TW202334412A - 針對 sars-cov-2 變體的環狀 rna 疫苗及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本申請提供了編碼SARS-CoV-2變體的抗原多肽的環狀RNA（circRNA）。在一些實施方案中，本申請提供了針對SARS-CoV-2變體，如德爾塔或奧密克戎變體的circRNA疫苗。在一些實施方案中，circRNA疫苗包含circRNA，其包含編碼抗原多肽的核酸序列，所述抗原多肽包含SARS-CoV-2變體的刺突（S）蛋白或其片段。還提供了使用本文所公開的circRNA或其組合物治療或預防SARS-CoV-2感染的方法。

Description

針對SARS-COV-2變體的環狀RNA疫苗及其使用方法
[相關申請的交叉引用] 本申請要求對2022年1月11日提交的國際專利申請號PCT/CN2022/071347和2022年1月28日提交的國際專利申請號PCT/CN2022/074752的優先權，其公開內容通過引用整體併入本文。
[電子序列表的引用] 電子序列表的內容（165392001043seqlist.xml；大小：95,801位元組；創建日期：2023年1月6日）通過引用整體併入本文。
本申請涉及針對SARS-Co-V-2變體的環狀RNA（circRNA）疫苗，及其使用方法。
2019年冠狀病毒病（COVID-19）是由新型嚴重急性呼吸系統綜合症冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起的嚴重的世界性公共衛生突發事件 1,2。迄今為止，COVID-19已經導致了超過2億的確診病例和超過500萬的確診死亡（世界衛生組織）。因此，迫切需要開發針對SARS-CoV-2和新出現的變體的安全和有效的疫苗。
SARS-CoV-2連同嚴重急性呼吸系統綜合症（SARS）-CoV和中東呼吸系統綜合症（MERS）-CoV（其他兩種高致病性冠狀病毒）一起，屬於冠狀病毒（ Coronaviridae）科的貝塔冠狀病毒（ Betacoronavirus）屬 3。SARS-CoV-2是一種單鏈、正義的包膜病毒，其病毒體由核衣殼（N）蛋白包裹的30 kb的RNA基因組形成的內衣殼和被膜（M）、包膜（E）和三聚體刺突（S）蛋白的脂質包膜組成 4。SARS-CoV-2的S蛋白由S1和S2亞基組成，是病毒體的主要表面蛋白。S蛋白通過S1亞基C末端的受體結合結構域（RBD）與其受體-血管緊張素轉換酶2（ACE2）結合，介導病毒進入宿主細胞。這種結合隨後誘導由S2亞基介導的SARS-CoV-2包膜和宿主細胞膜之間的融合，導致病毒基因組釋放到細胞質中 5-8。
S蛋白、S1亞基或SARS-CoV-2的RBD抗原可以誘導B細胞和T細胞應答應，產生針對SARS-CoV-2的高強效中和抗體 9-11。疫苗接種是結束COVID-19大流行的最有希望的方法。傳統的疫苗平臺，如滅活疫苗、病毒樣顆粒疫苗和基於病毒載體的疫苗已被採用來開發SARS-CoV-2疫苗 12-20。重要的是，針對SARS-CoV-2的mRNA疫苗已經以極快的速度開發出來，並被緊急批准使用 21-27，儘管這種策略以前從未被商業化應用 28。mRNA疫苗含有線性單鏈RNA，其由5’帽、非翻譯區（UTR）、抗原編碼區和3’ polyA尾組成，通過脂質納米顆粒（LNP）封裝遞送到體內 28。臨床規模的mRNA疫苗可以在病毒抗原序列釋放後被迅速生產 21。然而，目前的mRNA疫苗仍有一定的局限性，因為其固有的不穩定性和LNP封裝後用於體內施用的次優的熱穩定性 29-31，以及潛在的免疫原性副作用 32,33。
環狀RNA（circRNA）是共價封閉的單鏈RNA轉錄物，包含大類由真核細胞中稱為反剪接的非經典RNA剪接事件產生的非編碼RNA 34-36。一些病毒基因組恰好是環狀RNA，如丁型肝炎病毒和植物病毒 33。近年來，通過高通量RNA測序和circRNA特異性生物資訊學，在真核生物中已鑒定出數以千計的circRNA，其包括真菌、植物、昆蟲、魚類和哺乳動物 36。與線性mRNA不同，circRNA是高度穩定的，因為它的共價閉環結構可以保護它免受外核酸外切酶介導的降解 36-38。到目前為止，只有少數內源性circRNA顯示出具有作為蛋白質翻譯範本的功能 39-42。儘管circRNA缺乏帽依賴性翻譯的基本元件，但它可以被工程改造為通過內部核糖體進入點（IRES）或加入開放閱讀框（ORF）上游的m6A修飾來實現蛋白質翻譯 43,44。
本申請提供了基於環狀RNA（circRNA）的針對SARS-CoV-2變體（例如，德爾塔（Delta）或奧密克戎（Omicron）的新型疫苗。還提供了生產circRNA疫苗的方法和使用circRNA疫苗治療或預防SARS-CoV-2感染的方法。
本申請的一個方面提供了環狀RNA（circRNA），其包含編碼SARS-CoV-2變體的抗原多肽的核酸序列，其中SARS-CoV-2變體是德爾塔變體或奧密克戎變體。在一些實施方案中，抗原多肽包含SARS-CoV-2變體的刺突（S）蛋白或其片段。在一些實施方案中，抗原多肽包含S蛋白的受體結合結構域（RBD）。在一些實施方案中，RBD包含SARS-CoV-2全長S蛋白的氨基酸殘基319至542，其中編號基於SEQ ID NO: 1。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是德爾塔變體，並且其中抗原多肽包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是奧密克戎變體，並且其中抗原多肽包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列。
在根據上述任何一種circRNA的一些實施方案中，抗原多肽進一步包含多聚化結構域。在一些實施方案中，多聚化結構域是T4纖維蛋白的C末端折疊子（foldon）（Fd）結構域，其介導T4纖維蛋白的三聚化。在一些實施方案中，Fd結構域包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。
在根據上述任何一種circRNA的一些實施方案中，circRNA進一步包含與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接的Kozak序列。
在根據上述任何一種circRNA的一些實施方案中，circRNA進一步包含與編碼抗原多肽的核酸序列的3’端可操作地連接的框內2A肽編碼序列。
在根據上述任何一種circRNA的一些實施方案中，circRNA進一步包含與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接的內部核糖體進入位點（IRES）序列。在一些實施方案中，IRES序列是選自下組的IRES序列：CVB3病毒、EV71病毒、EMCV病毒、PV病毒和CSFV病毒的IRES序列。在一些實施方案中，circRNA包含核酸序列，所述核酸序列從5’端到3’端包含：IRES序列、Kozak序列和編碼所述抗原多肽的核酸序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含位於IRES序列的5’端的polyAC或polyA序列。
在根據上述任何一種circRNA的一些實施方案中，circRNA進一步包含與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接的m6A修飾基序序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含核酸序列，所述核酸序列從5’端到3’端包含：m6A修飾基序序列、Kozak序列和編碼所述抗原多肽的核酸序列。
在根據上述任何一種circRNA的一些實施方案中，circRNA進一步包含可被側接於編碼所述抗原多肽的核酸序列的5’端的3’催化性I型內含子片段識別的3’外顯子序列，以及可被側接於編碼所述抗原多肽的核酸序列的3’端的5’催化性I型內含子片段識別的5’外顯子序列。
本申請的另一個方面提供了一種組合物，其包含根據上述任何一種circRNA的多個circRNA，其中對應於多個circRNA的抗原多肽彼此不同。在一些實施方案中，多個circRNA靶向多個SARS-CoV-2變體。
本申請的一個方面提供了circRNA疫苗，其包含上述任何一種circRNA或上述任何一種組合物。在一些實施例中，circRNA疫苗進一步包含轉染劑。在一些實施方案中，轉染劑是聚乙烯亞胺（PEI）。在一些實施方案中，轉染劑是脂質納米顆粒（LNP）。在一些實施方案中，LNP包含可離子化脂質、PEG2000-DMG、DSPC和膽固醇。在一些實施例中，circRNA不與轉染劑一起配製。
還提供了藥物組合物，其包含上述任何一種circRNA和藥學上可接受的載體。在一些實施方案中，藥物組合物進一步包含轉染劑。在一些實施方案中，轉染劑是PEI。在一些實施方案中，轉染劑是LNP。在一些實施方案中，LNP包括可離子化脂質、PEG2000-DMG、DSPC和膽固醇。在一些實施例中，circRNA不與轉染劑一起配製。
進一步提供了治療或預防個體SARS-CoV-2感染的方法，其包括向該個體施用有效量的上述任何一種circRNA、上述任何一種組合物、上述任何一種藥物組合物或上述任何一種circRNA疫苗。在一些實施方案中，circRNA以裸circRNA的形式施用。在一些實施方案中，circRNA以脂質納米顆粒製劑的形式施用。在一些實施方案中，施用circRNA兩次或更多次。在一些實施方案中，每次施用之間的間隔時間至少約為四周，如至少為五、六、七或八周中的任何一個。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由SARS-CoV-2變體引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種以上的SARS-CoV-2變體引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由SARS-CoV-2的德爾塔變體引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由SARS-CoV-2的奧密克戎變體引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種奧密克戎亞變體（例如BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5）引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由奧密克戎亞變體的一種或多種亞譜系（例如BA.2.75.2、BA.4.6、BF.7、BQ.1.1）引起的。在一些實施方案中，circRNA在個體中通過核糖體進行滾環翻譯。
本申請的其他方面提供了能夠形成本文提供的任何一種circRNA的線性RNA。在一些實施方案中，線性RNA可以通過包含5’催化性I型內含子片段和3’催化性I型內含子片段的I型內含子的自催化而環化。在一些實施方案中，線性RNA包含：側接於可被I型內含子識別的3’外顯子序列的5’端的3’催化性I型內含子片段，以及側接於可被I型內含子識別的5’外顯子序列的3’端的5’催化性I型內含子片段。在一些實施方案中，3’催化性I型內含子片段包含SEQ ID NO: 28的序列，5’催化性I型內含子片段包含SEQ ID NO: 29的序列。在一些實施方案中，線性RNA進一步包含：側接於3’催化性I型內含子片段的5’端的5’同源序列，以及側接於5’催化性I型內含子片段的3’端的3’同源序列。在一些實施方案中，5’同源序列包含SEQ ID NO: 23的核酸序列，3’同源序列包含SEQ ID NO: 24的核酸序列。
在一些實施方案中，線性RNA可以通過連接酶（例如，RNA連接酶）環化。在一些實施方案中，連接酶選自下組：T4 DNA連接酶（T4 Dnl）、T4 RNA連接酶1（T4 Rnl1）和T4 RNA連接酶2（T4 Rnl2）。在一些實施方案中，線性RNA包含：位於編碼circRNA的核酸序列5’端的5’連接序列，以及位於編碼circRNA的核酸序列3’端的3’連接序列，其中5’連接序列和3’連接序列可以通過連接酶互相連接。
本申請的一個方面提供了核酸構建體，其包含編碼上述任何一種線性RNA的核酸序列。在一些實施方案中，核酸構建體包含與編碼線性RNA的核酸序列可操作地連接的T7啟動子。
本申請的一個方面提供了產生circRNA的方法，其包括：（a）使上述任何一種線性RNA處於啟動5’催化性I型內含子片段和3’催化性I型內含子片段的自催化的條件下，以提供環化的RNA產物，其中線性RNA包含：側接於可被I型內含子識別的3’外顯子序列的5’端的3’催化性I型內含子片段，以及側接於可被I型內含子識別的5’外顯子序列的3’端的5’催化性I型內含子片段；以及（b）分離環化的RNA產物，從而提供circRNA疫苗。
本申請的一個方面提供了產生circRNA的方法，其包括：（a）使上述任何一種線性RNA與單鏈銜接子核酸接觸，其中線性RNA包含：位於編碼所述circRNA的核酸序列5’端的5’連接序列，以及位於編碼所述circRNA的核酸序列3’端的3’連接序列，其中所述單鏈銜接子核酸從5’端到3’端包含：與3’連接序列互補的第一序列，以及與5’連接序列互補的第二序列，且其中5’連接序列和3’連接序列與單鏈銜接子核酸雜交以提供雙鏈核酸中間體，所述雙鏈核酸中間體包含5’連接序列的3’端和3’連接序列的5’端之間的單鏈斷裂；（b）在允許5’連接序列與3’連接序列連接的條件下，將中間體與RNA連接酶接觸以提供環化的RNA產物；以及（c）分離環化的RNA產物，從而提供circRNA疫苗。
本申請的一個方面提供了產生circRNA的方法，其包括：（a）在允許5’連接序列與3’連接序列連接的條件下，使上述任何一種線性RNA與RNA連接酶接觸以提供環化的RNA產物，其中所述線性RNA包含：位於編碼circRNA的核酸序列5’端的5’連接序列，以及位於編碼circRNA的核酸序列3’端的3’連接序列；以及（b）分離環化的RNA產物，從而提供環狀RNA。
在根據上述任何一種產生circRNA疫苗的方法的一些實施方案中，所述方法進一步包括：通過體外轉錄包含編碼所線性RNA的核酸序列的核酸構建體來獲得線性RNA。在根據上述任何一種產生circRNA疫苗的方法的一些實施方案中，所述方法進一步包括純化環化的RNA產物。
還提供了用於上述任何一種方法的組合物、試劑盒和製品。
本申請提供了circRNA疫苗，其編碼包含SARS-CoV-2變體，如德爾塔或奧密克戎變體或其亞變體的刺突蛋白或其片段的抗原多肽。本文所述的circRNA疫苗對SARS-CoV-2或其新出現的變體有效，它在小鼠體內誘導高比例的中和抗體和強烈的Th1偏向的細胞應答，並有效保護小鼠和恒河猴免受SARS-CoV-2和變體的感染。
與其他類型的冠狀病毒疫苗不同，本文所述的circRNA疫苗在生產過程中不需要處理大量傳染性顆粒。此外，與線性RNA疫苗相比，本文所述的circRNA疫苗可提供增強的穩定性和功效。例如，鑒於其環狀性質，與許多線性RNA相比，circRNA特別穩定，因為它們對細胞外泌體核糖核酸酶複合體的核酸外切降解具有抵抗力。在一些實施方案中，本文公開的circRNA疫苗中的circRNA可以在已向其施用疫苗的個體中通過核糖體進行滾環翻譯，從而產生大量抗原多肽。這種circRNA疫苗的生產可以使用多種方法進行，如化學連接、酶催化或核酶自催化。本文所述的circRNA疫苗為快速開發針對新出現的冠狀病毒株的疫苗提供了平臺。此外，環狀RNA可以在體外快速大量生成，且它們不需要任何核苷酸修飾，這與經典的mRNA疫苗顯著不同。我們的資料表明，示例性circRNA和封裝的circRNA-LNP複合物在4℃或室溫下高度熱穩定7-14天。由於其特定的特性，circRNA在生物醫學應用中具有潛力。 I. 定義
除非如下另有定義，否則本文使用的術語如本領域中通常使用的術語。
如本文所用，「變體」病毒是指病毒的分離物，其基因組序列與參考病毒的基因組序列不同，並且基因組序列的差異賦予了新的表型特性，如與參考病毒相比，適應性增加。當提及本申請的病毒物種，如SARS-CoV-2時，應理解為該物種包括變體以及首次分離和鑒定的參考病毒。在一些實施方案中，變異病毒是美國疾病控制和預防中心（「CDC」）或世界衛生組織（「WHO」）正在監控的變體（VBM）。被指定為VBM的變體包括那些資料顯示對已批准或授權的醫療對策有潛在或明確影響的變體，或與更嚴重的疾病或傳播增加有關但不再被檢測到的變體，或在美國以非常低的水準流通的變體。在一些實施方案中，本文所述的變異病毒是「感興趣的變體」，即具有特定遺傳標誌物的變體，這些標誌物與受體結合的變化、針對先前感染或疫苗接種產生的抗體的中和作用降低、治療效果降低、潛在的診斷影響和/或預測的傳播性和/或疾病嚴重程度增加有關。在一些實施方案中，本文所述的變異病毒是「值得關注的變體」，即有證據表明其傳播性增加、疾病更加嚴重（例如，住院和/或死亡人數增加）、以前感染或接種疫苗期間產生的抗體中和作用顯著降低、治療或疫苗的有效性降低和/或診斷檢測失敗的變體。在一些實施方案中，本文所述的變異病毒是「高後果變體」，即高後果變體有明確證據表明預防措施或醫療對策（MCM）相對於先前流通的變體有效性顯著降低。
術語「多核苷酸」、「核酸」、「核苷酸序列」和「核酸序列」可互換使用。它們是指任何長度的核苷酸的聚合形式，可以是去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物。
本文所述的「裸circRNA」是指不含遞送媒介物（例如脂質體、脂質納米顆粒或膠體顆粒（colloidal party））的circRNA。
術語「疫苗」被理解為涉及免疫活性藥物製劑。在某些實施方案中，在施用於宿主時疫苗誘導適應性免疫。疫苗製劑可進一步含有藥物載體，其可被設計用於旨在施用疫苗的特定模式。
術語「I型內含子」和「I型催化內含子」可互換使用，指可催化其自身從RNA前體切除的自剪接核酶。I型內含子包含兩個片段，即5’催化性I型內含子片段和3’催化性I型內含子片段，它們保留了它們的折疊和催化功能（即自剪接活性）。在其天然環境中，5’催化性I型內含子片段在其5’端側翼為5’外顯子，該5’外顯子包含被5’催化性I型內含子片段識別的5’外顯子序列；並且3’催化性I型內含子片段在其3’端側翼為3’外顯子，該3’外顯子包含被3’催化性I型內含子片段識別的3’外顯子序列。本文使用的術語「5’外顯子序列」和「3’外顯子序列」根據該外顯子在其自然環境中相對於I型內含子的順序進行標記，例如，如圖1A所示。
術語「抗原多肽」是指可用於觸發哺乳動物的免疫系統以產生對該多肽或其部分特異的抗體的多肽。本文所述的抗原多肽包含天然存在的蛋白、蛋白結構域和衍生自天然存在的蛋白的短肽片段。抗原多肽可含有天然存在的蛋白的一個或多個已知表位。抗原多肽可包含提高免疫原性的載體蛋白或多聚化蛋白。
術語參考蛋白的「功能變體」是指衍生自參考蛋白或其部分的變體多肽，且該變體具有與參考蛋白基本上相同的活性（例如，與靶標的結合或酶促活性）。「基本上相同的活性」是指與參考蛋白活性的至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多中的任一個的活性水準。
如本文所用，術語「引入（introducing /introduction）」是指將一種或多種多核苷酸（如circRNA）或一種或多種包括本文所述載體的構建體、其一種或多種轉錄物遞送至宿主細胞。本申請的方法可以採用許多遞送系統，包括但不限於：病毒、脂質體、電穿孔、顯微注射和綴合，以實現將本文所述的circRNA或構建體引入宿主細胞。可使用常規的基於病毒的和非基於病毒的基因轉移方法將核酸引入哺乳動物細胞或靶組織。此類方法可用於將編碼本申請circRNA的核酸施用於培養基中的細胞或宿主生物體中。非病毒載體遞送系統包括：DNA質粒、RNA（例如本文所述構建體的轉錄物）、裸核酸和與遞送媒介物（如脂質體）複合的核酸。病毒載體遞送系統包括DNA病毒和RNA病毒，它們具有用於遞送至宿主細胞的游離基因組或整合基因組。
如本文所用，當提到與第二核酸序列可操作地連接的第一核酸序列時，「可操作地連接」是指當第一核酸序列與第二核酸序列處於功能關係時的情況。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄，則啟動子與編碼序列可操作地連接。同樣，如果信號肽影響多肽的細胞外分泌，則信號肽的編碼序列與多肽的編碼序列可操作地連接。一般而言，可操作地連接的核酸序列是連續的，且在需要連接兩個蛋白編碼區時，比對開放閱讀框。
如本文所用，「互補性」是指一種核酸通過傳統的沃森-克裡克堿基配對與另一種核酸形成氫鍵的能力。百分比互補性表示可以與第二核酸形成氫鍵（即沃森-克裡克堿基配對）的核酸分子中殘基的百分比（例如，10個中的約5、6、7、8、9、10個，分別為約50%、60%、70%、80%、90%和100%互補）。「完全互補」是指核酸序列的所有連續殘基與第二核酸序列中相同數量的連續殘基形成氫鍵。如本文所用，「基本上互補」是指在約40、50、60、70、80、100、150、200、250或更多個核苷酸的區域，具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%中任一個的互補程度，或指在嚴格條件下雜交的兩個核酸。
如本文所用，「治療（treatment/treating）」是用於獲得有益的或期望的結果（包括臨床結果）的方法。出於本申請的目的，有益的或期望的臨床結果包括但不限於以下中的一種或多種：減少由疾病引起的一種或多種症狀，減輕疾病的程度，穩定疾病（例如，預防或延緩疾病的惡化），預防或延緩疾病的傳播，預防或延緩疾病的發生或復發，延緩或減緩疾病的進展，改善疾病狀態，提供疾病緩解（無論是部分還是全部），減少治療疾病所需的一種或多種其他藥物的劑量，延緩疾病的進展，提高生活品質，和/或延長生存期。「治療」還包括降低疾病的病理後果。本申請的方法考慮了這些治療方面中的任何一個或多個。
術語「個體」、「受試者」和「患者」在本文中可互換使用以描述哺乳動物，包括人。在一些實施方案中，個體是人。在一些實施方案中，個體是齧齒動物，例如小鼠。在一些實施方案中，個體患有遺傳疾病或病況。在一些實施方案中，個體患有SARS-CoV-2感染。在一些實施方案中，個體有感染SARS-CoV-2感染的風險。在一些實施方案中，個體需要治療。
如本領域所理解的，「有效量」是指足以產生所需治療結果（例如，刺激抗體的產生並提高針對一種或多種SARS-CoV-2變體的免疫力，降低SARS-CoV-2感染的嚴重程度或持續時間、穩定其嚴重程度或消除其一種或多種症狀）的組合物的量。對於治療用途，有益的或期望的結果包括，例如減少由疾病（生化、組織學和/或行為）引起的一種或多種症狀，包括其併發症和在疾病發展過程中出現的中間病理表型，提高那些患有該疾病者的生活品質，減少治療疾病所需的其他藥物的劑量，增強另一種藥物的效果，延緩疾病的進展，和/或延長患者的生存期。在一些實施方案中，有效量的治療劑可以延長生存期（包括總生存期和無進展生存期）；導致客觀反應（包括完全反應或部分反應）；在一定程度上緩解疾病或病況的一種或多種體征或症狀；和/或改善受試者的生活品質。在一些實施方案中，有效量是預防有效量，其是當施用于易感和/或可能發展SARS-CoV-2感染的個體時，足以預防或降低SARS-CoV-2感染的一種或多種未來症狀的嚴重性的組合物的量。對於預防性使用，有益的或期望的結果包括：例如結果如消除或降低風險、減輕未來疾病的嚴重性，或延遲疾病的發作（例如延遲疾病的生化、組織學和/或行為症狀，其併發症以及在疾病未來發展過程中出現的中間病理表型）。
如本文所用，術語「野生型」是技術人員理解的本領域術語，是指生物體、菌株、基因或特徵的典型形式，如其在自然界中出現的，與突變體或變體形式不同。
本公開提供了幾種類型的基於多核苷酸或多肽的組合物，其包括變體和衍生物。這些包括，例如，取代、插入、缺失和共價變體和衍生物。術語「衍生物」與術語「變體」同義，並且通常指相對於參考分子或起始分子以任何方式已經被修飾和/或改變的分子。
因此，編碼相對於參考序列含有取代、插入和/或添加、缺失和共價修飾的肽或多肽的多核苷酸，特別是本文公開的多肽序列，包括在本公開的範圍內。例如，序列標籤或氨基酸如一個或多個賴氨酸，可以添加到肽序列中（例如，在N末端或C末端）。序列標籤可用於肽檢測、純化或定位。賴氨酸可用于增加肽溶解度或允許生物素化。或者，位於肽或蛋白的氨基酸序列的羧基和氨基末端區域的氨基酸殘基，可以任選地被刪除以提供截短的序列。某些氨基酸（例如，C末端殘基或N末端殘基）或者可根據序列的用途而被刪除，例如，作為可溶的或連接到固體支持物的較大序列一部分的序列表達。
術語「同一性」是指聚合分子之間，例如多核苷酸分子（例如DNA分子和/或RNA分子）之間和/或多肽分子之間的總體相關性。兩個多核酸序列的百分比同一性的計算，例如，可以通過為了最佳比較目的而比對這兩個序列來進行（例如，可以在第一核酸序列和第二核酸序列的一個或兩個中引入空位（gap）以獲得最佳比對，並且為了比較目的可以忽略不相同的序列）。在某些實施方案中，出於比較目的比對的序列長度為參考序列長度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。然後，比較相應核苷酸位置的核苷酸。當第一序列中的位置被與第二序列中相應位置相同的核苷酸佔據時，則在該位置的分子是相同的。兩個序列之間的百分比同一性是所述序列共用的相同位置數量的函數，考慮到空位的數量和每個空位的長度，需要引入以實現兩個序列的最佳比對。序列的比較和兩個序列之間的百分比同一性的確定，可以使用數學演算法來完成。例如，兩個核酸序列之間的百分比同一性可以使用以下文獻中描述的那些方法確定：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; 以及Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991；其各自通過引用併入本文。例如，可以使用Meyers和Miller的演算法（CABIOS, 1989, 4:11-17）確定兩個核酸序列之間的百分比同一性，該演算法已併入ALIGN程式（2.0版），其使用PAM 120權重殘基表，空位長度罰分為12，空位罰分為4。或者，可以使用GCG套裝軟體中的GAP程式，使用NWSgapdna.CMP矩陣確定兩個核酸序列之間的同一性百分比。通常用於確定序列之間百分比同一性的方法，包括但不限於以下文獻中公開的那些方法：Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988)；通過引用併入本文。確定同一性的技術已編入公開可用的電腦程式中。確定兩個序列之間同源性的示例性電腦軟體，包括但不限於GCG套裝程式（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984)）、BLASTP、BLASTN和FASTA（Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215, 403 (1990)）。
關於本文鑒定的多肽序列的「氨基酸序列同一性百分比（%）」定義為，在將任何保守取代看作序列同一性一部分的序列進行比對後，候選序列中與被比較的多肽中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基百分比。可以以本領域技術人員熟知的多種方式實現用於確定氨基酸序列同一性百分比為目的的比對，例如，使用公開可用的電腦軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign （DNASTAR）或MUSCLE軟體。本領域技術人員可以確定用於測量比對的合適參數，包括在被比較的序列全長上實現最大比對所需的任何演算法。然而，出於本文的目的，使用序列比較電腦程式MUSCLE生成%氨基酸序列同一性的值（Edgar, R.C., Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797, 2004; Edgar, R.C., BMC Bioinformatics 5(1):113, 2004，出於所有目的，其各自通過引用以其整體併入本文）。
術語「非天然存在的」或「工程化的」可互換使用，並表示人的手參與。當提及核酸分子或多肽時，該術語是指核酸分子或多肽至少基本上不含至少一種在自然界中與之天然結合並且如在自然界中發現的其他成分。
如本文所用，「表達」是指多核苷酸從DNA範本轉錄的過程（如轉錄成mRNA或其他RNA轉錄物），和/或從轉錄的mRNA隨後被翻譯成肽、多肽或蛋白的過程。轉錄物和編碼的多肽可統稱為「基因產物」。如果多核苷酸衍自基因組DNA，則表達可包括在真核細胞中的mRNA剪接。
如本文所用，術語「多肽」或「肽」涵蓋所有種類的天然存在的和合成的蛋白，包括所有長度的蛋白片段、融合蛋白和修飾蛋白，包括但不限於糖蛋白，以及所有其他類型的修飾蛋白（例如，由磷酸化、乙醯化、肉豆蔻醯化、棕櫚醯化、糖基化、氧化、甲醯化、醯胺化、聚穀氨醯化、ADP-核糖基化、聚乙二醇化、生物素化等產生的蛋白）。
如本文所用，術語「同時施用」是指聯合療法中的第一療法和第二療法，以不超過約15min（如不超過約10、5或1min中的任意一種）的時間間隔施用。當第一療法和第二療法同時施用時，第一療法和第二療法可以包含在相同的組合物中（例如，包含第一療法和第二療法的組合物）或在單獨的組合物中（例如，第一療法包含在一種組合物中，而第二療法包含在另一種組合物中）。
如本文所用，術語「序貫施用」是指聯合療法中的第一療法和第二療法，以超過約15min（如超過約20、30、40、50、60min或更多分鐘中的任一種）的時間間隔施用。可以首先施用第一療法或第二療法。第一療法和第二療法包含在單獨的組合物中，這些組合物可以包含在相同或不同的包裝或試劑盒中。
如本文所用，術語「並行施用」是指聯合療法中第一療法的施用和第二療法的施用彼此重疊。
術語「藥物組合物」是指這樣的製劑，其形式允許其中含有的活性成分的生物活性是有效的，且不含有對要施用該製劑的受試者具有不可接受的毒性的附加組分。
「藥學上可接受的載體」是指藥物製劑中對受試者無毒的一種或多種成分，而不是活性成分。藥學上可接受的載體包括但不限於：緩衝劑、賦形劑、穩定劑、冷凍保護劑、張力劑、防腐劑及其組合。藥學上可接受的載體或賦形劑，優選滿足毒理學和製造測試的要求標準和/或包含在美國食品和藥物管理局或其他州/聯邦政府編制的《非活性成分指南》中或列在美國藥典或其他公認的用於哺乳動物，尤其是人類的藥典中。
術語「包裝說明書」用於指通常包括在治療產品的商業包裝中的說明書，其中含有關於使用此類治療產品的適應症、用法、劑量、施用、聯合治療、禁忌症和/或警告的資訊。
「製品」是任何製品（例如，包裝或容器）或試劑盒，其包含至少一種試劑（例如用於治療SARS-CoV-2感染的藥物），或特異性地檢測本文所述的生物標誌物的探針。在某些實施方案中，製品或試劑盒作為用於執行本文所述方法的單元被推廣、分發或銷售。
應理解，本文描述的本申請的實施方案包括「由…組成」和/或「基本上由…組成」的實施方案。
本文提及的「約」值或參數包括（並描述）涉及該值或參數本身的變化。例如，關於「約X」的描述包括「X」的描述。
如本文所用，提及「不是」值或參數通常意味著並描述「除了」該值或參數。例如，所述方法不用於治療X型疾病指該方法用於治療X型以外類型的疾病。
如本文所用，術語「約X-Y」與「約X至約Y」具有相同的含義。
如本文和所附權利要求中所用，單數形式「一/一個（a/an）」或「所述/該（the）」包括複數形式，除非上下文另有明確規定。
如本文所用，術語「和/或」，如「A和/或B」之類的短語旨在包括：A和B兩者；A或B；A（單獨）；和B（單獨）。同樣地，如本文所用，術語「和/或」，如「A、B和/或C」這樣的短語旨在涵蓋以下實施方案中的每一個：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A（單獨）；B（單獨）；和C（單獨）。 II. 環形 RNA 疫苗
本申請提供了編碼SARS-CoV-2變體（如下文C部分-「SARS-CoV-2變體」中描述的任何一種SARS-CoV-2變體）的抗原多肽的環狀RNA（circRNA）。示例性的抗原多肽在下文A節-「抗原多肽」中描述。circRNA可包括下文B節-「額外的circRNA表達和環化元件」中描述的任何一種circRNA表達和/或環化元件。
