JP2023518295A - 環状ｒｎａ組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

環状ＲＮＡが、関連する組成物及び方法とともに本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、本発明の環状ＲＮＡは、スプライシング後グループＩイントロンフラグメント、スペーサー、ＩＲＥＳ、任意の二重鎖形成領域、及び１つを超える発現配列を含む。いくつかの実施形態では、発現配列は、切断部位をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列によって分離される。いくつかの実施形態では、本発明の環状ＲＮＡは、直鎖状ＲＮＡと比較して改善された、発現、機能安定性、免疫原性、製造容易性、及び／または半減期を有する。いくつかの実施形態では、本発明の方法及び構築物は、既存のＲＮＡ環化アプローチと比較して改善された、環化効率、スプライシング効率、及び／または純度をもたらす。【選択図】図４４

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月２０日に出願された米国仮出願第６２／９９２，５１８号の利益及び優先権を主張し、その内容は全ての目的で参照により完全に組み込まれる。

背景
従来の遺伝子療法は、宿主細胞に所望の遺伝子情報を挿入するためのＤＮＡの使用を伴う。細胞へと導入されたＤＮＡは通常、１つ以上のトランスフェクトされた細胞のゲノムへとある程度組み込まれ、宿主内での導入された遺伝物質の長期的な作用を可能にする。かかる持続的な作用には実質的な利点があり得る一方で、外因性ＤＮＡの宿主ゲノムへの組み込みは、多くの有害な作用も有し得る。例えば、導入されたＤＮＡがインタクトな遺伝子へと挿入され、内因性遺伝子の機能を妨げるまたさらには完全に排除する変異をもたらすことになる可能性がある。ゆえに、ＤＮＡを用いた遺伝子療法は、処置される宿主において、致命的な遺伝子機能の障害、例えば、必須酵素の産生の排除もしくは有害な低下、または細胞成長の制御に決定的に重要な遺伝子の妨害をもたらす可能性があり、非制御または癌性細胞増殖をもたらし得る。加えて、従来のＤＮＡベースの遺伝子療法では、所望の遺伝子産物の効果的な発現のためには強力なプロモーター配列を含める必要があり、これもまた、細胞内の正常な遺伝子発現の制御において望ましくない変化をもたらし得る。また、ＤＮＡベースの遺伝物質が望ましくない抗ＤＮＡ抗体の誘導をもたらし、それが致命的となり得る免疫応答を誘発し得る可能性もある。ウイルスベクターを使用する遺伝子療法アプローチも、有害な免疫応答をもたらし得る。いくつかの状況では、ウイルスベクターが宿主ゲノムに組み込まれることさえある。加えて、臨床グレードのウイルスベクターの産生は、費用も時間もかかる。ウイルスベクターを使用した導入遺伝物質のターゲティング送達も、制御が難しくあり得る。ゆえに、ＤＮＡベースの遺伝子療法は、ウイルスベクターを使用する分泌タンパク質の送達に関して評価されてきたが（米国特許第６，０６６，６２６号；米国公開第２００４／０１１０７０９号）、これらのアプローチは、これらの様々な理由で制限され得る。

ＤＮＡとは対照的に、遺伝子療法剤としてのＲＮＡの使用は、ＲＮＡがトランスフェクトされた細胞のゲノムへと安定して組み込まれることのリスクを伴わないため、実質的により安全であり、ゆえに導入遺伝物質が必須遺伝子の正常な機能を妨害する、または有害もしくは発癌効果をもたらす変異を引き起こす懸念を排除し、外来プロモーター配列は、コードされたタンパク質の効果的な翻訳のために必要とされず、再度、起こり得る有害な副作用を回避する。加えて、ｍＲＮＡは、その機能を実行するために核に入る必要がないが、ＤＮＡはこの大きな障壁を克服しなければならない。

環状ＲＮＡは、安定した形態のＲＮＡの設計及び産生に役立つ。ＲＮＡ分子の環状化は、特に、不活性なコンフォメーションで折り畳まれやすい分子の場合、ＲＮＡ構造及び機能の研究に利点を提供する（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｒｕｆｆｎｅｒ，１９９８）。環状ＲＮＡはまた、特に、タンパク質置換療法及びワクチン接種を含む、遺伝子発現及び治療剤のＲＮＡベースの制御の研究分野において、特に興味深く、インビボ用途に有用であり得る。

本発明の前に、インビトロで環状化ＲＮＡを作製するための３つの主要な技術があった：スプリントを介した方法、順列置換イントロン－エクソン法、及びＲＮＡリガーゼを介した方法。ただし、既存の方法論は、環状化できるＲＮＡのサイズによって制限されるため、その治療用途が制限される。

概要
環状ＲＮＡが、関連する組成物及び方法とともに本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、本発明の環状ＲＮＡは、スプライシング後グループＩイントロンフラグメント、スペーサー、ＩＲＥＳ、任意の二重鎖形成領域、及び１つを超える発現配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の環状ＲＮＡは、二重鎖形成領域を含む。いくつかの実施形態では、発現配列は、切断部位をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列によって分離される。いくつかの実施形態では、切断部位は、自己切断ペプチドである。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、２Ａ自己切断ペプチドである。いくつかの実施形態では、第１及び第２の発現配列は、リボソームスキッピングエレメントによって分離される。いくつかの実施形態では、各発現配列は、治療用タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列は、サイトカインまたはその機能的フラグメントをコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列は、転写因子をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現は、免疫チェックポイント阻害剤をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列は、キメラ抗原受容体をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列は、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖をコードし、第２の発現は、第２のＴＣＲ鎖をコードする。いくつかの実施形態では、本発明の環状ＲＮＡは、直鎖状ＲＮＡと比較した場合に、改善された発現、機能安定性、製造容易性、及び／または半減期を有する。いくつかの実施形態では、本発明の環状ＲＮＡは、低減された免疫原性を有する。いくつかの実施形態では、本発明の方法及び構築物は、既存のＲＮＡ環化アプローチと比較した場合に、改善された環化効率、スプライシング効率及び／または純度をもたらす。

いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、１つ以上のマイクロＲＮＡ結合部位を含む。マイクロＲＮＡ結合部位は、肝臓で発現したマイクロＲＮＡによって認識される。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２２によって認識される。

本出願の一態様は、環状ＲＮＡポリヌクレオチドであって、以下の順序で、スプライシング後３’グループＩイントロンフラグメント、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、第１の発現配列、第２の発現配列、及びスプライシング後５’グループＩイントロンフラグメントを含む、環状ＲＮＡポリヌクレオチドが提供される。

いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、第１の発現配列と第２の発現配列との間の切断部位をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、切断部位は、自己切断スペーサーである。いくつかの実施形態では、自己切断スペーサーは、２Ａ自己切断ペプチドである。

いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、第１の発現配列と第２の発現配列との間に第２のＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態では、第１のＩＲＥＳは、配列番号１～７２のいずれかの配列からなるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、第２のＩＲＥＳは、配列番号１～７２のいずれかの配列からなるか、またはそれを含む。

いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、第１の治療用タンパク質をコードし、第２の発現配列が、第２の治療用タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列または第２の発現配列が、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列または第２の発現配列が、キメラ抗原受容体をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列または第２の発現配列が、転写因子をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列または第２の発現配列が、サイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列または第２の発現配列が、免疫阻害分子をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列または第２の発現配列が、共刺激分子のアゴニストをコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列または第２の発現配列が、免疫チェックポイント分子の阻害剤をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖をコードし、第２の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のベータ鎖をコードする。

いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のベータ鎖をコードし、第２の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のガンマ鎖をコードし、第２の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のデルタ鎖をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のデルタ鎖をコードし、第２の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のガンマ鎖をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードし、第２の発現配列が、ケモカインをコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、ケモカインをコードし、第２の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、第２の発現配列が、ＰＤ１またはＰＤＬ１アンタゴニストをコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、ＰＤ１またはＰＤＬ１アンタゴニストをコードし、第２の発現配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、第２の発現配列が、ケモカインをコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、ケモカインをコードし、第２の発現配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、転写因子をコードし、第２の発現配列が、サイトカインをコードする。

いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードし、第２の発現配列が、サイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、サイトカインをコードし、第２の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする。いくつかの実施形態では、サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１５から選択される。

いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードし、第２の発現配列が、転写因子をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、転写因子をコードし、第２の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする。いくつかの実施形態では、転写因子が、ＦＯＸＰ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＨＥＬＩＯＳ、Ｔｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＲＯＲｇｔ、及びｃｄ２５から選択される。

いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、第２の発現配列が、サイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、サイトカインをコードし、第２の発現配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。いくつかの実施形態では、サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１５から選択される。

いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、サイトカインをコードし、第２の発現配列が、転写因子をコードする。いくつかの実施形態では、転写因子が、ＦＯＸＰ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＨＥＬＩＯＳ、Ｔｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＲＯＲｇｔ、及びｃｄ２５から選択される。いくつかの実施形態では、サイトカインが、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、及びＴＧＦβから選択される。

いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、転写因子をコードし、第２の発現配列が、ケモカインをコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、ケモカインをコードし、第２の発現配列が、転写因子をコードする。いくつかの実施形態では、転写因子が、ＦＯＸＰ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、及びＨＥＬＩＯＳから選択される。いくつかの実施形態では、ケモカインが、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、Ｃケモカイン、またはＣＸ３Ｃケモカインである。いくつかの実施形態では、ケモカインが、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９／ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＬＣ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、及びＣＸ３ＣＬ１から選択される。

いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、腫瘍抗原をコードし、第２の発現配列が、サイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、サイトカインをコードし、第２の発現配列が、腫瘍抗原をコードする。いくつかの実施形態では、抗原が、新生抗原である。いくつかの実施形態では、サイトカインが、ＩＦＮγである。

いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、ＣＡＲをコードし、第２の発現配列が、ＣＡＲをコードする。

いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、サイトカインをコードし、第２の発現配列が、サイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、第１または第２の発現配列が、ＩＬ－１０、ＴＧＦβ、及びＩＬ－３５から選択されるサイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、第１または第２の発現配列が、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８から選択されるサイトカインをコードする。

いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードし、第２の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、ケモカインをコードし、第２の発現配列が、ケモカインをコードする。いくつかの実施形態では、第１または第２の発現配列が、免疫抑制酵素をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、律速酵素をコードし、第２の発現配列が、フラックス制限酵素をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、フラックス制限酵素をコードし、第２の発現配列が、律速酵素をコードする。

いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、転写因子をコードし、第２の発現配列が、生存因子をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、生存因子をコードし、第２の発現配列が、転写因子をコードする。いくつかの実施形態では、転写因子が、ＦＯＸＰ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＨＥＬＩＯＳ、Ｔｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＲＯＲｇｔ、及びｃｄ２５から選択される。いくつかの実施形態では、生存因子が、ＢＣＬ－ＸＬから選択される。

いくつかの実施形態では、第１または第２の発現配列が、シャペロンタンパク質または複合体をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、転写因子をコードし、第２の発現配列が、シャペロンタンパク質または複合体をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、シャペロンタンパク質または複合体をコードし、第２の発現配列が、転写因子をコードする。いくつかの実施形態では、シャペロンタンパク質または複合体が、Ｓｋｐ、Ｓｐｙ、ＦｋｐＡ、ＳｕｒＡ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、Ｈｓｐ９０、ＨｔｐＧ、Ｈｓｐ１００、ＣｌｐＡ、ＣｌｐＸ、ＣｌｐＰ、及びＨｓｐ１０４から選択される。いくつかの実施形態では、転写因子が、ＦＯＸＰ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＨＥＬＩＯＳ、Ｔｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＲＯＲｇｔ、及びｃｄ２５から選択される。

いくつかの実施形態では、一方または両方の発現配列が、シグナル伝達タンパク質をコードする。

いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、酵素をコードし、第２の発現が、第１の発現配列の負の制御性阻害剤をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、第２の発現配列にコードされる酵素の負の制御性阻害剤タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、負の制御性阻害剤が、ｐ５７ｋｉｐ２、ＢＡＸ阻害剤、及びＴＩＰＥ２から選択される。

いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、ドミナントネガティブタンパク質をコードし、第２の発現配列が、免疫タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、免疫タンパク質をコードし、第２の発現配列が、ドミナントネガティブタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、第１または第２の発現配列が、抗炎症タンパク質をコードする。

いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、転写因子をコードし、第２の発現配列が、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）を５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）に変換することができる。いくつかの実施形態では、第１の発現配列が、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）を５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）に変換することができ、第２の発現配列が、転写因子である。いくつかの実施形態では、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）を５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）に変換することできる発現配列が、シトシンデアミナーゼである。

いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、５’二重鎖形成領域とスプライシング後３’グループＩイントロンフラグメントとの間の第１のスペーサー、及びスプライシング後５’グループＩイントロンフラグメントと３’二重鎖形成領域との間の第２のスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のスペーサーは、各々、約１０～約６０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の二重鎖形成領域は、各々、約９～約１９ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の二重鎖形成領域は、各々、約３０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、タウラ症候群ウイルス、トリアトーマウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、シミアンウイルス４０、ヒアリ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ）ウイルス１、ムギクビレアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉ）ウイルス、細網内皮症ウイルス、ヒトポリオウイルス１、チャバネアオカメムシ（Ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ）腸ウイルス、カシミールハチウイルス、ヒトライノウイルス２、ホマロディスカ・コアグラタ（Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ ｃｏａｇｕｌａｔａ）ウイルス－１、ヒト免疫不全ウイルス１型、ホマロディスカ・コアグラタウイルス－１、ヒメトビＰウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ＧＢ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒトエンテロウイルス７１、ウマ鼻炎ウイルス、ウスジロエダシャク（Ｅｃｔｒｏｐｉｓ ｏｂｌｉｑｕａ）ピコルナ様ウイルス、脳心筋炎ウイルス、ショウジョウバエＣウイルス、ヒトコクサッキーウイルスＢ３、アブラナ科トバモウイルス、コオロギ麻痺ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス１、黒色女王蜂児ウイルス、アブラムシ致死麻痺ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、急性ミツバチ麻痺ウイルス、ハイビスカス退緑輪点ウイルス、古典的ブタ熱ウイルス、ヒトＦＧＦ２、ヒトＳＦＴＰＡ１、ヒトＡＭＬ１／ＲＵＮＸ１、ショウジョウバエアンテナペディア、ヒトＡＱＰ４、ヒトＡＴ１Ｒ、ヒトＢＡＧ－１、ヒトＢＣＬ２、ヒトＢｉＰ、ヒトｃ－ＩＡＰｌ、ヒトｃ－ｍｙｃ、ヒトｅＩＦ４Ｇ、マウスＮＤＳＴ４Ｌ、ヒトＬＥＦ１、マウスＨＩＦ１アルファ、ヒトｎ．ｍｙｃ、マウスＧｔｘ、ヒトｐ２７ｋｉｐｌ、ヒトＰＤＧＦ２／ｃ－ｓｉｓ、ヒトｐ５３、ヒトＰｉｍ－１、マウスＲｂｍ３、ショウジョウバエ リーパー（ｒｅａｐｅｒ）、イヌ スキャンパー（Ｓｃａｍｐｅｒ）、ショウジョウバエＵｂｘ、ヒトＵＮＲ、マウスＵｔｒＡ、ヒトＶＥＧＦ－Ａ、ヒトＸＩＡＰ、ショウジョウバエ ヘアレス（ｈａｉｒｌｅｓｓ）、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＦＩＩＤ、出芽酵母ＹＡＰ１、タバコエッチウイルス、カブクリンクルウイルス、ＥＭＣＶ－Ａ、ＥＭＣＶ－Ｂ、ＥＭＣＶ－Ｂｆ、ＥＭＣＶ－Ｃｆ、ＥＭＣＶ ｐＥＣ９、ピコビルナウイルス、ＨＣＶ ＱＣ６４、ヒトコサウイルスＥ／Ｄ、ヒトコサウイルスＦ、ヒトコサウイルスＪＭＹ、ライノウイルスＮＡＴ００１、ＨＲＶ１４、ＨＲＶ８９、ＨＲＶＣ－０２、ＨＲＶ－Ａ２１、サリウイルスＡ ＳＨ１、サリウイルスＦＨＢ、サリウイルスＮＧ－Ｊ１、ヒトパレコウイルス１、クロヒウイルスＢ、Ｙｃ－３、ロザウイルスＭ－７、シャンバウイルスＡ、パシウイルスＡ、パシウイルスＡ ２、エコーウイルスＥ１４、ヒトパレコウイルス５、アイチウイルス、Ａ型肝炎ウイルスＨＡ１６、フォピウイルス、ＣＶＡ１０、エンテロウイルスＣ、エンテロウイルスＤ、エンテロウイルスＪ、ヒトペギウイルス２、ＧＢＶ－Ｃ ＧＴ１１０、ＧＢＶ－Ｃ Ｋ１７３７、ＧＢＶ－Ｃ Ｉｏｗａ、ペギウイルスＡ １２２０、パシウイルスＡ ３、サペロウイルス、ロザウイルスＢ、バクンサ（Ｂａｋｕｎｓａ）ウイルス、トレモウイルスＡ、ブタパシウイルス１、ＰＬＶ－ＣＨＮ、パシウイルスＡ、シシニウイルス、ヘパシウイルスＫ、ヘパシウイルスＡ、ＢＶＤＶ１、ボーダー病ウイルス、ＢＶＤＶ２、ＣＳＦＶ－ＰＫ１５Ｃ、ＳＦ５７３ジシストロウイルス、フーペイピコルナ様ウイルス、ＣＲＰＶ、サリウイルスＡ ＢＮ５、サリウイルスＡ ＢＮ２、サリウイルスＡ ０２３９４、サリウイルスＡ ＧＵＴ、サリウイルスＡ ＣＨ、サリウイルスＡ ＳＺ１、サリウイルスＦＨＢ、ＣＶＢ３、ＣＶＢ１、エコーウイルス７、ＣＶＢ５、ＥＶＡ７１、ＣＶＡ３、ＣＶＡ１２、ＥＶ２４、またはｅＩＦ４Ｇに対するアプタマーからのＩＲＥＳの配列を有する。

いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、天然ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、天然ヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、発現配列は、コドン最適化される。

いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、同等の最適化前ポリヌクレオチドに存在する少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠くように最適化される。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、同等の最適化前ポリヌクレオチドに存在する少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ感受性部位を欠くように最適化される。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、同等の最適化前ポリヌクレオチドに存在する少なくとも１つのＲＮＡ編集感受性部位を欠くように最適化される。

いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、約１００ヌクレオチド～約１５キロベースの長さである、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。

いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、ヒトにおいて少なくとも約２０時間のインビボでの治療効果の持続期間を有する。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、少なくとも約２０時間の機能的半減期を有する。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、同じ発現配列を含む同等の直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドよりも長いまたは同等のヒト細胞における治療効果の持続期間を有する。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、同じ発現配列を含む同等の直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドよりも長いまたは同等のヒト細胞における機能的半減期を有する。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、同じ発現配列を有する同等の直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドのものよりも長いヒトにおける治療効果のインビボ持続期間を有する。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、同じ発現配列を有する同等の直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドのものよりも長いヒトにおけるインビボ機能的半減期を有する。

別の態様では、本出願は、本明細書に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド、ナノ粒子、及び任意で、ナノ粒子と作動可能に接続されたターゲティング部分を含む、薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、脂質ナノ粒子、コア・シェルナノ粒子、生分解性ナノ粒子、生分解性脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、または生分解性ポリマーナノ粒子である。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ターゲティング部分を含み、ターゲティング部分は、細胞単離または精製なしで、選択された細胞集団または組織のうちの選択された細胞への受容体媒介エンドサイトーシスまたは直接融合を媒介する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ナノ粒子と作動可能に接続されたターゲティング部分を含む。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、ｓｃＦｖ、ナノボディ、ペプチド、ミニボディ、ポリヌクレオチドアプタマー、重鎖可変領域、軽鎖可変領域またはそのフラグメントである。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、組成物における二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡスプリント、または三リン酸化ＲＮＡである、ポリヌクレオチドの１重量％未満を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡスプリント、三リン酸化ＲＮＡ、ホスファターゼタンパク質、タンパク質リガーゼ、及びキャッピング酵素である、薬学的組成物におけるポリヌクレオチド及びタンパク質の１重量％未満を含む。

別の態様では、本開示は、処置を必要とする対象を処置する方法であって、本明細書に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド、ナノ粒子、及び任意で、ナノ粒子と作動可能に接続されたターゲティング部分を含む治療的有効量の組成物を投与することを含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、組成物が、ターゲティング部分を含み、ターゲティング部分が、細胞選択または精製なしで、選択された細胞集団のうちの細胞への受容体媒介エンドサイトーシスを選択的に媒介する。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、ｓｃＦｖ、ナノボディ、ペプチド、ミニボディ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、脂質ナノ粒子、コア・シェルナノ粒子、または生分解性ナノ粒子である。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質、イオン化可能脂質、またはポリβ－アミノエステルを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、１つ以上の非カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質、ポリグルタミン酸脂質、またはヒアルロン酸脂質を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、コレステロールを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、アラキドン酸またはオレイン酸を含む。いくつかの実施形態では、提供されるナノ粒子は、１つを超える環状ＲＮＡポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、対象が、急性リンパ性白血病；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；胞巣状横紋筋肉腫；Ｂ細胞悪性腫瘍；膀胱癌（例えば、膀胱癌腫）；骨癌；脳癌（例えば、髄芽腫）；乳癌；肛門、肛門管、または肛門直腸の癌；眼の癌；肝内胆管の癌；関節の癌；首の癌；胆嚢癌；胸膜癌；鼻、鼻腔、または中耳の癌；口腔の癌；外陰の癌；慢性リンパ性白血病；慢性骨髄性癌；結腸癌；食道癌；子宮頸癌；線維肉腫；消化管カルチノイド腫瘍；頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌）；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；腎臓癌；喉頭癌；白血病；液性腫瘍；肝臓癌；肺癌（例えば、非小細胞肺癌及び肺腺癌）；リンパ腫；中皮腫；肥満細胞腫；黒色腫；多発性骨髄腫；上咽頭癌；非ホジキンリンパ腫；Ｂ慢性リンパ球性白血病；有毛細胞白血病；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；バーキットリンパ腫；卵巣癌；膵臓癌；腹膜の癌；大網の癌；腸間膜癌；咽頭癌；前立腺癌；直腸癌；腎癌；皮膚癌；小腸癌；軟部組織癌；固形腫瘍；滑膜肉腫；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；及び尿管癌からなる群から選択されるがんを有する。いくつかの実施形態では、対象が、強皮症、バセドウ病、クローン病、シェーグレン病、多発性硬化症、橋本病、乾癬、重症筋無力症、自己免疫性多腺性内分泌不全症候群、Ｉ型糖尿病（ＴＩＤＭ）、自己免疫性胃炎、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎、大腸炎、甲状腺炎、ヒトループスによって典型的に表される全身性自己免疫疾患から選択される自己免疫障害を有する。

別の態様では、本出願は、環状ＲＮＡポリヌクレオチドを作製するためのベクターであって、以下の順序で、５’二重鎖形成領域、３’グループＩイントロンフラグメント、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、第１の発現配列、第２の発現配列、５’グループＩイントロンフラグメント、及び３’二重鎖形成領域を含む、ベクターが提供される。

いくつかの実施形態では、ベクターは、第１の発現配列と第２の発現配列との間の切断部位をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、切断部位は、自己切断スペーサーである。いくつかの実施形態では、自己切断スペーサーは、２Ａ自己切断ペプチドである。

いくつかの実施形態では、ベクターは、５’二重鎖形成領域と３’グループＩイントロンフラグメントとの間の第１のスペーサー、及び５’グループＩイントロンフラグメントと３’二重鎖形成領域との間の第２のスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のスペーサーが、各々、約５～約６０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のスペーサーが、各々、少なくとも５ヌクレオチドの長さの非構造化領域を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のスペーサーが、各々、少なくとも７ヌクレオチドの長さの構造化領域を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の二重鎖形成領域は、各々、約９～５０ヌクレオチドの長さを有する。

いくつかの実施形態では、ベクターは、コドン最適化される。いくつかの実施形態では、ベクターは、同等の最適化前ポリヌクレオチドに存在する少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠く。

別の態様では、本出願は、本明細書に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチドを含む真核細胞を提供する。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、Ｔ細胞である。

一態様では、本明細書に提供されるのは、環状ＲＮＡポリヌクレオチドであって、以下の順序で、スプライシング後３’グループＩイントロンフラグメント、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、第１の発現配列、切断部位をコードするポリヌクレオチド配列、第２の発現配列、及びスプライシング後５’グループＩイントロンフラグメントを含む、環状ＲＮＡポリヌクレオチドである。一態様では、本明細書に提供されるのは、環状ＲＮＡポリヌクレオチドであって、以下の順序で、スプライシング後３’グループＩイントロンフラグメント、第１の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、第１の発現配列、第２のＩＲＥＳ、第２の発現配列、及びスプライシング後５’グループＩイントロンフラグメントを含む、環状ＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第１の発現配列及び第２の発現配列が、異なる治療用タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、第１の発現配列及び第２の発現配列が、同じ治療用タンパク質をコードする。

一態様では、本明細書に提供されるのは、ベクターの転写から産生される環状ＲＮＡポリヌクレオチドであって、以下の順序で、任意の５’二重鎖形成領域、スプライシング後３’グループＩイントロンフラグメント、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現配列、切断部位をコードするポリヌクレオチド配列、第２の発現配列、５’グループＩイントロンフラグメント、及び任意の３’二重鎖形成領域を含む、環状ＲＮＡポリヌクレオチドである。一態様では、本明細書に提供されるのは、ベクターの転写から産生される環状ＲＮＡポリヌクレオチドであって、以下の順序で、任意の５’二重鎖形成領域、３’グループＩイントロンフラグメント、第１の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現配列、第２のＩＲＥＳ、第２の発現配列、５’グループＩイントロンフラグメント、及び任意の３’二重鎖形成領域を含む、環状ＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡポリヌクレオチドまたはベクターは、３’及び５’二重鎖形成領域を含む。

いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、５’二重鎖形成領域とスプライシング後３’グループＩイントロンフラグメントとの間の第１のスペーサー、及びスプライシング後５’グループＩイントロンフラグメントと３’二重鎖形成領域との間の第２のスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のスペーサーは、各々、約１０～約６０ヌクレオチドの長さを有する。特定の実施形態では、第１及び第２の二重鎖形成領域は、各々、約９～約１９ヌクレオチドの長さを有する。特定の他の実施形態では、第１及び第２の二重鎖形成領域は、各々、約３０ヌクレオチドの長さを有する。

特定の実施形態において、ＩＲＥＳは、ＩＲＥＳの配列を有する表１７から選択されるか、またはその機能的フラグメントもしくはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、タウラ症候群ウイルス、トリアトーマウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、シミアンウイルス４０、ヒアリウイルス１、ムギクビレアブラムシウイルス、細網内皮症ウイルス、ヒトポリオウイルス１、チャバネアオカメムシ腸ウイルス、カシミールハチウイルス、ヒトライノウイルス２、ホマロディスカ・コアグラタウイルス－１、ヒト免疫不全ウイルス１型、ホマロディスカ・コアグラタウイルス－１、ヒメトビＰウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ＧＢ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒトエンテロウイルス７１、ウマ鼻炎ウイルス、ウスジロエダシャクピコルナ様ウイルス、脳心筋炎ウイルス、ショウジョウバエＣウイルス、ヒトコクサッキーウイルスＢ３、アブラナ科トバモウイルス、コオロギ麻痺ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス１、黒色女王蜂児ウイルス、アブラムシ致死麻痺ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、急性ミツバチ麻痺ウイルス、ハイビスカス退緑輪点ウイルス、古典的ブタ熱ウイルス、ヒトＦＧＦ２、ヒトＳＦＴＰＡ１、ヒトＡＭＬ１／ＲＵＮＸ１、ショウジョウバエアンテナペディア、ヒトＡＱＰ４、ヒトＡＴ１Ｒ、ヒトＢＡＧ－１、ヒトＢＣＬ２、ヒトＢｉＰ、ヒトｃ－ＩＡＰｌ、ヒトｃ－ｍｙｃ、ヒトｅＩＦ４Ｇ、マウスＮＤＳＴ４Ｌ、ヒトＬＥＦ１、マウスＨＩＦ１アルファ、ヒトｎ．ｍｙｃ、マウスＧｔｘ、ヒトｐ２７ｋｉｐｌ、ヒトＰＤＧＦ２／ｃ－ｓｉｓ、ヒトｐ５３、ヒトＰｉｍ－１、マウスＲｂｍ３、ショウジョウバエ リーパー、イヌ スキャンパー、ショウジョウバエＵｂｘ、ヒトＵＮＲ、マウスＵｔｒＡ、ヒトＶＥＧＦ－Ａ、ヒトＸＩＡＰ、ショウジョウバエ ヘアレス、出芽酵母ＴＦＩＩＤ、出芽酵母ＹＡＰ１、タバコエッチウイルス、カブクリンクルウイルス、ＥＭＣＶ－Ａ、ＥＭＣＶ－Ｂ、ＥＭＣＶ－Ｂｆ、ＥＭＣＶ－Ｃｆ、ＥＭＣＶ ｐＥＣ９、ピコビルナウイルス、ＨＣＶ ＱＣ６４、ヒトコサウイルスＥ／Ｄ、ヒトコサウイルスＦ、ヒトコサウイルスＪＭＹ、ライノウイルスＮＡＴ００１、ＨＲＶ１４、ＨＲＶ８９、ＨＲＶＣ－０２、ＨＲＶ－Ａ２１、サリウイルスＡ ＳＨ１、サリウイルスＦＨＢ、サリウイルスＮＧ－Ｊ１、ヒトパレコウイルス１、クロヒウイルスＢ、Ｙｃ－３、ロザウイルスＭ－７、シャンバウイルスＡ、パシウイルスＡ、パシウイルスＡ ２、エコーウイルスＥ１４、ヒトパレコウイルス５、アイチウイルス、Ａ型肝炎ウイルスＨＡ１６、フォピウイルス、ＣＶＡ１０、エンテロウイルスＣ、エンテロウイルスＤ、エンテロウイルスＪ、ヒトペギウイルス２、ＧＢＶ－Ｃ ＧＴ１１０、ＧＢＶ－Ｃ Ｋ１７３７、ＧＢＶ－Ｃ Ｉｏｗａ、ペギウイルスＡ １２２０、パシウイルスＡ ３、サペロウイルス、ロザウイルスＢ、バクンサ（Ｂａｋｕｎｓａ）ウイルス、トレモウイルスＡ、ブタパシウイルス１、ＰＬＶ－ＣＨＮ、パシウイルスＡ、シシニウイルス、ヘパシウイルスＫ、ヘパシウイルスＡ、ＢＶＤＶ１、ボーダー病ウイルス、ＢＶＤＶ２、ＣＳＦＶ－ＰＫ１５Ｃ、ＳＦ５７３ジシストロウイルス、フーペイピコルナ様ウイルス、ＣＲＰＶ、サリウイルスＡ ＢＮ５、サリウイルスＡ ＢＮ２、サリウイルスＡ ０２３９４、サリウイルスＡ ＧＵＴ、サリウイルスＡ ＣＨ、サリウイルスＡ ＳＺ１、サリウイルスＦＨＢ、ＣＶＢ３、ＣＶＢ１、エコーウイルス７、ＣＶＢ５、ＥＶＡ７１、ＣＶＡ３、ＣＶＡ１２、ＥＶ２４、またはｅＩＦ４Ｇに対するアプタマーからのＩＲＥＳの配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリＡ配列は、各々、１５～５０ｎｔの長さを有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリＡ配列は、各々、約２０～２５ｎｔの長さを有する。

特定の実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の天然ヌクレオチドを含有する。特定の実施形態では、発現配列は、コドン最適化される。特定の実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、同等の最適化前ポリヌクレオチドに存在する少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠くように最適化される。特定の実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、同等の最適化前ポリヌクレオチドに存在する少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ感受性部位を欠くように最適化される。特定の実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、同等の最適化前ポリヌクレオチドに存在する少なくとも１つのＲＮＡ編集感受性部位を欠くように最適化される。

いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、約１００ヌクレオチド～約１５キロベースの長さである。特定の実施形態では、本開示の環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、ヒトにおいて少なくとも約２０時間のインビボでの治療効果の持続期間を有する。特定の実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドが、少なくとも約２０時間の機能的半減期を有する。ある特定の実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、同じ発現配列を含む同等の直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドよりも長いまたは同等のヒト細胞における治療効果の持続期間を有する。特定の実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、同じ発現配列を含む同等の直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドよりも長いまたは同等のヒト細胞における機能的半減期を有する。特定の実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、同じ発現配列を有する同等の直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドのものよりも長いヒトにおけるインビボ機能的半減期を有する。いくつかの実施形態では、参照直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドは、ｃａｐ１構造及び長さが少なくとも８０ｎｔのポリＡテールを含む直鎖状の、未修飾またはヌクレオシド修飾された、完全にプロセシングされたｍＲＮＡである。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、既定の閾値のものよりも長いまたは同等のヒト細胞における機能的半減期を有する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、既定の閾値のものよりも長いヒト細胞におけるインビボでの機能的半減期を有する。いくつかの実施形態では、機能的タンパク質アッセイは、インビトロルシフェラーゼアッセイである。いくつかの実施形態では、機能的タンパク質アッセイは、患者血清または組織試料における環状ＲＮＡポリヌクレオチドの発現配列によってコードされるタンパク質のレベルを測定することを含む。いくつかの実施形態では、既定の閾値は、環状ＲＮＡポリヌクレオチドと同じ発現配列を含む参照直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドの機能的半減期である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、少なくとも約２０時間の機能的半減期を有する。

一態様では、環状ＲＮＡポリヌクレオチド、ナノ粒子、及び任意で、ナノ粒子と作動可能に接続されたターゲティング部分を含む薬学的組成物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、脂質ナノ粒子、コア・シェルナノ粒子、生分解性ナノ粒子、生分解性脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、または生分解性ポリマーナノ粒子である。特定の実施形態では、ナノ粒子は、Ｃ１２－２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ及びＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、ならびにそれらの組み合わせの群から選択される１つ以上のカチオン性脂質を含む。

特定の実施形態では、薬学的組成物は、ターゲティング部分を含み、ターゲティング部分は、細胞単離または精製なしで、選択された細胞集団または組織のうちの選択された細胞への受容体媒介エンドサイトーシスまたは直接融合を媒介する。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、ｓｃＦｖ、ナノボディ、ペプチド、ミニボディ、ポリヌクレオチドアプタマー、重鎖可変領域、軽鎖可変領域またはそのフラグメントである。特定の実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、それを必要とするヒト対象の自己免疫障害またはがんを治療するのに有効な量である。特定の実施形態では、薬学的組成物は、同じ発現配列をコードする外因性ＤＮＡを含むベクターを含む薬学的組成物と比較した場合に、増強された安全性プロファイルを有する。

特定の実施形態では、組成物におけるポリヌクレオチドの１重量％未満は、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡスプリント、または三リン酸化ＲＮＡである。特定の実施形態では、薬学的組成物におけるポリヌクレオチド及びタンパク質の１重量％未満は、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡスプリント、三リン酸化ＲＮＡ、ホスファターゼタンパク質、タンパク質リガーゼ、及びキャッピング酵素である。

処置を必要とする対象を処置する方法であって、環状ＲＮＡポリヌクレオチド、ナノ粒子、及び任意で、ナノ粒子と作動可能に接続されたターゲティング部分を含む治療的有効量の組成物を投与することを含む、方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、対象は、自己免疫障害またはがんを有する。

いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、ｓｃＦｖ、ナノボディ、ペプチド、ミニボディ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、組成物は、ターゲティング部分を含み、ターゲティング部分は、細胞の単離または精製なしで、選択された細胞集団のうちの選択された細胞への受容体媒介エンドサイトーシスを媒介する。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、脂質ナノ粒子、コア・シェルナノ粒子、または生分解性ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質、イオン化可能脂質、またはポリβ－アミノエステルを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、１つ以上の非カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質、ポリグルタミン酸脂質、構造脂質、またはヒアルロン酸脂質を含む。特定の実施形態では、ナノ粒子は、コレステロールを含む。いくつかの実施形態では、構造脂質は、ベータシトステロールである。いくつかの実施形態では、構造脂質は、ベータシトステロールではない。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、アラキドン酸またはオレイン酸を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、１つより多い環状ＲＮＡポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、構造脂質は、Ｃ１ｑに結合し、及び／または構造脂質を欠く対照輸送ビヒクルと比較して当該脂質を含む輸送ビヒクルのＣ１ｑへの結合を促進し、及び／または構造脂質を欠く対照輸送ビヒクルと比較してＣ１ｑが結合した輸送ビヒクルの免疫細胞への取り込みを増加させる。

いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＭＧ－ＰＥＧ、またはＰＥＧ－１である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）である。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ヘルパー脂質をさらに含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、ＤＳＰＣまたはＤＯＰＥである。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧを含む。

いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、モル比で約０．５％～約４％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、モル比で約１％～約２％のＰＥＧ修飾脂質を含む。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）のモル比は、６２：４：３３：１である。

いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、イオン性脂質、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）を含む。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）のモル比は、５０：１０：３８．５：１．５である。

いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、約３～約６の窒素：ホスフェート（Ｎ：Ｐ）比を有する。

いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、環状ＲＮＡポリヌクレオチドのエンドソーム放出のために製剤化されている。

いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、ＡＰＯＥに結合することが可能である。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、環状ＲＮＡポリヌクレオチドと同じ発現配列を有する参照直鎖状ＲＮＡがロードされた同等の輸送ビヒクルよりも少なくアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）と相互作用する。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルの外面は、ＡＰＯＥ結合部位を実質的に含まない。

いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、約１２０ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、３００ｎｍを超える直径を有する凝集体を形成しない。

いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、約１２０ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、３００ｎｍを超える直径を有する凝集体を形成しない。

いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、約３０時間未満のインビボ半減期を有する。

いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、細胞への低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）依存性取り込みが可能である。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、細胞へのＬＤＬＲ依存性取り込みが可能である。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、直鎖状ＲＮＡを実質的に含まない。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、輸送ビヒクルに機能可能に接続されたターゲティング部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、免疫細胞抗原に特異的に結合し、または間接的に結合する。いくつかの実施形態では、免疫細胞抗原は、Ｔ細胞抗原である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ４、ベータ７インテグリン、ベータ２インテグリン、及びＣ１ｑからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、輸送ビヒクル結合部位及び細胞結合部位を含むアダプター分子をさらに含み、ターゲティング部分は、輸送ビヒクル結合部位に特異的に結合し、細胞結合部位は、標的細胞抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的細胞抗原は、免疫細胞抗原である。いくつかの実施形態では、免疫細胞抗原は、Ｔ細胞抗原、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、または好中球である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ４、ベータ７インテグリン、ベータ２インテグリン、ＣＤ２５、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ａ２ａ受容体、Ａ２ｂ受容体、及びＣ１ｑからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞抗原は、マクロファージ抗原である。いくつかの実施形態では、マクロファージ抗原は、マンノース受容体、ＣＤ２０６、及びＣ１ｑからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、小分子である。いくつかの実施形態では、小分子は、免疫細胞上の外酵素に結合し、外酵素は、ＣＤ３８、ＣＤ７３、アデノシン２ａ受容体、及びアデノシン２ｂ受容体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、小分子は、マンノース、レクチン、アシビシン、ビオチン、またはジゴキシゲニンである。

いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、ナノボディ、ペプチド、ペプチドベースのマクロサイクル、ミニボディ、小分子リガンド、例えば、葉酸、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）、またはフェノール可溶性モジュリンアルファ１ペプチド（ＰＳＭＡ１）、重鎖可変領域、軽鎖可変領域またはそのフラグメントである。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、約２週未満の細胞膜における半減期を有する。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、約１週未満の細胞膜における半減期を有する。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、約３０時間未満の細胞膜における半減期を有する。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、環状ＲＮＡポリヌクレオチドの機能的半減期未満の細胞膜における半減期を有する。

別の態様では、本出願は、疾患、障害、または病態を処置または予防する方法であって、有効量の本明細書に開示する薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、または病態は、表２７または２８から選択されるポリペプチドの異常な発現、活性、または局在化に関連する。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、治療用タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、脾臓における治療用タンパク質発現は、肝臓における治療用タンパク質発現よりも多い。いくつかの実施形態では、脾臓における治療用タンパク質発現は、肝臓における治療用タンパク質発現の少なくとも約２．９倍である。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、肝臓において機能的レベルで発現しない。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、肝臓において検出可能なレベルで発現しない。いくつかの実施形態では、脾臓における治療用タンパク質発現は、総治療用タンパク質発現の少なくとも約６３％である。

いくつかの実施形態では、直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドは、３’アナベナグループＩイントロンフラグメント及び５’アナベナグループＩイントロンフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、参照ＲＮＡポリヌクレオチドは、参照３’アナベナグループＩイントロンフラグメント及び参照５’アナベナグループＩイントロンフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、参照３’アナベナグループＩイントロンフラグメント及び参照５’アナベナグループＩイントロンフラグメントは、Ｌ６－５順列置換部位を使用して生成された。いくつかの実施形態では、３’アナベナグループＩイントロンフラグメント及び５’アナベナグループＩイントロンフラグメントは、Ｌ６－５順列置換部位を使用して生成されなかった。いくつかの実施形態では、３’アナベナグループＩイントロンフラグメントは、配列番号１１２～１２３及び１２５～１５０から選択される配列を含み、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、５’アナベナグループＩイントロンフラグメントは、配列番号７３～８４及び８６～１１１から選択される対応配列を含む。いくつかの実施形態では、５’アナベナグループＩイントロンフラグメントは、配列番号７３～８４及び８６～１１１から選択される配列を含み、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、３’アナベナグループＩイントロンフラグメントは、配列番号１１２～１２４及び１２５～１５０から選択される対応配列を含み、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、配列番号３４８～３５１から選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、参照ＩＲＥＳは、ＣＶＢ３である。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、ＣＶＢ３ではない。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、配列番号１～６４及び６６～７２から選択される配列を含む。

別の態様では、本出願は、本明細書に開示する直鎖状ＲＮＡから産生される環状ＲＮＡポリヌクレオチドを開示する。

別の態様では、本出願は、５’から３’まで、３’グループＩイントロンフラグメント、ＩＲＥＳ、発現配列、及び５’グループＩイントロンフラグメントを含む環状ＲＮＡであって、ＩＲＥＳは、配列番号３４８～３５１から選択されるヌクレオチド配列を含む、環状ＲＮＡを開示する。

いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、３’グループＩイントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間にスペーサーをさらに含む。

いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、二重鎖を形成することが可能な第１及び第２の二重鎖形成領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の二重鎖形成領域は、各々、約９～１９ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の二重鎖形成領域は、各々、約３０ヌクレオチドの長さを有する。

一態様では、本明細書に提供されるのは、環状ＲＮＡポリヌクレオチドを作製するためのベクターであって、以下の順序で、任意の５’二重鎖形成領域、３’グループＩイントロンフラグメント、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、第１の発現配列、切断部位をコードするポリヌクレオチド配列、第２の発現配列、５’グループＩイントロンフラグメント、及び任意の３’二重鎖形成領域を含む、ベクターである。一態様では、本明細書に提供されるのは、環状ＲＮＡポリヌクレオチドを作製するためのベクターであって、以下の順序で、任意の５’二重鎖形成領域、３’グループＩイントロンフラグメント、第１の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、第１の発現配列、第２のＩＲＥＳ、第２の発現配列、５’グループＩイントロンフラグメント、及び任意の３’二重鎖形成領域を含む、ベクターである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、３’二重鎖形成領域及び５’二重鎖形成領域を含む。特定の実施形態では、ベクターは、５’二重鎖形成領域と３’グループＩイントロンフラグメントとの間の第１のスペーサー、及び５’グループＩイントロンフラグメントと３’二重鎖形成領域との間の第２のスペーサーを含む。特定の実施形態では、第１及び第２のスペーサーが、各々、約５～約６０ヌクレオチドの長さを有する。特定の実施形態では、第１及び第２のスペーサーが、各々、約８～約６０ヌクレオチドの長さを有する。特定の実施形態では、第１及び第２のスペーサーが、各々、少なくとも５ヌクレオチドの長さの非構造化領域を含む。特定の実施形態では、第１及び第２のスペーサーが、各々、少なくとも７ヌクレオチドの長さの構造化領域を含む。特定の実施形態では、第１及び第２の二重鎖形成領域は、各々、約９～５０ヌクレオチドの長さを有する。特定の実施形態では、ベクターは、コドン最適化される。特定の実施形態では、ベクターは、同等の最適化前ポリヌクレオチドに存在する少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠く。

一態様では、本明細書に提供されるのは、環状ＲＮＡポリヌクレオチドを作製するためのベクターを含む原核細胞であって、以下の順序で、任意の５’二重鎖形成領域、３’グループＩイントロンフラグメント、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、第１の発現配列、切断部位をコードするポリヌクレオチド配列、第２の発現配列、５’グループＩイントロンフラグメント、及び任意の３’二重鎖形成領域を含む、原核細胞である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、３’二重鎖形成領域及び５’二重鎖形成領域を含む。一態様では、本明細書に提供されるのは、環状ＲＮＡポリヌクレオチドを作製するためのベクターを含む原核細胞であって、以下の順序で、任意の５’二重鎖形成領域、３’グループＩイントロンフラグメント、第１の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、第１の発現配列、第２のＩＲＥＳ、第２の発現配列、５’グループＩイントロンフラグメント、及び任意の３’二重鎖形成領域を含む、原核細胞である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、３’二重鎖形成領域及び５’二重鎖形成領域を含む。

一態様では、本開示の環状ＲＮＡポリヌクレオチドを含む真核細胞が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、または好中球である。

ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び様々なＩＲＥＳ配列を含む環状ＲＮＡを用いたトランスフェクションから２４時間後のＨＥＫ２９３細胞の上清における発光を示す。 ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び様々なＩＲＥＳ配列を含む環状ＲＮＡを用いたトランスフェクションから２４時間後のＨｅｐＧ２細胞の上清における発光を示す。 ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び様々なＩＲＥＳ配列を含む環状ＲＮＡを用いたトランスフェクションから２４時間後の１Ｃ１Ｃ７細胞の上清における発光を示す。 ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び様々なＩＲＥＳ配列を含む環状ＲＮＡを用いたトランスフェクションから２４時間後のＨＥＫ２９３細胞の上清における発光を示す。 ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び様々なＩＲＥＳ配列を含む環状ＲＮＡを用いたトランスフェクションから２４時間後のＨＥＫ２９３細胞の上清における発光を示す。

ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び異なる長さを有する様々なＩＲＥＳ配列を含む環状ＲＮＡを用いたトランスフェクションから２４時間後のＨＥＫ２９３（Ａ）、ＨｅｐＧ２（Ｂ）、または１Ｃ１Ｃ７（Ｃ）細胞の上清における発光を示す。

発光によって測定された、３日間にわたるＨｅｐＧ２（Ａ）または１Ｃ１Ｃ７（Ｂ）細胞における選択されたＩＲＥＳ構築物の安定性を示す。

Ａ及びＢは、細胞上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光によって測定された、Ｊｕｒｋａｔ細胞における選択されたＩＲＥＳ構築物からのタンパク質発現を示す。

Ａ及びＢは、発光によって測定された、３日間にわたるＪｕｒｋａｔ細胞における選択されたＩＲＥＳ構築物の安定性を示す。

ガウシアルシフェラーゼをコードする修飾直鎖状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡの２４時間発光の比較を示す。 ガウシアルシフェラーゼをコードする修飾直鎖状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡの３日間にわたる相対発光の比較を示す。

修飾直鎖状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたＪｕｒｋａｔ細胞のエレクトロポレーション後の、ＩＦＮγの転写産物誘導を示す。 修飾直鎖状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたＪｕｒｋａｔ細胞のエレクトロポレーション後の、ＩＬ－６の転写産物誘導を示す。 修飾直鎖状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたＪｕｒｋａｔ細胞のエレクトロポレーション後の、ＩＬ－２の転写産物誘導を示す。 修飾直鎖状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたＪｕｒｋａｔ細胞のエレクトロポレーション後の、ＲＩＧ－Ｉの転写産物誘導を示す。 修飾直鎖状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたＪｕｒｋａｔ細胞のエレクトロポレーション後の、ＩＦＮ－β１の転写産物誘導を示す。 修飾直鎖状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたＪｕｒｋａｔ細胞のエレクトロポレーション後の、ＴＮＦαの転写産物誘導を示す。

ヒト初代単球におけるガウシアルシフェラーゼをコードする環状ＲＮＡ及び修飾直鎖状ＲＮＡの発光の比較を示す。 マクロファージにおけるガウシアルシフェラーゼをコードする環状ＲＮＡ及び修飾直鎖状ＲＮＡの発光の比較を示す。 マクロファージにおけるガウシアルシフェラーゼをコードする環状ＲＮＡ及び修飾直鎖状ＲＮＡの発光の比較を示す。

ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び様々なＩＲＥＳ配列を含む環状ＲＮＡを用いた形質導入後の初代Ｔ細胞の上清における３日間にわたる相対発光（Ａ）または２４時間発光（Ｂ）を示す。

ガウシアルシフェラーゼ発現配列を含む環状ＲＮＡまたは修飾直鎖状ＲＮＡを用いた形質導入後の初代Ｔ細胞の上清における２４時間発光を示す。 ガウシアルシフェラーゼ発現配列を含む環状ＲＮＡまたは修飾直鎖状ＲＮＡを用いた形質導入後の初代Ｔ細胞の上清における３日間にわたる相対発光を示す。 ガウシアルシフェラーゼ発現配列を含む環状ＲＮＡまたは修飾直鎖状ＲＮＡを用いた形質導入後の初代Ｔ細胞の上清におけるＰＢＭＣにおける２４時間発光を示す。

異なる順列置換部位を有するＲＮＡ構築物のＨＰＬＣクロマトグラム（Ａ）及び環状化効率（Ｂ）を示す。

異なるイントロン及び／または順列置換部位を有するＲＮＡ構築物のＨＰＬＣクロマトグラム（Ａ）及び環状化効率（Ｂ）を示す。

相同性アームを伴うまたは伴わない３つのＲＮＡ構築物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 相同性アームを伴うまたは伴わない３つのＲＮＡ構築物の環状化効率を示す。

相同アームを伴わない、または様々な長さ及びＧＣ含量を有する相同アームを伴う３つのＲＮＡ構築物の環状化効率を示す。

Ａ及びＢは、スプライシング効率の改善に対する強い相同アームの寄与、選択された構築物における環状化効率とニッキングとの間の関係、ならびに環状化効率の改善を示すと仮定された順列置換部位及び相同アームの組み合わせを示すＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

モックエレクトロポレーションした（左）またはＣＡＲをコードする環状ＲＮＡでエレクトロポレーション（右）し、ＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼを発現するＲａｊｉ細胞と共培養したＴ細胞の蛍光画像を示す。

モックエレクトロポレーションした（上）またはＣＡＲをコードする環状ＲＮＡでエレクトロポレーション（下）し、ＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼを発現するＲａｊｉ細胞と共培養したＴ細胞の明視野（左）、蛍光（中心）、及びオーバーレイ（右）画像を示す。

モックエレクトロポレーションした、または異なるＣＡＲ配列をコードする環状ＲＮＡでエレクトロポレーションしたＴ細胞によるＲａｊｉ標的細胞の特異的溶解を示す。

ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び様々なＩＲＥＳ配列を含む直鎖状または環状ＲＮＡを用いた形質導入から２４時間後のＪｕｒｋａｔ細胞（左）または休止初代ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞（右）の上清における発光（Ａ）、及び３日間にわたる相対発光（Ｂ）を示す。

修飾直鎖状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のエレクトロポレーション後のＩＦＮ－β１の転写産物誘導を示す。 修飾直鎖状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のエレクトロポレーション後のＲＩＧ－Ｉの転写産物誘導を示す。 修飾直鎖状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のエレクトロポレーション後のＩＬ－２の転写産物誘導を示す。 修飾直鎖状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のエレクトロポレーション後のＩＬ－６の転写産物誘導を示す。 修飾直鎖状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のエレクトロポレーション後のＩＦＮγの転写産物誘導を示す。 修飾直鎖状、未精製環状、または精製環状ＲＮＡを用いたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のエレクトロポレーション後のＴＮＦαの転写産物誘導を示す。

ホタル発光の検出によって決定した、ＣＡＲをコードするｃｉｒｃＲＮＡでエレクトロポレーションしたヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞によるＲａｊｉ標的細胞の特異的溶解を示す。 ＣＡＲ配列をコードする異なる量の環状または直鎖状ＲＮＡを用いたエレクトロポレーションの２４時間後のＩＦＮγ転写産物誘導を示す。

ホタルの発光の検出によって決定した、異なるＥ：Ｔ比（Ａ及びＢ）にてＣＡＲをコードする環状または直鎖状ＲＮＡでエレクトロポレーションしたヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞による標的細胞または非標的細胞の特異的溶解を示す。

エレクトロポレーションの１、３、５、及び７日後での、ＣＡＲをコードするＲＮＡでエレクトロポレーションしたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞による標的細胞の特異的溶解を示す。

ＣＤ１９またはＢＣＭＡ標的ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡでエレクトロポレーションしたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞による標的細胞の特異的溶解を示す。

ＦＬｕｃをコードし、５０％脂質１５（表１０ｂ）、１０％ＤＳＰＣ、１．５％ＰＥＧ－ＤＭＧ、及び３８．５％コレステロールで製剤化された環状ＲＮＡが投薬されたＣＤ－１マウスから採取された器官の総フラックスを示す。

ＦＬｕｃをコードし、５０％脂質１５（表１０ｂ）、１０％ＤＳＰＣ、１．５％ＰＥＧ－ＤＭＧ、及び３８．５％コレステロールで製剤化された環状ＲＮＡが投薬されたＣＤ－１マウスから採取された器官の発光を強調する画像を示す。

表１０ａからの脂質２６及び２７の分子特徴評価を示す。脂質２６のプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示す。 表１０ａからの脂質２６及び２７の分子特徴評価を示す。液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって測定された脂質２６の保持時間を示す。 表１０ａからの脂質２６及び２７の分子特徴評価を示す。脂質２６の質量スペクトルを示す。 表１０ａからの脂質２６及び２７の分子特徴評価を示す。脂質２７のプロトンＮＭＲスペクトルを示す。 表１０ａからの脂質２６及び２７の分子特徴評価を示す。ＬＣ－ＭＳによって測定された脂質２７の保持時間を示す。 表１０ａからの脂質２６及び２７の分子特徴評価を示す。脂質２７の質量スペクトルを示す。

脂質２２－Ｓ１４及びその合成中間体の分子特徴評価を示す。２－（テトラデシルチオ）エタン－１－オールのＮＭＲスペクトルを示す。 脂質２２－Ｓ１４及びその合成中間体の分子特徴評価を示す。２－（テトラデシルチオ）エチルアクリレートのＮＭＲスペクトルを示す。 脂質２２－Ｓ１４及びその合成中間体の分子特徴評価を示す。ビス（２－（テトラデシルチオ）エチル）３，３’－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ジプロピオネート（脂質２２－Ｓ１４）のＮＭＲスペクトルを示す。

ビス（２－（テトラデシルチオ）エチル）３，３’－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ジプロピオネート（脂質９３－Ｓ１４）のＮＭＲスペクトルを示す。

ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（表１０ａからの脂質５４）の分子特徴評価を示す。脂質５４のプロトンＮＭＲスペクトルを示す。 ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（表１０ａからの脂質５４）の分子特徴評価を示す。ＬＣ－ＭＳによって測定された脂質５４の保持時間を示す。 ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（表１０ａからの脂質５４）の分子特徴評価を示す。脂質５４の質量スペクトルを示す。

ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（表１０ａからの脂質５３）の分子特徴評価を示す。脂質５３のプロトンＮＭＲスペクトルを示す。 ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（表１０ａからの脂質５３）の分子特徴評価を示す。ＬＣ－ＭＳによって測定された脂質５３の保持時間を示す。 ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（表１０ａからの脂質５３）の分子特徴評価を示す。脂質５３の質量スペクトルを示す。

Ａは、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をコードし、目的のイオン化可能脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）で１６：１：４：１の重量比または６２：４：３３：１のモル比で製剤化された環状ＲＮＡが投薬されたＣＤ－１マウスから採取された脾臓及び肝臓の総フラックスを示す。Ｂは、タンパク質発現の生体内分布についての平均輝度を示す。

Ａは、ＦＬｕｃをコードし、イオン化可能脂質２２－Ｓ１４、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）で１６：１：４：１の重量比または６２：４：３３：１のモル比で製剤化された環状ＲＮＡが投薬されたＣＤ－１マウスから採取された器官の発光を強調する画像を示す。Ｂは、ＦＬｕｃをコードし、イオン化可能脂質２２－Ｓ１４、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）で１６：１：４：１の重量比または６２：４：３３：１のモル比で製剤化された環状ＲＮＡが投薬されたＣＤ－１マウスの全身ＩＶＩＳ画像を示す。

Ａは、ＦＬｕｃをコードし、イオン化可能脂質９３－Ｓ１４、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）で１６：１：４：１の重量比または６２：４：３３：１のモル比で製剤化された環状ＲＮＡが投薬されたＣＤ－１マウスから採取された器官の発光を強調する画像を示す。Ｂは、ＦＬｕｃをコードし、イオン化可能脂質９３－Ｓ１４、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）で１６：１：４：１の重量比または６２：４：３３：１のモル比で製剤化された環状ＲＮＡが投薬されたＣＤ－１マウスの全身ＩＶＩＳ画像を示す。

Ａは、ＦＬｕｃをコードし、表１０ａからのイオン化可能脂質２６、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）で１６：１：４：１の重量比または６２：４：３３：１のモル比で製剤化された環状ＲＮＡが投薬されたＣＤ－１マウスから採取された器官の発光を強調する画像を示す。Ｂは、ＦＬｕｃをコードし、イオン化可能脂質２６、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）で１６：１：４：１の重量比または６２：４：３３：１のモル比で製剤化された環状ＲＮＡが投薬されたＣＤ－１マウスの全身ＩＶＩＳ画像を示す。

ＦＬｕｃをコードし、表１０ｂからの脂質１５（図３６Ａ）で形成された脂質ナノ粒子に封入された環状ＲＮＡが投薬されたｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから採取された器官の発光を強調する画像を示す。 ＦＬｕｃをコードし、表１０ａからの脂質５３（図３６Ｂ）で形成された脂質ナノ粒子に封入された環状ＲＮＡが投薬されたｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから採取された器官の発光を強調する画像を示す。 ＦＬｕｃをコードし、表１０ａからの脂質５４（図３６Ｃ）で形成された脂質ナノ粒子に封入された環状ＲＮＡが投薬されたｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから採取された器官の発光を強調する画像を示す。 ＰＢＳを対照として使用した（図３６Ｄ）。

ホタルルシフェラーゼをコードする環状ＲＮＡを含有する試験用脂質ナノ粒子との２４時間のインキュベーション後のヒトＰＢＭＣの溶解物における相対的発光を示す。

ＧＦＰまたはＣＤ１９ ＣＡＲのいずれかをコードする環状ＲＮＡを含有する試験用脂質ナノ粒子とインキュベートした後のヒトＰＢＭＣにおけるＧＦＰ（Ａ）及びＣＤ１９ ＣＡＲ（Ｂ）の発現を示す。

抗ネズミＣＤ１９ ＣＡＲ発現配列及び様々なＩＲＥＳ配列を含む環状ＲＮＡでリポトランスフェクトされた１Ｃ１Ｃ７細胞における抗ネズミＣＤ１９ ＣＡＲの発現を示す。

ネズミＴ細胞に対する抗ネズミＣＤ１９ ＣＡＲの細胞傷害を示す。ＣＤ１９ ＣＡＲは、ネズミＴ細胞にエレクトロポレーションされた環状ＲＮＡによってコードされ、発現する。

抗ネズミＣＤ１９ ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡを封入している試験用脂質ナノ粒子が１日おきに注射されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける末梢血（図４０Ａ及び図４０Ｂ）または脾臓（図４０Ｃ）におけるＢ細胞数を示す。 抗ネズミＣＤ１９ ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡを封入している試験用脂質ナノ粒子が１日おきに注射されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける末梢血（図４０Ａ及び図４０Ｂ）または脾臓（図４０Ｃ）におけるＢ細胞数を示す。 抗ネズミＣＤ１９ ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡを封入している試験用脂質ナノ粒子が１日おきに注射されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける末梢血（図４０Ａ及び図４０Ｂ）または脾臓（図４０Ｃ）におけるＢ細胞数を示す。

環状ＲＮＡから発現した抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲの発現レベルを直鎖状ｍＲＮＡから発現したものと比較している。

環状ＲＮＡから発現した抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲの細胞傷害効果を直鎖状ｍＲＮＡから発現したものと比較している。

Ｔ細胞において単一の環状ＲＮＡから発現した２つのＣＡＲ（抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲ及び抗ヒトＢＣＭＡ ＣＡＲ）の細胞傷害を示す。

表１０ａからの脂質２７もしくは２６または表１０ｂからの脂質１５で形成されたＬＮＰでの処置後の様々な脾臓免疫細胞サブセットにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ発現の頻度とともに代表的なＦＡＣＳプロットを示す。 Ｃｒｅ環状ＲＮＡで成功裏にトランスフェクトされた各細胞集団の割合と同等な、ｔｄＴｏｍａｔｏを発現する骨髄細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞の割合の定量を示す（平均＋標準偏差、ｎ＝３）。 脂質２７及び２６での処置後にｔｄＴｏｍａｔｏを発現するＮＫ細胞、古典的単球、非古典的単球、好中球、及び樹状細胞を含む追加の脾臓免疫細胞集団の割合を示す（平均＋標準偏差、ｎ＝３）。

イントロンにビルトインポリＡ配列を有する例示的なＲＮＡ構築物設計を示す。 未精製環状ＲＮＡのクロマトグラフィートレースを示す。 アフィニティー精製された環状ＲＮＡのクロマトグラフィートレースを示す。 様々なＩＶＴ条件及び精製方法で調製された環状ＲＮＡの免疫原性を示す。（市販＝市販ＩＶＴミックス；カスタム＝カスタマイズされたＩＶＴミックス；Ａｆｆ＝アフィニティー精製；Ｅｎｚ＝酵素精製；ＧＭＰ：ＧＴＰ比＝８、１２．５、または１３．７５）。

Ａは、ハイブリダイゼーション精製のためのポリＡの代替手段として特殊結合配列を有する例示的なＲＮＡ構築物設計を示す。Ｂは、未精製環状ＲＮＡのクロマトグラフィートレースを示す。Ｃは、アフィニティー精製された環状ＲＮＡのクロマトグラフィートレースを示す。

Ａは、ジストロフィンをコードする未精製環状ＲＮＡのクロマトグラフィートレースを示す。Ｂは、ジストロフィンをコードする酵素精製された環状ＲＮＡのクロマトグラフィートレースを示す。

Ｊｕｒｋａｔ細胞における３’イントロンフラグメント／５’内部二重鎖領域とＩＲＥＳとの間に異なる５’スペーサーを有する精製されたｃｉｒｃＲＮＡの発現（図４９Ａ）及び安定性（図４９Ｂ）を比較している。（ＡＣ＝Ａ及びＣのみがスペーサー配列において使用された；ＵＣ＝Ｕ及びＣのみがスペーサー配列において使用された）。

示されたオリジナルのまたは修飾ＩＲＥＳエレメントを含有する環状ＲＮＡからの初代Ｔ細胞における発光発現レベル及び発現の安定性を示す。

示されたオリジナルのまたは修飾されたＩＲＥＳエレメントを含有する環状ＲＮＡからのＨｅｐＧ２細胞における発光発現レベル及び発現の安定性を示す。

示されたオリジナルのまたは修飾ＩＲＥＳエレメントを含有する環状ＲＮＡからの１Ｃ１Ｃ７細胞における発光発現レベル及び発現の安定性を示す。

挿入された非翻訳領域（ＵＴＲ）を有するＩＲＥＳエレメントまたはハイブリッドＩＲＥＳエレメントを含有する環状ＲＮＡからのＨｅｐＧ２細胞における発光発現レベル及び発現の安定性を示す。「Ｓｃｒ」は、対照として使用されたスクランブルを意味する。

ガウシアルシフェラーゼをコードする配列に作動可能に連結されたＩＲＥＳ及び可変終止コドンカセットを含有する環状ＲＮＡからの１Ｃ１Ｃ７細胞における発光発現レベル及び発現の安定性を示す。

