JP2023525270A - 環状ｒｎａ組成物及び方法 - Google Patents

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Abstract

環状ＲＮＡ及び輸送ビヒクルを、関連する組成物及び処置方法と共に本明細書に開示する。環状ＲＮＡは、グループＩイントロンフラグメント、スペーサー、ＩＲＥＳ、二重鎖形成領域、及び／または発現配列を含むことができ、それにより、直鎖ＲＮＡと比較して、発現、機能的安定性、低免疫原性、製造容易性、及び／または半減期延長が改善されているという特徴を有する。そのような環状ＲＮＡと輸送ビヒクルとを含む医薬組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫細胞における効率的なタンパク質発現に特に好適である。また、前駆体または環状ＲＮＡを生産するのに有用な前駆体ＲＮＡ及び物質であって、環状化効率が改善されている、及び／または環状ＲＮＡの有効な精製方法に適合する前駆体ＲＮＡ及び物質も開示する。【選択図】図６３Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月８日に出願された米国仮出願第６３／０２２，２４８号、２０２０年１０月５日に出願された米国仮出願第６３／０８７，５８２号、及び２０２０年１２月４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６３４９４号の利益及び優先権を主張し、これらの各々の内容は、それらの全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
背景
従来の遺伝子治療は、宿主細胞に所望の遺伝子情報を挿入するためのＤＮＡの使用を伴う。細胞へと導入されたＤＮＡは通常、１つ以上のトランスフェクトされた細胞のゲノムへとある程度組み込まれ、宿主内での導入された遺伝物質の長期的な作用を可能にする。そのような持続的な作用には実質的な利点があり得るが、一方で、外因性ＤＮＡの宿主ゲノムへの組み込みには、多くの有害な作用もあり得る。例えば、導入されたＤＮＡがインタクトな遺伝子へと挿入されて、内在性遺伝子の機能を妨げる、または完全に消失さえさせる突然変異をもたらす可能性がある。したがって、ＤＮＡを用いた遺伝子治療は、処置された宿主において、致命的な遺伝子機能の障害、例えば、必須酵素の産生の除去もしくは有害な低下、または細胞増殖の調節に決定的に重要な遺伝子の妨害をもたらして、無秩序な、またはがん性の細胞増殖をもたらし得る。さらに、従来のＤＮＡベースの遺伝子治療の場合、所望の遺伝子産物の有効な発現のためには強力なプロモーター配列を含める必要があり、これもやはり、細胞内の正常な遺伝子発現の調節の望ましくない変化をもたらし得る。また、ＤＮＡベースの遺伝物質が望ましくない抗ＤＮＡ抗体の誘導をもたらし、それが致命的となり得る免疫応答を誘発する場合がある。ウイルスベクターを使用する遺伝子治療法もまた、有害な免疫応答をもたらし得る。状況によっては、ウイルスベクターが宿主ゲノムに組み込まれる場合さえある。さらに、臨床グレードのウイルスベクターの生産は、費用も時間もかかる。ウイルスベクターを使用した導入遺伝物質の標的指向性送達もまた、制御が困難であり得る。したがって、ＤＮＡベースの遺伝子治療は、ウイルスベクターを使用する分泌タンパク質の送達に関して評価されてきたが（米国特許第６，０６６，６２６号；ＵＳ２００４／０１１０７０９）、これらの手法は、これらの様々な理由で制限され得る。
ＤＮＡとは対照的に、ＲＮＡでは、トランスフェクトされた細胞のゲノムに安定的に組み込まれるというリスクを伴わないため、遺伝子治療剤としてのＲＮＡの使用は実質的により安全であり、それ故、導入遺伝物質が必須遺伝子の正常な機能を妨害する、または有害もしくは発がん性の作用をもたらす突然変異を引き起こすという懸念が排除され、コードされたタンパク質の有効な翻訳のために外来性プロモーター配列は必要とされず、やはり、可能性のある有害な副作用が回避される。さらに、ｍＲＮＡは、その機能を実行するために核に入る必要はないが、ＤＮＡはこの大きな障害を克服しなければならない。
環状ＲＮＡは、ＲＮＡの安定形態の設計及び産生に役立つ。ＲＮＡ分子の環状化は、不活性なコンフォメーションで折り畳まれやすい分子の場合に特に、ＲＮＡの構造及び機能の研究に利点を提供する（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｒｕｆｆｎｅｒ，１９９８）。環状ＲＮＡはまた、特に、タンパク質補充療法及びワクチン接種を含む、遺伝子発現及び治療剤のＲＮＡベースの制御の研究分野において、特に興味深く、またｉｎ ｖｉｖｏ用途に有用であり得る。
本発明に先立ち、ｉｎ ｖｉｔｒｏで環状化ＲＮＡを作製するための３つの主要な技術、すなわち、スプリントを介した方法、順列置換イントロン－エクソン法、及びＲＮＡリガーゼを介した方法があった。しかしながら、既存の方法は、環状化され得るＲＮＡのサイズによって制限されるため、その治療用途が制限される。
概要
本出願は、環状ＲＮＡ及び輸送ビヒクルと共に、関連する組成物及び処置の方法を提供する。輸送ビヒクルは、例えば、イオン化可能脂質、ＰＥＧ修飾脂質、及び／または構造脂質を含み、それにより環状ＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子を形成し得る。環状ＲＮＡは、グループＩイントロンフラグメント、スペーサー、ＩＲＥＳ、二重鎖形成領域、及び／または発現配列を含み、それにより直鎖ＲＮＡと比較して改善された発現、機能安定性、低免疫原性、製造容易性、及び／または半減期延長という特徴を有し得る。そのような環状ＲＮＡ及び輸送ビヒクルを含む医薬組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫細胞における効率的なタンパク質発現に特に好適である。本出願はまた、改善された環状化効率を有し、及び／または有効な環状ＲＮＡ精製方法と適合性のある前駆体ＲＮＡ及び前駆体または環状ＲＮＡを産生するのに有用な物質を提供する。
したがって、本出願の一態様は、環状ＲＮＡポリヌクレオチドと、式（１）によって表されるイオン化可能脂質を含む輸送ビヒクルと、を含む医薬組成物を提供する：
Figure 2023525270000002
［式中、
各ｎは、独立して、２～１５の整数であり；
Ｌ１及びＬ３は、それぞれ独立して、－ＯＣ（Ｏ）－＊または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－＊であり、「＊」は、Ｒ１またはＲ３に対する結合点を示し；
Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立して、直鎖または分岐のＣ９－Ｃ２０アルキルまたはＣ９－Ｃ２０アルケニルであり、任意選択で、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルケニル、アルデヒド、ヘテロシクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、ジヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルアミノアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、（ヘテロシクリル）（アルキル）アミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、アルキニル、アルコキシ、アミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルカルボニルアミノ、アミノカルボニルアルキルアミノ、（アミノカルボニルアルキル）（アルキル）アミノ、アルケニルカルボニルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ヘテロシクリルアルキルアミノカルボニル、（アルキルアミノアルキル）（アルキル）アミノカルボニル、アルキルアミノアルキルカルボニル、ジアルキルアミノアルキルカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アルキルスルホキシド、アルキルスルホキシドアルキル、アルキルスルホニル、及びアルキルスルホンアルキルからなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換され；かつ
Ｒ２は、
Figure 2023525270000003
からなる群から選択される］。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、輸送ビヒクルに封入されている。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、輸送ビヒクルに少なくとも８０％の封入効率で封入されている。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、直径が約５６ｎｍ以上である。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、直径が約５６ｎｍ～約１５７ｎｍである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立して、
Figure 2023525270000004
からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１とＲ３は同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ１とＲ３は異なる。
いくつかの実施形態では、式（１）のイオン化可能脂質は、式（１－１）または式（１－２）：
Figure 2023525270000005
Figure 2023525270000006
で表される。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、
Figure 2023525270000007
Figure 2023525270000008
からなる群から選択される。
別の態様では、本出願は、環状ＲＮＡポリヌクレオチドと、式（２）で表されるイオン化可能脂質を含む輸送ビヒクルと、を含む医薬組成物を提供する：
Figure 2023525270000009
［式中、
各ｎは、独立して、１～１５の整数であり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、
Figure 2023525270000010
Figure 2023525270000011
からなる群から選択され；かつ
Ｒ３は、
Figure 2023525270000012
からなる群から選択される］。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、
Figure 2023525270000013
からなる群から選択される。
別の態様では、本出願は、環状ＲＮＡポリヌクレオチドと、式（３）で表されるイオン化可能脂質を含む輸送ビヒクルと、を含む医薬組成物を提供する：
Figure 2023525270000014
［式中、
Ｘは、－Ｏ－、－Ｓ－、または－ＯＣ（Ｏ）－＊から選択され、＊は、Ｒ１に対する結合点を示し；
Ｒ１は、
Figure 2023525270000015
からなる群から選択され；かつ
Ｒ２は、
Figure 2023525270000016
からなる群から選択される］。
いくつかの実施形態では、式（３）のイオン化可能脂質は、式（３－１）、式（３－２）、または式（３－３）
Figure 2023525270000017
Figure 2023525270000018
Figure 2023525270000019
で表される。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、
Figure 2023525270000020
からなる群から選択される。
別の態様では、本出願は、環状ＲＮＡポリヌクレオチドと、式（４）で表されるイオン化可能脂質を含む輸送ビヒクルと、を含む医薬組成物を提供する：
Figure 2023525270000021
［式中、各ｎは、独立して、２～１５の整数であり；Ｒ２は、式（１）において定義されている］。
別の態様では、本出願は、環状ＲＮＡポリヌクレオチドと、式（６）で表されるイオン化可能脂質を含む輸送ビヒクルと、を含む医薬組成物を提供する：
Figure 2023525270000022
［式中、
各ｎは、独立して、０～１５の整数であり；
Ｌ１及びＬ３は、それぞれ独立して、－ＯＣ（Ｏ）－＊または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－＊であり、「＊」は、Ｒ１またはＲ３に対する結合点を示し；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、直鎖または分岐のＣ９－Ｃ２０アルキルまたはＣ９－Ｃ２０アルケニルであり、任意選択で、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルケニル、アルデヒド、ヘテロシクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、ジヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルアミノアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、（ヘテロシクリル）（アルキル）アミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、アルキニル、アルコキシ、アミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルカルボニルアミノ、アミノカルボニルアルキルアミノ、（アミノカルボニルアルキル）（アルキル）アミノ、アルケニルカルボニルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ヘテロシクリルアルキルアミノカルボニル、（アルキルアミノアルキル）（アルキル）アミノカルボニル、アルキルアミノアルキルカルボニル、ジアルキルアミノアルキルカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アルキルスルホキシド、アルキルスルホキシドアルキル、アルキルスルホニル、及びアルキルスルホンアルキルからなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換され；
Ｒ３は、
Figure 2023525270000023
からなる群から選択され；かつ
Ｒ４は、直鎖または分岐したＣ１－Ｃ１５アルキルまたはＣ１－Ｃ１５アルケニルである］。
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、
Figure 2023525270000024
Figure 2023525270000025
からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１とＲ２は同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ１とＲ２は異なる。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、
Figure 2023525270000026
からなる群から選択される。
別の態様では、本出願は、環状ＲＮＡポリヌクレオチドと、表１０ａから選択されるイオン化可能脂質を含む輸送ビヒクルと、を含む医薬組成物を提供する。
本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、輸送ビヒクルに封入されている。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、輸送ビヒクルに少なくとも８０％の封入効率で封入されている。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、第１の発現配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の発現配列は、治療用タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列は、サイトカインまたはその機能的フラグメントをコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列は、転写因子をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列は、免疫チェックポイント阻害剤をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列は、キメラ抗原受容体をコードする。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドはさらに、第２の発現配列を含む。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドはさらに、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。
いくつかの実施形態では、第１及び第２の発現配列は、リボソームスキッピングエレメント、またはプロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列によって区切られている。いくつかの実施形態では、第１の発現配列は、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖をコードし、第２の発現配列は、第２のＴＣＲ鎖をコードする。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、１つ以上のマイクロＲＮＡ結合部位を含む。マイクロＲＮＡ結合部位は、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡによって認識される。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２２によって認識される。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、参照ヒト細胞よりもヒト免疫細胞において多いタンパク質発現に関連する第１のＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態では、ヒト免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、または好中球である。いくつかの実施形態では、参照ヒト細胞は、肝細胞である。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、ａ）３’グループＩイントロンフラグメントのスプライシング後イントロンフラグメント、ｂ）ＩＲＥＳ、ｃ）発現配列、及びｄ）５’グループＩイントロンフラグメントのスプライシング後イントロンフラグメントを、この順序で含む。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、含む。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、３’グループＩイントロンフラグメントのスプライシング後イントロンフラグメントの前に第１のスペーサーを、また５’グループＩイントロンフラグメントのスプライシング後イントロンフラグメントの後に第２のスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のスペーサーはそれぞれ、長さが約１０～約６０ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、３’グループＩイントロンフラグメント、ＩＲＥＳ、発現配列、及び５’グループＩイントロンフラグメント、をこの順序で含むＲＮＡポリヌクレオチドの環状化により作製される。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、５’外部二重鎖形成領域、３’グループＩイントロンフラグメント、５’内部二重鎖形成領域を任意選択で含む５’内部スペーサー、ＩＲＥＳ、発現配列、３’内部二重鎖形成領域を任意選択で含む３’内部スペーサー、５’グループＩイントロンフラグメント、及び３’外部二重鎖形成領域、をこの順序で含むＲＮＡポリヌクレオチドの環状化により作製される。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、５’外部二重鎖形成領域、５’外部スペーサー、３’グループＩイントロンフラグメント、５’内部二重鎖形成領域を任意選択で含む５’内部スペーサー、ＩＲＥＳ、発現配列、３’内部二重鎖形成領域を任意選択で含む３’内部スペーサー、５’グループＩイントロンフラグメント、３’外部スペーサー、及び３’外部二重鎖形成領域、をこの順序で含むＲＮＡポリヌクレオチドの環状化により作製される。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、３’グループＩイントロンフラグメント、５’内部二重鎖形成領域を含む５’内部スペーサー、ＩＲＥＳ、発現配列、３’内部二重鎖形成領域を含む３’内部スペーサー、及び５’グループＩイントロンフラグメント、をこの順序で含むＲＮＡポリヌクレオチドの環状化により作製される。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、５’外部二重鎖形成領域、５’外部スペーサー、３’グループＩイントロンフラグメント、５’内部二重鎖形成領域を含む５’内部スペーサー、ＩＲＥＳ、発現配列、３’内部二重鎖形成領域を含む３’内部スペーサー、５’グループＩイントロンフラグメント、３’外部スペーサー、及び３’外部二重鎖形成領域、をこの順序で含むＲＮＡポリヌクレオチドの環状化により作製される。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、第１のポリＡ配列、５’外部二重鎖形成領域、５’外部スペーサー、３’グループＩイントロンフラグメント、５’内部二重鎖形成領域を含む５’内部スペーサー、ＩＲＥＳ、発現配列、３’内部二重鎖形成領域を含む３’内部スペーサー、５’グループＩイントロンフラグメント、３’外部スペーサー、３’外部二重鎖形成領域、及び第２のポリＡ配列、をこの順序で含むＲＮＡポリヌクレオチドの環状化により作製される。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、第１のポリＡ配列、５’外部スペーサー、３’グループＩイントロンフラグメント、５’内部二重鎖形成領域を含む５’内部スペーサー、ＩＲＥＳ、発現配列、３’内部二重鎖形成領域を含む３’内部スペーサー、５’グループＩイントロンフラグメント、３’外部スペーサー、及び第２のポリＡ配列、をこの順序で含むＲＮＡポリヌクレオチドの環状化により作製される。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、第１のポリＡ配列、５’外部スペーサー、３’グループＩイントロンフラグメント、５’内部二重鎖形成領域を含む５’内部スペーサー、ＩＲＥＳ、発現配列、終止コドン、３’内部二重鎖形成領域を含む３’内部スペーサー、５’グループＩイントロンフラグメント、３’外部スペーサー、及び第２のポリＡ配列、をこの順序で含むＲＮＡポリヌクレオチドの環状化により作製される。
いくつかの実施形態では、３’または５’の内部スペーサーもしくは外部スペーサーのうちの少なくとも１つは、長さが約８～約６０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、３’及び５’の外部二重鎖形成領域はそれぞれ、長さが約１０～５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、３’及び５’の内部二重鎖形成領域はそれぞれ、長さが約６～３０ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、表１７から選択されるか、またはその機能的フラグメントもしくはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、タウラ症候群ウイルス、トリアトーマウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、シミアンウイルス４０、ヒアリウイルス１、ムギクビレアブラムシウイルス、細網内皮症ウイルス、ヒトポリオウイルス１、チャバネアオカメムシ腸ウイルス、カシミールハチウイルス、ヒトライノウイルス２、ホマロディスカ・コアグラタウイルス－１、ヒト免疫不全ウイルス１型、ホマロディスカ・コアグラタウイルス－１、ヒメトビＰウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ＧＢ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒトエンテロウイルス７１、ウマ鼻炎ウイルス、ウスジロエダシャクピコルナ様ウイルス、脳心筋炎ウイルス、ショウジョウバエＣウイルス、ヒトコクサッキーウイルスＢ３、アブラナ科トバモウイルス、コオロギ麻痺ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス１、黒色女王蜂児ウイルス、アブラムシ致死麻痺ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、急性ミツバチ麻痺ウイルス、ハイビスカス退緑輪点ウイルス、古典的ブタ熱ウイルス、ヒトＦＧＦ２、ヒトＳＦＴＰＡ１、ヒトＡＭＬ１／ＲＵＮＸ１、ショウジョウバエアンテナペディア、ヒトＡＱＰ４、ヒトＡＴ１Ｒ、ヒトＢＡＧ－１、ヒトＢＣＬ２、ヒトＢｉＰ、ヒトｃ－ＩＡＰｌ、ヒトｃ－ｍｙｃ、ヒトｅＩＦ４Ｇ、マウスＮＤＳＴ４Ｌ、ヒトＬＥＦ１、マウスＨＩＦ１アルファ、ヒトｎ．ｍｙｃ、マウスＧｔｘ、ヒトｐ２７ｋｉｐｌ、ヒトＰＤＧＦ２／ｃ－ｓｉｓ、ヒトｐ５３、ヒトＰｉｍ－１、マウスＲｂｍ３、ショウジョウバエ リーパー、イヌ スキャンパー、ショウジョウバエＵｂｘ、ヒトＵＮＲ、マウスＵｔｒＡ、ヒトＶＥＧＦ－Ａ、ヒトＸＩＡＰ、ショウジョウバエ ヘアレス、出芽酵母ＴＦＩＩＤ、出芽酵母ＹＡＰ１、タバコエッチウイルス、カブクリンクルウイルス、ＥＭＣＶ－Ａ、ＥＭＣＶ－Ｂ、ＥＭＣＶ－Ｂｆ、ＥＭＣＶ－Ｃｆ、ＥＭＣＶ ｐＥＣ９、ピコビルナウイルス、ＨＣＶ ＱＣ６４、ヒトコサウイルス Ｅ／Ｄ、ヒトコサウイルスＦ、ヒトコサウイルスＪＭＹ、ライノウイルスＮＡＴ００１、ＨＲＶ１４、ＨＲＶ８９、ＨＲＶＣ－０２、ＨＲＶ－Ａ２１、サリウイルスＡ ＳＨ１、サリウイルスＦＨＢ、サリウイルスＮＧ－Ｊ１、ヒトパレコウイルス１、クロヒウイルスＢ、Ｙｃ－３、ロザウイルスＭ－７、シャンバウイルスＡ、パシウイルスＡ、パシウイルスＡ ２、エコーウイルスＥ１４、ヒトパレコウイルス５、アイチウイルス、Ａ型肝炎ウイルスＨＡ１６、フォピウイルス、ＣＶＡ１０、エンテロウイルスＣ、エンテロウイルスＤ、エンテロウイルスＪ、ヒトペギウイルス２、ＧＢＶ－Ｃ ＧＴ１１０、ＧＢＶ－Ｃ Ｋ１７３７、ＧＢＶ－Ｃ Ｉｏｗａ、ペギウイルスＡ １２２０、パシウイルスＡ ３、サペロウイルス、ロザウイルスＢ、バクンサ（Ｂａｋｕｎｓａ）ウイルス、トレモウイルスＡ、ブタパシウイルス１、ＰＬＶ－ＣＨＮ、パシウイルスＡ、シシニウイルス、ヘパシウイルスＫ、ヘパシウイルスＡ、ＢＶＤＶ１、ボーダー病ウイルス、ＢＶＤＶ２、ＣＳＦＶ－ＰＫ１５Ｃ、ＳＦ５７３ジシストロウイルス、湖北ピコルナ様ウイルス、ＣＲＰＶ、セスジネズミ（Ａｐｏｄｅｍｕｓ Ａｇｒａｒｉｕｓ）ピコルナウイルス、ヤギコブウイルス、パラボウイルス、サリウイルスＡ ＢＮ５、サリウイルスＡ ＢＮ２、サリウイルスＡ ０２３９４、サリウイルスＡ ＧＵＴ、サリウイルスＡ ＣＨ、サリウイルスＡ ＳＺ１、サリウイルスＦＨＢ、ＣＶＢ３、ＣＶＢ１、エコーウイルス７、ＣＶＢ５、ＥＶＡ７１、ＣＶＡ３、ＣＶＡ１２、ＥＶ２４、またはｅＩＦ４Ｇに対するアプタマーからのＩＲＥＳの配列を有する。
いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリＡ配列はそれぞれ、長さが約１５～５０ｎｔである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリＡ配列はそれぞれ、長さが約２０～２５ｎｔである。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の天然に存在するヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドからなる。
いくつかの実施形態では、発現配列は、コドンが最適化されている。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、最適化される前の同等のポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠くよう最適化されている。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、環状ＲＮＡポリヌクレオチドが発現される細胞中に存在する、マイクロＲＮＡへの結合能のある少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠くよう最適化されている。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、最適化される前の同等のポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ感受性部位を欠くよう最適化されている。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼが発現される細胞中に存在する、エンドヌクレアーゼによって切断されることのできる少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ感受性部位を欠くよう最適化されている。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、最適化される前の同等のポリヌクレオチド中に存在する、少なくとも１つのＲＮＡ編集感受性部位を欠くよう最適化されている。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、長さが約１００ｎｔ～約１０，０００ｎｔである。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、長さが約１００ｎｔ～約１５，０００ｎｔである。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、かかる環状ＲＮＡポリヌクレオチドと同じ発現配列を有する参照直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドよりもコンパクトである。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ヒト細胞での治療効果の持続期間が、環状ＲＮＡポリヌクレオチドと同じ発現配列を有する参照直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物と同程度であるかまたはそれ以上である。いくつかの実施形態では、参照直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、未修飾であるかまたはヌクレオシド修飾されている完全にプロセシングされた直鎖ｍＲＮＡであり、ｃａｐ１構造及び少なくとも８０ｎｔ長のポリＡテールを含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの治療効果の持続期間が、環状ＲＮＡポリヌクレオチドと同じ発現配列を有する参照直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物を超える。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの治療効果の持続期間が少なくとも約１０時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約８０時間、少なくとも約９０時間、または少なくとも約１００時間である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ヒト細胞での機能的半減期が、既定の閾値と同程度であるかまたはそれ以上である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの機能的半減期が、既定の閾値を超える。いくつかの実施形態では、機能的半減期は、機能性タンパク質アッセイによって決定される。いくつかの実施形態では、機能性タンパク質アッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏルシフェラーゼアッセイである。いくつかの実施形態では、機能性タンパク質アッセイは、患者の血清または組織試料における環状ＲＮＡポリヌクレオチドの発現配列によってコードされるタンパク質のレベルを測定することを含む。いくつかの実施形態では、既定の閾値は、環状ＲＮＡポリヌクレオチドと同じ発現配列を含む参照直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの機能的半減期である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、機能的半減期が少なくとも約２０時間である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、構造脂質及びＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、構造脂質は、Ｃ１ｑに結合する、及び／または構造脂質を欠く対照輸送ビヒクルと比較して前記脂質を含む輸送ビヒクルのＣ１ｑへの結合を促進する、及び／または構造脂質を欠く対照輸送ビヒクルと比較してＣ１ｑが結合した輸送ビヒクルの免疫細胞への取り込みを増加させる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、または好中球である。
いくつかの実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、構造脂質は、ベータ－シトステロールである。いくつかの実施形態では、構造脂質は、ベータ－シトステロールではない。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＭＧ－ＰＥＧ、またはＰＥＧ－１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物はさらに、ヘルパー脂質を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、ＤＳＰＣまたはＤＯＰＥである。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧを含む。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、モル比で約０．５％～約４％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、モル比で約１％～約２％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、
ａ．
Figure 2023525270000027
またはその混合物から選択されるイオン化可能脂質、
ｂ．ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣから選択されるヘルパー脂質、
ｃ．コレステロール、及び
ｄ．ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）またはＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）
から選択されるＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、
ａ．
Figure 2023525270000028
またはその混合物から選択されるイオン化可能脂質、
ｂ．ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣから選択されるヘルパー脂質、
ｃ．コレステロール、及び
ｄ．ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）またはＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）
から選択されるＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、
ａ．
Figure 2023525270000029
またはその混合物から選択されるイオン化可能脂質、
ｂ．ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣから選択されるヘルパー脂質、
ｃ．コレステロール、及び
ｄ．ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）であるＰＥＧ脂質
を含む。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、
ａ．
Figure 2023525270000030
またはその混合物から選択されるイオン化可能脂質、
ｂ．ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣから選択されるヘルパー脂質、
ｃ．コレステロール、及び
ｄ．ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）、ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）、またはＣ１４－ＰＥＧ（２０００）
から選択されるＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、
ａ．
Figure 2023525270000031
Figure 2023525270000032
またはその混合物から選択されるイオン化可能脂質、
ｂ．ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣから選択されるヘルパー脂質、
ｃ．コレステロール、及び
ｄ．ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）であるＰＥＧ脂質
を含む。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、
ａ．
Figure 2023525270000033
またはその混合物から選択されるイオン化可能脂質、
ｂ．ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣから選択されるヘルパー脂質、
ｃ．コレステロール、及び
ｄ．ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）またはＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）
から選択されるＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、
ａ．
Figure 2023525270000034
Figure 2023525270000035
またはその混合物から選択されるイオン化可能脂質、
ｂ．ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣから選択されるヘルパー脂質、
ｃ．コレステロール、及び
ｄ．ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）、ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）、またはＣ１４－ＰＥＧ（２０００）
から選択されるＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質：ヘルパー脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質のモル比は、６２：４：３３：１である。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質：ヘルパー脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質のモル比は、５０：１０：３８．５：１．５である。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質：ヘルパー脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質のモル比は、３５：１６：４６．２．５である。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質：ヘルパー脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質のモル比は、４０：１０：４０：１０である。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、ヘルパー脂質のＤＯＰＥ及びＰＥＧ脂質のＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）を含み、イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）のモル比は、６２：４：３３：１である。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、ヘルパー脂質のＤＯＰＥ及びＰＥＧ脂質のＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）を含み、イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）のモル比は、５０：１０：３８．５：１．５である。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、ヘルパー脂質のＤＯＰＥ及びＰＥＧ脂質のＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）を含み、イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）のモル比は、６２：４：３３：１である。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、ヘルパー脂質のＤＯＰＥ及びＰＥＧ脂質のＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）を含み、イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）のモル比は、５０：１０：３８．５：１．５である。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、ヘルパー脂質のＤＳＰＣ及びＰＥＧ脂質のＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）を含み、イオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）のモル比は、６２：４：３３：１である。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、ヘルパー脂質のＤＳＰＣ及びＰＥＧ脂質のＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）を含み、イオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）のモル比は、５０：１０：３８．５：１．５である。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、ヘルパー脂質のＤＳＰＣ及びＰＥＧ脂質のＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）を含み、イオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）のモル比は、６２：４：３３：１である。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、ヘルパー脂質のＤＳＰＣ及びＰＥＧ脂質のＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）を含み、イオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）のモル比は、５０：１０：３８．５：１．５である。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、ヘルパー脂質のＤＯＰＥを含み、ＰＥＧ脂質はＣ１４－ＰＥＧ（２０００）であり、イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：Ｃ１４－ＰＥＧ（２０００）のモル比は、３５：１６：４６．５：２．５である。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、ヘルパー脂質のＤＳＰＣを含み、ＰＥＧ脂質はＣ１４－ＰＥＧ（２０００）であり、イオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：Ｃ１４－ＰＥＧ（２０００）のモル比は、３５：１６：４６．５：２．５である。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、ヘルパー脂質のＤＯＰＥ及びＰＥＧ脂質のＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）を含み、イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）のモル比は、４０：１０：４０：１０である。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、ヘルパー脂質のＤＳＰＣ及びＰＥＧ脂質のＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）を含み、イオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）のモル比は、４０：１０：４０：１０である。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、脂質の窒素－対－リン酸（Ｎ：Ｐ）が約３～約６である。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは脂質の窒素－対－リン酸（Ｎ：Ｐ）比が約４、約４．５、約５、または約５．５である。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、環状ＲＮＡポリヌクレオチドのエンドソーム放出のために配合されている。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、ＡＰＯＥへの結合能がある。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、環状ＲＮＡポリヌクレオチドと同じ発現配列を有する参照直鎖ＲＮＡが搭載された同等の輸送ビヒクルほど、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）と相互作用しない。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルの外面は、ＡＰＯＥ結合部位を実質的に含まない。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、直径が約１２０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、直径が３００ｎｍを超える凝集体を形成しない。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が約３０時間未満である。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、低比重リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）依存的に細胞に取り込まれることができる。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、ＬＤＬＲ非依存的に細胞に取り込まれることができる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、直鎖ＲＮＡを実質的に含まない。
いくつかの実施形態では、医薬組成物はさらに、輸送ビヒクルに機能的に接続された標的指向性部分を含む。いくつかの実施形態では、標的指向性部分は、免疫細胞抗原と特異的に結合するかまたは間接的に結合する。いくつかの実施形態では、免疫細胞抗原は、Ｔ細胞抗原である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ４、ベータ７インテグリン、ベータ２インテグリン、及びＣ１ｑからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物はさらに、輸送ビヒクル結合部分と細胞結合部分とを含むアダプター分子を含み、標的指向性部分は輸送ビヒクル結合部分に特異的に結合し、細胞結合部分は標的細胞抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的細胞抗原は、免疫細胞抗原である。いくつかの実施形態では、免疫細胞抗原は、Ｔ細胞抗原、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、または好中球である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ４、ベータ７インテグリン、ベータ２インテグリン、ＣＤ２５、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ａ２ａ受容体、Ａ２ｂ受容体、及びＣ１ｑからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞抗原は、マクロファージ抗原である。いくつかの実施形態では、マクロファージ抗原は、マンノース受容体、ＣＤ２０６、及びＣ１ｑからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、標的指向性部分は、小分子である。いくつかの実施形態では、小分子は、免疫細胞上のエクト酵素に結合し、エクト酵素は、ＣＤ３８、ＣＤ７３、アデノシン２ａ受容体、及びアデノシン２ｂ受容体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、小分子は、マンノース、レクチン、アシビシン、ビオチン、またはジゴキシゲニンである。
いくつかの実施形態では、標的指向性部分は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、ナノボディ、ペプチド、ペプチドベースのマクロ環、ミニボディ、小分子リガンド、例えば、葉酸塩、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）、もしくはフェノール可溶性モジュリンアルファ１ペプチド（ＰＳＭＡ１）等、重鎖可変領域、軽鎖可変領域またはそのフラグメントである。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、細胞膜での半減期が約２週間未満である。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、細胞膜での半減期が約１週間未満である。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、細胞膜での半減期が約３０時間未満である。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、細胞膜での半減期が、環状ＲＮＡポリヌクレオチドの機能的半減期に満たない。
別の態様では、本出願は、疾患、障害、または状態を処置または予防する方法を提供し、有効量の本明細書に開示される医薬組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、疾患、障害、または状態は、表２７または表２８から選択されるポリペプチドの異常な発現、活性、または局在化と関連する。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、治療用タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、脾臓での治療用タンパク質発現は、肝臓での治療用タンパク質発現よりも高い。いくつかの実施形態では、脾臓での治療用タンパク質発現は、肝臓での治療用タンパク質発現の少なくとも約２．９倍である。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、肝臓では機能的レベルで発現しない。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、肝臓では検出可能レベルで発現しない。いくつかの実施形態では、脾臓での治療用タンパク質発現は、総治療用タンパク質発現の少なくとも約５０％である。いくつかの実施形態では、脾臓での治療用タンパク質発現は、総治療用タンパク質発現の少なくとも約６３％である。
別の態様では、本出願は、５’から３’方向へ、３’グループＩイントロンフラグメント、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現配列、及び５’グループＩイントロンフラグメントを含み、３’グループＩイントロンフラグメントに対して５’に第１のスペーサーを及び／または５’グループＩイントロンフラグメントに対して３’に第２のスペーサーをさらに含む、直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態では、直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、３’グループＩイントロンフラグメントに対して５’に第１のスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、第１のスペーサーは、長さが１０～５０ヌクレオチドであり、任意選択で１０～２０ヌクレオチド、さらに任意選択で約１５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第１のスペーサーは、ポリＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、５’グループＩイントロンフラグメントに対して３’に第２のスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、第２のスペーサーは、長さが１０～５０ヌクレオチドであり、任意選択で１０～２０ヌクレオチド、さらに任意選択で約１５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第２のスペーサーは、ポリＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドはさらに、３’グループＩイントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間に第３のスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、第３のスペーサーは、長さが約１０～約６０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドはさらに、二重鎖を形成することのできる第１及び第２の二重鎖形成領域を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の二重鎖形成領域はそれぞれ、長さが約９～１９ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第１及び第２の二重鎖形成領域はそれぞれ、長さが約３０ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、参照直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドと比較して発現、環状化効率、機能的安定性、及び／または安定性が増強され、参照直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’方向へ、第１のポリＡ配列、５’外部スペーサー、３’グループＩイントロンフラグメント、５’内部二重鎖形成領域を含む５’内部スペーサー、ＩＲＥＳ、発現配列、終止コドン、３’内部二重鎖形成領域を含む３’内部スペーサー、５’グループＩイントロンフラグメント、３’外部スペーサー、及び第２のポリＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、参照直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドと比較して発現、環状化効率、機能的安定性、及び／または安定性が増強され、参照直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、５’から３’方向へ、参照３’グループＩイントロンフラグメント、参照ＩＲＥＳ、参照発現配列、及び参照５’グループＩイントロンフラグメントを含み、３’グループＩイントロンフラグメントに対して５’にスペーサーをまたは５’グループＩイントロンフラグメントに対して３’にスペーサーを含まない。いくつかの実施形態では、発現配列及び参照発現配列は同じ配列を有する。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳ及び参照ＩＲＥＳは同じ配列を有する。
いくつかの実施形態では、直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、３’アナベナグループＩイントロンフラグメント及び５’アナベナグループＩイントロンフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、参照ＲＮＡポリヌクレオチドは、参照３’アナベナグループＩイントロンフラグメント及び参照５’アナベナグループＩイントロンフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、参照３’アナベナグループＩイントロンフラグメント及び参照５’アナベナグループＩイントロンフラグメントは、Ｌ６－５順列置換部位を使用して作製された。いくつかの実施形態では、３’アナベナグループＩイントロンフラグメント及び５’アナベナグループＩイントロンフラグメントは、Ｌ６－５順列置換部位を使用して作製されなかった。いくつかの実施形態では、３’アナベナグループＩイントロンフラグメントは、配列番号１１２～１２３及び１２５～１５０から選択される配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、５’アナベナグループＩイントロンフラグメントは、配列番号７３～８４及び８６～１１１から選択される対応配列を含む。いくつかの実施形態では、５’アナベナグループＩイントロンフラグメントは、配列番号７３～８４及び８６～１１１から選択される配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、３’アナベナグループＩイントロンフラグメントは、配列番号１１２～１２４及び１２５～１５０から選択される対応配列を含むかまたはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、配列番号３４８～３５１から選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、参照ＩＲＥＳはＣＶＢ３である。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳはＣＶＢ３ではない。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、配列番号１～６４及び６６～７２から選択される配列を含む。
別の態様では、本出願では、本明細書に開示される直鎖ＲＮＡから生成される環状ＲＮＡポリヌクレオチドを開示する。
別の態様では、本出願では、５’から３’方向へ、３’グループＩイントロンフラグメント、ＩＲＥＳ、発現配列、及び５’グループＩイントロンフラグメントを含む環状ＲＮＡを開示し、ここで、ＩＲＥＳは、配列番号３４８～３５１から選択されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドはさらに、３’グループＩイントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間にスペーサーを含む。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドはさらに、二重鎖を形成することのできる第１及び第２の二重鎖形成領域を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の二重鎖形成領域はそれぞれ、長さが約９～１９ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第１及び第２の二重鎖形成領域はそれぞれ、長さが約３０ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、発現配列は、サイズが少なくとも約１，０００ｎｔ、少なくとも約２，０００ｎｔ、少なくとも約３，０００ｎｔ、少なくとも約４，０００ｎｔ、または少なくとも約５，０００ｎｔである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、天然ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、発現配列は、コドンが最適化されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドはさらに、各リーディングフレームに少なくとも１つの終止コドンを含む翻訳終結カセットを含む。いくつかの実施形態では、翻訳終結カセットは、発現配列のリーディングフレームに少なくとも２つの終止コドンを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、最適化される前の同等のポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠くよう最適化されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、最適化される前の同等のポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ感受性部位を欠くよう最適化されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、最適化される前の同等のポリヌクレオチド中に存在する、少なくとも１つのＲＮＡ編集感受性部位を欠くよう最適化されている。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも２つの発現配列を含む。いくつかの実施形態では、それぞれの発現配列は、異なる治療用タンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、長さが約１００～１５，０００ヌクレオチドであり、任意選択で約１００～１２，０００ヌクレオチド、さらに任意選択で約１００～１０，０００ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、ヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの治療効果の持続期間が少なくとも約２０時間である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、機能的半減期が少なくとも約２０時間である。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、ヒト細胞での治療効果の持続期間が、同じ発現配列を含む同等の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドと同程度であるかまたはそれ以上である。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、ヒト細胞での機能的半減期が、同じ発現配列を含む同等の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドと同程度であるかまたはそれ以上である。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、ヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの治療効果の持続期間が、同じ発現配列を有する同等の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドを超える。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、ヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの機能的半減期が、同じ発現配列を有する同等の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドを超える。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される環状ＲＮＡポリヌクレオチドと、ナノ粒子と、任意選択で、ナノ粒子に機能的に接続された標的指向性部分と、を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、脂質ナノ粒子、コア・シェルナノ粒子、生分解性ナノ粒子、生分解性脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、または生分解性ポリマーナノ粒子である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、標的指向性部分を含み、標的指向性部分は、細胞の分離または精製なしで、選択された細胞集団もしくは組織の細胞に選択的に受容体介在性エンドサイトーシスまたは直接融合を媒介する。いくつかの実施形態では、標的指向性部分は、ｓｃｆｖ、ナノボディ、ペプチド、ミニボディ、ポリヌクレオチドアプタマー、重鎖可変領域、軽鎖可変領域またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、組成物中のポリヌクレオチドの１重量％未満は、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡスプリント、または三リン酸化ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、医薬組成物中のポリヌクレオチド及びタンパク質の１重量％未満は、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡスプリント、三リン酸化ＲＮＡ、ホスファターゼタンパク質、タンパク質リガーゼ、及びキャッピング酵素である。
別の態様では、本開示は、その必要のある対象を処置する方法を提供し、治療的有効量の、本明細書に開示される環状ＲＮＡポリヌクレオチドと、ナノ粒子と、任意選択で、ナノ粒子に機能的に接続された標的指向性部分と、を含む組成物を投与することを含む。
別の態様では、本開示は、その必要のある対象を処置する方法を提供し、治療的有効量の本明細書に開示される医薬組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、標的指向性部分は、ｓｃｆｖ、ナノボディ、ペプチド、ミニボディ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ＴＣＲの細胞外ドメイン、またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、脂質ナノ粒子、コア・シェルナノ粒子、または生分解性ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質、イオン化可能脂質、またはポリβ－アミノエステルを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、１つ以上の非カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質、ポリグルタミン酸脂質、またはヒアルロン酸脂質を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、コレステロールを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、アラキドン酸またはオレイン酸を含む。
いくつかの実施形態では、提供される医薬組成物は、標的指向性部分を含み、標的指向性部分は、細胞の選択または精製なしで、選択された細胞集団の細胞に選択的に受容体介在性エンドサイトーシスを媒介する。
いくつかの実施形態では、提供されるナノ粒子は、２つ以上の環状ＲＮＡポリヌクレオチドを含む。
別の態様では、本出願は、本明細書に開示されるＲＮＡポリヌクレオチドをコードするＤＮＡベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡベクターはさらに転写制御配列を含む。いくつかの実施形態では、転写制御配列は、プロモーター及び／またはエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、Ｔ７プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡベクターは、環状ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡベクターは、直鎖状ＤＮＡを含む。
別の態様では、本出願は、本明細書に開示されるＤＮＡベクターを含む原核細胞を提供する。
別の態様では、本出願は、本明細書に開示される環状ＲＮＡポリヌクレオチドを含む真核細胞を提供する。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。
別の態様では、本出願は、環状ＲＮＡポリヌクレオチドを生産する方法を提供し、かかる方法は、本明細書に開示される直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドを、環状化に好適な条件下でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に開示されるＤＮＡを、転写に好適な条件下でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写される。いくつかの実施形態では、好適な条件は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアニン三リン酸（ＧＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、及びＲＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、好適な条件はさらに、グアニン一リン酸（ＧＭＰ）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＭＰ濃度とＧＴＰ濃度の比は、約３：１～約１５：１、任意選択で約４：１、５：１、または６：１の範囲内である。
別の態様では、本出願は、環状ＲＮＡポリヌクレオチドを生産する方法を提供し、かかる方法は、本明細書に開示される原核細胞を、細胞においてＤＮＡを転写するために好適な条件下で培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、環状ＲＮＡポリヌクレオチドを精製することを含む。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、固体表面にコンジュゲートされた第１または第２のスペーサーとハイブリダイズする親和性オリゴヌクレオチドを使用する、陰性選択によって精製される。いくつかの実施形態では、第１または第２のスペーサーは、ポリＡ配列を含み、親和性オリゴヌクレオチドは、デオキシチミンオリゴヌクレオチドである。
本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、医薬組成物：肝細胞の重量比は、１：５以下である。本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、医薬組成物：脾臓細胞の重量比は、７：１０以下である。
ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び様々なＩＲＥＳ配列を含む環状ＲＮＡを用いたトランスフェクションから２４時間後のＨＥＫ２９３細胞の上清における発光を示す。 ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び様々なＩＲＥＳ配列を含む環状ＲＮＡを用いたトランスフェクションから２４時間後のＨｅｐＧ２細胞の上清における発光を示す。 ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び様々なＩＲＥＳ配列を含む環状ＲＮＡを用いたトランスフェクションから２４時間後の１Ｃ１Ｃ７細胞の上清における発光を示す。 ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び様々なＩＲＥＳ配列を含む環状ＲＮＡを用いたトランスフェクションから２４時間後のＨＥＫ２９３細胞の上清における発光を示す。 ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び様々なＩＲＥＳ配列を含む環状ＲＮＡを用いたトランスフェクションから２４時間後のＨＥＫ２９３細胞の上清における発光を示す。
ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び長さの異なる様々なＩＲＥＳ配列を含む環状ＲＮＡを用いたトランスフェクションから２４時間後のＨＥＫ２９３（Ａ）、ＨｅｐＧ２（Ｂ）、１Ｃ１Ｃ７（Ｃ）細胞の上清における発光を示す。
発光によって測定された、３日間にわたるＨｅｐＧ２（Ａ）または１Ｃ１Ｃ７（Ｂ）細胞における選択されたＩＲＥＳコンストラクトの安定性を示す。
細胞上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光によって測定された、Ｊｕｒｋａｔ細胞における選択されたＩＲＥＳコンストラクトからのタンパク質発現を示す。
発光によって測定された、３日間にわたるＪｕｒｋａｔ細胞における選択されたＩＲＥＳコンストラクトの安定性を示す。
ガウシアルシフェラーゼをコードする修飾線状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡの２４時間発光の比較を示す。 ガウシアルシフェラーゼをコードする修飾線状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡの３日間にわたる相対発光の比較を示す。
修飾線状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたＪｕｒｋａｔ細胞のエレクトロポレーション後の、ＩＦＮγの転写産物誘導を示す。 修飾線状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたＪｕｒｋａｔ細胞のエレクトロポレーション後の、ＩＬ－６の転写産物誘導を示す。 修飾線状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたＪｕｒｋａｔ細胞のエレクトロポレーション後の、ＩＬ－２の転写産物誘導を示す。 修飾線状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたＪｕｒｋａｔ細胞のエレクトロポレーション後の、ＲＩＧ－Ｉの転写産物誘導を示す。 修飾線状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたＪｕｒｋａｔ細胞のエレクトロポレーション後の、ＩＦＮ－β１の転写産物誘導を示す。 修飾線状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたＪｕｒｋａｔ細胞のエレクトロポレーション後の、ＴＮＦαの転写産物誘導を示す。
ヒト初代単球におけるガウシアルシフェラーゼをコードする環状ＲＮＡ及び修飾線状ＲＮＡの発光の比較を示す。 マクロファージにおけるガウシアルシフェラーゼをコードする環状ＲＮＡ及び修飾線状ＲＮＡの発光の比較を示す。 マクロファージにおけるガウシアルシフェラーゼをコードする環状ＲＮＡ及び修飾線状ＲＮＡの発光の比較を示す。
ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び様々なＩＲＥＳ配列を含む環状ＲＮＡを用いた形質導入後の初代Ｔ細胞の上清における３日間にわたる相対発光（Ａ）または２４時間発光（Ｂ）を示す。
ガウシアルシフェラーゼ発現配列を含む環状ＲＮＡまたは修飾線状ＲＮＡを用いた形質導入後の初代Ｔ細胞の上清における２４時間発光を示す。 ガウシアルシフェラーゼ発現配列を含む環状ＲＮＡまたは修飾線状ＲＮＡを用いた形質導入後の初代Ｔ細胞の上清における３日間にわたる相対発光を示す。 ガウシアルシフェラーゼ発現配列を含む環状ＲＮＡまたは修飾線状ＲＮＡを用いた形質導入後の初代Ｔ細胞の上清におけるＰＢＭＣにおける２４時間発光を示す。
異なる順列置換部位を有するＲＮＡコンストラクトのＨＰＬＣクロマトグラム（Ａ）及び環状化効率（Ｂ）を示す。
異なるイントロン及び／または順列置換部位を有するＲＮＡコンストラクトのＨＰＬＣクロマトグラム（Ａ）及び環状化効率（Ｂ）を示す。
相同アームを伴うまたは伴わない３つのＲＮＡコンストラクトのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 相同アームを伴うまたは伴わない３つのＲＮＡコンストラクトの環状化効率を示す。
相同アームを伴わない、または様々な長さ及びＧＣ含量を有する相同アームを伴う３つのＲＮＡコンストラクトの環状化効率を示す。
スプライシング効率の改善に対する強い相同アームの寄与、選択されたコンストラクトにおける環状化効率及びニッキング間の関係、ならびに環状化効率の改善を示すと仮定された順列置換部位及び相同アームの組み合わせを示すＨＰＬＣ ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
モックエレクトロポレーションした（左）またはＣＡＲをコードする環状ＲＮＡでエレクトロポレーション（右）し、ＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼを発現するＲａｊｉ細胞と共培養したＴ細胞の蛍光画像を示す。
モックエレクトロポレーションした（上）またはＣＡＲをコードする環状ＲＮＡでエレクトロポレーション（下）し、ＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼを発現するＲａｊｉ細胞と共培養したＴ細胞の明視野（左）、蛍光（中心）、及びオーバーレイ（右）画像を示す。
モックエレクトロポレーションした、または異なるＣＡＲ配列をコードする環状ＲＮＡでエレクトロポレーションしたＴ細胞によるＲａｊｉ標的細胞の特異的溶解を示す。
ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び様々なＩＲＥＳ配列を含む線状または環状ＲＮＡを用いた形質導入から２４時間後のＪｕｒｋａｔ細胞（左）または休止初代ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞（右）の上清における発光（Ａ）、及び３日間にわたる相対発光（Ｂ）を示す。
修飾線状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のエレクトロポレーション後のＩＦＮ－β１の転写産物誘導を示す。 修飾線状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のエレクトロポレーション後のＲＩＧ－Ｉの転写産物誘導を示す。 修飾線状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のエレクトロポレーション後のＬ－２の転写産物誘導を示す。 修飾線状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のエレクトロポレーション後のＩＬ－６の転写産物誘導を示す。 修飾線状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のエレクトロポレーション後のＩＦＮγの転写産物誘導を示す。 修飾線状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のエレクトロポレーション後のＴＮＦαの転写産物誘導を示す。
ホタル発光の検出によって決定した、ＣＡＲをコードするｃｉｒｃＲＮＡでエレクトロポレーションしたヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞によるＲａｊｉ標的細胞の特異的溶解を示す。 ＣＡＲ配列をコードする異なる量の環状または線状ＲＮＡでエレクトロポレーションした２４時間後のＩＦＮγ転写産物誘導を示す。
ホタルの発光の検出によって決定した、異なるＥ：Ｔ比（Ａ及びＢ）にてＣＡＲをコードする環状または線状ＲＮＡでエレクトロポレーションしたヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞による標的細胞または非標的細胞の特異的溶解を示す。
エレクトロポレーションの１、３、５、及び７日後での、ＣＡＲをコードするＲＮＡでエレクトロポレーションしたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞による標的細胞の特異的溶解を示す。
ＣＤ１９またはＢＣＭＡ標的ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡでエレクトロポレーションしたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞による標的細胞の特異的溶解を示す。
ＦＬｕｃをコードし、５０％脂質１５（表１０ｂ）、１０％ＤＳＰＣ、１．５％ＰＥＧ－ＤＭＧ、及び３８．５％コレステロールで製剤化された環状ＲＮＡが投薬されたＣＤ－１マウスから採取された器官のｔｏｔａｌ ｆｌｕｘを示す。
ＦＬｕｃをコードし、５０％脂質１５（表１０ｂ）、１０％ＤＳＰＣ、１．５％ＰＥＧ－ＤＭＧ、及び３８．５％コレステロールで製剤化された環状ＲＮＡが投薬されたＣＤ－１マウスから採取された器官の発光を強調する画像を示す。
表１０ａからの脂質２６及び２７の分子特徴評価を示す。脂質２６のプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示す。 表１０ａからの脂質２６及び２７の分子特徴評価を示す。液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって測定された脂質２６の保持時間を示す。 表１０ａからの脂質２６及び２７の分子特徴評価を示す。脂質２６の質量スペクトルを示す。 表１０ａからの脂質２６及び２７の分子特徴評価を示す。脂質２７のプロトンＮＭＲスペクトルを示す。 表１０ａからの脂質２６及び２７の分子特徴評価を示す。ＬＣ－ＭＳによって測定された脂質２７の保持時間を示す。 表１０ａからの脂質２６及び２７の分子特徴評価を示す。脂質２７の質量スペクトルを示す。
脂質２２－Ｓ１４及びその合成中間体の分子特徴評価を示す。２－（テトラデシルチオ）エタン－１－オールのＮＭＲスペクトルを示す。 脂質２２－Ｓ１４及びその合成中間体の分子特徴評価を示す。２－（テトラデシルチオ）エチルアクリレートのＮＭＲスペクトルを示す。 脂質２２－Ｓ１４及びその合成中間体の分子特徴評価を示す。ビス（２－（テトラデシルチオ）エチル）３，３’－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ジプロピオネート（脂質２２－Ｓ１４）のＮＭＲスペクトルを示す。
ビス（２－（テトラデシルチオ）エチル）３，３’－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ジプロピオネート（脂質９３－Ｓ１４）のＮＭＲスペクトルを示す。
ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（表１０ａからの脂質５４）の分子特徴評価を示す。脂質５４のプロトンＮＭＲスペクトルを示す。 ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（表１０ａからの脂質５４）の分子特徴評価を示す。ＬＣ－ＭＳによって測定された脂質５４の保持時間を示す。 ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（表１０ａからの脂質５４）の分子特徴評価を示す。脂質５４の質量スペクトルを示す。
ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（表１０ａからの脂質５３）の分子特徴評価を示す。脂質５３のプロトンＮＭＲスペクトルを示す。 ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（表１０ａからの脂質５３）の分子特徴評価を示す。ＬＣ－ＭＳによって測定された脂質５３の保持時間を示す。 ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（表１０ａからの脂質５３）の分子特徴評価を示す。脂質５３の質量スペクトルを示す。
Ａは、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をコードし、目的のイオン化可能脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）と１６：１：４：１の重量比または６２：４：３３：１のモル比で製剤化された環状ＲＮＡが投薬されたＣＤ－１マウスから採取された脾臓及び肝臓のｔｏｔａｌ ｆｌｕｘを示す。Ｂは、タンパク質発現の生体内分布についての平均輝度を示す。
Ａは、ＦＬｕｃをコードし、イオン化可能脂質２２－Ｓ１４、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）と１６：１：４：１の重量比または６２：４：３３：１のモル比で製剤化された環状ＲＮＡが投薬されたＣＤ－１マウスから採取された器官の発光を強調する画像を示す。Ｂは、ＦＬｕｃをコードし、イオン化可能脂質２２－Ｓ１４、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）で１６：１：４：１の重量比または６２：４：３３：１のモル比で製剤化された環状ＲＮＡが投薬されたＣＤ－１マウスの全身ＩＶＩＳ画像を示す。
Ａは、ＦＬｕｃをコードし、イオン化可能脂質９３－Ｓ１４、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）と１６：１：４：１の重量比または６２：４：３３：１のモル比で製剤化された環状ＲＮＡが投薬されたＣＤ－１マウスから採取された器官の発光を強調する画像を示す。Ｂは、ＦＬｕｃをコードし、イオン化可能脂質９３－Ｓ１４、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）で１６：１：４：１の重量比または６２：４：３３：１のモル比で製剤化された環状ＲＮＡが投薬されたＣＤ－１マウスの全身ＩＶＩＳ画像を示す。
Ａは、ＦＬｕｃをコードし、表１０ａからのイオン化可能脂質２６、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）と１６：１：４：１の重量比または６２：４：３３：１のモル比で製剤化された環状ＲＮＡが投薬されたＣＤ－１マウスから採取された器官の発光を強調する画像を示す。Ｂは、ＦＬｕｃをコードし、イオン化可能脂質２６、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）で１６：１：４：１の重量比または６２：４：３３：１のモル比で製剤化された環状ＲＮＡが投薬されたＣＤ－１マウスの全身ＩＶＩＳ画像を示す。
ＦＬｕｃをコードし、表１０ｂからの脂質１５（図３６Ａ）で形成された脂質ナノ粒子に封入された環状ＲＮＡが投薬されたｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから採取された器官の発光を強調する画像を示す。 ＦＬｕｃをコードし、表１０ａからの脂質５３（図３６Ｂ）で形成された脂質ナノ粒子に封入された環状ＲＮＡが投薬されたｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから採取された器官の発光を強調する画像を示す。 ＦＬｕｃをコードし、表１０ａからの脂質５４（図３６Ｃ）で形成された脂質ナノ粒子に封入された環状ＲＮＡが投薬されたｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから採取された器官の発光を強調する画像を示す。 ＰＢＳを対照として使用した（図３６Ｄ）。
ホタルルシフェラーゼをコードする環状ＲＮＡを含有する試験用脂質ナノ粒子との２４時間のインキュベーション後のヒトＰＢＭＣの溶解物における相対的発光を示す。 ホタルルシフェラーゼをコードする環状ＲＮＡを含有する試験用脂質ナノ粒子との２４時間のインキュベーション後のヒトＰＢＭＣの溶解物における相対的発光を示す。
ＧＦＰまたはＣＤ１９ ＣＡＲのいずれかをコードする環状ＲＮＡを含有する試験用脂質ナノ粒子とインキュベートした後のヒトＰＢＭＣにおけるＧＦＰ（図３７Ａ）及びＣＤ１９ ＣＡＲ（図３７Ｂ）の発現を示す。
抗ネズミＣＤ１９ ＣＡＲ発現配列及び様々なＩＲＥＳ配列を含む環状ＲＮＡでリポトランスフェクトされた１Ｃ１Ｃ７細胞における抗ネズミＣＤ１９ ＣＡＲの発現を示す。
ネズミＴ細胞に対する抗ネズミＣＤ１９ ＣＡＲの細胞傷害を示す。ＣＤ１９ ＣＡＲは、ネズミＴ細胞にエレクトロポレーションされた環状ＲＮＡによってコードされ、発現する。
抗ネズミＣＤ１９ ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡを封入している試験用脂質ナノ粒子が１日おきに注射されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける末梢血（図４０Ａ及び４０Ｂ）または脾臓（図４０Ｃ）におけるＢ細胞数を示す。 抗ネズミＣＤ１９ ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡを封入している試験用脂質ナノ粒子が１日おきに注射されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける末梢血（図４０Ａ及び４０Ｂ）または脾臓（図４０Ｃ）におけるＢ細胞数を示す。 抗ネズミＣＤ１９ ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡを封入している試験用脂質ナノ粒子が１日おきに注射されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける末梢血（図４０Ａ及び４０Ｂ）または脾臓（図４０Ｃ）におけるＢ細胞数を示す。
環状ＲＮＡから発現した抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲの発現レベルを線状ｍＲＮＡから発現したものと比較している。 環状ＲＮＡから発現した抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲの発現レベルを線状ｍＲＮＡから発現したものと比較している。
環状ＲＮＡから発現した抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲの細胞傷害効果を線状ｍＲＮＡから発現したものと比較している。 環状ＲＮＡから発現した抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲの細胞傷害効果を線状ｍＲＮＡから発現したものと比較している。
は、Ｔ細胞において単一の環状ＲＮＡから発現した２つのＣＡＲ（抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲ及び抗ヒトＢＣＭＡ ＣＡＲ）の細胞傷害を示す。
表１０ａからの脂質２７もしくは２６または表１０ｂからの脂質１５で形成されたＬＮＰでの処置後の様々な脾臓免疫細胞サブセットにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ発現の頻度と共に代表的なＦＡＣＳプロットを示す。 Ｃｒｅ環状ＲＮＡで成功裏にトランスフェクトされた各細胞集団の割合と同等な、ｔｄＴｏｍａｔｏを発現する骨髄細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞の割合の定量を示している（平均＋標準偏差、ｎ＝３）。 脂質２７及び２６での処置後にｔｄＴｏｍａｔｏを発現するＮＫ細胞、古典的単球、非古典的単球、好中球、及び樹状細胞を含む追加の脾臓免疫細胞集団の割合を示している（平均＋標準偏差、ｎ＝３）。
イントロンにビルトインポリＡ配列を有する例示的なＲＮＡコンストラクト設計を示す。 未精製環状ＲＮＡのクロマトグラフィートレースを示す。 アフィニティー精製された環状ＲＮＡのクロマトグラフィートレースを示す。 様々なＩＶＴ条件及び精製方法で調製された環状ＲＮＡの免疫原性を示す。（市販＝市販ＩＶＴミックス；カスタム＝カスタマイズされたＩＶＴミックス；Ａｆｆ＝アフィニティー精製；Ｅｎｚ＝酵素精製；ＧＭＰ：ＧＴＰ比＝８、１２．５、または１３．７５）。
Ａは、ハイブリダイゼーション精製のためのポリＡの代替手段として特殊結合配列を有する例示的なＲＮＡコンストラクト設計を示す。Ｂは、未精製環状ＲＮＡのクロマトグラフィートレースを示す。Ｃは、アフィニティー精製された環状ＲＮＡのクロマトグラフィートレースを示す。
Ａは、ジストロフィンをコードする未精製環状ＲＮＡのクロマトグラフィートレースを示す。Ｂは、ジストロフィンをコードする酵素精製された環状ＲＮＡのクロマトグラフィートレースを示す。
Ｊｕｒｋａｔ細胞における３’イントロンフラグメント／５’内部二重鎖領域とＩＲＥＳとの間に異なる５’スペーサーを有する精製されたｃｉｒｃＲＮＡの発現（Ａ）及び安定性（Ｂ）を比較している。（ＡＣ＝Ａ及びＣのみがスペーサー配列において使用された；ＵＣ＝Ｕ及びＣのみがスペーサー配列において使用された）。
示されたオリジナルのまたは修飾されたＩＲＥＳエレメントを含有する環状ＲＮＡからの初代Ｔ細胞における発光発現レベル及び発現の安定性を示す。
示されたオリジナルのまたは修飾されたＩＲＥＳエレメントを含有する環状ＲＮＡからのＨｅｐＧ２細胞における発光発現レベル及び発現の安定性を示す。
示されたオリジナルのまたは修飾されたＩＲＥＳエレメントを含有する環状ＲＮＡからの１Ｃ１Ｃ７細胞における発光発現レベル及び発現の安定性を示す。
挿入された非翻訳領域（ＵＴＲ）を有するＩＲＥＳエレメントまたはハイブリッドＩＲＥＳエレメントを含有する環状ＲＮＡからのＨｅｐＧ２細胞における発光発現レベル及び発現の安定性を示している。「Ｓｃｒ」は、対照として使用されたスクランブルを意味する。
ガウシアルシフェラーゼをコードする配列に機能的に連結されたＩＲＥＳ及び可変終止コドンカセットを含有する環状ＲＮＡからの１Ｃ１Ｃ７細胞における発光発現レベル及び発現の安定性を示す。
ガウシアルシフェラーゼをコードする配列の開始コドンの前に挿入されたＩＲＥＳ及び可変非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有する環状ＲＮＡからの１Ｃ１Ｃ７細胞における発光発現レベル及び発現の安定性を示している。
ｈＥＰＯをコードする配列の下流に２つのｍｉＲ－１２２標的部位を含有する環状ＲＮＡからのＨｕｈ７細胞におけるヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）の発現レベルを示している。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの、ホタルルシフェラーゼをコードする環状ＲＮＡをトランスフェクトしたＬＮＰからの、ＳｕｐＴ１細胞（ヒトＴ細胞腫瘍株由来）及びＭＶ４－１１細胞（ヒトマクロファージ株由来）における発光発現レベルを示している。
ヘルパー脂質、ＰＥＧ脂質、及びイオン化可能脂質と、リン酸との比が異なる製剤に基づいた、トランスフェクトされた初代ヒトＴ細胞の環状ＲＮＡ含有ＬＮＰのＡｐｏＥ依存性の比較を示す。
ＡｐｏＥ３を用いる場合または用いない場合の、ｅＧＦＰをコードする環状ＲＮＡを含有するＬＮＰの、活性化初代ヒトＴ細胞内への取り込みを示す。
Ｃｒｅレポーターマウスモデルにおける、Ｃｒｅ蛍光タンパク質をコードする環状ＲＮＡを含有するＬＮＰからの免疫細胞での発現を示す。
ｍＯＸ４０Ｌをコードする環状ＲＮＡをトランスフェクトしてあるＬＮＰの静脈内注射後の、野生型マウスにおける免疫細胞のｍＯＸ４０Ｌ発現を示す。
ｍＯＸ４０Ｌ発現能のある環状ＲＮＡをトランスフェクトしたｍＯＸ４０Ｌ含有ＬＮＰの単回投与を示す。脾臓のＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、及び他の骨髄系細胞でのｍＯＸ４０Ｌ発現パーセントを示す。 ｍＯＸ４０Ｌ発現能のある環状ＲＮＡをトランスフェクトしたｍＯＸ４０Ｌ含有ＬＮＰの単回投与を示す。脾臓のＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、及び他の骨髄系細胞でのｍＯＸ４０Ｌ発現パーセントを示す。 ｍＯＸ４０Ｌ発現能のある環状ＲＮＡをトランスフェクトしたｍＯＸ４０Ｌ含有ＬＮＰの単回投与を示す。トランスフェクションから２４時間後のマウスの体重変化を示す。
マウスにおける環状ＲＮＡを静脈内にトランスフェクトしたＬＮＰのＢ細胞枯渇を示す。生きたＣＤ４５＋免疫細胞であるＢ２２０＋Ｂ細胞を介したＢｅ細胞枯渇を定量化する。 マウスにおける環状ＲＮＡを静脈内にトランスフェクトしたＬＮＰのＢ細胞枯渇を示す。ルシフェラーゼ発現環状ＲＮＡと比較した、生きたＣＤ４５＋免疫細胞であるＢ２２０＋Ｂ細胞のＢ細胞枯渇を比較する。 マウスにおける環状ＲＮＡを静脈内にトランスフェクトしたＬＮＰのＢ細胞枯渇を示す。トランスフェクトされた細胞のＢ細胞重量増加を示す。
抗ＣＤ１９ＣＡＲを発現する環状ＲＮＡを封入しているＬＮＰで処理した場合の末梢血（Ａ）及び脾臓（Ｂ）でのＣＡＲ発現レベルを示す。抗ＣＤ２０（ａＣＤ２０）及びルシフェラーゼをコードする環状ＲＮＡ（ｏＬｕｃ）を比較のために使用した。
抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現の全体的な頻度、細胞表面での抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現の頻度、及びＴ細胞上の抗ＣＤ１９ＣＡＲをコードするＩＲＥＳ特異的環状ＲＮＡの抗腫瘍反応に対する効果を示す。Ａは、抗ＣＤ１９ＣＡＲ幾何平均蛍光強度を示し、Ｂは、抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現のパーセンテージを示し、Ｃは、抗ＣＤ１９ＣＡＲにより実行された標的細胞溶解パーセンテージを示す。（ＣＫ＝ヤギコブウイルス；ＡＰ＝アポデムスピコルナウイルス；ＣＫ＊＝コドンが最適化されたヤギコブウイルス；ＰＶ＝パラボウイルス；ＳＶ＝サリウイルス。）
ＩＲＥＳ特異的環状ＲＮＡコンストラクトで処理した場合のＡ２０ ＦＬｕｃ標的細胞のＣＡＲ発現レベルを示す。
初代ヒトＴ細胞における環状ＲＮＡからの細胞質（Ａ）及び表面（Ｂ）でのタンパク質の発光発現レベルを示している。
ＩＲＥＳ特異的環状コンストラクトで処理した場合のヒトＴ細胞での発光発現を示す。環状ＲＮＡコンストラクトでの発現を直鎖ｍＲＮＡと比較した。複数のドナー細胞でのガウシアルシフェラーゼ発現を示す。 ＩＲＥＳ特異的環状コンストラクトで処理した場合のヒトＴ細胞での発光発現を示す。環状ＲＮＡコンストラクトでの発現を直鎖ｍＲＮＡと比較した。複数のドナー細胞でのガウシアルシフェラーゼ発現を示す。 ＩＲＥＳ特異的環状コンストラクトで処理した場合のヒトＴ細胞での発光発現を示す。環状ＲＮＡコンストラクトでの発現を直鎖ｍＲＮＡと比較した。複数のドナー細胞でのホタルルシフェラーゼ発現を示す。 ＩＲＥＳ特異的環状コンストラクトで処理した場合のヒトＴ細胞での発光発現を示す。環状ＲＮＡコンストラクトでの発現を直鎖ｍＲＮＡと比較した。複数のドナー細胞でのホタルルシフェラーゼ発現を示す。 ＩＲＥＳ特異的環状コンストラクトで処理した場合のヒトＴ細胞での発光発現を示す。環状ＲＮＡコンストラクトでの発現を直鎖ｍＲＮＡと比較した。複数のドナー細胞でのホタルルシフェラーゼ発現を示す。 ＩＲＥＳ特異的環状コンストラクトで処理した場合のヒトＴ細胞での発光発現を示す。環状ＲＮＡコンストラクトでの発現を直鎖ｍＲＮＡと比較した。複数のドナー細胞でのホタルルシフェラーゼ発現を示す。複数のドナー細胞でのホタルルシフェラーゼ発現を示す。 ＩＲＥＳ特異的環状コンストラクトで処理した場合のヒトＴ細胞での発光発現を示す。環状ＲＮＡコンストラクトでの発現を直鎖ｍＲＮＡと比較した。複数のドナー細胞でのガウシアルシフェラーゼ発現を示す。
ホタルルシフェラーゼ発現Ｋ５６２細胞に対する、抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ ＣＡＲのいずれかをコードする環状ＲＮＡを包む脂質ナノ粒子の処理後の、ヒトＴ細胞での抗ＣＤ１９ＣＡＲ（Ａ及びＢ）及び抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ（Ｂ）の発現を示す。
抗ＣＤ１９ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏエレクトロポレーションによる送達から特定抗原依存的にもたらされる抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現レベルを示す。Ａは、抗ＣＤ１９ＣＡＲでのＮａｌｍ６細胞の溶解を示す。Ｂは、抗ＣＤ１９ＣＡＲでのＫ５６２細胞の溶解を示す。
ＬＮＰと、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する環状ＲＮＡとを含有するＡｐｏＥ３溶液の使用により媒介されたＬＮＰのトランスフェクションを示す。ｌｉｖｅ－ｄｅａｄの結果を示した。 ＬＮＰと、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する環状ＲＮＡとを含有するＡｐｏＥ３溶液の使用により媒介されたＬＮＰのトランスフェクションを示す。複数のドナーの発現頻度を示す。 ＬＮＰと、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する環状ＲＮＡとを含有するＡｐｏＥ３溶液の使用により媒介されたＬＮＰのトランスフェクションを示す。複数のドナーの発現頻度を示す。 ＬＮＰと、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する環状ＲＮＡとを含有するＡｐｏＥ３溶液の使用により媒介されたＬＮＰのトランスフェクションを示す。複数のドナーの発現頻度を示す。 ＬＮＰと、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する環状ＲＮＡとを含有するＡｐｏＥ３溶液の使用により媒介されたＬＮＰのトランスフェクションを示す。複数のドナーの発現頻度を示す。
表１０ａからの異なる脂質製剤の総フラックス及び発現パーセントを示す。 表１０ａからの異なる脂質製剤の総フラックス及び発現パーセントを示す。 表１０ａからの異なる脂質製剤の総フラックス及び発現パーセントを示す。 表１０ａからの異なる脂質製剤の総フラックス及び発現パーセントを示す。 表１０ａからの異なる脂質製剤の総フラックス及び発現パーセントを示す。 表１０ａからの異なる脂質製剤の総フラックス及び発現パーセントを示す。 表１０ａからの異なる脂質製剤の総フラックス及び発現パーセントを示す。 表１０ａからの異なる脂質製剤の総フラックス及び発現パーセントを示す。 表１０ａからの異なる脂質製剤の総フラックス及び発現パーセントを示す。 表１０ａからの異なる脂質製剤の総フラックス及び発現パーセントを示す。 表１０ａからの異なる脂質製剤の総フラックス及び発現パーセントを示す。 表１０ａからの異なる脂質製剤の総フラックス及び発現パーセントを示す。
詳細な説明
本明細書では、環状ＲＮＡを含む医薬組成物及び輸送ビヒクル、例えば、脂質ナノ粒子を提供する。本明細書で提供される環状ＲＮＡは、細胞に、輸送ビヒクルに入れて、例えば、ナノ粒子、または輸送ビヒクルを含む組成物に入れて送達及び／または指向され得る。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡはまた、輸送ビヒクルまたは輸送ビヒクルを含む組成物に入れて対象に送達され得る。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、脂質ナノ粒子、ポリマーコアシェルナノ粒子、または生分解性ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、１つ以上のイオン化可能脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ヘルパー脂質、及び／または構造脂質を含む。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、環状ＲＮＡを封入し、イオン化可能脂質、構造脂質、及びＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、環状ＲＮＡを封入し、イオン化可能脂質、構造脂質、ＰＥＧ修飾脂質、及びヘルパー脂質を含む。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、本明細書に記載のイオン化可能脂質を含む。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、表１～１０、１０ａ、１０ｂ、１１～１５、及び１５ｂのいずれか１つに示されるイオン化可能脂質を含む。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、表１０ａに示されるイオン化可能脂質を含む。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクル中のＲＮＡは、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、またはそれ以上の環状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、搭載されたＲＮＡの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％未満は、輸送ビヒクルの外面上にあるか、またはそれと会合している。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、ＡＰＯＥへの結合能がある。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルの表面は、ＡＰＯＥ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルの表面は、ＡＰＯＥ結合部位を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、直鎖ＲＮＡが搭載された同等の輸送ビヒクルほど、ＡＰＯＥと相互作用しない。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＥ相互作用は、ＡＰＯ除去血清またはＡＰＯ補充血清における細胞でのナノ粒子の取り込みを比較することによって測定され得る。
理論に拘束されることは望まないが、ＡＰＯＥ結合部位を含む輸送ビヒクルは、環状ＲＮＡをより効率的に肝臓に送達することが企図される。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のイオン化可能脂質を含み、かつ、環状ＲＮＡが搭載された輸送ビヒクルは、輸送ビヒクル表面にＡＰＯＥ結合部位を実質的に含み、それにより、表面にＡＰＯＥ結合部位を実質的に欠く輸送ビヒクルと比較して高い効率で環状ＲＮＡを肝臓に送達する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のイオン化可能脂質を含み、かつ、環状ＲＮＡが搭載された輸送ビヒクルは、輸送ビヒクル表面にＡＰＯＥ結合部位を実質的に欠き、それにより、表面にＡＰＯＥ結合部位を含む輸送ビヒクルと比較して低い効率で環状ＲＮＡを肝臓に送達する。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、環状ＲＮＡを脾臓に送達するか、または送達する能力がある。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、治療用タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、対象で発現する総治療用タンパク質の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％は、脾臓で発現する。いくつかの実施形態では、肝臓よりも脾臓でより多くの治療用タンパク質が発現する（例えば、２倍、３倍、４倍、または５倍以上）。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能脂質：リン酸比が３～７である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能脂質：リン酸比が４～６である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能脂質：リン酸比が４．５である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、窒素：リン酸（Ｎ：Ｐ）比が３～６である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、Ｎ：Ｐ比が５～６である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、Ｎ：Ｐ比が５．７である。いくつかの実施形態では、非分泌タンパク質の発現は、ＥＬＩＳＡを使用して測定され、組織重量に対して正規化され得る。
理論に拘束されることは望まないが、本明細書に記載の輸送ビヒクルは、封入された環状ＲＮＡを分解から保護して、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで標的細胞への環状ＲＮＡの有効な送達を提供すると考えられる。
本開示の実施形態は、製剤中の構成脂質のそれぞれのモル比に従って記載された脂質組成物を提供する。一実施形態では、イオン化可能脂質のｍｏｌ％は、約１０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態では、イオン化可能脂質のｍｏｌ％は、約２０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態では、イオン化可能脂質のｍｏｌ％は、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態では、イオン化可能脂質のｍｏｌ％は、約３５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％であり得る。一実施形態では、イオン化可能脂質のｍｏｌ％は、約４０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％であり得る。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルバッチのイオン化可能脂質ｍｏｌ％は、標的ｍｏｌ％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％であるだろう。特定の実施形態では、輸送ビヒクルのロット間変動は、１５％未満、１０％未満または５％未満であるだろう。
一実施形態では、ヘルパー脂質のｍｏｌ％は、約１ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態では、ヘルパー脂質のｍｏｌ％は、約２ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％であり得る。一実施形態では、ヘルパー脂質のｍｏｌ％は、約３ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態では、ヘルパー脂質のｍｏｌ％は、約４ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％であり得る。一実施形態では、ヘルパー脂質のｍｏｌ％は、約５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態では、ヘルパー脂質のｍｏｌ％は、約１０ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％であり得る。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルバッチのヘルパー脂質ｍｏｌ％は、標的ｍｏｌ％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％であるだろう。
一実施形態では、構造脂質のｍｏｌ％は、約１０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態では、構造脂質のｍｏｌ％は、約２０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態では、構造脂質のｍｏｌ％は、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態では、構造脂質のｍｏｌ％は、約３５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％であり得る。一実施形態では、構造脂質のｍｏｌ％は、約４０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％であり得る。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルバッチの構造脂質ｍｏｌ％は、標的ｍｏｌ％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％であるだろう。
一実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質のｍｏｌ％は、約０．１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質のｍｏｌ％は、約０．２ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％であり得る。一実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質のｍｏｌ％は、約０．５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％であり得る。一実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質のｍｏｌ％は、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％であり得る。一実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質のｍｏｌ％は、約１．５ｍｏｌ％であり得る。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルバッチのＰＥＧ修飾脂質ｍｏｌ％は、標的ｍｏｌ％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％であるだろう。
本明細書に開示する化合物のうちの１つ以上を含む医薬組成物、特に輸送ビヒクルも企図される。特定の実施形態では、そのような輸送ビヒクルは、本明細書に開示するＰＥＧ修飾脂質、イオン化可能脂質、ヘルパー脂質及び／または構造脂質のうちの１つ以上を含む。本明細書に開示する化合物のうちの１つ以上を含み、さらに１つ以上の追加の脂質を含む、輸送ビヒクルも企図される。特定の実施形態では、そのような輸送ビヒクルは、環状ＲＮＡを搭載するか、そうでなければそれを封入する。
本発明の輸送ビヒクルは、環状ＲＮＡを封入する。特定の実施形態では、本発明の化合物または医薬組成物及びリポソーム組成物によって封入されるポリヌクレオチドには、タンパク質または酵素をコードするＲＮＡ（例えば、例として、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするｃｉｒｃＲＮＡ）が含まれる。本発明は、そのようなポリヌクレオチドを、治療剤として、すなわち、標的細胞によって発現されることができ、それにより、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８４５７号及び２０１１年６月８日に出願された米国仮特許出願第６１／４９４，８８１号（これらの教示はいずれも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で開示されているように、かかる標的細胞による機能性の酵素またはタンパク質の産生（また特定の場合には、排泄）を促進することのできる治療剤として使用することを企図している。例えば、特定の実施形態では、標的細胞による１つ以上のポリヌクレオチドの発現時に、対象で欠乏している機能性の酵素またはタンパク質（例えば、尿素サイクル酵素またはリソソーム蓄積障害と関連する酵素）の産生が観察され得る。別の例として、輸送ビヒクルによって封入された環状ＲＮＡは、Ｔ細胞受容体タンパク質の１本または両方のポリペプチド鎖をコードするか、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし得る。
本明細書ではまた、本明細書に記載の機能性タンパク質をコードする環状ＲＮＡと輸送ビヒクルとを含む組成物を有効量にて対象に投与することにより対象の疾患を処置する方法も提供する。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、輸送ビヒクル内に封入される。特定の実施形態では、そのような方法は、ポリヌクレオチドの発現を増強させる（例えば、増加させる）、及び／または１つ以上の標的細胞及び標的組織（例えば、免疫細胞または肝細胞）における機能性ポリペプチド産物の産生及び分泌を増加させ得る。一般に、そのような方法は、標的細胞を、ｃｉｒｃＲＮＡを含むか、そうでなければ封入する１つ以上の化合物及び／または輸送ビヒクルと接触させることを含む。
特定の実施形態では、輸送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）は、それらが標的細胞の（例えば、環状ＲＮＡの）トランスフェクションを促進する能力に部分的に基づいて製剤化される。別の実施形態では、輸送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）は、標的細胞、標的組織または標的器官への環状ＲＮＡの送達を最適化するよう選択及び／または調製され得る。例えば、標的細胞が肝細胞である場合、または標的器官が脾臓である場合、医薬組成物及び／またはリポソーム組成物の特性（例えば、サイズ、電荷及び／またはｐＨ）は、そのような組成物（例えば、脂質ナノ粒子）が、標的細胞または標的器官に効果的に送達されるよう、免疫クリアランスを低下させるよう、及び／または標的細胞もしくは標的器官での保持が促進されるよう最適化され得る。あるいは、標的組織が中枢神経系である場合、輸送ビヒクルの選択及び調製には、血液脳関門の浸透性及び血液脳関門内での保持、及び／またはそのような組成物（例えば、脂質ナノ粒子）をそのような標的組織に（例えば、脳血管内投与を介して）直接送達する代替手段の使用を考慮しなければならない。特定の実施形態では、輸送ビヒクルは、血液脳関門を越える封入された物質の輸送を促進する物質（例えば、血液脳関門を破壊するかまたはその透過性を改善し、それによって標的細胞への環状ＲＮＡの輸送を増強させる物質）と組み合わされ得る。本明細書に記載の輸送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）は、標的細胞へのｃｉｒｃＲＮＡの導入を促進することができるが、コポリマーとしてポリカチオン（例えば、ポリＬ－リジン及びプロタミン）を、例えば、医薬組成物を含む脂質ナノ粒子のうちの１つ以上に添加することによっても、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのいずれでも多くの細胞株で数種の輸送ビヒクルのトランスフェクション効率を２～２８倍促進する、場合によっては、著しく増強させることができる（Ｎ．Ｊ．Ｃａｐｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９５；２：６０３；Ｓ．Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９７；４，８９１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、標的細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、Ｔ細胞である。
特定の実施形態では、本明細書に記載の輸送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）は、複数の脂質成分（例えば、本明細書に開示する化合物のうちの１つ以上）を１つ以上のポリマー成分と組み合わせることによって調製される。例えば、脂質ナノ粒子は、ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を使用して調製され得る。脂質ナノ粒子は、例えば、ＨＧＴ４００１、ＤＯＰＥ及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含め、様々な比率の追加の脂質の組み合わせから構成され得る。脂質ナノ粒子を構成するイオン化可能脂質、ヘルパー脂質、構造脂質及び／またはＰＥＧ修飾脂質の選択、ならびにそのような脂質相互の相対モル比は、選択された脂質（複数可）の特徴、意図される標的細胞または標的組織の性質、及び脂質ナノ粒子によって送達される物質またはポリヌクレオチドの特徴に基づく。追加の考慮事項には、例えば、アルキル鎖の飽和、ならびに選択された脂質（複数可）のサイズ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、融合性及び毒性が含まれる。
本明細書に記載の輸送ビヒクルは、封入されたポリヌクレオチドが標的細胞に到達することを可能にし得るか、または封入されたポリヌクレオチドが標的細胞もしくは標的器官に差別的に到達することを選択的に可能にし得る（例えば、輸送ビヒクルは、そのような輸送ビヒクルが投与される対象の肝臓または脾臓に集中し得る）。あるいは、輸送ビヒクルは、封入されたポリヌクレオチドの存在が望ましくないか、または有用性が限られる場合がある、他の非標的細胞または非標的器官への封入されたポリヌクレオチドの送達を制限し得る。
ポリヌクレオチド、例えば、ｃｉｒｃＲＮＡを、輸送ビヒクルに搭載するかまたは封入することは、そのようなポリヌクレオチドを分解する酵素もしくは化学物質を含有し得る環境（例えば、血清）及び／またはそのようなポリヌクレオチドの急速な排泄を引き起こす系もしくは受容体から、ポリヌクレオチドを保護するのに役立ち得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、封入されたポリヌクレオチド（複数可）の安定性を、特に、そのようなポリヌクレオチドが曝露され得る環境に関して、増強させることができる。
特定の実施形態では、本明細書において、環状ＲＮＡを作製するためのベクターが提供され、かかるベクターは、５’二重鎖形成領域、３’グループＩイントロンフラグメント、任意選択で第１のスペーサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現配列、任意選択で第２のスペーサー、５’グループＩイントロンフラグメント、及び３’二重鎖形成領域を含む。いくつかの実施形態では、これらのエレメントは、上記の順序でベクター内に配置される。いくつかの実施形態では、ベクターはさらに、３’グループＩイントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間に内部５’二重鎖形成領域を、また発現配列と５’グループＩイントロンフラグメント間に内部３’二重鎖形成領域を含む。いくつかの実施形態では、内部二重鎖形成領域は、互いの間に二重鎖を形成する能力があるが、外部二重鎖形成領域とは形成できない。いくつかの実施形態では、内部二重鎖形成領域は、第１及び第２のスペーサーの一部である。追加の実施形態には、本明細書に提供するベクターを使用して作成された環状ＲＮＡポリヌクレオチド等の環状ＲＮＡポリヌクレオチド、そのような環状ＲＮＡを含む組成物、そのような環状ＲＮＡを含む細胞、そのようなベクター、環状ＲＮＡ、組成物及び細胞を使用及び作成する方法が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書において、治療のため、またはＰＡＨ等の有用なタンパク質の産生のための、本明細書で提供される環状ＲＮＡポリヌクレオチドの細胞への投与を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、リボヌクレアーゼに対し環状ＲＮＡが耐性であるために、真核細胞内部での所望のポリペプチドの産生を直鎖ＲＮＡより長い半減期で提供する上で有利である。
