TW202428289A - 環狀rna組合物 - Google Patents

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Abstract

本文提供包含IRES及至少一個編碼結合分子之表現序列的環狀RNA構築體、其組合物及治療方法，包括用於癌症及自體免疫疾病。特定言之，提供包含IRES及CD19結合子、HER2結合子或BCMA結合子之環狀RNA，視情況與遞送媒劑一起調配。本文中亦描述包含IRES及至少一個編碼CAR構築體之表現序列的前驅體聚核苷酸。

Description

環狀RNA組合物
環狀RNA (circRNA或oRNA™)為已知穩定形式之RNA，其在結構及功能方面，尤其在易於摺疊成非活性構形之分子的情況下提供與線性RNA相比之優勢(Wang and Ruffner, 1998)。環狀RNA聚核苷酸缺乏核酸外切酶介導之降解所必需的自由端，使其對若干RNA降解機制具有抗性，且與等效的線性RNA相比時半衰期延長。環化可允許一般受短半衰期影響之RNA聚核苷酸穩定化且可在各種應用中改進外源性mRNA之總體功效。尤其引起關注且適合的是，環狀RNA亦可用於活體內應用，尤其在基於RNA之基因表現控制以及包括蛋白質替代療法及疫苗接種之治療學的研究領域中。
授受性T細胞免疫療法為快速發展的領域，尤其在癌症治療方面。一般而言，表現CD19之癌症細胞的嵌合抗原受體(CAR) T細胞或「CAR-T」接合引起T細胞活化、發炎性細胞介素及趨化介素之增殖及分泌，從而引起腫瘤細胞溶解。然而，雖然CAR-T療法在癌症治療中已成為重要工具，但其具有毒性副作用且涉及複雜程序。用CAR-T治療可引起細胞介素大量且快速釋放至血液中，且可引起細胞介素釋放症候群(CRS)或CAR-T細胞相關之腦病症候群(CRES)，亦稱為與CAR-T相關之神經毒性。CRS為與CAR-T療法相關之最常見及描述最清楚之毒性，其在超過90%之處於任何級別之患者中發生且特徵在於高熱、低血壓、低氧及/或多器官毒性，且可能導致死亡。神經毒性之特徵在於神經組織之損傷，可引起震顫、腦病、眩暈或癲癇。另外，在輸注之前，患者一般經歷淋巴球耗乏。已知淋巴球耗乏藉由例如改變腫瘤表現型及微環境來增加CAR-T細胞擴增及輸注之CAR-T細胞的增強之功效。然而，淋巴球耗乏劑通常對患者產生副作用。舉例而言，淋巴球耗乏可引起嗜中性白細胞減少症、貧血、血小板減少症及免疫抑制，引起較大感染風險以及其他毒性。除了與靶向CAR-T療法相關之毒性之外，亦存在涉及產生經修飾之淋巴球的程序、特定設備及成本。CAR-T療法需要一系列方案以在將其輸注回患者之前分離、基因修飾及選擇性地擴增經重新導向之細胞。
在用於難治性全身性紅斑性狼瘡症之同情使用抗CD19 CAR-T細胞療法中，來自五名SLE患者之自體性T細胞「經慢病毒抗CD19 CAR載體轉導，擴增且再輸注等至經氟達拉賓(fludarabine)及環磷醯胺(cyclophosphamide)之淋巴球耗乏之後的患者中。活體內擴增之CAR T細胞引起B細胞之深度耗乏、臨床症狀之改善及實驗室參數之標準化，包括抗雙股DNA抗體之血清轉化。3個月之後在所有五名患者中實現根據DORIS準則之SLE緩解，且3個月之後中值(範圍)全身性紅斑性狼瘡症疾病活性指數評分為0(2)。」參見Mackensen等人, Anti-CD19 CAR T cell therapy for refractory systemic lupus erythematosus, Nature Medicine (2022)；亦參見Nunez等人, Cytokine and reactivity profiles in SLE patients following anti-CD19 CART therapy, Molecular Therapy (2023)。
因為環狀RNA更穩定且可以組織特異性方式表現，且因為使用環狀RNA可避免傳統療法之淋巴球耗乏步驟，所以環狀RNA提供對傳統CAR療法及其他療法之引人注目之替代方案。因此，本文提供包含內部核糖體進入位點(IRES)及至少一個編碼結合分子之表現序列的環狀RNA構築體。在某些實施例中，結合分子編碼靶向癌症抗原之CAR，用於治療癌症。環狀RNA可與轉移媒劑一起調配以促進及/或增強環狀RNA向一或多個目標細胞之遞送及釋放。因此，脂質奈米粒子(LNP)或含有可離子化脂質之其他轉移媒劑可用於將本文所描述之環狀RNA遞送至例如需要治療之患者。
本發明提供編碼與脂質轉移媒劑配對之癌症結合多肽的環狀RNA用於治療癌症。特定言之，本發明提供包含IRES及編碼結合分子之核酸的環狀RNA，其中該IRES及編碼結合分子之核酸經配對以實現多肽結合分子之最佳表現。已出人意料地發現，某些IRES及核酸組合比其他者更佳地用於最佳表現。進一步發現某些轉移媒劑可與某些IRES/結合分子組合更好地起作用。因此，本文提供IRES/編碼結合分子之核酸/轉移媒劑的尤其較佳組合。在一些實施例中，本文所提供之環狀RNA可用於治療或預防癌症。在一些實施例中，本文提供之環狀RNA可用於治療或預防自體免疫疾病，例如B細胞介導之自體免疫疾病，例如狼瘡。
在一些實施例中，經工程化之嵌合抗原受體(CAR)係由環狀RNA編碼，且可在經由脂質轉移媒劑遞送之後經由經工程化之環狀RNA (circRNA或oRNA)插入至包括T細胞、NK細胞、巨噬細胞等之免疫細胞中且由其表現。在一些實施例中，CAR可識別特異性抗原(例如，CD19、HER2或BCMA)，且當結合於彼抗原時，活化免疫細胞以攻擊及破壞細胞。本文之環狀RNA、組合物及方法因此適用於藉由程式化具有腫瘤識別能力之循環的免疫細胞，例如T細胞及藉由使用脂質轉移媒劑(例如，LNP)來減少與CAR-T療法相關之已知副作用，以遞送可有效引入CAR基因至免疫細胞之環狀RNA構築體。亦提供用於製造此類環化RNA構築體之方法，以及使用環狀RNA治療有需要之個體的方法。提供線性前驅體RNA聚核苷酸以用於製備包含核心功能元件之環狀RNA構築體，該核心功能元件包含轉譯起始元件(TIE)。TIE可包含非轉譯區(UTR)、適體複合體或其組合。UTR可完全或部分來自病毒或真核mRNA。UTR可包含病毒或真核內部核糖體進入位點(IRES)。亦提供醫藥組合物用於包含IRES、表現序列及視情況包含轉移媒劑之線性前驅體及環狀RNA構築體。在某些實施例中，環狀RNA構築體包含編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列。本發明之醫藥組合物尤其適合於活體內免疫細胞中之高效蛋白質表現。轉移媒劑可包含例如能夠囊封環狀RNA之可離子化脂質、經PEG改質之脂質、輔助脂質及/或結構性脂質。
因此，提供以下實施例： 實施例1.一種環狀RNA構築體，其包含： (A) IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)至少一個編碼結合分子之表現序列。 實施例2.一種環狀RNA構築體，其包含： (A) IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之嵌合抗原受體(CAR)之表現序列。 實施例3.一種環狀RNA構築體，其包含： (A) IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子。 實施例4.如實施例3之環狀RNA構築體，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 19-34中之任一者之序列至少80%一致的序列。 實施例5.一種環狀RNA構築體，其包含： (A) IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，其中該CAR構築體包含BCMA結合子。 實施例6.如實施例5之環狀RNA構築體，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 103-115中之任一者之序列至少80%一致的序列。 實施例7.一種環狀RNA構築體，其包含： (A)選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 (B)至少一個編碼結合分子之表現序列。 實施例8.一種環狀RNA構築體，其包含： (A)選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之嵌合抗原受體(CAR)之表現序列。 實施例9.一種環狀RNA構築體，其包含： (A)選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子。 實施例10.如實施例9之環狀RNA構築體，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 19-34中之任一者之序列至少80%一致的序列。 實施例11.一種環狀RNA構築體，其包含： (A)選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，其中該CAR構築體包含BCMA結合子。 實施例12.如實施例11之環狀RNA構築體，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 103-115中之任一者之序列至少80%一致的序列。 實施例13.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼結合分子之表現序列，及 (B)轉移媒劑。 實施例14.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，及 (B)轉移媒劑。 實施例15.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼結合分子之表現序列，及 (B)轉移媒劑。 實施例16.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，及 (B)轉移媒劑。 實施例17.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼結合分子之表現序列，及 (B)包含可離子化脂質之轉移媒劑。 實施例18.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，及 (B)包含可離子化脂質之轉移媒劑。 實施例19.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子，及 (B)包含可離子化脂質之轉移媒劑。 實施例20.如實施例19之醫藥組合物，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 19-34中之任一者之序列至少80%一致的序列。 實施例21.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，其中該CAR構築體包含BMCA結合子，及 (B)包含可離子化脂質之轉移媒劑。 實施例22.如實施例21之醫藥組合物，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 103-115中之任一者之序列至少80%一致的序列。 實施例23.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼結合分子之表現序列，及 (B)包含可離子化脂質之轉移媒劑。 實施例24.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，及 (B)包含可離子化脂質之轉移媒劑。 實施例25.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子，及 (B)包含可離子化脂質之轉移媒劑。 實施例26.如實施例25之醫藥組合物，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 19-34中之任一者之序列至少80%一致的序列。 實施例27.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，其中該CAR構築體包含BMCA結合子，及 (B)包含可離子化脂質之轉移媒劑。 實施例28.如實施例27之醫藥組合物，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 103-115中之任一者之序列至少80%一致的序列。 實施例29.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼結合分子之表現序列，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。 實施例30.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。 實施例31.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。 實施例32.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子，及其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 19-34中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。 實施例33.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含BCMA結合子，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。 實施例34.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含抗BCMA結合子，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 103-115中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。 實施例35.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼結合分子之表現序列，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。 實施例36.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。 實施例37.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。 實施例38.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含抗CD19結合子，且其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 19-34中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。 實施例39.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含BCMA結合子，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。 實施例40.一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含抗BCMA結合子，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 103-115中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。 實施例41.如實施例1-4、7-10、13-20、23-26、29-32及35-38中任一項之醫藥組合物，其中該CAR構築體包含CD19結合子，及其中該環狀RNA包含與選自SEQ ID NO: 50-61中之任一者之序列至少80%一致的序列。 實施例42.如實施例1-4、7-10、13-20、23-26、29-32及35-38中任一項之醫藥組合物，其中該CAR構築體包含CD19結合子，及其中該環狀RNA包含選自SEQ ID NO: 50-61中之任一者之序列。 實施例43.如實施例42之醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含選自SEQ ID NO: 50、51、52、54、55、56、58及59中之任一者之序列。 實施例44.一種醫藥組合物，其包含環狀RNA構築體及轉移媒劑，其中該環狀RNA構築體包含IRES及至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子，其中該環狀RNA包含與選自SEQ ID NO: 50-61中之任一者之序列至少80%一致的序列。 實施例45.一種醫藥組合物，其包含環狀RNA構築體及轉移媒劑，其中該環狀RNA構築體包含IRES及至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子，其中該環狀RNA構築體包含選自SEQ ID NO: 50-61中之任一者之序列。 實施例46.如實施例45之醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含選自SEQ ID NO: 50、51、52、54、55、56、58及59中之任一者之序列。 實施例47.一種醫藥組合物，其包含環狀RNA構築體及轉移媒劑，其中該環狀RNA構築體包含IRES及至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子，其中該環狀RNA包含與選自SEQ ID NO: 50-61中之任一者之序列至少80%一致的序列，且其中該轉移媒劑包含： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。 實施例48.一種醫藥組合物，其包含環狀RNA構築體及轉移媒劑，其中該環狀RNA構築體包含IRES及至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子，其中該環狀RNA包含與選自SEQ ID NO: 50-61中之任一者之序列，且其中該轉移媒劑包含： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。 實施例49.如實施例48之醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含選自SEQ ID NO: 50、51、52、54、55、56、58及59中之任一者之序列。 實施例50.如實施例1至49中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含SEQ ID NO: 50。 實施例51.如實施例1至49中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含SEQ ID NO: 51。 實施例52.如實施例1至49中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含SEQ ID NO: 52。 實施例53.如實施例1至49中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含SEQ ID NO: 54。 實施例54.如實施例1至49中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含SEQ ID NO: 55。 實施例55.如實施例1至49中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含SEQ ID NO: 56。 實施例56.如實施例1至49中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含SEQ ID NO: 58。 實施例57.如實施例1至49中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含SEQ ID NO: 59。 實施例58.如實施例5-6、21-22、27、28、33-34或39-40中任一項之醫藥組合物，其中該IRES包含SEQ ID NO: 8之序列，其中該CAR構築體包含BCMA結合子，且其中該BCMA結合子包含選自SEQ ID NO: 104-115中之任一者的序列。 實施例59.如實施例13-58中任一項之醫藥組合物，其中該轉移媒劑包含式(I)之可離子化脂質。 實施例60.如實施例59之醫藥組合物，其中該轉移媒劑包含輔助脂質、結構性脂質及PEG脂質。 實施例61.如實施例59-60中任一項之醫藥組合物，其中該轉移媒劑具有表4b所描述之脂質莫耳比調配物。 實施例62.如實施例13-58中任一項之醫藥組合物，其中該轉移媒劑包含式(II)之可離子化脂質。 實施例63.如實施例62之醫藥組合物，其中該可離子化脂質選自選自以下之可離子化脂質： 。 實施例64.如實施例63之醫藥組合物，其中該可離子化脂質為： 。 實施例65.如實施例13-64中任一項之醫藥組合物，其中該轉移媒劑進一步包含選自輔助脂質、結構性脂質及經PEG改質之脂質的至少一種脂質。 實施例66.如實施例65之醫藥組合物，其中該轉移媒劑包含PEG-DSPC。 實施例67.如實施例13-66中任一項之醫藥組合物，其中該轉移媒劑為脂質奈米粒子。 實施例68.如實施例13-67中任一項之醫藥組合物，其中該轉移媒劑進一步包含靶向部分。 實施例69.如實施例68之醫藥組合物，其中該靶向部分為小分子、scFv、奈米抗體、肽、環狀肽、二環狀肽或三環狀肽、微型抗體、聚核苷酸適體、經工程化之骨架蛋白、重鏈可變區、輕鏈可變區，或其片段。 實施例70.如實施例13至69中任一項之醫藥組合物，其進一步包含醫藥鹽、緩衝劑、稀釋劑或其組合。 實施例71.如前述實施例中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA進一步包含polyA區。 實施例72.如前述實施例中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA進一步包含至少一個miRNA結合位點。 實施例73.如實施例72之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA包含至少一個miR-122結合位點。 實施例74.如前述實施例中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該至少一個編碼CAR之表現序列經密碼子最佳化。 實施例75.如前述實施例中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該RNA構築體進一步包含5'增強型內含子元件、5'增強型外顯子元件、3'增強型外顯子元件及3'增強型內含子片段。 實施例76.一種製備如前述實施例中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物之方法。 實施例77.一種治療個體之癌症的方法，其藉由投與有效量之包含如實施例1至75中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物的組合物，由此治療該癌症。另外，一種治療個體之自體免疫疾病之方法，其藉由投與有效量之包含如實施例1至75中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物的組合物，由此治療該自體免疫疾病。 實施例78.一種包含如實施例1至75中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物之組合物的用途，其用於治療癌症。另外，使用包含如實施例1至75中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物之組合物治療自體免疫疾病。 實施例79.一種線性前驅體RNA聚核苷酸，其包含： (A) IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)至少一個編碼結合分子之表現序列。 實施例80.一種線性前驅體RNA聚核苷酸，其包含： (A) IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列。 實施例81.一種線性前驅體RNA聚核苷酸，其包含： (A) IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子。 實施例82.如實施例81之線性前驅體RNA聚核苷酸，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 19-34中之任一者之序列至少80%一致的序列。 實施例83.一種線性前驅體RNA聚核苷酸，其包含： (A) IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含BCMA結合子。 實施例84.如實施例83之線性前驅體RNA聚核苷酸，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 103-115中之任一者之序列至少80%一致的序列。 實施例85.一種線性前驅體RNA聚核苷酸，其包含： (A)選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 (B)至少一個編碼結合分子之表現序列。 實施例86.一種線性前驅體RNA聚核苷酸，其包含： (A)選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列。 實施例87.一種線性前驅體RNA聚核苷酸，其包含： (A)選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子。 實施例88.如實施例87之線性前驅體RNA聚核苷酸，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 19-34中之任一者之序列至少80%一致的序列。 實施例89.一種線性前驅體RNA聚核苷酸，其包含： (A)選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含BCMA結合子。 實施例90.如實施例89之線性前驅體RNA聚核苷酸，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 103-115中之任一者之序列至少80%一致的序列。 實施例91.如實施例79至90中任一項之線性前驅體RNA聚核苷酸，其中該表現序列經密碼子最佳化。 實施例92.如實施例79至91中任一項之線形前驅體RNA聚核苷酸，其進一步包含5'增強型內含子元件、5'增強型外顯子元件、3'增強型外顯子元件及3'增強型內含子片段。 實施例93.如實施例92之線性前驅體RNA聚核苷酸，其包含以下次序： (A)該5'增強型內含子元件， (B)該5'增強型外顯子元件， (C)包含IRES及至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列及視情況包含終止密碼子或終止卡匣的核心功能元件， (D)該3'增強型外顯子元件，及 (E)該3'增強型內含子元件。 實施例94.如實施例79至93中任一項之線性前驅體RNA聚核苷酸，其進一步包含至少一個miRNA結合位點。 實施例95.如實施例94之線性前驅體RNA聚核苷酸，其中該前驅體RNA包含至少一個miR-122結合位點。 實施例96.一種DNA載體，其編碼如實施例79至95中任一項之RNA聚核苷酸。 實施例97.一種製備環狀RNA構築體之方法，該方法包含在適合環化之條件下培育如實施例79至95中任一項之線性RNA聚核苷酸。 實施例98.一種醫藥組合物，其包含環狀RNA構築體及轉移媒劑，其中該環狀RNA構築體包含(i) IRES，其包含選自SEQ ID NO: 1、2、4及8中之任一者之序列，及(ii)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含含有選自SEQ ID NO: 19及20中之任一者之序列的CD19結合子，且其中該轉移媒劑為脂質奈米粒子。 實施例99.一種醫藥組合物，其包含環狀RNA構築體及轉移媒劑，其中該環狀RNA構築體包含(i) IRES，其包含選自SEQ ID NO: 8、16、17及18中之任一者之序列，及(ii)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含含有SEQ ID NO: 115之CD19結合子，且其中該轉移媒劑為脂質奈米粒子。 實施例100.一種醫藥組合物，其包含環狀RNA構築體及轉移媒劑，其中該環狀RNA構築體包含(i) IRES，其包含選自SEQ ID NO: 8、16、17及18中之任一者之序列，及(ii)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含含有選自SEQ ID NO: 132或133中之任一者之核苷酸序列的HER2結合子，且其中該轉移媒劑為脂質奈米粒子。 實施例101.如實施例98至100中任一項之醫藥組合物，其中該脂質奈米粒子包含：(i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。 實施例102.如實施例101之醫藥組合物，其中該脂質奈米粒子轉移媒劑包含可離子化脂質，其中該可離子化脂質為 。 實施例103.如實施例98-102中任一項之醫藥組合物，其中脂質奈米粒子轉移媒劑進一步包含選自輔助脂質、結構性脂質及經PEG改質之脂質的至少一種脂質。 實施例104.一種治療癌症之方法，其包含向有需要之人類個體投與如實施例98至103中任一項之醫藥組合物。 實施例105.一種治療自體免疫疾病之方法，其包含向有需要之人類個體投與如實施例98至103中任一項之醫藥組合物。 實施例106.一種包含環狀RNA構築體之組合物用於治療癌症的用途，其包含向有需要之人類個體投與如實施例98至103中任一項之醫藥組合物。 實施例107.一種包含環狀RNA構築體之組合物用於治療自體免疫疾病的用途，其包含向有需要之人類個體投與如實施例98至103中任一項之醫藥組合物。 實施例108.如實施例77或實施例104或105之方法或如實施例106或107之用途，其中該投與每天、每隔一天、一週兩次、每週、每十天、每兩週、每三週、每四週、一月一次、每六週、每八週、每三個月、每四個月、每六個月、每八個月、每九個月或每年進行。
相關申請案的交叉參考
本申請案主張於2022年11月8日申請之美國臨時申請案第63/423,760號、2023年5月12日申請之美國臨時申請案第63/501,820號及2023年6月21日申請之美國臨時申請案第63/509,361號之優先權，其中之每一者出於任何目的以全文引用之方式併入本文中。
現將詳細參考本發明之某些實施例，其實例在附圖中加以說明。儘管本發明結合所說明之實施例加以描述，但應理解其不意欲將本發明限於彼等實施例。相反，本發明意欲涵蓋所有替代方案、修改及等效物，其可如所附申請專利範圍及包括之實施例所定義包括於本發明內。
在詳細描述本教示內容之前，應瞭解，本發明不限於特定組合物或方法步驟，因而可加以改變。應注意，除非上下文另外明確規定，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個參考物。因此，舉例而言，提及「一嚮導」包括複數個嚮導，且提及「一細胞」包括複數個細胞及其類似物。
數值範圍包括界定該範圍之數字。考慮到有效數位及與量測有關之誤差，所量測及可量測值應理解為大致的。此外，「包含(comprise/comprises/comprising)」、「含有(contain/contains/containing)」及「包括(include/includes/including)」之使用不希望具有限制性。應理解，前述一般描述與詳細描述僅為例示性及解釋性的且並不限制教示內容。
除非在本說明書中特定指出，否則在本說明書中敍述「包含」各種組分之實施例亦涵蓋為「由所敍述之組分組成」或「基本上由所敍述之組分組成」；在本說明書中敍述「由各種組分組成」之實施例亦涵蓋為「包含」所敍述之組分或「基本上由所敍述之組分組成」；且在本說明書中敍述「基本上由各種組分組成」之實施例亦涵蓋為「由所敍述之組分組成」或「包含」所敍述之組分(此互換性並不適用於此等術語在申請專利範圍中之使用)。除非上下文另外明確說明，否則術語「或(or)」以包括性意義使用，亦即等於「及/或(and/or)」。
本文所用之章節標題僅出於組織目的而不應解釋為以任何方式限制所需主題。在以引用的方式併入之任何材料與本說明書中所定義之任何術語或本說明書之任何其他表述內容相矛盾之情況下，以本說明書為準。儘管本發明之教示係與各種實施例結合描述，但並不意欲使本發明之教示限制於此類實施例。相反，如熟習此項技術者將瞭解，本教示內容涵蓋各種替代方案、修改及等效物。 I.定義
除非另外說明，否則如本文所用之以下術語及片語意欲具有以下含義：
如本文所用，術語「環狀RNA」、「環狀多核糖核苷酸」、「環狀RNA」、「環化RNA」或「oRNA」可互換使用且係指單股RNA聚核苷酸，其中通常存在於線性RNA聚核苷酸中之3'及5'端已連接在一起。
如本文所用，術語「DNA模板(DNA template)」係指能夠轉錄線性RNA聚核苷酸之DNA序列。舉例而言但不意欲為限制的，DNA模板可包括DNA載體、PCR產物或質體。
如本文所使用之術語「3'第I組內含子片段(3' group I intron fragment)」係指與包括剪接位點二核苷酸及視情況選用之一連串天然外顯子序列之天然第I組內含子之3'近端具有75%或更高類似性的序列。在一些實施例中，環狀RNA包含剪接後3'第I組內含子片段。在一些實施例中，環狀RNA中之剪接後3'第I組內含子片段為外顯子序列之剪接後延伸段。在一些實施例中，環狀RNA進一步包含所需表現序列，且外顯子序列之剪接後延伸段(例如，經設計)為所需表現序列之一部分，與所需表現序列相鄰，及/或在具有所需表現序列之框架中。
如本文所使用之術語「5'第I組內含子片段(5' group I intron fragment)」係指與包括剪接位點二核苷酸及視情況選用之一連串天然外顯子序列之天然第I組內含子之5'近端具有75%或更高類似性的序列。在一些實施例中，環狀RNA包含剪接後5' I組內含子片段。在一些實施例中，環狀RNA中之剪接後5' I組內含子片段為外顯子序列之剪接後延伸段。在一些實施例中，環狀RNA進一步包含所需表現序列，且外顯子序列之剪接後延伸段(例如，經設計)為所需表現序列之一部分，與所需表現序列相鄰，及/或在具有所需表現序列之框架中。
如本文所用，術語「排列位點(permutation site)」係指其中在內含子排列之前進行切割之第I組內含子中之位點。此切割產生3'及5'第I組內含子片段，該等片段經排列以處於待環化之一連串前驅體RNA之任一側上。
如本文所用，術語「剪接位點(splice site)」係指部分或完全包括於第I組內含子中且在其間磷酸二酯鍵在RNA環化期間裂解之二核苷酸。(如本文所用，「剪接位點」係指在剪接反應期間發生磷酸二酯鍵裂解的一或多個二核苷酸。「5'剪接位點」係指內含子，例如第I組內含子之天然5'二核苷酸，而「3'剪接位點」係指內含子之天然3'二核苷酸)。
如本文所用，術語「表現序列(expression sequence)」係指編碼例如肽或多肽之產物或調節核酸或非編碼核酸之核酸序列。例示性編碼肽或多肽之表現序列可包含複數個核苷酸三分體，該複數個核苷酸三分體中之各者可編碼胺基酸且稱為「密碼子」。
如本文所用，「編碼元件」或「編碼區」為位於一或多種蛋白質或多肽(例如，治療性蛋白質)之表現序列及編碼內的區域。
如本文所使用之「非編碼元件(noncoding element)」、「非編碼區域(noncoding region)」或「非編碼核酸(non-coding nucleic acid/noncoding nucleic acid)」為位於表現序列內之區域。此序列本身不編碼蛋白質或多肽，而是可具有其他調節功能，包括(但不限於)允許整個聚核苷酸充當特定細胞之生物標記物或佐劑。
如本文所用，術語「治療蛋白(therapeutic protein)」係指當以經轉譯核酸形式直接或間接地向個體投與時具有治療性、診斷性及/或預防性作用及/或引發所需生物作用及/或藥理作用之任何蛋白質。
如本文所用，術語「免疫原性(immunogenic)」係指誘導針對物質之免疫反應之潛能。當生物體之免疫系統或某一類型免疫細胞暴露於免疫原性物質時可誘導免疫反應。術語「非免疫原性(non-immunogenic)」係指不具有或不存在高於可偵測臨限值之針對物質之免疫反應。當生物體之免疫系統或某一類型之免疫細胞暴露於非免疫原性物質時，未偵測到免疫反應。在一些實施例中，當藉由免疫原性分析量測時，如本文所提供之非免疫原性環狀聚核糖核苷酸不誘導高於預定臨限值之免疫反應。在一些實施例中，當生物體之免疫系統或某一類型之免疫細胞暴露於如本文提供之非免疫原性環狀聚核糖核苷酸時，未偵測到先天性免疫反應。在一些實施例中，當生物體之免疫系統或某一類型之免疫細胞暴露於如本文所提供之非免疫原性環狀聚核糖核苷酸時，未偵測到後天性免疫反應。
如本文所用，術語「轉譯效率(translation efficiency)」係指自核糖核苷酸轉錄本產生蛋白質或肽之速率或量。在一些實施例中，轉譯效率可表示為每既定量之編碼蛋白質或肽之轉錄本的所產生蛋白質或肽之量。
術語「核苷酸」係指核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、其經修飾形式或其類似物。核苷酸包括包含例如腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤之嘌呤及其衍生物及類似物，以及例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶之嘧啶及其衍生物及類似物的物種。核苷酸類似物包括在鹼基、糖及/或磷酸酯之化學結構中具有修飾的核苷酸，包括但不限於5'-位置嘧啶修飾、8'-位置嘌呤修飾、胞嘧啶外環胺之修飾及5-溴-尿嘧啶之取代；及2'-位置糖修飾，包括但不限於糖修飾之核糖核苷酸，其中2'-OH經諸如H、OR、R、鹵基、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN之基團置換，其中R為如本文所定義之烷基部分。核苷酸類似物亦意欲包括具有以下各者之核苷酸：鹼基，諸如肌苷、Q核苷、黃嘌呤；糖，諸如2'-甲基核糖；非天然磷酸二酯鍵聯，諸如甲基膦酸酯、硫代磷酸酯及肽鍵聯。核苷酸類似物包括5-甲氧基尿苷、1-甲基假尿苷及6-甲基腺苷。
「聚核苷酸」、「核酸」及「核酸分子」在本文中可互換使用以用於指包含核苷或核苷類似物之多聚體化合物，該等核苷或核苷類似物具有沿著主鏈連接在一起的含氮雜環鹼基或鹼基類似物，包括習知RNA、DNA、混合型RNA-DNA，及作為其類似物之聚合物。術語可用於描述由例如去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之核苷酸構成的例如大於約2個鹼基、大於約10個鹼基、大於約100個鹼基、大於約500個鹼基、大於1000個鹼基或多達約10,000或更多個鹼基之任何長度的聚合物，且可以酶方式或以合成方式產生(例如，如美國專利第5,948,902號及其中引用之參考文獻中所描述)，其可與天然存在之核酸以與兩種天然存在之核酸之方式類似的序列特異性方式雜交，例如可參與華特生-克里克鹼基配對(Watson-Crick base pairing)相互作用。核酸「主鏈(backbone)」可由多個鍵聯組成，其包括糖-磷酸二酯鍵聯、肽-核酸鍵聯(「肽核酸」或PNA；PCT第WO 95/32305號)、硫代磷酸酯鍵聯、甲基膦酸酯鍵聯或其組合中之一或多者。核酸之糖部分可為核糖、去氧核糖，或具有取代(例如2'甲氧基或2'鹵基取代)之類似化合物。含氮鹼基可為習知鹼基(A、G、C、T、U)、其類似物(例如經修飾之尿苷，諸如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷或其他)、肌苷、嘌呤或嘧啶之衍生物(例如N 4-甲基去氧鳥苷、去氮嘌呤或氮雜嘌呤、去氮嘧啶或氮雜嘧啶、在5位或6位處具有取代基之嘧啶鹼基(例如5-甲基胞嘧啶)、在2位、6位或8位處具有取代基之嘌呤鹼基、2-胺基-6-甲胺基嘌呤、O 6-甲基鳥嘌呤、4-硫基-嘧啶、4-胺基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶，及O 4-烷基-嘧啶；美國專利第5,378,825號及PCT第WO 93/13121號)。對於一般論述，參見The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams等人編, 第11版, 1992)。核酸可包括一或多個「無鹼基」殘基，其中主鏈不包括針對聚合物位置之含氮鹼基(美國專利第5,585,481號)。核酸可僅包含習知RNA或DNA糖、鹼基及鍵，或可包括習知組分及取代(例如具有2'甲氧基鍵之習知鹼基，或含有習知鹼基及一或多個鹼基類似物兩者的聚合物)兩者。本文揭示之所有核苷酸序列可表示RNA序列或對應DNA序列。應理解，DNA中之去氧胸苷(dT或T)經轉錄為RNA中之尿苷(U)。因此，在核苷酸序列中，「T」及「U」在本文中可互換地使用。
「寡核苷酸」為包含少於1000個核苷酸之聚核苷酸，諸如包含少於500個核苷酸或少於100個核苷酸之聚核苷酸。
如本文所用，術語「單內含子」、「單內含子序列」或「單內含子元件」可互換使用以係指位於聚核苷酸之5'或3'端，亦即來自介入區域之5'或3'端的前驅體RNA聚核苷酸區段。單內含子元件係指與天然第I組或第II組內含子(包括剪接位點二核苷酸)具有70%或更高相似性之序列。在一些實施例中，單內含子能夠促成允許其酶促自我裂解之核糖核酸酶活性。在一些實施例中，單內含子能夠與末端序列(亦即，含有剪接位點二核苷酸及視情況天然外顯子序列或其片段的序列)形成磷酸二酯鍵。在一些實施例中，末端序列在線性前驅體中位於單內含子上游。在一些實施例中，單內含子序列在線性前驅體中之末端序列上游。當末端序列在線性前驅體中位於單內含子上游時，單內含子可進行兩種轉酯化反應，例如依序自裂解及與末端序列形成磷酸二酯鍵。在末端序列在線性前驅體中位於單內含子上游之實施例中，(a)該單內含子能夠與能夠在該單內含子之5'端或接近該末端之剪接位點二核苷酸處裂解的親核試劑相互作用，及(b) (a) (亦即，5'剪接位點核苷酸，例如具有3'羥基)之裂解產物在該末端序列之剪接位點核苷酸處的酯基轉移反應(裂解)中接合，產生環狀RNA或oRNA。在此等實施例中，單內含子藉由與親核體形成結合袋而與親核體相互作用(例如，鳥苷，例如引入至前驅體之自由鳥苷)，且線性前驅體能夠採用構形，在構形中親核體接近於單內含子之5'端處或附近之剪接位點二核苷酸且能夠在該剪接位點二核苷酸處裂解。當單內含子在線性前驅體中之末端序列上游時，單內含子亦可進行兩個酯基轉移反應。在單內含子在線性前驅體中位於末端序列上游之實施例中，(a)該單內含子能夠與能夠在該末端元件之該剪接位點核苷酸處裂解的親核體相互作用，及(b) (a)，亦即該5'剪接位點核苷酸，例如具有3'羥基之裂解產物在該單內含子之3'端處或其附近之剪接位點二核苷酸處進行酯基轉移反應(裂解)，得到環狀RNA或oRNA。在此等實施例中，單內含子藉由與親核體形成結合袋而與親核體相互作用(例如，鳥苷，例如引入至前驅體之自由鳥苷)，且線性前驅體能夠採用構形，在構形中親核體接近於末端元件之剪接位點核苷酸且能夠裂解末端元件之剪接位點核苷酸。
在一些實施例中，單內含子包含天然第I組或第II組內含子之5'近端，包括剪接位點二核苷酸及視情況天然外顯子序列或其片段。在一些實施例中，單內含子之5'端係指在單內含子之5'半內的核苷酸。在一些實施例中，單內含子之3'端係指在單內含子之3'半內的核苷酸。在一些實施例中，在單內含子之5'端處或附近係指在單內含子之5'半內。在一些實施例中，在單內含子之5'端處或附近係指在單內含子中之前十個5'位內。在一些實施例中，在單內含子之5'端處係指單內含子中之前5'位。在一些實施例中，在單內含子之3'端處或附近係指在單內含子之3'半內。在一些實施例中，在單內含子之3'端處或附近係指在單內含子中最後十個3'位內。在一些實施例中，在單內含子之3'端處係指單內含子中之最後3'位。
如本文所用，術語「末端序列」或「末端元件」可互換使用以指代能夠與單內含子序列或單內含子元件複合之RNA序列。末端序列包含來自單內含子中存在之天然第I組或第II組內含子之剪接位點核苷酸。在一些實施例中，末端序列進一步包含天然外顯子或其片段及/或合成序列。
術語「親核體」係指能夠在剪接位點處引發親核攻擊及/或在剪接位點處進行酯基轉移反應(裂解)之親核核苷酸或核苷。
如本文所用，「polyA」意謂由包含腺嘌呤之核苷酸組成之聚核苷酸或聚核苷酸的一部分。如本文所用，「polyT」意謂由包含胸腺嘧啶之核苷酸組成之聚核苷酸或聚核苷酸的一部分。如本文所用，「polyAC」意謂由包含腺嘌呤或胞嘧啶之核苷酸組成之聚核苷酸或聚核苷酸的一部分。
「經分離」或「經純化」通常係指物質(例如在一些實施例中，化合物、聚核苷酸、蛋白質、多肽、聚核苷酸組合物或多肽組合物)之分離，使得物質占其所存在之樣品的顯著% (例如大於1%、大於2%、大於5%、大於10%、大於20%、大於50%或更多，通常至多約90%-100%)。在某些實施例中，實質上經純化之組分占樣品至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。在額外實施例中，實質上經純化之組分占樣品之約80%-85%或90%-95%、95%-99%、96%-99%、97%-99%或95%-100%。用於純化所關注之聚核苷酸及多肽之技術為此項技術中熟知的且包括例如離子交換層析法、親和層析法及根據密度之沉降。一般而言，當物質相對於樣品之其他組分以超過其天然存在之量的量存在於樣品中時，該物質經純化。
如本文所用，關於RNA之「非結構化(unstructured)」係指未藉由RNA結構預測工具預測與其自身或相同RNA分子中之其他序列形成結構(例如髮夾環)的RNA序列。在一些實施例中，非結構化RNA可使用核酸酶保護分析進行功能性表徵。
如本文所用，關於RNA使用之「結構化(structured)」係指藉由RNAFold軟體或類似預測工具預測與自身或相同RNA分子中之其他序列形成結構(例如髮夾環)的RNA序列。
如本文所用，兩個「雙螺旋體序列」、「雙螺旋體區(duplex region)」、「雙螺旋體區(duplex regions)」、「同源臂」或「同源區」可為熱力學上有利於在序列特異性相互作用中交叉配對之任何兩個區。在一些實施例中，兩個雙螺旋體序列、雙螺旋體區、同源臂或同源區與彼此之反向互補序列共用足夠含量之序列一致性以充當雜交反應之受質。如本文所使用，當聚核苷酸序列與反向互補序列或「互補」序列一致或共有序列一致性時，其具有「同源性」。同源區與對應同源區之反向互補序列之間的序列一致性百分比可為允許雜交發生之任何序列一致性百分比。在一些實施例中，本發明聚核苷酸之內部雙螺旋體區能夠與另一內部雙螺旋體區形成雙螺旋體且不與外部雙螺旋體區形成雙螺旋體。
如本文所用，「親和序列」或「親和標籤」為出於輔助聚核苷酸序列純化之目的含有重複集合之核苷酸的在1個核苷酸至數百或數千個核苷酸範圍內之聚核苷酸序列之區域。舉例而言，親和序列可包含但不限於polyA或polyAC序列。在一些實施例中，親和標籤用於在本文中稱為「親和純化」之純化方法中，其中結合劑與包含親和標籤之分子的選擇性結合便於與不包含親和標籤之分子進行分離。在一些實施例中，親和純化方法為「負向選擇」純化方法，其中選擇性結合且移除諸如線性RNA之不合需要之物種，且將諸如環狀RNA之合乎需要之物種溶離且與不合需要之物種分離。
如本文所用，「間隔子(spacer)」係指沿聚核苷酸序列分隔兩個其他元件之在1個核苷酸至數百或數千個核苷酸範圍內之聚核苷酸序列之區域。序列可為確定的或可為隨機的。間隔子通常為非編碼的。在一些實施例中，間隔子包括雙螺旋體區。
據稱線性核酸分子具有「5'-末端(5'端)」及「3'-末端(3'端)」，此係因為在取代基單核苷酸之糖部分之5'碳及3'碳處存在核酸磷酸二酯鍵聯。將與5'碳存在新鍵聯之聚核苷酸之末端核苷酸為其5'末端核苷酸。將與3'碳存在新鍵聯之聚核苷酸之末端核苷酸為其3'端核苷酸。如本文所用，末端核苷酸為3'末端或5'末端之末端位置處之核苷酸。
如本文所用，「前導非轉譯序列」為位於聚核苷酸序列之最上5'端處之在1個核苷酸至數百個核苷酸範圍內之聚核苷酸序列之區域。序列可為確定的或可為隨機的。前導非轉譯序列為非編碼的。
如本文所使用之「末端非轉譯序列(terminal untranslated sequence)」為位於聚核苷酸序列之最下3'端處之在1個核苷酸至數百個核苷酸範圍內之聚核苷酸序列之區域。序列可為確定的或可為隨機的。末端非轉譯序列為非編碼的。
「轉錄(transcription)」意謂使用DNA分子作為模板，由RNA聚合酶形成或合成RNA分子。本發明就用於轉錄之RNA聚合酶而言不受限制。舉例而言，在一些實施例中，可使用T7型RNA聚合酶。
「轉譯(translation)」意謂基於RNA模板，藉由核糖體形成多肽分子。
如本文所用，「內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site)」或「IRES」係指能夠在不存在典型RNA帽結構之情況下起始多肽轉譯之大小在10 nt至1000 nt或更大範圍內之RNA序列或結構元件。例示性IRES之長度可為約500 nt至約700 nt。
如本文中所使用，術語「約(about)」或「大致(approximately)」」意謂經由一般熟習此項技術者所測定之特定值的可接受誤差，其部分取決於如何量測或測定該值。除非明確陳述或自上下文顯而易見，否則如本文所用，術語「約」應理解為在此項技術中之一般公差範圍內，例如在平均值之2個標準差內。除非上下文另外明確說明，否則本文所提供之所有數值均由術語「約」來修飾。
如本文所用，術語「編碼(encode)」廣泛地指藉以使用聚合大分子中之資訊來導引不同於第一分子之第二分子產生的任何方法。第二分子可具有不同於第一分子之化學性質之化學結構。
如本文所用，「適體(aptamer)」一般指單一已確定序列之寡核苷酸或該等核苷酸之混合物，其中混合物保留特異性結合至目標分子(例如真核起始因子、40S核糖體、polyC結合蛋白、polyA結合蛋白、聚嘧啶束結合蛋白、阿耳戈(argonaute)蛋白家族、異質核核糖核蛋白K及La以及相關RNA結合蛋白)的特性。因此，如本文所用，「適體」指示如上文所定義之核苷酸之單個序列及複數個序列。術語「適體」意欲指能夠結合至蛋白質或其他分子之單股或雙股核酸。一般而言，適體較佳包含約10至約100個核苷酸，較佳約15至約40個核苷酸，更佳約20至約40個核苷酸，因為屬於此等範圍內之長度之寡核苷酸易於藉由習知技術製備。視情況而言，適體可進一步包含實現特異性結合所必需之最少大致6個核苷酸，較佳10個且更佳14或15個核苷酸。
如本文所使用，「miRNA位點」或「miRNA結合位點」係指能夠與天然miRNA序列之至少8個核苷酸形成雙螺旋體的聚核苷酸內之核苷酸的延伸段。
如本文所用，「雙順反子RNA (bicistronic RNA)」係指包括編碼兩個不同蛋白質之兩個表現序列的聚核苷酸。此等表現序列可藉由編碼諸如蛋白酶裂解位點之可裂解肽的核苷酸序列間隔開。其亦可藉由核糖體跳躍元件間隔開。
如本文所用，術語「核糖體跳躍元件(ribosomal skipping element)」係指能夠使得自一個RNA分子轉譯產生兩個肽鏈之編碼短肽序列之核苷酸序列。儘管不希望受理論束縛，但假設核糖體跳躍元件藉由以下起作用：(1)終止第一肽鏈之轉譯及再起始第二肽鏈之轉譯；或(2)由核糖體跳躍元件編碼之肽序列中之肽鍵藉由經編碼肽之內部蛋白酶活性或藉由環境(例如胞溶質)中之另一蛋白酶進行裂解。
如本文所用，術語「轉染(transfect)」或「轉染(transfection)」係指將一或多種經囊封材料(例如核酸及/或聚核苷酸)胞內引入細胞中，或較佳引入目標細胞中。術語「轉染效率(transfection efficiency)」係指藉由引入進行轉染之目標細胞中及/或由進行轉染之目標細胞表現而吸收之此類經囊封材料(例如聚核苷酸)之相對量。在一些實施例中，轉染效率可藉由轉染後目標細胞所產生之報導體聚核苷酸產物之量進行估計。在一些實施例中，轉移媒劑具有高轉染效率。在一些實施例中，轉移媒劑具有至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%轉染效率。
如本文所用，「轉移媒劑(transfer vehicle)」包括一般預期用於結合包括核酸之生物活性劑投與使用之標準醫藥載劑、稀釋劑、賦形劑及其類似者中之任一者。
如本文所用，片語「奈米粒子」係指例如直徑低於約1000 nm之遞送或轉移媒劑。奈米粒子可為脂質奈米粒子，且在本文之某些情況下，術語在本文中可互換使用。
如本文所使用之片語「LNP」或「脂質奈米粒子(lipid nanoparticle)」係指包含一或多種陽離子型脂質或可離子化脂質、穩定脂質、結構脂質及輔助脂質之轉移媒劑。
如本文所使用之片語「陽離子型脂質(cationic lipid)」或「可離子化脂質(ionizable lipid)」係指在諸如生理pH 4之選定pH下攜帶淨正電荷且在諸如生理pH 7之其他pH下攜帶中性電荷之多種脂質物種中的任一者。
在一些實施例中，本文所揭示之例如可離子化脂質之脂質包含一或多個可裂解基團。術語「裂解(cleave)」及「可裂解(cleavable)」在本文中用於意謂處於主題官能基中或與主題官能基相鄰之原子之間的一或多個化學鍵(例如共價鍵、氫鍵、凡得瓦爾力(van der Waals' force)及/或離子相互作用中之一或多者)在暴露於選定條件後(例如在暴露於酶條件後)斷裂(例如水解)或能夠斷裂。在某些實施例中，可裂解基團為二硫鍵官能基，且在特定實施例中為能夠在暴露於所選生物條件(例如細胞內條件)後裂解之二硫鍵基團。在某些實施例中，可裂解基團為能夠在暴露於選定生物條件後裂解之酯官能基。舉例而言，二硫鍵基可酶促裂解或藉由水解、氧化或還原反應裂解。在裂解該二硫鍵官能基之後，可釋放與其結合之一或多個官能部分或官能基(例如頭基及/或尾基中之一或多者)。例示性可裂解基團可包括但不限於二硫鍵基、酯基、醚基及其任何衍生物(例如烷基及芳基酯)。在某些實施例中，可裂解基團不為酯基或醚基。在一些實施例中，可裂解基團與一或多個官能部分或官能基(例如，至少一個頭基及至少一個尾基)結合(例如藉由氫鍵、凡得瓦爾力、離子相互作用及共價鍵中之一或多者結合)。在某些實施例中，官能部分或官能基中之至少一者為親水性的(例如包含咪唑、鈲、胺基、亞胺、烯胺、視情況經取代之烷基胺基及吡啶基中之一或多者的親水性頭基)。
如本文所用，術語「脂質體(liposome)」一般指由以一或多個球形雙層排列之脂質(例如兩親媒性脂質)構成的囊泡。此類脂質體可為單層或多層囊泡，該等囊泡具有由親脂性材料形成之膜及含有待遞送至一或多個目標細胞、組織及器官之經囊封環狀RNA的水性內部。在某些實施例中，本文所描述之組合物包含一或多種脂質奈米粒子。可用於形成涵蓋之脂質體及脂質奈米粒子之適合脂質(例如可離子化脂質)之實例包括本文所揭示之化合物中之一或多者(例如HGT4001、HGT4002、HGT4003、HGT4004及/或HGT4005)。此類脂質體及脂質奈米粒子亦可包含諸如以下之額外可離子化脂質：C12-200、DLin-KC2-DMA及/或HGT5001、輔助脂質、結構性脂質、經PEG修飾之脂質、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK-E12、ICE、HGT5000、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA、DMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、HGT4003及其組合。
如本文所用，片語「可生物降解脂質」或「可降解脂質」係指在宿主環境中在數分鐘、數小時或數天之數量級分解，從而理想地使其毒性較低且不太可能隨時間推移積聚於宿主中之多種脂質物種中的任一者。脂質之常見修飾尤其包括酯鍵及二硫鍵以提高脂質之可生物降解性。
如本文所使用之術語「結構脂質(structural lipid)」係指固醇以及含有固醇部分之脂質。
如本文所定義，「固醇(sterol)」為由類固醇組成之類固醇子組。
如本文所用，術語「PEG」意謂任何聚乙二醇或其他聚伸烷基醚聚合物。如本文中一般定義，「PEG-OH脂質(PEG-OH lipid)」(在本文中亦稱為「羥基-聚乙二醇化脂質」)為脂質上具有一或多個羥基(-OH)之聚乙二醇化脂質。如本文所用，片語「可生物降解PEG脂質(biodegradable PEG lipid)」或「可降解PEG脂質(degradable PEG lipid)」係指其中在宿主環境中在數分鐘、數小時或數天之數量級自脂質裂解PEG分子，從而理想地使其具有較低免疫原性之多種脂質物種中的任一者。PEG脂質之常見修飾尤其包括酯鍵及二硫鍵以提高脂質之可生物降解性。
如本文所用，術語「親水性(hydrophilic)」用於定性指示官能基偏好水且通常此類基團為水溶性的。舉例而言，本文中揭示包含結合至一或多個親水性基團(例如親水性頭基)之可裂解二硫鍵(S-S)官能基的化合物，其中此類親水性基團包含以下或選自由以下組成之群：咪唑、鈲、胺基、亞胺、烯胺、視情況經取代之烷基胺基(例如烷基胺基，諸如二甲胺基)及吡啶基。
在某些實施例中，包含本文所揭示之化合物之部分的官能基中之至少一者本質上為疏水性的(例如，包含天然存在之脂質，諸如膽固醇的疏水性尾基)。如本文所用，術語「疏水性(hydrophobic)」用於定性指示官能基避開水且通常此類基團不可溶於水。舉例而言，本文揭示化合物，其包含結合至一或多個疏水性基團之可裂解官能基(例如，二硫鍵(S-S)基團)，其中此類疏水性基團包含一或多種天然存在之脂質，諸如膽固醇，及/或視情況經取代、可變飽和或不飽和C6-C20烷基及/或視情況經取代、可變飽和或不飽和C6-C20醯基。
本文所描述之化合物亦可包含一或多種同位素取代。舉例而言，H可呈任何同位素形式，包括 1H、 2H (D或氘)及 3H (T或氚)；C可呈任何同位素形式，包括 12C、 13C及 14C；O可呈任何同位素形式，包括 16O及 18O；F可呈任何同位素形式，包括 18F及 19F；及其類似者。
除非另外規定，否則如本文所用，以下術語(若存在)具有以下含義。應理解，當在本文中描述時，下文定義之部分中之任一者可經多種取代基取代，且各別定義意欲將該等經取代之部分包括在其如下文所描述之範疇內。除非另外陳述，否則術語「經取代」應如下文所闡述地定義。應進一步理解，術語「基團(group及radical)」在本文中使用時視為可互換的。
當列舉值之範圍時，其意欲涵蓋該範圍內之各值及子範圍。舉例而言，「C 1 - 6烷基」意欲涵蓋C 1、C 2、C 3、C 4、C 5、C 6、C 1 - 6、C 1 - 5、C 1 - 4、C 1 - 3、C 1 - 2、C 2 - 6、C 2 - 5、C 2 - 4、C 2 - 3、C 3 - 6、C 3 - 5、C 3 - 4、C 4 - 6、C 4 - 5及C 5 - 6烷基。
如本文所用，術語「烷基」係指直鏈及分支鏈C1-C40烴(例如C6-C20烴)，且包括飽和烴及不飽和烴。在某些實施例中，烷基可包含一或多個環狀烷基及/或一或多個雜原子，諸如氧、氮或硫，且可視情況經取代基(例如烷基、鹵基、烷氧基、羥基、胺基、芳基、醚、酯或醯胺中之一或多者)取代。在某些實施例中，所考慮之烷基包括(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯。諸如「C6-C20」之名稱之使用意欲指具有所敍述範圍之碳原子之烷基(例如直鏈或分支鏈且包括烯烴及烷基)。在一些實施例中，烷基具有1至10個碳原子(「C1-10烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至9個碳原子(「C1-9烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至8個碳原子(「C1-C8烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至7個碳原子(「C1-7烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至6個碳原子(「C1-6烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至5個碳原子(「C1-5烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至4個碳原子(「C1-4烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至3個碳原子(「C1-3烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至2個碳原子(「C1-2烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1個碳原子(「C1烷基」)。C1-6烷基之實例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、戊基、己基及其類似基團。
如本文所使用之「烯基(alkenyl)」係指具有2至20個碳原子、一或多個碳-碳雙鍵(例如1、2、3或4個碳-碳雙鍵)及視情況選用之一或多個碳-碳參鍵(例如1、2、3或4個碳-碳參鍵)之直鏈或分支鏈烴基(「C2-20烯基」)。在某些實施例中，烯基不含任何三鍵。在一些實施例中，烯基具有2至10個碳原子(「C2-10烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至9個碳原子(「C2-9烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至8個碳原子(「C2-8烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至7個碳原子(「C2-7烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至6個碳原子(「C2-6烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至5個碳原子(「C2-5烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至4個碳原子(「C2-4烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至3個碳原子(「C2-3烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2個碳原子(「C2烯基」)。一或多個碳-碳雙鍵可以為內部的(諸如在2-丁烯基中)或末端的(諸如在1-丁烯基中)。C2-4烯基之實例包括乙烯基(C2)、1-丙烯基(C3)、2-丙烯基(C3)、1-丁烯基(C4)、2-丁烯基(C4)、丁二烯基(C4)及其類似基團。C2-6烯基之實例包括前述C2-4烯基以及戊烯基(C5)、戊二烯基(C5)、己烯基(C6)及類似基團。烯基之額外實例包括庚烯基(C7)、辛烯基(C8)、辛三烯基(C8)及其類似基團。
如本文所用，術語「芳基(aryl)」係指在環部分中含有六至十個碳之芳族基團(例如單環、雙環及三環結構)。芳基可視情況經由可用碳原子取代且在某些實施例中可包括一或多個雜原子，諸如氧、氮或硫。在一些實施例中，芳基具有六個環碳原子(「C6芳基」；例如苯基)。在一些實施例中，芳基具有十個環碳原子(「C10芳基」；例如萘基，諸如1-萘基及2-萘基)。
如本文所用，「雜芳基(heteroaryl)」係指在芳族環系統中提供有環碳原子及1-4個環雜原子之5-10員單環或雙環4n+2芳族環系統(例如在環狀陣列中共有6或10個電子)之基團，其中各雜原子獨立地選自氮、氧及硫(「5-10員雜芳基」)。在含有一或多個氮原子之雜芳基中，在價數允許時，連接點可為碳或氮原子。雜芳基雙環系統可以在一個或兩個環中包括一或多個雜原子。「雜芳基」包括如上文所定義之雜芳基環與一或多個碳環基或雜環基稠合之環系統，其中連接點在雜芳基環上，且在此等情況下，環成員之數量繼續指示雜芳基環系統中環成員之數量。「雜芳基」亦包括如上文所定義之雜芳基環與一或多個芳基稠合之環系統，其中連接點在芳基或雜芳基環上，且在此等情況下，環成員之數量指示稠合(芳基/雜芳基)環系統中環成員之數量。一個環不含雜原子(例如吲哚基、喹啉基、咔唑基及類似基團)之雙環雜芳基的連接點可以在任一環上，亦即，帶有雜原子之環(例如2-吲哚基)或不含雜原子之環(例如5-吲哚基)。
如本文所用，「雜環基」或「雜環」係指具有環碳原子以及1至4個環雜原子之3至10員非芳族環系統的基團，其中各雜原子獨立地選自氮、氧、硫、硼、磷及矽(「3-10員雜環基」)。在含有一或多個氮原子之雜環基中，在價數允許時，連接點可為碳或氮原子。雜環基可為單環(「單環雜環基」)或稠合、橋聯或螺環系統，諸如雙環系統(「雙環雜環基」)，且可為飽和的或可為部分不飽和的。雜環基雙環系統可以在一個或兩個環中包括一或多個雜原子。「雜環基」亦包括如上文所定義之雜環基環與一或多個碳環基稠合之環系統，其中連接點在碳環基或雜環基環上，或如上文所定義之雜環基與一或多個芳基或雜芳基稠合之環系統，其中連接點在雜環基環上，且在此等情況下，環成員之數量繼續指示雜環基環系統中之環成員之數量。術語「雜環(heterocycle)」、「雜環基(heterocyclyl)」、「雜環基環(heterocyclyl ring)」、「雜環基(heterocyclic group)」、「雜環部分(heterocyclic moiety)」及「雜環基(heterocyclic radical)」可互換地使用。
如本文所用，「氰基(cyano)」係指-CN。
如本文所用，術語「鹵基(halo)」及「鹵素(halogen)」係指選自氟(fluorine/fluoro，F)、氯(chlorine/chloro，Cl)、溴(bromine/bromo，Br)及碘(iodine/iodo，I)之原子。在某些實施例中，鹵基為氟或氯。
如本文所使用之術語「烷氧基(alkoxy)」係指經由氧原子連接至另一部分之烷基(-O(烷基))。非限制性實例包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基及丁氧基。
如本文所使用之「側氧基(oxo)」係指-C=O。
一般而言，術語「經取代」無論是否在術語「視情況」之前，意謂存在於基團(例如碳或氮原子)上之至少一個氫經可容許的取代基置換，例如取代後產生穩定化合物(例如不會諸如藉由重組、環化、消除或其他反應自發地經歷轉化之化合物)之取代基。除非另外指明，否則「經取代」之基團在該基團之一或多個可取代位置處具有取代基，且當任何給定結構中之多於一個位置經取代時，取代基在各位置處相同或不同。
如本文所用，「醫藥學上可接受之鹽」係指在合理醫學判斷範疇內，適合於與人類及低等動物之組織接觸使用而無過度毒性、刺激、過敏反應及類似情形且與合理效益/風險比相稱的鹽。醫藥學上可接受之鹽在此項技術中為吾人所熟知。舉例而言，Berge等人在J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1-19中詳細描述了醫藥學上可接受之鹽。醫藥學上可接受之鹽包括衍生自適合無機及有機酸及鹼之鹽。醫藥學上可接受之無毒酸加成鹽之實例為胺基與無機酸(諸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸及過氯酸)或有機酸(諸如乙酸、草酸、順丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、丁二酸或丙二酸)形成之鹽，或藉由使用此項技術中所用之其他方法(諸如離子交換)形成之鹽。其他醫藥學上可接受之鹽包括己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、甲酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、葡糖酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫碘化物、2-羥基-乙烷磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽及其類似鹽。衍生自適合的鹼之醫藥學上可接受之鹽包括鹼金屬、鹼土金屬、銨及N +(C 1 - 4烷基) 4鹽。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽及其類似者。適當時，其他醫藥學上可接受之鹽包括使用抗衡離子諸如鹵離子、氫氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低碳數烷基磺酸根及芳基磺酸根形成的無毒銨、四級銨及胺陽離子。
術語「組合物」或「調配物」係指呈准許其中所含活性成分之生物活性有效之形式且不含有對該組合物將投與之個體具有不可接受之毒性的額外組分的製劑。
如本文中所用，「抗原」係指引起免疫反應或能夠由抗體或抗原結合分子結合之任何分子。免疫反應可涉及抗體產生或特異性免疫勝任細胞之活化或兩者。熟習此項技術者將容易理解，任何巨分子，包括實際上所有蛋白質或肽均可充當抗原。抗原可內源性表現，亦即由基因體DNA表現，或可以重組方式表現。抗原可對諸如癌細胞之某一組織具有特異性，或其可經廣泛表現。另外，較大分子之片段可充當抗原。在一些實施例中，抗原為腫瘤抗原。
如本文中所使用，「治療(treatment)」(及其變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指針對個體中之疾病或病症之治療劑的任何投與或施用，且包括抑制疾病或疾病之發展(其可在正式診斷疾病之前或之後發生，例如在個體具有可能或很可能造成疾病發展之基因型的情況下)、遏制其發展、減輕疾病之一或多種症狀、治癒疾病或預防疾病之一或多種症狀復發。如本文中所使用，「治療」可包括投與治療劑或治療方案(包括視情況選用之佐劑或預處理方案)以達成治療或預防益處。如本文中所使用，「治療」亦涵蓋「緩解」，其係指對於表現型或症狀之任何有益作用，諸如降低其嚴重程度、減緩或延遲其發展、遏制其發展，或使其部分或完全逆轉或消除。
如本文所使用，「癌症」係指以體內異常細胞不受控制之生長為特徵的一大組疾病。不受調控細胞分裂及生長導致形成侵入鄰近組織且亦可經由淋巴系統或血流轉移至身體之遠端部分的惡性腫瘤。「癌症」或「癌症組織」可包括腫瘤。可藉由本文所揭示之方法治療之癌症之實例包括(但不限於)免疫系統之癌症，包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤及其他白血球惡性腫瘤。在一些實施例中，本文所揭示之方法可用於減小衍生自例如以下之腫瘤之腫瘤大小：骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌、睾丸癌、子宮癌、多發性骨髓瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、轉化型濾泡性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病、急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL) (包括非T細胞ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、兒童實體腫瘤、淋巴球性淋巴瘤、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊髓軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤；環境誘發型癌症，包括石棉誘發型癌症；其他B細胞惡性病；及該等癌症之組合。在一些實施例中，本文所揭示之方法可用於減小衍生自例如以下之腫瘤之腫瘤大小：肉瘤及癌瘤、纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、軟組織肉瘤及其他肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細胞癌、肺癌、大腸直腸癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌(例如胰臟腺癌、結腸腺癌、卵巢腺癌、肺腺癌、乳癌、胃腺癌、前列腺腺癌、子宮頸腺癌或食道腺癌)、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓質癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝腫瘤、膽管癌、絨毛膜癌、威耳姆氏腫瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睾丸腫瘤、膀胱癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、腎盂癌、CNS腫瘤(諸如神經膠質瘤、星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠細胞瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤及視網膜母細胞瘤)。特定癌症可對化學或放射治療有反應，或癌症可為難治性的。難治性癌症係指不適合於手術干預之癌症，且癌症起初對化學或放射治療無反應或癌症隨時間推移變得無反應。
如本文所用，「自體免疫疾病」係指針對個體自身組織及/或器官及/或由其引起之疾病或病症。自體免疫疾病之臨床及實驗室標記物為此項技術中已知的。例示性標記物包括(但不限於)高含量之自體抗體、抗原-抗體複合物沉積物(例如，個體組織中)、受影響組織中之淋巴細胞聚集體、高γ-球蛋白血症。例示性自體免疫疾病包括(但不限於)狼瘡，例如全身性紅斑狼瘡(SLE)、皮膚紅斑性狼瘡(CLE)、狼瘡性腎炎(LN)、抗合成酶症候群、多灶性運動神經病變、重症肌無力、視神經脊髓炎、尋常天疱瘡及全身性硬化症。在一些實施例中，自體免疫疾病為B細胞介導之疾病。自體免疫可與自體抗體產生、免疫複合物形成、樹突狀細胞活化、T細胞活化、細胞介素合成及/或趨化激素釋放相關。舉例而言，SLE為「危及生命的自體免疫疾病，其特徵為適應性免疫系統活化、雙股DNA自體抗體之形成及器官發炎」。Mackensen等人, Anti-CD19 CAR T cell therapy for refractory systemic lupus erythematosus, Nature Medicine (2022)。SLE可使用全身性紅斑性狼瘡症疾病活性指數及/或DORIS準則評估。同上。
如本文所使用之「抗腫瘤作用(anti-tumor effect)」係指可呈現為以下之生物作用：腫瘤體積減小、腫瘤細胞數目減少、腫瘤細胞增殖減少、轉移灶數目減少、總存活期或無惡化存活期延長、預期壽命延長或與腫瘤相關之各種生理症狀改善。抗腫瘤作用亦可指預防腫瘤出現，例如疫苗。
如本文中所使用，術語「投與」係指使用熟習此項技術者已知的各種方法及遞送系統中之任一者將藥劑物理引入至個體中。本文中所揭示之藥劑之例示性投藥途徑包括靜脈內、肌內、皮下、腹膜內、脊椎或其他非經腸投藥途徑，例如藉由注射或輸注。如本文所用，片語「非經腸投與」意謂通常藉由注射之除腸及局部投與之外的投與模式，且包括(但不限於)靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、淋巴管內、病灶內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸液，以及活體內電穿孔。在一些實施例中，本文中所揭示之藥劑可經由非-非經腸途徑(例如經口)投與。其他非-非經腸途徑包括體表、表皮或經黏膜投藥途徑，例如鼻內、經陰道、經直腸、舌下或體表。如本文中所使用之片語「全身性注射」非排他性地係關於靜脈內、腹膜內、皮下、經由鼻黏膜下層、經舌、經由支氣管鏡檢、靜脈內、動脈內、肌內、眼內、紋狀體內、皮下、皮內、藉由真皮貼片、藉由皮膚貼片、藉由貼片、至腦脊髓液中、至門靜脈中、至大腦中、至淋巴系統中、胸膜內、眶後、真皮內、至脾臟中、淋巴內，以及其他。
術語「基因工程化」或「基因修飾」係指修飾細胞基因體之方法，包括但不限於缺失編碼或非編碼區或其一部分或插入編碼區或其一部分。在一些實施例中，經修飾之細胞為淋巴球，例如T細胞，其可自患者或供體獲得。細胞可經修飾以表現外源構築體，諸如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)，其併入至細胞基因體中。
如本文所用，「細胞介素」係指回應於與特異性抗原之接觸而藉由一個細胞釋放之非抗體蛋白質，其中細胞介素與第二細胞相互作用以介導第二細胞中之反應。如本文所用，「細胞介素」意指由一種細胞群體釋放的作為細胞間介體作用於另一細胞之蛋白質。細胞介素可由細胞內源性表現，或向個體投與。細胞介素可由包括巨噬細胞、B細胞、T細胞、嗜中性球、樹突狀細胞、嗜酸性球及肥大細胞之免疫細胞釋放以傳播免疫反應。細胞介素可在接受者細胞中誘導各種反應。細胞介素可包括恆定細胞介素、趨化因子、促炎性細胞介素、效應子及急性期蛋白。舉例而言，包括介白素(IL7及IL-15)之體內恆定細胞介素促進免疫細胞存活及增殖，且促炎性細胞介素可促進發炎反應。體內恆定細胞介素之實例包括(但不限於)IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-15及干擾素(IFN) γ。促炎性細胞介素之實例包括但不限於：IL-la、IL-lb、IL- 6、IL-13、IL-17a、IL-23、IL-27、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor；TNF)-α、TNF-β、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor；FGF) 2、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor；GM-CSF)、可溶性細胞間黏附分子1 (sICAM-1)、可溶性血管黏附分子1 (sVCAM-1)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor；VEGF)、VEGF-C、VEGF-D及胎盤生長因子(PLGF)。效應子之實例包括但不限於顆粒酶A、顆粒酶B、可溶性Fas配體(sFasL)、TGF-β、IL-35及穿孔蛋白。急性期蛋白質之實例包括(但不限於)：C反應蛋白(CRP)及血清澱粉樣蛋白A (SAA)。
如本文所用，術語「淋巴球」包括自然殺手(NK)細胞、T細胞或B細胞。NK細胞為一種類型之代表先天性免疫系統之主要組分的細胞毒性(cytotoxic/cell toxic)淋巴球。NK細胞抑制腫瘤及感染病毒之細胞。其經由細胞凋亡或計劃性細胞死亡之過程起作用。其稱為「自然殺手」，此係因為其並不需要活化以殺滅細胞。T細胞在細胞介導之免疫中起主要作用(無抗體參與)。T細胞受體(TCR)將T細胞與其他淋巴球類型加以區分。作為免疫系統之特殊器官的胸腺為用於T細胞成熟之主要部位。存在許多類型之T細胞，包括：輔助T細胞(例如CD4+細胞)、細胞毒性T細胞(亦稱為TC、細胞毒性T淋巴球、CTL、T殺手細胞、細胞溶解T細胞、CD8+ T細胞或殺手T細胞)、記憶T細胞((i)如原生細胞之幹記憶細胞(TSCM)為CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+ (L-選滯蛋白)、CD27+、CD28+及IL-7Rα+，但亦表現大量CD95、IL-2R、CXCR3及LFA-1，且展示記憶細胞特有之許多功能屬性)；(ii)中樞記憶細胞(TCM)表現L-選滯蛋白及CCR7，其分泌IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4，及(iii)然而，效應記憶細胞(TEM)不表現L-選滯蛋白或CCR7，但產生如IFNγ及IL-4之效應細胞介素)、調控T細胞(Treg、抑制因子T細胞或CD4+CD25+或CD4+ FoxP3+調控性T細胞)、自然殺手T細胞(NKT)及γ δ T細胞。另一方面，B細胞在體液免疫(有抗體參與)中起主要作用。B細胞製造抗體，能夠充當抗原呈現細胞(antigen-presenting cell；APC)且在藉由抗原相互作用進行活化之後變成記憶B細胞及漿細胞，短壽命及長壽命兩者。在哺乳動物中，未成熟B細胞形成於骨髓中。
「免疫反應」係指免疫系統之細胞(例如，T淋巴球、B淋巴球、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、樹突狀細胞及嗜中性球)及藉由此等細胞中之任一者或肝臟產生之可溶性大分子(包括Ab、細胞介素及補體)的作用，該等細胞中之任一者或肝臟導致選擇性靶向、結合至、損傷、破壞以下及/或自以下消除：具有入侵病原體、感染病原體之細胞或組織、癌或其他異常細胞或在自體免疫或病理性發炎的情況下，正常人類細胞或組織之脊椎動物的身體。
如本文所用，「協同刺激信號」係指與諸如TCR/CD3接合之主要信號組合之引起T細胞反應之信號，該T細胞反應為諸如但不限於關鍵分子之增殖及/或上調或下調。
如本文所用，「協同刺激配位體」包括特異性結合T細胞上之同源協同刺激分子之抗原呈現細胞上之分子。協同刺激配位體之結合提供介導T細胞反應之信號，該T細胞反應包括但不限於增殖、活化、分化及其類似反應。共刺激配體誘導除初級信號以外藉由刺激分子，例如藉由T細胞受體(TCR)/CD3複合物與負載有肽之主要組織相容複合體(major histocompatibility complex；MHC)分子結合提供的信號。共刺激配位體可包括但不限於3/TR6、4-IBB配位體、結合鐸(Toll)樣受體之促效劑或抗體、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD30配位體、CD40、CD7、CD70、CD83、疱疹病毒侵入介體(HVEM)、人類白血球抗原G (HLA-G)、ILT4、免疫球蛋白樣轉錄本(ILT) 3、誘導性共刺激配位體(ICOS-L)、細胞間黏著分子(ICAM)、特異性結合B7-H3之配位體、淋巴毒素β受體、I類MHC鏈相關蛋白A (MICA)、I類MHC鏈相關蛋白B (MICB)、OX40配位體、PD-L2或計劃性死亡(PD) LI。共刺激配體包括不限於與存在於T細胞上之共刺激分子特異性結合之抗體，諸如但不限於4-1BB、B7-H3、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD7、ICOS、與CD83特異性結合之配體、淋巴球功能相關抗原1 (LFA-1)、自然殺手細胞受體C (NKG2C)、OX40、PD-1或腫瘤壞死因子超家族成員14 (TNFSF14或LIGHT)。
「協同刺激分子」為T細胞上之同源結合搭配物，其與協同刺激配位體特異性結合，由此藉由T細胞介導協同刺激反應，諸如但不限於增殖。協同刺激分子包括但不限於4-1BB/CD137、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD 33、CD 45、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD134、CD137、CD154、CD16、CD160 (BY55)、CD 18、CD19、CD19a、CD2、CD22、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3 (α；β；δ；ε；γ；ζ)、CD30、CD37、CD4、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD5、CD64、CD69、CD7、CD80、CD83配位體、CD84、CD86、CD8α、CD8β、CD9、CD96 (觸覺)、CD1- la、CDl-lb、CDl-lc、CDl-ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、ICOS、Igα(CD79a)、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、IT GAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、LIGHT、LIGHT (腫瘤壞死因子超家族成員14；TNFSF14)、LTBR、Ly9 (CD229)、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1 (CD1 la/CD18)、I類MHC分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX40、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SELPLG (CD162)、傳訊淋巴球性活化分子、SLAM (SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4 (CD244；2B4)、SLAMF6 (NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF、TNFr、TNFR2、鐸配位體受體、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6或其片段、截短物或組合。
如本文中所使用，「個體」可為哺乳動物，諸如靈長類動物、有蹄類動物(例如母牛、豬、馬)、貓、狗、家養寵物或家養哺乳動物。在一些情況下，哺乳動物可為兔、豬、馬、綿羊、母牛、貓或狗或人類。在一些實施例中，該個體為人類。在一些實施例中，個體為成人。在一些實施例中，個體為青少年人類。 II.環狀RNA及其組合物
本文提供包含轉移媒劑之環狀RNA構築體及相關醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體能夠活體內遞送至免疫細胞以用於治療或產生蛋白質。根據本發明，本文提供之環狀RNA可注射至動物(例如，人類)中，使得由環狀RNA分子編碼之多肽例如由免疫細胞及T細胞在動物內表現。
在某些實施例中，環狀RNA構築體包含IRES。在某些實施例中，環狀RNA構築體包含至少一個編碼結合分子之表現序列，其中結合分子與腫瘤細胞抗原結合或締合。在某些實施例中，環狀RNA構築體包含IRES及至少一個編碼結合分子之表現序列。
在一些實施例中，本文提供包含剪接後3第I組內含子片段(例如，外顯子序列之延伸段)、視情況第一間隔子、內部核糖體進入位點(IRES)、表現序列、視情況第二間隔子及剪接後5第I組內含子片段(例如，外顯子序列之延伸段)的環狀RNA聚核苷酸。在一些實施例中，此等區域呈彼次序。
在某些實施例中，構築之環狀RNA調配成醫藥組合物。在某些實施例中，醫藥組合物包含轉移媒劑。在某些實施例中，包含IRES及至少一個編碼結合分子之表現序列的環狀RNA構築體調配於包含轉移媒劑之醫藥組合物中。
在某些實施例中，揭示醫藥組合物，其包含含有IRES及至少一個編碼結合分子之表現序列的環狀RNA構築體及轉移媒劑。在某些實施例中，轉移媒劑促進及/或增強環狀RNA至一或多個目標細胞之遞送及釋放。
在某些實施例中，環狀RNA構築體及相關醫藥組合物包含IRES及至少一個編碼治療性蛋白質之表現序列，其中該IRES能夠促進活體內遞送蛋白質之表現。
在某些實施例中，環狀RNA構築體包含IRES及至少一個編碼細胞介素、免疫檢查點抑制劑、促效劑、嵌合抗原受體(CAR)、抑制性受體促效劑、一或多種T細胞受體及/或B細胞受體之表現序列。
在一些實施例中，聚核苷酸編碼由經超過一種基因編碼之次單元構成的蛋白質。舉例而言，蛋白質可為異二聚體，其中蛋白質之各鏈或次單元經單獨基因編碼。超過一種環狀RNA分子係在轉移媒劑中遞送且各環狀RNA編碼蛋白質之單獨次單元係可能的。可替代地，單個環狀RNA可經工程化以編碼超過一個亞單元。在某些實施例中，編碼個別亞單元之單獨環狀RNA分子可在單獨轉移媒劑中投與。
在某些實施例中，環狀RNA包含IRES及至少一個編碼CAR構築體之表現序列。在一些實施例中，CAR靶向癌症抗原。在一些實施例中，CAR可經程式化以識別特異性抗原且當結合至彼抗原時活化免疫細胞以攻擊及破壞細胞。在某些實施例中，由環狀RNA聚核苷酸編碼之有效負載可經由使用轉譯起始元件(TIE)內之特異性內部核糖體進入位點(IRES)最佳化。TIE可包含非轉譯區(UTR)、適體複合體或其組合。UTR可完全或部分來自病毒或真核mRNA。在一些實施例中，環狀RNA內之IRES特異性可顯著增強編碼元件內經編碼之特異性蛋白質的表現。
環狀RNA係藉由DNA模板之轉錄產生，其引起能夠環化之前驅體線性RNA聚核苷酸形成。提供線性前驅體RNA聚核苷酸以用於製備環狀RNA構築體及相關醫藥組合物。在前驅體線性RNA聚核苷酸之剪接之前，DNA模板與前驅體線性RNA聚核苷酸共有相同序列。DNA模板在前驅體線性RNA聚核苷酸(例如，3'增強型內含子元件、3'增強型外顯子元件、核心功能元件及5'增強型外顯子元件、5'增強型內含子元件)之剪接之前共有與前驅體線性RNA聚核苷酸相同的序列。在一些實施例中，該線性前驅體RNA聚核苷酸經歷剪接，使得在環化過程期間移除3'增強型內含子元件及5'增強型內含子元件。在一些實施例中，所得環狀RNA聚核苷酸缺乏3'增強型內含子片段及5'增強型內含子片段，但維持3'增強型外顯子片段、核心功能元件及5'增強型外顯子元件。環化策略為此項技術中已知的且描述於本文別處。在某些實施例中，所得環狀RNA可包括PIE (排列之內含子-外顯子)區域、轉譯區(IRES及編碼/非編碼元件)及PIE區域。所得排列之內含子-外顯子(PIE)區域允許RNA之5及3'端共價連接且形成環狀RNA。
在一些實施例中，前驅體RNA聚核苷酸以下列次序包含(a)末端元件；(b)插入區；及(c)單內含子元件。在一些實施例中，末端序列在前驅體RNA聚核苷酸中之單內含子序列上游。在此類實施例中：(i)末端元件包含剪接位點核苷酸，(ii)單內含子元件包含在單內含子之5'端處或附近之剪接位點二核苷酸，且(iii)單內含子元件能夠與能夠在單內含子元件之5'端處或附近之剪接位點二核苷酸處裂解的親核體相互作用，其中(iii)之裂解產物包含能夠在末端元件之剪接位點核苷酸處裂解之5'剪接位點核苷酸。在一些實施例中，親核體為引入至前驅體RNA聚核苷酸之游離親核體，例如不以順式及/或共價連接至前驅體RNA聚核苷酸。在一些實施例中，親核體為能夠在單內含子之5'端處或附近之剪接位點二核苷酸處裂解的鳥苷。在一些實施例中，鳥苷為游離鳥苷，其引入至前驅體RNA聚核苷酸中，例如不呈順式及/或共價連接至前驅體RNA聚核苷酸。在一些實施例中，(iii)之裂解產物包含具有3'羥基之5'剪接位點核苷酸，其能夠在末端元件之剪接位點核苷酸處裂解。
在一些實施例中，前驅體RNA聚核苷酸按以下次序包含(a)單內含子元件；(b)插入區及(c)末端元件。在一些實施例中，單內含子序列在前驅體RNA聚核苷酸中之末端序列上游。在此類實施例中：(i)單內含子元件在該單內含子之3'端處或附近包含剪接位點二核苷酸，(ii)該末端元件包含剪接位點核苷酸，及(iii)該單內含子元件能夠與能夠在該末端元件之該剪接位點核苷酸處裂解之親核體相互作用，其中(iii)之該裂解產物包含能夠在該單內含子之3'端處或附近之剪接位點二核苷酸處裂解的5'剪接位點核苷酸。在一些實施例中，親核體為引入至前驅體RNA聚核苷酸之游離親核體，例如不以順式及/或共價連接至前驅體RNA聚核苷酸。在一些實施例中，親核體為能夠在末端元件之剪接位點核苷酸處裂解之鳥苷。在一些實施例中，鳥苷為游離鳥苷，其引入至前驅體RNA聚核苷酸中，例如不呈順式及/或共價連接至前驅體RNA聚核苷酸。在一些實施例中，(iii)之裂解產物包含具有3'羥基之5'剪接位點核苷酸，其能夠在末端元件之剪接位點核苷酸處裂解。
在一些實施例中，當在存在一或多種鳥苷核苷酸或核苷(例如GTP)及二價陽離子(例如Mg 2 +)之情況下培育時，前驅體線性RNA聚核苷酸環化。在一些實施例中，3'增強型外顯子元件、5'增強型外顯子元件及/或核心功能元件完全或部分地促進前驅體線性RNA聚核苷酸之環化以形成本文所提供之環狀RNA聚核苷酸。
在某些實施例中，本文所提供之環狀RNA係在細胞內部產生。在一些實施例中，在細胞質中藉由噬菌體RNA聚合酶或在核中藉由宿主RNA聚合酶II使用DNA模板(例如在一些實施例中使用本文所提供之載體)轉錄前驅體RNA且隨後環化。
在某些實施例中，將本文所提供之環狀RNA注射至動物(例如人類)中，以使得由環狀RNA分子編碼之多肽在動物內表現。
在一些實施例中，本文提供之DNA (例如載體)、線性RNA (例如前驅體RNA)及/或環狀RNA聚核苷酸之長度在以下之間：300至10000、400至9000、500至8000、600至7000、700至6000、800至5000、900至5000、1000至5000、1100至5000、1200至5000、1300至5000、1400至5000及/或1500至5000個核苷酸。在一些實施例中，聚核苷酸之長度為至少300 nt、400 nt、500 nt、600 nt、700 nt、800 nt、900 nt、1000 nt、1100 nt、1200 nt、1300 nt、1400 nt、1500 nt、2000 nt、2500 nt、3000 nt、3500 nt、4000 nt、4500 nt或5000 nt。在一些實施例中，聚核苷酸之長度不超過3000 nt、3500 nt、4000 nt、4500 nt、5000 nt、6000 nt、7000 nt、8000 nt、9000 nt或10000 nt。在一些實施例中，本文提供之DNA、線性RNA及/或環狀RNA聚核苷酸之長度為約300 nt、400 nt、500 nt、600 nt、700 nt、800 nt、900 nt、1000 nt、1100 nt、1200 nt、1300 nt、1400 nt、1500 nt、2000 nt、2500 nt、3000 nt、3500 nt、4000 nt、4500 nt、5000 nt、6000 nt、7000 nt、8000 nt、9000 nt或10000 nt。
在一些實施例中，本文所提供之環狀RNA具有比包含相同表現序列之mRNA高之功能穩定性。在一些實施例中，本文提供之環狀RNA具有與包含相同表現序列、經修飾之核苷酸(例如，5moU修飾)、經最佳化UTR、蓋及/或polyA尾之mRNA相比更高的功能穩定性。
在一些實施例中，本文所提供之環狀RNA聚核苷酸之功能半衰期為至少5小時、10小時、15小時、20小時。30小時、40小時、50小時、60小時、70小時或80小時。在一些實施例中，本文所提供之環狀RNA聚核苷酸之功能性半衰期為5-80小時、10-70小時、15-60小時及/或20-50小時。在一些實施例中，本文所提供之環狀RNA聚核苷酸之功能半衰期比編碼相同蛋白質之等效線性RNA聚核苷酸之功能半衰期長(例如長至少1.5倍、長至少2倍)。在一些實施例中，可經由功能蛋白合成偵測來評定功能半衰期。
在一些實施例中，本文所提供之環狀RNA聚核苷酸之半衰期為至少5小時、10小時、15小時、20小時、30小時、40小時、50小時、60小時、70小時或80小時。在一些實施例中，本文所提供之環狀RNA聚核苷酸之半衰期為5-80、10-70、15-60及/或20-50小時。在一些實施例中，本文所提供之環狀RNA聚核苷酸之半衰期比編碼相同蛋白質之等效線性RNA聚核苷酸之半衰期長(例如長至少1.5倍、長至少2倍)。在一些實施例中，環狀RNA聚核苷酸或其醫藥組合物在人類細胞中具有長於或等於預定臨限值之功能性半衰期的功能性半衰期。在一些實施例中，藉由功能蛋白分析來測定功能半衰期。舉例而言，在一些實施例中，藉由活體外螢光素酶分析來測定功能半衰期，其中經1、2、3、4、5、6、7或14天每1、2、6、12或24小時在表現環狀RNA聚核苷酸之人類細胞(例如HepG2)培養基中量測高斯螢光素酶(GLuc)之活性。在其他實施例中，功能性半衰期係藉由活體內分析測定，其中歷經1、2、3、4、5、6、7或14天每1、2、6、12或24小時在患者血清或組織樣品中量測由環狀RNA聚核苷酸之表現序列編碼之蛋白質的含量。在一些實施例中，預定臨限值為包含與環狀RNA聚核苷酸相同的表現序列之參考線性RNA聚核苷酸之功能性半衰期。
在一些實施例中，與等效線性mRNA相比，本文所提供之環狀RNA可具有更高表現幅度，例如在向細胞投與RNA24小時之後具有更高表現幅度。在一些實施例中，與包含相同表現序列、5moU修飾、經最佳化UTR、帽及/或polyA尾之mRNA相比，本文所提供之環狀RNA具有較高表現幅度。
在一些實施例中，當暴露於生物體或某一類型之免疫細胞之免疫系統時，本文所提供之環狀RNA可具有比等效mRNA低之免疫原性。在一些實施例中，當暴露於生物體或某一類型之免疫細胞之免疫系統時，本文所提供之環狀RNA與細胞介素之調節型生產相關。舉例而言，在一些實施例中，與包含相同表現序列之mRNA相比，本文提供之環狀RNA在暴露於生物體之免疫系統或某一類型之免疫細胞時與IFN-β1、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ及/或TNFα之產生減少相關。在一些實施例中，與包含相同表現序列之mRNA相比，本文所提供之環狀RNA在暴露於生物體或某一類型之免疫細胞之免疫系統時與較少IFN-β1、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ及/或TNFα轉錄物誘導相關。在一些實施例中，本文所提供之環狀RNA具有比包含相同表現序列之mRNA低之免疫原性。在一些實施例中，與包含相同表現序列、經修飾之核苷酸(例如，5moU修飾)、經最佳化UTR、帽及/或polyA尾之mRNA相比，本文所提供之環狀RNA具有較低免疫原性。
在一些實施例中，本文提供之環狀RNA可由轉移媒劑(例如，LNP)囊封，該轉移媒劑可遞送環狀RNA構築體。將環狀RNA囊封於轉移媒劑中例如可將CAR基因有效引入T細胞。轉移媒劑可包含例如能夠囊封環狀RNA之可離子化脂質、經PEG改質之脂質、輔助脂質及/或結構性脂質。本發明提供包含IRES、表現序列及轉移媒劑之環狀RNA構築體的醫藥組合物。
在某些實施例中，本文所提供之環狀RNA構築體可按原樣轉染至細胞中，或可在細胞中以DNA載體形式轉染及轉錄。可經由添加的聚合酶或由轉染至細胞中之核酸編碼之聚合酶或較佳地經由內源性聚合酶自經轉染DNA載體轉錄環狀RNA。因此，本文亦提供包含本文所提供之環狀RNA聚核苷酸的真核生物細胞。在一些實施例中，該真核細胞為人類細胞。在一些實施例中，真核細胞為免疫細胞。在一些實施例中，真核生物細胞為T細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞、嗜中性球或嗜鹼性球。本文亦提供包含本文所提供之環狀RNA聚核苷酸的原核細胞。
在一些實施例中，本文提供一種包含本文所提供之環狀RNA構築體之T細胞，例如人類T細胞。在一些實施例中，本文提供一種包含本文所提供之環狀RNA構築體之輔助T細胞，例如人類輔助T細胞。在一些實施例中，本文提供一種包含本文所提供之環狀RNA構築體之細胞毒性T細胞，例如人類細胞毒性T細胞。在一些實施例中，本文提供一種包含本文所提供之環狀RNA構築體之NK細胞，例如人類NK細胞。在一些實施例中，本文提供一種包含本文所提供之環狀RNA構築體之巨噬細胞，例如人類巨噬細胞。在一些實施例中，本文提供一種包含本文所提供之環狀RNA構築體之單核球，例如人類單核球。在一些實施例中，本文提供一種包含本文所提供之環狀RNA構築體之骨髓細胞，人類單核球。在一些實施例中，此等細胞存在於骨髓中。在一些實施例中，此等細胞存在於脾臟中。在一些實施例中，此等細胞存在於血液中，例如周邊血液。
在一些實施例中，本文提供一種包含本文所提供之環狀RNA構築體之CD3+細胞，例如人類CD3+細胞。在一些實施例中，本文提供一種包含本文所提供之環狀RNA構築體之CD4+細胞，例如人類CD4+細胞。在一些實施例中，本文提供一種包含本文所提供之環狀RNA構築體之CD8+細胞，例如人類CD8+細胞。在一些實施例中，本文提供一種包含本文所提供之環狀RNA構築體之CD14+細胞，例如人類CD14+細胞。在一些實施例中，本文提供一種包含本文所提供之環狀RNA構築體之CD16+細胞，例如人類CD16+細胞。在一些實施例中，本文提供一種包含本文所提供之環狀RNA構築體之CD56+細胞，例如人類CD56+細胞。在一些實施例中，本文提供一種包含本文所提供之環狀RNA構築體之CD11B+細胞，例如人類CD11B+細胞。在一些實施例中，本文提供一種包含本文所提供之環狀RNA構築體之CD33+細胞，例如人類CD33+細胞。在一些實施例中，本文提供一種包含本文所提供之環狀RNA構築體之CD33+ CD14+細胞，例如人類CD33+ CD14+細胞。在一些實施例中，本文提供一種包含本文所提供之環狀RNA構築體之CD33+ CD14+細胞，例如人類CD33+ CD64+細胞。在一些實施例中，此等細胞存在於骨髓中。在一些實施例中，此等細胞存在於脾臟中。在一些實施例中，此等細胞存在於血液中，例如周邊血液。
環狀RNA可未經修飾、部分經修飾或完全經修飾。在一個實施例中，環狀RNA含有至少一個核苷修飾。在一個實施例中，環狀RNA之至多100%核苷經修飾。在一個實施例中，至少一個核苷修飾為尿苷修飾或腺苷修飾。在一個實施例中，至少一個核苷修飾選自N6-甲基腺苷(m6A)、假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)及5-甲氧基尿苷(5moU)。在一個實施例中，前驅體RNA經甲基假尿苷修飾(m1ψ)。
在某些實施例中，所提供之聚核苷酸(例如DNA模板、前驅體RNA聚核苷酸或環狀RNA聚核苷酸)包含經修飾核苷酸及/或經修飾核苷。在一些實施例中，經修飾核苷為m 5C (5-甲基胞苷)。在另一實施例中，經修飾核苷為m 5U (5-甲基尿苷)。在另一實施例中，經修飾核苷為m 6A (N 6-甲基腺苷)。在另一實施例中，經修飾核苷為s 2U (2-硫代尿苷)。在另一實施例中，經修飾核苷為Ψ (假尿苷)。在另一實施例中，經修飾核苷為Um (2'-O-甲基尿苷)。在其它實施例中，經修飾之核苷為m 1A (1-甲基腺苷)；m 2A (2-甲基腺苷)；Am (2'-O-甲基腺苷)；ms 2m 6A (2-甲硫基-N 6-甲基腺苷)；i 6A (N 6-異戊烯基腺苷)；ms 2i6A (2-甲硫基-N 6異戊烯基腺苷)；io 6A (N 6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷)；ms 2io 6A (2-甲硫基-N 6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷)；g 6A (N 6-甘胺醯基胺甲醯基腺苷)；t 6A (N 6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷)；ms 2t 6A (2-甲硫基-N 6-羥丁胺醯基胺甲醯基腺苷)；m 6t 6A (N 6-甲基-N 6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷)；hn 6A(N 6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基腺苷)；ms 2hn 6A (2-甲硫基-N 6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基腺苷)；Ar(p) (2'-O-核糖苷基腺苷(磷酸鹽))；I (肌苷)；m 1I (1-甲基肌苷)；m 1Im (1,2'-O-二甲基肌苷)；m 3C (3-甲基胞啶)；Cm (2'-O-甲基胞啶)；s 2C (2-硫胞苷)；ac 4C (N 4-乙醯基胞苷)；f 5C (5-甲醯基胞苷)；m 5Cm (5,2'-O-二甲基胞苷)；ac 4Cm (N 4-乙醯基-2'-O-甲基胞啶)；k 2C (賴西啶)；m 1G (1-甲基鳥苷)；m 2G (N 2-甲基鳥苷)；m 7G (7-甲基鳥苷)；Gm (2'-O-甲基鳥苷)；m 2 2G (N 2,N 2-二甲基鳥苷)；m 2Gm (N 2,2'-O-二甲基鳥苷)；m 2 2Gm (N 2,N 2,2'-O-三甲基鳥苷)；Gr(p) (2'-O-核糖苷基鳥苷(磷酸鹽))；yW (懷俄丁苷(wybutosine))；o 2yW (過氧基懷俄丁苷(peroxywybutosine))；OHyW (羥基懷俄丁苷)；OHyW* (欠修飾之羥基懷俄丁苷)；imG (懷俄苷(wyosine))；mimG (甲基懷俄苷)；Q (Q核苷(queuosine))；oQ (環氧Q核苷)；galQ (半乳糖苷-Q核苷)；manQ (甘露糖基-Q核苷)；preQ 0(7-氰基-7-去氮鳥苷)；preQ 1(7-胺基甲基-7-去氮鳥苷)；G +(古嘌苷(archaeosine))；D (二氫尿苷)；m 5Um (5,2'-O-二甲基尿苷)；s 4U (4-硫代尿苷)；m 5s 2U (5-甲基-2-硫代尿苷)；s 2Um (2-硫基-2'-O-甲基尿苷)；acp 3U (3-(3-胺基-3-羧丙基)尿苷)；ho 5U (5-羥基尿苷)；mo 5U (5-甲氧基尿苷)；cmo 5U (尿苷5-氧基乙酸)；mcmo 5U (尿苷5-氧基乙酸甲基酯)；chm 5U (5-(羧基羥甲基)尿苷))；mchm 5U (5-(羧基羥甲基)尿苷甲基酯)；mcm 5U (5-甲氧基羧甲基尿苷)；mcm 5Um (5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基尿苷)；mcm 5s 2U (5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷)；nm 5S 2U (5-胺基甲基-2-硫代尿苷)；mnm 5U (5-甲基胺基甲基尿苷)；mnm 5s 2U (5-甲胺基甲基-2-硫代尿苷)；mnm 5se 2U (5-甲胺基甲基-2-硒基尿苷)；ncm 5U (5-胺甲醯基甲基尿苷)；ncm 5Um (5-胺甲醯基甲基-2'-O-甲基尿苷)；cmnm 5U (5-羧甲基胺基甲基尿苷)；cmnm 5Um (5-羧甲基胺基甲基-2'-O-甲基尿苷)；cmnm 5s 2U (5-羧甲基胺基甲基-2-硫代尿苷)；m 6 2A (N 6,N 6-二甲基胞苷)；Im (2'-O-甲基肌苷)；m 4C (N 4-甲基胞啶)；m 4Cm (N 4,2'-O-二甲基胞苷)；hm 5C (5-羥甲基胞苷)；m 3U (3-甲基尿苷)；cm 5U (5-羧甲基尿苷)；m 6Am (N 6,2'-O-二甲基腺苷)；m 6 2Am (N 6,N 6,O-2'-三甲基腺苷)；m 2 , 7G (N 2,7-二甲基鳥苷)；m 2 , 2 , 7G (N 2,N 2,7-三甲基鳥苷)；m 3Um (3,2'-O-二甲基尿苷)；m 5D (5-甲基二氫尿苷)；f 5Cm (5-甲醯基-2'-O-甲基胞啶)；m 1Gm (1,2'-O-二甲基鳥苷)；m 1Am (1,2'-O-二甲基腺苷)；τm 5U (5-牛磺酸甲基尿苷)；τm 5s 2U (5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷))；imG-14 (4-去甲基懷俄苷)；imG2 (異懷俄苷)；或ac 6A (N 6-乙醯基腺苷)。
在一些實施例中，經修飾核苷可包括選自以下之群之化合物：吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫基-假尿苷、2-硫基-假尿苷、5-羥基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫基-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫基-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氫尿苷、二氫假尿苷、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫基-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、5-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙醯基胞苷、5-甲醯基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羥甲基胞苷、1-甲基-假異胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假異胞苷、2-硫基-胞苷、2-硫基-5-甲基-胞苷、4-硫基-假異胞苷、4-硫基-1-甲基-假異胞苷、4-硫基-1-甲基-1-去氮-假異胞苷、1-甲基-1-去氮-假異胞苷、澤布拉林、5-氮雜-澤布拉林、5-甲基-澤布拉林、5-氮雜-2-硫基-澤布拉林、2-硫基-澤布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮-2-胺基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2-胺基嘌呤、7-去氮-2,6-二胺基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、N6-甘胺醯基胺甲醯基腺苷、N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、2-甲硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、懷俄苷、懷俄丁苷、7-去氮-鳥苷、7-去氮-8-氮雜-鳥苷、6-硫基-鳥苷、6-硫基-7-去氮-鳥苷、6-硫基-7-去氮-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷、6-硫基-7-甲基-鳥苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基鳥苷、N2-甲基鳥苷、N2,N2-二甲基鳥苷、8-側氧基-鳥苷、7-甲基-8-側氧基-鳥苷、1-甲基-6-硫基-鳥苷、N2-甲基-6-硫基-鳥苷及N2,N2-二甲基-6-硫基-鳥苷。在另一實施例中，修飾獨立地選自由5-甲基胞嘧啶、假尿苷及1-甲基假尿苷組成之群。
在一些實施例中，經修飾核糖核苷包括5-甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、1-甲基-假尿苷、N6-甲基腺苷及/或假尿苷。在一些實施例中，該等經修飾核苷提供額外穩定性及對免疫活化之抗性。