ガウシアルシフェラーゼをコードする配列の開始コドンの前に挿入されたＩＲＥＳ及び可変非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有する環状ＲＮＡからの１Ｃ１Ｃ７細胞における発光発現レベル及び発現の安定性を示す。

ｈＥＰＯをコードする配列の下流に２つのｍｉＲ－１２２標的部位を含有する環状ＲＮＡからのＨｕｈ７細胞におけるヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）の発現レベルを示す。

抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する環状ＲＮＡを封入したＬＮＰで処理した場合の末梢血（Ａ）及び脾臓（Ｂ）におけるＣＡＲ発現レベルを示す。抗ＣＤ２０（ａＣＤ２０）及びルシフェラーゼをコードする環状ＲＮＡ（ｏＬｕｃ）を比較のために使用した。

抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現の全体的な頻度、細胞表面上の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現の頻度、及びＴ細胞上の抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするＩＲＥＳ特異的環状ＲＮＡの抗腫瘍応答への影響を示す。Ａは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの幾何平均蛍光強度を示し、Ｂは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現のパーセンテージを示し、Ｃは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲによって実施された標的細胞溶解のパーセンテージを示す。（ＣＫ＝ヤギコブウイルス；ＡＰ＝アポデムスピコルナウイルス；ＣＫ＊＝コドン最適化されたヤギコブウイルス；ＰＶ＝パラボウイルス；ＳＶ＝サリウイルス）。

ＩＲＥＳ特異的環状ＲＮＡ構築物で処理した場合のＡ２０ ＦＬｕｃ標的細胞のＣＡＲ発現レベルを示す。

初代ヒトＴ細胞における環状ＲＮＡからの細胞質（Ａ）及び表面（Ｂ）タンパク質の発光発現レベルを示す。

ＩＲＥＳ特異的環状構築物で処理した場合のヒトＴ細胞における発光発現を示す。環状ＲＮＡ構築物における発現を直鎖状ｍＲＮＡと比較した。図６１Ａ、図６１Ｂ、及び図６１Ｇは、複数ドナー細胞におけるガウシアルシフェラーゼ発現を提供する。図６１Ｃ、図６１Ｄ、図６１Ｅ、及び図６１Ｆは、複数ドナー細胞におけるホタルルシフェラーゼ発現を提供する。 ＩＲＥＳ特異的環状構築物で処理した場合のヒトＴ細胞における発光発現を示す。環状ＲＮＡ構築物における発現を直鎖状ｍＲＮＡと比較した。図６１Ａ、図６１Ｂ、及び図６１Ｇは、複数ドナー細胞におけるガウシアルシフェラーゼ発現を提供する。図６１Ｃ、図６１Ｄ、図６１Ｅ、及び図６１Ｆは、複数ドナー細胞におけるホタルルシフェラーゼ発現を提供する。 ＩＲＥＳ特異的環状構築物で処理した場合のヒトＴ細胞における発光発現を示す。環状ＲＮＡ構築物における発現を直鎖状ｍＲＮＡと比較した。図６１Ａ、図６１Ｂ、及び図６１Ｇは、複数ドナー細胞におけるガウシアルシフェラーゼ発現を提供する。図６１Ｃ、図６１Ｄ、図６１Ｅ、及び図６１Ｆは、複数ドナー細胞におけるホタルルシフェラーゼ発現を提供する。 ＩＲＥＳ特異的環状構築物で処理した場合のヒトＴ細胞における発光発現を示す。環状ＲＮＡ構築物における発現を直鎖状ｍＲＮＡと比較した。図６１Ａ、図６１Ｂ、及び図６１Ｇは、複数ドナー細胞におけるガウシアルシフェラーゼ発現を提供する。図６１Ｃ、図６１Ｄ、図６１Ｅ、及び図６１Ｆは、複数ドナー細胞におけるホタルルシフェラーゼ発現を提供する。 ＩＲＥＳ特異的環状構築物で処理した場合のヒトＴ細胞における発光発現を示す。環状ＲＮＡ構築物における発現を直鎖状ｍＲＮＡと比較した。図６１Ａ、図６１Ｂ、及び図６１Ｇは、複数ドナー細胞におけるガウシアルシフェラーゼ発現を提供する。図６１Ｃ、図６１Ｄ、図６１Ｅ、及び図６１Ｆは、複数ドナー細胞におけるホタルルシフェラーゼ発現を提供する。 ＩＲＥＳ特異的環状構築物で処理した場合のヒトＴ細胞における発光発現を示す。環状ＲＮＡ構築物における発現を直鎖状ｍＲＮＡと比較した。図６１Ａ、図６１Ｂ、及び図６１Ｇは、複数ドナー細胞におけるガウシアルシフェラーゼ発現を提供する。図６１Ｃ、図６１Ｄ、図６１Ｅ、及び図６１Ｆは、複数ドナー細胞におけるホタルルシフェラーゼ発現を提供する。 ＩＲＥＳ特異的環状構築物で処理した場合のヒトＴ細胞における発光発現を示す。環状ＲＮＡ構築物における発現を直鎖状ｍＲＮＡと比較した。図６１Ａ、図６１Ｂ、及び図６１Ｇは、複数ドナー細胞におけるガウシアルシフェラーゼ発現を提供する。図６１Ｃ、図６１Ｄ、図６１Ｅ、及び図６１Ｆは、複数ドナー細胞におけるホタルルシフェラーゼ発現を提供する。

ホタルルシフェラーゼを発現するＫ５６２細胞に対して、抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ ＣＡＲのいずれかをコードする環状ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子処理後のヒトＴ細胞における抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（Ａ及びＢ）及び抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ（Ｂ）の発現を示す。

特異的抗原依存的様式に抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡのインビトロにおけるエレクトロポレーションによる送達から生じる抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現レベルを示す。Ａは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲによるＮａｌｍ６細胞溶解を示す。Ｂは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲによるＫ５６２細胞溶解を示す。

緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＬＮＰ及び環状ＲＮＡを含む溶液中でのＡｐｏＥ３の使用を介したＬＮＰのトランスフェクションを示す。図６４Ａは、生死の結果を示した。図６４Ｂ、図６１Ｃ、図６１Ｄ、及び図６４Ｅは、複数ドナーの発現頻度を提供する。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＬＮＰ及び環状ＲＮＡを含む溶液中でのＡｐｏＥ３の使用を介したＬＮＰのトランスフェクションを示す。図６４Ａは、生死の結果を示した。図６４Ｂ、図６１Ｃ、図６１Ｄ、及び図６４Ｅは、複数ドナーの発現頻度を提供する。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＬＮＰ及び環状ＲＮＡを含む溶液中でのＡｐｏＥ３の使用を介したＬＮＰのトランスフェクションを示す。図６４Ａは、生死の結果を示した。図６４Ｂ、図６１Ｃ、図６１Ｄ、及び図６４Ｅは、複数ドナーの発現頻度を提供する。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＬＮＰ及び環状ＲＮＡを含む溶液中でのＡｐｏＥ３の使用を介したＬＮＰのトランスフェクションを示す。図６４Ａは、生死の結果を示した。図６４Ｂ、図６１Ｃ、図６１Ｄ、及び図６４Ｅは、複数ドナーの発現頻度を提供する。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＬＮＰ及び環状ＲＮＡを含む溶液中でのＡｐｏＥ３の使用を介したＬＮＰのトランスフェクションを示す。図６４Ａは、生死の結果を示した。図６４Ｂ、図６１Ｃ、図６１Ｄ、及び図６４Ｅは、複数ドナーの発現頻度を提供する。

詳細な説明
本発明は、とりわけ、環状ＲＮＡ療法に基づいて自己免疫障害またはがんを処置するための方法及び組成物を提供する。特に、本発明は、治療を必要とする対象に、自己免疫障害もしくはがんの少なくとも１つの症状または特徴の強度、重症度、または頻度が低下するか、発症が遅延するように、２つの治療用タンパク質をコードするＲＮＡを含む組成物を有効用量及び投与間隔で投与することによって、自己免疫障害またはがんを治療する方法を提供する。

特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、環状ＲＮＡを作製するためのベクターであり、ベクターは、任意の５’二重鎖形成領域、３’グループＩイントロンフラグメント、任意の第１のスペーサー、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、第１の発現配列、切断部位をコードするポリヌクレオチド配列、第２の発現配列、任意の第２のスペーサー、５’グループＩイントロンフラグメント、及び任意の３’二重鎖形成領域を含む。特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、環状ＲＮＡを作製するためのベクターであり、ベクターは、任意の５’二重鎖形成領域、３’グループＩイントロンフラグメント、任意の第１のスペーサー、第１の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、第１の発現配列、第２のＩＲＥＳ、第２の発現配列、任意の第２のスペーサー、５’グループＩイントロンフラグメント、及び任意の３’二重鎖形成領域を含む。いくつかの実施形態では、これらのエレメントは、上記の順序でベクター内に配置される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、３’二重鎖形成領域及び５’二重鎖形成領域を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、３’グループＩイントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間の内部５’二重鎖形成領域、及び発現配列と５’グループＩイントロンフラグメントとの間の内部３’二重鎖形成領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、内部二重鎖形成領域は、互いの間に二重鎖を形成することができるが、外部二重鎖形成領域とは形成できない。いくつかの実施形態では、内部二重鎖形成領域は、第１及び第２のスペーサーの一部である。追加の実施形態には、本明細書に提供するベクターを使用して作製された環状ＲＮＡポリヌクレオチドを含む環状ＲＮＡポリヌクレオチド、かかる環状ＲＮＡを含む組成物、かかる環状ＲＮＡを含む細胞、かかるベクター、環状ＲＮＡ、組成物及び細胞を使用及び作製する方法が含まれる。

いくつかの実施形態では、治療または有用なタンパク質の産生のために、本明細書で提供される環状ＲＮＡポリヌクレオチドを細胞に投与することを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、リボヌクレアーゼに対し環状ＲＮＡが耐性であるために、直鎖状ＲＮＡよりも長い半減期を伴う真核細胞内での所望のポリペプチドの産生を提供することにおいて有利である。

環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼを介した分解に必要な遊離端を欠いているため、同等の直鎖状ＲＮＡと比較した場合、ＲＮＡ分解のいくつかのメカニズムに対して耐性がもたらされ、半減期が長くなる。環状化により、一般に半減期が短いＲＮＡポリヌクレオチドの安定化が可能になり得、様々な用途において外因性ｍＲＮＡの全体的な有効性が改善し得る。ある実施形態では、タンパク質合成によって評価される真核細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞）における本明細書で提供される環状ＲＮＡポリヌクレオチドの機能的半減期は、少なくとも２０時間（例えば、少なくとも８０時間）である。

１．定義
本明細書で使用する場合、「ｃｉｒｃＲＮＡ」または「環状ポリリボヌクレオチド」または「環状ＲＮＡ」という用語は、互換可能に使用され、共有結合を通して環状構造を形成するポリリボヌクレオチドを指す。

本明細書で使用する場合、「３’グループＩイントロンフラグメント」という用語は、スプライス部位ジヌクレオチド及び任意で天然エクソン配列のストレッチを含む天然グループＩイントロンの３’近位端と７５％以上の類似性を有する配列を指す。

本明細書で使用する場合、「５’グループＩイントロンフラグメント」という用語は、スプライス部位ジヌクレオチド及び任意で天然エクソン配列のストレッチを含む天然グループＩイントロンの５’近位端と７５％以上の類似性を有する配列を指す。

本明細書で使用する場合、「順列置換部位」という用語は、イントロンの順列置換の前に切断が行われるグループＩイントロン内の部位を指す。この切断により、３’及び５’グループＩイントロンフラグメントが生成され、これらは、環状化される前駆体ＲＮＡのストレッチのいずれかの側に順列置換される。

本明細書で使用する場合、「スプライス部位」という用語は、グループＩイントロンに部分的または完全に含まれ、その間でＲＮＡ環状化中にホスホジエステル結合が切断されるジヌクレオチドを指す。

ポリヌクレオチド構築物中の発現配列は、発現配列によってコードされるポリペプチドが翻訳されると、細胞によって別々に発現されることを可能にする「切断部位」配列によって分離され得る。

「自己切断ペプチド」とは、２つの隣接するアミノ酸間のペプチド結合なしで翻訳されるか、またはタンパク質及び自己切断ペプチドを含むポリペプチドが産生されるときに、いかなる外部切断活性も必要なく、すぐに切断または別個の第１及び第２のポリペプチドに分離されるように機能するペプチドを指す。

本明細書で使用する場合、「治療用タンパク質」という用語は、対象に、翻訳された核酸の形態で直接または間接的に投与された場合に、治療的、診断的、及び／または予防効果を有する、及び／または望ましい生物学的及び／または薬理学的効果を引き出す、任意のタンパク質を指す。

αβ ＴＣＲのα鎖及びβ鎖は、一般に、各々、２つのドメインまたは領域、すなわち、可変ドメイン及び定常ドメイン／領域を有するとみなされる。可変ドメインは、可変領域及び結合領域の連結からなる。したがって、本明細書及び特許請求の範囲では、「ＴＣＲアルファ可変ドメイン」という用語は、ＴＲＡＶ及びＴＲＡＪ領域の連結を指し、ＴＣＲアルファ定常ドメインという用語は、細胞外ＴＲＡＣ領域またはＣ末端切断ＴＲＡＣ配列を指す。同様に、「ＴＣＲベータ可変ドメイン」という用語は、ＴＲＢＶ及びＴＲＢＤ／ＴＲＢＪ領域の連結を指し、ＴＣＲベータ定常ドメインという用語は、細胞外ＴＲＢＣ領域またはＣ末端切断ＴＲＢＣ配列を指す。

本明細書で使用する場合、「免疫原性」という用語は、物質に対する。免疫応答を誘導する可能性を指す免疫応答は、生物の免疫系またはある特定のタイプの免疫細胞が免疫原性物質に曝露された場合に誘導され得る。「非免疫原性」という用語は、物質に対する検出可能な閾値を超える。免疫応答の欠如または非存在を指す免疫応答は、生物の免疫系またはある特定のタイプの免疫細胞が非免疫原性物質に曝露した場合には検出されない。いくつかの実施形態では、本明細書に提供するような非免疫原性環状ポリリボヌクレオチドは、免疫原性アッセイによって測定された場合、所定の閾値を超える免疫応答を誘導しない。いくつかの実施形態では、自然免疫応答は、生物の免疫系または特定のタイプの免疫細胞が本明細書に提供するような非免疫原性環状ポリリボヌクレオチドに曝露された場合には、検出されない。いくつかの実施形態では、適応免疫応答は、生物の免疫系または特定のタイプの免疫細胞が本明細書に提供するような非免疫原性環状ポリリボヌクレオチドに曝露された場合には、検出されない。

本明細書で使用する場合、「環状化効率」という用語は、その直鎖状出発物質と比較した、結果得られた環状ポリリボヌクレオチドの測定値を指す。

本明細書で使用する場合、「翻訳効率」という用語は、リボヌクレオチド転写産物からのタンパク質またはペプチド産生の速度または量を指す。いくつかの実施形態では、翻訳効率は、タンパク質またはペプチドをコードする転写産物の所与の量当たりに産生されるタンパク質またはペプチドの量として表すことができる。

「ヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、その修飾形態、またはその類似体を指す。ヌクレオチドには、プリン、例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、ならびにその誘導体及び類似体、ならびにピリミジン、例えば、シトシン、ウラシル、チミン、ならびにその誘導体及び類似体を含む種が含まれる。ヌクレオチド類似体には、塩基、糖及び／またはリン酸の化学構造に修飾を有するヌクレオチドが含まれ、それには、５’位ピリミジン修飾、８’位プリン修飾、シトシン環外アミンでの修飾、及び５－ブロモ－ウラシルの置換；ならびに２’位糖修飾、例えば限定されないが、２’－ＯＨがＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、またはＣＮ（ここで、Ｒは、本明細書で定義するようなアルキル部分である）などの基によって置換されている糖修飾リボヌクレオチドが含まれるが、これに限定されない。ヌクレオチド類似体はまた、塩基、例えばイノシン、クエオシン、キサンチン；糖、例えば２’－メチルリボース；非天然ホスホジエステル連結、例えばメチルホスホン酸、ホスホロチオエート及びペプチド連結を伴うヌクレオチドを含むことを意図する。ヌクレオチド類似体には、５－メトキシウリジン、１－メチルシュードウリジン、及び６－メチルアデノシンが含まれる。

「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、任意の長さ、例えば、約２塩基を超える、約１０塩基を超える、約１００塩基を超える、約５００塩基を超える、１０００塩基を超える、または最大で約１０，０００塩基以上の、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから構成されるポリマーを説明し、酵素的または合成的に産生され得（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号及びそこに引用される参考文献に記載されるとおりである）、これは２つの天然に存在する核酸のものに類似した配列特異的様式で天然に存在する核酸とハイブリダイズする、例えば、ワトソン－クリック塩基対形成相互作用に参加することができる。天然に存在する核酸は、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、及びウラシル（それぞれ、Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｔ、及びＵ）を含むヌクレオチドから構成される。

本明細書で使用する場合、「リボ核酸」及び「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチドから構成されるポリマーを意味する。

本明細書で使用する場合、「デオキシリボ核酸」及び「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボヌクレオチドから構成されるポリマーを意味する。

「単離された」または「精製された」は、一般に、物質（例えば、いくつかの実施形態では、化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド組成物、またはポリペプチド組成物）が、それが存在する試料のかなりのパーセント（例えば、１％を超える、２％を超える、５％を超える、１０％を超える、２０％を超える、５０％を超える、またはそれ以上、通常は最大約９０％～１００％）を構成するような、物質の単離を指す。特定の実施形態では、実質的に精製された成分は、試料の少なくとも５０％、８０％～８５％、また９０％～９５％を含む。目的のポリヌクレオチド及びポリペプチドを精製するための技術は当該技術分野で周知であり、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、及び密度に応じた沈降が含まれる。一般に、物質は、試料の他の成分と比較して、自然に見られる量よりも多い量で試料に存在する場合に精製される。

本明細書で使用する場合、「二本鎖」、「二重鎖」または「ハイブリダイズ」という用語は、相補的配列を含有する核酸の２本の一本鎖のハイブリダイゼーションによって形成された核酸を指す。ほとんどの場合、ゲノムＤＮＡは二本鎖である。配列は、完全に相補的または部分的に相補的であることができる。

本明細書で使用する場合、ＲＮＡに関して「非構造化」とは、ＲＮＡＦｏｌｄソフトウェアまたは同様の予測ツールによって、それ自体または同じＲＮＡ分子内の他の配列と構造（例えば、ヘアピンループ）を形成すると予測されないＲＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、非構造化ＲＮＡは、ヌクレアーゼ保護アッセイを使用して機能的に特徴評価することができる。

本明細書で使用する場合、ＲＮＡに関して「構造化」とは、ＲＮＡＦｏｌｄソフトウェアまたは同様の予測ツールによって、それ自体または同じＲＮＡ分子内の他の配列と構造（例えば、ヘアピンループ）を形成すると予測されるＲＮＡ配列を指す。

本明細書で使用される場合、２つの「二重鎖形成領域」、「相同性アーム」、または「相同性領域」は、ハイブリダイゼーション反応のための基質として作用するために、２つの領域が互いの逆補体に対して十分なレベルの配列同一性を共有している場合、互いに相補体であるか、または相補的である。本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド配列は、それらが逆相補体または「相補的」配列に対して同一であるまたは配列同一性を共有する場合、「相同性」を有する。二重鎖形成領域及び対応する二重鎖形成領域の逆相補体間のパーセント配列同一性は、ハイブリダイゼーションが起こることを可能にする任意のパーセントの配列同一性であり得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの内部二重鎖形成領域は、別の内部二重鎖形成領域と二重鎖を形成することができ、外部二重鎖形成領域と二重鎖を形成しない。

直鎖状核酸分子は、核酸ホスホジエステル連結が置換基モノヌクレオチドの糖部分の５’炭素及び３’炭素で発生するため、「５’末端」（５’端）及び「３’末端」（３’端）を有すると言われている。新しい連結が５’炭素にあるポリヌクレオチドの端ヌクレオチドは、その５’末端ヌクレオチドである。新しい連結が３’炭素にあるポリヌクレオチドの端ヌクレオチドは、その３’末端ヌクレオチドである。本明細書で使用する場合、末端ヌクレオチドは、３’または５’末端の端位置にあるヌクレオチドである。

「転写」は、ＤＮＡ分子をテンプレートとして使用するＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ分子の形成または合成を意味する。本発明は、転写に使用されるＲＮＡポリメラーゼに関して制限されない。例えば、いくつかの実施形態では、Ｔ７型ＲＮＡポリメラーゼを使用することができる。

「翻訳」は、ＲＮＡテンプレートに基づくリボソームによるポリペプチド分子の形成を意味する。

本明細書において使用される用語は、単に特定の実施形態を説明することを目的とし、制限することを意図しないことを理解されたい。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、内容が明確に別様に指示しない限り、複数の指示対象を含む。ゆえに、例えば、「細胞」への言及は、２つ以上の細胞の組み合わせ、または細胞の培養物全体を含む；「ポリヌクレオチド」への言及は、実際問題として、そのポリヌクレオチドの多くのコピーを含む。具体的に述べられるまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する場合、「または」という用語は、包括的であると理解される。本明細書及び下の残りの本明細書において定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。

具体的に述べられるまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する場合、「約」という用語は、当該技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均の２標準偏差内にあるものと理解される。「約」は、記載される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、または０．０１％内であると理解され得る。文脈から別様に明確でない限り、本明細書に提供する全ての数値は、「約」という用語によって修飾される。

本明細書で使用する場合、「コードする」という用語は、ポリマー巨大分子の情報を使用して、第１の分子とは異なる第２の分子の生成を指示する任意のプロセスを広く指す。第２の分子は、第１の分子の化学的性質とは異なる化学構造を有し得る。

「共投与」とは、本明細書に提供する治療剤を、１つ以上の追加の治療剤と併せて、本明細書に提供する治療剤が１つ以上の追加の治療剤の効果を向上することができるように、またはその逆であるように、十分に近い時間で投与することを意味する。

本明細書で使用する場合、「処置する」及び「予防する」という用語、ならびにそれらに由来する単語は、必ずしも１００％または完全な処置または予防を意味するものではない。むしろ、当業者が潜在的な利益または治療効果を有すると認識する処置または予防の程度は様々である本明細書に開示する方法によって提供される。処置または予防は、疾患の１つ以上の状態または症状の処置または予防を含むことができる。また、本明細書の目的のために、「予防」は、疾患、またはその症状もしくは状態の発症を遅らせることを包含することができる。

本明細書で使用する場合、「自己免疫」は、哺乳動物及びヒト内に侵入及び持続する細菌、ウイルス、真菌、または寄生生物由来の感染性非自己抗原とは異なる、非感染性自己抗原に対する持続性及び進行性の免疫反応として定義される。自己免疫疾患には、強皮症、バセドウ病、クローン病、シェーグレン病、多発性硬化症、橋本病、乾癬、重症筋無力症、自己免疫性多腺性内分泌不全症候群、Ｉ型糖尿病（ＴＩＤＭ）、自己免疫性胃炎、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎、大腸炎、及び甲状腺炎、ならびにヒトループスによって典型的に表される全身性自己免疫疾患が含まれる。本明細書で使用される「自己抗原（Ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）」または「自己抗原（ｓｅｌｆ－ａｎｔｉｇｅｎ）」は、哺乳動物に固有であり、当該哺乳動物において免疫原性である抗原またはエピトープを指す。

本明細書で使用する場合、「発現配列」という用語は、産物、例えば、ペプチドもしくはポリペプチド、制御核酸、または非コード核酸をコードする核酸配列を指すことができる。ペプチドまたはポリペプチドをコードする例示的な発現配列は、複数のヌクレオチドトライアドを含むことができ、そのそれぞれは、アミノ酸をコードすることができ、「コドン」と称される。

本明細書で使用する場合、「スペーサー」は、ポリヌクレオチド配列に沿って２つの他のエレメントを分離する１ヌクレオチドから数百または数千ヌクレオチドの範囲のポリヌクレオチド配列の領域を指す。配列は定義することができるまたは無作為であることもできる。スペーサーは典型的には、非コードである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、二重鎖形成領域を含む。

本明細書で使用する場合、「配列内リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、典型的なＲＮＡキャップ構造の非存在下でポリペプチドの翻訳を開始することができる、１０ｎｔ～１０００ｎｔ以上のサイズ範囲のＲＮＡ配列または構造エレメントを指す。ＩＲＥＳは典型的には、約５００ｎｔ～約７００ｎｔの長さである。

本明細書で使用する場合、「ｍｉＲＮＡ部位」は、少なくとも８ヌクレオチドの天然ｍｉＲＮＡ配列と二重鎖を形成することができるポリヌクレオチド内のヌクレオチドのストレッチを指す。

本明細書で使用する場合、「エンドヌクレアーゼ部位」は、エンドヌクレアーゼタンパク質によって認識及び切断されることができるポリヌクレオチド内のヌクレオチドのストレッチを指す。

本明細書で使用する場合、「バイシストロン性ＲＮＡ」は、２つの異なるタンパク質をコードする２つの発現配列を含むポリヌクレオチドを指す。これらの発現配列は、多くの場合、２Ａ部位またはＩＲＥＳ配列などの切断可能なペプチドによって分離される。それらは、リボソームスキッピングエレメントまたはプロテアーゼ切断によって分離され得る。

本明細書で使用する場合、「リボソームスキッピングエレメント」という用語は、１つのＲＮＡ分子の翻訳から２つのペプチド鎖の生成を引き起こすことが可能な短いペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を指す。理論に拘束されることを望まないが、リボソームスキッピングエレメントは、（１）第１のペプチド鎖の翻訳を終結させ、第２のペプチド鎖の翻訳を再開すること、または（２）コードされるペプチドの固有のプロテアーゼ活性による、または環境（例えば、サイトゾル）における別のプロテアーゼによる、リボソームスキッピングエレメントによってコードされるペプチド配列におけるペプチド結合の切断によって機能すると仮定される。

本明細書で使用する場合、「共製剤」という用語は、２つ以上の核酸または核酸及び他の活性薬物を含むナノ粒子製剤を指す。典型的には、比率は等モルである、または２つ以上の核酸もしくは核酸及び他の活性薬物の比率計測量で定義される。

本明細書で使用する場合、「輸送ビヒクル」は、核酸を含む生物学的に活性な作用物質の投与に関連して使用することを一般に意図する標準的な医薬担体、希釈剤、賦形剤などのいずれかを含む。

本明細書で使用する場合、「脂質ナノ粒子」という語句は、１つ以上の脂質（例えば、いくつかの実施形態では、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及びＰＥＧ修飾脂質）を含む輸送ビヒクルを指す。

本明細書で使用する場合、「カチオン性脂質」という語句は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味正電荷を持つ多くの脂質種のいずれかを指す。

本明細書で使用する場合、「非カチオン性脂質」という語句は、任意の中性、双性イオン性、またはアニオン性脂質を指す。

本明細書で使用する場合、「アニオン性脂質」という語句は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味負電荷を持つ多くの脂質種のいずれかを指す。

本明細書で使用する場合、「イオン化可能脂質」という語句は、生理学的ｐＨ４などの選択されたｐＨで正味正電荷を持ち、生理学的ｐＨ７などの他のｐＨで中性電荷を持つ多くの脂質種のいずれかを指す。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示する脂質、例えば、イオン化可能脂質は、１つ以上の切断可能基を含む。「切断」及び「切断可能」という用語は、本明細書で使用する場合、対象の官能基内またはそれに隣接する原子間の１つ以上の化学結合（例えば、共有結合、水素結合、ファンデルワールス力及び／またはイオン相互作用のうちの１つ以上）が、壊れる（例えば、加水分解される）、または選択された条件への曝露時に（例えば、酵素条件への曝露時に）壊れることが可能であることを意味する。特定の実施形態では、切断可能基は、ジスルフィド官能基であり、特定の実施形態は、選択された生物学的条件（例えば、細胞内条件）への曝露時に切断されることができるジスルフィド基である。特定の実施形態では、切断可能基は、選択された生物学的条件への曝露時に切断されることができるエステル官能基である。例えば、ジスルフィド基は、酵素的に、または加水分解、酸化もしくは還元反応によって切断され得る。かかるジスルフィド官能基の切断時に、それに結合している１つ以上の官能部分または基（例えば、頭部基及び／または尾部基のうちの１つ以上）は、遊離し得る。例示的な切断可能基には、ジスルフィド基、エステル基、エーテル基、及びその任意の誘導体（例えば、アルキル及びアリールエステル）が含まれ得るが、これに限定されない。特定の実施形態では、切断可能基は、エステル基またはエーテル基ではない。いくつかの実施形態では、切断可能基は、１つ以上の官能部分または基（例えば、少なくとも１つの頭部基及び少なくとも１つの尾部基）に結合している（例えば、水素結合、ファンデルワールス力、イオン相互作用及び共有結合のうちの１つ以上によって結合している）。特定の実施形態では、官能部分または基の少なくとも１つは、親水性である（例えば、イミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、任意で置換されたアルキルアミノ及びピリジルのうちの１つ以上を含む親水性頭部基）。

本明細書で使用する場合、「親水性」という用語は、官能基が水を好み、典型的にはかかる基が水溶性であることを定性的に示すために使用される。例えば、１つ以上の親水性基（例えば、親水性頭部基）に結合した切断可能なジスルフィド（Ｓ－Ｓ）官能基を含む化合物を本明細書に開示し、かかる親水性基は、イミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、任意で置換されたアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノなどのアルキルアミノ）及びピリジルからなる群を含む、またはこれから選択される。

特定の実施形態では、本明細書に開示する化合物を含む部分の官能基の少なくとも１つは、本質的に疎水性である（例えば、コレステロールなどの天然に存在する脂質を含む疎水性尾部基）。本明細書で使用する場合、「疎水性」という用語は、官能基が水を嫌い、典型的にはかかる基が水溶性でないことを定性的に示すために使用される。例えば、１つ以上の疎水性基に結合した切断可能な官能基（例えば、ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）基）を含む化合物を本明細書に開示し、かかる疎水性基は、１つもしくは複数の天然に存在する脂質、例えばコレステロール、及び／または任意で置換された、可変飽和もしくは不飽和Ｃ_６－Ｃ_２０アルキル及び／または任意で置換された、可変飽和もしくは不飽和Ｃ_６－Ｃ_２０アシルを含む。

本明細書に記載の化合物はまた、１つ以上の同位体置換を含み得る。例えば、Ｈは、^１Ｈ、^２Ｈ（Ｄまたは重水素）、及び^３Ｈ（Ｔまたはトリチウム）を含む、任意の同位体形態であり得；Ｃは、^１２Ｃ、^１３Ｃ、及び^１４Ｃを含む、任意の同位体形態であり得；Ｏは、^１６Ｏ及び^１８Ｏを含む、任意の同位体形態であり得；Ｆは、^１８Ｆ及び^１９Ｆを含む、任意の同位体形態であり得る。

化合物及びその薬学的に許容可能な塩、かかる化合物を含有する薬学的組成物ならびにかかる化合物及び組成物を使用する方法を含み得る本発明を説明する場合、以下の用語は、存在する場合、別段示されない限り、以下の意味を有する。本明細書に記載される際に、以下に定義される部分のうちのいずれかが様々な置換基で置換され得ること、及びそれぞれの定義が以下に述べられるそれらの範囲内にかかる置換された部分を含むように意図されることも理解されたい。別段明記しない限り、「置換された」という用語は、以下に述べられるように定義される。「基」及び「ラジカル」という用語は、本明細書で使用される際に、交換可能であるとみなされ得ることを、さらに理解されたい。

値の範囲が列挙される際、範囲内の各値及びサブ範囲を包含することが、意図される。例えば、「Ｃ_１－６アルキル」は、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_１－６、Ｃ_１－５、Ｃ_１－４、Ｃ_１－３、Ｃ_１－２、Ｃ_２－６、Ｃ_２－５、Ｃ_２－４、Ｃ_２－３、Ｃ_３－６、Ｃ_３－５、Ｃ_３－４、Ｃ_４－６、Ｃ_４－５、及びＣ_５－６アルキルを包含することが意図される。