在一些實施方案中，在4℃或室溫下儲存時，circRNA至少穩定7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20天。在一些實施方案中，在4℃或室溫下儲存時，circRNA至少穩定7天。在一些實施方案中，在4℃或室溫下儲存時，circRNA至少穩定14天。在一些實施方案中，在4℃儲存時，circRNA的至少穩定30天。在一些實施方案中，在室溫下儲存14天后，circRNA的降解率低於40%。在一些實施方案中，在室溫下儲存14天后，circRNA的降解率低於30%。在一些實施方案中，在室溫下儲存14天后，circRNA的降解率低於20%。在一些實施方案中，在室溫下儲存14天后，circRNA的降解率低於10%。在一些實施方案中，在室溫下儲存7天后，circRNA的降解率低於40%。在一些實施方案中，在室溫下儲存7天后，circRNA的降解率低於30%。在一些實施方案中，在室溫下儲存7天后，circRNA的降解率低於20%。在一些實施方案中，在室溫下儲存7天后，circRNA的降解率低於10%。在一些實施方案中，在室溫下儲存7天后，circRNA的降解率低於5%。
在一些實施方案中，本申請提供了circRNA，其包含：（a）編碼SARS-CoV-2變體的抗原多肽的核酸序列，和（b）內部核糖體進入位點（IRES）序列，其中IRES序列與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接。在一些實施方案中，核酸序列進一步編碼與抗原多肽的N末端融合的SP（例如，人tPA或IgE SP）。在一些實施方案中，circRNA進一步包含與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接的Kozak序列。在一些實施方案中，circRNA包含核酸序列，所述核酸序列從5’端到3’端包含：IRES序列、Kozak序列和編碼抗原多肽的核酸序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含位於IRES序列的5’端的polyA或polyAC序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含可被側接於編碼所述抗原多肽的核酸序列的5’端的3’催化性I型內含子片段識別的3’外顯子序列，以及可被側接於編碼所述抗原多肽的核酸序列的3’端的5’催化性I型內含子片段識別的5’外顯子序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含位於circRNA的5’端的5’連接序列，和位於circRNA的3’端的3’連接序列，其中5’連接序列和3’連接序列通過連接酶（例如T4 RNA連接酶）互相連接。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種SARS-CoV-2變體引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是德爾塔變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是奧密克戎變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種奧密克戎亞變體（例如BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5）引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由奧密克戎亞變體的一種或多種亞譜系（例如BA.2.75.2、BA.4.6、BF.7、BQ.1.1）引起的。
在一些實施方案中，本申請提供了circRNA，其包含：（a）編碼SARS-CoV-2變體的抗原多肽的核酸序列；（b）IRES序列，其中IRES序列與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接；以及（c）與編碼抗原多肽的核酸序列的3’端可操作地連接的框內2A肽編碼序列。在一些實施方案中，核酸序列進一步編碼與抗原多肽的N末端融合的SP（例如人tPA或IgE SP）。在一些實施方案中，circRNA進一步包含與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接的Kozak序列。在一些實施方案中，circRNA包含核酸序列，所述核酸序列從5’端到3’端包含：IRES序列、Kozak序列、編碼抗原多肽的核酸序列和框內2A肽編碼序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含位於IRES序列的5’端的polyA或polyAC序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含可被側接於編碼所述抗原多肽的核酸序列的5’端的3’催化性I型內含子片段識別的3’外顯子序列，以及可被側接於編碼所述抗原多肽的核酸序列的3’端的5’催化性I型內含子片段識別的5’外顯子序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含位於circRNA的5’端的5’連接序列，和位於circRNA的3’端的3’連接序列，其中5’連接序列和3’連接序列通過連接酶（例如T4 RNA連接酶）互相連接。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種SARS-CoV-2變體引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是德爾塔變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是奧密克戎變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種奧密克戎亞變體（例如BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5）引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由奧密克戎亞變體的一種或多種亞譜系（例如BA.2.75.2、BA.4.6、BF.7、BQ.1.1）引起的。
在一些實施方案中，本申請提供了circRNA，其包含：（a）編碼SARS-CoV-2變體的抗原多肽的核酸序列；和（b）與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接的m6A修飾基序序列。在一些實施方案中，核酸序列進一步編碼與抗原多肽的N末端融合的SP（例如，人tPA或IgE SP）。在一些實施方案中，circRNA進一步包含與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接的Kozak序列。在一些實施方案中，circRNA包含核酸序列，所述核酸序列從5’端到3’端包含：m6A修飾基序序列、Kozak序列和編碼抗原多肽的核酸序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含可被側接於編碼所述抗原多肽的核酸序列的5’端的3’催化性I型內含子片段識別的3’外顯子序列，以及可被側接於編碼所述抗原多肽的核酸序列的3’端的5’催化性I型內含子片段識別的5’外顯子序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含位於circRNA的5’端的5’連接序列，和位於circRNA的3’端的3’連接序列，其中5’連接序列和3’連接序列通過連接酶（例如T4 RNA連接酶）互相連接。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種SARS-CoV-2變體引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是德爾塔變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是奧密克戎變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種奧密克戎亞變體（例如BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5）引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由奧密克戎奧密克戎亞變體的一種或多種亞譜系（例如BA.2.75.2、BA.4.6、BF.7、BQ.1.1）引起的。
在一些實施方案中，本申請提供了包含circRNA的環狀RNA（circRNA）疫苗，所述circRNA包含編碼含有SARS-CoV-2的S蛋白或其片段的抗原多肽的核酸序列。
在一些實施方案中，本申請提供了包含circRNA的環狀RNA（circRNA）疫苗，所述circRNA包含編碼含有SARS-CoV-2變體的刺突（S）蛋白或其片段的抗原多肽的核酸序列。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種SARS-CoV-2變體引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是德爾塔變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是奧密克戎變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種奧密克戎亞變體（例如BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5）引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由奧密克戎亞變體的一種或多種亞譜系（例如BA.2.75.2、BA.4.6、BF.7、BQ.1.1）引起的。
在一些實施方案中，本申請提供了包含circRNA的環狀RNA（circRNA）疫苗，所述circRNA包含編碼抗原多肽的核酸序列，所述抗原多肽包含：（a） SARS-CoV-2變體的S蛋白或其片段；和（b）多聚化結構域。在一些實施方案中，多聚化結構域是T4纖維蛋白的C末端折疊子（Fd）結構域，它介導T4纖維蛋白的三聚化。在一些實施方案中，多聚化結構域是基於GCN-4的異亮氨酸拉鍊結構域。在一些實施方案中，多聚化結構域包含如SEQ ID NOs: 3-4所示的氨基酸序列。在一些實施方案中，多聚化結構域通過肽接頭（例如，包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的肽接頭）與S蛋白的RBD結構域融合。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種SARS-CoV-2變體引起。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是德爾塔變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是奧密克戎變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種奧密克戎亞變體（例如BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5）引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由奧密克戎亞變體的一種或多種亞譜系（例如BA.2.75.2、BA.4.6、BF.7、BQ.1.1）引起的。
在一些實施方案中，本申請提供了包含circRNA的環狀RNA（circRNA）疫苗，所述circRNA包含編碼抗原多肽的核酸序列，所述抗原多肽包含SARS-CoV2變體的S蛋白的受體結合結構域（RBD）。在一些實施方案中，RBD包含SARS-CoV-2全長S蛋白的氨基酸殘基319至542，其中編號基於SEQ ID NO: 1。在一些實施方案中，RBD包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。在一些實施方案中，RBD包含SEQ ID NO: 41的氨基酸序列。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種SARS-CoV-2變體引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是德爾塔變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是奧密克戎變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種奧密克戎亞變體（例如BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5）引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由奧密克戎亞變體的一種或多種亞譜系（例如BA.2.75.2、BA.4.6、BF.7、BQ.1.1）引起的。
在一些實施方案中，本申請提供了包含circRNA的環狀RNA（circRNA）疫苗，所述circRNA包含編碼抗原多肽的核酸序列，所述抗原多肽包含：（a） SARS-CoV-2變體的S蛋白片段的RBD，和（b）多聚化結構域。在一些實施方案中，RBD包含SARS-CoV-2全長S蛋白的氨基酸殘基319至542，其中編號基於SEQ ID NO: 1。在一些實施方案中，多聚化結構域是T4纖維蛋白的C末端折疊子（Fd）結構域，其介導T4纖維蛋白的三聚化。在一些實施方案中，多聚化結構域是基於GCN-4的異亮氨酸拉鍊結構域。在一些實施方案中，多聚化結構域包含如SEQ ID NOs: 3-4所示的氨基酸序列。在一些實施方案中，多聚化結構域通過肽接頭（例如包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的肽接頭）與S蛋白的RBD結構域融合。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是德爾塔變體，並且RBD包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是奧密克戎變體，並且RBD包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列。
在一些實施方案中，本申請提供了包含circRNA的環狀RNA（circRNA）疫苗，所述circRNA包含編碼抗原多肽的核酸序列，所述抗原多肽包含SARS-CoV2變體的S蛋白的S2區。在一些實施方案中，S2區包含SARS-CoV-2的全長S蛋白的氨基酸殘基686至1273，其中編號基於SEQ ID NO: 1。在一些實施方案中，S2區包含穩定S蛋白的融合前構象的一個或多個突變（例如，K986P和V987P）。在一些實施方案中，S2區包含SEQ ID NO: 6或7的氨基酸序列。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是德爾塔變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是奧密克戎變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種奧密克戎亞變體（例如BA.1, BA.1.1, BA.2, BA.3, BA.4, BA.5）引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由奧密克戎亞變體的一種或多種亞譜系（例如BA.2.75.2、BA.4.6、BF.7、BQ.1.1）引起的。
在一些實施方案中，本申請提供了包含circRNA的環狀RNA（circRNA）疫苗，所述circRNA包含編碼抗原多肽的核酸序列，所述抗原多肽包含SARS-CoV-2變體的全長S蛋白的氨基酸殘基2至1273，其中編號基於SEQ ID NO: 1。在一些實施方案中，S蛋白的S2區包含穩定S蛋白的融合前構象的一個或多個突變（例如，K986P和V987P）。在一些實施方案中，抗原多肽包含抑制S蛋白切割的一個或多個突變（例如，氨基酸殘基681至684的缺失）。在一些實施方案中，抗原多肽包含選自SEQ ID NOs: 8-10和40的氨基酸序列。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是德爾塔變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是奧密克戎變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種奧密克戎亞變體（例如BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5）引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由奧密克戎亞變體的一種或多種亞譜系（例如BA.2.75.2、BA.4.6、BF.7、BQ.1.1）引起的。
在一些實施方案中，本申請提供了包含circRNA的環狀RNA（circRNA）疫苗，所述circRNA包含：（a）編碼抗原多肽的核酸序列，所述抗原多肽包含SARS-CoV-2變體的S蛋白或其片段；以及（b）內部核糖體進入位點（IRES）序列，其中IRES序列與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接。在一些實施方案中，核酸序列進一步編碼與S蛋白或其片段的N末端融合的SP（例如，人tPA或IgE SP）。在一些實施方案中，circRNA進一步包含與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接的Kozak序列。在一些實施方案中，circRNA包含核酸序列，所述核酸序列從5’端到3’端包含：IRES序列、Kozak序列、SP和編碼抗原多肽的核酸序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含位於IRES序列5’端的polyA或polyAC序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含可被側接於編碼所述抗原多肽的核酸序列的5’端的3’催化性I型內含子片段識別的3’外顯子序列，以及可被側接於編碼所述抗原多肽的核酸序列的3’端的5’催化性I型內含子片段識別的5’外顯子序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含位於circRNA的5’端的5’連接序列，和位於circRNA的3’端的3’連接序列，其中5’連接序列和3’連接序列通過連接酶（例如，T4 RNA連接酶）互相連接。在一些實施方案中，抗原多肽包含S蛋白的RBD。在一些實施方案中，抗原多肽進一步包含多聚化結構域（例如，C末端Fd結構域，或基於GCN-4的異亮氨酸拉鍊結構域）。在一些實施方案中，抗原多肽包含S蛋白的S2區。在一些實施方案中，抗原多肽包含SARS-CoV-2變體的全長S蛋白的氨基酸殘基2至1273，其中編號基於SEQ ID NO: 1。在一些實施方案中，S蛋白的S2區包含穩定S蛋白的融合前構象的一個或多個突變（例如，K986P和V987P）。在一些實施方案中，抗原多肽包含抑制S蛋白切割的一個或多個突變（例如，氨基酸殘基681-684的缺失）。在一些實施方案中，circRNA包含選自SEQ ID NOs: 20-21的核酸序列。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是德爾塔變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是奧密克戎變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種奧密克戎亞變體（例如BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5）引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由奧密克戎亞變體的一種或多種亞譜系（例如BA.2.75.2、BA.4.6、BF.7、BQ.1.1）引起的。
在一些實施方案中，本申請提供了包含circRNA的環狀RNA（circRNA）疫苗，所述circRNA包含：（a）編碼抗原多肽的核酸序列，所述抗原多肽包含SARS-CoV-2變體的S蛋白或其片段；（b）IRES序列，其中IRES序列與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接；以及（c）與編碼抗原多肽的核酸序列3’端可操作地連接的框內2A肽編碼序列。在一些實施方案中，核酸序列進一步編碼與S蛋白或其片段的N末端融合的SP（例如，人tPA或IgE SP）。在一些實施方案中，circRNA進一步包含與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接的Kozak序列。在一些實施方案中，circRNA包含核酸序列，所述核酸序列從5’端到3’端包含：IRES序列、Kozak序列、SP、編碼抗原多肽的核酸序列和框內2A肽編碼序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含位於IRES序列5’端的polyA或polyAC序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含可被側接於編碼所述抗原多肽的核酸序列的5’端的3’催化性I型內含子片段識別的3’外顯子序列，以及可被側接於編碼所述抗原多肽的核酸序列的3’端的5’催化性I型內含子片段識別的5’外顯子序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含位於circRNA的5’端的5’連接序列，和位於circRNA的3’端的3’連接序列，其中5’連接序列和3’連接序列通過連接酶（例如，T4 RNA連接酶）互相連接。在一些實施方案中，抗原多肽包含S蛋白的RBD。在一些實施方案中，抗原多肽進一步包含多聚化結構域（例如，C末端Fd結構域，或基於GCN-4的異亮氨酸拉鍊結構域）。在一些實施方案中，抗原多肽包含S蛋白的S2區。在一些實施方案中，抗原多肽包含SARS-CoV-2變體的全長S蛋白的氨基酸殘基2至1273，其中編號基於SEQ ID NO: 1。在一些實施方案中，S蛋白的S2區包含穩定S蛋白的融合前構象的一個或多個突變（例如，K986P和V987P）。在一些實施方案中，抗原多肽包含抑制S蛋白切割的一個或多個突變（例如，氨基酸殘基681-684的缺失）。在一些實施方案中，circRNA包含選自SEQ ID NOs: 20-21的核酸序列。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是德爾塔變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是奧密克戎變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種奧密克戎亞變體（例如BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5）引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由奧密克戎亞變體的一種或多種亞譜系（例如BA.2.75.2、BA.4.6、BF.7、BQ.1.1）引起的。
在一些實施方案中，本申請提供了包含circRNA的環狀RNA（circRNA）疫苗，所述circRNA包含：（a）編碼抗原多肽的核酸序列，所述抗原多肽包含SARS-CoV-2變體的S蛋白或其片段；以及（b）與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接的m6A修飾基序序列。在一些實施方案中，核酸序列進一步編碼與S蛋白或其片段的N末端融合的SP（例如，人tPA或IgE SP）。在一些實施方案中，circRNA進一步包含與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接的Kozak序列。在一些實施方案中，circRNA包含核酸序列，所述核酸序列從5’端到3’端包含：m6A修飾基序序列、Kozak序列、SP和編碼抗原多肽的核酸序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含可被側於接編碼所述抗原多肽的核酸序列的5’端的3’催化性I型內含子片段識別的3’外顯子序列，以及可被側接於編碼所述抗原多肽的核酸序列的3’端的5’催化性I型內含子片段識別的5’外顯子序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含位於circRNA的5’端的5’連接序列，和位於circRNA的3’端的3’連接序列，其中5’連接序列和3’連接序列通過連接酶（例如，T4 RNA連接酶）互相連接。在一些實施方案中，抗原多肽包含S蛋白的RBD。在一些實施方案中，抗原多肽進一步包含多聚化結構域（例如，C末端Fd結構域，或基於GCN-4的異亮氨酸拉鍊結構域）。在一些實施方案中，抗原多肽包含S蛋白的S2區。在一些實施方案中，抗原多肽包含SARS-CoV-2變體的全長S蛋白的氨基酸殘基2至1273，其中編號基於SEQ ID NO: 1。在一些實施方案中，S蛋白的S2區包含穩定S蛋白的融合前構象的一個或多個突變（例如，K986P和V987P）。在一些實施方案中，抗原多肽包含抑制S蛋白切割的一個或多個突變（例如，氨基酸殘基681-684的缺失）。在一些實施方案中，circRNA包含選自SEQ ID NOs: 20-21的核酸序列。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是德爾塔變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是奧密克戎變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種奧密克戎亞變體（例如BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5）引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由奧密克戎亞變體的一種或多種亞譜系（例如BA.2.75、BA.4.6、BF.7、BQ.1.1）引起的。
本申請進一步提供了雞尾酒組合物（cocktail composition），其包含多個circRNA，每個circRNA包含編碼SARS-CoV-2變體的抗原多肽的核酸序列。在一些實施方案中，多個circRNA編碼彼此不同的抗原多肽，如抗原多肽（例如S蛋白或其片段）的不同突變體，或不同SARS-CoV-2變體的抗原多肽。 A. 抗原多肽
本文所述的circRNA疫苗包含編碼抗原多肽的環狀RNA（circRNA）。在一些實施方案中，抗原多肽包含SARS-CoV-2變體的刺突（S）蛋白或其片段，例如下文「刺突蛋白或其片段」小節中描述的任一種S蛋白或其片段。在一些實施方案中，抗原多肽包含多聚化結構域，如S蛋白的天然多聚化結構域，或外源多聚化結構域。合適的多聚化結構域在下麵的「多聚化結構域」小節中進行了描述。S蛋白或其片段可以通過肽接頭融合到多聚化結構域，例如下文「肽接頭」小節中描述的任一種肽接頭。
抗原多肽包含可被T細胞受體（TCR）識別的至少一個表位。在一些實施方案中，抗原多肽是全長蛋白或其片段，或可以在受試者中觸發免疫應答的抗原融合蛋白。在一些實施方案中，抗原多肽是長度不超過100個氨基酸的短肽。抗原多肽可以是來自含有一個或多個表位的蛋白抗原的天然衍生肽片段，或具有一個或多個天然表位元元序列的人工設計的肽，其中肽接頭可以任選地置於相鄰表位序列之間。在一些實施方案中，抗原多肽包含抗原蛋白的單個表位。在一些實施方案中，抗原多肽包含來自單個抗原蛋白的約1、2、3、4、5、10個或更多個表位中的任一個。在一些實施方案中，抗原多肽包含來自多種（例如，2、3、4、5、10或更多種）不同抗原蛋白的表位。在一些實施方案中，抗原多肽包含主要組織相容性複合體（MHC） I類限制性表位。在一些實施方案中，抗原多肽包含MHC II類限制性表位。在一些實施方案中，抗原多肽包含MHC I類限制性表位和MHC II類限制性表位。
在一些實施方案中，抗原多肽是自身抗原（如涉及疾病或病況的抗原）的抗原蛋白或其片段或其變體。在一些實施方案中，抗原多肽是腫瘤抗原肽。腫瘤抗原肽序列是本領域已知的，並且可以在公共資料庫中找到，如癌症抗原肽資料庫（van der Bruggen P et al. (2013) 「Peptide database: T cell-defined tumor antigens.」 Cancer Immunity. URL: caped.icp.ucl.ac.be）。本文所述的線性RNA或circRNA中的編碼RNA序列，可以編碼任何已知的腫瘤抗原肽或其組合。在一些實施方案中，抗原多肽包含腫瘤相關抗原（TAA）的表位。在一些實施方案中，抗原多肽包含腫瘤特異性抗原的表位。在一些實施方案中，抗原多肽包含新抗原的表位，即個體腫瘤細胞中存在的新獲得和表達的抗原。
在一些實施方案中，使用用於T細胞表位元預測的生物資訊學工具，基於抗原蛋白（包括新抗原）的序列來預測一種或多種表位肽的氨基酸序列。用於T細胞表位元預測的示例性生物資訊學工具是本領域已知的，例如，參見Yang X. and Yu X. (2009) 「An introduction to epitope prediction methods and software」 Rev. Med. Virol.19(2): 77-96。在一些實施方案中，抗原蛋白的序列是本領域已知的，或可在公共資料庫中獲得。在一些實施方案中，抗原蛋白(包括新抗原)的序列通過對被治療個體的樣品(例如腫瘤樣品)進行測序來確定。
在一些實施方案中，抗原多肽包含SARS-CoV-2變體的刺突（S）蛋白或其片段。在一些實施方案中，抗原多肽是全長S蛋白。在一些實施方案中，抗原多肽是天然存在的S蛋白的片段。
在一些實施方案中，抗原多肽包含SARS-CoV-2變體的S蛋白或其片段的變體。已經描述了SARS-CoV-2基因組的變體。參見，例如Forster et al. (2020). Phylogenetic network analysis of SARS-CoV-2 genomes. PNAS 117 (17) 9241-9243，其通過引用整體併入本文。在一些實施方案中，抗原多肽包含賦予SARS-CoV-2變體適應度優勢(如增強的傳染性)的S蛋白或其片段的變體。在一些實施方案中，抗原多肽包含具有D614G突變的SARS-CoV-2的S蛋白或其片段。在一些實施方案中，抗原多肽能夠在個體中激發針對SARS-CoV-2不同毒株和變體的免疫應答。在一些實施方案中，抗原多肽能夠在個體中激發針對SARS-CoV-2變體的特定毒株或變體的免疫應答。
在一些實施方案中，抗原多肽包含SARS-CoV2變體的S蛋白的受體結合結構域（RBD）。在一些實施方案中，RBD包含SARS-CoV-2的全長S蛋白的氨基酸殘基319至542，其中編號基於SEQ ID NO: 1。在一些實施方案中，RBD包含與SEQ ID NO: 18的氨基酸序列具有至少約80%（例如，至少約85%、90%、95%、98%或更多、或100%）序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，RBD包含與SEQ ID NO: 19的氨基酸序列具有至少約80%（例如，至少約85%、90%、95%、98%或更多、或100%）序列同一性的氨基酸序列。