各種環狀RNA、環狀RNA構築體、包含環狀RNA、前驅體RNA之組合物及相關方法描述於例如WO2019236673、WO2020237227、WO2021113777、WO2021226597、WO2021189059、WO2021236855、WO2022261490、WO2023056033及WO2023081526中，其各自以全文引用之方式併入。 A.增強型內含子元件及增強型外顯子元件
本文提供之環狀RNA可包含增強型內含子元件或片段及增強型外顯子元件或片段。在某些實施例中，如本文所提供，增強型內含子元件及增強型外顯子元件可包含間隔子、雙螺旋體區、親和序列、內含子片段、外顯子片段及各種非轉譯元件。增強型內含子元件或增強型外顯子元件內之此等序列經排列以使環化或蛋白質表現最佳化。
在某些實施例中，本文提供之DNA模板、前驅體線性RNA聚核苷酸及環狀RNA包含第一(5')及/或第二(3')間隔子。在一些實施例中，DNA模板或前驅體線性RNA聚核苷酸在增強型內含子元件中包含一或多個間隔子。在一些實施例中，DNA模板或前驅體線性RNA聚核苷酸在增強型外顯子元件中包含一或多個間隔子。在某些實施例中，DNA模板或線性RNA聚核苷酸包含3'增強型內含子片段中之間隔子及5'增強型內含子片段中之間隔子。在某些實施例中，DNA模板、前驅體線性RNA聚核苷酸或環狀RNA包含3'增強型外顯子片段中之間隔子及5'增強型外顯子片段中之另一間隔子以幫助環化或蛋白質表現，此係因為在整個序列中產生之對稱性。
在一些實施例中，包括3'第I組內含子片段與核心功能元件之間的間隔子可在彼等區域中保存二級結構，此係藉由防止其相互作用來進行，因此提高了剪接效率。在一些實施例中，第一間隔子(在3'第I組內含子片段與核心功能元件之間)及第二間隔子(在兩個表現序列與核心功能元件之間)包含額外鹼基配對區，該等鹼基配對區經預測與彼此鹼基配對且不與第一雙螺旋體區及第二雙螺旋體區鹼基配對。在其他實施例中，第一間隔子(在3'第I組內含子片段與核心功能元件之間)及第二間隔子(在核心功能元件中之一者與5'第I組內含子片段之間)包含額外鹼基配對區，該等鹼基配對區經預測與彼此鹼基配對且不與第一雙螺旋體區及第二雙螺旋體區鹼基配對。在一些實施例中，該間隔子鹼基配對使I組內含子片段彼此極為接近，從而進一步提高剪接效率。另外，在一些實施例中，第一與第二雙螺旋區之間的鹼基配對及分別地，第一與第二間隔子之間的鹼基配對之組合促進形成含有側接鹼基配對之相鄰區域之I組內含子片段的剪接氣泡。典型間隔子為具有以下品質中之一或多者之相鄰序列：1)經預測避免干擾例如IRES、表現序列、適體或內含子之近端結構；2)長度為至少7 nt且不長於100 nt；3)位於3'內含子片段之後且與其鄰接及/或位於5'內含子片段之前且與其鄰接；及4)含有以下中之一或多者：a)長度為至少5 nt之非結構化區、b)長度為至少5 nt之與包括另一間隔子之遠端序列的鹼基配對區及c)長度為至少7 nt之範疇限於間隔子之序列的結構化區。間隔子可具有若干區域，包括非結構化區、鹼基配對區、髮夾/結構化區及其組合。在一實施例中，間隔子具有高GC含量之結構化區。在一實施例中，間隔子內之區域與同一間隔子內之另一區域鹼基配對。在一實施例中，間隔子內之一區域與另一間隔子內之一區域鹼基配對。在一實施例中，間隔子包含一或多個髮夾結構。在一實施例中，間隔子包含一或多個具有4至12個核苷酸之莖及2至10個核苷酸之環的髮夾結構。在一實施例中，存在3'第I組內含子片段與核心功能元件之間的額外間隔子。在一實施例中，此額外間隔子防止IRES之結構化區或TIE之適體干擾3'第I組內含子片段之摺疊，或降低此情況發生之程度。在一些實施例中，5'間隔序列之長度為至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30個核苷酸。在一些實施例中，5'間隔序列之長度不超過100、90、80、70、60、50、45、40、35或30個核苷酸。在一些實施例中，5'間隔序列之長度在5與50、10與50、20與50、20與40及/或25與35個核苷酸之間。在某些實施例中，5'間隔序列之長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。在一個實施例中，5'間隔序列為polyA序列。在另一實施例中，5'間隔序列為polyAC序列。在一個實施例中，間隔子包含約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100% polyAC含量。在一個實施例中，間隔子包含約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%聚嘧啶(C/T或C/U)含量。
在一些實施例中，本文提供之DNA模板及前驅體線性RNA聚核苷酸及環狀RNA聚核苷酸包含第一(5')雙螺旋體區及第二(3')雙螺旋體區。在某些實施例中，DNA模板及前驅體線性RNA聚核苷酸包含位於3'增強型內含子片段內之5'外部雙螺旋體區及位於5'增強型內含子片段內之3'外部雙螺旋體區。在一些實施例中，DNA模板、前驅體線性RNA聚核苷酸及環狀RNA聚核苷酸包含位於3'增強型外顯子片段內之5'內部雙螺旋體區及位於5'增強型外顯子片段內之3'內部雙螺旋體區。在一些實施例中，DNA聚核苷酸及前驅體線性RNA聚核苷酸包含5'外部雙螺旋體區、5'內部雙螺旋體區、3'內部雙螺旋體區及3'外部雙螺旋體區。
在某些實施例中，第一雙螺旋體區及第二雙螺旋體區可形成完美或不完美的雙螺旋體。因此，在某些實施例中，至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之第一及第二雙螺旋體區可彼此鹼基配對。在一些實施例中，預測雙螺旋體區與RNA中之非預期序列(例如非雙螺旋體區序列)具有小於50% (例如小於45%、小於40%、小於35%、小於30%、小於25%)鹼基配對。在一些實施例中，包括處於前驅體RNA股之末端上且與I組內含子片段相鄰或非常接近之此類雙螺旋體區使I組內含子片段彼此極為接近，從而提高了剪接效率。在一些實施例中，雙螺旋體區之長度為3至100個核苷酸(例如長度為3-75個核苷酸、長度為3-50個核苷酸、長度為20-50個核苷酸、長度為35-50個核苷酸、長度為5-25個核苷酸、長度為9-19個核苷酸)。在一些實施例中，雙螺旋體區之長度為約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。在一些實施例中，雙螺旋體區之長度為約9至約50個核苷酸。在一個實施例中，雙螺旋體區之長度為約9至約19個核苷酸。在一些實施例中，雙螺旋體區之長度為約20至約40個核苷酸。在某些實施例中，雙螺旋體區之長度為約30個核苷酸。
在其他實施例中，DNA模板、前驅體線性RNA聚核苷酸或環狀RNA聚核苷酸不包含任何雙螺旋區以使轉譯或環化最佳化。
在某些實施例中，如本文所提供，DNA模板或前驅體線性RNA聚核苷酸可包含親和標籤。在一些實施例中，親和標籤位於3'增強型內含子元件中。在一些實施例中，親和標籤位於5'增強型內含子元件中。在一些實施例中，兩個(3'及5')增強型內含子元件各自包含親和標籤。在一個實施例中，3'增強型內含子元件之親和標籤之長度與5'增強型內含子元件中親和標籤之長度相同。在一些實施例中，3'增強型內含子元件之親和標籤為與5'增強型內含子元件中之親和標籤相同的序列。在一些實施例中，置放親和序列以使寡dT純化最佳化。
在一些實施例中，存在於前驅體線性RNA聚核苷酸中之一或多個親和標籤在環化後移除。在一些實施例中，在執行RNA環化之後向殘餘線性RNA中添加親和標籤。在一些此等實施例中，將親和標籤以酶方式添加至線性RNA中。一或多個親和標籤存在於線性RNA中且其不存在於環狀RNA中可便於進行環狀RNA純化。在一些實施例中，使用負向選擇或親和純化方法執行該純化。在一些實施例中，使用優先或特異性結合至親和標籤之結合劑執行該純化。
在一些實施例中，親和標籤包含polyA區。在一些實施例中，polyA區之長度為至少15、30或60個核苷酸。在一些實施例中，包含polyA區之親和標籤存在於前驅體線性RNA中之兩個位置。在一些實施例中，一個或兩個polyA區之長度為15-50個核苷酸。在一些實施例中，一個或兩個polyA區之長度為20-25個核苷酸。polyA序列在環化後經移除。因此，與polyA序列雜交之寡核苷酸，諸如與固體表面(例如樹脂)結合之去氧胸苷寡核苷酸(oligo(dT))可用於自其前驅體RNA分離環狀RNA。
在一些實施例中，親和標籤包含不存在於環狀RNA產物中之序列。在一些此等實施例中，不存在於環狀RNA產物中之序列為專用結合位點(DBS)。在一些實施例中，DBS為非結構化序列，亦即不形成諸如髮夾環、相鄰dsRNA區或三螺旋體之限定結構元件的序列。在一些實施例中，DBS序列形成無規螺旋(random coil)。在一些實施例中，DBS包含至少25% GC含量、至少50% GC含量、至少75% GC含量或至少100% GC含量。在一些實施例中，DBS包含至少25% AC含量、至少50% AC含量、至少75% AC含量或100% AC含量。在一些實施例中，DBS之長度為至少15、30或60個核苷酸。在一些實施例中，包含DBS之親和標籤存在於前驅體線性RNA中之兩個位置。在一些實施例中，DBS序列之長度各自獨立地為15-50個核苷酸。在一些實施例中，DBS序列之長度各自獨立地為20-25個核苷酸。
在一些實施例中，(多個) DBS序列在環化後經移除。因此，可使用包含寡核苷酸之結合劑以便於進行環狀RNA純化，該等寡核苷酸包含與DBS互補之序列。舉例而言，結合劑可包含與結合至固體表面(例如樹脂)之DBS互補之寡核苷酸。
在一些實施例中，藉由接合將親和序列或諸如生物素之其他類型之親和柄(affinity handle)添加至線性RNA中。在一些實施例中，使包含寡核苷酸之親和序列與線性RNA接合。在一些實施例中，使結合至親和柄之寡核苷酸與線性RNA接合。在一些實施例中，使包含與親和序列或親和柄接合之線性RNA及不包含親和序列或親和柄之環狀RNA的溶液與包含結合至與親和序列互補之寡核苷酸或結合至親和柄之結合搭配物的固體載體的結合劑接觸，以使得線性RNA結合至結合劑，且自固體載體溶離或分離環狀RNA。
用於本文所描述之環狀RNA之任何純化方法可包含一或多個緩衝液交換步驟。在一些實施例中，在活體外轉錄(IVT)之後且在額外純化步驟之前執行緩衝液交換。在一些此等實施例中，將IVT反應溶液緩衝交換成包含Tris之緩衝液。在一些實施例中，將IVT反應溶液緩衝液交換成包含大於1 mM或大於10 mM一或多種諸如NaCl或KCl之單價鹽且視情況包含EDTA之緩衝液。在一些實施例中，在環狀RNA純化完成之後執行緩衝液交換。在一些實施例中，在IVT之後且在環狀RNA純化之後執行緩衝液交換。在一些實施例中，在環狀RNA純化之後執行之緩衝液交換包含將環狀RNA交換至水或儲存緩衝液中。在一些實施例中，儲存緩衝液包含1mM pH 6.5檸檬酸鈉。
在某些實施例中，3'增強型內含子元件包含前導非轉譯序列。在一些實施例中，前導非轉譯序列為3'增強型內含子片段之5'端。在一些實施例中，前導非轉譯序列包含轉錄起始位點(TSS)之最後一個核苷酸。在一些實施例中，TSS係選自病毒、細菌或真核DNA模板。在一個實施例中，前導非轉譯序列包含TSS之最後一個核苷酸以及0至100個額外核苷酸。在一些實施例中，TSS為末端間隔子。在一個實施例中，在RNA T7聚合酶轉譯後，前導非轉譯序列在5'端含有鳥苷。
在某些實施例中，5'增強型內含子元件包含尾隨非轉譯序列。在一些實施例中，5'尾隨非轉譯序列位於5'增強型內含子元件之3'端。在一些實施例中，尾隨非轉譯序列為部分限制消化序列。在一個實施例中，尾隨非轉譯序列完全或部分為用於使DNA模板線性化之限制消化位點。在一些實施例中，限制消化位點完全或部分來自天然病毒、細菌或真核DNA模板。在一些實施例中，尾隨非轉譯序列為末端限制位點片段。 1.增強型內含子片段
在某些實施例中，如本文所提供，3'增強型內含子元件及5'增強型內含子元件各自包含內含子片段。在某些實施例中，3'內含子片段係與包括3'剪接位點二核苷酸之天然第I組內含子之3'近端片段至少75%同源(例如，至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源)的連續序列。通常，5'內含子片段係與包括5'剪接位點二核苷酸之天然第I組內含子之5'近端片段至少75%同源(例如，至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源)的連續序列。在一些實施例中，3'內含子片段包括3' I組剪接位點二核苷酸之第一個核苷酸。在一些實施例中，5'內含子片段包括5'第I組剪接位點二核苷酸之第一個核苷酸。在其他實施例中，3'內含子片段包括3' I組內含子片段剪接位點二核苷酸之第一個核苷酸及第二個核苷酸；且5'內含子片段包括3' I組內含子片段二核苷酸之第一個核苷酸及第二個核苷酸。 2.增強型外顯子片段
在某些實施例中，如本文所提供，DNA模板、線性前驅體RNA聚核苷酸及環狀RNA聚核苷酸各自包含增強型外顯子片段。在一些實施例中，按5'至3'次序，3'增強型外顯子元件位於核心功能元件之上游。在一些實施例中，按5'至3'次序，5'增強型內含子元件位於核心功能元件之下游。
根據本發明，3'增強型外顯子元件及5'增強型外顯子元件各自包含外顯子片段。在一些實施例中，3'增強型外顯子元件包含3'外顯子片段。在一些實施例中，5'增強型外顯子元件包含5'外顯子片段。在某些實施例中，如本文所提供，3'外顯子片段及5'外顯子片段各自包含第I組內含子片段、及外顯子序列之1至100個核苷酸。在某些實施例中，3'內含子片段係與包括3'剪接位點二核苷酸之天然第I組內含子之3'近端片段至少75%同源(例如，至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源)的連續序列。通常，5'第I組內含子片段係與包括5'剪接位點二核苷酸之天然第I組內含子之5'近端片段至少75%同源(例如，至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源)的連續序列。在一些實施例中，3'外顯子片段包含3'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第二個核苷酸、及外顯子序列之1至100個核苷酸。在一些實施例中，5'外顯子片段包含5'第I組內含子剪接位點二核苷酸之第一個核苷酸、及外顯子序列之1至100個核苷酸。在一些實施例中，外顯子序列包含部分或完全來自天然存在之外顯子序列，該天然存在之外顯子序列來自病毒、細菌或真核DNA載體。在其他實施例中，外顯子序列進一步包含合成、經基因修飾之(例如含有經修飾之核苷酸)或其他經工程化之外顯子序列。
在一個實施例中，在3'內含子片段包含3'第I組剪接位點二核苷酸之兩個核苷酸且5'內含子片段包含5'第I組剪接位點二核苷酸之兩個核苷酸的情況下，位於5'增強型外顯子元件及3'增強型外顯子元件內之外顯子片段不包含第I組剪接位點二核苷酸。 3.增強型內含子元件及增強型外顯子元件之例示性排列
舉例而言且不意欲為限制性的，在一些實施例中，3'增強型內含子元件按以下5'至3'次序包含：前導非轉譯序列、5'親和標籤、視情況選用之5'外部雙螺旋體區、5'外部間隔子及3'內含子片段。在相同實施例中，3'增強型外顯子元件按以下5'至3'次序包含：3'外顯子片段、視情況選用之5'內部雙螺旋體區、視情況選用之5'內部雙螺旋體區及5'內部間隔子。在相同實施例中，5'增強型外顯子元件按以下5'至3'次序包含：3'內部間隔子、視情況選用之3'內部雙螺旋體區及5'外顯子片段。在再相同實施例中，3'增強型內含子元件按以下5'至3'次序包含：5'內含子片段、3'外部間隔子、視情況選用之3'外部雙螺旋體區、3'親和標籤及尾隨非轉譯序列。 B.核心功能元件-IRES
在一些實施例中，DNA模板、線性前驅體RNA聚核苷酸及環狀RNA聚核苷酸包含核心功能元件。在一些實施例中，核心功能元件包含編碼元件及/或非編碼元件。在一些實施例中，核心功能元件進一步包含在編碼或非編碼元件上游之轉譯起始元件(TIE)，及/或終止元件。
在一些實施例中，核心功能元件包含終止元件。在一些實施例中，終止序列包含終止密碼子。在一個實施例中，終止序列包含終止卡匣。在一些實施例中，終止卡匣包含至少2個終止密碼子。在一些實施例中，終止卡匣包含至少2個終止密碼子之框架。在相同實施例中，終止卡匣中之終止密碼子之框架各自包含1、2或更多個終止密碼子。在一些實施例中，終止卡匣包含LoxP或RoxStopRox、或frt側接之終止卡匣。在相同實施例中，終止卡匣包含lox-stop-lox終止卡匣。
在一些實施例中，本文中之聚核苷酸包含編碼元件或非編碼元件或兩者之組合。在一些實施例中，編碼元件包含表現序列。在一些實施例中，編碼元件編碼至少一種治療性蛋白質。在一些實施例中，環狀RNA編碼兩種或更多種多肽。
在一些實施例中，核心功能元件包含至少一個轉譯起始元件(TIE)。TIE經設計以允許經編碼蛋白之轉譯效率。在一些實施例中，包含一或多個編碼元件之核心功能元件將進一步包含一或多個TIE。在一些實施例中，轉譯起始元件(TIE)包含合成性TIE。在一些實施例中，合成TIE包含能夠起始線性RNA或環狀RNA聚核苷酸轉譯之適體複合物、合成IRES或其他經工程化之TIES。
在一些實施例中，TIE包含非轉譯區(UTR)或其片段、適體複合物或其片段、或其組合。在某些實施例中，TIE含有經修飾之核苷酸。在某些實施例中，本文所提供之TIE包含內部核糖體進入位點(IRES)。在某些實施例中，與野生型病毒IRES或真核IRES相比，該IRES包含一或多個經修飾之核苷酸。參見例如WO2022/261490，其以全文引用之方式併入本文中。
由於發現病毒IRES，因此由於其不相似性，因此其分類存在困難。已觀測到，不存在用於所有IRES之運行的共同機制。另外，未發現所有IRES共用之特定結構元件；其序列缺乏顯著同源性。參見Nikonov, Biochemistry (Moscow), 2017, 第82卷, 第13號, 第1615-1631頁。根據一個作者，已定義四種IRES類別。I型及II型IRES發現於微小RNA病毒且長度可為400-500nt。III型IRES係關於黃病毒(包括HCV)及HCV樣微小RNA病毒，且特徵在於在AUG密碼子上游假結之存在及編碼序列之第一30nt之需求。IV型IRES為基因間區域(IGR) IRES，其最初在蟋蟀麻痺病毒(CrPV)中鑑別，該病毒可在無任何起始密碼子之情況下起作用且其中轉譯以GCU三重態開始。參見Godet, Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 924; doi:10.3390/ijms20040924。
包括IRES准許自環狀RNA轉譯一或多個開讀框(例如形成表現序列之開讀框)。IRES元件吸引真核核糖體轉譯起始複合物且促進轉譯起始。參見例如Kaufman等人, Nuc. Acids Res. (1991) 19:4485-4490；Gurtu等人, Biochem. Biophys. Res. Comm. (1996) 229:295-298；Rees等人, BioTechniques (1996) 20: 102-110；Kobayashi等人, BioTechniques (1996) 21 :399-402；及Mosser等人, BioTechniques 1997 22 150-161。在一些實施例中，IRES能夠便於由前驅體RNA編碼之蛋白質於細胞中表現。在一些實施例中，IRES能夠便於蛋白質表現，以使得蛋白質之表現量與使用對照IRES時相當或比其高。
多個IRES序列可用且包括衍生自廣泛多種病毒之序列，諸如：微小RNA病毒，諸如腦心肌炎病毒(EMCV) UTR之前導序列(Jang等人, J. Virol. (1989) 63: 1651-1660)、脊髓灰質炎前導序列、A型肝炎病毒前導序列、C型肝炎病毒IRES、人類鼻病毒2型IRES (Dobrikova等人, Proc. Natl. Acad. Sci. (2003) 100(25): 15125- 15130)、來自口蹄疫病毒之IRES元件(Ramesh等人, Nucl. Acid Res. (1996) 24:2697-2700)、賈第蟲病毒IRES (Garlapati等人, J. Biol. Chem. (2004) 279(5):3389-3397)及其類似者。不同IRES序列具有不同的驅動蛋白質表現之能力，且任何特定經鑑別或預測之IRES序列驅動自線性mRNA或環狀RNA構築體進行之蛋白質表現的能力未知且不可預測。在某些實施例中，可基於病毒序列中之序列位置以生物資訊學方式鑑別潛在IRES序列。然而，該等序列之活性先前未經表徵。如本文中所證實，該等IRES序列可視細胞類型而定，例如在T細胞、肝細胞或肌肉細胞中具有不同的蛋白質表現能力。在一些實施例中，本文所描述之新穎IRES序列可在特定細胞類型中具有與先前所描述之EMCV IRES序列相比增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或100倍之表現。
在一些實施例中，IRES為阿里病毒(Aalivirus)、埃魯里病毒(Ailurivirus)、安匹病毒(Ampivirus)、安那提病毒(Anativirus)、口蹄疫病毒(Aphthovirus)、艾誇瑪病毒(Aquamavirus)、禽肝病毒(Avihepatovirus)、阿維斯病毒(Avisivirus)、布斯匹病毒(Boosepivirus)、博匹病毒、卡斯利病毒(Caecilivirus)、心病毒、科薩病毒、克拉赫利病毒(Crahelivirus)、克羅希病毒(Crohivirus)、丹尼匹病毒(Danipivirus)、地西匹病毒(Dicipivirus)、迪雷薩匹病毒(Diresapivirus)、腸病毒、馬鼻病毒、菲利匹病毒(Felipivirus)、菲匹病毒(Fipivirus)、加利病毒、格魯赫利病毒(Gruhelivirus)、格魯索匹病毒(Grusopivirus)、哈卡病毒(Harkavirus)、海密匹病毒(Hemipivirus)、肝病毒、匈奴病毒、嵴病毒、昆薩吉病毒(Kunsagivirus)、林尼匹病毒(Limnipivirus)、利夫匹病毒(Livupivirus)、盧多匹病毒(Ludopivirus)、馬拉加西病毒(Malagasivirus)、馬蘇匹病毒(Marsupivirus)、美格瑞病毒、米斯蒂病毒、莫薩病毒(Mosavirus)、木匹病毒(Mupivirus)、密羅匹病毒(Myrropivirus)、奧利病毒(Orivirus)、奧西病毒、帕拉博病毒、副腸孤病毒、帕西病毒(Pasivirus)、雀病毒、佩馬匹病毒(Pemapivirus)、珀西病毒(Poecivirus)、波塔米匹病毒(Potamipivirus)、派勾賽匹病毒(Pygoscepivirus)、拉博病毒、拉菲病毒(Rafivirus)、拉吉達匹病毒(Rajidapivirus)、羅赫利病毒(Rohelivirus)、羅沙病毒(Rosavirus)、沙科布病毒(Sakobuvirus)、薩利病毒、薩佩洛病毒(Sapelovirus)、塞尼卡病毒(Senecavirus)、香巴病毒、西西尼病毒、西馬匹病毒(Symapivirus)、鐵士古病毒、托爾奇病毒(Torchivirus)、鳥取病毒、震顫病毒(Tremovirus)、特羅匹病毒(Tropivirus)、C型肝炎病毒、佩吉病毒(Pegivirus)、瘟疫病毒(Pestivirus)、黃病毒(Flavivirus) IRES。在本文的一些實施例中，IRES選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒。
在一些實施例中，IRES為以下各者之IRES序列：桃拉症候群病毒(Taura syndrome virus)、錐蝽病毒(Triatoma virus)、蒂勒氏腦脊髓炎病毒(Theiler's encephalomyelitis virus)、猿猴病毒(Simian Virus) 40、紅火蟻病毒(Solenopsis invicta virus) 1、稻麥蚜病毒(Rhopalosiphum padi virus)、網狀內皮細胞增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus)、人類脊髓灰白質炎病毒1、斯氏珀蝽腸病毒(Plautia stali intestine virus)、喀什米爾蜂病毒(Kashmir bee virus)、人類鼻病毒2、玻璃葉蟬(Homalodisca coagulata)病毒-1、1型人類免疫缺乏病毒、虱P病毒、C型肝炎病毒、A型肝炎病毒、GB肝炎病毒、口蹄疫病毒、人類腸病毒71、馬鼻炎病毒、茶尺蠖微小RNA病毒樣病毒、腦心肌炎病毒、果蠅C病毒、人類柯薩奇病毒(Human coxsackievirus) B3、十字花科植物菸草花葉病毒、蟋蟀麻痺病毒、牛病毒性腹瀉病毒1、黑蜂王台病毒(Black Queen Cell Virus)、蚜蟲致死性麻痺病毒、禽類腦脊髓炎病毒、急性蜂麻痺病毒、朱槿黃脈嵌紋病毒、典型豬瘟病毒、人類FGF2、人類SFTPA1、人類AML1/RUNX1、果蠅觸角足、人類AQP4、人類AT1R、人類BAG-1、人類BCL2、人類BiP、人類c-IAPl、人類c-myc、人類eIF4G、小鼠NDST4L、人類LEF1、小鼠HIF1α、人類n.myc、小鼠Gtx、人類p27kipl、人類PDGF2/c-sis、人類p53、人類Pim-1、小鼠Rbm3、果蠅收割者(Drosophila reaper)、犬奔跑者(Canine Scamper)、果蠅Ubx、人類UNR、小鼠UtrA、人類VEGF-A、人類XIAP、無毛果蠅、釀酒酵母(S. cerevisiae) TFIID、釀酒酵母YAP1、菸草蝕刻病毒、蕪菁皺病毒、EMCV-A、EMCV-B、EMCV-Bf、EMCV-Cf、EMCV pEC9、小雙節RNA病毒、HCV QC64、人類科薩病毒(Cosavirus) E/D、人類科薩病毒F、人類科薩病毒JMY、鼻病毒NAT001、HRV14、HRV89、HRVC-02、HRV-A21、薩利病毒(Salivirus) A SH1、薩利病毒FHB、薩利病毒NG-J1、人類副腸孤病毒(Parechovirus) 1、克羅希病毒(Crohivirus) B、Yc-3、羅沙病毒(Rosavirus) M-7、香巴病毒(Shanbavirus) A、帕西病毒(Pasivirus) A、帕西病毒A 2、埃可病毒(Echovirus) E14、人類副腸孤病毒(Parechovirus) 5、愛知病毒(Aichi Virus)、A型肝炎病毒HA16、馮皮病毒(Phopivirus)、CVA10、腸病毒C、腸病毒D、腸病毒J、人類佩吉病毒(Pegivirus) 2、GBV-C GT110、GBV-C K1737、GBV-C Iowa、佩吉病毒A 1220、帕西病毒A3、薩佩洛病毒(Sapelovirus)、羅沙病毒B、巴庫薩病毒(Bakunsa Virus)、震顫病毒(Tremovirus) A、豬帕西病毒1、PLV-CHN、帕西病毒A、西西尼病毒(Sicinivirus)、C型肝炎病毒K、C型肝炎病毒屬A、BVDV1、邊界病病毒(Border Disease Virus)、BVDV2、CSFV-PK15C、SF573雙順反子病毒(Dicistrovirus)、湖北微小RNA病毒樣病毒(Hubei Picorna-like Virus)、CRPV、薩利病毒A BN5、薩利病毒A BN2、薩利病毒A 02394、薩利病毒A GUT、薩利病毒A CH、薩利病毒A SZ1、薩利病毒FHB、CVB3、CVB1、埃可病毒(Echovirus) 7、CVB5、EVA71、CVA3、CVA12、EV24或eIF4G之適體。
在一些實施例中，IRES完全或部分地包含來自真核或細胞IRES。在某些實施例中，IRES來自人類基因，其中人類基因為ABCF1、ABCG1、ACAD10、ACOT7、ACSS3、ACTG2、ADCYAP1、ADK、AGTR1、AHCYL2、AHI1、AKAP8L、AKR1A1、ALDH3A1、ALDOA、ALG13、AMMECR1L、ANGPTL4、ANK3、AOC3、AP4B1、AP4E1、APAF1、APBB1、APC、APH1A、APOBEC3D、APOM、APP、AQP4、ARHGAP36、ARL13B、ARMC8、ARMCX6、ARPC1A、ARPC2、ARRDC3、ASAP1、ASB3、ASB5、ASCL1、ASMTL、ATF2、ATF3、ATG4A、ATP5B、ATP6V0A1、ATXN3、AURKA、AURKA、AURKA、AURKA、B3GALNT1、B3GNTL1、B4GALT3、BAAT、BAG1、BAIAP2、BAIAP2L2、BAZ2A、BBX、BCAR1、BCL2、BCS1L、BET1、BID、BIRC2、BPGM、BPIFA2、BRINP2、BSG、BTN3A2、C12orf43、C14orf93、C17orf62、C1orf226、C21orf62、C2orf15、C4BPB、C4orf22、C9orf84、CACNA1A、CALCOCO2、CAPN11、CASP12、CASP8AP2、CAV1、CBX5、CCDC120、CCDC17、CCDC186、CCDC51、CCN1、CCND1、CCNT1、CD2BP2、CD9、CDC25C、CDC42、CDC7、CDCA7L、CDIP1、CDK1、CDK11A、CDKN1B、CEACAM7、CEP295NL、CFLAR、CHCHD7、CHIA、CHIC1、CHMP2A、CHRNA2、CLCN3、CLEC12A、CLEC7A、CLECL1、CLRN1、CMSS1、CNIH1、CNR1、CNTN5、COG4、COMMD1、COMMD5、CPEB1、CPS1、CRACR2B、CRBN、CREM、CRYBG1、CSDE1、CSF2RA、CSNK2A1、CSTF3、CTCFL、CTH、CTNNA3、CTNNB1、CTNNB1、CTNND1、CTSL、CUTA、CXCR5、CYB5R3、CYP24A1、CYP3A5、DAG1、DAP3、DAP5、DAXX、DCAF4、DCAF7、DCLRE1A、DCP1A、DCTN1、DCTN2、DDX19B、DDX46、DEFB123、DGKA、DGKD、DHRS4、DHX15、DIO3、DLG1、DLL4、DMD UTR、DMD ex5、DMKN、DNAH6、DNAL4、DUSP13、DUSP19、DYNC1I2、DYNLRB2、DYRK1A、ECI2、ECT2、EIF1AD、EIF2B4、EIF4G1、EIF4G2、EIF4G3、ELANE、ELOVL6、ELP5、EMCN、ENO1、EPB41、ERMN、ERVV-1、ESRRG、ETFB、ETFBKMT、ETV1、ETV4、EXD1、EXT1、EZH2、FAM111B、FAM157A、FAM213A、FBXO25、FBXO9、FBXW7、FCMR、FGF1、FGF1、FGF1A、FGF2、FGF2、FGF-9、FHL5、FMR1、FN1、FOXP1、FTH1、FUBP1、G3BP1、GABBR1、GALC、GART、GAS7、胃泌素、GATA1、GATA4、GFM2、GHR、GJB2、GLI1、GLRA2、GMNN、GPAT3、GPATCH3、GPR137、GPR34、GPR55、GPR89A、GPRASP1、GRAP2、GSDMB、GSTO2、GTF2B、GTF2H4、GUCY1B2、HAX1、HCST、HIGD1A、HIGD1B、HIPK1、HIST1H1C、HIST1H3H、HK1、HLA-DRB4、HMBS、HMGA1、HNRNPC、HOPX、HOXA2、HOXA3、HPCAL1、HR、HSP90AB1、HSPA1A、HSPA4L、HSPA5、HYPK、IFFO1、IFT74、IFT81、IGF1、IGF1R、IGF1R、IGF2、IL11、IL17RE、IL1RL1、IL1RN、IL32、IL6、ILF2、ILVBL、INSR、INTS13、IP6K1、ITGA4、ITGAE、KCNE4、KERA、KIAA0355、KIAA0895L、KIAA1324、KIAA1522、KIAA1683、KIF2C、KIZ、KLHL31、KLK7、KRR1、KRT14、KRT17、KRT33A、KRT6A、KRTAP10-2、KRTAP13-3、KRTAP13-4、KRTAP5-11、KRTCAP2、LACRT、LAMB1、LAMB3、LANCL1、LBX2、LCAT、LDHA、LDHAL6A、LEF1、LINC-PINT、LMO3、LRRC4C、LRRC7、LRTOMT、LSM5、LTB4R、LYRM1、LYRM2、MAGEA11、MAGEA8、MAGEB1、MAGEB16、MAGEB3、MAPT、MARS、MC1R、MCCC1、METTL12、METTL7A、MGC16025、MGC16025、MIA2、MIA2、MITF、MKLN1、MNT、MORF4L2、MPD6、MRFAP1、MRPL21、MRPS12、MSI2、MSLN、MSN、MT2A、MTFR1L、MTMR2、MTRR、MTUS1、MYB、MYC、MYCL、MYCN、MYL10、MYL3、MYLK、MYO1A、MYT2、MZB1、NAP1L1、NAV1、NBAS、NCF2、NDRG1、NDST2、NDUFA7、NDUFB11、NDUFC1、NDUFS1、NEDD4L、NFAT5、NFE2L2、NFE2L2、NFIA、NHEJ1、NHP2、NIT1、NKRF、NME1-NME2、NPAT、NR3C1、NRBF2、NRF1、NTRK2、NUDCD1、NXF2、NXT2、ODC1、ODF2、OPTN、OR10R2、OR11L1、OR2M2、OR2M3、OR2M5、OR2T10、OR4C15、OR4F17、OR4F5、OR5H1、OR5K1、OR6C3、OR6C75、OR6N1、OR7G2、p53、P2RY4、PAN2、PAQR6、PARP4、PARP9、PC、PCBP4、PCDHGC3、PCLAF、PDGFB、PDZRN4、PELO、PEMT、PEX2、PFKM、PGBD4、PGLYRP3、PHLDA2、PHTF1、PI4KB、PIGC、PIM1、PKD2L1、PKM、PLCB4、PLD3、PLEKHA1、PLEKHB1、PLS3、PML、PNMA5、PNN、POC1A、POC1B、POLD2、POLD4、POU5F1、PPIG、PQBP1、PRAME、PRPF4、PRR11、PRRT1、PRSS8、PSMA2、PSMA3、PSMA4、PSMD11、PSMD4、PSMD6、PSME3、PSMG3、PTBP3、PTCH1、PTHLH、PTPRD、PUS7L、PVRIG、QPRT、RAB27A、RAB7B、RABGGTB、RAET1E、RALGDS、RALYL、RARB、RCVRN、REG3G、RFC5、RGL4、RGS19、RGS3、RHD、RINL、RIPOR2、RITA1、RMDN2、RNASE1、RNASE4、RNF4、RPA2、RPL17、RPL21、RPL26L1、RPL28、RPL29、RPL41、RPL9、RPS11、RPS13、RPS14、RRBP1、RSU1、RTP2、RUNX1、RUNX1T1、RUNX1T1、RUNX2、RUSC1、RXRG、S100A13、S100A4、SAT1、SCHIP1、SCMH1、SEC14L1、SEMA4A、SERPINA1、SERPINB4、SERTAD3、SFTPD、SH3D19、SHC1、SHMT1、SHPRH、SIM1、SIRT5、SLC11A2、SLC12A4、SLC16A1、SLC25A3、SLC26A9、SLC5A11、SLC6A12、SLC6A19、SLC7A1、SLFN11、SLIRP、SMAD5、SMARCAD1、SMN1、SNCA、SNRNP200、SNRPB2、SNX12、SOD1、SOX13、SOX5、SP8、SPARCL1、SPATA12、SPATA31C2、SPN、SPOP、SQSTM1、SRBD1、SRC、SREBF1、SRPK2、SSB、SSB、SSBP1、ST3GAL6、STAB1、STAMBP、STAU1、STAU1、STAU1、STAU1、STAU1、STK16、STK24、STK38、STMN1、STX7、SULT2B1、SYK、SYNPR、TAF1C、TAGLN、TANK、TAS2R40、TBC1D15、TBXAS1、TCF4、TDGF1、TDP2、TDRD3、TDRD5、TESK2、THAP6、THBD、THTPA、TIAM2、TKFC、TKTL1、TLR10、TM9SF2、TMC6、TMCO2、TMED10、TMEM116、TMEM126A、TMEM159、TMEM208、TMEM230、TMEM67、TMPRSS13、TMUB2、TNFSF4、TNIP3、TP53、TP53、TP73、TRAF1、TRAK1、TRIM31、TRIM6、TRMT1、TRMT2B、TRPM7、TRPM8、TSPEAR、TTC39B、TTLL11、TUBB6、TXLNB、TXNIP、TXNL1、TXNRD1、TYROBP、U2AF1、UBA1、UBE2D3、UBE2I、UBE2L3、UBE2V1、UBE2V2、UMPS、UNG、UPP2、USMG5、USP18、UTP14A、UTRN、UTS2、VDR、VEGFA、VEGFA、VEPH1、VIPAS39、VPS29、VSIG10L、WDHD1、WDR12、WDR4、WDR45、WDYHV1、WRAP53、XIAP、XPNPEP3、YAP1、YWHAZ、YY1AP1、ZBTB32、ZNF146、ZNF250、ZNF385A、ZNF408、ZNF410、ZNF423、ZNF43、ZNF502、ZNF512、ZNF513、ZNF580、ZNF609、ZNF707或ZNRD1。
在一些實施例中，細胞為肌管。在一些實施例中，IRES衍生自博匹病毒(Bopivirus)、奧西病毒(Oscivirus)、亨尼病毒(Hunnivirus)、雀病毒(Passerivirus)、米斯蒂病毒(Mischivirus)、嵴病毒、腸病毒、心病毒、薩利病毒(Salivirus)、拉博病毒(Rabovirus)、副腸孤病毒、加利病毒(Gallivirus)或斯西尼病毒(Sicinivirus)。在一些實施例中，IRES衍生自亨尼病毒(Hunnivirus)、雀病毒、嵴病毒、博匹病毒或腸病毒。在一些實施例中，IRES由腸道病毒I、腸道病毒F、腸道病毒E、腸道病毒J、腸道病毒C、腸道病毒A、腸道病毒B、愛知病毒B、副腸孤病毒A、心病毒F、心病毒B或心病毒E衍生。
在一些實施例中，細胞為肝細胞。在一些實施例中，IRES衍生自腸病毒、博匹病毒、米斯蒂病毒、加利病毒、奧西病毒、心病毒、嵴病毒、拉博病毒、薩利病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、鳥取病毒(Tottorivirus)、雀病毒、科薩病毒(Cosavirus)或斯西尼病毒。在一些實施例中，IRES衍生自腸病毒、米斯蒂病毒、嵴病毒、博匹病毒或加利病毒。在一些實施例中，IRES由衍生腸道病毒B、腸道病毒A、腸道病毒D、腸道病毒J、腸道病毒C、鼻病毒B、腸道病毒H、腸道病毒I、腸道病毒E、腸道病毒F、腸道病毒B、愛知病毒A、愛知病毒A、副腸孤病毒F、心病毒E或心病毒B。
在一些實施例中，該細胞為T細胞。在一些實施例中，IRES衍生自雀病毒、博匹病毒、匈奴病毒、米斯蒂病毒、腸病毒、嵴病毒、拉博病毒、鳥取病毒、薩利病毒、心病毒、副腸孤病毒、美格瑞病毒(Megrivirus)、青蔥X病毒(Allexivirus)或山巴病毒(Shanbavirus)。在一些實施例中，IRES衍生自雀病毒、匈奴病毒、米斯蒂病毒、腸病毒或嵴病毒。在一些實施例中，IRES由腸道病毒I、腸道病毒D、腸道病毒C、腸道病毒A、腸道病毒J、腸道病毒H、愛知病毒B、副腸孤病毒A或心病毒B衍生。
為驅動蛋白質表現，環狀RNA包含可操作地連接於蛋白質編碼序列之IRES。例示性IRES序列提供於表1A中。在一些實施例中，本文所揭示之環狀RNA構築體及相關醫藥組合物包含與表1A中之IRES序列或來自SEQ ID NO: 50-61之構築體或表1B之構築體A-P中之任一者的IRES至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的IRES序列。在一些實施例中，本文所揭示之環狀RNA構築體及相關醫藥組合物包含表1A中之IRES序列或來自SEQ ID NO: 50-61之構築體或表1B之構築體A-P中之任一者的IRES。本文揭示用於例如藉由將IRES之5'端及/或3'端截短，在IRES 5'端添加間隔子，修飾轉譯起始位點5'端之6個核苷酸(Kozak序列)，修飾替代性轉譯起始位點及產生嵌合/雜交IRES序列來提高或降低IRES活性之對IRES及輔助序列之修飾。在一些實施例中，本文所揭示之環狀RNA構築體及相關醫藥組合物中之IRES序列相對於天然IRES包含此等修飾中之一或多者。
在特定實施例中，本文所揭示之環狀RNA構築體包含IRES及至少一個編碼結合分子之表現序列。在特定實施例中，IRES序列為下表1A中所提供之例示性IRES序列，或來自SEQ ID NO: 50-61之構築體或表1B之構築體A-P中之任一者的IRES。在一些實施例中，本文所揭示之環狀RNA構築體及相關醫藥組合物包含與表1A中之IRES序列或來自SEQ ID NO: 50-61之構築體或表1B之構築體A-P中之任一者的IRES至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的IRES序列。在一些實施例中，本文所揭示之環狀RNA構築體及相關醫藥組合物包含表1A中之IRES序列或來自SEQ ID NO: 50-61之構築體或表1B之構築體A-P中之任一者的IRES及至少一個編碼結合分子之表現序列。 表1A：IRES序列
IRES NO: SEQ ID NO: 序列
1-1 1 TTAAAACAGCTCTGGGGTTGTTCCCACCCCAGAGGCCCACGTGGCGGCCAGTACTCCGGTATTACGGTACCCTTGTACGCCTGTTTTATACTCCCTTCCCCTGTAACTTAGAAGCATACAAACCAAGTTCAATAGAAGGGGGTACAAACCAGTACCACCACGAACAAGCACTCCTGTTTCCCCGGTGACATTGCATAGACTGTACCCACGGTTGAAAGCGATCGATCCGTTACCCGCTCCTGTACTTCGAGAAGCCTAGTATCATCTTGGAATCTTCGATGCGTTGCGCTCAGCACTCAACCCCAGAGTGTAGCTTAGGCTGATGAGTCTGGACGTCCCCCACCGGCGACGGTGGTCCAGGCTGCGTTGGCGGCCTACCTGTGGCCCAAAGCCACAGGACGCTAGTTGTGAACAAGGTGTGAAGAGCCTATTGAGCTACAAGAGAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACCACGGAGCAGGCAGTTGCAAACCAGCAACCGGCCTGTCGTAACGCGCAAGTCTGTGGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTATTTTTACAATGGCTGCTTATGGTGACAATCATAGATTGTTATCATAAAGCGACTTGGATTGGCCATCCGGTGAAAGTAAAACACATTGTTTACTTGTTTGTTGGATTCACTCCAATTAACACTTTTACTTACAAACTCATTACAACAACTCTATTAATTAGAGATAAGCATCACA
1-2 2 TTTCCCCTGTTCGTAACTAAGTGTGTGCCCAATCTCCTCACTCCTGCTGGCTTCACCGACCGGCAGTGTCCAAAATGCTAGGTGAATCCCCTCCCTTTCCTCTGGGCTTCTGCCCAGCTTCCTCCCCCCAGCCTGACGTGACACAGGCTGTGCAAAGACCCCGCGAAAGCTGCCAAAAGTGGCAATTGTGGGTCCCCCCTTTGTAAAGGCGTCGAGTCTTTCTCCCTCAAGGCTAGACCCGTCAGTGAATTCTGTCGGGCAACTAGTGACGCCACTGCACGCCTCTGACCTCGGCCGCGGAGTGCTGCCCCCCAAGTCGTGCCCCTGACCACAAGTTGTGCTGTCTGGCAAACATTGTCTGTGAGAATGTTCCGCTGTGGCTGCCAAGCCTGGCAACAGGCTGCCCCAGTGTGCGTAGTTCTCATCCAGACTTCGGTCTGGCAACTTGCTGTTAAGACACGGCGTAAGGGGCGTGTGCCAACGCCCTGGAACGAGTGTCCACTCTAATACCCCGAGGAATGCTACGCAGGTACCCCTGGTTCGCCAGGGATCTGAGCGTAGGCTAATTGTCTAAGGGTATTTTCATTTCCCATTCTTTCTTTCTTGTTCATA
1-3 3 TCCCCGGCATGAGAGGAATAGACTCTTTCAGGGTTGAAGCCACGAGTGTCGTTACCCGCACTGGTACTACGCAAAGCCTAGTAACATCTTGAAACTCTTTTTGGTTGGTCGTTCCACTAGTTACCCCCTAGTAGACCTGGCAGATGAGGCAGGACGCTCCCCACTGGCGACAGTGGTCCTGCCTGCGTGGCTGCCTGCACACCCTTCGGGGTGTGAAGCCAAAAGAAAGACAAGGTGTGAAGAGCCCCGTGTGCTACCAGTGAATCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCTTACCCCACAGCTATTGCACACAATCCAGTGTGTATGTAGTCGTAATGAGCAATTGTGGGACGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTATTCCCATGTTTCTGCTTATGGTGACAATACTGACGTATAGTGTTGTTACC
1-4 4 TTAAAACAGCGGATGGGTATCCCACCATCCGGCCCACTGGGTGTAGTACTCTGGTACATTGTACCTTTGTACGCCTGTTTTCCCCCTCTTGTACCCGCCCTTCAAGCTCCTTGCCCAAGTAACGTTAGAAGTTTGAACATTGGTACAATAGGAAGCATCACATCCAGTGGTGTACTGTACAAACACTTCTGTTGCCCCGGAGCGAGGTATAGATGGTCCCCACCGTCAAAAGCCTTTAACCGTTATCCGCCAATCAACTACGTAATGGCTAGTAGCACCTTGGATTTAAGTTGGCGTTCGATCAGGTGGTAACCCCCACTAGTTTGGTCGATGAGGCTAGGAATTCCCCACGGGTGACCGTGTCCTAGCCTGCGTGGCGGCCAACCCAGCATCCGCTGGGACGCCAATTTAATGACATGGTGTGAAGACCTGCATGTGCTTGATTGTGAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAACCCTAACCCCGGAGCCTTGCAGCACAATCCAGTGTTGTTAAGGTCGTAATGAGCAATTCTGGGATGGGACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCTTATTTTTCTTGAATTTTTCTTATGGTCACAGCATATATACATTATATACTGTGATC
1-5 5 TTAAAATAGCCTCAGGGTTGTTCCCACCCTGAGGGCCCACGTGGTGTAGTACTCTGGTATTACGGTACCTTTGTACGCCTATTTTATACCCCCTTCCCCAAGTAATTTAGAAGCAAGCACAAACCAGTTCAGTAGTAAGCAGTACAATCCAGTACTGTAATGAACAAGTACTTCTGTTACCCCGGAAGGGTCTATCGGTAAGCTGTACCCACGGCTGAAGAATGACCTACCGTTAACCGGCTACCTACTTCGAGAAGCCTAGTAATGCCGTTGAAGTTTTATTGACGTTACGCTCAGCACACTACCCCGTGTGTAGTTTTGGCTGATGAGTCACGGCACTCCCCACGGGCGACCGTGGCCGTGGCTGCGTTGGCGGCCAACCAAGGAGTGCAAGCTCCTTGGACGTCATATTACAGACATGGTGTGAAGAGCCTATTGAGCTAGGTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTCCGGAGCATATCGGTGCGAACCAGCACTTGGTGTGTTGTAATACGTAAGTCTGGAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTGTTTTAACTTTTATGGCTGCTTATGGTGACAATTTAACATTGTTACCATATAGCTGTTGGGTTGGCCATCCGGATTTTGTTATAAAACCATTTCCTCGTGCCTTGACCTTTAACACATTTGTGAACTTCTTTAAATCCCTTTTATTAGTCCTTAAATACTAAGA
1-6 6 TTCAAACAGCCTGGGGGTTGTACCCACCCCTGGGGCCCACGTGGCGCTAGTACTCTGGTACGTTAGTACCTTTGTACGCCTGTTTTCCCCTCCCTTAAACAAATTAAGATTACCACTACTGAGGGGAGTAGTCCGACTCCGCTCCGGTACTGCCGCACCAGTACTCCGGTACACTTAGTACCCTAGTACGGAGTAGATGGTATCCCCACCCCGCAACTTAGAAGCATGCAAACAAACCGACCAATAGGCGCACGATATCCAGTCGTGTTTCGGTCAAGCACTTCTGTCTCCCCGGTCCGAAAGGATCGTTACCCGCCCGACCCACTACGAGAAGCCCAGTAACTGGCCAAGTGATTGCGAAGTTGCGCTCAGCCACAACCCCAGTGGTAGCTCTGGAAGATGGGGCTCGCGTCTCCCCCGTGGTGACACGGTCGCTTGCCCGCGTGTGCTTCCGGGTTCGGCCTACGCCGTTCACTTCAATGTCACGTAACCAGCCAAGAGCCTATTGTGCTGGGACGGTTTTCCTCCGGGGCCGTGAATGCTGCTAATCCCAACCTCCGAGCGTGTGCGCACAACCCAGTGTTGCTACGTCGTAATGCGTAAGTTGGAGGCGGAACAGACTACTTTCGGTACCCCGTGTTTCCTTTAAATTTTATTCATTATTTTATGGTGACAATTGCTGAGATCTGCGAATTAGCGACTCTGCCGTTGAATATTGCTCTGTACTATTTGGTTGCATTCCACAAAACCTCTGACATCCCCAGTACATACATTACTTTACTTGTTTACCTCAATCTAAAGCACAAGCTAGATAATACAAA
1-7 7 TTTAAACAGCCTGGGGGTTGTTCCCACCCCTGGGGCCCACGTGGCGCTAGTACTCTGGTACGCTAGTACCTTTGTACGCCTGTTTTTCCCCTCCCTTAAATAAATCAAGGTTGCCACTACTGAGGGGAGTAGTCCGACTCCGCTCCAGCAATGCTGCACCAGTGCACTGGTACGCTAGTACCTTTTCACGGAGTAGATGGTATCCCTTACCCCGGAACCTAGAAGATTGCACACAAACCGACCAATAGGCGCACCGCATCCAGCCGTGCAGCGGTCAAGCACTTCTGTCTCCCCGGTCTGTAAAGATCGTTATCCGCCCGACCCACTACGAAAAGCCTAGTAACTGGCCAAGTGAACGCGAAGTTGCGCTCCGCCACAACCCCAGTGGTAGCTCTGGAAGATGGGGCTCGCACCACCCCCGTGGTAACACGGTTGCCTGCCCGCGTGTGCTTCCGGGTTCGGTCTCGTGCCGTTCACTTCAACTTCACGCAACCAGCCAAGAGCCTATTGTGCTGGGACGGTTTTCCTCCGGGGCCGTGAATGCTGCTAATCCCAACCTCCGAGCGTGTGCGCACAATCCAGTGTTGCTACGTCGTAACGCGTAAGTTGGAGGCGGAACAGACTACTTTCGGTACCCCGTGTTTCCTCTCATTTTATTTAATATTTTATGGTGACAATTGTTGAGATTTGCGCTCTTGCAACGTTGCCATTGAATATTGGCTTATACTATTTGGTTGCCTTTTACAAAACCTCTGATATACCCAGTTCTTACATTGATCTGCTTGTTTTTCTCAATTTGAAGTATAGACTACAAATAGCAAA
1-8 8 CCCCCCTCCCCCCCTTCCCTTCCCTTTGCAACGCAACAATTGTAAGTGCCCTCACCTGTCAATTGGGACCACCACTTTCAGTGACCCCATGCGAAGTGCTGAGAGAAAGGAAGCTTTCTTACCCTTCATTTGTGAACCCACTGGTCTAAGCCGCTTGGAATACGATGAGTGGAAAAGTTCATTCTTAATGGAGTGAAACATGCTTAAATTTCCAGCTCGTGCTGGTCTTTCCAGTACGGGGCGGCCCTGTCTGGCCGTAATTCTTCAGAGTGTCACGCCACACTTGTGGATCTCACGTGCCACATGACAGCGCTACAGCTGGAACTGGGTGCTTGGTGCCCATGGAGTAACAGCGAAAAGTGTTAGATCAAGCCTTGCTTGGGCTATGAGCCTGCGGAACAACAACTGGTAACAGTTGCCTCAGGGGCCGAAAGCCACGGTGTTAACAGCACCCTCATAGTTTGATCCACCTCAGGGTGGTGATGTTTAGCAGTTAGTAGTTGCCAATCTGTGTTCACTGAAATCTCGGCATACCGTGTAGTGTACAGGGGTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCGTAGGTAACCTTAAGAGACTATGGATCTGATCTGGGGCCTTGTCCGGAGTGCTTTACACACGGCTCAAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCACAGAGCCCGAGGGATTCGGGTTTTCCCTTTAAAAACCCGACTAGAGCTTATGGTGACAATTATTGCTGTTCAGACGAACAGTGTAATTGTTGTCTATTCACAGCAGTTCTATCAGAGCTTTTCCCACAACGGATCTTCTTGGCAAGCAAATACAGCAGGAGTCAAT
1-9 9 CACTACGTTACGGTTCCCGCCCGGGACAACTGGTACCCCATTAGGCTACAACATGGCTGAAAAGGGTATTGGGTCCCCCCGGATTGTGTCCGTTCGTAGTGTGTGTAACGTGGTTTACCATCTCCACTAACATTGGACTAAGCATTTCATCTTTCCTCCCCGATTGTGTACTCACTTGGCTAACGCTGGGTGGTCGCGGTTGGGTCCTTGATTTACTTTTTCTCGTCTAAGCATTCCGACTGTCCTCCCCGATTATGTGCTCATTCAGTTAACTGCTGGGTGGTCATGACTAACATCGAGGAACCTTCTGTCCACGCTTACTTTGAGCTCCGGTCGCTTGACGCTTGTAGGGCGATAGGGTTATCTTCCTGACAACATCTTTATTCTACCTCCATAGGCTCTATCTATGGAGACGGAGTGTGGCACCCGTCCCTTCTTTGGGAGCTTCGGTAGTGACGCCCTTTGTCACTCTCGCCAGCCGAGGCATGCCTGGTGCCAGGTAGCAAAGAAAGCATATGTTTAAGGACTTGACTGATTTAGCGCAAGAGTTTGTAGCGATGTCCATAGTGTCTGCGGATTCCCCACACGGCGACGTGTGCCGCGGAGGCCAAAAGCCACGGTGTTCACAGCACCCCTATGGATGCCCACAGACCCCAGTGGGCACTCTTGTTGCCGGACTTTCAGGAAATTAGGCATAGGCTCTTCTCAAACTCCTGGCATTGGACTAGGTAAGAATGCCCCGGAGGTACCCCAGTACTCCTTCGGGAGTCTGGGATCTGACCGGGGGCCCCACAAACATGCTTTACGTGTTTCGTGCGGTCAAAAATTGTCTAACTAGTCCCAACCTTGAACAAGGGATTGTTCTTTCCTTTTTATTACTGAGACTGGCCTATGGTGACAACAGAGATTGACTGTGAATACAGTTATTTTCTGGTGTTTATCATTTGGTTTTTCTCCGTGCTCTTTTACCTTTGTGGTATTTGTTCTTTAGATAGGCAAA
1-10 10 CCCGGCCACCCCCTTTCGACGCGGGTACTGCGATAGTGCCACCCCAGTCTTTCCTACTCCCGACTCCCGACTCTAACCCAGGTTCCTTGGAACAGGAACACCAATATACTCATCCCCTGGATGCTGACTAATCAGAGGAACGTCAGCATTTTCCGGCCCAGGCTAAGAGAAGTAGATAAGTTAGATTCCAAATTGATTTATCATCCCCTTGACGAATTCGCGTTGGAAATGCACCTCTCACTTGCCGCTCTTCACACCCATTAACTTGATTCGGCCTCTGTGTTGAGCCCCTTGTTGAAGTGCTTCCCTCCATCGTGACGTGGTTGGAGATCTAAGTCAACCGACTCCGACGAAACTACCATCATGCCTCCCCGATTATGTGATGCTTTCTGCCCTGCTGGGTGGAGCATCCTCGGGTTGAGAAAACCTTCTTCCTTTTTCCTTGGACCCCGGTCCCCCGGTCTAAGCCGCTTGGAATAAGACAGGGTTATCTTCACCTCTTCCTTCTTCTACTTCATAGTGTTCTATACTATGAAAGGGTATGTGTCGCCCCTTCCTTCTTTGGAGAACACGCGCGGCGGTCTTTCCGTCTCTCGAAAAGCGCGTGTGCGACATGCAGAGAACCGTGAAGAAAGCAGTTTGCGGACTAGCTTTAGTGCCCACAAGAAAACAGCTGTAGCGACCACACAAAGGCAGCGGACCCCCCCTCCTGGCAACAGGAGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGGATAAGATCCACCTTTGTGTGCGGCACAACCCCAGTGCCCTGGTTTCTTGGTGACACTTCAGTGAAAACGCAAATGGCGATCTGAAGCGCCTCTGTAGGAAAGCCAAGAATGTCCAGGAGGTACCCCTTCCCTCGGGAAGGGATCTGACCTGGAGACACATCACATGTGCTTTACACCTGTGCTTGTGTTTAAAAATTGTCACAGCTTTCCCAAACCAAGTGGTCTTGGTTTTCACTCTTTAAACTGATTTCACT
1-11 11 CCCCCGGTTACCCCCTTTCGACGCGGGTACTGCGATAGTGCCACCCCAGTCTTTCCTACTCCCGACTCCCGACCCTAACCCAGGTTCCTCGGAACAGGAACACAAATTTACTCATCCCCTGGATGCTGACTAATCAGAGGAACGTCAGCATTTTCCGGCCCAGGCTTAGAGAAGTAGATAAGTTAGAATCTAAATTGATATGACTTCCCCTTGACGAATTCACGTTGGAAATGCACCCCTCACTTGCCGCTCTTCACACCCACTAATTGATTCGGCCTACTGTGTTGAGCCCCTTGTTGAAGTGCTTCCCTCCCTCGTGACGTGGTTGGAGAAATCTTGTCACCCGACTCCGACGAAACTACCATCATGCCTCCCCGATTATGTGATGCTTTCTGCCCTGCTGGGTGGAGTATCCTCGGGTTGAGAAATCCTTCTTCCTTTTACCTTGGACCTTGGTCCCCCGGTCTAAGCCGCTTGGAATAAGACAGGGTTATTTTCACCTCTTCTTCTTCTACTTCATGGTGCTCTATACCATGAAAGGGTATGTGTCGCCCCTTCCTTCTTGGAGAACTCACGCGGCGGTCTTCCGTCTCTCAAAAAGCGCGAGTGCGACATGCAGAGTAACGCGAAGAAAGCAGTTCCTGGCCTAGCTCTAGTGCCCACAAGAAAACGGCTGTAGCGACCACACAAAGGCAGCGGAACTCCCCTCCTGGTAACAGGAGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGGATTAGATCCACCTTTGTGTGCGGTGCAACCCCAGCACCCCGGTTTCTTGTTGACACTCTAGTGAATCCTTGAATGGCAATCTCAAGCGCCTCTGTAGGAAAGCCAAGAATGTCCAGGAGGTACCCCTTCCTCGCGGAAGGGATCTGACCTGGAGACACATCACACGTGCTTTACACTTGTGCTTGTGTTTAAAAATTGTCACAGCTTTCCCAAACCAAGTGGTCTTGGTTTTCCTTTTTTATCCTACTGTCAAT
1-12 12 TCCTCACCCATGCTTTTCCTACCCCCACCACGCCCGCATGTTTACTGCTTTCCTTGATGCTGCCCGTGACTACTTCCATGACCTCCCCAACCCAAACCTCAAACGCCTTAAGCTATCATGGGCTCTCTATCACCAATCCCCTTCCTTCCCACCCAGAACCCCCCCCTCCCTCCCCTACAACGTGTATGAGCAAGACGAGTTTGACAAGCTCGCCGAAGCCATGCTCACCCACTCTCCCTTCCCCACATCCCATTACCTCTTCCACCCCCTCCCGTCCAACGCCCGCACCATCGTCGAGCGTGAGGCTGACTGGGATGGCTGTGATCTAGAAAAGAAATGGCTCGACCTCGTCATAGAGGACGATGCCAAGTTCCTTCTGGAGAACGGCTCTCTCCCGTTTGGCTCCACCCTTGCC
1-13 13 TTCTCGCCTGAGTCAACAAAGCGAGAAACCTGCCCCTCCAGCGCCAGACGAGCGGCATAAAACTTGAACTTCTGGCATGCTCCACCACCCTTTTCCCCATTCCAACCCCCATTGCGCTCTCAAGGTCGCGCTTTTTCGAGACTAGCTCGGATTCAAAAGTTCCTGGCACCCTTTGCCCCTTCAGGCCCTTAAGGTAGGAACTGACCTTGTGCTGTGCCCTCGGTGCGGAAGTGCTACTGCGTAGCGATTGTAAGATCCCTTTGTGGTTCTGCCCTGGCAAGGTTATAGAGTACTGTGATCCGCTGCGGATGCCATCCTGGTAACAGGACCCCCAGTGTGCGCAACAGTATGTTCACGGTCTTCCGTGTCCACCACATTCGGAACACTGCTCTCGTGAAACAGTGTGTGTCCAATCCCTGCAATCAGTATCAACTACACCACCTAGGAATGCTAGGAAGGTACCCCGGTCCGCCGGGATCTGATCCTAGGCTAATTGTCTACGGTGGTGCTCCTTTTTATTTTCCACTTCAATTCATTGGTTACAACTGCTCGATCCCTGTGTTTGCTGCCCTTCTCTGCTCTCATCGCCATTCTCAAGTGTTCACACTGTCCAAGTTCCTTTGGTTGTTCGCTTCCACTTGCCACTGTCAACTCTTGTC
1-14 14 TCACCCTCTTTTCCGGTGGTCCGGACCCAGACCACCGTTACTCCATTCAGCTTCTTCGGAACCTGTTTGGAGGAATTAAACGGGCACCCACCCACCTTCACCCCCTTTTCGTAACTAAGTGTGTGCCCAATCTCATGACTCCTGCTGACTTCACCGACCAGCAGTGTCCAAAACGCTAGGTGAATTTCCTTCCTCCCCCTCTGGGCTTCTGCCCAGCTCCCTCCCTCCAGCCTGACGTGCCACAGGCTGTGCAAAGACCCCGCGAAAGCTGCCAAAAGTGGCAATTGTGGGTCCCCCCTTTGTAAAGGCGTCGAGTCTTTCTCCCTTAAGGCTAGACCCGTCAGTGAATTCTGTCGGGCAACTAGTGACGCCACTGCATGCCTCCGACCTCGGCCGCGGAGTGCTGCCCCCCAAGTCGTGCCCCTGACTACAAGTTGTGCTGTCTGGCAAACATTGTCTGTGAGAATGTTCCGCTGTGGCTGCCAAGCCTGGTAACAGGCTGCCCCAGTGTGCGTAGTTCTCATCCAGACTTCGGTCTGGCAACTTGCTGTTAAGACACGGCGTAAGGGGCGTGTGCCAACGCCCTGGAACGAGTGTCCACTCTAATACCCCGAGGAATGCTACGCAGGTACCCCTGGCTCCCCAGGGATCTGAGCGTAGGCTAATTGTCTAAGGGTATTTTCATTTCCCACTCTTTCTTTCTTGTTCATA
1-15 15 TCTGTCCTCACCCCATCTTCCCTTCTTTCCTGCACCGTTACGCTTACTCGCATGTGCATTGAGTGGTGCACGTGCTTGAACAAACAGCTACACTCACATGGGGGCGGGTTTTCCCGCCCTGCGGCCTCTCGCGAGGCCCACCCCTCCCCTTCCTCCCATAACTACAGTGCTTTGGTAGGTAAGCATCCTGATCCCCCGCGGAAGCTGCTCACGTGGCAACTGTGGGGACCCAGACAGGTTATCAAAGGCACCCGGTCTTTCCGCCTTCAGGAGTATCCCTGCTAGTGAATTCTAGTAGGGCTCTGCTTGGTGCCAACCTCCCCCAAATGCGCGCTGCGGGAGTGCTCTTCCCCAACTCACCCTAGTATCCTCTCATGTGTGTGCTTGGTCAGCATATCTGAGACGATGTTCCGCTGTCCCAGACCAGTCCAGTAATGGACGGGCCAGTGTGCGTAGTCGTCTTCCGGCTTGTCCGGCGCATGTTTGGTGAACCGGTGGGGTAAGGTTGGTGTGCCCAACGCCCGTACTTTGGTGATACCTCAAGACCACCCAGGAATGCCAGGGAGGTACCCCGCTTCACAGCGGGATCTGACCCTGGGCTAATTGTCTACGGTGGTTCTTCTTGCTTCCACTTCTTTCTACTGTTCATG
1-16 16 ATTCTCGGGCTACGGCCCTGGAGCCACTCCGGCTCCTAAAGATTTAGAAGTTTGAGCACACCCGCCCACTAGGGCCCCCCATCCAGGGGGGCAACGGGCAAGCACTTCTGTTTCCCCGGTATGATCTGATAGGCTGTAACCACGGCTGAAACAGAGATTATCGTTATCCGCTTCACTACTTCGAGAAGCCTAGTAATGATGGGTGAAATTGAATCCGTTGATCCGGTGTCTCCCCCACACCAGAAACTCATGATGAGGGTTGCCATCCCGGCTACGGCGACGTAGCGGGCATCCCTGCGCTGGCATGAGGCCTCTTAGGAGGACGGATGATATGGATCTTGTCGTGAAGAGCCTATTGAGCTAGTGTCGACTCCTCCGCCCCCGTGAATGCGGCTAATCCTAACCCCGGAGCAGGTGGGTCCAATCCAGGGCCTGGCCTGTCGTAATGCGTAAGTCTGGGACGGAACCGACTACTTTCGGGAAGGCGTGTTTCCATTTGTTCATTATTTGTGTGTTTATGGTGACAACTCTGGGTAAACGTTCTATTGCGTTTATTGAGAGATTCCCAACAATTGAACAAACGAGAACTACCTGTTTTATTAAATTTACACAGAGAAGAATTACA
1-17 17 GTGGCCACGCCCGGGCCACCGATACTTCCCTTCACTCCTTCGGGACTGTTGGGGAGGAACACAACAGGGCTCCCCTGTTTTCCCATTCCTTCCCCCTTTTCCCAACCCCAACCGCCGTATCTGGTGGCGGCAAGACACACGGGTCTTTCCCTCTAAAGCACAATTGTGTGTGTGTCCCAGGTCCTCCTGCGTACGGTGCGGGAGTGCTCCCACCCAACTGTTGTAAGCCTGTCCAACGCGTCGTCCTGGCAAGACTATGACGTCGCATGTTCCGCTGCGGATGCCGACCGGGTAACCGGTTCCCCAGTGTGTGTAGTGCGATCTTCCAGGTCCTCCTGGTTGGCGTTGTCCAGAAACTGCTTCAGGTAAGTGGGGTGTGCCCAATCCCTACAAAGGTTGATTCTTTCACCACCTTAGGAATGCTCCGGAGGTACCCCAGCAACAGCTGGGATCTGACCGGAGGCTAATTGTCTACGGGTGGTGTTTCCTTTTTCTTTTCACACAACTCTACTGCTGACAACTCACTGACTATCCACTTGCTCTGTCACG
1-18 18 TTTGCTCAGCGTAACTTCTCCGGGTTACGTGGAGACCAAAAGGCTACGGAGACTCGGGCTACGGCCCTGGAGCACCTAGGTGCTCCTAAAGACGTTAGAAGTTGTACAAACTCGCCCAATAGGGCCCCCCAACCAGGGGGGTAGCGGGCAAGCACTTCTGTTTCCCCGGTATGATCTCATAGGCTGTACCCACGGCTGAAAGAGAGATTATCGTTACCCGCCTCACTACTTCGAGAAGCCCAGTAATGGTTCATGAAGTTGATCTCGTTGACCCGGTGTTTCCCCCACACCAGAAACCTGTGATGGGGGTGGTCATCCCGGTCATGGCGACATGACGGACCTCCCCGCGCCGGCACAGGGCCTCTTCGGAGGACGAGTGACATGGATTCAACCGTGAAGAGCCTATTGAGCTAGTGTTGATTCCTCCGCCCCCGTGAATGCGGCTAATCCCAACTCCGGAGCAGGCGGGCCCAAACCAGGGTCTGGCCTGTCGTAACGCGAAAGTCTGGAGCGGAACCGACTACTTTCGGGAAGGCGTGTTTCCTTTTGTTCCTTTTATCAAGTTTTATGGTGACAACTCCTGGTAGACGTTTTATTGCGTTTATTGAGAGATTTCCAACAATTGAACAGACTAGAACCACTTGTTTTATCAAACCCTCACAGAATAAGATAACA
在一些實施例中，環狀RNA包含與表1A中之IRES序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列、來自SEQ ID NO: 50-61之構築體的IRES序列或關於表1B之構築體A-P中之任一者展示如下的IRES序列及編碼與表1B之構築體A-P中之任一者展示如下的CAR具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z或4-1BB共刺激域。
在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體A之IRES序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體A之CAR具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體A之IRES序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體A之CAR具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，與具有替代IRES之適合對照相比，該環狀RNA展現增加的表現及/或活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。
在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體B之IRES序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體B之CAR具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體B之IRES序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體B之CAR具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，與具有替代IRES之適合對照相比，該環狀RNA展現增加的表現及/或活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。
在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體C之IRES序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體C之CAR具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體C之IRES序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體C之CAR具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，與具有替代IRES之適合對照相比，該環狀RNA展現增加的表現及/或活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。
在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體D之IRES序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體D之CAR具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體D之IRES序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體D之CAR具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，與具有替代IRES之適合對照相比，該環狀RNA展現增加的表現及/或活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。
在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體E之IRES序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體E之CAR具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體E之IRES序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體E之CAR具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，與具有替代IRES之適合對照相比，該環狀RNA展現增加的表現及/或活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。
在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體F之IRES序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體F之CAR具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體F之IRES序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體F之CAR具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，與具有替代IRES之適合對照相比，該環狀RNA展現增加的表現及/或活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。
在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體G之IRES序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體G之CAR具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體G之IRES序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體G之CAR具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，與具有替代IRES之適合對照相比，該環狀RNA展現增加的表現及/或活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。
在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體H之IRES序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體H之CAR具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體H之IRES序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體H之CAR具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，與具有替代IRES之適合對照相比，該環狀RNA展現增加的表現及/或活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。
在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體I之IRES序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體I之CAR具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體I之IRES序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體I之CAR具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，與具有替代IRES之適合對照相比，該環狀RNA展現增加的表現及/或活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。
在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體J之IRES序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體J之CAR具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體J之IRES序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體J之CAR具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，與具有替代IRES之適合對照相比，該環狀RNA展現增加的表現及/或活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。
在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體K之IRES序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體K之CAR具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體K之IRES序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體K之CAR具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，與具有替代IRES之適合對照相比，該環狀RNA展現增加的表現及/或活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。
在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體L之IRES序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體L之CAR具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體L之IRES序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體L之CAR具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，與具有替代IRES之適合對照相比，該環狀RNA展現增加的表現及/或活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。
在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體M之IRES序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體M之CAR具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體M之IRES序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體M之CAR具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，與具有替代IRES之適合對照相比，該環狀RNA展現增加的表現及/或活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。
在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體N之IRES序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體N之CAR具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體N之IRES序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體N之CAR具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，與具有替代IRES之適合對照相比，該環狀RNA展現增加的表現及/或活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。
在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體O之IRES序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體O之CAR具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體O之IRES序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體O之CAR具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，與具有替代IRES之適合對照相比，該環狀RNA展現增加的表現及/或活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。
在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體P之IRES序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體P之CAR具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與構築體P之IRES序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列，及編碼與構築體P之CAR具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，與具有替代IRES之適合對照相比，該環狀RNA展現增加的表現及/或活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。
在一些實施例中，環狀RNA包含與SEQ ID NO: 8之IRES序列及編碼CAR多肽之序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。
在一些實施例中，環狀RNA包含與SEQ ID NO: 8之IRES序列及編碼HER2 CAR多肽之序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與SEQ ID NO: 8之IRES序列及編碼CD19 CAR多肽之序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與SEQ ID NO: 8之IRES序列及編碼BCMA多肽之序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。
在一些實施例中，環狀RNA包含與SEQ ID NO: 18之IRES序列及編碼CAR多肽之序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。
在一些實施例中，環狀RNA包含與SEQ ID NO: 18之IRES序列及編碼HER2 CAR多肽之序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與SEQ ID NO: 18之IRES序列及編碼CD19 CAR多肽之序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列。在一些實施例中，環狀RNA包含與SEQ ID NO: 18之IRES序列及編碼BCMA多肽之序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域且視情況展現出增加。
在一些實施例中，環狀RNA包含編碼與表1B之構築體A-P中之任一者的CAR或其結合片段具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽的CAR序列。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。 表1B：例示性構築體(DNA模板)
ID IRES序列 CAR 序列 CAR 序列
構築體A CCCCCCTCCCCCCCTTCCCTTCCCTTTGCAACGCAACAATTGTAAGTGCCCTCACCTGTCAATTGGGACCACCACTTTCAGTGACCCCATGCGAAGTGCTGAGAGAAAGGAAGCTTTCTTACCCTTCATTTGTGAACCCACTGGTCTAAGCCGCTTGGAATACGATGAGTGGAAAAGTTCATTCTTAATGGAGTGAAACATGCTTAAATTTCCAGCTCGTGCTGGTCTTTCCAGTACGGGGCGGCCCTGTCTGGCCGTAATTCTTCAGAGTGTCACGCCACACTTGTGGATCTCACGTGCCACATGACAGCGCTACAGCTGGAACTGGGTGCTTGGTGCCCATGGAGTAACAGCGAAAAGTGTTAGATCAAGCCTTGCTTGGGCTATGAGCCTGCGGAACAACAACTGGTAACAGTTGCCTCAGGGGCCGAAAGCCACGGTGTTAACAGCACCCTCATAGTTTGATCCACCTCAGGGTGGTGATGTTTAGCAGTTAGTAGTTGCCAATCTGTGTTCACTGAAATCTCGGCATACCGTGTAGTGTACAGGGGTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCGTAGGTAACCTTAAGAGACTATGGATCTGATCTGGGGCCTTGTCCGGAGTGCTTTACACACGGCTCAAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCACAGAGCCCGAGGGATTCGGGTTTTCCCTTTAAAAACCCGACTAGAGCTTATGGTGACAATTATTGCTGTTCAGACGAACAGTGTAATTGTTGTCTATTCACAGCAGTTCTATCAGAGCTTTTCCCACAACGGATCTTCTTGGCAAGCAAATACAGCAGGAGTCAAT (SEQ ID NO: 8) ATGGCTCTCCCCGTGACCGCTCTGCTGCTCCCTCTGGCCCTCCTTCTGCACGCAGCCAGACCACAGGTCAAGCTGGAGGAGTCTGGTGGCGGTCTGGTGCAGGCAGGGAGGAGCCTGAGGCTGAGCTGTGCAGCTTCCGAGCACACATTCTCAAGCCACGTCATGGGGTGGTTCAGACAGGCTCCCGGTAAAGAGAGGGAGTCCGTCGCCGTGATCGGATGGCGGGACATCTCCACCTCCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACAATCTCACGCGATAATGCCAAGAAGACACTGTATCTGCAGATGAATTCCTTGAAGCCCGAAGACACCGCCGTCTATTACTGTGCTGCTAGACGGATCGACGCTGCCGACTTCGACAGCTGGGGACAGGGTACCCAAGTGACCGTTTCCTCCGGAGGCGGAGGTTCTGGAGGAGGTGGGTCAGGTGGAGGTGGCTCCGAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGCTTGGTCCAGGCTGGAGGCAGTCTCAGACTCTCCTGCGCTGCTTCAGGGCGGACCTTCACCATGGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCAGGTAAGGAGAGGGAGTTCGTGGCCGCCATCTCCCTCTCCCCTACCCTGGCATACTACGCTGAGTCCGTGAAGGGACGGTTTACCATCTCCCGGGATAACGCAAAGAACACTGTGGTCCTCCAAATGAACTCCCTCAAACCCGAGGACACCGCTCTCTACTATTGTGCCGCAGATCGGAAGAGCGTCATGTCCATCCGGCCCGATTACTGGGGCCAAGGCACACAGGTGACTGTGTCCAGCACCTCCACCACCACCCCAGCACCAAGGCCTCCAACCCCTGCACCAACCATCGCCTCCCAGCCACTGTCTTTGCGGCCAGAAGCATGCCGCCCAGCAGCAGGTGGAGCCGTGCATACAAGAGGCCTGGACTTCGCCTGCGATATCTACATCTGGGCTCCTCTGGCCGGAACATGCGGAGTCCTGCTCTTGTCCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGCGGGGTCGGAAGAAGCTCCTCTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTCCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGGTGCTCATGCAGGTTCCCCGAAGAGGAGGAGGGTGGCTGTGAGCTGCGGGTGAAGTTCAGCAGGTCAGCAGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGTTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGAGACGGGAGGAGTACGATGTCCTTGACAAGAGAAGGGGCCGGGATCCAGAGATGGGCGGGAAGCCAAGACGGAAGAATCCTCAGGAGGGTCTGTATAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAAGGGGAGCGCCGCAGAGGAAAAGGTCACGATGGTCTGTACCAGGGGTTGAGCACCGCTACCAAGGATACTTACGACGCTCTGCACATGCAAGCTCTGCCACCCCGG (SEQ ID NO: 106) MALPVTALLLPLALLLHAARPQVKLEESGGGLVQAGRSLRLSCAASEHTFSSHVMGWFRQAPGKERESVAVIGWRDISTSYADSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAARRIDAADFDSWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFTMGWFRQAPGKEREFVAAISLSPTLAYYAESVKGRFTISRDNAKNTVVLQMNSLKPEDTALYYCAADRKSVMSIRPDYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 122)
構築體B GTGGCCACGCCCGGGCCACCGATACTTCCCTTCACTCCTTCGGGACTGTTGGGGAGGAACACAACAGGGCTCCCCTGTTTTCCCATTCCTTCCCCCTTTTCCCAACCCCAACCGCCGTATCTGGTGGCGGCAAGACACACGGGTCTTTCCCTCTAAAGCACAATTGTGTGTGTGTCCCAGGTCCTCCTGCGTACGGTGCGGGAGTGCTCCCACCCAACTGTTGTAAGCCTGTCCAACGCGTCGTCCTGGCAAGACTATGACGTCGCATGTTCCGCTGCGGATGCCGACCGGGTAACCGGTTCCCCAGTGTGTGTAGTGCGATCTTCCAGGTCCTCCTGGTTGGCGTTGTCCAGAAACTGCTTCAGGTAAGTGGGGTGTGCCCAATCCCTACAAAGGTTGATTCTTTCACCACCTTAGGAATGCTCCGGAGGTACCCCAGCAACAGCTGGGATCTGACCGGAGGCTAATTGTCTACGGGTGGTGTTTCCTTTTTCTTTTCACACAACTCTACTGCTGACAACTCACTGACTATCCACTTGCTCTGTCACG(SEQ ID NO: 17) ATGGCACTCCCGGTAACCGCCTTATTGCTTCCCCTTGCCCTCTTGCTCCACGCAGCACGCCCCGATATAGTCTTGACTCAATCCCCACCCAGTTTGGCAATGTCATTAGGCAAACGAGCAACAATTTCATGTAGGGCATCCGAAAGTGTAACGATTTTGGGGAGTCATTTAATTCATTGGTACCAACAAAAGCCTGGACAACCCCCGACGCTCTTGATCCAATTAGCATCTAACGTCCAAACCGGAGTCCCCGCACGATTCTCAGGATCCGGTTCCCGGACTGATTTTACATTAACTATTGATCCGGTAGAGGAAGATGACGTCGCTGTCTATTATTGTCTTCAAAGTAGGACGATTCCACGGACATTCGGTGGCGGAACTAAATTGGAGATTAAAGGTTCCACCTCTGGTAGTGGGAAACCCGGGTCCGGTGAAGGGTCCACTAAAGGCCAAATTCAACTCGTTCAATCCGGACCAGAACTGAAGAAGCCAGGAGAAACTGTCAAAATAAGCTGTAAAGCTTCCGGTTATACATTTACAGATTATTCCATAAATTGGGTGAAAAGGGCGCCAGGAAAAGGGTTAAAGTGGATGGGTTGGATTAATACAGAGACTCGGGAACCTGCATATGCTTATGATTTTAGGGGAAGGTTTGCCTTTTCTCTGGAGACTTCCGCTTCAACTGCTTATCTCCAAATTAATAATCTTAAATATGAGGACACAGCAACATACTTCTGTGCTTTGGACTATAGTTATGCTATGGATTACTGGGGACAAGGAACCAGTGTCACTGTAAGTTCCGCTGCTGCGACGACCACTCCTGCACCGCGACCACCCACTCCTGCCCCTACTATTGCTAGTCAACCACTTAGCTTGCGACCTGAGGCATGTCGGCCCGCGGCAGGTGGCGCAGTCCACACCAGGGGTTTAGACTTTGCTTGTGATATTTATATTTGGGCACCACTCGCCGGGACTTGCGGTGTTCTTCTCTTGTCCCTTGTTATAACTCTTTATTGTAAGCGCGGAAGGAAGAAATTGTTATATATTTTCAAACAACCTTTTATGCGACCCGTACAAACAACTCAGGAAGAGGACGGGTGTTCTTGTCGGTTTCCAGAAGAGGAAGAGGGTGGGTGTGAACTCCGGGTCAAATTTAGTAGGTCAGCAGATGCGCCGGCGTACCAACAAGGCCAAAACCAACTGTATAATGAACTCAATCTCGGTAGGCGTGAGGAATATGATGTCCTTGATAAAAGGCGCGGGAGAGATCCAGAAATGGGCGGAAAACCACGGCGAAAGAATCCGCAGGAAGGGTTATATAACGAACTTCAAAAGGATAAAATGGCTGAAGCTTATTCCGAAATTGGCATGAAAGGAGAGCGACGTAGGGGCAAAGGGCATGATGGCCTTTACCAAGGGCTCTCAACCGCTACAAAAGATACTTACGACGCTTTACATATGCAAGCACTTCCACCCAGG (SEQ ID NO: 103) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 119)
構築體C CCCCCCTCCCCCCCTTCCCTTCCCTTTGCAACGCAACAATTGTAAGTGCCCTCACCTGTCAATTGGGACCACCACTTTCAGTGACCCCATGCGAAGTGCTGAGAGAAAGGAAGCTTTCTTACCCTTCATTTGTGAACCCACTGGTCTAAGCCGCTTGGAATACGATGAGTGGAAAAGTTCATTCTTAATGGAGTGAAACATGCTTAAATTTCCAGCTCGTGCTGGTCTTTCCAGTACGGGGCGGCCCTGTCTGGCCGTAATTCTTCAGAGTGTCACGCCACACTTGTGGATCTCACGTGCCACATGACAGCGCTACAGCTGGAACTGGGTGCTTGGTGCCCATGGAGTAACAGCGAAAAGTGTTAGATCAAGCCTTGCTTGGGCTATGAGCCTGCGGAACAACAACTGGTAACAGTTGCCTCAGGGGCCGAAAGCCACGGTGTTAACAGCACCCTCATAGTTTGATCCACCTCAGGGTGGTGATGTTTAGCAGTTAGTAGTTGCCAATCTGTGTTCACTGAAATCTCGGCATACCGTGTAGTGTACAGGGGTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCGTAGGTAACCTTAAGAGACTATGGATCTGATCTGGGGCCTTGTCCGGAGTGCTTTACACACGGCTCAAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCACAGAGCCCGAGGGATTCGGGTTTTCCCTTTAAAAACCCGACTAGAGCTTATGGTGACAATTATTGCTGTTCAGACGAACAGTGTAATTGTTGTCTATTCACAGCAGTTCTATCAGAGCTTTTCCCACAACGGATCTTCTTGGCAAGCAAATACAGCAGGAGTCAAT (SEQ ID NO: 8) ATGGCACTCCCGGTAACCGCCTTATTGCTTCCCCTTGCCCTCTTGCTCCACGCAGCACGCCCCGATATAGTCTTGACTCAATCCCCACCCAGTTTGGCAATGTCATTAGGCAAACGAGCAACAATTTCATGTAGGGCATCCGAAAGTGTAACGATTTTGGGGAGTCATTTAATTCATTGGTACCAACAAAAGCCTGGACAACCCCCGACGCTCTTGATCCAATTAGCATCTAACGTCCAAACCGGAGTCCCCGCACGATTCTCAGGATCCGGTTCCCGGACTGATTTTACATTAACTATTGATCCGGTAGAGGAAGATGACGTCGCTGTCTATTATTGTCTTCAAAGTAGGACGATTCCACGGACATTCGGTGGCGGAACTAAATTGGAGATTAAAGGTTCCACCTCTGGTAGTGGGAAACCCGGGTCCGGTGAAGGGTCCACTAAAGGCCAAATTCAACTCGTTCAATCCGGACCAGAACTGAAGAAGCCAGGAGAAACTGTCAAAATAAGCTGTAAAGCTTCCGGTTATACATTTACAGATTATTCCATAAATTGGGTGAAAAGGGCGCCAGGAAAAGGGTTAAAGTGGATGGGTTGGATTAATACAGAGACTCGGGAACCTGCATATGCTTATGATTTTAGGGGAAGGTTTGCCTTTTCTCTGGAGACTTCCGCTTCAACTGCTTATCTCCAAATTAATAATCTTAAATATGAGGACACAGCAACATACTTCTGTGCTTTGGACTATAGTTATGCTATGGATTACTGGGGACAAGGAACCAGTGTCACTGTAAGTTCCGCTGCTGCGACGACCACTCCTGCACCGCGACCACCCACTCCTGCCCCTACTATTGCTAGTCAACCACTTAGCTTGCGACCTGAGGCATGTCGGCCCGCGGCAGGTGGCGCAGTCCACACCAGGGGTTTAGACTTTGCTTGTGATATTTATATTTGGGCACCACTCGCCGGGACTTGCGGTGTTCTTCTCTTGTCCCTTGTTATAACTCTTTATTGTAAGCGCGGAAGGAAGAAATTGTTATATATTTTCAAACAACCTTTTATGCGACCCGTACAAACAACTCAGGAAGAGGACGGGTGTTCTTGTCGGTTTCCAGAAGAGGAAGAGGGTGGGTGTGAACTCCGGGTCAAATTTAGTAGGTCAGCAGATGCGCCGGCGTACCAACAAGGCCAAAACCAACTGTATAATGAACTCAATCTCGGTAGGCGTGAGGAATATGATGTCCTTGATAAAAGGCGCGGGAGAGATCCAGAAATGGGCGGAAAACCACGGCGAAAGAATCCGCAGGAAGGGTTATATAACGAACTTCAAAAGGATAAAATGGCTGAAGCTTATTCCGAAATTGGCATGAAAGGAGAGCGACGTAGGGGCAAAGGGCATGATGGCCTTTACCAAGGGCTCTCAACCGCTACAAAAGATACTTACGACGCTTTACATATGCAAGCACTTCCACCCAGG (SEQ ID NO: 103) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 119)
構築體D TTTGCTCAGCGTAACTTCTCCGGGTTACGTGGAGACCAAAAGGCTACGGAGACTCGGGCTACGGCCCTGGAGCACCTAGGTGCTCCTAAAGACGTTAGAAGTTGTACAAACTCGCCCAATAGGGCCCCCCAACCAGGGGGGTAGCGGGCAAGCACTTCTGTTTCCCCGGTATGATCTCATAGGCTGTACCCACGGCTGAAAGAGAGATTATCGTTACCCGCCTCACTACTTCGAGAAGCCCAGTAATGGTTCATGAAGTTGATCTCGTTGACCCGGTGTTTCCCCCACACCAGAAACCTGTGATGGGGGTGGTCATCCCGGTCATGGCGACATGACGGACCTCCCCGCGCCGGCACAGGGCCTCTTCGGAGGACGAGTGACATGGATTCAACCGTGAAGAGCCTATTGAGCTAGTGTTGATTCCTCCGCCCCCGTGAATGCGGCTAATCCCAACTCCGGAGCAGGCGGGCCCAAACCAGGGTCTGGCCTGTCGTAACGCGAAAGTCTGGAGCGGAACCGACTACTTTCGGGAAGGCGTGTTTCCTTTTGTTCCTTTTATCAAGTTTTATGGTGACAACTCCTGGTAGACGTTTTATTGCGTTTATTGAGAGATTTCCAACAATTGAACAGACTAGAACCACTTGTTTTATCAAACCCTCACAGAATAAGATAACA (SEQ ID NO: 18) ATGGCACTCCCGGTAACCGCCTTATTGCTTCCCCTTGCCCTCTTGCTCCACGCAGCACGCCCCGATATAGTCTTGACTCAATCCCCACCCAGTTTGGCAATGTCATTAGGCAAACGAGCAACAATTTCATGTAGGGCATCCGAAAGTGTAACGATTTTGGGGAGTCATTTAATTCATTGGTACCAACAAAAGCCTGGACAACCCCCGACGCTCTTGATCCAATTAGCATCTAACGTCCAAACCGGAGTCCCCGCACGATTCTCAGGATCCGGTTCCCGGACTGATTTTACATTAACTATTGATCCGGTAGAGGAAGATGACGTCGCTGTCTATTATTGTCTTCAAAGTAGGACGATTCCACGGACATTCGGTGGCGGAACTAAATTGGAGATTAAAGGTTCCACCTCTGGTAGTGGGAAACCCGGGTCCGGTGAAGGGTCCACTAAAGGCCAAATTCAACTCGTTCAATCCGGACCAGAACTGAAGAAGCCAGGAGAAACTGTCAAAATAAGCTGTAAAGCTTCCGGTTATACATTTACAGATTATTCCATAAATTGGGTGAAAAGGGCGCCAGGAAAAGGGTTAAAGTGGATGGGTTGGATTAATACAGAGACTCGGGAACCTGCATATGCTTATGATTTTAGGGGAAGGTTTGCCTTTTCTCTGGAGACTTCCGCTTCAACTGCTTATCTCCAAATTAATAATCTTAAATATGAGGACACAGCAACATACTTCTGTGCTTTGGACTATAGTTATGCTATGGATTACTGGGGACAAGGAACCAGTGTCACTGTAAGTTCCGCTGCTGCGACGACCACTCCTGCACCGCGACCACCCACTCCTGCCCCTACTATTGCTAGTCAACCACTTAGCTTGCGACCTGAGGCATGTCGGCCCGCGGCAGGTGGCGCAGTCCACACCAGGGGTTTAGACTTTGCTTGTGATATTTATATTTGGGCACCACTCGCCGGGACTTGCGGTGTTCTTCTCTTGTCCCTTGTTATAACTCTTTATTGTAAGCGCGGAAGGAAGAAATTGTTATATATTTTCAAACAACCTTTTATGCGACCCGTACAAACAACTCAGGAAGAGGACGGGTGTTCTTGTCGGTTTCCAGAAGAGGAAGAGGGTGGGTGTGAACTCCGGGTCAAATTTAGTAGGTCAGCAGATGCGCCGGCGTACCAACAAGGCCAAAACCAACTGTATAATGAACTCAATCTCGGTAGGCGTGAGGAATATGATGTCCTTGATAAAAGGCGCGGGAGAGATCCAGAAATGGGCGGAAAACCACGGCGAAAGAATCCGCAGGAAGGGTTATATAACGAACTTCAAAAGGATAAAATGGCTGAAGCTTATTCCGAAATTGGCATGAAAGGAGAGCGACGTAGGGGCAAAGGGCATGATGGCCTTTACCAAGGGCTCTCAACCGCTACAAAAGATACTTACGACGCTTTACATATGCAAGCACTTCCACCCAGG (SEQ ID NO: 103) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 119)