特定の実施形態では、本明細書に開示する化合物は、例えば、少なくとも１つの親水性頭部基及び少なくとも１つの疎水性尾部基を含み、それぞれが少なくとも１つの切断可能基に結合し、それによってかかる化合物を両親媒性にする。化合物または組成物を説明するために本明細書で使用する場合、「両親媒性」という用語は、極性（例えば、水）及び非極性（例えば、脂質）環境の両方に溶解する能力を意味する。例えば、特定の実施形態では、本明細書に開示する化合物は、少なくとも１つの親油性尾部基（例えば、コレステロールまたはＣ_６－Ｃ_２０アルキル）及び少なくとも１つの親水性頭部基（例えば、イミダゾール）を含み、それぞれ切断可能基（例えば、ジスルフィド）に結合している。

使用される「頭部基」及び「尾部基」という用語は、本発明の化合物、及び特にかかる化合物を含む官能基を説明し、他の官能基に対する１つ以上の官能基の配向を説明するために参照を容易にするために使用されることに留意されるべきである。例えば、特定の実施形態では、親水性頭部基（例えば、グアニジニウム）は、（例えば、水素結合、ファンデルワールス力、イオン相互作用及び共有結合のうちの１つ以上によって）切断可能な官能基（例えば、ジスルフィド基）に結合し、これは次に親水性尾部基（例えば、コレステロール）に結合する。

本明細書で使用する場合、「アルキル」という用語は、直鎖及び分岐鎖の両方のＣ_１－Ｃ_４０炭化水素（例えば、Ｃ_６－Ｃ_２０炭化水素）を指し、飽和及び不飽和の両方の炭化水素を含む。特定の実施形態では、アルキルは、１つ以上の環状アルキル及び／または１つ以上のヘテロ原子、例えば、酸素、窒素、または硫黄を含み得、置換基（例えば、アルキル、ハロ、アルコキシル、ヒドロキシ、アミノ、アリール、エーテル、エステルまたはアミドのうちの１つ以上）で任意で置換され得る。特定の実施形態では、企図されるアルキルは、（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエンを含む。例えば、「Ｃ_６－Ｃ_２０」などの名称の使用は、記述された範囲の炭素原子を有するアルキル（例えば、直鎖または分岐鎖であり、アルケン及びアルキルを含む）を指すことが意図されている。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～１０個の炭素原子を有する（「Ｃ_１－１０アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～９個の炭素原子を有する（「Ｃ_１－９アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～８個の炭素原子を有する（「Ｃ_１－８アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～７個の炭素原子を有する（「Ｃ_１－７アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～６個の炭素原子を有する（「Ｃ_１－６アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～５個の炭素原子を有する（「Ｃ_１－５アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～４個の炭素原子を有する（「Ｃ_１－４アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～３個の炭素原子を有する（「Ｃ_１－３アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～２個の炭素原子を有する（「Ｃ_１－２アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１個の炭素原子を有する（「Ｃ_１アルキル」）。Ｃ_１－６アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれる。

本明細書で使用する場合、「アルケニル」は、２～２０個の炭素原子、１つ以上の炭素－炭素二重結合（例えば、１、２、３、または４個の炭素－炭素二重結合）、及び任意で１つ以上の炭素－炭素三重結合（例えば、１、２、３、または４個の炭素－炭素三重結合）を有する直鎖または分岐状炭化水素基のラジカルを指す（「Ｃ_２－２０アルケニル」）。特定の実施形態では、アルケニルは、いかなる三重結合も含有しない。いくつかの実施形態では、アルケニルは、２～１０個の炭素原子を有する（「Ｃ_２－１０アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～９個の炭素原子を有する（「Ｃ_２－９アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～８個の炭素原子を有する（「Ｃ_２－８アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～７個の炭素原子を有する（「Ｃ_２－７アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～６個の炭素原子を有する（「Ｃ_２－６アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～５個の炭素原子を有する（「Ｃ_２－５アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～４個の炭素原子を有する（「Ｃ_２－４アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～３個の炭素原子を有する（「Ｃ_２－３アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２個の炭素原子を有する（「Ｃ_２アルケニル」）。１つ以上の炭素－炭素二重結合は、内部（２－ブテニルにおけるものなど）または末端（１－ブテニルにおけるものなど）であり得る。Ｃ_２－４アルケニル基の例には、エテニル（Ｃ_２）、１－プロペニル（Ｃ_３）、２－プロペニル（Ｃ_３）、１－ブテニル（Ｃ_４）、２－ブテニル（Ｃ_４）、ブタジエニル（Ｃ_４）などが含まれる。Ｃ_２－６アルケニル基の例には、前述したＣ_２－４アルケニル基ならびにペンテニル（Ｃ_５）、ペンタジエニル（Ｃ_５）、ヘキセニル（Ｃ_６）などが含まれる。アルケニルの追加の例には、ヘプテニル（Ｃ_７）、オクテニル（Ｃ_８）、オクタトリエニル（Ｃ_８）などが含まれる。

本明細書で使用する場合、「アルキニル」は、２～２０個の炭素原子、１つ以上の炭素－炭素三重結合（例えば、１、２、３、または４個の炭素－炭素三重結合）、及び任意で１つ以上の炭素－炭素二重結合（例えば、１、２、３、または４個の炭素－炭素二重結合）を有する直鎖または分岐状炭化水素基のラジカルを指す（「Ｃ_２－２０アルキニル」）。特定の実施形態では、アルキニルは、いかなる二重結合も含有しない。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～１０個の炭素原子を有する（「Ｃ_２－１０アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～９個の炭素原子を有する（「Ｃ_２－９アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～８個の炭素原子を有する（「Ｃ_２－８アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～７個の炭素原子を有する（「Ｃ_２－７アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～６個の炭素原子を有する（「Ｃ_２－６アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～５個の炭素原子を有する（「Ｃ_２－５アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～４個の炭素原子を有する（「Ｃ_２－４アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～３個の炭素原子を有する（「Ｃ_２－３アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２個の炭素原子を有する（「Ｃ_２アルキニル」）。１つ以上の炭素－炭素三重結合は、内部（２－ブチニルにおけるものなど）または末端（１－ブチニルにおけるものなど）であり得る。Ｃ_２－４アルキニル基の例には、限定されないが、エチニル（Ｃ_２）、１－プロピニル（Ｃ_３）、２－プロピニル（Ｃ_３）、１－ブチニル（Ｃ_４）、２－ブチニル（Ｃ_４）などが含まれる。Ｃ_２－６アルケニル基の例には、前述したＣ_２－４アルキニル基ならびにペンチニル（Ｃ_５）、ヘキシニル（Ｃ_６）などが含まれる。アルキニルの追加の例には、ヘプチニル（Ｃ_７）、オクチニル（Ｃ_８）などが含まれる。

本明細書で使用する場合、「アルキレン」、「アルケニレン」、及び「アルキニレン」は、それぞれ、アルキル、アルケニル、及びアルキニル基の二価ラジカルを指す。炭素の範囲または数が、特定の「アルキレン」、「アルケニレン」、または「アルキニレン」基に提供される場合、範囲または数は、直鎖状炭素二価鎖中の炭素の範囲または数を指すことが理解される。「アルキレン」、「アルケニレン」、及び「アルキニレン」基は、本明細書に記載される１つ以上の置換基で置換されていてもよく、または置換されていなくてもよい。

本明細書で使用する場合、「アリール」という用語は、環部分において６～１０個の炭素を含有する芳香族基（例えば、単環式、二環式及び三環式構造）を指す。アリール基は、利用可能な炭素原子を介して任意で置換されていてもよく、特定の実施形態では、酸素、窒素または硫黄などの１つ以上のヘテロ原子を含み得る。いくつかの実施形態では、アリール基は、６個の環炭素原子を有する（「Ｃ_６アリール」、例えば、フェニル）。いくつかの実施形態では、アリール基は、１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ_１０アリール」、例えば、ナフチル、例えば、１－ナフチル及び２－ナフチル）。

本明細書で使用する場合、「ヘテロアリール」は、芳香族環系に提供される環炭素原子及び１～４個の環ヘテロ原子を有する５～１０員単環式または二環式４ｎ＋２芳香族環系（例えば、環状配列で共有された６または１０個の電子を有する）のラジカルを指し、各ヘテロ原子は、独立して、窒素、酸素、及び硫黄から選択される（「５～１０員ヘテロアリール」）。１つ以上の窒素原子を含有するヘテロアリール基において、結合点は、原子価が許す限り、炭素または窒素原子であり得る。ヘテロアリール二環式環系は、一方または両方の環において１つ以上のヘテロ原子を含み得る。「ヘテロアリール」は、環系を含み、上で定義されたヘテロアリール環は１つ以上のカルボシクリルまたはヘテロシクリル基と縮合し、結合点はヘテロアリール環上にあり、かかる例では、環員の数は、ヘテロアリール環系における環員の数を指定することを続ける。「ヘテロアリール」はまた、環系を含み、上で定義されたヘテロアリール環は１つ以上のアリール基と縮合し、結合点はアリールまたはヘテロアリール環上のいずれかにあり、かかる例では、環員の数は、縮合（アリール／ヘテロアリール）環系における環員の数を指定する。１つの環がヘテロ原子（例えば、インドリル、キノリニル、カルバゾリルなど）を含まない二環式ヘテロアリール基は、結合点は、いずれかの環、すなわち、ヘテロ原子を有する環（例えば、２－インドリル）またはヘテロ原子を含まない環（例えば、５－インドリル）のいずれかにあり得る。

「シクロアルキル」という用語は、３～１２、３～８、４～８、または４～６個の炭素の一価飽和環状、二環式、または架橋環状（例えば、アダマンチル）炭化水素基を指し、本明細書では、例えば、シクロアルカンに由来する「Ｃ_４－８シクロアルキル」と称される。例示的なシクロアルキル基には、シクロヘキサン、シクロペンタン、シクロブタン、及びシクロプロパンが含まれるがこれらに限定されない。

本明細書で使用する場合、「ヘテロシクリル」または「複素環式」は、環炭素原子及び１～４環ヘテロ原子を有する３～１０員の非芳香族環系のラジカルを指し、各ヘテロ原子は、独立して、窒素、酸素、硫黄、ホウ素、リン、及びケイ素から選択される（「３～１０員ヘテロシクリル」）。１つ以上の窒素原子を含むヘテロシクリル基は、結合点は、原子価が許す限り、炭素または窒素原子であり得る。ヘテロシクリル基は、単環式（「単環式ヘテロシクリル」）または二環式系（「二環式ヘテロシクリル」）などの縮合、架橋もしくはスピロ環系のいずれかであり得、飽和または部分的に不飽和であり得る。ヘテロシクリル二環式環系は、一方または両方の環に１つ以上のヘテロ原子を含み得る。「ヘテロシクリル」はまた、環系を含み、上で定義されたヘテロシクリル環は、１つ以上のカルボシクリル基と縮合し、結合点はカルボシクリルもしくはヘテロシクリル環または環系上のいずれかにあり、または上で定義されたヘテロシクリル環は、１つ以上のアリールまたはヘテロアリール基と縮合し、結合点はヘテロシクリル環上にあり、かかる例では、環員の数は、ヘテロシクリル環系における環員の数を指定することを続ける。「複素環」、「ヘテロシクリル」、「ヘテロシクリル環」、「複素環式基」、「複素環式部分」、及び「複素環式ラジカル」という用語は、交換可能に使用され得る。

本明細書で使用する場合、「シアノ」は、－ＣＮを指す。

本明細書で使用される用語「ハロ」及び「ハロゲン」は、フッ素（フルオロ、Ｆ）、塩素（クロロ、Ｃｌ）、臭素（ブロモ、Ｂｒ）、及びヨウ素（ヨード、Ｉ）から選択される原子を指す。特定の実施形態では、ハロ基は、フルオロまたはクロロのいずれかである。

本明細書で使用する場合、「アルコキシ」という用語は、酸素原子を介して別の部分に結合したアルキル基を指す（－Ｏ（アルキル））。非限定的な例は、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、及びブトキシを含む。

本明細書で使用する場合、「オキソ」は、－Ｃ＝Ｏを指す。

一般に、「置換」という用語は、「任意で」という用語が先行するどうかにかかわらず、基（例えば、炭素または窒素原子）に存在する少なくとも１つの水素が、許容される置換基、例えば、置換時に、安定な化合物、例えば、転位、環化、脱離、または他の反応などによって自発的に変換を受けない化合物を生じる置換基で置き換えられることを意味する。別段示されない限り、「置換」基は、基の１つ以上の置換可能な位置で置換基を有し、任意の所与の構造の１つより多い位置が置換される際に、置換基は、各位置で同じかまたは異なるかのいずれかである。

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な塩」は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激性、アレルギー応答などを伴わずに、ヒト及び下等動物の組織と接触させた使用に好適であり、合理的な利益／リスク比と釣り合うそれらの塩を指す。薬学的に許容可能な塩は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，は、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６：１－１９において薬学的に許容可能な塩を詳細に記載している。本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩には、好適な無機及び有機酸ならびに塩基から誘導されるものが含まれる。薬学的に許容可能な非毒性の酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸及び過塩素酸などの無機酸を用いて、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸などの有機酸を用いて、あるいはイオン交換などの当該技術分野において使用される他の方法を使用することによって形成されるアミノ基の塩である。他の薬学的に許容可能な塩には、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが含まれる。適切な塩基に由来する薬学的に許容可能な塩には、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム及びＮ^＋（Ｃ_１－４アルキル）_４塩が含まれる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが含まれる。さらなる薬学的に許容可能な塩には、適切な場合、ハライド、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩、及びアリールスルホン酸塩などの対イオンを使用して形成される非毒性アンモニウム、四級アンモニウム、ならびにアミンカチオンが含まれる。

典型的な実施形態では、本発明は、本明細書に開示する化合物、ならびにかかる化合物の薬学的に許容可能な塩、薬学的に許容可能なエステル、互変異性形態、多形体、及びプロドラッグを包含することが意図される。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容可能な付加塩、薬学的に許容可能なエステル、付加塩の溶媒和物（例えば、水和物）、互変異性形態、多形体、エナンチオマー、エナンチオマーの混合物、立体異性体または立体異性体の混合物（純粋またはラセミもしくは非ラセミ混合物として）を含む。

本明細書に記載の化合物は、１つ以上の不斉中心を含み得、よって、様々な異性体形態、例えば、エナンチオマー及び／またはジアステレオマーで存在し得る。例えば、本明細書に記載の化合物は、個々のエナンチオマー、ジアステレオマーもしくは幾何異性体の形態であり得、またはラセミ混合物及び１つ以上の立体異性体に富む混合物を含む立体異性体の混合物の形態であり得る。異性体は、キラル高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ならびにキラル塩の形成及び結晶化を含む、当業者に既知の方法によって混合物から単離され得、または好ましい異性体は、非対称合成によって調製され得る。例えば、Ｊａｃｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１）；Ｗｉｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３３：２７２５（１９７７）；Ｅｌｉｅｌ，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，ＮＹ，１９６２）；及びＷｉｌｅｎ，Ｔａｂｌｅｓ ｏｆ Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｐ．２６８（Ｅ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ，Ｅｄ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｎｏｔｒｅ Ｄａｍｅ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｔｒｅ Ｄａｍｅ，ＩＮ １９７２）を参照されたい。本発明は、追加的に、他の異性体を実質的に含まない個々の異性体として、また、代替的に、様々な異性体の混合物として、本明細書に記載の化合物を包含する。

特定の実施形態では、化合物及びかかる化合物が成分である輸送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）は、１つ以上の標的細胞をトランスフェクトする能力の向上（例えば、増加）を呈する。したがって、１つ以上の標的細胞をトランスフェクトする方法も本明細書に提供する。かかる方法は、一般に、１つ以上の標的細胞がその中に封入された環状ＲＮＡでトランスフェクトされるように、１つ以上の標的細胞を、本明細書に開示する化合物及び／または薬学的組成物と接触させるステップを含む。本明細書で使用する場合、「トランスフェクトする」または「トランスフェクション」という用語は、１つ以上の封入された物質（例えば、核酸及び／またはポリヌクレオチド）の、細胞への、または好ましくは標的細胞への細胞内導入を指す。「トランスフェクション効率」という用語は、トランスフェクションの対象となる標的細胞によって取り込まれる、標的細胞へと導入される及び／または標的細胞によって発現されるかかる封入された物質（例えば、ポリヌクレオチド）の相対量を指す。いくつかの実施形態では、トランスフェクション効率は、トランスフェクション後に標的細胞によって産生されるレポーターポリヌクレオチド産物の量によって推定され得る。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、高いトランスフェクション効率を有する。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のトランスフェクション効率を有する。

本明細書で使用する場合、「リポソーム」という用語は、一般に、１つ以上の球状二重層に配置された脂質（例えば、両親媒性脂質）から構成されるベシクルを指す。特定の実施形態では、リポソームは、脂質ナノ粒子（例えば、本明細書に開示するイオン化可能脂質化合物のうちの１つ以上を含む脂質ナノ粒子）である。かかるリポソームは、親油性物質から形成された膜、ならびに１つ以上の標的細胞、組織、及び器官に送達される封入されたｃｉｒｃＲＮＡを含有する水性内部を有する単層または多層ベシクルであり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、１つ以上の脂質ナノ粒子を含む。企図されるリポソーム及び脂質ナノ粒子を形成するために使用され得る好適な脂質（例えば、イオン化可能脂質）の例としては、本明細書に開示する化合物のうちの１つ以上が挙げられる（例えば、ＨＧＴ４００１、ＨＧＴ４００２、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ４００４及び／またはＨＧＴ４００５）。かかるリポソーム及び脂質ナノ粒子は、追加のイオン化可能脂質、例えばＣ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、及び／またはＨＧＴ５００１、ヘルパー脂質、構造脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＩＣＥ、ＨＧＴ５０００、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、及びその組み合わせも含み得る。

本明細書で使用する場合、「非カチオン性脂質」、「非カチオン性ヘルパー脂質」、及び「ヘルパー脂質」という語句は、互換可能に使用され、任意の中性、双性イオン性またはアニオン性脂質を指す。

本明細書で使用する場合、「アニオン性脂質」という語句は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味負電荷を持つ多くの脂質種のいずれかを指す。

本明細書で使用する場合、「生分解性脂質」または「分解性脂質」という語句は、宿主環境で数分、数時間、または数日ほどで分解され、理想的には毒性が低くなる及び宿主内に経時的に蓄積する可能性が低くなる、多くの脂質種のいずれかを指す。脂質への一般的な修飾には、エステル結合、及びなかでもジスルフィド結合を含み、脂質の生分解性を高める。

本明細書で使用する場合、「生分解性ＰＥＧ脂質」または「分解性ＰＥＧ脂質」という語句は、ＰＥＧ分子が、宿主環境で数分、数時間、または数日ほどで脂質から切断され、理想的には免疫原性が低くなる、多くの脂質種のいずれかを指す。ＰＥＧ脂質への一般的な修飾には、エステル結合、及びなかでもジスルフィド結合を含み、脂質の生分解性を高める。

本発明の特定の実施形態では、輸送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）は、１つ以上の物質または治療剤（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ）を封入するように調製される。所望の治療剤（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ）を輸送ビヒクルに組み込むプロセスは、本明細書では、「ロードする」または「封入する」と称する（Ｌａｓｉｃ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５－２５８，１９９２）。輸送ビヒクルにロードされた、または封入された物質（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ）は、完全にまたは部分的に、輸送ビヒクルの内部空間に、輸送ビヒクルの二重層膜内に、または輸送ビヒクルの外面に付随して配置され得る。

本明細書で使用する場合、「構造脂質」という用語は、ステロールを指す、及びステロール部分を含有する脂質も指す。

本明細書で定義する場合、「ステロール」は、ステロイドアルコールからなるステロイドのサブグループである。

本明細書で使用する場合、「構造脂質」という用語は、ステロールを指す、及びステロール部分を含有する脂質も指す。

本明細書で使用する場合、「ＰＥＧ」という用語は、任意のポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。

本明細書で一般に定義する場合、「ＰＥＧ－ＯＨ脂質」（本明細書では「ヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質」とも称する）は、脂質上に１つ以上のヒドロキシル（－ＯＨ）基を有するＰＥＧ化脂質である。

本明細書で使用する場合、「リン脂質」は、リン酸部分及び１つ以上の炭素鎖、例えば不飽和脂肪酸鎖を含む脂質である。

本明細書に開示する全てのヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列または対応するＤＮＡ配列を表し得る。ＤＮＡにおけるデオキシチミジン（ｄＴまたはＴ）は、ＲＮＡにおけるウリジン（Ｕ）に転写されることが理解される。このように、「Ｔ」及び「Ｕ」は、本明細書でヌクレオチド配列において互換的に使用される。

本明細書で使用する場合、「配列同一性」または、例えば、「に５０％同一である配列」を含む引用は、比較ウィンドウにわたって配列がヌクレオチドごとまたはアミノ酸ごとに同一である程度を指す。ゆえに、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適に整列された配列を比較ウィンドウにわたって比較し、一致する位置の数を得るために両配列において同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一アミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ及びＭｅｔ）が存在する位置の数を決定し、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けることにより算出され得て、配列同一性のパーセンテージが得られる。本明細書に記載の参照配列のいずれかに対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有するヌクレオチド及びポリペプチドが含まれ、典型的にはポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を維持する。

「抗体」（Ａｂ）という用語には、限定されないが、抗原と特異的に結合する糖タンパク質免疫グロブリンが含まれる。概して、抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖、またはその抗原結合分子を含み得る。各Ｈ鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）及び重鎖定常領域を含み得る。重鎖定常領域は、３つの定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含むことができる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）及び軽鎖定常領域を含むことができる。軽鎖定常領域は、１つの定常ドメインＣＬを含むことができる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含み得る。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。Ａｂの定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。抗体には、例えば、モノクローナル抗体、組換え産生抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、操作抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、２つの重鎖分子及び２つの軽鎖分子を含む四量体抗体、抗体軽鎖単量体、抗体重鎖単量体、抗体軽鎖二量体、抗体重鎖二量体、抗体軽鎖－抗体重鎖対、イントラボディ、抗体融合体（本明細書では「抗体複合体」と呼ばれることもある）、ヘテロ複合抗体、単一ドメイン抗体、一価抗体、単鎖抗体または単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ラクダ化抗体、アフィボディ、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、ジスルフィド結合可変フラグメント（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（ａｎｔｉ－ｉｄ）抗体（例えば、抗抗Ｉｄ抗体を含む）、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体模倣物」と呼ばれることもある）、及び上記のいずれかの抗原結合フラグメントが含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ポリクローナル抗体集団を指す。

免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＭを含むがこれらに限定されない、一般に知られているアイソタイプのいずれかに由来し得る。ＩｇＧサブクラスも当業者に周知であり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない。「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされるＡｂクラスまたはサブクラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。「抗体」という用語は、例として、天然に存在する及び天然に存在しないＡｂの両方、モノクローナル及びポリクローナルＡｂ、キメラ及びヒト化Ａｂ、ヒトまたは非ヒトＡｂ、完全合成Ａｂ、ならびに一本鎖Ａｂを含む。非ヒトＡｂは、ヒトにおけるその免疫原性を低減するために、組換え方法によってヒト化され得る。明示的に記載されない場合、及び文脈上別段の指示がない限り、「抗体」という用語は、前述の免疫グロブリンのいずれかの抗原結合フラグメントまたは抗原結合部分も含み、一価及び二価フラグメントまたは部分、ならびに一本鎖Ａｂを含む。

「抗原結合分子」、「抗原結合部分」、または「抗体フラグメント」は、分子が由来する抗体の抗原結合部分（例えば、ＣＤＲ）を含む任意の分子を指す。抗原結合分子は、抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ抗体、及び抗原結合分子から形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。ペプチボディ（すなわち、ペプチド結合ドメインを含むＦｃ融合分子）は、好適な抗原結合分子の別の例である。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、腫瘍細胞上の抗原と結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、またはウイルスまたは細菌抗原と結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、ＢＣＭＡと結合する。さらなる実施形態では、抗原結合分子は、抗原と特異的に結合する、その相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ以上を含む抗体フラグメントである。さらなる実施形態では、抗原結合分子は、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、アビマーを含むか、またはそれからなる。

本明細書で使用する場合、「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、互換的に使用され、当該技術分野において一般的である。可変領域は、典型的には、抗体の一部、一般に、軽鎖または重鎖の一部、典型的には、成熟重鎖におけるアミノ末端１１０～１２０アミノ酸、及び成熟軽鎖における約９０～１１５アミノ酸を指し、これらは、抗体間で配列が大きく異なり、特定の抗体の特定の抗原に対する結合及び特異性に使用される。配列の可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれるそれらの領域に集中し、可変ドメイン内のより高度に保存された領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。いかなる特定のメカニズムまたは理論に拘束されることを望まないが、軽鎖及び重鎖のＣＤＲは、抗体と抗原との相互作用及び特異性に主に関与すると考えられる。いくつかの実施形態では、可変領域は、ヒト可変領域である。いくつかの実施形態では、可変領域は、げっ歯類またはマウスＣＤＲ及びヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。特定の実施形態では、可変領域は、霊長類（例えば、非ヒト霊長類）可変領域である。いくつかの実施形態では、可変領域は、げっ歯類またはマウスＣＤＲ及び霊長類（例えば、非ヒト霊長類）フレームワーク領域（ＦＲ）を含む。

「ＶＬ」及び「ＶＬドメイン」という用語は、抗体またはその抗原結合分子の軽鎖可変領域を指すために互換的に使用される。

「ＶＨ」及び「ＶＨドメイン」という用語は、抗体またはその抗原結合分子の重鎖可変領域を指すために互換的に使用される。

ＣＤＲのいくつかの定義は、Ｋａｂａｔ番号付け、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け、ＡｂＭ番号付け、またはコンタクト番号付けで一般に使用される。ＡｂＭの定義は、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用される２つの間の中間物である。コンタクトの定義は、利用可能な複合結晶構造の分析に基づく。「Ｋａｂａｔ番号付け」という用語及び同様の用語は、当該技術分野において認識されており、抗体またはその抗原結合分子の重鎖及び軽鎖可変領域における番号付けアミノ酸残基のシステムを指す。特定の態様では、抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って決定され得る（例えば、Ｋａｂａｔ ＥＡ＆Ｗｕ ＴＴ（１９７１）Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９０：３８２－３９１及びＫａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ公開第９１－３２４２号を参照されたい）。Ｋａｂａｔ番号付けシステムを使用して、抗体重鎖分子内のＣＤＲは、典型的には、アミノ酸位置３１～３５に存在し、これは、任意で、３５（Ｋａｂａｔ番号付けスキームでは３５Ａ及び３５Ｂと呼ばれる）（ＣＤＲ１）、アミノ酸位置５０～６５（ＣＤＲ２）、及びアミノ酸位置９５～１０２（ＣＤＲ３）に続く、１つまたは２つの追加のアミノ酸を含み得る。Ｋａｂａｔ番号付けシステムを使用して、抗体軽鎖分子内のＣＤＲは、典型的には、アミノ酸位置２４～３４（ＣＤＲ１）、アミノ酸位置５０～５６（ＣＤＲ２）、及びアミノ酸位置８９～９７（ＣＤＲ３）に存在する。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従って決定される。ある特定の態様では、抗体のＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従って決定され得、これは、免疫グロブリン構造ループの位置を指す（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ＆Ｌｅｓｋ ＡＭ，（１９８７），Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－９１７、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ Ｂ ｅｔ ａｌ，（１９９７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７－９４８、Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２７：７９９－８１７、Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ Ａ ｅｔ ａｌ，（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５（１）：１７５－８２、及び米国特許第７，７０９，２２６号を参照されたい）。典型的には、Ｋａｂａｔ番号付け規則を使用する場合、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１ループは、重鎖アミノ酸２６～３２、３３、または３４に存在し、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ２ループは、重鎖アミノ酸５２～５６に存在し、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ３ループは、重鎖アミノ酸９５～１０２に存在し、一方でＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｌ１ループは、軽鎖アミノ酸２４～３４に存在し、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｌ２ループは、軽鎖アミノ酸５０～５６に存在し、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｌ３ループは、軽鎖アミノ酸８９～９７に存在する。Ｋａｂａｔ番号付け規則を使用して番号付けされた場合のＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－ＨＩループの終了は、ループの長さに応じてＨ３２とＨ３４との間で変化する（これは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームが挿入をＨ３５Ａ及びＨ３５Ｂに配置するためであり、３５Ａ及び３５Ｂが存在しない場合、ループは３２で終了し、３５Ａのみが存在する場合、ループは３３で終了し、３５Ａ及び３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４で終了する）。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体のＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従って決定される。

本明細書で使用する場合、「定常領域」及び「定常ドメイン」という用語は、互換的であり、当該技術分野で一般的な意味を有する。定常領域は、抗体部分、例えば、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、Ｆｃ受容体との相互作用などの様々なエフェクター機能を示し得る、軽鎖及び／または重鎖のカルボキシル末端部分である。免疫グロブリン分子の定常領域は、一般に、免疫グロブリン可変ドメインと比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する。

「結合親和性」は、一般に、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。別段の指示がない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般に、解離定数（ＫＤまたはＫｄ）によって表すことができる。親和性は、平衡解離定数（ＫＤ）及び平衡会合定数（ＫＡまたはＫａ）を含むがこれらに限定されない、当技術分野で即知の多くの方法で測定及び／または表現することができる。ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎの商から計算され、ＫＡはｋｏｎ／ｋｏｆｆの商から計算される。ｋｏｎは、例えば、抗原に対する抗体の会合速度定数を指し、ｋｏｆｆは、例えば、抗原に対する抗体の解離を指す。Ｋｏｎ及びｋｏｆｆは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）またはＫｉＮＥｘＡなどの当業者に即知の技術によって決定され得る。

本明細書で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸など）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ（複数可）内または抗体またはその抗原結合分子のフレームワーク領域（複数可）内の１つ以上のアミノ酸残基は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられ得る。

本明細書で使用される「異種」という用語は、天然に存在する配列以外の任意の供給源に由来することを意味する。

本明細書で使用する場合、「エピトープ」は、当該技術分野における用語であり、抗体が特異的に結合し得る抗原の局所領域を指す。エピトープは、例えば、ポリペプチドの連続アミノ酸（直鎖状または連続したエピトープ）であり得るか、またはエピトープは、例えば、ポリペプチドまたはポリペプチドの２つ以上の非連続領域（立体構造、非直鎖状、不連続、または非連続エピトープ）から一緒になり得る。いくつかの実施形態では、抗体が結合するエピトープは、例えば、ＮＭＲ分光法、Ｘ線回折結晶学的研究、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析と組み合わせた水素／重水素交換（例えば、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析）、アレイベースのオリゴペプチド走査アッセイ、及び／または変異誘発マッピング（例えば、部位特異的変異誘発マッピング）によって決定され得る。Ｘ線結晶学については、結晶化は、当該技術分野における既知の方法（例えば、Ｇｉｅｇｅ Ｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５０（Ｐｔ ４）：３３９－３５０、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ａ（１９９０）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８９：１－２３、Ｃｈａｙｅｎ ＮＥ（１９９７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：１２６９－１２７４、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ａ（１９７６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５１：６３００－６３０３）のいずれかを使用して達成され得る。抗体：抗原結晶は、周知のＸ線回折技術を使用して研究することができ、Ｘ－ＰＬＯＲ（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．によって普及された；例えば、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８５）ｖｏｌｕｍｅｓ １１４＆１１５，ｅｄｓ Ｗｙｃｋｏｆｆ ＨＷ ｅｔ ａｌ．、米国特許公開第２００４／００１４１９４号）、及びＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ Ｇ（１９９３）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ４９（Ｐｔ １）：３７－６０、Ｂｒｉｃｏｇｎｅ Ｇ（１９９７）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２７６Ａ：３６１－４２３，ｅｄ Ｃａｒｔｅｒ ＣＷ、Ｒｏｖｅｒｓｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５６（Ｐｔ １０）：１３１６－１３２３）などのコンピューターソフトウェアを使用して精製することができる。

本明細書で使用する場合、抗原と第１の結合分子、抗体、またはそれらの抗原結合分子との間の相互作用が、参照結合分子、参照抗体、またはそれらの抗原結合分子の抗原と相互作用する能力を遮断、制限、阻害、またはその他の方法で低減する場合、抗原結合分子、抗体、またはそれらの抗原結合分子は、参照抗体またはそれらの抗原結合分子と「交差競合」する。交差競合は、完全であり得、例えば、結合分子の抗原との結合は、参照結合分子が抗原に結合する能力を完全に遮断するか、または部分的であり得、例えば、結合分子の抗原との結合は、参照結合分子が抗原に結合する能力を低減させる。いくつかの実施形態では、参照抗原結合分子と交差競合する抗原結合分子は、参照抗原結合分子と同じまたは重複するエピトープと結合する。他の実施形態では、参照抗原結合分子と交差競合する抗原結合分子は、参照抗原結合分子とは異なるエピトープと結合する。１つの抗原結合分子が別の抗原結合分子と競合するかどうかを決定するために、例えば、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競争アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２－２５３）、固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４－３６１９）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， １９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、１－１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７－１５）、固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６－５５２）、及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７－８２）など多数の種類の競合結合アッセイを使用できる。