環状ＲＮＡポリヌクレオチドには、エキソヌクレアーゼ媒介性の分解に必要な自由端がないため、それらは、同等の直鎖ＲＮＡと比較した場合、ＲＮＡ分解のいくつかのメカニズムに対して耐性となり、半減期が延長される。環状化により、一般に半減期が短いという問題があるＲＮＡポリヌクレオチドの安定化が可能になり得、様々な用途において外因性ｍＲＮＡの全体的な有効性が改善し得る。ある実施形態では、真核細胞（例えば、ヒト細胞等の哺乳類細胞）における本明細書で提供される環状ＲＮＡポリヌクレオチドの半減期は、少なくとも２０時間（例えば、少なくとも８０時間）である。
１．定義
本明細書で使用する場合、「ｃｉｒｃＲＮＡ」または「環状ポリリボヌクレオチド」または「環状ＲＮＡ」または「ｏＲＮＡ」という用語は、互換可能に使用され、共有結合を介して環状構造を形成するポリリボヌクレオチドを指す。
本明細書で使用する場合、「３’グループＩイントロンフラグメント」という用語は、スプライス部位ジヌクレオチド及び任意選択で天然エクソン配列のストレッチを含む、天然グループＩイントロンの３’近位端と７５％以上の類似性を有する配列を指す。
本明細書で使用する場合、「５’グループＩイントロンフラグメント」という用語は、スプライス部位ジヌクレオチド及び任意選択で天然エクソン配列のストレッチを含む、天然グループＩイントロンの５’近位端と７５％以上の類似性を有する配列を指す。
本明細書で使用される場合、「順列置換部位」という用語は、イントロンの順列置換の前に切断が行われるグループＩイントロン内の部位を指す。この切断により、３’及び５’グループＩイントロンフラグメントが生成され、これらは、環状化される前駆体ＲＮＡのストレッチの両側にくるよう順列置換される。
本明細書で使用される場合、「スプライス部位」という用語は、グループＩイントロンに部分的または完全に含まれているジヌクレオチドであり、その間のホスホジエステル結合がＲＮＡ環状化時に切断されるものを指す。
本明細書で使用される場合、「治療用タンパク質」という用語は、翻訳された核酸の形態で直接または間接的に対象に投与された場合に、治療的、診断的、及び／または予防的な効果を有し、／または所望の生物学的及び／または薬理学的な効果を誘発する、任意のタンパク質を指す。
本明細書で使用される場合、「免疫原性」という用語は、物質に対する免疫応答を誘導する可能性を指す。免疫応答は、生物の免疫系または特定の種類の免疫細胞が免疫原性物質に曝露された場合に誘導され得る。「非免疫原性」という用語は、物質に対する、閾値を超える検出可能な免疫応答の欠如または非存在を指す。免疫応答は、生物の免疫系または特定の種類の免疫細胞が非免疫原性物質に曝露された場合には検出されない。いくつかの実施形態では、本明細書に提供するような非免疫原性環状ポリリボヌクレオチドは、免疫原性アッセイによって測定した場合に所定の閾値を超える免疫応答を誘導しない。いくつかの実施形態では、自然免疫応答は、生物の免疫系または特定の種類の免疫細胞が本明細書に提供するような非免疫原性環状ポリリボヌクレオチドに曝露された場合には、検出されない。いくつかの実施形態では、適応免疫応答は、生物の免疫系または特定の種類の免疫細胞が本明細書に提供するような非免疫原性環状ポリリボヌクレオチドに曝露された場合には、検出されない。
本明細書で使用される場合、「環状化効率」という用語は、生じた環状ポリリボヌクレオチドの直鎖状出発物質と比較した、その測定値を指す。
本明細書で使用される場合、「翻訳効率」という用語は、リボヌクレオチド転写産物からのタンパク質またはペプチドの産生率または産生量を指す。いくつかの実施形態では、翻訳効率は、タンパク質またはペプチドをコードする転写産物の所与の量あたりの産生されたタンパク質またはペプチドの量として表すことができる。
「ヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、その修飾形態、またはその類似体を指す。ヌクレオチドには、プリン、例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、ならびにその誘導体及び類似体、ならびにピリミジン、例えば、シトシン、ウラシル、チミン、ならびにその誘導体及び類似体、を含む種が含まれる。ヌクレオチド類似体には、塩基、糖及び／またはリン酸の化学構造に修飾を有するヌクレオチドが含まれ、それには、５’位ピリミジン修飾、８’位プリン修飾、シトシン環外アミンでの修飾、及び５－ブロモ－ウラシルの置換；ならびに２’位糖修飾、例えば限定されないが、２’－ＯＨがＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、またはＣＮ（ここで、Ｒは、本明細書で定義するようなアルキル部分である）等の基によって置き換えられている糖修飾リボヌクレオチドが含まれるが、これに限定されない。ヌクレオチド類似体はまた、ヌクレオチドであって、塩基、例えばイノシン、クエオシン、キサンチン；糖、例えば２’－メチルリボース；非天然ホスホジエステル結合、例えばメチルホスホナート結合、ホスホロチオエート結合及びペプチド結合を有するヌクレオチドが含まれることを意図する。ヌクレオチド類似体には、５－メトキシウリジン、１－メチルシュードウリジン、及び６－メチルアデノシンが含まれる。
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、任意の長さ、例えば、約２塩基超、約１０塩基超、約１００塩基超、約５００塩基超、１０００塩基超、または最大で約１０，０００塩基またはそれ以上のポリマーであって、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成されるポリマーを表し、酵素によるかまたは合成で生成され得（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号及びそこに引用される参考文献に記載されるようなもの）、これは２つの天然に存在する核酸のものに類似した配列特異的様式で天然に存在する核酸とハイブリダイズすることができ、例えば、ワトソン－クリック塩基対形成相互作用に関与することができる。天然に存在する核酸は、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、及びウラシル（それぞれ、Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｔ、及びＵ）を含むヌクレオチドで構成される。
本明細書で使用される場合、「リボ核酸」及び「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチドで構成されるポリマーを意味する。
本明細書で使用される場合、「デオキシリボ核酸」及び「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボヌクレオチドで構成されるポリマーを意味する。
「単離された」または「精製された」は、一般に、ある物質（例えば、いくつかの実施形態では、化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド組成物、またはポリペプチド組成物）の単離であって、その物質が、それが存在している試料のかなりのパーセント（例えば、１％超、２％超、５％超、１０％超、２０％超、５０％超、またはそれ以上、通常は最大約９０％～１００％）を構成するようなものを指す。特定の実施形態では、実質的に精製された成分は、試料の少なくとも５０％、８０％～８５％、また９０％～９５％を含む。目的のポリヌクレオチド及びポリペプチドを精製するための技術は当該技術分野で周知であり、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、及び密度に応じた沈降が含まれる。一般に、ある物質が、試料の他の成分と比較して、天然で見られる量よりも多い量で試料に存在する場合、その物質は精製されている。
本明細書で使用される場合、「二本鎖」、「二重鎖」または「ハイブリダイズ」という用語は、相補的配列を含有する核酸の２本の一本鎖のハイブリダイゼーションによって形成された核酸を指す。ほとんどの場合、ゲノムＤＮＡは二本鎖である。配列は、完全に相補的または部分的に相補的であり得る。
本明細書で使用される場合、ＲＮＡに関して「構造不定」とは、ＲＮＡＦｏｌｄソフトウェアまたは同様の予測ツールによって、それ自体または同じＲＮＡ分子内の他の配列と構造（例えば、ヘアピンループ）を形成すると予測されないＲＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、構造不定のＲＮＡは、ヌクレアーゼ保護アッセイを使用して機能的に特徴評価することができる。
本明細書で使用される場合、ＲＮＡに関して「構造化」とは、ＲＮＡＦｏｌｄソフトウェアまたは同様の予測ツールによって、それ自体または同じＲＮＡ分子内の他の配列と構造（例えば、ヘアピンループ）を形成すると予測されるＲＮＡ配列を指す。
本明細書で使用される場合、２つの「二重鎖形成領域」、「ホモロジーアーム」、または「相同性領域」は、配列特異的相互作用において交差対合することが熱力学的に有利な任意の２つの領域であり得る。いくつかの実施形態では、２つの二重鎖形成領域、ホモロジーアーム、または相同性領域は、ハイブリダイゼーション反応の基質として作用するために、互いの逆相補鎖に対する十分なレベルの配列同一性を共有する。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド配列は、それらが逆相補鎖または「相補的」配列に対して同一であるか、または配列同一性を共有する場合、「相同性」を有している。相同性領域及び対応する相同性領域の逆相補鎖間の配列同一性パーセントは、ハイブリダイゼーションが起こることを可能にする任意のパーセントの配列同一性であり得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの内部二重鎖形成領域は、別の内部二重鎖形成領域と二重鎖を形成する能力があり、外部二重鎖形成領域とは二重鎖を形成しない。
直鎖状核酸分子は、核酸ホスホジエステル結合が置換基モノヌクレオチドの糖部分の５’炭素及び３’炭素で生じることから、「５’末端」（５’端）及び「３’末端」（３’端）を有すると言われている。新たな連結が５’炭素に対してであるポリヌクレオチドの端ヌクレオチドは、その５’末端ヌクレオチドである。新たな連結が３’炭素に対してであるポリヌクレオチドの端ヌクレオチドは、その３’末端ヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、末端ヌクレオチドは、３’または５’末端の端位置にあるヌクレオチドである。
「転写」は、ＤＮＡ分子をテンプレートとして使用するＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ分子の形成または合成を意味する。本発明は、転写に使用されるＲＮＡポリメラーゼに関しては制限されない。例えば、いくつかの実施形態では、Ｔ７型ＲＮＡポリメラーゼを使用することができる。
「翻訳」は、ＲＮＡテンプレートに基づくリボソームによるポリペプチド分子の形成を意味する。
本明細書で使用される用語は、個々の実施形態を説明することのみを目的とするものであり、限定されることを意図しないことを理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、記載に特に明確な指示がない限り、複数の指示対象を含まれる。したがって、例えば、「細胞」への言及には、２つ以上の細胞の組み合わせ、または細胞の培養物全体が含まれる、「ポリヌクレオチド」への言及には、実際問題として、そのポリヌクレオチドの多くのコピーが含まれる。具体的に記述されるかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「または」という用語は、包括的であると理解される。本明細書及び以下の残りの本明細書において定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解される意味と同じ意味を有する。
具体的に記述されるかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当該技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均の２標準偏差内にあるものと理解される。「約」は、記述された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、または０．０１％以内であると理解され得る。文脈から別様に明確でない限り、本明細書で提供される全ての数値は、「約」という用語によって修飾される。
本明細書で使用される場合、「コードする」という用語は、ポリマー巨大分子の情報を使用して、第１の分子とは異なる第２の分子の生成を指示する任意のプロセスを広く指す。第２の分子は、第１の分子の化学的性質とは異なる化学構造を有し得る。
「同時投与」とは、本明細書で提供される治療剤を、１つ以上の追加の治療剤と併せて十分に近い時間で投与し、本明細書で提供される治療剤が１つ以上の追加の治療剤の効果を増強させる、またはその逆を増強させることができるようにすることを意味する。
本明細書で使用される場合、「処置する」及び「予防する」という用語、ならびにそれらに由来する単語は、必ずしも１００％または完全な処置または予防を意味するものではない。むしろ、当業者が潜在的な有益性または治療効果を有すると認識する処置または予防の程度は様々である。本明細書に開示する方法によって提供される処置または予防には、疾患の１つ以上の状態または症状の処置または予防が含まれ得る。また、本明細書の目的の場合、「予防」は、疾患、またはその症状もしくは状態の発症を遅らせることを包含することができる。
本明細書で使用される場合、「発現配列」という用語は、産物、例えば、ペプチドもしくはポリペプチド、調節性核酸、または非コード核酸をコードする核酸配列を指す。ペプチドまたはポリペプチドをコードする例示的な発現配列は、複数の３つ組ヌクレオチドを含むことができ、そのそれぞれがアミノ酸をコードすることができ、「コドン」と称される。
本明細書で使用される場合、「スペーサー」は、ポリヌクレオチド配列に沿った２つの他のエレメントを隔てる１ヌクレオチドから数百または数千ヌクレオチドの範囲のポリヌクレオチド配列の領域を指す。配列は定義することも無作為であることもできる。スペーサーは典型的には非コードである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、二重鎖形成領域を含む。
本明細書で使用される場合、「スプライス部位」は、スプライシング反応中に間でホスホジエステル結合の切断が生じるジヌクレオチド（複数可）を指す。「５’スプライス部位」は、イントロン、例えば、グループＩイントロンの天然５’ジヌクレオチドを指し、「３’スプライス部位」は、イントロンの天然３’ジヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される場合、「内部リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、典型的なＲＮＡキャップ構造の非存在下でポリペプチドの翻訳を開始する能力がある、サイズが１０ｎｔ～１０００ｎｔ以上の範囲のＲＮＡ配列または構造エレメントを指す。ＩＲＥＳは典型的には、長さが約５００ｎｔ～約７００ｎｔである。
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ部位」は、少なくとも８ヌクレオチドの天然ｍｉＲＮＡ配列と二重鎖を形成する能力がある、ポリヌクレオチド内のヌクレオチドのストレッチを指す。
本明細書で使用される場合、「エンドヌクレアーゼ部位」は、エンドヌクレアーゼタンパク質によって認識及び切断されることのできる、ポリヌクレオチド内のヌクレオチドのストレッチを指す。
本明細書で使用される場合、「バイシストロン性ＲＮＡ」は、２つの異なるタンパク質をコードする２つの発現配列を含むポリヌクレオチドを指す。これらの発現配列は、プロテアーゼ切断部位等の切断可能なペプチドをコードするヌクレオチド配列によって区切られ得る。それらはまた、リボソームスキッピングエレメントによって区切られ得る。
本明細書で使用される場合、「リボソームスキッピングエレメント」という用語は、１つのＲＮＡ分子の翻訳から２本のペプチド鎖の生成を生じさせる能力がある短いペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を指す。理論に拘束されることは望まないが、リボソームスキッピングエレメントは、（１）第１のペプチド鎖の翻訳を終結させ、第２のペプチド鎖の翻訳を再開することによって；または（２）コードされるペプチドの固有のプロテアーゼ活性によるか、もしくは環境（例えば、サイトゾル）中の別のプロテアーゼによる、リボソームスキッピングエレメントによりコードされたペプチド配列中のペプチド結合の切断によって機能すると仮定される。
本明細書で使用される場合、「配合剤」という用語は、２つ以上の核酸または核酸及び他の活性原薬を含むナノ粒子製剤を指す。典型的には、比は等モルであるか、または２つ以上の核酸もしくは核酸及び他の活性原薬の比率計測量で定義される。
本明細書で使用される場合、「輸送ビヒクル」には、核酸を含め、生物学的に活性な薬剤の投与との関連での使用が一般に意図される、標準的な医薬担体、希釈剤、賦形剤等のいずれかが含まれる。
本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」という語句は、１つ以上の脂質（例えば、いくつかの実施形態では、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及びＰＥＧ修飾脂質）を含む輸送ビヒクルを指す。
本明細書で使用される場合、「イオン化可能脂質」という語句は、生理的ｐＨ４等の選択されたｐＨで正味正電荷を持ち、生理的ｐＨ７等の他のｐＨで中性電荷を持つ多くの脂質種のうちのいずれかを指す。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する脂質、例えば、イオン化可能脂質は、１つ以上の切断可能基を含む。「切断」及び「切断可能」という用語は、本明細書で使用される場合、対象の官能基にあるかもしくはそれに隣接する原子同士の１つ以上の化学結合（例えば、共有結合、水素結合、ファンデルワールス力及び／またはイオン相互作用のうちの１つ以上）が、破壊される（例えば、加水分解される）か、または選択された条件への曝露時に（例えば、酵素条件への曝露時に）破壊されることができることを意味する。特定の実施形態では、切断可能基は、ジスルフィド官能基であり、特定の実施形態は、選択された生物学的条件（例えば、細胞内条件）への曝露時に切断されることのできるジスルフィド基である。特定の実施形態では、切断可能基は、選択された生物学的条件への曝露時に切断されることのできるエステル官能基である。例えば、ジスルフィド基は、酵素によるか、または加水分解、酸化もしくは還元反応によって切断され得る。そのようなジスルフィド官能基の切断時、それに結合している１つ以上の官能部分または基（例えば、頭部基及び／または尾部基のうちの１つ以上）は、遊離し得る。例示的な切断可能基には、ジスルフィド基、エステル基、エーテル基、及びその任意の誘導体（例えば、アルキル及びアリールエステル）が含まれ得るが、これに限定されない。特定の実施形態では、切断可能基は、エステル基またはエーテル基ではない。いくつかの実施形態では、切断可能基は、１つ以上の官能部分または基（例えば、少なくとも１つの頭部基及び少なくとも１つの尾部基）に結合している（例えば、水素結合、ファンデルワールス力、イオン相互作用及び共有結合のうちの１つ以上によって結合している）。特定の実施形態では、官能部分または基の少なくとも１つは、親水性である（例えば、イミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、任意選択で置換されたアルキルアミノ及びピリジルのうちの１つ以上を含む親水性頭部基）。
本明細書で使用される場合、「親水性」という用語は、官能基が水を好み、典型的にはそのような基が水溶性であることを定性的に示すために使用される。例えば、本明細書では、１つ以上の親水性基（例えば、親水性頭部基）に結合した切断可能なジスルフィド（Ｓ－Ｓ）官能基を含む化合物を開示し、そのような親水性基は、イミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、任意選択で置換されたアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノ等のアルキルアミノ）及びピリジルからなる群を含む、またはこれから選択される。
特定の実施形態では、本明細書に開示する化合物を含む部分の官能基の少なくとも１つは、本質的に疎水性である（例えば、コレステロール等の天然に存在する脂質を含む疎水性尾部基）。本明細書で使用される場合、「疎水性」という用語は、官能基が水を嫌い、典型的にはそのような基が水溶性でないことを定性的に示すために使用される。例えば、１つ以上の疎水性基に結合した切断可能な官能基（例えば、ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）基）を含む化合物を本明細書に開示し、そのような疎水性基は、１つ以上の天然に存在する脂質、例えばコレステロール、及び／または任意選択で置換された、可変的に飽和もしくは不飽和のＣ６－Ｃ２０アルキル及び／または任意選択で置換された、可変的に飽和もしくは不飽和のＣ６－Ｃ２０アシルを含む。
本明細書に記載の化合物はまた、１つ以上の同位体置換を含み得る。例えば、Ｈは、１Ｈ、２Ｈ（Ｄまたは重水素）、及び３Ｈ（Ｔまたは三重水素）を含む、任意の同位体形態であり得；Ｃは、１２Ｃ、１３Ｃ、及び１４Ｃを含め、任意の同位体形態であり得；Ｏは、１６Ｏ及び１８Ｏを含め、任意の同位体形態であり得；Ｆは、１８Ｆ及び１９Ｆを含め、任意の同位体形態であり得る。
化合物及びその薬学的に許容される塩、そのような化合物を含有する医薬組成物ならびにそのような化合物及び組成物を使用する方法を含み得る本発明を説明する際、以下の用語は、存在する場合、別段示されない限り、以下の意味を有する。本明細書に記載される際に、以下に定義される部分のうちのいずれも様々な置換基で置換され得ること、また、それぞれの定義が、以下に述べられるそれらの範囲内にそのような置換された部分を含むことが意図されることも理解されたい。別段明記しない限り、「置換された」という用語は、以下に述べられるように定義される。「基」及び「ラジカル」という用語は、本明細書で使用される際に、交換可能であると見なされ得ることを、さらに理解されたい。
値の範囲が列挙されている場合、範囲内のそれぞれの値及び部分的範囲を包含することが意図される。例えば、「Ｃ１－６アルキル」は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ１－６、Ｃ１－５、Ｃ１－４、Ｃ１－３、Ｃ１－２、Ｃ２－６、Ｃ２－５、Ｃ２－４、Ｃ２－３、Ｃ３－６、Ｃ３－５、Ｃ３－４、Ｃ４－６、Ｃ４－５、及びＣ５－６のアルキルを包含することが意図される。
特定の実施形態では、本明細書に開示する化合物は、例えば、少なくとも１つの親水性頭部基及び少なくとも１つの疎水性尾部基を含み、それぞれが少なくとも１つの切断可能基に結合し、それによってそのような化合物を両親媒性にしている。化合物または組成物を説明するために本明細書で使用される場合、「両親媒性」という用語は、極性（例えば、水）及び非極性（例えば、脂質）のいずれの環境でも溶解する能力を意味する。例えば、特定の実施形態では、本明細書に開示する化合物は、少なくとも１つの親油性尾部基（例えば、コレステロールまたはＣ６－Ｃ２０アルキル）及び少なくとも１つの親水性頭部基（例えば、イミダゾール）を含み、それぞれ切断可能基（例えば、ジスルフィド）に結合している。
使用される「頭部基」及び「尾部基」という用語は、本発明の化合物、特にそのような化合物を構成する官能基を表し、他の官能基に対する１つ以上の官能基の配向を説明するために参照しやすくするために使用されることに留意されるべきである。例えば、特定の実施形態では、親水性頭部基（例えば、グアニジニウム）は、切断可能な官能基（例えば、ジスルフィド基）に（例えば、水素結合、ファンデルワールス力、イオン相互作用及び共有結合のうちの１つ以上によって）結合しており、これが次に親水性尾部基（例えば、コレステロール）に結合している。
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、直鎖及び分岐鎖の両方のＣ１－Ｃ４０炭化水素（例えば、Ｃ６－Ｃ２０炭化水素）を指し、飽和及び不飽和の両方の炭化水素が含まれる。特定の実施形態では、アルキルは、１つ以上の環状アルキル及び／または１つ以上のヘテロ原子、例えば、酸素、窒素、または硫黄を含み得、任意選択で、置換基（例えば、アルキル、ハロ、アルコキシル、ヒドロキシ、アミノ、アリール、エーテル、エステルまたはアミドのうちの１つ以上）で置換され得る。特定の実施形態では、企図されるアルキルには、（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエンが含まれる。例えば、「Ｃ６－Ｃ２０」等の名称の使用は、記述された範囲の炭素原子を有するアルキル（例えば、直鎖または分岐鎖であり、アルケン及びアルキルを含む）を指すことが意図されている。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～１０個の炭素原子を有する（「Ｃ１－１０アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～９個の炭素原子を有する（「Ｃ１－９アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～８個の炭素原子を有する（「Ｃ１－８アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～７個の炭素原子を有する（「Ｃ１－７アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～６個の炭素原子を有する（「Ｃ１－６アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～５個の炭素原子を有する（「Ｃ１－５アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～４個の炭素原子を有する（「Ｃ１－４アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～３個の炭素原子を有する（「Ｃ１－３アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～２個の炭素原子を有する（「Ｃ１－２アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１個の炭素原子を有する（「Ｃ１アルキル」）。Ｃ１－６アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル等が含まれる。
本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、２～２０個の炭素原子、１つ以上の炭素－炭素二重結合（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つの炭素－炭素二重結合）、及び任意選択で１つ以上の炭素－炭素三重結合（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つの炭素－炭素三重結合）を有する直鎖または分岐した炭化水素基のラジカルを指す。（「Ｃ２－２０アルケニル」）。特定の実施形態では、アルケニルは、いかなる三重結合も含有しない。いくつかの実施形態では、アルケニルは、２～１０個の炭素原子を有する（「Ｃ２－１０アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～９個の炭素原子を有する（「Ｃ２－９アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～８個の炭素原子を有する（「Ｃ２－８アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～７個の炭素原子を有する（「Ｃ２－７アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～６個の炭素原子を有する（「Ｃ２－６アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～５個の炭素原子を有する（「Ｃ２－５アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～４個の炭素原子を有する（「Ｃ２－４アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～３個の炭素原子を有する（「Ｃ２－３アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２個の炭素原子を有する（「Ｃ２アルケニル」）。１つ以上の炭素－炭素二重結合は、内部（２－ブテニルのような場合）または末端（１－ブテニルのような場合）であり得る。Ｃ２－４アルケニル基の例には、エテニル（Ｃ２）、１－プロペニル（Ｃ３）、２－プロペニル（Ｃ３）、１－ブテニル（Ｃ４）、２－ブテニル（Ｃ４）、ブタジエニル（Ｃ４）等が含まれる。Ｃ２－６アルケニル基の例には、前述したＣ２－４アルケニル基ならびにペンテニル（Ｃ５）、ペンタジエニル（Ｃ５）、ヘキセニル（Ｃ６）等が含まれる。アルケニルの追加の例には、ヘプテニル（Ｃ７）、オクテニル（Ｃ８）、オクタトリエニル（Ｃ８）等が含まれる。
本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、２～２０個の炭素原子、１つ以上の炭素－炭素三重結合（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つの炭素－炭素三重結合）、及び任意選択で１つ以上の炭素－炭素二重結合（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つの炭素－炭素二重結合）を有する直鎖または分岐した炭化水素基のラジカルを指す。（「Ｃ２－２０アルキニル」）。特定の実施形態では、アルキニルは、いかなる二重結合も含有しない。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～１０個の炭素原子を有する（「Ｃ２－１０アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～９個の炭素原子を有する（「Ｃ２－９アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～８個の炭素原子を有する（「Ｃ２－８アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～７個の炭素原子を有する（「Ｃ２－７アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～６個の炭素原子を有する（「Ｃ２－６アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～５個の炭素原子を有する（「Ｃ２－５アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～４個の炭素原子を有する（「Ｃ２－４アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～３個の炭素原子を有する（「Ｃ２－３アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２個の炭素原子を有する（「Ｃ２アルキニル」）。１つ以上の炭素－炭素三重結合は、内部（２－ブチニルのような場合）または末端（１－ブチニルのような場合）であり得る。Ｃ２－４アルキニル基の例には、限定されないが、エチニル（Ｃ２）、１－プロピニル（Ｃ３）、２－プロピニル（Ｃ３）、１－ブチニル（Ｃ４）、２－ブチニル（Ｃ４）等が含まれる。Ｃ２－６アルケニル基の例には、前述したＣ２－４アルキニル基ならびにペンチニル（Ｃ５）、ヘキシニル（Ｃ６）等が含まれる。アルキニルの追加の例には、ヘプチニル（Ｃ７）、オクチニル（Ｃ８）等が含まれる。
本明細書で使用される場合、「アルキレン」、「アルケニレン」、及び「アルキニレン」は、それぞれ、アルキル、アルケニル、及びアルキニル基の二価ラジカルを指す。特定の「アルキレン」、「アルケニレン」、または「アルキニレン」基について炭素の範囲または数が与えられている場合、その範囲または数は、直鎖二価の炭素鎖中の炭素の範囲または数を指すことが理解される。「アルキレン」、「アルケニレン」、及び「アルキニレン」基は、本明細書に記載される１つ以上の置換基で置換されても、または置換されなくてもよい。
本明細書で使用される場合、「アリール」という用語は、環部分に６～１０個の炭素を含有する芳香族基（例えば、単環式、二環式及び三環式の構造）を指す。アリール基は、利用可能な炭素原子を介して任意選択で置換されてよく、特定の実施形態では、酸素、窒素または硫黄等の１つ以上のヘテロ原子が含まれ得る。いくつかの実施形態では、アリール基は、６個の環炭素原子を有する（「Ｃ６アリール」；例えば、フェニル）。いくつかの実施形態では、アリール基は、１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ１０アリール」；例えば、ナフチル、例えば、１－ナフチル及び２－ナフチル）。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」は、芳香環系に環炭素原子及び１～４個の環ヘテロ原子が与えられている５～１０員の単環式または二環式４ｎ＋２の芳香環系（例えば、環状配列で共有された６個または１０個の電子を有する）のラジカルを指し、各ヘテロ原子は、独立して、窒素、酸素、及び硫黄から選択される（「５～１０員ヘテロアリール」）。１つ以上の窒素原子を含有するヘテロアリール基では、結合点は、原子価が許す限り、炭素原子または窒素原子であり得る。ヘテロアリール二環式環系には、一方または両方の環に１つ以上のヘテロ原子が含まれ得る。「ヘテロアリール」には、上記で定義されるようなヘテロアリール環が、そのヘテロアリール環上に結合点がある１つ以上のカルボシクリル基またはヘテロシクリル基と縮合している環系が含まれ、そのような場合、環員の番号は、ヘテロアリール環系内の環員の番号が連番で指定される。「ヘテロアリール」にはまた、上記で定義されるようなヘテロアリール環が１つ以上のアリール基と縮合しており、アリールまたはヘテロアリール環上のいずれかに結合点がある環系が含まれ、そのような場合、環員の番号は、縮合（アリール／ヘテロアリール）環系内の環員の番号が指定される。１つの環がヘテロ原子（例えば、インドリル、キノリニル、カルバゾリル等）を含まない二環式ヘテロアリール基は、結合点は、いずれかの環、すなわち、ヘテロ原子を持つ環（例えば、２－インドリル）またはヘテロ原子を含まない環（例えば、５－インドリル）のいずれかにあり得る。
「シクロアルキル」という用語は、３～１２個、３～８個、４～８個、または４～６個の炭素の一価飽和環状、二環式、または架橋環状（例えば、アダマンチル）の炭化水素基を指し、本明細書では、例えば、シクロアルカンに由来する「Ｃ４－８シクロアルキル」と称される。例示的なシクロアルキル基には、シクロヘキサン、シクロペンタン、シクロブタン、及びシクロプロパンが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ヘテロシクリル」または「複素環式」は、環炭素原子及び１～４個の環ヘテロ原子を有する３～１０員の非芳香環系のラジカルを指し、各ヘテロ原子は、独立して、窒素、酸素、硫黄、ホウ素、リン、及びケイ素から選択される（「３～１０員ヘテロシクリル」）。１個以上の窒素原子を含むヘテロシクリル基は、結合点は、原子価が許す限り、炭素原子または窒素原子であり得る。ヘテロシクリル基は、単環式（「単環式ヘテロシクリル」）環系または縮合環系、架橋環系もしくはスピロ環系、例えば、二環式系（「二環式ヘテロシクリル」）のいずれでもあり得、飽和の場合も部分的に不飽和の場合もある。ヘテロシクリル二環式環系には、一方または両方の環に１つ以上のヘテロ原子が含まれ得る。「ヘテロシクリル」にはまた、上記で定義されるようなヘテロシクリル環が１つ以上のカルボシクリル基と縮合しており、結合点がカルボシクリル環もしくはヘテロシクリル環または環系上のいずれかにある環系が含まれるか、または上記で定義されるようなヘテロシクリル環が１つ以上のアリールまたはヘテロアリール基と縮合しており、結合点がヘテロシクリル環上にある環系が含まれ、そのような場合、環員の番号は、ヘテロシクリル環系内の環員の番号が連番で指定される。「複素環」、「ヘテロシクリル」、「ヘテロシクリル環」、「複素環式基」、「複素環式部分」、及び「複素環式ラジカル」という用語は、交換可能に使用され得る。
本明細書で使用される場合、「シアノ」は、－ＣＮを指す。
本明細書で使用される用語「ハロ」及び「ハロゲン」は、フッ素（フルオロ、－Ｆ）、塩素（クロロ、－Ｃｌ）、臭素（ブロモ、－Ｂｒ）、及びヨウ素（ヨード、－Ｉ）から選択される原子を指す。特定の実施形態では、ハロ基は、フルオロまたはクロロであるのいずれかである。
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」という用語は、酸素原子を介して別の部分に結合しているアルキル基（－Ｏ（アルキル））を指す。非限定的な例には、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、及びブトキシが含まれる。
本明細書で使用される場合、「オキソ」は、－Ｃ＝Ｏを指す。
一般に、「置換」という用語は、「任意選択で」という用語が先行するかどうかにかかわらず、基（例えば、炭素原子または窒素原子）に存在する少なくとも１つの水素が、許容される置換基、例えば、置換時に、安定な化合物、例えば、転位、環化、脱離、または他の反応等により自発的に変換に進行しない化合物をもたらす置換基で置き換えられることを意味する。別段に示されない限り、「置換」基は、基の１つ以上の置換可能な位置で置換基を有し、任意の所与の構造で１つ以上の位置が置換される際、置換基は、各位置で同じかまたは異なるかのいずれかである。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、正当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、炎症、アレルギー反応等を伴わずに、ヒト及び下等動物の組織と接触する使用に好適であり、妥当なベネフィット／リスク比に見合う塩を指す。薬学的に許容される塩は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６：１－１９において薬学的に許容される塩を詳述している。本発明の化合物の薬学的に許容される塩には、好適な無機及び有機の酸及び塩基から誘導されるものが含まれる。薬学的に許容される無毒性の酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸及び過塩素酸等の無機酸を用いて、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸等の有機酸を用いて、あるいはイオン交換等の当該技術分野において使用される他の方法を使用することによって形成されるアミノ基の塩である。他の薬学的に許容される塩には、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が含まれる。適切な塩基に由来する薬学的に許容される塩には、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム及びＮ＋（Ｃ１－４アルキル）４塩が含まれる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属の塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等が含まれる。さらなる薬学的に許容される塩には、適切な場合、ハライド、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩、及びアリールスルホン酸塩等の対イオンを使用して形成される無毒性アンモニウム、第４級アンモニウム、及びアミンカチオンが含まれる。
典型的な実施形態では、本発明は、本明細書に開示する化合物、ならびにそのような化合物の薬学的に許容される塩、薬学的に許容されるエステル、互変異性体、多形、及びプロドラッグを包含することが意図される。いくつかの実施形態では、本発明には、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される付加塩、薬学的に許容されるエステル、付加塩の溶媒和物（例えば、水和物）、互変異性体、多形、エナンチオマー、エナンチオマーの混合物、立体異性体または立体異性体の混合物（純粋、またはラセミもしくは非ラセミ混合物として）を含む。
本明細書に記載の化合物は、１つ以上の不斉中心を含むことができ、そのため、様々な異性体形態、例えば、エナンチオマー及び／またはジアステレオマーで存在し得る。例えば、本明細書に記載の化合物は、個々のエナンチオマー、ジアステレオマーもしくは幾何異性体の形態であり得、またラセミ混合物及び１つ以上の立体異性体に富む混合物等の立体異性体の混合物形態でもあり得る。異性体は、キラル高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ならびにキラル塩の形成及び結晶化を含め、当業者に既知の方法によって混合物から単離することができ、または好ましい異性体を不斉合成によって調製することもできる。例えば、Ｊａｃｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１）、Ｗｉｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３３：２７２５（１９７７）、Ｅｌｉｅｌ，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，ＮＹ，１９６２）、及びＷｉｌｅｎ，Ｔａｂｌｅｓ ｏｆ Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｐ．２６８（Ｅ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ，Ｅｄ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｎｏｔｒｅ Ｄａｍｅ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｔｒｅ Ｄａｍｅ，ＩＮ １９７２）を参照されたい。本発明はさらに、他の異性体を実質的に含まない個々の異性体として、また別法として、様々な異性体の混合物として、本明細書に記載の化合物を包含する。
特定の実施形態では、化合物及びそのような化合物が成分である輸送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）は、１つ以上の標的細胞をトランスフェクトする能力の増強（例えば、増加）を示す。したがって、本明細書では、１つ以上の標的細胞をトランスフェクトする方法も提供する。そのような方法は、一般に、１つ以上の標的細胞を、本明細書に開示する化合物及び／または医薬組成物と接触させ、その中に封入された環状ＲＮＡが１つ以上の標的細胞にトランスフェクトされるようにするステップを含む。本明細書で使用される場合、「トランスフェクトする」または「トランスフェクション」という用語は、１つ以上の封入された物質（例えば、核酸及び／またはポリヌクレオチド）の、細胞への、または好ましくは標的細胞への細胞内導入を指す。「トランスフェクション効率」という用語は、そのような封入された物質（例えば、ポリヌクレオチド）が、トランスフェクションの対象となる標的細胞によって取り込まれる、その標的細胞へと導入される、及び／またはその標的細胞によって発現される相対量を指す。いくつかの実施形態では、トランスフェクション効率は、トランスフェクション後に標的細胞によって産生されるレポーターポリヌクレオチド産物の量によって推定され得る。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、高いトランスフェクション効率を有する。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のトランスフェクション効率を有する。
本明細書で使用される場合、「リポソーム」という用語は、一般に、１つ以上の球状二重層に配置された脂質（例えば、両親媒性脂質）で構成されるベシクルを指す。特定の実施形態では、リポソームは、脂質ナノ粒子（例えば、本明細書に開示するイオン化可能脂質化合物のうちの１つ以上を含む脂質ナノ粒子）である。そのようなリポソームは、親油性物質から形成された膜、ならびに１つ以上の標的細胞、組織、及び器官に送達される封入されたｃｉｒｃＲＮＡを含有する水性の内相を有する単層または多層のベシクルであり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、１つ以上の脂質ナノ粒子を含む。企図されるリポソーム及び脂質ナノ粒子を形成するために使用され得る好適な脂質（例えば、イオン化可能脂質）の例としては、本明細書に開示する化合物のうちの１つ以上が挙げられる（例えば、ＨＧＴ４００１、ＨＧＴ４００２、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ４００４及び／またはＨＧＴ４００５）。そのようなリポソーム及び脂質ナノ粒子は、追加のイオン化可能脂質、例えばＣ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、及び／またはＨＧＴ５００１、ヘルパー脂質、構造脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＩＣＥ、ＨＧＴ５０００、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、及びその組み合わせも含み得る。
本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」、「非カチオン性ヘルパー脂質」、及び「ヘルパー脂質」という語句は、互換可能に使用され、任意の中性、双性イオン性またはアニオン性脂質を指す。
本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」という語句は、生理的ｐＨ等の選択されたｐＨで正味負電荷を持つ多くの脂質種のいずれかを指す。
本明細書で使用される場合、「生分解性脂質」または「分解性脂質」という語句は、宿主環境で数分、数時間、または数日ほどで分解され、理想的には毒性が低くなり、かつ、宿主内に経時的に蓄積する可能性が低くなる、多くの脂質種のいずれかを指す。脂質への一般的な修飾には、エステル結合、中でもジスルフィド結合を含み、脂質の生分解性を高める。
本明細書で使用される場合、「生分解性ＰＥＧ脂質」または「分解性ＰＥＧ脂質」という語句は、ＰＥＧ分子が、宿主環境で数分、数時間、または数日ほどで脂質から切断され、理想的には免疫原性が低くなる、多くの脂質種のいずれかを指す。ＰＥＧ脂質への一般的な修飾には、エステル結合、及び中でもジスルフィド結合を含み、脂質の生分解性を高める。
本発明の特定の実施形態では、輸送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）は、１つ以上の物質または治療剤（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ）を封入するように調製される。所望の治療剤（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ）を輸送ビヒクルに組み込むプロセスは、本明細書では、「搭載する」または「封入する」と称する（Ｌａｓｉｃ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５－２５８，１９９２）。輸送ビヒクルに搭載または封入された物質（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ）は、完全または部分的に、輸送ビヒクルの内相空間内、輸送ビヒクルの二重層膜内、または輸送ビヒクルの外面と会合して配置され得る。
本明細書で使用される場合、「構造脂質」という用語は、ステロールを指し、またステロール部分を含有する脂質も指す。
本明細書で定義する場合、「ステロール」は、ステロイドアルコールからなるステロイドのサブグループである。
本明細書で使用される場合、「構造脂質」という用語は、ステロールを指し、またステロール部分を含有する脂質も指す。
本明細書で使用される場合、「ＰＥＧ」という用語は、任意のポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。
本明細書で一般に定義する場合、「ＰＥＧ－ＯＨ脂質」（本明細書では「ヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質」とも称する）は、脂質上に１つ以上のヒドロキシル（－ＯＨ）基を有するＰＥＧ化脂質である。
本明細書で使用される場合、「リン脂質」は、リン酸部分及び１つ以上の炭素鎖、例えば不飽和脂肪酸鎖を含む脂質である。
本明細書に開示する全てのヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列または対応するＤＮＡ配列を表し得る。ＤＮＡにおけるデオキシチミジン（ｄＴまたはＴ）は、ＲＮＡにおけるウリジン（Ｕ）に転写されることが理解される。このように、「Ｔ」及び「Ｕ」は、本明細書でヌクレオチド配列において互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」または、例えば、「と５０％同一である配列」を含む引用は、比較ウィンドウにわたって配列がヌクレオチドごとまたはアミノ酸ごとに同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適に整列された配列を比較ウィンドウにわたって比較し、両配列において核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が同一であり、またはアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ及びＭｅｔ）が同一である位置の数を決定して一致位置数を得、一致位置数を比較ウィンドウ内の総位置数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出され得る。本明細書に記載の参照配列のいずれかに対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有するヌクレオチド及びポリペプチドが含まれ、典型的にはポリペプチド変異体は、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を維持する。
２．ベクター、前駆体ＲＮＡ、及び環状ＲＮＡ
本明細書ではまた、環状ＲＮＡ、環状ＲＮＡに環状化し得る前駆体ＲＮＡ、及び前駆体ＲＮＡまたは環状ＲＮＡに転写され得るベクター（例えば、ＤＮＡベクター）も提供する。
２種類のスペーサーが、前駆体ＲＮＡ環状化及び／または環状ＲＮＡからの遺伝子発現を改善するために設計された。第１のタイプのスペーサーは外部スペーサーであり、すなわち、前駆体ＲＮＡに存在はするが環状化時に除去される。理論に拘束されることは望まないが、外部スペーサーは、リボザイム自体の構造を維持し、他の隣接配列エレメントがその折り畳み及び機能と干渉することを防止することによってリボザイム媒介性の環化を改善し得ることが企図される。第２のタイプのスペーサーは、内部スペーサーであり、すなわち、前駆体ＲＮＡに存在し、生じる環状ＲＮＡに保持される。理論に拘束されることは望まないが、内部スペーサーは、リボザイム自体の構造を維持し、他の隣接配列エレメント、特に隣接ＩＲＥＳ及びコード領域がその折り畳み及び機能と干渉することを防止することによってリボザイム媒介性の環化を改善し得ることが企図される。内部スペーサーは、隣接配列エレメント、特にイントロンエレメントがＩＲＥＳ内の配列とハイブリダイズすることを防止し、それが、その最も好ましくかつ活性的なコンフォメーションに折り畳まれる能力を阻害することによってタンパク質発現を改善し得ることも企図される。
タンパク質発現を誘導するために、環状ＲＮＡは、タンパク質をコードする配列に機能的に連結されたＩＲＥＳを含む。例示的なＩＲＥＳ配列は、以下の表１７に提供されている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する環状ＲＮＡは、表１７のＩＲＥＳ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なＩＲＥＳ配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する環状ＲＮＡは、表１７のＩＲＥＳ配列を含む。ＩＲＥＳ及び付属配列の改変が本明細書に開示され、例えば、ＩＲＥＳの５’末端及び／または３’末端を切断すること、ＩＲＥＳに対して５’にスペーサーを付加すること、翻訳開始部位（コザック配列）の５’の６ヌクレオチドを修飾すること、代替翻訳開始部位の修飾、及びキメラ／ハイブリッドＩＲＥＳ配列を生成することによって、ＩＲＥＳ活性を増大または低下させる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する環状ＲＮＡにおけるＩＲＥＳ配列は、ネイティブＩＲＥＳ（例えば、表１７に開示されるネイティブＩＲＥＳ）に対するこれらの修飾の１つ以上を含む。
特定の態様では、本明細書において、３’スプライシング後グループＩイントロンフラグメント、任意選択で第１のスペーサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現配列、任意選択で第２のスペーサー、及び５’スプライシング後グループＩイントロンフラグメントを含む環状ＲＮＡポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、これらの領域は、この順序である。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、本明細書に提供する方法によって、または本明細書に提供するベクターから作製される。
特定の実施形態では、（例えば、５’相同性領域、３’グループＩイントロンフラグメント、任意選択で第１のスペーサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現配列、任意選択で第２のスペーサー、５’グループＩイントロンフラグメント、及び３’相同性領域を含む）本明細書に提供するベクターの転写により、環状化能のある直鎖状前駆体ＲＮＡポリヌクレオチドの形成がもたらされる。いくつかの実施形態では、この直鎖状前駆体ＲＮＡポリヌクレオチドは、グアノシンヌクレオチドまたはヌクレオシドである（例えば、ＧＴＰ）及び二価カチオン（例えば、Ｍｇ２＋）の存在下でインキュベートされる場合に環状化する。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供するベクター及び前駆体ＲＮＡポリヌクレオチドは、第１の（５’）二重鎖形成領域及び第２の（３’）二重鎖形成領域を含む。特定の実施形態では、第１及び第２の相同性領域は、完全または不完全な二重鎖を形成し得る。したがって、特定の実施形態では、第１及び第２の二重鎖形成領域の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、互いに塩基対形成し得る。いくつかの実施形態では、二重鎖形成領域は、ＲＮＡ内の意図しない配列（例えば、非二重鎖形成領域配列）との塩基対形成が５０％未満（例えば、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満）であると予測される。いくつかの実施形態では、そのような二重鎖形成領域を前駆体ＲＮＡ鎖の両端に含み、かつグループＩイントロンフラグメントに隣接または近接して含むことで、グループＩイントロンフラグメントを互いに近接させ、スプライシング効率を増大させる。いくつかの実施形態では、二重鎖形成領域は、長さが３～１００ヌクレオチド（例えば、３～７５ヌクレオチド長、３～５０ヌクレオチド長、２０～５０ヌクレオチド長、３５～５０ヌクレオチド長、５～２５ヌクレオチド長、９～１９ヌクレオチド長）である。いくつかの実施形態では、二重鎖形成領域は、長さが約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、二重鎖形成領域は、長さが約９～約５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、二重鎖形成領域は、長さが約９～約１９ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、二重鎖形成領域は、長さが約２０～約４０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、二重鎖形成領域は、長さが約３０ヌクレオチドである。
特定の実施形態では、本明細書に提供するベクター、前駆体ＲＮＡ及び環状ＲＮＡは、第１の（５’）及び／または第２の（３’）スペーサーを含む。いくつかの実施形態では、３’グループＩイントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間にスペーサーを含むことにより、それらの領域における二次構造が、それらの相互作用を防ぐことで保存され、したがって、スプライシング効率が増大し得る。いくつかの実施形態では、第１（３’グループＩイントロンフラグメントとＩＲＥＳの間）及び第２（発現配列と５’グループＩイントロンフラグメントの間）のスペーサーは、追加の塩基対形成領域を含み、それらは、互いに塩基対形成するが、第１及び第２の二重鎖形成領域に対しては塩基対形成しないことが予測される。いくつかの実施形態では、そのようなスペーサーの塩基対形成は、グループＩイントロンフラグメントを互いに近接させ、スプライシング効率をさらに増大させる。さらに、いくつかの実施形態では、第１及び第２の二重鎖形成領域間の塩基対形成を、それとは別個に、第１及び第２のスペーサー間の塩基対形成と組み合わせることで、塩基対形成の隣接領域に挟まれたグループＩイントロンフラグメントを含有するスプライシングバブルの形成が促進される。典型的なスペーサーは、以下の質のうちの１つ以上を有する連続配列である：１）近位構造、例えば、ＩＲＥＳ、発現配列、またはイントロンとの干渉を回避すると予測される；２）少なくとも７ｎｔ長であり、１００ｎｔ以下であり；３）３’イントロンフラグメントの後であり、かつ近接している、及び／または５’イントロンフラグメントの前であり、かつ近接している位置にある；ならびに４）以下のうちの１つ以上を含有する：ａ）少なくとも５ｎｔ長の構造不定領域、ｂ）別のスペーサー等の遠位配列までが少なくとも５ｎｔ長の塩基対形成の領域、及びｃ）スペーサーの配列までの範囲に限定された少なくとも７ｎｔ長の構造化領域。スペーサーは、いくつかの領域を有し得、これには構造不定領域、塩基対形成領域、ヘアピン／構造化領域、及びその組み合わせが含まれる。ある実施形態では、スペーサーは、ＧＣ含量の高い構造化領域を有する。ある実施形態では、スペーサー内の領域は、同じスペーサー内の別の領域と塩基対形成する。ある実施形態では、スペーサー内の領域は、別のスペーサー内の領域と塩基対形成する。ある実施形態では、スペーサーは、１つ以上のヘアピン構造を含む。ある実施形態では、スペーサーは、４～１２ヌクレオチドのステム及び２～１０ヌクレオチドのループを有する１つ以上のヘアピン構造を含む。ある実施形態では、３’グループＩイントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間に追加のスペーサーがある。ある実施形態では、この追加のスペーサーは、ＩＲＥＳの構造化領域が３’グループＩイントロンフラグメントの折り畳みに干渉することを防止するか、またはこれが生じる程度を低減する。いくつかの実施形態では、５’スペーサー配列は、少なくとも長さが７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５または３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、５’スペーサー配列は、長さが１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５または３０ヌクレオチド以下である。いくつかの実施形態では、５’スペーサー配列は、長さが５～５０、１０～５０、２０～５０、２０～４０、及び／または２５～３５ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’スペーサー配列は、長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチドである。一実施形態では、５’スペーサー配列は、ポリＡ配列である。別の実施形態では、５’スペーサー配列は、ポリＡＣ配列である。一実施形態では、スペーサーは、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のポリＡＣ含量を含む。一実施形態では、スペーサーは、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のポリピリミジン（Ｃ／ＴまたはＣ／Ｕ）含量を含む。
特定の実施形態では、３’グループＩイントロンフラグメントは、３’スプライス部位ジヌクレオチド及び任意選択で少なくとも１ｎｔ長（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０ｎｔ長）、最大でもエクソンの長さの隣接するエクソン配列が含まれる天然グループＩイントロンの３’近位フラグメントと少なくとも７５％同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一）である連続配列である。典型的には、５’グループＩイントロンフラグメントは、５’スプライス部位ジヌクレオチド及び任意選択で少なくとも１ｎｔ長（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０ｎｔ長）、最大でもエクソンの長さの隣接するエクソン配列が含まれる天然グループＩイントロンの５’近位フラグメントと少なくとも７５％同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一）である連続配列である。Ｕｍｅｋａｇｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）によって記載されるように、３’グループＩイントロンフラグメント及び５’グループＩイントロンフラグメントの外部部分は環状化において除去され、本明細書で提供される環状ＲＮＡは、少なくとも１ｎｔ長の任意選択のエクソン配列によって形成される３’グループＩイントロンフラグメント及び少なくとも１ｎｔ長の任意選択のエクソン配列によって形成される５’グループＩイントロンフラグメントの部分のみを含むようになるが、これはそのような配列が非環状化前駆体ＲＮＡに存在する場合である。環状ＲＮＡによって保持される３’グループＩイントロンフラグメントの一部は、本明細書では、スプライシング後３’グループＩイントロンフラグメントと称する。環状ＲＮＡによって保持される５’グループＩイントロンフラグメントの一部は、本明細書では、スプライシング後５’グループＩイントロンフラグメントと称する。
特定の実施形態では、本明細書に提供するベクター、前駆体ＲＮＡ及び環状ＲＮＡは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。ＩＲＥＳを含めることにより、環状ＲＮＡからの１つ以上のオープンリーディングフレーム（例えば、発現配列を形成するオープンリーディングフレーム）の翻訳が可能になる。ＩＲＥＳエレメントは、真核生物のリボソーム翻訳開始複合体を引き付け、翻訳開始を促進する。例えば、Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：４４８５－４４９０、Ｇｕｒｔｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９９６）２２９：２９５－２９８、Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）２０：１０２－１１０、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６） ２１ ：３９９－４０２、及びＭｏｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９７ ２２ １５０－１６１）を参照されたい。
多数のＩＲＥＳ配列が利用可能であり、多種多様なウイルスに由来する配列、例えば、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＵＴＲ等のピコルナウイルスのリーダー配列（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８９）６３：１６５１－１６６０）、ポリオリーダー配列、Ａ型肝炎ウイルスリーダー、Ｃ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、ヒトライノウイルス２型ＩＲＥＳ（Ｄｏｂｒｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００３）１００（２５）：１５１２５－１５１３０）、口蹄疫ウイルスからのＩＲＥＳエレメント（Ｒａｍｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（１９９６）２４：２６９７－２７００）、ジアルジアウイルスＩＲＥＳ（Ｇａｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００４）２７９（５）：３３８９－３３９７）等に由来する配列が含まれる。
いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、タウラ症候群ウイルス、トリアトーマウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、シミアンウイルス４０、ヒアリ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ）ウイルス１、ムギクビレアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉ）ウイルス、細網内皮症ウイルス、ヒトポリオウイルス１、チャバネアオカメムシ（Ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ）腸ウイルス、カシミールハチウイルス、ヒトライノウイルス２、ホマロディスカ・コアグラタ（Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ ｃｏａｇｕｌａｔａ）ウイルス－１、ヒト免疫不全ウイルス１型、ヒメトビＰウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ＧＢ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒトエンテロウイルス７１、ウマ鼻炎ウイルス、ウスジロエダシャク（Ｅｃｔｒｏｐｉｓ ｏｂｌｉｑｕａ）ピコルナ様ウイルス、脳心筋炎ウイルス、ショウジョウバエＣウイルス、ヒトコクサッキーウイルスＢ３、アブラナ科トバモウイルス、コオロギ麻痺ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス１、黒色女王蜂児ウイルス、アブラムシ致死麻痺ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、急性ミツバチ麻痺ウイルス、ハイビスカス退緑輪点ウイルス、古典的ブタ熱ウイルス、ヒトＦＧＦ２、ヒトＳＦＴＰＡ１、ヒトＡＭＬ１／ＲＵＮＸ１、ショウジョウバエアンテナペディア、ヒトＡＱＰ４、ヒトＡＴ１Ｒ、ヒトＢＡＧ－１、ヒトＢＣＬ２、ヒトＢｉＰ、ヒトｃ－ＩＡＰｌ、ヒトｃ－ｍｙｃ、ヒトｅＩＦ４Ｇ、マウスＮＤＳＴ４Ｌ、ヒトＬＥＦ１、マウスＨＩＦ１アルファ、ヒトｎ．ｍｙｃ、マウスＧｔｘ、ヒトｐ２７ｋｉｐｌ、ヒトＰＤＧＦ２／ｃ－ｓｉｓ、ヒトｐ５３、ヒトＰｉｍ－１、マウスＲｂｍ３、ショウジョウバエ リーパー（ｒｅａｐｅｒ）、イヌ スキャンパー（Ｓｃａｍｐｅｒ）、ショウジョウバエＵｂｘ、ヒトＵＮＲ、マウスＵｔｒＡ、ヒトＶＥＧＦ－Ａ、ヒトＸＩＡＰ、ショウジョウバエ ヘアレス（ｈａｉｒｌｅｓｓ）、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＦＩＩＤ、出芽酵母ＹＡＰ１、タバコエッチウイルス、カブクリンクルウイルス、ＥＭＣＶ－Ａ、ＥＭＣＶ－Ｂ、ＥＭＣＶ－Ｂｆ、ＥＭＣＶ－Ｃｆ、ＥＭＣＶ ｐＥＣ９、ピコビルナウイルス、ＨＣＶ ＱＣ６４、ヒトコサウイルス Ｅ／Ｄ、ヒトコサウイルスＦ、ヒトコサウイルスＪＭＹ、ライノウイルスＮＡＴ００１、ＨＲＶ１４、ＨＲＶ８９、ＨＲＶＣ－０２、ＨＲＶ－Ａ２１、サリウイルスＡ ＳＨ１、サリウイルスＦＨＢ、サリウイルスＮＧ－Ｊ１、ヒトパレコウイルス１、クロヒウイルスＢ、Ｙｃ－３、ロザウイルスＭ－７、シャンバウイルスＡ、パシウイルスＡ、パシウイルスＡ ２、エコーウイルスＥ１４、ヒトパレコウイルス５、アイチウイルス、Ａ型肝炎ウイルスＨＡ１６、フォピウイルス、ＣＶＡ１０、エンテロウイルスＣ、エンテロウイルスＤ、エンテロウイルスＪ、ヒトペギウイルス２、ＧＢＶ－Ｃ ＧＴ１１０、ＧＢＶ－Ｃ Ｋ１７３７、ＧＢＶ－Ｃ Ｉｏｗａ、ペギウイルスＡ １２２０、パシウイルスＡ ３、サペロウイルス、ロザウイルスＢ、バクンサウイルス、トレモウイルスＡ、ブタパシウイルス１、ＰＬＶ－ＣＨＮ、パシウイルスＡ、シシニウイルス、ヘパシウイルスＫ、ヘパシウイルスＡ、ＢＶＤＶ１、ボーダー病ウイルス、ＢＶＤＶ２、ＣＳＦＶ－ＰＫ１５Ｃ、ＳＦ５７３ジシストロウイルス、湖北ピコルナ様ウイルス、ＣＲＰＶ、サリウイルスＡ ＢＮ５、サリウイルスＡ ＢＮ２、サリウイルスＡ ０２３９４、サリウイルスＡ ＧＵＴ、サリウイルスＡ ＣＨ、サリウイルスＡ ＳＺ１、サリウイルスＦＨＢ、ＣＶＢ３、ＣＶＢ１、エコーウイルス７、ＣＶＢ５、ＥＶＡ７１、ＣＶＡ３、ＣＶＡ１２、ＥＶ２４、またはｅＩＦ４Ｇに対するアプタマーのＩＲＥＳの配列である。
いくつかの実施形態では、本明細書におけるポリヌクレオチドは、発現配列を含む。いくつかの実施形態では、発現配列は、治療用タンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、２つ以上のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、バイシストロン性ＲＮＡである。２つ以上のポリペプチドをコードする配列は、リボソームスキッピングエレメント、またはプロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列によって区切られ得る。特定の実施形態では、リボソームスキッピングエレメントは、トセア・アシグナウイルス２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）、ブタテシオウイルス－１ ２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａペプチド（Ｅ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａペプチド（ＢｍＣＰＶ ２Ａ）、またはＢ．ｍｏｒｉ軟化病ウイルス２Ａペプチド（ＢｍＩＦＶ ２Ａ）をコードする。
特定の実施形態では、本明細書に提供するベクターは、３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、ヒトベータグロビン、ヒトアルファグロビンクセノプスベータグロビン、クセノプスアルファグロビン、ヒトプロラクチン、ヒトＧＡＰ－４３、ヒトｅＥＦｌａｌ、ヒトＴａｕ、ヒトＴＮＦα、デングウイルス、ハンタウイルス小ｍＲＮＡ、ブニヤウイルス小ｍＲＮＡ、カブ黄色モザイクウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、風疹ウイルス、タバコモザイクウイルス、ヒトＩＬ－８、ヒトアクチン、ヒトＧＡＰＤＨ、ヒトチューブリン、ハイビスカス退緑輪点ウイルス、ウッドチャック肝炎ウイルスｐ肝炎ウイルス翻訳後制御エレメント、シンドビスウイルス、カブクリンクルウイルス、タバコエッチングウイルス、またはベネズエラウマ脳炎ウイルスに由来する。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供するベクターは、５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、ヒトベータグロビン、アフリカツメガエルベータグロビン、ヒトアルファグロビン、アフリカツメガエルアルファグロビン、ルベラウイルス、タバコモザイクウイルス、マウスＧｔｘ、デングウイルス、熱ショックタンパク質７０ｋＤａタンパク質１Ａ、タバコアルコールデヒドロゲナーゼ、タバコエッチングウイルス、カブクリンクルウイルス、またはアデノウイルス三者リーダーに由来する。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供するベクターは、３’及び／または５’のグループＩイントロンフラグメントの外部のポリＡ領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ領域は、少なくとも１５、３０、または６０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、一方または両方のポリＡ領域は、１５～５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、一方または両方のポリＡ領域は、２０～２５ヌクレオチド長である。ポリＡ配列は、環状化の際に除去される。したがって、固体表面（例えば、樹脂）にコンジュゲートされるデオキシチミンオリゴヌクレオチド（オリゴ（ｄＴ））等の、ポリＡ配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、環状ＲＮＡをその前駆体ＲＮＡから分離するために使用され得る。他の配列もまた、３’グループＩイントロンフラグメントに対して５’または５’グループＩイントロンフラグメントに対して３’に配置され得、相補性配列が、環状ＲＮＡ精製のために同様に使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供するＤＮＡ（例えば、ベクター）、直鎖ＲＮＡ（例えば、前駆体ＲＮＡ）、及び／または環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、長さが３００～１００００、４００～９０００、５００～８０００、６００～７０００、７００～６０００、８００～５０００、９００～５０００、１０００～５０００、１１００～５０００、１２００～５０００、１３００～５０００、１４００～５０００、及び／または１５００～５０００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、長さが少なくとも３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔ、６００ｎｔ、７００ｎｔ、８００ｎｔ、９００ｎｔ、１０００ｎｔ、１１００ｎｔ、１２００ｎｔ、１３００ｎｔ、１４００ｎｔ、１５００ｎｔ、２０００ｎｔ、２５００ｎｔ、３０００ｎｔ、３５００ｎｔ、４０００ｎｔ、４５００ｎｔ、または５０００ｎｔである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、長さが３０００ｎｔ、３５００ｎｔ、４０００ｎｔ、４５００ｎｔ、５０００ｎｔ、６０００ｎｔ、７０００ｎｔ、８０００ｎｔ、９０００ｎｔ、または１００００ｎｔ以下である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供するＤＮＡ、直鎖ＲＮＡ、及び／または環状ＲＮＡポリヌクレオチドの長さは、約３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔ、６００ｎｔ、７００ｎｔ、８００ｎｔ、９００ｎｔ、１０００ｎｔ、１１００ｎｔ、１２００ｎｔ、１３００ｎｔ、１４００ｎｔ、１５００ｎｔ、２０００ｎｔ、２５００ｎｔ、３０００ｎｔ、３５００ｎｔ、４０００ｎｔ、４５００ｎｔ、５０００ｎｔ、６０００ｎｔ、７０００ｎｔ、８０００ｎｔ、９０００ｎｔ、または１００００ｎｔである。
いくつかの実施形態では、本明細書において、ベクターを提供する。特定の実施形態では、ベクターは、ａ）５’相同性領域、ｂ）３’グループＩイントロンフラグメント、ｃ）任意選択で、第１のスペーサー配列、ｄ）ＩＲＥＳ、ｅ）発現配列、ｆ）任意選択で、第２のスペーサー配列、ｇ）５’グループＩイントロンフラグメント、及びｈ）３’相同性領域を、この順序で含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、５’相同性領域の上流に転写プロモーターを含む。特定の実施形態では、前駆体ＲＮＡは、ａ）ポリＡ配列、ｂ）外部スペーサー、ｃ）３’グループＩイントロンフラグメント、ｄ）二重鎖形成領域、ｅ）内部スペーサー、ｆ）ＩＲＥＳ、ｇ）発現配列、ｈ）終止コドンカセット、ｉ）任意選択で、内部スペーサー、ｊ）ｄの二重鎖形成領域と二重鎖を形成することのできる二重鎖形成領域、ｋ）５’グループＩイントロンフラグメント、ｌ）外部スペーサー、及びｍ）ポリＡ配列を、この順序で含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において、前駆体ＲＮＡを提供する。特定の実施形態では、前駆体ＲＮＡは、本明細書に提供するベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって産生される直鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前駆体ＲＮＡは、ａ）５’相同性領域、ｂ）３’グループＩイントロンフラグメント、ｃ）任意選択で、第１のスペーサー配列、ｄ）ＩＲＥＳ、ｅ）発現配列、ｆ）任意選択で、第２のスペーサー配列、ｇ）５’グループＩイントロンフラグメント、及びｈ）３’相同性領域を、この順序で含む。前駆体ＲＮＡは、未修飾であっても、部分的に修飾されても、または完全に修飾されてもよい。
特定の実施形態では、本明細書において、環状ＲＮＡを提供する。特定の実施形態では、環状ＲＮＡは、本明細書に提供するベクターによって産生される環状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、本明細書に提供する前駆体ＲＮＡの環状化によって生成される環状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、ａ）第１のスペーサー配列、ｂ）ＩＲＥＳ、ｃ）発現配列、及びｄ）第２のスペーサー配列を、この配列で含む。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡはさらに、３’スプライス部位の３’である３’グループＩイントロンフラグメントの部分を含む。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡはさらに、５’スプライス部位の５’である５’グループＩイントロンフラグメントの部分を含む。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、サイズが少なくとも５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００または４５００ヌクレオチドである。環状ＲＮＡは、未修飾であっても、部分的に修飾されても、または完全に修飾されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡは、同じ発現配列を含むｍＲＮＡよりも機能安定性が高い。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡは、同じ発現配列、５ｍｏＵ修飾、最適化ＵＴＲ、キャップ、及び／またはポリＡテールを含むｍＲＮＡよりも機能安定性が高い。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、機能的半減期が少なくとも５時間、１０時間、１５時間、２０時間、３０時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間または８０時間である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、機能的半減期が５～８０、１０～７０、１５～６０、及び／または２０～５０時間である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、同じタンパク質をコードする同等の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドよりも機能的半減期が長い（例えば、少なくとも１．５倍長い、少なくとも２倍長い）。いくつかの実施形態では、機能的半減期は、機能性タンパク質合成の検出を介して評価することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、半減期が少なくとも５時間、１０時間、１５時間、２０時間、３０時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間または８０時間である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、半減期が５～８０、１０～７０、１５～６０、及び／または２０～５０時間である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、同じタンパク質をコードする同等の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドよりも半減期が長い（例えば、少なくとも１．５倍長い、少なくとも２倍長い）。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチド、またはその医薬組成物は、ヒト細胞における機能的半減期が既定の閾値と同程度であるかまたはそれ以上である。いくつかの実施形態では機能的半減期は、機能性タンパク質アッセイによって決定される。例えば、いくつかの実施形態では、機能的半減期は、ｉｎ ｖｉｔｒｏルシフェラーゼアッセイによって決定され、その場合、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）の活性を、環状ＲＮＡポリヌクレオチドを発現するヒト細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）の培地において１、２、３、４、５、６、７、または１４日にわたって１、２、６、１２、または２４時間毎に測定する。他の実施形態では、機能的半減期は、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイによって決定され、その場合、環状ＲＮＡポリヌクレオチドの発現配列によってコードされるタンパク質のレベルを、患者の血清または組織試料において１、２、３、４、５、６、７、または１４日にわたって１、２、６、１２、または２４時間毎に測定する。いくつかの実施形態では、既定の閾値は、環状ＲＮＡポリヌクレオチドと同じ発現配列を含む参照直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの機能的半減期である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡは、同等の直鎖ｍＲＮＡよりも発現の程度が高い、例えば、細胞へのＲＮＡ投与２４時間後の発現の程度が高い場合がある。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡは、同じ発現配列、５ｍｏＵ修飾、最適化ＵＴＲ、キャップ、及び／またはポリＡテールを含むｍＲＮＡよりも発現の程度が高い。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡは、生物の免疫系または特定の種類の免疫細胞に曝露された場合、同等のｍＲＮＡよりも免疫原性が低い場合がある。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡは、生物の免疫系または特定の種類の免疫細胞に曝露された場合、サイトカインの産生の調節に関連している。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡは、生物の免疫系または特定の種類の免疫細胞に曝露された場合、同じ発現配列を含むｍＲＮＡと比較して、ＩＦＮ－β１、ＲＩＧ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮγ、及び／またはＴＮＦαの産生の低下に関連している。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡは、生物の免疫系または特定の種類の免疫細胞に曝露された場合、同じ発現配列を含むｍＲＮＡと比較して、より少ないＩＦＮ－β１、ＲＩＧ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮγ、及び／またはＴＮＦαの転写産物誘導に関連している。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡは、同じ発現配列を含むｍＲＮＡよりも免疫原性が低い。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡは、同じ発現配列、５ｍｏＵ修飾、最適化ＵＴＲ、キャップ、及び／またはポリＡテールを含むｍＲＮＡよりも免疫原性が低い。
特定の実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡは、そのまま細胞へとトランスフェクトすることができ、またＤＮＡベクターの形でトランスフェクトされて細胞内で転写されることもできる。トランスフェクトされたＤＮＡベクターからの環状ＲＮＡの転写は、追加のポリメラーゼまたは細胞にトランスフェクトされた核酸によってコードされるポリメラーゼを介するか、または好ましくは内因性ポリメラーゼを介することができる。
特定の実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、修飾ＲＮＡヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、ｍ５Ｃ（５－メチルシチジン）である。別の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、ｍ５Ｕ（５－メチルウリジン）である。別の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、ｍ６Ａ（Ｎ６－メチルアデノシン）である。別の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、ｓ２Ｕ（２－チオウリジン）である。別の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ψ（シュードウリジン）である。別の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｕｍ（２′－Ｏ－メチルウリジン）である。他の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、ｍ１Ａ（１－メチルアデノシン）；ｍ２Ａ（２－メチルアデノシン）；Ａｍ（２’－Ｏ－メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６－イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ６Ａ（Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルアデノシン（ホスファート））；Ｉ（イノシン）；ｍ１Ｉ（１－メチルイノシン）；ｍ１Ｉｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン）；ｍ３Ｃ（３－メチルシチジン）；Ｃｍ（２’－Ｏ－メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２－チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４－アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５－ホルミルシチジン）；ｍ５Ｃｍ（５，２′－Ｏ－ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチルシチジン）；ｋ２Ｃ（リシジン）；ｍ１Ｇ（１－メチルグアノシン）；ｍ２Ｇ（Ｎ２－メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７－メチルグアノシン）；Ｇｍ（２′－Ｏ－メチルグアノシン）；ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）；ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルグアノシン（ホスファート））；ｙＷ（ワイブトシン）；ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ＊（未修飾ヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ワイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルワイオシン）；Ｑ（ケウオシン）；ｏＱ（エポキシケウオシン）；ｇａｌＱ（ガラクトシル－ケウオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル－ケウオシン）；ｐｒｅＱ０（７－シアノ－７－デアザグアノシン）；ｐｒｅＱ１（７－アミノメチル－７－デアザグアノシン）；Ｇ＋（アルカエオシン）；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン）；ｓ４Ｕ（４－チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５－メチル－２－チオウリジン）；ｓ２Ｕｍ（２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５－ヒドロキシウリジン）；ｍｏ５Ｕ（５－メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））；ｍｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５－メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕｍ（５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン）；ｎｍ５Ｓ２Ｕ（５－アミノメチル－２－チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５－メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５－カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５－カルバモイルメチル－２′－Ｏ－メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕｍ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２′－Ｏ－メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン）；ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン）；Ｉｍ（２’－Ｏ－メチルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４－メチルシチジン）；ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン）；ｈｍ５Ｃ（５－ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３－メチルウリジン）；ｃｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン）；ｍ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ－２’－トリメチルアデノシン）；ｍ２，７Ｇ（Ｎ２，７－ジメチルグアノシン）；ｍ２，２，７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５－メチルジヒドロウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）；ｍ１Ａｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン）；τｍ５Ｕ（５－タウリノメチルウリジン）；τｍ５ｓ２Ｕ（５－タウリノメチル－２－チオウリジン））；ｉｍＧ－１４（４－デメチルワイオシン）；ｉｍＧ２（イソワイオシン）；またはａｃ６Ａ（Ｎ６－アセチルアデノシン）である。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドには、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、５－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、２－メトキシ－アデニン、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンの群から選択される化合物が含まれ得る。別の実施形態では、修飾は、５－メチルシトシン、シュードウリジン及び１－メチルシュードウリジンからなる群から独立して選択される。
いくつかの実施形態では、修飾リボヌクレオシドには、５－メチルシチジン、５－メトキシウリジン、１－メチル－シュードウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、及び／またはシュードウリジンが含まれる。いくつかの実施形態では、そのような修飾ヌクレオシドは、さらなる安定性、及び免疫活性化に対する耐性を提供する。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドンが最適化されている場合がある。コドンが最適化されている配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンが、ポリペプチドの発現、安定性及び／または活性を増大させるために、置換されている配列であり得る。コドン最適化に影響を与える因子には、（ｉ）２つ以上の生物もしくは遺伝子間のコドンバイアスまたは合成により構築されたバイアステーブルの変動、（ｉｉ）生物、遺伝子、または遺伝子セット内のコドンバイアスの程度の変動、（ｉｉｉ）コンテクストが含まれるコドンの系統的変動、（ｉｖ）コドンのデコードｔＲＮＡに従ったそれらコドンの変動、（ｖ）トリプレットの全体または１つの位置のいずれかでの、ＧＣ％に従ったコドンの変動、（ｖｉ）参照配列、例えば、天然に存在する配列に対する類似度の変動、（ｖｉｉ）コドン頻度カットオフの変動、（ｖｉｉｉ）ＤＮＡ配列から転写されたｍＲＮＡの構造特性、（ｉｘ）コドン置換セットの設計の基となるＤＮＡ配列の機能に関する事前知識、及び／または（ｘ）各アミノ酸についてのコドンセットの系統的変動のうちの１つ以上が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、コドン最適化ポリヌクレオチドは、リボザイム衝突を最小化し得る、及び／または発現配列とＩＲＥＳ間の構造的干渉を制限し得る。
特定の実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡは、細胞内部で生成される。いくつかの実施形態では、前駆体ＲＮＡは、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼによって細胞質中で、または宿主ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって核内で、ＤＮＡテンプレートを使用して（例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に提供するベクターを使用して）転写され、次に環状化される。
特定の実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡは、環状ＲＮＡ分子によってコードされるポリペプチドが動物内部で発現されるように、動物（例えば、ヒト）に注射される。
３．ペイロード
いくつかの実施形態では、発現配列は、治療用タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、以下の表に列挙されるタンパク質から選択される。
Figure 2023525270000036
Figure 2023525270000037
Figure 2023525270000038
Figure 2023525270000039
Figure 2023525270000040
Figure 2023525270000041
Figure 2023525270000042
Figure 2023525270000043
Figure 2023525270000044
いくつかの実施形態では、発現配列は、治療用タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、発現配列は、サイトカイン、例えば、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－ベータ、ＩＬ－４、もしくはＩＬ－３５、またはその機能的フラグメントをコードする。いくつかの実施形態では、発現配列は、免疫チェックポイント阻害剤をコードする。いくつかの実施形態では、発現配列は、アゴニスト（例えば、ＴＮＦＲファミリーメンバー、例えば、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＬＩＧＨＴ、またはＣＤ７０）をコードする。いくつかの実施形態では、発現配列は、キメラ抗原受容体をコードする。いくつかの実施形態では、発現配列は、抑制性受容体アゴニスト（例えば、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ガレクチン－９、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７Ｈ４、またはＭＨＣＩＩ）または抑制性受容体（例えば、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、またはＴＩＭ３）をコードする。いくつかの実施形態では、発現配列は、抑制性受容体アンタゴニストをコードする。いくつかの実施形態では、発現配列は、１つ以上のＴＣＲ鎖（アルファ鎖及びベータ鎖またはガンマ鎖及びデルタ鎖）をコードする。いくつかの実施形態では、発現配列は、分泌Ｔ細胞または免疫細胞エンゲージャー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ１３７、またはＣＤ２８及び腫瘍発現タンパク質、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＢＣＭＡ等を標的とするＢｉＴＥ等の二重特異性抗体）をコードする。いくつかの実施形態では、発現配列は、転写因子（例えば、ＦＯＸＰ３、ＨＥＬＩＯＳ、ＴＯＸ１、またはＴＯＸ２）をコードする。いくつかの実施形態では、発現配列は、免疫抑制性酵素（例えば、ＩＤＯまたはＣＤ３９／ＣＤ７３）をコードする。いくつかの実施形態では、発現配列は、ＧｖＨＤ（例えば、抗ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲ－Ｔｒｅｇ）をコードする。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つ以上の遺伝子によってコードされるサブユニットで構成されるタンパク質をコードする。例えば、タンパク質は、タンパク質の各鎖またはサブユニットが別個の遺伝子によってコードされているヘテロダイマーであり得る。２つ以上のｃｉｒｃＲＮＡ分子が輸送ビヒクルにて送達され、各ｃｉｒｃＲＮＡがタンパク質の別個のサブユニットをコードすることが可能である。あるいは、単一のｃｉｒｃＲＮＡを、２つ以上のサブユニットをコードするよう操作してよい。特定の実施形態では、個々のサブユニットをコードする別個のｃｉｒｃＲＮＡ分子は、別個の輸送ビヒクルにて投与され得る。
３．１ サイトカイン
ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２７ベータ、ＩＦＮガンマ、及び／またはＴＧＦベータ１の説明及び／またはアミノ酸配列は、本明細書及びｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇデータベースにおいて受託番号：Ｐ６０５６８（ＩＬ－２）、Ｐ２９４５９（ＩＬ－１２Ａ）、Ｐ２９４６０（ＩＬ－１２Ｂ）、Ｐ１３２３２（ＩＬ－７）、Ｐ２２３０１（ＩＬ－１０）、Ｐ４０９３３（ＩＬ－１５）、Ｑ１４１１６（ＩＬ－１８）、Ｑ１４２１３（ＩＬ－２７ベータ）、Ｐ０１５７９（ＩＦＮガンマ）、及び／またはＰ０１１３７（ＴＧＦｂｅｔａ１）で提供される。
３．２ ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、またはニボルマブである。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、Ｗ０２００６／１２１１６８に記載されている。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、Ｗ０２００９／１１４３３５に記載されている。いくつかの実施形態では、ピジリズマブは、ＷＯ２００９／１０１６１１に記載されている。追加の抗ＰＤ１抗体は、米国特許第８，６０９，０８９号、ＵＳ２０１００２８３３０、ＵＳ２０１２０１１４６４９、ＷＯ２０１０／０２７８２７及びＷＯ２０１１／０６６３４２に記載されている。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、またはＣＫ－３０１である。
ＰＤ－１、及び／またはＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖及び軽鎖の説明及び／またはアミノ酸配列は、本明細書及びｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａデータベースにおいて受託番号：ＤＢ０９０３７（ペムブロリズマブ）、ＤＢ０９０３５（ニボルマブ）、ＤＢ１５３８３（ピジリズマブ）、ＤＢ１１５９５（アテゾリズマブ）、ＤＢ１１９４５（アベルマブ）、及びＤＢ１１７１４（デュルバルマブ）で提供される。
３．３ Ｔ細胞受容体
ＴＣＲは、国際免疫遺伝学（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ；ＩＭＧＴ）ＴＣＲ命名法、及びＴＣＲ配列のＩＭＧＴ公共データベースへのリンクを使用して表される。ネイティブアルファ－ベータヘテロ二量体ＴＣＲは、アルファ鎖及びベータ鎖を有する。概して、各鎖は、可変領域、連結領域及び定常領域を含み得、ベータ鎖はまた通常、可変領域と連結領域との間に短い多様性領域を含有するが、この多様性領域はしばしば、連結領域の一部と見なされる。各可変領域は、フレームワーク配列に埋め込まれた３つのＣＤＲ（相補性決定領域）を含み得、１つはＣＤＲ３と名づけられた超可変領域である。数種のアルファ鎖可変（Ｖα）領域及び数種のベータ鎖可変（Ｖβ）領域があり、それらのフレームワーク、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２の配列によって、また部分的に定義されるＣＤＲ３配列によって区別される。Ｖαタイプは、ＩＭＧＴ命名法で独自のＴＲＡＶ番号によって言及される。したがって、「ＴＲＡＶ２１」は、独自のフレームワーク配列ならびにＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列、ならびにＴＣＲ間で保存されたアミノ酸配列によって部分的に定義されるがＴＣＲ間で変動するアミノ酸配列も含まれるＣＤＲ３配列を有する、ＴＣＲ Ｖα領域を定義する。同じように、「ＴＲＢＶ５－１」は、独自のフレームワーク配列ならびにＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列を有するが、部分的にのみ定義されたＣＤＲ３配列を有するＴＣＲ Ｖβ領域を定義する。
ＴＣＲの連結領域は、同様に、独自のＩＭＧＴ ＴＲＡＪ及びＴＲＢＪ命名法によって定義され、定常領域は、ＩＭＧＴ ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ命名法によって定義される。
ベータ鎖多様性領域は、ＩＭＧＴ命名法では、略語ＴＲＢＤと称され、述べたように、連結したＴＲＢＤ／ＴＲＢＪ領域はしばしば、一緒に連結領域と見なされる。
ＩＭＧＴ命名法によって定義される独自の配列は広く知られており、ＴＣＲの分野で働く人々にはアクセス可能である。例えば、それらは、ＩＭＧＴ公共データベースで見ることができる。“Ｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ”，（２００１）ＬｅＦｒａｎｃ ａｎｄ ＬｅＦｒａｎｃ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ ０－１２－４４１３５２－８もまた、ＩＭＧＴ命名法によって定義された配列を開示しているが、その公開日及び結果として生じるタイムラグのため、その中の情報は、ＩＭＧＴデータベースへの参照によって確認する必要がある。
ネイティブＴＣＲは、ヘテロ二量体αβまたはγδ形態で存在する。しかしながら、ααまたはββホモ二量体からなる組換えＴＣＲは、ペプチドＭＨＣ分子に結合することが以前に示されている。したがって、本発明のＴＣＲは、ヘテロ二量体αβＴＣＲであり得、またはααもしくはββホモ二量体ＴＣＲであり得る。
養子療法での使用の場合、αβヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、細胞質及び膜貫通ドメインの両方を有する全長鎖としてトランスフェクトされ得る。特定の実施形態では、本発明のＴＣＲは、例えば、ＷＯ２００６／０００８３０に記載されているように、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合を有し得る。
本発明のＴＣＲ、特にアルファ－ベータヘテロ二量体ＴＣＲは、アルファ鎖ＴＲＡＣ定常ドメイン配列及び／またはベータ鎖ＴＲＢＣ１もしくはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列を含み得る。アルファ鎖及びベータ鎖定常ドメイン配列は、ＴＲＡＣのエクソン２のＣｙｓ４とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のエクソン２のＣｙｓ２との間のネイティブジスルフィド結合を欠失させるよう切断または置換によって修飾され得る。アルファ及び／またはベータ鎖定常ドメイン配列（複数可）はまた、ＴＲＡＣのＴｈｒ ４８及びＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のＳｅｒ５７のシステイン残基の置換によって修飾され得、前記システインが、ＴＣＲのアルファ及びベータ定常ドメイン間のジスルフィド結合を形成する。
結合親和性（平衡定数ＫＤに反比例する）及び結合半減期（Ｔ１／２として表される）は、任意の適切な方法によって決定することができる。ＴＣＲの親和性を２倍にすると、ＫＤが半分になることが理解される。Ｔ１／２は、ｌｎ２を解離速度（ｋｏｆｆ）で除算したものとして計算される。そのため、Ｔ１／２を２倍にすると、ｋｏｆｆが半分になる。ＴＣＲのＫＤ及びｋｏｆｆ値は通常、ＴＣＲの可溶性形態、すなわち、切断されて細胞質及び膜貫通ドメインの残基が除去される形態について測定される。したがって、所与のＴＣＲは、そのＴＣＲの可溶性形態が前記特徴を有する場合、親ＴＣＲに対して結合親和性、及び／または結合半減期が改善されていることを理解されたい。好ましくは、所与のＴＣＲの結合親和性または結合半減期は、同じアッセイプロトコルを使用して数回、例えば、３回またはそれ以上測定され、その結果の平均が取得される。
本発明のＴＣＲには養子療法における有用性があるため、本発明には、天然には存在しない、及び／または精製された、及び／または操作された細胞、特に、本発明のＴＣＲを提示するＴ細胞を含む。本発明のＴＣＲをコードする核酸（ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ等）でのＴ細胞のトランスフェクションに好適な方法が多数ある（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：６１１６－６１３１を参照されたい。）。本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞は、がん（膵臓及び肝臓のもの等）の養子療法に基づく処置での使用に好適である。当業者に知られているように、養子療法が行うことができる好適な方法が多数ある（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ８（４）：２９９－３０８を参照されたい。）。
当該技術分野でよく知られているように、本発明のＴＣＲは、トランスフェクトされた細胞によって発現される場合、翻訳後修飾を受け得る。グリコシル化は、そのような修飾の１つであり、ＴＣＲ鎖における定義されたアミノ酸に対するオリゴ糖部分の共有結合を含み得る。例えば、アスパラギン残基、またはセリン／トレオニン残基は、オリゴ糖結合のためのよく知られた位置である。特定のタンパク質のグリコシル化状態は、所定の酵素のタンパク質配列、タンパク質コンフォメーション及び利用可能性を含め、多数の要因に依存する。さらに、グリコシル化状態（すなわち、オリゴ糖の種類、共有結合及び総結合数）は、タンパク質機能に影響を及ぼし得る。したがって、組換えタンパク質を生産する場合、グリコシル化を制御することが望ましいことが多い。トランスフェクトされたＴＣＲのグリコシル化は、トランスフェクトされた遺伝子の変異によって制御され得る（Ｋｕｂａｌｌ Ｊ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０６（２）：４６３－４７５）。そのような変異もまた本発明に包含される。
ＴＣＲは、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ａ１３、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７、ＧＡＧＥ－８、ＢＡＧＥ－１、ＲＡＧＥ－１、ＬＢ３３／ＭＵＭ－１、ＰＲＡＭＥ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ－Ｘｐ２（ＭＡＧＥ－Ｂ２）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ３（ＭＡＧＥ－Ｂ３）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ４（ＡＧＥ－Ｂ４）、チロシナーゼ、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、Ｍｅｌａｎ－Ａ、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－２（ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０）、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－４、ＳＳＸ－５、ＳＣＰ－１、ＣＴ－７、アルファ－アクチニン－４、Ｂｃｒ－Ａｂｌ融合タンパク質、Ｃａｓｐ－８、ベータ－カテニン、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｏａ－１、ｄｅｋ－ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦ２、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１融合タンパク質、ＬＤＬＲ－フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ１１、ｈｓｐ７０－２、ＫＩＡＡＯ２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ－２、及び３、ｎｅｏ－ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ－９、ｐｍｌ－ＲＡＲａ融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ－ｒａｓ、Ｎ－ｒａｓ、トリオースホスファートイソメラス、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ－Ｋ－ｍｅｌ、Ｌａｇｅ－１、Ｍａｇｅ－Ｃ２、ＮＡ－８８、Ｌａｇｅ－２、ＳＰ１７、及びＴＲＰ２－Ｉｎｔ２、（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ｐ１５（５８）、ＣＥＡ、ＮＹ－ＥＳＯ（ＬＡＧＥ）、ＳＣＰ－１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ－４０、ｐ５３、Ｈ－Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２－４、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ，．ベータ．－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、テロメラーゼ、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３（ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ＼１７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０（Ｍａｃ－２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及びＴＰＳの群における抗原に特異的であり得る。
３．４ 転写因子
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、ホメオスタシスの維持、炎症反応の程度と持続期間の制御、及び自己免疫性及びアレルギー性反応の防止において重要である。
一般に、Ｔｒｅｇは、免疫応答の抑制に主に関与し、過剰な反応を防ぐよう免疫系の「セルフチェック」として部分的に機能すると考えられている。特に、Ｔｒｅｇは、自己抗原、無害な物質、例えば、花粉または食品に対する寛容を維持し、自己免疫性疾患を阻止することに関与する。
Ｔｒｅｇは、限定されないが、腸、皮膚、肺、及び肝臓を含めて、全身にわたって見られる。さらに、Ｔｒｅｇ細胞は、脾臓、リンパ節、さらには脂肪組織等の、外部環境に直接曝露されることのない身体の特定のコンパートメントにも見られ得る。これらのＴｒｅｇ細胞集団の各々は、１つ以上の特有の特徴を有することが知られているかまたはそのように疑われており、追加の情報は、Ｌｅｈｔｉｍａｋｉ ａｎｄ Ｌａｈｅｓｍａａ，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅｉｒ ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ，２０１３，ＦＲＯＮＴＩＥＲＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬ．，４（２９４）：１－１０（その開示は、その全体が本明細書に組み込まれる）で見ることができる。
典型的には、Ｔｒｅｇは、適切な活性化及び発達のためにＴＧＦ－β及びＩＬ－２を必要とすることが知られている。豊富な量のＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）を発現するＴｒｅｇは、活性化Ｔ細胞によって産生されるＩＬ－２に依存する。Ｔｒｅｇは、いずれも強力な免疫抑制サイトカインであるＩＬ－１０及びＴＧＦ－βの両方を産生することが知られている。さらに、Ｔｒｅｇは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）がＴ細胞を刺激する能力を阻害することが知られている。ＡＰＣ阻害に提案されているメカニズムの１つは、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇによって発現されるＣＴＬＡ－４を介するものである。ＣＴＬＡ－４は、ＡＰＣ上のＢ７分子に結合して、Ｂ７の利用可能性を低下させる内部移行、及び免疫応答のための適切な共刺激の提供不能を引き起こすことによってこれらの分子をブロックするか、またはそれらを除去すると考えられている。Ｔｒｅｇの起源、分化及び機能に関するさらなる考察は、開示が本発明によりその全体が組み込まれるＤｈａｍｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｎｄ ｔｈｙｍｉｃ Ｆｏｘｐ３＋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｏｒｉｇｉｎ，ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，２０１３，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４（２５３）：１－１１で見ることができる。
ＦＯＸＰ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、及び／またはＨＥＬＩＯＳの説明及び／またはアミノ酸配列は、本明細書に及びｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇデータベースで受託番号：Ｑ９ＢＺＳ１（ＦＯＸＰ３）、Ｐ５１６９２（ＳＴＡＴ５ｂ）、及び／またはＱ９ＵＫＳ７（ＨＥＬＩＯＳ）で提供される。
Ｆｏｘｐ３
いくつかの実施形態では、転写因子は、フォークヘッドボックスＰ３転写因子（Ｆｏｘｐ３）である。Ｆｏｘｐ３は、Ｔｒｅｇの分化及び活性における重要な調節因子であることが示されている。事実、Ｆｏｘｐ３遺伝子における機能喪失型変異は、致死的なＩＰＥＸ症候群（免疫調節異常、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）をもたらすことが示されている。ＩＰＥＸの患者は、重度の自己免疫応答、持続性湿疹、及び大腸炎を患う。Ｆｏｘｐ３を発現する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、腸における炎症反応を制限する上で重要な役割を果たす（Ｊｏｓｅｆｏｗｉｃｚ，Ｓ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１２，４８２，３９５－Ｕ１５１０）。
ＳＴＡＴ
シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）タンパク質ファミリーのメンバーは、細胞の免疫、増殖、アポトーシス及び分化という多くの態様を媒介する細胞内転写因子である。それらは主に、膜受容体関連ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）によって活性化される。この経路の調節異常は、原発腫瘍において頻繁に観察され、血管新生の増加、腫瘍の生存の増加及び免疫抑制をもたらす。遺伝子ノックアウト研究により、ＳＴＡＴタンパク質が、免疫系の発達及び機能に関与し、免疫寛容及び腫瘍監視を維持する上での役割を果たすという証拠が得られた。
同定されている哺乳類ＳＴＡＴファミリーメンバーは、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５（ＳＴＡＴ５Ａ及びＳＴＡＴ５Ｂを含む）、及びＳＴＡＴＥの７種ある。
サイトカインまたは成長因子の細胞外結合は、受容体関連ヤヌスキナーゼの活性化を誘導し、これは、ＳＴＡＴタンパク質内の特定のチロシン残基をリン酸化してそれらのＳＨ２ドメインを介して二量体化を促進する。リン酸化二量体は次いで、インポーチンα／β三元複合体を介して核へ能動的に輸送される。元々、ＳＴＡＴタンパク質は、リン酸化が核内保持に必要とされると考えられていたことから、潜在的細胞質性転写因子として記載されていた。しかしながら、非リン酸化ＳＴＡＴタンパク質もまた、サイトゾルと核との間で往復し、遺伝子発現における役割を果たす。ＳＴＡＴは、核に到達した後、サイトカイン誘導性遺伝子のプロモーター領域にあるガンマ－活性化部位（ＧＡＳ）と呼ばれるコンセンサスＤＮＡ認識モチーフに結合し、転写を活性化する。ＳＴＡＴタンパク質は、核ホスファターゼによって脱リン酸化され得、これが、ＳＴＡＴの不活性化、及びその後のエクスポーチン－ＲａｎＧＴＰ複合体による核外への輸送をもたらす。
いくつかの実施形態では、本開示のＳＴＡＴタンパク質は、その発現レベルまたは活性を調節する修飾を含むＳＴＡＴタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、そのような修飾には、とりわけ、ＳＴＡＴの二量体化、ＳＴＡＴタンパク質のシグナル伝達パートナーへの結合、ＳＴＡＴタンパク質の局在化またはＳＴＡＴタンパク質の分解をもたらす変異が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＴＡＴタンパク質は、構成的に活性である。いくつかの実施形態では、本開示のＳＴＡＴタンパク質は、構成的二量体化により、構成的に活性である。いくつかの実施形態では、本開示のＳＴＡＴタンパク質は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＯｎｉｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｊｕｌｙ １９９８ ｖｏｌ．１８ ｎｏ．７ ３８７１－３８７９に記載されているように構成的リン酸化により、構成的に活性である。
３．５ キメラ抗原受容体
キメラ抗原受容体（ＣＡＲまたはＣＡＲ－Ｔ）は、遺伝子操作された受容体である。これらの操作された受容体は、本明細書に記載するような環状ＲＮＡを介してＴ細胞等の免疫細胞に挿入され、またそれらにより発現され得る。ＣＡＲを使用すると、単一の受容体を、特定の抗原を認識し、かつ、その抗原に結合した際に、免疫細胞を活性化してその抗原を持つ細胞を攻撃して破壊するようにプログラムすることができる。これらの抗原が腫瘍細胞上に存在する場合、ＣＡＲを発現する免疫細胞は、腫瘍細胞を標的とし、殺傷し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＡＲは、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する抗原結合分子、（ｉｉ）ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメイン、ならびに（ｉｉｉ）活性化ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本開示に従ったＣＡＲの配向は、抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ等）を共刺激ドメイン及び活性化ドメインとタンデムで含む。共刺激ドメインは、細胞外部分、膜貫通部分、及び細胞内部分のうちの１つ以上を含み得る。他の実施形態では、複数の共刺激ドメインがタンデムで利用され得る。
抗原結合ドメイン