在一些實施方案中，抗原多肽包含SARS-CoV2變體的S蛋白的S2區。在一些實施方案中，S2區包含SARS-CoV-2的全長S蛋白的氨基酸殘基686至1273，其中編號基於SEQ ID NO: 1。在一些實施方案中，S2區包含與SEQ ID NO: 6的氨基酸序列具有至少約80%（例如，至少約85%、90%、95%、98%或更多、或100%）序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，S2區包含穩定S蛋白的融合前構象的一個或多個突變。在一些實施方案中，S2區包含K986P和V987P突變。在一些實施方案中，S2區包含與SEQ ID NO: 7的氨基酸序列具有至少約80%（例如，至少約85%、90%、95%、98%或更多、或100%）序列同一性的氨基酸序列。
在一些實施方案中，抗原多肽包含SARS-CoV2變體的S蛋白的RBD和S2區。在一些實施方案中，抗原多肽包含與SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有至少約80%（例如，至少約85%、90%、95%、98%或更多、或100%）序列同一性的氨基酸序列。
在一些實施方案中，抗原多肽包含SARS-CoV2變體的刺突（S）蛋白片段和多聚化結構域，其可以可操作地連接到S蛋白片段。在一些實施方案中，多聚化結構域是介導T4纖維蛋白三聚化的T4纖維蛋白的C末端折疊子（Fd）結構域。在一些實施方案中，多聚化結構域是基於GCN-4的異亮氨酸拉鍊結構域。在一些實施方案中，多聚化結構域包含如SEQ ID NO: 3或4所示的氨基酸序列。在一些實施方案中，多聚化結構域通過肽接頭與S蛋白片段融合。在一些實施方案中，抗原多肽包含通過肽接頭與多聚化結構域融合的S蛋白的RBD結構域。在一些實施方案中，肽接頭包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。
在一些實施方案中，抗原多肽包含與多聚化結構域融合的SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白或其片段。在一些實施方案中，抗原多肽包含與介導T4纖維蛋白（例如，SEQ ID NO: 4）三聚化的T4纖維蛋白的C末端折疊子（Fd）結構域（例如，SEQ ID NO: 3）融合的S蛋白片段。在一些實施方案中，抗原多肽包含與基於GCN-4的異亮氨酸拉鍊結構域融合的S蛋白片段。在一些實施方案中，抗原多肽包含通過肽接頭與多聚化結構域融合的SARS-CoV-2的S蛋白的受體結合結構域（RBD）。在一些實施方案中，肽接頭包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。
抗原多肽可包含信號肽（SP）。在一些實施方案中，SP融合到S蛋白或其片段的N末端。在非限制性實例中，信號肽是來自人組織纖溶酶原啟動物（tPA）的信號序列和前肽，來自人IgE免疫球蛋白的信號序列，或MHC I的信號肽序列。在一些實施方案中，信號肽可以促進通過circRNA疫苗編碼的抗原多肽的分泌。
在一些實施方案中，circRNA包含與編碼抗原多肽的核酸序列的3’端可操作地連接的框內2A肽編碼序列。在一些實施方案中，circRNA在編碼抗原多肽的核酸序列的3’端不包含終止密碼子。在一些實施方案中，框內2A肽編碼序列替換終止密碼子。在一些實施方案中，circRNA不含有終止密碼子並且組成RNA的核苷酸數目是三的倍數。在一些實施方案中，不具有終止密碼子且組成RNA的核苷酸數目為三的倍數的circRNA，允許circRNA的滾環翻譯。在一些實施方案中，2A肽編碼序列允許circRNA的滾環翻譯。在一些實施方案中，2A肽允許將通過滾環翻譯生成的多肽切割成單體多肽序列。在非限制性實例中，2A肽編碼序列編碼P2A或T2A肽，如SEQ ID NO: 30或31所示的序列。
還提供了包含編碼本文所述的任一種抗原多肽的核酸序列的circRNA。編碼抗原多肽的核酸序列可以是密碼子優化的。在一些實施方案中，circRNA包含與選自SEQ ID NOs:20-21的核酸序列具有至少約80%（例如，至少約85%、90%、95%、98%或更多、或100%）序列同一性的核酸序列。 刺突蛋白或其片段
本文所述的circRNA疫苗包含circRNA，所述circRNA包含編碼含有SARS-CoV-2變體的刺突（S）蛋白或其片段的抗原多肽的核酸序列。
在一些實施方案中，S蛋白或其片段包含SARS-CoV-2的全長S蛋白的氨基酸殘基2至1273，其中編號基於SEQ ID NO: 1。在一些實施方案中，S蛋白或其片段包含氨基酸殘基681至684的缺失。在一些實施方案中，S蛋白或其片段在S2區包含至少一個點突變，例如K986P、V987P、F817P、A892P、A899P或A942P突變或其組合。在一些實施方案中，S蛋白或其片段包含選自下表A中列出的突變，如A222V、E406W、K417N、K417T、N439K、L452R、L452Q、L455N、L478K、E484K、Q493F、F490S、N501Y、A570D、D614G、P681H、A701V、T716I、S982A的至少一個突變或其組合。在一些實施方案中，S蛋白或其片段包含N501Y點突變。在一些實施方案中，S蛋白或其片段包含K417N、E484K和/或N501Y點突變。在一些實施方案中，S蛋白或其片段包含E484K點突變。在一些實施方案中，S蛋白或其片段包含K417T、E484K和N501Y點突變。在一些實施方案中，SARS-CoV-2的S蛋白或其片段包含K986P和V987P點突變，單獨或與氨基酸殘基681至684的缺失組合。在一些實施方案中，S蛋白或其片段包含如SEQ ID NOs: 1-2、SEQ ID NOs: 6-10、SEQ ID NOs: 18-19和SEQ ID NOs: 41中任一項所示的氨基酸序列。在一些實施方案中，S蛋白或其片段包含如SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列。在一些實施方案中，S蛋白或其片段包含如SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列。
在一些實施方案中，S蛋白或其片段包SARS-CoV-2變體的S蛋白的N末端結構域（NTD）。
在一些實施方案中，S蛋白或其片段包含與SARS-CoV-2變體的野生型S蛋白或其片段具有約80%、至少85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%或更多序列同一性的氨基酸序列，或具有如SEQ ID NOs:1-2、SEQ ID NOs:6-10、SEQ ID NOs:18-19和SEQ ID NO:41中任一項所示的氨基酸序列。 RBD 結構域
在一些實施方案中，S蛋白或其片段包含S蛋白的受體結合結構域（RBD）。在一些實施方案中，RBD包含SARS-CoV-2變體的全長S蛋白的氨基酸殘基319至542，其中編號基於SEQ ID NO: 1。在一些實施方案中，RBD包含SEQ ID NO: 18或19的氨基酸序列。在一些實施方案中，RBD包含與SEQ ID NO: 18的氨基酸序列具有約80%、至少85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%或更多序列同一性的序列。在一些實施方案中，RBD包含與SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有約80%、至少85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%或更多序列同一性的序列。在一些實施方案中，RBD與多聚化結構域連接。在一些實施方案中，RBD通過柔性肽接頭與多聚化結構域融合。 S2 區
在一些實施方案中，S蛋白或其片段包含S蛋白的S2區。在一些實施方案中，S2區包含SARS-CoV-2的全長S蛋白的氨基酸殘基686至1273，其中該編號基於SEQ ID NO: 1。在一些實施方案中，S2區包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列。在一些實施方案中，S2區包含穩定S蛋白的融合前構象的一個或多個突變。在一些實施方案中，S2區包含K986P和V987P突變，例如，如在SEQ ID NO: 7所示的序列中。在一些實施方案中，S2區包含單點突變，例如K986P、V987P、F817P、A892P、A899P或A942P突變。在一些實施方案中，S2區包含點突變的組合，包括K986P、V987P、F817P、A892P、A899P或A942P。在一些實施方案中，S2區包含SARS-CoV-2變體的S蛋白的野生型序列，如SEQ ID NO: 6的序列，或與SEQ ID NO: 6的氨基酸序列具有約80%、至少85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%或更多序列同一性的序列。 多聚化結構域
在一些實施方案中，抗原多肽進一步包含多聚化結構域，如二聚化結構域、三聚化結構域，或介導更高級多聚體形成的結構域。在一些實施方案中，多聚化結構域是三聚化結構域。在非限制性實例中，多聚化結構域包含T4纖維蛋白的C末端折疊子（Fd）結構域，其中C末端折疊子結構域是介導T4纖維蛋白三聚化的結構域，如SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列。在另一個實例中，多聚化結構域包含基於GCN4異亮氨酸拉鍊（IZ）結構域，其是基於來自釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）的GCN4轉錄啟動因數的三聚化結構域，如SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列。在一些實施方案中，多聚化結構域與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有約80%、至少85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%或更多的序列同一性。在一些實施方案中，可根據本領域已知技術修飾GCN4 IZ結構域或T4纖維蛋白Fd結構域以降低它們的免疫原性。例如，可以用N-連接的糖基化位點修飾GCN4 IZ結構域以降低其免疫原性（Sliepen et al. Immunosilencing a Highly Immunogenic Protein Trimerization Domain. The Journal of Biol. Chem. Vol. 290, No. 12, pp. 7436-7442）。在一些實施方案中，多聚化結構域與S蛋白或其片段的N末端融合。在一些實施方案中，多聚化結構域與S蛋白或其片段的C末端融合。 肽接頭
在一些實施方案中，抗原多肽中的各個結構域（例如，刺突蛋白或其片段的各個結構域）可以相互融合或包含通過肽接頭相互融合的結構域（例如，抗原多肽結構域和載體蛋白或多聚化結構域）。在一些實施方案中，抗原多肽是通過肽接頭與多聚化結構域融合的SARS-CoV-2的S蛋白的結構域。柔性肽接頭，如甘氨酸接頭、甘氨酸-絲氨酸接頭和含有其他氨基酸的接頭是本領域已知的（例如，合適的肽接頭由Chen等人在Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality. Adv. Drug Deli Rev. 2013 October 15; 65(10): 1357–1369中描述，該文獻通過引用整體併入本文）。肽接頭也可以通過計算方法設計。肽接頭可以是1到10，10到20，20到30，30到40，40到50，或大於50個氨基酸的任何長度。在一些實施方案中，肽接頭包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。 B. 附加的 circRNA 表達和環化元件
本文所述的circRNA疫苗的circRNA包含一個或多個額外的表達元件，其促進circRNA的表達和/或環化。
在一些實施方案中，circRNA包含與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接的Kozak序列，所述抗原多肽包含SARS-CoV-2變體的刺突（S）蛋白或其片段。在一些實施方案中，Kozak序列作為蛋白質翻譯起始位點發揮作用。
在一些實施方案中，circRNA包含編碼抗原多肽的核酸序列，所述抗原多肽包含SARS-CoV-2變體的刺突（S）蛋白或其片段，其與內部核糖體進入位點（IRES）可操作地連接。在非限制性實例中，IRES序列可以是CVB3病毒、EV71病毒、EMCV病毒、PV病毒或CSFV病毒的IRES序列。參見，例如，Searching for IRES. RNA. 2006 Oct; 12(10): 1755–1785，其通過引用整體併入本文。在一些實施方案中，IRES序列是細胞IRES序列。在一些實施方案中，IRES序列之後是與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接的Kozak序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含位於IRES序列的5’端的polyA或polyAC序列。
在一些實施方案中，polyA序列或polyAC間隔子位於IRES的5’端。在一些實施方案中，polyA或polyAC序列位於IRES的5’端和外顯子-外顯子剪接點之間。內部polyA序列或polyAC間隔子的長度可以在1到500個核苷酸的範圍內（例如，至少20、30、40、50、60、70、80、90、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500個核苷酸）。在一些實施方案中，polyA序列或polyAC序列的長度可以在10-70，20-60，或30-60個核苷酸的範圍內。在一些實施方案中，circRNA包含如SEQ ID NO: 23所示的polyAC序列，該序列位於IRES序列的5’端。在一些實施方案中，在IRES序列的5’端沒有polyA序列或polyAC序列。不受任何理論或假設的約束，在IRES序列之前添加的內部polyA序列或polyAC間隔子可以幫助保持IRES元件的功能性第二結構，以實現由IRES啟動的高效蛋白翻譯。在一些實施方案中，polyA序列或polyAC間隔子增加RNA構建體的表達。
在一些實施方案中，circRNA包含編碼抗原多肽的核酸序列，所述抗原多肽包含SARS-CoV-2變體的刺突（S）蛋白或其片段，所述核酸序列與m6A（N 6-甲基腺苷）修飾基序序列可操作地連接。m6A修飾序列可以包含m6A共有序列。M6A共有序列是本領域已知的（例如，Ke et al., 2017, m 6A mRNA modifications are deposited in nascent pre-mRNA and are not required for splicing but do specify cytoplasmic turnover. Genes & Dev. 2017. 31: 990-1006鑒定了共有序列，其通過引用整體併入本文）並可從GEO（GSE86336）下載。在一些實施方案中，m6A修飾基序序列包含如SEQ ID NO: 24所示序列。在一些實施方案中，m6A修飾基序序列之後是與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接的Kozak序列。
在一些實施方案中，circRNA進一步包含可被側接於編碼抗原多肽的核酸序列的5’端的3’催化性I型內含子片段識別的3’外顯子序列，以及可被側接於編碼抗原多肽的核酸序列的3’端的5’催化性I型內含子片段識別的5’外顯子序列。在一些實施方案中，可被3’催化性I型內含子片段識別的3’外顯子序列包含SEQ ID NO: 25的核酸序列。在一些實施方案中，可被5’催化性I型內含子片段識別的5’外顯子序列包含SEQ ID NO: 26的核酸序列。在一些實施方案中，3’催化性I型內含子片段包含SEQ ID NO: 32的核酸序列，並且5’催化性I型內含子片段序列包含SEQ ID NO: 33的核酸序列。
在一些實施方案中，T4噬菌體Td基因的I型催化內含子以這樣的方式被一分為二，以保留對核酶折疊至關重要的結構元件。然後將外顯子片段2連接到外顯子片段1的上游，並在外顯子-外顯子連接點（exon-exon junction）之間插入包含編碼抗原多肽的核酸序列，所述抗原多肽包含SARS-CoV-2變體的刺突（S）蛋白或其片段。在一些實施方案中，將包含IRES或m6A序列、Kozak序列、信號肽編碼序列、含有SARS-CoV-2變體的S蛋白或其片段的抗原多肽以及終止密碼子或框內2A肽序列插入外顯子-外顯子連接點之間。
在一些實施方案中，circRNA包含位於circRNA的5’端的5’連接序列，和位於circRNA的3’端的3’連接序列，其中5’連接序列和3’連接序列通過連接酶（例如T4 RNA連接酶）互相連接。 C. SARS-CoV-2 變體
示例性的SARS-CoV-2變體和與這些變體相關的刺突蛋白突變顯示在下麵的表A中。本文所述的circRNA疫苗和組合物可用于治療本文所述的任何一種SARS-CoV-2變體或其組合。本文所述的SARS-COV-2變體是由世界衛生組織命名的，或根據命名的全球疫情（PANGO）譜系軟體的系統發育分配命名的。應理解，可以使用本領域內不同的命名系統和演算法來指代相同的變體。SARS-CoV-2變體的分類和定義以及已知的SARS-CoV-2變體列表可在world wide web.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/variants/ variant-classifications.html找到。
表A. SARS-CoV-2變體
WHO標籤 Pango譜系 類型 S蛋白突變
α B.1.1.7和Q譜系 正在監控的變體 （VBM） 69del, 70del, 144del, (E484K*), (S494P*), N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H (K1191N*)
β B.1.351及後代譜系 VBM D80A, D215G, 241del, 242del, 243del, K417N, E484K, N501Y, D614G, A701V
γ P.1及後代譜系 VBM L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I
艾普西隆(Epsilon) B.1.427 B.1.429 VBM L452R, D614G S13I, W152C
艾塔(Eta) B.1.525 VBM A67V, 69del, 70del, 144del, E484K, D614G, Q677H, F888L
約塔(Iota) B.1.526 VBM (L5F*), T95I, D253G, (S477N*), (E484K*), D614G, (A701V*)
卡帕(Kappa) B.1.617.1 VBM (T95I), G142D, E154K, L452R, E484Q, D614G, P681R, Q1071H
N/A B.1.617.3 VBM T19R, G142D, L452R, E484Q, D614G, P681R, D950N
澤塔(Zeta) P.2 VBM E484K, (F565L*), D614G, V1176F
米尤(Mu) B.1.621, B.1.621.1 VBM D80G, 144del, F157S, L452R, D614G, (T791I*), (T859N*), D950H
德爾塔 B.1.617.2和AY 譜系 值得關注的變體 (VOC) T19R, (V70F*), T95I, G142D, E156-, F157-, R158G, (A222V*), (W258L*), (K417N*), L452R, T478K, D614G, P681R, D950N
奧密克戎 B.1.1.529和BA譜系 VOC A67V, del69-70, T95I, del142-144, Y145D, del211, L212I, ins214EPE, G339D, S371L, S373P, S375F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493R, G496S, Q498R, N501Y, Y505H, T547K, D614G, H655Y, N679K, P681H, N764K, D796Y, N856K, Q954H, N969K, L981F
參考SARS-CoV-2病毒是βCoV/WIV04/2019/（登錄號：epi-isl-402124）。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是正在監控的變體、感興趣的變體、值得關注的變體或高後果的變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體選自下組：α（即B.1.1.7和Q）變體、β（即B.1.351）變體、γ（即P.1，也稱為B.1.28.1）變體、艾普西隆（即B.1.427或B.1.429）變體、艾塔（即B.1.525）變體、約塔（即B.1.526）變體、卡帕（即B.1.617.1）變體、B.1.617.3變體、澤塔（即P.2）變體、米尤（即B.1.621或B.1.621.1）變體、德爾塔（即B.1.617.2或AY）變體，以及奧密克戎（即B.1.1.529或BA）變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是德爾塔變體，如B.1.617.2變體，或AY變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種SARS-CoV-2變體引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是奧密克戎變體，如B.1.529變體或BA變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種奧密克戎亞變體（例如BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5）引起。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由奧密克戎亞變體的一種或多種亞譜系（如BA.2.75.2、BA.4.6、BF.7、BQ.1.1）引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體在刺突蛋白中具有一個或多個突變（例如插入、缺失和/或替換）。在一些實施方案中，刺突蛋白中的一個或多個突變可影響病毒的適應度，如傳播性、毒力和/或抗藥性（例如對中和抗體的抗性和/或對疫苗的抗性）。在一些實施方案中，刺突蛋白中的一個或多個突變基本上不改變病毒的適應度。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體在刺突蛋白中不具有突變。 III. 治療方法
本文所述的circRNA和組合物可用於治療或預防個體的SARS-CoV-2感染，包括但不限於由SARS-CoV-2的德爾塔變體或奧密克戎變體引起的感染。在一些實施方案中，circRNA在個體中通過核糖體進行滾環翻譯。在一些實施方案中，circRNA以裸circRNA的形式施用。在一些實施方案中，circRNA以脂質納米顆粒製劑的形式施用。在一些實施方案中，circRNA被施用兩次或更多次。在一些實施方案中，每次施用的間隔時間是至少約四周，如至少為五、六、七或八周中的任何一周。在一些實施方案中，circRNA以初始劑量施用，隨後在大約4、6、8或10周中的任何一周以二次劑量施用。
在一些實施方案中，提供了治療或預防個體的SARS-CoV-2感染的方法，其包括向個體施用有效量的circRNA，其包含編碼SARS-CoV-2變體的抗原多肽的核酸序列。在一些實施方案中，抗原多肽是S蛋白或其片段。在一些實施方案中，所述方法包括施用有效量的雞尾酒組合物，其包含多個編碼不同抗原多肽的circRNA。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種SARS-CoV-2變體引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是德爾塔變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是奧密克戎變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種奧密克戎亞變體（例如BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5）引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由奧密克戎亞變體的一種或多種亞譜系（如BA.2.75.2、BA.4.6、BF.7、BQ.1.1）引起的。在一些實施方案中，circRNA以裸circRNA的形式施用。在一些實施方案中，circRNA以脂質納米顆粒製劑的形式施用。在一些實施方案中，circRNA被施用兩次或更多次。在一些實施方案中，每次施用之間的間隔時間是至少約4周，例如至少5、6、7或8周中的任何一周。
在一些實施方案中，本申請提供了包含circRNA的circRNA疫苗在製造治療或預防個體的SARS-CoV-2感染的疫苗的用途，所述circRNA包含編碼含有SARS-CoV-2變體的刺突（S）蛋白或其片段的抗原多肽的核酸序列。在一些實施方案中，circRNA以裸circRNA的形式施用。在一些實施方案中，circRNA以脂質納米顆粒製劑的形式施用。在一些實施方案中，circRNA被施用兩次或更多次。在一些實施方案中，每次施用之間的間隔時間是至少約4周，例如至少5、6、7或8周中的任何一次。
在一些實施方案中，本申請提供了預防或降低個體SARS-CoV-2的感染風險的方法，其包括向個體施用有效量的上述任何一個實施方案的circRNA，其中circRNA編碼SARS-CoV-2變體的抗原多肽。在一些實施方案中，所述方法包括施用雞尾酒組合物，其包含編碼不同抗原多肽的多個circRNA。在一些實施方案中，circRNA在個體中通過核糖體進行滾環翻譯。在一些實施方案中，circRNA以裸circRNA的形式施用，或以包含轉染劑的藥物組合物的形式施用。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種SARS-CoV-2變體引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是德爾塔變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2變體是奧密克戎變體。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由一種或多種奧密克戎亞變體（例如BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5）引起的。在一些實施方案中，SARS-CoV-2感染是由奧密克戎亞變體的一種或多種亞譜系（例如BA.2.75.2、BA.4.6、BF.7、BQ.1.1）引起的。在一些實施方案中，circRNA以裸circRNA的形式施用。在一些實施方案中，circRNA以脂質納米顆粒製劑的形式施用。在一些實施方案中，circRNA被施用兩次或更多次。在一些實施方案中，每次施用之間的間隔時間是至少約4周，例如至少5、6、7或8周中的任何一周。
在一些實施方案中，本申請提供了治療或預防個體中由多個SARS-CoV-2毒株引起的感染的方法，其包括向個體施用有效量的本文所述的任何一個實施方案中的circRNA疫苗。在一些實施方案中，所述方法包括向個體施用有效量的本文所述的任何一個實施方案中的多個不同的circRNA疫苗。在一些實施方案中，所述方法包括向個體施用包含多個（例如兩個或多個）circRNA的組合物，其中第一circRNA編碼SARS-CoV-2第一毒株的S蛋白或其片段，以及第二circRNA編碼SARS-CoV-2第二毒株的S蛋白或其片段。在一些實施方案中，多個circRNA中的至少一個編碼包含在表A的變體（如德爾塔或奧密克戎變體）中發現的突變的S蛋白或其片段。在一些實施方案中，circRNA以裸circRNA的形式施用。在一些實施方案中，circRNA以脂質納米顆粒製劑形式施用。在一些實施方案中，circRNA被施用兩次或更多次。在一些實施方案中，每次施用之間的間隔時間是至少約4周，例如至少5、6、7或8周中的任何一周。
在一些實施方案中，本申請提供了治療或預防個體中SARS-CoV-2感染的方法，其包括向個體施用有效量的包含circRNA的circRNA疫苗，所述circRNA包含編碼含有SARS-CoV-2變體的S蛋白或其片段的抗原多肽的核酸序列。在一些實施方案中，抗原多肽包含S蛋白的RBD。在一些實施方案中，抗原多肽進一步包含多聚化結構域（例如，C末端Fd結構域，或基於GCN-4的異亮氨酸拉鍊結構域）。在一些實施方案中，抗原多肽包含S蛋白的S2區。在一些實施方案中，抗原多肽包含SARS-CoV-2全長S蛋白的氨基酸殘基2至1273，其中編號基於SEQ ID NO: 1。在一些實施方案中，S蛋白的S2區包含一個或多個突變（例如K986P和V987P），所述突變穩定S蛋白的融合前構象。在一些實施方案中，抗原多肽包含一個或多個突變（例如，氨基酸殘基681至684的缺失），所述突變抑制S蛋白的切割。在一些實施方案中，抗原多肽包含具有D614G突變的SARS-CoV-2的S蛋白或其片段。在一些實施方案中，circRNA包含選自SEQ ID NOs: 20-21的核酸序列。在一些實施方案中，circRNA在個體中通過核糖體進行滾環翻譯。在一些實施方案中，circRNA以裸circRNA的形式施用。在一些實施方案中，circRNA以脂質納米顆粒製劑的形式施用。在一些實施方案中，circRNA被施用兩次或更多次。在一些實施方案中，每次施用之間的間隔時間是至少約四周，例如至少五、六、七或八周中的任何一周。
在一些實施方案中，本申請提供了治療或預防個體中SARS-CoV-2感染的方法，其包括向個體施用有效量的包含circRNA的circRNA疫苗，所述circRNA包含：（a）編碼抗原多肽的核酸序列，所述抗原多肽包含SARS-CoV-2變體的S蛋白或其片段，和（b）IRES序列，其中IRES序列與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接。在一些實施方案中，circRNA進一步包含與編碼抗原多肽的核酸序列的3’端可操作地連接的框內2A肽編碼序列。在一些實施方案中，核酸序列進一步編碼與S蛋白或其片段的N末端融合的SP（例如人tPA或IgE SP）。在一些實施方案中，circRNA進一步包含與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接的Kozak序列。在一些實施方案中，circRNA包含核酸序列，所述核酸序列從5’端到3’端包含：IRES序列、Kozak序列、SP和編碼抗原多肽的核酸序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含位於IRES序列的5’端的polyA或polyAC序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含可被側接於編碼抗原多肽的核酸序列的5’端的3’催化性I型內含子片段識別的3’外顯子序列，以及可被側接於編碼抗原多肽的核酸序列的3’端的5’催化性I型內含子片段識別的5’外顯子序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含位於circRNA的5’端的5’連接序列，和位於circRNA的3’端的3’連接序列，其中5’連接序列和3’連接序列通過連接酶（例如T4 RNA連接酶）互相連接。在一些實施方案中，抗原多肽包含S蛋白的RBD。在一些實施方案中，抗原多肽進一步包含多聚化結構域（例如，C末端的Fd結構域，或基於GCN-4的異亮氨酸拉鍊結構域）。在一些實施方案中，抗原多肽包含S蛋白的S2區。在一些實施方案中，抗原多肽包含SARS-CoV-2全長S蛋白的氨基酸殘基2至1273，其中編號基於SEQ ID NO: 1。在一些實施方案中，S蛋白的S2區包含一個或多個突變（例如K986P和V987P），所述突變穩定S蛋白的融合前構象。在一些實施方案中，抗原多肽包含一個或多個突變（例如，氨基酸殘基681至684的缺失），所述突變抑制S蛋白的切割。在一些實施方案中，抗原多肽包含具有D614G突變的SARS-CoV-2的S蛋白或其片段。在一些實施方案中，circRNA包含SEQ ID NO: 20或SEQ ID NO: 21的核酸序列。在一些實施方案中，circRNA在個體中通過核糖體進行滾環翻譯。在一些實施方案中，circRNA疫苗通過肌肉注射（i.m）施用。在一些實施方案中，施用一種或多種劑量的circRNA疫苗。在一些實施方案中，各劑量之間的間隔時間約為2周（例如，12、13、14、15或16天）。在一些實施方案中，所述方法包括施用第一劑量的circRNA疫苗，並在2周或約2周後施用第二劑量的circRNA疫苗。在一些實施方案中，circRNA以裸circRNA的形式施用。在一些實施方案中，circRNA以脂質納米顆粒製劑的形式施用。在一些實施方案中，circRNA被施用兩次或更多次。在一些實施方案中，每次施用之間的間隔時間是至少約四周，例如至少五、六、七或八周中的任何一周。