本明細書で使用する場合、「免疫特異的に結合する」、「免疫特異的に認識する」、「特異的に結合する」、及び「特異的に認識する」という用語は、抗体の文脈における類似の用語であり、かかる結合が当業者によって理解されるように、抗原（例えば、エピトープまたは免疫複合体）と結合する分子を指す。例えば、抗原と特異的に結合する分子は、一般に、例えば、免疫アッセイ、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）、ＫｉｎＥｘＡ ３０００機器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂｏｉｓｅ、ＩＤ）、または当該技術分野で即知の他のアッセイによって決定されるより低い親和性で、他のペプチドまたはポリペプチドと結合し得る。特定の実施形態では、抗原に特異的に結合する分子は、分子が別の抗原に結合する場合に、ＫＡよりも少なくとも２ｌｏｇ、２．５ｌｏｇ、３ｌｏｇ、４ｌｏｇまたはそれ以上であるＫＡで抗原と結合する。

「抗原」は、免疫応答を誘発するか、または抗体もしくは抗原結合分子によって結合されることができる任意の分子を指す。免疫応答は、抗体の産生、特定の免疫適格細胞の活性化、またはその両方に関与し得る。当業者は、事実上全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の巨大分子が抗原として機能し得ることを容易に理解するであろう。抗原は、内因的に発現され得、すなわち、ゲノムＤＮＡによって発現され得る、または組換え的に発現され得る。抗原は、がん細胞などの特定の組織に特異的であってもよく、またはそれは広く発現されてもよい。加えて、より大きな分子のフラグメントは、抗原として作用し得る。いくつかの実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。

「自己」という用語は、それが後に再導入される同じ個体に由来する任意の物質を指す。例えば、本明細書に記載の操作自己細胞療法（ｅＡＣＴ（商標））方法は、患者からのリンパ球の収集を伴い、次に、例えば、ＣＡＲ構築物を発現するように操作され、次に、同じ患者に投与される。

「同種異系」という用語は、ある個体に由来し、次に、同種の別の個体に導入される任意の物質、例えば、同種異系Ｔ細胞移植を指す。

「がん」は、体内の異常細胞の制御不能な成長を特徴とする様々な疾患の広範なグループを指す。非制御細胞分裂及び成長は、隣接組織に侵入する悪性腫瘍の形成をもたらし、また、リンパ系または血流を介して身体の遠位部に転移し得る。「がん」または「がん組織」は、腫瘍を含み得る。本明細書に開示される方法によって治療され得るがんの例には、リンパ腫、白血病、骨髄腫、及び他の白血球悪性腫瘍を含む免疫系のがんが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、例えば、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、多発性骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、形質転換濾胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、尿道の癌、陰茎の癌、慢性または急性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）（非Ｔ細胞ＡＬＬを含む）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小児の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱の癌、腎臓または尿管の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘導されるものを含む環境誘発性の癌、他のＢ細胞悪性腫瘍、及びこれらのがんの組み合わせに由来する腫瘍の腫瘍サイズを低減するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、例えば、肉腫及び癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、カポジ肉腫、軟部肉腫、他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、肺癌、結腸直腸癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌（例えば、膵臓、結腸、卵巣、肺、乳房、胃、前立腺、子宮頸部、または食道の腺癌）、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、膀胱癌、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸の癌、膣の癌、外陰の癌、腎盂の癌、ＣＮＳ腫瘍（神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫など）に由来する腫瘍の腫瘍サイズを低減するために使用され得る。特定のがんは、化学療法または放射線療法に応答し得るか、またはがんは、難治性であり得る。難治性癌は、外科的介入に適しておらず、がんが化学療法または放射線療法に最初に応答しないか、またはがんが経時的に応答しなくなるがんを指す。

本明細書で使用する場合、「抗腫瘍効果」は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の減少、転移数の減少、全生存期間または無増悪生存期間の増加、寿命の増加、または腫瘍に関連する様々な生理学的症状の改善として現れ得る生物学的効果を指す。抗腫瘍効果はまた、腫瘍の発生の予防、例えばワクチンを指すこともある。

本明細書で使用される「サイトカイン」は、特定の抗原との接触に応答して１つの細胞によって放出される非抗体タンパク質を指し、サイトカインは、第２の細胞と相互作用して、第２の細胞における応答を媒介する。本明細書で使用される「サイトカイン」は、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用する、ある細胞集団によって放出されるタンパク質を指すことを意味する。サイトカインは、細胞によって内因的に発現され得るか、または対象に投与され得る。サイトカインは、免疫応答を伝播するために、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好中球、樹状細胞、好酸球、及び肥満細胞を含む免疫細胞によって放出され得る。サイトカインは、レシピエント細胞における様々な応答を誘導し得る。サイトカインは、恒常性サイトカイン、ケモカイン、炎症促進性サイトカイン、エフェクター、及び急性期タンパク質を含み得る。例えば、インターロイキン（ＩＬ）７及びＩＬ－１５を含む恒常性サイトカインは、免疫細胞の生存及び増殖を促進し、炎症促進性サイトカインは、炎症反応を促進し得る。恒常性サイトカインの例には、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１５、及びインターフェロン（ＩＦＮ）ガンマが含まれるが、これらに限定されない。炎症促進性サイトカインの例にはＩＬ－ｌａ、ＩＬ－ｌｂ、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７ａ、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－アルファ、ＴＮＦ－ベータ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、可溶性細胞間接着分子１（ｓＩＣＡＭ－１）、可溶性血管接着分子１（ｓＶＣＡＭ－１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、及び胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）が含まれるが、これらに限定されない。エフェクターの例には、グランザイムＡ、グランザイムＢ、可溶性Ｆａｓリガンド（ｓＦａｓＬ）、ＴＧＦ－ベータ、ＩＬ－３５、及びパーフォリンが含まれるが、これらに限定されない。急性期タンパク質の例には、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及び血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「リンパ球」という用語には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞が含まれる。ＮＫ細胞は、自然免疫系の主要な構成要素である細胞傷害性（細胞傷害性）リンパ球の一種である。ＮＫ細胞は、腫瘍及びウイルスに感染した細胞を拒絶する。それは、アポトーシスまたはプログラムされた細胞死のプロセスを通じて機能する。それらは、細胞を殺すために活性化を必要としないため、「ナチュラルキラー」と呼ばれた。Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫において主要な役割を果たす（抗体の関与はない）。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞を他のリンパ球型と区別する。免疫系の特殊な器官である胸腺は、Ｔ細胞成熟のための主要な部位である。ヘルパーＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ、細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＴＬ、Ｔキラー細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはキラーＴ細胞としても知られる）、メモリーＴ細胞（（ｉ）幹メモリー細胞（ＴＳＣＭ）は、ナイーブ細胞と同様に、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ－セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、及びＩＬ－７Ｒａ＋であるが、ＣＤ９５、ＩＬ－２Ｒ、ＣＸＣＲ３、ＬＦＡ－１も大量に発現し、メモリー細胞に特有の多くの機能的属性を示す）、（ｉｉ）セントラルメモリー細胞（ＴＣＭ）は、Ｌ－セレクチン及びＣＣＲ７を発現し、ＩＬ－２を分泌するが、ＩＦＮγまたはＩＬ－４は分泌しない、（ｉｉｉ）しかしながら、エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）は、Ｌ－セレクチンまたはＣＣＲ７を発現しないが、ＩＦＮγ及びＩＬ－４などのエフェクターサイトカインを産生する）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、サプレッサーＴ細胞、またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋もしくはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、及びガンマデルタＴ細胞を含む多くの種類のＴ細胞が存在する。一方、Ｂ細胞は、体液性免疫において主な役割を果たす（抗体関与を伴う）。Ｂ細胞は、抗体を作製し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能し、抗原相互作用によって活性化された後、短命及び長寿の両方で、メモリーＢ細胞及び形質細胞に変わることができる。哺乳動物では、未熟なＢ細胞は骨髄で形成される。

「遺伝子操作」または「操作」という用語は、コードもしくは非コード領域またはその一部を欠失させること、またはコード領域もしくはその一部を挿入することを含むがこれらに限定されない、細胞のゲノムを修飾する方法を指す。いくつかの実施形態では、修飾される細胞は、患者またはドナーのいずれかから得ることができるリンパ球、例えばＴ細胞である。細胞は、細胞のゲノムに組み込まれる、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの外因性構築物を発現するように修飾され得る。

「免疫応答」とは、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん細胞もしくは他の異常細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合は正常なヒト細胞もしくは組織の選択的ターゲティング、結合、損傷、破壊、及び／または脊椎動物の体からの排除をもたらす、免疫系の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞、及び好中球）とこれらの細胞または肝臓のいずれかによって生成される可溶性高分子（Ａｂ、サイトカイン、補体を含む）の作用を指す。

本明細書で使用される「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、鍵分子の増殖及び／または上方制御または下方制御などのＴ細胞応答をもたらすシグナルを指すが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「共刺激リガンド」には、Ｔ細胞上の同族共刺激分子と特異的に結合する抗原提示細胞上の分子が含まれる。共刺激リガンドの結合は、増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する。共刺激リガンドは、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体とペプチドを負荷した主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子との結合によって、刺激分子によって提供される一次シグナルに加えてシグナルを誘導する。共刺激リガンドには、Ｔｏｌｌ様受容体、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０、ＣＤ７、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、ＩＬＴ４、免疫グロブリン様転写物（ＩＬＴ）３、誘導共刺激リガンド（ＩＣＯＳ－Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、Ｂ７－Ｈ３と特異的に結合するリガンド、リンホトキシンベータ受容体、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）、ＯＸ４０リガンド、ＰＤ－Ｌ２、またはプログラム死（ＰＤ）ＬＩと結合する３／ＴＲ６、４－ＩＢＢリガンド、アゴニスト、または抗体が含まれるが、これらに限定されない。共刺激リガンドには、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体、例えば、４－１ＢＢ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７、ＩＣＯＳ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ナチュラルキラー細胞受容体Ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＯＸ４０、ＰＤ－１、または腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４またはＬＩＧＨＴ）が含まれるが、これに限定されない。

「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の同族結合パートナーであり、それによって、増殖などのＴ細胞による共刺激応答を媒介するが、これらに限定されない。共刺激分子には、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、Ｂ７－Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＢＴＬＡ、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ１６、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２、ＣＤ２２、ＣＤ２４７、ＣＤ２７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３（アルファ、ベータ、デルタ、イプシロン、ガンマ、ゼータ）、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ４、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５、ＣＤ６４、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３リガンド、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＣＤ９、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１－ｌａ、ＣＤｌ－ｌｂ、ＣＤｌ－ｌｃ、ＣＤｌ－ｌｄ、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、ＤＡＰ－１０、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｆｃガンマ受容体、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、インテグリン、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴ ＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＩＴＧＢ１、ＫＩＲＤＳ２、ＬＡＴ、ＬＦＡ－１、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＬＩＧＨＴ（腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４；ＴＮＦＳＦ１４）、ＬＴＢＲ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１（ＣＤ１ ｌａ／ＣＤ１８）、ＭＨＣクラスＩ分子、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＯＸ４０、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＰＤ－１、ＰＳＧＬ１、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、シグナル伝達リンパ球活性化分子、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１；ＣＤ１５０；ＩＰＯ－３）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４；２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ；Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ－７６、ＴＮＦ、ＴＮＦｒ、ＴＮＦＲ２、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ１、もしくはＶＬＡ－６、またはそれらのフラグメント、トランケーション体、もしくは組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用する場合、「配列同一性」または、例えば、「に５０％同一である配列」を含む引用は、比較ウィンドウにわたって配列がヌクレオチドごとまたはアミノ酸ごとに同一である程度を指す。ゆえに、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適に整列された配列を比較ウィンドウにわたって比較し、一致する位置の数を得るために両配列において同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）または同一アミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ及びＭｅｔ）が存在する位置の数を決定し、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けることにより算出され得て、配列同一性のパーセンテージが得られる。本明細書に記載の参照配列のいずれかに対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有するヌクレオチド及びポリペプチドが含まれ、典型的にはポリペプチドの場合、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を維持する。

本明細書で使用する場合、「ワクチン」は、疾患の予防及び／または治療のための免疫を生成するための組成物を指す。したがって、ワクチンは、抗原を含み、ヒトまたは動物への投与時に特異的な防御物質及び保護物質を生成するためにヒトまたは動物で使用されることが意図される薬剤である。

本明細書で使用する場合、「新生抗原」は、発現タンパク質における腫瘍特異的変異から生じる腫瘍抗原のクラスを指す。

２．ベクター、前駆体ＲＮＡ、及び環状ＲＮＡ
環状ＲＮＡ、環状ＲＮＡに環状化し得る前駆体ＲＮＡ、及び前駆体ＲＮＡまたは環状ＲＮＡに転写され得るベクター（例えば、ＤＮＡベクター）も本明細書に提供する。

特定の態様では、スプライシング後３’グループＩイントロンフラグメント、任意で第１のスペーサー、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現配列、任意で第２のスペーサー、及びスプライシング後５’グループＩイントロンフラグメントを含む環状ＲＮＡポリヌクレオチドを本明細書に提供する。いくつかの実施形態では、これらの領域は、この順序である。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、本明細書に提供する方法によって、または本明細書に提供するベクターから作製される。

特定の実施形態では、本明細書に提供されるベクター（例えば、５’二重鎖形成領域、３’グループＩイントロンフラグメント、任意の第１のスペーサー、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、第１の発現配列、切断部位をコードするポリヌクレオチド配列、第２の発現配列、任意の第２のスペーサー、５’グループＩイントロンフラグメント、及び３’二重鎖形成領域を含む）の転写は、環状化することができる前駆直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドの形成をもたらす。いくつかの実施形態では、この前駆体直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドは、グアノシンヌクレオチドまたはヌクレオシド（例えば、ＧＴＰ）及び二価カチオン（例えば、Ｍｇ２＋）の存在下でインキュベートされる場合に環状化する。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供するベクター及び前駆体ＲＮＡポリヌクレオチドは、第１の（５’）二重鎖形成領域及び第２の（３’）二重鎖形成領域を含む。特定の実施形態では、第１及び第２の二重鎖形成領域は、完全または不完全な二重鎖を形成し得る。ゆえに、特定の実施形態では、第１及び第２の二重鎖形成領域の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、互いに塩基対形成し得る。いくつかの実施形態では、二重鎖形成領域は、ＲＮＡ内の意図しない配列（例えば、非二重鎖形成領域配列）と５０％未満（例えば、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満）の塩基対形成を有すると予測される。かかる二重鎖形成領域を前駆体ＲＮＡ鎖の端に含み、グループＩイントロンフラグメントに隣接するまたは非常に近接するいくつかの実施形態では、グループＩイントロンフラグメントを互いに近接させ、スプライシング効率を増加させる。いくつかの実施形態では、二重鎖形成領域は、３～１００ヌクレオチドの長さ（例えば、３～７５ヌクレオチドの長さ、３～５０ヌクレオチドの長さ、２０～５０ヌクレオチドの長さ、３５～５０ヌクレオチドの長さ、５～２５ヌクレオチドの長さ、９～１９ヌクレオチドの長さ）である。いくつかの実施形態では、二重鎖形成領域は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、二重鎖形成領域は、約９～約５０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、二重鎖形成領域は、約９～約１９ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、二重鎖形成領域は、約２０～約４０ヌクレオチドの長さを有する。特定の実施形態では、二重鎖形成領域は、約３０ヌクレオチドの長さを有する。

２つのタイプのスペーサーが、前駆体ＲＮＡ環状化及び／または環状ＲＮＡからの遺伝子発現を改善するために設計された。第１のタイプのスペーサーは、外部スペーサーであり、すなわち、前駆体ＲＮＡに存在するが環状化すると除去される。理論に拘束されることを望まないが、外部スペーサーは、リボザイム自体の構造を維持し、他の隣接配列エレメントがその折り畳み及び機能と干渉することを防止することによってリボザイム媒介環化を改善し得ることが企図される。第２のタイプのスペーサーは、内部スペーサーであり、すなわち、前駆体ＲＮＡに存在し、得られる環状ＲＮＡに保持される。理論に拘束されることを望まないが、内部スペーサーは、リボザイム自体の構造を維持し、他の隣接配列エレメント、特に隣接ＩＲＥＳ及びコード領域がその折り畳み及び機能と干渉することを防止することによってリボザイム媒介環化を改善し得ることが企図される。内部スペーサーは、隣接配列エレメント、特にイントロンエレメントがＩＲＥＳ内の配列とハイブリダイズすることを防止し、その最も好ましくかつ活性的なコンフォメーションに折り畳まれるその能力を阻害することによってＩＲＥＳからタンパク質発現を改善し得ることも企図される。

特定の実施形態では、本明細書に提供するベクター、前駆体ＲＮＡ及び環状ＲＮＡは、第１の（５’）及び／または第２の（３’）スペーサーを含む。いくつかの実施形態では、３’グループＩイントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間にスペーサーを含むことは、それらが相互作用するのを防ぎ、ゆえにスプライシング効率を増加させることによって、それらの領域における二次構造を保存し得る。いくつかの実施形態では、第１の（３’グループＩイントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間）及び第２の（発現配列と５’グループＩイントロンフラグメントとの間）スペーサーは、互いに塩基対形成し、第１及び第２の二重鎖形成領域に対してではないと予測される追加の塩基対形成領域を含む。いくつかの実施形態では、かかるスペーサー塩基対形成は、グループＩイントロンフラグメントを互いに近接させ、スプライシング効率をさらに増加させる。加えて、いくつかの実施形態では、第１と第２の二重鎖形成領域との間の塩基対形成、及び別個に、第１と第２のスペーサーとの間の塩基対形成の組み合わせは、塩基対形成の隣接領域に接するグループＩイントロンフラグメントを含有するスプライシングバブルの形成を促進する。典型的なスペーサーは、以下の質：１）近位構造、例えば、ＩＲＥＳ、発現配列、またはイントロンとの干渉を回避すると予測される；２）少なくとも７ｎｔ長であり、１００ｎｔ以下である；３）３’イントロンフラグメントの後及びこれに近接している及び／または５’イントロンフラグメントの前及びこれに近接している位置にある；ならびに４）以下：ａ）少なくとも５ｎｔ長の非構造化領域、ｂ）別のスペーサーを含む遠位配列に少なくとも５ｎｔ長の塩基対形成の領域、及びｃ）スペーサーの配列に範囲が限定された少なくとも７ｎｔ長の構造化領域のうちの１つ以上を含有する、のうちの１つ以上を伴う連続した配列である。スペーサーは、非構造化領域、塩基対形成領域、ヘアピン／構造化領域、及びその組み合わせを含む、いくつかの領域を有し得る。ある実施形態では、スペーサーは、高いＧＣ含量を伴う構造化領域を有する。ある実施形態では、スペーサー塩基内の領域は、同じスペーサー内の別の領域と対を形成する。ある実施形態では、スペーサー塩基内の領域は、別のスペーサー内の領域と対を形成する。ある実施形態では、スペーサーは、１つ以上のヘアピン構造を含む。ある実施形態では、スペーサーは、４～１２ヌクレオチドのステム及び２～１０ヌクレオチドのループを伴う１つ以上のヘアピン構造を含む。ある実施形態では、３’グループＩイントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間に追加のスペーサーが存在する。ある実施形態では、この追加のスペーサーは、ＩＲＥＳの構造化領域が３’グループＩイントロンフラグメントの折り畳みに干渉することを防止する、またはこれが生じる程度を低下させる。いくつかの実施形態では、５’スペーサー配列は、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５または３０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’スペーサー配列は、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５または３０ヌクレオチド以下の長さである。いくつかの実施形態では、５’スペーサー配列は、５及び５０、１０及び５０、２０及び５０、２０及び４０、及び／または２５及び３５ヌクレオチド間の長さである。特定の実施形態では、５’スペーサー配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、５’スペーサー配列は、ポリＡ配列である。別の実施形態では、５’スペーサー配列は、ポリＡＣ配列である。一実施形態では、スペーサーは、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％ポリＡＣ含量を含む。一実施形態では、スペーサーは、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％ポリピリミジン（Ｃ／ＴまたはＣ／Ｕ）含量を含む。

特定の実施形態では、３’グループＩイントロンフラグメントは、３’スプライス部位ジヌクレオチド及び任意で少なくとも１ｎｔの長さ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０ｎｔの長さ）及び最大でエクソンの長さの隣接するエクソン配列を含む天然グループＩイントロンの３’近位フラグメントに対して少なくとも７５％相同（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同）である連続配列である。典型的には、５’グループＩイントロンフラグメントは、５’スプライス部位ジヌクレオチド及び任意で少なくとも１ｎｔの長さ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０ｎｔの長さ）及び最大でエクソンの長さの隣接するエクソン配列を含む天然グループＩイントロンの５’近位フラグメントに対して少なくとも７５％相同（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同）である連続配列である。Ｕｍｅｋａｇｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）によって記載されるように、３’グループＩイントロンフラグメント及び５’グループＩイントロンフラグメントの外部部分は、環状化において除去され、本明細書に提供する環状ＲＮＡは、少なくとも１ｎｔの長さの任意のエクソン配列によって形成される３’グループＩイントロンフラグメント及び少なくとも１ｎｔの長さの任意のエクソン配列によって形成される５’グループＩイントロンフラグメントの部分のみを含むようになるが、これはかかる配列が非環状化前駆体ＲＮＡに存在する場合である。環状ＲＮＡによって保持される３’グループＩイントロンフラグメントの一部は、本明細書では、「スプライシング後３’グループＩイントロンフラグメント」と称する。環状ＲＮＡによって保持される５’グループＩイントロンフラグメントの一部は、本明細書では、「スプライシング後５’グループＩイントロンフラグメント」と称する。

特定の実施形態では、本明細書に提供するベクター、前駆体ＲＮＡ及び環状ＲＮＡは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。ＩＲＥＳを含めることにより、環状ＲＮＡからの１つ以上のオープンリーディングフレーム（例えば、発現配列を形成するオープンリーディングフレーム）の翻訳が可能になる。ＩＲＥＳエレメントは、真核生物のリボソーム翻訳開始複合体を引き付け、翻訳開始を促進する。例えば、Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：４４８５－４４９０；Ｇｕｒｔｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９９６）２２９：２９５－２９８；Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）２０：１０２－１１０；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）２１：３９９－４０２；及びＭｏｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９７ ２２ １５０－１６１）を参照されたい。

多数のＩＲＥＳ配列が利用可能であり、多種多様なウイルスに由来する配列、例えば脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＵＴＲなどのピコルナウイルスのリーダー配列（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８９）６３：１６５１－１６６０）、ポリオリーダー配列、Ａ型肝炎ウイルスリーダー、Ｃ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、ヒトライノウイルス２型ＩＲＥＳ（Ｄｏｂｒｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００３）１００（２５）：１５１２５－１５１３０）、口蹄疫ウイルスからのＩＲＥＳエレメント（Ｒａｍｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（１９９６）２４：２６９７－２７００）、ジアルジアウイルスＩＲＥＳ（Ｇａｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００４）２７９（５）：３３８９－３３９７）などが含まれる。

いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、タウラ症候群ウイルス、トリアトーマウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、シミアンウイルス４０、ヒアリウイルス１、ムギクビレアブラムシウイルス、細網内皮症ウイルス、ヒトポリオウイルス１、チャバネアオカメムシ腸ウイルス、カシミールハチウイルス、ヒトライノウイルス２、ホマロディスカ・コアグラタウイルス－１、ヒト免疫不全ウイルス１型、ヒメトビＰウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ＧＢ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒトエンテロウイルス７１、ウマ鼻炎ウイルス、ウスジロエダシャクピコルナ様ウイルス、脳心筋炎ウイルス、ショウジョウバエＣウイルス、ヒトコクサッキーウイルスＢ３、アブラナ科トバモウイルス、コオロギ麻痺ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス１、黒色女王蜂児ウイルス、アブラムシ致死麻痺ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、急性ミツバチ麻痺ウイルス、ハイビスカス退緑輪点ウイルス、古典的ブタ熱ウイルス、ヒトＦＧＦ２、ヒトＳＦＴＰＡ１、ヒトＡＭＬ１／ＲＵＮＸ１、ショウジョウバエアンテナペディア、ヒトＡＱＰ４、ヒトＡＴ１Ｒ、ヒトＢＡＧ－１、ヒトＢＣＬ２、ヒトＢｉＰ、ヒトｃ－ＩＡＰｌ、ヒトｃ－ｍｙｃ、ヒトｅＩＦ４Ｇ、マウスＮＤＳＴ４Ｌ、ヒトＬＥＦ１、マウスＨＩＦ１アルファ、ヒトｎ．ｍｙｃ、マウスＧｔｘ、ヒトｐ２７ｋｉｐｌ、ヒトＰＤＧＦ２／ｃ－ｓｉｓ、ヒトｐ５３、ヒトＰｉｍ－１、マウスＲｂｍ３、ショウジョウバエ リーパー、イヌ スキャンパー、ショウジョウバエＵｂｘ、ヒトＵＮＲ、マウスＵｔｒＡ、ヒトＶＥＧＦ－Ａ、ヒトＸＩＡＰ、ショウジョウバエ ヘアレス、出芽酵母ＴＦＩＩＤ、出芽酵母ＹＡＰ１、タバコエッチウイルス、カブクリンクルウイルス、ＥＭＣＶ－Ａ、ＥＭＣＶ－Ｂ、ＥＭＣＶ－Ｂｆ、ＥＭＣＶ－Ｃｆ、ＥＭＣＶ ｐＥＣ９、ピコビルナウイルス、ＨＣＶ ＱＣ６４、ヒトコサウイルスＥ／Ｄ、ヒトコサウイルスＦ、ヒトコサウイルスＪＭＹ、ライノウイルスＮＡＴ００１、ＨＲＶ１４、ＨＲＶ８９、ＨＲＶＣ－０２、ＨＲＶ－Ａ２１、サリウイルスＡ ＳＨ１、サリウイルスＦＨＢ、サリウイルスＮＧ－Ｊ１、ヒトパレコウイルス１、クロヒウイルスＢ、Ｙｃ－３、ロザウイルスＭ－７、シャンバウイルスＡ、パシウイルスＡ、パシウイルスＡ ２、エコーウイルスＥ１４、ヒトパレコウイルス５、アイチウイルス、Ａ型肝炎ウイルスＨＡ１６、フォピウイルス、ＣＶＡ１０、エンテロウイルスＣ、エンテロウイルスＤ、エンテロウイルスＪ、ヒトペギウイルス２、ＧＢＶ－Ｃ ＧＴ１１０、ＧＢＶ－Ｃ Ｋ１７３７、ＧＢＶ－Ｃ Ｉｏｗａ、ペギウイルスＡ １２２０、パシウイルスＡ ３、サペロウイルス、ロザウイルスＢ、バクンサウイルス、トレモウイルスＡ、ブタパシウイルス１、ＰＬＶ－ＣＨＮ、パシウイルスＡ、シシニウイルス、ヘパシウイルスＫ、ヘパシウイルスＡ、ＢＶＤＶ１、ボーダー病ウイルス、ＢＶＤＶ２、ＣＳＦＶ－ＰＫ１５Ｃ、ＳＦ５７３ジシストロウイルス、フーペイピコルナ様ウイルス、ＣＲＰＶ、サリウイルスＡ ＢＮ５、サリウイルスＡ ＢＮ２、サリウイルスＡ ０２３９４、サリウイルスＡ ＧＵＴ、サリウイルスＡ ＣＨ、サリウイルスＡ ＳＺ１、サリウイルスＦＨＢ、ＣＶＢ３、ＣＶＢ１、エコーウイルス７、ＣＶＢ５、ＥＶＡ７１、ＣＶＡ３、ＣＶＡ１２、ＥＶ２４、またはｅＩＦ４Ｇに対するアプタマーのＩＲＥＳ配列である。

タンパク質発現を誘導するために、環状ＲＮＡは、タンパク質をコードする配列に機能可能に連結されたＩＲＥＳを含む。例示的なＩＲＥＳ配列は、以下の表１７に提供されている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する環状ＲＮＡは、表１７におけるＩＲＥＳ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＩＲＥＳ配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する環状ＲＮＡは、表１７におけるＩＲＥＳ配列を含む。ＩＲＥＳ及び付属配列の修飾は、例えば、ＩＲＥＳの５’及び／または３’末端を切断すること、ＩＲＥＳに対して５’にスペーサーを付加すること、翻訳開始部位（コザック配列）の５’の６ヌクレオチドを修飾すること、代替翻訳開始部位の修飾、及びキメラ／ハイブリッドＩＲＥＳ配列を生成することによって、ＩＲＥＳ活性を上昇または低下させることが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する環状ＲＮＡにおけるＩＲＥＳ配列は、ネイティブＩＲＥＳ（例えば、表１７に開示されるネイティブＩＲＥＳ）に対するこれらの修飾の１つ以上を含む。

多数のＩＲＥＳ配列が利用可能であり、多種多様なウイルスに由来する配列、例えば脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＵＴＲなどのピコルナウイルスのリーダー配列（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８９）６３：１６５１－１６６０）、ポリオリーダー配列、Ａ型肝炎ウイルスリーダー、Ｃ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、ヒトライノウイルス２型ＩＲＥＳ（Ｄｏｂｒｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００３）１００（２５）：１５１２５－１５１３０）、口蹄疫ウイルスからのＩＲＥＳエレメント（Ｒａｍｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（１９９６）２４：２６９７－２７００）、ジアルジアウイルスＩＲＥＳ（Ｇａｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００４）２７９（５）：３３８９－３３９７）などが含まれる。

いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、タウラ症候群ウイルス、トリアトーマウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、シミアンウイルス４０、ヒアリウイルス１、ムギクビレアブラムシウイルス、細網内皮症ウイルス、ヒトポリオウイルス１、チャバネアオカメムシ腸ウイルス、カシミールハチウイルス、ヒトライノウイルス２、ホマロディスカ・コアグラタウイルス－１、ヒト免疫不全ウイルス１型、ヒメトビＰウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ＧＢ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒトエンテロウイルス７１、ウマ鼻炎ウイルス、ウスジロエダシャクピコルナ様ウイルス、脳心筋炎ウイルス、ショウジョウバエＣウイルス、ヒトコクサッキーウイルスＢ３、アブラナ科トバモウイルス、コオロギ麻痺ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス１、黒色女王蜂児ウイルス、アブラムシ致死麻痺ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、急性ミツバチ麻痺ウイルス、ハイビスカス退緑輪点ウイルス、古典的ブタ熱ウイルス、ヒトＦＧＦ２、ヒトＳＦＴＰＡ１、ヒトＡＭＬ１／ＲＵＮＸ１、ショウジョウバエアンテナペディア、ヒトＡＱＰ４、ヒトＡＴ１Ｒ、ヒトＢＡＧ－１、ヒトＢＣＬ２、ヒトＢｉＰ、ヒトｃ－ＩＡＰｌ、ヒトｃ－ｍｙｃ、ヒトｅＩＦ４Ｇ、マウスＮＤＳＴ４Ｌ、ヒトＬＥＦ１、マウスＨＩＦ１アルファ、ヒトｎ．ｍｙｃ、マウスＧｔｘ、ヒトｐ２７ｋｉｐｌ、ヒトＰＤＧＦ２／ｃ－ｓｉｓ、ヒトｐ５３、ヒトＰｉｍ－１、マウスＲｂｍ３、ショウジョウバエ リーパー、イヌ スキャンパー、ショウジョウバエＵｂｘ、ヒトＵＮＲ、マウスＵｔｒＡ、ヒトＶＥＧＦ－Ａ、ヒトＸＩＡＰ、ショウジョウバエ ヘアレス、出芽酵母ＴＦＩＩＤ、出芽酵母ＹＡＰ１、タバコエッチウイルス、カブクリンクルウイルス、ＥＭＣＶ－Ａ、ＥＭＣＶ－Ｂ、ＥＭＣＶ－Ｂｆ、ＥＭＣＶ－Ｃｆ、ＥＭＣＶ ｐＥＣ９、ピコビルナウイルス、ＨＣＶ ＱＣ６４、ヒトコサウイルスＥ／Ｄ、ヒトコサウイルスＦ、ヒトコサウイルスＪＭＹ、ライノウイルスＮＡＴ００１、ＨＲＶ１４、ＨＲＶ８９、ＨＲＶＣ－０２、ＨＲＶ－Ａ２１、サリウイルスＡ ＳＨ１、サリウイルスＦＨＢ、サリウイルスＮＧ－Ｊ１、ヒトパレコウイルス１、クロヒウイルスＢ、Ｙｃ－３、ロザウイルスＭ－７、シャンバウイルスＡ、パシウイルスＡ、パシウイルスＡ ２、エコーウイルスＥ１４、ヒトパレコウイルス５、アイチウイルス、Ａ型肝炎ウイルスＨＡ１６、フォピウイルス、ＣＶＡ１０、エンテロウイルスＣ、エンテロウイルスＤ、エンテロウイルスＪ、ヒトペギウイルス２、ＧＢＶ－Ｃ ＧＴ１１０、ＧＢＶ－Ｃ Ｋ１７３７、ＧＢＶ－Ｃ Ｉｏｗａ、ペギウイルスＡ １２２０、パシウイルスＡ ３、サペロウイルス、ロザウイルスＢ、バクンサウイルス、トレモウイルスＡ、ブタパシウイルス１、ＰＬＶ－ＣＨＮ、パシウイルスＡ、シシニウイルス、ヘパシウイルスＫ、ヘパシウイルスＡ、ＢＶＤＶ１、ボーダー病ウイルス、ＢＶＤＶ２、ＣＳＦＶ－ＰＫ１５Ｃ、ＳＦ５７３ジシストロウイルス、フーペイピコルナ様ウイルス、ＣＲＰＶ、サリウイルスＡ ＢＮ５、サリウイルスＡ ＢＮ２、サリウイルスＡ ０２３９４、サリウイルスＡ ＧＵＴ、サリウイルスＡ ＣＨ、サリウイルスＡ ＳＺ１、サリウイルスＦＨＢ、ＣＶＢ３、ＣＶＢ１、エコーウイルス７、ＣＶＢ５、ＥＶＡ７１、ＣＶＡ３、ＣＶＡ１２、ＥＶ２４、またはｅＩＦ４Ｇに対するアプタマーのＩＲＥＳの配列である。