ＣＡＲは、標的抗原（細胞表面抗原等）と相互作用する抗原結合分子を組み込むことによって、その抗原に結合するように操作され得る。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、その抗体フラグメント、例えば、１つ以上の一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、一緒に連結されている抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を有する一本鎖抗体フラグメントである。米国特許第７，７４１，４６５号及び同第６，３１９，４９４号、ならびにＥｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（１９９７）４５：１３１－１３６を参照されたい。ｓｃＦｖは、標的抗原と特異的に相互作用する親抗体の能力を保持する。ｓｃＦｖは、他のＣＡＲ構成要素と共に一本鎖の一部として発現されるように操作され得るため、キメラ抗原受容体に有用である。同文献．Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅ １８８，Ｎｏ．４，１９９８（６１９－６２６）、Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１６１：２７９１－２７９７も参照されたい。抗原結合分子が、典型的には、目的抗原を認識して結合することができるように、ＣＡＲの細胞外部分内部に含有されることが理解されるであろう。二重特異性及び多重特異性のＣＡＲは、本発明の範囲内に企図され、２つ以上の目的標的に対する特異性を有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合分子は一本鎖を含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域がリンカーによって接続されている。いくつかの実施形態では、ＶＨはリンカーのＮ末端に位置し、ＶＬはリンカーのＣ末端に位置する。他の実施形態では、ＶＬはリンカーのＮ末端に位置し、ＶＨはリンカーのＣ末端に位置する。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも約５、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１３、少なくとも約１５、少なくとも約１８、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、または少なくとも約１００のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、ナノボディを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、ＤＡＲＰｉｎを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、標的タンパク質への特異的結合能があるアンチカリンまたは他の合成タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、群ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、Ｃ型レクチン様分子－１、ＣＤ３３、上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧＤ３、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）、Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）または（ＧａＩＮＡｃａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＫＩＴ（ＣＤ１１７）、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２、メソセリン、インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１Ｒａ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プロテアーゼセリン２１、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ルイス（Ｙ）抗原、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ－ベータ）、ステージ特異的胚性抗原－４（ＳＳＥＡ－４）、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、プロスターゼ、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、伸長因子２突然変異（ＥＬＦ２Ｍ）、エフリンＢ２、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸アンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、ベータタイプ、９（ＬＭＰ２）、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、ブレークポイントクラスター領域（ＢＣＲ）及びアベルソンマウス白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなるがん遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ－ａｂｌ）、チロシナーゼ、エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）、フコシルＧＭ１、シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）、ガングリオシドＧＭ３、トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）、ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）、葉酸受容体ベータ、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、クローディン６（ＣＬＤＮ６）、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、ポリシアル酸、胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）、ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）、乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）、ウロプラキン２（ＵＰＫ２）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）、アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）、パネキシン３（ＰＡＮＸ３）、Ｇタンパク質共役型受容体２０（ＧＰＲ２０）、リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）、嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）、ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）、ＭＡＧＥファミリーメンバー（ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３及びＭＡＧＥ－Ａ４を含む）、ＥＴＳ転座バリアント遺伝子６、染色体１２ｐに位置（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）、精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）、Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）、アンギオポイエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）、黒色腫がん精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）、黒色腫がん精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）、Ｆｏｓ関連抗原１、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ｐ５３突然変異体、プロスタイン、サバイビン、テロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原－１、Ｔ細胞１によって認識される黒色腫抗原１、ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、肉腫転座ブレークポイント、アポトーシスの黒色腫阻害因子（ＭＬ－ＩＡＰ）、ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）、ペアボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ｖ－ｍｙｃトリ骨髄細胞腫症ウイルスがん遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）、ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）、チトクロームＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）、ＣＣＣＴＣ結合因子（亜鉛フィンガータンパク質）様、Ｔ細胞３により認識される扁平上皮細胞がん抗原（ＳＡＲＴ３）、ペアボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）、プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）、Ａキナーゼ固定タンパク質４（ＡＫＡＰ－４）、滑膜肉腫、Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）、進行型糖化末端産物の受容体（ＲＡＧＥ－１）、腎臓ユビキタス１（ＲＵ１）、腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）、レグマイン、ヒト乳頭腫ウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）、ヒト乳頭腫ウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）、腸カルボキシルエステラーゼ、ヒートショックタンパク質７０－２突然変異（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）、ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）、骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）、リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、ＭＵＣ１６、５Ｔ４、８Ｈ９、ανβθインテグリン、αｖβ６インテグリン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｂ７－Ｈ６、ｃａ－１２５、ＣＡ９、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ５２、Ｅ－カドヘリン、ＥＭＡ（上皮膜抗原）、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、ＥｒｂＢ４、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ｋ－軽鎖、Ｌ１細胞接着分子、ＭＵＣ１８、ＮＫＧ２Ｄ、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、腫瘍／精巣抗原１Ｂ、ＧＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＢＡＧＥ、ＳＣＰ－１、ＣＴＺ９、ＳＡＧＥ、ＣＡＧＥ、ＣＴ１０、ＭＡＲＴ－１、免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）、Ｂ型肝炎表面抗原結合タンパク質（ＨＢｓＡｇ）、ウイルスキャプシド抗原（ＶＣＡ）、初期抗原（ＥＡ）、ＥＢＶ核抗原（ＥＢＮＡ）、ＨＨＶ－６ ｐ４１初期抗原、ＨＨＶ－６Ｂ Ｕ９４潜伏抗原、ＨＨＶ－６Ｂ ｐ９８後期抗原、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、ラージＴ抗原、スモールＴ抗原、アデノウイルス抗原、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原、血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、パラインフルエンザ１型抗原、パラインフルエンザ２型抗原、パラインフルエンザ３型抗原、パラインフルエンザ４型抗原、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コア抗原、ＨＩＶ ｐ２４抗原、ヒトＴ細胞リンパ栄養性ウイルス（ＨＴＬＶ－１）抗原、メルケル細胞ポリオーマウイルススモールＴ抗原、メルケル細胞ポリオーマウイルスラージＴ抗原、ならびにカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）溶解性核抗原及びＫＳＨＶ潜伏核抗原から選択される抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３２１及び／または３２２を含む。
ヒンジ／スペーサードメイン
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、ヒンジまたはスペーサードメインを含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ／スペーサードメインは、切断型ヒンジ／スペーサードメイン（ＴＨＤ）を含み得、ＴＨＤドメインは、完全なヒンジ／スペーサードメイン（「ＣＨＤ」）の切断されたバージョンである。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、ＥｒｂＢ２、グリコホリンＡ（ＧｐＡ）、ＣＤ２、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、Ｄ４、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８［Ｔ ＣＤ１ １ａ（ＩＴ ＧＡＬ）、ＣＤ１ １ｂ（ＩＴ ＧＡＭ）、ＣＤ１ １ｃ（ＩＴＧＡＸ）、ＣＤ１ １ｄ（ＩＴ ＧＡＤ）、ＣＤ１８（ＩＴＧＢ２）、ＣＤ１９（Ｂ４）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｔ、ＣＤ２９（ＩＴＧＢ１）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）、ＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ４９ａ（ＩＴＧＡ１）、ＣＤ４９ｄ（ＩＴＧＡ４）、ＣＤ４９ｆ（ＩＴＧＡ６）、ＣＤ６６ａ（ＣＥＡＣＡＭ１）、ＣＤ６６ｂ（ＣＥＡＣＡＭ８）、ＣＤ６６ｃ（ＣＥＡＣＡＭ６）、ＣＤ６６ｄ（ＣＥＡＣＡＭ３）、ＣＤ６６ｅ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＤ６９（ＣＬＥＣ２）、ＣＤ７９Ａ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連アルファ鎖）、ＣＤ７９Ｂ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連ベータ鎖）、ＣＤ８４（ＳＬＡＭＦ５）、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３（ＩＴＧＡＥ）、ＣＤ１３４（０Ｘ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５８Ａ（ＫＩＲ２ＤＬ１）、ＣＤ１５８Ｂ１（ＫＩＲ２ＤＬ２）、ＣＤ１５８Ｂ２（ＫＩＲ２ＤＬ３）、ＣＤ１５８Ｃ（ＫＩＲ３ＤＰ１）、ＣＤ１５８Ｄ（ＫＩＲＤＬ４）、ＣＤ１５８Ｆ１（ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ）、ＣＤ１５８Ｆ２（ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ）、ＣＤ１５８Ｋ（ＫＩＲ３ＤＬ２）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１６２（ＳＥＬＰＬＧ）、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ２２９（ＳＬＡＭＦ３）、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４）、ＣＤ２４７（ＣＤ３－ゼータ）、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＣＤ２６８（ＢＡＦＦＲ）、ＣＤ２７０（ＴＮＦＳＦ１４）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７９（ＰＤ－１）、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３１９（ＳＬＡＭＦ７）、ＣＤ３３５（ＮＫ－ｐ４６）、ＣＤ３３６（ＮＫ－ｐ４４）、ＣＤ３３７（ＮＫ－ｐ３０）、ＣＤ３５２（ＳＬＡＭＦ６）、ＣＤ３５３（ＳＬＡＭＦ８）、ＣＤ３５５（ＣＲＴ ＡＭ）、ＣＤ３５７（ＴＮＦＲＳＦ１８）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＬＦＡ－１（ＣＤ１ １ａ／ＣＤ１８）、ＮＫＧ２Ｃ、ＤＡＰ－１０、ＩＣＡＭ－１、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＬＦＡ－１、ＳＬＡＭＦ９、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ（ＧｒｐＬ）、ＳＬＰ－７６（ＬＣＰ２）、ＰＡＧ１／ＣＢＰ、ＣＤ８３リガンド、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＭＨＣクラス２分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、活性化ＮＫ細胞受容体、トールリガンド受容体、及びそのフラグメントまたは組み合わせからのものであるか、またはそれに由来する（例えば、その全部またはそのフラグメントを含む）。ヒンジまたはスペーサードメインは、天然材料または合成材料のいずれにも由来し得る。
いくつかの実施形態では、ヒンジまたはスペーサードメインは、抗原結合分子（例えば、ｓｃＦｖ）と膜貫通ドメインとの間に配置される。この配向では、ヒンジ／スペーサードメインは、抗原結合分子とＣＡＲが発現される細胞膜の表面との間に距離をもたらす。いくつかの実施形態では、ヒンジまたはスペーサードメインであるは、免疫グロブリンからであるか、またはこれに由来する。いくつかの実施形態では、ヒンジまたはスペーサードメインであるは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭのヒンジ／スペーサー領域またはそのフラグメントから選択される。いくつかの実施形態では、ヒンジまたはスペーサードメインであるは、ＣＤ８アルファのヒンジ／スペーサー領域を含むか、それからであるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、ヒンジまたはスペーサードメインであるは、ＣＤ２８のヒンジ／スペーサー領域を含むか、それからであるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、ヒンジまたはスペーサードメインであるは、ＣＤ８アルファのヒンジ／スペーサー領域のフラグメントまたはＣＤ２８のヒンジ／スペーサー領域のフラグメントを含み、フラグメントは全ヒンジ／スペーサー領域よりも小さい任意のものである。いくつかの実施形態では、ＣＤ８アルファヒンジ／スペーサー領域のフラグメントまたはＣＤ２８ヒンジ／スペーサー領域のフラグメントは、ＣＤ８アルファヒンジ／スペーサー領域またはＣＤ２８ヒンジ／スペーサー領域の、Ｎ末端もしくはＣ末端、またはその両端における少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０のアミノ酸を除外するアミノ酸配列を含む。
膜貫通ドメイン
本開示のＣＡＲはさらに、膜貫通ドメイン及び／または細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。膜貫通ドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合するように設計され得る。同様に、ＣＡＲの細胞内ドメインに融合され得る。いくつかの実施形態では、天然においてＣＡＲ内のドメインの１つと会合している膜貫通ドメインが使用される。場合によっては、膜貫通ドメインは、そのようなドメインが、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合することを回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用が最小限に抑えられるように選択されるかまたは（例えば、アミノ酸置換によって）修飾され得る。膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。
膜貫通領域は、受容体型チロシンキナーゼ（例えば、ＥｒｂＢ２）、グリコホリンＡ（ＧｐＡ）、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、活性化ＮＫ細胞受容体、免疫グロブリンタンパク質、Ｂ７－Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＦＡＭＥ（ＳＥＡＭＦ８）、ＢＴＥＡ、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２、ＣＤ２４７、ＣＤ２７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３０、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１ １ａ、ＣＤ１ １ｂ、ＣＤ１ １ｃ、ＣＤ１ １ｄ、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、サイトカイン受容体、ＤＡＰ－１０、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｆｃガンマ受容体、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＥＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＩＥ－２Ｒベータ、ＩＥ－２Ｒガンマ、ＩＥ－７Ｒアルファ、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、インテグリン、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴ ＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴ ＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＩＴＧＢ１、ＫＩＲＤＳ２、ＥＡＴ、ＬＦＡ－１、ＬＦＡ－１、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＬＩＧＨＴ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１；ＣＤ１－１ａ／ＣＤ１８）、ＭＨＣクラス１分子、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＯＸ－４０、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）、ＰＳＧＬ１、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１；ＣＤ１５０；ＩＰＯ－３）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４；２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ；Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ－７６、ＴＮＦ受容体タンパク質、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＳＦ１４、トールリガンド受容体、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ１、もしくはＶＬＡ－６、またはそのフラグメント、トランケーション、あるいはその組み合わせに由来し（すなわち、含み）得る。
いくつかの実施形態では、好適な細胞内シグナル伝達ドメインには、活性化マクロファージ／骨髄細胞受容体ＣＳＦＲ１、ＭＹＤ８８、ＣＤ１４、ＴＩＥ２、ＴＬＲ４、ＣＲ３、ＣＤ６４、ＴＲＥＭ２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ１６９、ＤＥＣＴＩＮ１、ＣＤ２０６、ＣＤ４７、ＣＤ１６３、ＣＤ３６、ＭＡＲＣＯ、ＴＩＭ４、ＭＥＲＴＫ、Ｆ４／８０、ＣＤ９１、Ｃ１ＱＲ、ＬＯＸ－１、ＣＤ６８、ＳＲＡ、ＢＡＩ－１、ＡＢＣＡ７、ＣＤ３６、ＣＤ３１、ラクトフェリン、またはそのフラグメント、トランケーション、もしくは組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、受容体チロシンキナーゼは、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）、インスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、インスリン受容体関連受容体（ＩＲＲ）、血小板由来成長因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲａ）、血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲｆｉ）、ＫＩＴがん原遺伝子受容体チロシンキナーゼ（Ｋｉｔ）、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦＲ）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ＶＥＧＦＲ－１）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＶＥＧＦＲ－２）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ４（ＶＥＧＦＲ－３）、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、線維芽細胞増殖因子受容体２（ＦＧＦＲ２）、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＣＣＫ４）、神経栄養受容体チロシンキナーゼ１（ｔｒｋＡ）、神経栄養受容体チロシンキナーゼ２（ｔｒｋＢ）、神経栄養受容体チロシンキナーゼ３（ｔｒｋＣ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体２（ＲＯＲ２）、筋肉関連受容体チロシンキナーゼ（ＭｕＳＫ）、ＭＥＴがん原遺伝子、受容体チロシンキナーゼ（ＭＥＴ）、マクロファージ刺激１受容体（Ｒｏｎ）、ＡＸＬ受容体チロシンキナーゼ（Ａｘｌ）、ＴＹＲ０３タンパク質チロシンキナーゼ（Ｔｙｒｏ３）、ＭＥＲがん原遺伝子、チロシンキナーゼ（Ｍｅｒ）、免疫グロブリン様及びＥＧＦ様ドメイン１を伴うチロシンキナーゼ（ＴＩＥ１）、ＴＥＫ受容体チロシンキナーゼ（ＴＩＥ２）、ＥＰＨ受容体Ａ１（ＥｐｈＡｌ）、ＥＰＨ受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）、（ＥＰＨ受容体Ａ３）ＥｐｈＡ３、ＥＰＨ受容体Ａ４（ＥｐｈＡ４）、ＥＰＨ受容体Ａ５（ＥｐｈＡ５）、ＥＰＨ受容体Ａ６（ＥｐｈＡ６）、ＥＰＨ受容体Ａ７（ＥｐｈＡ７）、ＥＰＨ受容体Ａ８（ＥｐｈＡ８）、ＥＰＨ受容体Ａ１０（ＥｐｈＡ１０）、ＥＰＨ受容体Ｂ１（ＥｐｈＢ１）、ＥＰＨ受容体Ｂ２（ＥｐｈＢ２）、ＥＰＨ受容体Ｂ３（ＥｐｈＢ３）、ＥＰＨ受容体Ｂ４（ＥｐｈＢ４）、ＥＰＨ受容体Ｂ６（ＥｐｈＢ６）、ｒｅｔプロト腫瘍遺伝子（Ｒｅｔ）、受容体様チロシンキナーゼ（ＲＹＫ）、ディスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ１（ＤＤＲ１）、ディスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ２（ＤＤＲ２）、ｃ－ｒｏｓがん遺伝子１、受容体チロシンキナーゼ（ＲＯＳ）、アポトーシス関連チロシンキナーゼ（Ｌｍｒｌ）、レムールチロシンキナーゼ２（Ｌｍｒ２）、レムールチロシンキナーゼ３（Ｌｍｒ３）、白血球受容体チロシンキナーゼ（ＬＴＫ）、ＡＬＫ受容体チロシンキナーゼ（ＡＬＫ）、またはセリン／トレオニン／チロシンキナーゼ１（ＳＴＹＫ１）に由来し（例えば、含み）得る。
共刺激ドメイン
特定の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインには、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、もしくはその両方、及び／または細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが含まれる。好ましい実施形態では、共刺激ドメインは、ヒトＣＤ２８、ヒト４－１ＢＢ、またはその両方であり、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ゼータ（ζ）である。４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３ゼータはそれぞれ、全４－１ＢＢ、全ＣＤ２８または全ＣＤ３ゼータよりも少なく含まれ得る。キメラ抗原受容体は、それらの効力が増大するよう共刺激（シグナル伝達）ドメインを組み込み得る。米国特許第７，７４１，４６５号、及び同第６，３１９，４９４号、ならびにＫｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．ａｎｄ Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（上述），Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１９：６９６－７０６（２０１２）、Ｋａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．３：９５（２０１１）；Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：７２５－３３（２０１１）、及びＧｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｕｒ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．５６：５９－８３（２０１６）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、配列番号３１８または３２０のアミノ酸配列を含む。
細胞内シグナル伝達ドメイン
本明細書に開示する操作されたＴ細胞の細胞内（シグナル伝達）ドメインは、活性化ドメインへのシグナル伝達を提供し得、これは次に免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つを活性化する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはヘルパー活性、例えば、サイトカインの分泌であり得る。
いくつかの実施形態では、好適な細胞内シグナル伝達ドメインとしては、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、活性化ＮＫ細胞受容体、免疫グロブリンタンパク質、Ｂ７－Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＢＴＬＡ、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ １９ａ、ＣＤ２、ＣＤ２４７、ＣＤ２７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３０、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８４、ＣＤ８ａｌｐｈａ、ＣＤ８ｂｅｔａ、ＣＤ９６（タクタイル）、ＣＤ１ ｌａ、ＣＤ１ ｌｂ、ＣＤ１ ｌｃ、ＣＤ１ １ｄ、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、サイトカイン受容体、ＤＡＰ－１０、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｆｃガンマ受容体、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＣＡＭ－１、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、インテグリン、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＩＴＧＢ１、ＫＩＲＤＳ２、ＬＡＴ、ＬＦＡ－１、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、Ｌｙｌ０８、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１；ＣＤｌ－ｌａ／ＣＤ１８）、ＭＨＣクラス１分子、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＯＸ－４０、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、プログラム死－１（ＰＤ－１）、ＰＳＧＬ１、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、シグナル伝達リンパ球性活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１；ＣＤ１５０；ＩＰＯ－３）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４；２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ－７６、ＴＮＦ受容体タンパク質、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＳＦ１４、トールリガンド受容体、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ１、またはＶＬＡ－６、またはそのフラグメント、トランケーション、もしくは組み合わせが挙げられる（例えば、含まれる）が、これらに限定されない。
ＣＤ３は、ネイティブＴ細胞上のＴ細胞受容体のエレメントであり、ＣＡＲにおいて重要な細胞内活性化エレメントであることが示されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ３は、ＣＤ３ゼータである。いくつかの実施形態では、活性化ドメインは、配列番号３１９のポリペプチド配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一なアミノ酸配列を含む。
３．６ 三重特異性抗原結合タンパク質及び二重特異性抗原結合タンパク質
三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＲＩＴＥ）、二重特異性抗原結合タンパク質（ＢＩＴＥ）、その機能的フラグメント、及びその医薬組成物をコードする環状ＲＮＡポリペプチドを本明細書に開示する。本明細書ではまた、三重特異性抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質をコードする環状ＲＮＡを作製するのに有用な組換え発現ベクター、及び本発明の環状ＲＮＡを含む細胞も提供する。また、肝臓の疾患、状態及び障害の予防及び／または処置において、開示される三重特異性抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質を使用する方法が提供される。三重特異性抗原結合タンパク質は、標的抗原、例えば、がん抗原、ならびにＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ１６Ａ、またはＮＫｐ４６、及び肝臓保持ドメインまたは半減期延長ドメイン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合するドメインに特異的に結合することが可能である。いくつかの実施形態では、ＴＲＩＴＥまたはＢＩＴＥは、本発明の環状ＲＮＡポリペプチドを含む組成物をそれを必要とする患者に投与した後に患者の肝臓内で生成される。
一態様では、三重特異性抗原結合タンパク質は、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ１６Ａ、またはＮＫｐ４６に特異的に結合するドメイン（Ａ）、半減期延長分子または肝臓保持分子に特異的に結合するドメイン（Ｂ）、及び標的抗原、例えば、がん細胞抗原に特異的に結合するドメイン（Ｃ）を含む。三重特異性抗原結合タンパク質における３つのドメインは、任意の順序で配置され得る。したがって、三重特異性抗原結合タンパク質のドメイン順序は、（Ａ）－（Ｂ）－（Ｃ）、（Ａ）－（Ｃ）－（Ｂ）、（Ｂ）－（Ａ）－（Ｃ）、（Ｂ）－（Ｃ）－（Ａ）、（Ｃ）－（Ｂ）－（Ａ）、または（Ｃ）－（Ａ）－（Ｂ）という順序のいずれかであることが企図される。
いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質は、（Ａ）－（Ｂ）－（Ｃ）のドメイン順序を有する。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質は、（Ａ）－（Ｃ）－（Ｂ）のドメイン順序を有する。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質は、（Ｂ）－（Ａ）－（Ｃ）のドメイン順序を有する。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質は、（Ｂ）－（Ｃ）－（Ａ）のドメイン順序を有する。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質は、（Ｃ）－（Ｂ）－（Ａ）のドメイン順序を有する。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質は、（Ｃ）－（Ａ）－（Ｂ）のドメイン順序を有する。
実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ１６Ａ、またはＮＫｐ４６に特異的に結合するドメイン（Ａ）、及び標的抗原に特異的に結合するドメイン（Ｂ）を含む。二重特異性抗原結合タンパク質における２つのドメインは、任意の順序で配置される。したがって、二重特異性抗原結合タンパク質のドメイン順序は、（Ａ）－（Ｂ）、または（Ｂ）－（Ａ）であり得ることが企図される。
本明細書に記載の三重特異性抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞またはＮＫ細胞を動員することによって標的抗原を発現する細胞を特異的に標的とすることを可能とするように設計される。これにより、唯一の抗原を対照とする全長抗体を使用し、かつ細胞傷害性Ｔ細胞を直接的に動員することができないＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介細胞傷害）と比較して有効性が改善される。対照的に、これらの細胞に特異的に発現するＣＤ３分子を関与させることによって、三重特異性抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、非常に特異的な様式で標的抗原を発現する細胞と架橋させ、それにより、動員されたＴ細胞またはＮＫ細胞の細胞傷害可能性を標的細胞に誘導することができる。本明細書に記載の三重特異性抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質は、ＴＣＲの一部を形成する表面発現ＣＤ３タンパク質、またはＮＫ細胞を活性化するＣＤ１６ＡもしくはＮＫｐ４６への結合を介して細胞傷害性Ｔ細胞を関与させる。ＣＤ３及び特定の細胞の表面に発現した標的抗原に対するいくつかの三重特異性抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質の同時結合は、Ｔ細胞活性化を引き起こし、その後の特定の標的抗原を発現する細胞の溶解を媒介する。したがって、三重特異性抗原結合または二重特異性抗原結合タンパク質は、強力で特異的かつ効率的な標的細胞殺傷を示すことが企図される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の三重特異性抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞による標的細胞殺傷を刺激して病原性細胞（例えば、腫瘍細胞、ウイルスまたは細菌に感染した細胞、自己反応性Ｔ細胞等）を除去する。いくつかの実施形態では、細胞は、選択的に除去され、それにより毒性副作用の潜在性を低減させる。いくつかの実施形態では、抗４１ｂｂまたはＣＤ１３７結合ドメインは、Ｔ細胞エンゲージャーとして使用される。
免疫細胞結合ドメイン
Ｔ細胞の応答の特異性は、ＴＣＲによる抗原の認識（主要組織適合性複合体、ＭＨＣとの関連で提示される）によって媒介される。ＴＣＲの一部として、ＣＤ３は、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及び２本のＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含むタンパク質複合体であり、それらは細胞表面に存在する。ＣＤ３は、ＴＣＲのα（アルファ）鎖及びβ（ベータ）鎖、ならびにＣＤ３ζ（ゼータ）と会合し全体で完全なＴＣＲを構成する。固定化抗ＣＤ３抗体による等のＴ細胞上のＣＤ３のクラスタリングは、Ｔ細胞受容体の会合と類似のＴ細胞活性化をもたらすが、そのクローンに典型的な特異性とは無関係である。
一態様では、本明細書に記載の二重特異性及び三重特異性タンパク質は、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを含む。一態様では、本明細書に記載の三重特異性タンパク質は、ヒトＣＤ３に特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の三重特異性タンパク質は、ＣＤ３γに特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の三重特異性タンパク質は、ＣＤ３６に特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の三重特異性タンパク質は、ＣＤ３εに特異的に結合するドメインを含む。
さらなる実施形態では、本明細書に記載の三重特異性タンパク質は、ＴＣＲに特異的に結合するドメインを含む。特定の場合には、本明細書に記載の三重特異性タンパク質は、ＴＣＲのα鎖と特異的に結合するドメインを含む。特定の場合には、本明細書に記載の三重特異性タンパク質は、ＴＣＲのβ鎖と特異的に結合するドメインを含む。
いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質は、ＮＫｐ４６特異的結合体を含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質は、ＣＤ１６Ａ特異的結合体を含む。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａの結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含むがこれらに限定されないＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａに結合する任意のドメインであり得る。いくつかの例では、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａの結合ドメインは、三重特異性抗原結合タンパク質が最終的に使用される種と同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトにおいて使用する場合、三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａの結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインからのヒト残基またはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
したがって、一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体もしくはヒト抗体または抗体フラグメント、あるいはネズミ抗体または抗体フラグメントを含む。一実施形態では、ヒト化またはヒトの抗ＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａの結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化またはヒトの抗ＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａの結合ドメインの１つ以上（例えば、３つ全て）の、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、及び／または本明細書に記載のヒト化またはヒトの抗ＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａの結合ドメインの１つ以上（例えば、３つ全て）の、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含み、例えば、ヒト化またはヒトの抗ＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａの結合ドメインは、１つ以上、例えば、３つ全てのＬＣ ＣＤＲ及び１つ以上、例えば、３つ全てのＨＣ ＣＤＲを含む。
いくつかの実施形態では、ヒト化またはヒトの抗ＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａの結合ドメインは、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａに特異的なヒト化またはヒトの重鎖可変領域を含み、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａに特異的な重鎖可変領域は、ヒト重鎖フレームワーク領域においてヒトまたは非ヒトの重鎖ＣＤＲを含む。
特定の場合には、重鎖及び／または軽鎖の相補性決定領域は、既知の抗ＣＤ３抗体、例えば、ムロモナブ－ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビシリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ＳＰ３４、ＴＲ－６６またはＸ３５－３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ－Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１－４０９、ＣＬＢ－Ｔ３．４．２、ＴＲ－６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ－Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ－１４１、ＸＩＩＩ－４６、ＸＩＩＩ－８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２－８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２－４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ－Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ－１及びＷＴ－３１等に由来する。
いくつかの実施形態では、抗ＮＫｐ４６結合ドメインは、米国特許出願第１６／４５１０５１号に記載されている抗体またはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫｐ４６結合ドメインは、抗体ＢＡＢ２８１、９Ｅ２、１９５３１４またはそのフラグメントを含む。
一実施形態では、抗ＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａの結合ドメインは、本明細書に提供するアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ある実施形態では、抗ＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａの結合ドメインは、本明細書に提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つもしくは３つの修飾（例えば、置換）、但し、３０、２０もしくは１０以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または本明細書に提供するアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；及び／または本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つもしくは３つの修飾（例えば、置換）、但し、３０、２０もしくは１０以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または本明細書に提供するアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化またはヒトの抗ＣＤ３結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域にｓｃＦｖリンカーを介して結合される。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、軽鎖可変領域－ｓｃＦｖリンカー－重鎖可変領域、または重鎖可変領域－ｓｃＦｖリンカー－軽鎖可変領域という配向のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａの結合ドメインは、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａを発現する細胞上のＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａに対し、ＫＤが１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下の親和性を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３ε、γ、またはδに対し、ＫＤが１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下の親和性を有する。さらなる実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａの結合ドメインは、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａに対し低親和性であり、すなわち、約１００ｎＭ以上である。
ＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａに結合する親和性は、例えば、三重特異性抗原結合タンパク質自体またはそのＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、もしくはＣＤ１６Ａの結合ドメインが、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａをコートしたアッセイプレート上、それらを提示する微生物細胞表面、それらの溶液中等で、それらと結合する能力によって決定され得る。ＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａに対する本開示の三重特異性抗原結合タンパク質自体またはそのＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、もしくはＣＤ１６Ａの結合ドメインの結合活性は、リガンド（例えば、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ１６Ａ）あるいは三重特異性抗原結合タンパク質自体またはそのＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、もしくはＣＤ１６Ａの結合ドメインを、ビーズ、基材、細胞等に固定化することによってアッセイされ得る。薬剤を適切な緩衝液に添加し、結合パートナーを所与の温度で所定期間インキュベートすることができる。未結合物質を除去するための洗浄後、結合したタンパク質を、例えば、ＳＤＳ、高ｐＨの緩衝液等で遊離させ、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析することができる。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質は、ＴＣＲ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ結合ドメインは、ウイルス抗原またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ－１（ＨＴＬＶ－ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ－ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ－ＩＩＩとも称される；及び他の分離株、例えば、ＨＩＶ－ＬＰ；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、水胞性口炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボラウイルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふく風邪ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルス）；Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ハンターンウイルス、ブンヤウイルス、フレボウイルス及びナイロウイルス）；Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウイルス）；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、レオウイルス、オルビウイルス及びロタウイルス）；Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウイルス）；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ（パルボウイルス）；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（ほとんどのアデノウイルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；及びＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アフリカ豚熱ウイルス）という科；ならびに分類対象外ウイルス（例えば、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥サテライトと考えられている）、Ｃ型肝炎；ノーウォーク及び関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）からのものである。
リンカー
本明細書に記載の三重特異性タンパク質では、ドメインは、内部リンカーＬ１及びＬ２によって連結されており、Ｌ１は、三重特異性タンパク質の第１のドメインと第２のドメインを連結し、Ｌ２は、三重特異性タンパク質の第２のドメインと第３のドメインを連結する。いくつかの実施形態では、リンカーＬ１及びＬ２は、長さ及び／またはアミノ酸組成が最適化されている。いくつかの実施形態では、リンカーＬ１及びＬ２は、長さ及びアミノ酸組成が同じである。他の実施形態では、Ｌ１及びＬ２は異なる。特定の実施形態では、内部リンカーＬ１及び／またはＬ２は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のアミノ酸残基からなる。したがって、特定の場合には、内部リンカーは、約１２以下のアミノ酸残基からなる。アミノ酸残基が０の場合、内部リンカーは、ペプチド結合である。特定の実施形態では、内部リンカーＬ１及び／またはＬ２は、１５、２０または２５のアミノ酸残基からなる。いくつかの実施形態では、これらの内部リンカーは、約３～約１５、例えば８、９または１０のアミノ酸残基からなる。内部リンカーＬ１及びＬ２のアミノ酸組成に関して、ペプチドは、三重特異性タンパク質に柔軟性を付与し、結合ドメインと干渉せず、また、プロテアーゼからの切断に耐性であるという特性で選択される。例えば、グリシン及びセリン残基は通常、プロテアーゼ耐性を提供する。三重特異性タンパク質におけるドメインを連結するのに好適な内部リンカーの例には、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＳＧ）ｎ、（ＧＧＳＧＧ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＧ）ｎ、または（ＧＧＧ）ｎ［式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である］が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、内部リンカーＬ１及び／またはＬ２は、（ＧＧＧＧＳ）４または（ＧＧＧＧＳ）３である。
半減期延長ドメイン
本明細書では、抗原結合ドメインの半減期を延長させるドメインが企図される。そのようなドメインには、限定されることなく、アルブミン結合ドメイン、Ｆｃドメイン、小分子、及び当該技術分野で知られている他の半減期延長ドメインが含まれることが企図される。
ヒトアルブミン（ＡＬＢ）は、血漿中で最も豊富なタンパク質であり、約５０ｍｇ／ｍｌで存在し、ヒトでは半減期が約２０日である。ＡＬＢは、血漿ｐＨを維持する役目を果たし、コロイド血圧に寄与し、多くの代謝産物及び脂肪酸の担体として機能し、血漿中の主要な薬物輸送タンパク質としての役目を果たす。
アルブミンとの非共有結合性会合は、短命タンパク質の消失半減時間を延長させる。
一態様では、本明細書に記載の三重特異性タンパク質は、半減期延長ドメイン、例えば、ＡＬＢに特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質のＡＬＢ結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含むがこれらに限定されないＡＬＢに結合する任意のドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＡＬＢ結合ドメインは、ＨＳＡに特異的な一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ由来単一ドメイン抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、ペプチド、リガンドまたは小分子実体である。特定の実施形態では、ＡＬＢ結合ドメインは、単一ドメイン抗体である。他の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、ペプチドである。さらなる実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、小分子である。ＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質のＨＳＡ結合ドメインは、かなり小さく、いくつかの実施形態では、２５ｋＤ以下、２０ｋＤ以下、１５ｋＤ以下、または１０ｋＤ以下であることが企図される。特定の場合には、ＡＬＢ結合は、ペプチドまたは小分子実体である場合、５ｋＤ以下である。
三重特異性抗原結合タンパク質の半減期延長ドメインは、三重特異性抗原結合タンパク質自体の薬力学及び薬物動態の変化を提供する。上記のように、半減期延長ドメインは、消失半減時間を延長させる。半減期延長ドメインはまた、三重特異性抗原結合タンパク質の組織分布、浸透、及び拡散の変化を含め、薬力学的特性を変化させる。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、半減期延長ドメインのないタンパク質と比較して、組織（腫瘍を含む）指向性、組織分布、組織浸透、組織内核酸の改善、及び有効性の増強を提供する。一実施形態では、治療方法は、低量の三重特異性抗原結合タンパク質を有効かつ効率的に利用し、副作用の低減、例えば、非腫瘍細胞の細胞傷害性の低減をもたらす。
さらに、半減期延長ドメインの結合親和性は、特定の三重特異性抗原結合タンパク質の特定の消失半減時間を目標とするように選択され得る。したがって、いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、高い結合親和性を有する。他の実施形態では、半減期延長ドメインは、中程度の結合親和性を有する。さらに他の実施形態では、半減期延長ドメインは、低いかまたはわずかな結合親和性を有する。例示的な結合親和性には、１０ｎＭ以下（高）、１０ｎＭ～１００ｎＭの間（中）、及び１００ｎＭ超（低）のＫＤ濃度が含まれる。上記のように、ＡＬＢに対する結合親和性は、既知の方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定される。
肝臓保持ドメイン
本明細書では、肝臓内の三重特異性抗原結合タンパク質のより高い保持を可能とし、それを促進するドメインが企図される。三重特異性抗原結合タンパク質の肝臓保持ドメインは、肝細胞部分へ指向するよう誘導される。ある実施形態では、肝細胞には、肝細胞、肝星細胞、類洞内皮細胞が含まれるが、これらに限定されない。
ある実施形態では、肝細胞は、肝臓指向性部分に結合する受容体を含有する。ある実施形態では、肝臓指向性部分には、ラクトース、塩化シアヌル、セロビオース、ポリルシン、ポリアルギニン、マンノース－６－ホスファート、ＰＤＧＦ、ヒト血清アルブミン、ガラクトシド、ガラクトサミン、リノール酸、アポリオポタンパク質Ａ－１、アセチルＣＫＮＥＫＫＮＩＥＲＮＮＫＬＫＱＰＰ－アミド、グリチルリチン、ラクトビオン酸、マンノース－ＢＳＡ、ＢＳＡ、ポリ－ＡＣＯ－ＨＡＳ、ＫＬＧＲペプチド、ヒアルロン酸、ＩＦＮ－アルファ、ｃＲＧＤペプチド、６－ホスファート－ＨＳＡ、レチノール、ラクトビオチン、ガラクトシド、プルラン、大豆ステリグルコシド、アシアロオロソムコイド、グリチルリチン酸／グリチルリチン、リノール酸、ＡＭＤ３１００、切断性ヒアルロン酸－グリチルリチン酸、Ｂ型肝炎ウイルスプレ－Ｓ１由来リポタンパク質、Ａｐｏ－Ａ１、またはＬＤＬが含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、肝細胞受容体には、ガラクトース受容体、マンノース受容体、スカベンジャー受容体、低密度リポタンパク質受容体、ＨＡＲＥ、ＣＤ４４、ＩＦＮα受容体、コラーゲンＶＩ型受容体、６－ホスファート／インスリン様成長因子２受容体、血小板由来成長因子受容体β、ＲＢＰ受容体、αＶβ３インテグリン受容体、ＡＳＧＰ受容体、グリチルリチン酸／グリチルリチン受容体、ＰＰＡＲ、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン受容体、ＣＸＣ受容体４型、グリチルリチン酸受容体、ＨＢＶＰ受容体、ＨＤＬ受容体、スカベンジャー受容体クラスＢメンバー１ＬＤＬ受容体またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
標的抗原結合ドメイン
本明細書に記載の三重特異性抗原結合タンパク質及び二重特異性抗原結合タンパク質は、標的抗原に結合するドメインを含む。標的抗原は、疾患、障害または状態、例えば、がんに関与及び／または関連する。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＳＳＸ－２、Ｓｐ １７、ＡＦＰ、グリピカン－３、Ｇｐａ３３、アネキシン－Ａ２、ＷＴ１、ＰＳＭＡ、ミッドカイン、ＰＲＡＭＥ、スルビビン、ＭＵＣ－１、Ｐ５３、ＣＥＡ、ＲＡＳ、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ２７、扁平上皮がん抗原（ＳＣＣＡ）、ＧＰ７３、ＴＡＧ－７２、またはＭＡＧＥファミリーのタンパク質である。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、肝臓に転移した非肝臓腫瘍細胞に見られるものである。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質または三重特異性抗原結合タンパク質は、群ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、Ｃ型レクチン様分子－１、ＣＤ３３、上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧＤ３、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）、Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）または（ＧａＩＮＡｃａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＫＩＴ（ＣＤ１１７）、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２、メソテリン、インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１Ｒａ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プロテアーゼセリン２１、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ルイス（Ｙ）抗原、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ－ベータ）、ステージ特異的胚性抗原－４（ＳＳＥＡ－４）、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ムチン１、ステージ特異的胚性抗原（ＭＵＣ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、プロスターゼ、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、伸長因子２突然変異（ＥＬＦ２Ｍ）、エフリンＢ２、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸アンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、ベータタイプ、９（ＬＭＰ２）、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、ブレークポイントクラスター領域（ＢＣＲ）及びアベルソンマウス白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなるがん遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ－ａｂｌ）、チロシナーゼ、エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）、フコシルＧＭ１、シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）、ガングリオシドＧＭ３、トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）、ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）、葉酸受容体ベータ、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、クローディン６（ＣＬＤＮ６）、クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）、ＣＤ９７、またはＣＤ１７９ａに特異的な標的抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ウイルス性疾患、例えば、ウイルス抗原に関連する抗原である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎またはＥ型肝炎抗原である。
本明細書に記載の三重特異性抗原結合タンパク質の設計により、肝臓標的抗原に対する結合ドメインに柔軟性を持たせることが可能となり、肝臓標的抗原に対する結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメイン等、これらに限定されない任意の種類の結合ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、肝臓標的抗原に対する結合ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ科由来単一ドメイン抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）である。他の実施形態では、肝臓標的抗原に対する結合ドメインは、非Ｉｇ結合ドメイン、すなわち、抗体ミメティック、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クーニッツドメインペプチド、及びモノボディである。さらなる実施形態では、肝臓標的抗原に対する結合ドメインは、標的抗原に結合するかまたはそれと会合するリガンドまたはペプチドである。
３．７ ＰＡＨ
いくつかの実施形態では、本発明は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の処置のために、ＰＡＨをコードするｃｉｒｃＲＮＡを対象に送達するための方法及び組成物を提供する。好適なＰＡＨ ｃｉｒｃＲＮＡは、天然に存在するＰＡＨタンパク質の活性の代用となること、及び／またはＰＫＵに関連する１つ以上の症状の強度、重症度、及び／または頻度を低減することができる、ＰＡＨタンパク質の任意の全長、フラグメントまたは部分をコードする。
いくつかの実施形態では、本発明のための好適なＲＮＡ配列は、ヒトＰＡＨタンパク質をコードするｃｉｒｃＲＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、好適なＲＮＡ配列は、ヒトＰＡＨのホモログまたはアナログをコードするＲＮＡ配列であり得る。本明細書で使用される場合、ヒトＰＡＨタンパク質のホモログまたはアナログは、実質的なＰＡＨタンパク質活性を保持しながら、野生型もしくは天然に存在するヒトＰＡＨタンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／または挿入を含有する修飾ヒトＰＡＨタンパク質であり得る。
本発明は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に罹患しているかまたは罹患しやすい対象を処置するために使用され得る。ＰＫＵは、肝酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の遺伝子における変異で、それが非機能性にしていることを特徴とする、常染色体劣性代謝遺伝性障害である。ＰＡＨは、アミノ酸フェニルアラニン（Ｐｈｅ）をアミノ酸チロシン（Ｔｙｒ）に代謝するのに必要である。ＰＡＨ活性が低下すると、フェニルアラニンが蓄積し、尿中に検出され得るフェニルピルビン酸（フェニルケトンとしても知られている）に変換される。
フェニルアラニンは、大型中性アミノ酸（ＬＮＡＡ）である。ＬＮＡＡは、大型中性アミノ酸トランスポーター（ＬＮＡＡＴ）を介した血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する輸送について競合する。血液における過剰なＰｈｅは、トランスポーターを飽和させ、脳内の他のＬＮＡＡのレベルを低下させる傾向がある。これらの他のアミノ酸のいくつかは、タンパク質及び神経伝達物質の合成に必要であるため、Ｐｈｅの蓄積が脳の発達を妨げ、精神遅滞を引き起こし得る。
脳の発達妨害に加え、その疾患は、臨床上様々な症状となって現れ得、それには、発作、白皮症過活動性、成長障害、皮膚発疹（湿疹）、小頭症、及び／または産生されるケトンの１つであるフェニル酢酸による新生児の汗及び尿の「かび臭い」臭気が含まれる。未処置の小児は典型的には、出生時は正常であるが、精神的及び社会的スキルの遅れを有し、頭部のサイズが正常よりも大幅に小さく、多くの場合、進行性の脳機能の障害を示す。小児が成長し、発達するにつれて、多動性、手足の痙動、ＥＥＧ異常、皮膚発疹、振戦、発作、及び重度の学習障害を含め、追加の症状を発症する傾向がある。しかしながら、ＰＫＵは一般的には、ほとんどの国の日常的な新生児スクリーニングパネルに含まれ、典型的には生後２～７日に実施される。
ＰＫＵが十分に早期に診断された場合、罹患した新生児は、比較的正常な脳の発達を伴って成長し得るが、食事、または食事と投薬の組み合わせを介してＰｈｅレベルを管理及び制御することによってのみ可能である。全てのＰＫＵ患者は、最適な脳発達のためにはＰｈｅが少ない特別な食事を遵守しなければならない。食事は、肉、鶏肉、魚、卵、ナッツ、チーズ、豆類、牛乳及び他の乳製品等のＰｈｅが多い食品を厳しく制限するかまたは排除することを必要とする。ジャガイモ、パン、パスタ、トウモロコシ等のデンプン質の食品は、モニタリングされなければならない。乳児には、母乳の利点を全て得られるよう依然として母乳が与えられ得るが、その量もモニタリングしなければならず、足りない栄養の補充が必要となる。多くのダイエット食品及びソフトドリンクに存在する甘味料アスパルテームも、アスパルテームがフェニルアラニンを含有するため、避けなければならない。
生涯にわたって、患者は、低フェニルアラニン食では補給しなければ欠乏するであろうアミノ酸及び他の必要な栄養を得るために、補助的な乳児用ミルク、錠剤、または特別配合の食品を使用することができる。一部のＰｈｅは、多くのタンパク質の合成に必要とされ、また適切な成長のために必要とされるが、そのレベルは、ＰＫＵ患者では厳密に制御されなければならない。さらに、ＰＫＵ患者は、通常フェニルアラニンに由来するチロシンのサプリメントを摂取しなければならない。他のサプリメントとしては、標準的なＰｈｅ除去食で不足する長鎖脂肪酸を補充して神経発達を改善するための魚油、及び鉄またはカルニチンが含まれ得る。ＰＫＵのための可能性のある別の療法は、Ｐｈｅの酸化のための補因子であるテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）であり、特定の患者ではＰｈｅの血中濃度を低下させ得る。ＢＨ４療法に応答する患者は、摂食できる天然タンパク質の量を増加させることもできる。
いくつかの実施形態では、ＰＡＨタンパク質の発現は、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、血清、脳、骨格筋、リンパ節、皮膚、及び／または脳脊髄液において検出可能である。
いくつかの実施形態では、提供組成物を投与することは、肝臓における総タンパク質１ｍｇあたり約１００ｎｇ／ｍｇ、約２００ｎｇ／ｍｇ、約３００ｎｇ／ｍｇ、約４００ｎｇ／ｍｇ、約５００ｎｇ／ｍｇ、約６００ｎｇ／ｍｇ、約７００ｎｇ／ｍｇ、約８００ｎｇ／ｍｇ、約９００ｎｇ／ｍｇ、約１０００ｎｇ／ｍｇ、約１２００ｎｇ／ｍｇもしくは約１４００ｎｇ／ｍｇまたはそれを超えるＰＡＨタンパク質の発現レベルをもたらす。
いくつかの実施形態では、ＰＡＨタンパク質の発現は、投与から１～９６時間後に検出可能である。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＡＨタンパク質の発現は、投与から１～８４時間、１～７２時間、１～６０時間、１～４８時間、１～３６時間、１～２４時間、１～１２時間、１～１０時間、１～８時間、１～６時間、１～４時間、１～２時間、２～９６時間、２～８４時間、２～７２時間、２～６０時間、２～４８時間、２～３６時間、２～２４時間、２～１２時間、２～１０時間、２～８時間、２～６時間、２～４時間、４～９６時間、４～８４時間、４～７２時間、４～６０時間、４～４８時間、４～３６時間、４～２４時間、４～１２時間、４～１０時間、４～８時間、４～６時間、６～９６時間、６～８４時間、６～７２時間、６～６０時間、６～４８時間、６～３６時間、６～２４時間、６～１２時間、６～１０時間、６～８時間、８～９６時間、８～８４時間、８～７２時間、８～６０時間、８～４８時間、８～３６時間、８～２４時間、８～１２時間、８～１０時間、１０～９６時間、１０～８４時間、１０～７２時間、１０～６０時間、１０～４８時間、１０～３６時間、１０～２４時間、１０～１２時間、１２～９６時間、１２～８４時間、１２～７２時間、１２～６０時間、１２～４８時間、１２～３６時間、１２～２４時間、２４～９６時間、２４～８４時間、２４～７２時間、２４～６０時間、２４～４８時間、２４～３６時間、３６～９６時間、３６～８４時間、３６～７２時間、３６～６０時間、３６～４８時間、４８～９６時間、４８～８４時間、４８～７２時間、４８～６０時間、４８～８４時間、４８～７２時間、４８～６０時間、６０～９６時間、６０～８４時間、６０～７２時間、７２時間～９６時間、７２時間～８４時間、または８４時間～９６時間後に検出可能である。例えば、特定の実施形態では、ＰＡＨタンパク質の発現は、投与から６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、及び／または７２時間後に検出可能である。いくつかの実施形態では、ＰＡＨタンパク質の発現は、投与から１～７日後に検出可能である。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＡＨタンパク質は、投与から１日、２日、３日、４日、５日、６日、及び／または７日後に検出可能である。いくつかの実施形態では、ＰＡＨタンパク質の発現は、投与から１週～８週後に検出可能である。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＡＨタンパク質の発現は、投与から１週、２間、３週、及び／または４週後に検出可能である。いくつかの実施形態では、ＰＡＨタンパク質の発現は、投与後１ヶ月後に検出可能である。
３．８ ＣＰＳ１
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＰＳ１欠損症の処置のために、ＣＰＳ１をコードするｃｉｒｃＲＮＡを対象に送達するための方法及び組成物を提供する。好適なＣＰＳ１ ｃｉｒｃＲＮＡは、天然に存在するＣＰＳ１タンパク質の活性の代用となること、及び／またはＣＰＳ１欠損症に関連する１つ以上の症状の強度、重症度、及び／または頻度を低減することができる、ＣＰＳ１タンパク質の任意の全長、フラグメントまたは部分をコードする。
いくつかの実施形態では、本発明のための好適なＲＮＡ配列は、ヒトＣＰＳ１タンパク質をコードするｃｉｒｃＲＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、好適なＲＮＡ配列は、ヒトＣＰＳ１のホモログまたはアナログをコードするＲＮＡ配列であり得る。本明細書で使用される場合、ヒトＣＰＳ１タンパク質のホモログまたはアナログは、実質的なＣＰＳ１タンパク質活性を保持しながら、野生型または天然に存在するヒトＣＰＳ１タンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／または挿入を含有する修飾ヒトＣＰＳ１タンパク質であり得る。
カルバモイルリン酸シンテターゼＩ（ＣＰＳ１）は、尿素サイクルの第１段階において、アンモニア、重炭酸塩及び２ＡＴＰの変換を触媒しカルバモイルリン酸を形成させる。それはまた、アルギニンの生合成において役割を果たし、今度は、例えば、エンドトキシンショックの場合に、ＮＯの生合成のための基質となる（Ｓｈｏｋｏ Ｔａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｎｄ Ｕｒｅａ Ｃｙｃｌｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｒａｔ Ｌｉｖｅｒ ｉｎ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｓｈｏｃｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２６８，２２１－２２４（２０００）を参照されたい。）。ＣＰＳ１は、細胞質酵素ＣＰＳ２とは区別されるべきであり、これは、尿素サイクルにおいて同様に役割を果たすが、基質グルタミンを処理する。ＣＰＳ１がミトコンドリアに局在し、この形態で肝臓組織に多量に存在する（肝臓タンパク質全体の２～６％を占める）ことが知られている。そのアミノ酸配列及び遺伝子局在化は、以前より知られている（Ｈａｒａｇｕｃｈｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｃａｒｂａｍｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ Ｉ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉａ，Ｇｅｎｅ １９９１，Ｎｏｖ．１；１０７（２）；３３５－３４０を参照されたい。また、その出願人の公開ＷＯ０３／０８９９３３Ａ１も参照されたい。）。その生理的役割に関して、例えば、Ｈ．Ｍ．Ｈｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂａｍｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ａｎ ａｍａｚｉｎｇ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｏｄｙｓｓｅｙ ｆｒｏｍ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｔ，ＣＭＬＳ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５６（１９９９）５０７－５２２、及びそこで参照されている文献、ならびにＭｉｋｉｋｏ Ｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ ｏｆ Ｃａｒｂａｍｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ Ｉ：Ｐｌａｓｍａ Ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ Ｒａｔ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ，Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １９９４，９５：４８：２１３－２２１による刊行物の緒言等の総説を参照してよい。
カルバモイルリン酸シンテターゼＩ（ＣＰＳ１）欠損症は、酵素カルバモイルリン酸シンテターゼＩの遺伝子における変異（この酵素がアンモニア及び重炭酸塩からカルバモイルリン酸の合成を触媒する能力に影響を及ぼす）を特徴とする遺伝性疾患である。この反応は、尿素サイクルの第１段階であり、細胞からの過剰尿素の除去において重要である。ＣＰＳ１タンパク質における欠陥は、尿素サイクルを壊し、肝臓が過剰の窒素を尿素に適切に処理することを妨げる。
いくつかの実施形態では、提供組成物を投与することは、肝臓における総タンパク質の１ｍｇあたり約１００ｎｇ／ｍｇ、約２００ｎｇ／ｍｇ、約３００ｎｇ／ｍｇ、約４００ｎｇ／ｍｇ、約５００ｎｇ／ｍｇ、約６００ｎｇ／ｍｇ、約７００ｎｇ／ｍｇ、約８００ｎｇ／ｍｇ、約９００ｎｇ／ｍｇ、約１０００ｎｇ／ｍｇ、約１２００ｎｇ／ｍｇもしくは約１４００ｎｇ／ｍｇまたはそれを超えるＣＰＳ１タンパク質の発現レベルをもたらす。
いくつかの実施形態では、ＣＰＳ１タンパク質の発現は、投与から１～９６時間後に検出可能である。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＰＳ１タンパク質の発現は、投与から１～８４時間、１～７２時間、１～６０時間、１～４８時間、１～３６時間、１～２４時間、１～１２時間、１～１０時間、１～８時間、１～６時間、１～４時間、１～２時間、２～９６時間、２～８４時間、２～７２時間、２～６０時間、２～４８時間、２～３６時間、２～２４時間、２～１２時間、２～１０時間、２～８時間、２～６時間、２～４時間、４～９６時間、４～８４時間、４～７２時間、４～６０時間、４～４８時間、４～３６時間、４～２４時間、４～１２時間、４～１０時間、４～８時間、４～６時間、６～９６時間、６～８４時間、６～７２時間、６～６０時間、６～４８時間、６～３６時間、６～２４時間、６～１２時間、６～１０時間、６～８時間、８～９６時間、８～８４時間、８～７２時間、８～６０時間、８～４８時間、８～３６時間、８～２４時間、８～１２時間、８～１０時間、１０～９６時間、１０～８４時間、１０～７２時間、１０～６０時間、１０～４８時間、１０～３６時間、１０～２４時間、１０～１２時間、１２～９６時間、１２～８４時間、１２～７２時間、１２～６０時間、１２～４８時間、１２～３６時間、１２～２４時間、２４～９６時間、２４～８４時間、２４～７２時間、２４～６０時間、２４～４８時間、２４～３６時間、３６～９６時間、３６～８４時間、３６～７２時間、３６～６０時間、３６～４８時間、４８～９６時間、４８～８４時間、４８～７２時間、４８～６０時間、４８～８４時間、４８～７２時間、４８～６０時間、６０～９６時間、６０～８４時間、６０～７２時間、７２時間～９６時間、７２時間～８４時間、または８４時間～９６時間後に検出可能である。例えば、特定の実施形態では、ＣＰＳ１タンパク質の発現は、投与から６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、及び／または７２時間後に検出可能である。いくつかの実施形態では、ＣＰＳ１タンパク質の発現は、投与から１日～７日後に検出可能である。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＰＳ１タンパク質は、投与から１日、２日、３日、４日、５日、６日、及び／または７日後に検出可能である。いくつかの実施形態では、ＣＰＳ１タンパク質の発現は、投与から１週～８週後に検出可能である。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＰＳ１タンパク質は、投与から１週、２週、３週、及び／または４週後に検出可能である。いくつかの実施形態では、ＣＰＳ１タンパク質の発現は、投与後１ヶ月後に検出可能である。
いくつかの実施形態では、組成物の投与は、処置前のベースラインレベルと比較して、対象でのアンモニアレベル低下をもたらす。典型的には、ベースラインレベルは、処置直前の対象において測定される。典型的には、アンモニアレベルは、生体試料において測定される。好適な生体試料には、例えば、全血、血漿、血清、尿または脳脊髄液が含まれる。
いくつかの実施形態では、組成物を投与することは、生体試料（例えば、血清、血漿、または尿試料）でのアンモニアレベルを、処置直前の対象におけるベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％低下させる。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供する組成物を投与することは、処置直前の対象におけるベースラインのアンモニアレベルと比較して、血漿または血清でのアンモニアレベル低下をもたらす。いくつかの実施形態では、提供組成物を投与することは、処置されていない対象におけるアンモニアレベルと比較して、血漿または血清でのアンモニアレベル低下をもたらす。いくつかの実施形態では、組成物を投与することは、対象の血漿または血清でのアンモニアレベルを約３０００μｍｏｌ／Ｌ以下、約２７５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約２５００μｍｏｌ／Ｌ以下、約２２５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約２０００μｍｏｌ／Ｌ以下、約１７５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約１５００μｍｏｌ／Ｌ以下、約１２５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約１０００μｍｏｌ／Ｌ以下、約７５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約５００μｍｏｌ／Ｌ以下、約２５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約１００μｍｏｌ／Ｌ以下または約５０μｍｏｌ／Ｌ以下まで低下させる。特定の実施形態では、組成物を投与することは、血漿または血清でのアンモニアレベルを約５０μｍｏｌ／Ｌ以下まで低下させる。
３．９ ＡＤＡＭＴＳ１３
いくつかの実施形態では、本発明は、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）の処置のために、ＡＤＡＭＴＳ１３をコードするｃｉｒｃＲＮＡを対象に送達するための方法及び組成物を提供する。好適なＡＤＡＭＴＳ１３ ｃｉｒｃＲＮＡは、任意の全長ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質、またはその機能的フラグメントもしくは部分をコードし、それらは、天然に存在するＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の代わりになること、及び／またはＴＴＰに関連する１つ以上の症状の強度、重症度、及び／または頻度を低減することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡ配列は、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードするｃｉｒｃＲＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ配列は、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３のホモログまたはアナログをコードするＲＮＡ配列であり得る。本明細書で使用される場合、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質のホモログまたはアナログは、実質的なＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質活性を保持しながら、野生型または天然に存在するヒトＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／または挿入を含有する修飾ヒトＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質であり得る。
ＡＤＡＭＴＳ１３酵素はフォンヴィレブランド因子を切断するが、これは、その非切断型では、血小板と相互作用してそれらが一緒に粘着し、血管壁に付着して、血栓を形成する。ＡＤＡＭＴＳ１３の欠陥は、ＴＴＰに関連する。
いくつかの実施形態では、提供組成物を投与することは、肝臓における総タンパク質の１ｍｇあたり約１００ｎｇ／ｍｇ、約２００ｎｇ／ｍｇ、約３００ｎｇ／ｍｇ、約４００ｎｇ／ｍｇ、約５００ｎｇ／ｍｇ、約６００ｎｇ／ｍｇ、約７００ｎｇ／ｍｇ、約８００ｎｇ／ｍｇ、約９００ｎｇ／ｍｇ、約１０００ｎｇ／ｍｇ、約１２００ｎｇ／ｍｇもしくは約１４００ｎｇ／ｍｇまたはそれを超えるＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の発現レベルをもたらす。
いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の発現は、投与から１～９６時間後に検出可能である。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の発現は、投与から１～８４時間、１～７２時間、１～６０時間、１～４８時間、１～３６時間、１～２４時間、１～１２時間、１～１０時間、１～８時間、１～６時間、１～４時間、１～２時間、２～９６時間、２～８４時間、２～７２時間、２～６０時間、２～４８時間、２～３６時間、２～２４時間、２～１２時間、２～１０時間、２～８時間、２～６時間、２～４時間、４～９６時間、４～８４時間、４～７２時間、４～６０時間、４～４８時間、４～３６時間、４～２４時間、４～１２時間、４～１０時間、４～８時間、４～６時間、６～９６時間、６～８４時間、６～７２時間、６～６０時間、６～４８時間、６～３６時間、６～２４時間、６～１２時間、６～１０時間、６～８時間、８～９６時間、８～８４時間、８～７２時間、８～６０時間、８～４８時間、８～３６時間、８～２４時間、８～１２時間、８～１０時間、１０～９６時間、１０～８４時間、１０～７２時間、１０～６０時間、１０～４８時間、１０～３６時間、１０～２４時間、１０～１２時間、１２～９６時間、１２～８４時間、１２～７２時間、１２～６０時間、１２～４８時間、１２～３６時間、１２～２４時間、２４～９６時間、２４～８４時間、２４～７２時間、２４～６０時間、２４～４８時間、２４～３６時間、３６～９６時間、３６～８４時間、３６～７２時間、３６～６０時間、３６～４８時間、４８～９６時間、４８～８４時間、４８～７２時間、４８～６０時間、４８～８４時間、４８～７２時間、４８～６０時間、６０～９６時間、６０～８４時間、６０～７２時間、７２時間～９６時間、７２時間～８４時間、または８４時間～９６時間後に検出可能である。例えば、特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の発現は、投与から６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、及び／または７２時間後に検出可能である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の発現は、投与から１日～７日後に検出可能である。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、投与から１日、２日、３日、４日、５日、６日、及び／または７日後に検出可能である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の発現は、投与から１週～８週後に検出可能である。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、投与から１週、２週、３週、及び／または４週後に検出可能である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の発現は、投与後１ヶ月後に検出可能である。
いくつかの実施形態では、組成物の投与は、処置前のベースラインｖＷＦレベルと比較して、対象でのフォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）低下をもたらす。典型的には、ベースラインレベルは、処置直前の対象において測定される。典型的には、ｖＷＦレベルは、生体試料において測定される。好適な生体試料には、例えば、全血、血漿または血清が含まれる。
いくつかの実施形態では、組成物を投与することは、処置直前のベースラインｖＷＦレベルと比較して、対象から採取された生体試料でのｖＷＦレベルを少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下させる。いくつかの実施形態では、組成物を投与することは、対象での血漿ｖＷＦレベルを約２０００μＭ、１５００μＭ、１０００μＭ、７５０μＭ、５００μＭ、２５０μＭ、１００μＭ、９０μＭ、８０μＭ、７０μＭ、６０μＭ、５０μＭ、４０μＭ、または３０μＭ未満まで低下させる。
いくつかの実施形態では、提供組成物を投与することは、処置直前のベースラインｖＷＦレベルと比較して、対象から採取された血漿または血清試料でのｖＷＦレベル低下をもたらす。いくつかの実施形態では、提供組成物を投与することは、処置されていない対象におけるｖＷＦレベルと比較して、血漿または血清でのｖＷＦレベル低下をもたらす。いくつかの実施形態では、組成物を投与することは、血漿または血清においてｖＷＦレベルを約３０００μｍｏｌ／Ｌ以下、約２７５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約２５００μｍｏｌ／Ｌ以下、約２２５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約２０００μｍｏｌ／Ｌ以下、約１７５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約１５００μｍｏｌ／Ｌ以下、約１２５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約１０００μｍｏｌ／Ｌ以下、約７５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約５００μｍｏｌ／Ｌ以下、約２５０μｍｏｌ／Ｌ以下、約１００μｍｏｌ／Ｌ以下または約５０μｍｏｌ／Ｌ以下まで低下させる。特定の実施形態では、組成物を投与することは、血漿または血清でのｖＷＦレベルを約５０μｍｏｌ／Ｌ以下まで低下させる。
４．ポリヌクレオチドの産生
本明細書に提供するベクターは、分子生物学の標準的な技術を使用して作成することができる。例えば、本明細書に提供するベクターの様々なエレメントは、組換え法を使用して、例えば、細胞からｃＤＮＡ及びゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、またはあるポリヌクレオチドが含まれることが既知のベクターからそのポリヌクレオチドを誘導することによって、取得することができる。
本明細書に提供するベクターの様々なエレメントはまた、クローニングされるというよりむしろ、既知の配列に基づいて合成により生成することもできる。完全な配列は、標準的方法によって調製された重複オリゴヌクレオチドから構築し、完全な配列へと構築することができる。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９、及びＪａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：６３１ １を参照されたい。
したがって、特定のヌクレオチド配列は、所望の配列を持つベクターから取得すること、または適宜、部位特異的突然変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術等の当該技術分野で公知の様々なオリゴヌクレオチド合成技術を使用して完全もしくは部分的に合成することができる。所望のベクターエレメントをコードするヌクレオチド配列を取得する１つの方法は、従来の自動ポリヌクレオチドシンセサイザーで生成された重複する合成オリゴヌクレオチドの相補的セットをアニーリングし、続いて適切なＤＮＡリガーゼでライゲーションし、ＰＣＲによりライゲーションされたヌクレオチド配列を増幅することによるものである。例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：４０８４－４０８８を参照されたい。さらに、オリゴヌクレオチド特異的合成（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）５４：７５－８２）、既存のヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３２：３２３－３２７及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：１５３４－１５３６）、及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用するギャップ入りオリゴヌクレオチドの酵素的充填（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：１００２９－１００３３）を使用することができる。
本明細書に提供する前駆体ＲＮＡは、本明細書に提供するベクターを、ベクターによりコードされる前駆体ＲＮＡの転写を許容する条件下でインキュベートすることによって生成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、前駆体ＲＮＡは、その５’二重鎖形成領域及び／または発現配列の上流にＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む本明細書に提供するベクターを、適合するＲＮＡポリメラーゼ酵素とｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を許容する条件下でインキュベートすることによって合成される。いくつかの実施形態では、ベクターは、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼによって細胞内部で、または宿主ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって細胞の核内でインキュベートされる。
特定の実施形態では、本明細書において、本明細書に提供されるベクター（例えば、５’相同性領域の上流に配置されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する本明細書に提供されるベクター）をテンプレートとして使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行うことによって前駆体ＲＮＡを生成する方法を提供する。
特定の実施形態では、得られた前駆体ＲＮＡを使用して、それをマグネシウムイオン及びグアノシンヌクレオチドまたはヌクレオシドの存在下で、ＲＮＡ環状化が生じる温度（例えば、２０℃～６０℃間）にてインキュベートすることによって、環状ＲＮＡ（例えば、本明細書で提供される環状ＲＮＡポリヌクレオチド）を生成することができる。
したがって、特定の実施形態では、環状ＲＮＡを作製する方法を本明細書で提供する。特定の実施形態では、本方法は、前駆体ＲＮＡを、本明細書に提供するベクター（例えば、以下の順序で、５’相同性領域、３’グループＩイントロンフラグメント、第１のスペーサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現配列、第２のスペーサー、５’グループＩイントロンフラグメント、及び３’相同性領域を含むベクター）をテンプレートとして使用する転写（例えば、ランオフ転写）によって合成すること、ならびに得られた前駆体ＲＮＡを、それが環状化するよう、二価カチオン（例えば、マグネシウムイオン）及びＧＴＰの存在下でインキュベートして、環状ＲＮＡを形成することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する前駆体ＲＮＡは、マグネシウムイオン及びＧＴＰの非存在下で、及び／またはマグネシウムイオン及びＧＴＰとのインキュベーションのステップを伴わずに、環状化することができる。環状ＲＮＡは、対応するｍＲＮＡと比べて免疫原性の低下が発見されたが、理由の少なくとも一部は、ｍＲＮＡが免疫原性５’ｃａｐを含有するためである。前駆体ＲＮＡを生成させるために特定のプロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）からＤＮＡベクターを転写する場合、前駆体ＲＮＡの５’末端はＧであることが理解される。低レベルの夾雑直鎖ｍＲＮＡを含有する環状ＲＮＡ組成物の免疫原性を低下させるため、キャップすることができない５’ＧＭＰがほとんどの転写産物に含有されるよう、ＧＴＰに対して過剰のＧＭＰを転写時に与えることができる。したがって、いくつかの実施形態では、転写は、過剰のＧＭＰの存在下で行われる。いくつかの実施形態では、転写は、ＧＭＰ濃度とＧＴＰ濃度の比が約３：１～約１５：１の範囲内、例えば、約３：１～約１０：１、約３：１～約５：１、約３：１、約４：１、または約５：１で行われる。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡを含む組成物は、精製されている。環状ＲＮＡは、当該技術分野で一般的に使用される任意の公知の方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製され得る。いくつかの実施形態では、精製は、ホスファターゼ処理、ＨＰＬＣサイズ排除精製、及びＲＮａｓｅ Ｒ消化というステップのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、精製は、ＲＮａｓｅ Ｒ消化、ホスファターゼ処理、及びＨＰＬＣサイズ排除精製というステップを、この順序で含む。いくつかの実施形態では、精製は、逆相ＨＰＬＣを含む。いくつかの実施形態では、精製された組成物は、未精製ＲＮＡよりも少ない二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡスプリント、三リン酸化ＲＮＡ、ホスファターゼタンパク質、タンパク質リガーゼ、キャッピング酵素及び／またはニックの入ったＲＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、精製組成物は、未精製組成物よりも免疫原性が低い。いくつかの実施形態では、精製組成物に曝露された免疫細胞は、未精製組成物に曝露された免疫細胞よりも少ないＩＦＮ－β１、ＲＩＧ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮγ、及び／またはＴＮＦαを産生する。
５．イオン化可能脂質
特定の実施形態では、本明細書において、輸送ビヒクルの成分として使用され、１つ以上の標的細胞への環状ＲＮＡの送達及び放出を（例えば、そのような標的細胞の脂質膜を透過するかまたはこれと融合することによって）促進または増強させ得る、イオン化可能脂質を開示する。特定の実施形態では、イオン化可能脂質は、１つ以上の切断可能な官能基（例えば、ジスルフィド）を含み、これは、例えば、化合物の親水性官能頭部基が（例えば、酸化的、還元的または酸性の条件への曝露時に）親油性官能尾部基から解離することを可能にし、それにより、１つ以上の標的細胞の脂質二重層における相転移を促進する。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５８５５５号に記載されているような脂質である。
実施形態の一部では、カチオン性脂質は、以下の式を有する：
Figure 2023525270000045
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、同じであるかまたは異なっており、独立して、任意選択で置換されたＣ１０－Ｃ２４アルキル、任意選択で置換されたＣ１０－Ｃ２４アルケニル、任意選択で置換されたＣ１０－Ｃ２４アルキニル、または任意選択で置換されたＣ１０－Ｃ２４アシルであり；
Ｒ３及びＲ４は、同じであるかまたは異なっており、独立して、任意選択で置換されたＣ１－Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ２－Ｃ６アルケニル、もしくは任意選択で置換されたＣ２－Ｃ６アルキニルであるか、またはＲ３とＲ４が連結されて、炭素原子が４～６個ならびに窒素及び酸素から選択されるヘテロ原子が１個もしくは２個の、任意選択で置換された複素環を形成し得；
Ｒ５は、存在しないかまたは存在し、存在する場合、水素またはＣ１－Ｃ６アルキルであり；ｍ、ｎ、及びｐは、同じであるかまたは異なっており、独立して、０または１のいずれかであるが、但し、ｍ、ｎ、及びｐが同時に０ということはなく；ｑは、０、１、２、３、または４であり；かつ
Ｙ及びＺは、同じであるかまたは異なっており、独立してＯ、Ｓ、またはＮＨである］。
一実施形態では、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、リノレイルであり、アミノ脂質は、ジリノレイルアミノ脂質である。
一実施形態では、アミノ脂質は、ジリノレイルアミノ脂質である。
様々な他の実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造：
Figure 2023525270000046
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を有する
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ及びＣ１－Ｃ３アルキルからなる群から選択され；かつ
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、約１０～約２０個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ３及びＲ４のうちの少なくとも１つは、少なくとも２つの不飽和部位を含む］。
いくつかの実施形態では、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、ドデカジエニル、テトラデカジエニル、ヘキサデカジエニル、リノレイル、及びイコサジエニルから選択される。ある実施形態では、Ｒ３及びＲ４及びはいずれもリノレイルである。いくつかの実施形態では、Ｒ３及び／またはＲ４は、少なくとも３つの不飽和部位を含み得る（例えば、Ｒ３及び／またはＲ４は、例えば、ドデカトリエニル、テトラデクトリエニル、ヘキサデカトリエニル、リノレニル、及びイコサトリエニルであり得る）。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造：
Figure 2023525270000047
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を有する
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ及びＣ１－Ｃ３アルキルから選択され；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、約１０～約２０個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ３及びＲ４のうちの少なくとも１つは、少なくとも２つの不飽和部位を含む］。
一実施形態では、Ｒ３及びＲ４は同じであり、例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ３及びＲ４は、いずれもリノレイル（Ｃ１８－アルキル）。別の実施形態では、Ｒ３及びＲ４は異なり、例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ３は、テトラデクトリエニル（Ｃ１４－アルキル）及びＲ４は、リノレイル（Ｃ１８－アルキル）である。好ましい実施形態では、本発明のカチオン性脂質（複数可）は対称であり、すなわち、Ｒ３とＲ４が同じである。別の好ましい実施形態では、Ｒ３及びＲ４のどちらも、少なくとも２つの不飽和部位を含む。いくつかの実施形態では、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、ドデカジエニル、テトラデカジエニル、ヘキサデカジエニル、リノレイル、及びイコサジエニルから選択される。ある実施形態では、Ｒ３及びＲ４はいずれもリノレイルである。いくつかの実施形態では、Ｒ３及び／またはＲ４は、少なくとも３つの不飽和部位を含みそれぞれ独立して、ドデカトリエニル、テトラデクトリエニル、ヘキサデカトリエニル、リノレニル、及びイコサトリエニルから選択される。
様々な実施形態では、カチオン性脂質は、式：
Figure 2023525270000048
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を有する
［式中、
Ｘａａは、式－ＮＲＮ－ＣＲ１Ｒ２－Ｃ（Ｃ＝Ｏ）－を有するＤ－もしくはＬ－アミノ酸残基であるか、または式－｛ＮＲＮ－ＣＲ１Ｒ２－Ｃ（Ｃ＝Ｏ）｝ｎ－（式中、ｎは、２～２０の整数である）を有するアミノ酸残基のペプチドもしくはペプチドであり；
Ｒ１は、独立して、出現ごとに、水素以外であるか、またはアミノ酸の置換もしくは非置換の側鎖であり；
Ｒ２及びＲＮは、独立して、出現ごとに、水素、有機基であって、炭素、酸素、窒素、硫黄、及び水素原子、もしくは前述のものの任意の組み合わせからなり、かつ、１～２０個の炭素原子を有する有機基、Ｃ（１－５）アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、Ｃ（１－５）アルケニル、Ｃ（１－５）アルキニル、Ｃ（１－５）アルカノイル、Ｃ（１－５）アルカノイルオキシ、Ｃ（１－５）アルコキシ、Ｃ（１－５）アルコキシ－Ｃ（１－５）アルキル、Ｃ（１－５）アルコキシ－Ｃ（１－５）アルコキシ、Ｃ（１－５）アルキル－アミノ－Ｃ（１－５）アルキル－、Ｃ（１－５）ジアルキル－アミノ－Ｃ（１－５）アルキル－、ニトロ－Ｃ（１－５）アルキル、シアノ－Ｃ（１－５）アルキル、アリール－Ｃ（１－５）アルキル、４－ビフェニル－Ｃ（１－５）アルキル、カルボキシル、またはヒドロキシルであり；
Ｚは、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＣＨ２Ｓ－、－ＣＨ２Ｓ（Ｏ）－であるか、または水素原子、炭素原子、酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子から選択される１～４０個の原子からなる有機リンカーであり（好ましくは、Ｚは、－ＮＨ－または－Ｏ－である）；
Ｒｘ及びＲｙは、独立して、（ｉ）脂質（天然に存在するかまたは合成であり得る）、例えば、リン脂質、糖脂質、トリアシルグリセロール、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、セラミド、スフィンゴミエリン、セレブロシド、またはガングリオシドに由来する親油性尾部（尾部には、任意選択でステロイドが含まれる）；（ｉｉ）水素、ヒドロキシル、アミノ、及び有機保護基から選択されるアミノ酸末端基；または（ｉｉｉ）置換もしくは非置換のＣ（３－２２）アルキル、Ｃ（６－１２）シクロアルキル、Ｃ（６－１２）シクロアルキル－Ｃ（３－２２）アルキル、Ｃ（３－２２）アルケニル、Ｃ（３－２２）アルキニル、Ｃ（３－２２）アルコキシ、もしくはＣ（６－１２）－アルコキシＣ（３－２２）アルキルである］。
いくつかの実施形態では、Ｒｘ及びＲｙの一方は、上記で定義されている親油性尾部であり、他方は、アミノ酸末端基である。いくつかの実施形態では、Ｒｘ及びＲｙのどちらも親油性尾部である。
いくつかの実施形態では、Ｒｘ及びＲｙのうちの少なくとも１つは、１つ以上の生分解性基（例えば、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＯＣ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）（ＮＲ５）－、－Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）（ＮＲ５）－、－Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）－、－Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳｉ（Ｒ５）２Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＲ３Ｒ４）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ３Ｒ４）Ｃ（Ｏ）－、または
Figure 2023525270000049
により中断されている。
いくつかの実施形態では、Ｒ１１は、Ｃ２－Ｃ８アルキルまたはアルケニルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ５の各出現は、独立して、Ｈまたはアルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ３及びＲ４の各出現は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、アルキル、アルコキシ、－ＮＨ２、アルキルアミノ、もしくはジアルキルアミノであるか、またはＲ３とＲ４は、それらが直接結合している炭素原子と一緒になって、シクロアルキル基を形成する。いくつかの特定の実施形態では、Ｒ３及びＲ４の各出現は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ４アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒｘ及びＲｙはそれぞれ、独立して、１つ以上の炭素－炭素二重結合を有する。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、
Figure 2023525270000050
のうちの１つであるか、またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体である
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、その各々が、任意選択で置換されてよく；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ６アルキルであるか、またはＲ３とＲ４が一緒になって、任意選択で置換された複素環を形成する］。
有用な代表的ジリノレイルアミノ脂質は、式：
Figure 2023525270000051
を有し、
式中、ｎは、０、１、２、３、または４である。
一実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡである。一実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（上記ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡであり、ｎは、２である）である。
一実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造：
Figure 2023525270000052
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を有する
［式中、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、各出現ごとに独立して、任意選択で置換されたＣ１０－Ｃ３０アルキル、任意選択で置換されたＣ１０－Ｃ３０アルケニル、任意選択で置換されたＣ１０－Ｃ３０アルキニルまたは任意選択で置換されたＣ１０－Ｃ３０アシルであり；
Ｒ３は、Ｈ、任意選択で置換されたＣ２－Ｃ１０アルキル、任意選択で置換されたＣ２－Ｃ１０アルケニル、任意選択で置換されたＣ２－Ｃ１０アルキリル、アルキル複素環、アルキルホスファート、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホロジチオアート、アルキルホスホナート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω－アミノアルキル、ω－（置換）アミノアルキル、ω－ホスホアルキル、ω－チオホスホアルキル、任意選択で置換されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分子量１００～４０Ｋ）、任意選択で置換されたｍＰＥＧ（分子量１２０～４０Ｋ）、ヘテロアリール、もしくは複素環、またはリンカーリガンドであり、例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ３は、（ＣΗ３）２Ν（ＣＨ２）ｎ－であり、式中、ｎは、１、２、３または４であり；
Ｅは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｑ）、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）、（Ｑ）Ｎ（ＣＯ）Ｏ、Ｏ（ＣＯ）Ｎ（Ｑ）、Ｓ（Ｏ）、ＮＳ（Ｏ）２Ｎ（Ｑ）、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（Ｑ）Ｓ（Ｏ）２、ＳＳ、Ｏ－Ｎ、アリール、ヘテロアリール、環または複素環、例えば－Ｃ（Ｏ）Ｏであり、ここで、－は、Ｒ３への接続点であり；かつ
Ｑは、Ｈ、アルキル、ω－アミノアルキル、ω－（置換）アミノアルキル、ω－ホスホアルキルまたはω－チオホスホアルキルである］。
具体的な一実施形態では、実施形態１、２、３、４または５のカチオン性脂質は、以下の構造：
Figure 2023525270000053
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を有する
［式中、
Ｅは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｑ）、Ｃ（Ｏ）、Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）、（Ｑ）Ｎ（ＣＯ）Ｏ、Ｏ（ＣＯ）Ｎ（Ｑ）、Ｓ（Ｏ）、ＮＳ（Ｏ）２Ｎ（Ｑ）、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（Ｑ）Ｓ（Ｏ）２、ＳＳ、Ｏ＝Ｎ、アリール、ヘテロアリール、環または複素環であり；
Ｑは、Ｈ、アルキル、ω－アミノアルキル、ω－（置換）アミノアルキル、ω－ホスホアルキルまたはω－チオホスホアルキルであり；
Ｒ１及びＲ２及びＲｘはそれぞれ、各出現ごとに独立して、Ｈ、任意選択で置換されたＣ１－Ｃ１０アルキル、任意選択で置換されたＣ１０－Ｃ３０アルキル、任意選択で置換されたＣ１０－Ｃ３０アルケニル、任意選択で置換されたＣ１０－Ｃ３０アルキニル、任意選択で置換されたＣ１０－Ｃ３０アシル、またはリンカー－リガンドであるが、但し、Ｒ１、Ｒ２及びＲｘのうちの少なくとも１つがＨではなく；
Ｒ３は、Ｈ、任意選択で置換されたＣ１－Ｃ１０アルキル、任意選択で置換されたＣ２－Ｃ１０アルケニル、任意選択で置換されたＣ２－Ｃ１０アルキニル、アルキル複素環、アルキルホスファート、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホロジチオアート、アルキルホスホナート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω－アミノアルキル、ω－（置換）アミノアルキル、ω－ホスホアルキル、ω－チオホスホアルキル、任意選択で置換されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分子量１００～４０Ｋ）、任意選択で置換されたｍＰＥＧ（分子量１２０～４０Ｋ）、ヘテロアリール、もしくは複素環、またリンカーリガンドであり；かつ
ｎは、０、１、２、または３である］。
一実施形態では、実施形態１、２、３、４または５のカチオン性脂質は、式Ｉの構造：
Figure 2023525270000054
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を有する
［式中、
Ｌ１またはＬ２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）Ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－もしくは－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ１またはＬ２の他方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）Ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－もしくは－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であるか、または直接結合であり；
Ｒａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、各出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、または（ｂ）Ｒ１ａが、ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する、のいずれかであり；
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、各出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、または（ｂ）Ｒ２ａが、ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ２ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する、のいずれかであり；