構築體E ATTCTCGGGCTACGGCCCTGGAGCCACTCCGGCTCCTAAAGATTTAGAAGTTTGAGCACACCCGCCCACTAGGGCCCCCCATCCAGGGGGGCAACGGGCAAGCACTTCTGTTTCCCCGGTATGATCTGATAGGCTGTAACCACGGCTGAAACAGAGATTATCGTTATCCGCTTCACTACTTCGAGAAGCCTAGTAATGATGGGTGAAATTGAATCCGTTGATCCGGTGTCTCCCCCACACCAGAAACTCATGATGAGGGTTGCCATCCCGGCTACGGCGACGTAGCGGGCATCCCTGCGCTGGCATGAGGCCTCTTAGGAGGACGGATGATATGGATCTTGTCGTGAAGAGCCTATTGAGCTAGTGTCGACTCCTCCGCCCCCGTGAATGCGGCTAATCCTAACCCCGGAGCAGGTGGGTCCAATCCAGGGCCTGGCCTGTCGTAATGCGTAAGTCTGGGACGGAACCGACTACTTTCGGGAAGGCGTGTTTCCATTTGTTCATTATTTGTGTGTTTATGGTGACAACTCTGGGTAAACGTTCTATTGCGTTTATTGAGAGATTCCCAACAATTGAACAAACGAGAACTACCTGTTTTATTAAATTTACACAGAGAAGAATTACA (SEQ ID NO: 16) ATGGCACTCCCGGTAACCGCCTTATTGCTTCCCCTTGCCCTCTTGCTCCACGCAGCACGCCCCGATATAGTCTTGACTCAATCCCCACCCAGTTTGGCAATGTCATTAGGCAAACGAGCAACAATTTCATGTAGGGCATCCGAAAGTGTAACGATTTTGGGGAGTCATTTAATTCATTGGTACCAACAAAAGCCTGGACAACCCCCGACGCTCTTGATCCAATTAGCATCTAACGTCCAAACCGGAGTCCCCGCACGATTCTCAGGATCCGGTTCCCGGACTGATTTTACATTAACTATTGATCCGGTAGAGGAAGATGACGTCGCTGTCTATTATTGTCTTCAAAGTAGGACGATTCCACGGACATTCGGTGGCGGAACTAAATTGGAGATTAAAGGTTCCACCTCTGGTAGTGGGAAACCCGGGTCCGGTGAAGGGTCCACTAAAGGCCAAATTCAACTCGTTCAATCCGGACCAGAACTGAAGAAGCCAGGAGAAACTGTCAAAATAAGCTGTAAAGCTTCCGGTTATACATTTACAGATTATTCCATAAATTGGGTGAAAAGGGCGCCAGGAAAAGGGTTAAAGTGGATGGGTTGGATTAATACAGAGACTCGGGAACCTGCATATGCTTATGATTTTAGGGGAAGGTTTGCCTTTTCTCTGGAGACTTCCGCTTCAACTGCTTATCTCCAAATTAATAATCTTAAATATGAGGACACAGCAACATACTTCTGTGCTTTGGACTATAGTTATGCTATGGATTACTGGGGACAAGGAACCAGTGTCACTGTAAGTTCCGCTGCTGCGACGACCACTCCTGCACCGCGACCACCCACTCCTGCCCCTACTATTGCTAGTCAACCACTTAGCTTGCGACCTGAGGCATGTCGGCCCGCGGCAGGTGGCGCAGTCCACACCAGGGGTTTAGACTTTGCTTGTGATATTTATATTTGGGCACCACTCGCCGGGACTTGCGGTGTTCTTCTCTTGTCCCTTGTTATAACTCTTTATTGTAAGCGCGGAAGGAAGAAATTGTTATATATTTTCAAACAACCTTTTATGCGACCCGTACAAACAACTCAGGAAGAGGACGGGTGTTCTTGTCGGTTTCCAGAAGAGGAAGAGGGTGGGTGTGAACTCCGGGTCAAATTTAGTAGGTCAGCAGATGCGCCGGCGTACCAACAAGGCCAAAACCAACTGTATAATGAACTCAATCTCGGTAGGCGTGAGGAATATGATGTCCTTGATAAAAGGCGCGGGAGAGATCCAGAAATGGGCGGAAAACCACGGCGAAAGAATCCGCAGGAAGGGTTATATAACGAACTTCAAAAGGATAAAATGGCTGAAGCTTATTCCGAAATTGGCATGAAAGGAGAGCGACGTAGGGGCAAAGGGCATGATGGCCTTTACCAAGGGCTCTCAACCGCTACAAAAGATACTTACGACGCTTTACATATGCAAGCACTTCCACCCAGG (SEQ ID NO: 103) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 119)
構築體F GTGGCCACGCCCGGGCCACCGATACTTCCCTTCACTCCTTCGGGACTGTTGGGGAGGAACACAACAGGGCTCCCCTGTTTTCCCATTCCTTCCCCCTTTTCCCAACCCCAACCGCCGTATCTGGTGGCGGCAAGACACACGGGTCTTTCCCTCTAAAGCACAATTGTGTGTGTGTCCCAGGTCCTCCTGCGTACGGTGCGGGAGTGCTCCCACCCAACTGTTGTAAGCCTGTCCAACGCGTCGTCCTGGCAAGACTATGACGTCGCATGTTCCGCTGCGGATGCCGACCGGGTAACCGGTTCCCCAGTGTGTGTAGTGCGATCTTCCAGGTCCTCCTGGTTGGCGTTGTCCAGAAACTGCTTCAGGTAAGTGGGGTGTGCCCAATCCCTACAAAGGTTGATTCTTTCACCACCTTAGGAATGCTCCGGAGGTACCCCAGCAACAGCTGGGATCTGACCGGAGGCTAATTGTCTACGGGTGGTGTTTCCTTTTTCTTTTCACACAACTCTACTGCTGACAACTCACTGACTATCCACTTGCTCTGTCACG(SEQ ID NO: 17) ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACCCAGACAACCAGCAGCCTGTCTGCCAGCCTGGGCGATAGAGTGACCATCAGCTGTAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTACAGCCTGACAATCAGCAACCTGGAACAAGAGGATATCGCTACCTACTTCTGCCAGCAAGGCAACACCCTGCCTTACACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCACAGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGTGGATCTGAAGTGAAACTGCAAGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTGGCCCCATCTCAATCTCTGAGCGTGACCTGTACCGTCAGCGGAGTGTCCCTGCCTGATTATGGCGTGTCCTGGATCCGGCAGCCTCCTAGAAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCTAGCATCGAAGTGATGTACCCTCCACCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTACTCTCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 21) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 29)
構築體G CCCCCCTCCCCCCCTTCCCTTCCCTTTGCAACGCAACAATTGTAAGTGCCCTCACCTGTCAATTGGGACCACCACTTTCAGTGACCCCATGCGAAGTGCTGAGAGAAAGGAAGCTTTCTTACCCTTCATTTGTGAACCCACTGGTCTAAGCCGCTTGGAATACGATGAGTGGAAAAGTTCATTCTTAATGGAGTGAAACATGCTTAAATTTCCAGCTCGTGCTGGTCTTTCCAGTACGGGGCGGCCCTGTCTGGCCGTAATTCTTCAGAGTGTCACGCCACACTTGTGGATCTCACGTGCCACATGACAGCGCTACAGCTGGAACTGGGTGCTTGGTGCCCATGGAGTAACAGCGAAAAGTGTTAGATCAAGCCTTGCTTGGGCTATGAGCCTGCGGAACAACAACTGGTAACAGTTGCCTCAGGGGCCGAAAGCCACGGTGTTAACAGCACCCTCATAGTTTGATCCACCTCAGGGTGGTGATGTTTAGCAGTTAGTAGTTGCCAATCTGTGTTCACTGAAATCTCGGCATACCGTGTAGTGTACAGGGGTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCGTAGGTAACCTTAAGAGACTATGGATCTGATCTGGGGCCTTGTCCGGAGTGCTTTACACACGGCTCAAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCACAGAGCCCGAGGGATTCGGGTTTTCCCTTTAAAAACCCGACTAGAGCTTATGGTGACAATTATTGCTGTTCAGACGAACAGTGTAATTGTTGTCTATTCACAGCAGTTCTATCAGAGCTTTTCCCACAACGGATCTTCTTGGCAAGCAAATACAGCAGGAGTCAAT (SEQ ID NO: 8) ATGGCCCTCCCCGTCACAGCTCTCCTGCTCCCACTGGCCCTTCTTTTGCACGCTGCTCGCCCCGATATCGTGCTCACCCAGTCACCTCCAAGCCTTGCCATGAGCCTCGGGAAACGGGCTACCATCTCCTGCCGGGCTTCAGAGTCCGTCACCATCCTCGGGTCACACCTCATCCACTGGTACCAACAGAAACCAGGGCAGCCTCCTACCCTCTTGATCCAGTTGGCCTCCAACGTGCAAACTGGGGTTCCCGCCAGGTTCAGTGGCTCCGGATCCCGGACAGATTTCACACTTACCATCGATCCTGTGGAGGAGGACGATGTGGCCGTCTATTACTGCCTGCAGTCTCGCACCATCCCTCGGACCTTCGGTGGAGGCACCAAGCTCGAGATCAAGGGTAGCACCTCCGGCTCTGGAAAGCCAGGCTCTGGTGAGGGTTCTACCAAGGGCCAAATCCAGCTGGTCCAGTCTGGGCCCGAGCTGAAGAAACCCGGGGAGACCGTGAAGATCTCCTGCAAGGCCTCCGGTTATACCTTCACCGACTACTCCATCAACTGGGTCAAGCGCGCTCCTGGAAAGGGCCTCAAGTGGATGGGCTGGATCAACACCGAAACCCGCGAGCCTGCCTATGCTTACGACTTCAGGGGCCGGTTCGCTTTCTCACTGGAGACCTCCGCTTCCACAGCCTACCTCCAGATCAACAACCTCAAGTACGAAGACACCGCCACCTATTTCTGCGCTCTCGACTATTCCTACGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGCACCTCTGTGACCGTCTCTAGCGCAGCCGCCACCACAACACCAGCCCCACGGCCACCTACTCCCGCACCCACCATCGCATCCCAACCACTCAGTCTGAGGCCCGAGGCCTGTAGACCTGCTGCTGGAGGCGCAGTGCATACCCGCGGTCTCGACTTCGCCTGCGACATCTATATCTGGGCCCCATTGGCAGGTACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGTCACTCGTCATCACCCTGTACTGCCGGAGTAAGCGCTCTAGGCTGTTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCAAGAAGACCAGGGCCTACCCGGAAGCACTACCAGCCATACGCACCTCCCCGGGACTTTGCCGCCTATCGGTCTCGGGTGAAGTTCTCACGCTCCGCTGATGCCCCAGCATACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTGTACAATGAGCTCAACCTCGGTCGCCGCGAAGAGTACGACGTGCTCGACAAGAGAAGGGGCAGGGACCCTGAGATGGGAGGCAAGCCCCGCAGAAAGAATCCCCAGGAAGGTCTGTACAACGAGCTGCAAAAGGATAAGATGGCTGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGGAGACGGGGAAAGGGCCACGACGGGCTCTACCAGGGACTCTCCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTCCACATGCAGGCTCTGCCACCCAGG (SEQ ID NO: 104) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 120)
構築體H CCCCCCTCCCCCCCTTCCCTTCCCTTTGCAACGCAACAATTGTAAGTGCCCTCACCTGTCAATTGGGACCACCACTTTCAGTGACCCCATGCGAAGTGCTGAGAGAAAGGAAGCTTTCTTACCCTTCATTTGTGAACCCACTGGTCTAAGCCGCTTGGAATACGATGAGTGGAAAAGTTCATTCTTAATGGAGTGAAACATGCTTAAATTTCCAGCTCGTGCTGGTCTTTCCAGTACGGGGCGGCCCTGTCTGGCCGTAATTCTTCAGAGTGTCACGCCACACTTGTGGATCTCACGTGCCACATGACAGCGCTACAGCTGGAACTGGGTGCTTGGTGCCCATGGAGTAACAGCGAAAAGTGTTAGATCAAGCCTTGCTTGGGCTATGAGCCTGCGGAACAACAACTGGTAACAGTTGCCTCAGGGGCCGAAAGCCACGGTGTTAACAGCACCCTCATAGTTTGATCCACCTCAGGGTGGTGATGTTTAGCAGTTAGTAGTTGCCAATCTGTGTTCACTGAAATCTCGGCATACCGTGTAGTGTACAGGGGTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCGTAGGTAACCTTAAGAGACTATGGATCTGATCTGGGGCCTTGTCCGGAGTGCTTTACACACGGCTCAAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCACAGAGCCCGAGGGATTCGGGTTTTCCCTTTAAAAACCCGACTAGAGCTTATGGTGACAATTATTGCTGTTCAGACGAACAGTGTAATTGTTGTCTATTCACAGCAGTTCTATCAGAGCTTTTCCCACAACGGATCTTCTTGGCAAGCAAATACAGCAGGAGTCAAT (SEQ ID NO: 8) ATGGCACTTCCCGTCACCGCTCTCCTGCTGCCCCTCGCACTGCTGCTCCATGCAGCCCGCCCAGACATCGTCCTGACCCAGTCCCCTCCCTCCCTCGCAATGTCCCTCGGGAAACGGGCCACCATCAGCTGCCGGGCCTCTGAGTCAGTGACAATCCTCGGAAGCCATCTGATCCATTGGTACCAGCAGAAACCCGGTCAGCCTCCAACCCTCCTCATCCAGCTGGCCTCCAACGTGCAGACAGGAGTCCCCGCTCGGTTCTCAGGCAGCGGTTCCAGGACCGACTTCACCCTGACCATCGACCCCGTGGAAGAGGACGATGTGGCTGTGTACTACTGCCTCCAGTCCCGGACCATCCCACGGACCTTCGGAGGTGGGACAAAGCTGGAGATCAAAGGCAGCACCAGCGGTTCTGGCAAGCCAGGGTCAGGTGAGGGGAGCACAAAGGGTCAGATCCAGCTGGTGCAGAGCGGTCCCGAGCTGAAGAAGCCCGGGGAGACCGTTAAGATCTCCTGCAAGGCTAGCGGGTACACCTTCACCGACTATAGTATCAACTGGGTCAAGCGCGCTCCTGGCAAGGGGCTCAAGTGGATGGGGTGGATCAACACCGAAACCAGGGAGCCCGCATACGCTTATGACTTTCGGGGCCGGTTCGCCTTTTCCCTGGAGACCAGCGCCTCTACCGCCTACCTCCAGATCAACAACCTGAAGTACGAGGACACCGCCACCTACTTCTGCGCACTCGACTACTCCTACGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACCTCCGTCACCGTCTCCAGCATCGAGGTCATGTACCCTCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCATGTGAAGGGCAAGCATCTCTGCCCCAGCCCACTGTTCCCCGGACCCTCTAAGCCCTTCTGGGTCCTGGTCGTCGTCGGCGGTGTTCTGGCTTGCTACAGCTTGCTGGTCACCGTCGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGCTCCAAGAGGAGCCGGCTGCTGCATAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGAAGGCCTGGTCCAACCCGCAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCACGGGACTTCGCAGCCTACCGGTCACGGGTGAAGTTCTCTCGGAGCGCAGATGCCCCAGCATACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAACTTAACCTTGGTCGGCGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGCGCAGGGGTCGGGATCCTGAAATGGGCGGGAAACCACGCCGGAAGAACCCACAGGAGGGGCTCTATAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCTGAGGCTTACAGCGAGATTGGAATGAAGGGAGAAAGAAGACGGGGCAAGGGTCACGACGGGTTGTACCAGGGTCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTCCACATGCAAGCCCTTCCACCCCGC (SEQ ID NO: 105) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 121)
構築體I CCCCCCTCCCCCCCTTCCCTTCCCTTTGCAACGCAACAATTGTAAGTGCCCTCACCTGTCAATTGGGACCACCACTTTCAGTGACCCCATGCGAAGTGCTGAGAGAAAGGAAGCTTTCTTACCCTTCATTTGTGAACCCACTGGTCTAAGCCGCTTGGAATACGATGAGTGGAAAAGTTCATTCTTAATGGAGTGAAACATGCTTAAATTTCCAGCTCGTGCTGGTCTTTCCAGTACGGGGCGGCCCTGTCTGGCCGTAATTCTTCAGAGTGTCACGCCACACTTGTGGATCTCACGTGCCACATGACAGCGCTACAGCTGGAACTGGGTGCTTGGTGCCCATGGAGTAACAGCGAAAAGTGTTAGATCAAGCCTTGCTTGGGCTATGAGCCTGCGGAACAACAACTGGTAACAGTTGCCTCAGGGGCCGAAAGCCACGGTGTTAACAGCACCCTCATAGTTTGATCCACCTCAGGGTGGTGATGTTTAGCAGTTAGTAGTTGCCAATCTGTGTTCACTGAAATCTCGGCATACCGTGTAGTGTACAGGGGTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCGTAGGTAACCTTAAGAGACTATGGATCTGATCTGGGGCCTTGTCCGGAGTGCTTTACACACGGCTCAAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCACAGAGCCCGAGGGATTCGGGTTTTCCCTTTAAAAACCCGACTAGAGCTTATGGTGACAATTATTGCTGTTCAGACGAACAGTGTAATTGTTGTCTATTCACAGCAGTTCTATCAGAGCTTTTCCCACAACGGATCTTCTTGGCAAGCAAATACAGCAGGAGTCAAT (SEQ ID NO: 8) ATGGCACTCCCCGTTACCGCCCTTCTGCTGCCTCTCGCCTTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCACAGGTCAAGCTGGAGGAGTCTGGTGGCGGGCTCGTTCAAGCAGGTCGGAGTCTCCGCCTGTCTTGCGCAGCATCAGAGCATACCTTCTCCTCACACGTGATGGGGTGGTTCAGGCAAGCTCCCGGTAAGGAGAGGGAGTCCGTGGCCGTTATCGGCTGGCGCGATATCAGCACCTCCTACGCAGACAGCGTTAAGGGCCGGTTCACTATCTCCAGGGACAACGCTAAGAAGACACTCTACCTCCAGATGAACAGTCTGAAGCCCGAGGACACCGCAGTGTACTATTGCGCTGCTCGGCGGATCGATGCTGCCGACTTCGACAGCTGGGGTCAAGGGACCCAGGTCACCGTTTCCAGCGGAGGTGGCGGAAGTGGTGGCGGAGGATCAGGTGGTGGAGGCTCCGAGGTCCAGCTGGTGGAATCAGGAGGCGGCTTGGTGCAGGCTGGTGGGTCTTTGCGGTTGTCCTGCGCAGCTTCCGGCAGGACCTTCACCATGGGATGGTTCAGACAAGCCCCAGGTAAGGAGCGGGAGTTTGTGGCCGCAATCTCACTGTCTCCCACCCTCGCTTACTACGCCGAGAGTGTGAAGGGGCGCTTCACAATCAGTCGCGACAACGCAAAGAACACCGTCGTCCTGCAAATGAACTCCCTGAAGCCTGAGGATACCGCACTCTATTACTGCGCCGCCGATCGGAAGAGCGTCATGTCCATCCGGCCCGACTATTGGGGCCAAGGCACCCAAGTGACCGTCAGCTCCACCTCCACAACCACTCCCGCCCCAAGACCACCTACCCCAGCCCCAACAATCGCATCCCAGCCTCTGTCCCTTCGGCCCGAAGCTTGTCGCCCTGCAGCAGGTGGAGCAGTGCACACCCGGGGACTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCACCCCTGGCTGGAACCTGCGGCGTGTTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTCTACTGCCGCTCTAAGAGAAGCCGGCTGCTGCATAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGGAGACCAGGACCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCACGGGATTTCGCTGCTTACCGCAGCCGGGTGAAGTTTTCCAGGTCAGCTGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAATTGTACAACGAACTGAATCTGGGACGGCGCGAGGAATACGACGTCCTGGACAAGAGGCGGGGTAGAGATCCCGAGATGGGCGGGAAACCTCGGCGGAAGAACCCTCAGGAGGGGCTCTACAACGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCCGAAGCCTACTCCGAGATCGGGATGAAGGGTGAACGGAGGAGGGGCAAGGGACACGACGGCCTGTATCAGGGCCTCAGCACCGCTACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCTCTCCCACCACGG (SEQ ID NO: 107) MALPVTALLLPLALLLHAARPQVKLEESGGGLVQAGRSLRLSCAASEHTFSSHVMGWFRQAPGKERESVAVIGWRDISTSYADSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAARRIDAADFDSWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFTMGWFRQAPGKEREFVAAISLSPTLAYYAESVKGRFTISRDNAKNTVVLQMNSLKPEDTALYYCAADRKSVMSIRPDYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 123)
構築體J CCCCCCTCCCCCCCTTCCCTTCCCTTTGCAACGCAACAATTGTAAGTGCCCTCACCTGTCAATTGGGACCACCACTTTCAGTGACCCCATGCGAAGTGCTGAGAGAAAGGAAGCTTTCTTACCCTTCATTTGTGAACCCACTGGTCTAAGCCGCTTGGAATACGATGAGTGGAAAAGTTCATTCTTAATGGAGTGAAACATGCTTAAATTTCCAGCTCGTGCTGGTCTTTCCAGTACGGGGCGGCCCTGTCTGGCCGTAATTCTTCAGAGTGTCACGCCACACTTGTGGATCTCACGTGCCACATGACAGCGCTACAGCTGGAACTGGGTGCTTGGTGCCCATGGAGTAACAGCGAAAAGTGTTAGATCAAGCCTTGCTTGGGCTATGAGCCTGCGGAACAACAACTGGTAACAGTTGCCTCAGGGGCCGAAAGCCACGGTGTTAACAGCACCCTCATAGTTTGATCCACCTCAGGGTGGTGATGTTTAGCAGTTAGTAGTTGCCAATCTGTGTTCACTGAAATCTCGGCATACCGTGTAGTGTACAGGGGTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCGTAGGTAACCTTAAGAGACTATGGATCTGATCTGGGGCCTTGTCCGGAGTGCTTTACACACGGCTCAAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCACAGAGCCCGAGGGATTCGGGTTTTCCCTTTAAAAACCCGACTAGAGCTTATGGTGACAATTATTGCTGTTCAGACGAACAGTGTAATTGTTGTCTATTCACAGCAGTTCTATCAGAGCTTTTCCCACAACGGATCTTCTTGGCAAGCAAATACAGCAGGAGTCAAT (SEQ ID NO: 8) ATGGCTCTTCCCGTCACCGCTTTGCTGCTGCCCCTGGCACTCCTCCTCCATGCTGCTCGGCCTCAGGTGAAGCTGGAGGAGAGTGGTGGCGGTCTGGTGCAAGCTGGCAGATCTCTGCGCCTGTCTTGCGCAGCCAGCGAACACACCTTCTCCTCCCACGTGATGGGGTGGTTTCGGCAGGCACCCGGGAAAGAGCGCGAGTCCGTCGCAGTCATCGGGTGGCGGGACATCTCTACCAGCTACGCAGATTCCGTCAAGGGCCGGTTCACCATTTCCCGGGATAACGCTAAGAAGACCCTCTACCTGCAAATGAACTCTCTGAAGCCCGAAGACACCGCCGTCTACTATTGCGCAGCAAGGCGCATCGACGCTGCCGACTTCGACTCTTGGGGCCAAGGAACCCAGGTCACCGTGTCTTCCGGAGGAGGAGGCTCCGGTGGTGGAGGTTCTGGAGGTGGCGGCTCAGAGGTGCAGCTCGTGGAGAGCGGTGGTGGACTCGTTCAGGCAGGCGGCAGTTTGCGGCTGTCCTGTGCAGCCTCCGGTCGCACTTTCACTATGGGATGGTTCCGCCAGGCTCCTGGTAAAGAAAGGGAGTTCGTGGCCGCCATCAGTCTGAGCCCCACCCTCGCATACTACGCCGAGAGCGTGAAGGGTAGGTTCACTATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACACCGTGGTGCTCCAGATGAATTCCCTGAAGCCTGAGGATACCGCCCTCTACTACTGCGCTGCCGACCGCAAGAGCGTGATGAGCATCCGGCCTGACTATTGGGGTCAGGGGACACAGGTGACCGTCAGCAGCATCGAGGTGATGTATCCACCACCCTACCTCGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTCAAGGGGAAGCACCTCTGCCCTTCCCCTCTGTTCCCTGGCCCCTCAAAGCCCTTCTGGGTCCTGGTGGTGGTTGGTGGGGTGCTGGCTTGCTACTCCCTGCTCGTGACCGTGGCTTTCATCATCTTCTGGGTTCGGAGCAAACGGTCCAGACTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCAAGAAGACCTGGGCCCACACGGAAGCATTACCAACCCTATGCACCACCTCGGGATTTCGCCGCCTACAGATCCCGGGTCAAGTTCTCCAGGTCCGCCGATGCACCAGCCTATCAGCAGGGGCAAAACCAGCTGTATAATGAGCTGAACCTTGGACGGCGCGAGGAGTACGACGTGCTCGACAAAAGACGCGGTCGCGACCCAGAGATGGGCGGCAAGCCTAGACGCAAGAATCCCCAGGAGGGGCTCTATAACGAGTTGCAGAAGGATAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGGATGAAAGGCGAAAGACGGCGCGGAAAGGGTCACGACGGACTCTACCAGGGCCTGAGCACAGCCACCAAAGACACCTACGACGCTCTGCATATGCAAGCACTGCCTCCCCGG (SEQ ID NO: 108) MALPVTALLLPLALLLHAARPQVKLEESGGGLVQAGRSLRLSCAASEHTFSSHVMGWFRQAPGKERESVAVIGWRDISTSYADSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAARRIDAADFDSWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFTMGWFRQAPGKEREFVAAISLSPTLAYYAESVKGRFTISRDNAKNTVVLQMNSLKPEDTALYYCAADRKSVMSIRPDYWGQGTQVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 124)
構築體K GTGGCCACGCCCGGGCCACCGATACTTCCCTTCACTCCTTCGGGACTGTTGGGGAGGAACACAACAGGGCTCCCCTGTTTTCCCATTCCTTCCCCCTTTTCCCAACCCCAACCGCCGTATCTGGTGGCGGCAAGACACACGGGTCTTTCCCTCTAAAGCACAATTGTGTGTGTGTCCCAGGTCCTCCTGCGTACGGTGCGGGAGTGCTCCCACCCAACTGTTGTAAGCCTGTCCAACGCGTCGTCCTGGCAAGACTATGACGTCGCATGTTCCGCTGCGGATGCCGACCGGGTAACCGGTTCCCCAGTGTGTGTAGTGCGATCTTCCAGGTCCTCCTGGTTGGCGTTGTCCAGAAACTGCTTCAGGTAAGTGGGGTGTGCCCAATCCCTACAAAGGTTGATTCTTTCACCACCTTAGGAATGCTCCGGAGGTACCCCAGCAACAGCTGGGATCTGACCGGAGGCTAATTGTCTACGGGTGGTGTTTCCTTTTTCTTTTCACACAACTCTACTGCTGACAACTCACTGACTATCCACTTGCTCTGTCACG(SEQ ID NO: 17) ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACTCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGCCGGGCCAGCCAGGATGTGAATACTGCTGTCGCCTGGTATCAACAAAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTACAGCGCCAGCTTTCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCTCCGGAAGCAGAAGCGGCACAGATTTCACACTGACCATAAGCAGCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGCACTACACCACACCTCCAACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTCGAGATTAAGAGAACAGGCAGCACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGATCTGGCGAGGGCTCTGAAGTCCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCAGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGCCAGGATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTGCCGACACCAGCAAGAATACCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTATTACTGTTCCAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTCGTGACCGTTTCTTCTATCGAAGTGATGTACCCTCCACCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTACTCTCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 101) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 117)
構築體L GTGGCCACGCCCGGGCCACCGATACTTCCCTTCACTCCTTCGGGACTGTTGGGGAGGAACACAACAGGGCTCCCCTGTTTTCCCATTCCTTCCCCCTTTTCCCAACCCCAACCGCCGTATCTGGTGGCGGCAAGACACACGGGTCTTTCCCTCTAAAGCACAATTGTGTGTGTGTCCCAGGTCCTCCTGCGTACGGTGCGGGAGTGCTCCCACCCAACTGTTGTAAGCCTGTCCAACGCGTCGTCCTGGCAAGACTATGACGTCGCATGTTCCGCTGCGGATGCCGACCGGGTAACCGGTTCCCCAGTGTGTGTAGTGCGATCTTCCAGGTCCTCCTGGTTGGCGTTGTCCAGAAACTGCTTCAGGTAAGTGGGGTGTGCCCAATCCCTACAAAGGTTGATTCTTTCACCACCTTAGGAATGCTCCGGAGGTACCCCAGCAACAGCTGGGATCTGACCGGAGGCTAATTGTCTACGGGTGGTGTTTCCTTTTTCTTTTCACACAACTCTACTGCTGACAACTCACTGACTATCCACTTGCTCTGTCACG(SEQ ID NO: 17) ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACTCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGCCGGGCCAGCCAGGATGTGAATACTGCTGTCGCCTGGTATCAACAAAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTACAGCGCCAGCTTTCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCTCCGGAAGCAGAAGCGGCACAGATTTCACACTGACCATAAGCAGCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGCACTACACCACACCTCCAACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTCGAGATTAAGAGAACAGGCAGCACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGATCTGGCGAGGGCTCTGAAGTCCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCAGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGCCAGGATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTGCCGACACCAGCAAGAATACCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTATTACTGTTCCAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTCGTGACCGTTTCTTCTACCACCACACCAGCTCCTCGGCCTCCAACTCCTGCTCCTACAATTGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCTCCTCTGGCCGGAACATGTGGCGTTCTGCTGCTGAGCCTGGTCATCACCCTGTACTGTAAGCGGGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACACAAGAGGAAGATGGCTGCTCCTGCAGATTCCCCGAGGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 102) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO: 118)
構築體M CCCCCCTCCCCCCCTTCCCTTCCCTTTGCAACGCAACAATTGTAAGTGCCCTCACCTGTCAATTGGGACCACCACTTTCAGTGACCCCATGCGAAGTGCTGAGAGAAAGGAAGCTTTCTTACCCTTCATTTGTGAACCCACTGGTCTAAGCCGCTTGGAATACGATGAGTGGAAAAGTTCATTCTTAATGGAGTGAAACATGCTTAAATTTCCAGCTCGTGCTGGTCTTTCCAGTACGGGGCGGCCCTGTCTGGCCGTAATTCTTCAGAGTGTCACGCCACACTTGTGGATCTCACGTGCCACATGACAGCGCTACAGCTGGAACTGGGTGCTTGGTGCCCATGGAGTAACAGCGAAAAGTGTTAGATCAAGCCTTGCTTGGGCTATGAGCCTGCGGAACAACAACTGGTAACAGTTGCCTCAGGGGCCGAAAGCCACGGTGTTAACAGCACCCTCATAGTTTGATCCACCTCAGGGTGGTGATGTTTAGCAGTTAGTAGTTGCCAATCTGTGTTCACTGAAATCTCGGCATACCGTGTAGTGTACAGGGGTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCGTAGGTAACCTTAAGAGACTATGGATCTGATCTGGGGCCTTGTCCGGAGTGCTTTACACACGGCTCAAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCACAGAGCCCGAGGGATTCGGGTTTTCCCTTTAAAAACCCGACTAGAGCTTATGGTGACAATTATTGCTGTTCAGACGAACAGTGTAATTGTTGTCTATTCACAGCAGTTCTATCAGAGCTTTTCCCACAACGGATCTTCTTGGCAAGCAAATACAGCAGGAGTCAAT (SEQ ID NO: 8) ATGGCACTGCCCGTCACCGCACTCCTGCTCCCACTGGCACTGCTGCTCCATGCAGCTCGCCCCGATATCCAGATGACCCAGACCACCTCTAGCCTCAGCGCCTCTCTGGGTGACCGCGTCACCATCTCTTGCCGGGCCAGCCAAGACATCTCTAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCTGACGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGTCGGCTGCATTCCGGGGTGCCTTCCAGGTTCAGCGGTTCCGGCTCTGGGACCGATTATAGTCTCACCATCTCCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCAACCTACTTCTGCCAGCAGGGGAACACCCTGCCCTACACCTTCGGTGGCGGGACCAAGCTGGAGATCACTGGAGGTGGTGGCAGCGGAGGTGGAGGATCAGGTGGAGGCGGTAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGACCTGGTCTGGTGGCCCCAAGCCAGTCCCTCAGCGTCACCTGCACAGTGTCCGGGGTGTCCCTGCCTGACTACGGTGTCTCCTGGATCAGGCAACCACCCCGGAAGGGTCTCGAGTGGCTGGGCGTCATCTGGGGCTCCGAGACCACCTACTACAACAGCGCTCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAAGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCTTGAAGATGAACTCCCTGCAAACCGATGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGTAGCTACGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGTGTCACCGTCTCCTCCATCGAGGTGATGTACCCTCCACCCTATCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCTAGCCCTCTGTTCCCAGGACCCTCCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTCGTGGTGGGAGGAGTCCTGGCCTGCTATTCCCTCCTCGTCACCGTGGCATTTATCATCTTCTGGGTCCGGAGCAAGCGGTCACGCCTGCTCCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTCGCAGACCTGGACCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTATGCCCCACCCCGCGACTTTGCCGCTTACCGCTCTCGGGTCAAGTTCTCTCGGTCAGCAGACGCCCCTGCATACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTCGGCAGACGGGAGGAGTACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGTGGTAAGCCACGGCGCAAGAACCCACAGGAGGGCTTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGAGGCGCAGGGGCAAGGGTCACGACGGCCTGTACCAAGGGCTGTCCACCGCAACCAAGGACACCTACGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTCCCACCAAGG (SEQ ID NO: 19) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO: 29)
構築體N ATTCTCGGGCTACGGCCCTGGAGCCACTCCGGCTCCTAAAGATTTAGAAGTTTGAGCACACCCGCCCACTAGGGCCCCCCATCCAGGGGGGCAACGGGCAAGCACTTCTGTTTCCCCGGTATGATCTGATAGGCTGTAACCACGGCTGAAACAGAGATTATCGTTATCCGCTTCACTACTTCGAGAAGCCTAGTAATGATGGGTGAAATTGAATCCGTTGATCCGGTGTCTCCCCCACACCAGAAACTCATGATGAGGGTTGCCATCCCGGCTACGGCGACGTAGCGGGCATCCCTGCGCTGGCATGAGGCCTCTTAGGAGGACGGATGATATGGATCTTGTCGTGAAGAGCCTATTGAGCTAGTGTCGACTCCTCCGCCCCCGTGAATGCGGCTAATCCTAACCCCGGAGCAGGTGGGTCCAATCCAGGGCCTGGCCTGTCGTAATGCGTAAGTCTGGGACGGAACCGACTACTTTCGGGAAGGCGTGTTTCCATTTGTTCATTATTTGTGTGTTTATGGTGACAACTCTGGGTAAACGTTCTATTGCGTTTATTGAGAGATTCCCAACAATTGAACAAACGAGAACTACCTGTTTTATTAAATTTACACAGAGAAGAATTACA (SEQ ID NO: 16) ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACTCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGCCGGGCCAGCCAGGATGTGAATACTGCTGTCGCCTGGTATCAACAAAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTACAGCGCCAGCTTTCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCTCCGGAAGCAGAAGCGGCACAGATTTCACACTGACCATAAGCAGCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGCACTACACCACACCTCCAACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTCGAGATTAAGAGAACAGGCAGCACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGATCTGGCGAGGGCTCTGAAGTCCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCAGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGCCAGGATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTGCCGACACCAGCAAGAATACCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTATTACTGTTCCAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTCGTGACCGTTTCTTCTATCGAAGTGATGTACCCTCCACCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTACTCTCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 101) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 117)
構築體O CCCCCCTCCCCCCCTTCCCTTCCCTTTGCAACGCAACAATTGTAAGTGCCCTCACCTGTCAATTGGGACCACCACTTTCAGTGACCCCATGCGAAGTGCTGAGAGAAAGGAAGCTTTCTTACCCTTCATTTGTGAACCCACTGGTCTAAGCCGCTTGGAATACGATGAGTGGAAAAGTTCATTCTTAATGGAGTGAAACATGCTTAAATTTCCAGCTCGTGCTGGTCTTTCCAGTACGGGGCGGCCCTGTCTGGCCGTAATTCTTCAGAGTGTCACGCCACACTTGTGGATCTCACGTGCCACATGACAGCGCTACAGCTGGAACTGGGTGCTTGGTGCCCATGGAGTAACAGCGAAAAGTGTTAGATCAAGCCTTGCTTGGGCTATGAGCCTGCGGAACAACAACTGGTAACAGTTGCCTCAGGGGCCGAAAGCCACGGTGTTAACAGCACCCTCATAGTTTGATCCACCTCAGGGTGGTGATGTTTAGCAGTTAGTAGTTGCCAATCTGTGTTCACTGAAATCTCGGCATACCGTGTAGTGTACAGGGGTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCGTAGGTAACCTTAAGAGACTATGGATCTGATCTGGGGCCTTGTCCGGAGTGCTTTACACACGGCTCAAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCACAGAGCCCGAGGGATTCGGGTTTTCCCTTTAAAAACCCGACTAGAGCTTATGGTGACAATTATTGCTGTTCAGACGAACAGTGTAATTGTTGTCTATTCACAGCAGTTCTATCAGAGCTTTTCCCACAACGGATCTTCTTGGCAAGCAAATACAGCAGGAGTCAAT (SEQ ID NO: 8) ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACTCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGCCGGGCCAGCCAGGATGTGAATACTGCTGTCGCCTGGTATCAACAAAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTACAGCGCCAGCTTTCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCTCCGGAAGCAGAAGCGGCACAGATTTCACACTGACCATAAGCAGCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGCACTACACCACACCTCCAACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTCGAGATTAAGAGAACAGGCAGCACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGATCTGGCGAGGGCTCTGAAGTCCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCAGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGCCAGGATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTGCCGACACCAGCAAGAATACCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTATTACTGTTCCAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTCGTGACCGTTTCTTCTATCGAAGTGATGTACCCTCCACCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTACTCTCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA(SEQ ID NO: 101) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO: 117)
構築體P TTTGCTCAGCGTAACTTCTCCGGGTTACGTGGAGACCAAAAGGCTACGGAGACTCGGGCTACGGCCCTGGAGCACCTAGGTGCTCCTAAAGACGTTAGAAGTTGTACAAACTCGCCCAATAGGGCCCCCCAACCAGGGGGGTAGCGGGCAAGCACTTCTGTTTCCCCGGTATGATCTCATAGGCTGTACCCACGGCTGAAAGAGAGATTATCGTTACCCGCCTCACTACTTCGAGAAGCCCAGTAATGGTTCATGAAGTTGATCTCGTTGACCCGGTGTTTCCCCCACACCAGAAACCTGTGATGGGGGTGGTCATCCCGGTCATGGCGACATGACGGACCTCCCCGCGCCGGCACAGGGCCTCTTCGGAGGACGAGTGACATGGATTCAACCGTGAAGAGCCTATTGAGCTAGTGTTGATTCCTCCGCCCCCGTGAATGCGGCTAATCCCAACTCCGGAGCAGGCGGGCCCAAACCAGGGTCTGGCCTGTCGTAACGCGAAAGTCTGGAGCGGAACCGACTACTTTCGGGAAGGCGTGTTTCCTTTTGTTCCTTTTATCAAGTTTTATGGTGACAACTCCTGGTAGACGTTTTATTGCGTTTATTGAGAGATTTCCAACAATTGAACAGACTAGAACCACTTGTTTTATCAAACCCTCACAGAATAAGATAACA (SEQ ID NO: 18) ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACTCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGCCGGGCCAGCCAGGATGTGAATACTGCTGTCGCCTGGTATCAACAAAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTACAGCGCCAGCTTTCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCTCCGGAAGCAGAAGCGGCACAGATTTCACACTGACCATAAGCAGCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGCACTACACCACACCTCCAACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTCGAGATTAAGAGAACAGGCAGCACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGATCTGGCGAGGGCTCTGAAGTCCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCAGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGCCAGGATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTGCCGACACCAGCAAGAATACCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTATTACTGTTCCAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTCGTGACCGTTTCTTCTATCGAAGTGATGTACCCTCCACCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTACTCTCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA(SEQ ID NO: 101) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO: 117)
C.輔助元件
如本發明中所描述，本文所揭示之環狀RNA構築體及相關醫藥組合物、線性RNA聚核苷酸及/或DNA模板可進一步包含某些輔助元件(在本文中亦共同稱為「合併之輔助元件」)。在某些實施例中，此等輔助元件可包括於環狀RNA、線性RNA聚核苷酸及/或DNA模板之序列內以用於增強環化、轉譯或兩者。在某些實施例中，輔助元件為特異性位於各別聚核苷酸之增強型內含子元件、增強型外顯子元件或核心功能元件之間或其內的序列。作為非限制性實例，合併之輔助元件(例如，5'及3')可包括IRES異側作用因子區、miRNA結合位點、限制位點、RNA編輯區、結構元件或序列元件、顆粒位點、郵遞密碼元件、RNA遷移元件及/或增強、促進環狀RNA聚核苷酸內經編碼之蛋白質之環化及/或轉譯的另一特殊序列。
在一些實施例中，合併之輔助元件包含IRES異側作用因子(ITAF)區。在一些實施例中，IRES異側作用因子區經由結合至PCBP1-PCBP4 (polyC結合蛋白)、PABP1 (polyA結合蛋白)、PTB (聚嘧啶束結合)、阿爾戈瑙特蛋白家族、HNRNPK (異質核核糖核蛋白K蛋白)或La蛋白來調節轉譯起始。在一些實施例中，IRES異側作用因子區包含polyA、polyC、polyAC或聚嘧啶束。在一些實施例中，ITAF區位於核心功能元件內。在一些實施例中，ITAF區位於TIE內。
在某些實施例中，合併之輔助元件包含至少一個miRNA結合位點。在一些實施例中，miRNA結合位點位於5'增強型內含子元件、5'增強型外顯子元件、核心功能元件、3'增強型外顯子元件及/或3'增強型內含子元件內。在一些實施例中，其中miRNA結合位點位於增強型內含子元件或增強型外顯子元件內之間隔子內。在某些實施例中，miRNA結合位點包含整個間隔子區。在一些實施例中，5'增強型內含子元件及3'增強型內含子元件各自包含相同的miRNA結合位點。在另一實施例中，5'增強型內含子元件之miRNA結合位點包含與3'增強型內含子元件在長度或核苷酸方面不同之miRNA結合位點。在一個實施例中，5'增強型外顯子元件及3'增強型外顯子元件包含相同的miRNA結合位點。在其他實施例中，5'增強型外顯子元件及3'增強型外顯子元件包含在長度或核苷酸方面不同之miRNA結合位點。在一些實施例中，miRNA結合位點在環狀RNA構築體、線性RNA聚核苷酸前驅體及/或DNA模板內彼此鄰近地定位。在某些實施例中，miRNA結合位點中之一者之第一個核苷酸在第二miRNA結合位點之第一個核苷酸最後一個核苷酸之後。
在一些實施例中，miRNA結合位點位於核心功能元件之轉譯起始元件(TIE)內。在一個實施例中，miRNA結合位點位於內部核糖體進入位點(IRES)之前、之後或之內。在另一實施例中，miRNA結合位點位於適體複合物之前、之後或之內。
在環狀RNA分子內併入miRNA序列可准許編碼序列在核心功能元件內之組織特異性表現。舉例而言，在意欲在免疫細胞中表現蛋白質之環狀RNA中，可能需要在諸如肝或腎之組織中引起表現抑制之miRNA結合序列。該等miRNA結合序列可基於miRNA之細胞或組織表現進行選擇。由miRNA命名法定義之獨特序列為廣泛已知的，且對於微小RNA領域之工作人員而言係可獲得的。舉例而言，其可見於miRDB公共資料庫中。作為非限制性實例，一或多個miR-122目標位點可插入環狀RNA中。
在一些實施例中，miR-122位點可包含以下序列： CAAACACCATTGTCACACTCCAA  (SEQ ID NO: 200)。 D.表現序列及有效負載
在一些實施例中，環狀RNA構築體包含至少一個編碼結合分子之表現序列。在某些實施例中，環狀RNA構築體包含IRES及至少一個編碼治療性蛋白質之表現序列，其中IRES能夠在活體內遞送時促進蛋白質之表現。
在一些實施例中，環狀RNA可編碼此項技術中可獲得之各種治療性蛋白質、細胞介素、免疫檢查點抑制劑、促效劑、嵌合抗原受體、抑制性受體促效劑、一或多種T細胞受體及/或B細胞受體。嵌合蛋白質亦可包括例如重組融合蛋白質、嵌合突變蛋白質或其他融合蛋白質。在一些實施例中，環狀RNA包含超過1個表現序列，例如2、3、4或5個表現序列。在一些實施例中，環狀RNA為雙順反子RNA。在一些實施例中，雙順反子RNA經密碼子最佳化。例示性雙順反子環狀RNA描述於WO2021/189059A2中，其以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，表現序列編碼治療性蛋白質。在一些實施例中，治療性蛋白質選自下表中所列之蛋白質。
有效負載 例示性序列 例示性目標細胞 / 器官 例示性遞送媒劑
CD19 CAR 參見例如表2A-2C T細胞 (50 mol %) DSPC (10 mol %) β-植固醇(28.5% mol %) 膽固醇(10 mol %) PEG DMG (1.5 mol %)
BCMA CAR* 參見例如表2C MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPASLAVSLGERATINCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDAAIYYCLQSRIFPRTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSINWVRQAPGQGLEWMGWINTETREPAYAYDFRGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDYSYAMDYWGQGTLVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 201) * BCMA CAR可選自美國專利申請案US 2021/0128618A1中所揭示之抗BCMA CAR中之任一者。 T細胞 (50 mol %) DSPC (10 mol %) β-植固醇(28.5% mol %) 膽固醇(10 mol %) PEG DMG (1.5 mol %)
MAGE-A4 TCR TCR α鏈： KNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTIMTFSENTKSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVNHSGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQKPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS (SEQ ID NO: 202) TCR β鏈： DVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASSFLMTSGDPYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRAD (SEQ ID NO: 203) T細胞 (50 mol %) DSPC (10 mol %) β-植固醇(28.5% mol %) 膽固醇(10 mol %) PEG DMG (1.5 mol %)
NY-ESO TCR TCRα胞外序列 MQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVHPY (SEQ ID NO: 204) TCRβ胞外序列 MGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVL (SEQ ID NO: 205) T細胞 (50 mol %) DSPC (10 mol %) β-植固醇(28.5% mol %) 膽固醇(10 mol %) PEG DMG (1.5 mol %)
EPO APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR (SEQ ID NO: 206) 腎臟或骨髓
PAH MSTAVLENPGLGRKLSDFGQETSYIEDNCNQNGAISLIFSLKEEVGALAKVLRLFEENDVNLTHIESRPSRLKKDEYEFFTHLDKRSLPALTNIIKILRHDIGATVHELSRDKKKDTVPWFPRTIQELDRFANQILSYGAELDADHPGFKDPVYRARRKQFADIAYNYRHGQPIPRVEYMEEEKKTWGTVFKTLKSLYKTHACYEYNHIFPLLEKYCGFHEDNIPQLEDVSQFLQTCTGFRLRPVAGLLSSRDFLGGLAFRVFHCTQYIRHGSKPMYTPEPDICHELLGHVPLFSDRSFAQFSQEIGLASLGAPDEYIEKLATIYWFTVEFGLCKQGDSIKAYGAGLLSSFGELQYCLSEKPKLLPLELEKTAIQNYTVTEFQPLYYVAESFNDAKEKVRNFAATIPRPFSVRYDPYTQRIEVLDNTQQLKILADSINSEIGILCSALQKIK (SEQ ID NO: 207) 肝細胞 (50 mol %) DSPC (10 mol %) 膽固醇(38.5% mol %) PEG-DMG (1.5%) 或 MC3 (50 mol %) DSPC (10 mol %) 膽固醇(38.5% mol %) PEG-DMG (1.5%)
CPS1 LSVKAQTAHIVLEDGTKMKGYSFGHPSSVAGEVVFNTGLGGYPEAITDPAYKGQILTMANPIIGNGGAPDTTALDELGLSKYLESNGIKVSGLLVLDYSKDYNHWLATKSLGQWLQEEKVPAIYGVDTRMLTKIIRDKGTMLGKIEFEGQPVDFVDPNKQNLIAEVSTKDVKVYGKGNPTKVVAVDCGIKNNVIRLLVKRGAEVHLVPWNHDFTKMEYDGILIAGGPGNPALAEPLIQNVRKILESDRKEPLFGISTGNLITGLAAGAKTYKMSMANRGQNQPVLNITNKQAFITAQNHGYALDNTLPAGWKPLFVNVNDQTNEGIMHESKPFFAVQFHPEVTPGPIDTEYLFDSFFSLIKKGKATTITSVLPKPALVASRVEVSKVLILGSGGLSIGQAGEFDYSGSQAVKAMKEENVKTVLMNPNIASVQTNEVGLKQADTVYFLPITPQFVTEVIKAEQPDGLILGMGGQTALNCGVELFKRGVLKEYGVKVLGTSVESIMATEDRQLFSDKLNEINEKIAPSFAVESIEDALKAADTIGYPVMIRSAYALGGLGSGICPNRETLMDLSTKAFAMTNQILVEKSVTGWKEIEYEVVRDADDNCVTVCNMENVDAMGVHTGDSVVVAPAQTLSNAEFQMLRRTSINVVRHLGIVGECNIQFALHPTSMEYCIIEVNARLSRSSALASKATGYPLAFIAAKIALGIPLPEIKNVVSGKTSACFEPSLDYMVTKIPRWDLDRFHGTSSRIGSSMKSVGEVMAIGRTFEESFQKALRMCHPSIEGFTPRLPMNKEWPSNLDLRKELSEPSSTRIYAIAKAIDDNMSLDEIEKLTYIDKWFLYKMRDILNMEKTLKGLNSESMTEETLKRAKEIGFSDKQISKCLGLTEAQTRELRLKKNIHPWVKQIDTLAAEYPSVTNYLYVTYNGQEHDVNFDDHGMMVLGCGPYHIGSSVEFDWCAVSSIRTLRQLGKKTVVVNCNPETVSTDFDECDKLYFEELSLERILDIYHQEACGGCIISVGGQIPNNLAVPLYKNGVKIMGTSPLQIDRAEDRSIFSAVLDELKVAQAPWKAVNTLNEALEFAKSVDYPCLLRPSYVLSGSAMNVVFSEDEMKKFLEEATRVSQEHPVVLTKFVEGAREVEMDAVGKDGRVISHAISEHVEDAGVHSGDATLMLPTQTISQGAIEKVKDATRKIAKAFAISGPFNVQFLVKGNDVLVIECNLRASRSFPFVSKTLGVDFIDVATKVMIGENVDEKHLPTLDHPIIPADYVAIKAPMFSWPRLRDADPILRCEMASTGEVACFGEGIHTAFLKAMLSTGFKIPQKGILIGIQQSFRPRFLGVAEQLHNEGFKLFATEATSDWLNANNVPATPVAWPSQEGQNPSLSSIRKLIRDGSIDLVINLPNNNTKFVHDNYVIRRTAVDSGIPLLTNFQVTKLFAEAVQKSRKVDSKSLFHYRQYSAGKAA (SEQ ID NO: 208) 肝細胞 (50 mol %) DSPC (10 mol %) 膽固醇(38.5% mol %) PEG-DMG (1.5%) 或 MC3 (50 mol %) DSPC (10 mol %) 膽固醇(38.5% mol %) PEG-DMG (1.5%)
Cas9 MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG (SEQ ID NO: 209) 免疫細胞 (50 mol %) DSPC (10 mol %) β-植固醇(28.5% mol %) 膽固醇(10 mol %) PEG DMG (1.5 mol %)
ADAMTS13 AAGGILHLELLVAVGPDVFQAHQEDTERYVLTNLNIGAELLRDPSLGAQFRVHLVKMVILTEPEGAPNITANLTSSLLSVCGWSQTINPEDDTDPGHADLVLYITRFDLELPDGNRQVRGVTQLGGACSPTWSCLITEDTGFDLGVTIAHEIGHSFGLEHDGAPGSGCGPSGHVMASDGAAPRAGLAWSPCSRRQLLSLLSAGRARCVWDPPRPQPGSAGHPPDAQPGLYYSANEQCRVAFGPKAVACTFAREHLDMCQALSCHTDPLDQSSCSRLLVPLLDGTECGVEKWCSKGRCRSLVELTPIAAVHGRWSSWGPRSPCSRSCGGGVVTRRRQCNNPRPAFGGRACVGADLQAEMCNTQACEKTQLEFMSQQCARTDGQPLRSSPGGASFYHWGAAVPHSQGDALCRHMCRAIGESFIMKRGDSFLDGTRCMPSGPREDGTLSLCVSGSCRTFGCDGRMDSQQVWDRCQVCGGDNSTCSPRKGSFTAGRAREYVTFLTVTPNLTSVYIANHRPLFTHLAVRIGGRYVVAGKMSISPNTTYPSLLEDGRVEYRVALTEDRLPRLEEIRIWGPLQEDADIQVYRRYGEEYGNLTRPDITFTYFQPKPRQAWVWAAVRGPCSVSCGAGLRWVNYSCLDQARKELVETVQCQGSQQPPAWPEACVLEPCPPYWAVGDFGPCSASCGGGLRERPVRCVEAQGSLLKTLPPARCRAGAQQPAVALETCNPQPCPARWEVSEPSSCTSAGGAGLALENETCVPGADGLEAPVTEGPGSVDEKLPAPEPCVGMSCPPGWGHLDATSAGEKAPSPWGSIRTGAQAAHVWTPAAGSCSVSCGRGLMELRFLCMDSALRVPVQEELCGLASKPGSRREVCQAVPCPARWQYKLAACSVSCGRGVVRRILYCARAHGEDDGEEILLDTQCQGLPRPEPQEACSLEPCPPRWKVMSLGPCSASCGLGTARRSVACVQLDQGQDVEVDEAACAALVRPEASVPCLIADCTYRWHVGTWMECSVSCGDGIQRRRDTCLGPQAQAPVPADFCQHLPKPVTVRGCWAGPCVGQGTPSLVPHEEAAAPGRTTATPAGASLEWSQARGLLFSPAPQPRRLLPGPQENSVQSSACGRQHLEPTGTIDMRGPGQADCAVAIGRPLGEVVTLRVLESSLNCSAGDMLLLWGRLTWRKMCRKLLDMTFSSKTNTLVVRQRCGRPGGGVLLRYGSQLAPETFYRECDMQLFGPWGEIVSPSLSPATSNAGGCRLFINVAPHARIAIHALATNMGAGTEGANASYILIRDTHSLRTTAFHGQQVLYWESESSQAEMEFSEGFLKAQASLRGQYWTLQSWVPEMQDPQSWKGKEGT (SEQ ID NO: 210) 肝細胞 (50 mol %) DSPC (10 mol %) 膽固醇(38.5% mol %) PEG-DMG (1.5%) 或 MC3 (50 mol %) DSPC (10 mol %) 膽固醇(38.5% mol %) PEG-DMG (1.5%)
FOXP3 MPNPRPGKPSAPSLALGPSPGASPSWRAAPKASDLLGARGPGGTFQGRDLRGGAHASSSSLNPMPPSQLQLPTLPLVMVAPSGARLGPLPHLQALLQDRPHFMHQLSTVDAHARTPVLQVHPLESPAMISLTPPTTATGVFSLKARPGLPPGINVASLEWVSREPALLCTFPNPSAPRKDSTLSAVPQSSYPLLANGVCKWPGCEKVFEEPEDFLKHCQADHLLDEKGRAQCLLQREMVQSLEQQLVLEKEKLSAMQAHLAGKMALTKASSVASSDKGSCCIVAAGSQGPVVPAWSGPREAPDSLFAVRRHLWGSHGNSTFPEFLHNMDYFKFHNMRPPFTYATLIRWAILEAPEKQRTLNEIYHWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCFVRVESEKGAVWTVDELEFRKKRSQRPSRCSNPTPGP (SEQ ID NO: 211) 免疫細胞 (50 mol %) DSPC (10 mol %) β-植固醇(28.5% mol %) 膽固醇(10 mol %) PEG DMG (1.5 mol %)
IL-10 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 212) 免疫細胞 (50 mol %) DSPC (10 mol %) β-植固醇(28.5% mol %) 膽固醇(10 mol %) PEG DMG (1.5 mol %)
IL-2 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT (SEQ ID NO: 213) 免疫細胞 (50 mol %) DSPC (10 mol %) β-植固醇(28.5% mol %) 膽固醇(10 mol %) PEG DMG (1.5 mol %)
在一些實施例中，表現序列編碼治療性蛋白質。在一些實施例中，表現序列編碼細胞介素，例如IL-12p70、IL-15、IL-2、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-β、IL-10、TGF-β、IL-4或IL-35，或其功能片段。在一些實施例中，表現序列編碼免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，表現序列編碼促效劑(例如，TNFR家族成員，諸如CD137L、OX40L、ICOSL、LIGHT或CD70)。在一些實施例中，表現序列編碼嵌合抗原受體。在一些實施例中，表現序列編碼抑制性受體促效劑(例如PDL1、PDL2、半乳糖凝集素-9、VISTA、B7H4或MHCII)或抑制性受體(例如PD1、CTLA4、TIGIT、LAG3或TIM3)。在一些實施例中，表現序列編碼抑制性受體拮抗劑。在一些實施例中，表現序列編碼一或多種TCR鏈(α鏈及β鏈或γ鏈及δ鏈)。在一些實施例中，表現序列編碼分泌T細胞或免疫細胞接合子(例如雙特異性抗體，諸如BiTE，靶向例如CD3、CD137或CD28及腫瘤表現蛋白，例如CD19、CD20或BCMA等)。在一些實施例中，表現序列編碼轉錄因子(例如FOXP3、HELIOS、TOX1或TOX2)。在一些實施例中，表現序列編碼免疫抑制性酶(例如IDO或CD39/CD73)。在一些實施例中，表現序列編碼GvHD (例如抗HLA-A2 CAR-Treg)。
在一些實施例中，環狀RNA構築體包含IRES及編碼CAR之表現序列。在某些實施例中，本文中之環狀RNA構築體及相關醫藥組合物包含編碼嵌合抗原受體(CAR)複合蛋白質之CAR編碼區。在某些實施例中，表現序列編碼靶向癌症抗原之CAR。在某些實施例中，CAR構築體包含例如抗CD19、抗HER2或抗BCMA結合子。
嵌合抗原受體(CAR或CAR-T)為經基因工程化之受體。此等經工程化之受體可經由本文所描述之環狀RNA插入免疫細胞中且由免疫細胞表現，該等免疫細胞包括T細胞。在CAR之情況下，單一受體可經程式化以辨識特異性抗原且當結合至抗原時活化免疫細胞以攻擊及破壞帶有該抗原之細胞。當此等抗原存在於腫瘤細胞上時，表現CAR之免疫細胞可靶向且殺滅腫瘤細胞。
因此，在一些實施例中，由聚核苷酸編碼之CAR包含(i)特異性結合至目標抗原之抗原結合分子，(ii)鉸鏈域、跨膜域及胞內域，及(iii)活化域。在一些實施例中，本發明之CAR之定向包含與共刺激域及活化域串聯之抗原結合域(諸如scFv)。共刺激域可包含胞外部分、跨膜部分及胞內部分中之一或多者。在其他實施例中，多個共刺激域可以串聯方式利用。在一些實施例中，CAR包含CAR蛋白質間隔子。CAR蛋白質間隔子可在任何前述域之間。在一些實施例中，CAR係針對表現腫瘤之蛋白質，包括(但不限於) CD19、BCMA及HER2。 1.密碼子最佳化
在環狀RNA構築體包含至少一個編碼結合分子之表現序列的一些實施例中，表現序列可經密碼子最佳化。在一些實施例中，環狀RNA構築體經最佳化以缺乏至少一個存在於等效預最佳化聚核苷酸中之微小RNA結合位點。在一些實施例中，環狀RNA構築體經最佳化以缺乏至少一個能夠結合至微小RNA之微小RNA結合位點，該微小RNA存在於表現環狀RNA構築體之細胞中。在一些實施例中，環狀RNA構築體經最佳化而不具有至少一個存在於等效預最佳化聚核苷酸中之核酸內切酶敏感性位點。在一些實施例中，環狀RNA構築體經最佳化而不具有至少一個能夠被核酸內切酶裂解之核酸內切酶敏感性位點，該核酸內切酶存在於表現核酸內切酶之細胞中。在一些實施例中，環狀RNA構築體經最佳化而不具有至少一個存在於等效預最佳化聚核苷酸中之RNA編輯敏感性位點。
密碼子最佳化序列可為其中編碼多肽之聚核苷酸中之密碼子已經取代以增加多肽之表現、穩定性及/或活性的序列。影響密碼子最佳化之因素包括(但不限於)以下中之一或多者：(i)兩個或更多個生物體或基因之間的密碼子偏差之變化或以合成方式構築之偏窗表，(ii)生物體、基因或一組基因內之密碼子偏差程度的變化，(iii)密碼子之系統性變異，包括內容，(iv)密碼子根據其解碼tRNA之變化，(v)根據GC% (總體或在三重態之一個位置)的密碼子差異，(vi)與參考序列(例如，天然存在之序列)之類似性程度變化，(vii)密碼子頻率截止值之變化，(viii)自該DNA序列轉錄之mRNA的結構特性，(ix)關於DNA序列之功能的先前知識，密碼子取代組之設計基於該等DNA序列；及/或(x)各胺基酸之密碼子組的系統性變化。在一些實施例中，經密碼子最佳化聚核苷酸可使核糖核酸酶碰撞降至最低及/或限制表現序列與IRES之間的結構干擾。
密碼子最佳化可藉由此項技術中已知之方法使用已知算法來執行。可影響密碼子最佳化之因素包括在序列間核糖體停留時間之差異。基於核糖體停留時間之最佳化對較低停留時間密碼子排序，亦即核糖體不會終止極長(與轉譯速度相關)之密碼子。此等密碼子傾向於具有低GC，目標GC%為約例如48至54%。RNA穩定性亦影響密碼子最佳化。基於經修飾之穩定性的最佳化對與RNA穩定性相關之密碼子排序，其亦傾向於具有更高GC，其中目標GC%為約(例如) 57至62%。更高GC密碼子傾向於藉由在RNA中形成小結構來改進穩定性，該等小結構約束反應性2'羥基及可對核酸內切酶活性具有抗性之雙股RNA之小區段。此等結構亦可減緩核糖體且防止其碰撞其他核糖體。另一密碼子最佳化方法利用具有自已知序列反向工程化之特定密碼子使用的算法，該算法之目標GC%為約57-62%。
在使用此等算法之實施例中，各算法將產生與該算法相關之密碼子使用頻率黏附的隨機序列。對於大部分胺基酸，可使用多個密碼子(然而，某些算法可針對各胺基酸選擇單一預定義密碼子)。對於採用多個密碼子之算法而言，單一胺基酸序列輸入可具有許多不同的核苷酸序列輸出，因為在各位置之密碼子選擇為隨機的且加權。算法一般不包括罕見密碼子，其對於各算法略微不同地定義，但通常藉由對應基因體中之密碼子使用來定義。基於核糖體停留時間及經修飾之穩定性的最佳化，例如使用偏置密碼子矩陣來產生第一遍序列。例如，第一遍偏壓可設定為10。此意謂例如，對於在0.6及0.4使用率(60%/40%)處具有兩個潛在密碼子之胺基酸，10之偏差會使0.6變為：(0.6^10)/((0.6^10)-(0.4^10)) = ~0.98及(0.4^10)/((0.6^10)-(0.4^10)) = ~0.02，產生選擇最初0.6密碼子之98%機率及選擇最初0.4密碼子之2%機率。
一級序列隨後將經過「拋光過程」以鑑別「問題序列」，諸如：(a)包含超過11個連續核苷酸之自互補序列區域；(b)超過11個連續核苷酸之重複區域；及(c)非所需序列，其包括(但不限於) XbaI位點(TCTAGA)，其用於使質體線性化且必須不存在於環狀RNA區域中；5+均聚物(例如，AAAAA)，其可引起RNA中之框移突變；且在18nt窗上＞75%或＜33% GC%內含物。
一旦鑑別此等問題序列，算法將嘗試藉由在所討論之問題序列內之隨機位置重新選擇密碼子來移除該等問題序列。算法將循環例如多達25次以移除各問題序列，且隨後重複此過程，例如25次以移除各問題序列。若算法無法移除問題序列，則其將報導問題序列在最終序列旁邊之存在，且隨後將此過程重複任何次數以基於相同胺基酸序列產生獨特序列。 2.例示性抗原結合域
在一些實施例中，環狀RNA構築體包含IRES及至少一個編碼結合分子之表現序列。在某些實施例中，表現序列編碼治療性蛋白質，例如嵌合抗原受體(CAR)。
CAR可經工程化以藉由併入與彼靶向抗原，例如癌症抗原相互作用之抗原結合分子結合至抗原(諸如，細胞表面抗原)。在一些實施例中，抗原結合分子為其抗體片段，例如一或多個單鏈抗體片段(scFv)。scFv為具有連接在一起之抗體之重鏈及輕鏈之可變區的單鏈抗體片段。參見美國專利第7,741,465號及第6,319,494號以及Eshhar等人, Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131-136。scFv保留親本抗體與目標抗原特異性相互作用之能力。scFv適用於嵌合抗原受體，因為其可經工程化以連同其他CAR組分一起表現為單鏈之一部分。同上，亦參見Krause等人, J. Exp. Med., 第188卷, 第4期, 1998 (619-626)；Finney等人, Journal of Immunology, 1998, 161: 2791-2797。應瞭解，抗原結合分子通常含於CAR之胞外部分內以使得其能夠辨識且結合至所關注之抗原。涵蓋對超過一個相關目標具有特異性之雙特異性及多特異性CAR。
在一些實施例中，抗原結合分子包含單鏈，其中重鏈可變區及輕鏈可變區由連接子連接。在一些實施例中，VH位於連接子之N端處且VL位於連接子之C端處。在其他實施例中，VL位於連接子之N端處且VH位於連接子之C端處。在一些實施例中，連接子包含至少約5個、至少約8個、至少約10個、至少約13個、至少約15個、至少約18個、至少約20個、至少約25個、至少約30個、至少約35個、至少約40個、至少約45個、至少約50個、至少約60個、至少約70個、至少約80個、至少約90個或至少約100個胺基酸。
在一些實施例中，抗原結合分子包含奈米抗體。在一些實施例中，抗原結合分子包含DARPin。在一些實施例中，抗原結合分子包含能夠特異性結合至目標蛋白之抗運載蛋白或其他合成蛋白。
在一些實施例中，CAR包含對選自以下之抗原具有特異性的抗原結合域：CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、C型凝集素樣分子-1、CD33、表皮成長因子受體變異體III (EGFRvIII)、神經節苷脂G2 (GD2)、神經節苷脂GD3、TNF受體家族成員B細胞成熟(BCMA)、Tn抗原((Tn Ag)或(GaINAca-Ser/Thr))、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、受體酪胺酸激酶類孤兒受體1 (ROR1)、Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)、腫瘤相關醣蛋白72 (TAG72)、CD38、CD44v6、癌胚抗原(CEA)、上皮細胞黏附分子(EPCAM)、B7H3 (CD276)、KIT (CD117)、介白素-13受體次單元α-2、間皮素、介白素11受體α (IL-11Ra)、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、蛋白酶絲胺酸21、血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)、路易斯(Y)抗原、CD24、血小板衍生生長因子受體β (PDGFR-β)、階段特異性胚抗原-4 (SSEA-4)、CD20、葉酸受體α、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、HER3、黏蛋白1、細胞表面相關性(MUC1)、表皮成長因子受體(EGFR)、神經細胞黏附分子(NCAM)、前列腺酶、前列腺酸磷酸酶(PAP)、延長因子2突變型(ELF2M)、艾普瑞林B2、成纖維細胞活化蛋白α (FAP)、類胰島素生長因子1受體(IGF-I受體)、碳酸酐酶IX (CAIX)、蛋白酶體(前驅體，巨蛋白因子)次單元、β類型、9 (LMP2)、醣蛋白100 (gp100)、由斷點叢集區(BCR)及阿貝爾森鼠白血病病毒致癌基因同源物1 (Abl)組成之致癌基因融合蛋白質(bcr-abl)、酪胺酸酶、艾普瑞林A型受體2 (EphA2)、海藻糖基GM1、唾液酸基路易斯黏附分子(sLe)、神經節苷脂GM3、轉麩醯胺酸酶5 (TGS5)、高分子量黑素瘤相關抗原(HMWMAA)、o-乙醯基-GD2神經節苷脂(OAcGD2)、葉酸受體β、腫瘤內皮標記物1 (TEM1/CD248)、腫瘤內皮標記物7相關(TEM7R)、密連蛋白6 (CLDN6)、促甲狀腺激素受體(TSHR)、G蛋白偶合受體C類別第5類D成員(GPRC5D)、X染色體開讀框61 (CXORF61)、CD97、CD179a、多形性淋巴瘤激酶(ALK)、聚唾液酸、胎盤特異性1 (PLAC1)、globoH糖基神經醯胺之六醣部分(GloboH)、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、尿溶蛋白2 (UPK2)、A型肝炎病毒細胞受體1 (HAVCR1)、腎上腺素受體β3 (ADRB3)、泛連接蛋白3 (PANX3)、G蛋白偶合受體20 (GPR20)、淋巴球抗原6複合物、基因座K 9 (LY6K)、嗅覺受體51E2 (OR51E2)、TCRγ交替讀取範圍蛋白質(TARP)、威爾姆斯腫瘤蛋白質(WT1)、癌症/睪丸抗原1 (NY-ESO-1)、癌症/睪丸抗原2 (LAGE-1a)、MAGE家庭成員(包括MAGE-A1、MAGE-A3及MAGE-A4)、位於染色體12p上之ETS移位變異體基因6 (ETV6-AML)、精子蛋白質17 (SPA17)、X抗原家族成員1A (XAGE1)、血管生成素結合細胞表面受體2 (Tie 2)、黑素瘤癌症睪丸抗原-1 (MAD-CT-1)、黑素瘤癌症睪丸抗原-2 (MAD-CT-2)、Fos相關抗原1、腫瘤蛋白質p53 (p53)、p53突變體、前列腺蛋白、存活的端粒酶、前列腺癌腫瘤抗原-1、藉由T細胞1識別之黑素瘤抗原、大鼠肉瘤(Ras)突變體、人類端粒酶逆轉錄酶(hTERT)、肉瘤移位斷裂點、細胞凋亡之黑素瘤抑制劑(ML-IAP)、ERG (跨膜蛋白酶，絲胺酸2 (TMPRSS2) ETS融合基因)、N-乙醯基葡糖胺基-轉移酶V (NA17)、成對盒蛋白質Pax-3 (PAX3)、雄激素受體、週期素B1、v-myc禽類髓細胞瘤病病毒致癌基因神經母細胞瘤延伸之同源物(MYCN)、Ras同源物家族成員C (RhoC)、酪胺酸酶相關蛋白質2 (TRP-2)、細胞色素P450 1B1 (CYP1B1)、CCCTC結合因子(鋅指蛋白)類、藉由T細胞3識別之鱗狀細胞癌抗原(SART3)、成對盒蛋白質Pax-5 (PAX5)、前頂體素結合蛋白質sp32 (OY-TES1)、淋巴球特異性蛋白酪胺酸激酶(LCK)、A激酶錨定蛋白4 (AKAP-4)、滑膜肉瘤、X斷裂點2 (SSX2)、晚期糖化最終產物之受體(RAGE-1)、腎臟普遍存在性1 (RU1)、腎臟普遍存在性2 (RU2)、豆莢蛋白、人類乳頭狀瘤病毒E6 (HPV E6)、人類乳頭狀瘤病毒E7 (HPV E7)、腸道羧基酯酵素、熱衝擊蛋白質70-2突變型(mut hsp70-2)、CD79a、CD79b、CD72、白血球相關免疫球蛋白樣受體1 (LAIR1)、IgA受體之Fc片段(FCAR或CD89)、白血球免疫球蛋白樣受體亞家族A成員2 (LILRA2)、CD300分子樣家族成員f (CD300LF)、C型凝集素域家族12成員A (CLEC12A)、骨髓基質細胞抗原2 (BST2)、含有EGF樣模組之黏蛋白樣激素受體樣2 (EMR2)、淋巴球抗原75 (LY75)、磷脂醯肌醇蛋白-3 (GPC3)、Fc受體樣5 (FCRL5)、MUC16、5T4、8H9、ανβθ整合素、αvβ6整合素、α胎蛋白(AFP)、B7-H6、ca-125、CA9、CD44、CD44v7/8、CD52、上皮鈣黏蛋白、EMA (上皮膜抗原)、上皮醣蛋白-2 (EGP-2)、上皮醣蛋白-40 (EGP-40)、ErbB4、上皮腫瘤抗原(ETA)、葉酸鹽結合蛋白質(FBP)、激酶插入物域受體(KDR)、k-輕鏈、L1細胞黏附分子、MUC18、NKG2D、癌胚抗原(h5T4)、腫瘤/睪丸-抗原1B、GAGE、GAGE-1、BAGE、SCP-1、CTZ9、SAGE、CAGE、CT10、MART-1、免疫球蛋白λ樣多肽1 (IGLL1)、B型肝炎表面抗原結合蛋白質(HBsAg)、病毒衣殼抗原(VCA)、早期抗原(EA)、EBV細胞核抗原(EBNA)、HHV-6 p41早期抗原、HHV-6B U94潛伏性抗原、HHV-6B p98晚期抗原、巨細胞病毒(CMV)抗原、大T抗原、小T抗原、腺病毒抗原、呼吸道融合病毒(RSV)抗原、血凝素(HA)、神經胺糖酸苷酶(NA)、副流感1型抗原、副流感2型抗原、副流感3型抗原、副流感4型抗原、人類間質肺炎病毒(HMPV)抗原、C型肝炎病毒(HCV)核心抗原、HIV p24抗原、人類T細胞嗜淋巴球病毒(HTLV-1)抗原、梅克爾細胞多瘤病毒小T抗原、梅克爾細胞多瘤病毒大T抗原、卡堡氏肉瘤相關之疱疹病毒(KSHV)裂解細胞核抗原及KSHV潛伏性細胞核抗原。
作為一非限制性實例，在一些實施例中，環狀RNA構築體包含IRES及至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR的表現序列。作為一非限制性實例，在一些實施例中，環狀RNA構築體包含IRES及包含對CD19具有特異性之抗原結合域的CAR。在一些實施例中，環狀RNA構築體包含IRES及包含對BCMA具有特異性之抗原結合域的CAR。在一些實施例中，環狀RNA構築體包含IRES及CAR，該CAR包含對HER2具有特異性之抗原結合域。在一些實施例中，表現序列經密碼子最佳化。
舉一非限制性實例，在一些實施例中，環狀RNA構築體包含含有對CD19 (B淋巴球抗原CD19)具有特異性之抗原結合域的CAR。CD19為正常及贅生性B細胞以及濾泡性樹突狀細胞之生物標記物。瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)為最常見淋巴瘤，佔所有非霍奇金氏淋巴瘤之約25%至30%，接著為FL。由於CD19表現於超過95%之B細胞惡性病中，因此其為免疫治療方法之引人注目之目標。靶向CD19之CAR T細胞療法的一個已知實例為Yescarta® (Kite Pharma Inc.，阿基侖賽)，抗CD19 28-ζ (28-ζ) CAR。靶向CD19之CAR T細胞療法的另一已知實例為Kymriah® (Novartis Pharmaceutical Corp.，替沙津魯)，抗CD19 BB-ζ (BB-ζ) CAR。因此，在一些實施例中，環狀RNA構築體之表現序列編碼CAR，其中密碼子係針對此項技術中已知之抗CD19域。在一些實施例中，CAR構築體包含抗CD19結合子。在一些實施例中，表現序列經密碼子最佳化。
作為另一非限制性實例，在一些實施例中，環狀RNA構築體包含含有對B細胞成熟抗原(BCMA)具有特異性之抗原結合域的CAR。BCMA (亦稱為TNFRSF17或CD269)為腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族之成員且由正常及惡性漿細胞及小B細胞亞群表現。已研究BCMA為某些癌症之已知生物標記物，包括多發性骨髓瘤及若干BCMA靶向之CAR T療法，其中構築體在其共刺激域、鉸鏈區、跨膜域、用於產生抗BCMA scFv之種類及使用不同修飾來解決CAR-T療法之安全性各不相同。通常參見Shah等人,「B-cell maturation antigen (BCMA) in multiple myeloma: rationale for targeting and current therapeutic approaches」, Leukemia 34, 985-1005 (2020)。因此，在一些實施例中，環狀RNA構築體之表現序列編碼CAR，其中密碼子係針對此項技術中已知之抗BCMA域。在一些實施例中，CAR構築體包含抗BCMA結合子。在一些實施例中，表現序列經密碼子最佳化。
作為另一非限制性實例，在一些實施例中，環狀RNA構築體包含含有對人類表皮生長因子受體2 (HER2)具有特異性之抗原結合域的CAR。舉例而言，CAR可導引至HER2-BB-ζ (BB-ζ)及/或HER2-28ζ (28-ζ)。因此，在一些實施例中，CAR構築體包含抗HER2結合子。在一些實施例中，表現序列經密碼子最佳化。
在一些實施例中，環狀RNA構築體及相關醫藥組合物包含描述於下表2A-2C中之表現序列。在一些實施例中，本文所揭示之環狀RNA構築體及相關醫藥組合物包含與表2A-2C中之序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的表現序列，其中該密碼子序列產生具有所需序列之蛋白質。
表2A中之例示性抗CD19結合子序列經密碼子最佳化且對應於抗CD19 28-ζ (28ζ) CAR。對應於表2A中之核苷酸序列的胺基酸序列闡述於SEQ ID NO: 29中： MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR  (SEQ ID NO: 29)
在一些實施例中，本文所揭示之環狀RNA構築體及相關醫藥組合物包含編碼多肽之CAR序列，該多肽包含與SEQ ID NO: 29或其結合片段至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
在一些實施例中，本文所揭示之環狀RNA構築體及相關醫藥組合物包含與來自表1A之IRES具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列、來自SEQ ID NO: 50-61中之任一者或表1B之構築體A-P中之任一者之構築體的IRES及編碼包含與SEQ ID NO: 29或其結合片段至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致之多肽的CAR序列。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。 表2A：經密碼子最佳化序列(抗CD19 28-ζ)
密碼子編號： SEQ ID NO: NT 序列
2A-19 19 ATGGCACTGCCCGTCACCGCACTCCTGCTCCCACTGGCACTGCTGCTCCATGCAGCTCGCCCCGATATCCAGATGACCCAGACCACCTCTAGCCTCAGCGCCTCTCTGGGTGACCGCGTCACCATCTCTTGCCGGGCCAGCCAAGACATCTCTAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCTGACGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGTCGGCTGCATTCCGGGGTGCCTTCCAGGTTCAGCGGTTCCGGCTCTGGGACCGATTATAGTCTCACCATCTCCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCAACCTACTTCTGCCAGCAGGGGAACACCCTGCCCTACACCTTCGGTGGCGGGACCAAGCTGGAGATCACTGGAGGTGGTGGCAGCGGAGGTGGAGGATCAGGTGGAGGCGGTAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGACCTGGTCTGGTGGCCCCAAGCCAGTCCCTCAGCGTCACCTGCACAGTGTCCGGGGTGTCCCTGCCTGACTACGGTGTCTCCTGGATCAGGCAACCACCCCGGAAGGGTCTCGAGTGGCTGGGCGTCATCTGGGGCTCCGAGACCACCTACTACAACAGCGCTCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAAGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCTTGAAGATGAACTCCCTGCAAACCGATGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGTAGCTACGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGTGTCACCGTCTCCTCCATCGAGGTGATGTACCCTCCACCCTATCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCTAGCCCTCTGTTCCCAGGACCCTCCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTCGTGGTGGGAGGAGTCCTGGCCTGCTATTCCCTCCTCGTCACCGTGGCATTTATCATCTTCTGGGTCCGGAGCAAGCGGTCACGCCTGCTCCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTCGCAGACCTGGACCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTATGCCCCACCCCGCGACTTTGCCGCTTACCGCTCTCGGGTCAAGTTCTCTCGGTCAGCAGACGCCCCTGCATACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTCGGCAGACGGGAGGAGTACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGTGGTAAGCCACGGCGCAAGAACCCACAGGAGGGCTTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGAGGCGCAGGGGCAAGGGTCACGACGGCCTGTACCAAGGGCTGTCCACCGCAACCAAGGACACCTACGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTCCCACCAAGG
2A-20 20 ATGGCACTCCCAGTCACCGCACTTCTGCTGCCTCTCGCCCTGCTGCTCCATGCAGCCAGACCCGACATCCAGATGACCCAAACCACCAGCTCCCTGTCCGCTTCCCTGGGTGACCGGGTGACTATCTCTTGCCGGGCCTCCCAAGACATCTCCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAAAAGCCTGACGGCACCGTCAAGCTCCTCATCTACCATACCTCCAGACTGCACTCCGGGGTGCCTAGCAGGTTCAGCGGAAGTGGGAGCGGCACCGACTACAGCCTCACCATCTCCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGGAACACACTGCCCTACACCTTCGGCGGTGGCACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGAGGTTCCGGAGGAGGAGGTAGTGGAGGTGGAGGCAGCGAGGTGAAGCTCCAGGAATCCGGACCAGGTCTGGTGGCTCCCAGCCAGTCCCTCAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGTCTCTTCCCGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGACAGCCACCCCGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATCTGGGGTTCCGAGACCACATACTACAACTCAGCCCTCAAGAGCCGGCTCACCATCATCAAGGATAACTCCAAGTCCCAGGTCTTCCTGAAGATGAACTCTCTCCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGGTCCTACGCCATGGACTACTGGGGTCAGGGAACCTCCGTCACCGTCAGCTCTATCGAGGTGATGTACCCTCCTCCCTACCTCGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCATGTGAAGGGGAAGCATCTCTGCCCCTCACCCCTGTTCCCCGGACCATCCAAGCCATTCTGGGTGCTGGTGGTTGTTGGTGGGGTCCTGGCTTGCTACTCACTCCTGGTCACCGTCGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGGTCAAAGAGGTCCCGGCTCTTGCACTCCGATTACATGAACATGACTCCAAGGAGGCCTGGTCCCACACGGAAGCACTACCAACCATATGCCCCACCACGCGACTTCGCTGCTTACCGGAGCCGGGTCAAGTTCAGTCGGAGTGCAGACGCCCCAGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAACTCTACAACGAGCTTAATCTGGGTCGCCGGGAGGAGTATGACGTGCTCGATAAGAGAAGGGGCCGGGATCCTGAGATGGGCGGTAAGCCCAGACGGAAGAACCCTCAGGAGGGGTTGTATAATGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCATACTCCGAGATCGGCATGAAAGGTGAGCGGAGGAGAGGCAAGGGGCATGACGGCCTGTACCAGGGGCTCAGCACAGCCACCAAGGATACCTATGACGCACTCCACATGCAGGCACTGCCTCCACGG
2A-21 21 ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACCCAGACAACCAGCAGCCTGTCTGCCAGCCTGGGCGATAGAGTGACCATCAGCTGTAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTACAGCCTGACAATCAGCAACCTGGAACAAGAGGATATCGCTACCTACTTCTGCCAGCAAGGCAACACCCTGCCTTACACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCACAGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGTGGATCTGAAGTGAAACTGCAAGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTGGCCCCATCTCAATCTCTGAGCGTGACCTGTACCGTCAGCGGAGTGTCCCTGCCTGATTATGGCGTGTCCTGGATCCGGCAGCCTCCTAGAAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCTAGCATCGAAGTGATGTACCCTCCACCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTACTCTCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA
2A-22 22 ATGGCCCTTCCCGTCACCGCTCTCCTCCTGCCACTGGCCTTGCTGCTGCACGCTGCACGGCCAGACATCCAGATGACCCAGACAACCAGCTCTCTGTCAGCCTCTCTCGGCGATCGCGTCACAATCAGCTGCCGCGCTTCCCAAGACATCTCCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAAAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTCATCTACCACACCTCCAGACTGCATAGCGGGGTGCCCAGCAGATTCAGTGGCTCAGGCTCAGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAGCAGGAGGACATTGCCACATACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGAGGCGGCACAAAGCTGGAGATCACCGGTGGAGGAGGGAGTGGAGGAGGAGGCAGTGGTGGCGGAGGTTCCGAGGTGAAGCTCCAGGAATCAGGTCCAGGACTGGTCGCCCCTTCCCAGTCCCTGTCCGTCACCTGCACCGTGAGTGGCGTCAGCCTCCCAGACTACGGTGTGTCTTGGATCCGCCAACCTCCTCGCAAAGGCCTGGAATGGCTCGGCGTCATCTGGGGAAGCGAGACAACCTACTATAACTCCGCACTGAAGTCCCGCCTCACCATCATCAAGGATAATAGCAAGAGCCAGGTCTTCCTCAAGATGAACTCCCTGCAGACCGACGATACCGCCATCTACTACTGTGCCAAGCACTACTACTACGGAGGTTCTTACGCCATGGATTACTGGGGACAGGGAACCTCTGTCACCGTCAGCTCCATCGAGGTCATGTATCCACCACCCTACCTGGACAACGAAAAGAGCAATGGCACCATCATCCACGTGAAGGGGAAGCACCTCTGCCCCTCACCCCTGTTCCCTGGTCCCTCCAAGCCTTTCTGGGTCCTGGTCGTCGTGGGAGGCGTGTTGGCCTGTTACTCCCTGCTCGTCACCGTCGCCTTCATCATCTTCTGGGTTAGGAGTAAGCGGTCCCGGCTTCTGCACTCTGACTACATGAACATGACACCCAGAAGACCTGGGCCAACCCGGAAGCACTACCAGCCCTACGCTCCACCCAGGGACTTTGCAGCCTACAGGTCCCGCGTCAAGTTCTCCCGGTCTGCTGACGCACCTGCCTACCAGCAGGGCCAAAACCAGCTCTACAACGAGTTGAACCTCGGCAGACGGGAGGAGTACGACGTCCTCGACAAAAGGCGGGGTCGGGATCCTGAGATGGGCGGTAAGCCAAGGCGGAAGAACCCACAGGAAGGCCTCTATAATGAGCTCCAGAAGGATAAGATGGCTGAGGCCTACTCCGAGATCGGGATGAAGGGCGAAAGGAGACGGGGTAAGGGGCACGACGGCCTCTATCAGGGTCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCACTGCCACCTCGG
2A-23 23 ATGGCTCTGCCAGTGACCGCACTGCTGCTGCCCTTAGCCTTACTCCTTCACGCAGCCAGGCCCGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCTCCCTTTCCGCAAGCCTCGGCGACAGGGTCACCATCTCCTGTCGGGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCTCACGGCTGCACTCAGGCGTGCCCTCACGGTTTAGCGGATCAGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACTATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACCGGTGGCGGTGGTTCAGGTGGCGGAGGCTCAGGAGGAGGCGGCAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGTCCAGGACTGGTGGCACCCAGCCAGAGCCTGAGCGTGACTTGCACCGTGTCAGGCGTGAGCCTGCCAGACTACGGCGTGAGCTGGATCCGGCAGCCTCCTCGGAAGGGCTTAGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACTCAGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGACAGGGTACCAGCGTGACCGTGAGCAGCATCGAGGTGATGTACCCTCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCTAGCCCTTTATTCCCCGGCCCCTCAAAACCCTTCTGGGTGCTGGTCGTCGTCGGTGGCGTGCTGGCATGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATATTCTGGGTCCGGTCAAAGCGGAGCCGGTTACTGCACAGCGACTACATGAACATGACTCCACGGCGTCCAGGTCCCACTCGGAAGCACTACCAACCCTACGCTCCTCCCCGTGACTTTGCTGCCTACCGTAGCCGGGTGAAGTTCTCCAGGAGCGCCGATGCCCCAGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTACAATGAGCTTAACCTTGGCAGGCGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCCGTGATCCCGAGATGGGAGGCAAGCCCCGTAGGAAGAATCCCCAGGAGGGCCTTTACAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGCGTAGGCGTGGAAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACTGCTACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCTCTTCCACCCCGG
表2B闡述未經密碼子最佳化之額外例示性抗CD19結合子序列的核苷酸及胺基酸序列。序列導向至抗CD19 28-ζ (28ζ) CAR。在一些實施例中，本文所揭示之環狀RNA構築體及相關醫藥組合物包含編碼多肽之CAR序列，該多肽包含與SEQ ID NO: 30-34中之任一者或其結合片段至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。
在一些實施例中，本文所揭示之環狀RNA構築體及相關醫藥組合物包含與來自表1A之IRES具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列、來自SEQ ID NO: 50-61中之任一者或表1B之構築體A-P中之任一者之構築體的IRES及編碼包含與SEQ ID NO: 30-34中之任一者或其結合片段至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致之多肽的CAR序列。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。 表2B：額外密碼子胺基酸及核苷酸序列(抗CD19 28-ζ)
SEQ ID NO 密碼子核苷酸序列 SEQ ID NO 密碼子胺基酸序列
24 ATGCTCCTCCTGGTGACCAGCTTGCTCCTGTGCGAACTGCCACACCCCGCCTTCCTCCTCATCCCCGATATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGAGCGCAAGCCTCGGCGATCGGGTGACCATCTCATGCAGGGCCTCCCAGGACATCTCCAAGTATCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCTGACGGCACCGTCAAGCTGCTCATCTACCACACCTCACGGCTGCACTCAGGCGTCCCCTCAAGATTCAGCGGTAGCGGATCCGGGACCGACTACTCCCTTACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGATATCGCCACATACTTCTGCCAGCAGGGTAACACCCTGCCCTATACCTTCGGCGGTGGGACCAAGCTGGAGATCACCGGTTCTACATCCGGATCCGGCAAGCCTGGTAGTGGCGAGGGCTCCACCAAAGGGGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGTCCAGGTCTGGTGGCTCCAAGTCAGTCCCTGTCTGTGACTTGCACCGTGTCAGGCGTGAGCCTGCCTGACTACGGGGTGAGCTGGATCCGGCAGCCACCTCGGAAGGGGTTGGAGTGGCTGGGAGTCATCTGGGGATCCGAGACCACCTACTACAATTCCGCCCTCAAAAGCCGCCTCACCATCATCAAGGACAACTCCAAGTCCCAGGTCTTCCTGAAGATGAATTCCCTGCAGACCGACGACACCGCTATCTATTACTGCGCCAAGCATTACTACTACGGCGGGTCCTACGCCATGGACTACTGGGGTCAAGGCACCTCCGTCACTGTTTCCTCCGCAGCAGCCATCGAGGTCATGTATCCTCCTCCCTACCTCGACAACGAGAAGTCCAACGGGACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTCTGCCCAAGCCCACTGTTCCCAGGGCCCTCCAAACCATTCTGGGTGCTCGTGGTGGTGGGTGGCGTGCTCGCTTGCTACTCCCTCCTGGTCACCGTCGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGGAGTAAGCGCAGCCGCCTGCTCCATAGCGACTACATGAACATGACCCCACGGAGACCTGGTCCCACCCGGAAACACTACCAGCCCTACGCACCACCCAGGGACTTCGCTGCCTATCGGTCCCGGGTTAAATTCTCTAGGTCCGCTGATGCCCCAGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAATGAGCTGAACCTGGGTAGACGGGAGGAGTATGACGTCCTGGATAAGCGCAGAGGGAGAGACCCCGAGATGGGTGGAAAGCCCAGGCGGAAGAATCCCCAGGAGGGTCTCTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGGATGAAAGGGGAAAGAAGGCGGGGAAAGGGCCATGACGGACTGTACCAGGGTCTGTCCACCGCTACCAAGGACACCTACGATGCACTGCACATGCAGGCACTGCCTCCTCGG 30 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
25 ATGCTGCTTCTCGTTACATCTCTGTTGCTCTGCGAGCTGCCTCATCCAGCCTTCCTCCTGATTCCCGATATCCAGATGACCCAGACCACCTCTAGCCTCAGCGCCTCTCTGGGTGACCGCGTCACCATCTCTTGCCGGGCCAGCCAAGACATCTCTAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCTGACGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGTCGGCTGCATTCCGGGGTGCCTTCCAGGTTCAGCGGTTCCGGCTCTGGGACCGATTATAGTCTCACCATCTCCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCAACCTACTTCTGCCAGCAGGGGAACACCCTGCCCTACACCTTCGGTGGCGGGACCAAGCTGGAGATCACTGGCAGCACCTCAGGCTCTGGGAAGCCTGGCAGCGGTGAAGGCAGCACCAAGGGTGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGACCTGGTCTGGTGGCCCCAAGCCAGTCCCTCAGCGTCACCTGCACAGTGTCCGGGGTGTCCCTGCCTGACTACGGTGTCTCCTGGATCAGGCAACCACCCCGGAAGGGTCTCGAGTGGCTGGGCGTCATCTGGGGCTCCGAGACCACCTACTACAACAGCGCTCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAAGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCTTGAAGATGAACTCCCTGCAAACCGATGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGTAGCTACGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGTGTCACCGTCTCCTCCGCTGCCGCTATCGAGGTGATGTACCCTCCACCCTATCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCTAGCCCTCTGTTCCCAGGACCCTCCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTCGTGGTGGGAGGAGTCCTGGCCTGCTATTCCCTCCTCGTCACCGTGGCATTTATCATCTTCTGGGTCCGGAGCAAGCGGTCACGCCTGCTCCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTCGCAGACCTGGACCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTATGCCCCACCCCGCGACTTTGCCGCTTACCGCTCTCGGGTCAAGTTCTCTCGGTCAGCAGACGCCCCTGCATACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTCGGCAGACGGGAGGAGTACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGTGGTAAGCCACGGCGCAAGAACCCACAGGAGGGCTTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGAGGCGCAGGGGCAAGGGTCACGACGGCCTGTACCAAGGGCTGTCCACCGCAACCAAGGACACCTACGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTCCCACCAAGG 31 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
26 ATGGCACTTCCAGTTACAGCACTTCTGCTTCCATTGGCACTGCTGCTCCATGCAGCTCGCCCCGATATCCAGATGACCCAGACCACCTCTAGCCTCAGCGCCTCTCTGGGTGACCGCGTCACCATCTCTTGCCGGGCCAGCCAAGACATCTCTAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCTGACGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGTCGGCTGCATTCCGGGGTGCCTTCCAGGTTCAGCGGTTCCGGCTCTGGGACCGATTATAGTCTCACCATCTCCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCAACCTACTTCTGCCAGCAGGGGAACACCCTGCCCTACACCTTCGGTGGCGGGACCAAGCTGGAGATCACTGGCAGCACCTCAGGCTCTGGGAAGCCTGGCAGCGGTGAAGGCAGCACCAAGGGTGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGACCTGGTCTGGTGGCCCCAAGCCAGTCCCTCAGCGTCACCTGCACAGTGTCCGGGGTGTCCCTGCCTGACTACGGTGTCTCCTGGATCAGGCAACCACCCCGGAAGGGTCTCGAGTGGCTGGGCGTCATCTGGGGCTCCGAGACCACCTACTACAACAGCGCTCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAAGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCTTGAAGATGAACTCCCTGCAAACCGATGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGTAGCTACGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGTGTCACCGTCTCCTCCGCTGCCGCTATCGAGGTGATGTACCCTCCACCCTATCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCTAGCCCTCTGTTCCCAGGACCCTCCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTCGTGGTGGGAGGAGTCCTGGCCTGCTATTCCCTCCTCGTCACCGTGGCATTTATCATCTTCTGGGTCCGGAGCAAGCGGTCACGCCTGCTCCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTCGCAGACCTGGACCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTATGCCCCACCCCGCGACTTTGCCGCTTACCGCTCTCGGGTCAAGTTCTCTCGGTCAGCAGACGCCCCTGCATACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTCGGCAGACGGGAGGAGTACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGTGGTAAGCCACGGCGCAAGAACCCACAGGAGGGCTTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGAGGCGCAGGGGCAAGGGTCACGACGGCCTGTACCAAGGGCTGTCCACCGCAACCAAGGACACCTACGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTCCCACCAAGG 32 MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
27 ATGGCACTGCCCGTCACCGCACTCCTGCTCCCACTGGCACTGCTGCTCCATGCAGCTCGCCCCGATATCCAGATGACCCAGACCACCTCTAGCCTCAGCGCCTCTCTGGGTGACCGCGTCACCATCTCTTGCCGGGCCAGCCAAGACATCTCTAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCTGACGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGTCGGCTGCATTCCGGGGTGCCTTCCAGGTTCAGCGGTTCCGGCTCTGGGACCGATTATAGTCTCACCATCTCCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCAACCTACTTCTGCCAGCAGGGGAACACCCTGCCCTACACCTTCGGTGGCGGGACCAAGCTGGAGATCACTGGCAGCACCTCAGGCTCTGGGAAGCCTGGCAGCGGTGAAGGCAGCACCAAGGGTGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGACCTGGTCTGGTGGCCCCAAGCCAGTCCCTCAGCGTCACCTGCACAGTGTCCGGGGTGTCCCTGCCTGACTACGGTGTCTCCTGGATCAGGCAACCACCCCGGAAGGGTCTCGAGTGGCTGGGCGTCATCTGGGGCTCCGAGACCACCTACTACAACAGCGCTCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAAGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCTTGAAGATGAACTCCCTGCAAACCGATGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGTAGCTACGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGTGTCACCGTCTCCTCCGCTGCCGCTATCGAGGTGATGTACCCTCCACCCTATCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCTAGCCCTCTGTTCCCAGGACCCTCCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTCGTGGTGGGAGGAGTCCTGGCCTGCTATTCCCTCCTCGTCACCGTGGCATTTATCATCTTCTGGGTCCGGAGCAAGCGGTCACGCCTGCTCCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTCGCAGACCTGGACCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTATGCCCCACCCCGCGACTTTGCCGCTTACCGCTCTCGGGTCAAGTTCTCTCGGTCAGCAGACGCCCCTGCATACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTCGGCAGACGGGAGGAGTACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGTGGTAAGCCACGGCGCAAGAACCCACAGGAGGGCTTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGAGGCGCAGGGGCAAGGGTCACGACGGCCTGTACCAAGGGCTGTCCACCGCAACCAAGGACACCTACGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTCCCACCAAGG 33 MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
28 ATGGCACTTCCAGTTACAGCACTTCTGCTTCCATTGGCACTGCTGCTCCATGCAGCTCGCCCCGATATCCAGATGACCCAGACCACCTCTAGCCTCAGCGCCTCTCTGGGTGACCGCGTCACCATCTCTTGCCGGGCCAGCCAAGACATCTCTAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCTGACGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGTCGGCTGCATTCCGGGGTGCCTTCCAGGTTCAGCGGTTCCGGCTCTGGGACCGATTATAGTCTCACCATCTCCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCAACCTACTTCTGCCAGCAGGGGAACACCCTGCCCTACACCTTCGGTGGCGGGACCAAGCTGGAGATCACTGGAGGTGGTGGCAGCGGAGGTGGAGGATCAGGTGGAGGCGGTAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGACCTGGTCTGGTGGCCCCAAGCCAGTCCCTCAGCGTCACCTGCACAGTGTCCGGGGTGTCCCTGCCTGACTACGGTGTCTCCTGGATCAGGCAACCACCCCGGAAGGGTCTCGAGTGGCTGGGCGTCATCTGGGGCTCCGAGACCACCTACTACAACAGCGCTCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAAGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCTTGAAGATGAACTCCCTGCAAACCGATGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGTAGCTACGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGTGTCACCGTCTCCTCCATCGAGGTGATGTACCCTCCACCCTATCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCTAGCCCTCTGTTCCCAGGACCCTCCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTCGTGGTGGGAGGAGTCCTGGCCTGCTATTCCCTCCTCGTCACCGTGGCATTTATCATCTTCTGGGTCCGGAGCAAGCGGTCACGCCTGCTCCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTCGCAGACCTGGACCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTATGCCCCACCCCGCGACTTTGCCGCTTACCGCTCTCGGGTCAAGTTCTCTCGGTCAGCAGACGCCCCTGCATACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTCGGCAGACGGGAGGAGTACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGTGGTAAGCCACGGCGCAAGAACCCACAGGAGGGCTTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGAGGCGCAGGGGCAAGGGTCACGACGGCCTGTACCAAGGGCTGTCCACCGCAACCAAGGACACCTACGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTCCCACCAAGG 34 MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
表2C闡述未經密碼子最佳化之其他例示性結合子序列之核苷酸及胺基酸序列，包括小鼠抗CD19結合子、抗BCMA結合子及抗HER2結合子。在一些實施例中，本文所揭示之環狀RNA構築體及相關醫藥組合物包含編碼多肽之CAR序列，該多肽包含與SEQ ID NO: 116-135或其結合片段中之任一者至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
在一些實施例中，本文所揭示之環狀RNA構築體及相關醫藥組合物包含與來自表1A之IRES具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的IRES序列、來自SEQ ID NO: 50-61中之任一者或表1B之構築體A-P中之任一者之構築體的IRES及編碼包含與SEQ ID NO: 116-135中之任一者或其結合片段至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致之多肽的CAR序列。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之CD28z共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。在一些實施例中，該環狀RNA進一步包含本文所描述之4-1BB共刺激域，且視情況與具有替代共刺激域之適合對照相比展現增加的活性。 表2C：額外密碼子胺基酸及核苷酸序列
SEQ ID NO 密碼子核苷酸序列 SEQ ID NO 密碼子胺基酸序列
小鼠CD19 100 ATGGGCGTGCCTACCCAGCTGCTCGGTCTCCTGCTGCTCTGGATCACCGACGCTATCTGCGACATCCAAATGACCCAGAGTCCCGCTTCCCTCAGCACCTCCCTGGGTGAGACCGTCACCATCCAGTGCCAGGCATCCGAGGACATCTACAGTGGTCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGTAAGTCCCCTCAGCTGCTGATCTACGGTGCTTCCGATCTGCAGGACGGAGTCCCTAGCCGCTTCTCAGGCTCTGGCTCCGGTACCCAGTACTCCCTGAAGATCACATCCATGCAGACCGAAGACGAGGGAGTGTACTTCTGCCAGCAGGGGCTGACCTACCCTCGGACATTCGGCGGTGGAACCAAGCTCGAGCTGAAGGGAGGTGGAGGCAGTGGTGGCGGAGGATCTGGTGGTGGTGGCTCCGAGGTCCAACTGCAGCAGTCCGGCGCTGAGCTGGTGAGGCCCGGAACCAGCGTCAAACTCAGCTGCAAGGTGAGCGGGGACACCATCACCTTCTACTACATGCACTTCGTCAAGCAGAGGCCTGGGCAGGGTCTTGAATGGATCGGCCGGATCGATCCAGAGGACGAGTCTACAAAGTACTCCGAGAAGTTCAAGAACAAAGCAACCCTGACCGCCGACACAAGCTCCAACACCGCCTACCTGAAGCTGTCCAGCCTCACCTCTGAGGACACCGCCACCTACTTCTGCATCTACGGCGGGTACTACTTCGACTATTGGGGCCAAGGGGTGATGGTCACCGTGTCCTCTATCGAGTTCATGTATCCTCCTCCCTACCTGGACAACGAGCGGAGCAACGGCACCATCATCCACATCAAAGAGAAGCACCTCTGCCACACCCAATCCTCTCCCAAACTCTTCTGGGCCCTCGTTGTGGTCGCAGGCGTGCTCTTCTGCTACGGGCTGCTGGTGACTGTGGCCTTGTGCGTGATCTGGACCAACAGTAGACGGAATCGGGGAGGTCAGAGCGACTACATGAACATGACACCTCGCAGACCAGGCCTGACACGGAAGCCCTACCAACCATACGCTCCTGCCCGGGATTTTGCAGCATATCGGCCACGGGCCAAGTTTAGCAGGTCCGCAGAGACCGCAGCCAACCTGCAAGACCCTAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTTGGTCGCCGGGAGGAGTACGACGTCCTGGAGAAGAAGAGAGCACGGGATCCCGAGATGGGCGGAAAGCAACAACGCCGGCGGAATCCTCAGGAGGGTGTCTACAACGCCCTCCAGAAGGACAAGATGGCTGAGGCCTACTCCGAGATCGGCACTAAGGGCGAGCGCAGACGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGTCTCAGCACCGCAACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAAACCCTCGCACCCCGG 116 MGVPTQLLGLLLLWITDAICDIQMTQSPASLSTSLGETVTIQCQASEDIYSGLAWYQQKPGKSPQLLIYGASDLQDGVPSRFSGSGSGTQYSLKITSMQTEDEGVYFCQQGLTYPRTFGGGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELVRPGTSVKLSCKVSGDTITFYYMHFVKQRPGQGLEWIGRIDPEDESTKYSEKFKNKATLTADTSSNTAYLKLSSLTSEDTATYFCIYGGYYFDYWGQGVMVTVSSIEFMYPPPYLDNERSNGTIIHIKEKHLCHTQSSPKLFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWTNSRRNRGGQSDYMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRPRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR
HER2 101 ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACTCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGCCGGGCCAGCCAGGATGTGAATACTGCTGTCGCCTGGTATCAACAAAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTACAGCGCCAGCTTTCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCTCCGGAAGCAGAAGCGGCACAGATTTCACACTGACCATAAGCAGCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGCACTACACCACACCTCCAACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTCGAGATTAAGAGAACAGGCAGCACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGATCTGGCGAGGGCTCTGAAGTCCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCAGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGCCAGGATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTGCCGACACCAGCAAGAATACCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTATTACTGTTCCAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTCGTGACCGTTTCTTCTATCGAAGTGATGTACCCTCCACCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTACTCTCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA 117 MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
HER2 102 ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACTCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGCCGGGCCAGCCAGGATGTGAATACTGCTGTCGCCTGGTATCAACAAAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTACAGCGCCAGCTTTCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCTCCGGAAGCAGAAGCGGCACAGATTTCACACTGACCATAAGCAGCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGCACTACACCACACCTCCAACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTCGAGATTAAGAGAACAGGCAGCACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGATCTGGCGAGGGCTCTGAAGTCCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCAGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGCCAGGATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTGCCGACACCAGCAAGAATACCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTATTACTGTTCCAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTCGTGACCGTTTCTTCTACCACCACACCAGCTCCTCGGCCTCCAACTCCTGCTCCTACAATTGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCTCCTCTGGCCGGAACATGTGGCGTTCTGCTGCTGAGCCTGGTCATCACCCTGTACTGTAAGCGGGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACACAAGAGGAAGATGGCTGCTCCTGCAGATTCCCCGAGGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA 118 MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
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BCMA 104 ATGGCCCTCCCCGTCACAGCTCTCCTGCTCCCACTGGCCCTTCTTTTGCACGCTGCTCGCCCCGATATCGTGCTCACCCAGTCACCTCCAAGCCTTGCCATGAGCCTCGGGAAACGGGCTACCATCTCCTGCCGGGCTTCAGAGTCCGTCACCATCCTCGGGTCACACCTCATCCACTGGTACCAACAGAAACCAGGGCAGCCTCCTACCCTCTTGATCCAGTTGGCCTCCAACGTGCAAACTGGGGTTCCCGCCAGGTTCAGTGGCTCCGGATCCCGGACAGATTTCACACTTACCATCGATCCTGTGGAGGAGGACGATGTGGCCGTCTATTACTGCCTGCAGTCTCGCACCATCCCTCGGACCTTCGGTGGAGGCACCAAGCTCGAGATCAAGGGTAGCACCTCCGGCTCTGGAAAGCCAGGCTCTGGTGAGGGTTCTACCAAGGGCCAAATCCAGCTGGTCCAGTCTGGGCCCGAGCTGAAGAAACCCGGGGAGACCGTGAAGATCTCCTGCAAGGCCTCCGGTTATACCTTCACCGACTACTCCATCAACTGGGTCAAGCGCGCTCCTGGAAAGGGCCTCAAGTGGATGGGCTGGATCAACACCGAAACCCGCGAGCCTGCCTATGCTTACGACTTCAGGGGCCGGTTCGCTTTCTCACTGGAGACCTCCGCTTCCACAGCCTACCTCCAGATCAACAACCTCAAGTACGAAGACACCGCCACCTATTTCTGCGCTCTCGACTATTCCTACGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGCACCTCTGTGACCGTCTCTAGCGCAGCCGCCACCACAACACCAGCCCCACGGCCACCTACTCCCGCACCCACCATCGCATCCCAACCACTCAGTCTGAGGCCCGAGGCCTGTAGACCTGCTGCTGGAGGCGCAGTGCATACCCGCGGTCTCGACTTCGCCTGCGACATCTATATCTGGGCCCCATTGGCAGGTACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGTCACTCGTCATCACCCTGTACTGCCGGAGTAAGCGCTCTAGGCTGTTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCAAGAAGACCAGGGCCTACCCGGAAGCACTACCAGCCATACGCACCTCCCCGGGACTTTGCCGCCTATCGGTCTCGGGTGAAGTTCTCACGCTCCGCTGATGCCCCAGCATACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTGTACAATGAGCTCAACCTCGGTCGCCGCGAAGAGTACGACGTGCTCGACAAGAGAAGGGGCAGGGACCCTGAGATGGGAGGCAAGCCCCGCAGAAAGAATCCCCAGGAAGGTCTGTACAACGAGCTGCAAAAGGATAAGATGGCTGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGGAGACGGGGAAAGGGCCACGACGGGCTCTACCAGGGACTCTCCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTCCACATGCAGGCTCTGCCACCCAGG 120 MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
BCMA 105 ATGGCACTTCCCGTCACCGCTCTCCTGCTGCCCCTCGCACTGCTGCTCCATGCAGCCCGCCCAGACATCGTCCTGACCCAGTCCCCTCCCTCCCTCGCAATGTCCCTCGGGAAACGGGCCACCATCAGCTGCCGGGCCTCTGAGTCAGTGACAATCCTCGGAAGCCATCTGATCCATTGGTACCAGCAGAAACCCGGTCAGCCTCCAACCCTCCTCATCCAGCTGGCCTCCAACGTGCAGACAGGAGTCCCCGCTCGGTTCTCAGGCAGCGGTTCCAGGACCGACTTCACCCTGACCATCGACCCCGTGGAAGAGGACGATGTGGCTGTGTACTACTGCCTCCAGTCCCGGACCATCCCACGGACCTTCGGAGGTGGGACAAAGCTGGAGATCAAAGGCAGCACCAGCGGTTCTGGCAAGCCAGGGTCAGGTGAGGGGAGCACAAAGGGTCAGATCCAGCTGGTGCAGAGCGGTCCCGAGCTGAAGAAGCCCGGGGAGACCGTTAAGATCTCCTGCAAGGCTAGCGGGTACACCTTCACCGACTATAGTATCAACTGGGTCAAGCGCGCTCCTGGCAAGGGGCTCAAGTGGATGGGGTGGATCAACACCGAAACCAGGGAGCCCGCATACGCTTATGACTTTCGGGGCCGGTTCGCCTTTTCCCTGGAGACCAGCGCCTCTACCGCCTACCTCCAGATCAACAACCTGAAGTACGAGGACACCGCCACCTACTTCTGCGCACTCGACTACTCCTACGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACCTCCGTCACCGTCTCCAGCATCGAGGTCATGTACCCTCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCATGTGAAGGGCAAGCATCTCTGCCCCAGCCCACTGTTCCCCGGACCCTCTAAGCCCTTCTGGGTCCTGGTCGTCGTCGGCGGTGTTCTGGCTTGCTACAGCTTGCTGGTCACCGTCGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGCTCCAAGAGGAGCCGGCTGCTGCATAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGAAGGCCTGGTCCAACCCGCAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCACGGGACTTCGCAGCCTACCGGTCACGGGTGAAGTTCTCTCGGAGCGCAGATGCCCCAGCATACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAACTTAACCTTGGTCGGCGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGCGCAGGGGTCGGGATCCTGAAATGGGCGGGAAACCACGCCGGAAGAACCCACAGGAGGGGCTCTATAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCTGAGGCTTACAGCGAGATTGGAATGAAGGGAGAAAGAAGACGGGGCAAGGGTCACGACGGGTTGTACCAGGGTCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTCCACATGCAAGCCCTTCCACCCCGC 121 MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
BCMA 106 ATGGCTCTCCCCGTGACCGCTCTGCTGCTCCCTCTGGCCCTCCTTCTGCACGCAGCCAGACCACAGGTCAAGCTGGAGGAGTCTGGTGGCGGTCTGGTGCAGGCAGGGAGGAGCCTGAGGCTGAGCTGTGCAGCTTCCGAGCACACATTCTCAAGCCACGTCATGGGGTGGTTCAGACAGGCTCCCGGTAAAGAGAGGGAGTCCGTCGCCGTGATCGGATGGCGGGACATCTCCACCTCCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACAATCTCACGCGATAATGCCAAGAAGACACTGTATCTGCAGATGAATTCCTTGAAGCCCGAAGACACCGCCGTCTATTACTGTGCTGCTAGACGGATCGACGCTGCCGACTTCGACAGCTGGGGACAGGGTACCCAAGTGACCGTTTCCTCCGGAGGCGGAGGTTCTGGAGGAGGTGGGTCAGGTGGAGGTGGCTCCGAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGCTTGGTCCAGGCTGGAGGCAGTCTCAGACTCTCCTGCGCTGCTTCAGGGCGGACCTTCACCATGGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCAGGTAAGGAGAGGGAGTTCGTGGCCGCCATCTCCCTCTCCCCTACCCTGGCATACTACGCTGAGTCCGTGAAGGGACGGTTTACCATCTCCCGGGATAACGCAAAGAACACTGTGGTCCTCCAAATGAACTCCCTCAAACCCGAGGACACCGCTCTCTACTATTGTGCCGCAGATCGGAAGAGCGTCATGTCCATCCGGCCCGATTACTGGGGCCAAGGCACACAGGTGACTGTGTCCAGCACCTCCACCACCACCCCAGCACCAAGGCCTCCAACCCCTGCACCAACCATCGCCTCCCAGCCACTGTCTTTGCGGCCAGAAGCATGCCGCCCAGCAGCAGGTGGAGCCGTGCATACAAGAGGCCTGGACTTCGCCTGCGATATCTACATCTGGGCTCCTCTGGCCGGAACATGCGGAGTCCTGCTCTTGTCCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGCGGGGTCGGAAGAAGCTCCTCTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTCCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGGTGCTCATGCAGGTTCCCCGAAGAGGAGGAGGGTGGCTGTGAGCTGCGGGTGAAGTTCAGCAGGTCAGCAGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGTTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGAGACGGGAGGAGTACGATGTCCTTGACAAGAGAAGGGGCCGGGATCCAGAGATGGGCGGGAAGCCAAGACGGAAGAATCCTCAGGAGGGTCTGTATAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAAGGGGAGCGCCGCAGAGGAAAAGGTCACGATGGTCTGTACCAGGGGTTGAGCACCGCTACCAAGGATACTTACGACGCTCTGCACATGCAAGCTCTGCCACCCCGG 122 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVKLEESGGGLVQAGRSLRLSCAASEHTFSSHVMGWFRQAPGKERESVAVIGWRDISTSYADSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAARRIDAADFDSWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFTMGWFRQAPGKEREFVAAISLSPTLAYYAESVKGRFTISRDNAKNTVVLQMNSLKPEDTALYYCAADRKSVMSIRPDYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
BCMA 107 ATGGCACTCCCCGTTACCGCCCTTCTGCTGCCTCTCGCCTTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCACAGGTCAAGCTGGAGGAGTCTGGTGGCGGGCTCGTTCAAGCAGGTCGGAGTCTCCGCCTGTCTTGCGCAGCATCAGAGCATACCTTCTCCTCACACGTGATGGGGTGGTTCAGGCAAGCTCCCGGTAAGGAGAGGGAGTCCGTGGCCGTTATCGGCTGGCGCGATATCAGCACCTCCTACGCAGACAGCGTTAAGGGCCGGTTCACTATCTCCAGGGACAACGCTAAGAAGACACTCTACCTCCAGATGAACAGTCTGAAGCCCGAGGACACCGCAGTGTACTATTGCGCTGCTCGGCGGATCGATGCTGCCGACTTCGACAGCTGGGGTCAAGGGACCCAGGTCACCGTTTCCAGCGGAGGTGGCGGAAGTGGTGGCGGAGGATCAGGTGGTGGAGGCTCCGAGGTCCAGCTGGTGGAATCAGGAGGCGGCTTGGTGCAGGCTGGTGGGTCTTTGCGGTTGTCCTGCGCAGCTTCCGGCAGGACCTTCACCATGGGATGGTTCAGACAAGCCCCAGGTAAGGAGCGGGAGTTTGTGGCCGCAATCTCACTGTCTCCCACCCTCGCTTACTACGCCGAGAGTGTGAAGGGGCGCTTCACAATCAGTCGCGACAACGCAAAGAACACCGTCGTCCTGCAAATGAACTCCCTGAAGCCTGAGGATACCGCACTCTATTACTGCGCCGCCGATCGGAAGAGCGTCATGTCCATCCGGCCCGACTATTGGGGCCAAGGCACCCAAGTGACCGTCAGCTCCACCTCCACAACCACTCCCGCCCCAAGACCACCTACCCCAGCCCCAACAATCGCATCCCAGCCTCTGTCCCTTCGGCCCGAAGCTTGTCGCCCTGCAGCAGGTGGAGCAGTGCACACCCGGGGACTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCACCCCTGGCTGGAACCTGCGGCGTGTTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTCTACTGCCGCTCTAAGAGAAGCCGGCTGCTGCATAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGGAGACCAGGACCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCACGGGATTTCGCTGCTTACCGCAGCCGGGTGAAGTTTTCCAGGTCAGCTGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAATTGTACAACGAACTGAATCTGGGACGGCGCGAGGAATACGACGTCCTGGACAAGAGGCGGGGTAGAGATCCCGAGATGGGCGGGAAACCTCGGCGGAAGAACCCTCAGGAGGGGCTCTACAACGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCCGAAGCCTACTCCGAGATCGGGATGAAGGGTGAACGGAGGAGGGGCAAGGGACACGACGGCCTGTATCAGGGCCTCAGCACCGCTACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCTCTCCCACCACGG 123 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVKLEESGGGLVQAGRSLRLSCAASEHTFSSHVMGWFRQAPGKERESVAVIGWRDISTSYADSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAARRIDAADFDSWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFTMGWFRQAPGKEREFVAAISLSPTLAYYAESVKGRFTISRDNAKNTVVLQMNSLKPEDTALYYCAADRKSVMSIRPDYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
BCMA 108 ATGGCTCTTCCCGTCACCGCTTTGCTGCTGCCCCTGGCACTCCTCCTCCATGCTGCTCGGCCTCAGGTGAAGCTGGAGGAGAGTGGTGGCGGTCTGGTGCAAGCTGGCAGATCTCTGCGCCTGTCTTGCGCAGCCAGCGAACACACCTTCTCCTCCCACGTGATGGGGTGGTTTCGGCAGGCACCCGGGAAAGAGCGCGAGTCCGTCGCAGTCATCGGGTGGCGGGACATCTCTACCAGCTACGCAGATTCCGTCAAGGGCCGGTTCACCATTTCCCGGGATAACGCTAAGAAGACCCTCTACCTGCAAATGAACTCTCTGAAGCCCGAAGACACCGCCGTCTACTATTGCGCAGCAAGGCGCATCGACGCTGCCGACTTCGACTCTTGGGGCCAAGGAACCCAGGTCACCGTGTCTTCCGGAGGAGGAGGCTCCGGTGGTGGAGGTTCTGGAGGTGGCGGCTCAGAGGTGCAGCTCGTGGAGAGCGGTGGTGGACTCGTTCAGGCAGGCGGCAGTTTGCGGCTGTCCTGTGCAGCCTCCGGTCGCACTTTCACTATGGGATGGTTCCGCCAGGCTCCTGGTAAAGAAAGGGAGTTCGTGGCCGCCATCAGTCTGAGCCCCACCCTCGCATACTACGCCGAGAGCGTGAAGGGTAGGTTCACTATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACACCGTGGTGCTCCAGATGAATTCCCTGAAGCCTGAGGATACCGCCCTCTACTACTGCGCTGCCGACCGCAAGAGCGTGATGAGCATCCGGCCTGACTATTGGGGTCAGGGGACACAGGTGACCGTCAGCAGCATCGAGGTGATGTATCCACCACCCTACCTCGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTCAAGGGGAAGCACCTCTGCCCTTCCCCTCTGTTCCCTGGCCCCTCAAAGCCCTTCTGGGTCCTGGTGGTGGTTGGTGGGGTGCTGGCTTGCTACTCCCTGCTCGTGACCGTGGCTTTCATCATCTTCTGGGTTCGGAGCAAACGGTCCAGACTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCAAGAAGACCTGGGCCCACACGGAAGCATTACCAACCCTATGCACCACCTCGGGATTTCGCCGCCTACAGATCCCGGGTCAAGTTCTCCAGGTCCGCCGATGCACCAGCCTATCAGCAGGGGCAAAACCAGCTGTATAATGAGCTGAACCTTGGACGGCGCGAGGAGTACGACGTGCTCGACAAAAGACGCGGTCGCGACCCAGAGATGGGCGGCAAGCCTAGACGCAAGAATCCCCAGGAGGGGCTCTATAACGAGTTGCAGAAGGATAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGGATGAAAGGCGAAAGACGGCGCGGAAAGGGTCACGACGGACTCTACCAGGGCCTGAGCACAGCCACCAAAGACACCTACGACGCTCTGCATATGCAAGCACTGCCTCCCCGG 124 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVKLEESGGGLVQAGRSLRLSCAASEHTFSSHVMGWFRQAPGKERESVAVIGWRDISTSYADSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAARRIDAADFDSWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFTMGWFRQAPGKEREFVAAISLSPTLAYYAESVKGRFTISRDNAKNTVVLQMNSLKPEDTALYYCAADRKSVMSIRPDYWGQGTQVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
BCMA 109 ATGGCTCTCCCCGTGACCGCTCTCCTCCTTCCCTTGGCCTTGTTGCTGCACGCCGCAAGGCCTCAGGTGAAGCTGGAGGAATCCGGAGGCGGACTCGTCCAAGCAGGTCGGTCCCTCAGGCTGTCTTGCGCTGCCAGCGAGCACACCTTCTCTAGCCACGTGATGGGTTGGTTCAGACAGGCCCCAGGAAAGGAGCGGGAATCCGTGGCAGTGATCGGCTGGCGGGACATCAGCACCTCCTACGCCGACTCCGTCAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGCGACAACGCCAAGAAGACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTCAAGCCTGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCGCCAGAAGGATCGACGCCGCAGACTTCGACTCCTGGGGTCAGGGAACCCAGGTGACCGTGTCCTCCACCTCTACCACCACACCAGCACCCAGACCTCCTACTCCCGCTCCCACCATCGCTTCCCAGCCCCTGTCCCTCAGACCCGAAGCCTGCAGACCAGCAGCTGGCGGTGCAGTGCACACCAGGGGTCTTGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCTCCACTGGCTGGGACTTGCGGCGTTCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGCGGGGCCGGAAGAAGCTGCTCTACATCTTCAAGCAGCCTTTCATGCGGCCCGTTCAGACCACCCAGGAGGAAGACGGGTGCAGTTGCCGCTTCCCTGAGGAGGAGGAGGGAGGATGCGAGCTGCGGGTCAAGTTCTCTCGGTCCGCTGATGCCCCAGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTGAACCTCGGTAGGCGGGAGGAGTACGACGTCCTGGACAAAAGGAGGGGACGGGATCCTGAGATGGGAGGAAAGCCACGGCGGAAGAACCCTCAAGAGGGGCTGTACAACGAACTCCAGAAGGACAAGATGGCTGAGGCTTATTCTGAGATCGGCATGAAGGGAGAGCGCAGACGCGGCAAGGGACACGATGGCCTGTATCAGGGACTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTCCATATGCAGGCTCTCCCACCACGG 125 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVKLEESGGGLVQAGRSLRLSCAASEHTFSSHVMGWFRQAPGKERESVAVIGWRDISTSYADSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAARRIDAADFDSWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
BCMA 110 ATGGCACTGCCCGTCACAGCTCTGCTGCTGCCCTTGGCCCTCTTGTTGCACGCAGCACGGCCAGAGGTGCAACTTGTCGAGAGCGGTGGTGGCCTTGTGCAGGCCGGAGGCAGTTTGCGCCTCAGTTGTGCAGCTTCTGGCCGGACCTTCACCATGGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGTAAGGAACGCGAGTTCGTGGCCGCCATCAGCCTGTCCCCAACCCTGGCCTACTACGCAGAGAGCGTGAAGGGTCGGTTCACCATCTCCCGCGACAACGCAAAGAACACCGTGGTGCTCCAGATGAACTCCCTGAAGCCAGAAGACACCGCCCTGTACTACTGCGCAGCCGACCGGAAGAGCGTGATGTCCATCCGCCCTGACTACTGGGGCCAAGGCACACAGGTCACAGTGTCCAGCACCTCCACTACCACTCCAGCTCCACGCCCTCCAACACCCGCACCAACCATCGCCAGCCAGCCTCTGAGTCTGAGACCCGAAGCATGCCGGCCAGCTGCTGGAGGTGCCGTGCACACCAGAGGGCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCTCCTCTGGCCGGAACTTGCGGGGTGCTGCTCCTCTCACTGGTCATCACCCTGTACTGCAAGAGGGGCAGGAAGAAGCTCCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCAGTCCAGACAACCCAGGAGGAAGACGGATGCAGCTGTCGCTTCCCCGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAATTGCGGGTCAAGTTCAGCAGATCCGCTGACGCTCCTGCCTACCAACAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGCGGGAGGAGTACGACGTCCTGGACAAGAGAAGAGGACGCGACCCCGAGATGGGAGGTAAGCCCAGACGCAAGAACCCTCAAGAGGGACTGTATAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGTGAAAGAAGACGGGGAAAGGGGCACGACGGTCTGTATCAGGGGCTCTCCACCGCAACCAAGGATACCTATGACGCTCTGCACATGCAGGCACTCCCTCCACGC 126 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFTMGWFRQAPGKEREFVAAISLSPTLAYYAESVKGRFTISRDNAKNTVVLQMNSLKPEDTALYYCAADRKSVMSIRPDYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
BCMA 111 ATGGCACTGCCCGTGACCGCTCTGCTGCTGCCTCTCGCCCTGCTGCTGCATGCTGCCAGGCCCCAAGTCAAGCTCGAGGAGTCTGGTGGTGGGCTCGTCCAAGCTGGCAGGTCCCTGAGACTGAGTTGTGCCGCCTCCGAGCACACTTTCAGCTCTCACGTGATGGGCTGGTTCAGGCAGGCACCCGGTAAGGAGCGGGAGTCTGTGGCTGTTATCGGGTGGCGGGATATCTCTACCTCCTACGCCGACTCCGTCAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGCAAAGAAGACCCTCTACCTCCAGATGAACTCACTCAAGCCCGAGGACACCGCTGTGTACTACTGCGCAGCCAGACGCATCGATGCCGCAGACTTCGACTCCTGGGGCCAAGGTACCCAAGTGACAGTGTCCAGCATCGAGGTGATGTACCCACCTCCCTACCTCGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGGAAGCACCTGTGTCCCTCTCCCCTTTTCCCAGGACCCTCCAAGCCATTCTGGGTCCTGGTCGTTGTCGGAGGCGTGCTCGCTTGCTATTCCCTGCTCGTCACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGGTCCAAGAGATCCCGGCTGCTGCACTCTGATTACATGAACATGACACCCAGGAGGCCAGGGCCTACCAGGAAGCACTACCAGCCCTACGCTCCTCCACGCGACTTCGCAGCATACCGGTCCCGCGTCAAGTTCTCCCGGTCCGCAGATGCTCCAGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAACTCAATTTGGGGAGGCGCGAGGAGTATGATGTGCTCGATAAGAGAAGGGGCCGGGATCCTGAGATGGGAGGCAAGCCCAGACGGAAGAACCCTCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGGATGAAGGGTGAAAGAAGGAGGGGTAAGGGGCACGACGGGCTCTACCAAGGCCTGAGCACCGCTACCAAGGACACCTACGATGCACTGCATATGCAAGCCCTGCCACCACGG 127 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVKLEESGGGLVQAGRSLRLSCAASEHTFSSHVMGWFRQAPGKERESVAVIGWRDISTSYADSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAARRIDAADFDSWGQGTQVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
BCMA 112 ATGGCCCTCCCTGTCACAGCCCTCTTGCTGCCCCTCGCACTCCTTCTGCACGCAGCTCGGCCTGAGGTCCAGCTGGTCGAGAGTGGAGGCGGACTGGTCCAGGCAGGTGGGAGTCTTCGGCTTTCCTGCGCAGCTTCCGGACGGACCTTCACCATGGGTTGGTTCCGGCAGGCACCTGGGAAGGAGAGGGAGTTCGTTGCCGCTATCAGCCTCTCACCAACCCTGGCCTACTATGCAGAGAGCGTCAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAACGCCAAGAACACCGTCGTGCTGCAGATGAACTCCCTCAAGCCCGAGGATACCGCCCTGTACTACTGCGCTGCCGATCGGAAGTCCGTCATGTCCATTCGGCCCGACTACTGGGGACAGGGCACACAGGTGACCGTCAGCAGCATCGAGGTCATGTACCCTCCACCCTACCTGGACAACGAGAAGAGCAACGGGACCATCATCCACGTGAAGGGGAAGCACCTCTGTCCAAGTCCCCTCTTCCCAGGACCCTCCAAGCCATTCTGGGTCCTCGTGGTGGTTGGAGGAGTGCTCGCCTGCTACTCTCTGCTGGTGACCGTCGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGGTCCAAGCGGTCTCGCCTCCTCCACTCCGACTACATGAACATGACACCACGCAGACCTGGGCCCACTAGGAAGCACTATCAGCCCTATGCACCACCCCGGGATTTCGCAGCCTACCGGTCACGGGTGAAGTTCAGCAGATCCGCAGACGCACCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTCGGTCGCAGGGAGGAGTACGATGTCCTGGATAAGAGAAGGGGCAGGGATCCCGAGATGGGTGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAGGAGGGGCTCTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCTTACTCAGAGATCGGCATGAAAGGGGAGAGGAGGCGCGGAAAAGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGACTGTCCACCGCAACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAAGCCCTCCCACCTCGG 128 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFTMGWFRQAPGKEREFVAAISLSPTLAYYAESVKGRFTISRDNAKNTVVLQMNSLKPEDTALYYCAADRKSVMSIRPDYWGQGTQVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
BCMA 113 ATGGCTCTCCCCGTGACCGCTCTCCTCCTTCCCTTGGCCTTGTTGCTGCACGCCGCAAGGCCTCAGGTGAAGCTGGAGGAATCCGGAGGCGGACTCGTCCAAGCAGGTCGGTCCCTCAGGCTGTCTTGCGCTGCCAGCGAGCACACCTTCTCTAGCCACGTGATGGGTTGGTTCAGACAGGCCCCAGGAAAGGAGCGGGAATCCGTGGCAGTGATCGGCTGGCGGGACATCAGCACCTCCTACGCCGACTCCGTCAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGCGACAACGCCAAGAAGACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTCAAGCCTGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCGCCAGAAGGATCGACGCCGCAGACTTCGACTCCTGGGGTCAGGGAACCCAGGTGACCGTGTCCTCCACCTCTACCACCACACCAGCACCCAGACCTCCTACTCCCGCTCCCACCATCGCTTCCCAGCCCCTGTCCCTCAGACCCGAAGCCTGCAGACCAGCAGCTGGCGGTGCAGTGCACACCAGGGGTCTTGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCTCCACTGGCTGGGACTTGCGGCGTTCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGCGGGGCCGGAAGAAGCTGCTCTACATCTTCAAGCAGCCTTTCATGCGGCCCGTTCAGACCACCCAGGAGGAAGACGGGTGCAGTTGCCGCTTCCCTGAGGAGGAGGAGGGAGGATGCGAGCTGCGGGTCAAGTTCTCTCGGTCCGCTGATGCCCCAGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTGAACCTCGGTAGGCGGGAGGAGTACGACGTCCTGGACAAAAGGAGGGGACGGGATCCTGAGATGGGAGGAAAGCCACGGCGGAAGAACCCTCAAGAGGGGCTGTACAACGAACTCCAGAAGGACAAGATGGCTGAGGCTTATTCTGAGATCGGCATGAAGGGAGAGCGCAGACGCGGCAAGGGACACGATGGCCTGTATCAGGGACTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTCCATATGCAGGCTCTCCCACCACGGGGATCTGGCGAAGGCAGAGGATCTCTGCTGACATGCGGCGACGTGGAAGAGAACCCTGGACCTATGGCCCTCCCTGTCACAGCCCTCTTGCTGCCCCTCGCACTCCTTCTGCACGCAGCTCGGCCTGAGGTCCAGCTGGTCGAGAGTGGAGGCGGACTGGTCCAGGCAGGTGGGAGTCTTCGGCTTTCCTGCGCAGCTTCCGGACGGACCTTCACCATGGGTTGGTTCCGGCAGGCACCTGGGAAGGAGAGGGAGTTCGTTGCCGCTATCAGCCTCTCACCAACCCTGGCCTACTATGCAGAGAGCGTCAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAACGCCAAGAACACCGTCGTGCTGCAGATGAACTCCCTCAAGCCCGAGGATACCGCCCTGTACTACTGCGCTGCCGATCGGAAGTCCGTCATGTCCATTCGGCCCGACTACTGGGGACAGGGCACACAGGTGACCGTCAGCAGCATCGAGGTCATGTACCCTCCACCCTACCTGGACAACGAGAAGAGCAACGGGACCATCATCCACGTGAAGGGGAAGCACCTCTGTCCAAGTCCCCTCTTCCCAGGACCCTCCAAGCCATTCTGGGTCCTCGTGGTGGTTGGAGGAGTGCTCGCCTGCTACTCTCTGCTGGTGACCGTCGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGGTCCAAGCGGTCTCGCCTCCTCCACTCCGACTACATGAACATGACACCACGCAGACCTGGGCCCACTAGGAAGCACTATCAGCCCTATGCACCACCCCGGGATTTCGCAGCCTACCGGTCACGGGTGAAGTTCAGCAGATCCGCAGACGCACCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTCGGTCGCAGGGAGGAGTACGATGTCCTGGATAAGAGAAGGGGCAGGGATCCCGAGATGGGTGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAGGAGGGGCTCTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCTTACTCAGAGATCGGCATGAAAGGGGAGAGGAGGCGCGGAAAAGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGACTGTCCACCGCAACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAAGCCCTCCCACCTCGG 129 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVKLEESGGGLVQAGRSLRLSCAASEHTFSSHVMGWFRQAPGKERESVAVIGWRDISTSYADSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAARRIDAADFDSWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFTMGWFRQAPGKEREFVAAISLSPTLAYYAESVKGRFTISRDNAKNTVVLQMNSLKPEDTALYYCAADRKSVMSIRPDYWGQGTQVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
BCMA 114 ATGGCACTGCCCGTCACAGCTCTGCTGCTGCCCTTGGCCCTCTTGTTGCACGCAGCACGGCCAGAGGTGCAACTTGTCGAGAGCGGTGGTGGCCTTGTGCAGGCCGGAGGCAGTTTGCGCCTCAGTTGTGCAGCTTCTGGCCGGACCTTCACCATGGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGTAAGGAACGCGAGTTCGTGGCCGCCATCAGCCTGTCCCCAACCCTGGCCTACTACGCAGAGAGCGTGAAGGGTCGGTTCACCATCTCCCGCGACAACGCAAAGAACACCGTGGTGCTCCAGATGAACTCCCTGAAGCCAGAAGACACCGCCCTGTACTACTGCGCAGCCGACCGGAAGAGCGTGATGTCCATCCGCCCTGACTACTGGGGCCAAGGCACACAGGTCACAGTGTCCAGCACCTCCACTACCACTCCAGCTCCACGCCCTCCAACACCCGCACCAACCATCGCCAGCCAGCCTCTGAGTCTGAGACCCGAAGCATGCCGGCCAGCTGCTGGAGGTGCCGTGCACACCAGAGGGCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCTCCTCTGGCCGGAACTTGCGGGGTGCTGCTCCTCTCACTGGTCATCACCCTGTACTGCAAGAGGGGCAGGAAGAAGCTCCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCAGTCCAGACAACCCAGGAGGAAGACGGATGCAGCTGTCGCTTCCCCGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAATTGCGGGTCAAGTTCAGCAGATCCGCTGACGCTCCTGCCTACCAACAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGCGGGAGGAGTACGACGTCCTGGACAAGAGAAGAGGACGCGACCCCGAGATGGGAGGTAAGCCCAGACGCAAGAACCCTCAAGAGGGACTGTATAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGTGAAAGAAGACGGGGAAAGGGGCACGACGGTCTGTATCAGGGGCTCTCCACCGCAACCAAGGATACCTATGACGCTCTGCACATGCAGGCACTCCCTCCACGCGGATCTGGCGAAGGCAGAGGATCTCTGCTGACATGCGGCGACGTGGAAGAGAACCCTGGACCTATGGCACTGCCCGTGACCGCTCTGCTGCTGCCTCTCGCCCTGCTGCTGCATGCTGCCAGGCCCCAAGTCAAGCTCGAGGAGTCTGGTGGTGGGCTCGTCCAAGCTGGCAGGTCCCTGAGACTGAGTTGTGCCGCCTCCGAGCACACTTTCAGCTCTCACGTGATGGGCTGGTTCAGGCAGGCACCCGGTAAGGAGCGGGAGTCTGTGGCTGTTATCGGGTGGCGGGATATCTCTACCTCCTACGCCGACTCCGTCAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGCAAAGAAGACCCTCTACCTCCAGATGAACTCACTCAAGCCCGAGGACACCGCTGTGTACTACTGCGCAGCCAGACGCATCGATGCCGCAGACTTCGACTCCTGGGGCCAAGGTACCCAAGTGACAGTGTCCAGCATCGAGGTGATGTACCCACCTCCCTACCTCGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGGAAGCACCTGTGTCCCTCTCCCCTTTTCCCAGGACCCTCCAAGCCATTCTGGGTCCTGGTCGTTGTCGGAGGCGTGCTCGCTTGCTATTCCCTGCTCGTCACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGGTCCAAGAGATCCCGGCTGCTGCACTCTGATTACATGAACATGACACCCAGGAGGCCAGGGCCTACCAGGAAGCACTACCAGCCCTACGCTCCTCCACGCGACTTCGCAGCATACCGGTCCCGCGTCAAGTTCTCCCGGTCCGCAGATGCTCCAGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAACTCAATTTGGGGAGGCGCGAGGAGTATGATGTGCTCGATAAGAGAAGGGGCCGGGATCCTGAGATGGGAGGCAAGCCCAGACGGAAGAACCCTCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGGATGAAGGGTGAAAGAAGGAGGGGTAAGGGGCACGACGGGCTCTACCAAGGCCTGAGCACCGCTACCAAGGACACCTACGATGCACTGCATATGCAAGCCCTGCCACCACGG 130 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFTMGWFRQAPGKEREFVAAISLSPTLAYYAESVKGRFTISRDNAKNTVVLQMNSLKPEDTALYYCAADRKSVMSIRPDYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPQVKLEESGGGLVQAGRSLRLSCAASEHTFSSHVMGWFRQAPGKERESVAVIGWRDISTSYADSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAARRIDAADFDSWGQGTQVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
BCMA 115 ATGGCACTCCCGGTAACCGCCTTATTGCTTCCCCTTGCCCTCTTGCTCCACGCAGCACGCCCCGATATAGTCTTGACTCAATCCCCACCCAGTTTGGCAATGTCATTAGGCAAACGAGCAACAATTTCATGTAGGGCATCCGAAAGTGTAACGATTTTGGGGAGTCATTTAATTCATTGGTACCAACAAAAGCCTGGACAACCCCCGACGCTCTTGATCCAATTAGCATCTAACGTCCAAACCGGAGTCCCCGCACGATTCTCAGGATCCGGTTCCCGGACTGATTTTACATTAACTATTGATCCGGTAGAGGAAGATGACGTCGCTGTCTATTATTGTCTTCAAAGTAGGACGATTCCACGGACATTCGGTGGCGGAACTAAATTGGAGATTAAAGGTTCCACCTCTGGTAGTGGGAAACCCGGGTCCGGTGAAGGGTCCACTAAAGGCCAAATTCAACTCGTTCAATCCGGACCAGAACTGAAGAAGCCAGGAGAAACTGTCAAAATAAGCTGTAAAGCTTCCGGTTATACATTTACAGATTATTCCATAAATTGGGTGAAAAGGGCGCCAGGAAAAGGGTTAAAGTGGATGGGTTGGATTAATACAGAGACTCGGGAACCTGCATATGCTTATGATTTTAGGGGAAGGTTTGCCTTTTCTCTGGAGACTTCCGCTTCAACTGCTTATCTCCAAATTAATAATCTTAAATATGAGGACACAGCAACATACTTCTGTGCTTTGGACTATAGTTATGCTATGGATTACTGGGGACAAGGAACCAGTGTCACTGTAAGTTCCGCTGCTGCGACGACCACTCCTGCACCGCGACCACCCACTCCTGCCCCTACTATTGCTAGTCAACCACTTAGCTTGCGACCTGAGGCATGTCGGCCCGCGGCAGGTGGCGCAGTCCACACCAGGGGTTTAGACTTTGCTTGTGATATTTATATTTGGGCACCACTCGCCGGGACTTGCGGTGTTCTTCTCTTGTCCCTTGTTATAACTCTTTATTGTAAGCGCGGAAGGAAGAAATTGTTATATATTTTCAAACAACCTTTTATGCGACCCGTACAAACAACTCAGGAAGAGGACGGGTGTTCTTGTCGGTTTCCAGAAGAGGAAGAGGGTGGGTGTGAACTCCGGGTCAAATTTAGTAGGTCAGCAGATGCGCCGGCGTACCAACAAGGCCAAAACCAACTGTATAATGAACTCAATCTCGGTAGGCGTGAGGAATATGATGTCCTTGATAAAAGGCGCGGGAGAGATCCAGAAATGGGCGGAAAACCACGGCGAAAGAATCCGCAGGAAGGGTTATATAACGAACTTCAAAAGGATAAAATGGCTGAAGCTTATTCCGAAATTGGCATGAAAGGAGAGCGACGTAGGGGCAAAGGGCATGATGGCCTTTACCAAGGGCTCTCAACCGCTACAAAAGATACTTACGACGCTTTACATATGCAAGCACTTCCACCCAGG 131 MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
HER2 132 ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACTCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGCCGGGCCAGCCAGGATGTGAATACTGCTGTCGCCTGGTATCAACAAAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTACAGCGCCAGCTTTCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCTCCGGAAGCAGAAGCGGCACAGATTTCACACTGACCATAAGCAGCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGCACTACACCACACCTCCAACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTCGAGATTAAGAGAACAGGCAGCACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGATCTGGCGAGGGCTCTGAAGTCCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCAGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGCCAGGATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTGCCGACACCAGCAAGAATACCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTATTACTGTTCCAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTCGTGACCGTTTCTTCTATCGAAGTGATGTACCCTCCACCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTACTCTCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA 134 MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
HER2 133 ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACTCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGCCGGGCCAGCCAGGATGTGAATACTGCTGTCGCCTGGTATCAACAAAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTACAGCGCCAGCTTTCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCTCCGGAAGCAGAAGCGGCACAGATTTCACACTGACCATAAGCAGCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGCACTACACCACACCTCCAACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTCGAGATTAAGAGAACAGGCAGCACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGATCTGGCGAGGGCTCTGAAGTCCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCAGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGCCAGGATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTGCCGACACCAGCAAGAATACCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTATTACTGTTCCAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTCGTGACCGTTTCTTCTACCACCACACCAGCTCCTCGGCCTCCAACTCCTGCTCCTACAATTGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCTCCTCTGGCCGGAACATGTGGCGTTCTGCTGCTGAGCCTGGTCATCACCCTGTACTGTAAGCGGGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACACAAGAGGAAGATGGCTGCTCCTGCAGATTCCCCGAGGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA 135 MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
3.鉸鏈/間隔子域
在一些實施例中，本發明之CAR包含鉸鏈域或間隔子域。在一些實施例中，鉸鏈域/間隔子域可包含經截短鉸鏈域/間隔子域(THD)，其中該THD域為完整鉸鏈域/間隔子域(「CHD」)之截短型式。在一些實施例中，鉸鏈或間隔子域來自以下或由以下衍生(例如，包含以下之所有或片段)：ErbB2、血型糖蛋白A (GpA)、CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8a、CD8[T CDl la (IT GAL)、CDl lb (IT GAM)、CDl lc (ITGAX)、CDl ld (IT GAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD28T、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A (B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B (B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96 (觸覺)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (0X40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRT AM)、CD357 (TNFRSF18)、誘導性T細胞共刺激子(ICOS)、LFA-1 (CDl la/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2R β、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配位體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白質、免疫球蛋白蛋白質、細胞激素受體、整合素、活化NK細胞受體、鐸配位體受體及片段或其組合。鉸鏈或間隔子域可衍生自天然來源或合成來源。
在一些實施例中，鉸鏈或間隔子域位於抗原結合分子(例如scFv)與跨膜域之間。在此定向中，鉸鏈/間隔子域提供抗原結合分子與CAR表現於其上之細胞膜表面之間的距離。在一些實施例中，鉸鏈或間隔子域來自或衍生自免疫球蛋白。在一些實施例中，鉸鏈或間隔子域選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、IgM之鉸鏈/間隔子區或其片段。在一些實施例中，鉸鏈或間隔子域包含、來自或衍生自CD8 α之鉸鏈/間隔子區。在一些實施例中，鉸鏈或間隔子域包含、來自或衍生自CD28之鉸鏈/間隔子區。在一些實施例中，鉸鏈或間隔子域包含CD8 α之鉸鏈/間隔子區之片段或CD28之鉸鏈/間隔子區之片段，其中該片段為小於整個鉸鏈/間隔子區之任何片段。在一些實施例中，CD8 α鉸鏈/間隔子區之片段或CD28鉸鏈/間隔子區之片段包含不包括CD8 α鉸鏈/間隔子區或CD28鉸鏈/間隔子區之N端或C端或兩者處之至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個或至少20個胺基酸的胺基酸序列。 4.跨膜域
本發明之CAR可進一步包含跨膜域及/或胞內信號傳導域。跨膜域可經設計以與CAR之胞外域融合。其可類似地與CAR之胞內域融合。在一些實施例中，使用與CAR中之域中之一者天然締合之跨膜域。在一些情況下，跨膜域可經選擇或修飾(例如經胺基酸取代)以避免此類域與相同或不同表面膜蛋白之跨膜域結合，以使得與受體複合物之其他成員的相互作用減至最小。跨膜結構域可來源於天然或合成來源。在來源為天然時，該域可來源於任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。
跨膜區可來源於(亦即，包含)受體酪胺酸激酶(例如，ErbB2)、血型糖蛋白A (GpA)、4-1BB/CD137、活化NK細胞受體、免疫球蛋白蛋白質、B7-H3、BAFFR、BFAME (SEAMF8)、BTEA、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96 (觸覺)、CD1 la、CD1 lb、CD1 lc、CD1 Id、CDS、CEACAM1、CRT AM、細胞激素受體、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM (EIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα (CD79a)、IE-2Rβ、IE-2Rγ、IE-7Rα、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、IT GAD、ITGAE、ITGAE、IT GAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、EAT、LFA-1、LFA-1、與CD83特異性結合之配位體、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9 (CD229)、淋巴球功能相關之抗原1 (LFA-1；CDl-la/CD18)、MHC 1類分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程式性死亡-1 (PD-1)、PSGL1、SELPLG (CD162)、傳訊淋巴球性活化分子(SLAM蛋白質)、SLAM (SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4 (CD244；2B4)、SLAMF6 (NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF受體蛋白質、TNFR2、TNFSF14、鐸配位體受體、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6或其片段、截短物或組合。
在一些實施例中，適合的胞內傳訊域包括但不限於活化性巨噬細胞/骨髓細胞受體CSFR1、MYD88、CD14、TIE2、TLR4、CR3、CD64、TREM2、DAP10、DAP12、CD169、DECTIN1、CD206、CD47、CD163、CD36、MARCO、TIM4、MERTK、F4/80、CD91、C1QR、LOX-1、CD68、SRA、BAI-1、ABCA7、CD36、CD31、乳鐵蛋白或其片段、截短物或組合。
在一些實施例中，受體酪胺酸激酶可衍生自(例如包含)胰島素受體(InsR)、胰島素樣生長因子I受體(IGF1R)、胰島素受體相關受體(IRR)、血小板源生長因子受體α (PDGFRa)、血小板源生長因子受體β (PDGFRfi)。KIT原致癌基因受體酪胺酸激酶(Kit)、群落刺激因子1受體(CSFR)、fms相關酪胺酸激酶3 (FLT3)、fms相關酪胺酸激酶1 (VEGFR-1)、激酶插入域受體(VEGFR-2)、fms相關酪胺酸激酶4 (VEGFR-3)、纖維母細胞生長因子受體1 (FGFR1)、纖維母細胞生長因子受體2 (FGFR2)、纖維母細胞生長因子受體3 (FGFR3)、纖維母細胞生長因子受體4 (FGFR4)、蛋白酪胺酸激酶7 (CCK4)、神經營養受體酪胺酸激酶1 (trkA)、神經營養受體酪胺酸激酶2 (trkB)、神經營養受體酪胺酸激酶3 (trkC)、受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)、受體酪胺酸激酶樣孤兒受體2 (ROR2)、肌肉相關受體酪胺酸激酶(MuSK)、MET原致癌基因受體酪胺酸激酶(MET)、巨噬細胞刺激性1受體(Ron)、AXL受體酪胺酸激酶(Axl)、TYR03蛋白酪胺酸激酶(Tyro3)、MER原致癌基因酪胺酸激酶(Mer)、具有免疫球蛋白樣及EGF樣域之酪胺酸激酶1 (TIE1)、TEK受體酪胺酸激酶(TIE2)、EPH受體A1 (EphAl)、EPH受體A2 (EphA2)、(EPH受體A3) EphA3、EPH受體A4 (EphA4)、EPH受體A5 (EphA5)、EPH受體A6 (EphA6)、EPH受體A7 (EphA7)、EPH受體A8 (EphA8)、EPH受體A10 (EphAlO)、EPH受體B1 (EphBl)、EPH受體B2 (EphB2)、EPH受體B3 (EphB3)、EPH受體B4 (EphB4)、EPH受體B6 (EphB6)、ret原致癌基因(Ret)、受體樣酪胺酸激酶(RYK)、盤狀域受體酪胺酸激酶1 (DDR1)、盤狀域受體酪胺酸激酶2 (DDR2)、c-ros致癌基因1、受體酪胺酸激酶(ROS)、細胞凋亡相關酪胺酸激酶(Lmrl)、狐猴酪胺酸激酶2 (Lmr2)、狐猴酪胺酸激酶3 (Lmr3)、白血球受體酪胺酸激酶(LTK)、ALK受體酪胺酸激酶(ALK)或絲胺酸/蘇胺酸/酪胺酸激酶1 (STYK1)。 5.共刺激域
在某些實施例中，CAR包含共刺激域。在一些實施例中，共刺激域包含4-1BB (CD137)、CD28或兩者及/或胞內T細胞傳訊域。在一較佳實施例中，共刺激域為人類CD28、人類4-1BB或兩者，且細胞內T細胞傳訊域為人類CD3澤塔(ζ)。4-1BB、CD28、CD3 ζ可分別占低於整個4-1BB、CD28或CD3 ζ。嵌合抗原受體可併有共刺激(傳訊)域以提高其效力。參見美國專利第7,741,465號及第6,319,494號以及Krause等人及Finney等人(同前文獻)，Song等人, Blood 119:696-706 (2012)；Kalos等人, Sci Transl. Med. 3:95 (2011)；Porter等人, N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011)；及Gross等人, Amur. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016)。 6.胞內傳訊域
在某些實施例中，CAR包含胞內(傳訊)域。
在一些實施例中，適合之胞內傳訊域包含但不限於4-1BB/CD137、活化NK細胞受體、免疫球蛋白蛋白質、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD 19a、CD2、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96 (觸覺)、CD1 la、CD1 lb、CD1 lc、CD1 1d、CDS、CEACAM1、CRT AM、細胞激素受體、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、Igα(CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、與CD83特異性結合之配位體、LIGHT、LTBR、Ly9 (CD229)、Lyl08、淋巴球功能相關抗原1 (LFA-1；CDl-la/CD18)、MHC 1類分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程式性死亡-1 (PD-1)、PSGL1、SELPLG (CD162)、傳訊淋巴球性活化分子(SLAM蛋白質)、SLAM (SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4 (CD244；2B4)、SLAMF6 (NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TNF受體蛋白質、TNFR2、TNFSF14、鐸配位體受體、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6或其片段、截斷物或組合。
CD3為天然T細胞上之T細胞受體之元件，且已展示為CAR中之重要胞內活化元件。在一些實施例中，CD3為CD3 ζ。 E.轉移媒劑
在一個態樣中，本文提供一種醫藥組合物，其包含一或多個環狀RNA構築體，該等環狀RNA構築體包含內部核糖體進入位點(IRES)及編碼結合分子及轉移媒劑之表現序列。在某些實施例中，醫藥組合物包含至少一個包含IRES及嵌合抗原受體(CAR)之表現序列的環狀RNA構築體；及轉移媒劑。
在某些實施例中，轉移媒劑包含脂質。在某些實施例中，轉移媒劑包含可離子化脂質。在某些實施例中，轉移媒劑包含可離子化脂質以及其他脂質，例如結構性脂質及/或經PEG改質之脂質。在某些實施例中，轉移媒劑為脂質奈米粒子(LNP)。在某些實施例中，轉移媒劑能夠將環狀RNA構築體遞送至人類個體中存在之人類免疫細胞，使得編碼結合分子(例如，CAR)之表現序列在人類免疫細胞中轉譯且在人類免疫細胞之表面上表現。