いくつかの実施形態では、本明細書におけるポリヌクレオチドは、１つを超える発現配列を含む。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、バイシストロン性ＲＮＡである。２つ以上のポリペプチドをコードする配列は、リボソームスキッピングエレメントまたはプロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列によって分離され得る。特定の実施形態では、リボソームスキッピングエレメントは、トセア・アシグナウイルス２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）、ブタテシオウイルス－１ ２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａペプチド（Ｅ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａペプチド（ＢｍＣＰＶ ２Ａ）、またはカイコ（Ｂ．ｍｏｒｉ）軟化病ウイルス２Ａペプチド（ＢｍＩＦＶ ２Ａ）をコードする。

特定の実施形態では、本明細書に提供するベクターは、３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、ヒトベータグロビン、ヒトアルファグロビンクセノプスベータグロビン、クセノプスアルファグロビン、ヒトプロラクチン、ヒトＧＡＰ－４３、ヒトｅＥＦｌａｌ、ヒトＴａｕ、ヒトＴＮＦα、デングウイルス、ハンタウイルス小ｍＲＮＡ、ブニヤウイルス小ｍＲＮＡ、カブ黄色モザイクウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、風疹ウイルス、タバコモザイクウイルス、ヒトＩＬ－８、ヒトアクチン、ヒトＧＡＰＤＨ、ヒトチューブリン、ハイビスカス退緑輪点ウイルス、ウッドチャック肝炎ウイルス肝炎ウイルス翻訳後制御エレメント、シンドビスウイルス、カブクリンクルウイルス、タバコエッチングウイルス、またはベネズエラウマ脳炎ウイルスに由来する。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供するベクターは、５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、ヒトベータグロビン、アフリカツメガエルベータグロビン、ヒトアルファグロビン、アフリカツメガエルアルファグロビン、ルベラウイルス、タバコモザイクウイルス、マウスＧｔｘ、デングウイルス、熱ショックタンパク質７０ｋＤａタンパク質１Ａ、タバコアルコールデヒドロゲナーゼ、タバコエッチングウイルス、カブクリンクルウイルス、またはアデノウイルス三者リーダーに由来する。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供するベクターは、３’及び／または５’グループＩイントロンフラグメントの外部のポリＡ領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ領域は、少なくとも１５、３０、または６０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、一方または両方のポリＡ領域は、１５～５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、一方または両方のポリＡ領域は、２０～２５ヌクレオチド長である。ポリＡ配列は、環状化の際に除去される。ゆえに、固体表面（例えば、樹脂）に複合されるデオキシチミンオリゴヌクレオチド（オリゴ（ｄＴ））などの、ポリＡ配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、環状ＲＮＡをその前駆体ＲＮＡから分離するために使用され得る。他の配列もまた、３’グループＩイントロンフラグメントに対して５’または５’グループＩイントロンフラグメントに対して３’に配置され得、相補性配列が、環状ＲＮＡ精製のために同様に使用され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＤＮＡ（例えば、ベクター）、直鎖状ＲＮＡ（例えば、前駆体ＲＮＡ）、及び／または環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、３００～１５０００、３００～１４０００、３００～１３０００、３００～１２０００、３００～１１０００、３００～１００００、４００～９０００、５００～８０００、６００～７０００、７００～６０００、８００～５０００、９００～５０００、１０００～５０００、１１００～５０００、１２００～５０００、１３００～５０００、１４００～５０００、及び／または１５００～５０００ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔ、６００ｎｔ、７００ｎｔ、８００ｎｔ、９００ｎｔ、１０００ｎｔ、１１００ｎｔ、１２００ｎｔ、１３００ｎｔ、１４００ｎｔ、１５００ｎｔ、２０００ｎｔ、２５００ｎｔ、３０００ｎｔ、３５００ｎｔ、４０００ｎｔ、４５００ｎｔ、５０００ｎｔ、６０００ｎｔ、７０００ｎｔ、８０００ｎｔ、９０００ｎｔ、１００００ｎｔ、１１０００ｎｔ、１２０００ｎｔ、１３０００ｎｔ、１４０００ｎｔ、または１５０００ｎｔの長さである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、３０００ｎｔ、３５００ｎｔ、４０００ｎｔ、４５００ｎｔ、５０００ｎｔ、６０００ｎｔ、７０００ｎｔ、８０００ｎｔ、９０００ｎｔ、１００００ｎｔ、１１０００ｎｔ、１２０００ｎｔ、１３０００ｎｔ、１４０００ｎｔ、１５０００ｎｔ、または１６０００ｎｔ以下の長さである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供するＤＮＡ、直鎖状ＲＮＡ、及び／または環状ＲＮＡポリヌクレオチドの長さは、約３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔ、６００ｎｔ、７００ｎｔ、８００ｎｔ、９００ｎｔ、１０００ｎｔ、１１００ｎｔ、１２００ｎｔ、１３００ｎｔ、１４００ｎｔ、１５００ｎｔ、２０００ｎｔ、２５００ｎｔ、３０００ｎｔ、３５００ｎｔ、４０００ｎｔ、４５００ｎｔ、５０００ｎｔ、６０００ｎｔ、７０００ｎｔ、８０００ｎｔ、９０００ｎｔ、１００００ｎｔ、１１０００ｎｔ、１２０００ｎｔ、１３０００ｎｔ、１４０００ｎｔ、または１５０００ｎｔである。

いくつかの実施形態では、ベクターを本明細書に提供する。特定の実施形態では、ベクターは、以下の順序で、ａ）５’二重鎖形成領域、ｂ）３’グループＩイントロンフラグメント、ｃ）任意の第１のスペーサー配列、ｄ）ＩＲＥＳ、ｅ）第１の発現配列、ｆ）切断部位をコードするポリヌクレオチド配列、ｇ）第２の発現配列、ｈ）任意の第２のスペーサー配列、ｉ）５’グループＩイントロンフラグメント、及びｇ）３’二重鎖形成領域を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、５’二重鎖形成領域の上流に転写プロモーターを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターを本明細書に提供する。特定の実施形態では、ベクターは、以下の順序で、ａ）５’二重鎖形成領域、ｂ）３’グループＩイントロンフラグメント、ｃ）任意の第１のスペーサー配列、ｄ）第１のＩＲＥＳ、ｅ）第１の発現配列、ｆ）第２のＩＲＥＳ、ｇ）第２の発現配列、ｈ）任意の第２のスペーサー配列、ｉ）５’グループＩイントロンフラグメント、及びｇ）３’二重鎖形成領域を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、５’二重鎖形成領域の上流に転写プロモーターを含む。

いくつかの実施形態では、前駆体ＲＮＡを本明細書に提供する。特定の実施形態では、前駆体ＲＮＡは、本明細書に提供するベクターのインビトロ転写によって産生される直鎖状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前駆体ＲＮＡは、以下の順序で、ａ）任意の５’二重鎖形成領域、ｂ）３’グループＩイントロンフラグメント、ｃ）任意の第１のスペーサー配列、ｄ）ＩＲＥＳ、ｅ）第１の発現配列、ｆ）切断部位をコードするポリヌクレオチド配列、ｇ）第２の発現配列、ｈ）任意の第２のスペーサー配列、ｉ）５’グループＩイントロンフラグメント、及びｊ）任意の３’二重鎖形成領域を含む。いくつかの実施形態では、前駆体ＲＮＡは、以下の順序で、ａ）５’二重鎖形成領域、ｂ）３’グループＩイントロンフラグメント、ｃ）任意の第１のスペーサー配列、ｄ）第１のＩＲＥＳ、ｅ）第１の発現配列、ｆ）第２のＩＲＥＳ、ｇ）第２の発現配列、ｈ）任意の第２のスペーサー配列、ｉ）５’グループＩイントロンフラグメント、及びｊ）３’二重鎖形成領域を含む。前駆体ＲＮＡは、未修飾である、部分的に修飾される、または完全に修飾されることができる。

特定の実施形態では、環状ＲＮＡを本明細書に提供する。特定の実施形態では、環状ＲＮＡは、本明細書に提供するベクターによって産生される環状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、本明細書に提供する前駆体ＲＮＡの環状化によって産生される環状ＲＮＡである。特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクターの転写は、環状化することができる前駆体直鎖状ＲＮＡの形成をもたらす。いくつかの実施形態では、この前駆体直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドは、グアノシンヌクレオチドまたはヌクレオシド（例えば、ＧＴＰ）及び二価カチオン（例えば、Ｍｇ^２＋）の存在下でインキュベートされる場合に環状化する。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、以下の配列で、ａ）第１のスペーサー配列、ｂ）ＩＲＥＳ、ｃ）第１の発現配列、ｄ）切断部位をコードするポリヌクレオチド配列、ｅ）第２の発現配列、及びｆ）任意の第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、以下の配列で、ａ）スプライシング後３’グループＩイントロンフラグメント、ｂ）第１のスペーサー配列、ｃ）ＩＲＥＳ、ｄ）第１の発現配列、ｅ）切断部位をコードするポリヌクレオチド配列、ｆ）第２の発現配列、及びｇ）第２のスペーサー配列、ｈ）スプライシング後５’グループＩイントロンフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、以下の配列で、ａ）第１のスペーサー配列、ｂ）第１のＩＲＥＳ、ｃ）第１の発現配列、ｄ）第２のＩＲＥＳ、ｅ）第２の発現配列、及びｆ）任意の第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、３’スプライス部位の３’である３’グループＩイントロンフラグメントの部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、５’スプライス部位の５’である５’グループＩイントロンフラグメントの部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、少なくとも５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、または１５０００ヌクレオチドのサイズである。環状ＲＮＡは、未修飾である、部分的に修飾される、または完全に修飾されることができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供するベクター及び前駆体ＲＮＡポリヌクレオチドは、第１の（５’）二重鎖形成領域及び第２の（３’）二重鎖形成領域を含む。特定の実施形態では、第１及び第２の相同領域は、完全または不完全な二重鎖を形成し得る。ゆえに、特定の実施形態では、第１及び第２の二重鎖形成領域の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、互いに塩基対形成し得る。いくつかの実施形態では、二重鎖形成領域は、ＲＮＡ内の意図しない配列（例えば、非二重鎖形成領域配列）と５０％未満（例えば、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満）の塩基対形成を有すると予測される。かかる二重鎖形成領域を前駆体ＲＮＡ鎖の端に含み、グループＩイントロンフラグメントに隣接するまたは非常に近接するいくつかの実施形態では、グループＩイントロンフラグメントを互いに近接させ、スプライシング効率を増加させる。いくつかの実施形態では、二重鎖形成領域は、３～１００ヌクレオチドの長さ（例えば、３～７５ヌクレオチドの長さ、３～５０ヌクレオチドの長さ、２０～５０ヌクレオチドの長さ、３５～５０ヌクレオチドの長さ、５～２５ヌクレオチドの長さ、９～１９ヌクレオチドの長さ）である。いくつかの実施形態では、二重鎖形成領域は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、二重鎖形成領域は、約９～約５０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、二重鎖形成領域は、約９～約１９ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、二重鎖形成領域は、約２０～約４０ヌクレオチドの長さを有する。特定の実施形態では、二重鎖形成領域は、約３０ヌクレオチドの長さを有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡは、同じ発現配列を含むｍＲＮＡよりも高い機能安定性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡは、同じ発現配列、５ｍｏＵ修飾、最適化ＵＴＲ、キャップ、及び／またはポリＡテールを含むｍＲＮＡよりも高い機能安定性を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも５時間、１０時間、１５時間、２０時間、３０時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間または８０時間の機能的半減期を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、５～８０、１０～７０、１５～６０、及び／または２０～５０時間の機能的半減期を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、同じタンパク質をコードする同等の直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドよりも長い（例えば、少なくとも１．５倍長い、少なくとも２倍長い）機能的半減期を有する。いくつかの実施形態では、機能的半減期は、機能的タンパク質合成の検出を通して評価することができる。

特定の実施形態では、本明細書に提供するベクター、前駆体ＲＮＡ及び環状ＲＮＡは、第１の（５’）及び／または第２の（３’）スペーサーを含む。いくつかの実施形態では、３’グループＩイントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間にスペーサーを含むことは、それらが相互作用するのを防ぎ、ゆえにスプライシング効率を増加させることによって、それらの領域における二次構造を保存し得る。いくつかの実施形態では、第１の（３’グループＩイントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間）及び第２の（発現配列及び５’グループＩイントロンフラグメント間）スペーサーは、互いに塩基対形成し、第１及び第２の二重鎖形成領域に対してではないと予測される追加の塩基対形成領域を含む。他の実施形態では、第１の（３’グループＩイントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間）及び第２の（発現配列の１つと５’グループＩイントロンフラグメントとの間）スペーサーは、互いに塩基対形成し、第１及び第２の二重鎖形成領域に対してではないと予測される追加の塩基対形成領域を含む。いくつかの実施形態では、かかるスペーサー塩基対形成は、グループＩイントロンフラグメントを互いに近接させ、スプライシング効率をさらに増加させる。加えて、いくつかの実施形態では、第１と第２の二重鎖形成領域との間の塩基対形成、及び別個に、第１と第２のスペーサーとの間の塩基対形成の組み合わせは、塩基対形成の隣接領域に接するグループＩイントロンフラグメントを含有するスプライシングバブルの形成を促進する。典型的なスペーサーは、以下の質：１）近位構造、例えば、ＩＲＥＳ、発現配列、またはイントロンとの干渉を回避すると予測される；２）少なくとも７ｎｔ長であり、１００ｎｔ以下である；３）３’イントロンフラグメントの後及びこれに近接している及び／または５’イントロンフラグメントの前及びこれに近接している位置にある；ならびに４）以下：ａ）少なくとも５ｎｔ長の非構造化領域、ｂ）別のスペーサーを含む遠位配列に少なくとも５ｎｔ長の塩基対形成の領域、及びｃ）スペーサーの配列に範囲が限定された少なくとも７ｎｔ長の構造化領域のうちの１つ以上を含有する、のうちの１つ以上を伴う連続した配列である。スペーサーは、非構造化領域、塩基対形成領域、ヘアピン／構造化領域、及びその組み合わせを含む、いくつかの領域を有し得る。ある実施形態では、スペーサーは、高いＧＣ含量を伴う構造化領域を有する。ある実施形態では、スペーサー塩基内の領域は、同じスペーサー内の別の領域と対を形成する。ある実施形態では、スペーサー塩基内の領域は、別のスペーサー内の領域と対を形成する。ある実施形態では、スペーサーは、１つ以上のヘアピン構造を含む。ある実施形態では、スペーサーは、４～１２ヌクレオチドのステム及び２～１０ヌクレオチドのループを伴う１つ以上のヘアピン構造を含む。ある実施形態では、３’グループＩイントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間に追加のスペーサーが存在する。ある実施形態では、この追加のスペーサーは、ＩＲＥＳの構造化領域が３’グループＩイントロンフラグメントの折り畳みに干渉することを防止する、またはこれが生じる程度を低下させる。いくつかの実施形態では、５’スペーサー配列は、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５または３０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’スペーサー配列は、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５または３０ヌクレオチド以下の長さである。いくつかの実施形態では、５’スペーサー配列は、５及び５０、１０及び５０、２０及び５０、２０及び４０、及び／または２５及び３５ヌクレオチド間の長さである。特定の実施形態では、５’スペーサー配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、５’スペーサー配列は、ポリＡ配列である。別の実施形態では、５’スペーサー配列は、ポリＡＣ配列である。一実施形態では、スペーサーは、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％ポリＡＣ含量を含む。一実施形態では、スペーサーは、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％ポリピリミジン（Ｃ／ＴまたはＣ／Ｕ）含量を含む。

特定の実施形態では、３’グループＩイントロンフラグメントは、３’スプライス部位ジヌクレオチド及び任意で少なくとも１ｎｔの長さ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０ｎｔの長さ）及び最大でエクソンの長さの隣接するエクソン配列を含む天然グループＩイントロンの３’近位フラグメントに対して少なくとも７５％同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一）である連続配列である。典型的には、５’グループＩイントロンフラグメントは、５’スプライス部位ジヌクレオチド及び任意で少なくとも１ｎｔの長さ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０ｎｔの長さ）及び最大でエクソンの長さの隣接するエクソン配列を含む天然グループＩイントロンの５’近位フラグメントに対して少なくとも７５％同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一）である連続配列である。Ｕｍｅｋａｇｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）によって記載されるように、３’グループＩイントロンフラグメント及び５’グループＩイントロンフラグメントの外部部分は、環状化において除去され、本明細書に提供する環状ＲＮＡは、少なくとも１ｎｔの長さの任意のエクソン配列によって形成される３’グループＩイントロンフラグメント及び少なくとも１ｎｔの長さの任意のエクソン配列によって形成される５’グループＩイントロンフラグメントの部分のみを含むようになるが、これはかかる配列が非環状化前駆体ＲＮＡに存在する場合である。環状ＲＮＡによって保持される３’グループＩイントロンフラグメントの一部は、本明細書では、スプライシング後３’グループＩイントロンフラグメントと称する。環状ＲＮＡによって保持される５’グループＩイントロンフラグメントの一部は、本明細書では、スプライシング後５’グループＩイントロンフラグメントと称する。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡは、同等の直鎖状ｍＲＮＡよりも高い程度の発現、例えば、細胞へのＲＮＡの投与２４時間後により高い程度の発現を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡは、同じ発現配列、５ｍｏＵ修飾、最適化ＵＴＲ、キャップ、及び／またはポリＡテールを含むｍＲＮＡよりも高い程度の発現を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも５時間、１０時間、１５時間、２０時間、３０時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間または８０時間の機能的半減期を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、５～８０、１０～７０、１５～６０、及び／または２０～５０時間の機能的半減期を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、同じタンパク質をコードする同等の直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドよりも長い（例えば、少なくとも１．５倍長い、少なくとも２倍長い）機能的半減期を有する。いくつかの実施形態では、機能的半減期は、機能的タンパク質合成の検出を通して評価することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも５時間、１０時間、１５時間、２０時間、３０時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間または８０時間の半減期を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、５～８０、１０～７０、１５～６０、及び／または２０～５０時間の半減期を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、同じタンパク質をコードする同等の直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドよりも長い（例えば、少なくとも１．５倍長い、少なくとも２倍長い）半減期を有する。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡポリヌクレオチド、またはその薬学的組成物は、既定の閾値のものよりも長いまたは同等のヒト細胞における機能的半減期を有する。いくつかの実施形態では機能的半減期は、機能的タンパク質アッセイによって決定される。例えば、いくつかの実施形態では、機能的半減期は、インビトロルシフェラーゼアッセイによって決定され、その場合、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）の活性が、１、２、３、４、５、６、７、または１４日にわたって１、２、６、１２、または２４時間毎に環状ＲＮＡポリヌクレオチドを発現するヒト細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）の培地において測定される。他の実施形態では、機能的半減期は、インビボアッセイによって決定され、その場合、環状ＲＮＡポリヌクレオチドの発現配列によってコードされるタンパク質のレベルが、１、２、３、４、５、６、７、または１４日にわたって１、２、６、１２、または２４時間毎に患者血清または組織試料において測定される。いくつかの実施形態では、既定の閾値は、環状ＲＮＡポリヌクレオチドと同じ発現配列を含む参照直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドの機能的半減期である。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡは、同等の直鎖状ｍＲＮＡよりも高い程度の発現、例えば、細胞へのＲＮＡの投与２４時間後により高い程度の発現を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡは、同じ発現配列、５ｍｏＵ修飾、最適化ＵＴＲ、キャップ、及び／またはポリＡテールを含むｍＲＮＡよりも高い程度の発現を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡは、生物の免疫系またはある特定のタイプの免疫細胞に曝露された場合、同等のｍＲＮＡよりも免疫原性が低くあり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡは、生物の免疫系またはある特定のタイプの免疫細胞に曝露された場合、サイトカインの産生の調節に関連している。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡは、生物の免疫系またはある特定のタイプの免疫細胞に曝露された場合、同じ発現配列を含むｍＲＮＡと比較して、ＴＮＦα、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮγ、及び／または１型インターフェロン、例えば、ＩＦＮ－β１の産生の低下に関連している。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡは、生物の免疫系またはある特定のタイプの免疫細胞に曝露された場合、同じ発現配列を含むｍＲＮＡと比較して、より少ないＴＮＦα、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮγ、及び／または１型インターフェロン、例えば、ＩＦＮ－β１の転写産物誘導に関連している。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡは、同じ発現配列を含むｍＲＮＡよりも免疫原性が低い。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡは、同じ発現配列、５ｍｏＵ修飾、最適化ＵＴＲ、キャップ、及び／またはポリＡテールを含むｍＲＮＡよりも免疫原性が低い。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、ヌクレオシド修飾を必要とせずに、同等の直鎖状ＲＮＡよりも高い安定性または機能的安定性を有するＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、ヌクレオシド修飾を欠くＲＮＡを産生する方法は、不稔転写の減少に起因するＲＮＡ含有ヌクレオシド修飾を産生する方法よりも高い割合の全長転写物を産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、ヌクレオシド修飾を含むＲＮＡに関連する不稔転写を追加することなく、大きな（例えば、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、または１５ｋｂ）ＲＮＡ構築物を産生することができる。

特定の実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡは、そのまま細胞へとトランスフェクトすることができる、またはＤＮＡベクターの形でトランスフェクトされて細胞内で転写されることができる。トランスフェクトされたＤＮＡベクターからの環状ＲＮＡの転写は、追加のポリメラーゼまたは細胞にトランスフェクトされた核酸によってコードされるポリメラーゼを介する、または好ましくは内因性ポリメラーゼを介することができる。

特定の実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡポリヌクレオチドは、修飾ＲＮＡヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、ｍ^５Ｃ（５－メチルシチジン）である。別の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、ｍ^５Ｕ（５－メチルウリジン）である。別の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、ｍ^６Ａ（Ｎ^６－メチルアデノシン）である。別の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、ｓ^２Ｕ（２－チオウリジン）である。別の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ψ（シュードウリジン）である。別の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｕｍ（２′－Ｏ－メチルウリジン）である。他の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、ｍ^１Ａ（１－メチルアデノシン）；ｍ^２Ａ（２－メチルアデノシン）；Ａｍ（２’－Ｏ－メチルアデノシン）；ｍｓ^２ｍ^６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ^６－メチルアデノシン）；ｉ^６Ａ（Ｎ^６－イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ^２ｉ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ^６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ^６Ａ（Ｎ^６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ^２ｉｏ^６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ^６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ^６Ａ（Ｎ^６－グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ^６Ａ（Ｎ^６－トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ^２ｔ^６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ^６－トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ^６ｔ^６Ａ（Ｎ^６－メチル－Ｎ^６－トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ^６Ａ（Ｎ^６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ^２ｈｎ^６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ^６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルアデノシン（ホスフェート））；Ｉ（イノシン）；ｍ^１Ｉ（１－メチルイノシン）；ｍ^１Ｉｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン）；ｍ^３Ｃ（３－メチルシチジン）；Ｃｍ（２’－Ｏ－メチルシチジン）；ｓ^２Ｃ（２－チオシチジン）；ａｃ^４Ｃ（Ｎ^４－アセチルシチジン）；ｆ^５Ｃ（５－ホルミルシチジン）；ｍ^５Ｃｍ（５，２′－Ｏ－ジメチルシチジン）；ａｃ^４Ｃｍ（Ｎ^４－アセチル－２’－Ｏ－メチルシチジン）；ｋ^２Ｃ（リシジン）；ｍ^１Ｇ（１－メチルグアノシン）；ｍ^２Ｇ（Ｎ^２－メチルグアノシン）；ｍ^７Ｇ（７－メチルグアノシン）；Ｇｍ（２′－Ｏ－メチルグアノシン）；ｍ^２ _２Ｇ（Ｎ^２，Ｎ^２－ジメチルグアノシン）；ｍ^２Ｇｍ（Ｎ^２，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）；ｍ^２ _２Ｇｍ（Ｎ^２，Ｎ^２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルグアノシン（ホスフェート））；ｙＷ（ワイブトシン）；ｏ_２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ＊（未修飾ヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ワイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルワイオシン）；Ｑ（ケウオシン）；ｏＱ（エポキシケウオシン）；ｇａｌＱ（ガラクトシル－ケウオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル－ケウオシン）；ｐｒｅＱ_０（７－シアノ－７－デアザグアノシン）；ｐｒｅＱ_１（７－アミノメチル－７－デアザグアノシン）；Ｇ^＋（アルカエオシン）；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ^５Ｕｍ（５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン）；ｓ^４Ｕ（４－チオウリジン）；ｍ^５ｓ^２Ｕ（５－メチル－２－チオウリジン）；ｓ^２Ｕｍ（２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ａｃｐ^３Ｕ（３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ^５Ｕ（５－ヒドロキシウリジン）；ｍｏ^５Ｕ（５－メトキシウリジン）；ｃｍｏ^５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ^５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ^５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））；ｍｃｈｍ^５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ^５Ｕ（５－メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ^５Ｕｍ（５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ｍｃｍ^５ｓ^２Ｕ（５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン）；ｎｍ^５Ｓ^２Ｕ（５－アミノメチル－２－チオウリジン）；ｍｎｍ^５Ｕ（５－メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ^５ｓ^２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン）；ｍｎｍ^５ｓｅ^２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン）；ｎｃｍ^５Ｕ（５－カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ^５Ｕｍ（５－カルバモイルメチル－２′－Ｏ－メチルウリジン）；ｃｍｎｍ^５Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｍｎｍ^５Ｕｍ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２′－Ｏ－メチルウリジン）；ｃｍｎｍ^５ｓ^２Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン）；ｍ^６ _２Ａ（Ｎ^６，Ｎ^６－ジメチルアデノシン）；Ｉｍ（２’－Ｏ－メチルイノシン）；ｍ^４Ｃ（Ｎ^４－メチルシチジン）；ｍ^４Ｃｍ（Ｎ^４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン）；ｈｍ^５Ｃ（５－ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ^３Ｕ（３－メチルウリジン）；ｃｍ^５Ｕ（５－カルボキシメチルウリジン）；ｍ^６Ａｍ（Ｎ^６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン）；ｍ^６ _２Ａｍ（Ｎ^６，Ｎ^６，Ｏ－２’－トリメチルアデノシン）；ｍ^２，７Ｇ（Ｎ^２，７－ジメチルグアノシン）；ｍ^{２，２，７}Ｇ（Ｎ^２，Ｎ^２，７－トリメチルグアノシン）；ｍ^３Ｕｍ（３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン）；ｍ^５Ｄ（５－メチルジヒドロウリジン）；ｆ^５Ｃｍ（５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン）；ｍ^１Ｇｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）；ｍ^１Ａｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン）；τｍ^５Ｕ（５－タウリノメチルウリジン）；τｍ^５ｓ^２Ｕ（５－タウリノメチル－２－チオウリジン））；ｉｍＧ－１４（４－デメチルワイオシン）；ｉｍＧ２（イソワイオシン）；またはａｃ^６Ａ（Ｎ^６－アセチルアデノシン）である。

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドには、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、５－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、２－メトキシ－アデニン、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンの群から選択される化合物が含まれ得る。別の実施形態では、修飾は、５－メチルシトシン、シュードウリジン及び１－メチルシュードウリジンからなる群から独立して選択される。

いくつかの実施形態では、修飾リボヌクレオシドは、５－メチルシチジン、５－メトキシウリジン、１－メチル－シュードウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、及び／またはシュードウリジンを含む。いくつかの実施形態では、かかる修飾ヌクレオシドは、さらなる安定性及び免疫活性化に対する耐性を提供する。

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化され得る。コドン最適化配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンが、ポリペプチドの発現、安定性及び／または活性を増加させるために、置換されている配列であり得る。コドン最適化に影響を与える因子には、（ｉ）２つ以上の生物もしくは遺伝子または合成的に構築されたバイアステーブル間のコドンバイアスの変動、（ｉｉ）生物、遺伝子、または遺伝子のセット内のコドンバイアスの程度の変動、（ｉｉｉ）状況を含むコドンの系統的変動、（ｉｖ）それらのデコードｔＲＮＡに従ったコドンの変動、（ｖ）トリプレットの全体的または１つの位置のいずれかで、ＧＣ％に従ったコドンの変動、（ｖｉ）例えば天然に存在する配列のような参照配列に対する類似度の変動、（ｖｉｉ）コドン頻度カットオフの変動、（ｖｉｉｉ）ＤＮＡ配列から転写されたｍＲＮＡの構造特性、（ｉｘ）コドン置換セットの設計に基づくＤＮＡ配列の機能に関する事前知識、及び／または（ｘ）各アミノ酸のコドンセットの系統的変動のうちの１つ以上が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、コドン最適化ポリヌクレオチドは、リボザイム衝突を最小化し得る及び／または発現配列とＩＲＥＳとの間の構造的干渉を制限し得る。

特定の実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡは、細胞の内側で産生される。いくつかの実施形態では、前駆体ＲＮＡは、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼによって細胞質中で、または宿主ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって核内で、ＤＮＡテンプレートを使用して（例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に提供するベクターを使用して）転写され、次に環状化される。

特定の実施形態では、本明細書に提供する環状ＲＮＡは、環状ＲＮＡ分子によってコードされるポリペプチドが動物の内側で発現されるように、動物（例えば、ヒト）に注射される。

３．ペイロード
いくつかの実施形態では、第１の発現配列は、治療用タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、第２の発現配列は、治療用タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質の一方または両方が、以下の表に列挙されたタンパク質から選択される。