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、各出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、または（ｂ）Ｒ３ａが、ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ３ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する、のいずれかであり；
Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、または（ｂ）Ｒ４ａが、ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する、のいずれかであり；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、メチルまたはシクロアルキルであり；
Ｒ７は、各出現において、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、非置換Ｃ１－Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８及びＲ９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、１個の窒素原子を含む５員、６員または７員の複素環を形成し；
ａ及びｄは、それぞれ独立して、０～２４の整数であり；
ｂ及びｃは、それぞれ独立して、１～２４の整数であり；
ｅは、１または２であり；かつ
ｘは、０、１または２である］。
式Ｉのいくつかの実施形態では、Ｌ１及びＬ２は、独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－または－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。
式Ｉの特定の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａまたはＲ４ａのうちの少なくとも１つがＣ１－Ｃ１２アルキルであるか、あるいはＬ１またはＬ２のうちの少なくとも１つが－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－もしくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。他の実施形態では、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、ａが６の場合にイソプロピルではないか、またはａが８の場合にｎ－ブチルではない。
式Ｉのなおさらなる実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａまたはＲ４ａのうちの少なくとも１つがＣ１－Ｃ１２アルキルであるか、あるいはＬ１またはＬ２のうちの少なくとも１つが－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－もしくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－であり；かつ
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、ａが６の場合にイソプロピルではないか、またはａが８の場合にｎ－ブチルではない。
式Ｉの他の実施形態では、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、非置換Ｃ１－Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８とＲ９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、１個の窒素原子を含む５員、６員もしくは７員の複素環を形成する。
式Ｉの特定の実施形態では、Ｌ１またはＬ２のいずれか一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－または炭素－炭素二重結合であり得る。Ｌ１及びＬ２は、それぞれが－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－であり得、またそれぞれが炭素－炭素二重結合でもあり得る。
式Ｉのいくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。他の実施形態では、Ｌ１及びＬ２の両方が－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。
式Ｉのいくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２の一方は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。他の実施形態では、Ｌ１及びＬ２の両方が－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。
式Ｉの他のいくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２の一方は、炭素－炭素二重結合である。他の実施形態では、Ｌ１及びＬ２のどちらも、炭素－炭素二重結合である。
式Ｉのさらに他の実施形態では、Ｌ１またはＬ２の一方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－であり、Ｌ１またはＬ２の他方は－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。より多くの実施形態では、Ｌ１またはＬ２の一方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－であり、Ｌ１またはＬ２の他方は炭素－炭素二重結合である。さらに多くの実施形態では、Ｌ１またはＬ２の一方は－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ１またはＬ２の他方は炭素－炭素二重結合である。
「炭素－炭素」二重結合は、本明細書全体を通して使用される場合、以下の構造のうちの１つを指すことが理解される：
Figure 2023525270000055
［式中、Ｒａ及びＲｂは、各出現において、独立して、Ｈまたは置換基である］。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒａ及びＲｂは、各出現において、独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１２アルキルまたはシクロアルキルであり、例えば、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルである。
他の実施形態では、式Ｉの脂質化合物は、以下の式（Ｉａ）を有する。
Figure 2023525270000056
他の実施形態では、式Ｉの脂質化合物は、以下の式（Ｉｂ）を有する。
Figure 2023525270000057
さらに別の実施形態では、式Ｉの脂質化合物は、以下の式（Ｉｃ）を有する。
Figure 2023525270000058
式Ｉの脂質化合物の特定の実施形態では、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、それぞれ独立して、２～１２の整数または４～１２の整数である。他の実施形態では、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、それぞれ独立して、８～１２または５～９の整数である。いくつかの特定の実施形態では、ａは、０である。いくつかの実施形態では、ａは、１である。他の実施形態では、ａは、２である。より多くの実施形態では、ａは、３である。さらに別の実施形態では、ａは、４である。いくつかの実施形態では、ａは、５である。他の実施形態では、ａは、６である。より多くの実施形態では、ａは、７である。さらに別の実施形態では、ａは、８である。いくつかの実施形態では、ａは、９である。他の実施形態では、ａは、１０である。より多くの実施形態では、ａは、１１である。さらに別の実施形態では、ａは、１２である。いくつかの実施形態では、ａは、１３である。他の実施形態では、ａは、１４である。より多くの実施形態では、ａは、１５である。さらに別の実施形態では、ａは、１６である。
式Ｉの他のいくつかの実施形態では、ｂは、１である。他の実施形態では、ｂは、２である。より多くの実施形態では、ｂは、３である。さらに別の実施形態では、ｂは、４である。いくつかの実施形態では、ｂは、５である。他の実施形態では、ｂは、６である。より多くの実施形態では、ｂは、７である。さらに別の実施形態では、ｂは、８である。いくつかの実施形態では、ｂは、９である。他の実施形態では、ｂは、１０である。より多くの実施形態では、ｂは、１１である。さらに別の実施形態では、ｂは、１２である。いくつかの実施形態では、ｂは、１３である。他の実施形態では、ｂは、１４である。より多くの実施形態では、ｂは、１５である。さらに別の実施形態では、ｂは、１６である。
式Ｉのさらにより多くの実施形態では、ｃは、１である。他の実施形態では、ｃは、２である。より多くの実施形態では、ｃは、３である。さらに別の実施形態では、ｃは、４である。いくつかの実施形態では、ｃは、５である。他の実施形態では、ｃは、６である。より多くの実施形態では、ｃは、７である。さらに別の実施形態では、ｃは、８である。いくつかの実施形態では、ｃは、９である。他の実施形態では、ｃは、１０である。より多くの実施形態では、ｃは、１１である。さらに別の実施形態では、ｃは、１２である。いくつかの実施形態では、ｃは、１３である。他の実施形態では、ｃは、１４である。より多くの実施形態では、ｃは、１５である。さらに別の実施形態では、ｃは、１６である。
式Ｉのいくつかの他の特定の実施形態では、ｄは、０である。いくつかの実施形態では、ｄは、１である。他の実施形態では、ｄは、２である。より多くの実施形態では、ｄは、３である。さらに別の実施形態では、ｄは、４である。いくつかの実施形態では、ｄは、５である。他の実施形態では、ｄは、６である。より多くの実施形態では、ｄは、７である。さらに別の実施形態では、ｄは、８である。いくつかの実施形態では、ｄは、９である。他の実施形態では、ｄは、１０である。より多くの実施形態では、ｄは、１１である。さらに別の実施形態では、ｄは、１２である。いくつかの実施形態では、ｄは、１３である。他の実施形態では、ｄは、１４。より多くの実施形態では、ｄは、１５である。さらに別の実施形態では、ｄは、１６である。
式Ｉの他のいくつかの様々な実施形態では、ａとｄは同じである。他のいくつかの実施形態では、ｂとｃは同じである。他のいくつかの具体的な実施形態では、ａとｄが同じであり、かつｂとｃが同じである。
式Ｉにおけるａとｂの和、及びｃとｄの和は、所望の特性を有する式Ｉの脂質を得るために変更され得る因子である。一実施形態では、ａ及びｂは、それらの和が１４～２４の範囲の整数となるよう選択される。他の実施形態では、ｃ及びｄは、それらの和が１４～２４の範囲の整数となるよう選択される。さらなる実施形態では、ａとｂの和、及びｃとｄの和は同じである。例えば、いくつかの実施形態では、ａとｂの和、及びｃとｄの和はどちらも、１４～２４の範囲であり得る同じ整数である。さらにより多くの実施形態では、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、ａとｂの和、及びｃとｄの和が１２以上となるよう選択される。
式Ｉのいくつかの実施形態では、ｅは、１である。他の実施形態では、ｅは、２である。
式ＩのＲ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａにおける置換基は、特に限定されない。特定の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａは、各出現においてＨである。他の特定の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ、Ｒ３ａ及びＲ４ａのうちの少なくとも１つは、Ｃ１－Ｃ１２アルキルである。他の特定の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａのうちの少なくとも１は、Ｃ１－Ｃ８アルキルである。他の特定の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａのうちの少なくとも１つは、Ｃ１－Ｃ６アルキルである。前述の実施形態のうちのいくつかでは、Ｃ１－Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。
式Ｉの特定の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各出現においてＣ１－Ｃ１２アルキルである。
式Ｉのさらなる実施形態では、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ及びＲ４ｂのうちの少なくとも１つがＨであるか、またはＲ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ及びＲ４ｂは、各出現においてＨである。
式Ｉの特定の実施形態では、Ｒ１ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する。前述のものの他の実施形態では、Ｒ４ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する。
式ＩのＲ５及びＲ６における置換基は、前述の実施形態においては特に限定されない。特定の実施形態では、Ｒ５またはＲ６の一方または両方が、メチルである。他の特定の実施形態では、Ｒ５またはＲ６の一方または両方が、シクロアルキル、例えば、シクロヘキシルである。これらの実施形態では、シクロアルキルは、置換される場合も置換されない場合もある。他の特定の実施形態では、シクロアルキルは、Ｃ１－Ｃ１２アルキル、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルで置換される。
Ｒ７における置換基は、式Ｉの前述の実施形態においては特に限定されない。特定の実施形態では、少なくとも１つのＲ７はＨである。他のいくつかの実施形態では、Ｒ７は、各出現においてＨである。他の特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ１－Ｃ１２アルキルである。
式Ｉの前述の実施形態の他の特定のものでは、Ｒ８またはＲ９の一方は、メチルである。他の実施形態では、Ｒ８及びＲ９のどちらもメチルである。
式Ｉのいくつかの異なる実施形態では、Ｒ８とＲ９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、５員、６員または７員の複素環を形成する。前述のもののいくつかの実施形態では、Ｒ８とＲ９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、５員複素環、例えば、ピロリジニル環を形成する。
実施形態３のいくつかの実施形態では、第１及び第２のカチオン性脂質はそれぞれ、独立して、式Ｉの脂質から選択される。
様々な異なる実施形態では、式Ｉの脂質は、下表１に記載の構造のうちの１つを有する。
（表１）
Figure 2023525270000059
Figure 2023525270000060
Figure 2023525270000061
Figure 2023525270000062
Figure 2023525270000063
Figure 2023525270000064
いくつかの実施形態では、実施形態１、２、３、４または５のカチオン性脂質は、式ＩＩの構造：
Figure 2023525270000065
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を有する
［式中、
Ｌ１またはＬ２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）Ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－もしくは－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ１またはＬ２の他方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）Ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝０）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－もしくは－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であるか、または直接結合であり；
Ｇ１は、Ｃ１－Ｃ２アルキレン、－（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－または直接結合であり；
Ｇ２は、－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－または直接結合であり；
Ｇ３は、Ｃ１－Ｃ６アルキレンであり；
Ｒａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、各出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、または（ｂ）Ｒ１ａが、ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する、のいずれかであり；
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、各出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、または（ｂ）Ｒ２ａが、ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ２ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する、のいずれかであり；
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、各出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、または（ｂ）Ｒ３ａが、ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ３ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する、のいずれかであり；
Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、または（ｂ）Ｒ４ａが、ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する、のいずれかであり；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、Ｈまたはメチルであり；
Ｒ７は、Ｃ４－Ｃ２０アルキルであり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８及びＲ９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって５員、６員または７員の複素環を形成し；
ａ、ｂ、ｃ及びｄは、それぞれ独立して、１～２４の整数であり；かつ
ｘは、０、１または２である］。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－または直接結合である。他の実施形態では、Ｇ１及びＧ２は、それぞれ独立して、－（Ｃ＝Ｏ）－または直接結合である。いくつかの異なる実施形態では、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－または直接結合であり、Ｇ１及びＧ２は、それぞれ独立して、－（Ｃ＝Ｏ）－または直接結合である。
式（ＩＩ）のいくつかの異なる実施形態では、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）Ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａ－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲａＳ（Ｏ）ＸＮＲａ－、－ＮＲａＳ（Ｏ）ｘ－または－Ｓ（Ｏ）ＸＮＲａ－である。
式（ＩＩ）の前述の実施形態の他のものでは、脂質化合物は、以下の式（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）のうちの１つを有する。
Figure 2023525270000066
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、脂質化合物は、式（ＩＩＡ）を有する。他の実施形態では、脂質化合物は、式（ＩＩＢ）を有する。
式（ＩＩ）の前述の実施形態のいずれかでは、Ｌ１またはＬ２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々が、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。
式（ＩＩ）のいくつかの異なる実施形態では、Ｌ１またはＬ２の一方は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々が、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。
式（ＩＩ）の異なる実施形態では、Ｌ１またはＬ２の一方は、直接結合である。本明細書で使用される場合、「直接結合」とは、基（例えば、Ｌ１またはＬ２）が不在であることを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々が、直接結合である。
式（ＩＩ）の他の異なる実施形態では、Ｒ１ａ及びＲ１ｂの少なくとも１つの出現について、Ｒ１ａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する。
式（ＩＩ）のさらに他の異なる実施形態では、Ｒ４ａ及びＲ４ｂの少なくとも１つの出現について、Ｒ４ａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する。
式（ＩＩ）のより多くの実施形態では、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの少なくとも１つの出現について、Ｒ２ａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ２ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する。
式（ＩＩ）の他の異なる実施形態では、Ｒ３ａ及びＲ３ｂの少なくとも１つの出現について、Ｒ３ａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ３ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する。
式（ＩＩ）の様々な他の実施形態では、脂質化合物は、以下の式（ＩＩＣ）または（ＩＩＤ）のうちの１つを有する：
Figure 2023525270000067
［式中、ｅ、ｆ、ｇ及びｈは、それぞれ独立して、１～１２の整数である］。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、脂質化合物は、式（ＩＩＣ）を有する。他の実施形態では、脂質化合物は、式（ＩＩＤ）を有する。
式（ＩＩＣ）または（ＩＩＤ）の様々な実施形態では、ｅ、ｆ、ｇ及びｈは、それぞれ独立して、４～１０の整数である。
式（ＩＩ）の特定の実施形態では、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、それぞれ独立して、２～１２の整数または４～１２の整数である。他の実施形態では、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、それぞれ独立して、８～１２または５～９の整数である。いくつかの特定の実施形態では、ａは、０である。いくつかの実施形態では、ａは、１である。他の実施形態では、ａは、２である。より多くの実施形態では、ａは、３である。さらに別の実施形態では、ａは、４である。いくつかの実施形態では、ａは、５である。他の実施形態では、ａは、６である。より多くの実施形態では、ａは、７である。さらに別の実施形態では、ａは、８である。いくつかの実施形態では、ａは、９である。他の実施形態では、ａは、１０である。より多くの実施形態では、ａは、１１である。さらに別の実施形態では、ａは、１２である。いくつかの実施形態では、ａは、１３である。他の実施形態では、ａは、１４である。より多くの実施形態では、ａは、１５である。さらに別の実施形態では、ａは、１６である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｂは、１である。他の実施形態では、ｂは、２である。より多くの実施形態では、ｂは、３である。さらに別の実施形態では、ｂは、４である。いくつかの実施形態では、ｂは、５である。他の実施形態では、ｂは、６である。より多くの実施形態では、ｂは、７である。さらに別の実施形態では、ｂは、８である。いくつかの実施形態では、ｂは、９である。他の実施形態では、ｂは、１０である。より多くの実施形態では、ｂは、１１である。さらに別の実施形態では、ｂは、１２である。いくつかの実施形態では、ｂは、１３である。他の実施形態では、ｂは、１４である。より多くの実施形態では、ｂは、１５である。さらに別の実施形態では、ｂは、１６である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｃは、１である。他の実施形態では、ｃは、２である。より多くの実施形態では、ｃは、３である。さらに別の実施形態では、ｃは、４である。いくつかの実施形態では、ｃは、５である。他の実施形態では、ｃは、６である。より多くの実施形態では、ｃは、７である。さらに別の実施形態では、ｃは、８である。いくつかの実施形態では、ｃは、９である。他の実施形態では、ｃは、１０である。より多くの実施形態では、ｃは、１１である。さらに別の実施形態では、ｃは、１２である。いくつかの実施形態では、ｃは、１３である。他の実施形態では、ｃは、１４である。より多くの実施形態では、ｃは、１５である。さらに別の実施形態では、ｃは、１６である。
式（ＩＩ）のいくつかの特定の実施形態では、ｄは、０である。いくつかの実施形態では、ｄは、１である。他の実施形態では、ｄは、２である。より多くの実施形態では、ｄは、３である。さらに別の実施形態では、ｄは、４である。いくつかの実施形態では、ｄは、５である。他の実施形態では、ｄは、６である。より多くの実施形態では、ｄは、７である。さらに別の実施形態では、ｄは、８である。いくつかの実施形態では、ｄは、９である。他の実施形態では、ｄは、１０である。より多くの実施形態では、ｄは、１１である。さらに別の実施形態では、ｄは、１２である。いくつかの実施形態では、ｄは、１３である。他の実施形態では、ｄは、１４である。より多くの実施形態では、ｄは、１５である。さらに別の実施形態では、ｄは、１６である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｅは、１である。他の実施形態では、ｅは、２である。より多くの実施形態では、ｅは、３である。さらに別の実施形態では、ｅは、４である。いくつかの実施形態では、ｅは、５である。他の実施形態では、ｅは、６である。より多くの実施形態では、ｅは、７である。さらに別の実施形態では、ｅは、８である。いくつかの実施形態では、ｅは、９である。他の実施形態では、ｅは、１０である。より多くの実施形態では、ｅは、１１である。さらに別の実施形態では、ｅは、１２である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｆは、１である。他の実施形態では、ｆは、２である。より多くの実施形態では、ｆは、３である。さらに別の実施形態では、ｆは、４である。いくつかの実施形態では、ｆは、５である。他の実施形態では、ｆは、６である。より多くの実施形態では、ｆは、７である。さらに別の実施形態では、ｆは、８である。いくつかの実施形態では、ｆは、９である。他の実施形態では、ｆは、１０である。より多くの実施形態では、ｆは、１１である。さらに別の実施形態では、ｆは、１２である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｇは、１である。他の実施形態では、ｇは、２である。より多くの実施形態では、ｇは、３である。さらに別の実施形態では、ｇは、４である。いくつかの実施形態では、ｇは、５である。他の実施形態では、ｇは、６である。より多くの実施形態では、ｇは、７である。さらに別の実施形態では、ｇは、８である。いくつかの実施形態では、ｇは、９である。他の実施形態では、ｇは、１０である。より多くの実施形態では、ｇは、１１である。さらに別の実施形態では、ｇは、１２である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｈは、１である。他の実施形態では、ｅは、２である。より多くの実施形態では、ｈは、３である。さらに別の実施形態では、ｈは、４である。いくつかの実施形態では、ｅは、５である。他の実施形態では、ｈは、６である。より多くの実施形態では、ｈは、７である。さらに別の実施形態では、ｈは、８である。いくつかの実施形態では、ｈは、９である。他の実施形態では、ｈは、１０である。より多くの実施形態では、ｈは、１１である。さらに別の実施形態では、ｈは、１２である。
式（ＩＩ）の他のいくつかの様々な実施形態では、ａとｄは同じである。他のいくつかの実施形態では、ｂとｃは同じである。他のいくつかの具体的な実施形態では、ａとｄが同じであり、かつｂとｃが同じである。
式（ＩＩ）のａとｂの和、及びｃとｄの和は、所望の特性を有する脂質を得るために変更され得る因子である。一実施形態では、ａ及びｂは、それらの和が１４～２４の範囲の整数となるよう選択される。他の実施形態では、ｃ及びｄは、それらの和が１４～２４の範囲の整数となるよう選択される。さらなる実施形態では、ａとｂの和、及びｃとｄの和は同じである。例えば、いくつかの実施形態では、ａとｂの和、及びｃとｄの和はどちらも、１４～２４の範囲であり得る同じ整数である。さらにより多くの実施形態では、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、ａとｂの和、及びｃとｄの和が１２以上となるよう選択される。
式（ＩＩ）のＲ１ａ、Ｒ、Ｒ３ａ及びＲ４ａにおける置換基は、特に限定されない。いくつかの実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａのうちの少なくとも１つはＨである。特定の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａは、各出現においてＨである。他の特定の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａのうちの少なくとも１つは、Ｃ１－Ｃ１２アルキルである。他の特定の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａのうちの少なくとも１つは、Ｃ１－Ｃ８アルキルである。他の特定の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａのうちの少なくとも１つは、Ｃ１－Ｃ６アルキルである。前述の実施形態のうちのいくつかでは、Ｃ１－Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。
式（ＩＩ）の特定の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各出現においてＣ１－Ｃ１２アルキルである。
式（ＩＩ）のさらなる実施形態では、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ及びＲ４ｂのうちの少なくとも１つがＨであるか、またはＲ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ及びＲ４ｂは、各出現においてＨである。
式（ＩＩ）の特定の実施形態では、Ｒ１ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する。前述のものの他の実施形態では、Ｒ４ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する。
式（ＩＩ）のＲ５及びＲ６における置換基は、前述の実施形態においては特に限定されない。特定の実施形態では、Ｒ５またはＲ６の一方は、メチルである。他の実施形態では、Ｒ５またはＲ６の各々が、メチルである。
式（ＩＩ）のＲ７における置換基は、前述の実施形態においては特に限定されない。特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ６－Ｃ１６アルキルである。他のいくつかの実施形態では、Ｒ７は、Ｃ６－Ｃ９アルキルである。これらの実施形態のいくつかでは、Ｒ７は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲｂ、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、－ＯＲｂ、－Ｓ（Ｏ）ＸＲｂ、－Ｓ－ＳＲｂ、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｂ、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、－ＮＲａＲｂ、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＯＲｂ、－ＮＲａＳ（Ｏ）ＸＮＲａＲｂ、－ＮＲａＳ（Ｏ）ＸＲｂまたは－Ｓ（Ｏ）ＸＮＲａＲｂで置換され、式中、Ｒａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；Ｒｂは、Ｃ１－Ｃ１５アルキルであり；ｘは、０、１または２である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ７は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲｂまたは－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒｂで置換される。
式（ＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒｂは、分岐Ｃ６－Ｃ１６アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒｂは、以下の構造のうちの１つを有する：
Figure 2023525270000068
式（ＩＩ）の前述の実施形態の他の特定のものでは、Ｒ８またはＲ９の一方は、メチルである。他の実施形態では、Ｒ８及びＲ９のどちらもメチルである。
式（ＩＩ）のいくつかの異なる実施形態では、Ｒ８とＲ９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、５員、６員または７員の複素環を形成する。前述のもののいくつかの実施形態では、Ｒ８及びＲ９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって５員複素環、例えば、ピロリジニル環を形成する。前述のもののいくつかの異なる実施形態では、Ｒ８とＲ９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、６員複素環、例えば、ピペラジニル環を形成する。
実施形態３の特定の実施形態では、第１及び第２のカチオン性脂質はそれぞれ、独立して、式ＩＩの脂質から選択される。
式（ＩＩ）の脂質の前述のもののさらに他の実施形態では、Ｇ３は、Ｃ２－Ｃ４アルキレン、例えば、Ｃ３アルキレンである。様々な異なる実施形態では、脂質化合物は、下表２に記載の構造のうちの１つを有する。
（表２）
Figure 2023525270000069
Figure 2023525270000070
Figure 2023525270000071
Figure 2023525270000072
Figure 2023525270000073
Figure 2023525270000074
Figure 2023525270000075
Figure 2023525270000076
Figure 2023525270000077
他のいくつかの実施形態では、実施形態１、２、３、４または５のカチオン性脂質は、式ＩＩＩの構造：
Figure 2023525270000078
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグもしくは立体異性体を有する
［式中、
Ｌ１またはＬ２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）Ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－もしくは－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ１またはＬ２の他方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）Ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－もしくは－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であるか、もしくは直接結合であり；
Ｇ１及びＧ２は、それぞれ独立して、非置換のＣ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ１－Ｃ１２アルケニレンであり；
Ｇ３は、Ｃ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ１－Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニレンであり；
Ｒａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ６－Ｃ２４アルキルまたはＣ６－Ｃ２４アルケニルであり；
Ｒ３は、Ｈ、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または－ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり；
Ｒ４は、Ｃ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ５は、ＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり；かつ
ｘは、０、１または２である］。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、脂質は、以下の式（ＩＩＩＡ）または（ＩＩＩＢ）のうちの１つを有する：
Figure 2023525270000079
［式中、
Ａは、３～８員のシクロアルキル環またはシクロアルキレン環であり；
Ｒ６は、各出現において、独立して、Ｈ、ＯＨまたはＣ１－Ｃ２４アルキルであり；
ｎは、１～１５の範囲の整数である］。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、脂質は、式（ＩＩＩＡ）を有し、他の実施形態では、脂質は、式（ＩＩＩＢ）を有する。
式（ＩＩＩ）の他の実施形態では、脂質は、以下の式（ＩＩＩＣ）または（ＩＩＩＤ）のうちの１つを有する：
Figure 2023525270000080
［式中、ｙ及びｚは、それぞれ独立して、１～１２の範囲の整数である］。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいずれかでは、Ｌ１またはＬ２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々が、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。前述のもののいずれかのいくつかの異なる実施形態では、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－または－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々が、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。
式（ＩＩＩ）のいくつかの異なる実施形態では、脂質は、以下の式（ＩＩＩＥ）または（ＩＩＩＦ）のうちの１つを有する：
Figure 2023525270000081
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、脂質は、以下の式（ＩＩＩＧ）、（ＩＩＩＨ）、（ＩＩＩＩ）、または（ＩＩＩＪ）のうちの１つを有する：
Figure 2023525270000082
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、ｎは２～１２、例えば、２～８または２～４、の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｎは、３、４、５または６である。いくつかの実施形態では、ｎは、３である。いくつかの実施形態では、ｎは、４である。いくつかの実施形態では、ｎは、５である。いくつかの実施形態では、ｎは、６である。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態の他のいくつかのものでは、ｙ及びｚは、それぞれ独立して、２～１０の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｙ及びｚは、それぞれ独立して、４～９または４～６の範囲の整数である。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ６はＨである。前述の実施形態の他のものでは、Ｒ６は、Ｃ１－Ｃ２４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ６は、ＯＨである。
式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｇ３は、非置換である。他の実施形態では、Ｇ３は、置換されている。様々な異なる実施形態では、Ｇ３は、直鎖Ｃ１－Ｃ２４アルキレンまたは直鎖Ｃ１－Ｃ２４アルケニレンである。
式（ＩＩＩ）の他のいくつかの前述の実施形態では、Ｒ１もしくはＲ２、または両方が、Ｃ６－Ｃ２４アルケニルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、独立して、以下の構造を有する：
Figure 2023525270000083
［式中、
Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、各出現において、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；かつ
ａは、２～１２の整数であり、
ここで、Ｒ７ａ、Ｒｂ及びａはそれぞれ、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して６～２０個の炭素原子を含むよう選択される］。例えば、いくつかの実施形態では、ａは、５～９または８～１２の範囲の整数である。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ７ａの少なくとも１つの出現はＨである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ７ａは、各出現においてＨである。前述のものの他の異なる実施形態では、Ｒ７ｂの少なくとも１つの出現は、Ｃ１－Ｃ８アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ１－Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。
式（ＩＩＩ）の異なる実施形態では、Ｒ１もしくはＲ２、または両方が、以下の構造のうちの１つを有する。
Figure 2023525270000084
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ３は、ＯＨ、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ４である。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、メチルまたはエチルである。
実施形態３のいくつかの具体的な実施形態では、第１及び第２のカチオン性脂質はそれぞれ、独立して、式ＩＩＩの脂質から選択される。
様々な異なる実施形態では、式（ＩＩＩ）の開示の実施形態のいずれか１つのカチオン性脂質（例えば、カチオン性脂質、第１のカチオン性脂質、第２のカチオン性脂質）は、下表３に記載の構造のうちの１つを有する。
（表３）
Figure 2023525270000085
Figure 2023525270000086
Figure 2023525270000087
Figure 2023525270000088
Figure 2023525270000089
Figure 2023525270000090
Figure 2023525270000091
Figure 2023525270000092
一実施形態では、実施形態１、２、３、４または５のいずれか１つのカチオン性脂質は、式（ＩＶ）の構造：
Figure 2023525270000093
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグもしくは立体異性体を有する
［式中、
Ｇ１またはＧ２の一方は、各出現において、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｙ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒａ）－、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒａ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒａ）－もしくは－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｇ１またはＧ２の他方は、各出現において、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｙ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒａ）－、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒａ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒａ）－もしくは－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－であるか、または直接結合であり；
Ｌは、各出現において、～Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－であり、ここで、～は、Ｘへの共有結合を表し；
Ｘは、ＣＲａであり；
Ｚは、アルキル、シクロアルキル、もしくはｎが１の場合に少なくとも１つの極性官能基を含む一価の部分であるか、またはＺは、アルキレン、シクロアルキレン、もしくはｎが１より大きい場合に少なくとも１つの極性官能基を含む多価の部分であり；
Ｒａは、各出現において、独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１２アルキル、Ｃ１－Ｃ１２ヒドロキシルアルキル、Ｃ１－Ｃ１２アミノアルキル、Ｃ１－Ｃ１２アルキルアミニルアルキル、Ｃ１－Ｃ１２アルコキシアルキル、Ｃ１－Ｃ１２アルコキシカルボニル、Ｃ１－Ｃ１２アルキルカルボニルオキシ、Ｃ１－Ｃ１２アルキルカルボニルオキシアルキルまたはＣ１－Ｃ１２アルキルカルボニルであり；
Ｒは、各出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；または
（ｂ）Ｒは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する、のいずれかであり；
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、各出現において、以下の構造を有し、
Figure 2023525270000094
ａ１及びａ２は、各出現において、独立して、３～１２の整数であり；
ｂ１及びｂ２は、各出現において、独立して、０または１であり；
ｃ１及びｃ２は、各出現において、独立して、５～１０の整数であり；
ｄ１及びｄ２は、各出現において、独立して、５～１０の整数であり；
ｙは、各出現において、独立して、０～２の整数であり；かつ
ｎは、１～６の整数であり、
ここで、各アルキル、アルキレン、ヒドロキシルアルキル、アミノアルキル、アルキルアミニルアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルカルボニルオキシアルキル及びアルキルカルボニルは、任意選択で、１つ以上の置換基で置換される］。
式（ＩＶ）のいくつかの実施形態では、Ｇ１及びＧ２は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－または－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。
式（ＩＶ）の他の実施形態では、Ｘは、ＣＨである。
式（ＩＶ）の異なる実施形態では、ａ１＋ｂ１＋ｃ１の和またはａ２＋ｂ２＋ｃ２の和は、１２～２６の整数である。
式（ＩＶ）のさらに他の実施形態では、ａ１及びａ２は、独立して、３～１０の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ａ１及びａ２は、独立して、４～９の整数である。
式（ＩＶ）の様々な実施形態では、ｂ１及びｂ２は、０である。異なる実施形態では、ｂ１及びｂ２は、１である。
式（ＩＶ）のより多くの実施形態では、ｃ１、ｃ２、ｄ１及びｄ２は、独立して、６～８の整数である。
式（ＩＶ）の他の実施形態では、ｃ１及びｃ２は、各出現において、独立して、６～１０の整数であり、ｄ１及びｄ２は、各出現において、独立して、６～１０の整数である。
式（ＩＶ）の他の実施形態では、ｃ１及びｃ２は、各出現において、独立して、５～９の整数であり、ｄ１及びｄ２は、各出現において、独立して、５～９の整数である。
式（ＩＶ）のより多くの実施形態では、Ｚは、アルキル、シクロアルキル、またはｎが１の場合に少なくとも１つの極性官能基を含む一価の部分である。他の実施形態では、Ｚは、アルキルである。
式（ＩＶ）の前述のものの様々な実施形態では、Ｒは、各出現において、独立して、（ａ）Ｈもしくはメチルであり；または（ｂ）Ｒは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する、のいずれかである。特定の実施形態では、各ＲはＨである。他の実施形態では、少なくとも１つのＲは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する。
式（ＩＶ）の化合物の他の実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、独立して、以下の構造のうちの１つを有する：
Figure 2023525270000095
式（ＩＶ）の特定の実施形態では、化合物は、以下の構造のうちの１つを有する：
Figure 2023525270000096
Figure 2023525270000097
Figure 2023525270000098
Figure 2023525270000099
さらに異なる実施形態では、実施形態１、２、３、４または５のカチオン性脂質は、式（Ｖ）の構造：
Figure 2023525270000100
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグもしくは立体異性体を有する
［式中、
Ｇ１またはＧ２の一方は、各出現において、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｙ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒａ）－、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒａ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒａ）－もしくは－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｇ１またはＧ２の他方は、各出現において、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｙ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒａ）－、－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒａ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒａ）－もしくは－Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－であるか、もしくは直接結合であり；
Ｌは、各出現において、～Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－であり、ここで、～は、Ｘへの共有結合を表し；
Ｘは、ＣＲａであり；
Ｚは、アルキル、シクロアルキル、もしくはｎが１の場合に少なくとも１つの極性官能基を含む一価の部分であるか、またはＺは、アルキレン、シクロアルキレン、もしくはｎが１より大きい場合に少なくとも１つの極性官能基を含む多価の部分であり；
Ｒａは、各出現において、独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１２アルキル、Ｃ１－Ｃ１２ヒドロキシルアルキル、Ｃ１－Ｃ１２アミノアルキル、Ｃ１－Ｃ１２アルキルアミニルアルキル、Ｃ１－Ｃ１２アルコキシアルキル、Ｃ１－Ｃ１２アルコキシカルボニル、Ｃ１－Ｃ１２アルキルカルボニルオキシ、Ｃ１－Ｃ１２アルキルカルボニルオキシアルキルまたはＣ１－Ｃ１２アルキルカルボニルであり；
Ｒは、各出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；または
（ｂ）Ｒは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する、のいずれかであり；
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、各出現において、以下の構造を有し、
Figure 2023525270000101
Ｒ’は、各出現において、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
ａ１及びａ２は、各出現において、独立して、３～１２の整数であり；
ｂ１及びｂ２は、各出現において、独立して、０または１であり；
ｃ１及びｃ２は、各出現において、独立して、２～１２の整数であり；
ｄ１及びｄ２は、各出現において、独立して、２～１２の整数であり；
ｙは、各出現において、独立して、０～２の整数であり；かつ
ｎは、１～６の整数であり、
ここで、ａ１、ａ２、ｃ１、ｃ２、ｄ１及びｄ２は、ａ１＋ｃ１＋ｄ１の和が１８～３０の整数であり、ａ２＋ｃ２＋ｄ２の和が１８～３０の整数となるよう選択され、ここで、各アルキル、アルキレン、ヒドロキシルアルキル、アミノアルキル、アルキルアミニルアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルカルボニルオキシアルキル及びアルキルカルボニルは、任意選択で、１つ以上の置換基で置換される］。
式（Ｖ）の特定の実施形態では、Ｇ１及びＧ２は、それぞれ独立して
－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－または－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。
式（Ｖ）の他の実施形態では、Ｘは、ＣＨである。
式（Ｖ）のいくつかの実施形態では、ａ１＋ｃ１＋ｄ１の和は２０～３０の整数であり、ａ２＋ｃ２＋ｄ２の和は１８～３０の整数である。他の実施形態では、ａ１＋ｃ１＋ｄ１の和は２０～３０の整数であり、ａ２＋ｃ２＋ｄ２の和は２０～３０の整数である。
式（Ｖ）のより多くの実施形態では、ａ１＋ｂ１＋ｃの和またはａ＋ｂ＋ｃの和は、１２～２６の整数である。他の実施形態では、ｃ１、ｃ２、ｄ１及びｄ２は、ａ１＋ｃ１＋ｄ１の和が１８～２８の整数であり、ａ２＋ｃ２＋ｄ２の和が１８～２８の整数となるよう選択される。
式（Ｖ）のさらに他の実施形態では、ａ１及びａ２は、独立して、３～１０の整数、例えば、４～９の整数である。
式（Ｖ）のさらに他の実施形態では、ｂ１及びｂ２は、０である。異なる実施形態では、ｂ１及びｂ２は、１である。
式（Ｖ）の他の特定の実施形態では、ｃ１、ｃ２、ｄ１及びｄ２は、独立して、６～８の整数である。
式（Ｖ）の異なる他の実施形態では、Ｚは、アルキル、もしくはｎが１の場合に少なくとも１つの極性官能基を含む一価の部分であるか、またはＺは、アルキレン、もしくはｎが１より大きい場合に少なくとも１つの極性官能基を含む多価の部分である。
式（Ｖ）のより多くの実施形態では、Ｚは、アルキル、シクロアルキル、またはｎが１の場合に少なくとも１つの極性官能基を含む一価の部分である。他の実施形態では、Ｚは、アルキルである。
式（Ｖ）の他の異なる実施形態では、Ｒは、各出現において、独立して、（ａ）Ｈもしくはメチルであり；または（ｂ）Ｒは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する、のいずれかである。例えば、いくつかの実施形態では、各ＲはＨである。他の実施形態では、少なくとも１つのＲは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する。
より多くの実施形態では、各Ｒ’はＨである。
式（Ｖ）の特定の実施形態では、ａ１＋ｃ１＋ｄ１の和は２０～２５の整数であり、ａ２＋ｃ２＋ｄ２の和は２０～２５の整数である。
式（Ｖ）の他の実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、独立して、以下の構造のうちの１つを有する：
Figure 2023525270000102
式（Ｖ）のより多くの実施形態では、化合物は、以下の構造のうちの１つを有する：
Figure 2023525270000103
Figure 2023525270000104
Figure 2023525270000105
Figure 2023525270000106
式（ＩＶ）または（Ｖ）の前述の実施形態のいずれかでは、ｎは１である。
式（ＩＶ）または（Ｖ）の前述の実施形態の他のものでは、ｎは１より大きい。
式（ＩＶ）または（Ｖ）の前述の実施形態のいずれかの多くのものでは、Ｚは、少なくとも１つの極性官能基を含む一価または多価の部分である。いくつかの実施形態では、Ｚは、少なくとも１つの極性官能基を含む一価の部分である。他の実施形態では、Ｚは、少なくとも１つの極性官能基を含む多価の部分である。
式（ＩＶ）または（Ｖ）の前述の実施形態のいずれかの多くのものでは、極性官能基は、ヒドロキシル、アルコキシ、エステル、シアノ、アミド、アミノ、アルキルアミニル、ヘテロシクリルまたはヘテロアリール官能基である。
式（ＩＶ）または（Ｖ）の前述の実施形態のいずれかでは、Ｚは、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミニル、アルキルアミニルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルである。
式（ＩＶ）または（Ｖ）の他のいくつかの実施形態では、Ｚは、以下の構造を有する：
Figure 2023525270000107
［式中、
Ｒ５及びＲ６は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり；
Ｒ７及びＲ８は、独立して、ＨもしくはＣ１－Ｃ６アルキルであるか、またはＲ７及びＲ８は、それらが結合している窒素原子と一緒になって連結し、３～７員複素環を形成し；かつ
ｘは、０～６の整数である］。
式（ＩＶ）または（Ｖ）のさらに異なる実施形態では、Ｚは、以下の構造を有する：
Figure 2023525270000108
［式中、
Ｒ５及びＲ６は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり；
Ｒ７及びＲ８は、独立して、ＨもしくはＣ１－Ｃ６アルキルであるか、またはＲ及びＲ８は、それらが結合している窒素原子と一緒になって連結し、３～７員複素環を形成し；かつ
ｘは、０～６の整数である］。
式（ＩＶ）または（Ｖ）のさらに異なる実施形態では、Ｚは、以下の構造を有する：
Figure 2023525270000109
［式中、
Ｒ５及びＲ６は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり；
Ｒ７及びＲ８は、独立して、ＨもしくはＣ１－Ｃ６アルキルであるか、またはＲ及びＲ８は、それらが結合している窒素原子と一緒になって連結し、３～７員複素環を形成し；かつ
ｘは、０～６の整数である］。
式（ＩＶ）または（Ｖ）の他のいくつかの実施形態では、Ｚは、ヒドロキシルアルキル、シアノアルキル、または１つ以上のエステルもしくはアミド基で置換されるアルキルである。
例えば、式（ＩＶ）または（Ｖ）の前述の実施形態のいずれかでは、Ｚは、以下の構造を有する：
Figure 2023525270000110
式（ＩＶ）または（Ｖ）の他の実施形態では、Ｚ－Ｌは、以下の構造のうちの１つを有する：
Figure 2023525270000111
Figure 2023525270000112
他の実施形態では、Ｚ－Ｌは、以下の構造のうちの１つを有する：
Figure 2023525270000113
さらに他の実施形態では、Ｘは、ＣＨであり、Ｚ－Ｌは、以下の構造のうちの１つを有する：
Figure 2023525270000114
様々な異なる実施形態では、実施形態１、２、３、４または５のいずれか１つのカチオン性脂質は、下表４に記載の構造のうちの１つを有する。
（表４）
Figure 2023525270000115
一実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造（ＶＩ）：
Figure 2023525270000116
を有する化合物、
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）Ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＮＲａＣ（～Ｏ）Ｏ－または直接結合であり；
Ｇ１は、Ｃ１－Ｃ２アルキレン、－（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－または直接結合であり；
Ｇ２は、－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－または直接結合であり；
Ｇ３は、Ｃ１－Ｃ６アルキレンであり；
Ｒａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、各出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、または（ｂ）Ｒ１ａが、ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する、のいずれかであり；
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、各出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、または（ｂ）Ｒ２ａが、ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ２ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する、のいずれかであり；
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、各出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、または（ｂ）Ｒ３ａが、ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ３ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する、のいずれかであり；
Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、または（ｂ）Ｒ４ａが、ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する、のいずれかであり；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、Ｈまたはメチルであり；
Ｒ７は、ＨまたはＣ１－Ｃ２０アルキルであり；
Ｒ８は、ＯＨ、－Ｎ（Ｒ９）（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１０、－（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０、－ＮＲ９Ｒ１０、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ１１または－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１１であるが、但し、Ｒ８が－ＮＲ９Ｒ１０の場合、Ｇ３は、Ｃ４－Ｃ６アルキレンであり、
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１１は、アラルキルであり；
ａ、ｂ、ｃ及びｄは、それぞれ独立して、１～２４の整数であり；かつ
ｘは、０、１または２であり、
ここで、各アルキル、アルキレン及びアラルキルは、任意選択で置換される。
構造（ＶＩ）のいくつかの実施形態では、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－または直接結合である。他の実施形態では、Ｇ１及びＧ２は、それぞれ独立して、－（Ｃ＝Ｏ）－または直接結合である。いくつかの異なる実施形態では、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－または直接結合であり、Ｇ１及びＧ２は、それぞれ独立して、－（Ｃ＝Ｏ）－または直接結合である。
構造（ＶＩ）のいくつかの異なる実施形態では、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）Ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａ－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲａＳ（Ｏ）ＸＮＲａ－、－ＮＲａＳ（Ｏ）Ｘ－または－Ｓ（Ｏ）ＸＮＲａ－である。
構造（ＶＩ）の前述の実施形態の他のものでは、化合物は、以下の構造（ＶＩＡ）または（ＶＩＢ）のうちの１つを有する：
Figure 2023525270000117
いくつかの実施形態では、化合物は、構造（ＶＩＡ）を有する。他の実施形態では、化合物は、構造（ＶＩＢ）を有する。
構造（ＶＩ）の前述の実施形態のいずれかでは、Ｌ１またはＬ２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々が、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。
前述のもののいずれかのいくつかの異なる実施形態では、Ｌ１またはＬ２の一方は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々が、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。
構造（ＶＩ）の異なる実施形態では、Ｌ１またはＬ２の一方は、直接結合である。本明細書で使用される場合、「直接結合」とは、基（例えば、Ｌ１またはＬ２）が不在であることを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々が、直接結合である。
前述のものの他の異なる実施形態では、Ｒ１ａ及びＲ１ｂの少なくとも１つの出現について、Ｒ１ａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する。
構造（ＶＩ）のさらに他の異なる実施形態では、Ｒ４ａ及びＲ４ｂの少なくとも１つの出現について、Ｒ４ａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する。
構造（ＶＩ）のより多くの実施形態では、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの少なくとも１つの出現について、Ｒ２ａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、及びＲ２ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ２ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する。
他の異なる実施形態では、前述のもののいずれかの、Ｒ３ａ及びＲ３ｂの少なくとも１つの出現について、Ｒ３ａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ３ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する。
「炭素－炭素」二重結合は、以下の構造のうちの１つを指すことが理解される：
Figure 2023525270000118
［式中、Ｒｃ及びＲｄは、各出現において、独立して、Ｈまたは置換基である］。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒｃ及びＲｄは、各出現において、独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１２アルキルまたはシクロアルキルであり、例えば、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルである。
様々な他の実施形態では、化合物は、以下の構造（ＶＩＣ）または（ＶＩＤ）：
Figure 2023525270000119
のうちの１つを有し、
式中、ｅ、ｆ、ｇ及びｈは、それぞれ独立して、１～１２の整数である。
いくつかの実施形態では、化合物は、構造（ＶＩＣ）を有する。他の実施形態では、化合物は、構造（ＶＩＤ）を有する。
構造（ＶＩＣ）または（ＶＩＤ）の化合物の様々な実施形態では、ｅ、ｆ、ｇ及びｈは、それぞれ独立して、４～１０の整数である。
さらに別の実施形態では、
Figure 2023525270000120
もしくは
Figure 2023525270000121
または両方が、独立して、以下の構造のうちの１つを有する：
Figure 2023525270000122
特定の実施形態では、前述のものの、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、それぞれ独立して、２～１２の整数または４～１２の整数である。他の実施形態では、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、それぞれ独立して、８～１２または５～９の整数である。いくつかの特定の実施形態では、ａは、０である。いくつかの実施形態では、ａは、１である。他の実施形態では、ａは、２である。より多くの実施形態では、ａは、３である。さらに別の実施形態では、ａは、４である。いくつかの実施形態では、ａは、５である。他の実施形態では、ａは、６である。より多くの実施形態では、ａは、７である。さらに別の実施形態では、ａは、８である。いくつかの実施形態では、ａは、９である。他の実施形態では、ａは、１０である。より多くの実施形態では、ａは、１１である。さらに別の実施形態では、ａは、１２である。いくつかの実施形態では、ａは、１３である。他の実施形態では、ａは、１４である。より多くの実施形態では、ａは、１５である。さらに別の実施形態では、ａは、１６である。
構造（ＶＩ）のいくつかの実施形態では、ｂは、１である。他の実施形態では、ｂは、２である。より多くの実施形態では、ｂは、３である。さらに別の実施形態では、ｂは、４である。いくつかの実施形態では、ｂは、５である。他の実施形態では、ｂは、６である。より多くの実施形態では、ｂは、７である。さらに別の実施形態では、ｂは、８である。いくつかの実施形態では、ｂは、９である。他の実施形態では、ｂは、１０である。より多くの実施形態では、ｂは、１１である。さらに別の実施形態では、ｂは、１２である。いくつかの実施形態では、ｂは、１３である。他の実施形態では、ｂは、１４である。より多くの実施形態では、ｂは、１５である。さらに別の実施形態では、ｂは、１６である。
構造（ＶＩ）のいくつかの実施形態では、ｃは、１である。他の実施形態では、ｃは、２である。より多くの実施形態では、ｃは、３である。さらに別の実施形態では、ｃは、４である。いくつかの実施形態では、ｃは、５である。他の実施形態では、ｃは、６である。より多くの実施形態では、ｃは、７である。さらに別の実施形態では、ｃは、８である。いくつかの実施形態では、ｃは、９である。他の実施形態では、ｃは、１０である。より多くの実施形態では、ｃは、１１である。さらに別の実施形態では、ｃは、１２である。いくつかの実施形態では、ｃは、１３である。他の実施形態では、ｃは、１４である。より多くの実施形態では、ｃは、１５である。さらに別の実施形態では、ｃは、１６である。
構造（ＶＩ）のいくつかの特定の実施形態では、ｄは、０である。いくつかの実施形態では、ｄは、１である。他の実施形態では、ｄは、２である。より多くの実施形態では、ｄは、３である。さらに別の実施形態では、ｄは、４である。いくつかの実施形態では、ｄは、５である。他の実施形態では、ｄは、６である。より多くの実施形態では、ｄは、７である。さらに別の実施形態では、ｄは、８である。いくつかの実施形態では、ｄは、９である。他の実施形態では、ｄは、１０である。より多くの実施形態では、ｄは、１１である。さらに別の実施形態では、ｄは、１２である。いくつかの実施形態では、ｄは、１３である。他の実施形態では、ｄは、１４である。より多くの実施形態では、ｄは、１５である。さらに別の実施形態では、ｄは、１６である。
構造（ＶＩ）のいくつかの実施形態では、ｅは、１である。他の実施形態では、ｅは、２である。より多くの実施形態では、ｅは、３である。さらに別の実施形態では、ｅは、４である。いくつかの実施形態では、ｅは、５である。他の実施形態では、ｅは、６である。より多くの実施形態では、ｅは、７である。さらに別の実施形態では、ｅは、８である。いくつかの実施形態では、ｅは、９である。他の実施形態では、ｅは、１０である。より多くの実施形態では、ｅは、１１である。さらに別の実施形態では、ｅは、１２である。
構造（ＶＩ）のいくつかの実施形態では、ｆは、１である。他の実施形態では、ｆは、２である。より多くの実施形態では、ｆは、３である。さらに別の実施形態では、ｆは、４である。いくつかの実施形態では、ｆは、５である。他の実施形態では、ｆは、６である。より多くの実施形態では、ｆは、７である。さらに別の実施形態では、ｆは、８である。いくつかの実施形態では、ｆは、９である。他の実施形態では、ｆは、１０である。より多くの実施形態では、ｆは、１１である。さらに別の実施形態では、ｆは、１２である。
構造（ＶＩ）のいくつかの実施形態では、ｇは、１である。他の実施形態では、ｇは、２である。より多くの実施形態では、ｇは、３である。さらに別の実施形態では、ｇは、４である。いくつかの実施形態では、ｇは、５である。他の実施形態では、ｇは、６である。より多くの実施形態では、ｇは、７である。さらに別の実施形態では、ｇは、８である。いくつかの実施形態では、ｇは、９である。他の実施形態では、ｇは、１０である。より多くの実施形態では、ｇは、１１である。さらに別の実施形態では、ｇは、１２である。
構造（ＶＩ）のいくつかの実施形態では、ｈは、１である。他の実施形態では、ｅは、２である。より多くの実施形態では、ｈは、３である。さらに別の実施形態では、ｈは、４である。いくつかの実施形態では、ｅは、５である。他の実施形態では、ｈは、６である。より多くの実施形態では、ｈは、７である。さらに別の実施形態では、ｈは、８である。いくつかの実施形態では、ｈは、９である。他の実施形態では、ｈは、１０である。より多くの実施形態では、ｈは、１１である。さらに別の実施形態では、ｈは、１２である。
構造（ＶＩ）の他のいくつかの様々な実施形態では、ａとｄは同じである。他のいくつかの実施形態では、ｂとｃは同じである。他のいくつかの具体的な実施形態では、ａとｄが同じであり、かつｂとｃが同じである。
ａとｂの和、及びｃとｄの和は、所望の特性を有する脂質を得るために変更され得る因子である。一実施形態では、ａ及びｂは、それらの和が１４～２４の範囲の整数となるよう選択される。他の実施形態では、ｃ及びｄは、それらの和が１４～２４の範囲の整数となるよう選択される。さらなる実施形態では、ａとｂの和、及びｃとｄの和は同じである。例えば、いくつかの実施形態では、ａとｂの和、及びｃとｄの和はどちらも、１４～２４の範囲であり得る同じ整数である。さらにより多くの実施形態では、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、ａとｂの和、及びｃとｄの和が１２以上となるよう選択される。
Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａにおける置換基は、特に限定されない。いくつかの実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａのうちの少なくとも１つはＨである。特定の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａは、各出現においてＨである。他の特定の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａのうちの少なくとも１つは、Ｃ１－Ｃ１２アルキルである。他の特定の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａのうちの少なくとも１つは、Ｃ１－Ｃ８アルキルである。他の特定の実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａのうちの少なくとも１つは、Ｃ１－Ｃ６アルキルである。前述の実施形態のうちのいくつかでは、Ｃ１－Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。
特定の実施形態では、前述のものの、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各出現においてＣ１－Ｃ１２アルキルである。
前述のもののさらなる実施形態では、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ及びＲ４ｂのうちの少なくとも１つがＨであるか、またはＲ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ及びＲ４ｂは、各出現においてＨである。
特定の実施形態では、前述のものの、Ｒ１ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する。前述のものの他の実施形態では、Ｒ４ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接Ｒ４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成する。
Ｒ５及びＲ６における置換基は、前述の実施形態においては特に限定されない。特定の実施形態では、Ｒ５またはＲ６の一方は、メチルである。他の実施形態では、Ｒ５またはＲ６の各々が、メチルである。
Ｒ７における置換基は、前述の実施形態においては特に限定されない。特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ６－Ｃ１６アルキルである。他のいくつかの実施形態では、Ｒ７は、Ｃ６－Ｃ９アルキルである。これらの実施形態のいくつかでは、Ｒ７は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲｂ、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、－ＯＲｂ、－Ｓ（Ｏ）ＸＲｂ、－Ｓ－ＳＲｂ、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｂ、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、－ＮＲａＲｂ、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＯＲｂ、－ＮＲａＳ（Ｏ）ＸＮＲａＲｂ、－ＮＲａＳ（Ｏ）ＸＲｂまたは－Ｓ（Ｏ）ＸＮＲａＲｂで置換され、式中、Ｒａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒｂは、Ｃ１－Ｃ１５アルキルであり、ｘは、０、１または２である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ７は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲｂまたは－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒｂで置換される。
構造（ＶＩ）の前述の実施形態の様々なものでは、Ｒｂは、分岐Ｃ８－Ｃ１５アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒｂは、以下の構造のうちの１つを有する。
Figure 2023525270000123
特定の実施形態では、Ｒ８は、ＯＨである。
構造（ＶＩ）の他の実施形態では、Ｒ８は、－Ｎ（Ｒ９）（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１０である。他のいくつかの実施形態では、Ｒ８は、－（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０である。さらにより多くの実施形態では、Ｒ８は、－ＮＲ９Ｒ１０である。前述の実施形態のうちのいくつかでは、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ８アルキル、例えば、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルである。これらの実施形態のより具体的なものでは、Ｃ１－Ｃ８アルキルまたはＣ１－Ｃ３アルキルは、非置換であるか、またはヒドロキシルで置換される。これらの実施形態の他のものでは、Ｒ９及びＲ１０はそれぞれメチルである。
構造（ＶＩ）のさらに多くの実施形態では、Ｒ８は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ１１である。これらの実施形態のいくつかでは、Ｒ１１は、ベンジルである。
構造（ＶＩ）のよりさらに具体的な実施形態では、Ｒ８は、以下の構造のうちの１つを有する。
Figure 2023525270000124
前述の化合物のさらに他の実施形態では、Ｇ３は、Ｃ２－Ｃ５アルキレン、例えば、Ｃ２－Ｃ４アルキレン、Ｃ３アルキレンまたはＣ４アルキレンである。これらの実施形態のいくつかでは、Ｒ８は、ＯＨである。他の実施形態では、Ｇ２は、不在であり、Ｒ７は、メチル等のＣ１－Ｃ２アルキレンである。
様々な異なる実施形態では、化合物は、下表５に記載の構造のうちの１つを有する。
（表５）
Figure 2023525270000125
Figure 2023525270000126
Figure 2023525270000127
Figure 2023525270000128
Figure 2023525270000129
Figure 2023525270000130
一実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造（ＶＩＩ）
Figure 2023525270000131
を有する化合物、
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｘ及びＸ’は、それぞれ独立して、ＮまたはＣＲであり；
Ｙ及びＹ’は、それぞれ独立して、不在、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－またはＮＲであるが、但し、
ａ）ＸがＮである場合、Ｙは不在であり；
ｂ）Ｘ’がＮである場合、Ｙ’は不在であり；
ｃ）ＸがＣＲである場合、Ｙは－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－またはＮＲであり；かつ
ｄ）Ｘ’がＣＲである場合、Ｙは－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－またはＮＲであり、
Ｌ１及びＬ１’は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ１、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１、－ＯＲ１、－Ｓ（Ｏ）ＺＲ１、－Ｓ－ＳＲ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ１、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃ、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃまたは－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＯＲ１であり；
Ｌ２及びＬ２’は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ２、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２、－ＯＲ２、－Ｓ（Ｏ）ＺＲ２、－Ｓ－ＳＲ２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ２、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ２、－ＮＲｄＣ（＝Ｏ）Ｒ２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆ、－ＮＲｄＣ（＝Ｏ）ＮＲｃＲｆ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｃＲｆ；－ＮＲｄＣ（＝Ｏ）ＯＲ２またはＲ２への直接結合であり；
Ｇ１、Ｇ１’、Ｇ２及びＧ２’は、それぞれ独立して、Ｃ２－Ｃ１２アルキレンまたはＣ２－Ｃ１２アルケニレンであり；
Ｇ３は、Ｃ２－Ｃ２４ヘテロアルキレンまたはＣ２－Ｃ２４ヘテロアルケニレンであり；
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｄ及びＲｅは、各出現において、独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１２アルキルまたはＣ２－Ｃ１２アルケニルであり；
Ｒｃ及びＲｆは、各出現において、独立して、Ｃ１－Ｃ１２アルキルまたはＣ２－Ｃ１２アルケニルであり；
Ｒは、各出現において、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ１及びＲ２は、各出現において、独立して、分岐Ｃ６－Ｃ２４アルキルまたは分岐Ｃ６－Ｃ２４アルケニルであり；
ｚは、０、１または２であり、
ここで、各アルキル、アルケニル、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン及びヘテロアルケニレンは、特に明記しない限り、独立して、置換または非置換である。
構造（ＶＩＩ）の他の異なる実施形態では、
Ｘ及びＸ’は、それぞれ独立して、ＮまたはＣＲであり；
Ｙ及びＹ’は、それぞれ独立して、不在またはＮＲであるが、但し、
ａ）ＸがＮである場合、Ｙは不在であり；
ｂ）Ｘ’がＮである場合、Ｙ’は不在であり；
ｃ）ＸがＣＲである場合、ＹはＮＲであり；かつ
ｄ）Ｘ’がＣＲである場合、Ｙ’はＮＲであり、
Ｌ１及びＬ１’は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ１、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１、－ＯＲ１、－Ｓ（Ｏ）ＺＲ１、－Ｓ－ＳＲ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ１、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃ、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃまたは－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＯＲ１であり；
Ｌ２及びＬ２’は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ２、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２、－ＯＲ２、－Ｓ（Ｏ）ＺＲ２、－Ｓ－ＳＲ２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ２、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ２、－ＮＲｄＣ（＝Ｏ）Ｒ２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆ、－ＮＲｄＣ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆ；－ＮＲｄＣ（＝Ｏ）ＯＲ２またはＲ２への直接結合であり；
Ｇ１、Ｇ１’、Ｇ２及びＧ２’は、それぞれ独立して、Ｃ２－Ｃ１２アルキレンまたはＣ２－Ｃ１２アルケニレンであり；
Ｇ３は、Ｃ２－Ｃ２４アルキレンオキシドまたはＣ２－Ｃ２４アルケニレンオキシドであり；
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｄ及びＲｅは、各出現において、独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１２アルキルまたはＣ２－Ｃ１２アルケニルであり；
Ｒｃ及びＲｆは、各出現において、独立して、Ｃ１－Ｃ１２アルキルまたはＣ２－Ｃ１２アルケニルであり；
Ｒは、各出現において、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１及びＲ２は、各出現において、独立して、分岐Ｃ６－Ｃ２４アルキルまたは分岐Ｃ６－Ｃ２４アルケニルであり；
ｚは、０、１または２であり、
ここで、各アルキル、アルケニル、アルキレン、アルケニレン、アルキレンオキシド及びアルケニレンオキシドは、特に明記しない限り、独立して、置換または非置換である。
構造（ＶＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｇ３は、Ｃ２－Ｃ２４アルキレンオキシドまたはＣ２－Ｃ２４アルケニレンオキシドである。特定の実施形態では、Ｇ３は、非置換である。他の実施形態では、Ｇ３は、置換される、例えば、ヒドロキシルで置換される。より具体的な実施形態では、Ｇ３は、Ｃ２－Ｃ１２アルキレンオキシドであり、例えば、Ｇ３がＣ３－Ｃ７アルキレンオキシドの実施形態もあれば、Ｇ３がＣ３－Ｃ１２アルキレンオキシドの実施形態もある。
構造（ＶＩＩ）の他の実施形態では、Ｇ３は、Ｃ２－Ｃ２４アルキレンアミニルまたはＣ２－Ｃ２４アルケニレンアミニルであり、例えば、Ｃ６－Ｃ１２アルキレンアミニルである。これらの実施形態のいくつかでは、Ｇ３は、非置換である。これらの実施形態の他のものでは、Ｇ３は、Ｃ１－Ｃ６アルキルで置換される。
構造（ＶＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｘ及びＸ’はそれぞれＮであり、Ｙ及びＹ’はそれぞれ不在である。他の実施形態では、Ｘ及びＸ’はそれぞれＣＲであり、Ｙ及びＹ’はそれぞれＮＲである。これらの実施形態のいくつかでは、ＲはＨである。
構造（ＶＩＩ）の特定の実施形態では、Ｘ及びＸ’はそれぞれＣＲであり、Ｙ及びＹ’は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－または－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。
構造（ＶＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、化合物は、以下の構造（ＶＩＩＡ）、（ＶＩＩＢ）、（ＶＩＩＣ）、（ＶＩＩＤ）、（ＶＩＩＥ）、（ＶＩＩＦ）、（（ＶＩＩＧ））または（ＶＩＩＨ）：
Figure 2023525270000132
のうちの１つを有し、
式中、Ｒｄは、各出現において、独立して、Ｈまたは任意選択で置換されたＣ１－Ｃ６アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、ＲｄはＨである。他の実施形態では、Ｒｄは、メチル等のＣ１－Ｃ６アルキルである。他の実施形態では、Ｒｄは、置換Ｃ１－Ｃ６アルキル、例えば、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ、－ＮＲＣ（＝Ｏ）Ｒまたは－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）２で置換されたＣ１－Ｃ６アルキルであり、式中、Ｒは、各出現において、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルである。
構造（ＶＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｌ１及びＬ１’は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ１もしくは－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃであり、Ｌ２及びＬ２’は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ２、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２または－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ１及びＬ１’はそれぞれ－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ１であり、Ｌ２及びＬ２’はそれぞれ－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２である。他の実施形態では、Ｌ１及びＬ１’はそれぞれ－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ１であり、Ｌ２及びＬ２’はそれぞれ－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆである。他の実施形態では、Ｌ１及びＬ１’はそれぞれ－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃであり、Ｌ２及びＬ２’はそれぞれ－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆである。
前述のもののいくつかの実施形態では、Ｇ１、Ｇ１’、Ｇ２及びＧ２’は、それぞれ独立して、Ｃ２－Ｃ８アルキレン、例えば、Ｃ４－Ｃ８アルキレンである。
構造（ＶＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ１またはＲ２は、それぞれ、各出現において、独立して、分岐Ｃ６－Ｃ２４アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２各出現において、独立して、以下の構造：
Figure 2023525270000133
を有し、
式中、
Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、各出現において、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；かつ
ａは、２～１２の整数であり、
ここで、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ及びａはそれぞれ、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して６～２０個の炭素原子を含むよう選択される。例えば、いくつかの実施形態では、ａは、５～９または８～１２の範囲の整数である。
構造（ＶＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ７ａの少なくとも１つの出現はＨである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ７ａは、各出現においてＨである。前述のものの他の異なる実施形態では、Ｒ７ｂの少なくとも１つの出現は、Ｃ１－Ｃ８アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ１－Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。
構造（ＶＩＩ）の異なる実施形態では、Ｒ１もしくはＲ２、または両方が、各出現において独立して、以下の構造：
Figure 2023525270000134
のうちの１つを有する。
構造（ＶＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｅ及びＲｆは、存在する場合、それぞれ独立して、Ｃ３－Ｃ１２アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｅ及びＲｆは、存在する場合、ｎ－ヘキシルであり、他の実施形態では、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｅ及びＲｆは、存在する場合、ｎ－オクチルである。
構造（ＶＩＩ）の様々な異なる実施形態では、カチオン性脂質は、下表６に記載の構造のうちの１つを有する。
（表６）
Figure 2023525270000135
Figure 2023525270000136
一実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造（ＶＩＩＩ）：
Figure 2023525270000137
を有する化合物、
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
ＸがＮであり、Ｙは不在であるか、またはＸがＣＲであり、ＹはＮＲであり、
Ｌ１は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ１、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１、－ＯＲ１、－Ｓ（Ｏ）ＸＲ１、－Ｓ－ＳＲ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ１、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃ、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃまたは－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＯＲ１であり、
Ｌ２は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ２、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２、－ＯＲ２、－Ｓ（Ｏ）ＸＲ２、－Ｓ－ＳＲ２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ２、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ２、－ＮＲｄＣ（＝Ｏ）Ｒ２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆ、－ＮＲｄＣ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆ；－ＮＲｄＣ（＝Ｏ）ＯＲ２またはＲ２への直接結合であり；
Ｌ３は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ３または－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ３であり；
Ｇ１及びＧ２は、それぞれ独立して、Ｃ２－Ｃ１２アルキレンまたはＣ２－Ｃ１２アルケニレンであり；
Ｇ３は、Ｃ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ２－Ｃ２４アルケニレン、Ｃ１－Ｃ２４ヘテロアルキレンまたはＣ２－Ｃ２４ヘテロアルケニレンであり；
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルもしくはＣ１－Ｃ１２アルケニルであり；
Ｒｃ及びＲｆは、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ１２アルキルまたはＣ２－Ｃ１２アルケニルであり；
各Ｒは、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ２４アルキルまたはＣ２－Ｃ２４アルケニルであり；かつ
ｘは、０、１または２であり、
ここで、各アルキル、アルケニル、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン及びヘテロアルケニレンは、特に明記しない限り、独立して、置換または非置換である。
構造（Ｉ）のより多くの実施形態では、
ＸがＮであり、Ｙは不在であるか、またはＸがＣＲであり、ＹはＮＲであり；
Ｌ１は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ１、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１、－ＯＲ１、－Ｓ（Ｏ）ＸＲ１、－Ｓ－ＳＲ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ１、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃ、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃまたは－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＯＲ１であり；
Ｌ２は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ２、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２、－ＯＲ２、－Ｓ（Ｏ）ＸＲ２、－Ｓ－ＳＲ２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ２、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ２、－ＮＲｄＣ（＝Ｏ）Ｒ２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｃＲｆ、－ＮＲｄＣ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｃＲｆ；－ＮＲｄＣ（～Ｏ）ＯＲ２またはＲ２への直接結合であり；
Ｌ３は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ３または－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ３であり；
Ｇ１及びＧ２は、それぞれ独立して、Ｃ２－Ｃ１２アルキレンまたはＣ２－Ｃ１２アルケニレンであり；
ＸがＣＲであり、かつＹがＮＲである場合、Ｇ３は、Ｃ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ２－Ｃ２４アルケニレン、Ｃ１－Ｃ２４ヘテロアルキレンまたはＣ２－Ｃ２４ヘテロアルケニレンであり、ＸがＮであり、かつＹが不在である場合、Ｇ３は、Ｃ１－Ｃ２４ヘテロアルキレンまたはＣ２－Ｃ２４ヘテロアルケニレンであり；
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルもしくはＣ１－Ｃ１２アルケニルであり；
Ｒｃ及びＲｆは、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ１２アルキルまたはＣ２－Ｃ１２アルケニルであり；
各Ｒは、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ２４アルキルまたはＣ２－Ｃ２４アルケニルであり；かつ
ｘは、０、１または２であり、
ここで、各アルキル、アルケニル、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン及びヘテロアルケニレンは、特に明記しない限り、独立して、置換または非置換である。
構造（Ｉ）の他の実施形態では、
ＸはＮであり、Ｙは不在であるか、またはＸがＣＲであり、ＹはＮＲであり；
Ｌ１は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ１、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１、－ＯＲ１、－Ｓ（Ｏ）ＸＲ１、－Ｓ－ＳＲ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ１、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃ、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃまたは－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＯＲ１であり；
Ｌ２は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ２、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２、－ＯＲ２、－Ｓ（Ｏ）ＸＲ２、－Ｓ－ＳＲ２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ２、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ２、－ＮＲｄＣ（＝Ｏ）Ｒ２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆ、－ＮＲｄＣ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆ；－ＮＲｄＣ（～Ｏ）ＯＲ２またはＲ２への直接結合であり；
Ｌ３は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ３または－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ３であり；
Ｇ１及びＧ２は、それぞれ独立して、Ｃ２－Ｃ１２アルキレンまたはＣ２－Ｃ１２アルケニレンであり；
Ｇ３は、Ｃ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ２－Ｃ２４アルケニレン、Ｃ１－Ｃ２４ヘテロアルキレンまたはＣ２－Ｃ２４ヘテロアルケニレンであり；
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルもしくはＣ１－Ｃ１２アルケニルであり；
Ｒｃ及びＲｆは、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ１２アルキルまたはＣ２－Ｃ１２アルケニルであり；
各Ｒは、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、分岐Ｃ６－Ｃ２４アルキルまたは分岐Ｃ６－Ｃ２４アルケニルであり；かつ
ｘは、０、１または２であり、
ここで、各アルキル、アルケニル、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン及びヘテロアルケニレンは、特に明記しない限り、独立して、置換または非置換である。
構造（ＶＩＩＩ）の特定の実施形態では、Ｇ３は、非置換である。より具体的な実施形態では、Ｇ３は、Ｃ２－Ｃ１２アルキレンであり、例えば、Ｇ３がＣ３－Ｃ７アルキレンの実施形態もあれば、Ｇ３がＣ３－Ｃ１２アルキレンの実施形態もある。いくつかの実施形態では、Ｇ３は、Ｃ２またはＣ３アルキレンである。
構造（ＶＩＩＩ）の他の実施形態では、Ｇ３は、Ｃ１－Ｃ１２ヘテロアルキレン、例えば、Ｃ１－Ｃ１２アミニルアルキレンである。
構造（ＶＩＩＩ）の特定の実施形態では、ＸはＮであり、Ｙは不在である。他の実施形態では、ＸがＣＲであり、かつＹはＮＲであり、例えば、これらの実施形態のいくつかでは、ＲはＨである。
構造（ＶＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、化合物は、以下の構造（ＶＩＩＩＡ）、（ＶＩＩＩＢ）、（ＶＩＩＩＣ）または（ＶＩＩＩＤ）：
Figure 2023525270000138
のうちの１つを有する。
構造（ＶＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｌ１は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ１、または－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃであり、Ｌ２は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ２、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２または－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆである。他の具体的な実施形態では、Ｌ１は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ１であり、Ｌ２は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２である。前述の実施形態のいずれかでは、Ｌ３は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ３である。
構造（ＶＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｇ１及びＧ２は、それぞれ独立して、Ｃ２－Ｃ１２アルキレン、例えば、Ｃ４－Ｃ１０アルキレンである。
構造（ＶＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、独立して、分岐Ｃ６－Ｃ２４アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、独立して、以下の構造を有する：
Figure 2023525270000139
［式中、
Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、各出現において、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
ａは、２～１２の整数であり、
ここで、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ及びａはそれぞれ、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して６～２０個の炭素原子を含むよう選択される］。例えば、いくつかの実施形態では、ａは、５～９または８～１２の範囲の整数である。
構造（ＶＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ７ａの少なくとも１つの出現はＨである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ７ａは、各出現においてＨである。前述のものの他の異なる実施形態では、Ｒ７ｂの少なくとも１つの出現は、Ｃ１－Ｃ８アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ１－Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。
構造（ＶＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、ＸはＣＲであり、ＹはＮＲであり、かつ、Ｒ３は、エチル、プロピルまたはブチル等のＣ１－Ｃ１２アルキルである。これらの実施形態のいくつかでは、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、分岐Ｃ６－Ｃ２４アルキルである。
構造（ＶＩＩＩ）の異なる実施形態では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、独立して、以下の構造：
Figure 2023525270000140
のうちの１つを有する。
構造（ＶＩＩＩ）の特定の実施形態では、Ｒ１及びＲ２及びＲ３はそれぞれ、独立して、分岐Ｃ６－Ｃ２４アルキルであり、Ｒ３は、Ｃ１－Ｃ２４アルキルまたはＣ２－Ｃ２４アルケニルである。
構造（ＶＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｃ及びＲｆは、それぞれ独立して、Ｃ３－Ｃ１２アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｅ及びＲｆは、ｎ－ヘキシルであり、他の実施形態では、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｅ及びＲｆは、ｎ－オクチルである。
構造（ＶＩＩＩ）の様々な異なる実施形態では、化合物は、下表７に記載の構造のうちの１つを有する。
（表７）
Figure 2023525270000141
Figure 2023525270000142
一実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造（ＩＸ）：
Figure 2023525270000143
を有する化合物、
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｌ１は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ１、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１、－ＯＲ１、－Ｓ（Ｏ）ＸＲ１、－Ｓ－ＳＲ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ１、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃ、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃまたは－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＯＲ１であり、
Ｌ２は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ２、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２、－ＯＲ２、－Ｓ（Ｏ）ＸＲ２、－Ｓ－ＳＲ２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ２、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ２、－ＮＲｄＣ（＝Ｏ）Ｒ２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆ、－ＮＲｄＣ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆ；－ＮＲｄＣ（＝Ｏ）ＯＲ２またはＲ２への直接結合であり；
Ｇ１及びＧ２は、それぞれ独立して、Ｃ２－Ｃ１２アルキレンまたはＣ２－Ｃ１２アルケニレンであり；
Ｇ３は、Ｃ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ２－Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキレンまたはＣ３－Ｃ８シクロアルケニレンであり；
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルもしくはＣ１－Ｃ１２アルケニルであり；
Ｒｃ及びＲｆは、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ１２アルキルまたはＣ２－Ｃ１２アルケニルであり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、分岐Ｃ６－Ｃ２４アルキルまたは分岐Ｃ６－Ｃ２４アルケニルであり；
Ｒ３は、－Ｎ（Ｒ４）Ｒ５であり；
Ｒ４は、Ｃ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ５は、置換Ｃ１－Ｃ１２アルキル；かつ
ｘは、０、１または２であり、
ここで、各アルキル、アルケニル、アルキレン、アルケニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、アリール及びアラルキルは、特に明記しない限り、独立して、置換または非置換である。
構造（ＸＩ）の特定の実施形態では、Ｇ３は、非置換である。より具体的な実施形態では、Ｇ３は、Ｃ２－Ｃ１２アルキレンであり、例えば、Ｇ３がＣ３－Ｃ７アルキレンの実施形態もあれば、Ｇ３がＣ３－Ｃ１２アルキレンの実施形態もある。いくつかの実施形態では、Ｇ３は、Ｃ２またはＣ３アルキレンである。
構造（ＩＸ）の前述の実施形態のいくつかでは、化合物は、以下の構造（ＩＸ Ａ）：
Figure 2023525270000144
を有し、
式中、ｙ及びｚは、それぞれ独立して、２～１２の範囲の整数、例えば、２～６、４～１０の整数、または例えば、４もしくは５である。特定の実施形態では、ｙ及びｚはそれぞれ同じであり、４、５、６、７、８及び９から選択される。
構造（ＩＸ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｌ１は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ１または－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃであり、Ｌ２は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ２、－（Ｃ－Ｏ）ＯＲ２または－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ１及び－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２である。他の実施形態では、Ｌ１は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ１であり、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆである。他の実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂＲｃであり、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆである。
前述のものの他の実施形態では、化合物は、以下の構造（ＩＸＢ）、（ＩＸＣ）、（ＩＸＤ）または（ＩＸＥ）：
Figure 2023525270000145
のうちの１つを有する。
前述の実施形態のうちのいくつかでは、化合物は構造（ＩＸＢ）を有し、他の実施形態では、化合物は構造（ＩＸＣ）を有し、さらに他の実施形態では、化合物は構造（ＩＸＤ）を有する。他の実施形態では、化合物は、構造（ＩＸＥ）を有する。
前述のもののいくつかの異なる実施形態では、化合物は、以下の構造（ＩＸＦ）、（ＩＸＧ）、（ＩＸＨ）または（ＩＸＪ）：
Figure 2023525270000146
のうちの１つを有し、
式中、ｙ及びｚは、それぞれ独立して、２～１２の範囲の整数、例えば、２～６の整数、例えば、４である。
構造（ＩＸ）の前述の実施形態のいくつかでは、ｙ及びｚは、それぞれ独立して、２～１０、２～８、４～１０または４～７の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｙは、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２である。いくつかの実施形態では、ｚは、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２である。いくつかの実施形態では、ｙ及びｚは同じであるが、他の実施形態では、ｙ及びｚは異なる。
構造（ＩＸ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ１もしくはＲ２、または両方が、分岐Ｃ６－Ｃ２４アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、独立して、以下の構造：
Figure 2023525270000147
を有し、
式中、
Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、各出現において、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；かつ
ａは、２～１２の整数であり、
ここで、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ及びａはそれぞれ、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して６～２０個の炭素原子を含むよう選択される。例えば、いくつかの実施形態では、ａは、５～９または８～１２の範囲の整数である。
構造（ＩＸ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ７ａの少なくとも１つの出現はＨである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ７ａは、各出現においてＨである。前述のものの他の異なる実施形態では、Ｒ７ｂの少なくとも１つの出現は、Ｃ１－Ｃ８アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ１－Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。
構造（ＩＸ）の異なる実施形態では、Ｒ１もしくはＲ２、または両方が、以下の構造：
Figure 2023525270000148
のうちの１つを有する。
構造（ＩＸ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｅ及びＲｆは、それぞれ独立して、Ｃ３－Ｃ１２アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｅ及びＲｆは、ｎ－ヘキシルであり、他の実施形態では、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｅ及びＲｆは、ｎ－オクチルである。
構造（ＩＸ）の前述の実施形態のいずれかでは、Ｒ４は、置換または非置換の、メチル、エチル、プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－オクチルまたはｎ－ノニルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ４は、非置換である。他では、Ｒ４は、－ＯＲｇ、－ＮＲｇＣ（＝Ｏ）Ｒｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｇＲｈ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｈ、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｈ及び－ＯＲｉＯＨからなる群から選択される１つ以上の置換基で置換され、式中、
Ｒｇは、各出現において、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり；
Ｒｈは、各出現において、独立して、Ｃ１－Ｃ６アルキルであり；かつ
Ｒｉは、各出現において、独立して、Ｃ１－Ｃ６アルキレンである。