在某些實施例中，轉移媒劑經製備以囊封一或多種材料或治療劑(例如，環狀RNA)。將所需治療劑(例如，環狀RNA)併入轉移媒劑中之過程在本文中稱為或「裝載」或「囊封」(Lasic等人, FEBS Lett., 312: 255-258, 1992)。裝載或囊封有轉移媒劑之物質(例如環狀RNA)可完全或部分位於轉移媒劑之內部空間中，轉移媒劑之雙層膜內，或與轉移媒劑之外部表面結合。
在一些實施例中，轉移媒劑囊封環狀RNA。在一些實施例中，轉移媒劑囊封至少一個環狀RNA構築體且包含可離子化脂質。在一些實施例中，轉移媒劑囊封至少一個環狀RNA構築體且包含可離子化脂質及選自結構性脂質、輔助脂質及經PEG改質之脂質的額外脂質。在一些實施例中，轉移媒劑囊封至少一個環狀RNA構築體且包含可離子化脂質、結構性脂質、輔助脂質及/或經PEG改質之脂質。在一些實施例中，轉移媒劑囊封至少一個環狀RNA構築體且包含可離子化脂質、結構性脂質、經PEG改質之脂質及輔助脂質。在一些實施例中，轉移媒劑為脂質奈米粒子。
不希望受理論所束縛，認為本文所描述之轉移媒劑屏蔽經囊封環狀RNA免於降解且提供環狀RNA在活體內及活體外有效遞送至目標細胞。
在某些實施例中，轉移媒劑部分基於其促進目標細胞之轉染(例如，環狀RNA)之能力調配。在另一實施例中，轉移媒劑可經選擇及/或製備以最佳化環狀RNA遞送至目標細胞、組織或器官。舉例而言，若目標細胞為肝細胞，則組合物之特性(例如，尺寸、電荷及/或pH值)可經最佳化以將此類組合物(例如，脂質奈米粒子)有效地遞送至目標細胞或器官，降低免疫清除及/或促進目標細胞或器官中之滯留。或者，若目標組織為中樞神經系統，則轉移媒劑之選擇及製備必須考慮滲透此類組合物且保持在血腦障壁內，及/或使用將此類組合物直接遞送至此類目標組織(例如，經由腦血管內投與)之替代性方式。在某些實施例中，轉移媒劑可與促進囊封材料轉移穿過血腦障壁之試劑(例如，破壞或改進血腦障壁之滲透性且從而增強環狀RNA轉移至目標細胞之試劑)組合。儘管本文所描述之轉移媒劑可促進引入環狀RNA至目標細胞中，但添加聚陽離子(例如，聚L-離胺酸及魚精蛋白)作為共聚物至包含醫藥組合物之脂質奈米粒子中之一或多者可在一些情況下在多種細胞株中在活體外及活體內顯著地增強若干類型轉移媒劑之轉染效率2-28倍(參見N. J. Caplen等人, Gene Ther. 1995; 2: 603; S. Li等人, Gene Ther. 1997; 4, 891.)。
本文所描述之轉移媒劑可允許經囊封聚核苷酸到達目標細胞或可較佳地允許經囊封聚核苷酸在鑑別基礎上到達目標細胞或器官。或者，轉移媒劑可限制經囊封聚核苷酸遞送至其他非靶向細胞或器官，其中經囊封聚核苷酸之存在可為非所需的或具有有限效用。
將聚核苷酸(例如，環狀RNA)負載或囊封於轉移媒劑中可用以保護聚核苷酸免受環境(例如，血清)影響，該環境可含有降解此類聚核苷酸及/或引起此類聚核苷酸快速分泌之系統或受體的酶或化學物質。因此，在一些實施例中，本文所描述之組合物能夠增強經囊封聚核苷酸之穩定性，尤其相對於將暴露此類聚核苷酸之環境。
在某些實施例中，本文所描述之轉移媒劑係藉由將多種脂質組分(例如，本文所揭示之化合物中之一或多者)與一或多種聚合物組分組合來製備。
脂質奈米粒子可以各種比率包含其他脂質組合。表4a及表4b處之實例1描述包含不同莫耳比之例示性脂質媒劑調配物。構成脂質奈米粒子之可離子化脂質、輔助脂質、結構性脂質及/或經PEG改質之脂質的選擇以及此類脂質相對於彼此之莫耳比係基於所選擇脂質之特徵、預期目標細胞或組織之性質及待藉由脂質奈米粒子遞送之材料或聚核苷酸之特徵。其他考量包括例如烷基鏈之飽和度，以及所選脂質之尺寸、電荷、pH、pKa、融合性及毒性。 1.脂質奈米粒子(「LNP」)
在一個實施例中，環狀RNA可調配於轉移或遞送媒劑中或囊封於轉移或遞送媒劑中，其中媒劑為脂質奈米粒子，其可能能夠將該一或多個環狀RNA構築體遞送至一或多個目標細胞。
本文所描述之脂質奈米粒子(LNP)之形成可藉由此項技術中已知之任何方法實現。參見例如美國專利公開案第US2012/0178702 A1號，其以全文引用的方式併入本文中。脂質奈米粒子組合物及其製造方法之非限制性實例描述於例如Semple等人(2010) Nat. Biotechnol. 28:172-176；Jayarama等人(2012), Angew. Chem. Int. Ed., 51:8529-8533；及Maier等人(2013) Molecular Therapy 21, 1570-1578 (該等文獻中之各者之內容以全文引用之方式併入本文中)中。脂質奈米粒子、調配物及製備方法描述於例如以下中：國際專利公開案第WO 2011/127255或WO 2008/103276號、美國專利公開案第US2005/0222064 A1號、美國專利公開案第US2013/0156845 A1號、國際專利公開案第WO2013/093648 A2號、第WO2012/024526 A2號、美國專利公開案第US2013/0164400 A1號及美國專利第8,492,359號，其皆以全文引用之方式併入本文中。
脂質奈米粒子可以各種比率包含脂質組合。構成脂質奈米粒子之可離子化脂質、輔助脂質、結構性脂質及/或經PEG改質之脂質的選擇以及此類脂質相對於彼此之莫耳比係基於所選擇脂質之特徵、預期目標細胞或組織之性質及待藉由脂質奈米粒子遞送之材料或聚核苷酸之特徵。其他考量包括例如烷基鏈之飽和度，以及所選脂質之尺寸、電荷、pH、pKa、融合性及毒性。表4a及表4b處之實例1描述包含不同莫耳比之例示性脂質媒劑調配物。額外脂質描述於WO2022261490、WO2023056033及WO2023081526中，其各自以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，奈米粒子包含一或多種陽離子型脂質、可離子化脂質或聚β-胺基酯。在一些實施例中，奈米粒子包含一或多種非陽離子型脂質。在一些實施例中，奈米粒子包含一或多種經PEG修飾之脂質、聚麩胺酸脂質或玻糖醛酸脂質。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含膽固醇。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含二十碳四烯酸、白三烯或油酸。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含靶向部分，其中該靶向部分在不存在細胞選擇或純化之情況下選擇性介導受體介導之內飲作用至所選細胞群體之細胞中。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含超過一個環狀RNA構築體。
其他適合之脂質之實例包括磷脂醯基化合物(例如，磷脂醯甘油、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯乙醇胺、鞘脂、腦苷脂及神經節苷脂)。亦涵蓋聚合物作為轉移媒劑之用途，無論單獨還是與其他轉移媒劑組合。適合聚合物可包括例如聚丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己內酯、聚葡萄糖、白蛋白、明膠、海藻酸鹽、膠原蛋白、聚葡萄胺糖、環糊精、樹枝狀聚合物及聚乙烯亞胺。
脂質奈米粒子組合物可視情況包含一或多個塗層。舉例而言，可將奈米粒子組合物調配於具有包衣之膠囊、膜或錠劑中。包括本文所描述之組合物的膠囊、膜或錠劑可具有任何有用的大小、抗拉強度、硬度或密度。
在一個實施例中，脂質奈米粒子之直徑可為約10 nm至約100 nm，諸如但不限於約10 nm至約20 nm、約10 nm至約30 nm、約10 nm至約40 nm、約10 nm至約50 nm、約10 nm至約60 nm、約10 nm至約70 nm、約10 nm至約80 nm、約10 nm至約90 nm、約20 nm至約30 nm、約20 nm至約40 nm、約20 nm至約50 nm、約20 nm至約60 nm、約20 nm至約70 nm、約20 nm至約80 nm、約20 nm至約90 nm、約20 nm至約100 nm、約30 nm至約40 nm、約30 nm至約50 nm、約30 nm至約60 nm、約30 nm至約70 nm、約30 nm至約80 nm、約30 nm至約90 nm、約30 nm至約100 nm、約40 nm至約50 nm、約40 nm至約60 nm、約40 nm至約70 nm、約40 nm至約80 nm、約40 nm至約90 nm、約40 nm至約100 nm、約50 nm至約60 nm、約50 nm至約70 nm、約50 nm至約80 nm、約50 nm至約90 nm、約50 nm至約100 nm、約60 nm至約70 nm、約60 nm至約80 nm、約60 nm至約90 nm、約60 nm至約100 nm、約70 nm至約80 nm、約70 nm至約90 nm、約70 nm至約100 nm、約80 nm至約90 nm、約80 nm至約100 nm及/或約90 nm至約100 nm。在一個實施例中，脂質奈米粒子之直徑可為約10 nm至500 nm。在一個實施例中，脂質奈米粒子之直徑可大於100 nm、大於150 nm、大於200 nm、大於250 nm、大於300 nm、大於350 nm、大於400 nm、大於450 nm、大於500 nm、大於550 nm、大於600 nm、大於650 nm、大於700 nm、大於750 nm、大於800 nm、大於850 nm、大於900 nm、大於950 nm或大於1000 nm。各可能性代表單獨實施例。
在一些實施例中，奈米粒子(例如脂質奈米粒子)之平均直徑為10-500 nm、20-400 nm、30-300 nm或40-200 nm。在一些實施例中，奈米粒子(例如脂質奈米粒子)之平均直徑為50-150 nm、50-200 nm、80-100 nm或80-200 nm。
在一些實施例中，本文所描述之脂質奈米粒子之直徑可為低於0.1 µm至至多1 mm，諸如(但不限於)低於0.1 µm、低於1.0 µm、低於5 µm、低於10 µm、低於15 µm、低於20 µm、低於25 µm、低於30 µm、低於35 µm、低於40 µm、低於50 µm、低於55 µm、低於60 µm、低於65 µm、低於70 µm、低於75 µm、低於80 µm、低於85 µm、低於90 µm、低於95 µm、低於100 µm、低於125 µm、低於150 µm、低於175 µm、低於200 µm、低於225 µm、低於250 µm、低於275 µm、低於300 µm、低於325 µm、低於350 µm、低於375 µm、低於400 µm、低於425 µm、低於450 µm、低於475 µm、低於500 µm、低於525 µm、低於550 µm、低於575 µm、低於600 µm、低於625 µm、低於650 µm、低於675 µm、低於700 µm、低於725 µm、低於750 µm、低於775 µm、低於800 µm、低於825 µm、低於850 µm、低於875 µm、低於900 µm、低於925 µm、低於950 µm、低於975 µm。
在另一實施例中，LNP之直徑可為約1 nm至約100 nm、約1 nm至約10 nm、約1 nm至約20 nm、約1 nm至約30 nm、約1 nm至約40 nm、約1 nm至約50 nm、約1 nm至約60 nm、約1 nm至約70 nm、約1 nm至約80 nm、約1 nm至約90 nm、約5 nm至約from 100 nm、約5 nm至約10 nm、約5 nm至約20 nm、約5 nm至約30 nm、約5 nm至約40 nm、約5 nm至約50 nm、約5 nm至約60 nm、約5 nm至約70 nm、約5 nm至約80 nm、約5 nm至約90 nm、約10至約50 nM、約20至約50 nm、約30至約50 nm、約40至約50 nm、約20至約60 nm、約30至約60 nm、約40至約60 nm、約20至約70 nm、約30至約70 nm、約40至約70 nm、約50至約70 nm、約60至約70 nm、約20至約80 nm、約30至約80 nm、約40至約80 nm、約50至約80 nm、約60至約80 nm、約20至約90 nm、約30至約90 nm、約40至約90 nm、約50至約90 nm、約60至約90 nm及/或約70至約90 nm。各可能性代表單獨實施例。
奈米粒子組合物可為相對均質的。多分散性指數可用於指示奈米粒子組合物之均質性，例如奈米粒子組合物之粒徑分佈。小(例如小於0.3)多分散性指數一般指示窄粒徑分佈。奈米粒子組合物之多分散性指數可為約0至約0.25，諸如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些實施例中，奈米粒子組合物之多分散性指數可為約0.10至約0.20。各可能性代表單獨實施例。
奈米粒子組合物之ζ電位可用於指示組合物之動電位。舉例而言，ζ電位可描述奈米粒子組合物之表面電荷。具有相對低之正或負電荷之奈米粒子組合物一般為合乎需要的，此係因為更多高電荷物種可能會不合需要地與細胞、組織及體內其他元件相互作用。在一些實施例中，奈米粒子組合物之ζ電位可為約-20 mV至約+20 mV、約-20 mV至約+15 mV、約-20 mV至約+10 mV、約-20 mV至約+5 mV、約-20 mV至約0 mV、約-20 mV至約-5 mV、約-20 mV至約-10 mV、約-20 mV至約-15 mV、約-20 mV至約+20 mV、約-20 mV至約+15 mV、約-20 mV至約+10 mV、約-20 mV至約+5 mV、約-20 mV至約0 mV、約0 mV至約+20 mV、約0 mV至約+15 mV、約0 mV至約+10 mV、約0 mV至約+5 mV、約+5 mV至約+20 mV、約+5 mV至約+15 mV或約+5 mV至約+10 mV。各可能性代表單獨實施例。
治療劑之囊封效率描述在製備之後經囊封或以其他方式與奈米粒子組合物締合之治療劑相對於所提供之初始量的量。囊封效率宜較高(例如，接近100%)。囊封效率可例如藉由在使脂質奈米粒子組合物破裂之前及之後將治療劑在含有脂質奈米粒子組合物之溶液中的量與一或多種有機溶劑或清潔劑進行比較來量測。可使用螢光以量測溶液中之游離治療劑(例如核酸)之量。對於本文所描述之脂質奈米粒子組合物，治療劑之囊封效率可為至少50%，例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，囊封效率可為至少80%。在某些實施例中，囊封效率可為至少90%。
在一些實施例中，脂質奈米粒子之多重多樣性值小於0.4。在一些實施例中，脂質奈米粒子在中性pH下具有淨中性電荷。在一些實施例中，脂質奈米粒子之平均直徑為50-200 nm。
脂質奈米粒子調配物之特性可受包括但不限於以下之因素影響：陽離子型脂質組分之選擇、陽離子型脂質之飽和度、非陽離子型脂質組分之選擇、非陽離子型脂質之飽和度、結構性脂質組分之選擇、聚乙二醇化性質、所有組分之比率及諸如尺寸之生物物理學參數。如本文所描述，PEG脂質組分之純度對LNP之特性及效能亦至關重要。 a)可離子化脂質
在某些實施例中，轉移媒劑包含可離子化脂質。可離子化脂質可用作轉移媒劑之組分以促進或增強環狀RNA至一或多個目標細胞之遞送及釋放(例如，藉由用此類目標細胞之脂質膜滲透或融合)。在某些實施例中，可離子化脂質包含一或多個可裂解官能基(例如二硫鍵)，該一或多個可裂解官能基允許例如化合物之親水性官能頭基與親脂性官能尾基解離(例如在暴露於氧化、還原或酸性條件後)，藉此便於一或多個目標細胞之脂質雙層中進行相變。
在一些實施例中，可離子化脂質如國際專利申請案PCT/US2020/038678中所描述。在一些實施例中，可離子化脂質為如美國專利案第9,708,628號之表1或2中之式1所表示或所列舉之脂質，其內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，可離子化脂質如美國專利案第9,765,022號第7-13頁中所描述或如美國專利第9,765,022號之式1所表示，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，可離子化脂質描述於國際專利申請案第PCT/US2019/016362號之第12-24頁中或如國際專利申請案PCT/US2019/016362由式1表示，該申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，脂質或轉移媒劑為如國際專利申請案第PCT/US2010/061058、PCT/US2018/058555、PCT/US2018/053569、PCT/US2017/028981、PCT/US2019/025246、PCT/US2019/015913、PCT/US2019/016362、PCT/US2019/016362號、美國申請公開案第US2019/0314524、US2019/0321489、US2019/0314284及US2019/0091164號中所描述之脂質，其內容以全文引用的方式併入本文中。適用於本文中之組合物及方法的陽離子型脂質包括描述於國際專利公開案WO 2010/053572及/或美國專利申請案15/809,680中之陽離子脂質，例如C12-200。在某些實施例中，本文中之組合物及方法採用2012年3月29日申請之美國臨時專利申請案61/617,468 (以引用之方式併入本文中)中所描述之包含可離子化陽離子型脂質的脂質奈米粒子，諸如例如(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四碳-15,18-二烯-1-胺(HGT5000)、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四碳-4,15,18-三烯-1-胺(HGT5001)及(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四碳-5,15,18-三烯-1-胺(HGT5002)。
在一些實施例中，使用陽離子型脂質氯化N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基銨或「DOTMA」。(Felgner等人Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987)；美國專利第4,897,355號)。DOTMA可單獨調配或可與中性脂質、二油醯基磷脂醯-乙醇胺或「DOPE」或其他陽離子或非陽離子脂質組合至轉移媒劑或脂質奈米粒子中，且此類脂質體可用於增強核酸遞送至目標細胞中。其他適合之陽離子型脂質包括例如5-羧基精胺基甘胺酸二(十八烷基)醯胺或「DOGS」，2,3-二油烯基氧基-N-[2(精胺-甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙胺鎓或「DOSPA」(Behr等人. Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989)；美國專利第5,171,678；5,334,761號)、1,2-二油醯基-3-二甲胺-丙烷或「DODAP」、1,2-二油醯基-3-三甲銨-丙烷或「DOTAP」。預期陽離子型脂質亦包括1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷或「DSDMA」，1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷或「DODMA」，1,2-二亞油氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷或「DLinDMA」，1,2-二次亞麻氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷或「DLenDMA」，氯化N-二油基-N,N-二甲胺或「DODAC」，溴化N,N-二硬脂基-N,N-二甲胺或「DDAB」，N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥基乙基溴化銨或「DMRIE」，3-二甲胺基-2-(膽固醇-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(順式,順式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷或「CLinDMA」，2-[5'-(膽固醇-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧雜戊烯氧基)-3-二甲基1-1-(順式,順式-9', 1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷或「CpLinDMA」，N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苯甲胺或「DMOBA」，1,2-N,N'-二油烯基胺基甲醯基-3-二甲基胺基丙烷或「DOcarbDAP」，2,3-二亞油醯基氧基-N,N-二甲基丙胺或「DLinDAP」，1,2-N,N'-二亞油基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷或「DLincarbDAP」，1,2-二亞油醯基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷或「DLinCDAP」，2,2-二亞油基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷或「DLin-K-DMA」，2,2-二亞油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷或「DLin-K-XTC2-DMA」及2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧戊環-4-基)-N,N-二甲基乙胺(DLin-KC2-DMA)) (參見WO 2010/042877；Semple等人, Nature Biotech. 28:172-176 (2010))或其混合物。(Heyes, J.,等人, J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, D V.,等人, Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); PCT公開案WO2005/121348A1)。
本文亦涵蓋基於膽固醇之陽離子型脂質的使用。可使用單獨或與其他陽離子或非陽離子脂質組合之該等基於膽固醇之陽離子型脂質。適合之基於膽固醇之陽離子型脂質包括例如GL67，DC-Choi (N,N-二甲基-N-乙基羧醯胺基膽固醇)、l,4-雙(3-N-油基胺基-丙基))哌𠯤(Gao等人, 《生物化學與生物物理研究通訊(Biochem. Biophys. Res. Comm.)》 179, 280 (1991)；Wolf等人, 《生物技術(BioTechniques)》 23, 139 (1997)；美國專利第5,744,335號)或ICE。
在一些實施例中，陽離子或可離子化脂質中之一或多者提供核酸之增加之活性及活體內組合物之改善之耐受性。
在一些實施例中，陽離子型脂質或可離子化脂質中之一或多者由式(I)表示： 式(I) 其中： n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基。
在一些實施例中，Ra為氫。在一些實施例中，Ra為羥基。
在一些實施例中，可離子化脂質由式(Ia-1)、式(Ia-2)或式(Ia-3)表示： 式(Ia-1)                        式(Ia -2)                       式(Ia-3)
在一些實施例中，可離子化脂質由式(Ib-1)、式(Ib-2)或式(Ib-3)表示： 式(Ib-1)                         式(Ib-2)                        式(Ib-3)
在一些實施例中，可離子化脂質由式(Ib-4)、式(Ib-5)、式(Ib-6)、式(Ib-7)、式(Ib-8)或式(Ib-9)表示： 式(Ib-4)                       式(Ib-5)                        式(Ib-6) 式(Ib-7)                       式(Ib-8)                        式(Ib-9)
在一些實施例中，陽離子型脂質或可離子化脂質中之一或多者由式(I)表示，其中R 1及R 2各自獨立地選自： 。
在一些實施例中，R 1與R 2相同。在一些實施例中，R 1與R 2不同。
在各種實施例中，陽離子型脂質或可離子化脂質中之一或多者由式(I*)表示： 式(I*) 其中： n*為1至7之間的整數， R a為氫或羥基， R b為氫或C 1-C 6烷基， R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自以下之取代基取代之直鏈或分支鏈C 1-C 30烷基、C 2-C 30烯基或C 1-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、烷基羰氧基、烷基碳酸酯、烯氧基羰基、烯基羰氧基、烯基碳酸酯、炔氧基羰基、炔基羰氧基、炔基碳酸酯、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基。
在一些實施例中，陽離子型脂質或可離子化脂質中之一或多者由式(II)表示： 式(II) 其中： 各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。
在一些實施例中，該可離子化脂質係選自式II之可離子化脂質，其中R 1及R 3各自獨立地選自由以下組成之群： 。
在一些實施例中，R 1與R 3相同。在一些實施例中，R 1與R 3不同。
在一些實施例中，陽離子型脂質或可離子化脂質中之一或多者由式(II-1)或式(II-2)表示： 式(II-1)， 式(II-2)。
在一些實施例中，可離子化脂質選自WO2015/095340之可離子化脂質(表3之脂質數目123)。在一些實施例中，可離子化脂質選自WO2021/021634、WO2020/237227或WO2019/236673之可離子化脂質(表3之脂質編號124-127)。在一些實施例中，可離子化脂質選自WO2021226597及WO2021113777之可離子化脂質(表3之脂質數目128-131)。
在一些實施例中，轉移媒劑包含選自表3中所表示之可離子化脂質的可離子化脂質。在特定實施例中，在可離子化脂質具有式I之情況下，可離子化脂質選自以下表3之脂質數目16、45、86、89及90。在可離子化脂質為式II之可離子化脂質的特定實施例中，可離子化脂質選自以下表3之脂質編號128-131。
實例2描述合成某些由式I及式II表示且描述於表3中之可離子化脂質的例示性方法。
在一些實施例中，陽離子型脂質或可離子化脂質中之一或多者由式(III)表示： 式(III) 或其醫藥學上可接受之鹽，其中 L 1為C 2-C 11伸烷基、C 4-C 10伸烯基或C 4-C 10伸炔基； X 1為OR 1、SR 1或N(R 1) 2，其中R 1獨立地為H或未經取代之C 1-C 6烷基；及 R 2及R 3各自獨立地為C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30炔基。
在一些實施例中，陽離子型脂質或可離子化脂質中之一或多者由式(III*)表示： 式(III*) 或其醫藥學上可接受之鹽，其中 L 1為C 2-C 11伸烷基、C 4-C 10伸烯基或C 4-C 10伸炔基； X 1為OR 1、SR 1或N(R 1) 2，其中R 1獨立地為H或未經取代之C 1-C 6烷基；及 R 2及R 3各自獨立地為直鏈或分支鏈C 1-C 30烷基、C 2-C 30烯基或C 1-C 30雜烷基，其視情況經一或多個選自以下之取代基取代：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、烷基羰氧基、烷基碳酸酯、烯氧基羰基、烯基羰氧基、烯基碳酸酯、炔氧基羰基、炔基羰氧基、炔基碳酸酯、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基。 表3：例示性可離子化脂質結構
在一些實施例中，可離子化脂質為式(15)化合物： ， 式(15) 或為其醫藥學上可接受之鹽，其中： n *為1至7之整數； R a為氫或羥基； R h為氫或C 1-C 6烷基； R 1為C 1-C 30烷基或R 1 *； R 2為C 1-C 30烷基或R 2 *； R 1 *及R 2 *獨立地選自： -(CH 2) qC(O)O(CH 2) rC(R 8)(R 9)(R 10)， -(CH 2) qOC(O)(CH 2) rC(R 8)(R 9)(R 10)，及 -(CH 2) qOC(O)O(CH 2) rC(R 8)(R 9)(R 10)； 其中： q為0至12之整數， r為0至6之整數，其中r在至少一次出現時不為0； R 8為H或R 11； R 9、R 10及R 11各自獨立地為C 1-C 20烷基或C 2-C 20烯基；及 其中(i) R 1為R 1 *，(ii) R 2為R 2 *，或(iii) R 1為R 1 *且R 2為R 2 *。
在式(15)之一些實施例中，R a為氫且可離子化脂質具有式(16)： 。 式(16) 或為其醫藥學上可接受之鹽，其中： n*為1至7之整數。
在式(16)之一些實施例中，可離子化脂質具有式(17)： 式(17) 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： n為1至7之整數； q及q'各自獨立地為0至12之整數； r及r'各自獨立地為0至6之整數，其中r或r'中之至少一者不為0； Z A及Z B各自獨立地選自^-C(O)O-、^-OC(O)及-OC(O)O-；其中^表示與-(CH 2) q-或-(CH 2) q '-之連接點；及 R 9A、R 9B、R 10A及R 10B各自獨立地為C 1-C 20烷基或C 2-C 20烯基。
在式(17)之一些實施例中，Z A及Z B為^-C(O)O-，及該可離子化脂質具有式(17a-1) 。 式(17a-1)
在式(17)之一些實施例中，Z A及Z B為^-OC(O)-，及該可離子化脂質具有式(17a-2) 。 式(17a-2)
在式(17)之一些實施例中，Z A及Z B為-O(C)(O)O-，且可離子化脂質由式(17a-3)表示： 。 式(17a-3)
在式(15)之一些實施例中，R a為羥基且可離子化脂質具有式(18)： ， 式(18) 或為其醫藥學上可接受之鹽，其中： n *為1至7之整數； R h為氫或C 1-C 6烷基； R 1為C 1-C 30烷基或R 1 *； R 2為C 1-C 30烷基或R 2 *； R 1*及R 2*獨立地選自： -(CH 2) qC(O)O(CH 2) rC(R 8)(R 9)(R 10)、 -(CH 2) qOC(O)(CH 2) rC(R 8)(R 9)(R 10)及 -(CH 2) qOC(O)O(CH 2) rC(R 8)(R 9)(R 10)； 其中： q為0至12之整數， r為0至6之整數，其中r在至少一次出現時不為0； R 8為氫或R 11； R 9、R 10及R 11各自獨立地為C 1-C 20烷基或C 2-C 20烯基； 其中(i) R 1為R 1 *，(ii) R 2為R 2 *，或(iii) R 1為R 1 *且R 2為R 2 *；及 其中，對於(iii)，(a) R 1 *與R 2 *不同，或(b) R 9及R 10對於R 1 *及R 2 *中之至少一者具有不同數目個碳原子。
在式(18)之一些實施例中，可離子化脂質具有式(19)： ， 式(19) 或為其醫藥學上可接受之鹽，其中： n為1至7之整數； q及q'各自獨立地為0至12之整數； r及r'各自獨立地為0至6之整數，其中r或r'中之至少一者不為0； Z A及Z B各自獨立地選自^-C(O)O-、^-OC(O)及-OC(O)O-；其中^指示與-(CH 2) q-或-(CH 2) q '-之連接點；及 R 9A、R 9B、R 10A及R 10B各自獨立地為C 1-C 20烷基或C 2-C 20烯基。
在式(19)之一些實施例中，Z A及Z B為^-C(O)O-，及該可離子化脂質具有式(19a-1)： 。 式(19a-1)
在式(19)之一些實施例中，Z A及Z B為^-OC(O)-，及該可離子化脂質具有式(19a-2)： 。 式(19a-2)
在式(19)之一些實施例中，Z A及Z B為-O(C)(O)O-，且該可離子化脂質由式(19a-3)表示： 。 式(19a-3)
在式(15)之一些實施例中，R 1為C 1-C 30烷基，及該可離子化脂質具有式(20)： ， 式(20) 或為其醫藥學上可接受之鹽，其中： Z A選自^-C(O)O-、^-OC(O)-及-OC(O)O-；其中^指示與-(CH 2) q-之連接點； R 9A及R 10A各自獨立地為C 1-C 20烷基或C 2-C 20烯基； n為1至7之整數； q為0至12之整數；及 r為1至6之整數。
在式(20)之一些實施例中，Z A為^-C(O)O-，及該可離子化脂質具有式(20a-1)： 。 式(20a-1)
在式(20)之一些實施例中，Z A為^-OC(O)-，及該可離子化脂質具有式(20a-2)： 。 式(20a-2)
在式(20)之一些實施例中，Z A為-OC(O)O-，及該可離子化脂質具有式(20a-3)： 。 式(20a-3)
在式(15)之一些實施例中，R 2為C 1-C 30烷基，及該可離子化脂質具有式(21)： ， 式(21) 或為其醫藥學上可接受之鹽，其中： Z B選自^-C(O)O-、^-OC(O)-及-OC(O)O-；其中^指示與-(CH 2) q '-之連接點； R 9B及R 10B各自獨立地為C 1-C 20烷基或C 2-C 20烯基； n為1至7之整數； q'為0至12之整數；及 r'為1至6之整數。
在式(21)之一些實施例中，Z B為^-C(O)O-，及該可離子化脂質具有式(21a-1)： 。 式(21a-1)
在式(21)之一些實施例中，Z B為^-OC(O)-，及該可離子化脂質具有式(21a-2)： 。 式(21a-2)
在式(21)之一些實施例中，Z B為-OC(O)O-，及該可離子化脂質具有式(21a-3)： 。 式(21a-3)
在一些實施例中，可離子化脂質係選自下表：
在一些實施例中，本發明之可離子化脂質由式(22)表示： ， 式(22) 或為其醫藥學上可接受之鹽，其中： R a為氫或羥基； R 1為C 1-C 30烷基或R 1 *； R 2為C 1-C 30烷基或R 2 *； R 1*及R 2*獨立地選自： -(CH 2) qC(O)O(CH 2) rC(R 4)(R 5)(R 6)， -(CH 2) qOC(O)(CH 2) rC(R 4)(R 5)(R 6)，及 -(CH 2) qOC(O)O(CH 2) rC(R 4)(R 5)(R 6)； 其中： q為0至12之整數， r為0至6之整數，其中r在至少一次出現時不為0； R 4為氫或R 7； R 5、R 6及R 7各自獨立地為C 1-C 20烷基或C 2-C 20烯基； 其中(i) R 1為R 1 *，(ii) R 2為R 2 *，或(iii) R 1為R 1 *且R 2為R 2 *；及 R 3為L-R'，其中L為直鏈或分支鏈C 1-C 10伸烷基，及R'為(i)單環或雙環雜環基或雜芳基，諸如咪唑基、吡唑基、1,2,4-三唑基或苯并咪唑基，其各自視情況在一或多個可用碳及氮處經C 1-C 6烷基取代，或(ii) R A、R B或R C，其中 R A係選自： ； R B係選自： ；及 R C係選自： ； 其限制條件為該可離子化脂質不為：
在式(22)之一些實施例中，R 3係選自： 。
在式(22)之一些實施例中，R 1係R 1 *，R 2係R 2 *，及該可離子化脂質具有式(23)： 式(23) 其中： q及q'各自獨立地為0至12之整數； r及r'各自獨立地為0至6之整數，其中r或r'中之至少一者不為0； Z A及Z B各自獨立地選自^-C(O)O-、^-OC(O)及-OC(O)O-；其中^表示與-(CH 2) q-或-(CH 2) q '-之連接點；及 R 5A、R 5B、R 6A及R 6B各自獨立地為C 1-C 20烷基或C 2-C 20烯基。
在式(23)之一些實施例中，Z A及Z B為^-C(O)O-，及該可離子化脂質具有式(23a-1)： 。 式(23a-1)
在式(23)之一些實施例中，Z A及Z B為^-OC(O)-，及該可離子化脂質具有式(23a-2)： 。 式(23a-2)
在式(23)之一些實施例中，Z A及Z B為-O(C)(O)O-，且可離子化脂質由式(23a-3)表示： 。 式(23a-3)
在式(22)之一些實施例中，R 2為C 1-C 30烷基，及該可離子化脂質具有式(25)： ， 式(25) 或為其醫藥學上可接受之鹽，其中： Z B選自^-C(O)O-、^-OC(O)-及-OC(O)O-；其中^指示與-(CH 2) q '-之連接點； R 5B及R 6B各自獨立地為C 1-C 20烷基或C 2-C 20烯基； q'為0至12之整數；及 r'為1至6之整數。
在式(25)之一些實施例中，Z B為^-C(O)O-，及該可離子化脂質具有式(25a-1)： 。 式(25a-1)
在式(25)之一些實施例中，Z B為^-OC(O)-，及該可離子化脂質具有式(25a-2)： 。 式(25a-2)
在式(25)之一些實施例中，Z B為-OC(O)O-，及該可離子化脂質具有式(25a-3)： 。 式(25a-3)
在一些實施例中，可離子化脂質係選自下表：
脂質 結構
100-a ,
100-b ,
100-c ,
100-d ,
100-e 及
100-f
在一些實施例中，可離子化脂質係選自下表。
脂質 結構
1-al
1-am
1-an
1-ao
1-ap
1-aq
1-ar
1-as
1-at
1-au
在一些實施例中，可離子化脂質描述於美國專利公開案第20190321489號中。在一些實施例中，可離子化脂質描述於國際專利公開案WO 2010/053572中，該案以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，可離子化脂質為描述於WO 2010/053572之第[00225]段之C12-200。
若干可離子化脂質已描述於文獻中，其中許多為市售的。在某些實施例中，該等可離子化脂質包括於本文所描述之轉移媒劑中。在一些實施例中，使用可離子化脂質N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨或「DOTMA」。(Felgner等人Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987)；美國專利第4,897,355號)。DOTMA可單獨調配或可與中性脂質、二油醯基磷脂醯乙醇胺或「DOPE」或其他陽離子型脂質或非陽離子型脂質組合至脂質奈米粒子中。其他適合之陽離子型脂質包括例如2012年3月29日申請之美國臨時專利申請案61/617,468 (以引用的方式併入本文中)中所描述之可離子化陽離子型脂質，諸如例如(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-15,18-二烯-1-胺(HGT5000)、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-4,15,18-三烯-1-胺(HGT5001)及(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-5,15,18-三烯-1-胺(HGT5002)、C12-200 (描述於WO 2010/053572中)、2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧戊環-4-基)-N,N-二甲基乙胺(DLinKC2-DMA)) (參見，WO 2010/042877；Semple等人, Nature Biotech. 28:172-176 (2010))、2-(2,2-二((9Z,2Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧戊環-4-基)-N,N-二甲基乙胺(DLin-KC2-DMA)、(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-十四氫-1H-環戊[a]菲-3-基3-(1H-咪唑-4-基)丙酸酯(ICE)、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-15,18-二烯-1-胺(HGT5000)、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-4,15,18-三烯-1-胺(HGT5001)、(15Z,18 Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-5,15,18-三烯-1-胺(HGT5002)、5-羧基精胺基甘胺酸-二(十八烷基)醯胺(DOGS)、2,3-二油烯基氧基-N-[2(精胺-甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙胺鎓(DOSPA) (Behr等人. Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989)；美國專利第5,171,678；5,334,761號)、1,2-二油醯基-3-二甲胺-丙烷(DODAP)、1,2-二油醯基-3-三甲銨-丙烷或(DOTAP)。預期可離子化脂質亦包括1,2-二硬脂醯氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DSDMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DODMA)、1,2-二亞油氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二次亞麻氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DLenDMA)、N-二油基-N,N-二甲胺氯化物(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲胺溴化物(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥基乙基溴化銨(DMRIE)、3-二甲胺基-2-(膽固醇-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(順式,順式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5'-(膽固醇-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧雜戊烯氧基)-3-二甲基-1-(順式,順式-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苯甲胺(DMOBA)、1,2-N,N'-二油烯基胺基甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DOcarbDAP)、2,3-二亞油醯基氧基-N,N-二甲基丙胺(DLinDAP)、1,2-N,N'-二亞油基胺甲醯基-3-二甲胺基丙烷(DLincarbDAP)、1,2-二亞油醯基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLinCDAP)、2,2-二亞油基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)、2,2-二亞油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-XTC2-DMA)或GL67或其混合物。(Heyes, J.等人, J Controlled Release 107: 276-287 (2005)；Morrissey, D V.等人, Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005)；PCT公開案WO2005/121348A1)。本發明亦考慮使用基於膽固醇之可離子化脂質調配轉移媒劑(例如脂質奈米粒子)。可使用單獨或與其他脂質組合之該等基於膽固醇之可離子化脂質。適合之基於膽固醇之可離子化脂質包括例如DC-膽固醇(N,N-二甲基-N-乙基羧醯胺基膽固醇)及l,4-雙(3-N-油基胺基-丙基))哌𠯤(Gao等人, 《生物化學與生物物理研究通訊(Biochem. Biophys. Res. Comm.)》 179, 280 (1991)；Wolf等人, 《生物技術(BioTechniques)》 23, 139 (1997)；美國專利第5,744,335號)。
亦考慮諸如基於二烷基胺基之脂質、基於咪唑之脂質及基於鈲之脂質的陽離子型脂質。舉例而言，亦考慮可離子化脂質3-(1H-咪唑-4-基)丙酸(3S,10R, 13R, 17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-十四氫-1H-環戊并[a]菲-3-基酯(ICE)之使用，如國際申請案第PCT/US2010/058457號中所揭示，該案以引用之方式併入本文中。
亦考慮諸如基於二烷基胺基之脂質、基於咪唑之脂質及基於鈲之脂質的可離子化脂質。
在一些實施例中，可離子化脂質由美國專利公開案第20190314284號描述。
可離子化脂質包括國際專利申請案PCT/US2019/025246及美國專利公開案2017/0190661及2017/0114010中所揭示之可離子化脂質，該等案以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，可離子化脂質如國際專利申請案PCT/US2019/015913中所描述。
用於以上化合物及組合物之製備方法在本文中描述於下文及/或在此項技術中已知。
熟習此項技術者應瞭解，在本文所描述之方法中，中間化合物之官能基可能需要由適合的保護基保護。該等官能基包括例如羥基、胺基、巰基及羧酸。用於羥基之適合的保護基包括例如三烷基矽基或二芳基烷基矽基(例如三級丁基二甲基矽基、三級丁基二苯基矽基或三甲基矽基)、四氫哌喃基、苯甲基及其類似基團。用於胺基、甲脒基及胍基之適合的保護基包括例如三級丁氧基羰基、苯甲氧基羰基及其類似基團。用於巰基之適合的保護基包括例如-C(O)-R'' (其中R''為烷基、芳基或芳烷基)、對甲氧基苯甲基、三苯甲基及其類似基團。用於羧酸之適合的保護基包括例如烷基、芳基或芳烷基酯。保護基可根據熟習此項技術者已知且本文所描述之標準技術添加或移除。保護基之使用詳細描述於例如Green, T. W.及P. G. M. Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis (1999), 第3版, Wiley中。如熟習此項技術者將瞭解，保護基亦可為聚合物樹脂，如王樹脂(Wang resin)、林克樹脂(Rink resin)或2-氯三苯甲基氯化物樹脂。
熟習此項技術者亦應瞭解，儘管本文所描述之化合物之此類受保護衍生物可能本身不具有藥理學活性，但其可投與哺乳動物且此後在體內代謝而形成具有藥理學活性之本文所描述之化合物。因此，此類衍生物可描述為前藥。本文所描述之化合物之所有前藥均包括於本發明之範疇內。
此外，以游離鹼或酸形式存在之本文所描述之所有化合物可藉由用適當無機或有機鹼或酸藉由熟習此項技術者已知之方法處理而轉化成其醫藥學上可接受之鹽。本文所描述之化合物之鹽亦可藉由標準技術轉化成其游離鹼或酸形式。 胺脂質
在某些實施例中，用於遞送環狀RNA之轉移媒劑組合物包含胺脂質。在某些實施例中，可離子化脂質為胺脂質。在一些實施例中，胺脂質描述於國際專利申請案PCT/US2018/053569中。
適用於本文所描述之例如脂質奈米粒子之轉移媒劑中的胺脂質及其他生物可降解脂質在活體內生物可降解。本文所描述之胺脂質具有低毒性(例如在動物模型中在大於或等於10 mg/kg之量下耐受而無副作用)。在某些實施例中，包括胺脂質之轉移媒劑包括其中在8、10、12、24或48小時或3、4、5、6、7或10天內至少75%胺脂質自血漿清除的轉移媒劑。
生物可降解脂質包括例如WO2017/173054、WO2015/095340及WO2014/136086之生物可降解脂質。
脂質清除率可以熟習此項技術者已知之方法量測。參見例如Maier, M.A.等人Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics. Mol. Ther. 2013, 21(8), 1570-78。
包含胺脂質之轉移媒劑組合物可引起清除率增加。在一些實施例中，清除率為脂質清除率，例如自血液、血清或血漿清除脂質之速率。在一些實施例中，清除率為RNA清除率，例如自血液、血清或血漿清除環狀RNA之速率。在一些實施例中，清除率為自血液、血清或血漿清除轉移媒劑之速率。在一些實施例中，清除率為自諸如肝組織或脾組織之組織清除轉移媒劑之速率。在某些實施例中，高清除率會產生無顯著副作用之安全分佈。胺脂質及生物可降解脂質可減少循環中及組織中之轉移媒劑積聚。在一些實施例中，循環中及組織中之轉移媒劑積聚減少會產生無顯著副作用之安全分佈。
脂質可視其所處之介質之pH而離子化。舉例而言，在弱酸性介質中，諸如胺脂質之脂質可經質子化且因此帶有正電荷。相反地，在弱鹼性介質，諸如其中pH為大約7.35之血液中，脂質，諸如胺脂質可不經質子化且因此不帶電荷。脂質帶有電荷之能力與其固有pKa有關。在一些實施例中，本發明之胺脂質可各自獨立地具有在約5.1至約7.4範圍內之pKa。在一些實施例中，本發明之生物可用脂質可各自獨立地具有在約5.1至約7.4範圍內之pKa。舉例而言，本發明之胺脂質可各自獨立地具有在約5.8至約6.5範圍內之pKa。pKa在約5.1至約7.4範圍內之脂質有效用於活體內遞送運載物，例如遞送至肝。此外，已發現，pKa在約5.3至約6.4範圍內之脂質有效用於活體內遞送，例如遞送至腫瘤中。參見例如WO2014/136086。 含有二硫鍵之脂質
在一些實施例中，可離子化脂質描述於美國專利9,708,628中。
在一些實施例中，脂質可具有-S-S-(二硫鍵)鍵。用於此類化合物之生產方法包括例如包括以下之方法：產生 R 3a—(Y a—R 2a)n a—X a—R 1a—SH，及 R 3b—(Y b—R 2b)n b—X b—R 1b—SH，及 使其進行氧化(偶合)，得到含有-S-S-之化合物；包括以下之方法：使必需部分依序鍵結至含有-S-S-鍵之化合物，最終獲得化合物；及其類似方法。較佳為後一方法。 其他例示性可離子化脂質
在一些實施例中，可離子化脂質描述於美國專利9,765,022中。
在一些實施例中，其他脂質樣化合物可使用此項技術中已知的適合之途徑製備。該方法可包括用於添加或移除適合之保護基以便最終允許合成脂質樣化合物之額外步驟。另外，可按替代順序或次序執行各種合成步驟以得到所需材料。適用於合成適用的脂質樣化合物之合成化學轉換及保護基方法(保護及脫除保護基)係此項技術中已知的，包括例如R. Larock, Comprehensive Organic Transformations (第2版, VCH Publishers 1999)；P. G. M. Wuts及T. W. Greene, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis (第4版, John Wiley and Sons 2007)；L. Fieser及M. Fieser, Fieser and Fieser' s Reagents for Organic Synthesis (John Wiley and Sons 1994)；及L. Paquette編, Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis (第2版, John Wiley and Sons 2009)及其後續版本。某些脂質樣化合物可含有非芳族雙鍵及一或多個不對稱中心。因此，其可以外消旋體及外消旋混合物、單一鏡像異構體、個別非鏡像異構體、非鏡像異構體混合物及順式或反式異構體形式存在。考慮所有該等異構體形式。
如上文所提及，此等脂質樣化合物可用於遞送醫藥劑。可藉由活體外分析初步篩選其在遞送醫藥劑中之功效，且隨後藉由動物實驗及臨床試驗進行確認。其他方法亦將對一般熟習此項技術者顯而易見。
上文所描述之複合物可使用諸如Wang等人, ACS Synthetic Biology, 1, 403-07 (2012)之公開案中所描述之程序來製備。一般而言，其係藉由在諸如乙酸鈉緩衝液或磷酸鹽緩衝鹽水(「PBS」)之緩衝液中培育脂質樣化合物及醫藥劑而獲得。 親水性基團
在某些實施例中，選定親水性官能基或部分可改變或以其他方式賦予化合物或該化合物為其組分之轉移媒劑以特性(例如藉由改善該化合物為其組分之脂質奈米粒子的轉染效率)。舉例而言，在本文所揭示之化合物中併入鈲作為親水性頭基可促進該等化合物(或該等化合物為其組分之轉移媒劑)與一或多個目標細胞之細胞膜的融合，藉此增強例如該等化合物之轉染效率。已假設，來自親水性鈲部分之氮形成六員環過渡態，此將穩定性授予至相互作用且因此允許經囊封材料之細胞吸收。(Wender等人, Adv. Drug Del. Rev. (2008) 60: 452-472)。類似地，將一或多個胺基或部分併入所揭示之化合物中(例如作為頭基)可藉由採用該等胺基之融合性來進一步促進使目標細胞之內體/溶酶體膜破裂。此不僅基於組合物之胺基之pKa，且亦基於胺基進行六方相變且與目標細胞表面，亦即囊泡膜融合之能力。(Koltover等人. Science (1998) 281: 78-81。)咸信所得物會促進囊泡膜破裂及脂質奈米粒子內容物釋放至目標細胞中。
類似地，在某些實施例中，將例如咪唑作為親水性頭基併入本文所揭示之化合物中可用以促進例如囊封於本發明之轉移媒劑(例如，脂質奈米粒子)中之內容物的胞內體或溶酶體釋放。該增強之釋放可藉由質子-海綿介導之破裂機制及/或增強之融合機制中之一或兩者來達成。質子-海綿機制係基於化合物且特定言之該化合物之官能部分或基團緩衝胞內體酸化之能力。此可藉由該化合物或構成該化合物之官能基中之一或多者(例如咪唑)之pKa來操縱或以其他方式控制。因此，在某些實施例中，例如本文所揭示之基於咪唑之化合物(例如HGT4001及HGT4004)的融合性與胞內體破裂特性相關，該等特性由該等咪唑基團促進，該等咪唑基團具有相對於其他傳統的可離子化脂質而言低之pKa。該等胞內體破裂特性繼而促進滲透膨脹及脂質體膜破裂，接著將裝載或囊封於其中之聚核苷酸物質轉染或胞內釋放至目標細胞中。此現象可適用於除咪唑部分以外具有所需pKa概況之各種化合物。該等實施例亦包括基於多氮之官能基，諸如基於多元胺、多肽(組胺酸)及氮之樹突狀結構。
例示性可離子化脂質及/或陽離子型脂質描述於國際PCT專利公開案WO2015/095340、WO2015/199952、WO2018/011633、WO2017/049245、WO2015/061467、WO2012/040184、WO2012/000104、WO2015/074085、WO2016/081029、WO2017/004 143、WO2017/075531、WO2017/117528、WO2011/022460、WO2013/148541、WO2013/116126、WO2011/153120、WO2012/044638、WO2012/054365、WO2011/090965、WO2013/016058、WO2012/162210、WO2008/042973、WO2010/129709、WO2010/144740、WO20 12/099755、WO2013/049328、WO2013/086322、WO2013/086373、WO2011/071860、WO2009/132131、WO2010/048536、WO2010/088537、WO2010/054401、WO2010/054406、WO2010/054405、WO2010/054384、WO2012/016184、WO2009/086558、WO2010/042877、WO2011/000106、WO2011/000107、WO2005/120152、WO2011/141705、WO2013/126803、WO2006/007712、WO2011/038160、WO2005/121348、WO2011/066651、WO2009/127060、WO2011/141704、WO2006/069782、WO2012/031043、WO2013/006825、WO2013/033563、WO2013/089151、WO2017/099823、WO2015/095346及WO2013/086354，及美國專利公開案US2016/0311759、US2015/0376115、US2016/0151284、US2017/0210697、US2015/0140070、US2013/0178541、US2013/0303587、US2015/0141678、US2015/0239926、US2016/0376224、US2017/0119904、US2012/0149894、US2015/0057373、US2013/0090372、US2013/0274523、US2013/0274504、US2013/0274504、US2009/0023673、US2012/0128760、US2010/0324120、US2014/0200257、US2015/0203446、US2018/0005363、US2014/0308304、US2013/0338210、US2012/0101148、US2012/0027796、US2012/0058144、US2013/0323269、US2011/0117125、US2011/0256175、US2012/0202871、US2011/0076335、US2006/0083780、US2013/0123338、US2015/0064242、US2006/0051405、US2013/0065939、US2006/0008910、US2003/0022649、US2010/0130588、US2013/0116307、US2010/0062967、US2013/0202684、US2014/0141070、US2014/0255472、US2014/0039032、US2018/0028664、US2016/0317458及US2013/0195920，所有文獻之內容均以全文引用之方式併入本文中。國際專利申請案WO 2019/131770亦以全文引用之方式併入本文中。 b)穩定化脂質(例如，PEG脂質)
穩定化脂質或表面穩定化脂質可用於增強LNP之結構。如本文所考慮之穩定化脂質可為經聚乙二醇(PEG)改質之磷脂。
亦考慮在本文所描述之脂質體及醫藥組合物中使用及包括經聚乙二醇(PEG)改質之磷脂及衍生脂質，諸如衍生神經醯胺(PEG-CER)，包括N-辛醯基-神經鞘胺醇-l-[丁二醯基(甲氧基聚乙二醇)-2000] (C8 PEG-2000神經醯胺)，較佳與本文所揭示之化合物及脂質中之一或多者的組合。所考慮之經PEG改質之脂質包括但不限於與具有(多個) C6-C20長度之烷基鏈之脂質共價連接的長度為至多5 kDa之聚乙二醇鏈。在一些實施例中，本文所描述之組合物及方法中所採用之經PEG修飾之脂質為1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(2000 MW PEG)「DMG-PEG2000」。將經PEG改質之脂質添加至脂質遞送媒劑中可防止複雜聚集，且亦可提供用於延長循環壽命且增加脂質-聚核苷酸組合物遞送至目標組織之方式(Klibanov等人, (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237)，或其可經選擇以快速交換出活體內調配物(參見美國專利第5,885,613號)。特別適用之可交換脂質為具有較短醯基鏈(例如C14或C18)之PEG-神經醯胺。本發明之經PEG改質之磷脂及衍生脂質可占脂質體脂質奈米粒子中存在之總脂質的約0%至約20%、約0.5%至約20%、約1%至約15%、約4%至約10%或約2%之莫耳比。
在一些實施例中，PEG-脂質之脂質部分包括長度為約C 14至約C 22、較佳約C 14至約C 16之脂質部分。在一些實施例中，例如mPEG-NH 2之PEG部分之大小為約1000、約2000、約5000、約10,000、約15,000或約20,000道爾頓。
在一實施例中，經PEG改質之脂質描述於國際專利申請案第PCT/US2019/015913號中，該案以全文引用之方式併入本文中。在一實施例中，轉移媒劑包含一或多種經PEG改質之脂質。
經PEG改質之脂質之非限制性實例包括經PEG改質之磷脂醯乙醇胺及磷脂酸、PEG-腦醯胺共軛物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、經PEG改質之二烷基胺及經PEG改質之1,2-二醯基氧基丙-3-胺、經PEG改質之二醯基甘油、經PEG改質之二烷基甘油及其混合物。在一些其他實施例中，經PEG改質之脂質可為例如PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE、PEG-DAG、PEG-S-DAG、PEG-PE、PEG-S-DMG、PEG-CER、PEG-二烷氧基丙基胺基甲酸酯、PEG-OR、PEG-OH、PEG-c-DOMG或PEG-1。
在一些再另外實施例中，經PEG改質之脂質包括但不限於1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[胺基(聚乙二醇)] (PEG-DSPE)、PEG-二硬脂基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕櫚油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二醯基甘油醯胺(PEG-DAG)、PEG-二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-l,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。
在一個實施例中，本文所描述之脂質奈米粒子可包含經非可擴散PEG改質之脂質。非可擴散PEG之非限制性實例包括PEG-DSG及PEG-DSPE。在一個實施例中，本文中之脂質奈米粒子包含PEG-DSPC。
在一些實施例中，經PEG改質之脂質為PEG-DMG之經改質形式。PEG-DMG具有以下結構：
在一些實施例中，PEG脂質為式(P1)化合物： P1 或其鹽或異構物，其中： r為在1與100之間的整數； R為C 10 - 40烷基、C 10 - 40烯基或C 10 - 40炔基；且視情況，R之一或多個亞甲基獨立地經以下各者置換：C 3 - 10伸碳環基、4至10員亞雜環基、C 6 - 10伸芳基、4至10員伸雜芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-,-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(=NRN)-、-C(=NRN)N(RN)-、-NRNC(=NRN)-、-NRNC(=NRN)N(RN)- ,-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-；及 R N在各情況下獨立地為氫、C 1 - 6烷基或氮保護基。
舉例而言，R為C17烷基。舉例而言，PEG脂質為式(P1-a)化合物： 或其鹽或異構物，其中r為在1與100之間的整數。
在一些實施例中，經PEG改質之脂質為PEG-C18或PEG-1之經改質形式。PEG-1具有以下結構： 。
PEG-脂質為此項技術中已知的，諸如美國專利第8,158,601號及國際專利公開案第WO2015/130584 A2號中所描述之PEG-脂質，該等案以全文引用之方式併入本文中。在一個實施例中，PEG脂質可為國際公開案第WO2012099755號中所描述之聚乙二醇化脂質，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。本文所描述之此等例示性PEG脂質中之任一者可經改質以在PEG鏈上包含羥基。在某些實施例中，PEG脂質為PEG-OH脂質。在某些實施例中，PEG-OH脂質在PEG鏈上包括一或多個羥基。在某些實施例中，PEG-OH或羥基-聚乙二醇化脂質在PEG鏈之末端包含-OH基團。各可能性代表單獨實施例。 c)輔助脂質
在一些實施例中，本文所描述之轉移媒劑(例如LNP)包含一或多種非陽離子型輔助脂質。在一些實施例中，輔助脂質為磷脂。在一些實施例中，輔助脂質為磷脂替代物或置換物。在一些實施例中，磷脂或磷脂替代物可為例如一或多種飽和或(多)不飽和磷脂或磷脂替代物或其組合。一般而言，磷脂包含磷脂部分及一或多種脂肪酸部分。
磷脂部分可選自例如由以下組成之非限制性群組：磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、磷脂醯絲胺酸、磷脂酸、2-溶血磷脂醯膽鹼及神經鞘磷脂。
脂肪酸部分可選自例如由以下組成之非限制性群組：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、α-次亞麻油酸、芥子酸、植烷酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二烷酸、二十二碳五烯酸及二十二碳六烯酸。
磷脂包括但不限於甘油磷脂，諸如磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、磷脂醯甘油及磷脂酸。磷脂亦包括磷神經鞘脂，諸如神經鞘磷脂。
在一些實施例中，輔助脂質為1,2-二硬脂醯基-177-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)類似物、DSPC替代物、油酸或油酸類似物。
在一些實施例中，輔助脂質為非磷脂醯膽鹼(PC)兩性離子脂質、DSPC類似物、油酸、油酸類似物或DSPC替代物。
在一些實施例中，輔助脂質描述於PCT/US2018/053569中。適用於本發明之脂質組合物中之輔助脂質包括例如各種中性、不帶電或兩性離子脂質。該等輔助脂質較佳與本文所揭示之化合物及脂質中之一或多者組合使用。輔助脂質之實例包括但不限於5-十七基苯-1,3-二醇(間苯二酚)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、磷酸膽鹼(DOPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、磷脂醯膽鹼(PLPC)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DAPC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、卵磷脂醯膽鹼(EPC)、二月桂醯基磷脂醯膽鹼(DLPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、1-肉豆蔻醯基-2-棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(MPPC)、1-棕櫚醯基-2-肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(PMPC)、1-棕櫚醯基-2-硬脂醯基磷脂醯膽鹼(PSPC)、1,2-二花生醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DBPC)、1-硬脂醯基-2-棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(SPPC)、1,2-二(二十)碳烯醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DEPC)、棕櫚醯油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、溶血磷脂醯基膽鹼、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二亞油醯基磷脂醯膽鹼、二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、棕櫚醯油醯基磷脂醯乙醇胺(POPE)、溶血磷脂醯乙醇胺及其組合。在一個實施例中，輔助脂質可為二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)或二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)。在另一實施例中，輔助脂質可為二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)。輔助脂質用於穩定且改善轉移媒劑之處理。該等輔助脂質較佳與例如本文所揭示之可離子化脂質中之一或多者的其他賦形劑組合使用。在一些實施例中，當與可離子化脂質組合使用時，輔助脂質可占脂質奈米粒子中存在之總脂質的5%至約90%或約10%至約70%之莫耳比。 d)結構性脂質
本文所描述之轉移媒劑包含一或多種結構性脂質。結構性脂質併入脂質奈米粒子中可有助於減少其他脂質在粒子中的聚集。結構性脂質可包括(但不限於)膽固醇、糞固醇、麥角固醇、菜籽固醇、番茄次鹼、蕃茄鹼、熊果酸、α-生育酚及其混合物。在某些實施例中，結構性脂質為膽固醇。在某些實施例中，結構性脂質為膽固醇類似物。在某些實施例中，結構性脂質包括膽固醇及皮質類固醇(諸如普賴蘇穠(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、普賴松(prednisone)及氫皮質酮(hydrocortisone))或其組合。
在一實施例中，結構性脂質描述於國際專利申請案PCT/US2019/015913中。
在一些實施例中，結構性脂質為固醇(例如，植物固醇或動物固醇)。在某些實施例中，結構性脂質為類固醇。舉例而言，固醇可包括但不限於膽固醇、β-植固醇、糞固醇、麥角固醇、植固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、麥角固醇、番茄次鹼、蕃茄鹼、熊果酸或α-生育酚。在某些實施例中，結構性脂質為膽固醇。在某些實施例中，結構性脂質為膽固醇類似物。在某些實施例中，結構性脂質為α-生育酚。
本文所描述之轉移媒劑包含一或多種結構性脂質。將結構性脂質併入例如脂質奈米粒子之轉移媒劑中可幫助減少粒子中其他脂質之聚集。在某些實施例中，結構性脂質包括膽固醇及皮質類固醇(諸如普賴蘇穠(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、普賴松(prednisone)及氫皮質酮(hydrocortisone))或其組合。
在一些實施例中，轉移媒劑包括有效量之例如膽固醇類似物或胺基脂質或其組合之免疫細胞遞送增效脂質，當存在於例如脂質奈米粒子之轉移媒劑中時，相對於不具有免疫細胞遞送增效脂質之轉移媒劑，該脂質可藉由增強細胞締合及/或吸收、內化、胞內遷移及/或加工及/或胞內體逃逸而起作用，及/或可增強免疫細胞之辨識及/或與免疫細胞之結合。因此，儘管不意欲受任何特定機制或理論束縛，但在一個實施例中，本發明之結構性脂質或其他免疫細胞遞送增效脂質結合至C1q，或促進包含該脂質之轉移媒劑與C1q之結合。因此，對於用於將核酸分子遞送至免疫細胞之本發明之轉移媒劑的活體外用途，使用包括C1q之培養條件(例如使用包括血清之培養基或向無血清培養基添加外源性C1q)。對於本發明之轉移媒劑之活體內用途，對C1q之需求由內源性C1q供應。
在某些實施例中，結構性脂質為膽固醇。在某些實施例中，結構性脂質為膽固醇類似物。 2.此項技術中已知之其他遞送媒劑
在某些實施例中，此項技術中已知之其他遞送媒劑可用於輸送環狀RNA (亦即，為本文中涵蓋之轉移媒劑)。
在一些實施例中，脂質體或其他脂質雙層囊泡可用作組分或整個轉移媒劑以促進或增強環狀RAN至一或多個目標細胞之遞送及釋放。脂質體之特徵通常在於具有藉由一或多個形成微觀袋或囊泡之雙層之膜與外部介質螯合的內部空間。脂質體之雙層膜通常由包含在空間上分離之疏水性域或親水性域之脂質，亦即合成或天然來源之兩親媒性分子形成(Lasic, D及Papahadjopoulos, D.編Medical Applications of Liposomes. Elsevier, Amsterdam, 1998)。
在某些實施例中，用於輸送環狀RNA之轉移媒劑包含樹枝狀聚合物。「樹枝狀聚合物」之使用描述了轉移媒劑之建築模體。在一些實施例中，樹狀體包括但不限於含有內部核心及一或多個自內部核心延伸或連接出之層(亦即，世代)。在一些實施例中，產生物可含有一或多個分支點及連接至最外產生件之末端基之外部表面。在某些實施例中，分支點可大部分為單分散的且含有圍繞內部核心建構之對稱分支單元。在一些實施例中，內部核心。樹狀體之合成可包含發散方法、彙集生長、超核心及分枝單體生長、雙指數生長、樂高化學(lego chemistry)、點擊化學及此項技術中可用之其他方法(Mendes L等人, Molecules. 2017. 22 (9): 1401進一步描述此等方法)。
在某些實施例中，如本文所描述，用於環狀RNA構築體之轉移媒劑包含聚合物奈米粒子。在一些實施例中，聚合物奈米粒子包括奈米膠囊及奈米球。在一些實施例中，奈米膠囊由聚合殼包圍之油性核構成。在一些實施例中，環狀RNA含於核心內且聚合殼控制環狀RNA之釋放。另一方面，奈米球包含連續聚合物網，其中環狀RNA保留或吸收至表面上。在一些實施例中，由於陽離子與帶負電核酸及細胞膜存在有利的靜電相互作用，因此使用陽離子型聚合物來囊封環狀RNA。聚合物奈米粒子可藉由各種方法製備。在一些實施例中，聚合物奈米粒子可藉由奈米沉澱、乳液技術、溶劑蒸發、溶劑擴散、反向鹽析或此項技術中可用之其他方法來製備。
在某些實施例中，如本文所描述，用於環狀RNA構築體之轉移媒劑包含聚合物-脂質雜合奈米粒子(LPHNP)。在一些實施例中，LPHNP包含包膜於脂質雙層內之聚合物核心。在一些實施例中，聚合物核心囊封環狀RNA構築體。在一些實施例中，LPHNP進一步包含外部脂質雙層。在某些實施例中，此外部脂質雙層包含PEG-脂質、輔助脂質、膽固醇或此項技術中已知有助於基於脂質之奈米粒子之穩定性的其他分子。最接近聚合物核之脂質雙層減少了LPHNP形成過程中捕獲之環狀RNA的損失，且藉由防止水自轉移媒劑外部擴散至聚合物核中來防止聚合物核降解(Mukherjee等人, In J. Nanomedicine. 2019; 14: 1937-1952)。
在某些實施例中，可使用基於肽之遞送機制輸送環狀RNA。在一些實施例中，基於肽之遞送機制包含脂蛋白。基於待遞送藥物之大小，脂蛋白可為低密度脂蛋白(LDL)或高密度脂蛋白(HDL)。如US8734853B2中所見，高密度脂蛋白能夠在活體內及活體外輸送核酸。在特定實施例中，脂質組分包括膽固醇。在更特定實施例中，脂質組分包括膽固醇與膽固醇油酸酯之組合。
在某些實施例中，可使用碳水化合物載劑或糖-奈米膠囊輸送環狀RNA構築體。在某些實施例中，碳水化合物載劑包含經糖裝飾之奈米粒子、肽結合型樹狀體及醣結合型樹狀體、基於多醣之奈米粒子及此項技術中可用之其他基於碳水化合物之載劑。如本文所描述，碳水化合物分子之併入可經由合成方式進行。在一些實施例中，碳水化合物載劑包含多醣。此等多醣可由目標細胞之微生物細胞壁製成。舉例而言，已展示由甘露聚糖碳水化合物組成之碳水化合物載劑成功地遞送mRNA (Son等人, Nano Lett. 2020. 20(3): 1499-1509)。
在某些實施例中，如本文所提供，用於環狀RNA之轉移媒劑為糖奈米粒子(糖NP)。如此項技術中已知，糖奈米粒子含有包含金、氧化鐵、半導體奈米粒子或其組合之核心。在一些實施例中，使用碳水化合物使糖奈米粒子官能化。在某些實施例中，糖奈米粒子包含碳奈米管或石墨烯。在一個實施例中，糖奈米粒子包含基於多醣之糖NP (例如基於幾丁聚醣之糖NP)。在某些實施例中，糖奈米粒子為糖樹狀體。
在某些實施例中，如本文所提供，經由使用作為一種類型之胞外囊泡之胞外體轉移環狀RNA。胞泌體天然地由各種類型之細胞分泌且用作用於各種形式之運載物的轉運囊泡。在遞送期間，胞外體可含有且保護特異性mRNA、調節性微RNA、脂質及蛋白質(Luan等人., Acta Pharmacologica Sinica.  2017. 38:754-763)。胞外體可天然地為30 nm至125 nm。
在一些實施例中，胞外體可部分由免疫細胞製造。如Haney等人中所示，免疫細胞衍生之胞外體之使用能夠避免單核吞噬細胞(J Control Release. 2015. 207:18-30)。在一些實施例中，胞泌體可為樹突狀細胞、巨噬細胞、T細胞、B細胞或衍生自另一免疫細胞。如WO/2021/041473A1中所見，各種形式之不同長度之RNA可經由胞外體遞送進行轉運，胞外體遞送包括信使RNA (mRNA)、微小RNA (miRNA)、長基因間非編碼RNA (lincRNA)、長非編碼RNA (lncRNA)、非編碼RNA (ncRNA)、非信使RNA (nmRNA)、小RNA (sRNA)、小非信使RNA (smnRNA)、DNA損傷反應RNA (DD RNA)、胞外RNA (exRNA)、小核RNA (snRNA)、小核仁RNA (snoRNA)及前驅體信使RNA (pre-mRNA)。
在其他實施例中，轉移媒劑可包含完全或部分來自融合體。在一些實施例中，融合體衍生自生殖系包囊之內質網。在某些實施例中，生殖系包囊係來自果蠅卵巢。
在某些實施例中，環狀RNA構築體可使用非細胞且實際上經由機械遞送機制來轉運。在一些實施例中，此遞送方法包括微針、電穿孔、連續泵及/或基因槍。
在一些實施例中，環狀RNA構築體之轉移媒劑為包含鹽或緩衝劑之溶液或稀釋劑。 3.靶向
在一些實施例中，組合物使用靶向部分，其可結合(共價或非共價)至轉移媒劑以促進此類轉移媒劑在某些目標細胞或目標組織處之定位。舉例而言，靶向可藉由在轉移媒劑中或轉移媒劑上包括一或多個內源性靶向部分來介導，以促進向目標細胞或組織之分佈。目標組織辨識靶向部分有效地促進轉移媒劑及/或其內容物在目標細胞及組織中之組織分佈及細胞吸收(例如在轉移媒劑中或轉移媒劑上包括脂蛋白元-E靶向配位體促進了轉移媒劑之辨識及與由肝細胞表現之內源性低密度脂蛋白受體的結合)。
如本文所提供，該組合物可包含能夠增強該組合物對目標細胞之親和力的部分。靶向部分可在調配期間或調配後連接至脂質粒子之外部雙層。此等方法為此項技術中熟知的。另外，一些脂質粒子調配物可採用諸如PEAA、血球凝集素、其他脂肽(參見美國專利申請案第08/835,281號及第60/083,294號，該等案以引用之方式併入本文中)及可用於活體內及/或胞內遞送之其他特徵的促融聚合物。在其他一些實施例中，組合物展現出改進之轉染功效，及/或顯示對所關注之目標細胞或組織的增強之選擇性。因此，考慮包含一或多個能夠增強組合物及其核酸內容物針對目標細胞或組織之親和力之部分(例如肽、適體、寡核苷酸、維生素或其他分子)的組合物。適合之部分可視情況結合或連接至轉移媒劑之表面。在一些實施例中，靶向部分可跨越轉移媒劑之表面或囊封於轉移媒劑內。適合的部分係基於其物理、化學或生物特性(例如目標細胞表面標記物或特徵之選擇性親和力及/或辨識)來進行選擇。細胞特異性目標部位及其對應靶向配位體可廣泛變化。選擇適合之靶向部分以使得採用目標細胞之獨特特徵，因此允許組合物區分目標細胞與非目標細胞。舉例而言，在一些實施例中，組合物可包括選擇性增強對肝細胞之辨識或對肝細胞之親和力(例如，藉由受體介導之對該等表面標記物之辨識及與該等表面標記物之結合)的表面標記物(例如，脂蛋白元-B或脂蛋白元-E)。作為一實例，將預期使用半乳糖作為靶向部分以將組合物導引至實質肝細胞，或可替代地將預期使用含有糖殘基之甘露糖作為靶向配位體以將組合物導引至肝內皮細胞(例如，含有可較佳地結合於肝細胞中存在之去唾液酸醣蛋白受體之糖殘基的甘露糖)。(參見Hillery A M等人「Drug Delivery and Targeting: For Pharmacists and Pharmaceutical Scientists」 (2002) Taylor & Francis Inc.)因此，已結合至轉移媒劑中存在之部分(例如，脂質奈米粒子)之該等靶向部分之呈現促進目標細胞及組織中之組合物的辨識及吸收。適合之靶向部分之實例包括一或多種肽、蛋白質、適體、維生素及寡核苷酸。
在特定實施例中，轉移媒劑包含靶向部分。在一些實施例中，靶向部分將受體介導之胞吞作用選擇性介導至特定細胞群體中。在一些實施例中，靶向部分能夠結合至T細胞抗原。在一些實施例中，靶向部分能夠結合至NK、NKT或巨噬細胞抗原。在一些實施例中，靶向部分能夠結合至選自CD3、CD4、CD8、PD-1、4-1BB及CD2之群之蛋白質。在一些實施例中，靶向部分為單鏈Fv (scFv)片段、奈米抗體、肽、基於肽之大環、微型抗體、重鏈可變區、輕鏈可變區或其片段。在一些實施例中，靶向部分選自T細胞受體模體抗體、T細胞α鏈抗體、T細胞β鏈抗體、T細胞γ鏈抗體、T細胞δ鏈抗體、CCR7抗體、CD3抗體、CD4抗體、CD5抗體、CD7抗體、CD8抗體、CD11b抗體、CD11c抗體、CD16抗體、CD19抗體、CD20抗體、CD21抗體、CD22抗體、CD25抗體、CD28抗體、CD34抗體、CD35抗體、CD40抗體、CD45RA抗體、CD45RO抗體、CD52抗體、CD56抗體、CD62L抗體、CD68抗體、CD80抗體、CD95抗體、CD117抗體、CD127抗體、CD133抗體、CD137 (4-1BB)抗體、CD163抗體、F4/80抗體、IL-4Rα抗體、Sca-1抗體、CTLA-4抗體、GITR抗體GARP抗體、LAP抗體、顆粒酶B抗體、LFA-1抗體、運鐵蛋白受體抗體及其片段。在一些實施例中，靶向部分為淋巴球上之胞外酶之小分子結合劑。胞外酶之小分子結合劑包括A2A抑制劑CD73抑制劑、CD39或腺苷受體A2aR及A2bR。潛在小分子包括AB928。
在一些實施例中，轉移媒劑如Shobaki N, Sato Y, Harashima H. Mixing lipids to manipulate the ionization status of lipid nanoparticles for specific tissue targeting. Int J Nanomedicine. 2018;13:8395-8410. 公佈於2018年12月10日中所描述經調配及/或靶向。在一些實施例中，轉移媒劑由3種脂質類型構成。在一些實施例中，轉移媒劑由4種脂質類型構成。在一些實施例中，轉移媒劑由5種脂質類型構成。在一些實施例中，轉移媒劑由6種脂質類型構成。 F.醫藥組合物
本文提供一種醫藥組合物，其包含至少一個環狀RNA構築體及轉移媒劑。本文亦提供一種醫藥組合物，其包含本文所描述之至少一個環狀RNA構築體及醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，且如本文別處所描述，醫藥組合物包含至少一個環狀RNA構築體及包含可離子化脂質之轉移媒劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含至少一個環狀RNA構築體及轉移媒劑，其中該轉移媒劑為奈米粒子或脂質奈米粒子。
在一些實施例中，醫藥組合物包含至少一個環狀RNA構築體、奈米粒子及視情況包含可操作地連接至奈米粒子之靶向部分。在一些實施例中，奈米粒子為脂質奈米粒子(LNP)、核-殼奈米粒子、生物可降解奈米粒子、生物可降解脂質奈米粒子、聚合物奈米粒子、聚合複合體或生物可降解聚合物奈米粒子。在一些實施例中，醫藥組合物包含靶向部分，其中靶向部分在不存在細胞分離或純化之情況下將受體介導之胞吞作用、胞內體融合或直接融合介導至選定細胞群體或組織之選定細胞中。在一些實施例中，醫藥組合物包含可操作地連接至奈米粒子之靶向部分。在一些實施例中，靶向部分為小分子、scFv、奈米抗體、肽、環狀肽、二環狀肽或三環狀肽、微型抗體、聚核苷酸適體、經工程化之骨架蛋白、重鏈可變區、輕鏈可變區或其片段。在一些實施例中，組合物中小於1重量%之聚核苷酸為雙股RNA、DNA夾板、DNA模板或三磷酸化RNA。在一些實施例中，醫藥組合物中少於1重量%聚核苷酸及蛋白質為雙股RNA、DNA夾板、DNA模板、三磷酸化RNA、磷酸酶蛋白、蛋白質接合酶、RNA聚合酶及加帽酶。
本文亦提供一種醫藥組合物，其包含環狀RNA構築體及醫藥鹽、緩衝劑、稀釋劑或其組合。
在某些實施例中，本文提供包含本文所提供之治療劑的組合物(例如醫藥組合物)。在一些實施例中，治療劑為本文提供之環狀RNA聚核苷酸。在一些實施例中，治療劑為本文所提供之載體。在一些實施例中，治療劑為包含本文所提供之環狀RNA或載體之細胞(例如人類細胞，諸如人類T細胞)。在某些實施例中，該組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，本文提供之組合物包含本文提供之治療劑與其他醫藥活性劑或藥物(諸如抗炎藥或能夠靶向B細胞抗原之抗體，例如抗CD20抗體，例如利妥昔單抗(rituximab))的組合。
就醫藥組合物而言，醫藥學上可接受之載劑可為習知使用之彼等中之任一者，且僅受化學-物理考慮因素(諸如溶解度及缺乏與活性劑之反應性)及投與途徑限制。本文所描述之例如媒劑、佐劑、賦形劑及稀釋劑之醫藥學上可接受之載劑為熟習此項技術者所熟知且公眾容易獲得。較佳地，醫藥學上可接受之載劑為對(多種)治療劑呈化學惰性之載劑及在使用條件下無有害副作用或毒性之載劑。
載劑選擇將部分由特定治療劑以及用於投與治療劑之特定方法決定。因此，存在此項技術中已知之醫藥組合物的多種適合之調配物。在某些實施例中，醫藥組合物包含防腐劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含緩衝劑。
在一些實施例中，醫藥組合物中治療劑之濃度可變化，例如低於按重量計約1%，或至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%，或約50%或更高，且可主要藉由流體體積選擇，且在特定投與模式下。
經口、氣霧劑、非經腸(例如，皮下、靜脈內、動脈內、肌內、皮內、腹膜內及鞘內)及局部投與之調配物為此項技術中已知的。可使用超過一種途徑來投與本文提供之治療劑，且在某些情況下，特定途徑可提供比另一種途徑更直接且更有效的反應。
在某些實施例中，可將本文所提供之治療劑調配為諸如環糊精包合複合物之包合複合物或LNP或脂質體。
在一些實施例中，本文所提供之治療劑係在定時釋放型、延遲釋放型或持續釋放型遞送系統中調配以使得組合物之遞送在使所治療之部位致敏之前發生且遞送時間足以使所治療之部位致敏。此類系統可避免治療劑之重複投與，藉此增加個體及醫師之便利性，且可尤其適用於本文所提供之某些組合物實施例。在一個實施例中，調配組合物以使得其適合於其中所含之環狀RNA的延長釋放。可適宜地以延長之給藥間隔向個體投與該等延長釋放型組合物。舉例而言，在一個實施例中，組合物一天兩次、每天或每隔一天投與個體。在一個實施例中，每週兩次、每週一次、每十天、每兩週、每三週、每四週、每月一次、每六週、每八週、每三個月、每四個月、每六個月、每八個月、每九個月或每年一次向個體投與組合物。
在一些實施例中，由本發明聚核苷酸編碼之蛋白質由目標細胞在持續量之時間內產生。舉例而言，可在投與之後超過一小時、超過四小時、超過六小時、超過12小時、超過24小時、超過48小時或超過72小時產生蛋白質。在一些實施例中，多肽在投與之後約六小時以峰值含量表現。在一些實施例中，多肽表現至少維持在治療含量下。在一些實施例中，多肽在投與之後至少以治療含量表現超過一小時、超過四小時、超過六小時、超過12小時、超過24小時、超過48小時或超過72小時。在一些實施例中，多肽可在患者組織(例如肝或肺)中以治療含量偵測到。在一些實施例中，可偵測多肽之含量來自環狀RNA組合物在投與之後超過一個、超過四個、超過六個、超過12個、超過24個、超過48個或超過72小時的時間段內連續表現。
在一些實施例中，每天兩次、每天或每隔一天向個體投與本文所揭示之環狀RNA構築體(視情況與本文所揭示之轉移媒劑一起)。在一個實施例中，每週兩次、每週一次、每十天、每兩週、每三週、每四週、每月一次、每六週、每八週、每三個月、每四個月、每六個月、每八個月、每九個月或每年一次向個體投與組合物。
在一些實施例中，本文所揭示之環狀RNA構築體(視情況與本文所揭示之轉移媒劑一起)每隔一天投與。在一些實施例中，本文所揭示之環狀RNA構築體(視情況與本文所揭示之轉移媒劑一起)一週一次(亦即，每週一次)投與。在一些實施例中，本文所揭示之環狀RNA構築體(視情況與本文所揭示之轉移媒劑一起)每兩週(亦即，每隔一週或兩週一次，q2w)投與。在一些實施例中，相比於適合之比較劑(例如，相應線性RNA)所需要，本文所揭示之環狀RNA構築體(視情況與本文所揭示之轉移媒劑一起)之投與頻率較低及/或以較低劑量出現。
在某些實施例中，由本發明聚核苷酸編碼之蛋白質以高於正常生理含量之含量產生。與對照相比，蛋白質含量可增加。在一些實施例中，對照為正常個體中或正常個體群體中多肽之基線生理含量。在其他實施例中，對照為在缺乏相關蛋白質或多肽之個體中或在缺乏相關蛋白質或多肽之個體群體中之多肽之基線生理含量。在一些實施例中，對照可為投與組合物之個體中相關蛋白質或多肽之正常含量。在其他實施例中，對照為在其他治療性干預後，例如在直接注射對應多肽後，在一或多個可比時間點之多肽之表現量。
在某些實施例中，由本發明聚核苷酸編碼之蛋白質之含量可在投與之後3天、4天、5天或1週或更長時間偵測到。可在組織(例如肝或肺)中觀測到增加含量之蛋白質。
在一些實施例中，該方法產生由本發明聚核苷酸編碼之蛋白質的持續循環半衰期。舉例而言，可偵測到蛋白質之時間比經由皮下注射蛋白質或編碼蛋白質之mRNA觀測到之半衰期長數小時或數天。在一些實施例中，蛋白質之半衰期為1天、2天、3天、4天、5天或1週或更長時間。
不同類型之釋放遞送系統為組合物可用的且為一般熟習技術者所已知。
在某些實施例中，組合物可裝載有診斷性放射性核種、螢光材料或在活體外及活體內應用中可偵測之其他材料。舉例而言，適合之診斷材料可包括若丹明-二油醯基磷脂醯乙醇胺(Rh-PE)、綠色螢光蛋白質環狀RNA (GFP環狀RNA)、海腎螢光素酶環狀RNA及螢火蟲螢光素酶環狀RNA。 III.方法 A.製備方法 1.前驅體RNA製備
DNA模板(例如，包含3'增強型內含子元件、3'增強型外顯子元件、包括IRES及表現序列之核心功能元件、5'增強型外顯子元件及5'增強型內含子元件)之轉錄引起能夠環化之前驅體線性RNA聚核苷酸形成。在一些實施例中，此DNA模板包含載體、PCR產物、質體、小環DNA、黏質體、人工染色體、互補DNA (cDNA)、染色體外DNA (ecDNA)或其中之片段。在某些實施例中，小環DNA可為線性化或非線性化的。在某些實施例中，質體可為線性化或非線性化的。在一些實施例中，DNA模板可為單股的。在其他實施例中，DNA模板可為雙股的。在一些實施例中，DNA模板全部或部分地包含病毒、細菌或真核載體。
在一些實施例中，DNA模板在前驅體線性RNA聚核苷酸(例如，3'增強型內含子元件、3'增強型外顯子元件、核心功能元件及5'增強型外顯子元件、5'增強型內含子元件)之剪接之前共有與前驅體線性RNA聚核苷酸相同的序列。在一些實施例中，該線性前驅體RNA聚核苷酸經歷剪接，使得在環化過程期間移除3'增強型內含子元件及5'增強型內含子元件。在一些實施例中，所得環狀RNA聚核苷酸缺乏3'增強型內含子片段及5'增強型內含子片段，但維持3'增強型外顯子片段、核心功能元件及5'增強型外顯子元件。
在一些實施例中，當在存在一或多種鳥苷核苷酸或核苷(例如GTP)及二價陽離子(例如Mg 2 +)之情況下培育時，前驅體線性RNA聚核苷酸環化。在一些實施例中，3'增強型外顯子元件、5'增強型外顯子元件及/或核心功能元件完全或部分地促進前驅體線性RNA聚核苷酸之環化以形成本文所提供之環狀RNA構築體。
在某些實施例中，本文所提供之環狀RNA係在細胞內部產生。在一些實施例中，在細胞質中藉由噬菌體RNA聚合酶或在核中藉由宿主RNA聚合酶II使用DNA模板(例如在一些實施例中使用本文所提供之載體)轉錄前驅體RNA且隨後環化。
本文所提供之前驅體RNA可藉由在准許轉錄由DNA模板編碼之前驅體RNA之條件下培育本文所提供之DNA模板來產生。舉例而言，在一些實施例中，前驅體RNA係藉由在准許活體外轉錄之條件下將本文所提供之DNA模板與可相容RNA聚合酶一起培育來合成，該DNA模板包含在其5'雙螺旋體序列及/或表現序列上游之RNA聚合酶啟動子。在一些實施例中，DNA模板在細胞內部藉由噬菌體RNA聚合酶培育或在細胞之細胞核中藉由宿主RNA聚合酶II培育。
在某些實施例中，本文提供藉由使用本文所提供之DNA模板作為模板(例如本文所提供之具有位於5'雙螺旋體區上游之RNA聚合酶啟動子之載體)執行活體外轉錄來產生前驅體RNA的方法。
在某些實施例中，所得前驅體RNA可用於藉由在鎂離子及鳥苷核苷酸或核苷存在下在RNA環化發生之溫度下(例如在20℃與60℃之間)培育來產生環狀RNA(例如，本文所提供之環狀RNA構築體)。前驅體RNA一般描述於WO2022/261490中，其以全文引用之方式併入本文中。 2.環狀RNA製備
本文亦提供一種製備或產生環狀RNA之方法。在某些實施例中，該方法包含使用載體作為模板藉由轉錄(例如，徑流轉錄)合成前驅體RNA，且在二價陽離子(例如，鎂離子)及GTP存在下培育所得前驅體RNA以使得其環化形成環狀RNA。在一些實施例中，本發明前驅體RNA能夠在不存在鎂離子及GTP的情況下及/或在無與鎂離子及GTP一起培育之步驟的情況下環化。在一些實施例中，轉錄在過量GMP存在下進行。
因此，在某些實施例中，本文提供製造環狀RNA之方法。在某些實施例中，該方法包含藉由使用本文所提供之載體(例如5'增強型內含子元件、5'增強型外顯子元件、核心功能元件、3'增強型外顯子元件及3'增強型內含子元件)作為模板進行轉錄(例如失控轉錄(run-off transcription))合成前驅體RNA，且在存在二價陽離子(例如鎂離子)及GTP之情況下培育所得前驅體RNA以使得其環化以形成環狀RNA。在一些實施例中，本文所揭示之前驅體RNA能夠在不存在鎂離子及GTP的情況下及/或在無與鎂離子及GTP一起培育之步驟的情況下環化。已發現，環狀RNA具有相對於對應mRNA降低之免疫原性，此至少部分因為mRNA含有免疫原性5'帽。當自某些啟動子(例如T7啟動子)轉錄DNA載體以產生前驅體RNA時，應理解，前驅體RNA之5'端為G。為了降低含有低含量之污染物線性mRNA之環狀RNA組合物的免疫原性，可在轉錄期間提供相對於GTP過量之GMP以使得大部分轉錄本含有無法加帽之5' GMP。因此，在一些實施例中，轉錄係在存在過量GMP之情況下進行。在一些實施例中，進行轉錄，其中GMP濃度與GTP濃度之比在約3:1至約15:1範圍內，例如約3:1至約10:1、約3:1至約5:1、約3:1、約4:1或約5:1。
在一些實施例中，包含環狀RNA之組合物已經純化。環狀RNA可藉由諸如管柱層析法、凝膠過濾層析法及粒徑排阻層析法之此項技術中常用之任何已知方法來純化。在一些實施例中，純化包含以下步驟中之一或多者：磷酸酶處理、HPLC粒徑排阻純化及核糖核酸酶R消化。在一些實施例中，純化按次序包含以下步驟：核糖核酸酶R消化、磷酸酶處理及HPLC粒徑排阻純化。在一些實施例中，純化包含逆相HPLC。在一些實施例中，經純化組合物含有比未經純化RNA少之雙股RNA、DNA夾板、三磷酸化RNA、磷酸酶蛋白、蛋白質接合酶、加帽酶及/或帶切口RNA。在一些實施例中，環狀RNA之純化包含本文所描述之親和純化或負向選擇方法。在一些實施例中，環狀RNA之純化包含使用與線性RNA中之序列互補但不與環狀RNA中之序列互補的寡核苷酸將線性RNA與環狀RNA分離。在一些實施例中，經純化組合物之免疫原性低於未經純化組合物之免疫原性。在一些實施例中，暴露於經純化組合物之免疫細胞產生比暴露於未經純化組合物之免疫細胞更少的TNFα、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ及/或例如IFN-β1之1型干擾素。
前驅體RNA環化之例示性方法可見於例如WO2020/237227中，其以全文引用的方式併入本文中。WO2020/237227尤其描述使用排列之內含子外顯子(PIE)環化策略使長前驅體RNA環化。在其中，將含有全長腦心肌炎病毒(EMCV) IRES之1.1 kb序列、高斯螢光素酶(GLuc)表現序列及經排列內含子-外顯子(PIE)構築體之兩個短外顯子片段插入T4噬菌體之胸苷酸合成酶(Td)基因中之經排列第I組催化性內含子中之3'內含子與5'內含子之間。藉由失控轉錄來合成前驅體RNA。藉由在存在鎂離子及GTP之情況下加熱前驅體RNA來嘗試環化，但未獲得剪接產物。設計完美互補的9個核苷酸長之同源性區及19個核苷酸長之同源性區，且在前驅體RNA之5'端及3'端添加。用核糖核酸酶R處理剪接產物。跨經核糖核酸酶R處理之剪接反應物之推定剪接接合點的定序顯露已連接之外顯子，且用靶向寡核苷酸之核糖核酸酶H消化經核糖核酸酶R處理之剪接反應物產生單帶，此與經核糖核酸酶H消化之線性前驅體產生之雙帶形成對比。WO2020/237227進一步指示，設計一系列間隔子且插入3' PIE剪接位點與IRES之間。此等間隔子經設計以保留或破壞IRES、3' PIE剪接位點及/或5'剪接位點中之內含子序列內之二級結構。
用於製備環狀RNA之其他方法描述於WO2022/261490中，其以全文引用之方式併入本文中。 3.脂質奈米粒子製備
在一個實施例中，脂質奈米粒子調配物可藉由國際公開案第WO2011127255號或WO2008103276號中所描述之方法來製備，該等案中之各者以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物可如國際公開案第WO2019131770號中所描述，該案以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，環狀RNA係根據美國專利申請案15/809,680中所描述之方法來調配。在一些實施例中，本發明提供將環狀RNA囊封於轉移媒劑中之方法，其包含以下步驟：使脂質成形為預成形之轉移媒劑(亦即在不存在RNA之情況下形成)，且隨後將預成形之轉移媒劑與RNA組合。在一些實施例中，與在無預先形成脂質奈米粒子之步驟之情況下(例如將脂質直接與RNA組合)製備之相同RNA調配物相比，新穎調配方法產生在活體外及活體內均具有較高效力(肽或蛋白質表現)及較高功效(生物學上相關之終點改善)以及潛在較好的耐受性之RNA調配物。
對於RNA之某些陽離子型脂質奈米粒子調配物，為了達成RNA之高度囊封，必須加熱於緩衝液(例如檸檬酸鹽緩衝液)中之RNA。在彼等過程或方法中，在調配過程之前需要進行加熱(亦即，加熱單獨組分)，此係因為調配後(奈米粒子形成後)加熱並不會提高脂質奈米粒子中RNA之囊封效率。相比之下，在一些實施例中，加熱RNA之順序似乎不影響RNA囊封百分比。在一些實施例中，不需要在調配過程之前或之後對包含預先形成之脂質奈米粒子之溶液、包含RNA之溶液及包含經脂質奈米粒子囊封之RNA之混合溶液中的一或多者進行加熱(亦即維持在環境溫度下)。
RNA可提供於待與脂質溶液混合之溶液中，以使得RNA可囊封於脂質奈米粒子中。適合的RNA溶液可為任何含有待以各種濃度囊封之RNA之水溶液。舉例而言，適合的RNA溶液可含有濃度為或大於約0.01 mg/ml、0.05 mg/ml、0.06 mg/ml、0.07 mg/ml、0.08 mg/ml、0.09 mg/ml、0.1 mg/ml、0.15 mg/ml、0.2 mg/ml、0.3 mg/ml、0.4 mg/ml、0.5 mg/ml、0.6 mg/ml、0.7 mg/ml、0.8 mg/ml、0.9 mg/ml或1.0 mg/ml之RNA。在一些實施例中，適合的RNA溶液可含有濃度在約0.01-1.0 mg/ml、0.01-0.9 mg/ml、0.01-0.8 mg/ml、0.01-0.7 mg/ml、0.01-0.6 mg/ml、0.01-0.5 mg/ml、0.01-0.4 mg/ml、0.01-0.3 mg/ml、0.01-0.2 mg/ml、0.01-0.1 mg/ml、0.05-1.0 mg/ml、0.05-0.9 mg/ml、0.05-0.8 mg/ml、0.05-0.7 mg/ml、0.05-0.6 mg/ml、0.05-0.5 mg/ml、0.05-0.4 mg/ml、0.05-0.3 mg/ml、0.05-0.2 mg/ml、0.05-0.1 mg/ml、0.1-1.0 mg/ml、0.2-0.9 mg/ml、0.3-0.8 mg/ml、0.4-0.7 mg/ml或0.5-0.6 mg/ml範圍內之RNA。
通常，適合的RNA溶液亦可含有緩衝劑及/或鹽。一般而言，緩衝劑可包括HEPES、Tris、硫酸銨、碳酸氫鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、磷酸鉀或磷酸鈉。在一些實施例中，緩衝劑之適合濃度可在約0.1 mM至100 mM、0.5 mM至90 mM、1.0 mM至80 mM、2 mM至70 mM、3 mM至60 mM、4 mM至50 mM、5 mM至40 mM、6 mM至30 mM、7 mM至20 mM、8 mM至15 mM或9 mM至12 mM範圍內。
例示性鹽可包括氯化鈉、氯化鎂及氯化鉀。在一些實施例中，RNA溶液中鹽之適合濃度可在約1 mM至500 mM、5 mM至400 mM、10 mM至350 mM、15 mM至300 mM、20 mM至250 mM、30 mM至200 mM、40 mM至190 mM、50 mM至180 mM、50 mM至170 mM、50 mM至160 mM、50 mM至150 mM或50 mM至100 mM範圍內。
在一些實施例中，適合的RNA溶液之pH可在約3.5-6.5、3.5-6.0、3.5-5.5、3.5-5.0、3.5-4.5、4.0-5.5、4.0-5.0、4.0-4.9、4.0-4.8、4.0-4.7、4.0-4.6或4.0-4.5範圍內。
可使用各種方法製備適合之RNA溶液。在一些實施例中，RNA可直接溶解於本文所描述之緩衝溶液中。在一些實施例中，可藉由在與用於囊封之脂質溶液混合之前將RNA儲備溶液與緩衝溶液混合來產生RNA溶液。在一些實施例中，可藉由在即將與用於囊封之脂質溶液混合之前將RNA儲備溶液與緩衝溶液混合來產生RNA溶液。
根據本發明，脂質溶液含有適合於形成用於囊封RNA之轉移媒劑的脂質混合物。在一些實施例中，適合的脂質溶液為基於乙醇的。舉例而言，適合之脂質溶液可含有溶解於純乙醇(亦即，100%乙醇)中之所需脂質之混合物。在另一實施例中，適合的脂質溶液為基於異丙醇的。在另一實施例中，適合的脂質溶液為基於二甲亞碸的。在另一實施例中，適合的脂質溶液為包括但不限於乙醇、異丙醇及二甲亞碸之適合溶劑之混合物。
適合的脂質溶液可含有各種濃度之所需脂質之混合物。在一些實施例中，適合的脂質溶液可含有總濃度在約0.1-100 mg/ml、0.5-90 mg/ml、1.0-80 mg/ml、1.0-70 mg/ml、1.0-60 mg/ml、1.0-50 mg/ml、1.0-40 mg/ml、1.0-30 mg/ml、1.0-20 mg/ml、1.0-15 mg/ml、1.0-10 mg/ml、1.0-9 mg/ml、1.0-8 mg/ml、1.0-7 mg/ml、1.0-6 mg/ml或1.0-5 mg/ml範圍內之所需脂質之混合物。
可在1個流體流中或用諸如微流體及兩個流體流之T-接合點混合之混合方法製造奈米粒子，其中之一者含有環狀RNA且另一者具有脂質組分。例示性脂質組合物可根據方法且以實例1及表4a-b中所描述之比率製備。
在一些實施例中，本文所描述之脂質奈米粒子可使用包含例如以下之方法合成：微流體混合器、微結構引發之混亂平流(MICA)、狹縫交叉指微結構混合器(SIMM-V2)或標準狹縫交叉指微結構混合器(SSIMM)或履帶(CPMM)或來自Institut fur Mikrotechnik Mainz GmbH, Mainz Germany之衝擊射流(IJMM)，使用微混合器晶片及/或使用技術。例示性混合器及方法為此項技術中已知的。
額外脂質奈米粒子調配物及生產方法詳細描述於WO2021226597及WO2021113777中，其以全文引用之方式併入本文中。
舉例而言，WO2021226597及WO2021113777中所揭示為一種製備表3之可離子化脂質128及129之脂質奈米粒子調配物的方法。乙醇相含有表3之可離子化脂質128或脂質129、DOPE、膽固醇及DSPE-PEG 2000 (Avanti Polar Lipids公司)，其重量比為16:1:4:1或莫耳比為62:4:33:1，與含有環狀RNA及25 mM乙酸鈉緩衝劑之水相組合，pH 5.2。使用3:1水與乙醇混合比。隨後，在1 L水中透析所調配之LNP且經18小時交換2次。使用0.2 µm過濾器過濾經透析LNP。在活體內給藥之前，將LNP稀釋於PBS中。藉由動態光散射測定LNP大小。使用Malvern Panalytical Zetasizer Pro量測具有1 mL含20 µg/mL LNP之PBS (pH 7.4)的光析槽以獲得Z平均值。記錄Z平均值及多分散性指數。
製備奈米粒子組合物及合成某些可離子化脂質(例如，用於脂質奈米粒子)之額外例示性方法可見於實例1及2中。 B.治療方法
本文亦提供一種治療有需要之個體之方法，其包含投與治療有效量之本文所提供之環狀RNA構築體。在一些實施例中，本文提供一種治療有需要之個體之方法，其包含投與治療有效量之包含本文提供之環狀RNA構築體的組合物。在一些實施例中，除環狀RNA構築體以外，投與遞送媒劑及視情況可操作地連接至遞送媒劑之靶向部分。
因此，在某些實施例中，本文提供治療及/或預防個體(例如，哺乳動物個體，諸如人類個體)之疾病的方法。不受特定理論或機制束縛，其中環狀RNA編碼CAR，CAR具有生物活性，例如識別抗原，例如CD19、HER2或BCMA之能力，使得CAR當由細胞表現時能夠介導針對表現CAR特異性之抗原，例如CD19、HER2或BCMA之細胞的免疫反應。就此而言，本文提供之實施例提供一種治療或預防個體之癌症的方法，其包含向該個體投與環狀RNA治療劑及/或以可有效治療或預防個體之癌症之量的本文所提供之醫藥組合物。
在一些實施例中，該個體患有選自由以下組成之群之癌症：急性骨髓白血病(AML)；齒槽橫紋肌肉瘤；B細胞惡性病；膀胱癌(bladder cancer) (例如膀胱癌(bladder carcinoma))；骨癌；腦癌(例如神經管胚細胞瘤及多形性神經膠質母細胞瘤)；乳癌；肛門癌、肛管癌或肛門直腸癌；眼癌；肝內膽管癌；關節癌；頸癌；膽囊癌；胸膜癌；鼻癌、鼻腔癌或中耳癌；口腔癌；外陰癌；慢性淋巴球性白血病；慢性骨髓癌；結腸癌；食道癌、子宮頸癌；纖維肉瘤；腸胃類癌瘤；頭頸癌(例如頭頸鱗狀細胞癌)；霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)；下咽癌；腎癌；喉頭癌；白血病；液體腫瘤；脂肪瘤；肝癌；肺癌(例如非小細胞肺癌、肺腺癌及小細胞肺癌)；淋巴瘤；間皮瘤；肥胖細胞瘤；黑色素瘤；多發性骨髓瘤；鼻咽癌；非霍奇金淋巴瘤；慢性B淋巴球性白血病；毛細胞白血病；伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)；卵巢癌；胰臟癌；腹膜癌；胃系膜癌；腸系膜癌；咽癌；前列腺癌；直腸癌；腎癌；皮膚癌；小腸癌；軟組織癌；實體腫瘤；滑液肉瘤；胃癌；畸胎瘤；睾丸癌；甲狀腺癌；及輸尿管癌。
在一些實施例中，個體患有自體免疫疾病或病症。
在一些實施例中，該個體患有選自以下之自體免疫疾病或病症：硬皮病、格雷氏病(Grave's disease)、克隆氏病(Crohn's disease)、休格連氏病(Sjogren's disease)、多發性硬化症、橋本氏病(Hashimoto's disease)、牛皮癬、重症肌無力、自體免疫多內分泌病變症候群、I型糖尿病(TIDM)、自體免疫胃炎、自體免疫葡萄膜視網膜炎、多發性肌炎、結腸炎、甲狀腺炎及以人類狼瘡為代表之全身性自體免疫疾病。
在一些實施例中，個體患有B細胞介導之自體免疫疾病或病症。
在一些實施例中，該個體患有狼瘡，例如全身性紅斑狼瘡(SLE)、皮膚紅斑性狼瘡(CLE)、狼瘡性腎炎(LN)、新生兒狼瘡、藥物誘導之狼瘡。
在個體中具有抗合成酶症候群、多灶性運動神經病變、重症肌無力、視神經脊髓炎、尋常天疱瘡及/或全身性硬化症。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之癌症的方法，其包含引入本文所揭示之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之癌症之方法，其包含引入本文所揭示之編碼CD19 CAR之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之癌症的方法，其包含引入本文所揭示之編碼HER2 CAR之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之癌症的方法，包含引入本文所揭示之編碼BCMA CAR之環狀RNA及/或其醫藥組合物。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之B細胞淋巴瘤，例如大B細胞淋巴瘤的方法，其包含引入本文所揭示之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之B細胞淋巴瘤，例如大B細胞淋巴瘤之方法，其包含引入本文所揭示之編碼CD19 CAR之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之B細胞淋巴瘤，例如大B細胞淋巴瘤之方法，其包含引入本文所揭示之編碼CD19 CAR及包含IRES之環狀RNA及/或其醫藥組合物。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之套細胞淋巴瘤的方法，其包含引入本文所揭示之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之套細胞淋巴瘤的方法，包含引入本文所揭示之編碼CD19 CAR之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之套細胞淋巴瘤的方法，包含引入本文所揭示之編碼CD19 CAR及包含IRES之環狀RNA及/或其醫藥組合物。
在一些實施例中，本文提供治療及/或預防個體之多發性骨髓瘤之方法，其包含引入本文所揭示之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之多發性骨髓瘤的方法，其包含引入本文所揭示之編碼BCMA CAR之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之多發性骨髓瘤的方法，其包含引入本文所揭示之編碼BCMA CAR及包含IRES之環狀RNA及/或其醫藥組合物。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之實體腫瘤的方法，其包含引入本文所揭示之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供治療個體之實體腫瘤之方法，其包含引入本文所揭示之編碼HER2 CAR之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之實體腫瘤的方法，其包含引入本文所揭示之編碼HER2 CAR及包含IRES之環狀RNA及/或其醫藥組合物。