いくつかの実施形態では、発現配列の少なくとも１つは、治療用タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、第１または第２の発現配列は、サイトカイン、例えば、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－ベータ、ＩＬ－４、またはＩＬ－３５、またはその機能的フラグメントをコードする。いくつかの実施形態では、第１または第２の発現配列は、免疫チェックポイント阻害剤をコードする。いくつかの実施形態では、第１または第２の発現配列は、アゴニスト（例えば、ＴＮＦＲファミリーメンバー、例えば、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＬＩＧＨＴ、またはＣＤ７０）をコードする。いくつかの実施形態では、第１または第２の発現配列は、キメラ抗原受容体をコードする。いくつかの実施形態では、第１または第２の発現配列は、阻害性受容体アゴニスト（例えば、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ガレクチン－９、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７Ｈ４、またはＭＨＣＩＩ）または阻害性受容体（例えば、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、またはＴＩＭ３）をコードする。いくつかの実施形態では、第１または第２の発現配列は、阻害性受容体アンタゴニストをコードする。いくつかの実施形態では、第１または第２の発現配列は、１つ以上のＴＣＲ鎖（アルファ及びベータ鎖またはガンマ及びデルタ鎖）をコードする。いくつかの実施形態では、第１または第２の発現配列は、分泌Ｔ細胞または免疫細胞エンゲージャー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ１３７、またはＣＤ２８及び腫瘍発現タンパク質、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＢＣＭＡなどを標的とするＢｉＴＥなどの二重特異性抗体）をコードする。いくつかの実施形態では、第１または第２の発現配列は、転写因子（例えば、ＦＯＸＰ３、ＨＥＬＩＯＳ、ＴＯＸ１、またはＴＯＸ２）をコードする。いくつかの実施形態では、第１または第２の発現配列は、免疫抑制性酵素（例えば、ＩＤＯまたはＣＤ３９／ＣＤ７３）をコードする。いくつかの実施形態では、第１または第２の発現配列は、ＧｖＨＤ（例えば、抗ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲ－Ｔｒｅｇ）をコードする。

いくつかの実施形態では、第１及び第２の発現配列は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖及びベータ鎖をコードする。いくつかの実施形態では、第１及び第２の発現配列は、ＴＣＲのガンマ鎖及びデルタ鎖をコードする。本発明は、がんに罹患している対象を処置する方法であって、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖またはＴＣＲガンマ鎖及びＴＣＲデルタ鎖をコードする環状ＲＮＡポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法を含む。

いくつかの実施形態では、第１及び第２の発現配列は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＰＤ１またはＰＤＬ１のアンタゴニストをコードする。いくつかの実施形態では、第１及び第２の発現配列は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びサイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－ベータ、ＩＬ－４、またはＩＬ－３５、またはその機能的フラグメントである。本発明は、がんに罹患している対象を処置する方法であって、ＣＡＲ及びＰＤ１またはＰＤＬ１のアンタゴニストをコードする環状ＲＮＡポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法を含む。本発明は、がんに罹患している対象を処置する方法であって、ＣＡＲ及びサイトカインをコードする環状ＲＮＡポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法を含む。

いくつかの実施形態では、第１及び第２の発現配列は、転写因子及びサイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＦＯＸＰ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、またはＨＥＬＩＯＳであり、サイトカインは、ＩＬ１０、ＩＬ１２、またはＴＧＦベータである。本発明は、自己免疫障害に罹患している対象を処置する方法であって、転写因子、例えば、ＦＯＸＰ３及びサイトカインをコードする環状ＲＮＡポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法を含む。

いくつかの実施形態では、第１及び第２の発現配列は、転写因子及びＣＡＲをコードする。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＦＯＸＰ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、またはＨＥＬＩＯＳである。本発明は、自己免疫障害に罹患している対象を処置する方法であって、転写因子、例えば、ＦＯＸＰ３及びＣＡＲをコードする環状ＲＮＡポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法を含む。

いくつかの実施形態では、第１及び第２の発現配列は、サイトカイン及び抗原をコードする。いくつかの実施形態では、サイトカインが、ＩＦＮγである。いくつかの実施形態では、抗原が、新生抗原である。本発明は、がんに罹患している対象を処置する方法であって、サイトカイン、例えば、ＩＦＮγ、及び腫瘍抗原またはそのフラグメントをコードする環状ＲＮＡポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法を含む。

いくつかの実施形態では、第１の発現配列は、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、第２の発現配列は、第２のＣＡＲをコードする。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲは、第１の抗原に特異的であり、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、第２のＣＡＲは、第２の抗原と特異的であり、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、複数の腫瘍抗原を標的とするＣＡＲを発現することは、異種抗原発現を伴う腫瘍に対してより効果的な治療を提供する。本発明は、がんに罹患している対象を処置する方法であって、第１のＣＡＲ及び第２のＣＡＲをコードする環状ＲＮＡポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法を含む。

いくつかの実施形態では、第１の発現配列は、第１のサイトカインをコードし、第２の発現配列は、第２のサイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、第１及び第２のサイトカインは、ＩＬ－１０、ＴＧＦβ、及びＩＬ－３５の群にある。いくつかの実施形態では、第１及び第２のサイトカインは、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の群にある。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つを超える遺伝子によってコードされるサブユニットから構成されるタンパク質をコードする。例えば、タンパク質は、タンパク質の各鎖またはサブユニットが別個の遺伝子によってコードされているヘテロダイマーであり得る。１つを超えるｃｉｒｃＲＮＡ分子が輸送ビヒクルにて送達され、各ｃｉｒｃＲＮＡがタンパク質の別個のサブユニットをコードすることが可能である。代替的に、単一のｃｉｒｃＲＮＡを操作して、１つより多いサブユニットをコードし得る。特定の実施形態では、個々のサブユニットをコードする別個のｃｉｒｃＲＮＡ分子は、別個の輸送ビヒクルにて投与され得る。

３．１ サイトカイン
ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２７β、ＩＦＮγ、及び／またはＴＧＦβ１の説明及び／またはアミノ酸配列は、本明細書及びｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇデータベースにおいてアクセッション番号：Ｐ６０５６８（ＩＬ－２）、Ｐ２９４５９（ＩＬ－１２Ａ）、Ｐ２９４６０（ＩＬ－１２Ｂ）、Ｐ１３２３２（ＩＬ－７）、Ｐ２２３０１（ＩＬ－１０）、Ｐ４０９３３（ＩＬ－１５）、Ｑ１４１１６（ＩＬ－１８）、Ｑ１４２１３（ＩＬ－２７β）、Ｐ０１５７９（ＩＦＮγ）、及び／またはＰ０１１３７（ＴＧＦβ１）で提供される。

３．２ ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、またはニボルマブである。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、国際特許公開第ＷＯ２００６／１２１１６８号に記載されている。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、Ｗ０２００９／１１４３３５に記載されている。いくつかの実施形態では、ピジリズマブは、国際特許公開第ＷＯ２００９／１０１６１１号に記載されている。追加の抗ＰＤ１抗体は、米国特許第８，６０９，０８９号、米国特許公開第ＵＳ２０１００２８３３０号及び同第ＵＳ２０１２０１１４６４９号、ならびに国際特許公開第ＷＯ２０１０／０２７８２７号及び同第ＷＯ２０１１／０６６３４２号に記載されている。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、またはＣＫ－３０１である。

ＰＤ－１、及び／またはＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖及び軽鎖の説明及び／またはアミノ酸配列は、本明細書で及びｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａデータベースにおいてアクセッション番号：ＤＢ０９０３７（ペムブロリズマブ）、ＤＢ０９０３５（ニボルマブ）、ＤＢ１５３８３（ピジリズマブ）、ＤＢ１１５９５（アテゾリズマブ）、ＤＢ１１９４５（アベルマブ）、及びＤＢ１１７１４（デュルバルマブ）で提供される。

３．３キメラ抗原受容体
キメラ抗原受容体（ＣＡＲまたはＣＡＲ－Ｔ）は、遺伝子操作された受容体である。これらの操作された受容体は、本明細書に記載するような環状ＲＮＡを介してＴ細胞を含む免疫細胞に挿入され得る及び免疫細胞によって発現され得る。ＣＡＲを使用すると、単一の受容体をプログラムして、両方が特定の抗原を認識し、その抗原に結合すると、免疫細胞を活性化してその抗原を持つ細胞を攻撃及び破壊することができる。これらの抗原が腫瘍細胞上に存在する場合、ＣＡＲを発現する免疫細胞は、腫瘍細胞を標的とし、殺傷し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＡＲは、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する抗原結合分子、（ｉｉ）ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメイン、ならびに（ｉｉｉ）活性化ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、本開示に従うＣＡＲの配向は、抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖなど）を共刺激ドメイン及び活性化ドメインとタンデムに含む。共刺激ドメインは、細胞外部分、膜貫通部分、及び細胞内部分のうちの１つ以上を含み得る。他の実施形態では、複数の共刺激ドメインをタンデムで利用し得る。

抗原結合ドメイン
ＣＡＲは、標的抗原と相互作用する抗原結合分子を組み込むことによって、抗原（細胞表面抗原など）に結合するように操作され得る。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、その抗体フラグメント、例えば、１つ以上の一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、互いに連結した抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を有する一本鎖抗体フラグメントである。例えば、米国特許第７，７４１，４６５号及び同第６，３１９，４９４号、ならびにＥｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（１９９７）４５：１３１－１３６を参照されたい。ｓｃＦｖは、標的抗原と特異的に相互作用する親抗体の能力を保持する。ｓｃＦｖは、他のＣＡＲ構成要素とともに一本鎖の一部として発現するように操作され得るため、キメラ抗原受容体で有用である。Ｉｄ．Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅ １８８，Ｎｏ．４，１９９８（６１９－６２６）；Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１６１：２７９１－２７９７も参照されたい。抗原結合分子が、典型的には、目的の抗原を認識して結合することができるように、ＣＡＲの細胞外部分内に含有されることが理解されるであろう。二重特異性及び多重特異性ＣＡＲは、本発明の範囲内で企図され、１つより多い目的の標的に対する特異性を伴う。

いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、一本鎖を含み、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、リンカーによって接続されている。いくつかの実施形態では、ＶＨはリンカーのＮ末端に位置し、ＶＬはリンカーのＣ末端に位置する。他の実施形態では、ＶＬはリンカーのＮ末端に位置し、ＶＨはリンカーのＣ末端に位置する。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも約５、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１３、少なくとも約１５、少なくとも約１８、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、または少なくとも約１００アミノ酸を含む。

いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、ナノボディを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、ＤＡＲＰｉｎを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、標的タンパク質に特異的に結合することが可能なアンチカリンまたは他の合成タンパク質を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、群ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、Ｃ型レクチン様分子－１、ＣＤ３３、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧＤ３、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）、Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）または（ＧａＩＮＡｃａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＫＩＴ（ＣＤ１１７）、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２、メソセリン、インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１Ｒａ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プロテアーゼセリン２１、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ルイス（Ｙ）抗原、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ－ベータ）、ステージ特異的胚性抗原－４（ＳＳＥＡ－４）、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、プロスターゼ、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、伸長因子２変異（ＥＬＦ２Ｍ）、エフリンＢ２、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸アンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、ベータタイプ、９（ＬＭＰ２）、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、ブレークポイントクラスター領域（ＢＣＲ）及びアベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなる癌遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ－ａｂｌ）、チロシナーゼ、エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）、フコシルＧＭ１、シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）、ガングリオシドＧＭ３、トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）、ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）、葉酸受容体ベータ、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、クローディン６（ＣＬＤＮ６）、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、ポリシアル酸、胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）、ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）、乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）、ウロプラキン２（ＵＰＫ２）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）、アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）、パネキシン３（ＰＡＮＸ３）、Ｇタンパク質共役型受容体２０（ＧＰＲ２０）、リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）、嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）、ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）、ＭＡＧＥファミリーメンバー（ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３及びＭＡＧＥ－Ａ４を含む）、ＥＴＳ転座バリアント遺伝子６、染色体１２ｐに位置（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）、精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）、Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）、アンギオポイエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）、黒色腫癌精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）、黒色腫癌精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）、Ｆｏｓ関連抗原１、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ｐ５３変異体、プロスタイン、サバイビン、テロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１、Ｔ細胞１によって認識される黒色腫抗原、ラット肉腫（Ｒａｓ）変異体、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、肉腫転座ブレークポイント、アポトーシスの黒色腫阻害因子（ＭＬ－ＩＡＰ）、ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）、ペアボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ｖ－ｍｙｃトリ骨髄細胞腫症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）、ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）、チトクロームＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）、ＣＣＣＴＣ結合因子（亜鉛フィンガータンパク質）様、Ｔ細胞３により認識される扁平上皮細胞癌抗原（ＳＡＲＴ３）、ペアボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）、プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）、Ａキナーゼ固定タンパク質４（ＡＫＡＰ－４）、滑膜肉腫、Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）、進行型糖化末端産物の受容体（ＲＡＧＥ－１）、腎臓ユビキタス１（ＲＵ１）、腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）、レグマイン、ヒト乳頭腫ウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）、ヒト乳頭腫ウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）、腸カルボキシルエステラーゼ、ヒートショックタンパク質７０－２変異（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）、ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）、骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）、リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、ＭＵＣ１６、５Ｔ４、８Ｈ９、ανβθインテグリン、αｖβ６インテグリン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｂ７－Ｈ６、ｃａ－１２５、ＣＡ９、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ５２、Ｅ－カドヘリン、ＥＭＡ（上皮膜抗原）、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、ＥｒｂＢ４、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ｋ－軽鎖、Ｌ１細胞接着分子、ＭＵＣ１８、ＮＫＧ２Ｄ、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、腫瘍／精巣抗原１Ｂ、ＧＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＢＡＧＥ、ＳＣＰ－１、ＣＴＺ９、ＳＡＧＥ、ＣＡＧＥ、ＣＴ１０、ＭＡＲＴ－１、免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）、Ｂ型肝炎表面抗原結合タンパク質（ＨＢｓＡｇ）、ウイルスキャプシド抗原（ＶＣＡ）、初期抗原（ＥＡ）、ＥＢＶ核抗原（ＥＢＮＡ）、ＨＨＶ－６ ｐ４１初期抗原、ＨＨＶ－６Ｂ Ｕ９４潜伏抗原、ＨＨＶ－６Ｂ ｐ９８後期抗原、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、ラージＴ抗原、スモールＴ抗原、アデノウイルス抗原、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原、血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、パラインフルエンザ１型抗原、パラインフルエンザ２型抗原、パラインフルエンザ３型抗原、パラインフルエンザ４型抗原、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コア抗原、ＨＩＶ ｐ２４抗原、ヒトＴ細胞リンパ栄養性ウイルス（ＨＴＬＶ－１）抗原、メルケル細胞ポリオーマウイルススモールＴ抗原、メルケル細胞ポリオーマウイルスラージＴ抗原、ならびにカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）溶解性核抗原及びＫＳＨＶ潜伏核抗原から選択される抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号３２１及び／または３２２を含む。

ヒンジ／スペーサードメイン
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、ヒンジまたはスペーサードメインを含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ／スペーサードメインは、短縮型ヒンジ／スペーサードメイン（ＴＨＤ）を含み得、ＴＨＤドメインは、完全なヒンジ／スペーサードメイン（「ＣＨＤ」）の短縮バージョンである。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、ＥｒｂＢ２、グリコホリンＡ（ＧｐＡ）、ＣＤ２、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８［Ｔ ＣＤｌ １ａ（ＩＴ ＧＡＬ）、ＣＤｌ １ｂ（ＩＴ ＧＡＭ）、ＣＤｌ １ｃ（ＩＴＧＡＸ）、ＣＤｌ １ｄ（ＩＴ ＧＡＤ）、ＣＤ１８（ＩＴＧＢ２）、ＣＤ１９（Ｂ４）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｔ、ＣＤ２９（ＩＴＧＢ１）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）、ＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ４９ａ（ＩＴＧＡ１）、ＣＤ４９ｄ（ＩＴＧＡ４）、ＣＤ４９ｆ（ＩＴＧＡ６）、ＣＤ６６ａ（ＣＥＡＣＡＭ１）、ＣＤ６６ｂ（ＣＥＡＣＡＭ８）、ＣＤ６６ｃ（ＣＥＡＣＡＭ６）、ＣＤ６６ｄ（ＣＥＡＣＡＭ３）、ＣＤ６６ｅ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＤ６９（ＣＬＥＣ２）、ＣＤ７９Ａ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連アルファ鎖）、ＣＤ７９Ｂ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連ベータ鎖）、ＣＤ８４（ＳＬＡＭＦ５）、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３（ＩＴＧＡＥ）、ＣＤ１３４（０Ｘ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５８Ａ（ＫＩＲ２ＤＬ１）、ＣＤ１５８Ｂ１（ＫＩＲ２ＤＬ２）、ＣＤ１５８Ｂ２（ＫＩＲ２ＤＬ３）、ＣＤ１５８Ｃ（ＫＩＲ３ＤＰ１）、ＣＤ１５８Ｄ（ＫＩＲＤＬ４）、ＣＤ１５８Ｆ１（ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ）、ＣＤ１５８Ｆ２（ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ）、ＣＤ１５８Ｋ（ＫＩＲ３ＤＬ２）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１６２（ＳＥＬＰＬＧ）、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ２２９（ＳＬＡＭＦ３）、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４）、ＣＤ２４７（ＣＤ３－ゼータ）、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＣＤ２６８（ＢＡＦＦＲ）、ＣＤ２７０（ＴＮＦＳＦ１４）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７９（ＰＤ－１）、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３１９（ＳＬＡＭＦ７）、ＣＤ３３５（ＮＫ－ｐ４６）、ＣＤ３３６（ＮＫ－ｐ４４）、ＣＤ３３７（ＮＫ－ｐ３０）、ＣＤ３５２（ＳＬＡＭＦ６）、ＣＤ３５３（ＳＬＡＭＦ８）、ＣＤ３５５（ＣＲＴ ＡＭ）、ＣＤ３５７（ＴＮＦＲＳＦ１８）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＬＦＡ－１（ＣＤｌ １ａ／ＣＤ１８）、ＮＫＧ２Ｃ、ＤＡＰ－１０、ＩＣＡＭ－１、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＬＦＡ－１、ＳＬＡＭＦ９、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ（ＧｒｐＬ）、ＳＬＰ－７６（ＬＣＰ２）、ＰＡＧ１／ＣＢＰ、ＣＤ８３リガンド、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＭＨＣクラス２分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、活性化ＮＫ細胞受容体、トールリガンド受容体、及びそのフラグメントまたは組み合わせからであるまたはそれに由来する（例えば、その全てまたはそのフラグメントを含む）。ヒンジまたはスペーサードメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。

いくつかの実施形態では、ヒンジまたはスペーサードメインは、抗原結合分子（例えば、ｓｃＦｖ）と膜貫通ドメインとの間に配置される。この配向では、ヒンジ／スペーサードメインは、抗原結合分子とＣＡＲが発現される細胞膜の表面との間に距離をもたらす。いくつかの実施形態では、ヒンジまたはスペーサードメインは、免疫グロブリンからであるまたはこれに由来する。いくつかの実施形態では、ヒンジまたはスペーサードメインは、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭまたはそのフラグメントのヒンジ／スペーサー領域から選択される。いくつかの実施形態では、ヒンジまたはスペーサードメインは、ＣＤ８アルファのヒンジ／スペーサー領域を含む、からである、またはこれに由来する。いくつかの実施形態では、ヒンジまたはスペーサードメインは、ＣＤ２８のヒンジ／スペーサー領域を含む、からである、またはこれに由来する。いくつかの実施形態では、ヒンジまたはスペーサードメインは、ＣＤ８アルファのヒンジ／スペーサー領域のフラグメントまたはＣＤ２８のヒンジ／スペーサー領域のフラグメントを含み、フラグメントは全ヒンジ／スペーサー領域よりも小さい任意のものである。いくつかの実施形態では、ＣＤ８アルファヒンジ／スペーサー領域のフラグメントまたはＣＤ２８ヒンジ／スペーサー領域のフラグメントは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個のアミノ酸を、ＣＤ８アルファヒンジ／スペーサー領域またはＣＤ２８ヒンジ／スペーサー領域の、Ｎ末端もしくはＣ末端にてまたはその両方にて除外するアミノ酸配列を含む。

膜貫通ドメイン
本開示のＣＡＲは、膜貫通ドメイン及び／または細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含み得る。膜貫通ドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合するように設計され得る。同様に、ＣＡＲの細胞内ドメインに融合し得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ内のドメインの１つに天然に関連する膜貫通ドメインが使用される。いくつかの例では、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのかかるドメインの結合を回避するように選択または（例えば、アミノ酸置換によって）修飾され得る。膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。

膜貫通領域は、受容体チロシンキナーゼ（例えば、ＥｒｂＢ２）、グリコホリンＡ（ＧｐＡ）、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、活性化ＮＫ細胞受容体、免疫グロブリンタンパク質、Ｂ７－Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＦＡＭＥ（ＳＥＡＭＦ８）、ＢＴＥＡ、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２、ＣＤ２４７、ＣＤ２７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３０、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１ ｌａ、ＣＤ１ ｌｂ、ＣＤ１ ｌｃ、ＣＤ１ ｌｄ、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、サイトカイン受容体、ＤＡＰ－１０、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｆｃガンマ受容体、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＥＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＩＥ－２Ｒベータ、ＩＥ－２Ｒガンマ、ＩＥ－７Ｒアルファ、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、インテグリン、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴ ＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴ ＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＩＴＧＢ１、ＫＩＲＤＳ２、ＥＡＴ、ＬＦＡ－１、ＬＦＡ－１、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＬＩＧＨＴ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１；ＣＤｌ－１ａ／ＣＤ１８）、ＭＨＣクラス１分子、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＯＸ－４０、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）、ＰＳＧＬ１、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１；ＣＤ１５０；ＩＰＯ－３）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４；２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ；Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ－７６、ＴＮＦ受容体タンパク質、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＳＦ１４、トールリガンド受容体、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ１、もしくはＶＬＡ－６、またはそのフラグメント、トランケーション、もしくは組み合わせに由来し（すなわち、含み）得る。

いくつかの実施形態では、好適な細胞内シグナル伝達ドメインには、活性化マクロファージ／骨髄細胞受容体ＣＳＦＲ１、ＭＹＤ８８、ＣＤ１４、ＴＩＥ２、ＴＬＲ４、ＣＲ３、ＣＤ６４、ＴＲＥＭ２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ１６９、ＤＥＣＴＩＮ１、ＣＤ２０６、ＣＤ４７、ＣＤ１６３、ＣＤ３６、ＭＡＲＣＯ、ＴＩＭ４、ＭＥＲＴＫ、Ｆ４／８０、ＣＤ９１、Ｃ１ＱＲ、ＬＯＸ－１、ＣＤ６８、ＳＲＡ、ＢＡＩ－１、ＡＢＣＡ７、ＣＤ３６、ＣＤ３１、ラクトフェリン、またはそのフラグメント、トランケーション、もしくは組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。

いくつかの実施形態では、受容体チロシンキナーゼは、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）、インスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、インスリン受容体関連受容体（ＩＲＲ）、血小板由来成長因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲａ）、血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲｆｉ）、ＫＩＴ癌原遺伝子受容体チロシンキナーゼ（Ｋｉｔ）、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦＲ）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ＶＥＧＦＲ－１）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＶＥＧＦＲ－２）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ４（ＶＥＧＦＲ－３）、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、線維芽細胞成長因子受容体２（ＦＧＦＲ２）、線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、線維芽細胞成長因子受容体４（ＦＧＦＲ４）、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＣＣＫ４）、神経栄養受容体チロシンキナーゼ１（ｔｒｋＡ）、神経栄養受容体チロシンキナーゼ２（ｔｒｋＢ）、神経栄養受容体チロシンキナーゼ３（ｔｒｋＣ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体２（ＲＯＲ２）、筋肉関連受容体チロシンキナーゼ（ＭｕＳＫ）、ＭＥＴ癌原遺伝子、受容体チロシンキナーゼ（ＭＥＴ）、マクロファージ刺激１受容体（Ｒｏｎ）、ＡＸＬ受容体チロシンキナーゼ（Ａｘｌ）、ＴＹＲ０３タンパク質チロシンキナーゼ（Ｔｙｒｏ３）、ＭＥＲ癌原遺伝子、チロシンキナーゼ（Ｍｅｒ）、免疫グロブリン様及びＥＧＦ様ドメイン１を伴うチロシンキナーゼ（ＴＩＥ１）、ＴＥＫ受容体チロシンキナーゼ（ＴＩＥ２）、ＥＰＨ受容体Ａ１（ＥｐｈＡｌ）、ＥＰＨ受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）、（ＥＰＨ受容体Ａ３）ＥｐｈＡ３、ＥＰＨ受容体Ａ４（ＥｐｈＡ４）、ＥＰＨ受容体Ａ５（ＥｐｈＡ５）、ＥＰＨ受容体Ａ６（ＥｐｈＡ６）、ＥＰＨ受容体Ａ７（ＥｐｈＡ７）、ＥＰＨ受容体Ａ８（ＥｐｈＡ８）、ＥＰＨ受容体Ａ１０（ＥｐｈＡｌ０）、ＥＰＨ受容体Ｂ１（ＥｐｈＢｌ）、ＥＰＨ受容体Ｂ２（ＥｐｈＢ２）、ＥＰＨ受容体Ｂ３（ＥｐｈＢ３）、ＥＰＨ受容体Ｂ４（ＥｐｈＢ４）、ＥＰＨ受容体Ｂ６（ＥｐｈＢ６）、ｒｅｔプロト腫瘍遺伝子（Ｒｅｔ）、受容体様チロシンキナーゼ（ＲＹＫ）、ディスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ１（ＤＤＲ１）、ディスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ２（ＤＤＲ２）、ｃ－ｒｏｓ癌遺伝子１、受容体チロシンキナーゼ（ＲＯＳ）、アポトーシス関連チロシンキナーゼ（Ｌｍｒｌ）、レムールチロシンキナーゼ２（Ｌｍｒ２）、レムールチロシンキナーゼ３（Ｌｍｒ３）、白血球受容体チロシンキナーゼ（ＬＴＫ）、ＡＬＫ受容体チロシンキナーゼ（ＡＬＫ）、またはセリン／スレオニン／チロシンキナーゼ１（ＳＴＹＫ１）に由来し（例えば、含み）得る。

共刺激ドメイン
特定の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインには、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、もしくはその両方、及び／または細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが含まれる。好ましい実施形態では、共刺激ドメインは、ヒトＣＤ２８、ヒト４－１ＢＢ、またはその両方であり、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ゼータ（ζ）である。４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３ゼータ、またはこれらのいずれかは、それぞれ４－１ＢＢ、ＣＤ２８、またはＣＤ３ゼータ全体よりも少なく含まれ得る。キメラ抗原受容体は、それらの効力を増加させるために共刺激（シグナル伝達）ドメインを組み込み得る。米国特許第７，７４１，４６５号、及び同第６，３１９，４９４号、ならびにＫｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．ａｎｄ Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（上述），Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１９：６９６－７０６（２０１２）；Ｋａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．３：９５（２０１１）；Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：７２５－３３（２０１１）、及びＧｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｕｒ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．５６：５９－８３（２０１６）を参照されたい。

いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、配列番号３１８または３２０のアミノ酸配列を含む。

細胞内シグナル伝達ドメイン
本明細書に開示する操作されたＴ細胞の細胞内（シグナル伝達）ドメインは、活性化ドメインへのシグナル伝達を提供し得、これは次に免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つを活性化する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはヘルパー活性、例えばサイトカインの分泌であり得る。

いくつかの実施形態では、好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、活性化ＮＫ細胞受容体、免疫グロブリンタンパク質、Ｂ７－Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＢＴＬＡ、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２、ＣＤ２４７、ＣＤ２７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３０、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８４、ＣＤ８ａｌｐｈａ、ＣＤ８ｂｅｔａ、ＣＤ９６（タクタイル）、ＣＤ１ ｌａ、ＣＤ１ ｌｂ、ＣＤ１ ｌｃ、ＣＤ１ Ｉｄ、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、サイトカイン受容体、ＤＡＰ－１０、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｆｃガンマ受容体、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、インテグリン、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴ ＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴ ＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＩＴＧＢ１、ＫＩＲＤＳ２、ＬＡＴ、ＬＦＡ－１、ＬＦＡ－１、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＬＩＧＨＴ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、Ｌｙｌ０８）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１；ＣＤｌ－ｌａ／ＣＤ１８）、ＭＨＣクラス１分子、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＯＸ－４０、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、プログラム死－１（ＰＤ－１）、ＰＳＧＬ１、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、シグナル伝達リンパ球性活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１；ＣＤ１５０；ＩＰＯ－３）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４；２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ－７６、ＴＮＦ受容体タンパク質、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＳＦ１４、トールリガンド受容体、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ１、またはＶＬＡ－６、またはそのフラグメント、トランケーション、もしくは組み合わせが含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅ）（例えば、含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ））が、これに限定されない。

ＣＤ３は、ネイティブＴ細胞上のＴ細胞受容体のエレメントであり、ＣＡＲにおいて重要な細胞内活性化エレメントであることが示されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ３は、ＣＤ３ゼータである。いくつかの実施形態では、活性化ドメインは、配列番号３１９のポリペプチド配列に対して、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

３．４ Ｔ細胞受容体
ＴＣＲは、国際免疫遺伝学（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ；ＩＭＧＴ）ＴＣＲ命名法、及びＴＣＲ配列のＩＭＧＴ公共データベースへのリンクを使用して表される。ネイティブアルファ－ベータヘテロ二量体ＴＣＲは、アルファ鎖及びベータ鎖を有する。概して、各鎖は、可変、結合及び定常領域を含み得、ベータ鎖はまた通常、可変領域と結合領域との間に短い多様性領域を含有するが、この多様性領域はしばしば、結合領域の一部とみなされる。各可変領域は、フレームワーク配列に埋め込まれた３つのＣＤＲ（相補性決定領域）を含み得、１つはＣＤＲ３と名づけられた超可変領域である。それらのフレームワーク、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列によって、及び部分的に定義されるＣＤＲ３配列によって区別されるいくつかのタイプのアルファ鎖可変（Ｖα）領域及びいくつかのタイプのベータ鎖可変（Ｖβ）領域が存在する。Ｖαタイプは、ＩＭＧＴ命名法で独自のＴＲＡＶ番号によって称される。ゆえに、「ＴＲＡＶ２１」は、独自のフレームワークならびにＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列と、ＴＣＲ間で保存されたアミノ酸配列によって部分的に定義されるがＴＣＲ間で変動するアミノ酸配列も含むＣＤＲ３配列とを有するＴＣＲ Ｖα領域を定義する。同じように、「ＴＲＢＶ５－１」は、独自のフレームワークならびにＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列を有するが、部分的にのみ定義されたＣＤＲ３配列を有するＴＣＲ Ｖβ領域を定義する。

ＴＣＲの結合領域は、同様に、独自のＩＭＧＴ ＴＲＡＪ及びＴＲＢＪ命名法によって定義され、定常領域は、ＩＭＧＴ ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ命名法によって定義される。

ベータ鎖多様性領域は、ＩＭＧＴ命名法では、略語ＴＲＢＤと称され、述べたように、連結したＴＲＢＤ／ＴＲＢＪ領域はしばしば、一緒に結合領域とみなされる。

ＩＭＧＴ命名法によって定義される独自の配列は広く知られており、ＴＣＲの分野で働く人々にとってアクセス可能である。例えば、それらは、ＩＭＧＴ公共データベースで見ることができる。“Ｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ”，（２００１）ＬｅＦｒａｎｃ ａｎｄ ＬｅＦｒａｎｃ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ ０－１２－４４１３５２－８もまた、ＩＭＧＴ命名法によって定義された配列を開示しているが、その公開日及び結果として生じるタイムラグのため、その中の情報は、ＩＭＧＴデータベースへの参照によって確認する必要がある。

ネイティブＴＣＲは、ヘテロ二量体αβまたはγδ形態で存在する。しかしながら、ααまたはββホモ二量体からなる組換えＴＣＲは、ペプチドＭＨＣ分子に結合することが以前に示されている。そのため、本発明のＴＣＲは、ヘテロ二量体αβＴＣＲであり得、またはααもしくはββホモ二量体ＴＣＲであり得る。

養子療法において使用するため、αβヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、細胞質及び膜貫通ドメインの両方を有する全長鎖としてトランスフェクトされ得る。特定の実施形態では、本発明のＴＣＲは、例えば、ＷＯ２００６／０００８３０に記載されているように、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合を有し得る。

本発明のＴＣＲ、特にアルファ－ベータヘテロ二量体ＴＣＲは、アルファ鎖ＴＲＡＣ定常ドメイン配列及び／またはベータ鎖ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列を含み得る。アルファ及びベータ鎖定常ドメイン配列は、ＴＲＡＣのエクソン２のＣｙｓ４とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のエクソン２のＣｙｓ２との間のネイティブジスルフィド結合を欠失させるための切断または置換によって修飾され得る。アルファ及び／またはベータ鎖定常ドメイン配列（複数可）はまた、ＴＲＡＣのＴｈｒ ４８及びＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のＳｅｒ５７のシステイン残基での置換によって修飾され得、当該システインは、ＴＣＲのアルファとベータ定常ドメインとの間のジスルフィド結合を形成する。