構造（ＩＸ）の前述の実施形態の他のものでは、Ｒ５は、置換された、メチル、エチル、プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－オクチルまたはｎ－ノニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、置換エチルまたは置換プロピルである。他の異なる実施形態では、Ｒ５は、ヒドロキシルで置換される。さらにより多くの実施形態では、Ｒ５は、－ＯＲｇ、－ＮＲｇＣ（＝Ｏ）Ｒｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｇＲｈ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｈ及び－ＯＲｉＯＨからなる群から選択される１つ以上の置換基で置換され、式中、
Ｒｇは、各出現において、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり；
Ｒｈは、各出現において、独立して、Ｃ１－Ｃ６アルキルであり；かつ
Ｒｉは、各出現において、独立して、Ｃ１－Ｃ６アルキレンである。
構造（ＩＸ）の他の実施形態では、Ｒ４は、非置換のメチルであり、Ｒ５は、置換された、メチル、エチル、プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－オクチルまたはｎ－ノニルである。これらの実施形態のいくつかでは、Ｒ５は、ヒドロキシルで置換される。
構造（ＩＸ）の他のいくつかの具体的な実施形態では、Ｒ３は、以下の構造：
Figure 2023525270000149
のうちの１つを有する。
構造（ＩＸ）の様々な異なる実施形態では、カチオン性脂質は、下表８に記載の構造のうちの１つを有する。
（表８）
Figure 2023525270000150
Figure 2023525270000151
Figure 2023525270000152
一実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造（Ｘ）：
Figure 2023525270000153
を有する化合物、
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｇ１は、－ＯＨ、－ＮＲ３Ｒ４、－（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ５または－ＮＲ３（Ｃ＝Ｏ）Ｒ５であり；
Ｇ２は、－ＣＨ２－または－（Ｃ＝Ｏ）－であり；
Ｒは、各出現において、独立して、ＨまたはＯＨであり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、分岐した飽和または不飽和のＣ１２－Ｃ３６アルキルであり；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｈまたは直鎖もしくは分岐した飽和もしくは不飽和のＣ１－Ｃ６アルキルであり；
Ｒ５は、直鎖または分岐した飽和もしくは不飽和のＣ１－Ｃ６アルキルであり；かつ
ｎは、２～６の整数である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、分岐した飽和または不飽和のＣ１２－Ｃ３０アルキル、Ｃ１２－Ｃ２０アルキル、またはＣ１５－Ｃ２０アルキルである。いくつかの具体的な実施形態、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ飽和である。特定の実施形態では、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも１つは不飽和である。
構造（Ｘ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ１及びＲ２は、以下の構造：
Figure 2023525270000154
を有する。
構造（Ｘ）の前述の実施形態のいくつかでは、化合物は、以下の構造（ＸＡ）：
Figure 2023525270000155
を有し、
式中、
Ｒ６及びＲ７は、各出現において、独立して、Ｈまたは直鎖もしくは分岐した飽和もしくは不飽和のＣ１－Ｃ１４アルキルであり；
ａ及びｂは、それぞれ独立して、１～１５の範囲の整数であるが、但し、Ｒ６及びａ、ならびにＲ７及びｂは、それぞれ独立して、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ、各々に独立して、分岐、飽和、または不飽和のＣ１２－Ｃ３６アルキルであるよう選択される。
前述の実施形態のうちのいくつかでは、化合物は、以下の構造（ＸＢ）：
Figure 2023525270000156
を有し、
式中、
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立して、直鎖または分岐した飽和もしくは不飽和のＣ４－Ｃ１２アルキルであるが、但し、Ｒ８及びＲ９、及びＲ１０及びＲ１１、は、それぞれ独立して、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ、各々に独立して、分岐、飽和、または不飽和のＣ１２－Ｃ３６アルキルであるよう選択される。（ＸＢ）のいくつかの実施形態では、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立して、直鎖または分岐した飽和もしくは不飽和のＣ６－Ｃ１０アルキルである。（ＸＢ）の特定の実施形態では、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１のうちの少なくとも１つは、不飽和である。（ＸＢ）の他の特定の具体的な実施形態では、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１の各々は、飽和である。
前述の実施形態のうちのいくつかでは、化合物は構造（ＸＡ）を有し、他の実施形態では、化合物は構造（ＸＢ）を有する。
前述の実施形態のうちのいくつかでは、Ｇ１は、－ＯＨであり、いくつかの実施形態では、Ｇ１は、－ＮＲ３Ｒ４である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｇ１は、－ＮＨ２、－ＮＨＣＨ３または－Ｎ（ＣＨ３）２である。特定の実施形態では、Ｇ１は、－（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ５である。他の特定の実施形態では、Ｇ１は、－ＮＲ３（Ｃ＝Ｏ）Ｒ５である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｇ１は、－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３または－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３である。
構造（Ｘ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｇ２は、－ＣＨ２－である。いくつかの異なる実施形態では、Ｇ２は、－（Ｃ＝Ｏ）－である。
構造（Ｘ）の前述の実施形態のいくつかでは、ｎは、２～６の範囲の整数であり、例えば、いくつかの実施形態では、ｎは、２、３、４、５または６である。いくつかの実施形態では、ｎは、２である。いくつかの実施形態では、ｎは、３である。いくつかの実施形態では、ｎは、４である。
構造（Ｘ）の前述の実施形態の特定のものでは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうちの少なくとも１つは、非置換である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ非置換である。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、置換されている。他の実施形態では、Ｒ４は、置換されている。さらにより多くの実施形態では、Ｒ５は、置換されている。特定の具体的な実施形態では、Ｒ３及びＲ４のそれぞれは、置換されている。いくつかの実施形態では、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５にある置換基は、ヒドロキシルである。特定の実施形態では、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ、ヒドロキシルで置換される。
構造（Ｘ）の前述の実施形態のいくつかでは、少なくとも１つのＲは、ＯＨである。他の実施形態では、各ＲはＨである。
構造（Ｘ）の様々な異なる実施形態では、化合物は、下表９に記載の構造のうちの１つを有する。
（表９）
Figure 2023525270000157
Figure 2023525270000158
Figure 2023525270000159
Figure 2023525270000160
実施形態１、２、３、４または５のいずれかでは、ＬＮＰはさらに、中性脂質を含む。様々な実施形態では、カチオン性脂質と中性脂質のモル比は、約２：１～約８：１の範囲である。特定の実施形態では、中性脂質は、前述のＬＮＰのいずれかに、５～１０ｍｏｌパーセント、５～１５ｍｏｌパーセント、７～１３ｍｏｌパーセント、または９～１１ｍｏｌパーセントの範囲の濃度で存在する。特定の具体的な実施形態では、中性脂質は、約９．５、１０または１０．５ｍｏｌパーセントの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質と中性脂質のモル比は、約４．１：１．０～約４．９：１．０、約４．５：１．０～約４．８：１．０、または約４．７：１．０～４．８：１．０の範囲である。いくつかの実施形態では、総カチオン性脂質と中性脂質のモル比は、約４．１：１．０～約４．９：１．０、約４．５：１．０～約４．８：１．０、または約４．７：１．０～４．８：１．０の範囲である。
実施形態１、２、３、４または５のいずれかに使用するための例示的中性脂質には、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１カルボキシラート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアリオイル－２－オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、及び１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ｔｒａｎｓＤＯＰＥ）が含まれる。一実施形態では、中性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ及びＳＭから選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣである。
実施形態１、２、３、４または５の様々な実施形態では、開示される脂質ナノ粒子のいずれかは、ステロイドまたはステロイド類似体を含む。特定の実施形態では、ステロイドまたはステロイド類似体は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、ステロイドは、３９～４９モルパーセント、４０～４６モルパーセント、４０～４４モルパーセント、４０～４２モルパーセント、４２～４４モルパーセント、または４４～４６モルパーセントの範囲の濃度で存在する。特定の具体的な実施形態では、ステロイドは、４０、４１、４２、４３、４４、４５、または４６モルパーセントの濃度で存在する。
特定の実施形態では、カチオン性脂質とステロイドのモル比は、１．０：０．９～１．０：１．２、または１．０：１．０～１．０：１．２の範囲である。これらの実施形態のいくつかでは、カチオン性脂質とコレステロールのモル比は、約５：１～１：１の範囲である。特定の実施形態では、ステロイドは、３２～４０ｍｏｌパーセントの範囲の濃度のステロイドで存在する。
特定の実施形態では、総カチオン性とステロイドのモル比は、１．０：０．９～１．０：１．２、または１．０：１．０～１．０：１．２の範囲である。これらの実施形態のいくつかでは、総カチオン性脂質とコレステロールのモル比は、約５：１～１：１の範囲である。特定の実施形態では、ステロイドは、３２～４０ｍｏｌパーセントの範囲の濃度のステロイドで存在する。
実施形態１、２、３、４または５のいくつかの実施形態では、ＬＮＰはさらに、ポリマー複合脂質を含む。実施形態１、２、３、４または５の様々な他の実施形態では、ポリマー複合脂質は、ＰＥＧ化脂質である。例えば、いくつかの実施形態には、ＰＥＧ化ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、例えば、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）（４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオアート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）等）、ＰＥＧ化セラミド（ＰＥＧ－ｃｅｒ）、またはＰＥＧジアルコキシプロピルカルバマート、例えば、ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル－Ｎ－（２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル）カルバマートもしくは２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル－Ｎ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）カルバマートが含まれる。
様々な実施形態では、ポリマー複合脂質は、１．０～２．５モルパーセントの範囲の濃度で存在する。特定の具体的な実施形態では、ポリマー複合脂質は、約１．７モルパーセントの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ポリマー複合脂質は、約１．５モルパーセントの濃度で存在する。
特定の実施形態では、カチオン性脂質と、ポリマー複合脂質のモル比は、約３５：１～約２５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質とポリマー複合脂質のモル比は、約１００：１～約２０：１の範囲である。
特定の実施形態では、総カチオン性脂質（すなわち、第１と第２のカチオン性脂質の和）とポリマー複合脂質のモル比は、約３５：１～約２５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、総カチオン性脂質とポリマー複合脂質のモル比は、約１００：１～約２０：１の範囲である。
実施形態１、２、３、４または５のいくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、存在する場合、以下の式（ＸＩ）：
Figure 2023525270000161
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体を有する
［式中、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立して、１０～３０個の炭素原子を含有する直鎖または分岐した飽和もしくは不飽和のアルキル鎖であり、ここで、アルキル鎖は、任意選択で、１つ以上のエステル結合により中断されており；かつ
ｗは、３０～６０の範囲の平均値を有する］。
いくつかの実施形態では、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立して、１２～１６個の炭素原子を含有する直鎖飽和アルキル鎖である。他の実施形態では、平均ｗは、４２～５５の範囲、例えば、平均ｗは、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４または５５である。いくつかの具体的な実施形態、平均ｗは約４９である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、以下の式（ＸＩａ）：
Figure 2023525270000162
を有し、
式中、平均ｗは、約４９である。
実施形態１、２、３、４または５のいくつかの実施形態では、核酸は、アンチセンス及びメッセンジャーＲＮＡから選択される。例えば、メッセンジャーＲＮＡは、免疫原性タンパク質の翻訳によって、（例えば、ワクチンとして）免疫応答を誘導するために使用され得る。
実施形態１、２、３、４または５の他の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡであり、ＬＮＰにおけるｍＲＮＡと脂質の比（すなわち、Ｎ／Ｐ（Ｎは、カチオン性脂質のモルを表し、Ｐは、核の一部として存在するリン酸塩のモルを表す。
ある実施形態では、輸送ビヒクルは、米国特許公開番号２０１９０３１４５２４に記載されている脂質またはイオン化可能脂質を含む。
本発明のいくつかの実施形態は、ｉｎ ｖｉｖｏで核酸の活性増大及び組成物の忍容性改善を提供する、表１０に列挙される構造として本明細書に記載の新規カチオン性脂質の１つ以上を含む核酸－脂質ナノ粒子組成物を提供する。
一実施形態では、イオン化可能脂質は、以下の構造（ＸＩＩ）：
Figure 2023525270000163
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を有する
［式中、
Ｌ１またはＬ２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－もしくは－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ１またはＬ２の他方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－もしくは－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であるか、もしくは直接結合であり；
Ｇ１及びＧ２は、それぞれ独立して、非置換のＣ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ１－Ｃ１２アルケニレンであり；
Ｇ３は、Ｃ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ１－Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニレンであり；
Ｒａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ６－Ｃ２４アルキルまたはＣ６－Ｃ２４アルケニルであり；
Ｒ３は、Ｈ、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または－ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり；
Ｒ４は、Ｃ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ５は、ＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり；かつ
ｘは、０、１または２である］。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、以下の構造（ＸＩＩＡ）または（ＸＩＩＢ）のうちの１つを有し：
Figure 2023525270000164
式中、
Ａは、３～８員のシクロアルキル環またはシクロアルキレン環であり；
Ｒ６は、各出現において、独立して、Ｈ、ＯＨまたはＣ１－Ｃ２４アルキルであり；かつ
ｎは、１～１５の範囲の整数である。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は構造（ＸＩＩＡ）を有し、他の実施形態では、イオン化可能脂質は構造（ＸＩＩＢ）を有する。
他の実施形態では、イオン化可能脂質は、以下の構造（ＸＩＩＣ）または（ＸＩＩＤ）のうちの１つを有し：
Figure 2023525270000165
式中、ｙ及びｚは、それぞれ独立して、１～１２の範囲の整数である。
いくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々が、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。前述のもののいずれかのいくつかの異なる実施形態では、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－または－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ１及びＬ２の各々が、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、以下の構造（ＸＩＩＥ）または（ＸＩＩＦ）のうちの１つを有する：
Figure 2023525270000166
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、以下の構造（ＸＩＩＧ）、（ＸＩＩＨ）、（ＸＩＩＩ）、または（ＸＩＩＪ）のうちの１つを有する：
Figure 2023525270000167
いくつかの実施形態では、ｎは、２～１２、例えば、２～８または２～４の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｎは、３、４、５または６である。いくつかの実施形態では、ｎは、３である。いくつかの実施形態では、ｎは、４である。いくつかの実施形態では、ｎは、５である。いくつかの実施形態では、ｎは、６である。
いくつかの実施形態では、ｙ及びｚは、それぞれ独立して、２～１０の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｙ及びｚは、それぞれ独立して、４～９または４～６の範囲の整数である。
いくつかの実施形態では、Ｒ６はＨである。他の実施形態では、Ｒ６は、Ｃ１－Ｃ２４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ６は、ＯＨである。
いくつかの実施形態では、Ｇ３は、非置換である。他の実施形態では、Ｇ３は、置換されている。様々な異なる実施形態では、Ｇ３は、直鎖Ｃ１－Ｃ２４アルキレンまたは直鎖Ｃ１－Ｃ２４アルケニレンである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１もしくはＲ２、または両方が、Ｃ６－Ｃ２４アルケニルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、独立して、以下の構造を有し：
Figure 2023525270000168
式中、
Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、各出現において、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；かつ
ａは、２～１２の整数であり、
ここで、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ及びａはそれぞれ、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して６～２０個の炭素原子を含むよう選択される。
いくつかの実施形態では、ａは、５～９または８～１２の範囲の整数である。
いくつかの実施形態では、Ｒ７ａの少なくとも１つの出現はＨである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ７ａは、各出現においてＨである。他の異なる実施形態では、Ｒ７ｂの少なくとも１つの出現は、Ｃ１－Ｃ８アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ１－Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。
異なる実施形態では、Ｒ１もしくはＲ２、または両方が、以下の構造のうちの１つを有する：
Figure 2023525270000169
。
いくつかの実施形態では、Ｒ３は、－ＯＨ、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ４である。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、メチルまたはエチルである。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、式（１）：
Figure 2023525270000170
の化合物であり、
式中、
各ｎは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５であり；かつ
Ｌ１及びＬ３は、それぞれ独立して、－ＯＣ（Ｏ）－＊または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－＊であり、「＊」は、Ｒ１またはＲ３に対する結合点を示し；
Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立して、直鎖または分岐のＣ９－Ｃ２０アルキルまたはＣ９－Ｃ２０アルケニルであり、任意選択で、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルケニル、アルデヒド、ヘテロシクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、ジヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルアミノアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、（ヘテロシクリル）（アルキル）アミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、アルキニル、アルコキシ、アミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルカルボニルアミノ、アミノカルボニルアルキルアミノ、（アミノカルボニルアルキル）（アルキル）アミノ、アルケニルカルボニルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ヘテロシクリルアルキルアミノカルボニル、（アルキルアミノアルキル）（アルキル）アミノカルボニル、アルキルアミノアルキルカルボニル、ジアルキルアミノアルキルカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アルキルスルホキシド、アルキルスルホキシドアルキル、アルキルスルホニル、及びアルキルスルホンアルキルから選択される１つ以上の置換基により置換される。
いくつかの実施形態では、Ｒ１とＲ３は同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ１とＲ３は異なる。
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立して、分岐した飽和Ｃ９－Ｃ２０アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ３の一方は、分岐した飽和Ｃ９－Ｃ２０アルキルであり、他方は、非分岐の飽和Ｃ９－Ｃ２０アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立して、
Figure 2023525270000171
からなる群から選択される。
様々な実施形態では、Ｒ２は、
Figure 2023525270000172
からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１９／１５２８４８Ａ１号に記載のようなものであり得る。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、式（１－１）または式（１－２）の化合物であり：
Figure 2023525270000173
Figure 2023525270000174
式中、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、式（１）で定義されているとおりである。
上記化合物及び組成物の調製方法は、以下に記載されており、及び／または当該技術分野で知られている。
本明細書に記載のプロセスにおいて、中間体化合物の官能基は、好適な保護基で保護する必要がある場合があることが当業者によって理解される。そのような官能基には、例えば、ヒドロキシル、アミノ、メルカプト、及びカルボン酸が含まれる。
ヒドロキシルのための好適な保護基には、例えば、トリアルキルシリルまたはジアリールアルキルシリル（例えば、ｔ－ブチルジメチルシリル、ｔ－ブチルジフェニルシリルまたはトリメチルシリル）、テトラヒドロチオピラニル、ベンジル等が含まれる。アミノ、アミジノ、及びグアニジノのための好適な保護基には、例えば、ｔ－ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル等が含まれる。メルカプトのための好適な保護基には、例えば、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ’’（ここで、Ｒ’’は、アルキル、アリール、またはアリールアルキルである）、ｐ－メトキシベンジル、トリチル等が含まれる。カルボン酸のための好適な保護基には、例えば、アルキル、アリール、またはアリールアルキルエステルが含まれる。保護基は、標準的な技術に従って付加または除去され得、それらは当業者に知られており、また本明細書に記載されている。保護基の使用は、例えば、Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｚ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９９），３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙに詳細に記載されている。当業者であれば理解されるように、保護基はまた、Ｗａｎｇ樹脂、Ｒｉｎｋ樹脂、または２－クロロトリチル－クロリド樹脂等のポリマー樹脂でもあり得る。
また、本発明の化合物のそのような保護された誘導体は、それ自体では薬理学的活性を有しない場合があるが、それらは、哺乳類に投与され、その後に体内で代謝されて薬理学的に活性な本発明の化合物が形成され得ることが当業者によって理解される。したがって、そのような誘導体は、プロドラッグとして記載され得る。本発明の化合物の全てのプロドラッグは、本発明の範囲に含まれる。
さらに、遊離の塩基または酸の形態で存在する本発明の全ての化合物は、当業者に知られている方法によって適切な無機または有機の塩基または酸での処理によって、それらの化合物の薬学的に許容される塩に変換され得る。本発明の化合物の塩はまた、標準的な技術によってそれらの遊離の塩基または酸の形態に変換され得る。
以下の反応スキームは、式（１）の化合物を作製するための例示的な方法を示す。
Figure 2023525270000175
Ａ１は、購入するか、または当該技術分野で知られている方法に従って調製される。適切な縮合条件（例えば、ＤＣＣ）下でのＡ１とジオールＡ２との反応によりエステル／アルコールＡ３が得られ、これをその後、（例えば、ＰＣＣで）酸化させてアルデヒドＡ４にすることができる。還元的アミノ化条件下でのＡ４とアミンＡ５との反応により、式（１）の化合物が得られる。
以下の反応スキームは、式（１）の化合物を作製するための第２の例示的な方法を示し、ここで、Ｒ１及びＲ３は同じである。
Figure 2023525270000176
保護基を使用すること等の上記反応スキームに対する変更により、Ｒ１とＲ３が異なる化合物が得られる場合がある。上記反応スキームに対する保護基の使用、及び他の変更方法は、当業者に容易に明らかとなる。
類似の方法によって、または当業者に知られている他の方法を組み合わせることによって、当業者がこれらの化合物を作製することができる場合があることが理解される。また、当業者であれば、適切な出発物質を使用すること、及び合成のパラメータを変更することによって、本明細書に具体的に例示されていない式（１）の他の化合物を作製することができることが理解される。一般に、出発物質は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＴＣＩ、及びＦｌｕｏｒｏｃｈｅｍ ＵＳＡ等のような供給源から得ても、または当業者に知られている供給源に従って合成されても（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０００））、または本発明に記載されているように調製されてもよい。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、式（２）の化合物であり：
Figure 2023525270000177
式中、各ｎは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
いくつかの実施形態では、式（２）において使用される場合、Ｒ１及びＲ２は、式（１）で定義されているとおりである。
いくつかの実施形態では、式（２）において使用される場合、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、
Figure 2023525270000178
Figure 2023525270000179
Figure 2023525270000180
からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、式（２）において使用される場合のＲ１及び／またはＲ２は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１５／０９５３４０Ａ１号に記載されているとおりであり得る。いくつかの実施形態では、式（２）において使用される場合のＲ１は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１９／１５２５５７Ａ１号に記載されているとおりであり得る。
いくつかの実施形態では、式（２）において使用される場合、Ｒ３は、
Figure 2023525270000181
からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、式（３）の化合物であり：
Figure 2023525270000182
式中、Ｘは、－Ｏ－、－Ｓ－、または－ＯＣ（Ｏ）－＊から選択され、＊は、Ｒ１に対する結合点を示す。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、式（３－１）：
Figure 2023525270000183
の化合物である。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、式（３－２）：
Figure 2023525270000184
の化合物である。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、式（３－３）：
Figure 2023525270000185
の化合物である。
いくつかの実施形態では、式（３－１）、（３－２）、または（３－３）において使用される場合、各Ｒ１は、独立して、分岐した飽和Ｃ９－Ｃ２０アルキルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ１は、独立して、
Figure 2023525270000186
からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、式（３－１）、（３－２）、または（３－３）の各Ｒ１は同じである。
いくつかの実施形態では、式（３－１）、（３－２）、または（３－３）において使用される場合、Ｒ２は、
Figure 2023525270000187
からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、式（３－１）、（３－２）、または（３－３）において使用される場合Ｒ２は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１９／１５２８４８Ａ１号に記載されているとおりであり得る。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、式（５）：
Figure 2023525270000188
の化合物であり、
式中、
各ｎは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５であり；かつ
Ｒ２は、式（１）で定義されているとおりである。
いくつかの実施形態では、式（５）において使用される場合、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ、式（１）でＲ１及びＲ３として定義されているとおりである。いくつかの実施形態では、式（５）において使用される場合、Ｒ４及びＲ５は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１９／１９１７８０Ａ１号に記載されているとおりであり得る。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、式（６）：
Figure 2023525270000189
の化合物であり、
式中、
各ｎは、独立して、０～１５の整数であり；
Ｌ１及びＬ３は、それぞれ独立して、－ＯＣ（Ｏ）－＊または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－＊であり、「＊」は、Ｒ１またはＲ３に対する結合点を示し；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、直鎖または分岐のＣ９－Ｃ２０アルキルまたはＣ９－Ｃ２０アルケニルであり、任意選択で、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルケニル、アルデヒド、ヘテロシクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、ジヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルアミノアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、（ヘテロシクリル）（アルキル）アミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、アルキニル、アルコキシ、アミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルカルボニルアミノ、アミノカルボニルアルキルアミノ、（アミノカルボニルアルキル）（アルキル）アミノ、アルケニルカルボニルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ヘテロシクリルアルキルアミノカルボニル、（アルキルアミノアルキル）（アルキル）アミノカルボニル、アルキルアミノアルキルカルボニル、ジアルキルアミノアルキルカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アルキルスルホキシド、アルキルスルホキシドアルキル、アルキルスルホニル、及びアルキルスルホンアルキルからなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換され；
Ｒ３は、
Figure 2023525270000190
からなる群から選択される；かつ
Ｒ４は、直鎖または分岐したＣ１－Ｃ１５アルキルもしくはＣ１－Ｃ１５アルケニルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、
Figure 2023525270000191
Figure 2023525270000192
からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ１とＲ２は同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ１とＲ２は異なる。
いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能脂質は、表１０ａから選択される。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、表１０ａの脂質２６である。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、表１０ａの脂質２７である。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、表１０ａの脂質５３である。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、表１０ａの脂質５４である。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、表１０ａの脂質４５である。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、表１０ａの脂質４６である。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、表１０ａの脂質１３７である。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、表１０ａの脂質１３８である。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、表１０ａの脂質１３９である。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、表１０ａの脂質１２８である。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、表１０ａの脂質１３０である。
いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能脂質は、
Figure 2023525270000193
Figure 2023525270000194
からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能脂質は、
Figure 2023525270000195
からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能脂質は、
Figure 2023525270000196
からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能脂質は、
Figure 2023525270000197
からなる群から選択される。
（表１０ａ）
Figure 2023525270000198
Figure 2023525270000199
Figure 2023525270000200
Figure 2023525270000201
Figure 2023525270000202
Figure 2023525270000203
Figure 2023525270000204
Figure 2023525270000205
Figure 2023525270000206
Figure 2023525270000207
Figure 2023525270000208
Figure 2023525270000209
Figure 2023525270000210
Figure 2023525270000211
Figure 2023525270000212
Figure 2023525270000213
Figure 2023525270000214
Figure 2023525270000215
Figure 2023525270000216
Figure 2023525270000217
Figure 2023525270000218
Figure 2023525270000219
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、ベータ－ヒドロキシルアミン頭部基を有する。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、ガンマ－ヒドロキシルアミン頭部基を有する。
いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能脂質は、表１０ｂから選択される脂質である。いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能脂質は、表１０ｂからの脂質１５である。一実施形態では、イオン化可能脂質は、米国特許公開第ＵＳ２０１７０２１０６９７Ａ１号に記載されている。一実施形態では、イオン化可能脂質は、米国特許公開第ＵＳ２０１７０１１９９０４Ａ１号に記載されている。
（表１０ｂ）
Figure 2023525270000220
Figure 2023525270000221
Figure 2023525270000222
Figure 2023525270000223
Figure 2023525270000224
Figure 2023525270000225
Figure 2023525270000226
Figure 2023525270000227
Figure 2023525270000228
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、下表１０に記載の構造のうちの１つを有する。
（表１０）
Figure 2023525270000229
Figure 2023525270000230
Figure 2023525270000231
Figure 2023525270000232
Figure 2023525270000233
Figure 2023525270000234
Figure 2023525270000235
Figure 2023525270000236
Figure 2023525270000237
Figure 2023525270000238
Figure 2023525270000239
Figure 2023525270000240
Figure 2023525270000241
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、下表１１に記載の構造のうちの１つを有する。いくつかの実施形態では、表１１に記載されているイオン化可能脂質は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６１０５８に記載されているとおりである。
（表１１）
Figure 2023525270000242
Figure 2023525270000243
Figure 2023525270000244
Figure 2023525270000245
Figure 2023525270000246
Figure 2023525270000247
Figure 2023525270000248
Figure 2023525270000249
Figure 2023525270000250
Figure 2023525270000251
Figure 2023525270000252
Figure 2023525270000253
Figure 2023525270000254
Figure 2023525270000255
Figure 2023525270000256
Figure 2023525270000257
Figure 2023525270000258
Figure 2023525270000259
Figure 2023525270000260
Figure 2023525270000261
Figure 2023525270000262
Figure 2023525270000263
Figure 2023525270000264
Figure 2023525270000265
Figure 2023525270000266
Figure 2023525270000267
Figure 2023525270000268
Figure 2023525270000269
Figure 2023525270000270
Figure 2023525270000271
Figure 2023525270000272
Figure 2023525270000273
Figure 2023525270000274
Figure 2023525270000275
Figure 2023525270000276
Figure 2023525270000277
Figure 2023525270000278
Figure 2023525270000279
Figure 2023525270000280
Figure 2023525270000281
Figure 2023525270000282
Figure 2023525270000283
Figure 2023525270000284
Figure 2023525270000285
Figure 2023525270000286
Figure 2023525270000287
Figure 2023525270000288
Figure 2023525270000289
Figure 2023525270000290
Figure 2023525270000291
Figure 2023525270000292
Figure 2023525270000293
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、脂質Ａ、脂質Ｂ、脂質Ｃ、及び／または脂質Ｄを含む。いくつかの実施形態では、脂質Ａ、脂質Ｂ、脂質Ｃ、及び／または脂質Ｄを含めることにより、封入及び／またはエンドソーム脱出を改善する。いくつかの実施形態では、脂質Ａ、脂質Ｂ、脂質Ｃ、及び／または脂質Ｄは、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２８９８１に記載されている。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ９，１２－ジエノアートである脂質Ａであり、３－（（４，４４ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる。脂質Ａは、
Figure 2023525270000294
のように表すことができる。
脂質Ａは、参照によりその全体が組み込まれるＷＯ２０１５／０９５３４０（例えば、８４～８６頁）に従って合成され得る。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカン酸塩）である脂質Ｂである。脂質Ｂは、
Figure 2023525270000295
のように表すことができる。
脂質Ｂは、参照によりその全体が組み込まれるＷＯ２０１４／１３６０８６（例えば、１０７～０９頁）に従って合成され得る。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、２－（（４－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン－１，３－ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－９，１２－ジエノアート）である脂質Ｃである。脂質Ｃは、
Figure 2023525270000296
のように表すことができる。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、３－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）－１３－（オクタノイルオキシ）トリデシル３－オクチルウンデカノアートである脂質Ｄである。脂質Ｄは、
Figure 2023525270000297
のように表すことができる。
脂質Ｃ及び脂質Ｄは、参照によりその全体が組み込まれるＷＯ２０１５／０９５３４０に従って合成され得る。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、米国特許公開第２０１９０３２１４８９号に記載されている。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１０／０５３５７２号に記載されている。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、ＷＯ２０１０／０５３５７２の段落［００２２５］に記載されているＣ１２－２００である。
いくつかのイオン化可能脂質は、文献に記載されており、その多くのは市販されている。特定の実施形態では、そのようなイオン化可能脂質は、本明細書に記載の輸送ビヒクルに含まれる。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯＴＭＡ」が使用される。（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号）。ＤＯＴＭＡは、単独で製剤化することができ、または中性脂質、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンもしくは「ＤＯＰＥ」または他のカチオン性または非カチオン性の脂質と組み合わせて脂質ナノ粒子にすることもできる。他の好適なカチオン性脂質には、例えば、２０１２年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているイオン化可能なカチオン性脂質、例えば、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－１５，１８－ジエン－１－アミン（ＨＧＴ５０００）、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－４，１５，１８－トリエン－１－アミン（ＨＧＴ５００１）、及び（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－５，１５，１８－トリエン－１－アミン（ＨＧＴ５００２）、Ｃ１２－２００（ＷＯ２０１０／０５３５７２に記載されている）、２－（２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ））（ＷＯ２０１０／０４２８７７；Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２－１７６（２０１０）を参照されたい）、２－（２，２－ジ（（９Ｚ，２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノアート（ＩＣＥ）、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－１５，１８－ジエン－１－アミン（ＨＧＴ５０００）、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－４，１５，１８－トリエン－１－アミン（ＨＧＴ５００１）、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－５，１５，１８－トリエン－１－アミン（ＨＧＴ５００２）、５－カルボキシスペルミルグリシン－ジオクタデシルアミド（ＤＯＧＳ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウム（ＤＯＳＰＡ）（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）；米国特許第５，１７１，６７８号；同第５，３３４，７６１号）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパンまたは（ＤＯＴＡＰ）が含まれる。企図されるイオン化可能脂質にはまた、１，２－ジストカリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５′－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３′－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９′，１－２′－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ′－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、２，３－ジリノレオイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロピルアミン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ′－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアムニノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＣＤＡＰ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ）もしくはＧＬ６７、またはそれらの混合物が含まれる。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６－２８７（２００５）、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｄ Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３－１００７（２００５）；ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１２１３４８Ａ１号）。輸送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）を製剤化するためのコレステロールベースのイオン化可能脂質の使用も本発明によって企図される。そのようなコレステロールベースのイオン化可能脂質は、単独でも、または他の脂質と組み合わせても使用することができる。好適なコレステロールベースのイオン化可能脂質には、例えば、ＤＣ－コレステロール（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレステロール）、及び１，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）、Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３，１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）が含まれる。
ジアルキルアミノベース、イミダゾールベース、及びグアニジニウムベースの脂質ようなカチオン性脂質も企図される。例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８４５７号に開示されているイオン化可能脂質（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノアート（ＩＣＥ）の使用も企図される。
ジアルキルアミノベース、イミダゾールベース、及びグアニジニウムベースの脂質のようなイオン化可能脂質もまた企図される。例えば、特定の実施形態は、１つ以上のイミダゾールベースのイオン化可能脂質、例えば、以下の構造（ＸＩＩＩ）で表されるイミダゾールコレステロールエステルまたは「ＩＣＥ」脂質である、（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノアートを含む組成物を対象とする。ある実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの送達のための輸送ビヒクルは、１つ以上のイミダゾールベースのイオン化可能脂質、例えば、構造（ＸＩＩＩ）で表されるイミダゾールコレステロールエステルまたは「ＩＣＥ」脂質である（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノアートを含み得る。
Figure 2023525270000298
特定の理論に拘束されることは望まないが、イミダゾールベースのカチオン性脂質ＩＣＥの融合性は、従来のイオン化可能脂質と比べてｐＫａが低いイミダゾール基によって促進されるエンドソーム破壊に関連すると考えられる。エンドソーム破壊が次に浸透圧膨張及びリポソーム膜の破壊を促進し、続いて、中に搭載された核酸（複数可）含有物が標的細胞内にトランスフェクションまたは細胞内放出される。
イミダゾールベースのイオン化可能脂質はまた、それらが他のイオン化可能脂質と比べて毒性が低いことを特徴とする。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、米国特許公開第２０１９０３１４２８４号により記載されている。特定の実施形態では、イオン化可能脂質は、構造３、４、５、６、７、８、９、または１０（例えば、ＨＧＴ４００１、ＨＧＴ４００２、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ４００４及び／またはＨＧＴ４００５）で表される。特定の実施形態では、１つ以上の切断可能な官能基（例えば、ジスルフィド）は、例えば、親水性官能頭部基が、（例えば、酸化、還元または酸性条件への曝露により）化合物の親油性官能尾部基から解離することを可能にし、それにより１つ以上の標的細胞の脂質二重層における相転移を促進する。例えば、輸送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）が構造３～１０の脂質のうち１つ以上を含む場合、１つ以上の標的細胞の脂質二重層における相転移が、１つ以上の標的細胞へのｃｉｒｃＲＮＡの送達を促進する。
特定の実施形態では、イオン化可能脂質は、構造（ＸＩＶ）で表され、
Figure 2023525270000299
式中、
Ｒ１は、イミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、任意選択で置換されたアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノ等のアルキルアミノ）及びピリジルからなる群から選択され；
Ｒ２は、構造ＸＶ及び構造ＸＶＩからなる群から選択され；
Figure 2023525270000300
ここで、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、任意選択で置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６－Ｃ２０アルキル、及び任意選択で置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６－Ｃ２０アシルからなる群から選択され；ｎは、ゼロまたは任意の正の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上）である。特定の実施形態では、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ、任意選択で置換された多価不飽和Ｃ１８アルキルであり、他の実施形態では、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ、非置換の多価不飽和Ｃ１８アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ３及びＲ４のうちの１つ以上は、（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエンである。
また、本明細書には、構造ＸＩＶの化合物を含む医薬組成物も開示され、式中、Ｒ１は、イミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、任意選択で置換されたアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノ等のアルキルアミノ）及びピリジルからなる群から選択され；Ｒ２は、構造ＸＶであり；ｎは、ゼロまたは任意の正の整数である。本明細書にはさらに、構造ＸＩＶの化合物を含む医薬組成物が開示され、式中、Ｒ１は、イミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、任意選択で置換されたアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノ等のアルキルアミノ）及びピリジルからなる群から選択され；Ｒ２は、構造ＸＶＩであり；Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、任意選択で置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６－Ｃ２０アルキル、及び任意選択で置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６－Ｃ２０アシルからなる群から選択され；ｎは、ゼロまたは任意の正の整数である。特定の実施形態では、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ、任意選択で置換された多価不飽和Ｃ１８アルキルであり、他の実施形態では、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ、非置換の多価不飽和Ｃ１８アルキル（例えば、オクタデカ－９，１２－ジエン）である。
特定の実施形態では、Ｒ１基または頭部基は、極性基または親水性基（例えば、イミダゾール基、グアニジニウム基及びアミノ基のうちの１つ以上）であり、例えば、構造ＸＩＶに示されるジスルフィド（Ｓ－Ｓ）切断可能なリンカー基によってＲ２脂質基に結合されている）。他の企図される切断可能なリンカー基には、例えば、アルキル基（例えば、Ｃ１～Ｃ１０アルキル）に結合（例えば、共有結合）した１つ以上のジスルフィド（Ｓ－Ｓ）リンカー基を含む組成物が含まれ得る。特定の実施形態では、Ｒ１基は、Ｃ１－Ｃ２０アルキル基（例えば、ｎは１～２０である）によって切断可能なリンカー基に共有結合で結合されるか、または別法では、切断可能なリンカー基に直接結合され得る（例えば、ｎは０である）。特定の実施形態では、ジスルフィドリンカー基は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏで切断可能（例えば、酵素により切断可能または酸性もしくは還元条件への曝露で切断可能）である。
特定の実施形態では、本発明特定の実施形態では、本発明は、構造ＸＶＩＩ（本明細書で「ＨＧＴ４００１」と称される）を有する化合物５－（（（１０，１３－ジメチル－１７－（６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）ジスルファニル）メチル）－１Ｈ－イミダゾールに関する。
Figure 2023525270000301
特定の実施形態では、本発明は、構造ＸＶＩＩＩ（本明細書で「ＨＧＴ４００２」と称される）を有する化合物１－（２－（（（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）ジスルファニル）エチル）グアニジンに関する。
Figure 2023525270000302
特定の実施形態では、本発明は、構造ＸＩＸ（本明細書で「ＨＧＴ４００３」と称される）を有する化合物２－（（２，３－ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ）プロピル）ジスルファニル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミンに関する。
Figure 2023525270000303
他の実施形態では、本発明は、構造ＸＸ（本明細書で「ＨＧＴ４００４」と称される）の構造を有する化合物５－（（（２，３－ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ）プロピル）ジスルファニル）メチル）－１Ｈ－イミダゾールに関する。
Figure 2023525270000304
さらに他の実施形態では、本発明は、構造ＸＸＩ（本明細書で「ＨＧＴ４００５」と称される）を有する化合物１－（（（２，３－ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ）プロピル）ジスルファニル）メチル）グアニジンに関する。
Figure 2023525270000305
特定の実施形態では、構造３～１０として記載される化合物は、イオン化可能脂質である。
化合物、及び特に構造３～８として記載されるイミダゾールベースの化合物（例えば、ＨＧＴ４００１及びＨＧＴ４００４）は、特に従来のイオン化可能脂質と比べて、それらの低い毒性を特徴とする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の輸送ビヒクルは、そのような医薬組成物またはリポソーム組成物中のより毒性の高い他のイオン化可能脂質の相対濃度を低下させるか、そうでなければ除去され得るよう、１つ以上のイミダゾールベースのイオン化可能脂質化合物を含む。
イオン化可能脂質には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５２４６号、ならびに米国特許公開第２０１７／０１９０６６１号及び同第２０１７／０１１４０１０号に開示されているものが含まれる。イオン化可能脂質には、以下の表１２、１３、１４、または１５から選択される脂質が含まれる得る。
（表１２）
Figure 2023525270000306
Figure 2023525270000307
Figure 2023525270000308
Figure 2023525270000309
Figure 2023525270000310
（表１３）
Figure 2023525270000311
Figure 2023525270000312
Figure 2023525270000313
（表１４）
Figure 2023525270000314
Figure 2023525270000315
Figure 2023525270000316
Figure 2023525270000317
Figure 2023525270000318
Figure 2023525270000319
Figure 2023525270000320
Figure 2023525270000321
Figure 2023525270000322
Figure 2023525270000323
Figure 2023525270000324
Figure 2023525270000325
Figure 2023525270000326
Figure 2023525270000327
（表１５）
Figure 2023525270000328
Figure 2023525270000329
Figure 2023525270000330
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１５９１３号に記載されているとおりである。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、以下から選択される。
Figure 2023525270000331
Figure 2023525270000332
Figure 2023525270000333
Figure 2023525270000334
Figure 2023525270000335
Figure 2023525270000336
Figure 2023525270000337
Figure 2023525270000338
Figure 2023525270000339
Figure 2023525270000340
Figure 2023525270000341
Figure 2023525270000342
Figure 2023525270000343
Figure 2023525270000344
Figure 2023525270000345
Figure 2023525270000346
Figure 2023525270000347
Figure 2023525270000348
Figure 2023525270000349
Figure 2023525270000350
Figure 2023525270000351
Figure 2023525270000352
Figure 2023525270000353
Figure 2023525270000354
Figure 2023525270000355
Figure 2023525270000356
Figure 2023525270000357
Figure 2023525270000358
Figure 2023525270000359
Figure 2023525270000360
Figure 2023525270000361
Figure 2023525270000362
Figure 2023525270000363
Figure 2023525270000364
Figure 2023525270000365
Figure 2023525270000366
Figure 2023525270000367
Figure 2023525270000368
Figure 2023525270000369
Figure 2023525270000370
Figure 2023525270000371
Figure 2023525270000372
Figure 2023525270000373
Figure 2023525270000374
Figure 2023525270000375
Figure 2023525270000376
Figure 2023525270000377
Figure 2023525270000378
Figure 2023525270000379
Figure 2023525270000380
Figure 2023525270000381
Figure 2023525270000382
Figure 2023525270000383
５．１ アミン脂質
特定の実施形態では、環状ＲＮＡの送達のための輸送ビヒクル組成物は、アミン脂質を含む。特定の実施形態では、イオン化可能脂質は、アミン脂質である。いくつかの実施形態では、アミン脂質は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５３５６９号に記載されている。
いくつかの実施形態では、アミン脂質は、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル・オクタデカ－９、１２－ジエノアートである脂質Ｅである。
脂質Ｅは、
Figure 2023525270000384
のように表すことができる。
脂質Ｅは、ＷＯ２０１５／０９５３４０（例えば、８４～８６頁）に従って合成され得る。特定の実施形態では、アミン脂質は、脂質Ｅと同等である。
特定の実施形態では、アミン脂質は、脂質Ｅの類似体である。特定の実施形態では、脂質Ｅ類似体は、脂質Ｅのアセタール類似体である。特定の輸送ビヒクル組成物では、アセタール類似体は、Ｃ４－Ｃ１２アセタール類似体である。いくつかの実施形態では、アセタール類似体は、Ｃ５－Ｃ１２アセタール類似体である。追加の実施形態では、アセタール類似体は、Ｃ５－Ｃ１０アセタール類似体である。さらなる実施形態では、アセタール類似体は、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１及びＣ１２のアセタール類似体から選ばれる。
本明細書に記載の輸送ビヒクル、例えば、脂質ナノ粒子での使用に好適なアミン脂質及び他の生分解性脂質は、ｉｎ ｖｉｖｏで生分解性である。本明細書に記載のアミン脂質は、毒性が低い（例えば、動物モデルにおいて１０ｍｇ／ｋｇ以上の量で有害作用を伴わずに忍容される）。特定の実施形態では、アミン脂質を構成する輸送ビヒクルには、アミン脂質の少なくとも７５％が血漿から８時間、１０時間、１２時間、２４時間、もしくは４８時間以内、または３日、４日、５日、６日、７日、もしくは１０日以内に消失するものが含まれる。
生分解性脂質には、例えば、ＷＯ２０１７／１７３０５４、ＷＯ２０１５／０９５３４０、及びＷＯ２０１４／１３６０８６の生分解性脂質が含まれる。
脂質クリアランスは、当業者に知られている方法によって測定され得る。例えば、Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｌｉｐｉｄｓ Ｅｎａｂｌｉｎｇ Ｒａｐｉｄｌｙ Ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＲＮＡｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１３，２１（８），１５７０－７８を参照されたい。
アミン脂質を含む輸送ビヒクル組成物は、クリアランス速度増加をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は、脂質クリアランス速度、例えば、脂質が血液、血清、または血漿から消失する速度である。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は、ＲＮＡクリアランス速度、例えば、ｃｉｒｃＲＮＡが血液、血清、または血漿から消失する速度である。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は、輸送ビヒクルが血液、血清、または血漿から消失する速度である。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は、輸送ビヒクルが肝臓組織または脾臓組織等の組織から消失する速度である。特定の実施形態では、高いクリアランス速度は、実質的な有害作用のない安全性プロファイルをもたらす。アミン脂質及び生分解性脂質は、循環血中及び組織内の輸送ビヒクルの蓄積を低減し得る。いくつかの実施形態では、循環血中及び組織内の輸送ビヒクルの蓄積低減は、実質的な有害作用のない安全性プロファイルをもたらす。
脂質は、それらが入っている媒体のｐＨに応じてイオン化可能であり得る。例えば、わずかに酸性の媒体では、アミン脂質等の脂質はプロトン化され、そのため、正電荷を持ち得る。逆に、例えば、ｐＨがおよそ７．３５である血液のように、わずかに塩基性の媒体では、アミン脂質等の脂質はプロトン化されず、そのため、電荷を持たない場合がある。
脂質が電荷を持つ能力は、その固有のｐＫａに関連する。いくつかの実施形態では、本開示のアミン脂質はそれぞれ、独立して、ｐＫａが約５．１～約７．４の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の生物学的に利用可能な脂質はそれぞれ、独立して、ｐＫａが約５．１～約７．４の範囲であり得る。例えば、本開示のアミン脂質はそれぞれ、独立して、ｐＫａが約５．８～約６．５の範囲であり得る。ｐＫａが約５．１～約７．４の範囲である脂質は、例えば肝臓への、ｉｎ ｖｉｖｏでのカーゴの送達に有効である。さらに、ｐＫａが約５．３～約６．４の範囲である脂質は、例えば腫瘍への、ｉｎ ｖｉｖｏ送達に有効であることが見出された。例えば、ＷＯ２０１４／１３６０８６を参照されたい。
５．２ ジスルフィド結合を含有する脂質
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、米国特許第９，７０８，６２８号に記載されている。
本発明は、構造（ＸＸＩＩ）：
Figure 2023525270000385
で表される脂質を提供する。
構造（ＸＸＩＩ）において、Ｘａ及びＸｂは、それぞれ独立して、以下に示されるＸ１またはＸ２である。
Figure 2023525270000386
Ｘ１のＲ４は、１～６個の炭素原子を有するアルキル基であり、直鎖状、分岐状または環状であり得る。アルキル基は好ましくは、炭素数が１～３である。１～６個の炭素原子を有するアルキル基の具体例には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔ－ペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、２－メチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２，２－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、シクロヘキシル基等が含まれる。Ｒ４は好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基またはイソプロピル基、最も好ましくはメチル基である。
Ｘ２のｓは、１または２である。ｓが１である場合、Ｘ２はピロリジニウム基であり、ｓが２である場合、Ｘ２はピペリジニウム基である。ｓは、好ましくは２である。Ｘ２の結合方向は限定されないが、Ｘ２の窒素原子は好ましくは、Ｒ１ａ及びＲ１ｂに結合する。
Ｘａは、Ｘｂと同じであっても異なってもよく、Ｘａは、好ましくはＸｂと同じ基である。
ｎａ及びｎｂは、それぞれ独立して、０または１であり、好ましくは１である。ｎａが１である場合、Ｒ３ａは、Ｙａ及びＲ２ａを介してＸａに結合し、ｎａが０である場合、Ｒ３ａ－Ｘａ－Ｒ１ａ－Ｓ－の構造がとられる。同様に、ｎｂが１である場合、Ｒ３ｂは、Ｙｂ及びＲ２ｂを介してＸｂに結合し、ｎｂが０である場合、Ｒ３ｂ－Ｘｂ－Ｒ１ｂ－Ｓ－の構造がとられる。
ｎａは、ｎｂと同じであっても異なってもよく、ｎａは、好ましくはｎｂと同じである。
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、直鎖または分岐、好ましくは直鎖であり得る。１～６個の炭素原子を有するアルキレン基の具体例には、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ネオペンチレン基等が含まれる。Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ好ましくは、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基またはテトラメチレン基、最も好ましくはエチレン基である。
Ｒ１ａは、Ｒ１ｂと同じであっても異なってもよく、Ｒ１ａは、好ましくはＲ１ｂと同じ基である。
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、直鎖または分岐、好ましくは直鎖であり得る。１～６個の炭素原子を有するアルキレン基の例には、Ｒ１ａまたはＲ１ｂについて１～６個の炭素原子を有するアルキレン基の例として記述されているものが含まれる。Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ好ましくは、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基またはテトラメチレン基である。
Ｘａ及びＸｂがそれぞれＸ１である場合、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、好ましくはトリメチレン基である。Ｘａ及びＸｂがそれぞれＸ２である場合、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、好ましくはエチレン基である。
Ｒ２ａは、Ｒ２ｂと同じであっても異なってもよく、Ｒ２ａは、好ましくはＲ２ｂと同じ基である。
Ｙａ及びＹｂは、それぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カルバマート結合、エーテル結合または尿素結合、好ましくは、エステル結合、アミド結合またはカルバマート結合、最も好ましくは、エステル結合である。Ｙａ及びＹｂの結合方向は限定されないが、Ｙａがエステル結合である場合、Ｒ３ａ－ＣＯ－Ｏ－Ｒ２ａ－の構造が好ましく、Ｙｂがエステル結合である場合、Ｒ３ｂ－ＣＯ－Ｏ－Ｒ２ｂ－の構造が好ましい。
Ｙａは、Ｙｂと同じであっても異なってもよく、Ｙａは、好ましくはＹｂと同じ基である。
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ独立して、ステロール残基、脂溶性ビタミン残基または１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基、好ましくは脂溶性ビタミン残基または１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基、最も好ましくは脂溶性ビタミン残基である。
ステロール残基の例には、コレステリル基（コレステロール残基）、コレステタリル基（コレスタノール残基）、スチグマステリル基（スチグマステロール残基）、β－シトステリル基（β－シトステロール残基）、ラノステリル基（ラノステロール残基）、及びエルゴステリル基（エルゴステロール残基）等が含まれる。ステロール残基は好ましくは、コレステリル基またはコレステタリル基である。
脂溶性ビタミン残基として、脂溶性ビタミンに由来する残基、ならびに脂溶性ビタミンにおける官能基であるヒドロキシル基、アルデヒドまたはカルボン酸を、他の反応性官能基に適切に変換することによって得られる誘導体に由来する残基を使用することができる。例えば、ヒドロキシル基を有する脂溶性ビタミンの場合と同様、ヒドロキシル基は、コハク酸無水物、グルタル酸無水物等を反応させることによってカルボン酸に変換することができる。脂溶性ビタミンの例には、レチノイン酸、レチノール、レチナール、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、カルシフェロール、コレカルシフェロール、ジヒドロエルゴカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、トコフェロール、トコトリエノール等が含まれる。脂溶性ビタミンの好ましい例には、レチノイン酸及びトコフェロールが含まれる。
１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基は、直鎖または分岐、好ましくは直鎖であり得る。脂肪族炭化水素基は、飽和または不飽和であり得る。不飽和脂肪族炭化水素基の場合、脂肪族炭化水素基は一般に、１～６つ、好ましくは１～３つ、より好ましくは１～２つの不飽和結合を含有する。不飽和結合には、炭素－炭素二重結合及び炭素－炭素三重結合が含まれるが、好ましくは、炭素－炭素二重結合である。脂肪族炭化水素基は、炭素数が、好ましくは１２～１８、最も好ましくは１３～１７である。脂肪族炭化水素基には、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等が含まれるが、好ましくは、アルキル基またはアルケニル基である。１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基の具体例には、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘニコシル基、ドコシル基、ドデセニル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基、ヘプタデセニル基、オクタデセニル基、ノナデセニル基、イコセニル基、ヘニコセニル基、ドコセニル基、デカジエニル基、トリデカジエニル基、テトラデカジエニル基、ペンタデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデカジエニル基、オクタデカジエニル基、ノナデカジエニル基、イコサジエニル基、ヘニコサジエニル基、ドコサジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、イコサペンタエニル基、ドコサヘキサエニル基、イソステアリル基等が含まれる。１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基は、好ましくは、トリデシル基、テトラデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ヘプタデカジエニル基またはオクタデカジエニル基、特に好ましくは、トリデシル基、ヘプタデシル基またはヘプタデカジエニル基である。
一実施形態では、脂肪酸、脂肪族アルコール、または脂肪族アミンに由来する、１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基が使用される。Ｒ３ａ（またはＲ３ｂ）が脂肪酸に由来する場合、Ｙａ（またはＹｂ）は、エステル結合またはアミド結合であり、脂肪酸由来カルボニル炭素は、Ｙａ（またはＹｂ）に含まれる。例えば、リノール酸が使用される場合、Ｒ３ａ（またはＲ３ｂ）は、ヘプタデカジエニル基である。
Ｒ３ａは、Ｒ３ｂと同じであっても異なってもよく、Ｒ３ａは、好ましくはＲ３ｂと同じ基である。
一実施形態では、Ｘａは、Ｘｂと同じであり、ｎａは、ｎｂと同じであり、Ｒ１ａは、Ｒ１ｂと同じであり、Ｒ２ａは、Ｒ２ｂと同じであり、Ｒ３ａは、Ｒ３ｂと同じであり、及びＹａは、Ｙｂと同じである。
一実施形態では、
Ｘａ及びＸｂは、それぞれ独立して、Ｘ１であり、
Ｒ４は、１～３個の炭素原子を有するアルキル基であり、ｎａ及びｎｂは、それぞれ１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｙａ及びＹｂは、それぞれ、エステル結合またはアミド結合であり、かつ
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ独立して、１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基である。
一実施形態では、
Ｘａ及びＸｂは、それぞれ、Ｘ１であり、
Ｒ４は、１～３個の炭素原子を有するアルキル基であり、ｎａ及びｎｂは、それぞれ１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｙａ及びＹｂは、それぞれ、エステル結合またはアミド結合であり、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ、１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基であり、
Ｘａは、Ｘｂと同じであり、
Ｒ１ａは、Ｒ１ｂと同じであり、
Ｒ２ａは、Ｒ２ｂと同じであり、かつ
Ｒ３ａは、Ｒ３ｂと同じである。
一実施形態では、
Ｘａ及びＸｂは、それぞれ、Ｘ１であり、
Ｒ４は、メチル基であり、ｎａ及びｎｂは、それぞれ１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ、エチレン基であり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ、トリメチレン基であり、
Ｙａ及びＹｂは、それぞれ、－ＣＯ－Ｏ－であり、かつ
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ独立して、１３～１７個の炭素原子を有するアルキル基またはアルケニル基である。
一実施形態では、
Ｘａ及びＸｂは、それぞれ、Ｘ１であり、
Ｒ４は、メチル基であり、ｎａ及びｎｂは、それぞれ１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ、エチレン基であり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ、トリメチレン基であり、
Ｙａ及びＹｂは、それぞれ、－ＣＯ－Ｏ－であり、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ、１３～１７個の炭素原子を有するアルキル基またはアルケニル基であり、かつ
Ｒ３ａは、Ｒ３ｂと同じである。
一実施形態では、
Ｘａ及びＸｂは、それぞれ独立して、Ｘ１であり、
Ｒ４は、１～３個の炭素原子を有するアルキル基であり、ｎａ及びｎｂは、それぞれ１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｙａ及びＹｂは、それぞれ、エステル結合またはアミド結合であり、かつ
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ独立して、脂溶性ビタミン残基（例えば、レチノイン酸残基、トコフェロール残基）である。
一実施形態では、
Ｘａ及びＸｂは、それぞれ、Ｘ１であり、
Ｒ４は、１～３個の炭素原子を有するアルキル基であり、ｎａ及びｎｂは、それぞれ１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｙａ及びＹｂは、それぞれ、エステル結合またはアミド結合であり、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ、脂溶性ビタミン残基（例えば、レチノイン酸残基、トコフェロール残基）であり、
Ｘａは、Ｘｂと同じであり、
Ｒ１ａは、Ｒ１ｂと同じであり、
Ｒ２ａは、Ｒ２ｂと同じであり、かつ
Ｒ３ａは、Ｒ３ｂと同じである。
一実施形態では、
Ｘａ及びＸｂは、それぞれ、Ｘ１であり、
Ｒ４は、メチル基であり、ｎａ及びｎｂは、それぞれ１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ、エチレン基であり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ、トリメチレン基であり、
Ｙａ及びＹｂは、それぞれ、－ＣＯ－Ｏ－であり、及び
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ独立して、脂溶性ビタミン残基（例えば、レチノイン酸残基、トコフェロール残基）である。
一実施形態では、
Ｘａ及びＸｂは、それぞれ、Ｘ１であり、
Ｒ４は、メチル基であり、ｎａ及びｎｂは、それぞれ１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ、エチレン基であり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ、トリメチレン基であり、
Ｙａ及びＹｂは、それぞれ、－ＣＯ－Ｏ－であり、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ、脂溶性ビタミン残基（例えば、レチノイン酸残基、トコフェロール残基）であり、かつ
Ｒ３ａは、Ｒ３ｂと同じである。
一実施形態では、
Ｘａ及びＸｂは、それぞれ独立して、Ｘ２であり、
ｔは、２であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｙａ及びＹｂは、それぞれ、エステル結合であり、かつ
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ独立して、脂溶性ビタミン残基（例えば、レチノイン酸残基、トコフェロール残基）または１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基（例えば、１２～２２個の炭素原子を有するアルキル基）。
一実施形態では、
Ｘａ及びＸｂは、それぞれ独立して、Ｘ２であり、
ｔは、２であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｙａ及びＹｂは、それぞれ、エステル結合であり、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ独立して、脂溶性ビタミン残基（例えば、レチノイン酸残基、トコフェロール残基）または１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基（例えば、１２～２２個の炭素原子を有するアルキル基）であり、
Ｘａは、Ｘｂと同じであり、
Ｒ１ａは、Ｒ１ｂと同じであり、
Ｒ２ａは、Ｒ２ｂと同じであり、かつ
Ｒ３ａは、Ｒ３ｂと同じである。
一実施形態では、
Ｘａ及びＸｂは、それぞれ独立して、Ｘ２であり、
ｔは、２であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ、エチレン基であり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｙａ及びＹｂは、それぞれ、エステル結合であり、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれ独立して、脂溶性ビタミン残基（例えば、レチノイン酸残基、トコフェロール残基）または１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基（例えば、１２～２２個の炭素原子を有するアルキル基）であり、
Ｘａは、Ｘｂと同じであり、
Ｒ２ａは、Ｒ２ｂと同じであり、かつ
Ｒ３ａは、Ｒ３ｂと同じである。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、以下の表１５ｂに示される構造のうちの１つを有する。
（表１５ｂ）
Figure 2023525270000387
Figure 2023525270000388
Figure 2023525270000389
本発明の脂質は、－Ｓ－Ｓ－（ジスルフィド）結合を有し得る。そのような化合物の生成方法には、
Ｒ３ａ－（Ｙａ－Ｒ２ａ）ｎａ－Ｘａ－Ｒ１ａ－ＳＨ、及び
Ｒ３ｂ－（Ｙｂ－Ｒ２ｂ）ｎｂ－Ｘｂ－Ｒ１ｂ－ＳＨ
を生成すること、ならびにそれらを酸化（カップリング）に供して－Ｓ－Ｓ－を含有する化合物を得ることが含まれる方法、－Ｓ－Ｓ－を含有する化合物に必要な部分を順次結合させて最終的に本発明の化合物を得ることが含まれる方法等が含まれる。後者の方法が好ましい。
後者の方法の具体例が以下に示されているが、これは限定として解釈されるべきではない。
出発化合物の例には、－Ｓ－Ｓ－結合を含有する２つの末端カルボン酸、２つの末端カルボキシラート、２つの末端アミン、２つの末端イソシアナート、２つの末端アルコール、ＭｓＯ（メシラート基）等の脱離基を有する２つの末端アルコール、ｐＮＰ（ｐ－ニトロフェニルカルボナート基）等の脱離基を有する２つの末端カルボナート等が含まれる。
例えば、Ｘａ及びＸｂについてＸ１またはＸ２を含有する化合物を生成する場合、－Ｓ－Ｓ－結合を含有する化合物（１）の２つの末端官能基を、末端に－ＮＨ－基及び１つの官能基を有する化合物（２）の－ＮＨ－基と反応させ、反応に寄与しなかった化合物（２）の末端官能基を、Ｒ３を含有する化合物（３）の官能基と反応させ、それにより、－Ｓ－Ｓ－結合、Ｒ１ａ及びＲ１ｂ、Ｘａ及びＸｂ、Ｒ２ａ及びＲ２ｂ、Ｙａ及びＹｂ、ならびにＲ３ａ及びＲ３ｂを含有する本発明の化合物が得られ得る。
化合物（１）と化合物（２）の反応では、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、カリウムｔ－ブトキシド等のアルカリ触媒を触媒として使用しても、または触媒を用いずに反応を実施してもよい。好ましくは、炭酸カリウムまたは炭酸ナトリウムが触媒として使用される。
触媒の量は、化合物（１）に対して、０．１～１００モル当量、好ましくは、０．１～２０モル当量、より好ましくは０．１～５モル当量である。投入される化合物（２）の量は、化合物（１）に対して、１～５０モル当量、好ましくは１～１０モル当量である。
化合物（１）と化合物（２）の反応に使用される溶媒は、それが反応を阻害しない溶媒または水溶液である限り、特に限定されない。例えば、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン等が挙げられ得る。これらのうち、トルエン及びクロロホルムが好ましい。
反応温度は、－２０～２００℃、好ましくは０～８０℃、より好ましくは２０～５０℃であり、反応時間は、１～４８時間、好ましくは２～２４時間である。
化合物（１）と化合物（２）の反応生成物を化合物（３）と反応させる場合、アルカリ触媒、例えば、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、カリウムｔ－ブトキシド等、または酸触媒、例えば、ＰＴＳ（ｐ－トルエンスルホン酸）、ＭＳＡ（メタンスルホン酸）等を、化合物（１）と化合物（２）の反応に使用する触媒のように使用しても、または触媒を用いずに反応を実施してもよい。
さらに、化合物（１）と化合物（２）の反応生成物は、縮合剤、例えば、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）等を使用することによって化合物（３）と直接反応させてよい。あるいは、化合物（３）を、縮合剤で処理して一旦無水物等に変換し、その後で、それを化合物（１）と化合物（２）の反応生成物と反応させてよい。
投入される化合物（３）の量は、化合物（１）と化合物（２）の反応生成物に対して、１～５０モル当量、好ましくは１～１０モル当量である。
使用される触媒は、反応させる官能基に応じて適切に選択される。
触媒の量は、化合物（１）に対して、０．０５～１００モル当量、好ましくは０．１～２０モル当量、より好ましくは０．２～５モル当量である。
触媒の量は、化合物（１）に対して、０．０５～１００モル当量、好ましくは０．１～２０モル当量、より好ましくは０．２～５モル当量である。触媒の量は、化合物（１）に対して、０．０５～１００モル当量、好ましくは０．１～２０モル当量、より好ましくは０．２～５モル当量である。触媒の量は、化合物（１）に対して、０．０５～１００モル当量、好ましくは０．１～２０モル当量、より好ましくは０．２～５モル当量である。
反応温度は、０～２００℃、好ましくは０～１２０℃、より好ましくは２０～５０℃であり、反応時間は、１時間～４８時間、好ましくは２～２４時間である。
上記反応によって得られる反応生成物は、一般的な精製方法、例えば、水での洗浄、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、結晶化、再結晶化、液液抽出、再沈殿、イオン交換カラムクロマトグラフィー等によって適切に精製することができる。
５．３ 構造ＸＸＩＩＩの脂質
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、米国特許第９，７６５，０２２号に記載されている。
本発明は、構造（ＸＸＩＩＩ）：
Figure 2023525270000390
で表される化合物を提供する。
構造ＸＸＩＩＩでは、親水性であり、任意選択で正電荷を持つ頭部は
Figure 2023525270000391
であり、ここで、Ｒａ、Ｒａ’、Ｒａ’’、及びＲａ’’’の各々は、独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ２０一価脂肪族ラジカル、Ｃ１－Ｃ２０一価ヘテロ脂肪族ラジカル、一価アリールラジカル、または一価ヘテロアリールラジカルであり、Ｚは、Ｃ１－Ｃ２０二価脂肪族ラジカル、Ｃ１－Ｃ２０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであり；Ｂは、Ｃ１－Ｃ２４一価脂肪族ラジカル、Ｃ１－Ｃ２４一価ヘテロ脂肪族ラジカル、一価アリールラジカル、一価ヘテロアリールラジカル、または
Figure 2023525270000392
であり、Ｒ１及びＲ４の各々は、独立して、結合、Ｃ１－Ｃ１０二価脂肪族ラジカル、Ｃ１－Ｃ１０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであり；Ｒ２及びＲ５の各々は、独立して、結合、Ｃ１－Ｃ２０二価脂肪族ラジカル、Ｃ１－Ｃ２０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであり；Ｒ３及びＲ６の各々は、独立して、Ｃ１－Ｃ２０一価脂肪族ラジカル、Ｃ１－Ｃ２０一価ヘテロ脂肪族ラジカル、一価アリールラジカル、または一価ヘテロアリールラジカルであり；疎水性尾部である
Figure 2023525270000393
、及び同じく疎水性尾部である
Figure 2023525270000394
の各々は、８～２４個の炭素原子を有し；及びリンカーであるＸ、及び同じくリンカーであるＹの各々は、独立して、
Figure 2023525270000395
であり、
ここで、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、及びｔの各々は、独立して、１～６であり；Ｗは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｃであり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、またはＲ５に直接連結されているＬ１、Ｌ３、Ｌ５、Ｌ７、及びＬ９の各々は、独立して、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｄであり；Ｌ２、Ｌ４、Ｌ６、Ｌ８、及びＬ１０の各々は、独立して、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｅであり；Ｖは、ＯＲｆ、ＳＲｇ、またはＮＲｈＲｉであり；かつ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ、及びＲｉの各々は、独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１～１０オキシ脂肪族ラジカル、Ｃ１－Ｃ１０一価脂肪族ラジカル、Ｃ１－Ｃ１０一価ヘテロ脂肪族ラジカル、一価アリールラジカル、または一価ヘテロアリールラジカルである。
上述した脂質様化合物のサブセットには、Ａが、
Figure 2023525270000396
または
Figure 2023525270000397
であるものが含まれ、Ｒａ及びＲａ’の各々は、独立して、Ｃ１－Ｃ１０一価脂肪族ラジカル、Ｃ１－Ｃ１０一価ヘテロ脂肪族ラジカル、一価アリールラジカル、または一価ヘテロアリールラジカルであり；Ｚは、Ｃ１－Ｃ１０二価脂肪族ラジカル、Ｃ１－Ｃ１０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルである。
本発明のいくつかの脂質様化合物は、Ｒ１及びＲ４の各々が、独立して、Ｃ１－Ｃ６（例えば、Ｃ１－Ｃ４）二価脂肪族ラジカルまたはＣ１－Ｃ６（例えば、Ｃ１－Ｃ４）二価ヘテロ脂肪族ラジカルであり、Ｒ２及びＲ３の総炭素数が１２～２０（例えば、１４～１８）であり、Ｒ５及びＲ６の総炭素数もまた、１２～２０（例えば、１４～１８）であり、かつ、Ｘ及びＹの各々が、独立して、
Figure 2023525270000398
であることを特徴とする。
Ｘ及びＹの具体例には、
Figure 2023525270000399
が含まれ、ｍは、２～６である。
本発明の範囲内には、タンパク質及び生体内還元性化合物で形成されているナノコンプレックスを含有する医薬組成物がさらに含まれる。この医薬組成物では、ナノコンプレックスは、粒径が５０～５００ｎｍであり；生体内還元性化合物は、ジスルフィド疎水性部分、親水性部分、及びジスルフィド疎水性部分及び親水性部分を連結するリンカーを含有し；タンパク質は、非共有結合による相互作用、共有結合、またはその両方を介して生体内還元性化合物に結合する。
特定の実施形態では、ジスルフィド疎水性部分は、１つ以上の－Ｓ－Ｓ－基及び８～２４個の炭素原子を含有するヘテロ脂肪族ラジカルであり；親水性部分は、１つ以上の親水性基及び１～２０個の炭素原子を含有する脂肪族またはヘテロ脂肪族ラジカルであり、親水性基の各々は、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアミノ、テトラアルキルアンモニウム、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボキシラート、カルバメート、カルバミド、カルボナート、ホスファート、ホスファイト、スルファート、スルファイト、またはチオスルファートであり；リンカーは、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｃ１－Ｃ６アルキレン、
Figure 2023525270000400
であり、ここで、可変要素は上記で定義されている。
Ｘ及びＹの具体例には、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｃ１－Ｃ６アルキレン、
Figure 2023525270000401
が含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明の脂質様化合物には、上記構造ＸＸＩＩＩに示すように、（ｉ）親水性頭部であるＡ；（ｉｉ）疎水性尾部であるＲ２－Ｓ－Ｓ－Ｒ３；及び（ｉｉｉ）リンカーであるＸが含まれる。任意選択で、これらの化合物は、第２の疎水性尾部であるＲ５－Ｓ－Ｓ－Ｒ６及び第２のリンカーであるＹを含有する。
構造ＸＸＩＩＩの親水性頭部は、１つ以上の親水性官能基、例えば、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、アミノ、スルフヒドリル、ホスファート、アミド、エステル、エーテル、カルバメート、カルボナート、カルバミド、及びホスホジエステルを含有する。これらの基は、水素結合を形成することができ、任意選択で、正または負の電荷を持つ。
親水性頭部の例には、
Figure 2023525270000402
が含まれる。
他の例には、Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２６，５６１－６９（２００８）及びＭａｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願公開第２０１１／０２９３７０３号に記載されているものが含まれる。
構造ＸＸＩＩＩの疎水性尾部は、ジスルフィド結合及び８～２４個の炭素原子を含有する飽和または不飽和、線状または分岐状、非環状または環状、芳香族または非芳香族炭化水素部位である。炭素原子の１つ以上は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｂ、Ｓ、Ｓｉ、Ｓｂ、Ａｌ、Ｓｎ、Ａｓ、Ｓｅ、及びＧｅ等のヘテロ原子で置換され得る。尾部は、上述した１つ以上の基で任意選択で置換される。このジスルフィド結合を含有する脂質様化合物は、生体内還元性であり得る。例には、
Figure 2023525270000403
が含まれる。
構造ＸＸＩＩＩのリンカーは、親水性頭部と疎水性尾部を連結する。リンカーは、親水性または疎水性、極性または非極性である任意の化学基、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、アミノ、アルキレン、エステル、アミド、カルバメート、カルバミド、カルボナート、ホスファート、ホスファイト、スルファート、スルファイト、及びチオスルファートであり得る。例には、
Figure 2023525270000404
が含まれる。
以下に本発明の例示的な脂質様化合物を示す。
Figure 2023525270000405
Figure 2023525270000406
Figure 2023525270000407
構造ＸＸＩＩＩの脂質様化合物は、当該技術分野でよく知られている方法によって調製され得る。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，４０３－０７（２０１２）、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０４２９７３号、及びＺｕｇａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第８，０７１，０８２号を参照されたい。以下に示する経路は、これらの脂質様化合物の合成を例示している。
Figure 2023525270000408
Ｌａ、Ｌａ’、Ｌ、及びＬ’の各々は、Ｌ１－Ｌ１０のうちの１つであり得；Ｗａ及びＷｂの各々は、独立して、ＷまたはＶであり；Ｒａ及びＲ１－Ｒ６は、Ｌ１－Ｌ１０、Ｗ、及びＶと同様に、上記で定義されている。
この例示的な合成経路において、アミン化合物、すなわち、化合物Ｄは、臭化物Ｅ１及びＥ２と反応して化合物Ｆを形成し、これが次に、Ｇ１及びＧ２の両方と結合して最終生成物、すなわち、化合物Ｈが生成される。この化合物（上に示されている）における二重結合の一方または両方を、１つまたは２つの単結合に還元させ、構造ＸＸＩＩＩの異なる脂質様化合物を得ることができる。
本発明の他の脂質様化合物は、上述した合成経路を介した他の好適な出発物質及び当該技術分野で知られている他のものを使用して調製することができる。上記の方法には、脂質様化合物の合成を最終的に可能とするために、好適な保護基を付加または除去するために追加のステップ（複数可）が含まれ得る。さらに、様々な合成ステップを代替の配列または順序で実施して所望の物質を得ることができる。適用可能な脂質様化合物の合成において有用な合成化学変換及び保護基方法論（保護及び脱保護）は、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（２ｎｄ Ｅｄ．，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ １９９９）、Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ ａｎｄ Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（４ｔｈ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ ２００７）、Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９４）、及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ ２００９）ならびにそれらの後続版を含めて、当該技術分野で知られている。所定の脂質様化合物は、非芳香族二重結合及び１つ以上の不斉中心を含有し得る。したがって、それらは、ラセミ体及びラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマー、ジアステレオマー混合物、ならびにシスまたはトランスの異性体形態として存在し得る。そのような異性体形態の全てが企図される。
上記のように、これらの脂質様化合物は、医薬剤の送達に有用である。それらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって医薬剤の送達におけるそれらの有効性について予備スクリーニングされ、その後、動物実験及び臨床試験によって確認され得る。他の方法もまた当業者に明らかであろう。
いかなる理論にも拘束されないが、構造ＸＸＩＩＩの脂質様化合物は、複合体、例えば、ナノコンプレックス及びマイクロ粒子を形成することによって医薬剤の送達を促進する。正または負の電荷を持つそのような脂質様化合物の親水性頭部は、反対の電荷を持つ医薬剤の部分に結合し、その疎水性部分は、医薬剤の疎水性部分に結合する。いずれの結合も共有結合性または非共有結合性であり得る。
上述した複合体は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，４０３－０７（２０１２）等の刊行物に記載されている手順を使用して調製することができる。一般に、それらは、酢酸ナトリウム緩衝液またはリン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）等の緩衝液中で脂質様化合物及び医薬剤をインキュベートすることによって得られる。
５．４ 親水性基
例えば、本明細書に開示する化合物における親水性頭部基としてのグアニジニウムの組み込みは、そのような化合物の（またはそのような化合物が成分である輸送ビヒクルの）１つ以上の標的細胞の細胞膜との融合性を促進し、それにより、例えば、そのような化合物のトランスフェクション効率を向上させ得る。親水性グアニジニウム部分からの窒素は、相互作用に対する安定性を与える６員環遷移状態を形成し、これにより、封入された物質の細胞内への取り込みを可能にするという仮説が立てられている。（Ｗｅｎｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．（２００８）６０：４５２－４７２）。（Ｗｅｎｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．（２００８） ６０：４５２－４７２）。同様に、開示される化合物への１つ以上のアミノ基またはアミノ部分の（例えば、頭部基としての）組み込みは、そのようなアミノ基の融合性を利用することによって標的細胞のエンドソーム／リソソーム膜の破壊をさらに促進し得る。これは、組成物のアミノ基のｐＫａ基づくだけでなく、アミノ基が六方相転移を受け、標的細胞表面、すなわち、ベシクル膜と融合する能力にも基づく。（Ｋｏｌｔｏｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８） ２８１：７８－８１）。結果は、ベシクル膜の破壊及び標的細胞への脂質ナノ粒子含有物の放出を促進すると考えられる。
同様に、特定の実施形態では、例えば、本明細書に開示する化合物における親水性頭部基としてのイミダゾールの組み込みは、例えば、本発明の輸送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）に封入された内容物のエンドソームまたはリソソーム放出を促進する役目を果たし得る。そのような放出増強は、プロトン－スポンジ媒介性の破壊メカニズム及び／または増強した融合性メカニズムの一方または両方によって達成され得る。プロトン－スポンジメカニズムは、化合物、特に化合物の官能性の部分または基がエンドソームの酸性化を緩衝する能力に基づく。これは、化合物のｐＫａまたはそのような化合物（例えば、イミダゾール）を含む官能基の１つ以上のｐＫａで操作されるか、またはそうでなければ制御され得る。したがって、特定の実施形態では、例えば、本明細書に開示するイミダゾールベースの化合物（例えば、ＨＧＴ４００１及びＨＧＴ４００４）の融合性は、ｐＫａが他の従来のイオン化可能脂質と比べて低いそのようなイミダゾール基によって促進されるエンドソーム破壊特性に関連する。そのようなエンドソーム破壊が次に浸透圧膨張及びリポソーム膜の破壊を促進し、続いて、その中に搭載または封入されたポリヌクレオチド物質が標的細胞にトランスフェクションまたは細胞内放出される。この現象は、イミダゾール部分に加えて所望のｐＫａプロファイルを有する多様な化合物に当てはめることができる。そのような実施形態にはまた、多窒素ベースの官能基、例えば、ポリアミン、ポリ－ペプチド（ヒスチジン）、及び窒素ベースの樹状構造が含まれる。
例示的なイオン化可能脂質及び／またはカチオン性脂質は、国際ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１５／０９５３４０号、第ＷＯ２０１５／１９９９５２号、第ＷＯ２０１８／０１１６３３号、第ＷＯ２０１７／０４９２４５号、第ＷＯ２０１５／０６１４６７号、第ＷＯ２０１２／０４０１８４号、第ＷＯ２０１２／０００１０４号、第ＷＯ２０１５／０７４０８５号、第ＷＯ２０１６／０８１０２９号、第ＷＯ２０１７／００４１４３号、第ＷＯ２０１７／０７５５３１号、第ＷＯ２０１７／１１７５２８号、第ＷＯ２０１１／０２２４６０号、第ＷＯ２０１３／１４８５４１号、第ＷＯ２０１３／１１６１２６号、第ＷＯ２０１１／１５３１２０号、第ＷＯ２０１２／０４４６３８号、第ＷＯ２０１２／０５４３６５号、第ＷＯ２０１１／０９０９６５号、第ＷＯ２０１３／０１６０５８号、第ＷＯ２０１２／１６２２１０号、第ＷＯ２００８／０４２９７３号、第ＷＯ２０１０／１２９７０９号、第ＷＯ２０１０／１４４７４０号、第ＷＯ２０１２／０９９７５５号、第ＷＯ２０１３／０４９３２８号、第ＷＯ２０１３／０８６３２２号、第ＷＯ２０１３／０８６３７３号、第ＷＯ２０１１／０７１８６０号、第ＷＯ２００９／１３２１３１号、第ＷＯ２０１０／０４８５３６号、第ＷＯ２０１０／０８８５３７号、第ＷＯ２０１０／０５４４０１号、第ＷＯ２０１０／０５４４０６号、第ＷＯ２０１０／０５４４０５号、第ＷＯ２０１０／０５４３８４号、第ＷＯ２０１２／０１６１８４号、第ＷＯ２００９／０８６５５８号、第ＷＯ２０１０／０４２８７７号、第ＷＯ２０１１／０００１０６号、第ＷＯ２０１１／０００１０７号、第ＷＯ２００５／１２０１５２号、第ＷＯ２０１１／１４１７０５号、第ＷＯ２０１３／１２６８０３号、第ＷＯ２００６／００７７１２号、第ＷＯ２０１１／０３８１６０号、第ＷＯ２００５／１２１３４８号、第ＷＯ２０１１／０６６６５１号、第ＷＯ２００９／１２７０６０号、第ＷＯ２０１１／１４１７０４号、第ＷＯ２００６／０６９７８２号、第ＷＯ２０１２／０３１０４３号、第ＷＯ２０１３／００６８２５号、第ＷＯ２０１３／０３３５６３号、第ＷＯ２０１３／０８９１５１号、第ＷＯ２０１７／０９９８２３号、第ＷＯ２０１５／０９５３４６号、及び第ＷＯ２０１３／０８６３５４号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１６／０３１１７５９号、第ＵＳ２０１５／０３７６１１５号、第ＵＳ２０１６／０１５１２８４号、第ＵＳ２０１７／０２１０６９７号、第ＵＳ２０１５／０１４００７０号、第ＵＳ２０１３／０１７８５４１号、第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、第ＵＳ２０１５／０１４１６７８号、第ＵＳ２０１５／０２３９９２６号、第ＵＳ２０１６／０３７６２２４号、第ＵＳ２０１７／０１１９９０４号、第ＵＳ２０１２／０１４９８９４号、第ＵＳ２０１５／００５７３７３号、第ＵＳ２０１３／００９０３７２号、第ＵＳ２０１３／０２７４５２３号、第ＵＳ２０１３／０２７４５０４号、第ＵＳ２０１３／０２７４５０４号、第ＵＳ２００９／００２３６７３号、第ＵＳ２０１２／０１２８７６０号、第ＵＳ２０１０／０３２４１２０号、第ＵＳ２０１４／０２００２５７号、第ＵＳ２０１５／０２０３４４６号、第ＵＳ２０１８／０００５３６３号、第ＵＳ２０１４／０３０８３０４号、第ＵＳ２０１３／０３３８２１０号、第ＵＳ２０１２／０１０１１４８号、第ＵＳ２０１２／００２７７９６号、第ＵＳ２０１２／００５８１４４号、第ＵＳ２０１３／０３２３２６９号、第ＵＳ２０１１／０１１７１２５号、第ＵＳ２０１１／０２５６１７５号、第ＵＳ２０１２／０２０２８７１号、第ＵＳ２０１１／００７６３３５号、第ＵＳ２００６／００８３７８０号、第ＵＳ２０１３／０１２３３３８号、第ＵＳ２０１５／００６４２４２号、第ＵＳ２００６／００５１４０５号、第ＵＳ２０１３／００６５９３９号、第ＵＳ２００６／０００８９１０号、第ＵＳ２００３／００２２６４９号、第ＵＳ２０１０／０１３０５８８号、第ＵＳ２０１３／０１１６３０７号、第ＵＳ２０１０／００６２９６７号、第ＵＳ２０１３／０２０２６８４号、第ＵＳ２０１４／０１４１０７０号、第ＵＳ２０１４／０２５５４７２号、第ＵＳ２０１４／００３９０３２号、第ＵＳ２０１８／００２８６６４号、第ＵＳ２０１６／０３１７４５８号、及び第ＵＳ２０１３／０１９５９２０号に記載されており、これらの全ての内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。国際特許出願第ＷＯ２０１９／１３１７７０号もその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
１．ＰＥＧ脂質
本明細書に記載のリポソーム及び医薬組成物における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質及び誘導体化セラミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）等の誘導体化脂質、例えば、Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）－２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ－２０００セラミド）の使用及び包含が企図され、好ましくは、本明細書に開示する化合物及び脂質のうちの１つ以上と組み合わせたものが企図される。企図されるＰＥＧ修飾脂質には、長さがＣ６～Ｃ２０のアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合で結合している最大５ｋＤａの長さのポリエチレングリコール鎖が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法において採用されるＰＥＧ修飾脂質は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（２０００ＭＷ ＰＥＧ）「ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００」である。脂質送達ビヒクルへのＰＥＧ修飾脂質の追加は、複雑な凝集を防止し得、また、循環血中寿命を延長させ、標的組織への脂質－ポリヌクレオチド組成物の送達を増大させる手段も提供し得（Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５－２３７）、またそれらが、ｉｎ ｖｉｖｏで製剤から迅速に交換されるよう選択もされ得る（米国特許第５，８８５，６１３号を参照されたい）。特に有用な交換可能脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧ－セラミドである。本発明のＰＥＧ修飾リン脂質及び誘導体化脂質は、リポソーム脂質ナノ粒子に存在する総脂質の約０％～約２０％、約０．５％～約２０％、約１％～約１５％、約４％～約１０％、または約２％のモル比を構成し得る。
ある実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１５９１３号に記載されている。ある実施形態では、輸送ビヒクルは、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む。
ＰＥＧ修飾脂質の非限定的な例には、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミド複合体（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミンならびにＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが含まれる。いくつかのさらなる実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、例えば、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥであり得る。
いくつかのさらに別の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質には、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルメトレイル、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ－ｌ，２－ジミリスチルオキシルプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
様々な実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質はまた、「ＰＥＧ化脂質」または「ＰＥＧ脂質」と称され得る。