在一些實施方案中，本申請提供了治療或預防個體中SARS-CoV-2感染的方法，其包括向個體施用有效量的包含circRNA的circRNA疫苗，所述circRNA包括：（a）編碼抗原多肽的核酸序列，所述抗原多肽包含S蛋白或其變體的片段，以及（b）m6A修飾基序序列，其與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接。在一些實施方案中，核酸序列進一步編碼與S蛋白或其片段的N末端融合的SP（例如，人tPA或IgE SP）。在一些實施方案中，circRNA進一步包含與編碼抗原多肽的核酸序列可操作地連接的Kozak序列。在一些實施方案中，circRNA包含核酸序列，所述核酸序列從5’端到3’端包含：m6A修飾基序序列、Kozak序列、SP和編碼抗原多肽的核酸序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含可被側接於編碼所述抗原多肽的核酸序列的5’端的3’催化性I型內含子片段識別的3’外顯子序列，以及可被側接於編碼所述抗原多肽的核酸序列的3’端的5’催化性I型內含子片段識別的5’外顯子序列。在一些實施方案中，circRNA進一步包含位於circRNA的5’端的5’連接序列，和位於circRNA的3’端的3’連接序列，其中5’連接序列和3’連接序列通過連接酶（例如T4 RNA連接酶）互相連接。在一些實施方案中，抗原多肽包含S蛋白的RBD。在一些實施方案中，抗原多肽進一步包含多聚化結構域（例如，C末端的Fd結構域，或基於GCN-4的異亮氨酸拉鍊結構）。在一些實施方案中，抗原多肽包含S蛋白的S2區。在一些實施方案中，抗原多肽包含SARS-CoV-2全長S蛋白的氨基酸殘基2至1273，其中編號基於SEQ ID NO: 1。在一些實施方案中，S蛋白的S2區包含一個或多個突變（例如K986P和V987P），所述突變穩定S蛋白的融合前構象。在一些實施方案中，抗原多肽包含一個或多個突變（例如，氨基酸殘基681至684的缺失），所述突變抑制S蛋白的切割。在一些實施方案中，抗原多肽包含具有D614G突變的SARS-CoV-2的S蛋白或其片段。在一些實施方案中，circRNA包含選自SEQ ID NOs: 20-21的核酸序列。在一些實施方案中，circRNA在個體中通過核糖體進行滾環翻譯。在一些實施方案中，circRNA疫苗通過肌肉注射（i.m）施用。在一些實施方案中，施用一種或多種劑量的circRNA疫苗。在一些實施方案中，各劑量之間的間隔時間約為2周（例如，12、13、14、15或16天）。在一些實施方案中，所述方法包括施用第一劑量的circRNA疫苗，並在2周或約2周後施用第二劑量的circRNA疫苗。在一些實施方案中，circRNA以裸circRNA的形式施用。在一些實施方案中，circRNA以脂質納米顆粒製劑的形式施用。在一些實施方案中，circRNA被施用兩次或更多次。在一些實施方案中，每次施用的間隔時間是至少約四周，如至少為五、六、七或八周中的任何一周。 製劑和施用
在一些實施方案中，用於施用的circRNA組合物（例如circRNA疫苗或藥物組合物）進一步包含轉染劑。在非限制性實例中，轉染劑是聚乙烯亞胺（PEI）或脂質納米顆粒（LNP）。已經描述了用於施用circRNA的合適的脂質納米顆粒，例如描述於Ickenstein, L. M. & Garidel, P. Lipid-based nanoparticle formulations for small molecules and RNA drugs. 890 Expert Opin Drug Deliv 16, 1205-1226, doi:10.1080/17425247.2019.1669558 (2019), U.S. Patent App. Pub. No. 20200121809, U.S. Patent App. Pub. No. 20200163878, U.S. Patent App. Pub. No. 20190022247, and International Patent App. Pub. No. WO2021/030701，其內容通過引用整體併入本文。在一些實施方案中，LNP是由MC3-脂質：DSPC：膽固醇：PEG2000-DMG的脂質混合物形成。在一些實施方案中，MC3-脂質：DSPC：膽固醇：PEG2000-DMG以50: 10: 38.5: 1.5的摩爾比混合。
可用於施用circRNA組合物（例如，circRNA疫苗或藥物組合物）的脂質體的其他實例包括魚精蛋白、陽離子納米乳劑、修飾的樹枝狀納米顆粒、魚精蛋白脂質體、陽離子聚合物、陽離子聚合物脂質體、多糖顆粒、陽離子脂質納米顆粒、陽離子脂質-膽固醇納米顆粒、陽離子脂質-膽固醇PEG納米顆粒、以商標LIPOFECTAMINE出售的陽離子脂質轉染劑、以商標FUGENE出售的非脂質體轉染試劑，或其任何組合可以用作轉染劑。
在一些實施方案中，脂質體製劑可受到但不限於陽離子脂質成分的選擇、陽離子脂質的飽和度、PEG化的性質、所有成分的比例和生物物理參數（如尺寸）的影響。在一些實施方案中，脂質體製劑包括陽離子脂質、膽固醇和PEG化的脂質。例如，脂質體製劑可包括陽離子脂質、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、膽固醇和PEG-c-DMA。參見，例如Semple et al. Nature Biotech. 2010 28:172-176，該文獻通過引用整體併入本文。在一些實施方案中，脂質體製劑可包括約35%至約45%的陽離子脂質，約40%至約50%的陽離子脂質，約50%至約60%的陽離子脂質和/或約55%至約65%的陽離子脂質。在一些實施方案中，脂質體中脂質與RNA的比例可為約5:1至約20:1，約10:1至約25:1，約15:1至約30:1和/或至少30:1。合適的脂質體製劑已經描述於，例如在WO2020237227中，其內容通過引用整體併入本文。
在一些實施方案中，circRNA以裸RNA的形式遞送。在一些實施方案中，circRNA通過基因槍或通過電穿孔遞送。在一些實施方案中，circRNA疫苗基本上不含轉染劑（包括例如聚乙烯亞胺（PEI）、脂質體和/或脂質納米顆粒（LNP））。在一些實施方案中，circRNA疫苗基本上不含佐劑。在一些實施方案中，circRNA疫苗包含佐劑，這可以使疫苗激發更高的免疫應答。在一些實施方案中，佐劑不是氫氧化鋁。在一些實施方案中，circRNA疫苗基本上不含氫氧化鋁。在一些實施方案中，circRNA疫苗基本上不含下列物質中一種或多種（或全部）：魚精蛋白、陽離子納米乳劑、修飾的樹枝狀納米顆粒、魚精蛋白脂質體、陽離子聚合物、陽離子聚合物脂質體、多糖顆粒、陽離子脂質納米顆粒、陽離子脂質-膽固醇納米顆粒、陽離子脂質-膽固醇PEG納米顆粒、陽離子脂質轉染試劑、非脂質體轉染試劑，或其任何組合。
用於施用的circRNA疫苗（例如circRNA疫苗或藥物組合物）可以通過全身注射到血管系統中、全身注射到淋巴結中、皮下注射或儲庫（depot），或通過局部注射施用給受試者。在一些實施方案中，circRNA是通過鼻內施用。在一些實施方案中，circRNA經肌肉注射或皮內注射施用。
在一些實施方案中，本文的circRNA疫苗（例如，編碼SARS-CoV-2變體的S蛋白或其片段）通過肌肉注射（i.m）施用。在一些實施例中，施用一種或多種劑量的circRNA疫苗。在一些實施方案中，施用兩種或更多種劑量的circRNA疫苗。在一些實施方案中，各劑量之間的間隔時間約為2周（例如，12、13、14、15或16天）或更多。在一些實施方案中，所述方法包括施用第一劑量的circRNA疫苗，並在2周或約2周後施用第二劑量的circRNA疫苗。在一些實施方案中，第二劑量的circRNA在超過2周後施用，包括例如在3、4、5、6、7或8周中的任何一周後施用。
在一些實施方案中，circRNA可以配製在脂質納米顆粒中，例如在國際公開號WO2012170930中描述的那些，它們通過引用整體併入本文。
在一些實施方案中，合成納米載體可被配製成用於控制和/或持續釋放本文所述的circRNA。作為非限制性實例，用於持續釋放的合成納米載體可通過本領域中已知的、本文所述的和/或國際公開號WO2010138192和美國公公開號20100303850中所述的方法配製，其中每項通過引用整體併入本文。
在一些實施方案中，circRNA可被配製用於控制和/或持續釋放，其中所述製劑包含至少一種聚合物，所述聚合物是結晶側鏈（CYSC）聚合物。CYSC聚合物描述於美國專利號8,399,007，它通過引用整體併入本文。
在一些實施方案中，合成納米載體可被配製用作疫苗。在一些實施方案中，合成納米載體可封裝至少一種circRNA，其編碼至少一種抗原。作為一個非限制性的實例，合成納米載體可以包括至少一種抗原和用於疫苗劑型的賦形劑（參見國際公開號WO201 1150264和美國公開號US201 10293723，其中每一個都通過引用整體併入本文）。作為另一個非限制性的實例，疫苗劑型可以包括至少兩種具有相同或不同抗原的合成納米載體和賦形劑（參見國際公開號WO2011150249和美國公開號US20110293701，其中每一個都通過引用整體併入本文）。疫苗劑型可通過本文所述的方法、本領域已知的方法和/或國際公開號WO2011150258和美國公開號US20120027806中描述的方法來選擇，其中每一個都通過引用整體併入本文）。
在一些實施方案中，合成納米載體可包含至少一種circRNA，其編碼至少一種佐劑。作為非限制性的實例，佐劑可以包含二甲基二(十八烷基)溴化銨、二甲基二(十八烷基)氯化銨、二甲基二(十八烷基)磷酸銨或二甲基二(十八烷基)乙酸銨（DDA）和分枝桿菌的總脂質提取物的極性部分或所述極性部分的部分（參見例如美國專利號8,241,610；其通過引用整體併入本文）。在另一個實施方案中，合成的納米載體可包含至少一種circRNA和佐劑。作為非限制性的實例，合成納米載體和佐劑可以通過國際公開號WO2011150240和美國公開號US20110293700中描述的方法配製，其中每一個都通過引用整體併入本文。
在一些實施方案中，circRNA作為佐劑發揮作用。作為實例，細胞質中的RNA感應可以觸發先天性免疫，並且已知先天性免疫信號通過不同途徑促進適應性免疫。因此，包含抗原多肽的circRNA或第二circRNA（例如，不編碼多肽的circRNA）可被用作佐劑，以加強對抗原多肽的適應性免疫應答。
在一些實施方案中，用於施用的circRNA組合物（例如，circRNA疫苗或藥物組合物）可以鼻內施用。例如，circRNA疫苗可在鼻內施用，類似於活疫苗的施用。在一些實施方案中，circRNA可以肌肉注射或皮內注射施用，類似於本領域已知的滅活疫苗的施用。
在一些實施方案中，circRNA疫苗包含佐劑，其可使疫苗激發更高的免疫應答。作為非限制性的實例，佐劑可以是亞微米的水包油乳劑，其可以在人類兒科群體中激發更高的免疫應答（參見，例如美國專利公開號US20120027813和美國專利號US8506966中描述的含佐劑的疫苗，其內容通過引用整體併入本文）。
在一些實施方案中，本申請的circRNA組合物可與其他預防性或治療性化合物一起施用。作為非限制性的實例，預防性或治療性化合物可以是佐劑或加強劑。如本文所使用的，當提到預防性組合物，如疫苗時，術語「加強劑」是指預防性組合物的額外施用。加強劑（或加強疫苗）可以在預防性組合物的早期施用後給予。預防性組合物的初次施用和加強劑之間的施用時間可以是但不限於1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時、1天、36小時、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、18個月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或超過99年。 IV. 製備方法
本申請進一步提供了核酸構建體（例如線性RNA和載體等）用於製備本文所述的circRNA，以及用於製備circRNA的方法，例如通過線性RNA的化學連接、酶促連接或核酶自催化。在一些實施方案中，circRNA是通過體外環化線性RNA製備的。 線性 RNA 和編碼所述線性 RNA 的核酸構建體
在一些實施方案中，本申請提供了能夠形成上述任何一個實施方案的circRNA的線性RNA。在一些實施方案中，線性RNA可以通過使用溴化氰或類似的縮合劑的化學環化方法進行環化。在一些實施方案中，線性RNA可以通過包含5’催化性I型內含子片段和3’催化性I型內含子片段的I型內含子的自催化進行環化。在一些實施方案中，線性RNA可以通過連接酶進行環化。在一些實施方案中，線性RNA可通過T4 RNA連接酶進行環化。在一些實施方案中，線性RNA可通過DNA連接酶進行環化。合適的連接酶包括但不限於T4 DNA連接酶（T4 Dnl）、T4 RNA連接酶1（T4 Rnl1）和T4 RNA連接酶2（T4 Rnl2）。
在一些實施方案中，本申請提供了能夠形成上述任何一個實施方案的circRNA的線性RNA，其中線性RNA可通過I型內含子的自催化進行環化。在一些實施方案中，I型內含子包含5’催化性I型內含子片段和3’催化性I型內含子片段。在一些實施方案中，線性RNA包含3’催化性I型內含子片段（如SEQ ID NO: 32所示的序列），其側接可被3’催化性I型內含子片段（如SEQ ID NO. 25所示的序列）識別的3’外顯子序列的5’端，以及5’催化性I型內含子片段（如SEQ ID NO: 33所示的序列），其側接可被5’催化性I型內含子片段（如SEQ ID NO: 26所示的序列）識別的5’外顯子序列的3’端。
在一些實施方案中，線性RNA從5’到3’端包含3’內含子-IRES-Kozak-SP-刺突-5’內含子序列。在一些實施方案中，刺突序列包含如SEQ ID NOs: 11-15、18-19和41所示的序列之一。
在一些實施方案中，線性RNA從5’到3’端包含3’內含子-IRES-Kozak-SP-RBD-5’內含子序列。在一些實施方案中，RBD序列包含SARS-CoV-2的全長S蛋白的氨基酸殘基319至542，其中編號基於SEQ ID NO: 1。
在一些實施方案中，線性RNA進一步包含側接3’催化性I型內含子片段的5’端的5’同源序列，以及側接5’催化性I型內含子片段的3’端的3’同源序列。在一些實施方案中，線性RNA從5’到3’端包含5’同源臂-3’催化性I型內含子片段-3’外顯子序列-IRES-Kozak-SP-抗原多肽（例如，刺突蛋白或其片段）-5’外顯子序列-5’催化性I型內含子片段-3’同源臂序列。在一些實施方案中，同源序列的長度可以為1到100，5到80，5到60，10到50，或12到50個核苷酸。在一些實施方案中，同源序列的長度約為20-30個核苷酸。在一些實施方案中，5’同源序列包含SEQ ID NO: 27的核酸序列，3’同源序列包含SEQ ID NO: 28的核酸序列。在一些實施方案中，同源臂使RNA環化的效率提高約0至20%，超過20%，超過30%，超過40%，或超過50%。
在一些實施方案中，提供了核酸構建體，其包含編碼線性RNA的核酸序列。在一些實施方案中，T7啟動子與編碼線性RNA的核酸序列可操作地連接。在一些實施方案中，T7啟動子包含如SEQ ID NO: 29所示的序列。在一些實施方案中，T7啟動子能夠驅動體外轉錄。 質粒
在一些實施方案中，本申請提供了包含本文所述核苷酸序列的質粒。在一些實施方案中，質粒是通過將編碼線性化RNA的序列克隆到質粒載體中得到的。質粒可以通過本領域已知的技術，如Gibson克隆或使用限制性酶的克隆產生。在一些實施方案中，質粒載體包括抗生素表達盒，允許對表達該質粒的細菌進行抗生素選擇。在一些實施方案中，所提供的質粒可以從細菌中純化，並用於產生線性circRNA構建體。可以使用適合於體外轉錄線性RNA的任何質粒載體。
在一些實施方案中，質粒在體外轉錄線性RNA之前被線性化。在一些實施方案中，重組質粒通過限制性酶消化進行線性化。在一些實施方案中，重組質粒通過PCR擴增進行線性化。在一些實施方案中，所述方法進一步包括用線性化質粒範本進行體外轉錄。在一些實施例中，體外轉錄是由T7啟動子驅動的。 通過化學連接使線性 RNA 環化
在一些實施方案中，提供了製備本文所述的circRNA的方法，其包括：（a）化學連接包含編碼circRNA的核酸序列的線性RNA的5’端和3’端；以及（b）分離環化的RNA產物，從而提供circRNA。
在一些實施方案中，環化線性RNA的步驟包括使用溴化氰或類似縮合劑的化學環化方法。
在一些實施方案中，可以通過化學方法使線性RNA環化。在一些化學方法中，核酸（例如線性環狀多核糖核苷酸）的5’端和3’端包括化學反應性基團，當靠近時，可在分子的5’端和3’端之間形成新的共價連接。5’端可含有NHS酯反應性基團，3’端可含有3’氨基末端的核苷酸，使得在有機溶劑中，線性RNA分子3’端上的3’氨基末端的核苷酸將對5’-NHS-酯部分發生親核攻擊，形成新的5’-/3’-醯胺鍵。
在一些實施方案中，本文提供的環化方法的環化效率為至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或100%。在一些實施方案中，本文提供的環化方法的環化效率為至少約40%。 通過核酶自催化使線性 RNA 環化
在一些實施方案中，circRNA可以通過核酶自催化使線性RNA環化而獲得。在一些實施方案中，線性RNA在體外被環化。在一些實施方案中，通過核酶自催化進行環化包括（a）將線性RNA置於啟動I型內含子（或其5’和3’催化性I型內含子片段）的自催化的條件下，以提供環化的RNA產物；以及（b）分離環化的RNA產物，從而提供circRNA。
在一些實施方案中，所述方法包括通過首先將編碼線性化RNA的序列克隆到質粒載體中，然後將重組質粒線性化來獲得線性RNA的步驟。在一些實施方案中，重組質粒通過限制性酶消化進行線性化。在一些實施方案中，重組質粒通過PCR擴增進行線性化。在一些實施方案中，所述方法進一步包括用線性化質粒範本進行體外轉錄。在一些實施方案中，體外轉錄是由T7啟動子驅動的。在一些實施例中，所述方法進一步包括純化線性RNA轉錄物。在一些實施方案中，通過凝膠純化來純化線性RNA。
在一些實施方案中，本申請提供了通過I型內含子的核酶自催化來環化線性RNA（例如，純化的線性RNA）的方法。在剪接過程中，鳥苷核苷酸的3’羥基在5’剪接位點進行酯化反應。5’內含子的一半被切除，中間體端遊離的羥基在3’剪接位點進行第二次酯化反應，導致中間區域的環化和3’內含子的切除。在一些實施方案中，啟動I型內含子或5’和3’催化性I型內含子片段的自催化的條件是加入GTPs和Mg 2+。在一些實施方案中，提供了通過在55℃下加入GTPs和Mg 2+15分鐘使線性RNA環化的步驟。在一些實施方案中，所述方法進一步包括用RNase R處理以消化線性RNA轉錄物。在一些實施方案中，所述方法進一步包括分離環狀RNA（circRNA）。在一些實施方案中，分離circRNA的步驟包括凝膠純化circRNA。在一些實施方案中，純化的circRNA可以儲存在-80℃。
在一些實施方案中，環化的效率為至少2%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少32%、至少34%、至少36%、至少38%、至少40%、至少42%、至少44%、至少46%、至少48%、或至少50%。在一些實施方案中，環化的效率為約40%至約50%或超過50%。 通過連接使線性 RNA 環化
在一些實施方案中，circRNA可通過使用連接酶如RNA連接酶環化線性RNA而獲得。在一些實施方案中，線性RNA在體外被環化。在一些實施方案中，線性RNA可以通過T4 RNA連接酶環化。在一些實施例中，線性RNA包含位於編碼circRNA的核酸序列的5’端的5’連接序列，和位於編碼circRNA的核酸序列的3’端的3’連接序列，其中5’連接序列和3’連接序列可以通過RNA連接酶互相連接。在非限制性實例中，線性RNA可以通過連接酶，如T4 DNA連接酶（T4 Dnl）、T4 RNA連接酶1（T4 Rnl1）和T4 RNA連接酶2（T4 Rnl2）環化。線性RNA可以在有或沒有單鏈核酸銜接子，例如夾板（splint）DNA的情況下被環化。
在一些實施方案中，本申請提供了生產上述任何一種circRNA的方法，其包括：（a）將包含位於編碼circRNA的核酸序列的5’端的5’連接序列，和位於編碼上述circRNA的核酸序列的3’端的3’連接序列的任何一種線性RNA與單鏈銜接子核酸接觸，所述銜接子核酸從5’端到3’端包含：與3’連接序列互補的第一序列和與5’連接序列互補的第二序列，其中5’連接序列和3’連接序列與單鏈銜接子核酸雜交以提供雙鏈核酸中間體，其包含5’連接序列的3’端和3’連接序列的5’端之間的單鏈斷裂；（b）在允許5’連接序列與3’連接序列連接的條件下，將中間體與RNA連接酶接觸，以提供環化的RNA產物；以及（c）分離環化的RNA產物，從而提供circRNA。
在一些實施方案中，本文所述的方法包括在體外使線性RNA環化，其包括：（a）在允許5’連接序列與3’連接序列連接的條件下，將包含位於編碼環狀RNA的核酸序列的5’端的5’連接序列，和位於編碼上述環狀RNA的核酸序列的3’端的3’連接序列的任何一種線性RNA與RNA連接酶接觸，以提供環化的RNA產物；以及（b）分離環化的RNA產物，從而提供環狀RNA。
在一些實施方案中，所述方法進一步包括用RNase R處理以消化線性RNA轉錄物。在一些實施方案中，所述方法進一步包括分離環狀RNA （circRNA）。在一些實施方案中，分離circRNA的步驟包括凝膠純化circRNA。在一些實施方案中，純化的circRNA可以儲存在-80℃。
在一些實施方案中，可使用DNA或RNA連接酶將5’-磷酸化的核酸分子（例如，線性RNA）與核酸（例如，線性核酸）的3’-羥基酶促連接，形成新的磷酸二酯鍵。在一個反應實例中，根據製造商的方案，將線性環狀RNA與1-10個單位的T4 RNA連接酶（New England Biolabs, Ipswich, Mass .）在37℃溫育1小時。連接反應可以在能夠與5’-和3’-區域並列的堿基配對的線性核酸的存在下發生，以幫助酶促連接反應。在一些實施方案中，連接是夾板連接。例如，夾板連接酶，如SPLINTR®連接酶，可用於夾板連接。對於夾板連接，單鏈多核苷酸（夾板），如單鏈RNA，可以被設計成與線性多核糖核苷酸的兩個末端雜交，以便在與單鏈夾板雜交時兩個末端可以並列。夾板連接酶因此可以催化線性多核糖核苷酸的並列的兩個末端的連接，生成環形多核糖核苷酸。
在一些實施方案中，DNA或RNA連接酶可用於環狀RNA的合成。作為非限制性的實例，連接酶可以是環連接酶（circ ligase）或環狀連接酶（circular ligase）。 circRNA 的純化
在一些實施方案中，本文提供的產生circRNA的方法進一步包括純化環化的RNA產物的步驟。在非限制性實例中，通過凝膠純化或通過高效液相色譜法（HPLC）純化circRNA。在一些實施例中，瓊脂糖凝膠電泳可以簡單有效地將環狀剪接產物與線性前體分子、帶切口的環、剪接中間體和切除的內含子分離。在一些實施方案中，所述方法包括通過色譜法，如HPLC純化環狀RNA。在一些實施方案中，純化的環狀RNA可以儲存在-80℃。 V. 藥物組合物、試劑盒和製品
本申請進一步提供的藥物組合物包含本文描述的任何一種circRNA，和藥學上可接受的載體。藥物組合物可以通過將具有所需純度的本文所述的治療劑與任選的藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)，其通過引用整體併入本文）混合來製備，以凍幹製劑或水溶液的形式。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所採用的劑量和濃度下對接受者無毒，並且包括緩衝劑、抗氧化劑（包括抗壞血酸、蛋氨酸、維生素E、焦亞硫酸鈉）；防腐劑、等滲劑（例如氯化鈉）、穩定劑、金屬絡合物（例如Zn-蛋白絡合物）；螯合劑，例如EDTA和/或非離子表面活性劑。
在一些實施方案中，藥物組合物包含在一次性使用的小瓶中，例如一次性使用的密封小瓶。在一些實施方案中，藥物組合物包含在多用小瓶中。在一些實施方案中，藥物組合物以散裝形式包含在容器中。在一些實施方案中，藥物組合物被冷凍保存。
本申請進一步提供用於本文所述治療方法的任何實施方案的試劑盒和製品。試劑盒和製品可包含本文所述的任何一種製劑和藥物組合物。
在一些實施方案中，提供了包含本文所述的任何一種circRNA和用於治療或預防SARS-CoV-2感染的說明書的試劑盒。
在一些實施方案中，提供了包含本文所述的任何一種質粒或線性RNA，以及製備任何一種circRNA的說明書的試劑盒。在一些實施方案中，提供了包含本文所述的任何一種質粒、線性RNA或circRNA，以及用於施用circRNA的說明書的試劑盒。
本申請的試劑盒在合適的包裝中。合適的包裝包括但不限於小瓶、瓶子、罐、軟包裝（例如密封的Mylar或塑膠袋）等。試劑盒可任選地提供額外的成分，如緩衝劑和解釋資訊。因此，本申請還提供了製品，其包括小瓶（如密封小瓶）、瓶子、罐、軟包裝等。
與組合物的使用有關的說明書一般包括關於預期治療的劑量、給藥時間表和施用途徑的資訊。容器可以是單位劑量、散裝包裝（例如多劑量包裝）或子單位劑量。例如，可以提供含有足夠劑量的本文所公開的circRNA的試劑盒，以提供對個體或許多個體的有效治療。此外，可提供含有足夠劑量的circRNA的試劑盒，以便對個體進行多次施用（例如，在circRNA疫苗的情況下，初始疫苗施用和隨後的加強施用）。試劑盒還可包括多單位劑量的藥物組合物和使用說明書，並以足以在藥房（例如醫院藥房和複方藥房）儲存和使用的數量包裝。
在一些實施方案中，試劑盒包括遞送系統。遞送系統可以是單位劑量的遞送系統。每個劑量遞送的溶液或懸浮液的體積可以是約5至約2000微升，約10至約1000微升，或約50至約500微升。用於這些不同劑型的遞送系統可以是單位劑量或多劑量包裝的注射器、滴瓶、塑膠擠壓單元、噴霧器、霧化器或藥物氣霧劑。在一些實施方案中，提供了本文所述的任何一種circRNA的遞送系統，其包含circRNA和用於遞送circRNA的裝置。
本說明書中公開的所有特徵可以以任何組合方式組合。本說明書中公開的每個特徵可以由用於相同、等同或類似目的的替代特徵取代。因此，除非明確說明，否則所公開的每個特徵只是通用系列的等效或類似特徵的實例。 實施例
通過參考以下實例，將更充分地理解本申請。然而，它們不應該被解釋為限制本申請的範圍。應理解的是，本文所述的實例和實施方案僅用於說明目的，在此基礎上的各種修改或變化將被建議給本領域的技術人員，並被包括在本申請的精神和範圍以及所附的實施方案的範圍內。 實施例 1. circRNA RBD 產生功能性 SARS-CoV-2 RBD 抗原
採用I型核酶自催化策略 43來產生編碼SARS-CoV-2 RBD抗原 23的環狀RNA，稱為circRNA RBD（圖1A）。在這個構建體中，IRES元件被置於RBD編碼序列之前以啟動其翻譯。為了提高RBD抗原的免疫原性，將人組織纖溶酶原啟動物（tPA）的信號肽序列融合到RBD的N末端以確保抗原的分泌 17, 45-47。此外，最近的研究報導，RBD三聚體在結合hACE2方面優於單體RBD 6,7,48。因此，將噬菌體T4纖維蛋白（折疊子） 49的三聚化基序融合到其C末端，以進一步提高RBD抗原的免疫原性。然後將該IRES-SP-RBD-折疊子序列克隆到載體中，以構建體外轉錄（IVT）的範本，用於生產circRNA RBD（圖1A）。通過使用特異性引物的反轉錄-PCR分析和sanger測序驗證circRNA RBD的精確環化（圖1A-1B）。
由於其共價封閉的環狀結構，circRNA RBD在電泳中遷移得更快（圖9A），並且似乎比線性前體RNA對外切酶RNase R的抗性更大（圖9B）。高效液相色譜法（HPLC）顯示，RNase R處理清除了大量的線性前體RNA，這是純化circRNA RBD的重要步驟（圖9C）。
為了測試由circRNA RBD產生的RBD抗原的分泌表達，將純化的circRNA RBD轉染到HEK293T細胞。Western blot結果顯示，上清液中產生了大量的RBD抗原（圖1C）。定量ELISA檢測顯示，circRNA RBD產生的RBD抗原濃度達到~1400 ng/mL，比線性前體RNA高600倍（圖1D）。circRNA RBD在鼠NIH3T3細胞中也能產生RBD抗原，表明circRNA的高相容性（圖1E）。總之，這些結果表明，使用circRNA RBD可以在人和鼠細胞中產生豐富的分泌RBD抗原。
除了I型核酶自催化策略外，還使用T4 RNA連接酶來產生circRNA RBD（圖1F）。同樣，western blot和定量ELISA結果表明，RBD抗原在上清液中有效表達，抗原濃度達到~1000 ng/mL，比其線性前體RNA高~200倍（圖1G-1H）。
為了驗證由circRNA RBD產生的分泌SARS-CoV-2 RBD抗原是否具有功能性，使用hACE2過表達HEK293細胞（HEK293T-ACE2）和攜帶EGFP報告基因的SARS-CoV-2假病毒，將circRNA RBD轉染的細胞的上清液用於進行競爭試驗 50。分泌SARS-CoV-2 RBD抗原可以有效地阻斷SARS-CoV-2假病毒的感染（圖1I）。總之，circRNA RBD顯示了強大的蛋白質表達和高穩定性，說明它有被工程化為新的疫苗平臺的潛力。 實施例 2 ： SARS-CoV-2 circRNA RBD 疫苗誘導具有高水準中和抗體的持續體液免疫應答
為了探索circRNA是否可以被開發成新型的疫苗，然後評估了用脂質納米顆粒封裝的circRNA RBD在BALB/c小鼠中的免疫原性（圖2A）。circRNA RBD的封裝效率超過93%，其平均直徑為100 nm（圖2B）。小鼠通過肌肉注射LNP-circRNA RBD進行免疫兩次，每次間隔兩周，每只小鼠的劑量為10 μg或50 μg，而空LNP被用作安慰劑對照（圖2C）。在加強劑量後的兩周或五周，評估了RBD特異性結合IgG和中和抗體的數量。circRNA RBD以劑量依賴的方式激發了高滴度的RBD特異性IgG，每個劑量和加強免疫後2周和5周均為~3×10 4和~1×10 6，，表明circRNA RBD可以誘導針對SARS-CoV-2 RBD的長效抗體（圖2D）。
為了測試來自疫苗接種小鼠的血清樣本的中和能力，進行了中和試驗。證明來自circRNA RBD疫苗接種小鼠的血清可以有效中和SARS-CoV-2假病毒（圖2E）和真SARS-CoV-2病毒（圖2F），小鼠（50 μg circRNA RBD）的NT50分別為~5.6×10 3（圖2E）和~2.2×10 5（圖2F）。大量的RBD特異性IgG、強效的RBD抗原中和作用以及持續的SARS-CoV-2中和能力表明，circRNA RBD疫苗確實在小鼠中誘導了持久的體液免疫應答。 實施例 3 ： SARS-CoV-2 circRNA RBD-β 疫苗激發的抗體對 β 變體顯示出優先的中和活性