在2022，Mackensen等人報導用於難治性全身性紅斑性狼瘡症之同情使用抗CD19 CART細胞療法，其中來自SLE患者之自體T細胞「經慢病毒抗CD19 CAR載體轉導，擴增及重新輸注至淋巴球耗乏之後的患者中。活體內擴增之CAR T細胞引起B細胞之深度耗乏，臨床症狀之改善及實驗室參數之標準化，包括抗雙股DNA抗體之血清轉化。3個月之後在所有五名患者中實現根據DORIS準則之SLE緩解，且3個月之後中值(範圍)全身性紅斑性狼瘡症疾病活性指數評分為0(2)。」 Mackensen等人, Anti-CD19 CAR T cell therapy for refractory systemic lupus erythematosus, Nature Medicine (2022)；亦參見Nunez等人, Cytokine and reactivity profiles in SLE patients following anti-CD19 CART therapy, Molecular Therapy (2023)；兩者之內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之自體免疫疾病，例如B細胞介導之自體免疫疾病，例如狼瘡之方法，其包含引入本文所揭示之編碼CD19 CAR之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之狼瘡之方法，其包含引入本文所揭示之編碼CD19 CAR之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之SLE之方法，其包含引入本文所揭示之編碼CD19 CAR之環狀RNA及/或其醫藥組合物。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之自體免疫疾病，例如B細胞介導之自體免疫疾病，例如狼瘡之方法，其包含引入本文所揭示之編碼CD19 CAR及包含IRES之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之狼瘡之方法，其包含引入本文所揭示之編碼CD19 CAR及包含IRES之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之SLE之方法，其包含引入本文所揭示之編碼CD19 CAR及包含IRES之環狀RNA及/或其醫藥組合物。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之自體免疫疾病，例如B細胞介導之自體免疫疾病，例如狼瘡之方法，其包含引入本文所揭示之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之狼瘡之方法，其包含引入本文所揭示之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之SLE之方法，其包含引入本文所揭示之環狀RNA及/或其醫藥組合物。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之自體免疫疾病，例如B細胞介導之自體免疫疾病，例如狼瘡之方法，其包含引入本文所揭示之編碼CD19 CAR之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之狼瘡之方法，其包含引入本文所揭示之編碼CD19 CAR之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之SLE之方法，其包含引入本文所揭示之編碼CD19 CAR之環狀RNA及/或其醫藥組合物。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之自體免疫疾病，例如B細胞介導之自體免疫疾病，例如狼瘡之方法，其包含引入本文所揭示之編碼CD19 CAR及包含IRES之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之狼瘡之方法，其包含引入本文所揭示之編碼CD19 CAR及包含IRES之環狀RNA及/或其醫藥組合物。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之SLE之方法，其包含引入本文所揭示之編碼CD19 CAR及包含IRES之環狀RNA及/或其醫藥組合物。
轉移媒劑可較佳地分佈至特定目標細胞，諸如免疫細胞(例如，T細胞、NK細胞、巨噬細胞等)，或心臟、肺、腎、肝及脾。在一些實施例中，組合物分佈至肝或脾之細胞中以便於包含於其中之環狀RNA之遞送及隨後肝之細胞(例如肝細胞)或脾之細胞(例如免疫細胞)對其之表現。靶向細胞可充當能夠產生且全身分泌功能性蛋白或酶之生物「儲集器」或「儲槽」。因此，在本發明之一個實施例中，轉移媒劑可靶向肝細胞或免疫細胞及/或在遞送時較佳地分佈至肝臟或脾臟之細胞。在一實施例中，在轉染目標肝細胞或免疫細胞之後，媒劑中所裝載之環狀RNA經轉譯，且產生、排出及全身分佈功能性蛋白產物。在其他實施例中，除肝細胞以外之細胞(例如，肺、脾臟、心臟、眼或中樞神經系統之細胞)可充當用於蛋白質生產之儲槽位置。亦可製備用於優先靶向包括但不限於以下之各種目標細胞的本發明之組合物：肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、內皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神經細胞(例如腦膜細胞、星形細胞、運動神經元細胞、背根節細胞及前角運動神經元細胞)、感光受體細胞(例如桿狀體及錐體)、視網膜色素上皮細胞、分泌細胞、心臟細胞、脂肪細胞、血管平滑肌細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、β細胞、腦垂體細胞、滑液襯裡細胞、卵巢細胞、睾丸細胞、纖維母細胞、B細胞、T細胞、網狀紅血球、白血球、顆粒球及腫瘤細胞。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之疾病或病症的方法，其包含將環狀RNA及/或其醫藥組合物引入個體之T細胞。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之疾病或病症的方法，其包含將環狀RNA及/或其醫藥組合物引入個體之輔助T細胞。在一些實施例中，本文提供一種治療個體之疾病或病症的方法，其包含將環狀RNA及/或其醫藥組合物引入個體之細胞毒性T細胞。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之疾病或病症的方法，其包含將環狀RNA及/或其醫藥組合物引入個體之NK細胞。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之疾病或病症之方法，其包含將環狀RNA及/或其醫藥組合物引入個體之巨噬細胞。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之疾病或病症的方法，其包含將環狀RNA及/或其醫藥組合物引入個體之骨髓細胞。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之疾病或病症的方法，其包含將環狀RNA及/或其醫藥組合物引入個體之單核球。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之疾病或病症的方法，其包含將環狀RNA及/或其醫藥組合物引入個體之CD3+細胞。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之疾病或病症的方法，其包含將環狀RNA及/或其醫藥組合物引入個體之CD4+細胞。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之疾病或病症的方法，其包含將環狀RNA及/或其醫藥組合物引入個體之CD8+細胞。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之疾病或病症的方法，其包含將環狀RNA及/或其醫藥組合物引入個體之CD14+細胞。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之疾病或病症的方法，其包含將環狀RNA及/或其醫藥組合物引入個體之CD16+細胞。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之疾病或病症的方法，其包含將環狀RNA及/或其醫藥組合物引入個體之CD33+細胞。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之疾病或病症的方法，其包含將環狀RNA及/或其醫藥組合物引入個體之CD33+CD14+細胞。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之疾病或病症的方法，其包含將環狀RNA及/或其醫藥組合物引入個體之CD33+CD64+細胞。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之疾病或病症的方法，其包含將環狀RNA及/或其醫藥組合物引入個體之CD56+細胞。
在一些實施例中，本文提供一種治療及/或預防個體之疾病或病症的方法，其包含將環狀RNA及/或其醫藥組合物引入個體之CD11B+細胞。
在某些實施例中，本文所提供之治療劑(亦即，環狀RNA構築體及其組合物)及轉移媒劑(例如，脂質奈米粒子)展現出轉染一或多個目標細胞之增強(例如，增加)的能力。因此，本文亦提供轉染一或多種目標細胞之方法。此類方法一般包含使一或多種目標細胞與本文所揭示之化合物及/或醫藥組合物接觸以使得一或多種目標細胞用囊封於其中之環狀RNA轉染的步驟。如本文所用，術語「轉染(transfect)」或「轉染(transfection)」係指將一或多種經囊封材料(例如核酸及/或聚核苷酸)胞內引入細胞中，或較佳引入目標細胞中。術語「轉染效率(transfection efficiency)」係指藉由引入進行轉染之目標細胞中及/或由進行轉染之目標細胞表現而吸收之此類經囊封材料(例如聚核苷酸)之相對量。在一些實施例中，轉染效率可藉由轉染後目標細胞所產生之報導體聚核苷酸產物之量進行估計。在一些實施例中，轉移媒劑具有高轉染效率。在一些實施例中，轉移媒劑具有至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%轉染效率。
在某些實施例中，向個體投與本文所揭示之環狀RNA構築體或包含環狀RNA構築體之組合物。在一些實施例中，投與一天兩次、每天或每隔一天進行。在某些實施例中，投與一週兩次、一週一次、每十天、每兩週、每三週、每四週、一月一次、每六週、每八週、每三個月、每四個月、每六個月、每八個月、每九個月或每年進行。在一些實施例中，投與每隔一天進行。在一些實施例中，投與一週一次(亦即，每週一次)進行。在一些實施例中，投與每兩週(亦即，每隔一週或兩週一次，q2w)進行。在一些實施例中，投與比適合之比較劑(例如，相應線性RNA)所需更低頻率及/或以更低劑量進行。
在某些實施例中，本文所提供之治療劑(亦即，環狀RNA構築體及其組合物)與一或多種額外治療劑共同投與，例如在同一醫藥組合物中或在各別醫藥組合物中。在一些實施例中，可首先投與本文所提供之治療劑，且可其次投與一或多種額外治療劑，或反之亦然。或者，本文所提供之治療劑及一或多種額外治療劑可同時投與。在一些實施例中，治療劑在時間上足夠接近地共投與，使得本文所提供之治療劑可增強一或多種額外治療劑之作用，或反之亦然。
在某些實施例中，該等方法進一步包含在投與治療劑之前使個體之淋巴球耗乏。淋巴球耗乏之實例包括(但不限於)非清髓性淋巴球耗乏化學療法、清髓性淋巴球耗乏化學療法、全身照射等。
在一些實施例中，個體為哺乳動物。在一些實施例中，本文所提及之哺乳動物可為任何哺乳動物，包括但不限於嚙齒目之哺乳動物，諸如小鼠及倉鼠；或兔形目之哺乳動物，諸如兔。哺乳動物可來自食肉目，包括貓科動物(貓)及犬科動物(犬)。哺乳動物可來自偶蹄目(Artiodactyla)，包括牛科動物(Bovines)(奶牛)及豬科動物(Swines)(豬)或奇蹄目(Perssodactyla)，包括馬科動物(Equines)(馬)。哺乳動物可為靈長目、四足猴目或猴目(猴)或類人猿目(人類及猿)。較佳地，哺乳動物為人類。 實例
提供以下實例以說明某些所揭示實施例且不應視為以任何方式限制本發明之範疇。 實例1：產生脂質奈米粒子組合物
為了研究用於將環狀RNA遞送至細胞之安全且有效的奈米粒子組合物，製備且測試一系列調配物。具體言之，使奈米粒子組合物之脂質組分中之特定成分及其比率最佳化。
可在1個流體流中或用諸如微流體及兩個流體流之T-接合點混合之混合方法製造奈米粒子，其中之一者含有環狀RNA且另一者具有脂質組分。
包括藉由將可離子化脂質、視情況選用之輔助脂質(諸如，DOPE、DSPC或油酸，可獲自Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)、PEG脂質(諸如1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇，亦稱為PEG-DMG，可獲自Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)及結構性脂質(諸如，膽固醇)合併來製備呈約例如40或50 mM於例如乙醇之溶劑中之濃度的脂質組合物。溶液應冷藏儲存在例如-20℃下。將脂質合併，得到所需莫耳比(參見例如下表4a及表4b)，且用水及乙醇稀釋至例如在約5.5 mM與約25 mM之間的最終脂質濃度。 表4a：脂質奈米粒子調配物
調配物編號 說明書
1 將C12-200、DOPE、Chol及DMG-PEG2K (40:30:25:5)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地由1 mg/mL儲備液製備環狀RNA之緩衝水溶液(10 mM檸檬酸鹽/150 mM NaCl，pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪，得到於20%乙醇中之最終懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液，用1×PBS (pH 7.4)透濾，濃縮且儲存於2-8℃下。
2 將DODAP、DOPE、膽固醇及DMG-PEG2K (18:56:20:6)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地，由1 mg/mL儲備液製備EPO環狀RNA之緩衝水溶液(10 mM檸檬酸鹽/150 mM NaCl，pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪，得到於20%乙醇中之最終懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液，用1×PBS (pH 7.4)透濾，濃縮且儲存於2-8℃下。最終濃度=1.35 mg/mL EPO環狀RNA(經囊封)。波長=75.9 nm (Dv(50)=57.3 nm；Dv(90)=92.1 nm)。
3 將HGT4003、DOPE、膽固醇及DMG-PEG2K (50:25:20:5)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地由1 mg/mL儲備液製備環狀RNA之緩衝水溶液(10 mM檸檬酸鹽/150 mM NaCl，pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪，得到於20%乙醇中之最終懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液，用1×PBS (pH 7.4)透濾，濃縮且儲存於2-8℃下。
4 將ICE、DOPE及DMG-PEG2K (70:25:5)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地由1 mg/mL儲備液製備環狀RNA之緩衝水溶液(10 mM檸檬酸鹽/150 mM NaCl，pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪，得到於20%乙醇中之最終懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液，用1×PBS (pH 7.4)透濾，濃縮且儲存於2-8℃下。
5 將HGT5000、DOPE、膽固醇及DMG-PEG2K (40:20:35:5)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地，由1 mg/mL儲備液製備EPO環狀RNA之緩衝水溶液(10 mM檸檬酸鹽/150 mM NaCl，pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪，得到於20%乙醇中之最終懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液，用1×PBS (pH 7.4)透濾，濃縮且儲存於2-8℃下。最終濃度=1.82 mg/mL EPO mRNA (經囊封)。波長=105.6 nm (Dv(50)=53.7 nm；Dv(90)=157 nm)。
6 將HGT5001、DOPE、膽固醇及DMG-PEG2K (40:20:35:5)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地，由1 mg/mL儲備液製備EPO環狀RNA之緩衝水溶液(10 mM檸檬酸鹽/150 mM NaCl，pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪，得到於20%乙醇中之最終懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液，用1×PBS (pH 7.4)透濾，濃縮且儲存於2-8℃下。
7 將HGT5001、DOPE、膽固醇及DMG-PEG2K (35:16:46.5:2.5)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地，由1 mg/mL儲備液製備EPO環狀RNA之緩衝水溶液(10 mM檸檬酸鹽/150 mM NaCl，pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪，得到於20%乙醇中之最終懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液，用1×PBS (pH 7.4)透濾，濃縮且儲存於2-8℃下。
8 將HGT5001、DOPE、膽固醇及DMG-PEG2K (40:10:40:10)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地，由1 mg/mL儲備液製備EPO環狀RNA之緩衝水溶液(10 mM檸檬酸鹽/150 mM NaCl，pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪，得到於20%乙醇中之最終懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液，用1×PBS (pH 7.4)透濾，濃縮且儲存於2-8℃下。
9 將LP1、DSPC、膽固醇及DMG-PEG2K (45:9:44:2)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地由1 mg/mL儲備液製備FLuc、hEPO、微小肌縮蛋白、微型肌縮蛋白或肌縮蛋白環狀RNA之緩衝水溶液(50 mM乙酸鈉，pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪，得到於25%乙醇中之最終懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液，用1×PBS (pH 7.4)透濾，濃縮且儲存於2-8℃下。
10 將LP1、DSPC、膽固醇及DMG-PEG2K以及乙基月桂醯基精胺酸之DMSO溶液(38.25:7.65:37.4:1.7:15)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地由1 mg/mL儲備液製備FLuc、hEPO、微小肌縮蛋白、微型肌縮蛋白或肌縮蛋白環狀RNA之緩衝水溶液(50 mM Bis-Tris，pH 7.0)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪，得到於25%乙醇中之最終懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液，用1×PBS (pH 7.4)透濾，濃縮且儲存於2-8℃下。
11 將SM-102、DSPC、膽固醇及DMG-PEG2K (50:10:38.5:1.5)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地由1 mg/mL儲備液製備FLuc、hEPO、微小肌縮蛋白、微型肌縮蛋白或肌縮蛋白環狀RNA之緩衝水溶液(6.25 mM乙酸鈉，pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪，得到於25%乙醇中之最終懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液，用1×PBS (pH 7.4)透濾，濃縮且儲存於2-8℃下。
12 將SM-102、DSPC、膽固醇及DMG-PEG2K以及乙基月桂醯基精胺酸之DMSO溶液(42.5:8.5:32.73:1.275:15)之50 mg/mL乙醇溶液之等分試樣混合且用乙醇稀釋至3 mL最終體積。單獨地由1 mg/mL儲備液製備FLuc、hEPO、微小肌縮蛋白、微型肌縮蛋白或肌縮蛋白環狀RNA之緩衝水溶液(20 mM乙酸鈉，pH 4.5)。將脂質溶液快速注射至環狀RNA水溶液中且振盪，得到於25%乙醇中之最終懸浮液。過濾所得奈米粒子懸浮液，用1×PBS (pH 7.4)透濾，濃縮且儲存於2-8℃下。
在一些實施例中，轉移媒劑具有如表4b中所描述之調配物。 表4b：例示性脂質媒劑調配物
組合物 ( mol %) 組分
40:20:38.5:1.5 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
45:15:38.5:1.5 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
50:10:38.5:1.5 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
55:5:38.5:1.5 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
組合物 ( mol %) 組分
60:5:33.5:1 5 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
45:20:33.5:1.5 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
50:20:28.5 1.5 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
55:20:23.5:1.5 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
60:20:18.5:1.5 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
40:15:43.5:1.5 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
50:15:33.5:1.5 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
55:15:28.5:1.5 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
60:15:23.5:1.5 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
40:10:48.5:1.5 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
45:10:43.5:1.5 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
55:10:33.5:1.5 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
60:10:28.5:1.5 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
40:5:53.5:1.5 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
45:5:48.5:15 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
50:5:43.5:15 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
40:20:40:0 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
45:20:35:0 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
50:20:30:0 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
55:20:25:0 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
60:20:20:0 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
40:15:45:0 化合物:磷脂:植物固醇*:PEG-DMG
對於包括環狀RNA之奈米粒子組合物，將呈0.1 mg/ml濃度之環狀RNA於去離子水中之溶液在例如pH在3與4之間的50 mM檸檬酸鈉緩衝劑之緩衝液中稀釋以形成儲備溶液。可替代地，將呈0.15 mg/ml濃度之環狀RNA於去離子水中之溶液在例如pH在3與4.5之間的6.25 mM乙酸鈉緩衝劑之緩衝液中稀釋以形成儲備溶液。
藉由將脂質溶液與包括環狀RNA之溶液以在約5:1與約50:1之間的脂質組分與環狀RNA wt:wt比合併來製備包括環狀RNA及脂質組分之奈米粒子組合物。使用例如基於NanoAssemblr微流體之系統以在約10 ml/min與約18 ml/min之間或在約5 ml/min與約18 ml/min之間的流動速率將脂質溶液快速注射至環狀RNA溶液中，產生水與乙醇比在約1:1與約4:1之間的懸浮液。
可藉由透析處理奈米粒子組合物以移除乙醇且達成緩衝液交換。使用分子量截止值為10 kDa或20 kDa之Slide-A-Lyzer卡匣(Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL)以磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) pH 7.4以為主要產物體積200倍之體積透析調配物兩次。隨後，在4℃下透析調配物隔夜。經由0.2 μm無菌過濾器(Sarstedt，Nümbrecht，Germany)將所得奈米粒子懸浮液過濾至玻璃小瓶中且用捲曲密封件密封。一般獲得0.01 mg/ml至0.15 mg/ml奈米粒子組合物溶液。
上文所描述之方法誘導奈米沉澱及粒子形成。
可使用包括但不限於T-接合點及直接注射之替代性方法以達成相同奈米沉澱。
可在確定粒徑之1×PBS及確定ζ電位之15 mM PBS中使用Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd，Malvern，Worcestershire，UK)以確定奈米粒子組合物之粒徑、多分散性指數(PDI)及ζ電位。
可使用紫外線可見光譜法以測定奈米粒子組合物中之環狀RNA之濃度。將100 μL含經稀釋調配物之1×PBS添加至900 μL甲醇與氯仿之4:1 (v/v)混合物中。在混合後，在DU 800分光光度計(Beckman Coulter, Beckman Coulter, Inc., Brea, CA)上記錄例如在230 nm與330 nm之間的溶液之吸光度譜。可基於組合物中所使用之環狀RNA之消光係數及在例如260 nm之波長下的吸光度與在例如330 nm之波長下的基線值之間的差異來計算奈米粒子組合物中之環狀RNA的濃度。
可使用QUANT-IT™ RIBOGREEN® RNA分析(Invitrogen Corporation Carlsbad，CA)以評估奈米粒子組合物對環狀RNA之囊封。將樣品在TE緩衝溶液(10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA，pH 7.5)中稀釋至大致5 μg/mL或1 μg/mL之濃度。將50 μL經稀釋樣品轉移至聚苯乙烯96孔盤中，且將50 μL TE緩衝液或50 μL之2%-4% Triton X-100溶液添加至孔中。將培養盤在37℃溫度下培育15分鐘。將RIBOGREEN®試劑在TE緩衝液中1:100或1:200稀釋，且將100 μL此溶液添加至各孔中。可使用螢光盤讀取器(Wallac Victor 1420多標記計數器；Perkin Elmer，Waltham，MA)量測在例如約480 nm之激發波長及例如約520 nm之發射波長下之螢光強度。自樣品中之各者之螢光值減去空白試劑之螢光值，且藉由將完整樣品(不添加Triton X-100)之螢光強度除以破裂樣品(由添加Triton X-100造成)之螢光值來測定游離環狀RNA百分比。 實例2：可離子化脂質之合成
實例 2 . 1合成8-((3-羥基丙基)(2-羥基十四烷基)胺基)辛酸十七烷-9-酯(表3，脂質1)
實例 2 . 1 . 1合成8-溴辛酸十七烷-9-酯(3)
向8-溴辛酸2 (10 g，44.82 mmol)及十七烷-9-醇1 (9.6 g，37.35 mmol)於CH2Cl2 (300 mL)中之混合物中添加DMAP (900 mg，7.48 mmol)、DIPEA (26 mL，149.7 mmol)及EDC (10.7 g，56.03 mmol)。反應物在室溫下攪拌隔夜。在濃縮反應混合物之後，將粗殘餘物溶解於乙酸乙酯(300 mL)中，用1N HCl、飽和NaHCO 3、水及鹽水洗滌。有機層經無水Na2SO4乾燥。蒸發溶劑，且粗殘餘物藉由急驟層析(SiO 2：己烷=100%至30% EtOAc/己烷)純化，且獲得無色油狀產物3 (5 g，29%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.86 (m, 1H), 3.39 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.27 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.84 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.5-1.4 (m, 8H), 1.35-1.2 (m, 26H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 6H)。
實例 2.1.28-((3-羥丙基)胺基)辛酸十七烷-9-酯之合成(5)
向8-溴辛酸1-辛基壬酯3 (7.4 g，16.03 mmol)於EtOH (200 mL)中之溶液中添加3-胺基-1-丙醇4 (24.4 mL，320 mmol)，且在70℃下加熱反應溶液隔夜。MS顯示預期產物：[APCI]: [MH] +456.4。在濃縮反應混合物之後，將粗殘餘物溶解於甲基三級丁基醚(500 mL)中，用飽和NaHCO 3、水及鹽水洗滌。有機層經無水Na 2SO 4乾燥。蒸發溶劑，且藉由急驟層析(SiO 2：CH 2Cl 2=100%至10% MeOH/含1% NH 4OH之CH 2Cl 2)純化粗殘餘物且獲得無色油狀產物5 (6.6 g，88%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.84 (m, 1H), 3.80 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 2.87 (t, J = 5.76 Hz, 2H), 2.59 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.27 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.68 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.5-1.4 (m, 5H), 1.35-1.2 (m, 32H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 6H). MS (APCI+): 456.4 (M+1)。
實例 2.1.3合成8-((3-羥丙基)(2-羥基十四烷基)胺基)辛酸十七烷-9-基酯(7)
將化合物5 (6.6 g，14.5 mmol)及1,2-環氧十四烷(3.68 g，17.4 mmol)於異丙醇(150 mL)中之混合物加熱至回流隔夜。MS顯示預期產物：[APCI]: [MH]+668.6。濃縮反應混合物，且粗產物藉由急驟層析(SiO 2：CH 2Cl 2=100%至10% MeOH/含1% NH 4OH之CH 2Cl 2)純化，獲得呈無色油狀之脂質10e-1 (6.34 g，65%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.85 (m, 1H), 3.76 (t, J = 5.49 Hz, 2H), 3.68 (m, 1H), 2.75 (m, 1H), 2.59 (m, 2H), 2.38 (m, 3H), 2.27 (m, 2H), 1.58-1.68 (m, 2H), 1.48 (m, 6H),1.24 (m, 56H), 0.87 (m, 9H). MS (APCI+): 668.6 (M+1)。
實例 2.2合成二(十一烷-3-基) 8,8'-((3-羥基丙基)氮二基)雙(7-羥基辛酸酯) (表3，脂質7)
實例 2.2.1合成辛-7-烯酸十一烷-3-酯(3)
向辛-7-烯酸2 (10 g，70.3 mmol)及十一烷-3-醇1 (10 g，58.6 mmol)於CH2Cl2 (300 mL)中之混合物中添加DMAP (1.4 g，11.6 mmol)、DIPEA (40 mL，232 mmol)及EDC (16.9 g，87.9 mmol)。反應物在室溫下攪拌隔夜。在濃縮反應混合物之後，將粗殘餘物溶解於三級丁基甲基醚(500 mL)中，用1N HCl、飽和NaHCO 3、水及鹽水洗滌。有機層經無水Na2SO4乾燥。蒸發溶劑，且粗殘餘物藉由急驟層析(SiO2:己烷=100%至20% EtOAc/己烷)純化，且獲得無色油狀產物3 (17.2 g，98%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 5.88-5.72 (m, 1H), 5.02-4.91 (m, 1H), 4.80 (m, 1H), 2.28 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.05-2.03 (m, 2H), 1.62-1.49 (m, 6H), 1.37-1.25 (m, 16H), 0.87 (t, J = 7.4 Hz, 6H)。
實例 2.2.2合成6-(環氧乙烷-2-基)己酸十一烷-3-酯(4)
在0℃冰水浴下向辛-7-烯酸十一烷-3-基酯3 (17.2 g，58.1 mmol)於CH 2Cl 2(300 mL)中之混合物中一次性添加間氯過氧苯甲酸(mCPBA，＜77%) (19.5 g，87 mmol)。反應物在室溫下攪拌隔夜。過濾白色沉澱物(間苯甲酸)且將濾液用CH 2Cl 2(200 mL)稀釋，用10% Na 2S 2O 3、飽和NaHCO 3、水及鹽水洗滌。有機層經無水Na2SO4乾燥。蒸發溶劑，且粗殘餘物藉由急驟層析(SiO2:己烷=100%至30% EtOAc/己烷)純化，且獲得無色油狀產物3 (17.1 g，97%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.80 (m, 1H), 2.89-2.86 (m, 1H), 3.39 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.74 (t, J = 4.7 Hz, 1H), 2.47 (dd, J = 4.9, 2.2 Hz, 1H), 2.28 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 1.74-1.46 (m, 10H), 1.35-1.2 (m, 13H) 0.87 (m, 6H)。
實例 2.2.3合成二(十一烷-3-基) 8,8'-((3-羥基丙基)氮二基)雙(7-羥基辛酸酯) (表3，脂質7)
向6-(環氧乙烷-2-基)己酸十一烷-3-基酯4 (8 g，25.6 mmol)於異丙醇(50 mL)中之溶液中添加3-胺基-1-丙醇(769.1 mg，10.2 mmol)，且在90℃下加熱反應溶液隔夜。MS顯示預期產物：[APCI]: [MH]+700.6。在濃縮反應混合物之後，藉由急驟層析(SiO 2：CH 2Cl 2=100%至10% MeOH/CH 2Cl 2)純化粗殘餘物，且獲得無色油產物(5.1 g，71%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.81 (m, 2H), 3.80 (m, 2H), 3.73 (m, 2H), 2.78 (m, 2H), 2.52-2.43 (m, 4H), 2.28 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.68-1.48 (m, 15H), 1.35-1.17 (m, 37H), 0.88-0.83 (m, 12H)。MS (APCI+): 700.6 (M+1)。
實例 2.3合成((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)氮二基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯) (表3，脂質129)及((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氮二基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯) (表3，脂質128)
在與冷凝器連接之100 mL圓底燒瓶中，將3-(1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(100 mg，0.799 mmol)或3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(0.799 mmol)、2-己基癸酸6-溴己酯(737.2 mg，1.757 mmol)、碳酸鉀(485 mg，3.515 mmol)及碘化鉀(13 mg，0.08 mmol)在乙腈(30 mL)中混合，且將反應混合物加熱至80℃達48 h。將混合物冷卻至室溫且經由矽藻土墊過濾。用乙酸乙酯稀釋濾液。在用水、鹽水洗滌之後，且經無水硫酸鈉乾燥。蒸發溶劑且粗殘餘物藉由急驟層析(SiO 2:CH 2Cl 2=100%至10%甲醇/CH 2Cl 2)純化，且獲得無色油狀產物(92 mg，15%)。((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯))之分子式為C 50H 95N 3O 4且分子量(M w)為801.7。
合成((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氮二基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯))之反應方案(表3，脂質128)。 實例3：IRES及CodOP篩選 A.初始篩選
進行用以評估大致3,000個潛在IRES序列候選物之初始篩選。IRES序列候選物以此項技術中可用之部分及完整病毒序列(例如，Genbank)自病毒非轉譯區計算方式鑑定。選殖各DNA模板以包括IRES序列或片段。藉由活體外轉錄(IVT)由DNA模板產生經工程化之環狀RNA (oRNA)；且隨後自IVT反應物之非環狀RNA組分純化oRNA。用脂質使經純化oRNA奈米沉澱以形成LNP-oRNA構築體。用所調配之LNP-oRNA處理初級人類骨骼肌管(MYO)、初級人類肝細胞(PHH)及經活化初級人類T細胞(TCL)。例示性構築體包括5'增強型內含子元件、5'增強型外顯子元件、苛刻IRES、編碼高斯螢光素酶之編碼元件、3'增強型外顯子元件及3'增強型內含子元件。參見WO2022/261490。在轉染後48小時以發光量測評估上清液中之蛋白質表現。將重複盤之間的總發光信號標準化，以控制重複盤之間的盤寬差異。
基於蛋白質表現及穩定性量測來選擇最高IRES序列。
經由Nalm6溶解%及平均螢光強度(MFI)評定針對CD19之密碼子。
初始篩選之結果產生選擇18種IRES (包括由表1A中之SEQ ID NO: 1-15表示之IRES)及10種密碼子之約180種組合。在合成之後，進一步測試69種基於15種IRES (表1A中之SEQ ID NO: 1-15)及5種密碼子最佳化序列(表2A中之SEQ ID NO: 19-23)之組合的構築體。參見下文圖2A至圖2C及表5。 B.密碼子最佳化分析
使用核糖體停留時間算法(目標GC%為48-54%)、經修改之穩定性算法(目標GC%為57-62%)及基於已知序列之反向工程化的第三算法(目標GC%為57-62%)進行密碼子最佳化。如本文其他地方所詳細闡述，算法基於GC%、不合需要之序列移除及低GC前導來最佳化特定密碼子。來自兩個健康供體(4003；609C)之CD3+ T細胞用αCD3/CD28四聚複合物活化3天且隨後用CD19CAR oRNA序列電穿孔。oRNA序列使用3種算法(1：15序列，2：34序列，3：27序列)密碼子最佳化。CD19CAR表現經由流式細胞量測術分析。CD19CAR表現(gMFI)按照所有序列之排序順序繪製且藉由密碼子最佳化算法進行顏色編碼。白條指示未經密碼子最佳化之CD19CAR序列。參見圖3A及圖3B及圖4A至圖4C。
評估密碼子序列且選擇最高密碼子變異體以用於進一步評估。參見表2A。根據先前最佳化分析，基於持續穩固表現穩定性及針對Nalm6之細胞毒性選擇最高密碼子變異體。自10個密碼子中選擇4個密碼子及基礎用於進一步評估：基於評定例如CAR表現、CAR-T細胞頻率及CAR-T細胞計數，如表2中所闡述，對應於SEQ ID NO:19-23之數目69、24、39、45及基礎(3276)。 C.  IRES-CO構築體
此等最高四個密碼子最佳化變異體與最高IRES序列之組合經設計以活體外評估表現及抗腫瘤功能。
69種環狀RNA構築體經設計，其包含對應於表1A中之SEQ ID NO: 1-15之15種IRES序列及對應於表2A中之SEQ ID NO: 19-23之核苷酸序列之5種抗CD19 28-ζ密碼子最佳化表現序列之組合。69種構築體描述於表5及下文實例中。構築體在本文中藉由表5之IRES/CO純系編號，例如在圖8A及8B中提及。 表5：69種實驗構築體
IRES/CO 純系編號 IRES SEQ ID NO 密碼子SEQ ID NO
1 1 21
7 1 19
10 1 23
11 2 21
14 2 22
16 2 20
17 2 19
20 2 23
24 3 22
26 3 20
27 3 19
31 4 21
34 4 22
36 4 20
37 4 19
40 4 23
51 5 21
54 5 22
56 5 20
57 5 19
60 5 23
61 6 21
64 6 22
66 6 20
67 6 19
70 6 23
71 7 21
74 7 22
76 7 20
77 7 19
80 7 23
81 8 21
86 8 20
87 8 19
90 8 23
91 9 21
94 9 22
96 9 20
97 9 19
100 9 23
101 10 21
104 10 22
106 10 20
107 10 19
110 10 23
111 11 21
114 11 22
116 11 20
117 11 19
120 11 23
121 12 21
124 12 22
126 12 20
127 12 19
130 12 23
131 13 21
134 13 22
136 13 20
137 13 19
140 13 23
161 14 21
164 14 22
166 14 20
167 14 19
170 14 23
171 15 21
176 15 20
177 15 19
180 15 23
表5之69個例示性構築體中之12個的完整IRES-密碼子序列闡述於下表6中。如實例4至6中所描述，此等12個例示性構築體一般展現出較高及持久的表現且引起CAR表現T細胞之更高功能。 表6：12種例示性構築體序列
SEQ ID NO IRES/CO 純系編號 IRES+CO 序列
50 7 TTAAAACAGCTCTGGGGTTGTTCCCACCCCAGAGGCCCACGTGGCGGCCAGTACTCCGGTATTACGGTACCCTTGTACGCCTGTTTTATACTCCCTTCCCCTGTAACTTAGAAGCATACAAACCAAGTTCAATAGAAGGGGGTACAAACCAGTACCACCACGAACAAGCACTCCTGTTTCCCCGGTGACATTGCATAGACTGTACCCACGGTTGAAAGCGATCGATCCGTTACCCGCTCCTGTACTTCGAGAAGCCTAGTATCATCTTGGAATCTTCGATGCGTTGCGCTCAGCACTCAACCCCAGAGTGTAGCTTAGGCTGATGAGTCTGGACGTCCCCCACCGGCGACGGTGGTCCAGGCTGCGTTGGCGGCCTACCTGTGGCCCAAAGCCACAGGACGCTAGTTGTGAACAAGGTGTGAAGAGCCTATTGAGCTACAAGAGAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACCACGGAGCAGGCAGTTGCAAACCAGCAACCGGCCTGTCGTAACGCGCAAGTCTGTGGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTATTTTTACAATGGCTGCTTATGGTGACAATCATAGATTGTTATCATAAAGCGACTTGGATTGGCCATCCGGTGAAAGTAAAACACATTGTTTACTTGTTTGTTGGATTCACTCCAATTAACACTTTTACTTACAAACTCATTACAACAACTCTATTAATTAGAGATAAGCATCACAATGGCACTGCCCGTCACCGCACTCCTGCTCCCACTGGCACTGCTGCTCCATGCAGCTCGCCCCGATATCCAGATGACCCAGACCACCTCTAGCCTCAGCGCCTCTCTGGGTGACCGCGTCACCATCTCTTGCCGGGCCAGCCAAGACATCTCTAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCTGACGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGTCGGCTGCATTCCGGGGTGCCTTCCAGGTTCAGCGGTTCCGGCTCTGGGACCGATTATAGTCTCACCATCTCCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCAACCTACTTCTGCCAGCAGGGGAACACCCTGCCCTACACCTTCGGTGGCGGGACCAAGCTGGAGATCACTGGAGGTGGTGGCAGCGGAGGTGGAGGATCAGGTGGAGGCGGTAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGACCTGGTCTGGTGGCCCCAAGCCAGTCCCTCAGCGTCACCTGCACAGTGTCCGGGGTGTCCCTGCCTGACTACGGTGTCTCCTGGATCAGGCAACCACCCCGGAAGGGTCTCGAGTGGCTGGGCGTCATCTGGGGCTCCGAGACCACCTACTACAACAGCGCTCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAAGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCTTGAAGATGAACTCCCTGCAAACCGATGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGTAGCTACGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGTGTCACCGTCTCCTCCATCGAGGTGATGTACCCTCCACCCTATCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCTAGCCCTCTGTTCCCAGGACCCTCCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTCGTGGTGGGAGGAGTCCTGGCCTGCTATTCCCTCCTCGTCACCGTGGCATTTATCATCTTCTGGGTCCGGAGCAAGCGGTCACGCCTGCTCCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTCGCAGACCTGGACCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTATGCCCCACCCCGCGACTTTGCCGCTTACCGCTCTCGGGTCAAGTTCTCTCGGTCAGCAGACGCCCCTGCATACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTCGGCAGACGGGAGGAGTACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGTGGTAAGCCACGGCGCAAGAACCCACAGGAGGGCTTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGAGGCGCAGGGGCAAGGGTCACGACGGCCTGTACCAAGGGCTGTCCACCGCAACCAAGGACACCTACGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTCCCACCAAGG
51 17 TTTCCCCTGTTCGTAACTAAGTGTGTGCCCAATCTCCTCACTCCTGCTGGCTTCACCGACCGGCAGTGTCCAAAATGCTAGGTGAATCCCCTCCCTTTCCTCTGGGCTTCTGCCCAGCTTCCTCCCCCCAGCCTGACGTGACACAGGCTGTGCAAAGACCCCGCGAAAGCTGCCAAAAGTGGCAATTGTGGGTCCCCCCTTTGTAAAGGCGTCGAGTCTTTCTCCCTCAAGGCTAGACCCGTCAGTGAATTCTGTCGGGCAACTAGTGACGCCACTGCACGCCTCTGACCTCGGCCGCGGAGTGCTGCCCCCCAAGTCGTGCCCCTGACCACAAGTTGTGCTGTCTGGCAAACATTGTCTGTGAGAATGTTCCGCTGTGGCTGCCAAGCCTGGCAACAGGCTGCCCCAGTGTGCGTAGTTCTCATCCAGACTTCGGTCTGGCAACTTGCTGTTAAGACACGGCGTAAGGGGCGTGTGCCAACGCCCTGGAACGAGTGTCCACTCTAATACCCCGAGGAATGCTACGCAGGTACCCCTGGTTCGCCAGGGATCTGAGCGTAGGCTAATTGTCTAAGGGTATTTTCATTTCCCATTCTTTCTTTCTTGTTCATAATGGCACTGCCCGTCACCGCACTCCTGCTCCCACTGGCACTGCTGCTCCATGCAGCTCGCCCCGATATCCAGATGACCCAGACCACCTCTAGCCTCAGCGCCTCTCTGGGTGACCGCGTCACCATCTCTTGCCGGGCCAGCCAAGACATCTCTAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCTGACGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGTCGGCTGCATTCCGGGGTGCCTTCCAGGTTCAGCGGTTCCGGCTCTGGGACCGATTATAGTCTCACCATCTCCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCAACCTACTTCTGCCAGCAGGGGAACACCCTGCCCTACACCTTCGGTGGCGGGACCAAGCTGGAGATCACTGGAGGTGGTGGCAGCGGAGGTGGAGGATCAGGTGGAGGCGGTAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGACCTGGTCTGGTGGCCCCAAGCCAGTCCCTCAGCGTCACCTGCACAGTGTCCGGGGTGTCCCTGCCTGACTACGGTGTCTCCTGGATCAGGCAACCACCCCGGAAGGGTCTCGAGTGGCTGGGCGTCATCTGGGGCTCCGAGACCACCTACTACAACAGCGCTCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAAGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCTTGAAGATGAACTCCCTGCAAACCGATGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGTAGCTACGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGTGTCACCGTCTCCTCCATCGAGGTGATGTACCCTCCACCCTATCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCTAGCCCTCTGTTCCCAGGACCCTCCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTCGTGGTGGGAGGAGTCCTGGCCTGCTATTCCCTCCTCGTCACCGTGGCATTTATCATCTTCTGGGTCCGGAGCAAGCGGTCACGCCTGCTCCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTCGCAGACCTGGACCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTATGCCCCACCCCGCGACTTTGCCGCTTACCGCTCTCGGGTCAAGTTCTCTCGGTCAGCAGACGCCCCTGCATACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTCGGCAGACGGGAGGAGTACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGTGGTAAGCCACGGCGCAAGAACCCACAGGAGGGCTTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGAGGCGCAGGGGCAAGGGTCACGACGGCCTGTACCAAGGGCTGTCCACCGCAACCAAGGACACCTACGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTCCCACCAAGG
52 37 TTAAAACAGCGGATGGGTATCCCACCATCCGGCCCACTGGGTGTAGTACTCTGGTACATTGTACCTTTGTACGCCTGTTTTCCCCCTCTTGTACCCGCCCTTCAAGCTCCTTGCCCAAGTAACGTTAGAAGTTTGAACATTGGTACAATAGGAAGCATCACATCCAGTGGTGTACTGTACAAACACTTCTGTTGCCCCGGAGCGAGGTATAGATGGTCCCCACCGTCAAAAGCCTTTAACCGTTATCCGCCAATCAACTACGTAATGGCTAGTAGCACCTTGGATTTAAGTTGGCGTTCGATCAGGTGGTAACCCCCACTAGTTTGGTCGATGAGGCTAGGAATTCCCCACGGGTGACCGTGTCCTAGCCTGCGTGGCGGCCAACCCAGCATCCGCTGGGACGCCAATTTAATGACATGGTGTGAAGACCTGCATGTGCTTGATTGTGAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAACCCTAACCCCGGAGCCTTGCAGCACAATCCAGTGTTGTTAAGGTCGTAATGAGCAATTCTGGGATGGGACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCTTATTTTTCTTGAATTTTTCTTATGGTCACAGCATATATACATTATATACTGTGATCATGGCACTGCCCGTCACCGCACTCCTGCTCCCACTGGCACTGCTGCTCCATGCAGCTCGCCCCGATATCCAGATGACCCAGACCACCTCTAGCCTCAGCGCCTCTCTGGGTGACCGCGTCACCATCTCTTGCCGGGCCAGCCAAGACATCTCTAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCTGACGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGTCGGCTGCATTCCGGGGTGCCTTCCAGGTTCAGCGGTTCCGGCTCTGGGACCGATTATAGTCTCACCATCTCCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCAACCTACTTCTGCCAGCAGGGGAACACCCTGCCCTACACCTTCGGTGGCGGGACCAAGCTGGAGATCACTGGAGGTGGTGGCAGCGGAGGTGGAGGATCAGGTGGAGGCGGTAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGACCTGGTCTGGTGGCCCCAAGCCAGTCCCTCAGCGTCACCTGCACAGTGTCCGGGGTGTCCCTGCCTGACTACGGTGTCTCCTGGATCAGGCAACCACCCCGGAAGGGTCTCGAGTGGCTGGGCGTCATCTGGGGCTCCGAGACCACCTACTACAACAGCGCTCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAAGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCTTGAAGATGAACTCCCTGCAAACCGATGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGTAGCTACGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGTGTCACCGTCTCCTCCATCGAGGTGATGTACCCTCCACCCTATCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCTAGCCCTCTGTTCCCAGGACCCTCCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTCGTGGTGGGAGGAGTCCTGGCCTGCTATTCCCTCCTCGTCACCGTGGCATTTATCATCTTCTGGGTCCGGAGCAAGCGGTCACGCCTGCTCCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTCGCAGACCTGGACCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTATGCCCCACCCCGCGACTTTGCCGCTTACCGCTCTCGGGTCAAGTTCTCTCGGTCAGCAGACGCCCCTGCATACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTCGGCAGACGGGAGGAGTACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGTGGTAAGCCACGGCGCAAGAACCCACAGGAGGGCTTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGAGGCGCAGGGGCAAGGGTCACGACGGCCTGTACCAAGGGCTGTCCACCGCAACCAAGGACACCTACGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTCCCACCAAGG
53 67 TTCAAACAGCCTGGGGGTTGTACCCACCCCTGGGGCCCACGTGGCGCTAGTACTCTGGTACGTTAGTACCTTTGTACGCCTGTTTTCCCCTCCCTTAAACAAATTAAGATTACCACTACTGAGGGGAGTAGTCCGACTCCGCTCCGGTACTGCCGCACCAGTACTCCGGTACACTTAGTACCCTAGTACGGAGTAGATGGTATCCCCACCCCGCAACTTAGAAGCATGCAAACAAACCGACCAATAGGCGCACGATATCCAGTCGTGTTTCGGTCAAGCACTTCTGTCTCCCCGGTCCGAAAGGATCGTTACCCGCCCGACCCACTACGAGAAGCCCAGTAACTGGCCAAGTGATTGCGAAGTTGCGCTCAGCCACAACCCCAGTGGTAGCTCTGGAAGATGGGGCTCGCGTCTCCCCCGTGGTGACACGGTCGCTTGCCCGCGTGTGCTTCCGGGTTCGGCCTACGCCGTTCACTTCAATGTCACGTAACCAGCCAAGAGCCTATTGTGCTGGGACGGTTTTCCTCCGGGGCCGTGAATGCTGCTAATCCCAACCTCCGAGCGTGTGCGCACAACCCAGTGTTGCTACGTCGTAATGCGTAAGTTGGAGGCGGAACAGACTACTTTCGGTACCCCGTGTTTCCTTTAAATTTTATTCATTATTTTATGGTGACAATTGCTGAGATCTGCGAATTAGCGACTCTGCCGTTGAATATTGCTCTGTACTATTTGGTTGCATTCCACAAAACCTCTGACATCCCCAGTACATACATTACTTTACTTGTTTACCTCAATCTAAAGCACAAGCTAGATAATACAAAATGGCACTGCCCGTCACCGCACTCCTGCTCCCACTGGCACTGCTGCTCCATGCAGCTCGCCCCGATATCCAGATGACCCAGACCACCTCTAGCCTCAGCGCCTCTCTGGGTGACCGCGTCACCATCTCTTGCCGGGCCAGCCAAGACATCTCTAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCTGACGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGTCGGCTGCATTCCGGGGTGCCTTCCAGGTTCAGCGGTTCCGGCTCTGGGACCGATTATAGTCTCACCATCTCCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCAACCTACTTCTGCCAGCAGGGGAACACCCTGCCCTACACCTTCGGTGGCGGGACCAAGCTGGAGATCACTGGAGGTGGTGGCAGCGGAGGTGGAGGATCAGGTGGAGGCGGTAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGACCTGGTCTGGTGGCCCCAAGCCAGTCCCTCAGCGTCACCTGCACAGTGTCCGGGGTGTCCCTGCCTGACTACGGTGTCTCCTGGATCAGGCAACCACCCCGGAAGGGTCTCGAGTGGCTGGGCGTCATCTGGGGCTCCGAGACCACCTACTACAACAGCGCTCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAAGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCTTGAAGATGAACTCCCTGCAAACCGATGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGTAGCTACGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGTGTCACCGTCTCCTCCATCGAGGTGATGTACCCTCCACCCTATCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCTAGCCCTCTGTTCCCAGGACCCTCCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTCGTGGTGGGAGGAGTCCTGGCCTGCTATTCCCTCCTCGTCACCGTGGCATTTATCATCTTCTGGGTCCGGAGCAAGCGGTCACGCCTGCTCCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTCGCAGACCTGGACCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTATGCCCCACCCCGCGACTTTGCCGCTTACCGCTCTCGGGTCAAGTTCTCTCGGTCAGCAGACGCCCCTGCATACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTCGGCAGACGGGAGGAGTACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGTGGTAAGCCACGGCGCAAGAACCCACAGGAGGGCTTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGAGGCGCAGGGGCAAGGGTCACGACGGCCTGTACCAAGGGCTGTCCACCGCAACCAAGGACACCTACGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTCCCACCAAGG
54 86 CCCCCCTCCCCCCCTTCCCTTCCCTTTGCAACGCAACAATTGTAAGTGCCCTCACCTGTCAATTGGGACCACCACTTTCAGTGACCCCATGCGAAGTGCTGAGAGAAAGGAAGCTTTCTTACCCTTCATTTGTGAACCCACTGGTCTAAGCCGCTTGGAATACGATGAGTGGAAAAGTTCATTCTTAATGGAGTGAAACATGCTTAAATTTCCAGCTCGTGCTGGTCTTTCCAGTACGGGGCGGCCCTGTCTGGCCGTAATTCTTCAGAGTGTCACGCCACACTTGTGGATCTCACGTGCCACATGACAGCGCTACAGCTGGAACTGGGTGCTTGGTGCCCATGGAGTAACAGCGAAAAGTGTTAGATCAAGCCTTGCTTGGGCTATGAGCCTGCGGAACAACAACTGGTAACAGTTGCCTCAGGGGCCGAAAGCCACGGTGTTAACAGCACCCTCATAGTTTGATCCACCTCAGGGTGGTGATGTTTAGCAGTTAGTAGTTGCCAATCTGTGTTCACTGAAATCTCGGCATACCGTGTAGTGTACAGGGGTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCGTAGGTAACCTTAAGAGACTATGGATCTGATCTGGGGCCTTGTCCGGAGTGCTTTACACACGGCTCAAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCACAGAGCCCGAGGGATTCGGGTTTTCCCTTTAAAAACCCGACTAGAGCTTATGGTGACAATTATTGCTGTTCAGACGAACAGTGTAATTGTTGTCTATTCACAGCAGTTCTATCAGAGCTTTTCCCACAACGGATCTTCTTGGCAAGCAAATACAGCAGGAGTCAATATGGCACTCCCAGTCACCGCACTTCTGCTGCCTCTCGCCCTGCTGCTCCATGCAGCCAGACCCGACATCCAGATGACCCAAACCACCAGCTCCCTGTCCGCTTCCCTGGGTGACCGGGTGACTATCTCTTGCCGGGCCTCCCAAGACATCTCCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAAAAGCCTGACGGCACCGTCAAGCTCCTCATCTACCATACCTCCAGACTGCACTCCGGGGTGCCTAGCAGGTTCAGCGGAAGTGGGAGCGGCACCGACTACAGCCTCACCATCTCCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGGAACACACTGCCCTACACCTTCGGCGGTGGCACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGAGGTTCCGGAGGAGGAGGTAGTGGAGGTGGAGGCAGCGAGGTGAAGCTCCAGGAATCCGGACCAGGTCTGGTGGCTCCCAGCCAGTCCCTCAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGTCTCTTCCCGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGACAGCCACCCCGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATCTGGGGTTCCGAGACCACATACTACAACTCAGCCCTCAAGAGCCGGCTCACCATCATCAAGGATAACTCCAAGTCCCAGGTCTTCCTGAAGATGAACTCTCTCCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGGTCCTACGCCATGGACTACTGGGGTCAGGGAACCTCCGTCACCGTCAGCTCTATCGAGGTGATGTACCCTCCTCCCTACCTCGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCATGTGAAGGGGAAGCATCTCTGCCCCTCACCCCTGTTCCCCGGACCATCCAAGCCATTCTGGGTGCTGGTGGTTGTTGGTGGGGTCCTGGCTTGCTACTCACTCCTGGTCACCGTCGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGGTCAAAGAGGTCCCGGCTCTTGCACTCCGATTACATGAACATGACTCCAAGGAGGCCTGGTCCCACACGGAAGCACTACCAACCATATGCCCCACCACGCGACTTCGCTGCTTACCGGAGCCGGGTCAAGTTCAGTCGGAGTGCAGACGCCCCAGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAACTCTACAACGAGCTTAATCTGGGTCGCCGGGAGGAGTATGACGTGCTCGATAAGAGAAGGGGCCGGGATCCTGAGATGGGCGGTAAGCCCAGACGGAAGAACCCTCAGGAGGGGTTGTATAATGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCATACTCCGAGATCGGCATGAAAGGTGAGCGGAGGAGAGGCAAGGGGCATGACGGCCTGTACCAGGGGCTCAGCACAGCCACCAAGGATACCTATGACGCACTCCACATGCAGGCACTGCCTCCACGG
55 87 CCCCCCTCCCCCCCTTCCCTTCCCTTTGCAACGCAACAATTGTAAGTGCCCTCACCTGTCAATTGGGACCACCACTTTCAGTGACCCCATGCGAAGTGCTGAGAGAAAGGAAGCTTTCTTACCCTTCATTTGTGAACCCACTGGTCTAAGCCGCTTGGAATACGATGAGTGGAAAAGTTCATTCTTAATGGAGTGAAACATGCTTAAATTTCCAGCTCGTGCTGGTCTTTCCAGTACGGGGCGGCCCTGTCTGGCCGTAATTCTTCAGAGTGTCACGCCACACTTGTGGATCTCACGTGCCACATGACAGCGCTACAGCTGGAACTGGGTGCTTGGTGCCCATGGAGTAACAGCGAAAAGTGTTAGATCAAGCCTTGCTTGGGCTATGAGCCTGCGGAACAACAACTGGTAACAGTTGCCTCAGGGGCCGAAAGCCACGGTGTTAACAGCACCCTCATAGTTTGATCCACCTCAGGGTGGTGATGTTTAGCAGTTAGTAGTTGCCAATCTGTGTTCACTGAAATCTCGGCATACCGTGTAGTGTACAGGGGTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCGTAGGTAACCTTAAGAGACTATGGATCTGATCTGGGGCCTTGTCCGGAGTGCTTTACACACGGCTCAAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCACAGAGCCCGAGGGATTCGGGTTTTCCCTTTAAAAACCCGACTAGAGCTTATGGTGACAATTATTGCTGTTCAGACGAACAGTGTAATTGTTGTCTATTCACAGCAGTTCTATCAGAGCTTTTCCCACAACGGATCTTCTTGGCAAGCAAATACAGCAGGAGTCAATATGGCACTGCCCGTCACCGCACTCCTGCTCCCACTGGCACTGCTGCTCCATGCAGCTCGCCCCGATATCCAGATGACCCAGACCACCTCTAGCCTCAGCGCCTCTCTGGGTGACCGCGTCACCATCTCTTGCCGGGCCAGCCAAGACATCTCTAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCTGACGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGTCGGCTGCATTCCGGGGTGCCTTCCAGGTTCAGCGGTTCCGGCTCTGGGACCGATTATAGTCTCACCATCTCCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCAACCTACTTCTGCCAGCAGGGGAACACCCTGCCCTACACCTTCGGTGGCGGGACCAAGCTGGAGATCACTGGAGGTGGTGGCAGCGGAGGTGGAGGATCAGGTGGAGGCGGTAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGACCTGGTCTGGTGGCCCCAAGCCAGTCCCTCAGCGTCACCTGCACAGTGTCCGGGGTGTCCCTGCCTGACTACGGTGTCTCCTGGATCAGGCAACCACCCCGGAAGGGTCTCGAGTGGCTGGGCGTCATCTGGGGCTCCGAGACCACCTACTACAACAGCGCTCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAAGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCTTGAAGATGAACTCCCTGCAAACCGATGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGTAGCTACGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGTGTCACCGTCTCCTCCATCGAGGTGATGTACCCTCCACCCTATCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCTAGCCCTCTGTTCCCAGGACCCTCCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTCGTGGTGGGAGGAGTCCTGGCCTGCTATTCCCTCCTCGTCACCGTGGCATTTATCATCTTCTGGGTCCGGAGCAAGCGGTCACGCCTGCTCCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTCGCAGACCTGGACCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTATGCCCCACCCCGCGACTTTGCCGCTTACCGCTCTCGGGTCAAGTTCTCTCGGTCAGCAGACGCCCCTGCATACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTCGGCAGACGGGAGGAGTACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGTGGTAAGCCACGGCGCAAGAACCCACAGGAGGGCTTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGAGGCGCAGGGGCAAGGGTCACGACGGCCTGTACCAAGGGCTGTCCACCGCAACCAAGGACACCTACGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTCCCACCAAGG
56 97 CACTACGTTACGGTTCCCGCCCGGGACAACTGGTACCCCATTAGGCTACAACATGGCTGAAAAGGGTATTGGGTCCCCCCGGATTGTGTCCGTTCGTAGTGTGTGTAACGTGGTTTACCATCTCCACTAACATTGGACTAAGCATTTCATCTTTCCTCCCCGATTGTGTACTCACTTGGCTAACGCTGGGTGGTCGCGGTTGGGTCCTTGATTTACTTTTTCTCGTCTAAGCATTCCGACTGTCCTCCCCGATTATGTGCTCATTCAGTTAACTGCTGGGTGGTCATGACTAACATCGAGGAACCTTCTGTCCACGCTTACTTTGAGCTCCGGTCGCTTGACGCTTGTAGGGCGATAGGGTTATCTTCCTGACAACATCTTTATTCTACCTCCATAGGCTCTATCTATGGAGACGGAGTGTGGCACCCGTCCCTTCTTTGGGAGCTTCGGTAGTGACGCCCTTTGTCACTCTCGCCAGCCGAGGCATGCCTGGTGCCAGGTAGCAAAGAAAGCATATGTTTAAGGACTTGACTGATTTAGCGCAAGAGTTTGTAGCGATGTCCATAGTGTCTGCGGATTCCCCACACGGCGACGTGTGCCGCGGAGGCCAAAAGCCACGGTGTTCACAGCACCCCTATGGATGCCCACAGACCCCAGTGGGCACTCTTGTTGCCGGACTTTCAGGAAATTAGGCATAGGCTCTTCTCAAACTCCTGGCATTGGACTAGGTAAGAATGCCCCGGAGGTACCCCAGTACTCCTTCGGGAGTCTGGGATCTGACCGGGGGCCCCACAAACATGCTTTACGTGTTTCGTGCGGTCAAAAATTGTCTAACTAGTCCCAACCTTGAACAAGGGATTGTTCTTTCCTTTTTATTACTGAGACTGGCCTATGGTGACAACAGAGATTGACTGTGAATACAGTTATTTTCTGGTGTTTATCATTTGGTTTTTCTCCGTGCTCTTTTACCTTTGTGGTATTTGTTCTTTAGATAGGCAAAATGGCACTGCCCGTCACCGCACTCCTGCTCCCACTGGCACTGCTGCTCCATGCAGCTCGCCCCGATATCCAGATGACCCAGACCACCTCTAGCCTCAGCGCCTCTCTGGGTGACCGCGTCACCATCTCTTGCCGGGCCAGCCAAGACATCTCTAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCTGACGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGTCGGCTGCATTCCGGGGTGCCTTCCAGGTTCAGCGGTTCCGGCTCTGGGACCGATTATAGTCTCACCATCTCCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCAACCTACTTCTGCCAGCAGGGGAACACCCTGCCCTACACCTTCGGTGGCGGGACCAAGCTGGAGATCACTGGAGGTGGTGGCAGCGGAGGTGGAGGATCAGGTGGAGGCGGTAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGACCTGGTCTGGTGGCCCCAAGCCAGTCCCTCAGCGTCACCTGCACAGTGTCCGGGGTGTCCCTGCCTGACTACGGTGTCTCCTGGATCAGGCAACCACCCCGGAAGGGTCTCGAGTGGCTGGGCGTCATCTGGGGCTCCGAGACCACCTACTACAACAGCGCTCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAAGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCTTGAAGATGAACTCCCTGCAAACCGATGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGTAGCTACGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGTGTCACCGTCTCCTCCATCGAGGTGATGTACCCTCCACCCTATCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCTAGCCCTCTGTTCCCAGGACCCTCCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTCGTGGTGGGAGGAGTCCTGGCCTGCTATTCCCTCCTCGTCACCGTGGCATTTATCATCTTCTGGGTCCGGAGCAAGCGGTCACGCCTGCTCCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTCGCAGACCTGGACCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTATGCCCCACCCCGCGACTTTGCCGCTTACCGCTCTCGGGTCAAGTTCTCTCGGTCAGCAGACGCCCCTGCATACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTCGGCAGACGGGAGGAGTACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGTGGTAAGCCACGGCGCAAGAACCCACAGGAGGGCTTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGAGGCGCAGGGGCAAGGGTCACGACGGCCTGTACCAAGGGCTGTCCACCGCAACCAAGGACACCTACGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTCCCACCAAGG
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59 171 TCTGTCCTCACCCCATCTTCCCTTCTTTCCTGCACCGTTACGCTTACTCGCATGTGCATTGAGTGGTGCACGTGCTTGAACAAACAGCTACACTCACATGGGGGCGGGTTTTCCCGCCCTGCGGCCTCTCGCGAGGCCCACCCCTCCCCTTCCTCCCATAACTACAGTGCTTTGGTAGGTAAGCATCCTGATCCCCCGCGGAAGCTGCTCACGTGGCAACTGTGGGGACCCAGACAGGTTATCAAAGGCACCCGGTCTTTCCGCCTTCAGGAGTATCCCTGCTAGTGAATTCTAGTAGGGCTCTGCTTGGTGCCAACCTCCCCCAAATGCGCGCTGCGGGAGTGCTCTTCCCCAACTCACCCTAGTATCCTCTCATGTGTGTGCTTGGTCAGCATATCTGAGACGATGTTCCGCTGTCCCAGACCAGTCCAGTAATGGACGGGCCAGTGTGCGTAGTCGTCTTCCGGCTTGTCCGGCGCATGTTTGGTGAACCGGTGGGGTAAGGTTGGTGTGCCCAACGCCCGTACTTTGGTGATACCTCAAGACCACCCAGGAATGCCAGGGAGGTACCCCGCTTCACAGCGGGATCTGACCCTGGGCTAATTGTCTACGGTGGTTCTTCTTGCTTCCACTTCTTTCTACTGTTCATGATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACCCAGACAACCAGCAGCCTGTCTGCCAGCCTGGGCGATAGAGTGACCATCAGCTGTAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTACAGCCTGACAATCAGCAACCTGGAACAAGAGGATATCGCTACCTACTTCTGCCAGCAAGGCAACACCCTGCCTTACACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCACAGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGTGGATCTGAAGTGAAACTGCAAGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTGGCCCCATCTCAATCTCTGAGCGTGACCTGTACCGTCAGCGGAGTGTCCCTGCCTGATTATGGCGTGTCCTGGATCCGGCAGCCTCCTAGAAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCTAGCATCGAAGTGATGTACCCTCCACCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTACTCTCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA
60 177 TCTGTCCTCACCCCATCTTCCCTTCTTTCCTGCACCGTTACGCTTACTCGCATGTGCATTGAGTGGTGCACGTGCTTGAACAAACAGCTACACTCACATGGGGGCGGGTTTTCCCGCCCTGCGGCCTCTCGCGAGGCCCACCCCTCCCCTTCCTCCCATAACTACAGTGCTTTGGTAGGTAAGCATCCTGATCCCCCGCGGAAGCTGCTCACGTGGCAACTGTGGGGACCCAGACAGGTTATCAAAGGCACCCGGTCTTTCCGCCTTCAGGAGTATCCCTGCTAGTGAATTCTAGTAGGGCTCTGCTTGGTGCCAACCTCCCCCAAATGCGCGCTGCGGGAGTGCTCTTCCCCAACTCACCCTAGTATCCTCTCATGTGTGTGCTTGGTCAGCATATCTGAGACGATGTTCCGCTGTCCCAGACCAGTCCAGTAATGGACGGGCCAGTGTGCGTAGTCGTCTTCCGGCTTGTCCGGCGCATGTTTGGTGAACCGGTGGGGTAAGGTTGGTGTGCCCAACGCCCGTACTTTGGTGATACCTCAAGACCACCCAGGAATGCCAGGGAGGTACCCCGCTTCACAGCGGGATCTGACCCTGGGCTAATTGTCTACGGTGGTTCTTCTTGCTTCCACTTCTTTCTACTGTTCATGATGGCACTGCCCGTCACCGCACTCCTGCTCCCACTGGCACTGCTGCTCCATGCAGCTCGCCCCGATATCCAGATGACCCAGACCACCTCTAGCCTCAGCGCCTCTCTGGGTGACCGCGTCACCATCTCTTGCCGGGCCAGCCAAGACATCTCTAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCTGACGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGTCGGCTGCATTCCGGGGTGCCTTCCAGGTTCAGCGGTTCCGGCTCTGGGACCGATTATAGTCTCACCATCTCCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCAACCTACTTCTGCCAGCAGGGGAACACCCTGCCCTACACCTTCGGTGGCGGGACCAAGCTGGAGATCACTGGAGGTGGTGGCAGCGGAGGTGGAGGATCAGGTGGAGGCGGTAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGACCTGGTCTGGTGGCCCCAAGCCAGTCCCTCAGCGTCACCTGCACAGTGTCCGGGGTGTCCCTGCCTGACTACGGTGTCTCCTGGATCAGGCAACCACCCCGGAAGGGTCTCGAGTGGCTGGGCGTCATCTGGGGCTCCGAGACCACCTACTACAACAGCGCTCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAAGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCTTGAAGATGAACTCCCTGCAAACCGATGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGTAGCTACGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGTGTCACCGTCTCCTCCATCGAGGTGATGTACCCTCCACCCTATCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCTAGCCCTCTGTTCCCAGGACCCTCCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTCGTGGTGGGAGGAGTCCTGGCCTGCTATTCCCTCCTCGTCACCGTGGCATTTATCATCTTCTGGGTCCGGAGCAAGCGGTCACGCCTGCTCCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTCGCAGACCTGGACCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTATGCCCCACCCCGCGACTTTGCCGCTTACCGCTCTCGGGTCAAGTTCTCTCGGTCAGCAGACGCCCCTGCATACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTCGGCAGACGGGAGGAGTACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGTGGTAAGCCACGGCGCAAGAACCCACAGGAGGGCTTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGAGGCGCAGGGGCAAGGGTCACGACGGCCTGTACCAAGGGCTGTCCACCGCAACCAAGGACACCTACGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTCCCACCAAGG
61 180 TCTGTCCTCACCCCATCTTCCCTTCTTTCCTGCACCGTTACGCTTACTCGCATGTGCATTGAGTGGTGCACGTGCTTGAACAAACAGCTACACTCACATGGGGGCGGGTTTTCCCGCCCTGCGGCCTCTCGCGAGGCCCACCCCTCCCCTTCCTCCCATAACTACAGTGCTTTGGTAGGTAAGCATCCTGATCCCCCGCGGAAGCTGCTCACGTGGCAACTGTGGGGACCCAGACAGGTTATCAAAGGCACCCGGTCTTTCCGCCTTCAGGAGTATCCCTGCTAGTGAATTCTAGTAGGGCTCTGCTTGGTGCCAACCTCCCCCAAATGCGCGCTGCGGGAGTGCTCTTCCCCAACTCACCCTAGTATCCTCTCATGTGTGTGCTTGGTCAGCATATCTGAGACGATGTTCCGCTGTCCCAGACCAGTCCAGTAATGGACGGGCCAGTGTGCGTAGTCGTCTTCCGGCTTGTCCGGCGCATGTTTGGTGAACCGGTGGGGTAAGGTTGGTGTGCCCAACGCCCGTACTTTGGTGATACCTCAAGACCACCCAGGAATGCCAGGGAGGTACCCCGCTTCACAGCGGGATCTGACCCTGGGCTAATTGTCTACGGTGGTTCTTCTTGCTTCCACTTCTTTCTACTGTTCATGATGGCTCTGCCAGTGACCGCACTGCTGCTGCCCTTAGCCTTACTCCTTCACGCAGCCAGGCCCGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCTCCCTTTCCGCAAGCCTCGGCGACAGGGTCACCATCTCCTGTCGGGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCTCACGGCTGCACTCAGGCGTGCCCTCACGGTTTAGCGGATCAGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACTATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGAGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACCGGTGGCGGTGGTTCAGGTGGCGGAGGCTCAGGAGGAGGCGGCAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGTCCAGGACTGGTGGCACCCAGCCAGAGCCTGAGCGTGACTTGCACCGTGTCAGGCGTGAGCCTGCCAGACTACGGCGTGAGCTGGATCCGGCAGCCTCCTCGGAAGGGCTTAGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACTCAGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGACAGGGTACCAGCGTGACCGTGAGCAGCATCGAGGTGATGTACCCTCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCTAGCCCTTTATTCCCCGGCCCCTCAAAACCCTTCTGGGTGCTGGTCGTCGTCGGTGGCGTGCTGGCATGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATATTCTGGGTCCGGTCAAAGCGGAGCCGGTTACTGCACAGCGACTACATGAACATGACTCCACGGCGTCCAGGTCCCACTCGGAAGCACTACCAACCCTACGCTCCTCCCCGTGACTTTGCTGCCTACCGTAGCCGGGTGAAGTTCTCCAGGAGCGCCGATGCCCCAGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTACAATGAGCTTAACCTTGGCAGGCGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCCGTGATCCCGAGATGGGAGGCAAGCCCCGTAGGAAGAATCCCCAGGAGGGCCTTTACAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGCGTAGGCGTGGAAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACTGCTACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCTCTTCCACCCCGG
額外例示性環狀RNA構築體經設計，其包含表1A之IRES及表2B之抗CD19結合子，闡述於下表7A中或來自表1B之構築體之序列。表7A中之某些環狀RNA構築體包括miR-122位點。 表7A：其他CD19構築體(抗CD19 28-ζ)
IRES SEQ ID NO: 密碼子NT SEQ ID NO:
8 24
8 24 包括miR-122位點：SEQ ID NO:200
8 25
8 25 包括miR-122位點：SEQ ID NO:200
8 26
8 27
8 26 包括miR-122位點：SEQ ID NO:200
8 27
8 28 包括miR-122位點：SEQ ID NO:200
8 19 包括miR-122位點：SEQ ID NO:200
4 24
4 24 包括miR-122位點：SEQ ID NO:200
4 25
4 25
表7B描述經設計以包含針對小鼠CD19之表現序列及表1A之IRES的環狀RNA構築體。表7B中之某些環狀RNA構築體包括miR-122位點。 表7B：小鼠CD19構築體
IRES/CO純系編號 IRES SEQ ID NO: 密碼子NT SEQ ID NO:
mCD19-1 16 100
mCD19-2 8 100
mCD19-3 8 100 包括miR-122位點：SEQ ID NO: 200
mCD19-4 18 100
實例4：評估IRES-CO構築體 A.  IRES序列對表現之影響
來自兩個健康供體之CD3+ T細胞(609C，第一列；4003，第二列)用αCD3/CD28四聚複合物活化3天，且隨後用CD19CAR oRNA序列以10ng/100K細胞oRNA劑量電穿孔且評估。評估74個總序列，其包含5個包含SEQ ID NO: 19-23 (表2A之5個經密碼子最佳化序列)之CD19CAR序列與16個IRES序列(包括包含表1A之SEQ ID NO: 1-15之IRES及對應於基礎CD19對照之IRES)之組合。在電穿孔後24小時開始直至120小時，經由流式細胞量測術使用抗個體基因型抗體FMC63評估CD19CAR表現(T細胞MFI)，亦即每細胞隨時間推移之表現量。參見圖5A-5J。在電穿孔後24小時開始直至120小時，經由流式細胞量測術使用抗個體基因型抗體FMC63評估表現CD19CAR之細胞(藉由IRES隨時間推移之CAR陽性細胞%，亦即隨時間推移表現之細胞百分比或細胞平均信號)的頻率。參見圖6A至圖6J。 B.  IRES序列對oCAR™穩定性之影響
來自兩個健康供體(4003，第一列；609C，第二列)之CD3+ T細胞用αCD3/CD28四聚複合物活化3天，且隨後用CD19CAR oRNA序列電穿孔。評估74個總序列，其包含5個包含SEQ ID NO: 19-23 (表2A之5個經密碼子最佳化序列)之CD19CAR序列與18個IRES序列(包括包含表1A之SEQ ID NO: 1-15之IRES)之組合(參見例如，表1B)。CD19CAR表現細胞之頻率經由流式細胞量測術，在電穿孔後24至120小時時間點分析。相較於基礎對照CD19CAR及組合HER2標準對照序列，對於供體609C及供體4003中之各者，CD19CAR表現之頻率在各時間點依照以下表中之排序。 表-供體609C oCAR+細胞(電穿孔後之T細胞%)
第 1 天 第 2 天 第 3 天 第 4 天 第 5 天
97 97 87 87 86
97.9 97.5 97.8 91.1 90.8 92.3 53.3 53.7 56.2 13.1 13.6 14.8 3.28 4.74 7.06*
81 37 14 86 87
97.1 97.5 97.4 86.9 89.8 88.5 48.6 52.7 52.8 9.96 13.2 12.4 3.11 4.07 3.77
87 17 97 14 7
97 97.4 97.5 85.8 88.7 88.1 43.9 45.6 48.3 9.55 12.5 13.3 2.03 1.74 3.12
37 81 166 94 166
97.3 97.2 97.1 83.9 89.1 87.4 44.4 41.7 44 4.27 17.1* 5.14 1.01 1.52 1.77
7 87 171 37 14
97 96.5 71.4* 84.7 86.7 85 41 44.1 44.7 8.35 8.54 9.41 1.54 1.17 1.46
14 166 37 97 37
96.7 96.1 95.9 79.1 80.7 82.4 41.7 44.6 40.9 7.41 7.86 9.42 1.1 1.83 1.16
91 7 86 7 94
96.8 95.8 95.7 79.8 78.4 83.5 41.6 41.6 40.8 7.4 7.8 7.92 0.71 0.96 2.03
34 14 11 180 97
96.1 95.6 95.2 75.5 82 82.4 43.5 39.5 38.7 6.65 7.44 7.58 0.93 0.83 1.53
166 34 164 17 164
95.4 95.4 95.4 78.7 79.9 80.1 37.9 36.1 39 5.91 6.38 8.26 0.96 1.17 1
17 91 180 34 11
95.6 95.1 95.3 76.6 78.1 79.8 37.3 36.6 37.6 4.26 11.3* 4.83 0.89 0.65 0.91
90 90 17 11 90
94.6 94.6 94.4 72.5 75.3 73 37.8 35.8 35.2 6.45 7.04 6.83 0.71 0.76 0.8
100 57 7 166 17
94.6 94.4 94.5 69.5 73.3 73 35.6 35 34.5 6.77 6.11 6.96 0.75 0.62 0.71
96 96 94 171 167
94.9 93.6 94.5 70.1 70.8 72 31.6 34.7 35.9 4.79 6.72 8.12 0.55 0.9 0.6
57 164 96 164 137
95 93.9 93.9 67.2 69 68.6 31.7 35.8 34.4 6.15 6.77 6.2 0.084 0.35 1.33
10 137 34 96 1
95 94.2 93.4 68.5 68.6 67.1 32.5 31.2 30.8 4.92 4.8 5.33 0.33 0.4 0.82
164 100 57 81 96
94.3 93.3 93.6 68.5 69.7 65.7 27.8 28 27.4 4.17 4.62 4.57 0.42 0.41 0.56
171 11 36 36 34
93.3 92.2 93 64 71.2 67.1 26.4 26.5 26.8 5.6 3.47 3.97 0.51 0.45 0.39
170 171 140 1 180
93.1 91.5 77.8* 67.9 67 64.8 25.7 24.7 29.2 4.02 3.65 4.61 0.3 0.55 0.45
11 10 81 57 81
92.1 91.9 90.4 63.9 65.3 67.2 24.3 28.6 26.6 4.36 3.92 3.92 0.34 0.46 0.49
167 86 91 177 36
91.9 90.8 91.1 57.3* 66 64.7 25 24.6 25.9 3.88 2.51 5.45 0.47 0.42 0.38
86 167 1 91 177
92 90.4 91.2 61.3 62.5 62.5 24.3 26.9 23 2.66 2.95 2.94 0.32 0.47 0.31
54 36 131 100 171
91.5 90.2 100* 59.7 63.2 62.5 23 22.5 24.9 2.4 2.93 2.27 0.28 0.36 0.45
56 56 136 90 101
89.7 89.9 89.8 60.4 60 61.4 21.8 21.1 22.9 2.45 2.39 2.36 0.18 0.38 0.52
94 170 170 170 57
91 89.2 88.5 61.3 58.9 60.1 21.7 20.5 23 2.17 2.38 2.32 0.19 0.2 0.46
161 177 100 HER2標準_2 91
90.1 88.3 89.2 57 60.1 58.9 21.9 21.8 21.5 0.03 6.42 0.054 0.11 0.25 0.42
36 94 137 136 51
90.8 88.4 87.9 56.3 59 59.1 21.2 17.9 19.9 2.33 2.11 1.57 0.12 0.13 0.21
177 114 31 140 131
88.9 90.2 87.9 56.5 58.6 58.2 21.5 20.2 17.2 1.13 2.15 2.72 0.085 0.15 0.22
114 31 177 31 67
88.4 87.5 87.5 56.3 55.4 60.6 19.7 19.9 19.2 1.89 1.8 2.19 0.11 0.15 0.18
137 140 90 137 116
88.1 86.9 87.9 55.3 58.2 57.9 16.2 16.5 17.8 1.59 1.66 1.98 0.065 0.13 0.24
31 54 10 167 10