一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質の脂質部分には、長さが約Ｃ１４～約Ｃ２２、例えば、約Ｃ１４～約Ｃ１６のものが含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分、例えば、ｍＰＥＧ－ＮＨ２は、サイズが約１０００、約２０００、約５０００、約１０，０００、約１５，０００または約２０，０００ダルトンである。一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧで修飾された脂質を含み得る。非拡散性ＰＥＧの非限定的な例には、ＰＥＧ－ＤＳＧ及びＰＥＧ－ＤＳＰＥが含まれる。
ＰＥＧ脂質は、当該技術分野で知られており、例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，１５８，６０１号及び国際特許公開第ＷＯ２０１５／１３０５８４Ａ２号に記載されているものである。
様々な実施形態では、本明細書に記載の脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）は、その全体が参照により組み込まれる国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９号に記載されているように合成され得る。
脂質ナノ粒子組成物の脂質成分は、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質等のポリエチレングリコールを含む１つ以上の分子を含み得る。そのような種は、代替的にＰＥＧ化脂質と称され得る。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む非限定的な群から選択され得る。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧの修飾形態である。ＰＥＧ－ＤＭＧは、以下の構造：
Figure 2023525270000409
を有する。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ－Ｃ１８の修飾形態、またはＰＥＧ－１である。ＰＥＧ－１は、以下の構造：
Figure 2023525270000410
を有する。
一実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０９９７５５号、に記載されているＰＥＧ化脂質であり得る。本明細書に記載のこれらの例示的なＰＥＧ脂質のいずれかは、ＰＥＧ鎖上のヒドロキシル基を含むように修飾され得る。特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質である。特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨ脂質は、ＰＥＧ鎖上に１つ以上のヒドロキシル基を含む。特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨまたはヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ鎖の末端に－ＯＨ基を含む。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、式（Ｐ１）の化合物：
Figure 2023525270000411
またはその塩もしくは異性体である
［式中、
ｒは、１～１００の整数であり；
Ｒは、Ｃ１０～４０アルキル、Ｃ１０～４０アルケニル、またはＣ１０～４０アルキニルであり；任意選択で、Ｒの１つ以上のメチレン基は、独立して、Ｃ３－１０カルボシクリレン、４～１０員ヘテロシクリレン、Ｃ６－１０アリーレン、４～１０員ヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置き換えられ；かつそれぞれの場合のＲＮは、独立して、水素、Ｃ１～６アルキル、または窒素保護基である］。
例えば、Ｒは、Ｃ１７アルキルである。例えば、ＰＥＧ脂質は、式（Ｐ１－ａ）の化合物：
Figure 2023525270000412
またはその塩もしくは異性体であり、式中、Ｒは、１～１００の整数である。
例えば、ＰＥＧ脂質は、以下の式の化合物である。
Figure 2023525270000413
２．ヘルパー脂質
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の輸送ビヒクル（例えば、ＬＮＰ）は、１つ以上の非カチオン性ヘルパー脂質を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、リン脂質である。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、リン脂質代替物または代用物である。いくつかの実施形態では、リン脂質またはリン脂質代替物は、例えば、１つ以上の飽和もしくは（多価）不飽和のリン脂質、またはリン脂質代替物、あるいはそれらの組み合わせであり得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び１つ以上の脂肪酸部分を含む。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リソホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。
リン脂質には、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジグリセロール、及びホスファチジン酸が含まれるが、これらに限定されない。リン脂質にはまた、スフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質が含まれる。
いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、１，２－ジステアロイル－１７７－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）類似体、ＤＳＰＣ代替物、オレイン酸、またはオレイン酸類似体である。
いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、非ホスファチジルコリン（ＰＣ）双性イオン性脂質、ＤＳＰＣ類似体、オレイン酸、オレイン酸類似体、またはＤＳＰＣ代替物である。
いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５３５６９に記載されている。本開示の脂質組成物での使用に好適なヘルパー脂質には、例えば、多様な中性、非荷電または双性イオン性の脂質が含まれる。そのようなヘルパー脂質は好ましくは、本明細書に開示する化合物及び脂質のうちの１つ以上と組み合わせて使用される。ヘルパー脂質の例には、５－ヘプタデシルベンゼン－１，３－ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２－ジステアロイルｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パイミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パイミトイイオイエオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リソホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイロレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リソホスファチジルエタノールアミン及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、ヘルパー脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）またはジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）であり得る。別の実施形態では、ヘルパー脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であり得る。ヘルパー脂質は、輸送ビヒクルの処理を安定化及び改善するように機能する。そのようなヘルパー脂質は好ましくは、他の賦形剤、例えば、本明細書に開示するイオン化可能脂質の１つ以上と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質と組み合わせて使用される場合、ヘルパー脂質は、脂質ナノ粒子に存在する総脂質の５％～約９０％、または約１０％～約７０％のモル比を含み得る。
３． 構造脂質
実施形態では、構造脂質は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１５９１３号に記載されている。
本明細書に記載の輸送ビヒクルは、１つ以上の構造脂質を含む。脂質ナノ粒子における構造脂質の組み込みは、粒子中の他の脂質の凝集を軽減するのに役立ち得る。構造脂質には、コレステロール、フェコステロール、エルゴステロール、バシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル、アルファ－トコフェロール、及びそれらの混合物が含まれ得るが、これらに限定されない。特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。特定の実施形態では、構造脂質には、コレステロール及びコルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、及びヒドロコルチゾン等）、またはそれらの組み合わせが含まれる。
いくつかの実施形態では、構造脂質は、ステロールである。特定の実施形態では、構造脂質は、ステロイドである。特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールの類似体である。特定の実施形態では、構造脂質は、アルファ－トコフェロールである。
本明細書に記載の輸送ビヒクルは、１つ以上の構造脂質を含む。輸送ビヒクル、例えば、脂質ナノ粒子への構造脂質の組み込みは、粒子中の他の脂質の凝集を軽減するのに役立ち得る。特定の実施形態では、構造脂質には、コレステロール及びコルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、及びヒドロコルチゾン等）、またはそれらの組み合わせが含まれる。
いくつかの実施形態では、構造脂質は、ステロールである。構造脂質には、ステロール（例えば、フィトステロールまたは動物ステロール）が含まれ得るが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、構造脂質は、ステロイドである。例えば、ステロールには、コレステロール、β－シトステロール、フェコステロール、エルゴステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル酸、またはアルファ－トコフェロールが含まれ得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルには、有効量の免疫細胞送達増強脂質、例えば、コレステロール類似体もしくはアミノ脂質またはそれらの組み合わせが含まれ、これは、輸送ビヒクル、例えば、脂質ナノ粒子に存在する場合、免疫細胞送達増強脂質を欠く輸送ビヒクルと比べて、細胞の会合及び／または取り込み、内部移行、細胞内の輸送及び／またはプロセシング、及び／またはエンドソーム脱出を増強させることによって機能し得、及び／または免疫細胞による認識及び／または免疫細胞への結合を増強し得る。したがって、いかなる特定のメカニズムまたは理論によって拘束されることを意図するものではないが、一実施形態では、本開示の構造脂質または他の免疫細胞送達増強脂質は、Ｃ１ｑに結合するか、またはそのような脂質を含む輸送ビヒクルのＣ１ｑへの結合を促進する。したがって、免疫細胞への核酸分子の送達のための本開示の輸送ビヒクルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用の場合、Ｃ１ｑが含まれる培養条件が使用される（例えば、血清が含まれる培地の使用、または無血清培地への外因性Ｃ１ｑの添加）。本開示の輸送ビヒクルのｉｎ ｖｉｖｏ使用の場合、Ｃ１ｑに必要なものは、内因性Ｃ１ｑにより供給される。
特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールの類似体である。いくつかの実施形態では、構造脂質は表１６の脂質である。
（表１６）
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Figure 2023525270000415
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Figure 2023525270000424
４．ＬＮＰ製剤
本明細書に記載の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形成は、当該技術分野で知られている任意の方法によって達成され得る。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第ＵＳ２０１２／０１７８７０２Ａ１号に記載されているようなもの。脂質ナノ粒子組成物及びそれらを作製する方法の非限定的な例は、例えば、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１７２－１７６、Ｊａｙａｒａｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，５１：８５２９－８５３３、及びＭａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１，１５７０－１５７８に記載されている（これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、例えば、各々の内容が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１１／１２７２５５号または同第ＷＯ２００８／１０３２７６号に記載されている方法によって調製され得る。
一実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、ポリカチオン性組成物を含み得る。非限定的な例として、ポリカチオン性組成物は、内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第ＵＳ２００５／０２２２０６４Ａ１号の式１～６０から選択される組成物であり得る。
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第ＵＳ２０１３／０１５６８４５Ａ１号、及び国際特許公開第ＷＯ２０１３／０９３６４８Ａ２号または同第ＷＯ２０１２／０２４５２６Ａ２号に記載されている方法によって製剤化され得る。
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第ＵＳ２０１３／０１６４４００Ａ１号に記載されているシステム及び／または方法によって滅菌環境において作製され得る。
一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，４９２，３５９号に記載されている核酸－脂質粒子等のナノ粒子中で製剤化され得る。
ナノ粒子組成物は、任意選択で、１つ以上のコーティングを含み得る。例えば、ナノ粒子組成物は、コーティングを有するカプセル、フィルム、または錠剤に製剤化され得る。本明細書に記載の組成物を含むカプセル、フィルム、または錠剤は、任意の有用なサイズ、引張強度、硬度、または密度を有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、マイクロ流体ミキサーを含む方法を使用して合成され得る。例示的なマイクロ流体ミキサーには、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）、Ｍｉｃｒｏｉｎｎｏｖａ（Ａｌｌｅｒｈｅｉｌｉｇｅｎ ｂｅｉ Ｗｉｌｄｏｎ，Ａｕｓｔｒｉａ）によって製造されているもの等のこれらに限定されないスリット・インターデジタル・マイクロミキサー及び／または交互ヘリングボーンマイクロミキサー（ＳＨＭ）（Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖ，Ｉ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２８：３６３３－４０、Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．（２０１２）１：ｅ３７；Ｃｈｅｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０１２）１３４（１６）：６９４８－５１；（その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が含まれ得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ＳＨＭを含むＬＮＰ生成の方法はさらに、マイクロ構造で誘導されるカオス的移流（ＭＩＣＡ）によって混合が生じる少なくとも２つの導入ストリームの混合を含む。この方法によれば、流体ストリームは、ヘリングボーンパターンで存在するチャネルを通って流れ、回転流を引き起こし、互いに巻き込み合う。この方法はまた、流体混合用の表面を含み得、その表面は、流体循環中に向きを変える。ＳＨＭを使用してＬＮＰを生成する方法には、米国特許公開第ＵＳ２００４／０２６２２２３Ａ１号及び同第ＵＳ２０１２／０２７６２０９Ａ１号に開示されているものが含まれ、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、マイクロミキサー、例えば、限定されないが、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ Ｍａｉｎｚ ＧｍｂＨ，Ｍａｉｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＳｌｉｔ Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｍｉｘｅｒ（ＳＩＭＭ－Ｖ２）またはＳｔａｎｄａｒｄ Ｓｌｉｔ Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏ Ｍｉｘｅｒ（ＳＳＩＭＭ）またはＣａｔｅｒｐｉｌｌａｒ（ＣＰＭＭ）またはＩｍｐｉｎｇｉｎｇ－ｊｅｔ（ＩＪＭＭ）を使用して製剤化され得る。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、マイクロ流体技術を使用して生成される（各々が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ．４４２：３６８－３７３、及びＡｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９５：６４７－６５１を参照されたい）。非限定的な例として、制御されたマイクロ流体製剤化には、マイクロチャネルにおいて低いレイノルズ数で安定した圧力駆動流のストリームを混合するための受動的方法を含む（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９５：６４７６５１を参照されたい）。
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＲＮＡは、マイクロミキサーチップ、例えば、限定されないが、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）、Ｄｏｌｏｍｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｒｏｙｓｔｏｎ，ＵＫ）、またはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｖａｎ Ｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）製のものを使用して生成された脂質ナノ粒子で製剤化され得る。分割及び混和メカニズムでの２つ以上の流体ストリームの急速混合のためにマイクロミキサーチップを使用することができる。
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、直径が約１０～約１００ｎｍ、例えば、限定されないが、約１０～約２０ｎｍ、約１０～約３０ｎｍ、約１０～約４０ｎｍ、約１０～約５０ｎｍ、約１０～約６０ｎｍ、約１０～約７０ｎｍ、約１０～約８０ｎｍ、約１０～約９０ｎｍ、約２０～約３０ｎｍ、約２０～約４０ｎｍ、約２０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約２０～約１００ｎｍ、約３０～約４０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約４０～約１００ｎｍ、約５０～約６０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ約５０～約８０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ、約６０～約１００ｎｍ、約７０～約８０ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約７０～約１００ｎｍ、約８０～約９０ｎｍ、約８０～約１００ｎｍ及び／または約９０～約１００ｎｍであり得る。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、直径が約１０～５００ｎｍであり得る。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、直径が１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超または１０００ｎｍ超であり得る。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、平均直径が１０～５００ｎｍ、２０～４００ｎｍ、３０～３００ｎｍ、または４０～２００ｎｍであり得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、平均直径が５０～１５０ｎｍ、５０～２００ｎｍ、８０～１００ｎｍ、または８０～２００ｎｍであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、直径が０．１μｍ未満から最大で１ｍｍ、例えば、限定されないが、０．１μｍ未満、１．０μｍ未満、５μｍ未満、１０μｍ未満、１５μｍ未満、２０μｍ未満、２５μｍ未満、３０μｍ未満、３５μｍ未満、４０μｍ未満、５０μｍ未満、５５μｍ未満、６０μｍ未満、６５μｍ未満、７０μｍ未満、７５μｍ未満、８０μｍ未満、８５μｍ未満、９０μｍ未満、９５μｍ未満、１００μｍ未満、１２５μｍ未満、１５０μｍ未満、１７５μｍ未満、２００μｍ未満、２２５μｍ未満、２５０μｍ未満、２７５μｍ未満、３００μｍ未満、３２５μｍ未満、３５０μｍ未満、３７５μｍ未満、４００μｍ未満、４２５μｍ未満、４５０μｍ未満、４７５μｍ未満、５００μｍ未満、５２５μｍ未満、５５０μｍ未満、５７５μｍ未満、６００μｍ未満、６２５μｍ未満、６５０μｍ未満、６７５μｍ未満、７００μｍ未満、７２５μｍ未満、７５０μｍ未満、７７５μｍ未満、８００μｍ未満、８２５μｍ未満、８５０μｍ未満、８７５μｍ未満、９００μｍ未満、９２５μｍ未満、９５０μｍ未満、９７５μｍ未満であり得る。
別の実施形態では、ＬＮＰは、直径が約１ｎｍ～約１００ｎｍ、約１ｎｍ～約１０ｎｍ、約１ｎｍ～約２０ｎｍ、約１ｎｍ～約３０ｎｍ、約１ｎｍ～約４０ｎｍ、約１ｎｍ～約５０ｎｍ、約１ｎｍ～約６０ｎｍ、約１ｎｍ～約７０ｎｍ、約１ｎｍ～約８０ｎｍ、約１ｎｍ～約９０ｎｍ、約５ｎｍ～約１００ｎｍ、約５ｎｍ～約１０ｎｍ、約５ｎｍ～約２０ｎｍ、約５ｎｍ～約３０ｎｍ、約５ｎｍ～約４０ｎｍ、約５ｎｍ～約５０ｎｍ、約５ｎｍ～約６０ｎｍ、約５ｎｍ～約７０ｎｍ、約５ｎｍ～約８０ｎｍ、約５ｎｍ～約９０ｎｍ、約１０～約５０ｎＭ、約２０～約５０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約５０～約８０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ及び／または約７０～約９０ｎｍであり得る。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
ナノ粒子組成物は、比較的均質であり得る。多分散性指数は、ナノ粒子組成物の均一性、例えば、ナノ粒子組成物の粒径分布を示すために使用され得る。小さい（例えば、０．３未満）多分散性指数は一般に、狭い粒径分布を示す。ナノ粒子組成物は、多分散性指数が約０～約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、または０．２５であり得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物の多分散性指数は、約０．１０～約０．２０であり得る。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
組成物の界面動電位を示すためにナノ粒子組成物のゼータ電位が使用され得る。例えば、ゼータ電位は、ナノ粒子組成物の表面電荷を表し得る。より高い電荷を持つ種が、細胞、組織、及び身体の他の要素と不要に相互作用する場合があるため、正負を問わず比較的低い電荷を持つナノ粒子組成物が一般に望ましい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物のゼータ電位は、約－２０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－２０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－２０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－２０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－２０ｍＶ～約０ｍＶ、約－２０ｍＶ～約－５ｍＶ、約－２０ｍＶ～約－１０ｍＶ、約－２０ｍＶ～約－１５ｍＶ約－２０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－２０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－２０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－２０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－２０ｍＶ～約０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、または約＋５ｍＶ～約＋１０ｍＶであり得る。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
治療剤の封入の効率は、与えられた初期量と比べて、調製後にナノ粒子組成物に封入されるか、またはそうでなければ会合している治療剤の量を表す。封入効率は、高い（例えば、１００％に近い）ことが望ましい。封入効率は、例えば、１つ以上の有機溶媒または洗浄剤でナノ粒子組成物を分解する前後の、ナノ粒子組成物を含有する溶液中の治療剤の量を比較することによって測定され得る。蛍光は、溶液中の遊離治療剤（例えば、核酸）の量を測定するために使用され得る。本明細書に記載のナノ粒子組成物の場合、治療剤の封入効率は、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、封入効率は、少なくとも８０％であり得る。特定の実施形態では、封入効率は、少なくとも９０％であり得る。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．４未満の多重多様度の値を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、中性ｐＨで正味中性電荷を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、平均直径が５０～２００ｎｍであり得る。
脂質ナノ粒子製剤の特性は、カチオン性脂質成分の選択、カチオン性脂質飽和の程度、非カチオン性脂質成分の選択、非カチオン性脂質飽和の程度、構造脂質成分の選択、ＰＥＧ化の性質、全成分の比、及びサイズ等の生物物理学的パラメータを含むがこれらに限定されない要因によって影響を受け得る。本明細書に記載されるように、ＰＥＧ脂質成分の純度もまた、ＬＮＰの特性及び性能にとって重要である。
５．方法
一実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１１１２７２５５号または同第ＷＯ２００８１０３２７６号に記載されている方法によって調製され得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１９１３１７７０号に記載されているとおりであり得る。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、米国特許出願第１５／８０９，６８０号に記載されているプロセスに従って製剤化される。いくつかの実施形態では、本発明は、輸送ビヒクルに環状ＲＮＡを封入するプロセスであって、予形成した（すなわち、ＲＮＡの非存在下で形成した）輸送ビヒクル内に脂質を形成するステップ、及び次に予形成した輸送ビヒクルをＲＮＡと組み合わせるステップを含む、プロセスを提供する。いくつかの実施形態では、新規の製剤化プロセスは、脂質ナノ粒子を予形成するステップを用いずに調製された（例えば、脂質をＲＮＡと直接組み合わせた）同じＲＮＡ製剤と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも、効力（ペプチドまたはタンパク質発現）が高く、かつ有効性（生物学的に関連するエンドポイントの改善）が高い、潜在的に忍容性がより良好なＲＮＡ製剤をもたらす。
ＲＮＡの特定のカチオン性脂質ナノ粒子製剤の場合、ＲＮＡの高い封入を達成するために、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液）中のＲＮＡを加熱する必要がある。これらのプロセスまたは方法では、製剤化後（ナノ粒子の形成後）に加熱しても脂質ナノ粒子へのＲＮＡの封入効率を増加させることがないため、製剤化プロセスの前に加熱を行う必要がある（すなわち、別々の成分を加熱する）。対照的に、本発明の新規プロセスのいくつかの実施形態では、ＲＮＡの加熱の順序は、ＲＮＡ封入パーセンテージに影響を与えないように思われる。いくつかの実施形態では、予形成脂質ナノ粒子を含む溶液、ＲＮＡを含む溶液、及び脂質ナノ粒子に封入されたＲＮＡを含む混合溶液のうちの１つ以上の加熱は、製剤化プロセスの前でも後でも行う必要がない（すなわち、周囲温度で維持される）。
ＲＮＡは、ＲＮＡが脂質ナノ粒子に封入され得るように、脂質溶液と混合されるべき溶液で提供され得る。好適なＲＮＡ溶液は、様々な濃度で封入されるＲＮＡを含有する任意の水溶液であり得る。例えば、好適なＲＮＡ溶液は、ＲＮＡを約０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．０６ｍｇ／ｍｌ、０．０７ｍｇ／ｍｌ、０．０８ｍｇ／ｍｌ、０．０９ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、または１．０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で含有し得る。いくつかの実施形態では、好適なＲＮＡ溶液は、ＲＮＡを約０．０１～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．７ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．６ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．４ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．３ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．２ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．７ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．６ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．４ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．３ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．２ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．１ｍｇ／ｍｌ、０．１～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．２～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．３～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．４～０．７ｍｇ／ｍｌ、または０．５～０．６ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で含有し得る。
典型的には、好適なＲＮＡ溶液はまた、緩衝剤及び／または塩を含有し得る。一般に、緩衝剤には、ＨＥＰＥＳ、トリス、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウムまたはリン酸ナトリウムが含まれ得る。いくつかの実施形態では、緩衝剤の好適な濃度は、約０．１ｍＭ～１００ｍＭ、０．５ｍＭ～９０ｍＭ、１．０ｍＭ～８０ｍＭ、２ｍＭ～７０ｍＭ、３ｍＭ～６０ｍＭ、４ｍＭ～５０ｍＭ、５ｍＭ～４０ｍＭ、６ｍＭ～３０ｍＭ、７ｍＭ～２０ｍＭ、８ｍＭ～１５ｍＭ、または９～１２ｍＭの範囲であり得る。
例示的な塩には、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、及び塩化カリウムが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ溶液における塩の好適な濃度は、約１ｍＭ～５００ｍＭ、５ｍＭ～４００ｍＭ、１０ｍＭ～３５０ｍＭ、１５ｍＭ～３００ｍＭ、２０ｍＭ～２５０ｍＭ、３０ｍＭ～２００ｍＭ、４０ｍＭ～１９０ｍＭ、５０ｍＭ～１８０ｍＭ、５０ｍＭ～１７０ｍＭ、５０ｍＭ～１６０ｍＭ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ、または５０ｍＭ～１００ｍＭの範囲であり得る。
いくつかの実施形態では、好適なＲＮＡ溶液は、ｐＨが約３．５～６．５、３．５～６．０、３．５～５．５、３．５～５．０、３．５～４．５、４．０～５．５、４．０～５．０、４．０～４．９、４．０～４．８、４．０～４．７、４．０～４．６、または４．０～４．５の範囲であり得る。
本発明に好適なＲＮＡ溶液を調製するために様々な方法が使用され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、本明細書に記載の緩衝溶液に直接溶解され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ溶液は、封入のための脂質溶液と混合する前に、ＲＮＡストック溶液を緩衝液と混合することによって生成され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ溶液は、封入のための脂質溶液と混合する直前に、ＲＮＡストック溶液を緩衝液と混合することによって生成され得る。
本発明によれば、脂質溶液は、ＲＮＡの封入のための輸送ビヒクルを形成するのに好適な脂質の混合物を含有する。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、エタノールベースである。例えば、好適な脂質溶液は、純粋なエタノール（すなわち、１００％エタノール）に溶解した所望の脂質の混合物を含有し得る。別の実施形態では、好適な脂質溶液は、イソプロピルアルコールベースである。別の実施形態では、好適な脂質溶液は、ジメチルスルホキシドベースである。別の実施形態では、好適な脂質溶液は、エタノール、イソプロピルアルコール及びジメチルスルホキシドを含むがこれらに限定されない好適な溶媒の混合物である。
好適な脂質溶液は、様々な濃度で所望の脂質の混合物を含有し得る。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、所望の脂質の混合物を約０．１～１００ｍｇ／ｍｌ、０．５～９０ｍｇ／ｍｌ、１．０～８０ｍｇ／ｍｌ、１．０～７０ｍｇ／ｍｌ、１．０～６０ｍｇ／ｍｌ、１．０～５０ｍｇ／ｍｌ、１．０～４０ｍｇ／ｍｌ、１．０～３０ｍｇ／ｍｌ、１．０～２０ｍｇ／ｍｌ、１．０～１５ｍｇ／ｍｌ、１．０～１０ｍｇ／ｍｌ、１．０～９ｍｇ／ｍｌ、１．０～８ｍｇ／ｍｌ、１．０～７ｍｇ／ｍｌ、１．０～６ｍｇ／ｍｌ、または１．０～５ｍｇ／ｍｌの範囲の総濃度で含有し得る。
６．標的指向性
本発明は、受動的及び能動的な両方の標的指向手段による標的細胞及び標的組織の差別的標的指向性も企図する。受動的標的指向性の現象は、標的細胞による輸送ビヒクルの認識を増強させるための追加の賦形剤または手段の使用に依存することなく、ｉｎ ｖｉｖｏでの輸送ビヒクルの自然な分布パターンを利用する。例えば、細網内皮系の細胞による食作用の対象となる輸送ビヒクルは、肝臓または脾臓に蓄積する可能性が高く、したがって、そのような標的細胞への組成物の送達を受動的に導く手段を提供し得る。
あるいは、本発明は、輸送ビヒクルに（共有結合または非共有結合のいずれかで）結合され得る標的指向性部分を使用して、特定の標的細胞または標的組織でのそのような輸送ビヒクルの局在化が促進されるようにすることを伴う、能動的標的指向性を企図する。例えば、標的指向性は、標的細胞または標的組織への分布が促進されるよう、輸送ビヒクルの中または上に１つ以上の内因性標的指向性部分を含めることによって媒介され得る，標的組織による標的指向性部分の認識は、標的細胞及び標的組織における輸送ビヒクル及び／またはその内容物の組織分布及び細胞内への取り込みを能動的に促進する（例えば、輸送ビヒクルの中または上にアポリポタンパク質－Ｅ標的指向性リガンドを含めることは、肝細胞によって発現される内因性低密度リポタンパク質受容体を輸送ビヒクルが認識し、それに結合することを促進する）。本明細書に提供するように、組成物は、標的細胞に対する組成物の親和性を増強させる能力のある部分を含むことができる。標的指向性部分は、製剤化中または製剤化後に脂質粒子の外側の二重層に連結され得る。これらの方法は、当該技術分野で周知である。さらに、一部の脂質粒子製剤では、融合性ポリマー、例えばＰＥＡＡ、血球凝集素、他のリポペプチド（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第０８／８３５，２８１号、及び同第６０／０８３，２９４号を参照されたい）、ならびにｉｎ ｖｉｖｏ及び／または細胞内の送達に有用である他の特徴を採用する場合がある。他のいくつかの実施形態では、本発明の組成物は、改善されたトランスフェクション効率を示す、及び／または目的の標的細胞もしくは組織に対する選択性の向上を示す。したがって、標的細胞または標的組織に対する組成物及びその核酸内容物の親和性を増強させる能力がある１つ以上の部分（例えば、ペプチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド、ビタミンまたは他の分子）を含む組成物が企図される。好適な部分は、任意選択で、輸送ビヒクルの表面に結合または連結され得る。いくつかの実施形態では、標的指向性部分は、輸送ビヒクルの表面に広がるか、または輸送ビヒクル内に封入され得る。好適な部分は、それらの物理的、化学的または生物学的な特性（例えば、選択的親和性及び／または標的細胞表面のマーカーもしくは特徴の認識）に基づいて選択される。細胞特異的標的部位及びその対応する標的指向性リガンドは、大きく異なり得る。好適な標的指向性部分は、標的細胞の固有の特徴を利用するように選択され、したがって、組成物が標的細胞と非標的細胞とを差別することを可能にする。例えば、本発明の組成物には、（例えば、受容体媒介性のそのような表面マーカーの認識及びそれへの結合によって）肝細胞の認識、またはそれに対する親和性を選択的に増強させる表面マーカー（例えば、アポリポタンパク質Ｂまたはアポリポタンパク質Ｅ）が含まれ得る。例として、標的指向性部分としてのガラクトースの使用では、本発明の組成物を肝実質細胞に指向させることが予測され、また別法では、標的指向性リガンドとしての糖残基を含有するマンノース（例えば、肝細胞に存在するアシアロ糖タンパク質受容体に選択的に結合し得る糖残基を含有するマンノース）の使用では、本発明の組成物を肝臓内皮細胞に指向させることが予測される。（Ｈｉｌｌｅｒｙ Ａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．“Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ”（２００２）Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい）。したがって、輸送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する部分にコンジュゲートされてあるような標的指向性部分の提示により、標的細胞及び標的組織における本発明の組成物の認識及び取り込みが促進される。好適な標的指向性部分の例には、１つ以上のペプチド、タンパク質、アプタマー、ビタミン及びオリゴヌクレオチドが含まれる。
特定の実施形態では、輸送ビヒクルは、標的指向性部分を含む。いくつかの実施形態では、標的指向性部分は、受容体媒介性エンドサイトーシスを選択的に特定の細胞集団に媒介する。いくつかの実施形態では、標的指向性部分は、Ｔ細胞抗原への結合能がある。いくつかの実施形態では、標的指向性部分は、ＮＫ、ＮＫＴ、またはマクロファージ抗原への結合能がある。いくつかの実施形態では、標的指向性部分は、群ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＰＤ－１、４－１ＢＢ、及びＣＤ２から選択されるタンパク質への結合能がある。いくつかの実施形態では、標的指向性部分は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、ナノボディ、ペプチド、ペプチドベースのマクロ環、ミニボディ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、標的指向性部位は、Ｔ細胞受容体モチーフ抗体、Ｔ細胞α鎖抗体、Ｔ細胞β鎖抗体、Ｔ細胞γ鎖抗体、Ｔ細胞δ鎖抗体、ＣＣＲ７抗体、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ５抗体、ＣＤ７抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ２０抗体、ＣＤ２１抗体、ＣＤ２２抗体、ＣＤ２５抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ３５抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ４５ＲＯ抗体、ＣＤ５２抗体、ＣＤ５６抗体、ＣＤ６２Ｌ抗体、ＣＤ６８抗体、ＣＤ８０抗体、ＣＤ９５抗体、ＣＤ１１７抗体、ＣＤ１２７抗体、ＣＤ１３３抗体、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）抗体、ＣＤ１６３抗体、Ｆ４／８０抗体、ＩＬ－４Ｒα抗体、Ｓｃａ－１抗体、ＣＴＬＡ－４抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＧＡＲＰ抗体、ＬＡＰ抗体、グランザイムＢ抗体、ＬＦＡ－１抗体、トランスフェリン受容体抗体、及びそれらのフラグメントから選択される。いくつかの実施形態では、標的指向性部分は、リンパ球上のエクト酵素の小分子結合体である。エクト酵素の小分子結合体には、Ａ２Ａ阻害剤ＣＤ７３阻害剤、ＣＤ３９またはアデシン受容体Ａ２ａＲ及びＡ２ｂＲが含まれる。潜在的な小分子には、ＡＢ９２８が含まれる。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、Ｓｈｏｂａｋｉ Ｎ，Ｓａｔｏ Ｙ，Ｈａｒａｓｈｉｍａ Ｈ．Ｍｉｘｉｎｇ ｌｉｐｉｄｓ ｔｏ ｍａｎｉｐｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｉｓｓｕｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１８；１３：８３９５－８４１０．（２０１８年１２月１０日に公開）に記載されるように、製剤化及び／または指向される。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、３種の脂質で構成される。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、４種の脂質で構成される。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、５種の脂質で構成される。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、６種の脂質で構成される。
７．標的細胞
核酸を免疫細胞に送達することが所望される場合、免疫細胞が、標的細胞を表す。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、標的細胞を差別的にトランスフェクションする（すなわち、非標的細胞をトランスフェクトしない）。本発明の組成物はまた、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及び樹状細胞が含まれるが、これらに限定されない多様な標的細胞を選択的に標的とするように調製され得る。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、目的のタンパク質または酵素が欠損している。例えば、核酸を肝細胞に送達することが所望される場合、肝細胞が標的細胞を表す。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、標的細胞を差別的にトランスフェクトする（すなわち、非標的細胞をトランスフェクトしない）。本発明の組成物はまた、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞（例えば、髄膜、星状膠細胞、運動ニューロン、後根神経節細胞及び前角運動ニューロン）、光受容体細胞（例えば、杆体及び錐体）、網膜色素上皮細胞、分泌細胞、心細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑膜ライニング細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、及び腫瘍細胞を含むが、これに限定されない様々な標的細胞を選択的に標的とするように調製され得る。
本発明の組成物は、心臓、肺、腎臓、肝臓、及び脾臓等の標的細胞に選択的に分布するように調製され得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、肝臓または脾臓の細胞に分布して、肝臓の細胞（例えば、肝細胞）または脾臓の細胞（例えば、免疫細胞）による、組成物に含まれるｃｉｒｃＲＮＡの送達及びその後の発現を促進する。標的とされた細胞は、機能性のタンパク質または酵素を産生して、全身的に排泄する能力がある生物学的「リザーバー」または「デポー」として機能し得る。したがって、本発明の一実施形態では、輸送ビヒクルは、肝細胞または免疫細胞を標的とすること、及び／または送達時に肝臓または脾臓の細胞に選択的に分布することが可能である。ある実施形態では、標的肝細胞または免疫細胞のトランスフェクションに続いて、ビヒクルに搭載されたｃｉｒｃＲＮＡが翻訳され、機能性タンパク質産物が産生、排泄され、全身に分布される。他の実施形態では、肝細胞以外の細胞（例えば、肺、脾臓、心臓、眼球、または中枢神経系の細胞）は、タンパク質産生のためのデポー場所として機能することができる。
一実施形態では、本発明の組成物は、１つ以上の機能性のタンパク質及び／または酵素の、対象の内因性産生を促進する。本発明のある実施形態では、輸送ビヒクルは、欠損のタンパク質または酵素をコードするｃｉｒｃＲＮＡを含む。そのような組成物の標的組織への分布、及び続くそのような標的細胞のトランスフェクションの際、輸送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）に搭載された外因性ｃｉｒｃＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで翻訳されて、外因的に投与されたｃｉｒｃＲＮＡによってコードされる機能性のタンパク質または酵素（例えば、対象が欠損しているタンパク質または酵素）を産生し得る。したがって、本発明の組成物は、対象が、外因的にまたは組換えにより調製されたｃｉｒｃＲＮＡを翻訳して内因的に翻訳されたタンパク質または酵素を産生し、それによって機能性のタンパク質または酵素を産生する（及び該当する場合は排泄する）能力を利用する。発現または翻訳されたタンパク質または酵素はまた、組換えにより調製されたタンパク質または酵素には存在しないことが多い天然の翻訳後修飾をｉｎ ｖｉｖｏで含み、それにより、翻訳されたタンパク質または酵素の免疫原性がさらに低下することも特徴とし得る。
欠損のタンパク質または酵素をコードするｃｉｒｃＲＮＡの投与により、標的細胞内の特定の細胞小器官に核酸を送達する必要性が回避される。むしろ、標的細胞のトランスフェクション及び標的細胞の細胞質への核酸の送達の際に、輸送ビヒクルのｃｉｒｃＲＮＡ内容物が翻訳され、機能性のタンパク質または酵素が発現され得る。
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、１つ以上の非標的細胞または非標的細胞型（例えば、クッパー細胞または肝細胞）に存在し、かつ、１つ以上の標的細胞または標的細胞型（例えば、肝細胞またはＴ細胞）には存在しないｍｉＲＮＡによって認識される１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、１つ以上の非標的細胞または非標的細胞型（例えば、クッパー細胞または肝細胞）において、１つ以上の標的細胞または標的細胞型（例えば、肝細胞またはＴ細胞）と比較して高い濃度で存在するｍｉＲＮＡによって認識される１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含む。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ分子内の相補配列と対形成することによって機能し、遺伝子サイレンシングを引き起こすと考えられている。
８．医薬組成物
特定の実施形態では、本明細書において、本明細書で提供される治療剤を含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。いくつかの実施形態では、治療剤は、本明細書で提供される環状ＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、治療剤は、本明細書に提供するベクターである。いくつかの実施形態では、治療剤は、本明細書で提供される環状ＲＮＡまたはベクターを含む細胞（例えば、ヒトＴ細胞等のヒト細胞）である。特定の実施形態では、組成物はさらに、薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する組成物は、本明細書で提供される治療剤を、他の医薬的に活性な作用物質または薬物、例えば、Ｂ細胞抗原を標的とすることができる抗炎症薬物または抗体、例えば、抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブと組み合わせて含む。
医薬組成物に関して、薬学的に許容される担体は、慣習的に使用されるもののいずれでもあり得、限定されるのは、化学物理的考慮事項、例えば、溶解度、及び活性薬剤（複数可）との反応性の欠如等、ならびに投与経路によってのみである。本明細書に記載の薬学的に許容される担体、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、及び希釈剤は、当業者に周知であり、一般に容易に入手可能である。薬学的に許容される担体は、治療剤（複数可）に対して化学的に不活性なもの、及び使用条件下で有害な副作用または毒性を有しないものであることが好ましい。
担体の選択は、特定の治療剤、ならびに治療剤を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定されるだろう。したがって、本明細書に提供する医薬組成物の様々な好適な製剤が存在する。
特定の実施形態では、医薬組成物は、防腐剤を含む。特定の実施形態では、好適な防腐剤は、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、及び塩化ベンザルコニウムを含み得る。任意選択で、２つ以上の防腐剤の混合物を使用し得る。防腐剤またはその混合物は、典型的には、総組成物の約０．０００１重量％～約２重量％の量で存在する。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、好適な緩衝剤には、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、ならびに様々な他の酸及び塩が含まれ得る。２つ以上の緩衝剤の混合物を、任意選択で使用してよい緩衝剤またはその混合物は、典型的には、総組成物の約０．００１重量％～約４重量％の量で存在する。
いくつかの実施形態では、薬学的いくつかの実施形態では、医薬組成物中の治療剤の濃度は、例えば、約１重量％未満、または少なくとも約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、もしくは約５０重量％以上と様々であり得、また、選択された特定の投与様式に従って、流体容量、及び粘度によって主に選択することができる。
経口、エアロゾル、非経口（例えば、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び髄腔内）、及び局所投与のための以下の製剤は、単なる例示であり、決して限定するものではない。本明細書で提供される治療剤を投与するために２つ以上の経路を使用することができ、特定の場合には、ある特定の経路が別の経路よりも迅速及びより有効な応答を提供することができる。
経口投与に好適な製剤は、（ａ）液体溶液、例えば水、生理食塩水またはオレンジジュース等の希釈剤中に溶解させた有効量の治療剤；（ｂ）各々が所定量の活性成分を固体または顆粒として含有する、カプセル、サシェ、錠剤、舐剤及びトローチ；（ｃ）粉末；（ｄ）適切な液体中の懸濁液；ならびに（ｅ）好適なエマルジョン、を含むかまたはこれからなることができる。液体製剤には、希釈剤、例えば水及びアルコール、例えば、エタノール、ベンジルアルコール及びポリエチレンアルコールが含まれ得、薬学的に許容される界面活性剤の添加を伴う場合も伴わない場合もある。カプセル形態は、例えば、界面活性剤、滑剤、ならびに不活性充填剤、例えばラクトース、スクロース、リン酸カルシウム及びコーンスターチを含有する通常のハードシェルまたはソフトシェルのゼラチンタイプのものであり得る。錠剤形態には、ラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、防腐剤、香味料、ならびに他の薬理学的に適合する賦形剤のうち、１つ以上を含むことができる。舐剤形態は、香味料、通常はスクロース、アカシアまたはトラガカントと共に治療剤を含むことができる。香錠は、当該技術分野で知られているような賦形剤に加え、不活性基材、例えば、ゲラチン及びグリセリン、またはスクロース及びアカシア、エマルジョン、ゲル等を有する治療剤を含むことができる。
非経口投与に好適な製剤には、水性及び非水性の等張無菌注射液であって、製剤を、意図されたレシピエントの血液と等張にする、抗酸化剤、緩衝剤、制菌剤、及び溶質を含有することができるもの、ならびに水性及び非水性の滅菌懸濁液であって、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び防腐剤が含まれ得るもの、が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される治療剤は、無菌の液体または液体混合物等の医薬担体に入れた生理学的に許容される希釈剤にて投与することができ、そのような医薬担体には、水、生理食塩水、デキストロース水溶液及び関連糖溶液、アルコール、例えばエタノールもしくはヘキサデシルアルコール等、グリコール、例えばプロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、グリセロール等、ケタール、例えば２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－メタノール、エーテル、ポリ（エチレングリコール）４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステルもしくはグリセリド等、またはアセチル化脂肪酸グリセリドが含まれ、これに、薬学的に許容される、界面活性剤、例えば石鹸剤もしくは洗剤等、懸濁剤、例えばペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、もしくはカルボキシメチルセルロース等、または乳化剤及び他の医薬アジュバントの添加を、伴っても伴わなくてもよい。
いくつかの実施形態で非経口製剤に使用することができる油には、石油、動物油、植物油、または合成油が含まれる。油の具体例としては、ピーナッツ、大豆、ゴマ、綿実、トウモロコシ、オリーブ、ワセリン、及び鉱油が挙げられる。非経口製剤での使用に好適な脂肪酸には、オレイン酸、ステアリン酸、及びイソステアリン酸が含まれる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルは、好適な脂肪酸エステルの例である。
非経口製剤の特定の実施形態での使用に好適な石鹸には、脂肪アルカリ金属、アンモニウム、及びトリエタノールアミン塩が含まれ、好適な洗剤には、（ａ）カチオン性洗剤、例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライド、及びアルキルピリジニウムハライド、（ｂ）アニオン性洗剤、例えば、アルキル、アリール、及びオレフィンスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル、及びモノグリセリド硫酸塩、ならびにスルホサクシナート、（ｃ）非イオン性洗剤、例えば、脂肪族アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、及びポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー、（ｄ）両性洗剤、例えば、アルキル－β－アミノプロピオネート、及び２－アルキル－イミダゾリン第４級アンモニウム塩、ならびに（ｅ）その混合物が含まれる。
いくつかの実施形態では、非経口製剤は、例えば、約０．５重量％～約２５重量％の治療剤を溶液中に含有する。防腐剤及び緩衝液が使用され得る。注射部位での刺激を最小限に抑えるまたは排除するために、そのような組成物は、例えば、親水性－脂溶性バランス（ＨＬＢ）が約１２～約１７である１つ以上の非イオン性界面活性剤を含有し得る。そのような製剤中の界面活性剤の量は、典型的には、例えば、約５重量％～約１５重量％の範囲である。好適な界面活性剤には、ポリエチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステル、例えばソルビタンモノオレアート、及びプロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合によって形成される、疎水性塩基とのエチレンオキシドの高分子量付加物が含まれる。非経口製剤は、アンプル及びバイアル等の単位用量または複数用量の密封容器で提供することができ、注射のために、使用直前に、滅菌液体賦形剤、例えば水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管することができる。用時注射溶液及び懸濁液は、前述の種類の無菌散剤、顆粒剤、及び錠剤から調製することができる。
特定の実施形態では、注射用製剤が本明細書で提供される。注射用組成物のための有効な医薬担体の要件は、当業者に周知である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ ２３８－２５０（１９８２）、及びＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ ｅｄ，ｐａｇｅｓ ６２２－６３０（１９８６）を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、局所製剤を本明細書に提供する。経皮薬物放出に有用なものを含む局所製剤は、皮膚への適用のために本明細書に提供する特定の実施形態との関連において好適である。いくつかの実施形態では、治療剤は、単独で、または他の好適な成分と組み合わせて、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤にすることができる。これらのエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容可能な推進剤に入れることができる。それらはまた、ネブライザーまたはアトマイザー等の非加圧調製物用の医薬品として製剤化され得る。そのような噴霧製剤も、粘膜を噴霧するために使用され得る。
特定の実施形態では、本明細書で提供される治療剤は、包接複合体、例えばシクロデキストリン包接複合体、またはリポソームとして製剤化することができる。リポソームは、治療剤を特定の組織に指向させるのに役立ち得る。リポソームは、治療剤の半減期を延長するために使用することもできる。例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９，４６７（１９８０）ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、及び同第５，０１９，３６９号に記載のように、リポソームを調製するために多くの方法が利用可能である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される治療剤は、組成物の送達が、処置される部位の感作のより前に、それを引き起こすのに十分な時間で起こるように、時間放出、遅延放出、または持続放出送達システムで製剤化される。そのようなシステムは、治療剤の反復投与を回避することができ、それにより、対象及び医師にとっての利便性が増加し、本明細書に提供する特定の組成物の実施形態に特に好適であり得る。一実施形態では、本発明の組成物は、中に含有されるｃｉｒｃＲＮＡの徐放に好適であるように製剤化される。そのような徐放性組成物は、延長された投与間隔で対象に好都合に投与され得る。例えば、一実施形態では、本発明の組成物は、対象に、１日２回、連日または隔日で投与される。ある実施形態では、本発明の組成物は、対象に、週２回、週１回、１０日毎、２週毎、３週毎、４週毎、月１回、６週毎、８週毎、３ヶ月毎、４ヶ月毎、６ヶ月毎、８ヶ月毎、９ヶ月毎、または１年毎に投与される。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、長期間にわたって標的細胞によって産生される。例えば、タンパク質は、投与後１時間超、４時間超、６時間超、１２時間超、２４時間超、４８時間超、または７２時間超の間、産生され得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、投与から約６時間後にピークレベルで発現される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの発現は、少なくとも治療レベルで持続される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも治療レベルで、投与後１時間超、４時間超、６時間超、１２時間超、２４時間超、４８時間超、または７２時間超の間、発現される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、患者の血清または組織（例えば、肝臓または肺）において治療レベルで検出可能である。いくつかの実施形態では、検出可能なポリペプチドのレベルは、投与後１時間超、４時間超、６時間超、１２時間超、２４時間超、４８時間超、または７２時間超の時間にわたるｃｉｒｃＲＮＡ組成物からの継続的な発現からである。
特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、正常な生理学的レベルを超えるレベルで産生される。タンパク質のレベルは、対照と比較して増加している場合がある。いくつかの実施形態では、対照は、正常な個体または正常な個体の集団におけるポリペプチドのベースラインの生理学的レベルである。他の実施形態では、対照は、関連するタンパク質もしくはポリペプチドに欠損を有する個体または関連するタンパク質もしくはポリペプチドに欠損を有する個体の集団におけるポリペプチドのベースラインの生理学的レベルである。いくつかの実施形態では、対照は、組成物が投与される個体における関連するタンパク質またはポリペプチドの正常レベルであり得る。他の実施形態では、対照は、１つ以上の比較可能な時点での、他の治療的介入時、例えば、対応するポリペプチドの直接注射時のポリペプチドの発現レベルである。
特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質のレベルは、投与後３日、４日、５日、または１週間以上で検出可能である。血清及び／または組織（例えば、肝臓または肺）において分泌タンパク質のレベルの増加が観察され得る。
いくつかの実施形態では、本方法は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の持続的な循環半減期をもたらす例えば、タンパク質は、タンパク質またはタンパク質をコードするｍＲＮＡの皮下注射を介して観察される半減期よりも長い時間または日数にわたって検出され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質の半減期は、１日、２日、３日、４日、５日、または１週間以上である。
多くのタイプの放出送達システムが利用可能であり、当業者に公知である。それらは、ポリマーをベースとしたシステム、例えばポリ（ラクチド－グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、及びポリ無水物を含む。薬物を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルが、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。送達システムはまた、コレステロール、コレステロールエステル及び脂肪酸等のステロールまたはモノ－ジ－及びトリ－グリセリド等の中性脂肪を含む脂質；ヒドロゲル放出システム；シラスティックシステム；ペプチドをベースとしたシステム；ワックス被覆剤；従来の結合剤及び賦形剤を使用する圧縮錠剤；部分的に融合した移植片；等を含む非ポリマーシステムを含む。具体例としては、（ａ）米国特許第４，４５２，７７５号、同第４，６６７，０１４号、同第４，７４８，０３４号、及び同第５，２３９，６６０号に記載のような、活性組成物がマトリックス内の形態で含有される浸食システム、ならびに（ｂ）米国特許第３，８３２，２５３号及び同第３，８５４，４８０号に記載のような、活性成分が制御された速度でポリマーから浸透する拡散システムが挙げられるが、これに限定されない。さらに、ポンプをベースとしたハードウェア送達システムを使用することができ、そのうちいくつかは、移植に適合している。
いくつかの実施形態では、治療剤は、標的指向性部分に連結部分を介して直接または間接的にコンジュゲートすることができる。治療剤を標的指向性部分にコンジュゲートするための方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｗａｄｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ，Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ３：１１１（１９９５）及び米国特許第５，０８７，６１６号を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される治療剤は、デポー形態に製剤化され、治療剤が投与される体内にそれが放出される様式が、時間及び体内の部位に関して制御されるようになっている（例えば、米国特許第４，４５０，１５０号を参照されたい）。治療剤のデポー形態は、例えば、治療剤及びポリマー等の多孔質または非多孔質物質を含む埋込み型組成物であることができ、治療剤は物質によって封入される、もしくは物質全体に拡散される、及び／または非多孔質物質の分解である。デポーは次に体内の所望の部位に埋め込まれ、治療剤は、埋込み物から所定の速度で放出される。
９．治療方法
特定の態様では、本明細書において、状態、例えば、がんを処置及び／または予防する方法を提供する。
特定の実施形態では、本明細書で提供される治療剤は、１つ以上の追加の治療剤と共に（例えば、同じ医薬組成物にて、または別個の医薬組成物にて）同時投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される治療剤を最初に投与することができ、１つ以上の追加の治療剤を次に投与することができ、またはその逆も可能である。あるいは、本明細書で提供される治療剤及び１つ以上の追加の治療剤を同時に投与することができる。
いくつかの実施形態では、対象は、哺乳類である。いくつかの実施形態では、本明細書で言及される哺乳類は、げっ歯目の哺乳類、例えばマウス及びハムスター、またはウサギ目の哺乳類、例えばウサギを含むがこれに限定されない任意の哺乳類であり得る。哺乳類は、ネコ科（ネコ）及びイヌ科（イヌ）を含む食肉目からであり得る。哺乳類は、ウシ科（ウシ）及びイノシシ科（ブタ）を含む偶蹄目、またはウマ科（ウマ）を含む奇蹄目からであり得る。哺乳類は、霊長目、セボイド目、もしくはシモイド目（サル）、または類人猿目（ヒト及び類人猿）であり得る。好ましくは、哺乳類は、ヒトである。
１０．配列
（表１７）
Figure 2023525270000425
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いくつかの実施形態では、本発明のＩＲＥＳは、表１７に列挙される配列（配列番号１～７２及び３４８～３８９）を有するＩＲＥＳを有する。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、サリウイルスＩＲＥＳである。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、サリウイルスＳＺ１ ＩＲＥＳである。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、ＡＰ１．０（配列番号３４８）である。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、ＣＫ１．０（配列番号３４９）である。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、ＰＶ１．０（配列番号３５０）である。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、ＳＶ１．０（配列番号３５１）である。
（表１８）
Figure 2023525270000511
Figure 2023525270000512
Figure 2023525270000513
いくつかの実施形態では、５’イントロンフラグメントは、表１８に列挙される配列を有するフラグメントである。典型的には、表１８に列挙された５’イントロンフラグメントを含有するコンストラクトは、表１９に列挙されるような対応する３’イントロンフラグメントを含有する（例えば、両方ともＬ９ａ－８順列置換部位を有するフラグメントを表す）。
（表１９）
Figure 2023525270000514
Figure 2023525270000515
Figure 2023525270000516
Figure 2023525270000517
いくつかの実施形態では、３’イントロンフラグメントは、表１９に列挙される配列を有するフラグメントである。いくつかの実施形態では、表１９に列挙された３’イントロンフラグメントを含有するコンストラクトは、表１８に列挙されるような対応する５’イントロンフラグメントを含有する（例えば、両方ともＬ９ａ－８順列置換部位を伴うフラグメントを表す）。
（表２０）
Figure 2023525270000518
いくつかの実施形態では、５’イントロンフラグメントは、表２０に列挙される配列を有するフラグメントである。表２０に列挙された５’イントロンフラグメントを含有するコンストラクトは、表２１における対応する３’イントロンフラグメントを含有する（例えば、両方ともＡｚｏｐ１イントロンを有するフラグメントを表す）。
（表２１）
Figure 2023525270000519
Figure 2023525270000520
いくつかの実施形態では、３’イントロンフラグメントは、表２１に列挙される配列を有するフラグメントである。表２１に列挙された３’イントロンフラグメントを含有するコンストラクトは、表２０に列挙されるような対応する５’イントロンフラグメントを含有する（例えば、両方ともＡｚｏｐ１イントロンを有するフラグメントを表す）。
（表２２）
Figure 2023525270000521
Figure 2023525270000522
Figure 2023525270000523
Figure 2023525270000524
Figure 2023525270000525
いくつかの実施形態では、スペーサー及び５’イントロンフラグメントは、表２２に列挙される配列を有するスペーサー及びフラグメントである。
（表２３）
Figure 2023525270000526
Figure 2023525270000527
Figure 2023525270000528
Figure 2023525270000529
Figure 2023525270000530
Figure 2023525270000531
Figure 2023525270000532
いくつかの実施形態では、スペーサー及び３’イントロンフラグメントは、表２３に列挙される配列を有するスペーサー及びフラグメントである。
（表２４）
Figure 2023525270000533
Figure 2023525270000534
Figure 2023525270000535
Figure 2023525270000536
Figure 2023525270000537
Figure 2023525270000538
Figure 2023525270000539
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、表２４に列挙されるヌクレオチド配列によってコードされる。
（表２５）
Figure 2023525270000540
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるＣＡＲドメインは、表２５に列挙される配列を有する。
（表２６）
Figure 2023525270000541
Figure 2023525270000542
Figure 2023525270000543
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる発現配列を区切る切断部位は、表２６に列挙される配列を有する。
（表２７）
Figure 2023525270000544
Figure 2023525270000545
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるサイトカインは、表２７に列挙される配列を有する。
（表２８）
Figure 2023525270000546
Figure 2023525270000547
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる転写因子は、表２８に列挙される配列を有する。
（表２９）
Figure 2023525270000548
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する環状ＲＮＡまたは前駆体ＲＮＡ（例えば、直鎖状前駆体ＲＮＡ）は、表２９に列挙される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、本明細書に開示する１つ以上の配列との類似性が少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％である配列を含有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、本明細書に開示する１つ以上の配列と同一の配列を含有する。
好ましい実施形態を本明細書に記載する。これらの好ましい実施形態の変形は、前述の説明を読めば、当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がそのような変形を適切に用いることを期待し、また本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されるものとは別様に実践されることを意図している。したがって、本発明には、準拠法によって容認されているように、本明細書に添付の特許請求の範囲に記述される主題の全ての変更及び均等物が含まれる。さらに、その可能なあらゆる変形における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書に別様に示されない限りまたは別様に文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
Ｗｅｓｓｅｌｈｏｅｆｔ ｅｔ ａｌ．（２０１９） ＲＮＡ Ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｓ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｃａｎ Ｅｘｔｅｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｉｎ Ｖｉｖｏ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ．７４（３），５０８－５２０ ａｎｄ Ｗｅｓｓｅｌｈｏｅｆｔ ｅｔ ａｌ．（２０１８） Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｒ ＲＮＡ ｆｏｒ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｔａｂｌｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．９，２６２９は、参照によりその全体が組み込まれる。
本発明は、以下の実施例を参照することによってさらに詳細に説明されるが、以下の実施例に限定されることを意図するものではない。これらの実施例は、主題の発明の作成方法及び使用方法を当業者に完全な開示及び説明を提供することを目的として例示のありとあらゆる変形を包含し、本発明と見なすものの範囲を限定することを意図しない。
実施例１
実施例１Ａ：外部相同性領域は、順列置換イントロンエクソン（ＰＩＥ）環状化戦略を使用して長い前駆体ＲＮＡの環状化を可能にする。
全長脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳを含有する１，１００ｎｔ配列、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）発現配列、及び順列置換イントロン－エクソン（ＰＩＥ）コンストラクトの二つの短いエクソンフラグメントを、Ｔ４ファージのチミジル酸シンターゼ（Ｔｄ）遺伝子の順列置換グループＩ触媒イントロンの３’と５’のイントロン間に挿入した前駆体ＲＮＡは、ランオフ転写によって合成した環状化を、前駆体ＲＮＡを、マグネシウムイオン及びＧＴＰの存在下で加熱することにより試みたが、スプライシング産物は得られなかった。
完全に相補的な９ヌクレオチド長及び１９ヌクレオチド長の相同性領域を設計し、前駆体ＲＮＡの５’末端及び３’末端に追加したこれらのホモロジーアームの追加により、前駆体ＲＮＡバンドの消失によって評価されるように、スプライシング効率が、９ヌクレオチド相同性領域で０から１６％に、１９ヌクレオチド相同性領域で４８％に増加した。
スプライシング産物を、ＲＮａｓｅ Ｒで処理した。ＲＮａｓｅ Ｒで処理したスプライシング反応物の推定スプライスジャンクションにわたって配列決定すると、ライゲーションされたエクソンが明らかになり、ＲＮａｓｅ Ｒで処理したスプライシング反応物を、オリゴヌクレオチドを標的としたＲＮａｓｅ Ｈで消化すると、ＲＮａｓｅ Ｈで消化された直鎖状前駆体によって得られた２つのバンドとは対照的に、単一のバンドが産生された。これは、環状ＲＮＡが、９または１９のヌクレオチド長の外部相同性領域を含有する前駆体ＲＮＡのスプライシング反応物の主要な産物であることを示す。
実施例１Ｂ：ＩＲＥＳ及びＰＩＥスプライス部位の二次構造を保存するスペーサーは、環状化効率を増加させる。
一連のスペーサーを設計し、３’ＰＩＥスプライス部位とＩＲＥＳとの間に挿入した。これらのスペーサーは、ＩＲＥＳ、３’ＰＩＥスプライス部位、及び／または５’スプライス部位のイントロン配列内の二次構造を保存するかまたは破壊するように設計した。
二次構造を保存するように設計されたスペーサー配列の追加は、８７％のスプライシング効率をもたらしたが、破壊的なスペーサー配列の追加は、検出可能なスプライシングをもたらさなかった。
実施例２
実施例２Ａ：外部相同性領域に加え、内部相同性領域は、スプライシングバブルを作製し、いくつかの発現配列の翻訳を可能にする。
スペーサーは、構造不定の、イントロン及びＩＲＥＳ配列に非相同であり、スペーサー－スペーサー相同性領域を含有するように設計した。これらを、外部相同性領域、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、及びガウシアルシフェラーゼ（全長：１２８９ｎｔ）、ホタルルシフェラーゼ（２３８４ｎｔ）、ｅＧＦＰ（１４５１ｎｔ）、ヒトエリスロポエチン（１３１３ｎｔ）、及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（４９３４ｎｔ）の発現配列を含有するコンストラクトの５’エクソンとＩＲＥＳとの間ならびに３’エクソンと発現配列との間に挿入した。５つのコンストラクト全ての環状化を達成した。Ｔ４ファージ及びアナベナイントロンを利用したコンストラクトの環状化は、ほぼ同等であった。環状化効率は、配列が短いほど高かった。翻訳を測定するために、各コンストラクトを、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。ガウシア及びホタルルシフェラーゼをトランスフェクトした細胞は、発光によって測定されるように強い応答を示し、ヒトエリスロポエチンは、エリスロポエチンｃｉｒｃＲＮＡをトランスフェクトした細胞の培養培地で検出可能であり、ＥＧＦＰ蛍光は、ＥＧＦＰ ｃｉｒｃＲＮＡをトランスフェクトした細胞から観察された。Ｃａｓ９ ｃｉｒｃＲＮＡとＧＦＰに対するｓｇＲＮＡの、ＧＦＰを構成的に発現する細胞への同時トランスフェクションにより、ｓｇＲＮＡのみの対照と比較して、細胞の最大９７％で蛍光が消失した。
実施例２Ｂ：ＣＶＢ３ ＩＲＥＳの使用は、タンパク質産生を増加させる。
内部及び外部の相同性領域、ならびにガウシアルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼの発現配列のいずれかを含有する異なるＩＲＥＳを有するコンストラクトを作成した。タンパク質産生は、トランスフェクションから２４時間後のＨＥＫ２９３細胞の上清における発光によって測定した。コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）ＩＲＥＳコンストラクトは、両方の場合において最も多くのタンパク質を産生した。
実施例２Ｃ：ポリＡまたはポリＡＣスペーサーの使用は、タンパク質産生を増加させる。
３０ヌクレオチド長のポリＡまたはポリＡＣのスペーサーを、実施例２Ｂでタンパク質を産生した各ＩＲＥＳを有するコンストラクトのＩＲＥＳとスプライスジャンクションとの間に追加した。ガウシアルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションから２４時間後のＨＥＫ２９３細胞の上清における発光によって測定した。両方のスペーサーは、スペーサーのない対照コンストラクトよりも、全てのコンストラクトで発現を改善した。
実施例３
環状ＲＮＡをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３またはＨｅＬａ細胞は、同等の未修飾または修飾直鎖ＲＮＡをトランスフェクトされた細胞よりも多くのタンパク質を産生する。
ＨＰＬＣで精製したガウシアルシフェラーゼをコードするｃｉｒｃＲＮＡ（ＣＶＢ３－ＧＬｕｃ－ｐＡＣ）を、標準的な未修飾５’メチルグアノシンキャップ及び３’ポリＡテール直鎖状ＧＬｕｃ ｍＲＮＡ、ならびに市販のヌクレオシド修飾（シュードウリジン、５－メチルシトシン）直鎖状ＧＬｕｃ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ製）と比較した。トランスフェクション２４時間後に発光を測定し、ｃｉｒｃＲＮＡが、ＨＥＫ２９３細胞において未修飾直鎖ｍＲＮＡより８１１．２％多いタンパク質を産生し、修飾ｍＲＮＡより５４．５％多いタンパク質を産生したことが明らかになった。同様の結果が、ＨｅＬａ細胞、及びヒトエリスロポエチンをコードする最適化されたｃｉｒｃＲＮＡと５－メトキシウリジンで修飾された直鎖ｍＲＮＡとの比較において得られた。
発光データは、６日間にわたって収集した。ＨＥＫ２９３細胞では、ｃｉｒｃＲＮＡトランスフェクションは８０時間のタンパク質産生半減期をもたらし、それに対し、未修飾直鎖ｍＲＮＡは４３時間、及び修飾直鎖ｍＲＮＡは４５時間であった。ＨｅＬａ細胞では、ｃｉｒｃＲＮＡトランスフェクションは１１６時間のタンパク質産生半減期をもたらし、それに対し、未修飾直鎖ｍＲＮＡは４４時間、及び修飾直鎖ｍＲＮＡは４９時間であった。ＣｉｒｃＲＮＡは、両方の細胞型においてその寿命にわたって、未修飾及び修飾直鎖ｍＲＮＡの両方よりも実質的に多くのタンパク質を産生した。
実施例４
実施例４Ａ：ＲＮａｓｅ消化、ＨＰＬＣ精製、及びホスファターゼ処理によるｃｉｒｃＲＮＡの精製は、免疫原性を低減する。完全に精製された環状ＲＮＡは、未精製または部分的に精製された環状ＲＮＡよりも免疫原性が大幅に低い。タンパク質発現安定性及び細胞生存率は、細胞型及び環状ＲＮＡ純度に依存する。
ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）及びヒト肺がんＡ５４９細胞に、
・未精製ＧＬｕｃ環状ＲＮＡスプライシング反応の産物、
・スプライシング反応物のＲＮａｓｅ Ｒ消化の産物、
・スプライシング反応物のＲＮａｓｅ Ｒ消化及びＨＰＬＣ精製の産物、または
・スプライシング反応物のＲＮａｓｅ消化、ＨＰＬＣ精製、及びホスファターゼ処理の産物をトランスフェクトした。
スプライシング反応物のＲＮａｓｅ Ｒ消化は、トランスフェクトされていない対照と比較して、Ａ５４９細胞においてサイトカイン放出を防ぐには不十分であった。
ＨＰＬＣ精製の追加はまた、サイトカイン放出を防ぐには不十分であったが、未精製スプライシング反応物と比較して、インターロイキン－６（ＩＬ－６）が大幅に低下し、インターフェロン－α１（ＩＦＮ－α１）が大幅に増加した。
ＨＰＬＣ精製後及びＲＮａｓｅ Ｒ消化前にホスファターゼ処理を追加すると、Ａ５４９細胞において評価された全ての上方制御されたサイトカインの発現が劇的に低下した。分泌された単球化学誘引物質タンパク質１（ＭＣＰ１）、ＩＬ－６、ＩＦＮ－α１、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、及びＩＦＮγ誘導性タンパク質－１０（ＩＰ－１０）は、検出不可能またはトランスフェクトされていないベースラインレベルまで低下した。
ＨＥＫ２９３細胞では実質的なサイトカイン放出はなかった。Ａ５４９細胞は、より高純度の環状ＲＮＡをトランスフェクトすると、ＧＬｕｃ発現安定性及び細胞生存率が増加した。完全に精製された環状ＲＮＡは、トランスフェクトされた２９３細胞と同様の安定性表現型を有した。実施例４Ｂ：環状ＲＮＡは、有意な免疫原性を引き起こさず、ＲＩＧ－Ｉリガンドではない。
実施例４Ｂ：環状ＲＮＡは有意な免疫原性を引き起こさず、ＲＩＧ－Ｉのリガンドではない。
Ａ５４９細胞に、スプライシング反応の産物をトランスフェクトした。
Ａ５４９細胞に、
・未精製環状ＲＮＡ、
・高分子量（直鎖及び環状の連結）ＲＮＡ、
・環状（ニックの入った）ＲＮＡ、
・精製環状ＲＮＡの初期画分（ニックの入ったＲＮＡのピークとの重複が多い）、
・精製環状ＲＮＡの後期画分（ニックの入ったＲＮＡのピークとの重複が少ない）、
・環状化中に切除されたイントロン、または
・ビヒクル（すなわち、トランスフェクトされていない対照）、をトランスフェクトした。
前駆体ＲＮＡは、スプライシング反応物から好適に純粋な直鎖状前駆体ＲＮＡを取得することが困難なため、スプライス部位欠失突然変異体（ＤＳ）の形態で別個で合成及び精製した。サイトカイン放出及び細胞生存率を、各場合において測定した。
スプライシング反応物内に存在する大半の種、ならびに前駆体ＲＮＡに応答して、強力なＩＬ－６、ＲＡＮＴＥＳ、及びＩＰ－１０の放出が観察された。初期ｃｉｒｃＲＮＡ画分は、他の非ｃｉｒｃＲＮＡ画分に匹敵するサイトカイン応答を誘発した。これは、比較的少量の直鎖ＲＮＡ夾雑物でさえ、Ａ５４９細胞において実質的な細胞性免疫応答を誘発できることを示す後期ｃｉｒｃＲＮＡ画分は、トランスフェクトされていない対照からのサイトカイン応答を超えるサイトカイン応答を誘発しなかった。トランスフェクション３６時間後のＡ５４９細胞生存率は、他の全ての画分と比較して、後期ｃｉｒｃＲＮＡ画分で大幅に大きかった。
後期ｃｉｒｃＲＮＡ ＨＰＬＣ画分、前駆体ＲＮＡまたは未精製スプライシング反応物を用いたＡ５４９細胞のトランスフェクション時のＲＩＧ－Ｉ及びＩＦＮ－β１転写産物誘導を分析した。ＲＩＧ－Ｉ及びＩＦＮ－β１両方の転写産物の誘導は、前駆体ＲＮＡ及び未精製スプライシング反応物よりも後期ｃｉｒｃＲＮＡ画分で弱かった。スプライシング反応物のＲＮａｓｅ Ｒ処理だけでは、この効果を取り除くのに十分ではなかった。非常に少量のＲＩＧ－Ｉリガンド３ｐ－ｈｐＲＮＡを環状ＲＮＡに加えると、実質的なＲＩＧ－Ｉ転写が誘導された。ＨｅＬａ細胞では、ＲＮａｓｅ Ｒで消化したスプライシング反応物のトランスフェクションは、ＲＩＧ－Ｉ及びＩＦＮ－β１を誘導したが、精製ｃｉｒｃＲＮＡでは誘導されなかった。全体として、ＨｅＬａ細胞は、Ａ５４９細胞よりも夾雑ＲＮＡ種に対する感受性が低かった。
スプライシング反応物または完全に精製されたｃｉｒｃＲＮＡを用いたＡ５４９細胞のトランスフェクションから最初の８時間以内のＲＩＧ－Ｉ、ＩＦＮ－β１、ＩＬ－６、及びＲＡＮＴＥＳ転写産物誘導をモニタリングする経時的実験では、ｃｉｒｃＲＮＡに対する一過性の応答は明らかにならなかった。精製されたｃｉｒｃＲＮＡも同様に、ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージにおいて炎症促進性転写物を誘導できなかった。
Ａ５４９細胞に、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ及びＥＧＦＰ発現配列を含有する精製ｃｉｒｃＲＮＡをトランスフェクトした。これは、炎症促進性転写物の実質的な誘導を産生することはできなかった。これらのデータは、スプライシング反応物の非環状成分が、以前の研究で観察された免疫原性の原因であり、ｃｉｒｃＲＮＡがＲＩＧ－Ｉの天然リガンドではないことを実証する。
実施例５
環状ＲＮＡは、ＴＬＲによる検出を回避する。
ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８のレポーター細胞株に、複数の直鎖または環状のＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトし、分泌された胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を測定した。
直鎖化ＲＮＡは、イントロン及びホモロジーアームの配列を欠失させることによって構築した。次に、直鎖ＲＮＡコンストラクトを、ホスファターゼで処理し（キャップされたＲＮＡの場合、キャップした後）、ＨＰＬＣによって精製した。
試みたトランスフェクションのいずれも、ＴＬＲ７レポーター細胞において応答を産生しなかった。ＴＬＲ３及びＴＬＲ８のレポーター細胞は、キャップされた直鎖化ＲＮＡ、ポリアデニル化直鎖化ＲＮＡ、ニックの入ったｃｉｒｃＲＮＡ ＨＰＬＣ画分、及び初期ｃｉｒｃＲＮＡ画分によって活性化された。後期ｃｉｒｃＲＮＡ画分及びｍ１ψ－ｍＲＮＡは、どの細胞株でもＴＬＲ媒介応答を誘発しなかった。
２番目の実験では、ｃｉｒｃＲＮＡを、２つの方法、すなわち、マグネシウムイオンの存在下での熱を用いたｃｉｒｃＲＮＡの処理、及びＤＮＡオリゴヌクレオチド誘導によるＲＮａｓｅ Ｈの消化、を使用して直鎖化した。どちらの方法でも、大部分の完全長直鎖ＲＮＡと、少量のインタクトなｃｉｒｃＲＮＡが得られた。ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８のレポーター細胞に、環状ＲＮＡ、熱により分解された環状ＲＮＡ、またはＲＮａｓｅ Ｈにより分解された環状ＲＮＡをトランスフェクトし、ＳＥＡＰ分泌をトランスフェクションから３６時間後に測定した。ＴＬＲ８レポーター細胞は、分解された環状ＲＮＡの両方の形態に応答してＳＥＡＰを分泌したが、モックトランスフェクションよりも環状ＲＮＡトランスフェクションに対して大きな応答を産生しなかった。ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写された直鎖化ＲＮＡによるＴＬＲ３の活性化にもかかわらず、分解またはインタクト条件では、ＴＬＲ３及びＴＬＲ７のレポーター細胞における活性化は観察されなかった。
実施例６
未修飾環状ＲＮＡは、直鎖ＲＮＡよりも増加した持続的なｉｎ ｖｉｖｏタンパク質発現を産生する。
未修飾及びｍ１ψ修飾ヒトエリスロポエチン（ｈＥｐｏ）直鎖ｍＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡを用いて、マウスに注射し、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。ｍ１ψ－ｍＲＮＡ及び未修飾ｃｉｒｃＲＮＡの等モルトランスフェクションにより、ＨＥＫ２９３細胞で強力なタンパク質発現がもたらされた。ｈＥｐｏ直鎖ｍＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡは、ＨＥＫ２９３及びＡ５４９細胞の等重量トランスフェクション時のＧＬｕｃ直鎖ｍＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡと比較して、同様の相対的なタンパク質発現パターン及び細胞生存率を示した。
マウスでは、ｈＥｐｏ ｃｉｒｃＲＮＡまたは直鎖ｍＲＮＡを内臓脂肪に注射した後、ｈＥｐｏが血清中に検出された。未修飾ｃｉｒｃＲＮＡの注射後に検出されたｈＥｐｏは、未修飾またはｍ１ψ－ｍＲＮＡからのものよりもゆっくりと減衰し、注射後４２時間でも依然として存在していた。血清ｈＥｐｏは、未精製ｃｉｒｃＲＮＡスプライシング反応物または未修飾直鎖ｍＲＮＡの注射時には急速に下降した。未精製スプライシング反応物の注射は、血清中で検出可能なサイトカイン応答を産生し、これは精製ｃｉｒｃＲＮＡを含む他のＲＮＡでは観察されなかった。
実施例７
環状ＲＮＡは、脂質ナノ粒子を介してｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで有効に送達され得る。
精製環状ＲＮＡを、イオン化可能なリピドイドｃＫＫ－Ｅ１２を用いて脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）へと製剤化した（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｋａｕｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）粒子は、５ｍｏＵで修飾された市販の対照直鎖ｍＲＮＡを含有する粒子と同様の平均サイズ、多分散度指数、及び封入効率を備えた均一なマルチラメラ構造を形成した。
精製ｈＥｐｏ ｃｉｒｃＲＮＡは、ＬＮＰに封入し、ＨＥＫ２９３細胞に加えた場合、５ｍｏＵ－ｍＲＮＡよりも高い発現を示した。ＨＥＫ２９３細胞におけるＬＮＰ－ＲＮＡからの発現安定性は、５ｍｏＵ－ｍＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡの両方に関する減衰のわずかな遅延を除いて、トランスフェクション試薬によって送達されたＲＮＡの発現安定性と同様であった。未修飾ｃｉｒｃＲＮＡ及び５ｍｏＵ－ｍＲＮＡは両方とも、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＩＧ－Ｉ／ＩＦＮ－β１を活性化できなかった。
マウスでは、ＬＮＰ－ＲＮＡは、内臓脂肪組織への局所注射または肝臓への静脈内送達によって送達された。どちらの場合も、送達から６時間後、ｃｉｒｃＲＮＡからの血清ｈＥｐｏ発現は低かったが、５ｍｏＵ－ｍＲＮＡからの発現と同等であった。未修飾ＬＮＰ－ｃｉｒｃＲＮＡの脂肪注射後に検出された血清ｈＥｐｏは、ＬＮＰ－５ｍｏＵ－ｍＲＮＡからのものよりもゆっくりと減衰し、血清中に存在する発現減衰の遅延はｉｎ ｖｉｔｒｏで認められたものと同様であったが、ＬＮＰ－ｃｉｒｃＲＮＡまたはＬＮＰ－５ｍｏＵ－ｍＲＮＡの静脈内注射後の血清ｈＥｐｏは、およそ同じ速度で減衰した。これらの場合のいずれにおいても、血清サイトカインまたは局所ＲＩＧ－Ｉ、ＴＮＦα、もしくはＩＬ－６転写産物誘導において増加はなかった。
実施例８
実施例８Ａ：ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、及び１Ｃ１Ｃ７細胞におけるＩＲＥＳによる発現と機能安定性。
アナベナイントロン／エクソン領域、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、及び様々なＩＲＥＳを含むコンストラクトを環状化した。
１００ｎｇの各環状化反応物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを使用して、２０，０００個のＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、及び１Ｃ１Ｃ７細胞に別個にトランスフェクトした。各上清における発光は、タンパク質発現の尺度として２４時間後に評価した。ＨＥＫ２９３細胞では、クロヒウイルスＢ、サリウイルスＦＨＢ、アイチウイルス、サリウイルスＨＧ－Ｊ１、及びエンテロウイルスＪ ＩＲＥＳを含むコンストラクトが、２４時間で最も多くの発光を産生した（図１Ａ）ＨｅｐＧ２細胞では、アイチウイルス、サリウイルスＦＨＢ、ＥＭＣＶ－Ｃｆ、ＣＶＡ３ ＩＲＥＳを含むコンストラクトが、２４時間で高い発光を産生した（図１Ｂ）１Ｃ１Ｃ７細胞では、サリウイルスＦＨＢ、アイチウイルス、サリウイルスＮＧ－Ｊ１、及びサリウイルスＡ ＳＺ－１ ＩＲＥＳを含むコンストラクトが、２４時間で高い発光を産生した（図１Ｃ）。
より大きなＩＲＥＳが、２４時間でより大きな発光を産生する傾向が観察された。総配列長が短いと環状化効率が増加する傾向があるため、高い発現及び比較的短いＩＲＥＳの選択は、コンストラクトの改善をもたらし得る。ＨＥＫ２９３細胞では、クロヒウイルスＢ ＩＲＥＳを使用したコンストラクトが、特に同様の長さの他のＩＲＥＳと比較して、最も高い発光を産生した（図２Ａ）ＩＲＥＳサイズに対してプロットされたＨｅｐＧ２及び１Ｃ１Ｃ７細胞におけるＩＲＥＳコンストラクトからの発現を、図２のＢ及び２Ｃに示す。
ＨｅｐＧ２及び１Ｃ１Ｃ７細胞における選択されたＩＲＥＳコンストラクトの機能安定性を、３日間にわたって測定した。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を、２０，０００個の細胞に１００ｎｇの各環状化反応物をトランスフェクトした後２４時間毎に測定し、その後完全に培地を交換した。サリウイルスＡ ＧＵＴ及びサリウイルスＦＨＢは、ＨｅｐＧ２細胞で最も高い機能安定性を呈し、サリウイルスＮ－Ｊ１及びサリウイルスＦＨＢは、１Ｃ１Ｃ７細胞で最も安定した発現を産生した（図３のＡ及びＢ）。
実施例８Ｂ：追加のＩＲＥＳのスクリーニング
ＨＥＫ２９３細胞における追加のＩＲＥＳコンストラクトの機能安定性を測定した。簡潔には、目的の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）をＧｅｎＢａｎｋから特定した。選択されたＵＴＲを５’末端から６７５ｎｔに切断し、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）をコードする環状ＲＮＡ骨格コンストラクト内にＧｌｕｃコーディング領域の前に挿入した。環状ＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。２４時間後、上清を収集し、分泌されたＧｌｕｃタンパク質からの発光を市販の試薬を使用して測定した。結果が図１Ｄ及び図１Ｅならびに表３０に示されており、多くの天然ＩＲＥＳ配列が、環状ＲＮＡの状況でタンパク質発現を向上させることを示唆している。
（表３０）
Figure 2023525270000549
Figure 2023525270000550
Figure 2023525270000551
Figure 2023525270000552
Figure 2023525270000553
Figure 2023525270000554
Figure 2023525270000555
Figure 2023525270000556
実施例９
Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＩＲＥＳによる発現及び機能安定性。
アナベナイントロン／エクソン領域、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、及び以前に試験したＩＲＥＳのサブセットを含む２セットのコンストラクトを環状化した。６０，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞を、１μｇの各環状化反応物でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションから２４時間後に、上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を測定した。セット間の比較及び以前に定義されたＩＲＥＳの有効性との比較のために、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳコンストラクトを両方のセットに含めた。ＣＶＢ１及びサリウイルスＡ ＳＺ１ ＩＲＥＳコンストラクトは、２４時間で最も多くの発現を産生した。データは、図４のＡ及びＢに見出すことができる。
各ラウンドのエレクトロポレーションしたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＩＲＥＳコンストラクトの機能安定性を、３日間にわたって測定した。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を、６０，０００個の細胞を１μｇの各環状化反応物でエレクトロポレーションした後２４時間毎に測定し、その後完全に培地を交換した（図５のＡ及びＢ）。
サリウイルスＡ ＳＺ１及びサリウイルスＡ ＢＮ２ ＩＲＥＳコンストラクトは、他のコンストラクトと比較して高い機能安定性を有した。
実施例１０
Ｊｕｒｋａｔ細胞における環状及び直鎖ＲＮＡの発現、機能安定性、及びサイトカイン放出。
アナベナイントロン／エクソン領域、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、及びサリウイルスＦＨＢ ＩＲＥＳを含むコンストラクトを環状化した。ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び約１５０ｎｔポリＡテールを含むｍＲＮＡ、ならびに１００％のウリジンを５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）に置き換えるように修飾されたものは市販されており、Ｔｒｉｌｉｎｋから購入した。５ｍｏＵヌクレオチド修飾は、ｍＲＮＡの安定性及び発現を改善することが示されている（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２０１６ Ｍａｒ １６；２７（３）：８４９－５３）。Ｊｕｒｋａｔ細胞における修飾ｍＲＮＡの発現、環状化反応物（未純化）、及びサイズ排除ＨＰＬＣによって精製されたｃｉｒｃＲＮＡ（純粋）を測定し、比較した（図６Ａ）。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を、６０，０００個の細胞を１μｇの各ＲＮＡ種でエレクトロポレーションしてから２４時間後に測定した。
上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光は、６０，０００個の細胞を１ｕｇの各ＲＮＡ種でエレクトロポレーションした後２４時間毎に測定し、その後完全に培地を交換した。３日間にわたるＪｕｒｋａｔ細胞における修飾ｍＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡの機能安定性データの比較を、図６Ｂに示す。
ＩＦＮγ（図７Ａ）、ＩＬ－６（図７Ｂ）、ＩＬ－２（図７Ｃ）、ＲＩＧ－Ｉ（図７Ｄ）、ＩＦＮ－β１（図７Ｅ）、及びＴＮＦα（図７Ｆ）転写産物誘導を、６０，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞を１μｇの上記の各ＲＮＡ種及び３ｐ－ｈｐＲＮＡ（ＲＩＧ－Ｉアゴニストとして知られる５’三リン酸ヘアピンＲＮＡ）でエレクトロポレーションしてから１８時間後に測定した。
実施例１１
単球及びマクロファージにおける環状及び直鎖ＲＮＡの発現。
アナベナイントロン／エクソン領域、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、及びサリウイルスＦＨＢ ＩＲＥＳを含むコンストラクトを環状化した。ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び約１５０ｎｔポリＡテールを含むｍＲＮＡ、ならびに１００％のウリジンを５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）に置き換えるように修飾されたものは、Ｔｒｉｌｉｎｋから購入した。環状及び修飾ｍＲＮＡの発現を、ヒト初代単球（図８Ａ）及びヒト初代マクロファージ（図８Ｂ）において測定した。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を、６０，０００個の細胞を１μｇの各ＲＮＡ種でエレクトロポレーションしてから２４時間後に測定した。発光は、ヒト初代マクロファージをエレクトロポレーションしてから４日後にも測定し、培地は２４時間毎に交換した（図８Ｃ）。結果は、図８に見出すことができる。発光における差異は、いずれの場合も統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
実施例１２
初代Ｔ細胞におけるＩＲＥＳによる発現及び機能安定性。
アナベナイントロン／エクソン領域、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、及び以前に試験したＩＲＥＳのサブセットを含むコンストラクトを環状化し、反応産物をサイズ排除ＨＰＬＣによって精製した。１５０，０００個の初代ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を、１μｇの各ｃｉｒｃＲＮＡでエレクトロポレーションした。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を、エレクトロポレーションから２４時間後に測定した（図９Ａ）アイチウイルス及びＣＶＢ３ ＩＲＥＳコンストラクトは、２４時間で最も多く発現した。
発光はまた、各コンストラクトの機能安定性を比較するために、エレクトロポレーション後２４時間毎に３日間にわたって測定した（図９Ｂ）サリウイルスＡ ＳＺ１ ＩＲＥＳを伴うコンストラクトが最も安定していた。
実施例１３
初代Ｔ細胞及びＰＢＭＣにおける環状及び直鎖ＲＮＡの発現及び機能安定性。
アナベナイントロン／エクソン領域、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、及びサリウイルスＡ ＳＺ１ ＩＲＥＳまたはサリウイルスＦＨＢ ＩＲＥＳを含むコンストラクトを環状化した。ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び約１５０ｎｔポリＡテールを含むｍＲＮＡ、ならびに１００％のウリジンを５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）に置き換えるように修飾されたものは、Ｔｒｉｌｉｎｋから購入した。サリウイルスＡ ＳＺ１ ＩＲＥＳ ＨＰＬＣ精製環状及び修飾ｍＲＮＡの発現を、ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞において測定した。サリウイルスＦＨＢ ＨＰＬＣ精製環状、未精製環状及び修飾ｍＲＮＡの発現を、ヒトＰＢＭＣにおいて測定した。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を、１５０，０００個の細胞を１μｇの各ＲＮＡ種でエレクトロポレーションしてから２４時間後に測定した。初代ヒトＴ細胞に関するデータを図１０Ａ及び図１０Ｂに示し、ＰＢＭＣに関するデータを図１０Ｃに示す精製環状ＲＮＡ及び未精製環状ＲＮＡまたは直鎖ＲＮＡ間の発現における差異は、いずれの場合も有意であった（ｐ＜０．０５）。
初代Ｔ細胞上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を、コンストラクトの機能安定性を比較するために、エレクトロポレーション後２４時間毎に３日間にわたって測定した。データを、図１０Ｂに示す精製環状ＲＮＡ及び直鎖ＲＮＡ間の１日目の測定からの相対発光における差異は、初代Ｔ細胞に関して２日目及び３日目の両方で有意であった。
実施例１４
アナベナイントロンにおける順列置換部位による環状化効率。
ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、アナベナイントロン／エクソン領域、スペーサー、内部相同性領域、及びホモロジーアームを含むＲＮＡコンストラクトを産生した。従来のアナベナイントロン順列置換部位及びＰ９における５つの連続した順列置換部位を使用したコンストラクトの環状化効率を、ＨＰＬＣによって測定した。Ｐ９における５つの連続した順列置換部位に関するＨＰＬＣクロマトグラムを、図１１のＡに示す。
環状化効率は、様々な順列置換部位で測定した。環状化効率は、ｃｉｒｃＲＮＡ／（ｃｉｒｃＲＮＡ＋前駆体ＲＮＡ）のそれぞれに関するＨＰＬＣクロマトグラム曲線下面積として定義する。各順列置換部位での環状化効率のランク付けされた定量化を、図１１のＢに示す。３つの順列置換部位（図１１のＢに示している）を、さらなる調査のために選択した。
この実施例における環状ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって環状化し、次にスピンカラムを介して精製した。環状化効率は、全てのコンストラクトに関して、Ｍｇ２＋及びグアノシンヌクレオチドとのインキュベーションの追加ステップを含めると、高くなる可能性があり得る；但し、このステップの除去は、環状ＲＮＡコンストラクト間の比較、及び環状ＲＮＡコンストラクトの最適化を可能にした。このレベルの最適化は、キメラ抗原受容体をコードするもの等の大きなＲＮＡコンストラクトで高い環状化効率を維持するのに特に有用である。
実施例１５
代替イントロンの環状化効率。
様々な種起源の順列置換グループ１イントロンまたは順列置換部位及び、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、スペーサー、内部相同性領域、及びホモロジーアームを含むいくつかの定常エレメントを含有する前駆体ＲＮＡを作製した。環状化データは、図１２に見出すことができる。図１２のＡは、前駆体、ＣｉｒｃＲＮＡ及びイントロンを分解するクロマトグラムを示す図１２のＢは、イントロンコンストラクトの関数として、図１２のＡに示されるクロマトグラムに基づいて、環状化効率のランク付けされた定量化を提供する。
この実施例における環状ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって環状化し、次にスピンカラム精製を行った。環状化効率は、全てのコンストラクトに関して、Ｍｇ２＋及びグアノシンヌクレオチドとのインキュベーションの追加ステップを含めると、高くなる可能性があり得る；但し、このステップの除去は、環状ＲＮＡコンストラクト間の比較、及び環状ＲＮＡコンストラクトの最適化を可能にする。このレベルの最適化は、キメラ抗原受容体をコードするもの等の大きなＲＮＡコンストラクトで高い環状化効率を維持するのに特に有用である。
実施例１６
ホモロジーアームの存在または長さによる環状化効率。
ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、アナベナイントロン／エクソン領域、スペーサー、及び内部相同性領域を含むＲＮＡコンストラクトを産生した。３つのアナベナイントロン順列置換部位を表すコンストラクトを、３０ｎｔ、２５％ＧＣホモロジーアームを用いて、またはホモロジーアームを用いずに（「ＮＡ」）試験した。これらのコンストラクトは、Ｍｇ２＋インキュベーションステップを伴わずに環状化することが可能であった。環状化効率を測定し、比較した。データは、図１３Ａ及び図１３Ｂに見出すことができる。環状化効率は、ホモロジーアームを欠く各コンストラクトでより高かった。図１３Ａは、環状化効率のランク付けされた定量化を提供する；図１３Ｂは、前駆体、ｃｉｒｃＲＮＡ及びイントロンを分解するクロマトグラムを提供する。
３つの順列置換部位のそれぞれについて、コンストラクトを、１０ｎｔ、２０ｎｔ、及び３０ｎｔのアーム長ならびに２５％、５０％、及び７５％のＧＣ含量で作製した。これらのコンストラクトのスプライシング効率を測定し、ホモロジーアームを伴わないコンストラクトと比較した（図１４）。スプライシング効率は、スプライシング反応物における総ＲＮＡに対する遊離イントロンの割合として定義する。
図１５のＡ（左）は、スプライシング効率の改善に対する強いホモロジーアームの寄与を示すＨＰＬＣクロマトグラムを示す
左上：７５％ＧＣ含量、１０ｎｔホモロジーアーム
中央左：７５％ＧＣ含量、２０ｎｔホモロジーアーム
左下：７５％ＧＣ含量、３０ｎｔホモロジーアーム。
図１５のＡ（右）は、ニッキングの増加と対になったスプライシング効率の増加を示すＨＰＬＣクロマトグラムを示し、ｃｉｒｃＲＮＡピークのショルダーとして現れている。
右上：７５％ＧＣ含量、１０ｎｔホモロジーアーム
中央右：７５％ＧＣ含量、２０ｎｔホモロジーアーム
右下：７５％ＧＣ含量、３０ｎｔホモロジーアーム。
図１５のＢ（左）は、改善された環状化効率を実証すると仮定された順列置換部位及びホモロジーアームの選択された組み合わせを示す。
図１５のＢ（右）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼで処理された、改善された環状化効率を実証すると仮定された順列置換部位及びホモロジーアームの選択された組み合わせを示す。
この実施例における環状ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって環状化し、次にスピンカラム精製を行った。環状化効率は、全てのコンストラクトに関して、グアノシンヌクレオチドとの追加のＭｇ２＋インキュベーションステップを含めると、高くなる可能性があり得る；但し、このステップの除去は、環状ＲＮＡコンストラクト間の比較、及び環状ＲＮＡコンストラクトの最適化を可能にした。このレベルの最適化は、キメラ抗原受容体をコードするもの等の大きなＲＮＡコンストラクトで高い環状化効率を維持するのに特に有用である。
実施例１７
キメラ抗原受容体をコードする環状ＲＮＡ
アナベナイントロン／エクソン領域、キムリアキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現配列、及びＣＶＢ３ ＩＲＥＳを含むコンストラクトを環状化した。１００，０００個のヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、５００ｎｇのｃｉｒｃＲＮＡでエレクトロポレーションし、ＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼを安定して発現するＲａｊｉ細胞と２４時間共培養した。エフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ比）０．７５：１。１００，０００個のヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、モックエレクトロポレーションし、対照として共培養した（図１６）。
１００，０００個のヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞のセットを、モックエレクトロポレーションするか、または１μｇのｃｉｒｃＲＮＡでエレクトロポレーションし、次にＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼを安定して発現するＲａｊｉ細胞と４８時間共培養した。Ｅ：Ｔ比１０：１（図１７）。
Ｒａｊｉ標的細胞の特異的溶解の定量化は、ホタル発光の検出によって決定した（図１８）。モックエレクトロポレーションするか、または異なるＣＡＲ配列をコードするｃｉｒｃＲＮＡでエレクトロポレーションした１００，０００個のヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼを安定して発現するＲａｊｉ細胞と４８時間共培養した。特異的溶解率（％）は、１－［ＣＡＲ条件発光］／［モック条件発光］として定義した。Ｅ：Ｔ比１０：１。
実施例１８
Ｊｕｒｋａｔ細胞及び休止ヒトＴ細胞における環状及び直鎖ＲＮＡの発現及び機能安定性。
アナベナイントロン／エクソン領域、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、及び以前に試験したＩＲＥＳのサブセットを含むコンストラクトを環状化し、反応産物をサイズ排除ＨＰＬＣによって精製した。１５０，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞を、１μｇの環状ＲＮＡまたは５ｍｏＵ－ｍＲＮＡでエレクトロポレーションした。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を、エレクトロポレーションから２４時間後に測定した（図１９のＡの左）。１５０，０００個の休止初代ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞（刺激後１０日）を、１μｇの環状ＲＮＡまたは５ｍｏＵ－ｍＲＮＡでエレクトロポレーションした。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を、エレクトロポレーションから２４時間後に測定した（図１９のＡの右）。
上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光は、エレクトロポレーション後２４時間毎に測定し、その後完全に培地を交換した。機能安定性データを、図１９のＢに示す環状ＲＮＡは、いずれの場合も直鎖ＲＮＡよりも機能安定性が高く、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてより顕著な差異があった。
実施例１９
直鎖ＲＮＡまたは様々な環状ＲＮＡコンストラクトでエレクトロポレーションした細胞のＩＦＮ－β１、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮγ、及びＴＮＦα転写産物誘導。
アナベナイントロン／エクソン領域、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、及び以前に試験したＩＲＥＳのサブセットを含むコンストラクトを環状化し、反応産物をサイズ排除ＨＰＬＣによって精製した。１５０，０００個のＣＤ３＋ヒトＴ細胞を、１μｇの環状ＲＮＡ、５ｍｏＵ－ｍＲＮＡ、または免疫刺激陽性対照ポリイノシン：シトシンでエレクトロポレーションした。ＩＦＮ－β１（図２０Ａ）、ＲＩＧ－Ｉ（図２０Ｂ）、ＩＬ－２（図２０Ｃ）、ＩＬ－６（図２０Ｄ）、ＩＦＮ－γ（図２０Ｅ）、及びＴＮＦ－α（図２０Ｆ）転写産物誘導を、エレクトロポレーションから１８時間後に測定した。
実施例２０
異なる量の環状または直鎖のＲＮＡでエレクトロポレーションしたＣＡＲ発現細胞による標的細胞の特異的溶解及びＩＦＮγ転写産物誘導；異なるＥ：Ｔ比でのＣＡＲ発現細胞による標的細胞及び非標的細胞の特異的溶解。
アナベナイントロン／エクソン領域、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現配列、及びＣＶＢ３ ＩＲＥＳを含むコンストラクトを環状化し、反応産物をサイズ排除ＨＰＬＣによって精製した。モックエレクトロポレーションするか、または抗ＣＤ１９ ＣＡＲ配列をコードする異なる量のｃｉｒｃＲＮＡでエレクトロポレーションした１５０，０００個のヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、２：１のＥ：Ｔ比にて、ＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼを安定して発現するＲａｊｉ細胞と１２時間共培養した。Ｒａｊｉ標的細胞の特異的溶解率は、ホタル発光の検出によって決定した（図２１Ａ）。特異的溶解率（％）は、１－［ＣＡＲ条件発光］／［モック条件発光］として定義、ＩＦＮγ転写産物誘導は、エレクトロポレーションから２４時間後に測定した（図２１Ｂ）。アナベナイントロン／エクソン領域、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現配列、及びＣＶＢ３ ＩＲＥＳを含むコンストラクトを環状化し、反応産物をサイズ排除ＨＰＬＣによって精製した。
１５０，０００個のヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、モックエレクトロポレーションするか、または抗ＣＤ１９ ＣＡＲ配列をコードする５００ｎｇのｃｉｒｃＲＮＡもしくはｍ１ψ－ｍＲＮＡでエレクトロポレーションし、次に異なるＥ：Ｔ比にて、ホタルルシフェラーゼを安定して発現するＲａｊｉ細胞と２４時間共培養した。Ｒａｊｉ標的細胞の特異的溶解率（％）は、ホタル発光の検出によって決定した（図２２のＡ）特異的溶解率（％）は、１－［ＣＡＲ条件発光］／［モック条件発光］として定義した。
ＣＡＲを発現するＴ細胞をさらに、異なるＥ：Ｔ比にて、ホタルルシフェラーゼを安定して発現する。ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞と２４時間共培養したＲａｊｉ標的細胞またはＫ５６２非標的細胞の特異的溶解は、ホタル発光の検出によって決定した（図２２のＢ）。特異的溶解率（％）は、１－［ＣＡＲ条件発光］／［モック条件発光］として定義した。
実施例２１
ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡまたは直鎖ＲＮＡでエレクトロポレーションしたＴ細胞による標的細胞の特異的溶解。
アナベナイントロン／エクソン領域、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現配列、及びＣＶＢ３ ＩＲＥＳを含むコンストラクトを環状化し、反応産物をサイズ排除ＨＰＬＣによって精製した。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、５００ｎｇの環状ＲＮＡまたは等モル量のｍ１ψ－ｍＲＮＡでエレクトロポレーションし、それぞれがＣＤ１９を標的としたＣＡＲをコードした。Ｒａｊｉ細胞をＣＡＲ－Ｔ細胞培養物に７日間にわたって１０：１のＥ：Ｔ比にて加えた。特異的溶解率（％）を、両方のコンストラクトについて、１、３、５、及び７日目に測定した（図２３）。
実施例２２
抗ＣＤ１９ ＣＡＲまたは抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するＴ細胞によるＲａｊｉ細胞の特異的溶解。