接下來，評估了編碼衍生自SARS-CoV-2 β變體的RBD/K417N-E484K-N501Y抗原的circRNA疫苗（稱為circRNA RBD-β）的效力。BALB/c小鼠通過肌內注射circRNA RBD-β疫苗進行免疫，然後每隔兩周進行強化。在加強免疫後的1周和2周收集免疫小鼠的血清。ELISA顯示，RBD-β特異性IgG終點滴度在加強免疫後2周可達到~7×10 4（圖2G）。替代中和試驗顯示，circRNA RBD-β免疫小鼠的血清有效中和RBD抗原（圖10C）。SARS-CoV-2假病毒中和試驗顯示，circRNA RBD激發的抗體可以有效中和所有三種病毒株，其中對D614G毒株的中和活性最高（圖2H）。circRNA RBD-β激發的抗體也能中和所有三種假病毒，其中對其相應的變體β毒株的中和活性最高（圖2I）。
與假病毒中和試驗一致，血清可以有效中和真SARS-CoV-2 β毒株，NT50為7.1×10 4（圖2J），可以中和真SARS-CoV-2 D164G毒株，NT50為9.8×10 3（圖2K），效果較差。總的來說，circRNA疫苗激發的抗體對其相應的變異毒株顯示出最好的中和活性。值得注意的是，兩種疫苗都能中和所有三種菌株，儘管效力各異。儘管如此，基於新出現的變體的突變的更新疫苗或多價疫苗很可能對SARS-CoV-2流通變體（特別是最近具有嚴重抗體逃逸能力的奧密克戎變體）提供更好、更有效的保護奧密克戎。 實施例 4 ： circRNA RBD-β 疫苗保護小鼠免受 SARS-CoV-2 β 變體的感染
為了進一步評估SARS-CoV-2 circRNA RBD-β疫苗在體內的保護效力，進行了β毒株的真病毒攻擊實驗。與最近的報告 59一致，由於刺突蛋白，如K417N、E484Q和N501Y 59,60的突變，SARS-CoV-2 β變體可以感染BALB/c小鼠並在其肺部複製（圖2L）。加強劑量後近兩個月，RBD-501Y.V2特異性IgG的滴度約為2×10 4（圖10B），並且血清顯示出對RBD-β抗原的顯著中和能力（圖2M）。然後，每只免疫小鼠在加強劑量後7周通過鼻內途徑接受5×10 4PFU的真SARS-CoV-2 B.1.351/501Y.V2毒株的攻擊，攻擊後3天收集肺組織用於檢測病毒RNA。發現與疫苗接種的小鼠相比，安慰劑組的小鼠體重減輕更多（圖2N）。一致的是，與接受安慰劑的小鼠相比，疫苗接種的小鼠肺部的病毒滴度明顯下降（圖2O）。這些結果表明，circRNA RBD-β疫苗可以有效地保護小鼠免受SARS-CoV-2 β變體的感染。 實施例 5 ： circRNA RBD- 德爾塔 疫苗誘導針對 SARS-CoV-2 德爾塔變體的強效中和抗體
目前，SARS-CoV-2的德爾塔變體是世界範圍內的主要流行毒株。與β變體類似，德爾塔變體也能部分逃逸倖存者或接種疫苗者產生的抗體。因此，迫切需要開發針對德爾塔變體的更新疫苗。採用了I型核酶自催化和T4 RNA連接策略來產生編碼德爾塔變體的RBD抗原的circRNA RBD- 德爾塔。然後將circRNA RBD- 德爾塔用LNP（PRECISION NANOSYSTEMS）封裝，生成LNP-circRNA RBD- 德爾塔疫苗。用0.5 μg、2.5 μg、5 μg或10 μg的LNP-circRNA RBD- 德爾塔疫苗對小鼠進行肌內注射免疫2次，每次間隔2周，而空LNP則作為安慰劑對照。加強劑量後兩周，收集免疫小鼠的血清樣本以檢測RBD特異性抗體。I型核酶自催化策略或基於T4 RNA連接策略的circRNA RBD- 德爾塔疫苗都能在小鼠體內誘導出高滴度的IgG結合抗體（圖3A-3B）。來自circRNA RBD- 德爾塔疫苗接種的小鼠血清可以以劑量依賴的方式有效中和SARS-CoV-2 德爾塔假病毒，10 μg的劑量的NT50甚至可以達到~2×10 5（圖3C）。
重要的是，circRNA RBD- 德爾塔免疫小鼠的血清也能有效中和其他變體，包括原始株、α和β變體，但中和能力不同。來自circRNA RBD- 德爾塔免疫小鼠的血清對相應的德爾塔變體表現出高的中和活性。對原始株和α變體的中和活性部分下降（圖3D-3E），β變體在circRNA RBD- 德爾塔免疫小鼠的血清中逃逸最差，特別是在10 μg的劑量下（圖3E）。對這四種SARS-CoV-2變體的中和能力隨著接種劑量從0.5 μg增加到5 μg而提高。然而，當劑量從5 μg進一步增加到10 μg時，對原始株、α或β變體的中和活性未增加（圖3E）。但對相應的德爾塔變體的中和活性繼續增加，幾乎為10倍（圖3E）。與上述關於circRNA RBD-β的結果一致（圖2H-2K），這些結果強烈地表明，根據新出現的變體的相應突變開發更新的疫苗可能比目前使用原始SARS-CoV-2疫苗作為第三強化劑的策略提供更有效的保護。 實施例 6 ： circRNA RBD- 德爾塔 疫苗激發 T 細胞免疫應答
B細胞、CD4 +T細胞和CD8 +T細胞是適應性免疫的三大支柱，它們介導與COVID-19的非住院和住院病例中SARS-CoV-2的控制有關的效應子功能 （Sette and Crotty, 2021）。
為了探究和比較circRNA RBD- 德爾塔與1mΨ-修飾的mRNA RBD- 德爾塔（1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔）疫苗激發的CD4 +和CD8 +T細胞免疫應答，收集用circRNA RBD- 德爾塔疫苗或1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔疫苗免疫的小鼠脾細胞，用SARS-CoV-2 RBD-德爾塔混合肽（下表B）進行刺激，並通過細胞內細胞因數染色對效應記憶T細胞（Tem, CD44 +CD62L -）中的產生細胞因數的T細胞進行量化（圖11）。在RBD肽池的刺激下，檢測到來自用circRNA RBD- 德爾塔疫苗或1mΨU-mRNA RBD- 德爾塔疫苗免疫的小鼠的CD8 +T細胞產生幹擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因數（TNF-α）和白細胞介素-2（IL-2）（圖3F-3H），表明RBD特異性CD8 +T細胞應答被circRNA RBD- 德爾塔和1mΨU-mRNA RBD- 德爾塔疫苗激發。用circRNA RBD- 德爾塔疫苗或1mΨU-mRNA RBD- 德爾塔疫苗免疫的小鼠的CD4 +T細胞誘導出強烈的IFN-γ、TNF-α和IL-2應答，但IL-4應答極少（圖3I-3L），表明circRNA RBD- 德爾塔和1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔疫苗都誘導了Th1偏向的T細胞免疫應答，而1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔疫苗表現出比circRNA RBD- 德爾塔疫苗稍強的CD4 +T細胞應答（圖3I-3K）。
表B. RBD-德爾塔抗原的肽序列
名稱 序列 長度（氨基酸） SEQ ID NO
S-45 GIYQTSNFRVQPTESIVR 18 43
S-46 RVQPTESIVRFPNITNL 17 44
S-47 IVRFPNITNLCPFGEVF 17 45
S-48 TNLCPFGEVFNATRFASV 18 46
S-49 VFNATRFASVYAWNRKRI 18 47
S-50 SVYAWNRKRISNCVADY 17 48
S-51 KRISNCVADYSVLYNSA 17 49
S-52 ADYSVLYNSASFSTFKCY 18 50
S-53 SASFSTFKCYGVSPTKL 17 51
S-54 KCYGVSPTKLNDLCFTNV 18 52
S-55 KLNDLCFTNVYADSFVIR 18 53
S-56 NVYADSFVIRGDEVRQIA 18 54
S-57 IRGDEVRQIAPGQTGKIA 18 55
S-58 IAPGQTGKIADYNYKL 16 56
S-59 GKIADYNYKLPDDFTGCV 18 57
S-60 KLPDDFTGCVIAWNSNNL 18 58
S-61 CVIAWNSNNLDSKVGGNY 18 59
S-62 NLDSKVGGNYNYRYRLFR 18 60
2S-63 NYNYRYRLFRKSNLKPF 17 61
S-64 LFRKSNLKPFERDISTEI 18 62
S-65 PFERDISTEIYQA 13 63
S-66 RDISTEIYQAGSKPCNGV 18 64
S-67 YQAGSKPCNGVEGFNCYF 18 65
S-68 NGVEGFNCYFPLQSYGF 17 66
S-69 CYFPLQSYGFQPTNGVGY 18 67
S-70 GFQPTNGVGYQPYRVVVL 18 68
S-71 GYQPYRVVVLSFELLHA 17 69
S-72 VVLSFELLHAPATVCGPK 18 70
S-73 HAPATVCGPKKSTNLVK 17 71
S-74 GPKKSTNLVKNKCVNFNF 18 72
S-75 VKNKCVNFNFNGLTGTGV      18      73
實施例 7 ： circRNA 疫苗比 mRNA 疫苗擁有更高的抗原編碼效率
據報導，由於其共價封閉的環狀結構，circRNA比mRNA更穩定（Fischer and Leung，2017）。為了測試circRNA疫苗的穩定性是否能賦予更高的抗原編碼效率，生成了1mΨ修飾的mRNA，稱為1mΨ-mRNA，和未修飾的mRNA，兩者都含有與circRNA相同的RBD編碼序列。將純化的circRNA、1mΨ-mRNA和未修飾的mRNA分別轉染到HEK239T細胞。收集細胞上清液，測量12-96小時不同時間點的RBD抗原的豐度。ELISA結果顯示，circRNA不僅能在每個時間點產生更高水準的RBD抗原，而且產生的RBD抗原比1mΨ-mRNA和未修改的mRNA更穩定（圖4A）。RT-qPCR結果表明，circRNA比1mΨ-mRNA和未修飾的mRNA更穩定（圖4B）。同樣，LNP封裝的circRNA也比1mΨ-mRNA和未修飾的mRNA產生更多和更持久的RBD抗原（圖4C）。有趣的是，LNP封裝可將未修飾的mRNA的抗原編碼效率提高到與1mΨ-mRNA相當的水準，但它們都仍然比circRNA低很多（圖4C）。
熱穩定的RNA疫苗對於高效的疫苗分發是非常理想的。發現純化的circRNA即使在室溫（~25℃）下儲存兩周後也能輕易地表達，而不會有可檢測到的損失（圖4D），突出了其顯著的熱穩定性。此外，為了比較LNP-circRNA製劑與LNP-1mΨ-mRNA和LNP-未修飾的-mRNA的熱穩定性，將LNP封裝的circRNA、1mΨ-mRNA或未修飾的-mRNA在轉染前在4℃、室溫（~25℃）或37℃儲存1、3、11、14、21和28天。ELISA結果顯示，在4℃、25℃或37℃時，circRNA的抗原編碼效率遠遠高於其他兩組mRNA。在4℃時，1-28天內幾乎檢測不到由LNP封裝的circRNA產生的RBD抗原減少（圖4E），而由LNP封裝的1mΨ-mRNA或未修飾的-mRNA產生的RBD抗原減少分別從第21天和第28天開始（圖4E）。當儲存溫度升高到25℃或37℃時，LNP封裝的circRNA、1mΨ-mRNA和未修飾的-mRNA的穩定性降低，特別是在37℃時（圖4F-4G）。總之，這些結果表明，隨著保質期的延長和高溫，確實出現了劣化效應，但LNP封裝的circRNA在4℃時表現出高的穩定性（圖4E-4G）。 實施例 8 ： circRNA 疫苗比 mRNA 疫苗激發了更高比例的中和抗體和更強的 Th1 偏向的 T 細胞免疫應答
目前，廣泛接種的mRNA有兩種，mRNA-1273（Moderna）和BNT162b2 （Pfizer/BNT），它們都含有修飾的1mΨ。鑒於circRNA RBD- 德爾塔疫苗具有更高的穩定性和抗原編碼效率，LNP-circRNA疫苗是否比LNP-1mΨ-mRNA RBD-德爾塔疫苗表現出德爾塔更高的免疫原性，目前尚不清楚。首先，比較了circRNA RBD- 德爾塔疫苗和1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔疫苗之間Th1和Th2免疫應答的平衡，因為Th2偏向的免疫應答可能誘導疫苗相關的增強性呼吸道疾病（VAERD）。激發強烈的Th1偏向的免疫應答是SARS-CoV-2疫苗設計的主要安全考慮。因此，比較了circRNA RBD- 德爾塔疫苗或1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔疫苗激發的IgG2a/c和IgG1的終點滴度，這代表Th1和Th2免疫應答。ELISA表明，儘管circRNA RBD- 德爾塔疫苗誘導的總IgG水準與1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔疫苗相當（圖4H），但circRNA RBD- 德爾塔疫苗激發的IgG2a/IgG1、IgG2c/IgG1或(IgG2a + IgG2c)/IgG1的比率遠遠高於1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔疫苗（圖4I-4J），表明circRNA RBD- 德爾塔疫苗傾向於誘導更強烈的Th1偏向的免疫應答，比mRNA疫苗高約~7倍。
病毒特異性抗體對感染的抗體介導增強（ADE）是疫苗的另一個潛在問題，這在一些病毒感染中已有報導，包括寨卡、登革熱病毒和冠狀病毒。以前的研究報導，病毒感染或疫苗接種激發的沒有中和活性的病毒結合抗體可能引起ADE效應，特別是對於具有不同血清型的那些病毒。因此，研究了circRNA RBD- 德爾塔疫苗和1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔疫苗之間中和抗體與結合抗體比例的差異。發現儘管circRNA RBD- 德爾塔與1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔疫苗相比表現出同等的中和能力（圖4K-4M），但 德爾塔在不同劑量（0.5 μg、2.5 μg和5 μg）下，circRNA RBD- 德爾塔疫苗比1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔疫苗可以誘導出更高比例的中和抗體（圖4N），表明在小鼠中circRNA RBD- 德爾塔疫苗激發的病毒結合但非中和抗體的比例低得多。有了這個獨特的特點，circRNA平臺在滿足潛在的ADE效應和病毒變異可能具有重要的優越性。
總之，這些結果表明，與1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔疫苗相比，circRNA RBD- 德爾塔可以激發更高比例的中和抗體和更強的Th1偏向的T細胞免疫應答。 實施例 9 ： circRNA RBD 疫苗在恒河猴中激發有效的中和抗體和 Th1 偏向的免疫應答
為了進一步評估circRNA疫苗在非人靈長類動物中的免疫原性，在第0天和第21天用20 μg、100 μg或500 μg的LNP-circRNA RBD疫苗，或100 μg的LNP-circRNA EV對照（沒有編碼抗原的circRNA空載體），或PBS對照，對2.5-4歲的恒河猴組進行肌肉注射免疫（圖5A）。在加強劑量後兩周使用恒河猴的血漿測量總RBD特異性IgG結合抗體和中和抗體（圖5A）。ELISA結果顯示，LNP-circRNA RBD疫苗的終點IgG滴度達到~5.8×10 4（20 μg或100 μg劑量水準）和~5.5×10 4（500 μg劑量水準），而來自LNP-circRNA EV或PBS免疫的恒河猴的血漿樣本沒有可檢測到的RBD特異性IgG結合抗體（圖5B）。
接下來，用基於VSV的SARS-CoV-2假病毒和真SARS-CoV-2中和試驗檢測來自LNP-circRNA RBD疫苗免疫的恒河猴的血漿的病毒進入抑制能力。假病毒中和試驗顯示，NT50平均值達到~241（20 μg劑量水準）、~1656（100 μg劑量水準）和~1532（500 μg劑量水準）（圖5C）。真SARS-CoV-2中和試驗顯示，NT50平均值分別達到~156（20 μg劑量水準）、~244（100 μg劑量水準）和~152（500μg劑量水準）（圖5D）。假和真SARS-CoV-2中和試驗都表明，100 μg劑量水準可以激發高水準的中和抗體，而更高的劑量水準（500 μg）並沒有進一步提高中和抗體的水準（圖5C-5D）。
考慮到SARS-CoV-2的流通變體，使用來自免疫的恒河猴的血漿樣本進行了交叉中和試驗。假和真SARS-CoV-2中和試驗均顯示，LNP-circRNA RBD疫苗免疫的恒河猴血漿可以有效地抑制相應的原始株，而α和德爾塔變體也可以被抑制，但與原始株相比略有逃逸（圖5D、5E）。β變體也可以被來自LNP-circRNA RBD疫苗免疫的恒河猴的血漿樣本中和，但它部分逃逸（圖5D、5E）。
使用SARS-CoV-2攻擊前一天收集的外周血單核細胞（PBMC）檢測LNP-circRNA RBD、LNP-circRNA EV或PBS在恒河猴體內激發的RBD特異性T細胞應答。ELISpot試驗顯示了在LNP-circRNA RBD疫苗免疫的恒河猴中明顯的IFN-γ和IL-2應答，但幾乎檢測不到IL-4應答（圖5F），表明LNP-circRNA RBD疫苗在恒河猴中激發了Th1偏向的T細胞免疫應答。 實施例 10 ： circRNA RBD 疫苗保護恒河猴免受 SARS-CoV-2 感染
如前所述，加強劑量後5周，用LNP-circRNA RBD疫苗（20 μg、100 μg或500 μg）、LNP-circRNA EV（100μg）或PBS對照免疫的恒河猴，通過鼻內和氣管內途徑受到1×10 6個空斑形成單位的SARS-CoV-2原始株攻擊。在病毒攻擊後的幾天裡，被攻擊的恒河猴在7dpi時被安樂死，收集肺組織並分析病毒負荷和組織病理學分析。使用靶向SARS-CoV-2基因組RNA（N蛋白區）的引物進行的反轉錄定量PCR（RT-qPCR）表明，用100 μg或500 μg的LNP-circRNA RBD疫苗免疫的恒河猴對SARS-CoV-2感染有高度保護，因為與LNP-circRNA EV或PBS對照相比，SARS-CoV-2基因組RNA拷貝減少近1000倍（圖5G）。為了檢測主動複製的SARS-CoV-2的病毒負荷，使用靶向SARS-CoV-2亞基因組RNA（E蛋白區）的引物進行了qPCR。定量PCR顯示，所有20 μg、100 μg和500 μg的LNP-circRNA RBD免疫的恒河猴在肺組織中幾乎沒有可檢測到的病毒亞基因組RNA（圖5G）。
此外，進一步的組織病理學檢查表明，LNP-circRNA RBD（20 μg、100 μg或500 μg）疫苗免疫的恒河猴對SARS-CoV-2感染引起的肺炎有很好的保護，因為在LNP-circRNA RBD免疫組，特別是100 μg或500 μg劑量組觀察到非常輕微的肺炎（圖5H）。相反，在LNP-circRNA EV或PBS對照組的肺部觀察到嚴重的肺炎症狀，如局部肺間隔增厚，肺間隔中度出血，大量散落的塵細胞和大量炎症細胞浸潤（圖5H）。病理評分進一步表明，LNP-circRNA RBD免疫可以顯著保護恒河猴免受SARA-CoV-2感染引起的肺炎（圖5I），這可能是LNP-circRNA RBD疫苗激發的體液免疫應答和T細胞免疫應答之間的協同作用（圖5J）。 實施例 11 ： circRNA 疫苗在恒河猴中沒有引起明顯的臨床疾病症狀
除了circRNA疫苗在恒河猴中的效力外，circRNA疫苗的免疫原性和安全性對於新類型的疫苗平臺也很重要。為了評估circRNA疫苗在恒河猴中的免疫原性和安全性，監測了一些生理和生化指標，其中包括不良反應、表明先天免疫啟動的細胞因數、體重、體溫和血常規檢查。在初免和加強免疫之後，沒有觀察到嚴重的臨床不良反應。ELISA結果顯示，circRNA RBD疫苗誘導了高水準的IL-6和MCP-1（圖6A、6B），而TNF-α、IL-1β和IFN-α幾乎檢測不到（圖6C-6E）。在初免和加強免疫之後，對免疫的恒河猴的體溫連續監測3天，其顯示circRNA RBD、circRNA EV或PBS免疫的恒河猴的體溫都在正常生理指標範圍內（圖6F）。總之，我們的研究為circRNA疫苗平臺在非人靈長類動物中的安全性提供了初步證明。 實施例 12 ： circRNA 疫苗誘導對 SARS-CoV-2 奧密克戎變體的中和抗體降低
目前，SARS-CoV-2 奧密克戎變體正在世界範圍內迅速傳播，並在接種了針對SARS-CoV-2原始株的疫苗的受試者中引起明顯的體液免疫逃逸。因此，必須對我們的疫苗，特別是對奧密克戎變體的β和德爾塔變體進行評估。如上述結果所示，採用I型核酶自催化來產生編碼SARS-CoV-2原始株和2個變體（β和德爾塔）的RBD抗原的circRNA RBD疫苗。為了評估這些疫苗對奧密克戎變體的效率，收集用10 μg LNP-circRNA RBD/RBD-β/RBD- 德爾塔疫苗免疫的小鼠血清樣本，用於通過假病毒中和試驗檢測對奧密克戎變體的中和抗體。發現circRNA RBD/RBD-β/RBD- 德爾塔-疫苗接種的小鼠的血清可以中和SARS-CoV-2 奧密克戎假病毒，但都是強烈逃逸（圖7）。對於通過假病毒中和試驗確定的NT50，circRNA RBD組的血清有~37.0倍的減少，circRNA RBD-β組的血清有~23.8倍的減少（圖7）。而circRNA RBD- 德爾塔血清的中和活性保存得更好（~13.4倍的減少）（圖7）。 實施例 13 ： circRNA RBD- 奧密克戎 疫苗誘導 SARS-CoV-2 奧密克戎變體特異性抗體
將circRNA RBD- 奧密克戎用LNP封裝，以產生LNP-circRNA RBD- 德爾塔疫苗。用5 μg或10 μg的LNP-circRNA RBD- 奧密克戎疫苗對小鼠進行肌內注射免疫2次，每次間隔1周，而空LNP被用作安慰劑對照。加強劑量後4天，收集免疫小鼠的血清樣本以檢測RBD特異性抗體。circRNA RBD- 奧密克戎疫苗可以誘導奧密克戎變體特異性抗體，終點滴度為300（5 μg劑量）和900（10 μg劑量）（圖8A）。此外，還用1劑30 μg的LNP-circRNA RBD- 奧密克戎疫苗對小鼠進行肌內注射免疫（圖8B），而空LNP被用作安慰劑對照。加強劑量後11天，收集免疫小鼠的血清樣本，用於檢測RBD特異性抗體。circRNA RBD- 奧密克戎疫苗可以誘導奧密克戎變體特異性抗體，終點滴度為500（圖8A-8B）。 實施例 14 ： circRNA RBD- 德爾塔 疫苗針對奧密克戎變體激發高水準的中和抗體
最近，SARS-CoV-2 奧密克戎變體迅速傳播，該變體在刺突區域含有30多個突變，並逃逸了大多數先前報導的中和抗體和接受兩劑原始SARS-CoV-2疫苗的接種疫苗者的血清。為了應對奧密克戎緊急情況，首先測試了上述circRNA RBD、circRNA RBD-β和circRNA RBD- 德爾塔疫苗對奧密克戎變體的中和活性。假病毒中和試驗表明，三種circRNA疫苗免疫小鼠的血清可以中和奧密克戎變體，特別是circRNA RBD- 德爾塔疫苗，NT50超過2×10 4（圖12A）。奧密克戎變體逃逸circRNA RBD疫苗免疫的小鼠血清最為嚴重，中和能力下降了37倍，而circRNA RBD- 德爾塔疫苗的中和活性保留得更好，只下降了13.4倍（圖12A），表明正在進行的針對德爾塔變體的SARS-CoV-2疫苗仍可能有效地保護免受奧密克戎變體的感染。
此外，還比較了circRNA RBD- 德爾塔疫苗和1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔疫苗之間對奧密克戎變體的效力。短程（加強免疫後2周）和持久（加強免疫後7周）10 μg circRNA RBD- 德爾塔疫苗都激發了對奧密克戎變體更有效的中和抗體，其NT50值更高，中和活性保留得更好（圖12A-12B）。circRNA RBD- 德爾塔疫苗激發的中和抗體的NT50值在加強免疫後2周達到2×10 4，或在加強免疫後7周達到4×10 3，而1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔疫苗激發的中和抗體的NT50值在加強免疫後2周達到~4×10 3，或在加強免疫後7周達到9×10 2（圖5A-5B）。與上述結果類似（圖12H-12K），發現circRNA RBD- 德爾塔疫苗在加強免疫後2周（短程）和加強免疫後7周（持久）對奧密克戎變體激發的中和抗體比例高於1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔疫苗（圖12C-12D，圖13A-13C），表明由於中和抗體比例高，circRNA疫苗對可變變體具有潛在的優勢。 實施例 15 ： circRNA RBD- 奧密克戎 疫苗激發針對奧密克戎變體的高水準中和抗體
此外，開發了新的circRNA疫苗，稱為circRNA RBD- 奧密克戎疫苗，其編碼SARS-CoV-2 奧密克戎變體的RBD抗原。小鼠用5 μg或10μg的LNP-circRNA RBD- 奧密克戎疫苗進行肌內注射免疫2次，每次間隔2周，而空LNP則作為安慰劑對照。在第2劑後一周，收集免疫小鼠的血清樣本，用於檢測奧密克戎RBD/刺突特異性抗體。circRNA RBD- 奧密克戎疫苗可以誘導奧密克戎刺突特異性抗體，5 μg劑量的終點滴度為~6×10 4，10 μg劑量的終點滴度為~2×10 5（圖12E）。來自circRNA RBD- 奧密克戎疫苗接種的小鼠血清可以以劑量依賴的方式有效地中和SARS-CoV-2 奧密克戎假病毒，5 μg劑量的NT50可以達到~3×10 3，10 μg劑量可以達到~1×10 4（圖12F），而來自circRNA RBD- 奧密克戎疫苗接種的小鼠血清對SARS-CoV-2德爾塔變體和原始SARS-CoV-2毒株表現出垃圾（litter）中和活性（圖12G）。 實施例 16 ： circRNARBD- 德爾塔疫苗的第 3 次加強劑顯著地提高了對奧密克戎變體的中和抗體
此外，為了驗證在之前的兩劑免疫之後，額外的circRNA疫苗的第三劑加強劑是否能激發對奧密克戎變體的有效中和抗體。用2劑circRNA RBD- 德爾塔疫苗免疫的小鼠在第2劑後7周接受了circRNA RBD-β、circRNA RBD- 德爾塔或circRNA RBD- 奧密克戎疫苗的第3次加強劑（圖12H）。在第3次加強免疫後的1周，檢測針對奧密克戎變體假病毒的中和抗體（圖12H）。結果顯示，在2劑circRNA RBD- 德爾塔疫苗免疫後，相同circRNA RBD- 德爾塔疫苗的第3次加強劑顯著地提高了對Delat和奧密克戎變體的中和能力，幾乎是5~10倍（圖12I-12J）。然而，circRNA RBD- 德爾塔或circRNA RBD- 奧密克戎疫苗的第3次加強劑未能提高對奧密克戎變體的中和能力，circRNA RBD- 奧密克戎疫苗的第3次加強劑甚至急劇降低了對奧密克戎變體的能力（圖12I-12J）。
此外，用2劑circRNA RBD疫苗免疫的小鼠在第2劑後8周接受circRNA RBD或circRNA RBD- 德爾塔疫苗的第3次加強劑（圖12K）。在第3次強化後的1周也檢測對奧密克戎變異假病毒的中和抗體（圖12K）。結果顯示，相同circRNA RBD疫苗或circRNA RBD- 德爾塔疫苗的第3次加強劑都極大地加強了中和能力。結果顯示，相同circRNA RBD疫苗或circRNA RBD- 德爾塔疫苗的第3次加強劑都極大地提高了對德爾塔和奧密克戎變體的中和能力，尤其是circRNA RBD- 德爾塔疫苗的第3次加強劑，對奧密克戎變體的NT50值從6×10 2提高到3.8×10 4（圖12L-12M）。
總的來說，上述結果表明，不僅兩劑全新的circRNARBD-奧密克戎疫苗是對新出現的SARS-CoV-2 奧密克戎變體的應對策略，而且兩劑免疫後的circRNA RBD- 德爾塔疫苗的第3次強化劑可能是目前SARS-CoV-2德爾塔和奧密克戎變體流行的有效解決方案。 實施例 17 ： circRNA 疫苗
COVID-19仍然是快速增長的全球健康危機，流通的SAS-CoV-2變體逃逸了當前疫苗激發的抗體 53,65,66。實施例1-13證明瞭使用circRNA生產SARS-CoV-2疫苗的有效性。
幾項研究報導，全長的刺突蛋白（mRNA-1273和BNT162b2） 21,22,27或基於RBD的mRNA疫苗激發中和抗體和細胞免疫應答 23-26,67。正如報導的那樣，大多數有效的中和抗體識別S蛋白的RBD區 62,63,68-71，靶向RBD可能誘導較少數量的非中和抗體 23-26,67。鑒於RBD三聚體與全長刺突蛋白的三聚胞外結構域相似 48，並且與單體對應物 48相比，在結合hACE2方面更有優勢，因此選擇circRNA作為表達RBD三聚體的免疫原。RBD三聚體具有功能性（圖1I），並且確實誘導了針對真SARS-CoV-2病毒的有效和持續的中和抗體（圖2A-2O和圖5A-5J）。
CircRNA RBD-501Y.V2免疫的小鼠產生了高滴度的中和抗體。鑒於RBD中的K417N-E484K-N501Y突變體減少了其與某些中和抗體的相互作用 66,72，證明用circRNA RBD或circRNA RBD-β免疫的小鼠產生的中和抗體對其相應的病毒毒株具有優先的中和能力。最近的研究表明，β變體沒有表現出更高的感染性，但具有免疫逃逸能力 53-58，而且據報導，各種疫苗對SARS-CoV-2變體的效果較差 65,73-77。也有報導稱疫苗突破性地感染了SARS-CoV-2變體 78。因此，開發和實施針對新出現的變體的疫苗迫在眉睫，而cricRNA疫苗就是這樣的平臺，可以針對特定的變體快速定制。例如，可以通過circRNA平臺快速開發包含RBD中E484K、N501Y和L452R突變的疫苗，以應對由SARS-CoV-2變體引起的潛在爆發。
本公開中強調了這種用於設計免疫原的可通用策略。環形RNA的編碼序列可以迅速地適應於處理任何新出現的值得關注的SARS-CoV-2變體，包括α、β、γ、德爾塔（Oelta）和奧密克戎 66,85,86。此外，環狀RNA可以在體外快速大量生成，而且它們不需要任何核苷酸修飾，著與經典的mRNA疫苗顯著不同。由於環狀RNA具有共價封閉的環狀結構，因此它具有固有的穩定性 61。我們的資料表明，circRNA RBD和封裝的circRNA RBD-LNP複合物在4℃下高度熱穩定約4周（圖4E）。 實施例 18. 裸 circRNALuc 在小鼠中的螢光素酶表達
採用I型核酶自催化策略來產生編碼螢火蟲螢光素酶（Luc）的circRNA Luc。然後將circRNA Luc稀釋在PBS中。小鼠肌肉注射PBS或20 μg的裸circRNA Luc，而未處理組作為模擬對照。注射後24小時，小鼠腹腔注射螢光素並轉移到IVIS成像系統。裸circRNA Luc在注射部位顯示出局部表達螢火蟲螢光素酶（圖14A-14C）。 實施例 19. 包含裸 circRNA 的 circRNA 疫苗在小鼠中激發 SARS-CoV-2 RBD 特異性抗體
首先，採用I型核酶自催化策略來產生circRNA RBD-β疫苗，該疫苗包含編碼β變體的RBD抗原的裸circRNA RBD-Beβ，沒有LNP封裝。然後將circRNA RBD-β在PBS中稀釋。小鼠用2劑的100 μg circRNA RBD-β疫苗進行肌內注射免疫2次，每次間隔2周，並在加強免疫後的3周用第3劑的250 μg circRNA RBD-β疫苗進行免疫，而PBS則作為安慰劑對照。第3次加強免疫後2周，收集免疫小鼠的血清樣本以檢測RBD特異性抗體（圖15A）。CircRNA RBD-β疫苗可以誘導小鼠中的RBD-特異性IgG結合抗體（圖15B）。
考慮到RBD-德爾塔具有更多的免疫原性，且LNP封裝的circRNA RBD- 德爾塔疫苗比LNP封裝的circRNA RBD-β疫苗能在小鼠中誘導更高的IgG滴度。採用I型核酶自催化策略以產生circRNA RBD- 德爾塔疫苗，該疫苗包含編碼德爾塔變體的RBD抗原的裸circRNA RBD- 德爾塔，沒有LNP封裝。然後將circRNA RBD- 德爾塔在PBS中稀釋。用10或50 μg的circRNA RBD- 德爾塔疫苗對小鼠進行肌內注射免疫2次，每次間隔4周，而PBS則作為安慰劑對照。加強免疫後25天，收集免疫小鼠的血清樣本用於檢測RBD-德爾塔特異性抗體（圖16A）。CircRNA RBD- 德爾塔疫苗可以誘導小鼠中的RBD-德爾塔特異性IgG結合抗體，而50 μg組比10 μg組產生的IgG水準更高（圖16B）。 實施例 20. 裸 circRNA 疫苗在小鼠中激發比 mRNA 疫苗更高的抗體