88.4 87 86.2 55.2 62.5 50.2 16.4 18.1 15.3 1.55 1.58 1.73 0.15 0.11 0.16
180 180 CD19基礎_1 131 31
87.6 84.6 86.9 72.2 47.4 47.7 16 15.8 17.2 1.54 1.09 1.75 0.071 0.11 0.23
CD19基礎_1 161 101 10 136
87 85 84.6* 53.1 55.5 54 15.4 15.6 16.9 1.38 1.36 1.36 0.12 0.1 0.19
64 64 54 114 54
86.3 86.5 84.5 49.5 51.3 51.4 16 15.2 15.2 1.11 1.51 1.28 0.11 0.038 0.19
77 CD19基礎_1 CD19基礎_2 101 170
85.5 82.3 83 50.7 46.7 49 14.8 16.1 14.5 1.16 1.22 1.29 0.076 0.075 0.17
66 131 167 161 56
84.4 82.7 83.3 48.7 46.2 48.3 13.4 12 14.1 1.15 1.38 1.06 0.098 0.13 0.079
140 77 114 54 104
83.6 82.2 82.2 46.8 48.8 47 11.2 13.4 13.3 1.1 1.09 1.01 0.064 0.083 0.13
51 67 67 77 100
83.6 80.8 0* 31.3* 45.9 47.4 12.6 11.7 12.9 1.08 1.04 0.81 0.062 0.065 0.12
67 CD19基礎_2 161 CD19基礎_1 176
83.9 81.1 79.9 46.8 46.1 44.6 12.7 11.6 12.8 0.9 0.89 1 0.071 0.065 0.088
61 66 51 67 CD19基礎_1
83.2 30.8* 79.6 41.4* 47.9 38.5 11.9 11.4 12.3 0.74 0.79 1.14 0.093 0.024 0.08
131 74 77 CD19基礎_2 161
82.2 79.8 80 39.9 46.7 41.9 10.5 10.5 12.6 0.64 0.93 1.06 0.048 0.075 0.074
101 134 134 56 134
82.6 79.2 78.7 48.6 38.5 38.6 10.4 10.9 11.4 0.65 0.87 0.89 0.072 0.082 0.037
1 104 56 51 77
80.4 77.9 76.3 40.1 41.9 43.6 10.6 10.1 11.1 0.69 0.48 0.81 0.096 0.067 0.023
74 51 104 66 114
79.7 77.2 77.7 29.2* 40.6 39.2 8.91 8.79 10.3 0.59 0.63 0.66 0.062 0.051 0.054
80 136 74 104 40
79.1 77.5 76.5 38.3 41.4 39.1 8.17 8.22 11 0.6 0.49 0.76 0.049 0.048 0.048
CD19基礎_2 101 66 134 76
77.9 75.7 76.9 27.6* 40.4 38.2 7.68 9.72 8.4 0.54 0.59 0.7 0.032 0.043 0.069
110 61 116 40 HER2標準_2
77.3 76.8 75.8 37.7 39.3 38 7.06 6.8 7.64 0.63 0.64 0.54 0.00737 0.055 0.078
104 1 110 116 CD19基礎_2
77.3 75.4 48.4* 24.4* 36.2 39.1 7 6.32 5.8 0.48 0.65 0.6 0.029 0.037 0.063
24 110 40 107 20
0.2* 75 100* 36.6 34.7 38.8 6.14 6.1 6.58 0.46 0.39 0.5 0.051 0.021 0.051
134 40 107 176 74
75 76.6 68.2 30.9* 35 29.6 5.82 5.96 6.21 0.49 0.35 0.43 0.042 0.042 0.037
136 80 64 74 140
72.5 71 71 28.3 30.8 32.2 5.21 4.55 5.36 0.41 0.34 0.45 0.037 0.046 0.035
40 107 76 106 64
69.4 70.1 71.8 26 28.9 30.2 3.97 4.97 4.8 0.3 0.37 0.33 0.047 0.035 0.036
71 71 80 76 66
63.8 60 60.5 23 25.3 22.8 4.17 4.91 4.25 0.31 0.46 0.2 0.041 0.046 0.031
107 106 106 110 106
63.8 59.7 60.2 16.3 18.9 19.7 4.24 4.04 5.03 0.42 0.16 0.26 0.033 0.024 0.052
111 76 176 80 80
55.5 52.7 52 13.9 14 14.8 3.79 3.9 3.81 0.26 0.25 0.2 0.031 0.04 0.025
106 111 61 64 模擬物
52.3 48.7 49.6 12.3 13.7 14.1 2.8 3.41 3.09 0.21 0.21 0.14 0.026 0.027 0.041
70 176 71 111 70
48.2 45.2 100* 13.2 13.2 12.6 1.64 1.9 2.1 0.17 0.1 0.18 0.028 0.032 0.032
76 120 111 71 27
47.8 43.2 43.8 10.1 13.7 12.2 1.68 2.27 1.61 0.13 0.12 0.11 0.023 0.042 0.026
120 70 120 61 124
44 41.4 0.3* 10.2 10.4 12.7 0.9 1.08 1.18 0.14 0.1 0.11 0.049 0.019 0.015
176 116 70 120 26
42.9 38.3 41.3 7.32 7.19 7.23 0.56 0.72 0.73 0.097 0.086 0.094 0.03 0.022 0.031
116 27 24 127 120
30.4 26.3 27.2 1.67 2.32 2.02 0.17 0.17 0.29 0.077 0.098 0.047 0.023 0.016 0.044
27 20 27 20 110
10 8.34 7.66 0 0.76 1.06 0.19 0.16 0.16 0.11 0.067 0.04 0.00876 0.035 0.039
20 26 126 121 24
6.93 7.06 7.31 0.47 0.37 0.9 0.16 0.2 0.055 0.065 0.089 0.039 0.021 0.026 0.034
26 127 121 27 127
1.89 0.16 0* 0.35 0.1 0.42 0.076 0.14 0.081 0.031 0.062 0.08 0.016 0.031 0.031
126 124 HER2標準_1 126 61
0.46 0.46 0.6 0.32 0.096 0.21 0.059 0.14 0.094 0.09 0.049 0.033 0.028 0.012 0.034
HER2標準_2 126 124 24 HER2標準_1
0.46 0.67 0.31 0.25 0.26 0.067 0.11 0.12 0.045 0 0.052 0.11 0.015 0.025 0.028
124 130 130 模擬物 71
0.4 0.39 0.44 0.028 0.28 0.086 0.042 0.099 0.12 0.05 0.047 0.065 0.02 0.022 0.025
HER2標準_1 24 HER2標準_2 26 130
0.32 0.12 0.6 0* 0.13 0.13 0.03 0.13 0.082 0.043 0.055 0.063 0.02 0.024 0.02
127 HER2標準_1 模擬物 HER2標準_1 121
0.24 0.35 0.27 0.024 0.076 0.2 0.078 0.094 0.06 0.056 0.034 0.071 0.026 0.00905 0.023
模擬物 121 20 124 126
0.24 0.23 0.25 0.13 0 0.056 0.13 0.04 0.051 0.051 0.041 0.049 0.00939 0.01 0.018
130 HER2標準_2 26 70 107
0.33 0.2 0.17 0.087 0.038 0 0.072 0.05 0.096 0.021 0.064 0.048 0.037 0 0
121 模擬物 127 130 111
0.22 0.32 0.11 0 0 0 0 0.1 0.021 0.055 0.037 0.036 0.00878 0.027 0
表-供體4003 oCAR+細胞(電穿孔後之T細胞%)
第 1 天 第 2 天 第 3 天 第 4 天 第 5 天
171 166 37 37 100
97.8 97.5 97.6 93.7 93.9 93.5 50.9 43 30.5* 11.6 14.5 30.7* 2.1 2.56 0.4*
7 7 81 86 87
97.6 97.8 96.8 92.9 93.5 93.5 43.1 41.5 11* 10.2 9.99 8.67 2.02 1.73 1.94
161 87 86 81 7
97.1 97.1 97.4 93.6 92.3 93.2 43.6 38.6 36.9 8.76 7.62 7.26 2.02 1.64 1.52
87 171 17 17 37
97.4 97.6 96.4 91.9 93 91.8 38 34.2 13.9* 6.18 5.09 5.45 1.32 0.89* 1.29
166 81 100 14 86
96.8 97.2 96.2 91.2 88.1 87.4 36 30.5 39.5 6.13 4.9 4.84 1.01 0.84 0.86
100 100 164 87 81
96.8 96.1 97.1 87.2 88 88.9 33.8 29.2 33.2 6.31 4.82 4.71 1.09* 0.86 0.89
177 177 94 164 17
96.6 96.8 96.6 88.7 100* 87.2 34.8 25.6 2.61* 5.22 4.52 3.54 0.69 0.61 0.51
14 161 14 11 14
0* 96.3 96 89.3 84.2 88.6 29.4 27.6 9.76* 4.74 3.6 3.84 0.83 0.5 0.47
91 11 1 94 166
95.5 95.3 95.5 86.9 87.1 86.7 24 26.2 25.2 4.18 3.88 3.42 0.74 0.49 0.46
11 14 11 36 177
95.7 94.9 95.3 86.7 85.7 85.3 24.6 24.3 10.9* 3.89 4.36 2.98 0.57 0.53 0.4
34 91 34 7 171
94.8 95.4 94.4 84.9 84.6 84.7 22.6 24.6 25.1 4.21 3.81 3.07 0.38 0.41 0.36
37 37 87 1 94
95.3 94.6 94.5 85.5 84.1 83.9 26 22.1 23.6 3.96 3.29 3.2 0.41 0.33 0.33
54 54 36 100 57
94.3 94.5 94.6 83.7 83.8 82.6 23.9 22.1 2.5e-002* 10.4* 4.19 2.68 0.35 0.31 0.28
164 131 177 177 11
94 95.5 93.3 83.5 83.1 82.9 25.7 22.6 20.6 3.18 3.04 3.1 0.34 0.29 0.27
57 57 137 34 164
94.4 93.7 92.8 83.5 82.8 82.2 23.4 21.4 0.11* 3.76 3.01 2.5 0.3 0.26 0.15*
81 164 161 166 34
93.9 93.2 93.4 83.2 82.6 82.6 23.5 20.9 0.12* 2.81 3 2.07 0.31 0.28 0.23
170 86 166 90 137
93 93.4 92.1 82.6 81.9 83 23 19 18.2 2.5 2.04 3.25 0.26 0.18 0.21
94 34 7 137 167
92.8 91.9 92.4 81.4 80.7 81.1 19.9 18 14.9 2.73 1.77 1.86 0.21 0.23 0.19
96 94 171 161 1
91.6 91.8 93 81.7 78.8 80 17.9 15.6 8.54* 1.91 1.99 1.68 0.22 0.17 0.14
66 170 180 167 90
92.4 90.9 92.4 77.8 78 78.5 16.2 13.2 19.3 1.73 1.66 1.84 0.38* 0.16 0.19
86 17 131 180 91
91.3 91.7 91.8 78.5 77.4 76.4 16.9 16.1 13.9 1.98 1.73 1.5 0.16 0.14 0.086*
131 66 90 171 96
91 91.3 90.6 74.2 77.5 76.9 15.5 12.1 0.5* 1.94 1.81 1.32 0.18 0.096* 0.12
CD19基礎_1 96 51 96 180
91.6 91.2 87.5 74.9 77 74.2 14.6 13.8 12.1 1.58 1.25 1.1 0.19 0.12 0.12
56 136 167 40 161
88.7 89 89.8 72.7 72.4 73.3 13.7 12.3 6.67* 1.1 0.94 1.03 0.14 0.12 0.11
167 CD19基礎_1 114 131 56
89.6 87.7 89 74 71.6 72.4 13.5 12.1 42.2* 1 1.09 0.83 0.029* 0.1 0.098
114 137 66 51 131
88.3 88.7 88 73.3 72.6 71.9 15.3 13.2 9.24 1.3* 0.95 0.96 0.12* 0.092 0.082
17 140 40 57 170
88 87.6 88.9 71.8 72 70.9 14.1 11 0.31* 1.52* 0.96 0.78 0.085 0.059 0.092
137 180 170 170 36
87.7 89 87.5 72.3 71.1 70.7 13.2 10.2 2.72* 1.6* 0.88 0.82 0.28* 0.072 0.084
31 31 140 66 136
88.3 88.3 87.4 72.8 70.7 69.7 11.4 10.2 0.072* 0.89 0.78 0.59 0.13* 0.065 0.078
1 167 134 114 114
86.1 87.9 89.5 72 72 67.6 10.3 8.59 0.62* 0.92 0.73 0.56 0.072 0.053 0.069
140 114 77 67 66
87.2 87.5 88.2 70.1 69.3 71.3 9.34 8.03 2.29* 0.84 0.52 0.49 0.057 0.038 0.061
77 CD19基礎_2 96 77 77
87.8 85.6 88 69.3 69.2 68 11.2 8.15 6.62 0.79 0.56 0.49 0.042 0.064 0.045
CD19基礎_2 56 CD19基礎_2 54 176
86.4 87.3 87.4 70 0* 67.2 9.65 7.56 0.08* 0.64 0.59 0.44 0.061 0.051 0.035
40 40 54 56 54
87.6 85.1 87.6 69.5 67.8 64.9 12* 8.48 7.66 0.38 0.61 0.68 0.058 0.015* 0.037
80 77 57 140 CD19基礎_1
86.7 86.5 86.2 67.3 66.1 67.2 8.17 6.99 2.09* 0.72 0.62 0.32 0.045 0.07 0.027
136 1 67 91 10
86.4 87.3 84.9 66.1 66.2 65.7 8.85 7.18 6.31 0.6 0.6 0.41 0.021 0.064 0.055
180 51 91 10 40
84.1 87.1 86.6 64 61.8 62.5 5.79 5.81 1.73* 0.33 0.7 0.52 0.065 0.034 0.04
74 134 56 134 140
86.5 84.4 86.6 61.6 63.1 60.8 5.73 5.73 0.19* 0.65 0.42 0.46 0.051 0.024 0.061
51 36 10 CD19基礎_2 134
84.8 84.6 86.8 62.9 60.5 60.5 5.14 5.34 0* 0.54 0.4 0.34 0.044 0.058 0.028
36 67 CD19基礎_1 116 31
83.8 83.8 85.2 60.6 58.5 61.4 5.83 4.6 5.17 0.43 0.43 0.31 0.034 0.047 0.042
76 90 101 101 67
82.6 83.5 84 58 57.1 57.1 5.03 4.06 4.72 0.57 0.33 0.26 0.07 0.023 0.029
101 74 116 CD19基礎_1 110
82.5 83.9 83.5 59.1 57.6 54 4.81 4.43 4.28 0.42 0.19 0.43 0.035 0.039 0.047
67 76 110 176 51
81.8 81.2 83.4 56.1 51.4 52.2 4.09 3.55 8.14* 0.38 0.36 0.3 0.033 0.031 0.047
90 101 61 31 76
81.1 79.5 82.2 53.4 51.3 51.9 4.21 3.25 18.4* 0.3 0.25 0.27 0.049 0.027 0.027
134 10 136 136 101
81 79.4 81.4 54 50 20* 4.56 2.81 0.08* 0.29 0.2 0.22 0.025 0.038 0.037
10 80 64 104 20
75.6 80.4 79.5 52.8 50.8 49.1 4.21 2.73 42* 0.16 0.16 0.17 0.035 0.039 0.025
64 64 76 71 模擬物
76.9 76.4 77.5 51.3 49 47 3.34 3.22 0.22* 0.071 0.15 0.16 0.028 0.05 0.018
116 110 176 110 74
72.4 74.3 74.9 47.3 46.6 46.3 3.67 2.78 6.18* 0.12 0.13 0.13 0.022 0.023 0.045
70 116 31 61 CD19基礎_2
74.2 73.5 72.1 44.1 43.2 43.7 3.29 2.96 20.4* 0.1 0.16 0.086 0.031 0.031 0.028
110 104 74 64 124
72.3 73 73.3 43.5 42 40.3 2.95 2.42 6.53* 0.13 0.11 0.1 0.042 0.028 0.017
71 71 80 74 107
65.1 66.3 68 41.3 35.8 34.1 2.79 2.03 2.19 0.12 0.14 0.066 0.037 0.027 0.023
104 70 104 80 126
64.8 62.2 66.3 37.6 35.9 32.9 1.94 1.25 11.8* 0.12 0.1 0.095 0.014 0.029 0.044
61 61 120 76 80
63.6 59.7 65.1 33.9 30.5 31.4 1.31 0.98 1.25 0.11 0.071 0.12 0.027 0.025 0.033
120 120 70 120 27
59.7 57.4 60.9 30.5 29.8 30.1 0.58 0.58 0.28 0.072 0.1 0.075 0.042 0.026 0.013
111 176 111 HER2標準_1 HER2標準_1
56.4 56.7 58.5 24.9 26.5 25.1 0.58 0.33 0.018* 0.079 0.088 0.063 0.026 0.024 0.023
176 106 71 111 116
45.9 46.1 46.4 26.2 24.6 24.6 0.27 0.53 3.85* 0.1 0.025 0.092 0.06* 0.029 0.019
106 111 106 121 104
41.8 40.7 41.2 21.9 19.1 21.9 0.35 0.27 5.01* 0.12 0.068 0.026 0.028 0.015 0.027
20 27 HER2標準_2 106 97
22.4 26.2 25 3.77 50* 3.45 0.17 0.13 18* 0.083 0.062 0.068 0.014 0.033 0.022
27 127 107 HER2標準_2 61
12.1 15.5 16.3 1.75 0.66 1.21 0.17 0.084 24.3* 0.054 0.071 0.07 0.02 0.02 0.027
107 20 24 26 26
1.25 1.73 2.1 1.03 0.63 0.45 0.15 0.067* 0.1 0.059 0.1 0.032 0.02 0.017 0.028
126 24 26 126 127
1.48 0.84 1.93 1.16 0.21 0.066 0.14 0.022* 0.1 0.08 0.029 0.075 0 0.037 0.028
124 107 130 70 64
1.06 1.14 0.58 0.47 0.37 0.34 0.11 0.13 0.048* 0.052 0.042 0.089 0.00729 0.031 0.025
130 124 127 模擬物 121
0.8 0.59 0.047 0.28 0.33 0.32 0.15 0.088 11.8* 0.032 0.059 0.089 0.035 0.01 0.017
127 126 27 24 24
0.26 0.4 0.63 0.24 0.37 0.22 0.059 0.14 4.33* 0.1 0.046 0.027 0.028 0.013 0.019
97 HER2標準_2 124 27 130
0.21 0.4 0.62 0.18 0.29 0.094 0.12 0.053 2.9* 0.066 0 0.098 0.02 0.018 0.021
HER2標準_2 121 97 20 106
0.31 0.42 0.23 0.075 0.17 0.2 0.077 0.069 1.54* 0.061 0.048 0.039 0.016 0.017 0.023
24 26 20 127 HER2標準_2
0.34 0.23 0.31 0.21 0.19 0.03 0.067 0.056 2.96* 0.053 0.062 0.029 0.024 0.017 0.013
26 模擬物 126 97 71
0.23 0.39 0.19 0.17 0.21 0.042 0.058 0.058 0.33* 0.041 0.057 0.042 0 0.022 0.031
模擬物 HER2標準_1 模擬物 107 120
0.19 0.082 0.066 0.081 0.19 0.14 0 0.17 0 0.032 0.066 0.028 0.014 0.022 0.015
HER2標準_1 97 121 124 70
0.15 0.12 0.045 0.16 0.19 0.042 0.05 0.058 0.17* 0.05 0.027 0.029 0.00858 0.029 0.00597
121 130 HER2標準_1 130 111
0.14 0.08 0.074 0.13 0.12 0.098 0 0.081 0.037 0.052 0.016 0.015 0 0.014 0.0081
實例5：IRES對細胞毒性之影響
評估包含基礎CD19 CAR構築體以及表1A中所描述之不同IRES之oRNA構築體(參見例如，表1B)，包括對應於SEQ ID NO: 1、4-15之IRES序列在兩個供體(供體4003及供體609C)中之Nalm6溶解%。來自兩個健康供體(609C；4003)之CD3+ T細胞用αCD3/CD28四聚複合物活化3天且隨後用CD19 CAR oRNA序列電穿孔。在24小時及48小時時評估各CD19CAR基礎oRNA構築體之Nalm6殺傷以及模擬物陰性對照、單獨Nalm6及單獨基礎。參見圖7A至圖7B。點水平線反映在24及48小時時間點使用對照CD19 CAR oRNA基礎構築體(3276)之Nalm6殺傷。 實例6：細胞毒性 A.細胞毒性(69個構築體)
來自兩個健康供體(609C；4003)之CD3+ T細胞用αCD3/CD28四聚複合物活化3天且隨後用CD19CAR oRNA序列電穿孔。評估包括表5之69個構築體的74個總序列，其包含5個包含SEQ ID NO: 19-23 (表2A之5個經密碼子最佳化序列)之CD19CAR序列及18個IRES序列(包括對照)之組合。電穿孔後24小時，經轉染T細胞與Nalm6細胞共培養至多48小時。在24小時及48小時時評估各CD19CAR oRNA構築體之Nalm6殺傷，且基於Nalm6殺傷在24小時對所有構築體進行排序。點水平線反映在24及48小時時間點使用對照CD19 CAR oRNA基礎構築體(3276)之Nalm6殺傷。
圖8A至圖8B及下表展示跨越某些構築體之梯度，其中某些構築體表現得比基礎好。圖9A至圖9D呈現與圖8A至圖8B相同之細胞毒性資料，但對於兩個供體而言第1天及第2天，藉由表1A中之IRES (包括包含表1A之SEQ ID NO: 1-15之IRES及對應於基礎CD19對照之IRES)及表2A中之表現序列組織。
表-供體609C (細胞毒性)
構築體編號 24小時 48小時
180 82.47 94.26 99.83 88.28
101 72.26 81.07 97.48 90.96
177 73.46 79.66 99.3 99.86
164 77.31 63.82 99.42 94.53
116 72.3 62.95 99.48 93.29
7 54.22 69.98 97.14 71.58
161 54.38 66.14 97.65 97.55
67 68.49 51.85 98.96 82.72
86 57.35 49.01 91.98 87.07
10 57.74 45.42 17.95 54.97
114 44.83 56.02 79.97 69.84
167 50.01 46.4 96.99 75.15
97 40.88 54.2 73.19 61.54
87 48.07 46.87 68.47 60.87
81 46.21 47.9 94.59 88.67
51 49.97 43.35 57.7 46.32
1 40.97 51.64 65.48 53.55
170 38.78 52.68 59.99 57.11
131 46.25 43.41 69.35 53.78
104 47.21 42.14 23.61 50.69
90 43.32 43.42 96.65 64.33
166 43.33 43.35 74.59 63.71
74 37.07 49.22 64.39 63.58
100 35.55 45.84 94.07 80.59
77 33.67 47.04 37.12 29.73
120 44.55 34.14 21.06 41.83
176 37.43 39.09 66.66 53.82
56 36.33 38.22 17.58 50.35
54 32.47 31.56 39.74 43.57 40.91
64 35.31 33.68 67.78 58.17
17 30.28 36.02 36.52 54.59 53.72
11 30.34 37.59 81.38 66.48
91 35.71 34.52 31.65 64.43 55.96
126 20.54 46.96 11.28 10.29
171 32.24 35.25 91.99 70.07
36 35.83 31.36 66.75 40.24
31 36.7 30.02 48.7 39.85
57 34.55 32.07 84.31 68.29
14 30.75 35.34 55.87 44.05
130 19.37 44.52 18.27 19.24 19.19
37 29.61 34.24 62.62 48.96
71 28.23 34.26 77.87 50.88
134 29.23 32.53 29.88 46.09
94 28.51 33.15 44.42 31.05
80 30.98 29.93 54.84 44.52
66 29.56 30.69 76.9 72.33
24 11.57 48.39 12.55 11.18
96 29.77 29.91 52.02 32.35
40 29.42 28.99 74.42 59.57
136 31.34 28.04 25.67 74.52 65.51
137 24.52 28.72 28.08 47.09 36.73
61 26.37 26.82 39.57 30.87
110 24.19 24.62 39.51 17.47
34 23.6 24.86 43.28 27.4
111 16.2 29.21 45.69 59.32
70 25.21 19.8 31.08 31.29
140 19.92 22.47 20.23 48.47
106 16.52 24.97 64.57 50.56
20 13.03 23.51 20.73 13.61
76 17.4 18.49 34.25 18.25
107 17.3 16.75 37.66 25.44
121 15.41 18.29 16.45 22.58
26 10.96 22.16 14.97 14.86
27 13.72 14.92 57.7 32.66
127 2.7 12.85 3.5 3.11
124 3.15 10.52 18.67 15.48
模擬物 3.68 20.55 14.35 19.67 18.38
單獨Nalm6 A -6.09 -1.05 0.36 1.56
單獨Nalm6 B 6.09 1.05 -0.36 -1.56
PL3276.1*
PL3276.2 30.74 37.05 75.91 73.75
表-供體4003 (細胞毒性)
供體4003
構築體編號 24小時 48小時
161 82.07 96.59 95.34 94.55 95.66
74 72.42 93.48 95.92 99.87
100 82.18 73.54 -0.82 -15.45
177 72.49 72.33 92.42 98.85 98.39
114 66.9 60.59 88.82 82.94
1 65.83 56.91 68.18 99.96 99.03
167 42.45 66.65 99.9 97.3
11 41.33 67.52 99.61 99.19
120 42.12 62.76 29.21 32.94
67 53.2 49.86 36.92 26.15
54 49.35 49.85 46.19 30.5
166 43.19 52.24 47.79 48.65
101 51.86 39.2 45.65 49.91 32.88
27 47.8 42.77 15.45 17.24
134 50.02 37.41 59.67 40.79
116 49.3 37.15 41.38 27.21
7 36.2 42.97 49.86 71.98 0.2 19.92
164 38.03 46.68 42.48 34.38
70 33.71 49.2 31.1 28.42
51 47.51 41.68 34.37 42.39 22.13
87 38.23 42.17 52.26 53.98
131 35.64 42.33 54.41 35.62
97 39.91 37.95 17.42 30.36
80 35.32 42.43 20.7 21.77
37 39.48 36.72 99.82 99.81
24 31.64 42.49 16.79 5.88
86 30.49 40.88 53.23 20.11
26 31.09 24.27 45.6 21.73 25.58
176 36.89 27.19 -39.29 -1.09
104 36.13 29.29 30.11 27.42 18.1
17 40.86 22.09 67.06 55.07
57 29.99 31 46.16 46.3
90 30.29 27.67 32.92 28.97
130 37.81 19.66 12.68 5.09
10 27.93 31.85 24.06 24.62 18.81
180 23.14 31.97 56.71 24.62
136 25.31 29.72 43.45 44.03
20 21.97 24.62 35.85 -56.38 -9.6
171 26.48 27.24 20.75 45.25 25.48
34 26.22 22.48 23.08 16.9
36 28.52 19.96 24.21 38.59 35.78
77 24.08 20.69 24.45 20.86
56 18.5 25.39 21.38 28.7 22.11 21.25
66 21.96 21.16 -24.9 -3.67
170 17.4 22.07 42.8 42.58
64 20.12 19.01 16.55 8.62
31 21.26 17.77 37.89 27.69
126 8.62 29.94 20.47 20.84
110 21.86 15.09 17.68 22.17
91 17.42 18.01 27.14 22.06
140 16.51 16.48 22.75 20.98
76 16.59 15.86 25.11 23.59
61 17.37 14.91 29.58 25.06 23.1
96 16.69 16.26 13.01 27.07 26.36
71 14.31 16.06 26.14 23.43
94 14.17 14.13 29.96 29.18
40 18.59 9.03 -15.65 -0.65
106 14.66 12.69 19.27 11.37
81 15.11 10.29 -16.59 -0.47
107 8.08 11.77 13.21 29.86 27.01
14 16.68 5.03 35.76 25.75
111 8.1 12.36 18.59 9.42
121 9.76 7.55 30.91 24.92
137 6.3 9.98 29.17 26.4
124 11.62 0.53 11.61 28.24
127 -4.27 -3.68 -14.9 0.37 -8.26
模擬物 -4 13.88 14.87 18.18 19.52
單獨Nalm6_1 5.93 6.74 -0.39 -0.04 -6.8
單獨Nalm6_2 -5.93 -6.74 0.39 0.04
3276_1 44.73 52.2 57.63 49.11
B.細胞介素產生及細胞毒性之比較
收集共同培養物上清液且使用Meso Scale Discovery (MSD) (Agilent Technologies，Santa Clara，CA)針對IFNγ (圖10A-D)及IL-2表現(圖10E-H)進行分析。來自兩個健康供體(609C，第一列；4003，第二列)之CD3+ T細胞用αCD3/CD28四聚複合物活化3天，且隨後用CD19CAR oRNA序列電穿孔。評估74個總序列，其包含5個包含SEQ ID NO: 19-23 (表2A之5個經密碼子最佳化序列)之CD19CAR序列及18個IRES序列(其包括表1A中對應於SEQ ID NO: 1-15之IRES序列)之組合(參見例如，表1B)。電穿孔後24小時，經轉染T細胞與Nalm6細胞共培養至多48小時。在24小時及48小時時間點，收集上清液且經由MSD定量IL-2及IFN-γ量。 實例7：細胞毒性(表6之12個構築體)
藉由在3天內(24、48、72小時)投與環狀RNA構築體且評估2 E:T下之細胞毒性至多72小時評估表6之12個環狀RNA構築體的細胞毒性、基於發光及Incucyte之細胞毒性讀數及來自發光盤之細胞介素讀數。CD3+ T細胞用αCD3/CD28四聚複合物活化3天，且隨後用表3之經PEG改質之脂質86(式I之脂質)轉染，遞送HER2構築體(HER2_9，表9)、含有非最佳化CAR序列之基礎CD19 CAR構築體(包含SEQ ID NO: 21之3276)或SEQ ID NO: 52之IRES/CO純系編號37之CD19 CAR構築體(表5)。轉染後24小時，以1:20 T細胞與Nalm6比率將T細胞與GFP+ Nalm6 B-ALL細胞共培養。添加膜聯蛋白V以標記死細胞。經由Incucyte每2小時使共培養物成像以鑑別Nalm6、死細胞/垂死細胞及死細胞/垂死Nalm6細胞。結果繪製為死細胞/垂死Nalm6細胞除以總Nalm6細胞之百分比。參見圖11。此等資料展示與基礎CD19 CAR構築體(3276)相比及與具有模擬物陰性對照之HER2 oRNA相比及與單獨Nalm6相比，包含SEQ ID NO: 43序列之oRNA構築體。 實例8：活體外實驗(12個構築體)
十二個oRNA構築體經設計以包含IRES與經密碼子最佳化序列之組合(表6)且針對以下進行測試：(1)包含非最佳化CD19 CAR表現序列及用於表現之嵴病毒屬IRES之基礎oRNA構築體，及(2)包含HER2 CAR表現序列之oRNA構築體。模擬物構築體(媒劑對照)用作陰性對照。oRNA構築體使用此項技術中之標準操作電穿孔至來自單個供體(供體9003)之經活化T細胞中。隨後將細胞培育隔夜。參見圖12A，展示96小時內之T細胞%。
電穿孔T細胞後24、48、72及96小時收集CD19 CAR之表現。電穿孔之後24小時，T細胞用活/死IR染色、Fc阻斷及生物素化抗FMC63及生物素化抗HER2抗體、CD3、鏈黴抗生物素蛋白抗體染色且隨後培育。細胞隨後用染色緩衝液洗滌。
分析來自上文之相同oRNA構築體，包括基礎oRNA及編碼HER2之oRNA構築體以及模擬物構築體之細胞毒性。該等oRNA構築體經電穿孔於T細胞或Nalm6盤(僅Nalm 6對照盤)中。T細胞來自兩個供體(供體4003及供體9003)。隨後，T細胞與Nalm6細胞以1:20之E:T比率共培養。在電穿孔後24小時及48小時，使用FACS分析細胞毒性。共培養細胞連同單獨Nalm6細胞兩者均用膜聯蛋白V紅染色且隨後在標準組織培養培育箱(Incucyte)中掃描。參見圖12B(電穿孔後48小時內CAR + MFI)及12C(對於構築體第7、164、17及171號72小時內膜聯蛋白V+Nalm6，與基礎CD19及HER2對照、模擬物陰性對照及單獨Nalm6相比)。 實例9：IRESCO構築體增強活體內腫瘤功效
對NSG小鼠植入Nalm6-螢光素酶(Luc)腫瘤細胞，且4天後植入人類PBMC。第5天開始，小鼠每隔一天用1.0 mg/kg、0.3 mg/kg及0.1 mg/kg劑量之媒劑(PBS)、對照或抗CD19 LNP-oCAR化合物處理4次。PBS對照代表僅具有經植入Nalm6-luc腫瘤細胞且經媒劑處理之小鼠。本文所用之LNP包含表3之PEG可離子化脂質86。隨後動物經由IVIS進行全身成像以監測來自Nalm6細胞之螢光素酶表現。將Nalm6腫瘤負荷繪製為在各成像時間點時之螢光素酶表現之肝、脾、腎、肺及心臟的總通量(所關注區上之光子/秒)。
圖14展示包含SEQ ID NO: 50、52及55 (IRES/CO純系編號7、37及87)之CD19 oCAR構築體與基礎CD19 CAR對照、PBS及HER2對照構築體相比具有更高抗腫瘤功效。圖15顯示包含SEQ ID NO:56、51、58及55(IRES/CO純系編號97、17、164及87)之CD19 oCAR構築體與PBS及HER2對照構築體相比具有更高抗腫瘤功效。 實例10：在4個劑量LNP/oCAR之後觀測到所有脂質之抗腫瘤功效
隨時間推移觀測具有針對HER2及CD19之表現序列的oRNA構築體(參見例如，表1B)及評估使用LNP-環狀RNA不同脂質在4個劑量之後抗腫瘤功效之影響的總通量(光子/秒)，其中亦評估轉移媒劑中之PEG脂質的作用。對NSG小鼠植入Nalm6-螢光素酶(Luc)腫瘤細胞，且3天後植入人類PBMC。第1天開始，小鼠每隔一天用媒劑(PBS)或抗CD19 LNP-oCAR化合物處理4次。以5.7之可離子化脂質與磷酸鹽比率(IL:P)遞送由對照脂質(11及62)之經PEG改質之脂質及式I之脂質(包括表3之脂質16、45及86)構成的oCAR構築體。此等LNP之可離子化脂質:輔助脂質:膽固醇:PEG-脂質莫耳比為50:10:38.5:1.5。LNP之調配物進一步詳述於下文中。PBS對照代表僅具有經植入Nalm6-luc腫瘤細胞且經媒劑處理之小鼠。隨後動物經由IVIS進行全身成像以監測來自Nalm6細胞之螢光素酶表現。作為在各成像時間點時之螢光素酶表現之總通量繪製Nalm6腫瘤負荷。參見圖16。
調配物 可離子化脂質 輔助脂質 PEG- 脂質 可離子化脂質 : 輔助脂質 : 膽固醇 : PEG - 脂質 ( Mol %) HER2/CD19 Z 平均值 (nm) RNA 囊封效率 (%) PDI
3-126 [5.7A] 表3之脂質126 DSPC DMG-PEG 2000 50 : 10 : 38.5 : 1.5 HER2 93 93 0.03
CD19 81 96 0.07
(3-128)/3L [5.7A] 表3之脂質128 DSPC DMG-PEG 2000 50 : 10 : 38.5 : 1.5 HER2 97 97 0.04
CD19 82 95 0.02
(3-128)/3 [5.5A] 表3之脂質128 DSPC DMG-PEG 2000 50 : 10 : 38.5 : 1.5 HER2 97 97 0.14
CD19 106 96 0.15
(3-16)/3 [5.5A] 表3之脂質16 DSPC DMG-PEG 2000 50 : 10 : 38.5 : 1.5 HER2 91 91 0.06
CD19 65 96 0.05
(3-45)/3 [5.5A] 表3之脂質45 DSPC DMG-PEG 2000 50 : 10 : 38.5 : 1.5 HER2 97 97 0.03
CD19 67 96 0.05
(3-86)/3 [5.5A] 表3之脂質86 DSPC DMG-PEG 2000 50 : 10 : 38.5 : 1.5 HER2 94 94 0.05
CD19 81 94 0.03
實例11：包含抗HER2結合子之環狀RNA構築體
設計及評估包含抗HER2結合子之其他環狀RNA構築體。表9中之某些環狀RNA構築體包括miR-122位點。 表9：額外密碼子-IRES構築體(HER2)
IRES/CO 純系編號 IRES SEQ ID NO: 密碼子NT SEQ ID NO:
HER2_1 16 101
HER2_2 17 101 包括miR-122位點：SEQ ID NO: 200
HER2_3 8 101
HER2_4 18 101
HER2_5 16 102
HER2_6 17 102 包括miR-122位點：SEQ ID NO: 200
HER2_7 8 102
HER2_8 18 102
HER2_9 17 132
HER2_10 17 133
A.細胞毒性分析
設計兩種oRNA構築體(表9中之HER2_9及HER2_10)，其包含IRES與針對HER2之表現序列的組合。構築體之IRES-CO序列闡述於SEQ ID NO: 136及137中：
HER2_9： GTGGCCACGCCCGGGCCACCGATACTTCCCTTCACTCCTTCGGGACTGTTGGGGAGGAACACAACAGGGCTCCCCTGTTTTCCCATTCCTTCCCCCTTTTCCCAACCCCAACCGCCGTATCTGGTGGCGGCAAGACACACGGGTCTTTCCCTCTAAAGCACAATTGTGTGTGTGTCCCAGGTCCTCCTGCGTACGGTGCGGGAGTGCTCCCACCCAACTGTTGTAAGCCTGTCCAACGCGTCGTCCTGGCAAGACTATGACGTCGCATGTTCCGCTGCGGATGCCGACCGGGTAACCGGTTCCCCAGTGTGTGTAGTGCGATCTTCCAGGTCCTCCTGGTTGGCGTTGTCCAGAAACTGCTTCAGGTAAGTGGGGTGTGCCCAATCCCTACAAAGGTTGATTCTTTCACCACCTTAGGAATGCTCCGGAGGTACCCCAGCAACAGCTGGGATCTGACCGGAGGCTAATTGTCTACGGGTGGTGTTTCCTTTTTCTTTTCACACAACTCTACTGCTGACAACTCACTGACTATCCACTTGCTCTGTCACGATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACTCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGCCGGGCCAGCCAGGATGTGAATACTGCTGTCGCCTGGTATCAACAAAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTACAGCGCCAGCTTTCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCTCCGGAAGCAGAAGCGGCACAGATTTCACACTGACCATAAGCAGCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGCACTACACCACACCTCCAACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTCGAGATTAAGAGAACAGGCAGCACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGATCTGGCGAGGGCTCTGAAGTCCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCAGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGCCAGGATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTGCCGACACCAGCAAGAATACCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTATTACTGTTCCAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTCGTGACCGTTTCTTCTATCGAAGTGATGTACCCTCCACCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTACTCTCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA        (SEQ ID NO: 136)
HER_10： GTGGCCACGCCCGGGCCACCGATACTTCCCTTCACTCCTTCGGGACTGTTGGGGAGGAACACAACAGGGCTCCCCTGTTTTCCCATTCCTTCCCCCTTTTCCCAACCCCAACCGCCGTATCTGGTGGCGGCAAGACACACGGGTCTTTCCCTCTAAAGCACAATTGTGTGTGTGTCCCAGGTCCTCCTGCGTACGGTGCGGGAGTGCTCCCACCCAACTGTTGTAAGCCTGTCCAACGCGTCGTCCTGGCAAGACTATGACGTCGCATGTTCCGCTGCGGATGCCGACCGGGTAACCGGTTCCCCAGTGTGTGTAGTGCGATCTTCCAGGTCCTCCTGGTTGGCGTTGTCCAGAAACTGCTTCAGGTAAGTGGGGTGTGCCCAATCCCTACAAAGGTTGATTCTTTCACCACCTTAGGAATGCTCCGGAGGTACCCCAGCAACAGCTGGGATCTGACCGGAGGCTAATTGTCTACGGGTGGTGTTTCCTTTTTCTTTTCACACAACTCTACTGCTGACAACTCACTGACTATCCACTTGCTCTGTCACGATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACTCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGCCGGGCCAGCCAGGATGTGAATACTGCTGTCGCCTGGTATCAACAAAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTACAGCGCCAGCTTTCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCTCCGGAAGCAGAAGCGGCACAGATTTCACACTGACCATAAGCAGCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGCACTACACCACACCTCCAACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTCGAGATTAAGAGAACAGGCAGCACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGATCTGGCGAGGGCTCTGAAGTCCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCAGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGCCAGGATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTGCCGACACCAGCAAGAATACCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTATTACTGTTCCAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTCGTGACCGTTTCTTCTACCACCACACCAGCTCCTCGGCCTCCAACTCCTGCTCCTACAATTGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCTCCTCTGGCCGGAACATGTGGCGTTCTGCTGCTGAGCCTGGTCATCACCCTGTACTGTAAGCGGGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACACAAGAGGAAGATGGCTGCTCCTGCAGATTCCCCGAGGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA   (SEQ ID NO: 137)
在IncuCyte細胞毒性分析中測試兩種oRNA構築體HER2_9及HER2_10針對對照CD19CAR oRNA基礎構築體3276 (經密碼子最佳化)及模擬物陰性對照。來自單個供體(9003)之活化T細胞(來自BT-474細胞株)用LNP-oCAR (200ng/0.1e6 T細胞)活體外轉染。轉染後24小時，評估CAR-T細胞之表現且隨時間推移與目標細胞(2:1 E:T)共培養五天。參見圖17。HER2_9及HER2_10兩者以目標依賴性方式展現出細胞毒性功能。 B.   HER2及CD19 oCAR細胞毒性
使用基於FACS之細胞毒性分析，使用經工程化之HER2/K562細胞株(HER2-28ζ或HER2-BBζ)、CD19/K562細胞株(CD19-28ζ或CD19-BBζ)及Nalm6細胞株(CD19+/HER2-)，評估HER2.BBζ oCAR構築體、HER2 28ζ oCAR構築體及CD19 oCAR構築體針對基礎CD19 CAR對照及模擬物陰性對照之目標溶解%。所有oCAR構築體均電穿孔至經活化T細胞中以形成CAR-T細胞。隨後在37℃下將CAR-T細胞與目標細胞共培養(2:1 E:T，1:1 E:T，及1:2 E:T)持續24小時。目標細胞使用K562細胞株作為主鏈(過度表現HER2或CD19之K562細胞、GFP及螢光素酶)工程化。共培養之後24小時，使用單個時間點FACS分析評估CAR-T細胞以確定死GFP陽性目標細胞之數目。參見圖18A至圖18C。HER2及CD19 CAR oCAR構築體均能夠引發目標特異性殺傷。 實例12：包含抗BCMA結合子之環狀RNA構築體
設計及評估包含抗BCMA結合子之其他環狀RNA構築體。參見下表8。
包含BCMA_16之oCAR構築體經設計以包含IRES與針對BCMA表面表現之表現序列的組合。來自供體4003之人類T細胞用αCD3/αCD28活化。活化後兩天，BCMA_16 oCAR構築體、CD19基礎構築體及模擬物陰性對照經Nucleofect (50ng oCAR/o.1e6 T細胞)電穿孔。24小時後，T細胞與MM.1s、U266B1或Nalm 6 (CD19+/HER2-)細胞株一起共培養，在E:T=1:1及2:1下經由細胞死亡之總積聚分析目標特異性細胞毒性持續三天。參見圖19A至圖19C。BCMA_16及CD19 (基礎) oCAR展現出目標特異性殺傷。
BCMA_16構築體之IRES-CO序列闡述於SEQ ID NO: 138中： GTGGCCACGCCCGGGCCACCGATACTTCCCTTCACTCCTTCGGGACTGTTGGGGAGGAACACAACAGGGCTCCCCTGTTTTCCCATTCCTTCCCCCTTTTCCCAACCCCAACCGCCGTATCTGGTGGCGGCAAGACACACGGGTCTTTCCCTCTAAAGCACAATTGTGTGTGTGTCCCAGGTCCTCCTGCGTACGGTGCGGGAGTGCTCCCACCCAACTGTTGTAAGCCTGTCCAACGCGTCGTCCTGGCAAGACTATGACGTCGCATGTTCCGCTGCGGATGCCGACCGGGTAACCGGTTCCCCAGTGTGTGTAGTGCGATCTTCCAGGTCCTCCTGGTTGGCGTTGTCCAGAAACTGCTTCAGGTAAGTGGGGTGTGCCCAATCCCTACAAAGGTTGATTCTTTCACCACCTTAGGAATGCTCCGGAGGTACCCCAGCAACAGCTGGGATCTGACCGGAGGCTAATTGTCTACGGGTGGTGTTTCCTTTTTCTTTTCACACAACTCTACTGCTGACAACTCACTGACTATCCACTTGCTCTGTCACGATGGCACTCCCGGTAACCGCCTTATTGCTTCCCCTTGCCCTCTTGCTCCACGCAGCACGCCCCGATATAGTCTTGACTCAATCCCCACCCAGTTTGGCAATGTCATTAGGCAAACGAGCAACAATTTCATGTAGGGCATCCGAAAGTGTAACGATTTTGGGGAGTCATTTAATTCATTGGTACCAACAAAAGCCTGGACAACCCCCGACGCTCTTGATCCAATTAGCATCTAACGTCCAAACCGGAGTCCCCGCACGATTCTCAGGATCCGGTTCCCGGACTGATTTTACATTAACTATTGATCCGGTAGAGGAAGATGACGTCGCTGTCTATTATTGTCTTCAAAGTAGGACGATTCCACGGACATTCGGTGGCGGAACTAAATTGGAGATTAAAGGTTCCACCTCTGGTAGTGGGAAACCCGGGTCCGGTGAAGGGTCCACTAAAGGCCAAATTCAACTCGTTCAATCCGGACCAGAACTGAAGAAGCCAGGAGAAACTGTCAAAATAAGCTGTAAAGCTTCCGGTTATACATTTACAGATTATTCCATAAATTGGGTGAAAAGGGCGCCAGGAAAAGGGTTAAAGTGGATGGGTTGGATTAATACAGAGACTCGGGAACCTGCATATGCTTATGATTTTAGGGGAAGGTTTGCCTTTTCTCTGGAGACTTCCGCTTCAACTGCTTATCTCCAAATTAATAATCTTAAATATGAGGACACAGCAACATACTTCTGTGCTTTGGACTATAGTTATGCTATGGATTACTGGGGACAAGGAACCAGTGTCACTGTAAGTTCCGCTGCTGCGACGACCACTCCTGCACCGCGACCACCCACTCCTGCCCCTACTATTGCTAGTCAACCACTTAGCTTGCGACCTGAGGCATGTCGGCCCGCGGCAGGTGGCGCAGTCCACACCAGGGGTTTAGACTTTGCTTGTGATATTTATATTTGGGCACCACTCGCCGGGACTTGCGGTGTTCTTCTCTTGTCCCTTGTTATAACTCTTTATTGTAAGCGCGGAAGGAAGAAATTGTTATATATTTTCAAACAACCTTTTATGCGACCCGTACAAACAACTCAGGAAGAGGACGGGTGTTCTTGTCGGTTTCCAGAAGAGGAAGAGGGTGGGTGTGAACTCCGGGTCAAATTTAGTAGGTCAGCAGATGCGCCGGCGTACCAACAAGGCCAAAACCAACTGTATAATGAACTCAATCTCGGTAGGCGTGAGGAATATGATGTCCTTGATAAAAGGCGCGGGAGAGATCCAGAAATGGGCGGAAAACCACGGCGAAAGAATCCGCAGGAAGGGTTATATAACGAACTTCAAAAGGATAAAATGGCTGAAGCTTATTCCGAAATTGGCATGAAAGGAGAGCGACGTAGGGGCAAAGGGCATGATGGCCTTTACCAAGGGCTCTCAACCGCTACAAAAGATACTTACGACGCTTTACATATGCAAGCACTTCCACCCAGG (SEQ ID NO: 138) 表8：額外密碼子-IRES構築體(BCMA)
IRES/CO 純系編號 IRES SEQ ID NO: 密碼子NT SEQ ID NO:
BCMA_1 16 103
BCMA_2 17 103
BCMA_3 8 103
BCMA_4 18 103
BCMA_5 8 104
BCMA_6 8 105
BCMA_7 8 106
BCMA_8 8 107
BCMA_9 8 108
BCMA_10 8 109
BCMA_11 8 110
BCMA_12 8 111
BCMA_13 8 112
BCMA_14 8 113
BCMA_15 8 114
BCMA_16 17 115
實例13：活體內給藥後-Nalm6植入
在植入有Nalm6腫瘤細胞之小鼠中活體內評估實例10中所描述之抗CD19oRNA-LNP構築體，且比較給藥時程(植入後每隔一天給藥、植入後每週給藥以及植入後每隔一週給藥)。在四個PBMC供體中以1.0 mg/kg、0.3 mg/kg及0.1 mg/kg之劑量評估劑量時序組(兩個研究，每個研究兩個供體，A及B)。實驗方案展示於下表中。
對NSG MHC I/II雙基因剔除小鼠植入Nalm6-螢光素酶(Luc)腫瘤細胞，且4天後植入人類PBMC。在Nalm6植入後第5天開始，小鼠用本文所示之CD19 oRNA-LNP、PBS對照或HER2對照處理4次(如下表中之給藥日欄所示)。隨時間推移觀測CD19 oRNA構築體之總通量(光子/秒)。隨後動物經由IVIS每週兩次進行全身成像以監測來自Nalm6細胞之螢光素酶表現。
# oRNA 劑量(mg/kg) 劑量之編號 劑量時序 給藥天數(Nalm6後) LNP調配物 小鼠/組 PBMC供體
1 1X PBS N/A 4 1X/週 5、12、19、26 N/A 5 A
2 HER2 CAR 1.0 4 1X/週 5、12、19、26 1X TSS, -80C 5 A
3 CD19 CAR 1.0 4 1X/週 5、12、19、26 1X TSS, -80C 8 A
4 CD19 CAR 0.3 4 1X/週 5、12、19、26 1X TSS, -80C 8 A
5 CD19 CAR 0.1 4 1X/週 5、12、19、26 1X TSS, -80C 8 A
6 1X PBS N/A 4 每隔一週 5、19、33、47 N/A 5 A
7 HER2 CAR 1.0 4 每隔一週 5、19、33、47 1X TSS, -80C 5 A
8 CD19 CAR 1.0 4 每隔一週 5、19、33、47 1X TSS, -80C 8 A
9 CD19 CAR 0.3 4 每隔一週 5、19、33、47 1X TSS, -80C 8 A
10 CD19 CAR 0.1 4 每隔一週 5、19、33、47 1X TSS, -80C 8 A
11 1X PBS N/A 4 1X/週 5、12、19、26 N/A 5 B
12 HER2 CAR 1.0 4 1X/週 5、12、19、26 1X TSS, -80C 5 B
13 CD19 CAR 1.0 4 1X/週 5、12、19、26 1X TSS, -80C 8 B
14 CD19 CAR 0.3 4 1X/週 5、12、19、26 1X TSS, -80C 8 B
15 CD19 CAR 0.1 4 1X/週 5、12、19、26 1X TSS, -80C 8 B
16 1X PBS N/A 4 每隔一週 5、19、33、47 N/A 5 B
17 HER2 CAR 1.0 4 每隔一週 5、19、33、47 1X TSS, -80C 5 B
18 CD19 CAR 1.0 4 每隔一週 5、19、33、47 1X TSS, -80C 8 B
19 CD19 CAR 0.3 4 每隔一週 5、19、33、47 1X TSS, -80C 8 B
20 CD19 CAR 0.1 4 每隔一週 5、19、33、47 1X TSS, -80C 8 B
經CD19 oRNA-LNP處理之動物展現出腫瘤控制及與用本文所描述之HER2 oRNA構築體處理之對照相比改進之存活率。每週給藥之腫瘤控制展示於圖20中。對每隔一週給藥之腫瘤對照展示於圖21A-C及圖22中。在用每隔一週給藥處理之動物中觀測到腫瘤對照持續至多56天。圖23A及圖23B展示CD19 oRNA-LNP與對照相比之腫瘤控制。 實例14：編碼抗BCMA CAR之環狀RNA的表現
編碼抗BCMA CAR之環狀RNA的活體外表現
將來自單一供體之T細胞用抗CD3及CD28珠粒活化3天且使其靜置24小時。同時，設計經工程化之環狀RNA構築體以編碼BCMA-41BBζ嵌合抗原受體(CAR)。出於比較目的，「模擬物」或對照環狀RNA編碼HER2或CD19 CAR。環狀RNA由包含以下之DNA的活體外轉譯(IVT)反應開發：T7聚合酶啟動子；經排列念珠藻屬內含子外顯子區段；來自山羊嵴病毒、匈奴病毒、森鼠小核糖核酸病毒或小核糖核酸病毒目內部間隔子之內部核糖體進入位點(IRES)；視情況選用之內部同源臂；及X1ab限制位點。DNA模板包含來自下表之序列。供體T細胞用環狀RNA以每0.1x10 6個T細胞10 ng、30 ng或100 ng電穿孔以形成CAR-T細胞。作為對照，分析未經環狀RNA電穿孔之「模擬物」T細胞。接著使T細胞在電穿孔之後靜置24小時。電穿孔之後24小時，對CAR-T細胞進行計數且評估BCMA CAR表現。向所得具有抗BCMA CAR編碼區之環狀RNA添加含有R-藻紅素(PE)螢光團之市售可溶性BCMA偵測試劑(例如來自AcroBiosystems, Delaware)、抗惠特洛PE連接子抗體偵測試劑或抗G4S連接子PE偵測試劑(例如G4S-AF647)。使用此項技術中已知的螢光活化細胞分選(FACS)及圈選流動式細胞量測術方法(例如圖26中針對經衍生自DNA模板B且以每0.1X10 6個T細胞10 ng之劑量使用之環狀RNA電穿孔的T細胞所繪示)在電穿孔後24至72小時中之一或多個時間點評估抗BCMA、CD19或HER2表現。
圖24A提供在24小時、48小時及72小時收集之三種不同劑量之環狀RNA構築體中之各者的流動式細胞量測術直方圖。圖24B展示在24小時收集之三種不同劑量之環狀RNA構築體中之各者的gMFI表現。圖25A、圖25D至圖25F描繪藉由可溶性BCMA PE、抗惠特洛PE或抗G4S連接子PE偵測試劑偵測之CAR表現百分比。圖25B及圖25G分別為對於三種劑量中之各者，在電穿孔後24小時至96小時內之gMFI及平均MFI %。圖25C繪示在電穿孔後24小時藉由可溶性BCMA偵測試劑偵測之BCMA CAR的FACS成像。 表α1
ID 內部核糖體進入位點(IRES)序列 CAR序列 CAR序列
DNA模板A (構築體A) CCCCCCTCCCCCCCTTCCCTTCCCTTTGCAACGCAACAATTGTAAGTGCCCTCACCTGTCAATTGGGACCACCACTTTCAGTGACCCCATGCGAAGTGCTGAGAGAAAGGAAGCTTTCTTACCCTTCATTTGTGAACCCACTGGTCTAAGCCGCTTGGAATACGATGAGTGGAAAAGTTCATTCTTAATGGAGTGAAACATGCTTAAATTTCCAGCTCGTGCTGGTCTTTCCAGTACGGGGCGGCCCTGTCTGGCCGTAATTCTTCAGAGTGTCACGCCACACTTGTGGATCTCACGTGCCACATGACAGCGCTACAGCTGGAACTGGGTGCTTGGTGCCCATGGAGTAACAGCGAAAAGTGTTAGATCAAGCCTTGCTTGGGCTATGAGCCTGCGGAACAACAACTGGTAACAGTTGCCTCAGGGGCCGAAAGCCACGGTGTTAACAGCACCCTCATAGTTTGATCCACCTCAGGGTGGTGATGTTTAGCAGTTAGTAGTTGCCAATCTGTGTTCACTGAAATCTCGGCATACCGTGTAGTGTACAGGGGTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCGTAGGTAACCTTAAGAGACTATGGATCTGATCTGGGGCCTTGTCCGGAGTGCTTTACACACGGCTCAAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCACAGAGCCCGAGGGATTCGGGTTTTCCCTTTAAAAACCCGACTAGAGCTTATGGTGACAATTATTGCTGTTCAGACGAACAGTGTAATTGTTGTCTATTCACAGCAGTTCTATCAGAGCTTTTCCCACAACGGATCTTCTTGGCAAGCAAATACAGCAGGAGTCAAT (SEQ ID NO: 8) ATGGCTCTCCCCGTGACCGCTCTGCTGCTCCCTCTGGCCCTCCTTCTGCACGCAGCCAGACCACAGGTCAAGCTGGAGGAGTCTGGTGGCGGTCTGGTGCAGGCAGGGAGGAGCCTGAGGCTGAGCTGTGCAGCTTCCGAGCACACATTCTCAAGCCACGTCATGGGGTGGTTCAGACAGGCTCCCGGTAAAGAGAGGGAGTCCGTCGCCGTGATCGGATGGCGGGACATCTCCACCTCCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACAATCTCACGCGATAATGCCAAGAAGACACTGTATCTGCAGATGAATTCCTTGAAGCCCGAAGACACCGCCGTCTATTACTGTGCTGCTAGACGGATCGACGCTGCCGACTTCGACAGCTGGGGACAGGGTACCCAAGTGACCGTTTCCTCCGGAGGCGGAGGTTCTGGAGGAGGTGGGTCAGGTGGAGGTGGCTCCGAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGCTTGGTCCAGGCTGGAGGCAGTCTCAGACTCTCCTGCGCTGCTTCAGGGCGGACCTTCACCATGGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCAGGTAAGGAGAGGGAGTTCGTGGCCGCCATCTCCCTCTCCCCTACCCTGGCATACTACGCTGAGTCCGTGAAGGGACGGTTTACCATCTCCCGGGATAACGCAAAGAACACTGTGGTCCTCCAAATGAACTCCCTCAAACCCGAGGACACCGCTCTCTACTATTGTGCCGCAGATCGGAAGAGCGTCATGTCCATCCGGCCCGATTACTGGGGCCAAGGCACACAGGTGACTGTGTCCAGCACCTCCACCACCACCCCAGCACCAAGGCCTCCAACCCCTGCACCAACCATCGCCTCCCAGCCACTGTCTTTGCGGCCAGAAGCATGCCGCCCAGCAGCAGGTGGAGCCGTGCATACAAGAGGCCTGGACTTCGCCTGCGATATCTACATCTGGGCTCCTCTGGCCGGAACATGCGGAGTCCTGCTCTTGTCCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGCGGGGTCGGAAGAAGCTCCTCTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTCCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGGTGCTCATGCAGGTTCCCCGAAGAGGAGGAGGGTGGCTGTGAGCTGCGGGTGAAGTTCAGCAGGTCAGCAGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGTTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGAGACGGGAGGAGTACGATGTCCTTGACAAGAGAAGGGGCCGGGATCCAGAGATGGGCGGGAAGCCAAGACGGAAGAATCCTCAGGAGGGTCTGTATAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAAGGGGAGCGCCGCAGAGGAAAAGGTCACGATGGTCTGTACCAGGGGTTGAGCACCGCTACCAAGGATACTTACGACGCTCTGCACATGCAAGCTCTGCCACCCCGG (SEQ ID NO: 106) MALPVTALLLPLALLLHAARPQVKLEESGGGLVQAGRSLRLSCAASEHTFSSHVMGWFRQAPGKERESVAVIGWRDISTSYADSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAARRIDAADFDSWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFTMGWFRQAPGKEREFVAAISLSPTLAYYAESVKGRFTISRDNAKNTVVLQMNSLKPEDTALYYCAADRKSVMSIRPDYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 122)
DNA模板B (構築體B) GTGGCCACGCCCGGGCCACCGATACTTCCCTTCACTCCTTCGGGACTGTTGGGGAGGAACACAACAGGGCTCCCCTGTTTTCCCATTCCTTCCCCCTTTTCCCAACCCCAACCGCCGTATCTGGTGGCGGCAAGACACACGGGTCTTTCCCTCTAAAGCACAATTGTGTGTGTGTCCCAGGTCCTCCTGCGTACGGTGCGGGAGTGCTCCCACCCAACTGTTGTAAGCCTGTCCAACGCGTCGTCCTGGCAAGACTATGACGTCGCATGTTCCGCTGCGGATGCCGACCGGGTAACCGGTTCCCCAGTGTGTGTAGTGCGATCTTCCAGGTCCTCCTGGTTGGCGTTGTCCAGAAACTGCTTCAGGTAAGTGGGGTGTGCCCAATCCCTACAAAGGTTGATTCTTTCACCACCTTAGGAATGCTCCGGAGGTACCCCAGCAACAGCTGGGATCTGACCGGAGGCTAATTGTCTACGGGTGGTGTTTCCTTTTTCTTTTCACACAACTCTACTGCTGACAACTCACTGACTATCCACTTGCTCTGTCACG (SEQ ID NO: 17) ATGGCACTCCCGGTAACCGCCTTATTGCTTCCCCTTGCCCTCTTGCTCCACGCAGCACGCCCCGATATAGTCTTGACTCAATCCCCACCCAGTTTGGCAATGTCATTAGGCAAACGAGCAACAATTTCATGTAGGGCATCCGAAAGTGTAACGATTTTGGGGAGTCATTTAATTCATTGGTACCAACAAAAGCCTGGACAACCCCCGACGCTCTTGATCCAATTAGCATCTAACGTCCAAACCGGAGTCCCCGCACGATTCTCAGGATCCGGTTCCCGGACTGATTTTACATTAACTATTGATCCGGTAGAGGAAGATGACGTCGCTGTCTATTATTGTCTTCAAAGTAGGACGATTCCACGGACATTCGGTGGCGGAACTAAATTGGAGATTAAAGGTTCCACCTCTGGTAGTGGGAAACCCGGGTCCGGTGAAGGGTCCACTAAAGGCCAAATTCAACTCGTTCAATCCGGACCAGAACTGAAGAAGCCAGGAGAAACTGTCAAAATAAGCTGTAAAGCTTCCGGTTATACATTTACAGATTATTCCATAAATTGGGTGAAAAGGGCGCCAGGAAAAGGGTTAAAGTGGATGGGTTGGATTAATACAGAGACTCGGGAACCTGCATATGCTTATGATTTTAGGGGAAGGTTTGCCTTTTCTCTGGAGACTTCCGCTTCAACTGCTTATCTCCAAATTAATAATCTTAAATATGAGGACACAGCAACATACTTCTGTGCTTTGGACTATAGTTATGCTATGGATTACTGGGGACAAGGAACCAGTGTCACTGTAAGTTCCGCTGCTGCGACGACCACTCCTGCACCGCGACCACCCACTCCTGCCCCTACTATTGCTAGTCAACCACTTAGCTTGCGACCTGAGGCATGTCGGCCCGCGGCAGGTGGCGCAGTCCACACCAGGGGTTTAGACTTTGCTTGTGATATTTATATTTGGGCACCACTCGCCGGGACTTGCGGTGTTCTTCTCTTGTCCCTTGTTATAACTCTTTATTGTAAGCGCGGAAGGAAGAAATTGTTATATATTTTCAAACAACCTTTTATGCGACCCGTACAAACAACTCAGGAAGAGGACGGGTGTTCTTGTCGGTTTCCAGAAGAGGAAGAGGGTGGGTGTGAACTCCGGGTCAAATTTAGTAGGTCAGCAGATGCGCCGGCGTACCAACAAGGCCAAAACCAACTGTATAATGAACTCAATCTCGGTAGGCGTGAGGAATATGATGTCCTTGATAAAAGGCGCGGGAGAGATCCAGAAATGGGCGGAAAACCACGGCGAAAGAATCCGCAGGAAGGGTTATATAACGAACTTCAAAAGGATAAAATGGCTGAAGCTTATTCCGAAATTGGCATGAAAGGAGAGCGACGTAGGGGCAAAGGGCATGATGGCCTTTACCAAGGGCTCTCAACCGCTACAAAAGATACTTACGACGCTTTACATATGCAAGCACTTCCACCCAGG (SEQ ID NO: 103) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 119)
DNA模板C (構築體C) CCCCCCTCCCCCCCTTCCCTTCCCTTTGCAACGCAACAATTGTAAGTGCCCTCACCTGTCAATTGGGACCACCACTTTCAGTGACCCCATGCGAAGTGCTGAGAGAAAGGAAGCTTTCTTACCCTTCATTTGTGAACCCACTGGTCTAAGCCGCTTGGAATACGATGAGTGGAAAAGTTCATTCTTAATGGAGTGAAACATGCTTAAATTTCCAGCTCGTGCTGGTCTTTCCAGTACGGGGCGGCCCTGTCTGGCCGTAATTCTTCAGAGTGTCACGCCACACTTGTGGATCTCACGTGCCACATGACAGCGCTACAGCTGGAACTGGGTGCTTGGTGCCCATGGAGTAACAGCGAAAAGTGTTAGATCAAGCCTTGCTTGGGCTATGAGCCTGCGGAACAACAACTGGTAACAGTTGCCTCAGGGGCCGAAAGCCACGGTGTTAACAGCACCCTCATAGTTTGATCCACCTCAGGGTGGTGATGTTTAGCAGTTAGTAGTTGCCAATCTGTGTTCACTGAAATCTCGGCATACCGTGTAGTGTACAGGGGTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCGTAGGTAACCTTAAGAGACTATGGATCTGATCTGGGGCCTTGTCCGGAGTGCTTTACACACGGCTCAAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCACAGAGCCCGAGGGATTCGGGTTTTCCCTTTAAAAACCCGACTAGAGCTTATGGTGACAATTATTGCTGTTCAGACGAACAGTGTAATTGTTGTCTATTCACAGCAGTTCTATCAGAGCTTTTCCCACAACGGATCTTCTTGGCAAGCAAATACAGCAGGAGTCAAT (SEQ ID NO: 8) ATGGCACTCCCGGTAACCGCCTTATTGCTTCCCCTTGCCCTCTTGCTCCACGCAGCACGCCCCGATATAGTCTTGACTCAATCCCCACCCAGTTTGGCAATGTCATTAGGCAAACGAGCAACAATTTCATGTAGGGCATCCGAAAGTGTAACGATTTTGGGGAGTCATTTAATTCATTGGTACCAACAAAAGCCTGGACAACCCCCGACGCTCTTGATCCAATTAGCATCTAACGTCCAAACCGGAGTCCCCGCACGATTCTCAGGATCCGGTTCCCGGACTGATTTTACATTAACTATTGATCCGGTAGAGGAAGATGACGTCGCTGTCTATTATTGTCTTCAAAGTAGGACGATTCCACGGACATTCGGTGGCGGAACTAAATTGGAGATTAAAGGTTCCACCTCTGGTAGTGGGAAACCCGGGTCCGGTGAAGGGTCCACTAAAGGCCAAATTCAACTCGTTCAATCCGGACCAGAACTGAAGAAGCCAGGAGAAACTGTCAAAATAAGCTGTAAAGCTTCCGGTTATACATTTACAGATTATTCCATAAATTGGGTGAAAAGGGCGCCAGGAAAAGGGTTAAAGTGGATGGGTTGGATTAATACAGAGACTCGGGAACCTGCATATGCTTATGATTTTAGGGGAAGGTTTGCCTTTTCTCTGGAGACTTCCGCTTCAACTGCTTATCTCCAAATTAATAATCTTAAATATGAGGACACAGCAACATACTTCTGTGCTTTGGACTATAGTTATGCTATGGATTACTGGGGACAAGGAACCAGTGTCACTGTAAGTTCCGCTGCTGCGACGACCACTCCTGCACCGCGACCACCCACTCCTGCCCCTACTATTGCTAGTCAACCACTTAGCTTGCGACCTGAGGCATGTCGGCCCGCGGCAGGTGGCGCAGTCCACACCAGGGGTTTAGACTTTGCTTGTGATATTTATATTTGGGCACCACTCGCCGGGACTTGCGGTGTTCTTCTCTTGTCCCTTGTTATAACTCTTTATTGTAAGCGCGGAAGGAAGAAATTGTTATATATTTTCAAACAACCTTTTATGCGACCCGTACAAACAACTCAGGAAGAGGACGGGTGTTCTTGTCGGTTTCCAGAAGAGGAAGAGGGTGGGTGTGAACTCCGGGTCAAATTTAGTAGGTCAGCAGATGCGCCGGCGTACCAACAAGGCCAAAACCAACTGTATAATGAACTCAATCTCGGTAGGCGTGAGGAATATGATGTCCTTGATAAAAGGCGCGGGAGAGATCCAGAAATGGGCGGAAAACCACGGCGAAAGAATCCGCAGGAAGGGTTATATAACGAACTTCAAAAGGATAAAATGGCTGAAGCTTATTCCGAAATTGGCATGAAAGGAGAGCGACGTAGGGGCAAAGGGCATGATGGCCTTTACCAAGGGCTCTCAACCGCTACAAAAGATACTTACGACGCTTTACATATGCAAGCACTTCCACCCAGG (SEQ ID NO: 103) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 119)
DNA模板D (構築體D) TTTGCTCAGCGTAACTTCTCCGGGTTACGTGGAGACCAAAAGGCTACGGAGACTCGGGCTACGGCCCTGGAGCACCTAGGTGCTCCTAAAGACGTTAGAAGTTGTACAAACTCGCCCAATAGGGCCCCCCAACCAGGGGGGTAGCGGGCAAGCACTTCTGTTTCCCCGGTATGATCTCATAGGCTGTACCCACGGCTGAAAGAGAGATTATCGTTACCCGCCTCACTACTTCGAGAAGCCCAGTAATGGTTCATGAAGTTGATCTCGTTGACCCGGTGTTTCCCCCACACCAGAAACCTGTGATGGGGGTGGTCATCCCGGTCATGGCGACATGACGGACCTCCCCGCGCCGGCACAGGGCCTCTTCGGAGGACGAGTGACATGGATTCAACCGTGAAGAGCCTATTGAGCTAGTGTTGATTCCTCCGCCCCCGTGAATGCGGCTAATCCCAACTCCGGAGCAGGCGGGCCCAAACCAGGGTCTGGCCTGTCGTAACGCGAAAGTCTGGAGCGGAACCGACTACTTTCGGGAAGGCGTGTTTCCTTTTGTTCCTTTTATCAAGTTTTATGGTGACAACTCCTGGTAGACGTTTTATTGCGTTTATTGAGAGATTTCCAACAATTGAACAGACTAGAACCACTTGTTTTATCAAACCCTCACAGAATAAGATAACA (SEQ ID NO: 18) ATGGCACTCCCGGTAACCGCCTTATTGCTTCCCCTTGCCCTCTTGCTCCACGCAGCACGCCCCGATATAGTCTTGACTCAATCCCCACCCAGTTTGGCAATGTCATTAGGCAAACGAGCAACAATTTCATGTAGGGCATCCGAAAGTGTAACGATTTTGGGGAGTCATTTAATTCATTGGTACCAACAAAAGCCTGGACAACCCCCGACGCTCTTGATCCAATTAGCATCTAACGTCCAAACCGGAGTCCCCGCACGATTCTCAGGATCCGGTTCCCGGACTGATTTTACATTAACTATTGATCCGGTAGAGGAAGATGACGTCGCTGTCTATTATTGTCTTCAAAGTAGGACGATTCCACGGACATTCGGTGGCGGAACTAAATTGGAGATTAAAGGTTCCACCTCTGGTAGTGGGAAACCCGGGTCCGGTGAAGGGTCCACTAAAGGCCAAATTCAACTCGTTCAATCCGGACCAGAACTGAAGAAGCCAGGAGAAACTGTCAAAATAAGCTGTAAAGCTTCCGGTTATACATTTACAGATTATTCCATAAATTGGGTGAAAAGGGCGCCAGGAAAAGGGTTAAAGTGGATGGGTTGGATTAATACAGAGACTCGGGAACCTGCATATGCTTATGATTTTAGGGGAAGGTTTGCCTTTTCTCTGGAGACTTCCGCTTCAACTGCTTATCTCCAAATTAATAATCTTAAATATGAGGACACAGCAACATACTTCTGTGCTTTGGACTATAGTTATGCTATGGATTACTGGGGACAAGGAACCAGTGTCACTGTAAGTTCCGCTGCTGCGACGACCACTCCTGCACCGCGACCACCCACTCCTGCCCCTACTATTGCTAGTCAACCACTTAGCTTGCGACCTGAGGCATGTCGGCCCGCGGCAGGTGGCGCAGTCCACACCAGGGGTTTAGACTTTGCTTGTGATATTTATATTTGGGCACCACTCGCCGGGACTTGCGGTGTTCTTCTCTTGTCCCTTGTTATAACTCTTTATTGTAAGCGCGGAAGGAAGAAATTGTTATATATTTTCAAACAACCTTTTATGCGACCCGTACAAACAACTCAGGAAGAGGACGGGTGTTCTTGTCGGTTTCCAGAAGAGGAAGAGGGTGGGTGTGAACTCCGGGTCAAATTTAGTAGGTCAGCAGATGCGCCGGCGTACCAACAAGGCCAAAACCAACTGTATAATGAACTCAATCTCGGTAGGCGTGAGGAATATGATGTCCTTGATAAAAGGCGCGGGAGAGATCCAGAAATGGGCGGAAAACCACGGCGAAAGAATCCGCAGGAAGGGTTATATAACGAACTTCAAAAGGATAAAATGGCTGAAGCTTATTCCGAAATTGGCATGAAAGGAGAGCGACGTAGGGGCAAAGGGCATGATGGCCTTTACCAAGGGCTCTCAACCGCTACAAAAGATACTTACGACGCTTTACATATGCAAGCACTTCCACCCAGG (SEQ ID NO: 103) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 119)
DNA模板E (構築體E) ATTCTCGGGCTACGGCCCTGGAGCCACTCCGGCTCCTAAAGATTTAGAAGTTTGAGCACACCCGCCCACTAGGGCCCCCCATCCAGGGGGGCAACGGGCAAGCACTTCTGTTTCCCCGGTATGATCTGATAGGCTGTAACCACGGCTGAAACAGAGATTATCGTTATCCGCTTCACTACTTCGAGAAGCCTAGTAATGATGGGTGAAATTGAATCCGTTGATCCGGTGTCTCCCCCACACCAGAAACTCATGATGAGGGTTGCCATCCCGGCTACGGCGACGTAGCGGGCATCCCTGCGCTGGCATGAGGCCTCTTAGGAGGACGGATGATATGGATCTTGTCGTGAAGAGCCTATTGAGCTAGTGTCGACTCCTCCGCCCCCGTGAATGCGGCTAATCCTAACCCCGGAGCAGGTGGGTCCAATCCAGGGCCTGGCCTGTCGTAATGCGTAAGTCTGGGACGGAACCGACTACTTTCGGGAAGGCGTGTTTCCATTTGTTCATTATTTGTGTGTTTATGGTGACAACTCTGGGTAAACGTTCTATTGCGTTTATTGAGAGATTCCCAACAATTGAACAAACGAGAACTACCTGTTTTATTAAATTTACACAGAGAAGAATTACA (SEQ  ID NO: 16) ATGGCACTCCCGGTAACCGCCTTATTGCTTCCCCTTGCCCTCTTGCTCCACGCAGCACGCCCCGATATAGTCTTGACTCAATCCCCACCCAGTTTGGCAATGTCATTAGGCAAACGAGCAACAATTTCATGTAGGGCATCCGAAAGTGTAACGATTTTGGGGAGTCATTTAATTCATTGGTACCAACAAAAGCCTGGACAACCCCCGACGCTCTTGATCCAATTAGCATCTAACGTCCAAACCGGAGTCCCCGCACGATTCTCAGGATCCGGTTCCCGGACTGATTTTACATTAACTATTGATCCGGTAGAGGAAGATGACGTCGCTGTCTATTATTGTCTTCAAAGTAGGACGATTCCACGGACATTCGGTGGCGGAACTAAATTGGAGATTAAAGGTTCCACCTCTGGTAGTGGGAAACCCGGGTCCGGTGAAGGGTCCACTAAAGGCCAAATTCAACTCGTTCAATCCGGACCAGAACTGAAGAAGCCAGGAGAAACTGTCAAAATAAGCTGTAAAGCTTCCGGTTATACATTTACAGATTATTCCATAAATTGGGTGAAAAGGGCGCCAGGAAAAGGGTTAAAGTGGATGGGTTGGATTAATACAGAGACTCGGGAACCTGCATATGCTTATGATTTTAGGGGAAGGTTTGCCTTTTCTCTGGAGACTTCCGCTTCAACTGCTTATCTCCAAATTAATAATCTTAAATATGAGGACACAGCAACATACTTCTGTGCTTTGGACTATAGTTATGCTATGGATTACTGGGGACAAGGAACCAGTGTCACTGTAAGTTCCGCTGCTGCGACGACCACTCCTGCACCGCGACCACCCACTCCTGCCCCTACTATTGCTAGTCAACCACTTAGCTTGCGACCTGAGGCATGTCGGCCCGCGGCAGGTGGCGCAGTCCACACCAGGGGTTTAGACTTTGCTTGTGATATTTATATTTGGGCACCACTCGCCGGGACTTGCGGTGTTCTTCTCTTGTCCCTTGTTATAACTCTTTATTGTAAGCGCGGAAGGAAGAAATTGTTATATATTTTCAAACAACCTTTTATGCGACCCGTACAAACAACTCAGGAAGAGGACGGGTGTTCTTGTCGGTTTCCAGAAGAGGAAGAGGGTGGGTGTGAACTCCGGGTCAAATTTAGTAGGTCAGCAGATGCGCCGGCGTACCAACAAGGCCAAAACCAACTGTATAATGAACTCAATCTCGGTAGGCGTGAGGAATATGATGTCCTTGATAAAAGGCGCGGGAGAGATCCAGAAATGGGCGGAAAACCACGGCGAAAGAATCCGCAGGAAGGGTTATATAACGAACTTCAAAAGGATAAAATGGCTGAAGCTTATTCCGAAATTGGCATGAAAGGAGAGCGACGTAGGGGCAAAGGGCATGATGGCCTTTACCAAGGGCTCTCAACCGCTACAAAAGATACTTACGACGCTTTACATATGCAAGCACTTCCACCCAGG (SEQ ID NO: 103) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 119)
與MM1S共培養之編碼抗BCMA CAR之環狀RNA的表現
作為所用各種細胞株之初步測試，使用此項技術中已知之方法分析多發性骨髓瘤陽性細胞(例如MM1S、NCI-H929及RPMI-8226)及陰性目標細胞株(例如Nalm6目標細胞株)上之目標蛋白表現。初步測試之結果示於圖27中。
將供體T細胞解凍且用抗CD3/CD28溶液活化。在活化之後三天，洗滌細胞。第二天，將細胞用每0.1×106個T細胞一系列50 ng劑量之編碼BCMA-41BBζ或BCMA-CD28ζ CAR或CD19-CD28ζ CAR之環狀RNA電穿孔以形成經工程改造之CAR-T細胞(oCAR-T細胞)。針對6種編碼BCMA CAR之環狀RNA構築體分析選定oCAR-T細胞之活細胞百分比，且與包含CD19 28ζ CAR之環狀RNA構築體及僅包含EP緩衝液之對照進行比較(結果提供於圖28中)。環狀RNA由表α1及/或表β中存在之DNA模板形成。向細胞給予含有R-藻紅素(PE)螢光團之市售可溶性BCMA偵測試劑(例如來自AcroBiosystems, Delaware)、抗惠特洛PE偵測試劑或抗G4S連接子偵測試劑(例如G4S-AF647)。環狀RNA電穿孔至T細胞後24小時，基於FACS結果(例如圖30中所繪示)使oCAR-T細胞對活T細胞進行次圈選且收集可偵測試劑之量。結果提供於圖29A至圖29D及下表中。根據所收集之可偵測試劑，計算表現百分比(例如可溶性BCMA-PE百分比、抗惠特洛.PE百分比及G4S-AF647百分比)且將其提供於圖31A至圖31C中。
在環狀RNA電穿孔至供體T細胞之後第二天，將選定oCAR-T細胞與靶向多發性骨髓瘤細胞(例如MM1S)、NCI-H929、Nalm6或K562.CD19細胞以1:1之E:T比共培養。向oCAR-T細胞給予可溶性BCMA-PE或抗惠特洛.PE偵測試劑。在24-72小時收集經由gMFI得到的BMCA表現(圖32A至圖32B及圖32D)且計算可溶性BCMA-PE百分比(圖32C及圖32E)。 表α2
ID 可溶性BCMA-PE 惠特洛-PE G4S-AF647
模擬物 -11.1 -12.4 -54.3 -66.5 -74.2 -88.4
DNA模板F 71.7 81.5 -54.6 -54.2 6973 7037
DNA模板G 18239 18887 6221 6000 -80.1 -94.6
DNA模板H 57811 59733 14787 15078 -95 -87.8
DNA模板A 61524 66292 -73.3 -85.4 27263 27709
DNA模板I 57409 58003 -71.3 -73.7 21881 22384
DNA模板J 84711 93417 -66 -73.1 30438 28273
表β
ID 內部核糖體進入位點(IRES)序列 CAR序列 CAR序列
DNA模板F (構築體F) GTGGCCACGCCCGGGCCACCGATACTTCCCTTCACTCCTTCGGGACTGTTGGGGAGGAACACAACAGGGCTCCCCTGTTTTCCCATTCCTTCCCCCTTTTCCCAACCCCAACCGCCGTATCTGGTGGCGGCAAGACACACGGGTCTTTCCCTCTAAAGCACAATTGTGTGTGTGTCCCAGGTCCTCCTGCGTACGGTGCGGGAGTGCTCCCACCCAACTGTTGTAAGCCTGTCCAACGCGTCGTCCTGGCAAGACTATGACGTCGCATGTTCCGCTGCGGATGCCGACCGGGTAACCGGTTCCCCAGTGTGTGTAGTGCGATCTTCCAGGTCCTCCTGGTTGGCGTTGTCCAGAAACTGCTTCAGGTAAGTGGGGTGTGCCCAATCCCTACAAAGGTTGATTCTTTCACCACCTTAGGAATGCTCCGGAGGTACCCCAGCAACAGCTGGGATCTGACCGGAGGCTAATTGTCTACGGGTGGTGTTTCCTTTTTCTTTTCACACAACTCTACTGCTGACAACTCACTGACTATCCACTTGCTCTGTCACG (SEQ ID NO: 17) ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACCCAGACAACCAGCAGCCTGTCTGCCAGCCTGGGCGATAGAGTGACCATCAGCTGTAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTACAGCCTGACAATCAGCAACCTGGAACAAGAGGATATCGCTACCTACTTCTGCCAGCAAGGCAACACCCTGCCTTACACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCACAGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGTGGATCTGAAGTGAAACTGCAAGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTGGCCCCATCTCAATCTCTGAGCGTGACCTGTACCGTCAGCGGAGTGTCCCTGCCTGATTATGGCGTGTCCTGGATCCGGCAGCCTCCTAGAAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCTAGCATCGAAGTGATGTACCCTCCACCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTACTCTCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 21) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 29)
DNA模板G (構築體G) CCCCCCTCCCCCCCTTCCCTTCCCTTTGCAACGCAACAATTGTAAGTGCCCTCACCTGTCAATTGGGACCACCACTTTCAGTGACCCCATGCGAAGTGCTGAGAGAAAGGAAGCTTTCTTACCCTTCATTTGTGAACCCACTGGTCTAAGCCGCTTGGAATACGATGAGTGGAAAAGTTCATTCTTAATGGAGTGAAACATGCTTAAATTTCCAGCTCGTGCTGGTCTTTCCAGTACGGGGCGGCCCTGTCTGGCCGTAATTCTTCAGAGTGTCACGCCACACTTGTGGATCTCACGTGCCACATGACAGCGCTACAGCTGGAACTGGGTGCTTGGTGCCCATGGAGTAACAGCGAAAAGTGTTAGATCAAGCCTTGCTTGGGCTATGAGCCTGCGGAACAACAACTGGTAACAGTTGCCTCAGGGGCCGAAAGCCACGGTGTTAACAGCACCCTCATAGTTTGATCCACCTCAGGGTGGTGATGTTTAGCAGTTAGTAGTTGCCAATCTGTGTTCACTGAAATCTCGGCATACCGTGTAGTGTACAGGGGTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCGTAGGTAACCTTAAGAGACTATGGATCTGATCTGGGGCCTTGTCCGGAGTGCTTTACACACGGCTCAAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCACAGAGCCCGAGGGATTCGGGTTTTCCCTTTAAAAACCCGACTAGAGCTTATGGTGACAATTATTGCTGTTCAGACGAACAGTGTAATTGTTGTCTATTCACAGCAGTTCTATCAGAGCTTTTCCCACAACGGATCTTCTTGGCAAGCAAATACAGCAGGAGTCAAT (SEQ ID NO: 8) ATGGCCCTCCCCGTCACAGCTCTCCTGCTCCCACTGGCCCTTCTTTTGCACGCTGCTCGCCCCGATATCGTGCTCACCCAGTCACCTCCAAGCCTTGCCATGAGCCTCGGGAAACGGGCTACCATCTCCTGCCGGGCTTCAGAGTCCGTCACCATCCTCGGGTCACACCTCATCCACTGGTACCAACAGAAACCAGGGCAGCCTCCTACCCTCTTGATCCAGTTGGCCTCCAACGTGCAAACTGGGGTTCCCGCCAGGTTCAGTGGCTCCGGATCCCGGACAGATTTCACACTTACCATCGATCCTGTGGAGGAGGACGATGTGGCCGTCTATTACTGCCTGCAGTCTCGCACCATCCCTCGGACCTTCGGTGGAGGCACCAAGCTCGAGATCAAGGGTAGCACCTCCGGCTCTGGAAAGCCAGGCTCTGGTGAGGGTTCTACCAAGGGCCAAATCCAGCTGGTCCAGTCTGGGCCCGAGCTGAAGAAACCCGGGGAGACCGTGAAGATCTCCTGCAAGGCCTCCGGTTATACCTTCACCGACTACTCCATCAACTGGGTCAAGCGCGCTCCTGGAAAGGGCCTCAAGTGGATGGGCTGGATCAACACCGAAACCCGCGAGCCTGCCTATGCTTACGACTTCAGGGGCCGGTTCGCTTTCTCACTGGAGACCTCCGCTTCCACAGCCTACCTCCAGATCAACAACCTCAAGTACGAAGACACCGCCACCTATTTCTGCGCTCTCGACTATTCCTACGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGCACCTCTGTGACCGTCTCTAGCGCAGCCGCCACCACAACACCAGCCCCACGGCCACCTACTCCCGCACCCACCATCGCATCCCAACCACTCAGTCTGAGGCCCGAGGCCTGTAGACCTGCTGCTGGAGGCGCAGTGCATACCCGCGGTCTCGACTTCGCCTGCGACATCTATATCTGGGCCCCATTGGCAGGTACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGTCACTCGTCATCACCCTGTACTGCCGGAGTAAGCGCTCTAGGCTGTTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCAAGAAGACCAGGGCCTACCCGGAAGCACTACCAGCCATACGCACCTCCCCGGGACTTTGCCGCCTATCGGTCTCGGGTGAAGTTCTCACGCTCCGCTGATGCCCCAGCATACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTGTACAATGAGCTCAACCTCGGTCGCCGCGAAGAGTACGACGTGCTCGACAAGAGAAGGGGCAGGGACCCTGAGATGGGAGGCAAGCCCCGCAGAAAGAATCCCCAGGAAGGTCTGTACAACGAGCTGCAAAAGGATAAGATGGCTGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGGAGACGGGGAAAGGGCCACGACGGGCTCTACCAGGGACTCTCCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTCCACATGCAGGCTCTGCCACCCAGG (SEQ ID NO: 104) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 120)
DNA模板H (構築體H) CCCCCCTCCCCCCCTTCCCTTCCCTTTGCAACGCAACAATTGTAAGTGCCCTCACCTGTCAATTGGGACCACCACTTTCAGTGACCCCATGCGAAGTGCTGAGAGAAAGGAAGCTTTCTTACCCTTCATTTGTGAACCCACTGGTCTAAGCCGCTTGGAATACGATGAGTGGAAAAGTTCATTCTTAATGGAGTGAAACATGCTTAAATTTCCAGCTCGTGCTGGTCTTTCCAGTACGGGGCGGCCCTGTCTGGCCGTAATTCTTCAGAGTGTCACGCCACACTTGTGGATCTCACGTGCCACATGACAGCGCTACAGCTGGAACTGGGTGCTTGGTGCCCATGGAGTAACAGCGAAAAGTGTTAGATCAAGCCTTGCTTGGGCTATGAGCCTGCGGAACAACAACTGGTAACAGTTGCCTCAGGGGCCGAAAGCCACGGTGTTAACAGCACCCTCATAGTTTGATCCACCTCAGGGTGGTGATGTTTAGCAGTTAGTAGTTGCCAATCTGTGTTCACTGAAATCTCGGCATACCGTGTAGTGTACAGGGGTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCGTAGGTAACCTTAAGAGACTATGGATCTGATCTGGGGCCTTGTCCGGAGTGCTTTACACACGGCTCAAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCACAGAGCCCGAGGGATTCGGGTTTTCCCTTTAAAAACCCGACTAGAGCTTATGGTGACAATTATTGCTGTTCAGACGAACAGTGTAATTGTTGTCTATTCACAGCAGTTCTATCAGAGCTTTTCCCACAACGGATCTTCTTGGCAAGCAAATACAGCAGGAGTCAAT (SEQ ID NO: 8) ATGGCACTTCCCGTCACCGCTCTCCTGCTGCCCCTCGCACTGCTGCTCCATGCAGCCCGCCCAGACATCGTCCTGACCCAGTCCCCTCCCTCCCTCGCAATGTCCCTCGGGAAACGGGCCACCATCAGCTGCCGGGCCTCTGAGTCAGTGACAATCCTCGGAAGCCATCTGATCCATTGGTACCAGCAGAAACCCGGTCAGCCTCCAACCCTCCTCATCCAGCTGGCCTCCAACGTGCAGACAGGAGTCCCCGCTCGGTTCTCAGGCAGCGGTTCCAGGACCGACTTCACCCTGACCATCGACCCCGTGGAAGAGGACGATGTGGCTGTGTACTACTGCCTCCAGTCCCGGACCATCCCACGGACCTTCGGAGGTGGGACAAAGCTGGAGATCAAAGGCAGCACCAGCGGTTCTGGCAAGCCAGGGTCAGGTGAGGGGAGCACAAAGGGTCAGATCCAGCTGGTGCAGAGCGGTCCCGAGCTGAAGAAGCCCGGGGAGACCGTTAAGATCTCCTGCAAGGCTAGCGGGTACACCTTCACCGACTATAGTATCAACTGGGTCAAGCGCGCTCCTGGCAAGGGGCTCAAGTGGATGGGGTGGATCAACACCGAAACCAGGGAGCCCGCATACGCTTATGACTTTCGGGGCCGGTTCGCCTTTTCCCTGGAGACCAGCGCCTCTACCGCCTACCTCCAGATCAACAACCTGAAGTACGAGGACACCGCCACCTACTTCTGCGCACTCGACTACTCCTACGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACCTCCGTCACCGTCTCCAGCATCGAGGTCATGTACCCTCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCATGTGAAGGGCAAGCATCTCTGCCCCAGCCCACTGTTCCCCGGACCCTCTAAGCCCTTCTGGGTCCTGGTCGTCGTCGGCGGTGTTCTGGCTTGCTACAGCTTGCTGGTCACCGTCGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGCTCCAAGAGGAGCCGGCTGCTGCATAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGAAGGCCTGGTCCAACCCGCAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCACGGGACTTCGCAGCCTACCGGTCACGGGTGAAGTTCTCTCGGAGCGCAGATGCCCCAGCATACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAACTTAACCTTGGTCGGCGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGCGCAGGGGTCGGGATCCTGAAATGGGCGGGAAACCACGCCGGAAGAACCCACAGGAGGGGCTCTATAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCTGAGGCTTACAGCGAGATTGGAATGAAGGGAGAAAGAAGACGGGGCAAGGGTCACGACGGGTTGTACCAGGGTCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTCCACATGCAAGCCCTTCCACCCCGC (SEQ ID NO: 105) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 121)