アナベナイントロン／エクソン領域、抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現配列、及びＣＶＢ３ ＩＲＥＳを含むコンストラクトを環状化し、反応産物をサイズ排除ＨＰＬＣによって精製した。１５０，０００個の初代ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を、５００ｎｇのｃｉｒｃＲＮＡでエレクトロポレーションし、次にＲａｊｉ細胞と２：１のＥ：Ｔ比にて共培養した。特異的溶解率（％）を、エレクトロポレーションから１２時間後に測定した（図２４）。
実施例２３
実施例２３Ａ：化合物の合成
本発明の代表的なイオン化可能脂質の合成は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６１０５８号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５８５５５号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５３５６９号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２８９８１号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５２４６号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３５４１９号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１５９１３号、ならびに米国出願公開第２０１９０３１４５２４号、同第２０１９０３２１４８９号、及び同第２０１９０３１４２８４号に記載されており、それぞれの内容が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
実施例２３Ｂ：化合物の合成
本発明の代表的なイオン化可能脂質の合成は、内容が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第ＵＳ２０１７０２１０６９７Ａ１号に記載されている。
実施例２４
器官によるタンパク質発現
ＦＬｕｃをコードする環状または直鎖のＲＮＡを生成し、５０％の表１０ｂのイオン化可能脂質１５、１０％のＤＳＰＣ、１．５％のＰＥＧ－ＤＭＧ、３８．５％のコレステロールという配合で輸送ビヒクルに搭載した。ＣＤ－１マウスに０．２ｍｇ／ｋｇで投与し、発光を６時間目（生ＩＶＩＳ）及び２４時間目（生ＩＶＩＳ及びｅｘ ｖｉｖｏ ＩＶＩＳ）に測定した。肝臓、脾臓、腎臓、肺、及び心臓のｔｏｔａｌ ｆｌｕｘ（目的の領域にわたる光子／秒）を測定した（図２５及び図２６）。
実施例２５
脾臓における発現の分布
ＧＦＰをコードする環状または直鎖のＲＮＡを生成し、５０％の表１０ｂのイオン化可能脂質１５、１０％のＤＳＰＣ、１．５％のＰＥＧ－ＤＭＧ、３８．５％のコレステロールという配合で輸送ビヒクルに搭載する。製剤をＣＤ－１マウスに投与する。細胞型にわたる発現の分布を決定するために脾臓細胞についてフローサイトメトリーを実行する。
実施例２６
ナノ粒子組成物の生産
細胞への環状ＲＮＡの送達に使用するための安全かつ有効なナノ粒子組成物を調査するために、一連の製剤を調製し、試験する。具体的には、ナノ粒子組成物の脂質成分中の特定のエレメント及びその比率を最適化する。
ナノ粒子は、１つの流体ストリーム中で、または一方が環状ＲＮＡを含有し、他方が脂質成分を有する２つの流体ストリームの混合プロセス、例えばマイクロフルイディクス及びＴジャンクション混合で作製できる。
脂質組成物は、イオン化可能脂質、任意選択でヘルパー脂質（例えばＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬから入手可能な、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、またはオレイン酸）、ＰＥＧ脂質（例えばＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬから入手可能な、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール、ＰＥＧ－ＤＭＧとしても知られる）、及び構造脂質、例えばコレステロールを、約、例えば、溶媒、例えば、エタノール中４０または５０ｍＭの濃度にて組み合わせることにより調製される。溶液は、例えば、－２０℃で保管するために冷蔵するべきである。脂質を組み合わせて、所望のモル比を得（例えば、下の表３１ａ及び表３１ｂを参照されたい）、水及びエタノールで希釈して、最終脂質濃度を、例えば、約５．５ｍＭ～約２５ｍＭにする。
（表３１ａ）
Figure 2023525270000557
Figure 2023525270000558
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、表３１ａに記載するような製剤を有する。
（表３１ｂ）
Figure 2023525270000559
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、表３１ｂに記載するような製剤を有する。
ｃｉｒｃＲＮＡを含むナノ粒子組成物の場合、脱イオン水中０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のｃｉｒｃＲＮＡの溶液を、緩衝液、例えば、ｐＨ３～４間の５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液に希釈して、ストック溶液を形成する。あるいは、脱イオン水中０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度のｃｉｒｃＲＮＡの溶液を、緩衝液、例えば、ｐＨ３～４．５の６．２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に希釈して、ストック溶液を形成する。
環状ＲＮＡ及び脂質成分を含むナノ粒子組成物を、脂質溶液を、環状ＲＮＡを約５：１～約５０：１の脂質成分対ｃｉｒｃＲＮＡの重量：重量比にて含む溶液と組み合わせることによって調製する。脂質溶液は、例えば、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒマイクロ流体ベースのシステムを使用して、約１０ｍｌ／分～約１８ｍｌ／分間または約５ｍｌ／分～約１８ｍｌ／分間の流速でｃｉｒｃＲＮＡ溶液に迅速に注射して、約１：１～約４：１の水対エタノール比を有する懸濁液を産生する。
ナノ粒子組成物を透析によって処理して、エタノールを除去し、緩衝液交換を達成することができる。製剤を、分子量カットオフが１０ｋＤａまたは２０ｋＤａのＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒカセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、一次生成物の２００倍容量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に対して、２回透析する。次に、製剤を、４℃にて一晩透析する。得られたナノ粒子懸濁液を、０．２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に通してガラスバイアルにろ過し、圧着クロージャーで密閉する。０．０１ｍｇ／ｍｌ～０．１５ｍｇ／ｍｌのナノ粒子組成物溶液が一般に取得される。
上記の方法は、ナノ沈殿及び粒子形成を誘導する。
Ｔジャンクション及び直接注射を含むがこれに限定されない代替的プロセスを使用して、同じナノ沈殿が達成され得る。
Ｂ．ナノ粒子組成物の特徴評価
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、ナノ粒子組成物の粒径、多分散性指数（ＰＤＩ）及びゼータ電位を決定することができ、粒径の決定においては１×ＰＢＳで、またゼータ電位の決定においては１５ｍＭのＰＢＳで決定する。
紫外可視分光法を使用して、ナノ粒子組成物中のｃｉｒｃＲＮＡの濃度を決定することができる。１×ＰＢＳに希釈した１００μＬの製剤をメタノールとクロロホルムの４：１（ｖ／ｖ）混合物の９００μＬに加える。混合後、溶液の吸光度スペクトルを、例えば、ＤＵ ８００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）で、２３０ｎｍ～３３０ｎｍで記録する。ナノ粒子組成物中のｃｉｒｃＲＮＡの濃度は、その組成物中に使用されているｃｉｒｃＲＮＡの吸光係数に基づいて、また波長、例えば、２６０ｎｍでの吸光度と、波長、例えば、３３０ｎｍでのベースライン値の間の差に基づいて計算することができる。
ＱＵＡＮＴ－ＩＴ（商標）ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ナノ粒子組成物によるｃｉｒｃＲＮＡの封入を評価することができる。試料を、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で、約５μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬの濃度まで希釈する。５０μＬの希釈試料を、ポリスチレン９６ウェルプレートに移し、５０μＬのＴＥ緩衝液または５０μＬの２～４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液のいずれかをウェルに加える。プレートを、３７℃の温度で１５分間インキュベートする。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）試薬をＴＥ緩衝液で１：１００または１：２００に希釈し、この溶液の１００μＬを各ウェルに加える。蛍光強度は、蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、励起波長、例えば、約４８０ｎｍ及び発光波長、例えば、約５２０ｎｍにて測定することができる。試薬ブランクの蛍光値を試料の各値から引き、遊離ｃｉｒｃＲＮＡのパーセンテージを、インタクトな試料（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の添加なし）の蛍光強度を破壊試料（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の添加によって生じる）の蛍光値で除することで決定する。
Ｃ．ｉｎ ｖｉｖｏ製剤研究
様々なナノ粒子組成物がｃｉｒｃＲＮＡを標的細胞にいかに有効に送達するのかをモニターするために、ｃｉｒｃＲＮＡを含む異なるナノ粒子組成物を調製し、げっ歯類集団に投与する。マウスに、脂質ナノ粒子製剤を有するナノ粒子組成物を含む単回用量を、静脈内、筋肉内、動脈内、または腫瘍内に投与する。一部の例では、マウスに用量を吸入させ得る。用量サイズは、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲であってよく、この場合１０ｍｇ／ｋｇは、マウスの体重１ｋｇにつき、１０ｍｇのｃｉｒｃＲＮＡをナノ粒子組成物に含む用量を表す。ＰＢＳを含む対照組成物も採用され得る。
ナノ粒子組成物をマウスに投与する際、特定の製剤及びその用量の用量送達プロファイル、用量応答、及び毒性を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、生物発光イメージング、または他の方法によって測定することができる。タンパク質発現の時間経過も評価することができる。評価のためにげっ歯類から収集した試料には、血液及び組織（例えば、筋肉内注射部位からの筋肉組織及び内部組織）が含まれ得る；試料収集には、動物の屠殺が伴い得る。ｃｉｒｃＲＮＡが含まれる組成物の投与によって誘導されるタンパク質発現のより高いレベルは、ｃｉｒｃＲＮＡ翻訳及び／またはナノ粒子組成物ｃｉｒｃＲＮＡ送達効率がより高いことを示す。非ＲＮＡ成分は翻訳機構自体に影響を与えるとは考えられていないため、タンパク質発現のレベルが高いことは、他のナノ粒子組成物またはその非存在と比べて、所与のナノ粒子組成物によるｃｉｒｃＲＮＡの送達効率が高いことを示している可能性が高い。
実施例２７
ナノ粒子組成物の特徴評価
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、輸送ビヒクル組成物の粒径、多分散性指数（ＰＤＩ）及びゼータ電位を決定することができ、粒径の決定においては１×ＰＢＳで、またゼータ電位の決定においては１５ｍＭのＰＢＳで行う。
紫外可視分光法を使用して、輸送ビヒクル組成物中の治療剤及び／または予防剤（例えば、ＲＮＡ）の濃度を決定することができる。１×ＰＢＳに希釈した１００μＬの製剤をメタノールとクロロホルムの４：１（ｖ／ｖ）混合物の９００μＬに加える。混合後、溶液の吸光度スペクトルを、例えば、ＤＵ ８００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）で、２３０ｎｍ～３３０ｎｍで記録する。輸送ビヒクル組成物中の治療剤及び／または予防剤の濃度は、その組成物中に使用されている治療剤及び／または予防剤の吸光係数に基づいて、また波長、例えば、２６０ｎｍでの吸光度と、波長、例えば、３３０ｎｍでのベースライン値の間の差に基づいて計算することができる。
ＲＮＡを含む輸送ビヒクル組成物の場合、ＱＵＡＮＴ－ＩＴ（商標）ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、輸送ビヒクル組成物によるＲＮＡの封入を評価することができる。試料を、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で、約５μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬの濃度まで希釈する。５０μＬの希釈試料を、ポリスチレン９６ウェルプレートに移し、５０μＬのＴＥ緩衝液または５０μＬの２～４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液のいずれかをウェルに加える。プレートを、３７℃の温度にて１５分間インキュベートする。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）試薬を、ＴＥ緩衝液で１：１００または１：２００に希釈し、この溶液の１００μＬを各ウェルに加える。蛍光強度は、蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、励起波長、例えば、約４８０ｎｍ及び発光波長、例えば、約５２０ｎｍにて測定することができる。試薬ブランクの蛍光値を試料の各値から引き、遊離ＲＮＡのパーセンテージを、インタクトな試料（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加しない）の蛍光強度を破壊試料（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の添加によって生じる）の蛍光値で除することで決定する。
実施例２８
Ｔ細胞標的指向性
輸送ビヒクルをＴ細胞に標的するために、Ｔ細胞抗原結合剤、例えば、抗ＣＤ８抗体を、輸送ビヒクルの表面に結合させる。抗Ｔ細胞抗原抗体は、ＰＢＳ中のＥＤＴＡの存在下で過剰なＤＴＴにより穏やかに還元され、ヒンジ領域の遊離チオールに曝露される。ＤＴＴを除去するために、抗体を、脱塩カラムに通過させる。ヘテロ二官能性クロスリンカーＳＭ（ＰＥＧ）２４を使用して、抗体を、ｃｉｒｃＲＮＡを搭載した輸送ビヒクルの表面に係留する（アミン基は、ＰＥＧ脂質の頭部基に存在し、抗体上の遊離チオール基は、ＤＴＴによって生じ、ＳＭ（ＰＥＧ）２４は、アミン基とチオール基間で架橋する）。輸送ビヒクルを最初に過剰のＳＭ（ＰＥＧ）２４とインキュベートし、遠心分離して、未反応のクロスリンカーを除去する。次に、活性化された輸送ビヒクルを、過剰の還元型抗Ｔ細胞抗原抗体とインキュベートする。未結合抗体は、遠心ろ過デバイスを使用して除去する。
実施例２９
ＲＶ８８を使用するＲＮＡ含有輸送ビヒクル。
この実施例では、ＲＮＡ含有輸送ビヒクルを、ｃｉｒｃＲＮＡの送達のためにカチオン性脂質ＲＶ８８を含む２－Ｄボルテックスマイクロ流体チップを使用して合成する。
Figure 2023525270000560

Figure 2023525270000561
ＲＶ８８、ＤＳＰＣ、及びコレステロールは全て、ホウケイ酸バイアル中エタノールに１０ｍｇ／ｍｌの濃度にて調製する。脂質１４：０－ＰＥＧ２Ｋ ＰＥは、ホウケイ酸ガラスバイアル中４ｍｇ／ｍｌの濃度にて調製する。ストック濃度での脂質の溶解は、エタノール中で脂質を２分間超音波処理することによって達成される。次に、溶液を、１７０ ｒｐｍに設定したオービタル傾斜シェーカー上で、３７℃にて１０分間加熱する。次に、バイアルを２６℃にて最低４５分間平衡化する。次に、脂質を、表３２ｂに示すように、ある容量のストック脂質を加えることによって混合する。次に、溶液をエタノールで調整して、最終脂質濃度を７．９２ｍｇ／ｍｌとした。
（表３２ｂ）
Figure 2023525270000562
ｐＨ６．０の７５ｍＭクエン酸緩衝液を用い、ＲＮＡの濃度を１．２５０ｍｇ／ｍｌにして、ＲＮＡをストック溶液として調製する。次に、ＲＮＡの濃度を、ｐＨ６．０の７５ｍＭクエン酸緩衝液を用いて０．１０３７ｍｇ／ｍｌに調整し、２６℃に平衡化する。次に、溶液を、２６℃にて最低２５分間インキュベートする。
マイクロ流体チャンバーをエタノールで洗浄し、ｎｅＭＹＳＩＳシリンジポンプは、シリンジにＲＮＡ溶液をロードし、別のシリンジにエタノール脂質をロードすることによって調製される。両方のシリンジがロードされて、ｎｅＭＥＳＹＳソフトウェアの制御下にある。次に、溶液を、水相と有機相の比を２、また総流速を２２ｍｌ／分（ＲＮＡが１４．６７ｍｌ／分、及び脂質溶液が７．３３ｍｌ／分）にして、混合チップに適用する。両方のポンプを同期して起動した。マイクロ流体チップから流出したミキサー溶液は、４×１ｍｌ画分で収集し、最初の画分は廃棄物として廃棄する。ＲＮＡ－リポソームを含有する残りの溶液は、Ｇ－２５ミニ脱塩カラムを使用して、１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５に交換する。緩衝液の交換後、物質を、サイズ及びＲＮＡ封入について、それぞれ、ＤＬＳ分析及びＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイにより特徴評価する。
実施例３０
ＲＶ９４を使用するＲＮＡ含有輸送ビヒクル。
この実施例では、ＲＮＡ含有リポソームを、ｃｉｒｃＲＮＡの送達のためにカチオン性脂質ＲＶ９４を含む２－Ｄボルテックスマイクロ流体チップを使用して合成する。
Figure 2023525270000563
（表３３）
Figure 2023525270000564
脂質は、実施例２９と同様に調製し、表３４に挙げた物質量を使用して、最終脂質濃度を７．９２ｍｇ／ｍｌとした。
（表３４）
Figure 2023525270000565
ｐＨ６．０の７５ｍＭクエン酸緩衝液を用い、ｃｉｒｃＲＮＡを１．２５０ｍｇ／ｍｌにして、ｃｉｒｃＲＮＡの水溶液をストック溶液として調製する。次に、ＲＮＡの濃度を、ｐＨ６．０の７５ｍＭクエン酸緩衝液を用いて０．１０３７ｍｇ／ｍｌに調整し、２６℃に平衡化する。次に、溶液を、２６℃にて最低２５分間インキュベートする。
マイクロ流体チャンバーを、エタノールで洗浄し、ｎｅＭＹＳＩＳシリンジポンプは、シリンジにＲＮＡ溶液をロードし、別のシリンジにエタノール脂質をロードすることによって調製される。両方のシリンジがロードされ、ｎｅＭＥＳＹＳソフトウェアの制御下にある。次に、溶液を、水相と有機相の比を２、また総流速を２２ｍｌ／分（ＲＮＡが１４．６７ｍｌ／分、及び脂質溶液が７．３３ｍｌ／分）にして、混合チップに適用する。両方のポンプを同期して起動した。マイクロ流体チップから流出したミキサー溶液は、４×１ｍｌ画分で収集し、最初の画分は廃棄物として廃棄する。ｃｉｒｃＲＮＡ輸送ビヒクルを含有する残りの溶液は、Ｇ－２５ミニ脱塩カラムを使用して、上記のように、１０ｍＭ トリス－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５に交換する。緩衝液の交換後、物質を、サイズ及びＲＮＡ封入について、それぞれ、ＤＬＳ分析及びＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイにより特徴評価する。リポソームの生物物理学的分析を、表３５に示す。
（表３５）
Figure 2023525270000566
実施例３１
インライン混合の一般的プロトコル。
個々及び別個のストック溶液を調製する－１つは脂質を含有し、他方はｃｉｒｃＲＮＡを含有する。所望の脂質または脂質混合物、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ脂質を含有する脂質ストックを、９０％エタノールに可溶化することによって調製する。残りの１０％は、低ｐＨクエン酸緩衝液である。脂質ストックの濃度は、４ｍｇ／ｍＬである。このクエン酸緩衝液のｐＨは、採用する脂質の種類に応じて、ｐＨ３～ｐＨ５の範囲であることができる。ｃｉｒｃＲＮＡも、４ｍｇ／ｍＬの濃度にてクエン酸緩衝液に可溶化する。５ｍＬの各ストック溶液を調製する。
ストック溶液が完全に透明であり、脂質が完全に可溶化されることが確認されてからｃｉｒｃＲＮＡと合わせる。ストック溶液を加熱して、脂質を完全に可溶化し得る。このプロセスで使用されるｃｉｒｃＲＮＡは、未修飾または修飾オリゴヌクレオチドであってよく、コレステロール等の脂溶性部分とコンジュゲートし得る。
個々のストックは、各溶液をＴジャンクションにポンプで送り込むことによって合わされる。デュアルヘッドのＷａｔｓｏｎ－Ｍａｒｌｏｗポンプを使用して、２つのストリームの開始と停止を同時に制御した。１．６ｍｍポリプロピレンチューブを、線流速を増加させるために、０．８ｍｍチューブにさらにサイズを小さくする。ポリプロピレンライン（ＩＤ＝０．８ｍｍ）を、Ｔジャンクションのいずれかの側に取り付ける。ポリプロピレンＴは、１．６ｍｍの線状先端を有して、４．１ｍｍ３の容量を得る。ポリプロピレンラインの大端部（１．６ｍｍ）の各々を、可溶化脂質ストックまたは可溶化ｃｉｒｃＲＮＡのいずれかを含有する試験管の中に入れる。Ｔジャンクションの後に、組み合わされたストリームが流れ出る単一のチューブを配置する。次に、チューブを、２×容量のＰＢＳを含有する容器に伸ばし入れ、これを急速撹拌する。ポンプの流速は、３００ｒｐｍまたは１１０ｍＬ／分の設定とする。エタノールを除去し、透析によってＰＢＳに交換する。次に、脂質製剤を、遠心分離またはダイアフィルトレーションを使用して、適切な作業濃度に濃縮する。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ，ＭＡ）に、尾静脈注射を介して生理食塩水または製剤化されたｃｉｒｃＲＮＡのいずれかを与える。投与後の様々な時点で、血清試料を後眼窩採血によって収集する。第ＶＩＩ因子タンパク質の血清レベルは、発色アッセイ（Ｂｉｏｐｈｅｎ ＦＶＴＩ，Ａｎｉａｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＯＨ）を使用して試料中で決定する。第ＶＩＩ因子の肝臓ＲＮＡレベルを決定するために、動物を屠殺し、肝臓を採取して液体窒素で瞬間凍結する。組織溶解物を凍結組織から調製し、第ＶＩＩ因子の肝臓ＲＮＡレベルを分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ａｓｓａｙ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ，ＣＡ）を使用して定量化する。
ＦＶＩＩ活性を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける静脈内（ボーラス）注射から４８時間後に、ＦＶＴＩ ｓｉＲＮＡ処理動物において評価する。ＦＶＩＩは、マイクロプレートスケールで、製造元の指示に従って、血清または組織中のタンパク質レベルを決定するための市販のキットを使用して測定する。ＦＶＩＩの低下を、未処置対照マウスに対して決定し、結果を残存ＦＶＩＩ率（％）として表す２つの用量レベル（０．０５及び０．００５ｍｇ／ｋｇ ＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ）を、各新規リポソーム組成物のスクリーニングに使用する。
実施例３２
予形成ベシクルを使用するｃｉｒｃＲＮＡ製剤。
カチオン性脂質含有輸送ビヒクルを、予形成ベシクル法を使用して作製する。カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ脂質をそれぞれ、４０／１０／４０／１０のモル比でエタノールに可溶化する。脂質混合物を、水性緩衝液（５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４）に混合しながら加え、それぞれ、最終エタノール濃度が３０％（容量／容量）、最終脂質濃度が６．１ｍｇ／ｍＬになるようにし、室温で２分間平衡化してから押し出すＮｉｃｏｍｐ分析によって決定して、ベシクルの直径が７０～９０ｎｍになるまで、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）を使用して、２２℃にて、ポアサイズ８０ｎｍのフィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）を２枚積み重ねたものに水和脂質を通して押し出し、取得する。小ベシクルを形成しないカチオン性脂質混合物では、脂質混合物を低ｐＨ緩衝液（５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３）で水和させて、ＤＳＰＣ頭部基上のホスファート基をプロトン化することによって、安定的な７０～９０ｎｍのベシクルの形成を助ける。
ＦＶＩＩ ｃｉｒｃＲＮＡ（５０ｍＭクエン酸塩に可溶化した、３０％エタノールを含有するｐＨ４水溶液）を、混合しながら、３５℃に予め平衡化したベシクルに、約５ｍＬ／分の速度で加える。最終的な標的ｃｉｒｃＲＮＡ／脂質比０．０６（ｗｔ ｗｔ）を達成した後、混合物をさらに３０分間、３５℃にてインキュベートして、ベシクルの再構成及びＦＶＩＩ ＲＮＡの封入を可能にする。次に、エタノールを除去し、透析またはタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションのいずれかによって、外部緩衝液をＰＢＳ（１５５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）と置き換える。サイズ排除スピンカラムまたはイオン交換スピンカラムを使用して、非封入ＲＮＡを除去した後、封入ｃｉｒｃＲＮＡ対脂質の最終的な比率を決定する。
実施例３３
操作された環状ＲＮＡからの三重特異性抗原結合タンパク質の発現
環状ＲＮＡを、（１）３’スプライシング後グループＩイントロンフラグメント；（２）内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；（３）三重特異性抗原結合タンパク質コード領域；及び（４）３’相同性領域を含むように設計する。三重特異性抗原結合タンパク質領域を、標的抗原、例えば、ＧＰＣ３に結合する例示的な三重特異性抗原結合タンパク質を産生するように構築する。
ｓｃＦｖ ＣＤ３結合ドメインの生成
ヒトＣＤ３イプシロン鎖標準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ０７７６６である。ヒトＣＤ３ガンマ鎖標準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ０９６９３である。ヒトＣＤ３デルタ鎖標準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ０４３２３４である。ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマまたはＣＤ３デルタに対する抗体を、親和性成熟等の既知の技術を介して生成する。ネズミ抗ＣＤ３抗体を出発物質として使用する場合、マウス特異的残基が、本明細書に記載の三重特異性抗原結合タンパク質の処置を受けた対象においてヒト－抗マウス抗原（ＨＡＭＡ）反応を誘導し得る場合、ネズミ抗ＣＤ３抗体のヒト化が臨床環境のために所望である。ヒト化は、適切なヒト生殖系列アクセプターフレームワークに対するネズミ抗ＣＤ３抗体からのＣＤＲ領域のグラフト化（任意選択でＣＤＲ及び／またはフレームワーク領域に対する他の改変を含む）によって達成される。
したがって、ヒトまたはヒト化抗ＣＤ３抗体を使用して、三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインのためのｓｃＦｖ配列を生成する。ヒトまたはヒト化ＶＬ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を得て、コンストラクトのためのコドンを、ホモサピエンスからの細胞における発現のために任意選択で最適化する。ｓｃＦｖにおいてＶＬ及びＶＨドメインが現れる順序は様々であり（すなわち、ＶＬ－ＶＨ、またはＶＨ－ＶＬ配向）、３コピーの「Ｇ４Ｓ」または「Ｇ４Ｓ」サブユニット（Ｇ４Ｓ）３が可変ドメインを接続してｓｃＦｖドメインを生成する。抗ＣＤ３ｓｃＦｖプラスミドコンストラクトは、任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓまたは他の親和性タグを有し得、ＨＥＫ２９３または他の好適なヒトまたは哺乳類細胞株にエレクトロポレーションし、精製する。バリデーションアッセイには、ＦＡＣＳによる結合分析、Ｐｒｏｔｅｏｎを使用する動態分析、及びＣＤ３を発現する細胞の染色が含まれる。
ｓｃＦｖグリピカン－３（ＧＰＣ３）結合ドメインの生成
グリピカン－３（ＧＰＣ３）は、肝細胞がんに存在するが、健康な正常肝臓組織には存在しない細胞表面タンパク質の１つである。肝細胞がんにおいて上昇することが頻繁に観察され、ＨＣＣ患者にとって予後不良に関連する。それは、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化することが知られている。ＭＤＸ－１４１４、ＨＮ３、ＧＣ３３、及びＹＰ７を含むＧＰＣ３抗体が生成されている。
ＧＰＣ－３または別の標的抗原に結合するｓｃＦｖは、ＣＤ３に対するｓｃＦｖ結合ドメインの生成のための上記方法と同様に生成される。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの三重特異性抗原結合タンパク質の発現
ＣＨＯ－Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ－６１）（Ｋａｏ ａｎｄ Ｐｕｃｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９６８；６０（４）：１２７５－８１）の誘導体であるＣＨＯ細胞発現システム（Ｆｌｐ－Ｉｎ（登録商標），Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって提供される標準的な細胞培養プロトコルに従って接着細胞を継代培養する。
懸濁液における成長に対する適合のため、細胞を組織培養フラスコから脱着させ、無血清培地に入れる。１０％ＤＭＳＯを有する培地中で懸濁液適合細胞を凍結保存する。
分泌される三重特異性抗原結合タンパク質を安定的に発現する組換えＣＨＯ細胞株を、懸濁液適合細胞のトランスフェクションによって生成する。抗生物質ハイグロマイシンＢでの選択中に生存細胞密度を週２回測定し、細胞を遠心分離し、新たな選択培地に０．１×１０６生存細胞／ｍＬの最大密度で再懸濁する。三重特異性抗原結合タンパク質を安定的に発現する細胞プールを選択から２～３週間後に回収し、その時点で細胞を振盪フラスコ中の標準培地に移す。組換え分泌タンパク質の発現は、タンパク質ゲル電気泳動またはフローサイトメトリーを実施することによって確認する。安定な細胞プールをＤＭＳＯ含有培地中で凍結乾燥する。
三重特異性抗原結合タンパク質を、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株の１０日流加培養物において細胞培養上清への分泌によって産生させる。細胞培養上清を１０日後に典型的には＞７５％の培養生存率で採取する。試料を産生培養物から１日おきに収集し、細胞密度及び生存率を評価する。採取の日に、細胞培養上清を、さらなる使用の前に遠心分離及び真空ろ過によって清浄化する。
細胞培養上清におけるタンパク質発現力価及び産物全体性をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析する。
三重特異性抗原結合タンパク質の精製
三重特異性抗原結合タンパク質を、２ステップの手順でＣＨＯ細胞培養上清から精製する。コンストラクトを、第１のステップにおけるアフィニティークロマトグラフィーと、第２のステップにおけるＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００での分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供する。試料を緩衝液交換し、限外ろ過によって＞１ｍｇ／ｍＬの純度の典型的な濃度まで濃縮し、最終試料の均一性（典型的には＞９０％）を還元及び非還元条件下でＳＤＳ ＰＡＧＥによって評価し、続いて抗（半減期延長ドメイン）または抗イディオタイプ抗体を使用した免疫ブロット及び分析的ＳＥＣをそれぞれを行う。精製されたタンパク質を、使用するまで一定分量で－８０℃で保存する。
実施例３４
半減期延長ドメインを有する操作された環状ＲＮＡの発現は、半減期延長ドメインを有しないものと比べて改善した薬物動態パラメータを有する。
実施例２３のｃｉｒｃＲＮＡ分子でコードされた三重特異性抗原結合タンパク質を、０．５ｍｇ／ｋｇボーラス注射としてカニクイザルに筋肉内投与する。別のカニクイザル群に、ＣＤ３及びＧＰＣ－３に対する結合ドメインを有するが半減期延長ドメインを欠くサイズのｃｉｒｃＲＮＡ分子でコードされる同等のタンパク質を与える。第３及び第４の群に、ＣＤ３及び半減期延長ドメイン結合ドメインを有するｃｉｒｃＲＮＡ分子でコードされるタンパク質及びＧＰＣ－３及び半減期延長ドメインを有するタンパク質をそれぞれ与える。ｃｉｒｃＲＮＡによってコードされる両方のタンパク質は、サイズが三重特異性抗原結合タンパク質と同等である。各試験群は、５匹のサルからなる。血清試料を示された時点で採取し、段階希釈し、タンパク質の濃度を、ＣＤ３及び／またはＧＰＣ－３に対する結合ＥＬＩＳＡを使用して決定する。
薬物動態分析を、試験品血漿濃度を使用して実施する。各試験品についての群平均血漿データは、投与後の時間に対してプロットした場合、多指数プロファイルに適合する。データを、ボーラスインプットならびに分配相及び排泄相についての一次速度定数を用いて標準的な２コンパートメントモデルによってフィッティングさせる。静脈内投与についてのデータの最良あてはめのための一般方程式は、ｃ（ｔ）＝Ａｅ～ａｔ＋Ｂｅ～ｐｔｓｔ（式中、ｃ（ｔ）は時間ｔにおける血漿濃度であり、Ａ及びＢはＹ軸上の切片であり、α及びβはそれぞれ、分布相及び消失相の見かけの一次速度定数である）である。α相はクリアランスの初期相であり、動物の全ての細胞外液へのタンパク質の分布を反映する一方で、減衰曲線の第２またはβ相の部分は真の血漿クリアランスを表す。そのような方式を当てはめるための方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ａ＝Ｄ／Ｖ（ａ－ｋ２１）／（ａ－ｐ）、Ｂ＝Ｄ／Ｖ（ｐ－ｋ２１）／（ａ－ｐ）、ａ及びβ（α＞βの場合）は、二次方程式：ｒ２＋（ｋ１２＋ｋ２１＋ｋ１０）ｒ＋ｋ２１ｋ１０＝０の根であり、Ｖ＝分布容積、ｋ１０＝排出速度、ｋ１２＝コンパートメント１からコンパートメント２への移動速度及びｋ２１＝コンパートメント２からコンパートメント１への移動速度、及びＤ＝投与された用量の推定されるパラメータを使用する。
データ分析：濃度対時間プロファイルのグラフをＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（商標）ＶＶ．３．０９ Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９８６－１９９７．Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｐａ．）を使用して作製する。報告可能ではない（ＬＴＲ）ものとして報告された値は、ＰＫ分析に含めず、グラフで表されない。薬物動態パラメータは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｖ．３．１ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９８－１９９９．Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ）を使用してコンパートメント分析によって決定する。薬物動態パラメータは、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ Ｗ Ａ ａｎｄ Ｋｅａｒｎｓ Ｇ Ｌ，１９９９，ＥＳＴ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ記載されているように計算する。
実施例２３のｃｉｒｃＲＮＡ分子でコードされる三重特異性抗原結合タンパク質は、半減期延長ドメインを欠くタンパク質と比較して、消失半減期の延長等の改善した薬物動態パラメータを有することが予想される。
実施例３５
三重特異性抗原結合タンパク質の細胞傷害
実施例２３のｃｉｒｃＲＮＡ分子でコードされる三重特異性抗原結合タンパク質を、ＧＰＣ－３＋標的細胞に対するＴ細胞依存性細胞傷害のその媒介についてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価する。
蛍光標識されたＧＰＣ３標的細胞を、実施例２３の三重特異性抗原結合タンパク質の存在下で、エフェクター細胞としてのランダムドナーの分離されたＰＢＭＣまたはＴ細胞とインキュベートする。加湿インキュベーター内での３７℃で４時間のインキュベーション後、標的細胞から上清への蛍光色素の放出を蛍光光度計で決定する。実施例２３の三重特異性抗原結合タンパク質を用いずにインキュベートされた標的細胞及びインキュベーションの最後にサポニンの添加によって全体的に溶解した標的細胞は、それぞれ陰性対照及び陽性対照として機能する。
測定された残存する生存標的細胞に基づいて、特異的細胞溶解のパーセンテージを、以下の式：［１－（生存標的の数（試料）／生存標的の数（自発））］×１００％に従って計算する。シグモイド用量反応曲線及びＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して非線形回帰／４パラメータロジスティックフィットによって計算する。所与の抗体濃度について得られた溶解値を使用して、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して４パラメータロジスティックフィット分析によってシグモイド用量－反応曲線を計算する。
実施例３６
イオン化可能脂質の合成
３６．１ （（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノアート）（脂質２７、表１０ａ）及び（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノアート））（脂質２６、表１０ａ）の合成
凝縮器と接続された１００ｍＬの丸底フラスコ内で、３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロパン－１－アミン（１００ｍｇ、０．７９９ｍｍｏｌ）または３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロパン－１－アミン（０．７９９ｍｍｏｌ）、６－ブロモヘキシル２－ヘキシルデカノアート（７３７．２ｍｇ、１．７５７ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（４８５ｍｇ、３．５１５ｍｍｏｌ）及びヨウ化カリウム（１３ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３０ｍＬ）中で混合し、反応混合物を８０℃に４８時間加熱した。混合物を室温に冷却し、セライトのパッドを介してろ過した。ろ液を酢酸エチルで希釈した。水、ブラインで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させ、粗残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ＣＨ２Ｃｌ２＝ＣＨ２Ｃｌ２中の１００％～１０％のメタノール）によって精製し、無色の油生成物が得られた（９２ｍｇ、１５％）。（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノアート））の分子式はＣ５０Ｈ９５Ｎ３Ｏ４であり、分子量（Ｍｗ）は８０１．７である。
（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノアート））（脂質２６、表１０ａ）の合成のための反応スキーム。
Figure 2023525270000567
脂質２６の特徴評価をＬＣ－ＭＳによって実施した。図２７Ａ～Ｃは、脂質２６の特徴評価を示している。図２７Ａは、脂質２６について観察されたプロトンＮＭＲを示している。図２７Ｂは、示される総イオン及びＵＶクロマトグラムを伴う脂質２６についての代表的なＬＣ／ＭＳトレースである。
３６．２ 脂質２２－Ｓ１４の合成
３６．２．１ ２－（テトラデシルチオ）エタン－１－オールの合成
アセトニトリル（２００ｍＬ）中の２－スルファニルエタノール（５．４０ｇ、６９．１１ｍｍｏｌ、４．８２ｍＬ、０．８７１ｅｑ）の混合物に１－ブロモテトラデカン（２２ｇ、７９．３４ｍｍｏｌ、２３．６６ｍＬ、１ｅｑ）及び炭酸カリウム（１７．５５ｇ、１２６．９５ｍｍｏｌ、１．６ｅｑ）を２５℃で添加した。反応混合物を４０℃に温め、１２時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル／石油エーテル＝２５／１、Ｒｆ＝０．３、Ｉ２によって染色）は、出発物質が完全に消費され、新たな主要なスポットが生成されたことを示した。反応混合物をろ過し、フィルターケーキをアセトニトリル（５０ｍＬ）で洗浄し、次いでろ液を真空下で濃縮して残渣を得、これをシリカゲル上のカラム（酢酸エチル／石油エーテル＝１／１００～１／２５）によって精製して２－（テトラデシルチオ）エタン－１－オール（１４ｇ、収率６４．２８％）を白色の固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ （ＥＴ３６３８７－４５－Ｐ１Ａ， ４００ ＭＨｚ， クロロホルム－ｄ） δ ０．８７ － ０．９１ （ｍ， ３ Ｈ） １．２７ （ｓ， ２０ Ｈ） １．３５ － １．４３ （ｍ， ２ Ｈ） １．５３ － １．６４ （ｍ， ２ Ｈ） ２．１６ （ｂｒ ｓ， １ Ｈ） ２．４９ － ２．５６ （ｍ， ２ Ｈ） ２．７４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．９３ Ｈｚ， ２ Ｈ） ３．７２ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ４．８９ Ｈｚ， ２ Ｈ）。図２８は、対応する核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示している。
３８．２．２ ２－（テトラデシルチオ）エチルアクリラートの合成
ジクロロメタン（２４０ｍＬ）中の２－（テトラデシルチオ）エタン－１－オール（１４ｇ、５１．００ｍｍｏｌ、１ｅｑ）の溶液にトリエチルアミン（７．７４ｇ、７６．５０ｍｍｏｌ、１０．６５ｍＬ、１．５ｅｑ）及びプロプ－２－エノイルクロリド（５．５４ｇ、６１．２０ｍｍｏｌ、４．９９ｍＬ、１．２ｅｑ）を０℃で窒素下で滴下して添加した。反応混合物を２５℃に温め、１２時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル／石油エーテル＝２５／１、Ｒｆ＝０．５、Ｉ２によって染色）は、出発物質が完全に消費され、新たな主要なスポットが生成されたことを示した。反応溶液を真空下で濃縮して残渣を得、これをシリカゲル上のカラム（酢酸エチル／石油エーテル＝１／１００～１／２５）によって精製して２－（テトラデシルチオ）エチルアクリラート（１２ｇ、収率７１．６１％）を無色の油として得た。
１Ｈ ＮＭＲ （ＥＴ３６３８７－４９－Ｐ１Ａ， ４００ ＭＨｚ， クロロホルム－ｄ） δ ０．８５ － ０．９３ （ｍ， ３ Ｈ） １．２６ （ｓ， １９ Ｈ） １．３５ － １．４３ （ｍ， ２ Ｈ） １．５３ － １．６５ （ｍ， ２ Ｈ） ２．５３ － ２．６２ （ｍ， ２ Ｈ） ２．７９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０３ Ｈｚ， ２ Ｈ） ４．３２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０３ Ｈｚ， ２ Ｈ） ５．８６ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．３９， １．４７ Ｈｚ， １ Ｈ） ６．０９ － ６．１９ （ｍ， １ Ｈ） ６．４３ （ｄｄ， Ｊ ＝ １７．３０， １．４１ Ｈｚ， １ Ｈ）．図２９は、対応する核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示している。
３６．２．３ ビス（２－（テトラデシルチオ）エチル）３，３’－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ジプロピオナート（脂質２２－Ｓ１４）の合成
フラスコに３－（２－メチル－１－イミダゾール－１－イル）プロパン－１－アミン（３００ｍｇ、２．１６ｍｍｏｌ）及び２－（テトラデシルチオ）エチルアクリラート（１．７０ｇ、５．１７ｍｍｏｌ）を入れた。そのままの反応混合物を８０℃に加熱し、４８時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル、Ｒｆ＝０．３、Ｉ２によって染色、１滴の水酸化アンモニウムを添加）は、出発物質が完全に消費され、新たな主要なスポットが形成されたことを示した。反応混合物をジクロロメタン（４ｍＬ）で希釈し、シリカゲル上のカラム（石油エーテル／酢酸エチル＝３／１～０／１、０．１％水酸化アンモニウムを添加）によって精製してビス（２－（テトラデシルチオ）エチル）３，３’－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ジプロピオナート（５０１ｍｇ、収率２９．１％）を無色の油として得た。
１Ｈ ＮＭＲ （ＥＴ３６３８７－５１－Ｐ１Ａ， ４００ ＭＨｚ， クロロホルム－ｄ） δ ０．８７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７３ Ｈｚ， ６ Ｈ） １．２５ （ｓ， ４０ Ｈ） １．３３ － １．４０ （ｍ， ４ Ｈ） １．５２ － １．６１ （ｍ， ４ Ｈ） １．８１ － １．９０ （ｍ， ２ Ｈ） ２．３６ （ｓ， ３ Ｈ） ２．３９ － ２．４６ （ｍ， ６ Ｈ） ２．５３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．３９ Ｈｚ， ４ Ｈ） ２．７０ － ２．７８ （ｍ， ８ Ｈ） ３．８４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１７ Ｈｚ， ２ Ｈ） ４．２１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９５ Ｈｚ， ４ Ｈ） ６．８５ （ｓ， １ Ｈ） ６．８９ （ｓ， １ Ｈ）。図３０は、対応する核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示している。
３６．３ ビス（２－（テトラデシルチオ）エチル）３，３’－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ジプロピオナート（脂質９３－Ｓ１４）の合成
フラスコに３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロパン－１－アミン（３００ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ、１ｅｑ）及び２－（テトラデシルチオ）エチルアクリラート（１．８９ｇ、５．７５ｍｍｏｌ、２．４ｅｑ）を入れた。そのままの反応混合物を８０℃に加熱し、４８時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル、Ｒｆ＝０．３、Ｉ２によって染色、１滴の水酸化アンモニウムを添加）は、出発物質が完全に消費され、新たな主要なスポットが形成されたことを示した。反応混合物をジクロロメタン（４ｍＬ）で希釈し、シリカゲル上のカラム（石油エーテル／酢酸エチル＝１／２０～０／１００、０．１％水酸化アンモニウムを添加）によって精製してビス（２－（テトラデシルチオ）エチル）３，３’－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ジプロピオナート（５１２ｍｇ、収率２７．２２％）を無色の油として得た。
１Ｈ ＮＭＲ （ＥＴ３６３８７－５４－Ｐ１Ａ， ４００ ＭＨｚ， クロロホルム－ｄ） δ ０．８９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８４ Ｈｚ， ６ Ｈ） １．２６ （ｓ， ４０ Ｈ） １．３４ － １．４１ （ｍ， ４ Ｈ） １．５８ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ７．５０ Ｈｚ， ４ Ｈ） １．９２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６２ Ｈｚ， ２ Ｈ） ２．３６ － ２．４６ （ｍ， ６ Ｈ） ２．５５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５０ Ｈｚ， ４ Ｈ） ２．７５ （ｑ， Ｊ ＝ ６．８４ Ｈｚ， ８ Ｈ） ３．９７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９５ Ｈｚ， ２ Ｈ） ４．２３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９５ Ｈｚ， ４ Ｈ） ６．９５ （ｓ， １ Ｈ） ７．０６ （ｓ， １ Ｈ） ７．５１ （ｓ， １ Ｈ）。図３１は、対応する核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示している。
３６．４ ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノアート（脂質５４、表１０ａ）の合成
３６．４．１ ノニル８－ブロモオクタノアート（３）の合成
Figure 2023525270000568
ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）中の８－ブロモオクタン酸（２）（１８．６ｇ、８３．１８ｍｍｏｌ）及びノナン－１－オール（１）（１０ｇ、６９．３２ｍｍｏｌ）の混合物にＤＭＡＰ（１．７ｇ、１３．８６ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（４８ｍＬ、２７７．３ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（１６ｇ、８３．１８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。反応混合物の濃縮後、粗残渣を酢酸エチル（５００ｍＬ）に溶解し、１ＮのＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、水及びブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、粗残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ヘキサン＝ヘキサン中の１００％～３０％のＥｔＯＡｃ）によって精製し、無色の油生成物３が得られた（９ｇ、３７％）。
３６．４．２ ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（５）の合成
Figure 2023525270000569
ＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）中の８－ブロモオクタン酸（２）（１０ｇ、４４．８２ｍｍｏｌ）及びヘプタデカン－９－オール（４）（９．６ｇ、３７．３５ｍｍｏｌ）の混合物にＤＭＡＰ（９００ｍｇ、７．４８ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２６ｍＬ、１４９．７ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（１０．７ｇ、５６．０３ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。反応混合物の濃縮後、粗残渣を酢酸エチル（３００ｍＬ）に溶解し、１ＮのＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、水及びブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、粗残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ヘキサン＝ヘキサン中の１００％～の３０％のＥｔＯＡｃ）によって精製し、無色の油生成物５が得られた（５ｇ、２９％）。
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ ４．８６ （ｍ， １Ｈ）， ３．３９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８４ （ｍ， ２Ｈ）， １．６２ （ｍ， ２Ｈ）， １．５－１．４ （ｍ， ８Ｈ），１．３５－１．２ （ｍ， ２６Ｈ） ０．８７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ６Ｈ）。
３６．４．３ ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アミノ）オクタノアート（７）の合成
Figure 2023525270000570
凝縮器に接続された１００ｍＬの丸底フラスコ内で、ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（５）（８６０ｍｇ、１．８６８ｍｍｏｌ）及び３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロパン－１－アミン（６）（１．３ｇ、９．３３９ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）中で混合した。反応混合物を一晩加熱して還流した。ＭＳ（ＡＰＣＩ）は、予期された生成物を示した。混合物を室温に冷却し、濃縮した。粗残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ＣＨ２Ｃｌ２＝ＣＨ２Ｃｌ２中の１００％～１０％のメタノール＋１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製し、無色の油生成物７が得られた（６６５ｍｇ、６９％）。
３６．４．４ ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノアート（脂質５４、表１０ａ）の合成
Figure 2023525270000571
凝縮器に接続された１００ｍＬの丸底フラスコ内で、ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アミノ）オクタノアート（７）（６６５ｍｇ、１．２７９ｍｍｏｌ）及びノニル８－ブロモオクタノアート（３）（５３６ｍｇ、１．５３５ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）中で混合し、次いでＤＩＰＥＡ（０．５５ｍＬ、３．１９８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩加熱して還流した。ＭＳ（ＡＰＣＩ）及びＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中の１０％ＭｅＯＨ＋１％ＮＨ４ＯＨ）はいずれも、生成物及びいくつかの未反応出発物質を示した。混合物を室温に冷却し、濃縮した。粗残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ＣＨ２Ｃｌ２＝ＣＨ２Ｃｌ２中の１００％～１０％のメタノール＋１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製し、無色の油が得られた（１７０ｍｇ、１７％）。
３６．５ ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノアート（脂質５３、表１０ａ）の合成
Figure 2023525270000572
表１０ａからの脂質５３を上のスキームに従って合成する。反応条件は、イミダゾールアミンとしての３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロパン－１－アミンを除き、脂質５４と同一である。
３６．６ ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノアート（脂質４５、表１０ａ）の合成
３６．６．１ ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（３）の合成
Figure 2023525270000573
ＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）中の８－ブロモオクタン酸（２）（１０ｇ、４４．８２ｍｍｏｌ）及びヘプタデカン－９－オール（１）（９．６ｇ、３７．３５ｍｍｏｌ）の混合物にＤＭＡＰ（９００ｍｇ、７．４８ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２６ｍＬ、１４９．７ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（１０．７ｇ、５６．０３ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。反応混合物の濃縮後、粗残渣を酢酸エチル（３００ｍＬ）に溶解し、１ＮのＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、水及びブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、粗残渣を、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ヘキサン＝ヘキサン中の１００％～３０％のＥｔＯＡｃ）によって精製し、無色の油生成物３が得られた（５ｇ、２９％）。
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ ４．８６ （ｍ， １Ｈ）， ３．３９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８４ （ｍ， ２Ｈ）， １．６２ （ｍ， ２Ｈ）， １．５－１．４ （ｍ， ８Ｈ），１．３５－１．２ （ｍ， ２６Ｈ） ０．８７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ６Ｈ）。
３６．６．２ ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アミノ）オクタノアート（６）の合成
Figure 2023525270000574
凝縮器に接続された１００ｍＬの丸底フラスコ内で、ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（３）（１ｇ、２．１６７ｍｍｏｌ）及び３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロパン－１－アミン（４）（１．３ｍＬ、１０．８３ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）中で混合した。反応混合物を一晩加熱して還流した。ＭＳ（ＡＰＣＩ）は、予期された生成物を示した。混合物を室温に冷却し、濃縮した。粗残渣を、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ＣＨ２Ｃｌ２＝ＣＨ２Ｃｌ２中の１００％～１０％のメタノール＋１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製し、無色の油生成物６が得られた（４９８ｍｇ、４５％）。
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ ７．４７ （ｓ， １Ｈ）， ７．０４ （ｓ， １Ｈ）， ６．９１ （ｓ， １Ｈ）， ４．８５ （ｍ， １Ｈ）， ４．０３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５６ （ｄｄ， Ｊ ＝ １４．５， ７．４ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９２ （ｍ， ２Ｈ）， １．６０ （ｍ， ２Ｈ）， １．４８ （ｍ， ６Ｈ）， １．３０－１．２０ （ｍ， ３１Ｈ）， ０．８６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ６Ｈ）．ＭＳ （ＡＰＣＩ＋）： ５０６．４ （Ｍ＋１）。
３６．６．３ ノニル８－ブロモオクタノアート（９）の合成
Figure 2023525270000575
ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）中の８－ブロモオクタン酸（２）（１８．６ｇ、８３．１８ｍｍｏｌ）及びノナン－１－オール（８）（１０ｇ、６９．３２ｍｍｏｌ）の混合物にＤＭＡＰ（１．７ｇ、１３．８６ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（４８ｍＬ、２７７．３ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（１６ｇ、８３．１８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。反応混合物の濃縮後、粗残渣を酢酸エチル（５００ｍＬ）に溶解し、１ＮのＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、水及びブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、粗残渣を、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ヘキサン＝ヘキサン中の１００％～３０％のＥｔＯＡｃ）によって精製し、無色の油生成物９が得られた（９ｇ、３７％）。
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８４ （ｍ， ２Ｈ）， １．６２－１．５６ （ｍ， ６Ｈ）， １．４０－１．２０ （ｍ， １６Ｈ）， ０．８７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ３Ｈ）。
３６．６．４ ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノアートの合成
Figure 2023525270000576
凝縮器に接続された１００ｍＬの丸底フラスコ内で、ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アミノ）オクタノアート（６）（２４２ｍｇ、０．４７８ｍｍｏｌ）及びノニル８－ブロモオクタノアート９（２００ｍｇ、０．５７４ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）中で混合し、次いでＤＩＰＥＡ（０．２ｍＬ、１．１９６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩加熱して還流した。ＭＳ（ＡＰＣＩ）及びＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中の１０％ＭｅＯＨ＋１％ＮＨ４ＯＨ）はいずれも、生成物及びいくつかの未反応出発物質を示した。混合物を室温に冷却し、濃縮した。粗残渣を、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ＣＨ２Ｃｌ２＝ＣＨ２Ｃｌ２中の１００％～１０％のメタノール＋１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製し、無色の油が得られた（３５ｍｇ、１０％）。
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ ７．４６ （ｓ， １Ｈ）， ７．０５ （ｓ， １Ｈ）， ６．９０ （ｓ， １Ｈ）， ４．８５ （ｍ， １Ｈ）， ４．０４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．０１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３８ （ｍ， ６Ｈ）， ２．２７ （ｔ， Ｊ ＝ ３．８ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．８９ （ｍ， ２Ｈ）， １．６０－１．５８ （ｍ， １２Ｈ）， １．４８ （ｍ， ６Ｈ）， １．３０－１．２０ （ｍ， ４７Ｈ）， ０．８７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ９Ｈ）．ＭＳ （ＡＰＣＩ＋）： ７７４．６ （Ｍ＋１）。
３６．７ ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノアート（脂質４６、表１０ａ）の合成
Figure 2023525270000577
表１０ａからの脂質４６を、上のスキームに従って合成する。反応条件は、イミダゾールアミンとしての３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロパン－１－アミンを除き、脂質４５と同一である。
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ ６．８９ （ｓ， １Ｈ）， ６．８１ （ｓ， １Ｈ）， ４．８６ （ｍ， １Ｈ）， ４．０４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３８－２．３６ （ｍ， ９Ｈ）， ２．２８ （ｍ， ４Ｈ）， １．８２ （ｍ， ２Ｈ）， １．７２－１．５６ （ｍ， １２Ｈ）， １．４８ （ｍ， ４Ｈ）， １．３０－１．２０ （ｍ， ４６Ｈ）， ０．８６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ９Ｈ）．ＭＳ （ＡＰＣＩ＋）： ７８９．７ （Ｍ＋１）。
３６．８ ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－オキソ－８－（ウンデカン－３－イルオキシ）オクチル）アミノ）オクタノアート（脂質１３７、表１０ａ）の合成
３６．８．１ ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（３）の合成
Figure 2023525270000578
ＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）中の８－ブロモオクタン酸（２）（１０ｇ、４４．８２ｍｍｏｌ）及びヘプタデカン－９－オール（１）（９．６ｇ、３７．３５ｍｍｏｌ）の混合物にＤＭＡＰ（９００ｍｇ、７．４８ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２６ｍＬ、１４９．７ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（１０．７ｇ、５６．０３ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。反応混合物の濃縮後、粗残渣を酢酸エチル（３００ｍＬ）に溶解し、１ＮのＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、水及びブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、粗残渣を、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ヘキサン＝ヘキサン中の１００％～３０％のＥｔＯＡｃ）によって精製し、無色の油生成物３が得られた（５ｇ、２９％）。
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ ４．８６ （ｍ， １Ｈ）， ３．３９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８４ （ｍ， ２Ｈ）， １．６２ （ｍ， ２Ｈ）， １．５－１．４ （ｍ， ８Ｈ），１．３５－１．２ （ｍ， ２６Ｈ） ０．８７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ６Ｈ）。
３６．８．２ ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アミノ）オクタノアート（６）の合成
Figure 2023525270000579
凝縮器に接続された１００ｍＬの丸底フラスコ内で、ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（３）（１ｇ、２．１６７ｍｍｏｌ）及び３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロパン－１－アミン（４）（１．３ｍＬ、１０．８３ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）中で混合した。反応混合物を一晩加熱して還流した。ＭＳ（ＡＰＣＩ）は、予期された生成物を示した。混合物を室温に冷却し、濃縮した。粗残渣を、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ＣＨ２Ｃｌ２＝ＣＨ２Ｃｌ２中の１００％～１０％のメタノール＋１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製し、無色の油生成物６が得られた（４９８ｍｇ、４５％）。
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ ７．４７ （ｓ， １Ｈ）， ７．０４ （ｓ， １Ｈ）， ６．９１ （ｓ， １Ｈ）， ４．８５ （ｍ， １Ｈ）， ４．０３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５６ （ｄｄ， Ｊ ＝ １４．５， ７．４ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９２ （ｍ， ２Ｈ）， １．６０ （ｍ， ２Ｈ）， １．４８ （ｍ， ６Ｈ）， １．３０－１．２０ （ｍ， ３１Ｈ）， ０．８６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ６Ｈ）．ＭＳ （ＡＰＣＩ＋）： ５０６．４ （Ｍ＋１）．
３６．８．３ ウンデカン－３－オール（１１）の合成
Figure 2023525270000580
０℃の氷水浴の無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のノナナール（１０）（５ｇ、３５．２ｍｍｏｌ）の混合物に、臭化エチルマグネシウム（４７ｍＬ、４２．２ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中０．９Ｍ）を滴下して添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。反応を氷でクエンチし、酢酸エチル（５００ｍＬ）で希釈し、１ＮのＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、水及びブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、粗残渣を、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ヘキサン＝ヘキサン中の１００％～５０％のＥｔＯＡｃ）によって精製し、無色の油生成物１１が得られた（４ｇ、６６％）。
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ ３．５２ （ｍ， １Ｈ）， １．５６－１．３ （ｍ， ４Ｈ）， １．３－１．２０ （ｍ， １２Ｈ）， ０．９３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．８７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ３Ｈ）。
３６．８．４ ウンデカン－３－イル８－ブロモオクタノアート（１２）の合成
Figure 2023525270000581
ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中の８－ブロモオクタン酸（２）（６．２ｇ、２７．９ｍｍｏｌ）及びウンデカン－３－オール（１１）（４ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）の混合物にＤＭＡＰ（５６７．２ｍｇ、４．６４ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１６．２ｍＬ、９２．９ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（６．７ｇ、３４．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。反応混合物の濃縮後、粗残渣を酢酸エチル（５００ｍＬ）に溶解し、１ＮのＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、水及びブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、粗残渣を、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ヘキサン＝ヘキサン中の１００％～３０％のＥｔＯＡｃ）によって精製し、無色の油生成物１２が得られた（７．３ｇ、８３％）。
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ ４．８０ （ｍ， １Ｈ）， ３．３９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８４ （ｍ， ２Ｈ）， １．６－１．３５ （ｍ， ８Ｈ）， １．３５－１．２ （ｍ， １６Ｈ）， ０．８７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ６Ｈ）。
３６．８．４ ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノアートの合成
Figure 2023525270000582
凝縮器に接続された１００ｍＬの丸底フラスコ内で、ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アミノ）オクタノアート（６）（２４２ｍｇ、０．４７８ｍｍｏｌ）及びウンデカン－３－イル８－ブロモオクタノアート（１２）（２００ｍｇ、０．５７４ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）中で混合し、次いでＤＩＰＥＡ（０．２ｍＬ、１．１９６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩加熱して還流した。ＭＳ（ＡＰＣＩ）及びＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中の１０％ＭｅＯＨ＋１％ＮＨ４ＯＨ）はいずれも、生成物及びいくつかの未反応出発物質を示した。混合物を室温に冷却し、濃縮した。粗残渣を、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ＣＨ２Ｃｌ２＝ＣＨ２Ｃｌ２中の１００％～１０％のメタノール＋１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製し、無色の油が得られた（３５ｍｇ、１０％）。
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ ７．４５ （ｓ， １Ｈ）， ７．０４ （ｓ， １Ｈ）， ６．９０ （ｓ， １Ｈ）， ４．８２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３５ （ｍ， ６Ｈ）， ２．２７ （ｔ， Ｊ ＝ ３．８ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．８９ （ｍ， ２Ｈ）， １．６０－１．４８ （ｍ， １４Ｈ）， １．３０－１．２０ （ｍ， ５０Ｈ）， ０．８７ （ｍ， １２Ｈ）．ＭＳ （ＡＰＣＩ＋）： ８０２．８。
３６．９ ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノアート（脂質１３８、表１０ａ）の合成
Figure 2023525270000583
表１０ａからの脂質１３８を、上のスキームに従って合成する。反応条件は、イミダゾールアミンとしての３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロパン－１－アミンを除き、脂質１３７と同一である。
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ ６．８９ （ｓ， １Ｈ）， ６．８１ （ｓ， １Ｈ）， ４．８２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．８６ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３８－２．３ （ｍ， ９Ｈ）， ２．２７ （ｔ， Ｊ ＝ ３．８ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．８４ （ｍ， ２Ｈ）， １．６０－１．３７ （ｍ， １４Ｈ）， １．３０－１．２０ （ｍ， ５０Ｈ）， ０．８７ （ｍ， １２Ｈ）。ＭＳ （ＡＰＣＩ＋）： ８１６．８ （Ｍ＋１）。
３６．１０ （（（２－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）エチル）アザネジルｌ）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノアート（脂質１３９、表１０ａ）の合成
３６．１０．１ ６－ブロモヘキシル２－ヘキシルデカノアート（３）の合成
Figure 2023525270000584
ＣＨ２Ｃｌ２（１Ｌ）中の２－ヘキシルデカン酸（１）（１０２ｇ、０．３９８ｍｏｌ）及び６－ブロモ－１－ヘキサノール（２）（６０ｇ、０．３３１ｍｏｌ）の混合物に、ＤＭＡＰ（８．１ｇ、６６ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２３０ｍＬ、１．３２５ｍｏｌ）及びＥＤＣ（７６ｇ、０．３９８ｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。反応混合物の濃縮後、粗残渣を酢酸エチル（１Ｌ）に溶解し、１ＮのＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、水及びブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、粗残渣を、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ヘキサン＝ヘキサン中の１００％～３０％のＥｔＯＡｃ）によって精製し、無色の油生成物３が得られた（６７ｇ、４８％）。
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ ４．０６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３ （ｍ， １Ｈ）， １．８６ （ｍ， ２Ｈ）， １．６４ （ｍ， ２Ｈ）， １．５－１．４ （ｍ， ２Ｈ），１．３５－１．２ （ｍ， ２６Ｈ） ０．８７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ６Ｈ）。
３６．１０．２ ６－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ブチル）アミノ）ヘキシル２－ヘキシルデカノアート（７ａ）の合成
Figure 2023525270000585
凝縮器に接続された１００ｍＬの丸底フラスコ内で、６－ブロモヘキシル２－ヘキシルデカノアート（３）（１．２ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及び３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ブタン－１－アミン（７）（２ｇ、１４．３７ｍｍｏｌ）をエタノール（２０ｍＬ）中で混合した。反応混合物を一晩加熱して還流した。ＭＳ（ＡＰＣＩ）は、予期された生成物を示した。混合物を室温に冷却し、濃縮した。粗残渣を、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ＣＨ２Ｃｌ２＝ＣＨ２Ｃｌ２中の１００％～１０％のメタノール＋１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製し、無色の油生成物７ａが得られた（６２６ｍｇ、４６％）。
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ ７．５１ （ｓ， １Ｈ）， ７．０５ （ｓ， １Ｈ）， ６．９３ （ｓ， １Ｈ）， ４．３５ （ｍ， １Ｈ）， ４．０４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６－２．４ （ｍ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｍ， １Ｈ）， １．９４ （ｔｄ， Ｊ ＝ １４， ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６４－１．５６ （ｍ， ４Ｈ）， １．４７ （ｓ， ３Ｈ）， １．４２－１．２０ （ｍ， ２９Ｈ）， ０．８６ （ｍ， ６Ｈ）。ＭＳ （ＡＰＣＩ＋）： ４７８．８ （Ｍ＋１）
３６．１０．２ （（２－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）エチル）アザネジルｌ）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノアートの合成
Figure 2023525270000586
凝縮器に接続された１００ｍＬの丸底フラスコ内で、６－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ブチル）アミノ）ヘキシル２－ヘキシルデカノアート（７ａ）（６２６ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ）及び６－ブロモヘキシル２－ヘキシルデカノアート（３）（５５０ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ）をエタノール（２０ｍＬ）中で混合し、次いでＤＩＰＥＡ（０．６ｍＬ、３．２７６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩加熱して還流した。ＭＳ（ＡＰＣＩ）及びＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中の１０％ＭｅＯＨ＋１％ＮＨ４ＯＨ）はいずれも、生成物及び未反応出発物質７ａを示した。混合物を室温に冷却し、濃縮した。粗残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ＣＨ２Ｃｌ２＝ＣＨ２Ｃｌ２中の１００％～１０％のメタノール＋１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製し、得られた生成物をさらに、Ｃ１８逆相クロマトグラフィー（Ｈ２Ｏ＝９５％～０．１％、ＣＨ３ＣＮ中ＴＦＡ＝１００％）によって精製し、無色の油（ＴＦＡ塩）が得られた（１４０ｍｇ、１３％）。
１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ６．８７ （ｓ， １Ｈ）， ６．８３ （ｓ， １Ｈ）， ４，０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ４Ｈ）， ３．８４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４５－２．２０ （ｍ， ６Ｈ）， ２．３７ （ｓ， ３Ｈ）， １．６５－１．５０ （ｍ， ８Ｈ）， １．５－１．１ （ｍ， ５６Ｈ）， ０．８６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， １２Ｈ）。ＭＳ（ＡＰＣＩ＋）：８０２。６（Ｍ＋１）。
３６．１１ （（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）アザネジルｌ）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノアート）（脂質１３０、表１０ａ）の合成
Figure 2023525270000587
表１０ａからの脂質１３０を、上のスキームに従って合成する。反応条件は、イミダゾールアミンとしての３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ブチルアミンを除き、脂質１３９と同一である。
３６．１２ （（（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）アザネジルｌ）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノアート）（脂質１２８、表１０ａ）の合成
Figure 2023525270000588
表１０ａからの脂質１２８を、上のスキームに従って合成する。反応条件は、イミダゾールアミンとしての１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチルアミンを除き、脂質１３９と同一である。
１Ｈ－ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ６．８９ （ｄ， Ｊ ＝ １．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８１ （ｄ， Ｊ ＝ １．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４，０３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ４Ｈ）， ３．６８ （ｓ， ３Ｈ）， ３．６２ （ｓ， ２Ｈ）， ２．４５－２．２０ （ｍ， ６Ｈ）， １．６５－１．５０ （ｍ， ８Ｈ）， １．５－１．３５ （ｍ， ８Ｈ）， １．３５－１．１０ （ｍ， ４８Ｈ）， ０．８６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， １２Ｈ）。ＭＳ（ＡＰＣＩ＋）：７８７．６（Ｍ＋１）。
実施例３７
環状ＲＮＡを有する脂質ナノ粒子製剤
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を「ＮｅｘｔＧｅｎ」混合チャンバーを有するＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｇｎｉｔｅ装置を使用して形成した。表１０ａからのイオン化可能脂質２６、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）を１６：１：４：１の重量比または６２：４：３３：１のモル比で含有していたエタノール相を、環状ＲＮＡ及び２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を含有する水相とｐＨ５．２で合わせた。３：１の水対エタノールの混合比を使用した。次いで、製剤化されたＬＮＰを１Ｌの水で透析し、１８時間かけて２回交換した。透析したＬＮＰを０．２μｍフィルターでろ過した。ｉｎ ｖｉｖｏ投与の前に、ＬＮＰをＰＢＳに希釈した。ＬＮＰサイズは、動的光散乱によって決定した。１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２０μｇ／ｍＬのＬＮＰを有するキュベットをＭａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｐｒｏを使用してＺ平均について測定した。Ｚ平均及び多分散性指数を記録した。
３９．１ 表１０ａからの脂質２６及び２７の製剤
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を「ＮｅｘｔＧｅｎ」混合チャンバーを有するＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｇｎｉｔｅ装置を使用して形成した。表１０ａからのイオン化可能脂質２６または脂質２７、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）を１６：１：４：１の重量比または６２：４：３３：１のモル比で含有していたエタノール相を、環状ＲＮＡ及び２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を含有する水相とｐＨ５．２で合わせた。３：１の水対エタノールの混合比を使用した。次いで、製剤化されたＬＮＰを１Ｌの水で透析し、１８時間かけて２回交換した。透析したＬＮＰを０．２μｍフィルターでろ過した。ｉｎ ｖｉｖｏ投与の前に、ＬＮＰをＰＢＳに希釈した。ＬＮＰサイズは、動的光散乱によって決定した。１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２０μｇ／ｍＬのＬＮＰを有するキュベットをＭａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｐｒｏを使用してＺ平均について測定した。Ｚ平均及び多分散性指数を記録した。
３９．２ 表１０ａからの脂質５３及び５４の製剤
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を「ＮｅｘｔＧｅｎ」混合チャンバーを有するＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｇｎｉｔｅ装置を使用して形成した。表１０ａのイオン化可能脂質５３または５４、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）を５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含有していたエタノール相を、環状ＲＮＡ及び２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を含有する水相とｐＨ５．２で合わせた。３：１の水対エタノールの混合比を使用した。次いで、製剤化されたＬＮＰを１Ｌの１ｘＰＢＳで透析し、１８時間かけて２回交換した。透析したＬＮＰを０．２μｍフィルターでろ過した。ｉｎ ｖｉｖｏ投与の前に、ＬＮＰをＰＢＳに希釈した。ＬＮＰサイズは、動的光散乱によって決定した。１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２０μｇ／ｍＬのＬＮＰを有するキュベットをＭａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｐｒｏを使用してＺ平均について測定した。Ｚ平均及び多分散性指数を記録した。
ＬＮＰのゼータ電位は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｐｒｏを使用して測定した。水中の２００μＬの粒子溶液及び８００μＬの蒸留したＲＮＡｓｅ不含水を含有する混合物（４００μｇ／ｍＬの最終粒子濃度を有する）を分析のためのゼータサイザーキャピラリーセルにロードした。
ＲＮＡ封入をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイを使用して決定した。ナノ粒子溶液を２μｇ／ｍＬの理論的ｏＲＮＡ濃度でトリス－エチレンジアミン四酢酸（ＴＥ）緩衝液に希釈した。ＴＥ緩衝液で希釈した標準ｏＲＮＡ溶液を２μｇ／ｍＬ～０．１２５μｇ／ｍＬの範囲で作製した。粒子及び標準を全てのウェルに添加し、第２のインキュベーションを実施した（３７℃で３５０ｒｐｍにて３分間）。蛍光を、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ（登録商標）ＧＥＭＩＮＩ ＸＳマイクロプレート蛍光光度計を使用して測定した。各粒子溶液中の環状ＲＮＡの濃度を標準曲線を使用して計算した。封入効率を、溶解した粒子と溶解していない粒子の間で検出されたｏＲＮＡの比から計算した。
（表３６ａ）
Figure 2023525270000589
（表３６ｂ）
Figure 2023525270000590
実施例３８
ｉｎ ｖｉｖｏ分析
２２～２５ｇの範囲の雌ＣＤ－１または雌ｃ５７ＢＬ／６Ｊ＿マウスに０．５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡを静脈内に投与した。注射から６時間後、マウスに２００μＬのＤ－ルシフェリンを１５ｍｇ／ｍＬ濃度で腹腔内に注射した。注射から５分後、マウスをイソフルランを使用して麻酔し、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）内に背面を上にして入れた。脂質２２－Ｓ１４、９３－Ｓ１４、脂質２６（表１０ａ）の全身総ＩＶＩＳフラックスが図３２Ａに示されている。注射から１０分後、マウスを発光についてスキャンした。マウスを安楽死させ、器官をルシフェリン注射から２５分以内に抽出して肝臓、脾臓、腎臓、肺、及び心臓における発光についてスキャンした。画像（図３３のＡ及びＢ、図３４のＡ及びＢ、図３５のＡ及びＢ）をＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）ソフトウェアを使用して分析した。
図３２のＡは、脂質２２－Ｓ１４及び９３－Ｓ１４を用いて作製されたＬＮＰと比較して、脂質２６（表１０ａ）ＬＮＰでルシフェラーゼｏＲＮＡから観察された増加した全身ｔｏｔａｌ ｆｌｕｘを示している。図３２のＢは、発現を改善するために設計された有意な構造変化にもかかわらず、脂質２２－Ｓ１４及び９３－Ｓ１４で観察された所望の脾臓対肝臓比を維持しながら、脂質２６（表１０ａ）を用いて増加した全体的発現をさらに強調する組織のｅｘ ｖｉｖｏ ＩＶＩＳ分析を示している。これらのデータは、先行して報告された脂質と比較して、脂質２６（表１０ａ）によって得られた改善を強調する。
表１０ｂからの脂質１５または表１０ａからの脂質５３もしくは５４を用いて形成されたＬＮＰに封入されたｏＲＮＡで上述した同様の分析も実施した。図３６Ａ～図３６Ｃは、発現を改善するために設計された有意な構造変化にもかかわらず、所望の脾臓対肝臓比を維持しながら、脂質１５、５３、及び５４を用いて全体的発現をそれぞれ強調する組織のｅｘ ｖｉｖｏ ＩＶＩＳ分析を示している。図３６Ｄは、ＰＢＳ対照についての結果を示している。これらのデータは、９３－Ｓ１４及び２２－Ｓ１４等の先行して報告された脂質と比較した、表１０ａからの脂質１５、５３、及び５４によって得られる改善を実証している。
実施例３９
ルシフェラーゼの送達
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、ホタルルシフェラーゼ（ｆ．ｌｕｃ）環状ＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）をトランスフェクトし、ルシフェラーゼ発現について試験した。２人の異なるドナーからのＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ、２％ヒト血清、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）、及び５０ｕＭのＢＭＥ中で３７℃で、ホタルルシフェラーゼをコードする環状ＲＮＡ（２００ｎｇ）を含有する５つの異なるＬＮＰ組成物とインキュベートした。ＬＮＰを用いずにインキュベートされたＰＢＭＣを陰性対照として使用した。２４時間後、細胞を溶解し、生物発光（Ｐｒｏｍｅｇａ ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ）に基づいてホタルルシフェラーゼ発現について分析した。
代表的なデータが図３７Ａ及び３７Ｂに示されており、試験されたＬＮＰは、初代ヒト免疫細胞へ環状ＲＮＡを送達し、タンパク質発現をもたらす能力があることを示している。
実施例４０
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ送達
ヒトＰＢＭＣ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、ＧＦＰを封入しているＬＮＰをトランスフェクトし、フローサイトメトリーによって試験した。５人の異なるドナーからのＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ Ａ～Ｅ）を、ＧＦＰまたはＣＤ１９－ＣＡＲのいずれかをコードする環状ＲＮＡ（２００ｎｇ）を含有するＬＮＰ組成物の１つと共に、ＲＰＭＩ、２％ヒト血清、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）、及び５０ｕＭのＢＭＥ中で３７℃でインキュベートした。ＬＮＰを用いずにインキュベートされたＰＢＭＣを陰性対照として使用した。ＬＮＰインキュベーションから２４時間、４８時間、または７２時間後、細胞を、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、固定可能ｌｉｖｅ ｄｅａｄ、及びペイロード（ＧＦＰまたはＣＤ１９－ＣＡＲ）について分析した。
代表的なデータが図３８のＡ及びＢに示されており、試験されたＬＮＰは、初代ヒト免疫細胞へ環状ＲＮＡを送達し、タンパク質発現をもたらすことが可能であることを示している。
実施例４１
複数のＩＲＥＳバリアントは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでネズミＣＤ１９ ＣＡＲの発現を媒介し得る
抗ネズミＣＤ１９ ＣＡＲをコードする複数の環状ＲＮＡコンストラクトは、特有のＩＲＥＳ配列を含有し、これを１Ｃ１Ｃ７細胞株にリポトランスフェクトした。リポトランスフェクションの前に、１Ｃ１Ｃ７細胞を完全ＲＰＭＩで数日間増殖させる。細胞が適切な数まで増殖した後、１Ｃ１Ｃ７細胞に４つの異なる環状ＲＮＡコンストラクトをリポトランスフェクトした（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＲＮＡｉＭＡＸ）。２４時間後、１Ｃ１Ｃ７細胞をＨｉｓタグ化組換えネズミＣＤ１９（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）タンパク質とインキュベートし、次いで二次抗Ｈｉｓ抗体で染色した。その後、細胞をフローサイトメトリーを介して分析した。
代表的なデータが図３９に示されており、示されたウイルス（セスジネズミピコルナウイルス、ヤギコブウイルス、パラボウイルス、及びサリウイルス）に由来するＩＲＥＳは、ネズミＴ細胞において抗マウスＣＤ１９ ＣＡＲの発現を誘導する能力があることを示している。
実施例４２
ネズミＣＤ１９ ＣＡＲは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞殺傷を媒介する
抗マウスＣＤ１９ ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡをネズミＴ細胞にエレクトロポレーションしてＣＡＲ媒介細胞傷害を評価した。エレクトロポレーションのため、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用してＴ細胞を抗マウスＣＤ１９ ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡでエレクトロポレーションし、次いで一晩放置した。細胞傷害アッセイのため、エレクトロポレーションされたＴ細胞を、１０％ＦＢＳ、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）、及び５０ｕＭのＢＭＥを含有する完全ＲＰＭＩ中でＦｌｕｃ＋標的細胞及び非標的細胞と１：１の比で共培養し、３７℃で一晩インキュベートした。Ｆｌｕｃ＋標的細胞及び非標的細胞の溶解を検出するために、共培養から２４時間後にルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｒｉｇｈｔｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して細胞傷害を測定した。示された値は、トランスフェクトされていないモックシグナルと比べて計算される。
代表的なデータが図４０に示されており、環状ＲＮＡから発現した抗マウスＣＤ１９ ＣＡＲは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでネズミＴ細胞において機能的であることを示している。
実施例４３
ネズミＣＤ１９ ＣＡＲをコードする脂質封入環状ＲＮＡでのＢ細胞の機能的喪失
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、抗ネズミＣＤ１９ ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡを封入している、表１０ｂの脂質１５を用いて形成されたＬＮＰを注射した。対照として、ホタルルシフェラーゼ（ｆ．Ｌｕｃ）をコードする環状ＲＮＡを封入している表１０ｂの脂質１５を異なる群のマウスに注射した。２０～２５ｇの範囲の雌のＣ５７ＢＬ．６Ｊに、０．５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰの５用量を１日おきに静脈内に注射した。注射間で、採血物を固定可能ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ、ＣＤ４５、ＴＣＲｖｂ、Ｂ２２０、ＣＤ１１ｂ、及び抗ネズミＣＡＲについてフローサイトメトリーを介して分析した。最後の注射から２日後、脾臓を採取し、フローサイトメトリー分析のために処理した。脾細胞を固定可能ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ、ＣＤ４５、ＴＣＲｖｂ、Ｂ２２０、ＣＤ１１ｂ、ＮＫ１．１、Ｆ４／８０、ＣＤ１１ｃ、及び抗ネズミＣＡＲで染色した。抗ネズミＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＮＰを注射したマウスからのデータを、ｆ．Ｌｕｃ ＬＮＰを摂取したマウスに対して正規化した。
代表的なデータが図４１Ａ、図４１Ｂ、及び図４１Ｃに示されており、ＬＮＰを用いてｉｎ ｖｉｖｏで送達された環状ｏＲＮＡから発現した抗マウスＣＤ１９ ＣＡＲは、ｉｎ ｖｉｖｏでネズミＴ細胞において機能的であることを示している。
実施例４４
環状ＲＮＡから発現したＣＤ１９ ＣＡＲは、ｍＲＮＡから発現したものと比較して収率が高く、かつ細胞傷害作用が高い
Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＦＭＣ６３由来ｓｃＦｖ、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体をコードする環状ＲＮＡをヒト末梢Ｔ細胞にエレクトロポレーションして、表面発現及びＣＡＲ媒介細胞傷害を評価した。比較のため、環状ＲＮＡがエレクトロポレーションされたＴ細胞を、この実験ではｍＲＮＡがエレクトロポレーションされたＴ細胞と比較した。エレクトロポレーションのため、ドナーヒトＰＢＭＣから市販のＴ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＣＤ３＋Ｔ細胞をヒトＰＢＭＣから分離した。分離後、Ｔ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で刺激し、１０％ＦＢＳ、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）、及び５０ｕＭのＢＭＥを含有する完全ＲＰＭＩ中で３７℃で５日にわたって増殖させた。刺激から５日後、Ｔ細胞を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡでエレクトロポレーションし、次いで一晩放置した。細胞傷害アッセイのため、エレクトロポレーションされたＴ細胞を、１０％ＦＢＳ、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）、及び５０ｕＭのＢＭＥを含有する完全ＲＰＭＩ中でＦｌｕｃ＋標的細胞及び非標的細胞と１：１の比で共培養し、３７℃で一晩インキュベートした。Ｆｌｕｃ＋標的細胞及び非標的細胞の溶解を検出するために、共培養から２４時間後にルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｒｉｇｈｔｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して細胞傷害を測定した。さらに、エレクトロポレーションされたＴ細胞の一定分量を採取し、分析の日にｌｉｖｅ ｄｅａｄ固定可能染色、ＣＤ３、ＣＤ４５、及びキメラ抗原受容体（ＦＭＣ６３）について染色した。
代表的なデータが図４２及び図４３に示されている。図４２のＡ及びＢは、環状ＲＮＡから発現した抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲが、直鎖ｍＲＮＡから発現した抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲより高いレベルで長く発現することを示している。図４３のＡ及びＢは、環状ＲＮＡから発現した抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲが、直鎖ｍＲＮＡから発現した抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲと比べて高い細胞傷害作用を発揮することを示している。
実施例４５
単一の環状ＲＮＡからの２つのＣＡＲの機能的発現
キメラ抗原受容体をコードする環状ＲＮＡをヒト末梢Ｔ細胞にエレクトロポレーションして表面発現及びＣＡＲ媒介細胞傷害を評価した。この研究の目的は、２つのＣＡＲをコードする環状ＲＮＡが、２Ａ（Ｐ２Ａ）またはＩＲＥＳ配列で確率的に発現し得るかどうかを評価することである。エレクトロポレーションのため、ＣＤ３＋Ｔ細胞を商業的に購入し（Ｃｅｌｌｅｒｏ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で刺激し、１０％ＦＢＳ、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）、及び５０ｕＭのＢＭＥを含有する完全ＲＰＭＩ中で３７℃で５日にわたって増殖させた。刺激から４日後、Ｔ細胞を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲ、抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲ－２Ａ－抗ヒトＢＣＭＡ ＣＡＲ、及び抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲ－ＩＲＥＳ－抗ヒトＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡでエレクトロポレーションし、次いで一晩放置した。細胞傷害アッセイのため、エレクトロポレーションされたＴ細胞を、１０％ＦＢＳ、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）、及び５０ｕＭのＢＭＥを含有する完全ＲＰＭＩ中でヒトＣＤ１９またはＢＣＭＡ抗原を発現するＦｌｕｃ＋Ｋ５６２細胞と１：１の比で共培養し、３７℃で一晩インキュベートした。Ｆｌｕｃ＋標的細胞の溶解を検出するために、共培養から２４時間後にルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して細胞傷害を測定した。
代表的なデータが図４４に示されており、２つのＣＡＲが、同じ環状ＲＮＡコンストラクトから機能的に発現し、細胞傷害性エフェクター機能を発揮し得ることを示している。
実施例４６
Ｃｒｅレポーターマウスを使用したｉｎ ｖｉｖｏ環状ＲＮＡトランスフェクション
Ｃｒｅリコンビナーゼ（Ｃｒｅ）をコードする環状ＲＮＡを前述したように脂質ナノ粒子に封入する。雌の６～８週齢のＢ６．Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ９（ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊ（Ａｉ９）マウスに脂質ナノ粒子を０．５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡで静脈内に投与した。蛍光ｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質は、Ｃｒｅ組換えによりＡｉ９マウスにおいて転写及び翻訳され、これは、環状ＲＮＡがｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞に送達され、そこで翻訳されたことを意味する。４８時間後、マウスを安楽死させ、脾臓を採取し、シングルセル懸濁液へと処理し、フローサイトメトリーによるイムノフェノタイピングのための様々なフルオロフォアがコンジュゲートされた抗体で染色した。
図４５Ａは、表１０ａからの脂質２７もしくは２６または表１０ｂからの脂質１５を用いて形成されたＬＮＰでの処置後の総骨髄（ＣＤ１１ｂ＋）、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、及びＴ細胞（ＴＣＲ－Ｂ＋）を含む様々な脾臓免疫細胞（ＣＤ４５＋、生）サブセットにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ発現頻度と共に代表的なＦＡＣＳプロットを示している。ＰＢＳが注射されたＡｉ９マウスは、バックグラウンドのｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を表していた。図４５Ｂは、ｔｄＴｏｍａｔｏを発現する骨髄細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞の割合を定量し（平均＋標準偏差、ｎ＝３）、これは、Ｃｒｅ環状ＲＮＡを成功裏にトランスフェクトされた各細胞集団の割合と同等である。表１０ａからの脂質２７及び２６で作製されたＬＮＰは、脂質９３－Ｓ１４と比較して大幅に高い骨髄及びＴ細胞トランスフェクションを示し、脂質構造変更によって付与される改善を強調している。
図４５Ｃは、表１０ａからの脂質２７及び２６と共にｔｄＴｏｍａｔｏを発現する追加の脾臓免疫細胞集団の割合を示しており（平均＋標準偏差、ｎ＝３）、それにはまた、ＮＫ細胞（ＮＫｐ４６＋、ＴＣＲ－Ｂ－）、古典的単球（ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ－６Ｇ－、Ｌｙ－６Ｃ＿ｈｉ）、非古典的単球（ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ－６Ｇ－、Ｌｙ－６Ｃ＿ｌｏ）、好中球（ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ－６Ｇ＋）、及び樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋、ＭＨＣ－ＩＩ＋）が含まれる。これらの実験は、表１０ａからの脂質２７及び２６ならびに表１０ｂからの脂質１５で作製されたＬＮＰが、マウスにおいて環状ＲＮＡを多くの脾臓免疫細胞サブセットに送達するのに有効であり、それらの細胞において環状ＲＮＡからの成功したタンパク質発現をもたらすことを実証している。
実施例４７
実施例４７Ａ：免疫抑制環状ＲＮＡを生成するためのビルトインポリＡ配列及びアフィニティー精製
ポリＡ配列（２０～３０ｎｔ）をＲＮＡコンストラクト（イントロンにおいてビルトインポリＡ配列を有する前駆体ＲＮＡ）の５’末端及び３’末端に挿入した。前駆体ＲＮＡ及びイントロンは、代替的に、例えば、Ｅ ｃｏｌｉ、ポリＡポリメラーゼまたは酵母ポリＡポリメラーゼを使用して転写後にポリアデニル化され得、これは追加の酵素の使用を必要とする。
この実施例における環状ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって環状化し、市販のオリゴ－ｄＴ樹脂で洗浄することによってアフィニティー精製して、スプライシング反応からポリＡタグ化配列（フリーのイントロン及び前駆体ＲＮＡを含む）を選択的に取り除いた。ＩＶＴは、市販のＩＶＴキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）またはカスタマイズされたＩＶＴミックス（Ｏｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）及びグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を異なる比（ＧＭＰ：ＧＴＰ＝８、１２．５、または１３．７５）で含有する）を用いて実施した。いくつかの実施形態では、高いＧＭＰ：ＧＴＰ比のＧＭＰが第１のヌクレオチドとして選択的に含まれ、大多数の一リン酸でキャップされた前駆体ＲＮＡが生成され得る。比較として、環状ＲＮＡ産物を代替的に、Ｘｒｎ１、Ｒｎａｓｅ Ｒ、及びＤｎａｓｅ Ｉでの処理（酵素精製）によって精製した。
次いで、アフィニティー精製または酵素精製プロセスを使用して調製された環状ＲＮＡの免疫原性を評価した。簡潔には、調製された環状ＲＮＡをＡ５４９細胞にトランスフェクトした。２４時間後、細胞を溶解し、モック試料に対するインターフェロンベータ－１誘導をｑＰＣＲによって測定した。三リン酸化ＲＮＡである３ｐ－ｈｐＲＮＡを陽性対照として使用した。
図４６Ｂ及び図４６Ｃは、スプライシング中に取り除かれ、スプライシングされていない前駆体分子に存在するエレメントにポリＡ配列が含まれる場合、ネガティブセレクションアフィニティー精製により、スプライシング反応物から非環状産物が取り除かれることを示している。図４６Ｄは、試験されたＩＶＴ条件及び精製方法で調製された環状ＲＮＡが全て免疫不活性であることを示す。これらの結果は、ネガティブセレクションアフィニティー精製が、環状ＲＮＡ精製のための酵素精製と同等または優れていること、及びカスタマイズされた環状ＲＮＡ合成条件（ＩＶＴ条件）がＧＭＰ余剰に対する依存性を低下させて、最大の免疫不活性を達成し得ることを示唆している。
実施例４７Ｂ：環状ＲＮＡ産生のための専用の結合部位及びアフィニティー精製
ポリＡタグの代わりに、特異的設計配列（ＤＢＳ、専用結合部位）を含めることができる。
ポリＡタグの代わりに、樹脂に結合し得る特異設計された相補性オリゴヌクレオチド等の専用結合部位（ＤＢＳ）を使用して、前駆体ＲＮＡ及びフリーのイントロンを選択的に消失させ得る。この実施例では、ＤＢＳ配列（３０ｎｔ）を前駆体ＲＮＡの５’末端及び３’末端に挿入した。ＲＮＡを転写し、転写された産物を樹脂に連結されたカスタム相補性オリゴヌクレオチド上で洗浄した。
図４７のＢ及びＣは、設計されたＤＢＳ配列をスプライシング中に除去されるエレメントに含めることにより、ネガティブアフィニティー精製を介して、スプライシング反応においてスプライシングされていない前駆体ＲＮＡ及びフリーのイントロン成分を取り除くことが可能になることを実証している。
実施例４７Ｃ：ジストロフィンをコードする環状ＲＮＡの産生
ジストロフィンをコードする１２ｋｂ１２，０００ｎｔ環状ＲＮＡを、前駆体ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写と、それに続く、残存する直鎖成分を分解するためのＸｒｎ１、ＤＮａｓｅ １、及びＲＮａｓｅ Ｒの混合物を使用する酵素精製によって生成した。図４８は、ジストロフィンをコードする環状ＲＮＡが成功裏に産生されたことを示している。
実施例４８
３’イントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間の５’スペーサーは、環状ＲＮＡ発現を改善する
Ｊｕｒｋａｔ細胞における３’イントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間に異なる５’スペーサーを有する精製されたｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルを比較した。簡潔には、２５０ｎｇの各ＲＮＡ種での６０，０００細胞のエレクトロポレーションから２４時間後に上清において分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を測定した。
また、Ｊｕｒｋａｔ細胞における３’イントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間に異なる５’スペーサーを有する精製されたｃｉｒｃＲＮＡの安定性を比較した。簡潔には、２５０ｎｇの各ＲＮＡ種での６０，０００細胞のエレクトロポレーションから２日にわたって上清において分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を測定し、１日目の発現に対して正規化した。
結果が図４９のＡ及びＢに示されており、スペーサーの付加がＩＲＥＳ機能を増強させ得ること、ならびに付加されたスペーサーの配列同一性及び長さの重要性を示している。スペーサーは、ＩＲＥＳの直前に付加され、おそらく、ＩＲＥＳがイントロンフラグメント等の他の構造化エレメントから孤立して折り畳まれることを可能にすることによって機能するということが、考えられる説明である。
実施例４９
この実施例は、ヤギコブウイルスＩＲＥＳの５’末端または３’末端からの欠失スキャンを説明する。ＩＲＥＳボーダーは概して、十分に特徴評価されておらず、経験的分析を必要とするため、この実施例を、翻訳を誘導するために必要とされるコアの機能的配列を突き止めるために使用することができる。簡潔には、環状ＲＮＡコンストラクトを、ガウシアルシフェラーゼをコードする配列に機能的に連結された切断されたＩＲＥＳエレメントを用いて生成した。切断されたＩＲＥＳエレメントは、５’末端または３’末端から除去された示された長さのヌクレオチド配列を有していた。ＲＮＡでの初代ヒトＴ細胞のエレクトロポレーションから２４時間及び４８時間後に上清において分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を測定した。発現の安定性を、２４時間の時点における発現レベルに対する４８時間時点における発現レベルの比として計算した。
図５０に示されているように、ＩＲＥＳの５’末端からの４０超のヌクレオチドの欠失は、発現を減少させ、ＩＲＥＳ機能を崩壊させた。発現の安定性は、ＩＲＥＳエレメントの切断によって比較的影響を受けなかったが、発現レベルは、ＩＲＥＳの３’末端から１４１ヌクレオチドの欠失によって実質的に低下した一方で、３’末端からの５７または１２２ヌクレオチドの欠失は、発現レベルに対して良好な影響を及ぼした。
６ヌクレオチドの予備開始配列の欠失は、ルシフェラーゼレポーターの発現レベルを低下させることも観察された。その６ヌクレオチド配列の古典的コザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）での置き換えでは、大幅な影響はなかったが、少なくとも発現は維持された。
実施例５０
この実施例は、ヤギコブウイルス（ＣＫＶ）ＩＲＥＳ、パラボウイルスＩＲＥＳ、アポデムスピコルナウイルス（ＡＰ）ＩＲＥＳ、コブウイルスＳＺＡＬ６ ＩＲＥＳ、クロヒウイルスＢ（ＣｒＶＢ）ＩＲＥＳ、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、及びＳＡＦＶ ＩＲＥＳを含む、選択されたＩＲＥＳ配列の改変（例えば、切断）を記載する。ＩＲＥＳエレメントの配列は、配列番号３４８～３８９に提供されている。簡潔には、環状ＲＮＡコンストラクトを、ガウシアルシフェラーゼをコードする配列に機能的に連結された切断されたＩＲＥＳエレメントを用いて生成した。ＨｅｐＧ２細胞に環状ＲＮＡをトランスフェクトした。上清における発光をトランスフェクションから２４時間及び４８時間後に評価した。発現の安定性を、２４時間の時点における発現レベルに対する４８時間時点における発現レベルの比として計算した。
図５１に示されているように、切断は、ＩＲＥＳの同一性に応じて多様な効果を有し、これは、ＩＲＥＳ間でしばしば異なる、翻訳に使用される開始メカニズム及びタンパク質因子に依存し得る。５’及び３’の欠失は、例えば、ＣＫＶ ＩＲＥＳとの関連で有効に組み合わされ得る。標準的なコザック配列の付加は、いくつかの場合では、大幅に発現を改善するか（ＳＡＦＶにおけるＦｕｌｌ対Ｆｕｌｌ＋Ｋの場合）、または発現を減弱させた（ＣＫＶにおける５ｄ４０／３ｄ１２２対５ｄ４０／３ｄ１２２＋Ｋの場合）。
実施例５１
この実施例は、変異代替翻訳開始部位を含む、ＣＫ－７３９、ＡＰ－７４８、及びＰＶ－７４３ ＩＲＥＳ配列の改変を記載する。簡潔には、環状ＲＮＡコンストラクトを、ガウシアルシフェラーゼをコードする配列に機能的に連結された改変されたＩＲＥＳエレメントを用いて生成した。ＲＮＡでの１Ｃ１Ｃ７細胞のトランスフェクションから２４時間及び４８時間後に上清において分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を測定した。
ＣＵＧが、最も一般に見られる代替開始部位であったが、他の多くのものも特徴評価した。これらのトリプレットは、開始コドンの前のＩＲＥＳスキャニングトラクトに存在し得、正確なポリペプチドの翻訳に影響を及ぼし得る。配列番号３７８～３８０に提供されるＩＲＥＳ配列を用いて、４つの代替開始部位変異を生成した。図５２に示されているように、ＣＫ－７３９ ＩＲＥＳにおける代替翻訳開始部位の変異は、正確なポリペプチドの翻訳に、いくつかの例では正の、他の例では負の影響を及ぼした。全ての代替翻訳開始部位の変異は、翻訳のレベルを低下させた。
開始コドンの前の６ヌクレオチドの代替コザック配列も発現レベルに影響を及ぼし得る。開始コドンの上流の６ヌクレオチド配列は、ＣＫ－７３９ ＩＲＥＳ及び「６ｎｔ予備開始」群における試料番号１～５においてそれぞれ、ｇＴｃａｃＧ、ａａａｇｔｃ、ｇＴｃａｃＧ、ｇｔｃａｔｇ、ｇｃａａａｃ、及びａｃａａｃｃであった。図５２に示されているように、開始コドンの前の所定の６ヌクレオチド配列の置換は、翻訳に影響を及ぼした。
ＡＰ－７４８及びＰＶ－７４３ ＩＲＥＳ配列における５’末端及び３’末端の欠失が発現を減少させたことも観察された。しかしながら、長いスキャニングトラクトを有していたＣＫ－７３９ ＩＲＥＳでは、翻訳は比較的、スキャニングトラクトにおける欠失による影響を受けなかった。
実施例５２
この実施例は、５’及び／または３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）を挿入し、ＩＲＥＳハイブリッドを生成することによる選択されたＩＲＥＳ配列の改変を記載する。簡潔には、環状ＲＮＡコンストラクトを、ガウシアルシフェラーゼをコードする配列に機能的に連結された改変されたＩＲＥＳエレメントを用いて生成した。ＲＮＡでのＨｅｐＧ２細胞のトランスフェクションから２４時間及び４８時間後に上清において分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を測定した。
挿入されたＵＴＲを有するＩＲＥＳ配列は、配列番号３９０～４０１に提供されている。図５３に示されているように、ＩＲＥＳの３’末端の直後かつ開始コドンの前の５’ＵＴＲの挿入は、ヤギコブウイルス（ＣＫ）ＩＲＥＳからの翻訳をわずかに増加させたが、いくつかの例では、サリウイルスＳＺ１ ＩＲＥＳからの翻訳を阻害した。終止カセットの直後の３’ＵＴＲの挿入は、いずれのＩＲＥＳ配列にも影響を有しなかった。
ハイブリッドＣＫ ＩＲＥＳ配列は、配列番号３９０～４０１に提供されている。ＣＫ ＩＲＥＳをベースとして使用し、ＣＫ ＩＲＥＳの特定の領域を、他のＩＲＥＳ配列、例えば、ＳＺ１及びＡＶ（アイチウイルス）からの同様の外観の構造で置き換えた。図５３に示されているように、所定のハイブリッド合成ＩＲＥＳ配列は機能的であり、ハイブリッドＩＲＥＳが、同様の予測される構造を示す異なるＩＲＥＳ配列に由来する部分を使用して構築され得る一方で、これらの構造の欠失はＩＲＥＳ機能を完全に停止させたことを示している。
実施例５３
この実施例は、終止コドンまたはカセットバリアントを導入することによる環状ＲＮＡの改変を記載する。簡潔には、環状ＲＮＡコンストラクトを、ガウシアルシフェラーゼをコードする配列に機能的に連結されたＩＲＥＳエレメントと、それに続く可変終止コドンカセットを用いて生成し、その可変終止コドンカセットは、各フレームにおける終止コドン及びガウシアルシフェラーゼをコードする配列のリーディングフレームにおける２つの終始コドンを含んでいた。１Ｃ１Ｃ７細胞に環状ＲＮＡをトランスフェクトした。上清における発光をトランスフェクションから２４時間及び４８時間後に評価した。