採用I型核酶自催化策略來產生編碼德爾塔變體的RBD抗原的裸circRNA RBD- 德爾塔疫苗，沒有LNP封裝。對於裸mRNA RBD- 德爾塔疫苗，使用或不使用1mΨ修飾的UTP生成修飾或未修飾的mRNA。然後將RNA疫苗在PBS中稀釋。小鼠用50 μg的裸RNA疫苗免疫2次，每次間隔3周。加強免疫後7天，收集免疫小鼠的血清樣本用於檢測RBD-德爾塔特異性抗體，包括總IgG、IgG1、IgG2a和IgG2c（圖17A）。裸circRNA RBD- 德爾塔疫苗可以在小鼠中誘導強效的抗體，而裸的修飾或未修飾的mRNA RBD- 德爾塔疫苗則不能（圖17B）。此外，鑒於林格氏溶液以前曾用於裸mRNA疫苗，比較了PBS和林格氏溶液作為裸circRNA的緩衝液的差異。使用林格氏溶液，circRNA疫苗可以誘導更高的IgG2a和IgG2c，這表明抗體的品質更高（圖17C）。 實施例 21. 編碼奧密克戎 BA.1 RBD 抗原的 circRNA 疫苗的優化
以前採用I型核酶自催化策略，生成編碼奧密克戎變體的RBD抗原的circRNA RBD- 奧密克戎疫苗。它對原生或德爾塔變體顯示的效力低，但對新出現的奧密克戎及其亞譜系變體仍有一定的可能性。在這裡，合理地引入了一些突變，並修飾了RBD抗原的長度，試圖改善奧密克戎 BA.1疫苗的性能。此外，還測試了三聚化結構域折疊子的好處。所有的抗原都是由I型內含子自催化策略產生的circRNA表達的。
小鼠用5 μg的LNP-circRNA疫苗免疫兩次，每次間隔2周。加強免疫後7天，收集免疫小鼠的血清樣本，用於通過假病毒中和試驗檢測對多種SARS-CoV-2變體的中和抗體。對於原始的奧密克戎 BA.1疫苗，它對奧密克戎和一些奧密克戎亞譜系顯示的效力低（圖18A）。優化後，所有的新疫苗顯示出較好的性能，但不能有效地保護BA.4/5變體（圖18B-F）。
每種疫苗的詳細抗原資訊顯示如下： RBD-BA.1：RBD (319-541)-奧密克戎 BA.1 RBD-BA.1-mut1：RBD (319-541)-奧密克戎 BA.1 + S375A。 RBD-BA.1-mut2：RBD (319-537)-奧密克戎 BA.1 + S375A. RBD-BA.1-mut3：RBD (319-537)-奧密克戎 BA.1 + S375A + L452R 實施例 22. CircRNA RBD-BA.4/5 疫苗誘導針對奧密克戎及其亞譜系的一些變體的強效中和抗體
採用I型核酶自催化策略來生成編碼奧密克戎 BA.4/5的RBD抗原的circRNA RBD-BA.4/5疫苗。小鼠用5 μg或10 μg的LNP-circRNA疫苗免疫2次，每次間隔3周。加強免疫後7天，收集免疫小鼠的血清樣本，用於通過假病毒中和試驗檢測對多種SARS-CoV-2變體的中和抗體。來自疫苗接種的小鼠的血清以劑量依賴的方式有效地中和了假病毒，並對BA.4/5變體顯示出優先的中和活性（圖19A-B）。 實施例 23. CircRNA RBD- 三聚體 疫苗誘導針對奧密克戎及其亞譜系的一些變體的強效中和抗體
為了產生廣譜的SARS-CoV-2疫苗，採用了串聯表達不同變體的多個結構域的策略。為了證明這一概念，產生了兩種三聚體疫苗，其編碼三種變體的三個結構域。採用I型核酶自催化策略，生成circRNA RBD- 三聚體疫苗。小鼠用5 μg或10 μg的LNP-circRNA疫苗免疫2次，每次間隔2周。加強免疫後7天，收集免疫小鼠的血清樣本，用於通過假病毒中和試驗檢測對多種SARS-CoV-2變體的中和抗體。來自疫苗接種的小鼠的血清有效地中和了假病毒，並顯示出一些廣譜的中和活性（圖20A-D）。
每種疫苗的詳細抗原資訊顯示如下： 三聚體1：RBD 德爾塔-RBD BA.1-RBD BA.4/5三聚體2：NTD BA.4/5-RBD BA.4/5-RBD 德爾塔
提供上述實例是為了讓本領域的普通技術人員完整地公開和描述如何製造和使用本申請的circRNA、疫苗、組合物和方法的實施方案，而不是為了限制本發明人認為是其發明的範圍。對於本領域技術人員來說顯而易見的用於實施本申請的上述模式的修改旨在以下權利要求的範圍內。說明書中提到的所有專利和出版物都表明了本申請所涉及的技工的技術水準。
在不脫離本申請的精神和範圍的情況下，可以對其進行許多修改和變化，這對本領域的技術人員來說是顯而易見的。本文所述的具體實施方案和實例僅以實例方式提供。
所有的標題和章節名稱都是為了明確和參考目的而使用的，而不被認為是以任何方式限制。例如，本領域的技術人員將理解根據本文所述的本申請的精神和範圍適當結合來自不同標題和章節的各個方面的有用性。
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示例性序列 SEQ ID NO: 1  SARS-CoV-2 的全長 S 蛋白序列MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT SEQ ID NO: 2 S 蛋白的 RBD 氨基酸殘基 319 至 542RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF SEQ ID NO: 3 T4 纖維蛋白結構域的 C 末端折疊子結構域GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGRS SEQ ID NO: 4 基於 GCN4 的亮氨酸拉鍊結構域RMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGER SEQ ID NO: 5 示例性的肽接頭GGGGSGGGGS SEQ ID NO: 6 SARS-CoV-2 S 蛋白的野生型 S2 區SVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT SEQ ID NO: 7 SARS-CoV-2 S 蛋白的 K986P/V987P S2 區序列SVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT SEQ ID NO: 8 SARS-CoV-2 的 S 蛋白的野生型氨基酸殘基 2 至 1273 序列FVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT SEQ ID NO: 9 SARS-CoV-2 的 S 蛋白的氨基酸殘基 2 至 1273 序列 , Δ681-684FVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSRSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT SEQ ID NO: 10 SARS-CoV-2 的 S 蛋白的氨基酸殘基 2 至 1273 序列， K986P V987P Δ681-684 序列FVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSRSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT SEQ ID NO: 11 野生型 S2 區序列的核酸序列AGTGTGGCTTCTCAAAGCATTATAGCATACACTATGTCTCTTGGTGCCGAAAATTCCGTGGCCTATTCTAACAATTCAATCGCCATCCCAACCAACTTCACAATTAGCGTGACTACCGAAATACTGCCTGTGAGCATGACGAAAACCAGCGTAGACTGCACTATGTATATCTGTGGAGACTCCACTGAGTGCTCCAACCTTCTCCTGCAGTACGGTAGCTTCTGTACCCAATTGAACCGCGCCCTTACAGGCATCGCTGTTGAGCAAGATAAGAATACCCAGGAAGTTTTTGCCCAGGTTAAGCAGATATACAAAACACCGCCCATTAAGGACTTCGGAGGCTTCAACTTCTCTCAGATACTGCCTGACCCCTCCAAGCCATCAAAACGCAGCTTCATTGAGGACCTCTTGTTCAACAAAGTGACTCTGGCTGATGCTGGCTTCATTAAGCAGTACGGAGATTGCCTGGGAGATATTGCTGCCAGGGACCTCATCTGCGCCCAGAAGTTTAATGGCCTGACAGTCTTGCCCCCACTTCTGACAGACGAGATGATTGCTCAGTACACATCTGCCCTCCTCGCTGGCACCATAACATCCGGATGGACATTTGGTGCTGGTGCTGCCCTCCAGATTCCCTTCGCAATGCAGATGGCGTATCGCTTTAACGGCATCGGTGTCACACAAAACGTGTTGTATGAGAACCAAAAGCTCATCGCTAACCAGTTTAATTCTGCTATTGGTAAGATTCAGGACAGCCTGTCATCAACCGCGTCTGCCCTTGGTAAGTTGCAGGACGTGGTGAACCAGAATGCTCAGGCTTTGAATACTCTGGTGAAGCAACTCTCTTCAAATTTCGGCGCTATCTCTTCTGTGTTGAACGACATCCTGAGTCGCCTTGATAAGGTGGAAGCTGAAGTTCAAATTGATAGATTGATTACTGGCAGGCTCCAGTCTTTGCAGACCTACGTTACACAGCAGCTGATTAGGGCGGCTGAAATTAGAGCTTCCGCCAATCTGGCTGCAACCAAGATGTCCGAATGCGTCCTGGGTCAGTCAAAGCGCGTTGACTTTTGTGGTAAAGGCTACCACCTCATGTCATTTCCCCAGTCAGCACCTCACGGAGTAGTGTTCCTCCACGTCACCTACGTTCCAGCACAGGAAAAGAATTTTACCACTGCGCCGGCAATCTGTCACGACGGTAAGGCACACTTCCCCCGCGAGGGCGTATTCGTGTCTAACGGAACTCATTGGTTCGTCACACAGAGAAACTTCTATGAGCCTCAGATCATTACCACCGACAATACATTTGTGTCCGGTAACTGCGACGTTGTGATTGGAATCGTCAACAACACTGTGTACGATCCACTTCAGCCAGAACTGGATAGCTTCAAGGAAGAATTGGACAAATATTTCAAAAATCACACTTCACCCGATGTGGACCTGGGTGACATTAGTGGTATCAATGCGTCCGTGGTCAATATTCAAAAAGAGATTGACAGGCTCAACGAAGTGGCCAAGAACCTGAACGAAAGTCTTATCGATCTGCAAGAATTGGGAAAGTATGAGCAGTACATCAAGTGGCCGTGGTACATTTGGTTGGGTTTTATCGCCGGTCTGATCGCCATCGTTATGGTTACCATTATGCTTTGCTGCATGACGAGCTGTTGCTCCTGTCTGAAGGGATGCTGCTCTTGCGGATCATGTTGCAAGTTCGATGAAGACGATAGCGAACCAGTTCTGAAGGGCGTCAAGCTGCATTACACA SEQ ID NO: 12 K986P/V987P S2 區序列的核酸序列AGTGTGGCTTCTCAAAGCATTATAGCATACACTATGTCTCTTGGTGCCGAAAATTCCGTGGCCTATTCTAACAATTCAATCGCCATCCCAACCAACTTCACAATTAGCGTGACTACCGAAATACTGCCTGTGAGCATGACGAAAACCAGCGTAGACTGCACTATGTATATCTGTGGAGACTCCACTGAGTGCTCCAACCTTCTCCTGCAGTACGGTAGCTTCTGTACCCAATTGAACCGCGCCCTTACAGGCATCGCTGTTGAGCAAGATAAGAATACCCAGGAAGTTTTTGCCCAGGTTAAGCAGATATACAAAACACCGCCCATTAAGGACTTCGGAGGCTTCAACTTCTCTCAGATACTGCCTGACCCCTCCAAGCCATCAAAACGCAGCTTCATTGAGGACCTCTTGTTCAACAAAGTGACTCTGGCTGATGCTGGCTTCATTAAGCAGTACGGAGATTGCCTGGGAGATATTGCTGCCAGGGACCTCATCTGCGCCCAGAAGTTTAATGGCCTGACAGTCTTGCCCCCACTTCTGACAGACGAGATGATTGCTCAGTACACATCTGCCCTCCTCGCTGGCACCATAACATCCGGATGGACATTTGGTGCTGGTGCTGCCCTCCAGATTCCCTTCGCAATGCAGATGGCGTATCGCTTTAACGGCATCGGTGTCACACAAAACGTGTTGTATGAGAACCAAAAGCTCATCGCTAACCAGTTTAATTCTGCTATTGGTAAGATTCAGGACAGCCTGTCATCAACCGCGTCTGCCCTTGGTAAGTTGCAGGACGTGGTGAACCAGAATGCTCAGGCTTTGAATACTCTGGTGAAGCAACTCTCTTCAAATTTCGGCGCTATCTCTTCTGTGTTGAACGACATCCTGAGTCGCCTTGATcctccaGAAGCTGAAGTTCAAATTGATAGATTGATTACTGGCAGGCTCCAGTCTTTGCAGACCTACGTTACACAGCAGCTGATTAGGGCGGCTGAAATTAGAGCTTCCGCCAATCTGGCTGCAACCAAGATGTCCGAATGCGTCCTGGGTCAGTCAAAGCGCGTTGACTTTTGTGGTAAAGGCTACCACCTCATGTCATTTCCCCAGTCAGCACCTCACGGAGTAGTGTTCCTCCACGTCACCTACGTTCCAGCACAGGAAAAGAATTTTACCACTGCGCCGGCAATCTGTCACGACGGTAAGGCACACTTCCCCCGCGAGGGCGTATTCGTGTCTAACGGAACTCATTGGTTCGTCACACAGAGAAACTTCTATGAGCCTCAGATCATTACCACCGACAATACATTTGTGTCCGGTAACTGCGACGTTGTGATTGGAATCGTCAACAACACTGTGTACGATCCACTTCAGCCAGAACTGGATAGCTTCAAGGAAGAATTGGACAAATATTTCAAAAATCACACTTCACCCGATGTGGACCTGGGTGACATTAGTGGTATCAATGCGTCCGTGGTCAATATTCAAAAAGAGATTGACAGGCTCAACGAAGTGGCCAAGAACCTGAACGAAAGTCTTATCGATCTGCAAGAATTGGGAAAGTATGAGCAGTACATCAAGTGGCCGTGGTACATTTGGTTGGGTTTTATCGCCGGTCTGATCGCCATCGTTATGGTTACCATTATGCTTTGCTGCATGACGAGCTGTTGCTCCTGTCTGAAGGGATGCTGCTCTTGCGGATCATGTTGCAAGTTCGATGAAGACGATAGCGAACCAGTTCTGAAGGGCGTCAAGCTGCATTACACA SEQ ID NO: 13 刺突的野生型 2 至 1273 序列的核酸序列TTCGTTTTCCTTGTTCTGTTGCCTCTCGTTAGTAGCCAATGCGTCAACCTTACTACTAGAACCCAGCTCCCTCCAGCATATACCAACTCTTTCACCAGGGGCGTATATTACCCGGACAAAGTGTTCCGCTCAAGTGTGCTGCATTCTACGCAGGACCTTTTCTTGCCCTTTTTCAGTAATGTTACTTGGTTTCATGCTATCCATGTGTCTGGAACTAACGGAACCAAGCGCTTTGACAACCCCGTCCTCCCTTTCAACGATGGCGTGTACTTCGCTTCCACGGAAAAGTCAAACATAATTCGCGGCTGGATCTTTGGTACAACACTCGACTCAAAGACGCAGAGCCTGCTGATCGTTAATAACGCTACAAATGTTGTGATAAAGGTGTGTGAATTTCAGTTCTGCAATGATCCCTTCCTGGGTGTGTACTACCATAAGAATAACAAGAGCTGGATGGAATCCGAATTTAGGGTTTACAGTTCCGCTAACAACTGCACATTCGAATACGTAAGCCAGCCATTTCTTATGGATCTTGAGGGCAAGCAAGGAAACTTCAAGAACTTGAGGGAGTTCGTGTTCAAAAATATCGACGGCTATTTTAAGATATATAGCAAGCACACTCCAATAAACTTGGTGCGCGACCTGCCCCAGGGATTCTCTGCTCTGGAGCCCCTGGTGGATCTGCCCATTGGAATAAACATAACTCGCTTTCAAACACTGCTCGCCCTGCATCGCAGTTACCTCACCCCTGGTGATAGTAGTTCAGGATGGACAGCAGGAGCCGCCGCATACTACGTCGGCTACCTGCAGCCTAGGACCTTCTTGCTGAAGTACAACGAGAACGGTACAATAACTGACGCTGTGGACTGCGCTCTGGACCCTCTGTCCGAGACGAAGTGCACCCTGAAGAGCTTTACTGTTGAAAAAGGCATTTACCAAACCAGCAACTTCCGCGTCCAGCCAACCGAGAGCATCGTCAGATTTCCCAACATTACAAATCTGTGTCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACACGCTTCGCTTCAGTGTACGCATGGAACCGCAAGCGCATATCTAACTGCGTCGCGGATTATTCTGTCCTCTACAACTCCGCCTCTTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGAGTGTCACCGACTAAGCTGAACGATCTCTGCTTTACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTGATAAGAGGTGATGAAGTGAGACAAATAGCCCCAGGTCAGACTGGTAAGATCGCAGATTACAACTACAAATTGCCTGATGATTTCACTGGTTGCGTTATCGCGTGGAACTCTAATAACCTCGATTCTAAGGTCGGTGGTAACTACAATTACCTGTACCGCTTGTTTAGGAAGTCAAACCTGAAGCCTTTCGAGAGGGATATTTCAACCGAAATCTATCAAGCGGGTTCAACACCGTGTAACGGTGTGGAAGGATTTAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCTTACGGATTCCAGCCAACCAATGGCGTGGGTTACCAACCTTATCGCGTGGTGGTTCTGAGTTTCGAACTGTTGCACGCTCCCGCCACGGTATGCGGTCCCAAGAAGAGCACTAACTTGGTGAAGAATAAGTGCGTGAATTTCAATTTCAATGGCCTCACTGGAACTGGAGTGCTGACCGAATCCAATAAGAAGTTCTTGCCCTTCCAGCAGTTCGGAAGAGACATTGCTGACACAACCGACGCGGTGCGCGATCCTCAGACTCTGGAGATATTGGACATTACACCATGTTCTTTCGGCGGTGTGTCTGTCATTACTCCGGGCACGAATACTAGCAACCAGGTAGCCGTGCTGTACCAAGACGTGAATTGCACAGAGGTTCCCGTCGCAATTCACGCTGACCAGCTGACCCCCACGTGGAGGGTTTACAGCACTGGTAGTAACGTCTTCCAGACGAGAGCCGGTTGCTTGATCGGAGCGGAACATGTGAATAACTCCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGAGCCGGTATATGCGCCTCTTATCAGACACAAACTAACTCACCCAGGAGAGCCCGCAGTGTGGCTTCTCAAAGCATTATAGCATACACTATGTCTCTTGGTGCCGAAAATTCCGTGGCCTATTCTAACAATTCAATCGCCATCCCAACCAACTTCACAATTAGCGTGACTACCGAAATACTGCCTGTGAGCATGACGAAAACCAGCGTAGACTGCACTATGTATATCTGTGGAGACTCCACTGAGTGCTCCAACCTTCTCCTGCAGTACGGTAGCTTCTGTACCCAATTGAACCGCGCCCTTACAGGCATCGCTGTTGAGCAAGATAAGAATACCCAGGAAGTTTTTGCCCAGGTTAAGCAGATATACAAAACACCGCCCATTAAGGACTTCGGAGGCTTCAACTTCTCTCAGATACTGCCTGACCCCTCCAAGCCATCAAAACGCAGCTTCATTGAGGACCTCTTGTTCAACAAAGTGACTCTGGCTGATGCTGGCTTCATTAAGCAGTACGGAGATTGCCTGGGAGATATTGCTGCCAGGGACCTCATCTGCGCCCAGAAGTTTAATGGCCTGACAGTCTTGCCCCCACTTCTGACAGACGAGATGATTGCTCAGTACACATCTGCCCTCCTCGCTGGCACCATAACATCCGGATGGACATTTGGTGCTGGTGCTGCCCTCCAGATTCCCTTCGCAATGCAGATGGCGTATCGCTTTAACGGCATCGGTGTCACACAAAACGTGTTGTATGAGAACCAAAAGCTCATCGCTAACCAGTTTAATTCTGCTATTGGTAAGATTCAGGACAGCCTGTCATCAACCGCGTCTGCCCTTGGTAAGTTGCAGGACGTGGTGAACCAGAATGCTCAGGCTTTGAATACTCTGGTGAAGCAACTCTCTTCAAATTTCGGCGCTATCTCTTCTGTGTTGAACGACATCCTGAGTCGCCTTGATAAGGTGGAAGCTGAAGTTCAAATTGATAGATTGATTACTGGCAGGCTCCAGTCTTTGCAGACCTACGTTACACAGCAGCTGATTAGGGCGGCTGAAATTAGAGCTTCCGCCAATCTGGCTGCAACCAAGATGTCCGAATGCGTCCTGGGTCAGTCAAAGCGCGTTGACTTTTGTGGTAAAGGCTACCACCTCATGTCATTTCCCCAGTCAGCACCTCACGGAGTAGTGTTCCTCCACGTCACCTACGTTCCAGCACAGGAAAAGAATTTTACCACTGCGCCGGCAATCTGTCACGACGGTAAGGCACACTTCCCCCGCGAGGGCGTATTCGTGTCTAACGGAACTCATTGGTTCGTCACACAGAGAAACTTCTATGAGCCTCAGATCATTACCACCGACAATACATTTGTGTCCGGTAACTGCGACGTTGTGATTGGAATCGTCAACAACACTGTGTACGATCCACTTCAGCCAGAACTGGATAGCTTCAAGGAAGAATTGGACAAATATTTCAAAAATCACACTTCACCCGATGTGGACCTGGGTGACATTAGTGGTATCAATGCGTCCGTGGTCAATATTCAAAAAGAGATTGACAGGCTCAACGAAGTGGCCAAGAACCTGAACGAAAGTCTTATCGATCTGCAAGAATTGGGAAAGTATGAGCAGTACATCAAGTGGCCGTGGTACATTTGGTTGGGTTTTATCGCCGGTCTGATCGCCATCGTTATGGTTACCATTATGCTTTGCTGCATGACGAGCTGTTGCTCCTGTCTGAAGGGATGCTGCTCTTGCGGATCATGTTGCAAGTTCGATGAAGACGATAGCGAACCAGTTCTGAAGGGCGTCAAGCTGCATTACACA SEQ ID NO: 14 刺突的 Δ681-684 序列的核酸序列TTCGTTTTCCTTGTTCTGTTGCCTCTCGTTAGTAGCCAATGCGTCAACCTTACTACTAGAACCCAGCTCCCTCCAGCATATACCAACTCTTTCACCAGGGGCGTATATTACCCGGACAAAGTGTTCCGCTCAAGTGTGCTGCATTCTACGCAGGACCTTTTCTTGCCCTTTTTCAGTAATGTTACTTGGTTTCATGCTATCCATGTGTCTGGAACTAACGGAACCAAGCGCTTTGACAACCCCGTCCTCCCTTTCAACGATGGCGTGTACTTCGCTTCCACGGAAAAGTCAAACATAATTCGCGGCTGGATCTTTGGTACAACACTCGACTCAAAGACGCAGAGCCTGCTGATCGTTAATAACGCTACAAATGTTGTGATAAAGGTGTGTGAATTTCAGTTCTGCAATGATCCCTTCCTGGGTGTGTACTACCATAAGAATAACAAGAGCTGGATGGAATCCGAATTTAGGGTTTACAGTTCCGCTAACAACTGCACATTCGAATACGTAAGCCAGCCATTTCTTATGGATCTTGAGGGCAAGCAAGGAAACTTCAAGAACTTGAGGGAGTTCGTGTTCAAAAATATCGACGGCTATTTTAAGATATATAGCAAGCACACTCCAATAAACTTGGTGCGCGACCTGCCCCAGGGATTCTCTGCTCTGGAGCCCCTGGTGGATCTGCCCATTGGAATAAACATAACTCGCTTTCAAACACTGCTCGCCCTGCATCGCAGTTACCTCACCCCTGGTGATAGTAGTTCAGGATGGACAGCAGGAGCCGCCGCATACTACGTCGGCTACCTGCAGCCTAGGACCTTCTTGCTGAAGTACAACGAGAACGGTACAATAACTGACGCTGTGGACTGCGCTCTGGACCCTCTGTCCGAGACGAAGTGCACCCTGAAGAGCTTTACTGTTGAAAAAGGCATTTACCAAACCAGCAACTTCCGCGTCCAGCCAACCGAGAGCATCGTCAGATTTCCCAACATTACAAATCTGTGTCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACACGCTTCGCTTCAGTGTACGCATGGAACCGCAAGCGCATATCTAACTGCGTCGCGGATTATTCTGTCCTCTACAACTCCGCCTCTTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGAGTGTCACCGACTAAGCTGAACGATCTCTGCTTTACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTGATAAGAGGTGATGAAGTGAGACAAATAGCCCCAGGTCAGACTGGTAAGATCGCAGATTACAACTACAAATTGCCTGATGATTTCACTGGTTGCGTTATCGCGTGGAACTCTAATAACCTCGATTCTAAGGTCGGTGGTAACTACAATTACCTGTACCGCTTGTTTAGGAAGTCAAACCTGAAGCCTTTCGAGAGGGATATTTCAACCGAAATCTATCAAGCGGGTTCAACACCGTGTAACGGTGTGGAAGGATTTAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCTTACGGATTCCAGCCAACCAATGGCGTGGGTTACCAACCTTATCGCGTGGTGGTTCTGAGTTTCGAACTGTTGCACGCTCCCGCCACGGTATGCGGTCCCAAGAAGAGCACTAACTTGGTGAAGAATAAGTGCGTGAATTTCAATTTCAATGGCCTCACTGGAACTGGAGTGCTGACCGAATCCAATAAGAAGTTCTTGCCCTTCCAGCAGTTCGGAAGAGACATTGCTGACACAACCGACGCGGTGCGCGATCCTCAGACTCTGGAGATATTGGACATTACACCATGTTCTTTCGGCGGTGTGTCTGTCATTACTCCGGGCACGAATACTAGCAACCAGGTAGCCGTGCTGTACCAAGACGTGAATTGCACAGAGGTTCCCGTCGCAATTCACGCTGACCAGCTGACCCCCACGTGGAGGGTTTACAGCACTGGTAGTAACGTCTTCCAGACGAGAGCCGGTTGCTTGATCGGAGCGGAACATGTGAATAACTCCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGAGCCGGTATATGCGCCTCTTATCAGACACAAACTAACTCACGCAGTGTGGCTTCTCAAAGCATTATAGCATACACTATGTCTCTTGGTGCCGAAAATTCCGTGGCCTATTCTAACAATTCAATCGCCATCCCAACCAACTTCACAATTAGCGTGACTACCGAAATACTGCCTGTGAGCATGACGAAAACCAGCGTAGACTGCACTATGTATATCTGTGGAGACTCCACTGAGTGCTCCAACCTTCTCCTGCAGTACGGTAGCTTCTGTACCCAATTGAACCGCGCCCTTACAGGCATCGCTGTTGAGCAAGATAAGAATACCCAGGAAGTTTTTGCCCAGGTTAAGCAGATATACAAAACACCGCCCATTAAGGACTTCGGAGGCTTCAACTTCTCTCAGATACTGCCTGACCCCTCCAAGCCATCAAAACGCAGCTTCATTGAGGACCTCTTGTTCAACAAAGTGACTCTGGCTGATGCTGGCTTCATTAAGCAGTACGGAGATTGCCTGGGAGATATTGCTGCCAGGGACCTCATCTGCGCCCAGAAGTTTAATGGCCTGACAGTCTTGCCCCCACTTCTGACAGACGAGATGATTGCTCAGTACACATCTGCCCTCCTCGCTGGCACCATAACATCCGGATGGACATTTGGTGCTGGTGCTGCCCTCCAGATTCCCTTCGCAATGCAGATGGCGTATCGCTTTAACGGCATCGGTGTCACACAAAACGTGTTGTATGAGAACCAAAAGCTCATCGCTAACCAGTTTAATTCTGCTATTGGTAAGATTCAGGACAGCCTGTCATCAACCGCGTCTGCCCTTGGTAAGTTGCAGGACGTGGTGAACCAGAATGCTCAGGCTTTGAATACTCTGGTGAAGCAACTCTCTTCAAATTTCGGCGCTATCTCTTCTGTGTTGAACGACATCCTGAGTCGCCTTGATAAGGTGGAAGCTGAAGTTCAAATTGATAGATTGATTACTGGCAGGCTCCAGTCTTTGCAGACCTACGTTACACAGCAGCTGATTAGGGCGGCTGAAATTAGAGCTTCCGCCAATCTGGCTGCAACCAAGATGTCCGAATGCGTCCTGGGTCAGTCAAAGCGCGTTGACTTTTGTGGTAAAGGCTACCACCTCATGTCATTTCCCCAGTCAGCACCTCACGGAGTAGTGTTCCTCCACGTCACCTACGTTCCAGCACAGGAAAAGAATTTTACCACTGCGCCGGCAATCTGTCACGACGGTAAGGCACACTTCCCCCGCGAGGGCGTATTCGTGTCTAACGGAACTCATTGGTTCGTCACACAGAGAAACTTCTATGAGCCTCAGATCATTACCACCGACAATACATTTGTGTCCGGTAACTGCGACGTTGTGATTGGAATCGTCAACAACACTGTGTACGATCCACTTCAGCCAGAACTGGATAGCTTCAAGGAAGAATTGGACAAATATTTCAAAAATCACACTTCACCCGATGTGGACCTGGGTGACATTAGTGGTATCAATGCGTCCGTGGTCAATATTCAAAAAGAGATTGACAGGCTCAACGAAGTGGCCAAGAACCTGAACGAAAGTCTTATCGATCTGCAAGAATTGGGAAAGTATGAGCAGTACATCAAGTGGCCGTGGTACATTTGGTTGGGTTTTATCGCCGGTCTGATCGCCATCGTTATGGTTACCATTATGCTTTGCTGCATGACGAGCTGTTGCTCCTGTCTGAAGGGATGCTGCTCTTGCGGATCATGTTGCAAGTTCGATGAAGACGATAGCGAACCAGTTCTGAAGGGCGTCAAGCTGCATTACACA