DNA模板I (構築體I) CCCCCCTCCCCCCCTTCCCTTCCCTTTGCAACGCAACAATTGTAAGTGCCCTCACCTGTCAATTGGGACCACCACTTTCAGTGACCCCATGCGAAGTGCTGAGAGAAAGGAAGCTTTCTTACCCTTCATTTGTGAACCCACTGGTCTAAGCCGCTTGGAATACGATGAGTGGAAAAGTTCATTCTTAATGGAGTGAAACATGCTTAAATTTCCAGCTCGTGCTGGTCTTTCCAGTACGGGGCGGCCCTGTCTGGCCGTAATTCTTCAGAGTGTCACGCCACACTTGTGGATCTCACGTGCCACATGACAGCGCTACAGCTGGAACTGGGTGCTTGGTGCCCATGGAGTAACAGCGAAAAGTGTTAGATCAAGCCTTGCTTGGGCTATGAGCCTGCGGAACAACAACTGGTAACAGTTGCCTCAGGGGCCGAAAGCCACGGTGTTAACAGCACCCTCATAGTTTGATCCACCTCAGGGTGGTGATGTTTAGCAGTTAGTAGTTGCCAATCTGTGTTCACTGAAATCTCGGCATACCGTGTAGTGTACAGGGGTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCGTAGGTAACCTTAAGAGACTATGGATCTGATCTGGGGCCTTGTCCGGAGTGCTTTACACACGGCTCAAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCACAGAGCCCGAGGGATTCGGGTTTTCCCTTTAAAAACCCGACTAGAGCTTATGGTGACAATTATTGCTGTTCAGACGAACAGTGTAATTGTTGTCTATTCACAGCAGTTCTATCAGAGCTTTTCCCACAACGGATCTTCTTGGCAAGCAAATACAGCAGGAGTCAAT (SEQ ID NO: 8) ATGGCACTCCCCGTTACCGCCCTTCTGCTGCCTCTCGCCTTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCACAGGTCAAGCTGGAGGAGTCTGGTGGCGGGCTCGTTCAAGCAGGTCGGAGTCTCCGCCTGTCTTGCGCAGCATCAGAGCATACCTTCTCCTCACACGTGATGGGGTGGTTCAGGCAAGCTCCCGGTAAGGAGAGGGAGTCCGTGGCCGTTATCGGCTGGCGCGATATCAGCACCTCCTACGCAGACAGCGTTAAGGGCCGGTTCACTATCTCCAGGGACAACGCTAAGAAGACACTCTACCTCCAGATGAACAGTCTGAAGCCCGAGGACACCGCAGTGTACTATTGCGCTGCTCGGCGGATCGATGCTGCCGACTTCGACAGCTGGGGTCAAGGGACCCAGGTCACCGTTTCCAGCGGAGGTGGCGGAAGTGGTGGCGGAGGATCAGGTGGTGGAGGCTCCGAGGTCCAGCTGGTGGAATCAGGAGGCGGCTTGGTGCAGGCTGGTGGGTCTTTGCGGTTGTCCTGCGCAGCTTCCGGCAGGACCTTCACCATGGGATGGTTCAGACAAGCCCCAGGTAAGGAGCGGGAGTTTGTGGCCGCAATCTCACTGTCTCCCACCCTCGCTTACTACGCCGAGAGTGTGAAGGGGCGCTTCACAATCAGTCGCGACAACGCAAAGAACACCGTCGTCCTGCAAATGAACTCCCTGAAGCCTGAGGATACCGCACTCTATTACTGCGCCGCCGATCGGAAGAGCGTCATGTCCATCCGGCCCGACTATTGGGGCCAAGGCACCCAAGTGACCGTCAGCTCCACCTCCACAACCACTCCCGCCCCAAGACCACCTACCCCAGCCCCAACAATCGCATCCCAGCCTCTGTCCCTTCGGCCCGAAGCTTGTCGCCCTGCAGCAGGTGGAGCAGTGCACACCCGGGGACTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCACCCCTGGCTGGAACCTGCGGCGTGTTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTCTACTGCCGCTCTAAGAGAAGCCGGCTGCTGCATAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGGAGACCAGGACCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCACGGGATTTCGCTGCTTACCGCAGCCGGGTGAAGTTTTCCAGGTCAGCTGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAATTGTACAACGAACTGAATCTGGGACGGCGCGAGGAATACGACGTCCTGGACAAGAGGCGGGGTAGAGATCCCGAGATGGGCGGGAAACCTCGGCGGAAGAACCCTCAGGAGGGGCTCTACAACGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCCGAAGCCTACTCCGAGATCGGGATGAAGGGTGAACGGAGGAGGGGCAAGGGACACGACGGCCTGTATCAGGGCCTCAGCACCGCTACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCTCTCCCACCACGG (SEQ ID NO: 107) MALPVTALLLPLALLLHAARPQVKLEESGGGLVQAGRSLRLSCAASEHTFSSHVMGWFRQAPGKERESVAVIGWRDISTSYADSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAARRIDAADFDSWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFTMGWFRQAPGKEREFVAAISLSPTLAYYAESVKGRFTISRDNAKNTVVLQMNSLKPEDTALYYCAADRKSVMSIRPDYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 123)
DNA模板J (構築體J) CCCCCCTCCCCCCCTTCCCTTCCCTTTGCAACGCAACAATTGTAAGTGCCCTCACCTGTCAATTGGGACCACCACTTTCAGTGACCCCATGCGAAGTGCTGAGAGAAAGGAAGCTTTCTTACCCTTCATTTGTGAACCCACTGGTCTAAGCCGCTTGGAATACGATGAGTGGAAAAGTTCATTCTTAATGGAGTGAAACATGCTTAAATTTCCAGCTCGTGCTGGTCTTTCCAGTACGGGGCGGCCCTGTCTGGCCGTAATTCTTCAGAGTGTCACGCCACACTTGTGGATCTCACGTGCCACATGACAGCGCTACAGCTGGAACTGGGTGCTTGGTGCCCATGGAGTAACAGCGAAAAGTGTTAGATCAAGCCTTGCTTGGGCTATGAGCCTGCGGAACAACAACTGGTAACAGTTGCCTCAGGGGCCGAAAGCCACGGTGTTAACAGCACCCTCATAGTTTGATCCACCTCAGGGTGGTGATGTTTAGCAGTTAGTAGTTGCCAATCTGTGTTCACTGAAATCTCGGCATACCGTGTAGTGTACAGGGGTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCGTAGGTAACCTTAAGAGACTATGGATCTGATCTGGGGCCTTGTCCGGAGTGCTTTACACACGGCTCAAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCACAGAGCCCGAGGGATTCGGGTTTTCCCTTTAAAAACCCGACTAGAGCTTATGGTGACAATTATTGCTGTTCAGACGAACAGTGTAATTGTTGTCTATTCACAGCAGTTCTATCAGAGCTTTTCCCACAACGGATCTTCTTGGCAAGCAAATACAGCAGGAGTCAAT (SEQ ID NO: 8) ATGGCTCTTCCCGTCACCGCTTTGCTGCTGCCCCTGGCACTCCTCCTCCATGCTGCTCGGCCTCAGGTGAAGCTGGAGGAGAGTGGTGGCGGTCTGGTGCAAGCTGGCAGATCTCTGCGCCTGTCTTGCGCAGCCAGCGAACACACCTTCTCCTCCCACGTGATGGGGTGGTTTCGGCAGGCACCCGGGAAAGAGCGCGAGTCCGTCGCAGTCATCGGGTGGCGGGACATCTCTACCAGCTACGCAGATTCCGTCAAGGGCCGGTTCACCATTTCCCGGGATAACGCTAAGAAGACCCTCTACCTGCAAATGAACTCTCTGAAGCCCGAAGACACCGCCGTCTACTATTGCGCAGCAAGGCGCATCGACGCTGCCGACTTCGACTCTTGGGGCCAAGGAACCCAGGTCACCGTGTCTTCCGGAGGAGGAGGCTCCGGTGGTGGAGGTTCTGGAGGTGGCGGCTCAGAGGTGCAGCTCGTGGAGAGCGGTGGTGGACTCGTTCAGGCAGGCGGCAGTTTGCGGCTGTCCTGTGCAGCCTCCGGTCGCACTTTCACTATGGGATGGTTCCGCCAGGCTCCTGGTAAAGAAAGGGAGTTCGTGGCCGCCATCAGTCTGAGCCCCACCCTCGCATACTACGCCGAGAGCGTGAAGGGTAGGTTCACTATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACACCGTGGTGCTCCAGATGAATTCCCTGAAGCCTGAGGATACCGCCCTCTACTACTGCGCTGCCGACCGCAAGAGCGTGATGAGCATCCGGCCTGACTATTGGGGTCAGGGGACACAGGTGACCGTCAGCAGCATCGAGGTGATGTATCCACCACCCTACCTCGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTCAAGGGGAAGCACCTCTGCCCTTCCCCTCTGTTCCCTGGCCCCTCAAAGCCCTTCTGGGTCCTGGTGGTGGTTGGTGGGGTGCTGGCTTGCTACTCCCTGCTCGTGACCGTGGCTTTCATCATCTTCTGGGTTCGGAGCAAACGGTCCAGACTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCAAGAAGACCTGGGCCCACACGGAAGCATTACCAACCCTATGCACCACCTCGGGATTTCGCCGCCTACAGATCCCGGGTCAAGTTCTCCAGGTCCGCCGATGCACCAGCCTATCAGCAGGGGCAAAACCAGCTGTATAATGAGCTGAACCTTGGACGGCGCGAGGAGTACGACGTGCTCGACAAAAGACGCGGTCGCGACCCAGAGATGGGCGGCAAGCCTAGACGCAAGAATCCCCAGGAGGGGCTCTATAACGAGTTGCAGAAGGATAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGGATGAAAGGCGAAAGACGGCGCGGAAAGGGTCACGACGGACTCTACCAGGGCCTGAGCACAGCCACCAAAGACACCTACGACGCTCTGCATATGCAAGCACTGCCTCCCCGG (SEQ ID NO: 108) MALPVTALLLPLALLLHAARPQVKLEESGGGLVQAGRSLRLSCAASEHTFSSHVMGWFRQAPGKERESVAVIGWRDISTSYADSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAARRIDAADFDSWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFTMGWFRQAPGKEREFVAAISLSPTLAYYAESVKGRFTISRDNAKNTVVLQMNSLKPEDTALYYCAADRKSVMSIRPDYWGQGTQVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 124)
實例15：CAR表現之細胞毒性分析
多發性骨髓瘤陽性及陰性目標細胞株上之BCMA CAR表現及CD19 CAR表現
將供體T細胞解凍且用抗CD3/CD28溶液活化。在活化之後三天，洗滌細胞。第二天，將細胞用每0.1×10 6個T細胞10-30 ng範圍劑量之編碼BCMA-41BBζ CAR或CD19CD28ζ CAR之環狀RNA電穿孔以形成經工程化之CAR-T細胞(oCAR-T細胞)。環狀RNA按以下次序包含：3'念珠藻屬外顯子、內部核糖體進入位點(IRES)、編碼BCMA CAR或CD19 CAR之編碼區及5'念珠藻屬外顯子。環狀RNA由來自表α1、表β及表γ1之DNA模板的IVT反應形成。作為對照，使用模擬物T細胞，其中模擬物T細胞未經任何環狀RNA電穿孔。在環狀RNA電穿孔至T細胞之後第二天，將oCAR-T細胞與目標多發性骨髓瘤(MM)陽性或陰性T細胞以1:1 E:T比共培養。MM陽性T細胞包含MM1S、NCI-H929或RPM1-8226。MM陰性T細胞包含CD19陽性T細胞株(亦即Nalm6細胞株)。作為對照，出於比較目的分析未與T細胞共培養之目標腫瘤細胞。向環狀RNA給予含有R-藻紅素(PE)螢光團之市售可溶性BCMA偵測試劑或含有量子點(qdot)螢光團之可溶性CD19偵測試劑(例如來自AcroBiosystems, Delaware)。亦將oCAR-T細胞置放於市售活細胞分析組合系統(例如IncuCyte)中且在共培養後0-72小時或0-96小時分析細胞毒性。對於編碼BCMA、CD19或HER2 CAR之環狀RNA中之各者，細胞毒性結果分別可見於圖33A至圖33C中。分別在圖33A、圖33B及圖33C中在MM1S、Nalm6及CD19陽性T細胞株上觀測到編碼各種CAR之各種環狀RNA的交叉反應性。
經由FACS量測之對MM1S之BCMA靶向殺傷的細胞毒性
獲取且準備BMCA陽性細胞。將細胞用每0.1X10 6個細胞30 ng環狀RNA電穿孔，該環狀RNA包含3'念珠藻屬外顯子、內部核糖體進入位點(IRES)、BCMA-41BBζ CAR及5'念珠藻屬外顯子。環狀RNA由來自表α1、表β及表γ1之DNA模板的IVT反應形成。第二天，隨後將細胞與MM1S細胞共培養且用FSC-A、CD3-亮紫色650-A、LD-可固定Near IR-A染色以供螢光活化細胞分選分析(FACS)。與MM1S共培養之後24小時細胞之所得FACS成像可見於圖34A中。根據FACS成像，計算細胞溶解百分比(例如細胞溶解% = (1-((測試樣品中之活目標細胞%) / (對照樣品中之活目標細胞%))) × 100)。
作為後續行動，在每0.1×10 6個T細胞10、30、50或100 ng下對編碼BCMA-41BBζ、CD19-CD28ζ或HER2-CD28ζ CAR之環狀RNA及IRES執行FACS細胞毒性分析(經環狀RNA電穿孔之T細胞以及其模擬物對應物(缺乏環狀RNA之T細胞)的FACS成像示於圖35A及圖35B中)。環狀RNA由來自表α1、表β及表γ1之DNA模板的IVT反應形成。將含有環狀RNA之T細胞(oCAR-T)與四種目標細胞(MM1S (BCMA陽性細胞株)、NCI-H929 (BCMA陽性細胞株)、Nalm6細胞(CD19陽性細胞株)、CD19 T穩定細胞株(例如K562.CD19)中之一者以1:1之E:T比共培養。oCAR-T細胞與MM1S、Nalm6、NCI-H929或CD19 T穩定細胞共培養後24小時。MM1S+模擬物(亦即，與未經環狀RNA電穿孔之T細胞共培養的MM1S腫瘤細胞)、MM1S (亦即，未與T細胞共培養之MM1S腫瘤細胞)、Nalm6+模擬物(亦即，與未經環狀RNA電穿孔之T細胞共培養的Nalm6腫瘤細胞)、Nalm6 (亦即，未與T細胞共培養之Nalm6腫瘤細胞)、模擬物+NCI-H929 (亦即，與未經環狀RNA電穿孔之T細胞共培養的NCI-H929腫瘤細胞)及模擬物+K562.CD19 (亦即，與未經環狀RNA電穿孔之T細胞共培養的K562.CD19腫瘤細胞)用作對照。計算將T細胞與目標細胞共培養之後24小時後細胞類型中之各者的所得FACS成像。根據FACS成像，計算細胞溶解百分比(例如細胞溶解% = (1-((測試樣品中之活目標細胞%) / (對照樣品中之活目標細胞%))) × 100)且提供於圖34B (MM1S中之FACS細胞毒性)及圖34C (Nalm6中之FACS細胞毒性)中。與T細胞共培養之MM1S、NCI-H929、Nalm6及K562.CD19之目標殺傷百分比以及其存活率提供於圖36A-36D中。INγ (示於圖37A及圖37B以及圖38A至圖38P中)、IL2、顆粒酶及B、GM-CSF、IL2及TNFα產生係藉由針對細胞介素分泌量之市售細胞介素分泌套組(例如MSD)在目標細胞與T細胞共培養後24或48小時評估。 表γ1
ID 內部核糖體進入位點(IRES)序列 CAR序列 CAR序列
DNA模板K (構築體K) GTGGCCACGCCCGGGCCACCGATACTTCCCTTCACTCCTTCGGGACTGTTGGGGAGGAACACAACAGGGCTCCCCTGTTTTCCCATTCCTTCCCCCTTTTCCCAACCCCAACCGCCGTATCTGGTGGCGGCAAGACACACGGGTCTTTCCCTCTAAAGCACAATTGTGTGTGTGTCCCAGGTCCTCCTGCGTACGGTGCGGGAGTGCTCCCACCCAACTGTTGTAAGCCTGTCCAACGCGTCGTCCTGGCAAGACTATGACGTCGCATGTTCCGCTGCGGATGCCGACCGGGTAACCGGTTCCCCAGTGTGTGTAGTGCGATCTTCCAGGTCCTCCTGGTTGGCGTTGTCCAGAAACTGCTTCAGGTAAGTGGGGTGTGCCCAATCCCTACAAAGGTTGATTCTTTCACCACCTTAGGAATGCTCCGGAGGTACCCCAGCAACAGCTGGGATCTGACCGGAGGCTAATTGTCTACGGGTGGTGTTTCCTTTTTCTTTTCACACAACTCTACTGCTGACAACTCACTGACTATCCACTTGCTCTGTCACG (SEQ ID NO: 17) ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACTCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGCCGGGCCAGCCAGGATGTGAATACTGCTGTCGCCTGGTATCAACAAAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTACAGCGCCAGCTTTCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCTCCGGAAGCAGAAGCGGCACAGATTTCACACTGACCATAAGCAGCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGCACTACACCACACCTCCAACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTCGAGATTAAGAGAACAGGCAGCACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGATCTGGCGAGGGCTCTGAAGTCCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCAGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGCCAGGATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTGCCGACACCAGCAAGAATACCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTATTACTGTTCCAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTCGTGACCGTTTCTTCTATCGAAGTGATGTACCCTCCACCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTACTCTCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 101) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 117)
活體內測試編碼BCMA CAR之環狀RNA構築體。在第-1天製備NSG小鼠。在第0天注射5M U266細胞。在第4天注射10M PBMC細胞(n=2個供體)。環狀RNA構築體在EOD (2 mpk)，亦即第8天、第10天、第13天及第15天或QW (2 mpk)，亦即第8天、第15天及第22天注射。對照為經HER2 oCAR處理之小鼠及未處理之小鼠。每週兩次，經由IVIS定量腫瘤負荷，如本文所描述。EOD給藥展現出BCMA oCAR依賴性腫瘤對照(圖60)。QW給藥展現出BCMA oCAR依賴性腫瘤對照(圖61)。例示性IVIS影像展現出與對照相比BCMA oCAR腫瘤控制(圖62)。 實例16：編碼HER2 CAR之環狀RNA誘導活體外細胞毒性
將盤用0.01%聚-L-鳥胺酸溶液或5 µL/mL稀釋於0.1% BSA中之纖維連接蛋白塗佈。在培養基中製備稀釋細胞凋亡試劑(例如膜聯蛋白V)且製備細胞處理。細胞處理包含環狀RNA，其包含3'外顯子區段、山羊嵴病毒或匈奴病毒內部核糖體進入位點(IRES)、編碼HER2之編碼區及5'外顯子區段，E:T比為1:1或1:2。環狀RNA衍生自經歷IVT反應之來自表γ1或表δ之DNA模板，將100 µL/孔之25,000-50,000個HER2陽性BT474或SKBR2目標細胞置放於經塗佈之96孔盤中且使其黏附隔夜。約24小時後，BT474/SKBR3細胞黏附，且將0及100 ng劑量之含有環狀RNA及膜聯蛋白V的細胞處理添加至BT474或SKBR2細胞中。作為對照，一些BT474/SKBR3細胞未給予任何環狀RNA，但給予膜聯蛋白V。在活細胞分析組合系統(例如IncuCyte)中分析所有含有目標細胞之盤，該系統每2-3小時捕獲影像。在成像中，存活Nalm6細胞保留綠色螢光，及膜聯蛋白V凋亡細胞具有紅色發光。隨後藉由量測((綠色區域+紅色區域)/綠色區域)之量來計算凋亡細胞%。所得凋亡細胞%示於圖39中。
此外，製備來自單一供體之經活化PBMC T細胞。分別地，由包含3'內含子區段、3'外顯子區段、內部核糖體進入位點(IRES)、編碼HER2.28ζ、HER2.BBζ或CD19-28ζ CAR之編碼區、5'外顯子區段及5'內含子區段之DNA模板的IVT反應製備編碼HER2-CD28ζ、HER2-41BBζ或CD19-CD28ζ CAR之環狀RNA。使用包含來自表3之可離子化脂質的冷凍或新鮮脂質奈米粒子將環狀RNA以下表(表γ2)中所列之濃度轉染至經活化PBMC T細胞上。出於比較目的，經活化PBMC T細胞未給予環狀RNA作為對照。在將環狀RNA遞送至經活化PBMC T細胞後當天，將環狀RNA-經活化PBMC T細胞與三種HER2陽性細胞株(亦即，BT474、SKBR3、JIMT1)中之一者共培養。所得共培養細胞給予膜聯蛋白V且在活細胞分析組合系統(例如IncuCyte)中分析。圖40A至圖40C描繪藉由膜聯蛋白V/相%計算的活細胞分析組合系統之結果。圖41A至圖41B繪示環狀RNA之新鮮及冷凍LNP遞送且及圖41C描繪共培養細胞之細胞介素釋放(例如INFγ及/或TNFα)。 表γ2
環狀 RNA 之編碼區 DNA 模板 RNA 濃度 (µg/mL) EE (%) 直徑 (nm) PDI
HER2-CD28ζ CAR K 494 93 82 0.06
HER2-41BBζ CAR L 463 93 80 0.06
CD19-CD28ζ CAR M 498 93 85 0.00
表δ
ID 內部核糖體進入位點(IRES)序列 CAR序列 CAR序列
DNA模板L (構築體L) GTGGCCACGCCCGGGCCACCGATACTTCCCTTCACTCCTTCGGGACTGTTGGGGAGGAACACAACAGGGCTCCCCTGTTTTCCCATTCCTTCCCCCTTTTCCCAACCCCAACCGCCGTATCTGGTGGCGGCAAGACACACGGGTCTTTCCCTCTAAAGCACAATTGTGTGTGTGTCCCAGGTCCTCCTGCGTACGGTGCGGGAGTGCTCCCACCCAACTGTTGTAAGCCTGTCCAACGCGTCGTCCTGGCAAGACTATGACGTCGCATGTTCCGCTGCGGATGCCGACCGGGTAACCGGTTCCCCAGTGTGTGTAGTGCGATCTTCCAGGTCCTCCTGGTTGGCGTTGTCCAGAAACTGCTTCAGGTAAGTGGGGTGTGCCCAATCCCTACAAAGGTTGATTCTTTCACCACCTTAGGAATGCTCCGGAGGTACCCCAGCAACAGCTGGGATCTGACCGGAGGCTAATTGTCTACGGGTGGTGTTTCCTTTTTCTTTTCACACAACTCTACTGCTGACAACTCACTGACTATCCACTTGCTCTGTCACG (SEQ ID NO: 17) ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACTCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGCCGGGCCAGCCAGGATGTGAATACTGCTGTCGCCTGGTATCAACAAAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTACAGCGCCAGCTTTCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCTCCGGAAGCAGAAGCGGCACAGATTTCACACTGACCATAAGCAGCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGCACTACACCACACCTCCAACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTCGAGATTAAGAGAACAGGCAGCACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGATCTGGCGAGGGCTCTGAAGTCCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCAGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGCCAGGATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTGCCGACACCAGCAAGAATACCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTATTACTGTTCCAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTCGTGACCGTTTCTTCTACCACCACACCAGCTCCTCGGCCTCCAACTCCTGCTCCTACAATTGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCTCCTCTGGCCGGAACATGTGGCGTTCTGCTGCTGAGCCTGGTCATCACCCTGTACTGTAAGCGGGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACACAAGAGGAAGATGGCTGCTCCTGCAGATTCCCCGAGGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 102) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 118)
DNA模板M (構築體M) CCCCCCTCCCCCCCTTCCCTTCCCTTTGCAACGCAACAATTGTAAGTGCCCTCACCTGTCAATTGGGACCACCACTTTCAGTGACCCCATGCGAAGTGCTGAGAGAAAGGAAGCTTTCTTACCCTTCATTTGTGAACCCACTGGTCTAAGCCGCTTGGAATACGATGAGTGGAAAAGTTCATTCTTAATGGAGTGAAACATGCTTAAATTTCCAGCTCGTGCTGGTCTTTCCAGTACGGGGCGGCCCTGTCTGGCCGTAATTCTTCAGAGTGTCACGCCACACTTGTGGATCTCACGTGCCACATGACAGCGCTACAGCTGGAACTGGGTGCTTGGTGCCCATGGAGTAACAGCGAAAAGTGTTAGATCAAGCCTTGCTTGGGCTATGAGCCTGCGGAACAACAACTGGTAACAGTTGCCTCAGGGGCCGAAAGCCACGGTGTTAACAGCACCCTCATAGTTTGATCCACCTCAGGGTGGTGATGTTTAGCAGTTAGTAGTTGCCAATCTGTGTTCACTGAAATCTCGGCATACCGTGTAGTGTACAGGGGTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCGTAGGTAACCTTAAGAGACTATGGATCTGATCTGGGGCCTTGTCCGGAGTGCTTTACACACGGCTCAAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCACAGAGCCCGAGGGATTCGGGTTTTCCCTTTAAAAACCCGACTAGAGCTTATGGTGACAATTATTGCTGTTCAGACGAACAGTGTAATTGTTGTCTATTCACAGCAGTTCTATCAGAGCTTTTCCCACAACGGATCTTCTTGGCAAGCAAATACAGCAGGAGTCAAT (SEQ ID NO: 8) ATGGCACTGCCCGTCACCGCACTCCTGCTCCCACTGGCACTGCTGCTCCATGCAGCTCGCCCCGATATCCAGATGACCCAGACCACCTCTAGCCTCAGCGCCTCTCTGGGTGACCGCGTCACCATCTCTTGCCGGGCCAGCCAAGACATCTCTAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCTGACGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGTCGGCTGCATTCCGGGGTGCCTTCCAGGTTCAGCGGTTCCGGCTCTGGGACCGATTATAGTCTCACCATCTCCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCAACCTACTTCTGCCAGCAGGGGAACACCCTGCCCTACACCTTCGGTGGCGGGACCAAGCTGGAGATCACTGGAGGTGGTGGCAGCGGAGGTGGAGGATCAGGTGGAGGCGGTAGCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGACCTGGTCTGGTGGCCCCAAGCCAGTCCCTCAGCGTCACCTGCACAGTGTCCGGGGTGTCCCTGCCTGACTACGGTGTCTCCTGGATCAGGCAACCACCCCGGAAGGGTCTCGAGTGGCTGGGCGTCATCTGGGGCTCCGAGACCACCTACTACAACAGCGCTCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAAGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCTTGAAGATGAACTCCCTGCAAACCGATGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTATGGCGGTAGCTACGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGTGTCACCGTCTCCTCCATCGAGGTGATGTACCCTCCACCCTATCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCTAGCCCTCTGTTCCCAGGACCCTCCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTCGTGGTGGGAGGAGTCCTGGCCTGCTATTCCCTCCTCGTCACCGTGGCATTTATCATCTTCTGGGTCCGGAGCAAGCGGTCACGCCTGCTCCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTCGCAGACCTGGACCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTATGCCCCACCCCGCGACTTTGCCGCTTACCGCTCTCGGGTCAAGTTCTCTCGGTCAGCAGACGCCCCTGCATACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTCGGCAGACGGGAGGAGTACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGTGGTAAGCCACGGCGCAAGAACCCACAGGAGGGCTTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGAGGCGCAGGGGCAAGGGTCACGACGGCCTGTACCAAGGGCTGTCCACCGCAACCAAGGACACCTACGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTCCCACCAAGG (SEQ ID NO: 19) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 29)
DNA模板N (構築體N) ATTCTCGGGCTACGGCCCTGGAGCCACTCCGGCTCCTAAAGATTTAGAAGTTTGAGCACACCCGCCCACTAGGGCCCCCCATCCAGGGGGGCAACGGGCAAGCACTTCTGTTTCCCCGGTATGATCTGATAGGCTGTAACCACGGCTGAAACAGAGATTATCGTTATCCGCTTCACTACTTCGAGAAGCCTAGTAATGATGGGTGAAATTGAATCCGTTGATCCGGTGTCTCCCCCACACCAGAAACTCATGATGAGGGTTGCCATCCCGGCTACGGCGACGTAGCGGGCATCCCTGCGCTGGCATGAGGCCTCTTAGGAGGACGGATGATATGGATCTTGTCGTGAAGAGCCTATTGAGCTAGTGTCGACTCCTCCGCCCCCGTGAATGCGGCTAATCCTAACCCCGGAGCAGGTGGGTCCAATCCAGGGCCTGGCCTGTCGTAATGCGTAAGTCTGGGACGGAACCGACTACTTTCGGGAAGGCGTGTTTCCATTTGTTCATTATTTGTGTGTTTATGGTGACAACTCTGGGTAAACGTTCTATTGCGTTTATTGAGAGATTCCCAACAATTGAACAAACGAGAACTACCTGTTTTATTAAATTTACACAGAGAAGAATTACA (SEQ  ID NO: 16) ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACTCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGCCGGGCCAGCCAGGATGTGAATACTGCTGTCGCCTGGTATCAACAAAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTACAGCGCCAGCTTTCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCTCCGGAAGCAGAAGCGGCACAGATTTCACACTGACCATAAGCAGCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGCACTACACCACACCTCCAACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTCGAGATTAAGAGAACAGGCAGCACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGATCTGGCGAGGGCTCTGAAGTCCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCAGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGCCAGGATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTGCCGACACCAGCAAGAATACCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTATTACTGTTCCAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTCGTGACCGTTTCTTCTATCGAAGTGATGTACCCTCCACCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTACTCTCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 101) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 117)
DNA模板O (構築體O) CCCCCCTCCCCCCCTTCCCTTCCCTTTGCAACGCAACAATTGTAAGTGCCCTCACCTGTCAATTGGGACCACCACTTTCAGTGACCCCATGCGAAGTGCTGAGAGAAAGGAAGCTTTCTTACCCTTCATTTGTGAACCCACTGGTCTAAGCCGCTTGGAATACGATGAGTGGAAAAGTTCATTCTTAATGGAGTGAAACATGCTTAAATTTCCAGCTCGTGCTGGTCTTTCCAGTACGGGGCGGCCCTGTCTGGCCGTAATTCTTCAGAGTGTCACGCCACACTTGTGGATCTCACGTGCCACATGACAGCGCTACAGCTGGAACTGGGTGCTTGGTGCCCATGGAGTAACAGCGAAAAGTGTTAGATCAAGCCTTGCTTGGGCTATGAGCCTGCGGAACAACAACTGGTAACAGTTGCCTCAGGGGCCGAAAGCCACGGTGTTAACAGCACCCTCATAGTTTGATCCACCTCAGGGTGGTGATGTTTAGCAGTTAGTAGTTGCCAATCTGTGTTCACTGAAATCTCGGCATACCGTGTAGTGTACAGGGGTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCGTAGGTAACCTTAAGAGACTATGGATCTGATCTGGGGCCTTGTCCGGAGTGCTTTACACACGGCTCAAGGTTAAAAAACGTCTAGCCCCACAGAGCCCGAGGGATTCGGGTTTTCCCTTTAAAAACCCGACTAGAGCTTATGGTGACAATTATTGCTGTTCAGACGAACAGTGTAATTGTTGTCTATTCACAGCAGTTCTATCAGAGCTTTTCCCACAACGGATCTTCTTGGCAAGCAAATACAGCAGGAGTCAAT(SEQ ID NO: 8) ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACTCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGCCGGGCCAGCCAGGATGTGAATACTGCTGTCGCCTGGTATCAACAAAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTACAGCGCCAGCTTTCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCTCCGGAAGCAGAAGCGGCACAGATTTCACACTGACCATAAGCAGCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGCACTACACCACACCTCCAACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTCGAGATTAAGAGAACAGGCAGCACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGATCTGGCGAGGGCTCTGAAGTCCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCAGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGCCAGGATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTGCCGACACCAGCAAGAATACCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTATTACTGTTCCAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTCGTGACCGTTTCTTCTATCGAAGTGATGTACCCTCCACCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTACTCTCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 101) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 117)
DNA模板P (構築體P) TTTGCTCAGCGTAACTTCTCCGGGTTACGTGGAGACCAAAAGGCTACGGAGACTCGGGCTACGGCCCTGGAGCACCTAGGTGCTCCTAAAGACGTTAGAAGTTGTACAAACTCGCCCAATAGGGCCCCCCAACCAGGGGGGTAGCGGGCAAGCACTTCTGTTTCCCCGGTATGATCTCATAGGCTGTACCCACGGCTGAAAGAGAGATTATCGTTACCCGCCTCACTACTTCGAGAAGCCCAGTAATGGTTCATGAAGTTGATCTCGTTGACCCGGTGTTTCCCCCACACCAGAAACCTGTGATGGGGGTGGTCATCCCGGTCATGGCGACATGACGGACCTCCCCGCGCCGGCACAGGGCCTCTTCGGAGGACGAGTGACATGGATTCAACCGTGAAGAGCCTATTGAGCTAGTGTTGATTCCTCCGCCCCCGTGAATGCGGCTAATCCCAACTCCGGAGCAGGCGGGCCCAAACCAGGGTCTGGCCTGTCGTAACGCGAAAGTCTGGAGCGGAACCGACTACTTTCGGGAAGGCGTGTTTCCTTTTGTTCCTTTTATCAAGTTTTATGGTGACAACTCCTGGTAGACGTTTTATTGCGTTTATTGAGAGATTTCCAACAATTGAACAGACTAGAACCACTTGTTTTATCAAACCCTCACAGAATAAGATAACA (SEQ ID NO: 18) ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACTCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACAATTACCTGCCGGGCCAGCCAGGATGTGAATACTGCTGTCGCCTGGTATCAACAAAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTACAGCGCCAGCTTTCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCTCCGGAAGCAGAAGCGGCACAGATTTCACACTGACCATAAGCAGCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAGCACTACACCACACCTCCAACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTCGAGATTAAGAGAACAGGCAGCACATCTGGCTCTGGCAAACCTGGATCTGGCGAGGGCTCTGAAGTCCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCAGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGCCAGGATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTGCCGACACCAGCAAGAATACCGCCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTATTACTGTTCCAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTCGTGACCGTTTCTTCTATCGAAGTGATGTACCCTCCACCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTACTCTCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCAACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 101) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO: 117)
實例17：編碼HER2 CAR之環狀RNA活體內腫瘤殺傷活性
具有1X10 7JIMT-1或BT-474腫瘤細胞(在皮下側腹植入中)之雌性NSG免疫缺乏小鼠(8至12週齡)經製備以具有50-100 mm 3之平均腫瘤尺寸。將兩個不同供體之1×10 7個人類PBMC T細胞用抗CD3及抗CD8活化72小時，隨後移除活化且在PBS中製備細胞以供注射。在人類PBMC解凍之後第五天，將200 µL之50X10 6個/mL經刺激人類PBMC T細胞靜脈內注射至小鼠尾部靜脈中。在注射經活化人類PBMC T細胞之後一天，向小鼠靜脈內給與10 mL/kg多西他賽(docetaxel) (對照，無PBMC)、PBS (對照)或3 mg/kg包含編碼HER2.28ζ、HER2.BBζ或CD19.28ζ CAR之環狀RNA的LNP。環狀RNA進一步包含衍生自山羊嵴病毒或匈奴病毒之內部核糖體進入位點(IRES)。LNP包含前述實例中所提及之可離子化物。每隔一天(在四小時時間框內)向小鼠給藥，總共4次劑量。圖42A至圖42G提供包含JIMT-1 (圖42A至圖42F)及BT-474 (圖42F至圖42L)腫瘤細胞之小鼠在50天內累積之總腫瘤體積。 實例18：編碼HER2 CAR之環狀RNA
冷凍的人類T細胞經解凍且用幹細胞CD3/CD28抗體混合液活化72小時。活化後T細胞用本文所描述之包含不同IRES序列及具有28z或BBz域之以上構築體N及構築體O中所示之HER2 CAR序列的環狀RNA電穿孔。電穿孔(EP)但無環狀RNA(模擬物)或具有編碼CD19 CAR之環狀RNA的T細胞充當對照。EP之後，使細胞恢復24小時，隨後在轉染後24、48及72小時時藉由FACS評估其表現。使用可溶HER2螢光標記蛋白(與螢光團共軛之可溶蛋白質)偵測HER2 CAR。
進行Incucyte分析。EP之後24小時，將表現編碼HER2 CAR之環狀RNA的細胞以1:1之E:T與不具有IL2之T細胞生長培養基中之HER2陽性、GFP陽性BT474目標細胞接種在Incucyte盤上。將染色死細胞之膜聯蛋白V添加至共培養物中以追蹤死細胞之積聚。在Incucyte儀器上讀取盤持續5天。藉由分析用膜聯蛋白V染色之綠色目標細胞之百分比且與孔中之總GFP陽性群體以及模擬物對照進行比較來評估目標細胞死亡。
經72小時評定編碼HER2 CAR及包含不同IRES序列之環狀RNA的表現動力學。針對編碼HER2 CAR及包含不同IRES序列之環狀RNA評估藉由Incucyte之BT474目標細胞之細胞毒性功能。參見例如圖43A-D、圖44A-D、圖45A-B及圖46。 實例19：編碼CD19 CAR之環狀RNA在自體免疫疾病中之用途
在19週時使用CD34+ NOD.Cg-PrkdcscidIL-2rgem1/Smoc菌株評估編碼CD19 CAR之環狀RNA耗乏CD34+植入之人源化小鼠模型中人類B細胞之能力。由Invivocue產生CD34+人源化小鼠(HiMice)。將五至六週齡雌性NOD-PrkdcscidIL2rgem1/Smoc小鼠以約16-22g經亞致死輻射且經由靜脈內植入人類CD34+造血幹細胞。在人源化方法期間，在植入後12至14週之過程內監測小鼠以確保免疫譜系分化及成熟。在此實驗中使用在第12週或第14週具有極少10%之人類CD45+復原的HiMice。亦使HiMice補充有細胞激素GM-CSF、IL-3及IL-4以增強骨髓譜系、B細胞分化且保持T細胞發育。一旦證實植入，每週一次投與總計5個劑量之囊封於本文所揭示之LNP中之mWasabi oRNA或囊封於相同LNP中之CD19 CAR oRNA。在每次LNP-oRNA注射3天後收集周邊血液且分析免疫亞群。收集脾且在第5次LNP-oRNA注射之後3天處理以用於免疫分析。
來自血液或脾臟之細胞首先在室溫下用50 μl活/死溶液(在PBS中1:400稀釋)染色10分鐘。隨後藉由離心使細胞粒化，且在室溫下用小鼠及人類Fc受體阻斷試劑(於25 μl FACS緩衝液中)再懸浮10分鐘以防止非特異性結合。隨後，將經螢光標記之表面標記物(於25 μl FACS緩衝液中)添加至細胞中。在黑暗中培育約30分鐘之後，洗滌細胞，隨後使用Fortessa™ X-20流式細胞儀(BD Biosciences)用FACSDiva軟體獲取FACS資料。隨後用FlowJo軟體(Tree Star公司)分析FACS資料。
編碼CD19 CAR之環狀RNA介導CD34+人源化小鼠中之B細胞特異性耗乏。用囊封於LNP中之CD19 CAR oRNA處理的組中之B細胞介導之殺傷在周邊血液及脾臟內5個劑量後維持。觀測到最低LNP對總CD20+ B細胞頻率及周邊血液計數之影響。參見例如圖47、圖48A-C、圖49A-C。 實例20：NK細胞中編碼CD19 CAR之環狀RNA
使用編碼NOG-IL15小鼠中之CD19 CAR之環狀RNA評估自然殺手(NK)細胞中之RAJI對照。參見例如Katano等人, Long-term maintenance of peripheral blood derived human NK cells in a novel human IL-15- transgenic NOG mouse, Sci Rep (2017)，其內容以引用的方式併入本文中(「使用嚴重免疫缺陷NOD/Shi-scid-IL-2Rγnull (NOG)小鼠基因背景(NOG-IL-15 Tg)，表現轉殖基因人類介白素-15 (IL-15)之小鼠品系。自正常健康供體之周邊血液(hu-PB-NK)純化之人類自然殺手(NK)細胞在轉移至NOG-IL-15小鼠中時增殖」)。
NOG-IL15小鼠在第0天用CD19+ Raji-螢光素酶細胞株植入。第3天，將自周邊血液純化之初級人類NK細胞植入至接受體動物中。在第8天，小鼠保持未經處理，或靜脈內用媒劑、囊封於LNP中之編碼mOX40L CAR之環狀RNA (1 mg/kg)或囊封於LNP中之編碼CD19 CAR之環狀RNA (1 mg/kg)處理。每兩天處理小鼠持續10個劑量。使用本文所描述之IVIS成像評估腫瘤負荷。
在此小鼠模型中觀測腫瘤清除。用囊封於LNP中之編碼CD19 CAR的環狀RNA處理之小鼠展現出腫瘤控制，直至第24天研究終點。參見例如圖50及圖51。 實例21：巨噬細胞中編碼CD19 CAR之環狀RNA
NSG-QUAD小鼠用人類CD34+臍帶血植入。在植入後10週時，動物未經處理(對照)或經囊封於LNP中之包含mOX40L之序列的環狀RNA處理(參見圖52)。在24、48或72小時之後處死動物。mOX40L表現藉由流式細胞量測術分析血液、骨髓及脾臟中CD33+、CD33+CD14+或CD33+CD64+骨髓細胞。在各時間點偵測到在骨髓及脾臟中CD33+骨髓細胞之表面上的mOX40L，其中在72小時LNP-環狀RNA處理時觀測到峰值表現。參見例如圖53、圖54A-D、圖55A-G、圖56A-G、圖57A-D、圖58A-G及圖59A-G。
本說明書及例示性實施例不應視為限制性的。出於本說明書及所附申請專利範圍之目的，除非另外說明，否則表示數量、百分比或比例的所有數字，及說明書及申請專利範圍中所用之其他數值均應理解為在所有情況下藉由術語「約」修飾至其尚未如此修飾的程度。因此，除非有相反指示，否則本說明書及所附申請專利範圍中所闡述之數值參數為可視設法獲得之所需特性而變化的近似值。至少，且不試圖將均等論之應用限於申請專利範圍之範疇，各數值參數至少應根據所報導之有效數位之個數且藉由應用普通捨入技術來解釋。
應注意，如本說明書及申請專利範圍中所用，除非明確地且肯定地限於一個指示物，否則單數形式「一(a/an)」與「該」及任何字語之任何單數使用形式包括複數個指示物。如本文中所使用，術語「包括」及其語法變體意欲為非限制性的，以使得清單中之項之列舉不排除可取代或添加至所列項之其他類似項。
10:線性RNA聚核苷酸前驅體 20:5'增強型內含子元件 21:前導非轉譯序列 22:5'親和標籤 26:5'外部間隔子 28:3'內含子片段 30:5'增強型外顯子元件 32:3'外顯子片段 34:5'內部雙螺旋體區 36:5'內部間隔子 40:核心功能元件 42:TIE;轉譯起始元件 46:編碼元件;編碼區 47:非編碼區 48:終止區;終止密碼子;終止卡匣 50:3'增強型外顯子元件 52:3'內部間隔子 54:3'內部雙螺旋體區 56:5'外顯子片段 60:3'增強型內含子元件 62:5'內含子片段 64:3'外部間隔子 68:3'親和標籤 69:末端非轉譯序列 70:輔助元件
圖1A展示例示性IRES/密碼子質體之序列插入位點的示意圖。IRES及密碼子(表現序列)一起合成且插入至包含含有細菌序列及5'合併之輔助元件及3'合併之輔助元件之質體「主鏈」的環狀RNA中。輔助元件可包括(但不限於)啟動子、內含子、外顯子、內部及外部間隔子、內部雙螺旋區及polyA延伸段。圖1B描繪線性RNA聚核苷酸前驅體(10)之一般序列構築體。如所提供之序列係按5'增強型內含子元件(20)、5'增強型外顯子元件(30)、核心功能元件(40)、3'增強型外顯子元件(50)及3'增強型內含子元件(60)之5'至3'次序繪示。圖1C展示例示性線性RNA聚核苷酸前驅體(10)，其按以下5'至3'次序包含：前導非轉譯序列(21)、5'親和標籤(22)、5'外部間隔子(26)、3'內含子片段(28)、3'外顯子片段(32)、5'內部雙螺旋體區(34)、5'內部間隔子(36)、TIE (42)、編碼元件(46)、阻止區(48)、3'內部間隔子(52)、3'內部雙螺旋體區(54)、5'外顯子片段(56)、5'內含子片段(62)、3'外部間隔子(64)、3'親和標籤(68)及末端非轉譯序列(69)。圖1D繪示包括於位於核心功能元件(40)內之線性RNA聚核苷酸中之輔助元件(70)(例如，miRNA結合位點)的例示性位置，例如其中42為TIE (轉譯起始元件)，46為編碼區，47為非編碼區，及48為終止區(終止密碼子或終止卡匣)。
圖2A及圖2B描繪初步過程之示意圖，藉由該初步過程選擇IRES及密碼子之組合用於環狀RNA構築體。
圖3A及圖3B描繪三種不同密碼子最佳化算法之作用。針對兩種不同供體(供體4003及供體609C)中之各構築體，經由流式細胞分析術評估CD19CAR+表現(gMFI)且按所有序列之排序順序繪製且藉由密碼子最佳化算法編碼。右側之白條指示未經密碼子最佳化CD19CAR序列之表現(陽性對照)。
圖4A、4B及4C描繪三種不同密碼子最佳化算法之作用。在電穿孔後，使用三種算法隨時間推移評估與陽性對照及模擬物陰性對照相比之MFI (總T細胞)、CD3+細胞之百分比(CAR-T細胞頻率)及總細胞計數(CAR-T細胞數目)。
圖5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I及5J展示針對包含IRES與表現序列之組合的環狀RNA構築體之兩種供體(供體4003及供體609C)隨時間推移(5天)藉由IRES之T細胞MFI (表現)。X軸上之各點為來自表1A之IRES且各點為來自表2A之不同表現序列(經密碼子最佳化；抗CD19 28-ζ)。
圖6A、6B、6C、6D、6E、6F、6G、6H、6I及6J展示藉由IRES隨時間推移CAR陽性細胞%，亦即針對包含IRES與表現序列之組合的環狀RNA構築體之兩種供體(供體4003及供體609C)隨時間推移(5天)表現之細胞百分比或細胞的平均信號。X軸上之各點為來自表1A之IRES且各點為來自表2A之不同表現序列(經密碼子最佳化；抗CD19 28-ζ)。
圖7A及圖7B展示在24小時及48小時時改變IRES對Nalm6溶解%資料之作用。產生包含基礎CD19密碼子(3276)之不同構築體與不同IRES之組合，包括表1A (包含SEQ ID NO: 1、4-15)中之IRES編號1-1、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14及1-15，與模擬物陰性對照、基礎CD19 CAR對照之IRES及兩種不同供體(609C及4003)中之單獨Nalm6相比。
圖8A及圖8B展示與模擬物陰性對照、基礎CD19 CAR對照及單獨的Nalm6相比，在24及48小時分級時，表5中藉由IRES/CO構築體數鑑別之69種CD19CAR oRNA構築體之兩種不同供體(609C及4003)的細胞毒性資料。
圖9A、9B、9C及9D反映兩種供體之第1天及第2天CD19 CAR oRNA構築體的類似%Nalm6殺手細胞毒性資料，如圖8A及圖8B中，但以不同目視形式呈現。X軸上之各點為包含SEQ ID NO: 1-15序列之IRES (IRES編號1-1至1-15，描述於表1A中)。各點為包含SEQ ID NOs 19-23之序列的不同密碼子(密碼子編號2A-19至2A-23，描述於表2A中，經密碼子最佳化；抗CD19 28-ζ)。對照為基礎CD19 CAR對照之IRES (3276)。
圖10A、10B、10C及10D反映IFNγ表現，且圖10E、10F、10G及10H反映兩種不同供體中69種CD19CAR環狀RNA構築體在電穿孔後24小時及48小時時之IL-2表現(609C及4003)。
圖11展示對於IRES/CO純系編號37 (SEQ ID NO: 52)之CD19 CAR構築體的膜聯蛋白V+Nalm6 (Nalm6之百分比)，與含有非最佳化CAR序列、HER2環狀RNA構築體(包含HER2_9)、模擬物陰性對照及單獨的Nalm6之CD19 CAR構築體(3276)相比。
圖12A展示供體9003之表6之12種CD19 CAR構築體(藉由IRES/CO純系數目鑑別)經96小時之T細胞%。圖12B展示12種構築體之供體9003在電穿孔後48小時內之CAR + MFI。圖12C展示與基礎CD19 CAR對照(3276)、模擬物陰性對照、單獨的Nalm6及HER2相比經72小時之膜聯蛋白V+Nalm6。
圖13A及圖13B展示293細胞及Jurkat細胞類型中針對12種不同IRES的藉由發光之IRES表現。
圖14展示在1.0 mg/kg、0.3 mg/kg及0.1 mg/kg之劑量下與基礎CD19 CAR對照(3276)、PBS及HER2對照相比包含IRES/CO純系編號7、37及87 (分別為SEQ ID NO: 50、52、55)之CD19 oCAR構築體的活體內抗腫瘤功效。具有Holm-Sidak校正之多個曼-惠特尼測試，*p ≤ 0.05、** p≤ 0.01、***p ≤ 0.001。
圖15展示在1.0 mg/kg、0.3 mg/kg及0.1 mg/kg之劑量下與基礎CD19 CAR對照(3276)、PBS及HER2對照相比包含IRES/CO純系編號97、17、164及87 (分別為SEQ ID NO: 56、51、58、55)之CD19 oCAR構築體的活體內抗腫瘤功效。
圖16展示針對包含HER2及CD19之環狀RNA構築體之不同脂質組合物與對照相比在4個劑量之LNP/oCAR之後總通量(光子/秒)。HER2及CD19脂質組合物包含表3之可離子化脂質126、128、16、45及86。表3之可離子化脂質126及128為式II之脂質，且表3之可離子化脂質16、45及86為式I之脂質。「/3」名稱指示包含經PEG改質之脂質的脂質組合物。脂質(3-128)/3、(3-16)/3、(3-45)/3及(3-86)/3含有經PEG改質之脂質。脂質(3-128)/3L含有表3之可離子化脂質128及經PEG改質之脂質。
圖17展示與基礎CD19 CAR對照(3276)及模擬物陰性對照相比包含HER2_9及HER2_10之環狀RNA構築體隨時間推移的細胞毒性% (IncuCyte細胞毒性分析)。
圖18A、18B及18C展示在使用經工程化HER2/K562細胞株(圖18A)、CD19/K562 (圖18B)及Nalm6 (CD19+/HER2-) (圖18C)細胞24小時共培養之後使用基於FACS之細胞毒性分析評估的與CD19 oCAR構築體、基礎CD19 CAR對照及模擬物陰性對照相比HER2.BBζ oCAR構築體及HER228ζ oCAR構築體之目標溶解%。
圖19A、19B及19C展示用於與MM.1S細胞、U266B1細胞及Nalm 6細胞中之基礎CD19 CAR (3276)及模擬物陰性對照相比包含BCMA_16之序列之oCAR構築體的目標特異性細胞毒性 。
圖20展示如藉由總通量(光子/秒) Nalm6植入後使用每週一次給藥以0.1 mg/kg (mpk)及0.3 mg/kg (mpk)所量測之腫瘤對照。
圖21A、21B及21C展示使用每隔一週(兩週一次或q2w)按0.1 mg/kg及0.3 mg/kg給藥藉由Nalm6植入後總通量(光子/秒)所量測之腫瘤對照。表3 (「3-86」)之脂質86用於此等oRNA CAR構築體。
圖22展示使用每隔一週按0.1 mg/kg及0.3 mg/kg給藥之活體內腫瘤對照。
圖23A及圖23B展示Nalm6植入後隨時間推移之定量腫瘤量測結果。在圖23A中，灰色圓圈展示對對照之反應，且黑色方塊展示對本文所描述之CD19 oRNA CAR構築體之處理的反應。在圖23B中，全身影像展示未處理及隨時間推移經處理之小鼠。
圖24A描繪與未經任何環狀RNA電穿孔之「模擬物」對照T細胞相比，經由電穿孔以每0.1×10 6個T細胞10 ng、30 ng或100 ng劑量引入編碼BCMA-41BBζ CAR之例示性環狀RNA (circRNA)後用可溶性BCMA.PE偵測的BCMA CAR表現。引入環狀RNA後24小時、48小時及72小時分析T細胞之表現。圖24B描繪在以每0.1×10 6個T細胞10 ng、30 ng或100 ng劑量引入編碼BCMA-41BBζ CAR之環狀RNA後24小時內使用幾何平均螢光強度(gMFI)活性定量之BCMA CAR表現。「A」、「B」及「C」分別對應於表α1中之「DNA模板A」、「DNA模板B」及「DNA模板C」，亦即環狀RNA構築體「A」包含DNA模板A之IRES序列及DNA模板A之BCMA序列；環狀RNA構築體「B」包含DNA模板B之IRES序列及DNA模板B之BCMA序列；環狀RNA構築體「C」包含DNA模板C之IRES序列及DNA模板C之BCMA序列；等。
圖25A至圖25G描繪在環狀RNA電穿孔至T細胞中後編碼BCMA-41BBζ CAR之例示性環狀RNA之抗BCMA嵌合抗原受體(CAR)表現。「A」、「B」、「C」、「D」及「E」分別對應於表α1中之「DNA模板A」、「DNA模板B」、「DNA模板C」、「DNA模板D」及「DNA模板E」。圖中之「模擬物」表示未經環狀RNA電穿孔之對照T細胞的資料。圖25A描繪在由DNA模板A、DNA模板B及DNA模板C形成且以每0.1×10 6個T細胞10 ng、30 ng或100 ng給藥之環狀RNA電穿孔至T細胞中後24-72小時內藉由可溶性BCMA PE偵測試劑偵測的CAR表現百分比。圖25B描繪在由DNA模板A、DNA模板B及DNA模板C形成且以每0.1×10 6個T細胞10 ng、30 ng或100 ng給藥之環狀RNA電穿孔至T細胞中後24-72小時內藉由可溶性BCMA PE偵測試劑偵測的T細胞之幾何平均螢光強度(gMFI)。圖25C提供在將圖25A及25B中所描繪之環狀RNA以30 ng之劑量在24小時之後引入至T細胞後的螢光活化之細胞分選(FACS)成像。圖25D描繪在由DNA模板A、DNA模板B、DNA模板C、DNA模板D及DNA模板E形成且以每0.1×10 6個T細胞10 ng、30 ng或100 ng給藥之環狀RNA電穿孔至T細胞中後24-96小時內藉由可溶性BCMA PE偵測試劑偵測的CAR表現百分比。圖25E描繪在由DNA模板A、DNA模板B、DNA模板C、DNA模板D及DNA模板E形成且以每0.1×10 6個T細胞10 ng、30 ng或100 ng給藥之環狀RNA電穿孔至T細胞中後24-96小時內藉由抗惠特洛(anti-Whitlow) PE偵測試劑偵測的CAR表現百分比。圖25E描繪在由DNA模板A、DNA模板B、DNA模板C、DNA模板D及DNA模板E形成且以每0.1X10 6個T細胞10 ng、30 ng或100 ng給藥之環狀RNA電穿孔至T細胞中後24-96小時內藉由抗G4S偵測試劑偵測的CAR表現百分比。圖25G描繪在由DNA模板A、DNA模板B、DNA模板C、DNA模板D及DNA模板E形成且以每0.1X10 6個T細胞10 ng、30 ng或100 ng給藥之環狀RNA電穿孔至T細胞中後24-96小時內藉由可溶性BCMA PE偵測試劑偵測的T細胞之平均MFI (%)。
圖26描繪用於分析以10 ng×10之劑量經編碼BCMA CAR之環狀RNA電穿孔之T細胞的流動式細胞量測術結果的例示性圈選方法。用可溶性BCMA PE、抗惠特洛PE或抗G4S連接子偵測BCMA CAR表現。
圖27展示多發性骨髓瘤陽性細胞(例如MM1S、NCI-H929及RPMI-8226)及陰性目標細胞株(例如Nalm6目標細胞株)上之目標蛋白質表現。
圖28描繪與不包含環狀RNA且僅包含電穿孔緩衝溶液之「模擬物」溶液相比，在電穿孔包含BCMA-41BBζ CAR或CD19-CD28ζ CAR之環狀RNA後24小時收集之活T細胞的百分比。「A」、「G」、「C」、「F」、「H」、「I」及「J」對應於用於形成環狀RNA之「DNA模板A」、「DNA模板G」、「DNA模板C」、「DNA模板F」、「DNA模板H」、「DNA模板I」及「DNA模板J」。
圖29A至圖29D提供與缺乏任何環狀RNA (僅含有電穿孔緩衝液)之「模擬物」對照T細胞相比，以每0.1×10 6個T細胞50 ng之劑量電穿孔至T細胞上的編碼BCMA-41BBζ或BCMA-CD28ζ CAR或CD19-CD28ζ CAR之各種環狀RNA構築體收集的gMFI。向各環狀RNA溶液給予可溶性BCMA (sBCMA-PE)、抗惠特洛-PE或抗G4S連接子PE (G4S-AF647)偵測試劑。圖29A展示自細胞收集之gMFI的直方圖。圖29B至圖29D提供用於細胞中之每一者的gMFI，其中sBCMA-PE (圖29B)、抗惠特洛-PE (圖29C)及G4S-AF647 (圖29D)偵測試劑用於收集gMFI。「A」、「G」、「C」、「F」、「H」、「I」及「J」對應於用於形成環狀RNA之「DNA模板A」、「DNA模板G」、「DNA模板C」、「DNA模板F」、「DNA模板H」、「DNA模板I」及「DNA模板J」。
圖30描繪在電穿孔後24小時oCAR-T細胞之例示性圈選過程。頂部一列方框(自左至右)提供淋巴球、CD3陰性細胞、活T細胞及BCMA陽性細胞之FACS成像。底部兩個方框為藉由可溶性BCMA或抗惠特洛偵測試劑(左側底部)或抗GS4-PE螢光(右側底部)偵測之BCMA CAR的直方圖。
圖31A至圖31C描繪所用偵測試劑(亦即，可溶性BCMA PE (由圖31A中之「sBCMA」指示)、抗惠特洛-PE (由圖31B中之「惠特洛」指示)及抗G4S連接子PE (由圖31C中之「G4S」指示))之表現百分比。在電穿孔編碼BCMA-41BBζ、BCMA-CD28ζ或HER2 CAR之環狀RNA後24小時，根據對活T細胞圈選的相關偵測試劑之存在計算表現百分比。「A」、「G」、「C」、「F」、「H」、「I」及「J」對應於用於形成環狀RNA之「DNA模板A」、「DNA模板G」、「DNA模板C」、「DNA模板F」、「DNA模板H」、「DNA模板I」及「DNA模板J」。圖中之「模擬物」表示未經環狀RNA電穿孔之對照T細胞的資料。
圖32A至圖32E展示在電穿孔編碼BCMA-41BBζ、BCMA-CD-CD28ζ或CD19-CD28ζ之環狀RNA後，對CD3+細胞圈選的經由gMFI得到的BCMA表現(圖32A、圖32B及圖32D)或可溶性BCMA PE偵測(指示為「sBCMA-PE%」) (圖32C或圖32E)。「模擬物」指示T細胞溶液未經環狀RNA構築體電穿孔。圖32A提供環狀RNA構築體之可溶性BCMA-PE或抗惠特洛.PE偵測之24及48小時收集的直方圖。圖32B及圖32C提供在包含環狀RNA之CD3+細胞已與多發性骨髓瘤(MM1S)細胞共培養之後，構築體中之各者在24-72內之gMFI及sBCMA-PE表現%。圖32D及圖32E提供在包含環狀RNA之CD3+細胞已與多發性骨髓瘤(MM1S)細胞、NCI-H929 (在圖中指示為「H929」)、Nalm6或K562.CD19細胞共培養之後，構築體中之各者在電穿孔後72的gMFI及sBCMA-PE表現%。「C」、「G」、「H」、「A」、「I」及「J」對應於用於形成環狀RNA之「DNA模板C」、「DNA模板G」、「DNA模板H」、「DNA模板A」、「DNA模板I」及「DNA模板J」。圖中之「模擬物」表示未經環狀RNA電穿孔之對照T細胞的資料。
圖33A至圖33C描繪編碼BCMA-41BBζ嵌合抗原受體(CAR)之環狀RNA構築體在共培養後0至72或96小時內對各種細胞類型的細胞毒性，其中環狀RNA包含來自表α1、β或γ CD19-CD28ζ CAR或HER2-CD28ζ CAR之BCMA序列及IRES序列。圖33A提供編碼CAR構築體之環狀RNA中之各者在每0.1×10 6個T細胞10或30 ng之劑量下對MM1S細胞的細胞毒性。模擬物T細胞(亦即在圖中稱為「模擬物」的未電穿孔環狀RNA之T細胞)及圖33A中指示為「MM1S」的未與T細胞共培養之MM1S細胞用作對照。圖33B提供編碼CAR構築體之環狀RNA中之各者在每0.1×10 6個T細胞10或30 ng之劑量下對Nalm6細胞的細胞毒性。模擬物T細胞(亦即在圖中指示為「模擬物」的未電穿孔環狀RNA之T細胞)及圖33B中稱為「Nalm6」的未與T細胞共培養之Nalm6細胞用作對照。圖33C提供編碼CAR構築體之環狀RNA中之各者在每0.1×10 6個T細胞20 ng之劑量下對CD19 T穩定細胞株的細胞毒性。模擬物T細胞(亦即在圖中指示為「模擬物」的未電穿孔環狀RNA之腫瘤T細胞)及圖33C中稱為「腫瘤」的未與T細胞共培養之CD19 T穩定細胞用作對照。藉由活細胞分析組合系統成像產生的(綠色區域+紅色區域/綠色區域)計算細胞毒性%。「A」、「B」、「C」、「F」及「K」對應於用於形成環狀RNA之「DNA模板A」、「DNA模板B」、「DNA模板C」、「DNA模板F」及「DNA模板K」。
圖34A至圖34C描繪跨越多個細胞類型之各種經工程化之環狀RNA的細胞毒性分析。圖34A提供在共培養由引入包含3'念珠藻屬外顯子、山羊嵴病毒內部核糖體進入位點(IRES)、BCMA-41BBζ CAR及5'念珠藻屬外顯子之環狀RNA形成的oCAR-T細胞後24小時，細胞(例如淋巴球、CD3陰性細胞、活細胞及BCMA陽性細胞)之FACS成像。圖34B展示在MM1S (圖24B)或Nalm6 (圖24C)上自編碼BCMA-41BBζ、CD19-CD28ζ或HER2-CD28ζ CAR之環狀RNA獲得的細胞毒性百分比。如圖34B中所描繪之「MM1S+模擬物」及「MM1S」係指與未經環狀RNA轉染之T細胞共培養的MM1S細胞。如圖34C中所描繪之「Nalm6+模擬物」及「Nalm6」係指與未經環狀RNA轉染之T細胞共培養的Nalm6細胞。「A」、「B」、「C」、「F」及「K」對應於用於形成環狀RNA之「DNA模板A」、「DNA模板B」、「DNA模板C」、「DNA模板F」及「DNA模板K」。
圖35A描繪「模擬物+MM1S」(亦即與未經環狀RNA電穿孔之T細胞共培養的MM1S腫瘤細胞)、「模擬物+Nalm6」(亦即與未經環狀RNA電穿孔之T細胞共培養的Nalm6腫瘤細胞)、「模擬物+H929」(亦即與未經環狀RNA電穿孔之T細胞共培養的NCI-H929腫瘤細胞)及「模擬物+K562.CD19」(亦即與未經環狀RNA電穿孔之T細胞共培養的K562.CD19腫瘤細胞)的FACS成像。圖35B描繪CD19+CD3+細胞之FACS成像。
圖36A至圖36D描繪已經衍生自表α1、表β及/或表γ1中之DNA模板之環狀RNA電穿孔且隨後與目標細胞(例如MM1S (圖36A)、NCI-H929 (在圖36B中描繪為「H929」)、Nalm6 (圖36C)或K562.CD19 (圖36D))共培養，在共培養後24 (左側)或48 (右側)小時的目標細胞存活率% (頂部)及T細胞之目標細胞殺傷% (底部)。「模擬物+MM1S」(亦即與未經環狀RNA電穿孔之T細胞共培養的MM1S腫瘤細胞)、「模擬物+Nalm6」(亦即與未經環狀RNA電穿孔之T細胞共培養的Nalm6腫瘤細胞)、「模擬物+H929」(亦即與未經環狀RNA電穿孔之T細胞共培養的NCI-H929腫瘤細胞)及「模擬物+K562.CD19」(亦即與未經環狀RNA電穿孔之T細胞共培養的K562.CD19腫瘤細胞)。「F」、「C」、「G」、「H」、「A」、「I」及「J」對應於用於形成環狀RNA之「DNA模板F」、「DNA模板C」、「DNA模板G」、「DNA模板H」、「DNA模板A」、「DNA模板I」及「DNA模板J」。
圖37A及圖37B描繪在MM1S或Nalm6與含有環狀RNA之T細胞共培養後，由編碼BCMA-41BBζ、CD19-CD28ζ及HER2-CD28ζ CAR之環狀RNA在每0.1×10 6個T細胞10、30或100 ng劑量下在MM1S (圖37A)或Nalm6 (圖37B)細胞上產生的INϒ細胞介素分泌。細胞毒性量係由細胞介素及趨化介素套組(例如MSD)計算。「MM1S+模擬物」係指與未經環狀RNA電穿孔之T細胞共培養的MM1S腫瘤細胞。「MM1S」係指未與T細胞共培養之腫瘤細胞。「Nalm6+模擬物」係指與未經環狀RNA電穿孔之T細胞共培養的Nalm6腫瘤細胞。「Nalm6」係指未與T細胞共培養之腫瘤細胞。「A」、「B」、「C」、「F」及「K」對應於用於形成環狀RNA之「DNA模板A」、「DNA模板B」、「DNA模板C」、「DNA模板F」及「DNA模板K」。
圖38A至圖38P描繪包含編碼BMCA-41BBζ、BCMA-CD28ζ或CD19-CD28ζ CAR之環狀RNA的共培養T細胞及目標細胞中24及48小時(各圖中分別左側及右側)之細胞介素量(pg/mL)。目標細胞包括MM1S (圖38A、38E、38I及38M)、NCI- H929 (指示為「H929」) (圖38B、38F、38J、38N)、Nalm6 (圖38C、38G、38K、38O)及K562.CD19 (圖38D、38H、38L、38P)。圖38A至圖38D提供INFϒ細胞介素含量，圖38E至圖38H提供TNFα細胞介素含量，圖38I-38L提供IL-2細胞介素含量，及圖38M至圖38P GM-CSF含量。「F」、「C」、「G」、「H」、「A」、「I」及「J」對應於用於形成環狀RNA之「DNA模板F」、「DNA模板C」、「DNA模板G」、「DNA模板H」、「DNA模板A」、「DNA模板I」及「DNA模板J」。
圖39描繪在引入編碼HER2 CAR之環狀RNA後72小時內，自活細胞分析組合系統(例如IncuCyte)收集之目標細胞(例如Nalm6)的細胞凋亡百分比(例如凋亡目標細胞%=(綠色區域+紅色區域)/綠色區域)。綠色區域指示目標細胞。紅色區域指示存在於凋亡細胞中之膜聯蛋白V試劑。對於對照，使用不包含環狀RNA之Nalm6。
圖40A至圖40C描繪編碼HER2.28ζ、HER2. BBζ或CD19.28ζ CAR之環狀RNA引入至經活化PBMC T細胞及在BT474 (圖40A)、SKBR3 (圖40B)及JIMT1 (圖40C) HER2陽性細胞中共培養後膜聯蛋白V/相%。出於比較目的，使用缺乏任何環狀RNA之經活化PBMC T細胞(指示為「模擬物」)。圖40A至圖40C中所提及之「膜聯蛋白V/相%」係關於凋亡細胞/相之百分比。「K」、「L」及「M」對應於用於形成環狀RNA之「DNA模板K」、「DNA模板L」及「DNA模板M」。
圖41A描繪編碼HER2 CAR之三種不同環狀RNA構築體之冷凍及新鮮LNP遞送的CAR表現。「模擬物」細胞為給予空LNP (無環狀RNA)之T細胞。圖41B提供自與BT-474目標細胞以1:1 E:T比共培養之包含編碼HER2-28ζ、HER2-BBζ或CD19-28ζ CAR之環狀RNA構築體之T細胞的活細胞分析組合系統(例如IncuCyte)分析收集之細胞毒性%，其中環狀RNA用新鮮或冷凍LNP遞送。新鮮及冷凍LNP包含來自表3之可離子化脂質。圖41C提供由對於環狀RNA構築體中之各者在BT-474中共培養之T細胞產生的細胞介素釋放(圖41C之頂部圖：INFϒ及圖41C之底部圖：TNFα)。「K」、「L」及「F」對應於用於形成環狀RNA之「DNA模板K」、「DNA模板L」及「DNA模板F」。「新鮮」指示LNP先前未經冷凍。「冷凍」指示LNP先前經冷凍。
圖42A至圖42L描繪經靜脈內注射且使用脂質奈米粒子遞送至JIMT-1 (圖42A至圖42L)及BT-474 (圖42G至圖42L)小鼠模型中之編碼HER2.28ζ、HER2.BBζ或CD19.28ζ CAR之環狀RNA的抗HER2表現。圖42C-42F為圖42A至圖42B中收集之資料的一些蛛網圖。圖42I至圖42L為圖42G及圖42H中收集之資料的蛛網圖。「K」、「L」及「F」對應於用於形成環狀RNA之「DNA模板K」、「DNA模板L」及「DNA模板F」。「新鮮」指示LNP先前未經冷凍。「冷凍」指示LNP先前經冷凍。
圖43A-D展示在包含IRES序列、抗HER2 CAR及28z域(HER2_9、HER2_1、HER2_3、HER2_4，本文在表9中所描述)之環狀RNA構築體中電穿孔之後的CAR表現。
圖44A-D展示在包含IRES序列、抗HER2 CAR及BBz域(HER2_10、HER2_5、HER2_7、HER2_8，本文在表9中所描述)之環狀RNA構築體中電穿孔之後的CAR表現。
圖45A及圖45B展示在BT474目標細胞中與對照(3273 (基礎)及模擬物)相比包含IRES序列、抗HER2 CAR及28z或BBz域(HER2_10、HER2_5、HER2_7、HER2_8)之環狀RNA構築體的效能。
圖46展示用於評估包含抗CD19 CAR (原位CAR或isCAR™)之環狀RNA耗乏CD34+植入人源化小鼠模型中之人類B細胞之能力的例示性方法。
圖47展示用於自體免疫研究中之例示性流式細胞分析術組。
圖48A-C展示由包含抗CD19 CAR之環狀RNA介導的B細胞耗乏。
圖49A-C展示在小鼠中耗乏之脾B細胞，該小鼠用編碼囊封於本文所描述之脂質奈米粒子中之報導體(mWasabi)的環狀RNA處理。
圖50展示用於使用包含抗CD19 CAR之環狀RNA評估在NOG-IL15小鼠中NK細胞中之RAJI對照的例示性方法。
圖51展示在第0天植入CD19+ Raji-luc細胞株的NOG-IL15小鼠。在第3天，自外周血液純化初級人類NK細胞且將其植入至受體動物中。在第8天，小鼠保持未處理或用媒劑靜脈內，LNP-1 mg/kg mOX40L CAR或1 mg/kg LNP-CD19 CAR處理。每兩天處理小鼠持續10個劑量。使用IVIS影像使腫瘤負荷成像。資料顯示，用LNP-CD19 CAR處理之小鼠直至第24天研究終點展現腫瘤對照組。
圖52展示用於評定巨噬細胞中之環狀RNA之例示性方法。
圖53展示如本文別處所應用用於建立向單核球之環狀RNA遞送的例示性FACS閘控策略。
圖54A-D展示骨髓中之骨髓細胞中之mOX40L表現。
圖55A-G展示骨髓中之CD33+ CD14+及CD14-細胞中之mOX40L表現。
圖56A-G展示骨髓中之CD33+ CD64+及CD64-細胞中之mOX40L表現。
圖57A-D展示脾臟中之骨髓細胞中之mOX40L表現。
圖58A-G展示脾臟中之CD33 CD14及CD14-細胞中之mOX40L表現。
圖59A-G展示脾臟中之CD33+ CD64+及CD64-細胞中之mOX40L表現。
圖60A及B展示與HER2及無處理對照相比，當在兩種供體中投與EOD時，編碼BCMA CAR (BCMA oCAR、BCMA_7及BCMA_3)之環狀RNA活體內的腫瘤對照。
圖61A及B展示與HER2及無處理對照相比，當在多供體中每週一次(QW)給藥時，編碼BCMA CAR (BCMA oCAR，BCMA_7)之環狀RNA活體內的腫瘤對照。
圖62展示相較於HER2及治療對照，當每隔一天(EOD)給藥及每週一次(QW)給藥時例示性IVIS影像中編碼BCMA CAR (BCMA oCAR、BCMA_7及BCMA_3)之環狀RNA活體內腫瘤對照。
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Claims (108)

  1. 一種環狀RNA構築體，其包含： (A)  IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)至少一個編碼結合分子之表現序列。
  2. 一種環狀RNA構築體，其包含： (A) IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之嵌合抗原受體(CAR)之表現序列。
  3. 一種環狀RNA構築體，其包含： (A) IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子。
  4. 如請求項3之環狀RNA構築體，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 19-34中之任一者之序列至少80%一致的序列。
  5. 一種環狀RNA構築體，其包含： (A) IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，其中該CAR構築體包含BCMA結合子。
  6. 如請求項5之環狀RNA構築體，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 103-115中之任一者之序列至少80%一致的序列。
  7. 一種環狀RNA構築體，其包含： (A)選自腸病毒(Enterovirus)、嵴病毒(Kobuvirus)、副腸孤病毒(Parechovirus)、匈奴病毒(Hunnivirus)、雀病毒(Passerivirus)、米斯蒂病毒(Mischivirus)及心病毒(Cardiovirus)之IRES，及 (B)至少一個編碼結合分子之表現序列。
  8. 一種環狀RNA構築體，其包含： (A)選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之嵌合抗原受體(CAR)之表現序列。
  9. 一種環狀RNA構築體，其包含： (A)選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子。
  10. 如請求項9之環狀RNA構築體，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 19-34中之任一者之序列至少80%一致的序列。
  11. 一種環狀RNA構築體，其包含： (A)選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，其中該CAR構築體包含BCMA結合子。
  12. 如請求項11之環狀RNA構築體，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 103-115中之任一者之序列至少80%一致的序列。
  13. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼結合分子之表現序列，及 (B)轉移媒劑。
  14. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，及 (B)轉移媒劑。
  15. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼結合分子之表現序列，及 (B)轉移媒劑。
  16. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，及 (B)轉移媒劑。
  17. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼結合分子之表現序列，及 (B)包含可離子化脂質之轉移媒劑。
  18. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，及 (B)包含可離子化脂質之轉移媒劑。
  19. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子，及 (B)包含可離子化脂質之轉移媒劑。
  20. 如請求項19之醫藥組合物，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 19-34中之任一者之序列至少80%一致的序列。
  21. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，其中該CAR構築體包含BMCA結合子，及 (B)包含可離子化脂質之轉移媒劑。
  22. 如請求項21之醫藥組合物，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 103-115中之任一者之序列至少80%一致的序列。
  23. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼結合分子之表現序列，及 (B)包含可離子化脂質之轉移媒劑。
  24. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，及 (B)包含可離子化脂質之轉移媒劑。
  25. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子，及 (B)包含可離子化脂質之轉移媒劑。
  26. 如請求項25之醫藥組合物，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 19-34中之任一者之序列至少80%一致的序列。
  27. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，其中該CAR構築體包含BMCA結合子，及 (B)包含可離子化脂質之轉移媒劑。
  28. 如請求項27之醫藥組合物，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 103-115中之任一者之序列至少80%一致的序列。
  29. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼結合分子之表現序列，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。
  30. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR之表現序列，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。
  31. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。
  32. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子，及其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 19-34中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。
  33. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含BCMA結合子，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。
  34. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i. IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含抗BCMA結合子，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 103-115中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。
  35. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼結合分子之表現序列，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。
  36. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。
  37. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。
  38. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含抗CD19結合子，且其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 19-34中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。
  39. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含BCMA結合子，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。
  40. 一種醫藥組合物，其包含： (A)環狀RNA構築體，其包含： i.選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 ii.至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含抗BCMA結合子，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 103-115中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)包含以下之轉移媒劑： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。
  41. 如請求項1至4、7至10、13至20、23至26、29至32及35至38中任一項之醫藥組合物，其中該CAR構築體包含CD19結合子，且其中該環狀RNA包含與選自SEQ ID NO: 50-61中之任一者之序列至少80%一致的序列。
  42. 如請求項1至4、7至10、13至20、23至26、29至32及35至38中任一項之醫藥組合物，其中該CAR構築體包含CD19結合子，且其中該環狀RNA包含選自SEQ ID NO: 50-61中之任一者之序列。
  43. 如請求項42之醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含選自SEQ ID NO: 50、51、52、54、55、56、58及59中之任一者之序列。
  44. 一種包含環狀RNA構築體及轉移媒劑之醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含IRES及至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子，其中該環狀RNA包含與選自SEQ ID NO: 50-61中之任一者之序列至少80%一致的序列。
  45. 一種包含環狀RNA構築體及轉移媒劑之醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含IRES及至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子，其中該環狀RNA構築體包含選自SEQ ID NO: 50-61中之任一者之序列。
  46. 如請求項45之醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含選自SEQ ID NO: 50、51、52、54、55、56、58及59中之任一者之序列。
  47. 一種包含環狀RNA構築體及轉移媒劑之醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含IRES及至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子，其中該環狀RNA包含與選自SEQ ID NO: 50-61中之任一者之序列至少80%一致的序列，且其中該轉移媒劑包含： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。
  48. 一種包含環狀RNA構築體及轉移媒劑之醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含IRES及至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子，其中該環狀RNA包含選自SEQ ID NO: 50-61中之任一者之序列，且其中該轉移媒劑包含： (i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。
  49. 如請求項48之醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含選自SEQ ID NO: 50、51、52、54、55、56、58及59中之任一者之序列。
  50. 如請求項1至49中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含SEQ ID NO: 50。
  51. 如請求項1至49中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含SEQ ID NO: 51。
  52. 如請求項1至49中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含SEQ ID NO: 52。
  53. 如請求項1至49中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含SEQ ID NO: 54。
  54. 如請求項1至49中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含SEQ ID NO: 55。
  55. 如請求項1至49中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含SEQ ID NO: 56。
  56. 如請求項1至49中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含SEQ ID NO: 58。
  57. 如請求項1至49中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA構築體包含SEQ ID NO: 59。
  58. 如請求項5至6、21至22、27、28、33至34或39至40中任一項之醫藥組合物，其中該IRES包含SEQ ID NO: 8之序列，其中該CAR構築體包含BCMA結合子，且其中該BCMA結合子包含選自SEQ ID NO: 104-115中之任一者的序列。
  59. 如請求項13至58中任一項之醫藥組合物，其中該轉移媒劑包含式(I)之可離子化脂質。
  60. 如請求項59之醫藥組合物，其中該轉移媒劑包含輔助脂質、結構性脂質及PEG脂質。
  61. 如請求項59至60中任一項之醫藥組合物，其中該轉移媒劑具有表4b所描述之脂質莫耳比調配物。
  62. 如請求項13至58中任一項之醫藥組合物，其中該轉移媒劑包含式(II)之可離子化脂質。
  63. 如請求項62之醫藥組合物，其中該可離子化脂質選自可離子化脂質，該可離子化脂質選自以下： 。
  64. 如請求項63之醫藥組合物，其中該可離子化脂質為： 。
  65. 如請求項13至64中任一項之醫藥組合物，其中該轉移媒劑進一步包含選自輔助脂質、結構性脂質及經PEG改質之脂質的至少一種脂質。
  66. 如請求項65之醫藥組合物，其中該轉移媒劑包含PEG-DSPC。
  67. 如請求項13至66中任一項之醫藥組合物，其中該轉移媒劑為脂質奈米粒子。
  68. 如請求項13至67中任一項之醫藥組合物，其中該轉移媒劑進一步包含靶向部分。
  69. 如請求項68之醫藥組合物，其中該靶向部分為小分子、scFv、奈米抗體、肽、環狀肽、二環狀肽或三環狀肽、微型抗體、聚核苷酸適體、經工程化之骨架蛋白、重鏈可變區、輕鏈可變區或其片段。
  70. 如請求項13至69中任一項之醫藥組合物，其進一步包含醫藥鹽、緩衝劑、稀釋劑或其組合。
  71. 如前述請求項中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA進一步包含polyA區。
  72. 如前述請求項中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA進一步包含至少一個miRNA結合位點。
  73. 如請求項72之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該環狀RNA包含至少一個miR-122結合位點。
  74. 如前述請求項中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該至少一個編碼CAR之表現序列經密碼子最佳化。
  75. 如前述請求項中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物，其中該RNA構築體進一步包含5'增強型內含子元件、5'增強型外顯子元件、3'增強型外顯子元件及3'增強型內含子片段。
  76. 一種製備如前述請求項中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物之方法。
  77. 一種治療個體之癌症或自體免疫病症之方法，其藉由投與有效量之包含如請求項1至75中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物的組合物，藉此治療該癌症或自體免疫病症。
  78. 一種包含如請求項1至75中任一項之環狀RNA構築體或醫藥組合物的組合物之用途，其用於治療癌症或自體免疫病症。
  79. 一種線性前驅體RNA聚核苷酸，其包含： (A) IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)至少一個編碼結合分子之表現序列。
  80. 一種線性前驅體RNA聚核苷酸，其包含： (A) IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列。
  81. 一種線性前驅體RNA聚核苷酸，其包含： (A) IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子。
  82. 如請求項81之線性前驅體RNA聚核苷酸，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 19-34中之任一者之序列至少80%一致的序列。
  83. 一種線性前驅體RNA聚核苷酸，其包含： (A) IRES，其包含與選自SEQ ID NO: 1-18中之任一者之序列至少80%一致的序列，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含BCMA結合子。
  84. 如請求項83之線性前驅體RNA聚核苷酸，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 103-115中之任一者之序列至少80%一致的序列。
  85. 一種線性前驅體RNA聚核苷酸，其包含： (A)選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 (B)至少一個編碼結合分子之表現序列。
  86. 一種線性前驅體RNA聚核苷酸，其包含： (A)選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列。
  87. 一種線性前驅體RNA聚核苷酸，其包含： (A)選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含CD19結合子。
  88. 如請求項87之線性前驅體RNA聚核苷酸，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 19-34中之任一者之序列至少80%一致的序列。
  89. 一種線性前驅體RNA聚核苷酸，其包含： (A)選自腸病毒、嵴病毒、副腸孤病毒、匈奴病毒、雀病毒、米斯蒂病毒及心病毒之IRES，及 (B)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含BCMA結合子。
  90. 如請求項89之線性前驅體RNA聚核苷酸，其中該表現序列包含與選自SEQ ID NO: 103-115中之任一者之序列至少80%一致的序列。
  91. 如請求項79至90中任一項之線性前驅體RNA聚核苷酸，其中該表現序列經密碼子最佳化。
  92. 如請求項79至91中任一項之線性前驅體RNA聚核苷酸，其進一步包含5'增強型內含子元件、5'增強型外顯子元件、3'增強型外顯子元件及3'增強型內含子片段。
  93. 如請求項92之線性前驅體RNA聚核苷酸，其依序包含以下： (A)該5'增強型內含子元件， (B)該5'增強型外顯子元件， (C)包含IRES及至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列及視情況包含終止密碼子或終止卡匣的核心功能元件， (D)該3'增強型外顯子元件，及 (E)該3'增強型內含子元件。
  94. 如請求項79至93中任一項之線性前驅體RNA聚核苷酸，其進一步包含至少一個miRNA結合位點。
  95. 如請求項94之線性前驅體RNA聚核苷酸，其中該前驅體RNA包含至少一個miR-122結合位點。
  96. 一種DNA載體，其編碼如請求項79至95中任一項之RNA聚核苷酸。
  97. 一種製備環狀RNA構築體之方法，該方法包含在適合環化之條件下培育如請求項79至95中任一項之線性RNA聚核苷酸。
  98. 一種醫藥組合物，其包含環狀RNA構築體及轉移媒劑，其中該環狀RNA構築體包含(i) IRES，其包含選自SEQ ID NO: 1、2、4及8中之任一者之序列，及(ii)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含含有選自SEQ ID NO: 19及20中之任一者之序列的CD19結合子，且其中該轉移媒劑為脂質奈米粒子。
  99. 一種醫藥組合物，其包含環狀RNA構築體及轉移媒劑，其中該環狀RNA構築體包含(i) IRES，其包含選自SEQ ID NO: 8、16、17及18中之任一者之序列，及(ii)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含含有SEQ ID NO: 115之BCMA結合子，且其中該轉移媒劑為脂質奈米粒子。
  100. 一種醫藥組合物，其包含環狀RNA構築體及轉移媒劑，其中該環狀RNA構築體包含(i) IRES，其包含選自SEQ ID NO: 8、16、17及18中之任一者之序列，及(ii)至少一個編碼靶向癌症抗原之CAR構築體之表現序列，其中該CAR構築體包含含有選自SEQ ID NO: 132或133中之任一者之核苷酸序列的HER2結合子，且其中該轉移媒劑為脂質奈米粒子。
  101. 如請求項98至100中任一項之醫藥組合物，其中該脂質奈米粒子包含：(i)式(I)之可離子化脂質 式(I)， 其中n為1與4之間的整數； R a為氫或羥基；及 R 1及R 2各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群之取代基取代之直鏈或分支鏈C 6-C 30烷基、C 6-C 30烯基或C 6-C 30雜烷基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基； 或 (ii)式(II)之可離子化脂質 式(II)， 其中各n獨立地為2至15之整數； L 1及L 3各自獨立地為-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」指示與R 1或R 3之連接點； R 1及R 3各自獨立地為視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之直鏈或分支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥烷基、二羥烷基、羥烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基及烷基碸烷基；及 R 2係選自由以下組成之群： 。
  102. 如請求項101之醫藥組合物，其中該脂質奈米粒子轉移媒劑包含可離子化脂質，其中該可離子化脂質為 。
  103. 如請求項98至102中任一項之醫藥組合物，其中脂質奈米粒子轉移媒劑進一步包含選自輔助脂質、結構性脂質及經PEG改質之脂質的至少一種脂質。
  104. 一種治療癌症之方法，其包含向有需要之人類個體投與如請求項98至103中任一項之醫藥組合物。
  105. 一種治療自體免疫疾病之方法，其包含向有需要之人類個體投與如請求項98至103中任一項之醫藥組合物。
  106. 一種包含環狀RNA構築體之組合物用於治療癌症的用途，其包含向有需要之人類個體投與如請求項98至103中任一項之醫藥組合物。
  107. 一種包含環狀RNA構築體之組合物用於治療自體免疫疾病的用途，其包含向有需要之人類個體投與如請求項98至103中任一項之醫藥組合物。
  108. 如請求項77或請求項104或105之方法或如請求項106或107之用途，其中該投與每天、每隔一天、一週兩次、每週、每十天、每兩週、每三週、每四週、一月一次、每六週、每八週、每三個月、每四個月、每六個月、每八個月、每九個月或每年進行。
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