏病(Sjogren's disease)、多發性硬化症、橋本氏病(Hashimoto's disease)、乾癬、重症肌無力、自體免疫多內分泌病變症候群、I型糖尿病(TIDM)、自體免疫胃炎、自體免疫葡萄膜視網膜炎、多發性肌炎、結腸炎、甲狀腺炎,及以人類狼瘡為代表之全身性自體免疫疾病。
- 一種真核細胞,其包含如請求項133至143中任一項之環狀RNA聚核苷酸或如請求項147至155中任一項之醫藥組合物。
- 如請求項168之真核細胞,其中該真核細胞為人類細胞。
- 如請求項169之真核細胞,其中該真核細胞為免疫細胞。
- 如請求項170之真核細胞,其中該真核細胞為T細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞、嗜中性球,或嗜鹼性球。
- 一種原核細胞,其包含如請求項133至143中任一項之環狀RNA聚核苷酸。
- 一種純化環狀RNA之方法,其包含使結合至固體表面之寡核苷酸與親和序列雜交。
- 如請求項173之方法,其中該親和序列之一或多個複本存在於前驅體RNA中。
- 如請求項174之方法,其中該前驅體RNA為如請求項44至54、83至86或103至110中任一項之前驅體RNA。
- 如請求項173至175中任一項之方法,其中該環狀RNA為如請求項117至127中任一項之環狀RNA。
- 如請求項173至176中任一項之方法,其中該親和序列在形成該環狀RNA期間移除。
- 如請求項173至177中任一項之方法,其包含將該環狀RNA與該前驅體RNA分離。
- 如請求項173至178中任一項之方法,其中該親和序列包含聚A序列。
- 如請求項179之方法,其中與該親和序列雜交之寡核苷酸為去氧胸苷寡核苷酸。
- 如請求項173至178中任一項之方法,其中該親和序列包含專用結合位點(DBS)。
- 如請求項181之方法,其中該DBS包含以下核苷酸序列:TATAATTCTACCCTATTGAGGCATTGACTA (SEQ ID NO: 3269)。
- 如請求項181或182之方法,其中與該親和序列雜交之寡核苷酸包含與該DBS互補之序列。
- 一種純化環狀RNA之方法,其包含: a. 使包含線性RNA及環狀RNA之組合物與較該環狀RNA優先結合至該線性RNA之結合劑接觸;及 b. 將結合至該結合劑之RNA與未結合至該結合劑之RNA分離。
- 如請求項184之方法,其中該結合劑結合至固體載體。
- 如請求項185之方法,其中該固體載體包含瓊脂糖、瓊脂糖衍生之樹脂、纖維素、纖維素纖維、磁珠、高通量微量滴定盤、非瓊脂糖樹脂、玻璃表面、聚合物表面,或其組合。
- 如請求項185或186之方法,其中該固體載體包含瓊脂糖或纖維素。
- 如請求項184至187中任一項之方法,其中該結合劑包含與存在於該線性RNA中且不存在於該環狀RNA中之序列互補的寡核苷酸。
- 如請求項184至188中任一項之方法,其中該結合劑包含與存在於該線性RNA中且不存在於該環狀RNA中之序列100%互補的寡核苷酸。
- 如請求項188或189之方法,其中存在於該線性RNA中且不存在於該環狀RNA中之序列為親和序列。
- 如請求項188至190中任一項之方法,其中存在於該線性RNA中且不存在於該環狀RNA中之序列包含聚A序列。
- 如請求項184至191中任一項之方法,其中該結合劑包含含有聚去氧胸苷序列之寡核苷酸。
- 如請求項188至192中任一項之方法,其中存在於該線性RNA中且不存在於該環狀RNA中之序列包含DBS序列。
- 如請求項193之方法,其中該DBS序列包含以下核苷酸序列:TATAATTCTACCCTATTGAGGCATTGACTA (SEQ ID NO: 3269)。
- 如請求項188至194中任一項之方法,其中存在於該線性RNA中且不存在於該環狀RNA中之序列的長度為10至150個核苷酸。
- 如請求項188至194中任一項之方法,其中存在於該線性RNA中且不存在於該環狀RNA中之序列的長度為10至70個核苷酸。
- 如請求項188至194中任一項之方法,其中存在於該線性RNA中且不存在於該環狀RNA中之序列的長度為20至30個核苷酸。
- 如請求項188至197中任一項之方法,其中存在於該線性RNA中且不存在於該環狀RNA中之序列存在於該線性RNA中之兩個位置。
- 如請求項188至198中任一項之方法,其中存在於該線性RNA中且不存在於該環狀RNA中之序列在轉錄該線性RNA期間編碼至該線性RNA中。
- 如請求項188至198中任一項之方法,其中存在於該線性RNA中且不存在於該環狀RNA中之序列係以酶添加至該線性RNA中。
- 如請求項184至200中任一項之方法,其中該線性RNA不包含甲基鳥苷酸帽。
- 如請求項184至201中任一項之方法,其中該線性RNA包含前驅體RNA或其片段。
- 如請求項202之方法,其中該前驅體RNA為如請求項44至54、83至86或103至110中任一項之前驅體RNA或其片段。
- 如請求項202或203之方法,其中該前驅體RNA係使用活體外轉錄(IVT)產生。
- 如請求項202或203之方法,其中該片段包含內含子。
- 如請求項204或205之方法,其中該線性RNA包含提前終止之RNA或由失敗性轉錄形成之RNA。
- 如請求項184至206中任一項之方法,其中該環狀RNA包含如請求項117至127中任一項之環狀RNA。
- 如請求項184至207中任一項之方法,其中該環狀RNA係使用包含剪接該前驅體RNA之方法產生。
- 如請求項208之方法,其中存在於該線性RNA中且不存在於該環狀RNA中之序列在該剪接期間截除。
- 如請求項184至209中任一項之方法,其中該環狀RNA之大小為少於6千鹼基。
- 如請求項184至210中任一項之方法,其中該分離包含自該固體載體移除該未結合RNA。
- 如請求項211之方法,其中該移除包含自該固體載體溶離該未結合RNA。
- 如請求項184至212中任一項之方法,其包含加熱該組合物。
- 如請求項184至213中任一項之方法,其包含緩衝液交換。
- 如請求項214之方法,其中緩衝液交換係在該接觸之前執行。
- 如請求項214或215之方法,其中緩衝液交換係在該分離之後執行。
- 如請求項214至216中任一項之方法,其中緩衝液交換係在該接觸之前執行,且所得緩衝液包含大於1 mM單價鹽。
- 如請求項217之方法,其中該單價鹽為NaCl或KCl。
- 如請求項217或218之方法,其中該所得緩衝液包含Tris。
- 如請求項217至219中任一項之方法,其中該所得緩衝液包含EDTA。
- 如請求項214至220中任一項之方法,其中緩衝液交換係在該分離之後執行交換成儲存緩衝液,其中該儲存緩衝液包含1 mM pH 6.5檸檬酸鈉。
- 如請求項184至221中任一項之方法,其包含在該分離之後過濾該環狀RNA。
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