SEQ ID NO: 15 刺突的 K986P/V987P Δ681-684 序列的核酸序列TTCGTTTTCCTTGTTCTGTTGCCTCTCGTTAGTAGCCAATGCGTCAACCTTACTACTAGAACCCAGCTCCCTCCAGCATATACCAACTCTTTCACCAGGGGCGTATATTACCCGGACAAAGTGTTCCGCTCAAGTGTGCTGCATTCTACGCAGGACCTTTTCTTGCCCTTTTTCAGTAATGTTACTTGGTTTCATGCTATCCATGTGTCTGGAACTAACGGAACCAAGCGCTTTGACAACCCCGTCCTCCCTTTCAACGATGGCGTGTACTTCGCTTCCACGGAAAAGTCAAACATAATTCGCGGCTGGATCTTTGGTACAACACTCGACTCAAAGACGCAGAGCCTGCTGATCGTTAATAACGCTACAAATGTTGTGATAAAGGTGTGTGAATTTCAGTTCTGCAATGATCCCTTCCTGGGTGTGTACTACCATAAGAATAACAAGAGCTGGATGGAATCCGAATTTAGGGTTTACAGTTCCGCTAACAACTGCACATTCGAATACGTAAGCCAGCCATTTCTTATGGATCTTGAGGGCAAGCAAGGAAACTTCAAGAACTTGAGGGAGTTCGTGTTCAAAAATATCGACGGCTATTTTAAGATATATAGCAAGCACACTCCAATAAACTTGGTGCGCGACCTGCCCCAGGGATTCTCTGCTCTGGAGCCCCTGGTGGATCTGCCCATTGGAATAAACATAACTCGCTTTCAAACACTGCTCGCCCTGCATCGCAGTTACCTCACCCCTGGTGATAGTAGTTCAGGATGGACAGCAGGAGCCGCCGCATACTACGTCGGCTACCTGCAGCCTAGGACCTTCTTGCTGAAGTACAACGAGAACGGTACAATAACTGACGCTGTGGACTGCGCTCTGGACCCTCTGTCCGAGACGAAGTGCACCCTGAAGAGCTTTACTGTTGAAAAAGGCATTTACCAAACCAGCAACTTCCGCGTCCAGCCAACCGAGAGCATCGTCAGATTTCCCAACATTACAAATCTGTGTCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACACGCTTCGCTTCAGTGTACGCATGGAACCGCAAGCGCATATCTAACTGCGTCGCGGATTATTCTGTCCTCTACAACTCCGCCTCTTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGAGTGTCACCGACTAAGCTGAACGATCTCTGCTTTACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTGATAAGAGGTGATGAAGTGAGACAAATAGCCCCAGGTCAGACTGGTAAGATCGCAGATTACAACTACAAATTGCCTGATGATTTCACTGGTTGCGTTATCGCGTGGAACTCTAATAACCTCGATTCTAAGGTCGGTGGTAACTACAATTACCTGTACCGCTTGTTTAGGAAGTCAAACCTGAAGCCTTTCGAGAGGGATATTTCAACCGAAATCTATCAAGCGGGTTCAACACCGTGTAACGGTGTGGAAGGATTTAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCTTACGGATTCCAGCCAACCAATGGCGTGGGTTACCAACCTTATCGCGTGGTGGTTCTGAGTTTCGAACTGTTGCACGCTCCCGCCACGGTATGCGGTCCCAAGAAGAGCACTAACTTGGTGAAGAATAAGTGCGTGAATTTCAATTTCAATGGCCTCACTGGAACTGGAGTGCTGACCGAATCCAATAAGAAGTTCTTGCCCTTCCAGCAGTTCGGAAGAGACATTGCTGACACAACCGACGCGGTGCGCGATCCTCAGACTCTGGAGATATTGGACATTACACCATGTTCTTTCGGCGGTGTGTCTGTCATTACTCCGGGCACGAATACTAGCAACCAGGTAGCCGTGCTGTACCAAGACGTGAATTGCACAGAGGTTCCCGTCGCAATTCACGCTGACCAGCTGACCCCCACGTGGAGGGTTTACAGCACTGGTAGTAACGTCTTCCAGACGAGAGCCGGTTGCTTGATCGGAGCGGAACATGTGAATAACTCCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGAGCCGGTATATGCGCCTCTTATCAGACACAAACTAACTCACGCAGTGTGGCTTCTCAAAGCATTATAGCATACACTATGTCTCTTGGTGCCGAAAATTCCGTGGCCTATTCTAACAATTCAATCGCCATCCCAACCAACTTCACAATTAGCGTGACTACCGAAATACTGCCTGTGAGCATGACGAAAACCAGCGTAGACTGCACTATGTATATCTGTGGAGACTCCACTGAGTGCTCCAACCTTCTCCTGCAGTACGGTAGCTTCTGTACCCAATTGAACCGCGCCCTTACAGGCATCGCTGTTGAGCAAGATAAGAATACCCAGGAAGTTTTTGCCCAGGTTAAGCAGATATACAAAACACCGCCCATTAAGGACTTCGGAGGCTTCAACTTCTCTCAGATACTGCCTGACCCCTCCAAGCCATCAAAACGCAGCTTCATTGAGGACCTCTTGTTCAACAAAGTGACTCTGGCTGATGCTGGCTTCATTAAGCAGTACGGAGATTGCCTGGGAGATATTGCTGCCAGGGACCTCATCTGCGCCCAGAAGTTTAATGGCCTGACAGTCTTGCCCCCACTTCTGACAGACGAGATGATTGCTCAGTACACATCTGCCCTCCTCGCTGGCACCATAACATCCGGATGGACATTTGGTGCTGGTGCTGCCCTCCAGATTCCCTTCGCAATGCAGATGGCGTATCGCTTTAACGGCATCGGTGTCACACAAAACGTGTTGTATGAGAACCAAAAGCTCATCGCTAACCAGTTTAATTCTGCTATTGGTAAGATTCAGGACAGCCTGTCATCAACCGCGTCTGCCCTTGGTAAGTTGCAGGACGTGGTGAACCAGAATGCTCAGGCTTTGAATACTCTGGTGAAGCAACTCTCTTCAAATTTCGGCGCTATCTCTTCTGTGTTGAACGACATCCTGAGTCGCCTTGATcctccaGAAGCTGAAGTTCAAATTGATAGATTGATTACTGGCAGGCTCCAGTCTTTGCAGACCTACGTTACACAGCAGCTGATTAGGGCGGCTGAAATTAGAGCTTCCGCCAATCTGGCTGCAACCAAGATGTCCGAATGCGTCCTGGGTCAGTCAAAGCGCGTTGACTTTTGTGGTAAAGGCTACCACCTCATGTCATTTCCCCAGTCAGCACCTCACGGAGTAGTGTTCCTCCACGTCACCTACGTTCCAGCACAGGAAAAGAATTTTACCACTGCGCCGGCAATCTGTCACGACGGTAAGGCACACTTCCCCCGCGAGGGCGTATTCGTGTCTAACGGAACTCATTGGTTCGTCACACAGAGAAACTTCTATGAGCCTCAGATCATTACCACCGACAATACATTTGTGTCCGGTAACTGCGACGTTGTGATTGGAATCGTCAACAACACTGTGTACGATCCACTTCAGCCAGAACTGGATAGCTTCAAGGAAGAATTGGACAAATATTTCAAAAATCACACTTCACCCGATGTGGACCTGGGTGACATTAGTGGTATCAATGCGTCCGTGGTCAATATTCAAAAAGAGATTGACAGGCTCAACGAAGTGGCCAAGAACCTGAACGAAAGTCTTATCGATCTGCAAGAATTGGGAAAGTATGAGCAGTACATCAAGTGGCCGTGGTACATTTGGTTGGGTTTTATCGCCGGTCTGATCGCCATCGTTATGGTTACCATTATGCTTTGCTGCATGACGAGCTGTTGCTCCTGTCTGAAGGGATGCTGCTCTTGCGGATCATGTTGCAAGTTCGATGAAGACGATAGCGAACCAGTTCTGAAGGGCGTCAAGCTGCATTACACA SEQ ID NO: 16 組織纖溶酶原啟動物 SPDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSQEIHARFRR SEQ ID NO: 17 人 IgE 免疫球蛋白 SPDWTWILFLVAAATRVHS SEQ ID NO: 18 SARS-CoV-2 德爾塔變體 RBD 的氨基酸序列RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF SEQ ID NO: 19 SARS-CoV-2 奧密克戎變體 RBD 的氨基酸序列RVQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNLAPFFTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNCYFPLRSYSFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF SEQ ID NO: 20 SARS-CoV-2 德爾塔變體 RBD 的核酸序列CGCGTCCAGCCAACCGAGAGCATCGTCAGATTTCCCAACATTACAAATCTGTGTCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACACGCTTCGCTTCAGTGTACGCATGGAACCGCAAGCGCATATCTAACTGCGTCGCGGATTATTCTGTCCTCTACAACTCCGCCTCTTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGAGTGTCACCGACTAAGCTGAACGATCTCTGCTTTACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTGATAAGAGGTGATGAAGTGAGACAAATAGCCCCAGGTCAGACTGGTAAGATCGCAGATTACAACTACAAATTGCCTGATGATTTCACTGGTTGCGTTATCGCGTGGAACTCTAATAACCTCGATTCTAAGGTCGGTGGTAACTACAATTACaGGTACCGCTTGTTTAGGAAGTCAAACCTGAAGCCTTTCGAGAGGGATATTTCAACCGAAATCTATCAAGCGGGTTCAAagCCGTGTAACGGTGTGgAAGGATTTAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCTTACGGATTCCAGCCAACCAATGGCGTGGGTTACCAACCTTATCGCGTGGTGGTTCTGAGTTTCGAACTGTTGCACGCTCCCGCCACGGTATGCGGTCCCAAGAAGAGCACTAACTTGGTGAAGAATAAGTGCGTGAATTTC SEQ ID NO: 21 SARS-CoV-2 奧密克戎變體 RBD 的核酸序列CGCGTCCAGCCAACCGAGAGCATCGTCAGATTTCCCAACATTACAAATCTGTGTCCCTTCGaCGAGGTGTTCAACGCCACACGCTTCGCTTCAGTGTACGCATGGAACCGCAAGCGCATATCTAACTGCGTCGCGGATTATTCTGTCCTCTACAACctCGCCcCTTTCTtCACCTTCAAGTGCTACGGAGTGTCACCGACTAAGCTGAACGATCTCTGCTTTACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTGATAAGAGGTGATGAAGTGAGACAAATAGCCCCAGGTCAGACTGGTAAcATCGCAGATTACAACTACAAATTGCCTGATGATTTCACTGGTTGCGTTATCGCGTGGAACTCTAATAAgCTCGATTCTAAGGTCaGTGGTAACTACAATTACCTGTACCGCTTGTTTAGGAAGTCAAACCTGAAGCCTTTCGAGAGGGATATTTCAACCGAAATCTATCAAGCGGGTaacAagCCGTGTAACGGTGTGgcAGGATTTAACTGCTACTTCCCCCTGCgGTCTTACaGcTTCCgGCCAACCtATGGCGTGGGTcACCAACCTTATCGCGTGGTGGTTCTGAGTTTCGAACTGTTGCACGCTCCCGCCACGGTATGCGGTCCCAAGAAGAGCACTAACTTGGTGAAGAATAAGTGCGTGAATTTC SEQ ID NO: 22 Kozak 核酸序列GCCACCAUG SEQ ID NO: 23 polyAC 序列GAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACA SEQ ID NO: 24 m6A 修飾序列ACGAGTCCTGGACTGAAACGGACTTGT SEQ ID NO: 25 可被 3’ 催化性 I 型內含子片段識別的 3’ 外顯子序列AAAAUCCGUUGACCUUAAACGGUCGUGUGGGUUCAAGUCCCUCCACCCCCAC SEQ ID NO: 26 可被 5’ 催化性 I 型內含子片段識別的 5’ 外顯子序列GAGACGCUACGGACUU SEQ ID NO: 27 示例性的 5’ 同源序列GGGAGACCCUCGACCGUCGAUUGUCCACUGGUC SEQ ID NO: 28 示例性的 3’ 同源序列ACCAGUGGACAAUCGACGGAUAACAGCAUAUCUAG SEQ ID NO: 29 T7 啟動子UAAUACGACUCACUAUAGG SEQ ID NO: 30 T2A 肽編碼序列GAGGGCAGAGGAAGUCUUCUAACAUGCGGUGACGUGGAGGAGAAUCCCGGCCCU SEQ ID NO: 31 P2A 肽編碼序列GCUACUAACUUCAGCCUGCUGAAGCAGGCUGGAGACGUGGAGGAGAACCCUGGACCU SEQ ID NO: 32 催化性 I 型內含子片段AACAAUAGAUGACUUACAACUAAUCGGAAGGUGCAGAGACUCGACGGGAGCUACCCUAACGUCAAGACGAGGGUAAAGAGAGAGUCCAAUUCUCAAAGCCAAUAGGCAGUAGCGAAAGCUGCAAGAGAAUG SEQ ID NO: 33 5’ 催化性 I 型內含子片段AAAUAAUUGAGCCUUAAAGAAGAAAUUCUUUAAGUGGAUGCUCUCAAACUCAGGGAAACCUAAAUCUAGUUAUAGACAAGGCAAUCCUGAGCCAAGCCGAAGUAGUAAUUAGUAAG SEQ ID NO: 34 SARS-CoV-2 的全長 S 蛋白序列的核酸序列ATGTTCGTTTTCCTTGTTCTGTTGCCTCTCGTTAGTAGCCAATGCGTCAACCTTACTACTAGAACCCAGCTCCCTCCAGCATATACCAACTCTTTCACCAGGGGCGTATATTACCCGGACAAAGTGTTCCGCTCAAGTGTGCTGCATTCTACGCAGGACCTTTTCTTGCCCTTTTTCAGTAATGTTACTTGGTTTCATGCTATCCATGTGTCTGGAACTAACGGAACCAAGCGCTTTGACAACCCCGTCCTCCCTTTCAACGATGGCGTGTACTTCGCTTCCACGGAAAAGTCAAACATAATTCGCGGCTGGATCTTTGGTACAACACTCGACTCAAAGACGCAGAGCCTGCTGATCGTTAATAACGCTACAAATGTTGTGATAAAGGTGTGTGAATTTCAGTTCTGCAATGATCCCTTCCTGGGTGTGTACTACCATAAGAATAACAAGAGCTGGATGGAATCCGAATTTAGGGTTTACAGTTCCGCTAACAACTGCACATTCGAATACGTAAGCCAGCCATTTCTTATGGATCTTGAGGGCAAGCAAGGAAACTTCAAGAACTTGAGGGAGTTCGTGTTCAAAAATATCGACGGCTATTTTAAGATATATAGCAAGCACACTCCAATAAACTTGGTGCGCGACCTGCCCCAGGGATTCTCTGCTCTGGAGCCCCTGGTGGATCTGCCCATTGGAATAAACATAACTCGCTTTCAAACACTGCTCGCCCTGCATCGCAGTTACCTCACCCCTGGTGATAGTAGTTCAGGATGGACAGCAGGAGCCGCCGCATACTACGTCGGCTACCTGCAGCCTAGGACCTTCTTGCTGAAGTACAACGAGAACGGTACAATAACTGACGCTGTGGACTGCGCTCTGGACCCTCTGTCCGAGACGAAGTGCACCCTGAAGAGCTTTACTGTTGAAAAAGGCATTTACCAAACCAGCAACTTCCGCGTCCAGCCAACCGAGAGCATCGTCAGATTTCCCAACATTACAAATCTGTGTCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACACGCTTCGCTTCAGTGTACGCATGGAACCGCAAGCGCATATCTAACTGCGTCGCGGATTATTCTGTCCTCTACAACTCCGCCTCTTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGAGTGTCACCGACTAAGCTGAACGATCTCTGCTTTACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTGATAAGAGGTGATGAAGTGAGACAAATAGCCCCAGGTCAGACTGGTAAGATCGCAGATTACAACTACAAATTGCCTGATGATTTCACTGGTTGCGTTATCGCGTGGAACTCTAATAACCTCGATTCTAAGGTCGGTGGTAACTACAATTACCTGTACCGCTTGTTTAGGAAGTCAAACCTGAAGCCTTTCGAGAGGGATATTTCAACCGAAATCTATCAAGCGGGTTCAACACCGTGTAACGGTGTGGAAGGATTTAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCTTACGGATTCCAGCCAACCAATGGCGTGGGTTACCAACCTTATCGCGTGGTGGTTCTGAGTTTCGAACTGTTGCACGCTCCCGCCACGGTATGCGGTCCCAAGAAGAGCACTAACTTGGTGAAGAATAAGTGCGTGAATTTCAATTTCAATGGCCTCACTGGAACTGGAGTGCTGACCGAATCCAATAAGAAGTTCTTGCCCTTCCAGCAGTTCGGAAGAGACATTGCTGACACAACCGACGCGGTGCGCGATCCTCAGACTCTGGAGATATTGGACATTACACCATGTTCTTTCGGCGGTGTGTCTGTCATTACTCCGGGCACGAATACTAGCAACCAGGTAGCCGTGCTGTACCAAGACGTGAATTGCACAGAGGTTCCCGTCGCAATTCACGCTGACCAGCTGACCCCCACGTGGAGGGTTTACAGCACTGGTAGTAACGTCTTCCAGACGAGAGCCGGTTGCTTGATCGGAGCGGAACATGTGAATAACTCCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGAGCCGGTATATGCGCCTCTTATCAGACACAAACTAACTCACCCAGGAGAGCCCGCAGTGTGGCTTCTCAAAGCATTATAGCATACACTATGTCTCTTGGTGCCGAAAATTCCGTGGCCTATTCTAACAATTCAATCGCCATCCCAACCAACTTCACAATTAGCGTGACTACCGAAATACTGCCTGTGAGCATGACGAAAACCAGCGTAGACTGCACTATGTATATCTGTGGAGACTCCACTGAGTGCTCCAACCTTCTCCTGCAGTACGGTAGCTTCTGTACCCAATTGAACCGCGCCCTTACAGGCATCGCTGTTGAGCAAGATAAGAATACCCAGGAAGTTTTTGCCCAGGTTAAGCAGATATACAAAACACCGCCCATTAAGGACTTCGGAGGCTTCAACTTCTCTCAGATACTGCCTGACCCCTCCAAGCCATCAAAACGCAGCTTCATTGAGGACCTCTTGTTCAACAAAGTGACTCTGGCTGATGCTGGCTTCATTAAGCAGTACGGAGATTGCCTGGGAGATATTGCTGCCAGGGACCTCATCTGCGCCCAGAAGTTTAATGGCCTGACAGTCTTGCCCCCACTTCTGACAGACGAGATGATTGCTCAGTACACATCTGCCCTCCTCGCTGGCACCATAACATCCGGATGGACATTTGGTGCTGGTGCTGCCCTCCAGATTCCCTTCGCAATGCAGATGGCGTATCGCTTTAACGGCATCGGTGTCACACAAAACGTGTTGTATGAGAACCAAAAGCTCATCGCTAACCAGTTTAATTCTGCTATTGGTAAGATTCAGGACAGCCTGTCATCAACCGCGTCTGCCCTTGGTAAGTTGCAGGACGTGGTGAACCAGAATGCTCAGGCTTTGAATACTCTGGTGAAGCAACTCTCTTCAAATTTCGGCGCTATCTCTTCTGTGTTGAACGACATCCTGAGTCGCCTTGATAAGGTGGAAGCTGAAGTTCAAATTGATAGATTGATTACTGGCAGGCTCCAGTCTTTGCAGACCTACGTTACACAGCAGCTGATTAGGGCGGCTGAAATTAGAGCTTCCGCCAATCTGGCTGCAACCAAGATGTCCGAATGCGTCCTGGGTCAGTCAAAGCGCGTTGACTTTTGTGGTAAAGGCTACCACCTCATGTCATTTCCCCAGTCAGCACCTCACGGAGTAGTGTTCCTCCACGTCACCTACGTTCCAGCACAGGAAAAGAATTTTACCACTGCGCCGGCAATCTGTCACGACGGTAAGGCACACTTCCCCCGCGAGGGCGTATTCGTGTCTAACGGAACTCATTGGTTCGTCACACAGAGAAACTTCTATGAGCCTCAGATCATTACCACCGACAATACATTTGTGTCCGGTAACTGCGACGTTGTGATTGGAATCGTCAACAACACTGTGTACGATCCACTTCAGCCAGAACTGGATAGCTTCAAGGAAGAATTGGACAAATATTTCAAAAATCACACTTCACCCGATGTGGACCTGGGTGACATTAGTGGTATCAATGCGTCCGTGGTCAATATTCAAAAAGAGATTGACAGGCTCAACGAAGTGGCCAAGAACCTGAACGAAAGTCTTATCGATCTGCAAGAATTGGGAAAGTATGAGCAGTACATCAAGTGGCCGTGGTACATTTGGTTGGGTTTTATCGCCGGTCTGATCGCCATCGTTATGGTTACCATTATGCTTTGCTGCATGACGAGCTGTTGCTCCTGTCTGAAGGGATGCTGCTCTTGCGGATCATGTTGCAAGTTCGATGAAGACGATAGCGAACCAGTTCTGAAGGGCGTCAAGCTGCATTACACA SEQ ID NO: 35 S 蛋白的 RBD 氨基酸殘基 319 至 542 的核酸序列CGCGTCCAGCCAACCGAGAGCATCGTCAGATTTCCCAACATTACAAATCTGTGTCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACACGCTTCGCTTCAGTGTACGCATGGAACCGCAAGCGCATATCTAACTGCGTCGCGGATTATTCTGTCCTCTACAACTCCGCCTCTTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGAGTGTCACCGACTAAGCTGAACGATCTCTGCTTTACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTGATAAGAGGTGATGAAGTGAGACAAATAGCCCCAGGTCAGACTGGTAAGATCGCAGATTACAACTACAAATTGCCTGATGATTTCACTGGTTGCGTTATCGCGTGGAACTCTAATAACCTCGATTCTAAGGTCGGTGGTAACTACAATTACCTGTACCGCTTGTTTAGGAAGTCAAACCTGAAGCCTTTCGAGAGGGATATTTCAACCGAAATCTATCAAGCGGGTTCAACACCGTGTAACGGTGTGGAAGGATTTAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCTTACGGATTCCAGCCAACCAATGGCGTGGGTTACCAACCTTATCGCGTGGTGGTTCTGAGTTTCGAACTGTTGCACGCTCCCGCCACGGTATGCGGTCCCAAGAAGAGCACTAACTTGGTGAAGAATAAGTGCGTGAATTTC SEQ ID NO: 36 T4 纖維蛋白的 C 末端折疊子結構域的核酸序列GGAAGCGGCTACATCCCAGAAGCCCCTAGAGACGGACAGGCTTACGTGCGAAAAGACGGCGAGTGGGTGCTGCTGAGCACATTCCTGGGAAGGAGC SEQ ID NO: 37 基於 GCN4 的異亮氨酸拉鍊結構域的核酸序列CGAATGAAGCAGATTGAGGATAAAATTGAGGAGATTCTCAGCAAAATTTACCACATAGAAAATGAGATCGCTCGGATTAAAAAACTGATCGGAGAAAGA SEQ ID NO: 38 GS 肽接頭的核酸序列GGCGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCAGC SEQ ID NO: 39 CVB3 病毒 IRESTTAAAACAGCCTGTGGGTTGATCCCACCCACAGGCCCATTGGGCGCTAGCACTCTGGTATCACGGTACCTTTGTGCGCCTGTTTTATACCCCCTCCCCCAACTGTAACTTAGAAGTAACACACACCGATCAACAGTCAGCGTGGCACACCAGCCACGTTTTGATCAAGCACTTCTGTTACCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAGCGTTCGTTATCCGGCCAACTACTTCGAAAAACCTAGTAACACCGTGGAAGTTGCAGAGTGTTTCGCTCAGCACTACCCCAGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACCGCATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGAAACCCATGGGACGCTCTAATACAGACATGGTGCGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACACACCCTCAAGCCAGAGGGCAGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCATTTTATTCCTATACTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAGAGATCGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGACTAATAGAGCTATTATATATCCCTTTGTTGGGTTTATACCACTTAGCTTGAAAGAGGTTAAAACATTACAATTCATTGTTAAGTTGAATACAGCAAA SEQ ID NO: 40 SARS-CoV-2 的 S 蛋白的氨基酸殘基 2 至 1273 序列， K986P V987PFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT SEQ ID NO: 41 SARS-CoV-2 毒株 B.1.351 RBD 的氨基酸序列RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF SEQ ID NO: 42 編碼 SARS-CoV-2 毒株 B.1.351 RBD 的核酸序列CGCGTCCAGCCAACCGAGAGCATCGTCAGATTTCCCAACATTACAAATCTGTGTCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACACGCTTCGCTTCAGTGTACGCATGGAACCGCAAGCGCATATCTAACTGCGTCGCGGATTATTCTGTCCTCTACAACTCCGCCTCTTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGAGTGTCACCGACTAAGCTGAACGATCTCTGCTTTACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTGATAAGAGGTGATGAAGTGAGACAAATAGCCCCAGGTCAGACTGGTAACATCGCAGATTACAACTACAAATTGCCTGATGATTTCACTGGTTGCGTTATCGCGTGGAACTCTAATAACCTCGATTCTAAGGTCGGTGGTAACTACAATTACCTGTACCGCTTGTTTAGGAAGTCAAACCTGAAGCCTTTCGAGAGGGATATTTCAACCGAAATCTATCAAGCGGGTTCAACACCGTGTAACGGTGTGAAAGGATTTAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCTTACGGATTCCAGCCAACCTATGGCGTGGGTTACCAACCTTATCGCGTGGTGGTTCTGAGTTTCGAACTGTTGCACGCTCCCGCCACGGTATGCGGTCCCAAGAAGAGCACTAACTTGGTGAAGAATAAGTGCGTGAATTTC