終止コドンカセットの配列は、配列番号４０６～４１２に示されている。図５４に示されているように、所定の終止コドンカセットは、発現レベルを改善したが、それらは、発現安定性に対してほとんど影響を有しなかった。特に、２つのフレーム１（ガウシアルシフェラーゼをコードする配列のリーディングフレーム）終止コドン（１つ目はＴＡＡである）と、それに続くフレーム２終止コドン及びフレーム３終止コドンを有する終止カセットは、機能的翻訳を促進するのに有効である。
実施例５４
この実施例は、５’ＵＴＲバリアント挿入することによる環状ＲＮＡの改変を記載する。簡潔には、環状ＲＮＡコンストラクトを、ＩＲＥＳの３’末端と開始コドンとの間に挿入された５’ＵＴＲバリアントを有するＩＲＥＳエレメントを用いて生成した（ＩＲＥＳは、ガウシアルシフェラーゼをコードする配列に機能的に連結されている）。１Ｃ１Ｃ７細胞に環状ＲＮＡをトランスフェクトした。上清における発光をトランスフェクションから２４時間及び４８時間後に評価した。
５’ＵＴＲバリアントの配列は、配列番号４０２～４０５に示されている。図５５に示されているように、標準コザック配列（ＵＴＲ４）を有するＣＫ ＩＲＥＳは、３６ヌクレオチドの構造不定／低ＧＣスペーサー配列が付加された場合（ＵＴＲ２）、より有効であり、ＧＣリッチのコザック配列が、コアのＩＲＥＳの折り畳みと干渉し得ることを示唆している。コザック配列を有するより高いＧＣ／構造化スペーサーを使用すると、同じ利益を示さず（ＵＴＲ３）、これはおそらく、スペーサー自体によるＩＲＥＳの折り畳みとの干渉に起因する。コザック配列のｇＴｃａｃＧへの変異（ＵＴＲ１）は、スペーサーを必要とせずにコザック＋スペーサー代替物と同じレベルまで翻訳を向上させた。
実施例５５
この実施例は、発現レベルに対する環状ＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ標的部位の影響を記載する。簡潔には、環状ＲＮＡコンストラクトを、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードする配列に機能的に連結されたＩＲＥＳエレメントを用いて生成し、２つのタンデムｍｉＲ－１２２標的部位がコンストラクトに挿入された。ｍｉＲ－１２２を発現するＨｕｈ７細胞に環状ＲＮＡをトランスフェクトした。上清におけるｈＥＰＯ発現をサンドイッチＥＬＩＳＡによってトランスフェクションから２４時間及び４８時間後に評価した。
図５６に示されているように、ｈＥＰＯ発現レベルは、ｍｉＲ－１２２標的部位が環状ＲＮＡに挿入された場合に阻止された。この結果は、環状ＲＮＡからの発現がｍｉＲＮＡによって制御され得ることを実証している。このように、細胞型または組織に特異的な発現は、組換えタンパク質の発現が望ましくない細胞型で発現するｍｉＲＮＡの標的部位を組み込むことによって達成され得る。
実施例５６
この実施例は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＬＮＰによるヒト腫瘍細胞のトランスフェクションを示す。ＳｕｐＴ１細胞（ヒトＴ細胞腫瘍株）及びＭＶ４－１１細胞（ヒトマクロファージ腫瘍株）をそれぞれ、９６ウェルプレートに１００，０００個の細胞／ウェル及び１００，０００個の細胞／ウェルで一晩播種した。次いで、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をコードするｏＲＮＡを含有するＬＮＰを、細胞に２００ｎｇのＲＮＡ／ウェルで添加した。２４時間のインキュベーション後、発光を、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造元の指示に従って使用して定量化し、バックグラウンドの発光をＬＮＰで処理されていない細胞の発光から引いた。図５７では、測定されたホタル発光を定量化しており、表１０ａからの脂質２７（１０ａ－２７（４．５Ｄ）ＬＮＰ、実施例７０を参照されたい）または表１０ａからの脂質２６（１０ａ－２６（４．５Ｄ）ＬＮＰ、実施例７０を参照されたい）を含むＬＮＰは、ヒトＴ細胞でもｉｎ ｖｉｔｒｏマクロファージ腫瘍株でもｏＲＮＡをトランスフェクトし、発現することができることを示している。１０ａ－２７（４．５Ｄ）ＬＮＰは１０ａ－２６（４．５Ｄ）ＬＮＰよりも高い発光をもたらし、ヒト腫瘍細胞へのＬＮＰのトランスフェクションレベルが製剤により影響され得ることを示している。
実施例５７
この実施例は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの初代ヒト活性化Ｔ細胞のトランスフェクションを示す。独立したドナーからの初代ヒトＴ細胞をａＣＤ３／ａＣＤ２８で刺激し、ヒト血清及びＩＬ－２の存在下で６日間増殖させた。次いで、１００，０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をコードするｏＲＮＡを含有するＬＮＰを、アポリポタンパク質Ｅ３（ＡｐｏＥ３）と共に、またはアポリポタンパク質Ｅ３（ＡｐｏＥ３）なしで、細胞に２００ｎｇのＲＮＡ／ウェルで添加した。２４時間のインキュベーション後、発光を、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造元の指示に従って使用して定量化し、バックグラウンドの発光をＬＮＰで処理されていない細胞の発光から引いた。図５８は、独立した４ドナー間の測定されたホタル発光を示し、試験した全ＬＮＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代ヒトＴ細胞にトランスフェクトすることを実証している。表１０ａからの脂質２７（１０ａ－２７）を含有するＬＮＰは一般に、表１０ａからの脂質２６（１０ａ－２６）を含有するものよりも高い発光を産生した。さらに、ＡｐｏＥ３の添加は一般に、１０ａ－２７（４．５Ｄ）及び１０ａ－２６（４．５Ｄ）（それぞれ、３．１倍及び２．６倍）と比較して、１０ａ－２７（５．７Ａ）及び１０ａ－２６（５．７Ａ）のルシフェラーゼの発現をより多く増加させた（それぞれ、４ドナー間の平均が４．４倍及び９．３倍）。これは、ヘルパー脂質、ＰＥＧ脂質、及びイオン化可能脂質と、リン酸との比の全てが、同じイオン化可能脂質を用いて作製された異なる製剤のＡｐｏＥ－依存性に寄与することを示唆する。（ＬＮＰ製剤手順、例えば、１０ａ－２７（５．７Ａ）、１０ａ－２６（５．７Ａ）、１０ａ－２７（４．５Ｄ）、及び１０ａ－２６（４．５Ｄ）ＬＮＰについての実施例７０を参照されたい）。
実施例５８
この実施例は、ＬＮＰの尾部化学が異なれば、Ｔ細胞への取り込みメカニズムが異なることを示す。ｏＲＮＡを発現しているヒトＴ細胞のパーセントを定量化するため、ｅＧＦＰ ｏＲＮＡを含有するＬＮＰを、ＡｐｏＥ３を用いて、またはＡｐｏＥ３を用いずに、活性化初代ヒトＴ細胞（上記実施例５７のように調製）に２００ｎｇ ＲＮＡ／ウェルで添加した。２４時間のインキュベーション後、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、生きたＧＦＰ＋Ｔ細胞のパーセンテージを定量化した。図５９は、独立した２ドナーのＧＦＰ＋Ｔ細胞（％）をグラフにしたものであり、表１０ａからの脂質２７を含有するＬＮＰ（１０ａ－２７（４．５Ｄ）ＬＮＰ、実施例７０を参照されたい）及び表１０ａからの脂質４６を含有するＬＮＰ（１０ａ－４６（５．７Ａ）ＬＮＰ、実施例７０を参照されたい）について、５～１０％の細胞がＧＦＰ＋である。ＡｐｏＥ３の添加は、１０ａ－２７（４．５Ｄ）ＬＮＰではトランスフェクション増加をもたらしたが、１０ａ－４６（５．７Ａ）ＬＮＰではトランスフェクション増加は見受けられなかったことから、脂質１０ａ－２７と１０ａ－４６とで異なっている尾部化学が、Ｔ細胞への異なる取り込みメカニズムを媒介し得ることを示唆している。
実施例５９
この実施例は、ＣｒｅレポーターマウスモデルにおけるＣｒｅの免疫細胞の発現を記載する。
Ａｉ９マウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ９（ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊ、雌、６～８週齢、ｎ＝３／群）に、０．５ｍｇ／ｋｇのＣｒｅ ｏＲＮＡ ＬＮＰまたはＰＢＳをｉ．ｖ．注射した。Ａｉ９マウスは、Ｃｒｅ組換えにより蛍光レポーターｔｄＴｏｍａｔｏを転写及び翻訳し、これは、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋の細胞にＣｒｅ ｏＲＮＡが首尾よくトランスフェクトされたることを意味する。４８時間後、マウスを安楽死させ、それらの脾臓を採取し、手作業で処理してシングルセル懸濁液にした。脾細胞を死細胞について染色し（ＬｉｖｅＤｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ、Ｔｈｅｒｍｏ）、抗マウス抗体（ＴＣＲ－Ｂ鎖、ＢＶ４２１、Ｈ５７－５９７；ＣＤ４５、ＢＶ７１１、３０－Ｆ１１；ＣＤ１１ｂ、ＢＶ７８５、ＩＣＲＦ４４；ＮＫｐ４６、ＡＦ６４７、２９Ａ１．４；ＣＤ１９、ＡＰＣ／７５０、６Ｄ５；ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ，９３；抗体は全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄより）を１：２００の比で用いた。Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してフローサイトメトリーを実施した。
脾臓の骨髄細胞（ＣＤ１１ｂ＋）、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、及びＴ細胞（ＴＣＲ－Ｂ＋）におけるｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞のパーセントは、図６０に提示されている。脂質１０ａ－２７と脂質１０ａ－４６は、それらの尾部化学のみが異なっており、脂質１０ａ－２７で作製された製剤は、脂質１０ａ－４６で作製された製剤よりも大幅に多い脾臓免疫細胞をトランスフェクトする。さらに、Ｃｒｅ ｏＲＮＡを用いて製剤化された１０ａ－２７（４．５Ｄ）ＬＮＰ（実施例７０を参照されたい）は、Ｃｒｅ直鎖ｍＲＮＡを用いて製剤化されたものよりも、約２倍多いＴ細胞をトランスフェクトし、これは、ｏＲＮＡが、直鎖ｍＲＮＡと比較して、脾臓Ｔ細胞でのタンパク質発現の改善をもたらし得ることを示唆している。
（表３７）
Figure 2023525270000591
実施例６０
この実施例は、野生型マウスにおけるｍＯＸ４０Ｌ ｏＲＮＡの免疫細胞の発現を示す。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、６～８週齢、ｎ＝３または４／群）に、０．５ｍｇ／ｋｇのｍＯＸ４０Ｌ ｏＲＮＡ ＬＮＰまたはＰＢＳを静脈内注射した。２４時間後、マウスを安楽死させ、それらの脾臓を採取し、手作業で処理してシングルセル懸濁液にした。脾細胞を死細胞について染色し（ＬｉｖｅＤｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ、Ｔｈｅｒｍｏ）、抗マウス抗体（ＴＣＲ－Ｂ鎖、ＰａｃＢｌｕｅ、Ｈ５７－５９７；ＣＤ１１ｂ、ＦＩＴＣ、ＩＣＲＦ４４；Ｂ２２０、ＰＥ、ＲＡ３－６Ｂ２；ＣＤ４５、ＰｅｒＣＰ、３０－Ｆ１１；ｍＯＸ４０Ｌ、ＡＦ６４７、ＲＭ１３４Ｌ；ＮＫ１．１、ＡＰＣ／７５０、ＰＫ１３６；ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ，９３；抗体は全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄより）を１：２００で用いた。フローサイトメトリーを、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して実施した。
脾臓の骨髄（ＣＤ１１ｂ＋）、Ｔ細胞（ＴＣＲ－Ｂ＋）、及びＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋）におけるｍＯＸ４０Ｌ＋細胞のパーセントは、図６１に提示されている。注目すべきことに、緩衝液が異なる（低張ＰＢＳ、等張ＰＢＳ、及び等張ＴＢＳ）、静脈内注射された同じ製剤間で、大幅に異なるトランスフェクション効率が観察された。低張ＰＢＳ中の１０ａ－２７ ４．５Ｄ ＬＮＰは、約１４％の骨髄細胞トランスフェクション、６％のＴ細胞トランスフェクション、及び２１％のＮＫ細胞トランスフェクションを脾臓においてもたらす。等張緩衝液で注射された製剤のうち、１０ａ－２７ ＤＳＰＣ ５．７Ａ ＬＮＰは、脾臓において骨髄、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞のトランスフェクションを示す（それぞれ、９％、３％、及び８％）。（ＬＮＰ製剤手順、例えば、１０ａ－２７（４．５Ｄ）ＬＮＰ及び１０ａ－２７ ＤＳＰＣ（５．７Ａ）ＬＮＰについての実施例７０を参照されたい）。
（表３８）
Figure 2023525270000592
実施例６１
この実施例は、野生型マウスにおけるｍＯＸ４０Ｌ ｏＲＮＡ－ＬＮＰの単回用量漸増を示す。
５７ＢＬ／６マウス（雌、６～８週齢、ｎ＝３／群）に、１ｍｇ／ｋｇもしくは３ｍｇ／ｋｇのｍＯＸ４０Ｌ ｏＲＮＡ ＬＮＰまたは緩衝液対照を静脈内注射した。２４時間後、マウスを安楽死させ、それらの脾臓を採取し、手作業で処理してシングルセル懸濁液にした。脾細胞を死細胞について染色し（ＬｉｖｅＤｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｂｌｕｅ、Ｔｈｅｒｍｏ）、抗マウス抗体（ＴＣＲ－Ｂ鎖、ＢＶ４２１、Ｈ５７－５９７；ＣＤ１９、ＢＶ６０５、６Ｄ５；ＣＤ４５、ＢＶ７１１、３０－Ｆ１１；ＣＤ１１ｂ、ＢＶ７８５、ＩＣＲＦ４４；ＣＤ１１ｃ、ＦＩＴＣ、Ｎ４１８；ＣＤ８ａ、ＰｅｒＣＰ、５３－６．７；ｍＯＸ４０Ｌ、ＰＥ、ＲＭ１３４Ｌ；ＮＫｐ４６、ＡＦ６４７、２９Ａ１．４；ＣＤ４、ＡＰＣ／７５０、ＧＫ１．５；ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ，９３；抗体は全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄより）で１：２００にて染色した。フローサイトメトリーを、ＢＤ ＦＡＣＳＳｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーターを使用して実施した。
脾臓のＴ細胞（全ＴＣＲ－Ｂ＋）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＴＣＲ－Ｂ＋、ＣＤ４＋）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＴＣＲ－Ｂ＋、ＣＤ８ａ＋）、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、ＮＫ細胞（ＮＫｐ４６＋）、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋）、及び他の骨髄細胞（ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ－）におけるｍＯＸ４０Ｌ＋細胞のパーセントを図６２Ａ及び図６２Ｂに示し、対応する、２４時間後のマウスの体重変化を図６２Ｃに示す。１０ａ－２７（４．５Ｄ）ＬＮＰ １×ＰＢＳ群を除き、１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇを通して全群で免疫細胞サブセットのトランスフェクションの用量依存的な増加が観察される。３ｍｇ／ｋｇ用量では、３つの異なるＬＮＰ（ＴＢＳ中の１０ａ－２７（４．５Ｄ）、ＰＢＳ中の１０ａ－２６（４．５Ｄ）、及びＴＢＳ中の１０ａ－２７ ＤＳＰＣ（５．７Ａ）；製剤手順については実施例７０を参照されたい）で脾臓のＴ細胞における１０～２０％のｍＯＸ４０Ｌトランスフェクションが達成されており、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のサブセットの間で観察されるトランスフェクション率と同様である。これらの３製剤はまた、３ｍｇ／ｋｇにて、脾臓における約２０％のＢ細胞、６０～７０％の樹状細胞、６０～７０％のＮＫ細胞、及び３０～４０％の他の骨髄細胞へのｍＯＸ４０Ｌトランスフェクションをもたらす。これらの３製剤は、３ｍｇ／ｋｇの単回投与において２４時間でマウスの体重減少をほんのわずか（０～３％）しか引き起こさず、臨床観察の報告はない。
（表３９）
Figure 2023525270000593
実施例６２
この実施例は、マウスにおけるｏＲＮＡ－ＬＮＰ ＣＡＲ媒介性Ｂ細胞枯渇を示す。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、６～８週齢、ｎ＝５／群）に、０．５ｍｇ／ｋｇのａＣＤ１９－ＣＡＲ ｏＲＮＡ ＬＮＰまたは対照ＦＬｕｃ ｏＲＮＡ ＬＮＰを０日目、２日目、５日目、７日目、及び９日目に静脈内注射した。－１日目、１日目、８日目及び１２日目、顎下出血を実施して採血した。３０ｕＬの血液をＡＣＫ溶解バッファーで溶解し、ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄して免疫細胞を分離した。１２日目、マウスを安楽死させ、それらの脾臓を採取し、手作業で処理してシングルセル懸濁液にした。血液及び脾臓におけるＢ細胞の頻度を評価するため、これらのシングルセル懸濁液を死細胞について染色し（ＬｉｖｅＤｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ、Ｔｈｅｒｍｏ）、抗マウス抗体（ＴＣＲ－Ｂ鎖、ＰａｃＢｌｕｅ、Ｈ５７－５９７；ＣＤ１１ｂ、ＦＩＴＣ、ＩＣＲＦ４４；Ｂ２２０、ＰＥ、ＲＡ３－６Ｂ２；ＣＤ４５、ＰｅｒＣＰ、３０－Ｆ１１；ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ，９３；抗体は全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄより）で１：２００にて染色した。フローサイトメトリーを、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して実施した。
図６３Ａでは、本研究で観察されたＢ細胞枯渇を定量化しており、生きたＣＤ４５＋免疫細胞のＢ２２０＋Ｂ細胞のパーセンテージによって定義される。ａＣＤ１９－ＣＡＲ ｏＲＮＡ ＬＮＰ群におけるＢ細胞枯渇を、８日目及び１２日目（血液）及び１２日目（脾臓）に、そのそれぞれのＦＬｕｃ ｏＲＮＡ ＬＮＰ対照と比較した。血液では、ａＣＤ１９－ＣＡＲ １０ａ－２７（４．５Ｄ）及び１０ａ－２６（４．５Ｄ）ＬＮＰはそれぞれ８日目に、ＦＬｕｃ対照と比較して、生きたＣＤ４５＋のＢ２２０＋（％）の約２８％及び１７％の減少をもたらした。脾臓では、図６３のＢに示されるように、ａＣＤ１９－ＣＡＲ １０ａ－２７（４．５Ｄ）及び１０ａ－２６（４．５Ｄ）ＬＮＰは１２日目に、ＦＬｕｃ対照と比較して、生きたＣＤ４５＋のＢ２２０＋（％）の約５％及び９％の減少をもたらした。全体として、これらの結果は、脂質１０ａ－２７（４．５Ｄ）及び脂質１０ａ－２６（４．５Ｄ）のａＣＤ１９－ＣＡＲ ｏＲＮＡ ＬＮＰで処置されたマウスにおいてＣＡＲ媒介性Ｂ細胞枯渇が生じていることを示唆している。
さらに、図６３Ｃは、本研究でのマウスの体重増加パーセントを示す。１０ａ－２７ ４．５Ｄまたは１０ａ－２６ ４．５ＤのＬＮＰで処置されたマウス（９日にわたり５×０．５ｍｇ／ｋｇ）からの平均では、大幅体重減少はなかったことから、これらのＬＮＰが、今回の用量及びスケジュールにてマウスで十分に忍容され得ることが示唆される。
（表４０）
Figure 2023525270000594
実施例６３
抗ＣＤ１９ＣＡＲを含有するＬＮＰ及び環状ＲＮＡコンストラクトは、ｉｎ ｖｉｖｏで血液及び脾臓のＢ細胞を減少させる。
抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現をコードする環状ＲＮＡコンストラクトを、上記のように脂質ナノ粒子内に封入した。比較のため、ルシフェラーゼ発現をコードする環状ＲＮＡを、別々の脂質ナノ粒子内に封入した。
６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、いずれかのＬＮＰ溶液を注射し、各マウス内に隔日で計４回のＬＮＰ注射を行った。最終ＬＮＰ注射から２４時間後、マウスの脾臓及び血液を採取し、染色して、フローサイトメトリーにより分析した。図６４Ａ及びＢに示されるように、抗ＣＤ１９ＣＡＲをコードするＬＮＰ－環状ＲＮＡコンストラクトを含有するマウスでは、ルシフェラーゼをコードするＬＮＰ－環状ＲＮＡで処置されたマウスと比較して、末梢血及び脾臓におけるＣＤ１９＋Ｂ細胞の統計学的に有意な減少がもたらされた。
実施例６４
ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡ内に含有されたＩＲＥＳ配列は、Ｔ細胞のＣＡＲ発現及び細胞毒性を改善する。
活性化マウスＴ細胞を、特有のＩＲＥＳ及びマウス抗ＣＤ１９ １Ｄ３ζ ＣＡＲ発現配列を含有する２００ｎｇの環状ＲＮＡコンストラクトでエレクトロポレーションした。これらのコンストラクトを含有するＩＲＥＳは、全部または一部、ヤギコブウイルス、アポデムスピコルナウイルス、パラボウイルス、またはサリウイルスに由来した。ヤギコブウイルス由来ＩＲＥＳをさらにコドン最適化した。対照として、野生型ゼータマウスＣＡＲを含有する、ＩＲＥＳを含まない環状ＲＮＡを比較に使用した。Ｔ細胞を、エレクトロポレーション後２４時間のＣＤ－１９ ＣＡＲについて染色し、表面発現を評価し、次いで、Ａ２０ Ｆｌｕｃ標的細胞と共培養した。その後、アッセイを、Ｔ細胞と標的細胞の共培養から２４時間後のＦｌｕｃ＋ Ａ２０細胞の細胞傷害性殺傷について評価した。
図６５Ａ、Ｂ、Ｃ、及び図６６で見られるように、特有のＩＲＥＳは、ＣＡＲタンパク質を発現したＴ細胞の頻度及び細胞表面でのＣＡＲ発現のレベルを増大させることができた。ＣＡＲタンパク質の発現の頻度及び細胞表面でのＣＡＲ発現のレベルの増大は、抗腫瘍反応改善につながる。
実施例６５
初代ヒトＴ細胞における環状ＲＮＡコンストラクトから発現される細胞質及び表面のタンパク質。
環状ＲＮＡコンストラクトは、蛍光細胞質レポーターまたは表面抗原レポーターをコードする配列いずれかを含有した。蛍光レポーターには、緑色蛍光タンパク質、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｔｓａｐｐｈｉｒｅが含まれた。表面レポーターには、ＣＤ５２及びＴｈｙ１．１ｂｉｏが含まれた。初代ヒトＴ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で活性化し、レポーター配列を含有する環状ＲＮＡの活性化後６日目にエレクトロポレーションした。Ｔ細胞を採取し、エレクトロポレーション後２４時間目にフローサイトメトリーにより分析した。表面抗原を、市販抗体（例えば、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，ａｎｄ ＢＤ）で染色した。
図６７Ａ及びＢで見られるように、細胞質及び表面のタンパク質は、初代ヒトＴ細胞において、タンパク質をコードする環状ＲＮＡから発現され得る。
実施例６６
特有のＩＲＥＳ配列を含有する環状ＲＮＡは、直鎖ｍＲＮＡに対し、翻訳発現が改善されている。
環状ＲＮＡコンストラクトは、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）の発現配列と共に特有のＩＲＥＳを含有した。
２ドナーからのヒトＴ細胞を濃縮し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で刺激した。増殖から数日後、活性化Ｔ細胞を採取し、ＦＬｕｃペイロードを発現する等モルのｍＲＮＡまたは環状ＲＮＡでエレクトロポレーションした。ヤギコブウイルス、アポデムスピコルナウイルス、及びパラボウイルスに由来するＩＲＥＳ配列を含め、様々なＩＲＥＳ配列を試験して、７日にわたるペイロード発現の発現レベル及び耐久性を評価した。７日にわたり、Ｔ細胞をＰｒｏｍｅｇａ Ｂｒｉｇｈｔｇｌｏで溶解し、生物発光について評価した。
図６８Ｃ、図６８Ｄ、図６８Ｅ、図６８Ｆ、及び図６８Ｇに示すように、環状ＲＮＡ内にＩＲＥＳが存在することにより、直鎖ｍＲＮＡと比較して、細胞質タンパク質の翻訳及び発現を桁違いで増大させることができ、かつ、発現を改善することができる。これは、複数のヒトＴ細胞ドナーにわたり一貫して見られた。
実施例６７
実施例６５Ａ：抗ＣＤ１９をコードするＬＮＰ－環状ＲＮＡはＫ５６２細胞のヒトＴ細胞殺傷を媒介する。
環状ＲＮＡコンストラクトは、抗ＣＤ１９抗体をコードする配列を含有した。その後、環状ＲＮＡコンストラクトを脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入した。
ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で刺激し、最大６日間増殖させた。６日目、トランスフェクションが媒介されるようＬＮＰ－環状ＲＮＡ及びＡｐｏＥ３（１μｇ／ｍＬ）をＴ細胞と共培養した。２４時間後、Ｆｌｕｃ＋Ｋ５６２細胞を、抗ＣＤ１９抗体をコードする２００ｎｇの環状ＲＮＡでエレクトロポレーションし、その後７日目に共培養した。共培養後４８時間目、アッセイを、Ｋ５６２細胞のＣＡＲ発現及び細胞傷害性殺傷についてＦｌｕｃ発現により評価した。
図６９Ａ及びＢに示されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞へのＣＡＲのＬＮＰ媒介性送達によるＴ細胞の抗ＣＤ１９ＣＡＲの発現、及びそれが、操作されたＫ５６２細胞において特異的な抗原依存的様式で腫瘍細胞を溶解する能力、がある。
実施例６５Ｂ：抗ＢＣＭＡ抗体をコードするＬＮＰ－環状ＲＮＡはＫ５６２細胞のヒトＴ細胞殺傷を媒介する。
環状ＲＮＡコンストラクトは、抗ＢＣＭＡ抗体をコードする配列を含有した。その後、環状ＲＮＡコンストラクトを脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入した。
ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で刺激し、最大６日間増殖させた。６日目、トランスフェクションが媒介されるようＬＮＰ－環状ＲＮＡ及びＡｐｏＥ３（１μｇ／ｍＬ）をＴ細胞と共培養した。２４時間後、Ｆｌｕｃ＋Ｋ５６２細胞を、抗ＢＣＭＡ抗体をコードする２００ｎｇの環状ＲＮＡでエレクトロポレーションし、その後７日目に共培養した。共培養後４８時間目、アッセイを、Ｋ５６２細胞のＣＡＲ発現及び細胞傷害性殺傷についてＦｌｕｃ発現により評価した。
図６９Ｂに示されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞へのＣＡＲのＬＮＰ媒介性送達によるＴ細胞のＢＣＭＡ ＣＡＲの発現、及びそれが、操作されたＫ５６２細胞において特異的な抗原依存的様式で腫瘍細胞を溶解する能力、がある。
実施例６８
抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍活性を示す。
ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で活性化し、一旦、２００ｎｇの抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現環状ＲＮＡでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションしたＴ細胞を、ＦＬｕｃ＋ Ｎａｌｍ６標的細胞及び非標的Ｆｌｕｃ＋Ｋ５６２細胞と共培養し、ＣＡＲ媒介性殺傷を評価した。共培養後２４時間の後、Ｔ細胞を溶解し、標的細胞及び非標的細胞による残留ＦＬｕｃ発現について調べ、計８日わたり発現及び発現安定性を評価した。
図７０Ａ及びＢに示すように、Ｔ細胞は、環状ＲＮＡ ＣＡＲコンストラクトを特異的抗原依存的に発現する。結果はまた、ＣＡＲをコードする直鎖ｍＲＮＡと比較して、ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡの細胞傷害性の改善、及び機能性表面受容体の送達を示す。
実施例６９
ＡｐｏＥ３で媒介される環状ＲＮＡの有効なＬＮＰトランスフェクション
ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で刺激し、最大６日間増殖させた。６日目、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び緑色蛍光タンパク質を発現する環状ＲＮＡの溶液を、ＡｐｏＥ３を用いて、またはＡｐｏＥ３を用いずに（１μｇ／ｍＬ）Ｔ細胞と共培養した。２４時間後、Ｔ細胞をｌｉｖｅ／ｄｅａｄのＴ細胞について染色し、生きたＴ細胞を、ＧＦＰ発現についてフローサイトメーターで分析した。
図７１Ａ、図７１Ｂ、図７１Ｃ、図７２Ｄ、及び図７１Ｅで示されるように、活性化Ｔ細胞上のＡｐｏＥ３によって効率的ＬＮＰトランスフェクションが媒介され、その後、大幅なペイロード発現が媒介され得る。これらの結果は、複数のドナーにわたり示された。
実施例７０
実施例７０Ａ：脂質ナノ粒子製剤手順
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、輸送ビヒクル組成物の粒径、多分散性指数（ＰＤＩ）及びゼータ電位を決定することができ、粒径の決定においては１×ＰＢＳで、またゼータ電位の決定においては１５ｍＭのＰＢＳで行う。
紫外可視分光法を使用して、輸送ビヒクル組成物中の治療剤及び／または予防剤（例えば、ＲＮＡ）の濃度を決定することができる。１×ＰＢＳに希釈した１００μＬの製剤をメタノールとクロロホルムの４：１（ｖ／ｖ）混合物の９００μＬに加える。混合後、溶液の吸光度スペクトルを、例えば、ＤＵ ８００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）で、２３０ｎｍ～３３０ｎｍで記録する。輸送ビヒクル組成物中の治療剤及び／または予防剤の濃度は、その組成物中に使用されている治療剤及び／または予防剤の吸光係数に基づいて、また波長、例えば、２６０ｎｍでの吸光度と、波長、例えば、３３０ｎｍでのベースライン値の間の差に基づいて計算することができる。
ＲＮＡを含む輸送ビヒクル組成物の場合、ＱＵＡＮＴ－ＩＴ（商標）ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、輸送ビヒクル組成物によるＲＮＡの封入を評価することができる。試料を、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で、約５μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬの濃度まで希釈する。５０μＬの希釈試料を、ポリスチレン９６ウェルプレートに移し、５０μＬのＴＥ緩衝液または５０μＬの２～４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液のいずれかをウェルに加える。プレートを、３７℃の温度にて１５分間インキュベートする。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）試薬を、ＴＥ緩衝液で１：１００または１：２００に希釈し、この溶液の１００μＬを各ウェルに加える。蛍光強度は、蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、励起波長、例えば、約４８０ｎｍ及び発光波長、例えば、約５２０ｎｍにて測定することができる。試薬ブランクの蛍光値を試料の各値から引き、遊離ＲＮＡのパーセンテージを、インタクトな試料（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加しない）の蛍光強度を破壊試料（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の添加によって生じる）の蛍光値で除することで決定する。
実施例７０Ｂ：イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）製剤比が６２：４：３３：１の場合のＲＮＡ封入、ｔｏｔａｌ ｆｌｕｘ、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現パーセント。
表１０ａからの脂質２７、２６、４６、または４５を、イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）の製剤比を６２：４：３３：１（ｍｏｌ％）で使用して脂質ナノ粒子を製剤化し、ＲＮＡ分子を、脂質の窒素－対－リン酸比（Ｎ：Ｐ）＝４．５にて封入した。ＲＮＡの発現は全製剤で存在していた。図７２Ａ及び図７２Ｂにそれぞれ示されるように、脾臓内でより多いｔｏｔａｌ ｆｌｕｘ及び発現パーセントがあった。
Figure 2023525270000595
実施例７０Ｃ：イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）製剤比が５０：１０：３８．５：１．５の場合のＲＮＡ封入、ｔｏｔａｌ ｆｌｕｘ、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現パーセント。
表１０ａからの脂質４６または４５を、イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）の製剤比を５０：１０：３８．５：１．５（ｍｏｌ％）で使用して脂質ナノ粒子を製剤化し、ＲＮＡ分子を、脂質の窒素－対－リン酸比（Ｎ：Ｐ）＝５．７にて封入した。ＲＮＡの発現は全製剤で存在していた。図７２Ｃ及び図７２Ｄにそれぞれ示されるように、脾臓内でより多いｔｏｔａｌ ｆｌｕｘ及び発現パーセントがあった。
Figure 2023525270000596
実施例７０Ｄ：イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）製剤比が５０：１０：３８．５：１．５またはイオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：Ｃ１４－ＰＥＧ（２０００）製剤比が３５：１６：４６：２．５の場合のＲＮＡ封入、ｔｏｔａｌ ｆｌｕｘ、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現パーセント。
表１０ａからの脂質４５または４６を、イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）の製剤比を５０：１０：３８．５：１．５（ｍｏｌ％）で、またはイオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：Ｃ１４－ＰＥＧ（２０００）の製剤比を３５：１６：４６．２．５（ｍｏｌ％）で使用して脂質ナノ粒子を製剤化し、ＲＮＡ分子を、脂質の窒素－対－リン酸比（Ｎ：Ｐ）＝５．７または４．５にて封入した。ＲＮＡの発現は全製剤で存在していた。図７２Ｅ及び図７２Ｆにそれぞれ示されるように、脾臓内でより多いｔｏｔａｌ ｆｌｕｘ及び発現パーセントがあった。
Figure 2023525270000597
実施例７０Ｅ：イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）製剤比が６２：４：３３：１またはイオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）製剤比が５０：１０：３８．５：１．５の場合のＲＮＡ封入、ｔｏｔａｌ ｆｌｕｘ、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現パーセント。
表１０ａからの脂質２６または２７を、イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）の製剤比を６２：４：３３：１（ｍｏｌ％）で（ＲＮＡ分子をＮ：Ｐ比＝４．５にて封入）、またはイオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）の製剤比を５０：１０：３８．５：１．５（ｍｏｌ％）で（ＲＮＡ分子をＮ：Ｐ比＝５．７にて封入）使用して、脂質ナノ粒子を製剤化した。ＲＮＡの発現は全製剤で存在していた。図７２Ｇ及び図７２Ｈにそれぞれ示されるように、脾臓内でより多いｔｏｔａｌ ｆｌｕｘ及び発現パーセントがあった。
Figure 2023525270000598
実施例７０Ｆ：イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）製剤比が５０：１０：３８．５：１．５の場合のＲＮＡ封入、ｔｏｔａｌ ｆｌｕｘ、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現パーセント。
表１０ａからの脂質２６、２７、１３０及び／または表３からの脂質ＩＩＩ－１を、イオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）の製剤比を５０：１０：３８．５：１．５（ｍｏｌ％）で使用して脂質ナノ粒子を製剤化し、ＲＮＡ分子を、Ｎ：Ｐ比＝５．７にて封入した。ＲＮＡの発現は全製剤で存在していた。図７２Ｉ及び図７２Ｊにそれぞれ示されるように、肝臓内でより多いｔｏｔａｌ ｆｌｕｘ及び発現パーセントがあった。
ＴＮＳ及び粒子のｐＫａも計算した。６０μｇ／ｍＬの２－（ｐ－トルイジノ）ナフタレン－６－スルホン酸（ＴＮＳ）を５μＬ、また３０μｇのＲＮＡ／ｍＬ（脂質ナノ粒子）を５μＬにて、ｐＨ２～１２の範囲のＨＥＰＥＳ緩衝液の入ったウェルに添加した。その後、混合物を室温で５分間振盪し、マイクロプレートリーダーを使用して蛍光（励起３２２ｎｍ、発光４３１ｎｍ）を読み取った。蛍光シグナルの変曲点を計算し、粒子のｐＫａを決定した。
Figure 2023525270000599
実施例７０Ｇ：イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）製剤比が６２：４：３３：１またはイオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）製剤比が５０：１０：３８．５：１．５の場合のＲＮＡ封入、ｔｏｔａｌ ｆｌｕｘ、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現パーセント。
表１０ａからの脂質１３９を、イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）の製剤比を６２：４：３３：１（ｍｏｌ％）（ＲＮＡ分子をＮ：Ｐ比＝４．５にて封入）で、またはイオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）の製剤比を５０：１０：３８．５：１．５（ｍｏｌ％）（ＲＮＡ分子をＮ：Ｐ比＝５．７にて封入）で使用して脂質ナノ粒子を製剤化した。ＲＮＡの発現は全製剤で存在していた。図７２Ｋ及び図７２Ｌにそれぞれ示されるように、肝臓内でより多いｔｏｔａｌ ｆｌｕｘ及び発現パーセントがあった。
Figure 2023525270000600
参照による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的かつ個別に参照により本明細書に組み込まれることが示されているかの如く同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (252)

  1. 医薬組成物であって、
    ａ．環状ＲＮＡポリヌクレオチド、及び
    ｂ．式（１）で表されるイオン化可能脂質を含む輸送ビヒクル：
    Figure 2023525270000601
    ［式中、
    各ｎは、独立して、２～１５の整数であり；
    Ｌ１及びＬ３は、それぞれ独立して、－ＯＣ（Ｏ）－＊または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－＊であり、ここで「＊」は、Ｒ１またはＲ３に対する結合点を示し；
    Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立して、直鎖または分岐のＣ９－Ｃ２０アルキルまたはＣ９－Ｃ２０アルケニルであり、任意選択で、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルケニル、アルデヒド、ヘテロシクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、ジヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルアミノアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、（ヘテロシクリル）（アルキル）アミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、アルキニル、アルコキシ、アミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルカルボニルアミノ、アミノカルボニルアルキルアミノ、（アミノカルボニルアルキル）（アルキル）アミノ、アルケニルカルボニルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ヘテロシクリルアルキルアミノカルボニル、（アルキルアミノアルキル）（アルキル）アミノカルボニル、アルキルアミノアルキルカルボニル、ジアルキルアミノアルキルカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アルキルスルホキシド、アルキルスルホキシドアルキル、アルキルスルホニル、及びアルキルスルホンアルキルからなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換され；かつ
    Ｒ２は、
    Figure 2023525270000602
    からなる群から選択される］
    を含む、前記医薬組成物。
  2. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記輸送ビヒクルに封入されている、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記輸送ビヒクルに少なくとも８０％の封入効率で封入されている、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. Ｒ１及びＲ３が、それぞれ独立して、
    Figure 2023525270000603
    からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. Ｒ１とＲ３が同じである、請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  6. Ｒ１とＲ３が異なる、請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  7. 前記輸送ビヒクルが、直径約５６ｎｍ以上である、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  8. 前記輸送ビヒクルが、直径約５６ｎｍ～約１５７ｎｍである、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 前記イオン化可能脂質が、式（１－１）または式（１－２）：
    Figure 2023525270000604
    で表される、請求項１～８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  10. 前記イオン化可能脂質が、
    Figure 2023525270000605
    Figure 2023525270000606
    からなる群から選択される、請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  11. 医薬組成物であって、
    ａ．環状ＲＮＡポリヌクレオチド、及び
    ｂ．式（２）で表されるイオン化可能脂質を含む輸送ビヒクル：
    Figure 2023525270000607
    ［式中、
    各ｎは、独立して、１～１５の整数であり；
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、

    Figure 2023525270000608
    Figure 2023525270000609
    からなる群から選択され；かつ
    Ｒ３は、
    Figure 2023525270000610
    からなる群から選択される］
    を含む、前記医薬組成物。
  12. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記輸送ビヒクルに封入されている、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記輸送ビヒクルに少なくとも８０％の封入効率で封入されている、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 前記イオン化可能脂質が、
    Figure 2023525270000611
    からなる群から選択される、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  15. 医薬組成物であって、
    ａ．環状ＲＮＡポリヌクレオチド、及び
    ｂ．式（３）で表されるイオン化可能脂質を含む輸送ビヒクル：
    Figure 2023525270000612
    ［式中、
    Ｘは、－Ｏ－、－Ｓ－、または－ＯＣ（Ｏ）－＊から選択され、ここで＊は、Ｒ１に対する結合点を示し；
    Ｒ１は、
    Figure 2023525270000613
    からなる群から選択され；かつ
    Ｒ２は、
    Figure 2023525270000614
    からなる群から選択される］
    を含む、前記医薬組成物。
  16. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記輸送ビヒクルに封入されている、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記輸送ビヒクルに少なくとも８０％の封入効率で封入されている、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. 前記イオン化可能脂質が、式（３－１）、式（３－２）、または式（３－３）：
    Figure 2023525270000615
    で表される、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  19. 前記イオン化可能脂質が、
    Figure 2023525270000616
    からなる群から選択される、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  20. 医薬組成物であって、
    ａ．環状ＲＮＡポリヌクレオチド、及び
    ｂ．式（４）で表されるイオン化可能脂質を含む輸送ビヒクル：
    Figure 2023525270000617
    ［式中、
    各ｎは、独立して、２～１５の整数であり；かつ
    Ｒ２は、請求項２で定義されるとおりである］
    を含む、前記医薬組成物。
  21. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記輸送ビヒクルに封入されている、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記輸送ビヒクルに少なくとも８０％の封入効率で封入されている、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. 医薬組成物であって、
    ａ．環状ＲＮＡポリヌクレオチド、及び
    ｂ．式（６）で表されるイオン化可能脂質を含む輸送ビヒクル：
    Figure 2023525270000618
    ［式中、
    各ｎは、独立して、０～１５の整数であり；
    Ｌ１及びＬ３は、それぞれ独立して、－ＯＣ（Ｏ）－＊または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－＊であり、ここで「＊」は、Ｒ１またはＲ３に対する結合点を示し；
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、直鎖または分岐のＣ９－Ｃ２０アルキルまたはＣ９－Ｃ２０アルケニルであり、任意選択で、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルケニル、アルデヒド、ヘテロシクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、ジヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルアミノアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、（ヘテロシクリル）（アルキル）アミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、アルキニル、アルコキシ、アミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルカルボニルアミノ、アミノカルボニルアルキルアミノ、（アミノカルボニルアルキル）（アルキル）アミノ、アルケニルカルボニルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ヘテロシクリルアルキルアミノカルボニル、（アルキルアミノアルキル）（アルキル）アミノカルボニル、アルキルアミノアルキルカルボニル、ジアルキルアミノアルキルカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アルキルスルホキシド、アルキルスルホキシドアルキル、アルキルスルホニル、及びアルキルスルホンアルキルからなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換され；
    Ｒ３は、
    Figure 2023525270000619
    からなる群から選択され；かつ
    Ｒ４は、直鎖または分岐したＣ１－Ｃ１５アルキルまたはＣ１－Ｃ１５アルケニルである］
    を含む、前記医薬組成物。
  24. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記輸送ビヒクルに封入されている、請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記輸送ビヒクルに少なくとも８０％の封入効率で封入されている、請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立して、
    Figure 2023525270000620
    Figure 2023525270000621
    からなる群から選択される、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  27. Ｒ１とＲ２が同じである、請求項２３～２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  28. Ｒ１とＲ２が異なる、請求項２３～２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  29. 前記イオン化可能脂質が、
    Figure 2023525270000622
    Figure 2023525270000623
    からなる群から選択される、請求項２３～２８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  30. 医薬組成物であって、
    ａ．環状ＲＮＡポリヌクレオチド、及び
    ｂ．表１０ａから選択されるイオン化可能脂質を含む輸送ビヒクル
    を含む、前記医薬組成物。
  31. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記輸送ビヒクルに封入されている、請求項３０に記載の医薬組成物。
  32. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記輸送ビヒクルに少なくとも８０％の封入効率で封入されている、請求項３１に記載の医薬組成物。
  33. 前記環状ＲＮＡが、第１の発現配列を含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  34. 前記第１の発現配列が、治療用タンパク質をコードする、請求項３３に記載の医薬組成物。
  35. 前記第１の発現配列が、サイトカインまたはその機能的フラグメントをコードする、請求項３３に記載の医薬組成物。
  36. 前記第１の発現配列が、転写因子をコードする、請求項３３に記載の医薬組成物。
  37. 前記第１の発現配列が、免疫チェックポイント阻害剤をコードする、請求項３３に記載の医薬組成物。
  38. 前記第１の発現配列が、キメラ抗原受容体をコードする、請求項３３に記載の医薬組成物。
  39. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、第２の発現配列をさらに含む、請求項１～３８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  40. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む、請求項３９に記載の医薬組成物。
  41. 前記第１及び前記第２の発現配列が、リボソームスキッピングエレメント、またはプロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列によって区切られている、請求項３９に記載の医薬組成物。
  42. 前記第１の発現配列が第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖をコードし、前記第２の発現配列が第２のＴＣＲ鎖をコードする、請求項３９～４１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  43. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、１つ以上のマイクロＲＮＡ結合部位を含む、請求項１～４２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  44. 前記マイクロＲＮＡ結合部位が、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡによって認識される、請求項４３に記載の医薬組成物。
  45. 前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１２２によって認識される、請求項４３または４４に記載の医薬組成物。
  46. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、ヒト免疫細胞において参照ヒト細胞よりも多いタンパク質発現に関連する第１のＩＲＥＳを含む、請求項１～４５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  47. 前記ヒト免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、または好中球である、請求項４６に記載の医薬組成物。
  48. 前記参照ヒト細胞が、肝細胞である、請求項４６または４７に記載の医薬組成物。
  49. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、
    ａ．３’グループＩイントロンフラグメントのスプライシング後イントロンフラグメント、
    ｂ．ＩＲＥＳ、
    ｃ．発現配列、及び
    ｄ．５’グループＩイントロンフラグメントのスプライシング後イントロンフラグメント
    をこの順序で含む、請求項１～４８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  50. 前記３’グループＩイントロンフラグメントの前記スプライシング後イントロンフラグメントの前に第１のスペーサー、及び前記５’グループＩイントロンフラグメントの前記スプライシング後イントロンフラグメントの後に第２のスペーサーを含む、請求項４９に記載の医薬組成物。
  51. 前記第１及び前記第２のスペーサーがそれぞれ、長さ約１０～約６０ヌクレオチドである、請求項５０に記載の医薬組成物。
  52. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、
    ａ．３’グループＩイントロンフラグメント、
    ｂ．ＩＲＥＳ、
    ｃ．発現配列、及び
    ｄ．５’グループＩイントロンフラグメント
    をこの順序で含むＲＮＡポリヌクレオチドの環状化により作製される、請求項１～５１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  53. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、
    ａ．５’外部二重鎖形成領域、
    ｂ．３’グループＩイントロンフラグメント、
    ｃ．５’内部二重鎖形成領域を任意選択で含む５’内部スペーサー、
    ｄ．ＩＲＥＳ、
    ｅ．発現配列、
    ｆ．３’内部二重鎖形成領域を任意選択で含む３’内部スペーサー、
    ｇ．５’グループＩイントロンフラグメント、及び
    ｈ．３’外部二重鎖形成領域
    をこの順序で含むＲＮＡポリヌクレオチドの環状化により作製される、請求項１～５１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  54. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、
    ａ．５’外部二重鎖形成領域、
    ｂ．５’外部スペーサー、
    ｃ．３’グループＩイントロンフラグメント、
    ｄ．５’内部二重鎖形成領域を任意選択で含む５’内部スペーサー、
    ｅ．ＩＲＥＳ、
    ｆ．発現配列、
    ｇ．３’内部二重鎖形成領域を任意選択で含む３’内部スペーサー、
    ｈ．５’グループＩイントロンフラグメント、
    ｉ．３’外部スペーサー、及び
    ｊ．３’外部二重鎖形成領域
    をこの順序で含むＲＮＡポリヌクレオチドの環状化により作製される、請求項１～５１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  55. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、
    ａ．３’グループＩイントロンフラグメント、
    ｂ．５’内部二重鎖形成領域を含む５’内部スペーサー、
    ｃ．ＩＲＥＳ、
    ｄ．発現配列、
    ｅ．３’内部二重鎖形成領域を含む３’内部スペーサー、及び
    ｆ．５’グループＩイントロンフラグメント
    をこの順序で含むＲＮＡポリヌクレオチドの環状化により作製される、請求項１～５１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  56. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、
    ａ．５’外部二重鎖形成領域、
    ｂ．５’外部スペーサー、
    ｃ．３’グループＩイントロンフラグメント、
    ｄ．５’内部二重鎖形成領域を含む５’内部スペーサー、
    ｅ．ＩＲＥＳ、
    ｆ．発現配列、
    ｇ．３’内部二重鎖形成領域を含む３’内部スペーサー、
    ｈ．５’グループＩイントロンフラグメント、
    ｉ．３’外部スペーサー、及び
    ｊ．３’外部二重鎖形成領域
    をこの順序で含むＲＮＡポリヌクレオチドの環状化により作製される、請求項１～５１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  57. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、
    ａ．第１のポリＡ配列、
    ｂ．５’外部二重鎖形成領域、
    ｃ．５’外部スペーサー、
    ｄ．３’グループＩイントロンフラグメント、
    ｅ．５’内部二重鎖形成領域を含む５’内部スペーサー、
    ｆ．ＩＲＥＳ、
    ｇ．発現配列、
    ｈ．３’内部二重鎖形成領域を含む３’内部スペーサー、
    ｉ．５’グループＩイントロンフラグメント、
    ｊ．３’外部スペーサー、
    ｋ．３’外部二重鎖形成領域、及び
    ｌ．第２のポリＡ配列
    をこの順序で含むＲＮＡポリヌクレオチドの環状化により作製される、請求項１～５１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  58. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、
    ａ．第１のポリＡ配列、
    ｂ．５’外部スペーサー、
    ｃ．３’グループＩイントロンフラグメント、
    ｄ．５’内部二重鎖形成領域を含む５’内部スペーサー、
    ｅ．ＩＲＥＳ、
    ｆ．発現配列、
    ｇ．３’内部二重鎖形成領域を含む３’内部スペーサー、
    ｈ．５’グループＩイントロンフラグメント、
    ｉ．３’外部スペーサー、及び
    ｊ．第２のポリＡ配列
    をこの順序で含むＲＮＡポリヌクレオチドの環状化により作製される、請求項１～５１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  59. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、
    ａ．第１のポリＡ配列、
    ｂ．５’外部スペーサー、
    ｃ．３’グループＩイントロンフラグメント、
    ｄ．５’内部二重鎖形成領域を含む５’内部スペーサー、
    ｅ．ＩＲＥＳ、
    ｆ．発現配列、
    ｇ．終止コドンカセット、
    ｈ．３’内部二重鎖形成領域を含む３’内部スペーサー、
    ｉ．５’グループＩイントロンフラグメント、
    ｊ．３’外部スペーサー、及び
    ｋ．第２のポリＡ配列
    をこの順序で含むＲＮＡポリヌクレオチドの環状化により作製される、請求項１～５１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  60. 前記３’または前記５’内部スペーサーまたは外部スペーサーのうちの少なくとも１つが、長さ約８～約６０ヌクレオチドである、請求項５３～５９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  61. 前記３’及び前記５’外部二重鎖形成領域がそれぞれ、長さ約１０～５０ヌクレオチドである、請求項５３～５４及び５６～５７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  62. 前記３’及び前記５’内部二重鎖形成領域がそれぞれ、長さ約６～３０ヌクレオチドである、請求項５３～６１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  63. 前記ＩＲＥＳが、表１７から選択されるか、またはその機能的フラグメントもしくはバリアントである、請求項５２～６２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  64. 前記ＩＲＥＳが、タウラ症候群ウイルス、トリアトーマウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、シミアンウイルス４０、ヒアリ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ）ウイルス１、ムギクビレアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉ）ウイルス、細網内皮症ウイルス、ヒトポリオウイルス１、チャバネアオカメムシ（Ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ）腸ウイルス、カシミールハチウイルス、ヒトライノウイルス２、ホマロディスカ・コアグラタ（Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ ｃｏａｇｕｌａｔａ）ウイルス－１、ヒト免疫不全ウイルス１型、ホマロディスカ・コアグラタウイルス－１、ヒメトビＰウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ＧＢ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒトエンテロウイルス７１、ウマ鼻炎ウイルス、ウスジロエダシャク（Ｅｃｔｒｏｐｉｓ ｏｂｌｉｑｕａ）ピコルナ様ウイルス、脳心筋炎ウイルス、ショウジョウバエＣウイルス、ヒトコクサッキーウイルスＢ３、アブラナ科トバモウイルス、コオロギ麻痺ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス１、黒色女王蜂児ウイルス、アブラムシ致死麻痺ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、急性ミツバチ麻痺ウイルス、ハイビスカス退緑輪点ウイルス、古典的ブタ熱ウイルス、ヒトＦＧＦ２、ヒトＳＦＴＰＡ１、ヒトＡＭＬ１／ＲＵＮＸ１、ショウジョウバエアンテナペディア、ヒトＡＱＰ４、ヒトＡＴ１Ｒ、ヒトＢＡＧ－１、ヒトＢＣＬ２、ヒトＢｉＰ、ヒトｃ－ＩＡＰｌ、ヒトｃ－ｍｙｃ、ヒトｅＩＦ４Ｇ、マウスＮＤＳＴ４Ｌ、ヒトＬＥＦ１、マウスＨＩＦ１アルファ、ヒトｎ．ｍｙｃ、マウスＧｔｘ、ヒトｐ２７ｋｉｐｌ、ヒトＰＤＧＦ２／ｃ－ｓｉｓ、ヒトｐ５３、ヒトＰｉｍ－１、マウスＲｂｍ３、ショウジョウバエ リーパー（ｒｅａｐｅｒ）、イヌ スキャンパー（Ｓｃａｍｐｅｒ）、ショウジョウバエＵｂｘ、ヒトＵＮＲ、マウスＵｔｒＡ、ヒトＶＥＧＦ－Ａ、ヒトＸＩＡＰ、ショウジョウバエ ヘアレス（ｈａｉｒｌｅｓｓ）、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＦＩＩＤ、出芽酵母ＹＡＰ１、タバコエッチウイルス、カブクリンクルウイルス、ＥＭＣＶ－Ａ、ＥＭＣＶ－Ｂ、ＥＭＣＶ－Ｂｆ、ＥＭＣＶ－Ｃｆ、ＥＭＣＶ ｐＥＣ９、ピコビルナウイルス、ＨＣＶ ＱＣ６４、ヒトコサウイルス Ｅ／Ｄ、ヒトコサウイルスＦ、ヒトコサウイルスＪＭＹ、ライノウイルスＮＡＴ００１、ＨＲＶ１４、ＨＲＶ８９、ＨＲＶＣ－０２、ＨＲＶ－Ａ２１、サリウイルスＡ ＳＨ１、サリウイルスＦＨＢ、サリウイルスＮＧ－Ｊ１、ヒトパレコウイルス１、クロヒウイルスＢ、Ｙｃ－３、ロザウイルスＭ－７、シャンバウイルスＡ、パシウイルスＡ、パシウイルスＡ ２、エコーウイルスＥ１４、ヒトパレコウイルス５、アイチウイルス、Ａ型肝炎ウイルスＨＡ１６、フォピウイルス、ＣＶＡ１０、エンテロウイルスＣ、エンテロウイルスＤ、エンテロウイルスＪ、ヒトペギウイルス２、ＧＢＶ－Ｃ ＧＴ１１０、ＧＢＶ－Ｃ Ｋ１７３７、ＧＢＶ－Ｃ Ｉｏｗａ、ペギウイルスＡ １２２０、パシウイルスＡ ３、サペロウイルス、ロザウイルスＢ、バクンサ（Ｂａｋｕｎｓａ）ウイルス、トレモウイルスＡ、ブタパシウイルス１、ＰＬＶ－ＣＨＮ、パシウイルスＡ、シシニウイルス、ヘパシウイルスＫ、ヘパシウイルスＡ、ＢＶＤＶ１、ボーダー病ウイルス、ＢＶＤＶ２、ＣＳＦＶ－ＰＫ１５Ｃ、ＳＦ５７３ジシストロウイルス、湖北ピコルナ様ウイルス、ＣＲＰＶ、セスジネズミ（Ａｐｏｄｅｍｕｓ Ａｇｒａｒｉｕｓ）ピコルナウイルス、ヤギコブウイルス、パラボウイルス、サリウイルスＡ ＢＮ５、サリウイルスＡ ＢＮ２、サリウイルスＡ ０２３９４、サリウイルスＡ ＧＵＴ、サリウイルスＡ ＣＨ、サリウイルスＡ ＳＺ１、サリウイルスＦＨＢ、ＣＶＢ３、ＣＶＢ１、エコーウイルス７、ＣＶＢ５、ＥＶＡ７１、ＣＶＡ３、ＣＶＡ１２、ＥＶ２４、またはｅＩＦ４Ｇに対するアプタマーからのＩＲＥＳの配列を有する、請求項５２～６２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  65. 前記第１及び前記第２のポリＡ配列がそれぞれ、長さ約１５～５０ｎｔである、請求項５７～６４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  66. 前記第１及び前記第２のポリＡ配列がそれぞれ、長さ約２０～２５ｎｔである、請求項５７～６４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  67. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の天然に存在するヌクレオチドを含有する、請求項１～６６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  68. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、天然に存在するヌクレオチドからなる、請求項１～６７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  69. 前記発現配列が、コドン最適化されている、請求項３３～６８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  70. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、最適化される前の同等のポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠くよう最適化されている、請求項１～６９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  71. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが発現される細胞中に存在する、マイクロＲＮＡに結合することのできる少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠くよう最適化されている、請求項１～７０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  72. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、最適化される前の同等のポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ感受性部位を欠くよう最適化されている、請求項１～７１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  73. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼが発現される細胞中に存在する、前記エンドヌクレアーゼによって切断されることのできる少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ感受性部位を欠くよう最適化されている、請求項１～７２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  74. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、最適化される前の同等のポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つのＲＮＡ編集感受性部位を欠くよう最適化されている、請求項１～７３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  75. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、長さ約１００ｎｔ～約１０，０００ｎｔである、請求項１～７４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  76. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、長さ約１００ｎｔ～約１５，０００ｎｔである、請求項１～７５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  77. 前記環状ＲＮＡが、前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドと同じ発現配列を有する参照直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドよりもコンパクトである、請求項１～７６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  78. ヒト細胞での治療効果の持続期間が、前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドと同じ発現配列を有する参照直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物と同程度であるかまたはそれ以上である、請求項１～７７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  79. 前記参照直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドが、未修飾であるかまたはヌクレオシド修飾されている完全にプロセシングされた直鎖ｍＲＮＡであり、ｃａｐ１構造及び少なくとも８０ｎｔ長のポリＡテールを含む、請求項７８に記載の医薬組成物。
  80. ヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの治療効果の持続期間が、前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドと同じ発現配列を有する参照直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物を超える、請求項１～７９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  81. ヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの治療効果の持続期間が、少なくとも約１０時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約８０時間、少なくとも約９０時間、または少なくとも約１００時間である、請求項１～８０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  82. ヒト細胞での機能的半減期が、既定の閾値と同程度であるかまたはそれ以上である、請求項１～８１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  83. ヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの機能的半減期が、既定の閾値を超える、請求項１～８２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  84. 前記機能的半減期が、機能性タンパク質アッセイによって決定される、請求項８２または８３に記載の医薬組成物。
  85. 前記機能性タンパク質アッセイが、ｉｎ ｖｉｔｒｏルシフェラーゼアッセイである、請求項８４に記載の医薬組成物。
  86. 前記機能性タンパク質アッセイが、患者の血清または組織試料における前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドの前記発現配列によってコードされるタンパク質のレベルを測定することを含む、請求項８４に記載の医薬組成物。
  87. 前記既定の閾値が、前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドと同じ発現配列を含む参照直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの機能的半減期である、請求項８２～８６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  88. 機能的半減期が少なくとも約２０時間である、請求項１～８７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  89. 構造脂質及びＰＥＧ修飾脂質をさらに含む、請求項１～８８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  90. 前記構造脂質が、Ｃ１ｑに結合する、及び／または前記構造脂質を欠く対照輸送ビヒクルと比較して、前記脂質を含む前記輸送ビヒクルのＣ１ｑへの結合を促進する、及び／または前記構造脂質を欠く対照輸送ビヒクルと比較して、Ｃ１ｑが結合した輸送ビヒクルの免疫細胞への取り込みを増加させる、請求項８９に記載の医薬組成物。
  91. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、または好中球である、請求項９０に記載の医薬組成物。
  92. 前記構造脂質が、コレステロールである、請求項８９～９１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  93. 前記構造脂質が、ベータ－シトステロールである、請求項９２に記載の医薬組成物。
  94. 前記構造脂質が、ベータ－シトステロールではない、請求項９２に記載の医薬組成物。
  95. 前記ＰＥＧ修飾脂質が、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＭＧ－ＰＥＧ、またはＰＥＧ－１である、請求項８９～９４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  96. 前記ＰＥＧ修飾脂質が、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）である、請求項９５に記載の医薬組成物。
  97. ヘルパー脂質をさらに含む、請求項１～９６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  98. 前記ヘルパー脂質が、ＤＳＰＣまたはＤＯＰＥである、請求項９７に記載の医薬組成物。
  99. ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧをさらに含む、請求項１～９７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  100. 前記輸送ビヒクルが、モル比で約０．５％～約４％のＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項１～９９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  101. 前記輸送ビヒクルが、モル比で約１％～約２％のＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項１～１００のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  102. 前記輸送ビヒクルが、
    ａ．
    Figure 2023525270000624
    またはその混合物から選択されるイオン化可能脂質、
    ｂ．ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣから選択されるヘルパー脂質、
    ｃ．コレステロール、及び
    ｄ．ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）またはＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）から選択されるＰＥＧ脂質
    を含む、請求項１～１０１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  103. 前記輸送ビヒクルが、
    ａ．
    Figure 2023525270000625
    またはその混合物から選択からされるイオン化可能脂質、
    ｂ．ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣから選択されるヘルパー脂質、
    ｃ．コレステロール、及び
    ｄ．ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）またはＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）から選択されるＰＥＧ脂質
    を含む、請求項１～１０１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  104. 前記輸送ビヒクルが、
    ａ．
    Figure 2023525270000626
    またはその混合物から選択されるイオン化可能脂質、
    ｂ．ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣから選択されるヘルパー脂質、
    ｃ．コレステロール、及び
    ｄ．ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）であるＰＥＨ脂質
    を含む、請求項１～１０１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  105. 前記輸送ビヒクルが、
    ａ．
    Figure 2023525270000627
    またはその混合物から選択されるイオン化可能脂質、
    ｂ．ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣから選択されるヘルパー脂質、
    ｃ．コレステロール、及び
    ｄ．ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）、ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）、またはＣ１４－ＰＥＧ（２０００）から選択されるＰＥＧ脂質
    を含む、請求項１～１０１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  106. 前記輸送ビヒクルが、
    ａ．
    Figure 2023525270000628
    またはその混合物から選択されるイオン化可能脂質、
    ｂ．ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣから選択されるヘルパー脂質、
    ｃ．コレステロール、及び
    ｄ．ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）であるＰＥＨ脂質
    を含む、請求項１～１０１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  107. 前記輸送ビヒクルが、
    ａ．
    Figure 2023525270000629
    またはその混合物から選択されるイオン化可能脂質、
    ｂ．ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣから選択されるヘルパー脂質、
    ｃ．コレステロール、及び
    ｄ．ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）またはＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）から選択されるＰＥＨ脂質
    を含む、請求項１～１０１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  108. 前記輸送ビヒクルが、
    ａ．
    Figure 2023525270000630
    Figure 2023525270000631
    またはその混合物から選択されるイオン化可能脂質、
    ｂ．ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣから選択されるヘルパー脂質、
    ｃ．コレステロール、及び
    ｄ．ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）、ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）、またはＣ１４－ＰＥＧ（２０００）から選択されるＰＥＨ脂質
    を含む、請求項１～１０１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  109. イオン化可能脂質：ヘルパー脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質のモル比が、６２：４：３３：１である、請求項１０２～１０８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  110. イオン化可能脂質：ヘルパー脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質のモル比が、５０：１０：３８．５：１．５である、請求項１０２～１０８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  111. イオン化可能脂質：ヘルパー脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質のモル比が、３５：１６：４６：２．５である、請求項１０２～１０８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  112. イオン化可能脂質：ヘルパー脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質のモル比が、４０：１０：４０：１０である、請求項１０２～１０８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  113. 前記輸送ビヒクルが、ＤＯＰＥである前記ヘルパー脂質及びＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）である前記ＰＥＧ脂質を含み、イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）のモル比が、６２：４：３３：１である、請求項１０２～１０８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  114. 前記輸送ビヒクルが、ＤＯＰＥである前記ヘルパー脂質及びＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）である前記ＰＥＧ脂質を含み、イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）のモル比が、５０：１０：３８．５：１．５である、請求項１０２～１０８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  115. 前記輸送ビヒクルが、ＤＯＰＥである前記ヘルパー脂質及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）である前記ＰＥＧ脂質を含み、イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）のモル比が、６２：４：３３：１である、請求項１０２～１０８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  116. 前記輸送ビヒクルが、ＤＯＰＥである前記ヘルパー脂質及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）である前記ＰＥＧ脂質を含み、イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）のモル比が、５０：１０：３８．５：１．５である、請求項１０２～１０８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  117. 前記輸送ビヒクルが、ＤＳＰＣである前記ヘルパー脂質及びＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）である前記ＰＥＧ脂質を含み、イオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）のモル比が、６２：４：３３：１である、請求項１０２～１０８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  118. 前記輸送ビヒクルが、ＤＳＰＣである前記ヘルパー脂質及びＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）である前記ＰＥＧ脂質を含み、イオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）のモル比が、５０：１０：３８．５：１．５である、請求項１０２～１０８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  119. 前記輸送ビヒクルが、ＤＳＰＣである前記ヘルパー脂質及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）である前記ＰＥＧ脂質を含み、イオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）のモル比が、６２：４：３３：１である、請求項１０２～１０８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  120. 前記輸送ビヒクルが、ＤＳＰＣである前記ヘルパー脂質及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）である前記ＰＥＧ脂質を含み、イオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）のモル比が、５０：１０：３８．５：１．５である、請求項１０２～１０８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  121. 前記輸送ビヒクルが、ＤＯＰＥである前記ヘルパー脂質を含み、前記ＰＥＧ脂質がＣ１４－ＰＥＧ（２０００）であり、イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：Ｃ１４－ＰＥＧ（２０００）のモル比が、３５：１６：４６．５：２．５である、請求項１０２～１０８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  122. 前記輸送ビヒクルが、ＤＳＰＣである前記ヘルパー脂質を含み、前記ＰＥＧ脂質がＣ１４－ＰＥＧ（２０００）であり、イオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：Ｃ１４－ＰＥＧ（２０００）のモル比が、３５：１６：４６．５：２．５である、請求項１０２～１０８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  123. 前記輸送ビヒクルが、ＤＯＰＥである前記ヘルパー脂質及びＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）である前記ＰＥＧ脂質を含み、イオン化可能脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）のモル比が、４０：１０：４０：１０である、請求項１０２～１０８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  124. 前記輸送ビヒクルが、ＤＳＰＣである前記ヘルパー脂質及びＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）である前記ＰＥＧ脂質を含み、イオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ（２０００）のモル比が、４０：１０：４０：１０である、請求項１０２～１０８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  125. 脂質の窒素－対－リン酸（Ｎ：Ｐ）比が約３～約６である、請求項１～１２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  126. 脂質の窒素－対－リン酸（Ｎ：Ｐ）比が約４、約４．５、約５、または約５．５である、請求項１～１２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  127. 前記輸送ビヒクルが、前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドのエンドソーム放出のために配合されている、請求項１～１２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  128. 前記輸送ビヒクルが、ＡＰＯＥに結合することができる、請求項１～１２７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  129. 前記輸送ビヒクルが、前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドと同じ発現配列を有する参照直鎖ＲＮＡが搭載された同等の輸送ビヒクルほど、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）と相互作用しない、請求項１～１２８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  130. 前記輸送ビヒクルの外面が、ＡＰＯＥ結合部位を実質的に含まない、請求項１～１２９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  131. 前記輸送ビヒクルが、直径約１２０ｎｍ未満である、請求項１～１３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  132. 前記輸送ビヒクルが、直径３００ｎｍを超える凝集体を形成しない、請求項１～１３１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  133. 前記輸送ビヒクルの、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が、約３０時間未満である、請求項１～１３２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  134. 前記輸送ビヒクルが、低比重リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）依存的に細胞に取り込まれることができる、請求項１～１３３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  135. 前記輸送ビヒクルが、ＬＤＬＲ非依存的に細胞に取り込まれることができる、請求項１～１３４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  136. 直鎖ＲＮＡを実質的に含まない、請求項１～１３５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  137. 前記輸送ビヒクルに機能的に接続された標的指向性部分をさらに含む、請求項１～１３６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  138. 前記標的指向性部分が、免疫細胞抗原と特異的に結合するかまたは間接的に結合する、請求項１３７に記載の医薬組成物。
  139. 前記免疫細胞抗原が、Ｔ細胞抗原である、請求項１３８に記載の医薬組成物。
  140. 前記Ｔ細胞抗原が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ４、ベータ７インテグリン、ベータ２インテグリン、及びＣ１ｑＲからなる群から選択される、請求項１３９に記載の医薬組成物。
  141. 輸送ビヒクル結合部分と細胞結合部分とを含むアダプター分子をさらに含み、前記標的指向性部分が前記輸送ビヒクル結合部分に特異的に結合し、前記細胞結合部分が標的細胞抗原に特異的に結合する、請求項１３７に記載の医薬組成物。
  142. 前記標的細胞抗原が、免疫細胞抗原である、請求項１４１に記載の医薬組成物。
  143. 前記免疫細胞抗原が、Ｔ細胞抗原、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、または好中球である、請求項１４２に記載の医薬組成物。
  144. 前記Ｔ細胞抗原が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ４、ベータ７インテグリン、ベータ２インテグリン、ＣＤ２５、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ａ２ａ受容体、Ａ２ｂ受容体、及びＣ１ｑＲからなる群から選択される、請求項１４３に記載の医薬組成物。
  145. 前記免疫細胞抗原が、マクロファージ抗原である、請求項１３８に記載の医薬組成物。
  146. 前記マクロファージ抗原が、マンノース受容体、ＣＤ２０６、及びＣ１ｑからなる群から選択される、請求項１４５に記載の医薬組成物。
  147. 前記標的指向性部分が、小分子である、請求項１３７～１４６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  148. 前記小分子が、マンノース、レクチン、アシビシン、ビオチン、またはジゴキシゲニンである、請求項１４７に記載の医薬組成物。
  149. 前記小分子が、免疫細胞上のエクト酵素に結合し、前記エクト酵素が、ＣＤ３８、ＣＤ７３、アデノシン２ａ受容体、及びアデノシン２ｂ受容体からなる群から選択される、請求項１４７に記載の医薬組成物。
  150. 前記標的指向性部分が、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、ナノボディ、ペプチド、ペプチドベースのマクロ環、ミニボディ、小分子リガンド、例えば、葉酸塩、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）、もしくはフェノール可溶性モジュリンアルファ１ペプチド（ＰＳＭＡ１）、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはそのフラグメントである、請求項１３７～１４６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  151. 前記イオン化可能脂質の、細胞膜での半減期が、約２週間未満である、請求項１～１５０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  152. 前記イオン化可能脂質の、細胞膜での半減期が、約１週間未満である、請求項１～１５１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  153. 前記イオン化可能脂質の、細胞膜での半減期が、約３０時間未満である、請求項１～１５２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  154. 前記イオン化可能脂質の、細胞膜での半減期が、前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドの前記機能的半減期未満である、請求項１～１５３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  155. 疾患、障害、または状態を処置または予防する方法であって、請求項１～１５４のいずれか１項に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
  156. 前記疾患、障害、または状態が、表２７または表２８から選択されるポリペプチドの異常な発現、活性、または局在化と関連する、請求項１５５に記載の方法。
  157. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、治療用タンパク質をコードする、請求項１５５または１５６に記載の方法。
  158. 脾臓での治療用タンパク質発現が、肝臓での治療用タンパク質発現よりも高い、請求項１５７に記載の方法。
  159. 脾臓での治療用タンパク質発現が、肝臓での治療用タンパク質発現の少なくとも約２．９倍である、請求項１５８に記載の方法。
  160. 前記治療用タンパク質が、肝臓では機能的レベルで発現しない、請求項１５８に記載の方法。
  161. 前記治療用タンパク質が、肝臓では検出可能レベルで発現しない、請求項１５８に記載の方法。
  162. 脾臓での治療用タンパク質発現が、総治療用タンパク質発現の少なくとも約５０％である、請求項１５８に記載の方法。
  163. 脾臓での治療用タンパク質発現が、総治療用タンパク質発現の少なくとも約６３％である、請求項１５８に記載の方法。
  164. ５’から３’方向へ、３’グループＩイントロンフラグメント、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現配列、及び５’グループＩイントロンフラグメントを含み、前記３’グループＩイントロンフラグメントに対して５’に第１のスペーサーを及び／または前記５’グループＩイントロンフラグメントに対して３’に第２のスペーサーをさらに含む、直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  165. 前記３’グループＩイントロンフラグメントに対して５’に第１のスペーサーを含む、請求項１６４に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  166. 前記第１のスペーサーが、長さ１０～５０ヌクレオチドであり、任意選択で１０～２０ヌクレオチド、さらに任意選択で約１５ヌクレオチドである、請求項１６５に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  167. 前記第１のスペーサーが、ポリＡ配列を含む、請求項１６５または１６６に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  168. 前記５’グループＩイントロンフラグメントに対して３’に第２のスペーサーを含む、請求項１６４～１６７のいずれか１項に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  169. 前記第２のスペーサーが、長さ１０～５０ヌクレオチドであり、任意選択で１０～２０ヌクレオチド、さらに任意選択で約１５ヌクレオチドである、請求項１６８に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  170. 前記第２のスペーサーが、ポリＡ配列を含む、請求項１６８または１６９に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  171. 前記３’グループＩイントロンフラグメントと前記内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）との間に第３のスペーサーをさらに含む、請求項１６４～１７０のいずれか１項に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  172. 前記第３のスペーサーが、長さ約１０～約６０ヌクレオチドである、請求項１７１に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  173. 二重鎖を形成することのできる第１及び第２の二重鎖形成領域をさらに含む、請求項１６４～１７２のいずれか１項に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  174. 前記第１及び前記第２の二重鎖形成領域がそれぞれ、長さ約９～１９ヌクレオチドであり、任意選択で、前記第１及び前記第２の二重鎖形成領域がそれぞれ、長さ約３０ヌクレオチドである、請求項１７３に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  175. ５’から３’方向へ、第１のポリＡ配列、５’外部スペーサー、３’グループＩイントロンフラグメント、５’内部二重鎖形成領域を含む５’内部スペーサー、ＩＲＥＳ、発現配列、終止コドンカセット、３’内部二重鎖形成領域を含む３’内部スペーサー、５’グループＩイントロンフラグメント、３’外部スペーサー、及び第２のポリＡ配列を含む、請求項１６４～１７４のいずれか１項に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  176. 前記直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドが、参照直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドと比較して、発現、環状化効率、機能的安定性、及び／または安定性が増強されており、
    前記参照直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドが、５’から３’方向へ、参照３’グループＩイントロンフラグメント、参照ＩＲＥＳ、参照発現配列、及び参照５’グループＩイントロンフラグメントを含み、前記３’グループＩイントロンフラグメントに対して５’にスペーサーをもしくは前記５’グループＩイントロンフラグメントに対して３’にスペーサーを含まない、
    請求項１６４～１７５のいずれか１項に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  177. 前記発現配列及び前記参照発現配列が同じ配列を有する、請求項１７６に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  178. 前記ＩＲＥＳ及び前記参照ＩＲＥＳが同じ配列を有する、請求項１７６または１７７に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  179. ３’アナベナグループＩイントロンフラグメント及び５’アナベナグループＩイントロンフラグメントを含む、請求項１６４～１７８のいずれか１項に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  180. 前記参照ＲＮＡポリヌクレオチドが、参照３’アナベナグループＩイントロンフラグメント及び参照５’アナベナグループＩイントロンフラグメントを含む、請求項１７９に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  181. 前記参照３’アナベナグループＩイントロンフラグメント及び前記参照５’アナベナグループＩイントロンフラグメントが、Ｌ６－５順列置換部位を使用して作製された、請求項１８０に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  182. 前記３’アナベナグループＩイントロンフラグメント及び前記５’アナベナグループＩイントロンフラグメントが、Ｌ６－５順列置換部位を使用して作製されなかった、請求項１８０または１８１に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  183. 前記３’アナベナグループＩイントロンフラグメントが、配列番号１１２～１２３及び１２５～１５０から選択される配列を含むかまたはそれからなる、請求項１７９～１８２のいずれか１項に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  184. 前記５’アナベナグループＩイントロンフラグメントが、配列番号７３～８４及び８６～１１１から選択される対応配列を含む、請求項１８３に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  185. 前記５’アナベナグループＩイントロンフラグメントが、配列番号７３～８４及び８６～１１１から選択される配列を含むかまたはそれからなる、請求項１８０～１８４のいずれか１項に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  186. 前記３’アナベナグループＩイントロンフラグメントが、配列番号１１２～１２４及び１２５～１５０から選択される対応配列を含むかまたはそれからなる、請求項１８５に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  187. 前記ＩＲＥＳが、配列番号３４８～３５１から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１６４～１８６のいずれか１項に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  188. 前記参照ＩＲＥＳがＣＶＢ３である、請求項１６４～１８６のいずれか１項に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  189. 前記ＩＲＥＳがＣＶＢ３ではない、請求項１６４～１８６のいずれか１項に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  190. 前記ＩＲＥＳが、配列番号１～６４及び６６～７２から選択される配列を含む、請求項１６４～１８６のいずれか１項に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチド。
  191. 請求項１６４～１９０のいずれか１項に記載の直鎖ＲＮＡから生成される、環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
  192. ５’から３’方向へ、３’グループＩイントロンフラグメント、ＩＲＥＳ、発現配列、及び５’グループＩイントロンフラグメントを含む環状ＲＮＡポリヌクレオチドであって、
    前記ＩＲＥＳが、配列番号３４８～３５１から選択されるヌクレオチド配列を含む、
    環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
  193. 前記３’グループＩイントロンフラグメントと前記ＩＲＥＳとの間にスペーサーをさらに含む、請求項１９２に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
  194. 二重鎖を形成することのできる第１及び第２の二重鎖形成領域をさらに含む、請求項１９２または１９３に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
  195. 前記第１及び前記第２の二重鎖形成領域がそれぞれ、長さ約９～１９ヌクレオチドである、請求項１９４に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
  196. 前記第１及び前記第２の二重鎖形成領域がそれぞれ、長さ約３０ヌクレオチドである、請求項１９４に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
  197. 前記発現配列が、少なくとも約１，０００ｎｔ、少なくとも約２，０００ｎｔ、少なくとも約３，０００ｎｔ、少なくとも約４，０００ｎｔ、または少なくとも約５，０００ｎｔのサイズである、請求項１６４～１９６のいずれか１項に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
  198. 天然ヌクレオチドを含む、請求項１６４～１９７のいずれか１項に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
  199. 前記発現配列が、コドンが最適化されている、請求項１６４～１９８のいずれか１項に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
  200. 各リーディングフレームに少なくとも１つの終止コドンを含む翻訳終結カセットをさらに含む、請求項１６４～１９９のいずれか１項に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
  201. 前記翻訳終結カセットが、前記発現配列の前記リーディングフレームに少なくとも２つの終止コドンを含む、請求項２００に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
  202. 最適化される前の同等のポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠くよう最適化されている、請求項１６４～２０１のいずれか１項に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
  203. 最適化される前の同等のポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ感受性部位を欠くよう最適化されている、請求項１６４～２０２のいずれか１項に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
  204. 最適化される前の同等のポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つのＲＮＡ編集感受性部位を欠くよう最適化されている、請求項１６４～２０３のいずれか１項に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
  205. 少なくとも２つの発現配列を含む、請求項１６４～２０４のいずれか１項に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
  206. それぞれの発現配列が、異なる治療用タンパク質をコードする、請求項２０５に記載のＲＮＡポリヌクレオチド。
  207. 長さ約１００～１５，０００ヌクレオチドであり、任意選択で約１００～１２，０００ヌクレオチド、さらに任意選択で約１００～１０，０００ヌクレオチドである、請求項１９１～２０６のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
  208. ヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの治療効果の持続期間が、少なくとも約２０時間である、請求項１９１～２０７のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
  209. 機能的半減期が少なくとも約２０時間である、請求項１９１～２０８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
  210. ヒト細胞での治療効果の持続期間が、同じ発現配列を含む同等の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドと同程度であるかまたはそれ以上である、請求項１９１～２０９のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
  211. ヒト細胞での機能的半減期が、同じ発現配列を含む同等の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドと同程度であるかまたはそれ以上である、請求項１９１～２１０のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
  212. ヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの治療効果の持続期間が、同じ発現配列を有する同等の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドを超える、請求項１９１～２１１のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
  213. ヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの機能的半減期が、同じ発現配列を有する同等の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドを超える、請求項１９１～２１２のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
  214. 請求項１９１～２１３のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド、ナノ粒子、及び任意選択で、前記ナノ粒子に機能的に接続された標的指向性部分を含む、医薬組成物。
  215. 前記ナノ粒子が、脂質ナノ粒子、コア・シェルナノ粒子、生分解性ナノ粒子、生分解性脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、または生分解性ポリマーナノ粒子である、請求項２１４に記載の医薬組成物。
  216. 標的指向性部分を含み、
    前記標的指向性部分が、細胞の分離または精製なしで、選択された細胞集団もしくは組織の細胞に選択的に受容体介在性エンドサイトーシスまたは直接融合を媒介する、
    請求項２１４または２１５に記載の医薬組成物。
  217. 前記標的指向性部分が、ｓｃｆｖ、ナノボディ、ペプチド、ミニボディ、ポリヌクレオチドアプタマー、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはそのフラグメントである、請求項２１４～２１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  218. 前記組成物中の前記ポリヌクレオチドの１重量％未満が、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡスプリント、または三リン酸化ＲＮＡである、請求項２１４～２１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  219. 前記医薬組成物中のポリヌクレオチド及びタンパク質の１重量％未満が、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡスプリント、三リン酸化ＲＮＡ、ホスファターゼタンパク質、タンパク質リガーゼ、及びキャッピング酵素である、請求項２１４～２１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  220. その必要のある対象を処置する方法であって、請求項１９１～２１３のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド、ナノ粒子、及び任意選択で、前記ナノ粒子に機能的に接続された標的指向性部分を含む組成物の治療的有効量を投与することを含む、前記方法。
  221. その必要のある対象を処置する方法であって、請求項２１４～２１９のいずれか１項に記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、前記方法。
  222. 前記標的指向性部分が、ｓｃｆｖ、ナノボディ、ペプチド、ミニボディ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ＴＣＲの細胞外ドメイン、またはそのフラグメントである、請求項２２０または２２１に記載の方法。
  223. 前記ナノ粒子が、脂質ナノ粒子、コア・シェルナノ粒子、または生分解性ナノ粒子である、請求項２２０～２２２のいずれか１項に記載の方法。
  224. 前記ナノ粒子が、１つ以上のカチオン性脂質、イオン化可能脂質、またはポリβ－アミノエステルを含む、請求項２２０～２２３のいずれか１項に記載の方法。
  225. 前記ナノ粒子が、１つ以上の非カチオン性脂質を含む、請求項２２０～２２４のいずれか１項に記載の方法。
  226. 前記ナノ粒子が、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質、ポリグルタミン酸脂質、またはヒアルロン酸脂質を含む、請求項２２０～２２５のいずれか１項に記載の方法。
  227. 前記ナノ粒子が、コレステロールを含む、請求項２２０～２２６のいずれか１項に記載の方法。
  228. 前記ナノ粒子が、アラキドン酸またはオレイン酸を含む、請求項２２０～２２７のいずれか１項に記載の方法。
  229. 前記組成物が、標的指向性部分を含み、
    前記標的指向性部分が、細胞の選択または精製なしで、選択された細胞集団の細胞に選択的に受容体介在性エンドサイトーシスを媒介する、
    請求項２２０～２２８のいずれか１項に記載の方法。
  230. 前記ナノ粒子が、２つ以上の環状ＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項２２０～２２９のいずれか１項に記載の方法。
  231. 請求項１６４～２１３のいずれか１項に記載のＲＮＡポリヌクレオチドをコードする、ＤＮＡベクター。
  232. 転写制御配列をさらに含む、請求項２３１に記載のＤＮＡベクター。
  233. 前記転写制御配列が、プロモーター及び／またはエンハンサーを含む、請求項２３２に記載のＤＮＡベクター。
  234. 前記プロモーターが、Ｔ７プロモーターを含む、請求項２３３に記載のＤＮＡベクター。
  235. 環状ＤＮＡを含む、請求項２３１～２３４のいずれか１項に記載のＤＮＡベクター。
  236. 直鎖状ＤＮＡを含む、請求項２３１～２３５のいずれか１項に記載のＤＮＡベクター。
  237. 請求項２３１～２３６のいずれか１項に記載のＤＮＡベクターを含む、原核細胞。
  238. 請求項１９１～２１３のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチドを含む、真核細胞。
  239. ヒト細胞である、請求項２３８に記載の真核細胞。
  240. 環状ＲＮＡポリヌクレオチドを生産する方法であって、請求項１６４～１９０及び１９７～２０６のいずれか１項に記載の直鎖ＲＮＡポリヌクレオチドを、環状化に好適な条件下でインキュベートすることを含む、前記方法。
  241. 環状ＲＮＡポリヌクレオチドを生産する方法であって、請求項２３１～２３６のいずれか１項に記載のＤＮＡを、転写に好適な条件下でインキュベートすることを含む、前記方法。
  242. 前記ＤＮＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写される、請求項２４１に記載の方法。
  243. 前記好適な条件が、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアニン三リン酸（ＧＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、及びＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項２４１に記載の方法。
  244. 前記好適な条件が、グアニン一リン酸（ＧＭＰ）をさらに含む、請求項２４１に記載の方法。
  245. ＧＭＰ濃度とＧＴＰ濃度との比が、約３：１～約１５：１の範囲内、任意選択で約４：１、５：１、または６：１である、請求項２４４に記載の方法。
  246. 環状ＲＮＡポリヌクレオチドを生産する方法であって、請求項２３７に記載の原核細胞を、前記細胞において前記ＤＮＡを転写するために好適な条件下で培養することを含む、前記方法。
  247. 環状ＲＮＡポリヌクレオチドを精製することをさらに含む、請求項２４０～２４６のいずれか１項に記載の方法。
  248. 前記環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、固体表面にコンジュゲートされた前記第１または前記第２のスペーサーとハイブリダイズする親和性オリゴヌクレオチドを使用する陰性選択によって精製される、請求項２４７に記載の方法。
  249. 前記第１または前記第２のスペーサーがポリＡ配列を含み、前記親和性オリゴヌクレオチドがデオキシチミンオリゴヌクレオチドである、請求項２４８に記載の方法。
  250. 前記医薬組成物：肝細胞の重量比が１：５以下である、請求項１～１５４及び２１４～２１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  251. 前記医薬組成物：脾臓細胞の重量比が７：１０以下である、請求項１～１５４及び２１４～２１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  252. 必要としている前記対象に、前記医薬組成物を、体重１ｋｇあたり０．５ｍｇで、０日目、２日目、５日目、７日目、及び９日目の間隔にて投与する、請求項１５５～１６３及び２２１～２３０のいずれか１項に記載の方法。
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