無
圖1A-1I顯示了SARS-CoV-2RBD抗原在體外用環狀RNA的表達。圖1A顯示了通過I型核酶自催化進行circRNA RBD環化的示意圖。SP，人tPA蛋白的信號肽序列。折疊子，來自噬菌體T4纖維蛋白的三聚化結構域。RBD，SARS-CoV-2刺突蛋白的受體結合結構域。箭頭表示用於PCR分析的引物的設計。圖1B顯示線性RNA RBD和circRNA RBD的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖1C是Western Blot分析，其顯示了轉染了通過I型核酶自催化環化的circRNA RBD的HEK293T細胞上清液中RBD抗原的表達水準。circRNA EGFP和線性RNA RBD被設定為對照。圖1D顯示了定量ELISA檢測，用於測量上清液中RBD抗原的濃度。圖1E是Western Blot分析，顯示轉染了circRNA RBD的小鼠NIH3T3細胞的上清液中RBD抗原的表達水準。circRNA EGFP被設定為對照。圖1F是通過T4 RNA連接酶環化的circRNA RBD的示意圖。SP，人tPA蛋白的信號肽序列。折疊子，來自噬菌體T4纖維蛋白的三聚化結構域。RBD，SARS-CoV-2刺突蛋白的受體結合結構域。圖1G是Western Blot分析，顯示了轉染了通過T4 RNA連接酶環化的circRNA RBD的HEK293T細胞的上清液中RBD抗原的表達水準。circRNA EGFP和線性RNA RBD被設定為對照。圖1H顯示了定量ELISA檢測，用於測量上清液中RBD抗原的濃度。圖1I顯示了circRNA RBD-翻譯的RBD抗原對SARS-CoV-2假病毒感染（EGFP）的競爭性抑制的定量。circRNA EGFP和線性RNA RBD被設定為對照。在圖1E和圖1H中，資料顯示為平均值±S.E.M.（n=3）。在圖1I中，資料顯示為平均值±S.E.M.（n=2）。
圖2A-2O顯示了SARS-CoV-2 circRNA疫苗在小鼠中的免疫原性和保護作用。圖2A是LNP-circRNA複合物的示意圖。圖2B顯示通過動態光散射法測定的LNP-circRNA RBD的濃度大小圖。圖2C是LNP-circRNA RBD在BALB/c小鼠中的接種過程和用於特異性抗體分析的血清收集時間表的示意圖。圖2D顯示用ELISA測定的SARS-CoV-2特異性IgG抗體滴度。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=4或5）。圖2E顯示了用circRNA RBD疫苗免疫的小鼠血清對基於VSV的D614G假病毒進行的中和試驗。在加強免疫後5周收集血清樣本。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=5）。圖2F顯示了用circRNA RBD疫苗免疫的小鼠血清對SARS-CoV-2真實病毒的中和試驗。在加強免疫後5周收集血清樣本。資料顯示為平均值±S.E.M.圖2G顯示了用ELISA測定的circRNA RBD-β免疫小鼠的SARS-CoV-2（β）特異性IgG抗體滴度。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=4或5）。圖2H和2I顯示了用circRNA RBD或circRNA RBD-β疫苗免疫的小鼠血清對基於VSV的D614G、α或β假病毒進行的中和試驗。在加強免疫後1周收集血清樣本。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=5）。圖2J顯示了用circRNA RBD-β疫苗免疫的小鼠血清對SARS-CoV-2（β）真病毒進行的中和試驗。圖2K顯示了用circRNA RBD-β疫苗免疫的小鼠血清對SARS-CoV-2（D614G）真病毒進行的中和試驗。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=4或5）。圖2L顯示了circRNA RBD-β疫苗免疫小鼠血清的體外替代中和試驗。圖2M顯示了BALB/c小鼠中SARS-CoV-2 （β）真病毒的感染病毒負荷。用 GAPDH歸一化。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=3）。圖2N顯示了SARS-CoV-2（β）真病毒攻擊後免疫的或安慰劑小鼠的體重變化。圖2O顯示了被攻擊小鼠肺組織中的病毒負荷。資料顯示為平均值±S.E.M.（n≥5）。NT50用傳染性的SARS-CoV-2真病毒測定。每個符號代表個體小鼠。統計學檢驗是通過非配對的雙側學生t檢驗進行的。
圖3A-3O顯示了SARS-CoV-2 circRNA RBD- 德爾塔疫苗在小鼠中激發的體液和T細胞免疫應答。圖3A顯示了用ELISA法測定的由I型核酶自催化產生的circRNA RBD- 德爾塔疫苗的SARS-CoV-2（德爾塔）特異性IgG抗體滴度。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=5）。圖3B顯示了用ELISA測定的由T4 RNA連接酶產生的circRNA RBD- 德爾塔疫苗的SARS-CoV-2（德爾塔）特異性IgG抗體滴度。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=5）。圖3C顯示了用circRNA RBD- 德爾塔疫苗免疫的小鼠血清對基於VSV的SARS-CoV-2（德爾塔）假病毒進行的中和試驗。在加強免疫後1周收集血清樣本。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=5）。圖3D和圖3E顯示了用安慰劑小鼠組或用不同劑量circRNA RBD- 德爾塔疫苗免疫的小鼠的血清對SARS-CoV-2（D614G）、SARS-CoV-2（α）、SARS-CoV-2（β）和SARS-CoV-2（德爾塔）假病毒進行的中和試驗。在加強免疫後5周收集血清樣本。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=5）。圖3F、3G和3H是FACS分析結果，顯示了在單個和活的CD44 +CD62L -CD8 +T中評估的IFN-γ、IL-2和TNF-α陽性細胞的百分比。圖3I、3J、3K和3L是FACS分析結果，顯示在單個和活的CD44 +CD62L -CD4 +T中評估的IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-4陽性細胞的百分比。在圖3F-3L中，資料顯示為平均值±S.E.M.（n=3或4）。每個符號代表個體小鼠。
圖4A-4N顯示circRNA疫苗比mRNA疫苗激發了更高比例的中和抗體和更強的Th1偏向的T細胞免疫應答。圖4A通過ELISA比較了circRNA、1mΨ mRNA和非修飾的mRNA在HEK293T中通過脂質體轉染在不同時間點的抗原表達水準。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=3）。圖4B顯示了RNA水準的動態變化，資料顯示為平均值±S.E.M.（n=3）。圖4C通過ELISA比較circRNA、1mΨ mRNA和非修飾的mRNA在HEK293T中通過LNP轉染在不同時間點的抗原表達水準。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=3）。圖4D是Western Blot分析，顯示轉染了circRNA RBD的HEK293T細胞的上清液中RBD抗原的表達水準。circRNA RBD在室溫下保存，在第0天、第3天、第7天和第14天轉染。未處理的和線性前體被設定為對照。圖4E，4F和4G顯示了定量ELISA，以測量LNP轉染的circRNA RBD，1mΨ mRNA和非修飾的mRNA的表達水準。LNP-RNA在不同的溫度下儲存，在不同的時間點轉染。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=3）。圖4H顯示通過ELISA測定的circRNA RBD，1mΨ mRNA免疫的小鼠血清的SARS-CoV-2（德爾塔）特異性IgG抗體滴度。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=5）。圖4I顯示了通過ELISA測定的circRNA RBD- 德爾塔，1mΨ mRNARBD-德爾塔免疫的小鼠血清的SARS-CoV-2（德爾塔）特異性IgG同種型滴度。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=5）。圖4J顯示了circRNA RBD- 德爾塔，1mΨ mRNA RBD- 德爾塔免疫的小鼠血清的SARS-CoV-2（德爾塔）特異性IgG2a/IgG1, IgG2c/IgG1和（IgG2a+IgG2c）/IgG1比率。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=5）。圖4K、4L和4M顯示了用不同劑量的circRNA RBD- 德爾塔或1mΨ mRNA RBD- 德爾塔疫苗免疫的小鼠血清進行的基於VSV的SARS-CoV-2（德爾塔）假病毒的中和試驗。在加強免疫後1周收集血清樣本。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=5）。圖4N顯示了circRNA RBD- 德爾塔或1mΨ mRNA RBD- 德爾塔疫苗的中和抗體/結合抗體比率。該比率由每只小鼠的NT50除以終點IgG滴度計算。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=5）。
圖5A-5J顯示circRNA疫苗激發的免疫原性和對恒河猴SARS-CoV-2感染的保護。圖5A顯示了恒河猴的LNP-circRNA RBD疫苗接種過程和用於特異性抗體分析的血清收集時間表的示意圖。圖5B顯示了用ELISA測定的circRNA RBD免疫的恒河猴的SARS-CoV-2（D614G）特異性IgG抗體滴度。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=4）。圖5C顯示了用基於VSV的SARS-CoV-2（D614G）假病毒測定的circRNA RBD免疫的恒河猴的NT50。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=4）。圖5D顯示了用不同劑量circRNA RBD疫苗免疫的小鼠血清對基於VSV的SARS-CoV-2（D614G）、SARS-CoV-2（α）、SARS-CoV-2（β）和SARS-CoV-2（德爾塔）假病毒進行的中和試驗。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=4）。圖5E顯示了用不同劑量circRNA RBD疫苗免疫的小鼠血清對SARS-CoV-2（D614G）、SARS-CoV-2（α）、SARS-CoV-2（β）和SARS-CoV-2（德爾塔）真病毒進行的中和試驗。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=4）。圖5F顯示了通過ELISPOT測定的來自circRNA RBD疫苗免疫的恒河猴的PBMC的特異性SARS-CoV-2（D614G） IFN-γ、IL-2和IL-4應答。每個點代表獨立的生物複製。圖5G顯示了被攻擊的恒河猴肺組織中的病毒負荷（N基因）和亞基因組RNA負荷（E基因）。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=4）。圖5H顯示了circRNA RBD疫苗免疫的恒河猴或對照組的肺葉的病理切片和HE染色。圖5I顯示了circRNA RBD疫苗免疫的恒河猴或對照組的病理評分。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=4）。圖5J顯示了不同劑量組中每只恒河猴的B細胞（B）、T細胞（T）和保護排名。
圖6A-6F顯示circRNA疫苗在恒河猴中沒有引起明顯的臨床疾病症狀。圖6A、6B、6C、6D和6E顯示免疫的恒河猴血漿中的IL-6、MCP1、TNF-α、IL-1β和IFNα水準。圖6F顯示恒河猴的體溫。體溫在免疫後三天內被監測。
圖7顯示了circRNA疫苗對奧密克戎變體的假病毒中和作用。用10μg LNP-circRNA RBD或LNP-circRNA RBD-β或LNP-circRNA RBD- 德爾塔疫苗免疫的小鼠血清對基於VSV的SARS-CoV-2（奧密克戎）假病毒和相應的假病毒進行的中和試驗。血清樣本在加強免疫後2周收集。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=5或6）。
圖8A-8B顯示circRNA RBD- 奧密克戎疫苗激發的SARS-CoV-2 奧密克戎變體特異性抗體。圖8A顯示了使用來自用兩劑5 μg或10 μg（1周間隔）的circRNA RBD- 奧密克戎疫苗免疫的小鼠的血清，用ELISA測定的SARS-CoV-2 奧密克戎變體特異性IgG抗體滴度。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=3）。圖8B顯示了使用來自用1劑30 μg的circRNA RBD- 奧密克戎疫苗免疫的小鼠的血清，用ELISA測定的SARS-CoV-2 奧密克戎變體特異性IgG抗體滴度。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=3）。每個符號代表個體小鼠。
圖9A-9C顯示了circRNA RBD的瓊脂糖凝膠電泳和HPLC純化。圖9A顯示了不同處理的線性RNA RBD和circRNA RBD的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖9B顯示了時間從5分鐘到120分鐘的不同時間由RNase R消化的circRNA RBD和線性RNA RBD的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖9C顯示未經RNase R處理的circRNA RBD（左）和經RNase R處理的circRNA RBD（右）的HPLC色譜圖。
圖10A-10D顯示在攻擊前3天由circRNA RBD-β疫苗激發的結合和中和抗體。圖10A提供了構建體的示意圖。圖10B顯示了用ELISA測定的SARS-CoV-2特異性IgG抗體滴度。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=5）。每個符號代表個體小鼠。圖10C顯示了替代病毒中和試驗的免疫小鼠血清的抑制率的Sigmoidal曲線圖。在圖10B-10D中，在真SARS-CoV-2 β毒株攻擊前3天收集circRNA RBD-β（50 μg）免疫小鼠的血清。
圖11顯示了用於量化小鼠體內SARS-CoV-2-RBD特異性T細胞的流動圖和門控策略。圖中顯示了來自脾臟的單個且活的T細胞的門控策略。進一步用細胞因數的表達來分析CD4 +或CD8 +Tem細胞（CD44 +CD62 -）。
圖12A-12M顯示circRNA RBD- 德爾塔疫苗和circRNA RBD- 奧密克戎都激發了針對奧密克戎變體circRNA的高水準中和抗體。圖12A顯示了用10 μg的LNP-circRNA RBD、LNP-circRNA RBD-β、LNP-circRNA RBD- 德爾塔或LNP-1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔疫苗免疫的小鼠血清對基於VSV的SARS-CoV-2假病毒進行的中和試驗。血清樣本在加強免疫後2周收集。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=5或6）。圖12B顯示了用10 μg LNP-circRNA RBD- 德爾塔或LNP-1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔疫苗免疫的小鼠血清對基於VSV的SARS-CoV-2假病毒進行的中和試驗。血清樣本在加強免疫後7周收集。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=5）。圖12C和12D顯示了LNP-circRNA RBD- 德爾塔或LNP-1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔疫苗對奧密克戎變體的中和抗體/結合抗體比率。該比率由每只小鼠的NT50除以終點IgG滴度計算。NT50和終點IgG滴度是在加強免疫後2周（圖12C）或加強免疫後7周（圖12D）後測定的。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=5）。圖12E顯示了用ELISA測定的LNP-circRNA RBD- 奧密克戎免疫小鼠血清的奧密克戎-刺突特異性IgG抗體終點滴度。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=5）。圖12F顯示用基於VSV的奧密克戎假病毒的LNP-circRNA RBD- 奧密克戎免疫小鼠血清的NT50。血清樣本在以兩周間隔加強劑量後1周收集。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=4或5）。圖12G顯示了用5 μg或10 μg的LNP-circRNA RBD- 奧密克戎疫苗免疫的小鼠血清對基於VSV的假病毒進行的中和試驗。血清樣本在以兩周間隔加強免疫後1周收集。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=4或5）。圖12H顯示了BALB/c小鼠的LNP-circRNA疫苗接種過程和用於特異性抗體分析的血清收集時間表的示意圖。圖12I顯示了LNP-circRNA RBD-β、LNP-circRNA RBD- 德爾塔或LNP-circRNA RBD- 奧密克戎加強免疫的小鼠血清在接受兩劑LNP-circRNA RBD- 德爾塔 Delta後，用基於VSV的德爾塔假病毒的NT50值。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=3）。圖12J顯示了LNP-circRNA RBD-β、LNP-circRNA RBD- 德爾塔或LNP-circRNA RBD- 奧密克戎加強免疫的小鼠血清在接受兩劑LNP-circRNA RBD- 德爾塔後，用基於VSV的奧密克戎假病毒的NT50值。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=3）。圖12K顯示了BALB/c小鼠的LNP-circRNA疫苗接種過程和用於特異性抗體分析的血清收集時間表的示意圖。圖12L顯示了LNP-circRNA RBD或LNP-circRNA RBD- 德爾塔加強免疫的小鼠血清在接受兩劑LNP-circRNA RBD後，用基於VSV的德爾塔假病毒的NT50值。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=2或3）。圖12M顯示了LNP-circRNA RBD或LNP-circRNA RBD- 德爾塔加強免疫的小鼠血清在接受兩劑LNP-circRNA RBD後，用基於VSV的奧密克戎假病毒的NT50值。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=2或3）。每個符號代表個體小鼠。
圖13A-13C顯示了circRNA RBD- 德爾塔疫苗在加強免疫後7周對奧密克戎變體的高水準中和抗體。圖13A顯示了用5 μg LNP-circRNA RBD- 德爾塔或LNP-1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔疫苗免疫的小鼠血清對基於VSV的SARS-CoV-2假病毒進行的中和試驗。血清樣本在加強免疫後7周收集。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=5）。圖13B和13C顯示了LNP-circRNA RBD- 德爾塔或LNP-1mΨ-mRNA RBD- 德爾塔疫苗針對奧密克戎變體的中和抗體/結合抗體比率。該比率由每只小鼠的NT50除以終點IgG滴度計算。NT50和終點IgG滴度是在加強免疫後2周（圖13B）或加強免疫後7周（圖13C）後測定的。資料顯示為平均值±S.E.M.（n=5）。
圖14A-14C，由IVIS成像系統成像的小鼠。圖14A，未處理的。圖14B，注射了PBS。圖14C，注射了裸circRNA Luc。
圖15A-15B，包含裸circRNA RBD-β的SARS-CoV-2 circRNA RBD-β疫苗在小鼠中的免疫原性。圖15A，circRNA RBD-β疫苗在BALB/c小鼠中的接種過程和用於特異性抗體分析的血清收集時間表的示意圖。圖15B，用ELISA測量SARS-CoV-2特異性IgG抗體滴度。資料顯示為幾何平均值±幾何S.D。
圖16A-16B，包含裸circRNA RBD- 德爾塔的SARS-CoV-2 circRNA RBD- 德爾塔疫苗在小鼠中的免疫原性。圖16A，circRNA RBD- 德爾塔疫苗在BALB/c小鼠中的接種過程和用於特異性抗體分析的血清收集時間表的示意圖。圖16B，用ELISA測量SARS-CoV-2特異性IgG抗體滴度。資料顯示為幾何平均值±幾何S.D。
圖17A-17C顯示裸RNA RBD-β疫苗在小鼠中的免疫原性。圖17A顯示裸RNA RBD-β疫苗在BALB/c小鼠中的接種過程和用於特異性抗體分析的血清收集時間表的示意圖。圖17B顯示了由裸circRNA疫苗或裸mRNA疫苗誘導的SARS-CoV-2 RBD-德爾塔特異性抗體滴度的比較結果。圖17C顯示了由溶解在PBS或林格氏溶液中的裸circRNA疫苗誘導的SARS-CoV-2 RBD-德爾塔特異性抗體滴度的比較結果。資料顯示為幾何平均值±幾何S.D。
圖18A-18F顯示了編碼奧密克戎 BA.1 RBD抗原的circRNA疫苗的優化。圖18A顯示了用circRNA RBD-BA.1疫苗免疫的小鼠血清對SARS-CoV-2假病毒進行的中和試驗的結果。圖18B顯示了用優化的circRNA RBD-BA.1-mut1免疫的小鼠血清進行的SARS-CoV-2假病毒的中和試驗結果。圖18C顯示了用優化的circRNA RBD-BA.1-mut2免疫的小鼠血清對SARS-CoV-2假病毒進行的中和試驗結果。圖18D顯示用優化的circRNA RBD-BA.1-mut3免疫的小鼠血清對SARS-CoV-2假病毒進行的中和試驗結果。圖18E顯示了用優化的circRNA RBD-BA.1-mut2-Folden免疫的小鼠血清對SARS-CoV-2假病毒進行的中和試驗結果。圖18F顯示了用優化的circRNA RBD-BA.1-mut3-Folden免疫的小鼠血清對SARS-CoV-2假病毒進行的中和試驗結果。資料顯示為幾何平均值±幾何S.D。
圖19A-19B顯示，CircRNA RBD-BA.4/5疫苗誘導了針對奧密克戎及其亞譜系的一些變體的強效中和抗體。圖19A顯示了用5 μg的circRNA RBD-BA.4/5疫苗免疫2次（每次間隔3周）的的小鼠血清進行的SARS-CoV-2假病毒中和試驗的結果。圖19B顯示了用10 μg的circRNA RBD-BA.4/5疫苗免疫2次（每次間隔3周）的小鼠血清對SARS-CoV-2假病毒進行的中和試驗的結果。資料顯示為幾何平均值±幾何S.D。
圖20A-20D證明瞭用circRNA RBD-BA.4/5疫苗免疫的小鼠血清對SARS-CoV-2假病毒進行的中和試驗的結果，並顯示circRNARBD-三聚體疫苗誘導了針對奧密克戎及其亞譜系的一些變體的強效中和抗體。圖20A顯示了用5 μg的circRNA RBD- 三聚體 1疫苗免疫2次（每次間隔2周）的小鼠血清對SARS-CoV-2假病毒進行的中和試驗的結果。圖20B顯示了用10 μg的circRNA RBD- 三聚體 1疫苗免疫2次（每次間隔2周）的小鼠血清對SARS-CoV-2假病毒進行的中和試驗的結果。圖20C顯示了用5 μg的circRNA RBD- 三聚體 1- 折疊子疫苗免疫2次（每次間隔2周）的小鼠血清對SARS-CoV-2假病毒進行的中和試驗的結果。圖20D顯示了用10 μg的circRNA RBD- 三聚體 1- 折疊子疫苗免疫2次（每次間隔2周）的小鼠血清對SARS-CoV-2假病毒進行的中和試驗的結果。資料顯示為幾何平均數±幾何S.D。
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Claims (33)

  1. 一種環狀RNA（circRNA），其包含編碼SARS-CoV-2變體的抗原多肽的核酸序列，其中所述SARS-CoV-2變體是德爾塔變體或奧密克戎變體。
  2. 如請求項1所述的circRNA，其中所述抗原多肽包含所述SARS-CoV-2變體的刺突（S）蛋白或其片段。
  3. 如請求項2所述的circRNA，其中所述抗原多肽包含所述S蛋白的受體結合結構域（RBD）。
  4. 如請求項3所述的circRNA，其中所述RBD包含SARS-CoV-2全長S蛋白的氨基酸殘基319至542，其中編號基於SEQ ID NO: 1。
  5. 如請求項3或4所述的circRNA，其中所述SARS-CoV-2變體是德爾塔變體，並且其中所述抗原多肽包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列。
  6. 如請求項3或4所述的circRNA，其中所述SARS-CoV-2變體是奧密克戎變體，並且其中所述抗原多肽包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列。
  7. 如請求項1至6中任一項所述的circRNA，其中所述抗原多肽進一步包含多聚化結構域。
  8. 如請求項7所述的circRNA，其中所述多聚化結構域是T4纖維蛋白的C末端折疊子（Fd）結構域，其介導T4纖維蛋白的三聚化。
  9. 如請求項8所述的circRNA，其中所述Fd結構域包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。
  10. 如請求項1至9中任一項所述的circRNA，其進一步包含與編碼所述抗原多肽的核酸序列可操作地連接的Kozak序列。
  11. 如請求項1至10中任一項所述的circRNA，其進一步包含與編碼所述抗原多肽的核酸序列的3’端可操作地連接的框內2A肽編碼序列。
  12. 如請求項1至11中任一項所述的circRNA，其進一步包含與編碼所述抗原多肽的核酸序列可操作地連接的內部核糖體進入位點（IRES）序列。
  13. 如請求項12所述的circRNA，其中所述IRES序列是選自下組的IRES序列：CVB3病毒、EV71病毒、EMCV病毒、PV病毒和CSFV病毒的IRES序列。
  14. 如請求項13所述的circRNA，其包含核酸序列，所述核酸序列從5’端到3’端包含：IRES序列、Kozak序列和編碼所述抗原多肽的核酸序列。
  15. 如請求項12至14中任一項所述的circRNA，其進一步包含位於所述IRES序列5’端的polyAC或polyA序列。
  16. 如請求項1至11中任一項所述的circRNA，其進一步包含與編碼所述抗原多肽的核酸序列可操作地連接的m6A修飾基序序列。
  17. 如請求項16所述的circRNA，其包含核酸序列，所述核酸序列從5’端到3’端包含：m6A修飾基序序列、Kozak序列和編碼所述抗原多肽的核酸序列。
  18. 如請求項1至17中任一項所述的circRNA，其進一步包含可被側接於編碼所述抗原多肽的核酸序列的5’端的3’催化性I型內含子片段識別的3’外顯子序列，以及可被側接於編碼所述抗原多肽的核酸序列的3’端的5’催化性I型內含子片段識別的5’外顯子序列。
  19. 一種組合物，其包含多個如請求項1至18中任一項所述的circRNA，其中對應於多個circRNA的抗原多肽彼此不同。
  20. 如請求項19所述的組合物，其中所述多個circRNA靶向多個SARS-CoV-2變體。
  21. 一種circRNA疫苗，其包含如請求項1至18中任一項所述的circRNA或者如請求項19或20所述的組合物。
  22. 一種藥物組合物，其包含如請求項1至18中任一項所述的circRNA和藥學上可接受的載體。
  23. 如請求項21所述的circRNA疫苗或如請求項22所述的藥物組合物，其進一步包含轉染劑。
  24. 如請求項23所述的circRNA疫苗或藥物組合物，其中所述轉染劑是聚乙烯亞胺（PEI）或脂質納米顆粒（LNP）。
  25. 如請求項21所述的circRNA疫苗或如請求項22所述的藥物組合物，其中circRNA不與轉染劑一起配製。
  26. 一種治療或預防個體SARS-CoV-2感染的方法，其包括向所述個體施用有效量的如請求項1至18中任一項所述的circRNA、如請求項19至20中任一項所述的組合物、如請求項22至25中任一項的所述藥物組合物、或如請求項21及23至25中任一項所述的circRNA疫苗。
  27. 如請求項26所述的方法，其中所述SARS-CoV-2感染是由SARS-CoV-2變體引起的。
  28. 如請求項27所述的方法，其中所述SARS-CoV-2感染是由SARS-CoV-2的德爾塔或奧密克戎變體引起的。
  29. 如請求項26至28中任一項所述的方法，其中所述circRNA在個體中通過核糖體進行滾環翻譯。
  30. 如請求項26至29中任一項所述的方法，其中所述circRNA以裸circRNA的形式施用。
  31. 如請求項26至30中任一項所述的方法，其中施用所述circRNA兩次或更多次，並且每次施用之間的間隔時間超過兩周。
  32. 一種線性RNA，其能夠形成如請求項1至18中任一項所述的circRNA。
  33. 一種核酸構建體，其包含編碼如請求項32所述的線性RNA的核酸序列，任選地包含與所述核酸序列可操作地連接的T7啟動子。
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