結合親和性（平衡定数Ｋ_Ｄに対して反比例する）及び結合半減期（Ｔ１／２として表される）は、任意の適切な方法によって決定され得る。ＴＣＲの親和性を２倍にすると、Ｋ_Ｄが半分になることが理解される。Ｔ１／２は、ｌｎ２をオフ率（ｋｏｆｆ）で除算したものとして計算される。そのため、Ｔ１／２を２倍にすると、ｋｏｆｆが半分になる。ＴＣＲについてのＫ_Ｄ及びｋｏｆｆ値は通常、ＴＣＲの可溶性形態、すなわち、細胞質及び膜貫通ドメイン残基を除去するように切断されたそれらの形態について測定される。そのため、所与のＴＣＲは、そのＴＣＲの可溶性形態が当該特徴を有する場合、親ＴＣＲについて改善した結合親和性、及び／または結合半減期を有することを理解されたい。好ましくは所与のＴＣＲの結合親和性または結合半減期は、同じアッセイプロトコルを使用して数回、例えば、３回またはそれ以上測定され、結果の平均が取得される。

本発明のＴＣＲは、養子療法における実用性を有するので、本発明は、本発明のＴＣＲを提示する、天然に存在しない及び／または精製された及び／または操作された細胞、特にＴ細胞を含む。本発明のＴＣＲをコードする核酸（ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡなど）でのＴ細胞のトランスフェクションに好適な多数の方法が存在する（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：６１１６－６１３１を参照されたい）。本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞は、がん（膵臓及び肝臓のものなど）の養子療法ベースの処置において使用するのに好適である。当業者に知られているように、養子療法が行われ得る多数の好適な方法が存在する（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ８（４）：２９９－３０８を参照されたい）。

当該技術分野でよく知られているように、本発明のＴＣＲは、トランスフェクトされた細胞によって発現する場合、翻訳後修飾に供され得る。グリコシル化は、ＴＣＲ鎖における定義されたアミノ酸に対するオリゴ糖部位の共有結合を含み得る、１つのかかる修飾である。例えば、アスパラギン残基、またはセリン／スレオニン残基は、オリゴ糖結合のためのよく知られた位置である。特定のタンパク質のグリコシル化状態は、所定の酵素のタンパク質配列、タンパク質コンフォメーション及び利用可能性を含む多数の要因に依存する。さらに、グリコシル化状態（すなわち、オリゴ糖タイプ、共有結合及び結合の総数）は、タンパク質機能に影響を及ぼし得る。そのため、組換えタンパク質を産生する場合、グリコシル化を制御することがしばしば望ましい。トランスフェクトされたＴＣＲのグリコシル化は、トランスフェクトされた遺伝子の変異によって制御され得る（Ｋｕｂａｌｌ Ｊ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０６（２）：４６３－４７５）。かかる変異も本発明に包含される。

ＴＣＲは、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ａ１３、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７、ＧＡＧＥ－８、ＢＡＧＥ－１、ＲＡＧＥ－１、ＬＢ３３／ＭＵＭ－１、ＰＲＡＭＥ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ－Ｘｐ２（ＭＡＧＥ－Ｂ２）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ３（ＭＡＧＥ－Ｂ３）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ４（ＡＧＥ－Ｂ４）、チロシナーゼ、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、Ｍｅｌａｎ－Ａ、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－２（ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０）、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－４、ＳＳＸ－５、ＳＣＰ－１、ＣＴ－７、アルファ－アクチニン－４、Ｂｃｒ－Ａｂｌ融合タンパク質、Ｃａｓｐ－８、ベータ－カテニン、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｏａ－１、ｄｅｋ－ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦ２、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１融合タンパク質、ＬＤＬＲ－フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ１１、ｈｓｐ７０－２、ＫＩＡＡＯ２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ－２、及び３、ｎｅｏ－ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ－９、ｐｍｌ－ＲＡＲａ融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ－ｒａｓ、Ｎ－ｒａｓ、トリオースホスフェートイソメラス、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ－Ｋ－ｍｅｌ、Ｌａｇｅ－１、Ｍａｇｅ－Ｃ２、ＮＡ－８８、Ｌａｇｅ－２、ＳＰ１７、及びＴＲＰ２－Ｉｎｔ２、（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ｐ１５（５８）、ＣＥＡ、ＮＹ－ＥＳＯ（ＬＡＧＥ）、ＳＣＰ－１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ－４０、ｐ５３、Ｈ－Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２－４、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ベータ－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、テロメラーゼ、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α－フェトプロテイン、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３（ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ＼１７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０（Ｍａｃ－２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及びＴＰＳの群における抗原に特異的であり得る。

３．５ 転写因子
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、ホメオスタシスの維持、炎症反応の程度及び継続期間の制御、及び自己免疫性及びアレルギー性反応の防止において重要である。

通常、Ｔｒｅｇは、主に免疫反応の抑制に関与し、過剰な反応を防ぐための免疫系の「セルフチェック」として部分的に機能すると考えられている。特に、Ｔｒｅｇは、自己抗原、花粉または食品などの無害な物質に対する許容性を維持し、自己免疫疾患を阻止するのに関与する。

Ｔｒｅｇは、限定されないが、腸、皮膚、肺、及び肝臓を含めて、全身にわたって見られる。また、Ｔｒｅｇ細胞はまた、脾臓、リンパ節、及びさらに脂肪組織などの、外部環境に直接的に曝露されない身体の所定のコンパートメントに見られ得る。これらのＴｒｅｇ細胞集団の各々は、１つ以上の独自の特徴を有することが知られ、または疑われ、追加の情報は、Ｌｅｈｔｉｍａｋｉ ａｎｄ Ｌａｈｅｓｍａａ，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅｉｒ ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ，２０１３，ＦＲＯＮＴＩＥＲＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬ．，４（２９４）：１－１０で見ることができ、その開示は、その全体が本明細書に組み込まれる。

典型的には、Ｔｒｅｇは、適切な活性化及び発達のためにＴＧＦ－β及びＩＬ－２を必要とすることが知られている。豊富な量のＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）を発現するＴｒｅｇは、活性化Ｔ細胞によって産生されるＩＬ－２に依存する。Ｔｒｅｇは、ＩＬ－１０及びＴＧＦ－β（いずれも強力な免疫抑制サイトカインである）の両方を産生することが知られている。また、Ｔｒｅｇは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）がＴ細胞を刺激する能力を阻害することが知られている。ＡＰＣ阻害のための１提案されたメカニズムは、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇによって発現するＣＴＬＡ－４を介するものである。ＣＴＬＡ－４は、ＡＰＣ上のＢ７分子と結合し、これらの分子をブロックし、または内在化を引き起こすことによってそれらを除去することで、Ｂ７の利用可能性を低下させ、免疫反応のための適切な共刺激を提供することができなくなると考えられている。Ｔｒｅｇの起源、分化及び機能に関する追加の論述は、Ｄｈａｍｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｎｄ ｔｈｙｍｉｃ Ｆｏｘｐ３＋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｏｒｉｇｉｎ，ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，２０１３，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４（２５３）：１－１１で見ることができる。

ＦＯＸＰ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、及び／またはＨＥＬＩＯＳの説明及び／またはアミノ酸配列は、本明細書において及びｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇデータベースでアクセッション番号：Ｑ９ＢＺＳ１（ＦＯＸＰ３）、Ｐ５１６９２（ＳＴＡＴ５ｂ）、及び／またはＱ９ＵＫＳ７（ＨＥＬＩＯＳ）で提供される。

Ｆｏｘｐ３
いくつかの実施形態では、転写因子は、フォークヘッドボックスＰ３転写因子（Ｆｏｘｐ３）である。Ｆｏｘｐ３は、Ｔｒｅｇの分化及び活性における重要な制御因子であることが示されている。実施に、Ｆｏｘｐ３遺伝子における機能喪失変異は、致死的なＩＰＥＸ症候群（免疫調節異常、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖）をもたらすことが示されている。ＩＰＥＸを有する患者は、重度の自己免疫反応、持続性湿疹、及び大腸炎を患う。Ｆｏｘｐ３を発現するＴｒｅｇ細胞は、腸における炎症反応を制限する上で重要な役割を果たす（Ｊｏｓｅｆｏｗｉｃｚ，Ｓ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１２，４８２，３９５－Ｕ１５１０）。

ＳＴＡＴ
転写（ＳＴＡＴ）タンパク質ファミリーのシグナル伝達因子及び活性化因子のメンバーは、細胞免疫、増殖、アポトーシス及び分化の多くの態様を媒介する細胞内転写因子である。それらは主に、膜受容体関連ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）によって活性化される。この経路の調節異常は、原発腫瘍において頻繁に観察され、血管新生の増加、腫瘍の生存の増加及び免疫抑制をもたらす。遺伝子ノックアウト研究は、ＳＴＡＴタンパク質が、免疫系の発達及び機能に関与し、免疫寛容及び腫瘍監視を維持する上で役割を果たすという証拠を提供した。

同定されている７種の哺乳動物ＳＴＡＴファミリーメンバー：ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５（ＳＴＡＴ５Ａ及びＳＴＡＴ５Ｂを含む）、及びＳＴＡＴＥが存在する。

サイトカインまたは成長因子の細胞外結合は、受容体関連Ｊａｎｕｓキナーゼの活性化を誘導し、これは、それらのＳＨ２ドメインを介して二量化を促進するＳＴＡＴタンパク質内の特定のチロシン残基をリン酸化する。リン酸化二量体は次いで、インポーチンα／β三元複合体を介して核に能動的に輸送される。元々、リン酸化が核保持のために必要とされると考えられていたので、ＳＴＡＴタンパク質は、潜在的細胞質性転写因子として記載されていた。しかしながら、非リン酸化ＳＴＡＴタンパク質もまた、サイトゾルと核との間で往復し、遺伝子発現において役割を果たす。ＳＴＡＴが核に到達すると、それは、サイトカイン誘導性遺伝子のプロモーター領域におけるガンマ－活性化（ＧＡＳ）と呼ばれるコンセンサスＤＮＡ－認識モチーフに結合し、転写を活性化する。ＳＴＡＴタンパク質は、核ホスファターゼによって脱リン酸化され得、これは、ＳＴＡＴの不活性化及びその後のエクスポーチン－ＲａｎＧＴＰ複合体による核外への輸送をもたらす。

いくつかの実施形態では、本開示のＳＴＡＴタンパク質は、その発現レベルまたは活性を調節する修飾を含むＳＴＡＴタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、かかる修飾には、とりわけ、ＳＴＡＴ二量化、シグナル伝達パートナーに対するＳＴＡＴタンパク質の結合、ＳＴＡＴタンパク質局在化またはＳＴＡＴタンパク質分解をもたらす変異が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＴＡＴタンパク質は、構成的に活性である。いくつかの実施形態では、本開示のＳＴＡＴタンパク質は、構成的二量化により、構成的に活性である。いくつかの実施形態では、本開示のＳＴＡＴタンパク質は、Ｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｊｕｌｙ １９９８ ｖｏｌ．１８ ｎｏ．７ ３８７１－３８７９に記載されているように構成的リン酸化により、構成的に活性であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

３．６ ワクチン
ある実施形態では、１つ以上の発現配列が、抗原、例えば腫瘍抗原、またはそのフラグメントをコードする。いくつかの実施形態では、かかる配列の発現は、免疫原性組成物、例えば、特異的Ｔ細胞応答をもたらすことができるワクチン組成物を産生する。いくつかの実施形態では、抗原が、新生抗原である。

４．切断部位
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド構築物中の２つ以上の発現配列は、１つ以上の切断部位配列によって分離され得る。

切断部位は、２つ以上のポリペプチドが分離されることを可能にする任意の配列であり得る。切断部位は、ポリペプチドが産生されると、外部切断活性を必要とせずに個々のポリペプチドに即座に切断されるように、自己切断性であり得る。

切断部位は、フューリン切断部位であり得る。

フューリンは、サブチリシン様プロタンパク質転換酵素ファミリーに属する酵素である。このファミリーのメンバーは、潜在的な前駆体タンパク質を生物学的に活性な生成物に処理するプロタンパク質転換酵素である。フューリンは、カルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼであり、前駆体タンパク質を対になった塩基性アミノ酸処理部位で効率的に切断することができる。フューリン基質の例には、プロ副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング増殖因子ベータ１前駆体、プロアルブミン、プロベータセクレターゼ、膜タイプ１マトリックスメタロプロテイナーゼ、プロ神経成長因子のベータサブユニット、及びフォンヴィレブランド因子が含まれる。フューリンは、塩基性アミノ酸標的配列（典型的には、Ａｒｇ－Ｘ－（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）－Ａｒｇ）のすぐ下流でタンパク質を切断し、ゴルジ体で濃縮される。

切断部位は、自己切断ペプチドをコードし得る。

切断部位は、２Ａ自己切断ペプチドのＣ末端におけるグリシル－プロピル結合のスキップなどのリボソームスキップによって動作し得る。いくつかの実施形態では、立体障害は、リボソームスキッピングを引き起こす。いくつかの実施形態では、２Ａ自己切断ペプチドは、配列ＧＤＶＥＸＮＰＧＰ（配列番号３２４）を含み、Ｘは、ＥまたはＳである。いくつかの実施形態では、２Ａ自己切断ペプチドの上流にコードされるタンパク質は、Ｃ末端プロリン翻訳後を除いて、２Ａ自己切断ペプチドに結合される。いくつかの実施形態では、２Ａ自己切断ペプチドの下流にコードされるタンパク質は、翻訳後Ｎ末端でプロリンに結合される。

自己切断ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチドであり得る。アフトウイルス及びカルジオウイルスの主要な２Ａ／２Ｂ切断は、そのＣ末端での２Ａ切断によって媒介される。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）及びウマ鼻炎Ａウイルスなどのアプトウイルスでは、２Ａ領域は、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存されたプロリン残基）とともに、そのＣ末端での切断を媒介することができる自律的なエレメントを表す、約１８個のアミノ酸の短い切片である（Ｄｏｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（２００１））。

２Ａ様配列は、アプトウイルスまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルス及びトリパノソーマ属及び細菌配列内の反復配列において見出されている（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（２００１））。切断部位は、表８に列挙されるものなどのこれらの２Ａ様配列のうちの１つを含み得る。

いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、Ｆ２Ａである。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、口蹄疫ウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、Ｅ２Ａである。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、ウマ鼻炎Ａウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａである。いくつかの実施形態において、自己切断ペプチドは、ブタテスコウイルス－１に由来する。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａである。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、表８に列挙される配列を有する。

ある実施形態では、切断部位によって分離された治療用タンパク質をコードする発現配列は、同じレベルのタンパク質発現を有する。

いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、Ｌｉｕ，Ｚ．，Ｃｈｅｎ，Ｏ．，Ｗａｌｌ，Ｊ．Ｂ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉ－ｇｅｎｅｓ ｉｎ ａ ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｖｅｃｔｏｒ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７，２１９３（２０１７）に記載されている。

５．第２のＩＲＥＳを含むポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、第１及び第２の発現配列によってコードされる治療タンパク質の発現比は、ｃｉｒｃＲＮＡで使用されるＩＲＥＳ、及び切断部位または第２のＩＲＥＳが第１及び第２の発現配列を分離するかによって制御または影響を受け得る。第１及び第２の発現配列によってコードされるタンパク質の同等の発現が望まれる場合、ｃｉｒｃＲＮＡは、第１の発現配列と第２の発現配列との間の切断部位、例えば２Ａ自己切断ペプチドをコードし得る。第１の発現配列によってコードされるタンパク質のより多くの発現が望まれる場合、ｃｉｒｃＲＮＡは、第１のＩＲＥＳ及び第２のＩＲＥＳをコードすることができ、第１のＩＲＥＳは第２のＩＲＥＳよりも多くの発現と関連しており、または第２のＩＲＥＳは遺伝子間領域（ＩＧＲ）ＩＲＥＳである。第２の発現配列によってコードされるタンパク質のより多くの発現が望まれる場合、ｃｉｒｃＲＮＡは、第１のＩＲＥＳ及び第２のＩＲＥＳをコードすることができ、第２のＩＲＥＳは、第１のＩＲＥＳよりも多くの発現に関連している。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、本明細書に記載の第１のＩＲＥＳ及び第２のＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡベクターは、本明細書に記載の第１のＩＲＥＳ及び第２のＩＲＥＳをコードする。

ある実施形態では、第１のＩＲＥＳ及び第２のＩＲＥＳは、同じ配列を有する。ある実施形態では、第１のＩＲＥＳ及び第２のＩＲＥＳは、異なる配列を有する。ある実施形態では、第１のＩＲＥＳは、表１に列挙される配列（配列番号１～７２）を有するＩＲＥＳである。いくつかの実施形態では、第１のＩＲＥＳは、サリウイルスＩＲＥＳである。いくつかの実施形態では、第１のＩＲＥＳは、サリウイルスＳＺ１ ＩＲＥＳである。ある実施形態では、第２のＩＲＥＳは、表１に列挙される配列（配列番号１～７２）を有するＩＲＥＳである。いくつかの実施形態では、第２のＩＲＥＳは、サリウイルスＩＲＥＳである。いくつかの実施形態では、第１のＩＲＥＳは、サリウイルスＳＺ１ ＩＲＥＳである。

いくつかの実施形態では、第１のＩＲＥＳは、第２のＩＲＥＳよりも多くの発現に関連する（例えば、単一ＩＲＥＳを含む構築物を使用して比較した場合、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％多い発現）。いくつかの実施形態では、第２のＩＲＥＳは、第１のＩＲＥＳよりも多くの発現に関連する（例えば、単一ＩＲＥＳを含む構築物を使用して比較した場合、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％多い発現）。いくつかの実施形態では、第２のＩＲＥＳは、遺伝子間領域（ＩＧＲ）ＩＲＥＳである。

単一ｃｉｒｃＲＮＡポリヌクレオチドを使用して２つのタンパク質を発現させることは、複数のポリヌクレオチドを使用した発現よりも利点がある。いくつかの実施形態では、本発明のｃｉｒｃＲＮＡポリヌクレオチドからの２つのタンパク質の発現は、複数のポリヌクレオチドからの発現よりも一貫した比率の発現をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明のｃｉｒｃＲＮＡポリヌクレオチドからの２つのタンパク質の発現は、ＤＮＡの持続的な発現よりも望ましい場合がある、一過性の発現をもたらす。

６．ポリヌクレオチドの産生
本明細書に提供するベクターは、分子生物学の標準的な技術を使用して作製することができる。例えば、本明細書に提供するベクターの様々なエレメントは、組換え法を使用して、例えば細胞からｃＤＮＡ及びゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、またはポリヌクレオチドを含むことが知られているベクターからポリヌクレオチドを誘導することによって得ることができる。

本明細書に提供するベクターの様々なエレメントはまた、既知の配列に基づいて、クローン化されるのではなく、合成的に生成することもできる。完全な配列は、標準的な方法によって調製された重複するオリゴヌクレオチドから組み立て、完全な配列へと組み立てることができる。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９；及びＪａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：６３１ １を参照されたい。

ゆえに、特定のヌクレオチド配列は、所望の配列を抱えるベクターから取得する、または完全に、もしくは部分的に、適切な場合には部位特異的変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術などの当該技術分野で公知の様々なオリゴヌクレオチド合成技術を使用して合成することができる。所望のベクターエレメントをコードするヌクレオチド配列を取得する１つの方法は、従来の自動ポリヌクレオチドシンセサイザーで産生された重複する合成オリゴヌクレオチドの相補的セットをアニーリングし、続いて適切なＤＮＡリガーゼでライゲーションし、ＰＣＲを介してライゲーションされたヌクレオチド配列を増幅することによる。例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：４０８４－４０８８を参照されたい。加えて、オリゴヌクレオチド特異的合成（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）５４：７５－８２）、既存のヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３２：３２３－３２７及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：１５３４－１５３６）、及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用するギャップを伴うオリゴヌクレオチドの酵素的充填（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：１００２９－１００３３）を使用することができる。

本明細書に提供する前駆体ＲＮＡは、本明細書に提供するベクターを、ベクターによってコードされる前駆体ＲＮＡの転写を許容する条件下で、インキュベートすることによって生成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、前駆体ＲＮＡは、その５’二重鎖形成領域及び／または発現配列の上流にＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む本明細書に提供するベクターを、適合性ＲＮＡポリメラーゼ酵素とインビトロ転写を許容する条件下でインキュベートすることによって合成される。いくつかの実施形態では、ベクターは、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼによって細胞の内側で、または宿主ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって細胞の核内でインキュベートされる。

特定の実施形態では、テンプレートとして本明細書に提供されるベクター（例えば、５’二重鎖形成領域の上流に配置されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する本明細書に提供されるベクター）を使用してインビトロ転写を行うことによって前駆体ＲＮＡを生成する方法を本明細書に提供する。

特定の実施形態では、結果得られた前駆体ＲＮＡを使用して、それをマグネシウムイオン及びグアノシンヌクレオチドまたはヌクレオシド存在下で、ＲＮＡ環状化が生じる温度（例えば、２０℃～６０℃）にてインキュベートすることによって、環状ＲＮＡ（例えば、本明細書に提供する環状ＲＮＡポリヌクレオチド）を生成することができる。

ゆえに、特定の実施形態では、環状ＲＮＡを作製する方法を本明細書に提供する。特定の実施形態では、この方法は、本明細書で提供されるベクター（例えば、スプライシング後３’グループＩイントロンフラグメント、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現配列、切断部位をコードするポリヌクレオチド配列、第２の発現配列、及び５’グループＩイントロンフラグメント）を鋳型として使用して転写（例えば、ランオフ転写）によって前駆体ＲＮＡを合成することと、得られた前駆体ＲＮＡを二価陽イオン（例えば、マグネシウムイオン）及びＧＴＰの存在下で、環状化して環状ＲＮＡを形成するようにインキュベートすることと、を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する前駆体ＲＮＡは、マグネシウムイオン及びＧＴＰの非存在下で、及び／またはマグネシウムイオン及びＧＴＰとのインキュベーションのステップを伴わずに、環状化することができる。少なくとも部分的には、ｍＲＮＡが免疫原性５’キャップを含むため、環状ＲＮＡは対応するｍＲＮＡと比較して免疫原性が低減していることが発見されている。前駆体ＲＮＡを産生するために所定のプロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）からＤＮＡベクターを転写する場合、前駆体ＲＮＡの５’末端はＧであることが理解される。低レベルの夾雑直鎖状ｍＲＮＡを含有する環状ＲＮＡ組成物の免疫原性を低下させるため、ほとんどの転写産物が、キャップすることができない５’ＧＭＰを含有するように、ＧＴＰに対して過剰のＧＭＰが転写中に提供され得る。そのため、いくつかの実施形態では、転写は、過剰のＧＭＰの存在下で行われる。いくつかの実施形態では、転写は、ＧＭＰ濃度のＧＴＰ濃度に対する比が約３：１～約１５：１の範囲内、例えば、約３：１～約１０：１、約３：１～約５：１、約３：１、約４：１、または約５：１で行われる。

いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡを含む組成物は、精製されている。環状ＲＮＡは、当該技術分野で一般的に使用される任意の公知の方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製され得る。いくつかの実施形態では、精製は、以下のステップ：ホスファターゼ処理、ＨＰＬＣサイズ排除精製、及びＲＮａｓｅ Ｒ消化のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、精製は、以下のステップを順序：ＲＮａｓｅ Ｒ消化、ホスファターゼ処理、及びＨＰＬＣサイズ排除精製で含む。いくつかの実施形態では、精製は、逆相ＨＰＬＣを含む。いくつかの実施形態では、精製された組成物は、未精製ＲＮＡよりも少ない二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡスプリント、三リン酸化ＲＮＡ、ホスファターゼタンパク質、タンパク質リガーゼ、キャッピング酵素及び／またはニックの入ったＲＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、精製組成物は、未精製組成物よりも免疫原性が低い。いくつかの実施形態では、精製組成物に曝露された免疫細胞は、未精製組成物に曝露された免疫細胞よりも少ないＴＮＦα、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮγ、及び／または１型インターフェロン、例えばＩＦＮ－β１を産生する。

７．ナノ粒子
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される環状ＲＮＡを含む薬学的組成物である。特定の実施形態では、かかる薬学的組成物は、送達を容易にするためにナノ粒子とともに製剤化される。

特定の実施形態では、本明細書で提供される環状ＲＮＡは、例えば、ナノ粒子またはナノ粒子を含む組成物などの輸送ビヒクル中で細胞に送達及び／またはターゲティングされ得る。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡはまた、対象に、輸送ビヒクルまたは輸送ビヒクルを含む組成物にて送達され得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、脂質ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、ポリマーコアシェルナノ粒子、または生分解性ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、１つ以上のカチオン性脂質、非カチオン性脂質、イオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ポリグルタミン酸ポリマー、ヒアルロン酸ポリマー、ポリβ－アミノエステル、ポリベータアミノペプチド、もしくは正電荷ペプチドを含むか、またはそれらでコーティングされている。

一実施形態では、標的細胞へのｃｉｒｃＲＮＡの送達を最適化するために、輸送ビヒクルを選択及び／または調製することができる。例えば、標的細胞が肝細胞である場合、輸送ビヒクルの特性（例えば、サイズ、電荷及び／またはｐＨ）は、かかるビヒクルを標的細胞に効果的に送達し、免疫クリアランスを低減し、及び／またはその標的細胞での保持を促進するように最適化することができる。

標的細胞への核酸の送達を促進するための輸送ビヒクルの使用は、本発明によって企図される。リポソーム（例えば、リポソーム脂質ナノ粒子）は、一般に、研究、産業、及び医学における様々な用途に有用であり、特に、インビボにおける診断または治療用化合物の輸送ビヒクルとしてのそれらの使用に有用であり（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７－３２１，１９９８、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，５１：６９１－７４３，１９９９）、通常、１つ以上の二重層の膜によって外側の媒体から隔離された内部水性空間を有する顕微鏡的小胞として特徴付けられる。リポソームの二重層膜は、典型的には、空間的に分離された親水性及び疎水性ドメインを含む、合成または天然由来の脂質などの両親媒性分子によって形成される（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７－３２１，１９９８）。リポソームの二重層膜は、両親媒性ポリマー及び界面活性剤（例えば、ポリマーソーム、ニオソームなど）によっても形成され得る。

本発明の文脈では、輸送ビヒクルは、典型的には、ｃｉｒｃＲＮＡを標的細胞に輸送する役割を果たす。本発明の目的のために、輸送ビヒクルは、所望の核酸を含有または封入するように調製される。所望の実体（例えば、核酸）をリポソームに組み込むプロセスは、しばしば負荷すると称される（Ｌａｓｉｃ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５－２５８，１９９２）。リポソームに取り込まれた核酸は、リポソームの内部空間、リポソームの二分子膜内に完全にもしくは部分的に位置するか、またはリポソーム膜の外面と結合することができる。リポソームなどの輸送媒体にｃｉｒｃＲＮＡを組み込む目的は、多くの場合、核酸を分解する酵素もしくは化学物質、及び／または核酸の急速な排泄を引き起こすシステムもしくは受容体を含み得る環境から核酸を保護することである。したがって、本発明のある実施形態では、選択された輸送ビヒクルは、その中に含まれるｃｉｒｃＲＮＡの安定性を向上させることができる。リポソームは、封入されたｃｉｒｃＲＮＡが標的細胞に到達することを可能にし得る、または代替的に、かかる投与されたｃｉｒｃＲＮＡの存在が不要または望ましくない可能性がある他の部位または細胞へのかかるｃｉｒｃＲＮＡの送達を制限することができる。さらに、ｃｉｒｃＲＮＡを例えばカチオン性リポソームなどの輸送ビヒクルに組み込むことも、かかるｃｉｒｃＲＮＡの標的細胞への送達を促進する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される輸送ビヒクルは、例えば、輸送ビヒクルに封入された内容物（例えば、脂質ナノ粒子）のエンドソームまたはリソソーム放出を促進する働きをすることができる。

理想的には、輸送ビヒクルは、組成物が高いトランスフェクション効率及び向上した安定性を示すように、１つ以上の所望のｃｉｒｃＲＮＡを封入するように調製される。リポソームは標的細胞への核酸の導入を容易にすることができるが、コポリマーとしてのポリカチオン（例えば、ポリＬ－リジン及びプロタミン）の添加は、場合によっては、インビトロ及びインビボの両方の多くの細胞株において、数種類のカチオン性リポソームのトランスフェクション効率を２～２８倍に著しく高めることができる。（Ｎ Ｊ．Ｃａｐｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９５；２：６０３、Ｓ．Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９７；４，８９１を参照されたい）。

特定の実施形態では、１つ以上の標的細胞への環状ＲＮＡの送達及び放出を、（例えば、かかる標的細胞の脂質膜に浸透するまたはこれと融合することによって）容易にするまたは向上させるために輸送ビヒクルの成分として使用され得るイオン化可能脂質を本明細書に開示する。特定の実施形態では、イオン化可能脂質は、１つ以上の切断可能な官能基（例えば、ジスルフィド）を含み、これは、例えば、化合物の親水性官能頭部基の親油性官能尾部基からの解離（例えば、酸化的、還元的または酸性条件への曝露の際）を可能にし、それにより、１つ以上の標的細胞の脂質二重層における相転移を容易にする。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５８５５５号に記載されている脂質である。

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、以下の式を有し、

式中、
Ｒ_１及びＲ_２は、同じでありまたは異なり、独立して、任意で置換されたＣ_１０－Ｃ_２４アルキル、任意で置換されたＣ_１０－Ｃ_２４アルケニル、任意で置換されたＣ_１０－Ｃ_２４アルキニル、または任意で置換されたＣ_１０－Ｃ_２４アシルであり、
Ｒ_３及びＲ_４は、同じでありまたは異なり、独立して、任意で置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル、任意で置換されたＣ_２－Ｃ_６アルケニル、または任意で置換されたＣ_２－Ｃ_６アルキニルであり、またはＲ_３及びＲ_４は一緒になって、４～６個の炭素原子ならびに窒素及び酸素から選択される１または２個のヘテロ原子の任意で置換された複素環式環を形成し得、
Ｒ_５は、非存在でありまたは存在し、存在する場合、水素またはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり；ｍ、ｎ、及びｐは、同じでありまたは異なり、独立して、０または１のいずれかであり、ただし、ｍ、ｎ、及びｐは、同時に０ではなく；ｑは、０、１、２、３、または４であり、
Ｙ及びＺは、同じでありまたは異なり、独立して、Ｏ、Ｓ、またはＮＨである。

一実施形態では、Ｒ_１及びＲ_２は、各々、リノレイルであり、アミノ脂質は、ジリノレイルアミノ脂質である。

一実施形態では、アミノ脂質は、ジリノレイルアミノ脂質である。

様々な他の実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造を有するか、

またはその薬学的に許容可能な塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｒ_１及びＲ_２は、各々、独立して、Ｈ及びＣ_１－Ｃ_３アルキルからなる群から選択され、
Ｒ_３及びＲ_４は、各々、独立して、約１０～約２０個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ_３及びＲ_４の少なくとも１つは、少なくとも２つの不飽和部位を含む。

いくつかの実施形態では、Ｒ_３及びＲ_４は、各々、独立して、ドデカジエニル、テトラデカジエニル、ヘキサデカジエニル、リノレイル、及びイコサジエニルから選択される。ある実施形態では、Ｒ_３及びＲ_４は両方とも、リノレイルである。いくつかの実施形態では、Ｒ_３及び／またはＲ_４は、少なくとも３つの不飽和部位を含み得る（例えば、Ｒ_３及び／またはＲ_４は、例えば、ドデカトリエニル、テトラデクトリエニル、ヘキサデカトリエニル、リノレニル、及びイコサトリエニルであり得る）。

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造を有するか、

またはその薬学的に許容可能な塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｒ_１及びＲ_２は、各々、独立して、Ｈ及びＣ_１－Ｃ_３アルキルから選択され、
Ｒ_３及びＲ_４は、各々、独立して、約１０～約２０個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ_３及びＲ_４の少なくとも１つは、少なくとも２つの不飽和部位を含む。

一実施形態では、Ｒ_３及びＲ_４は、同じであり、例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ_３及びＲ_４はいずれとも、リノレイル（Ｃ_１８－アルキル）である。別の実施形態では、Ｒ_３及びＲ_４は、異なり、例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ_３は、テトラデクトリエニル（Ｃ_１４－アルキル）であり、Ｒ_４は、リノレイル（Ｃ_１８－アルキル）である。好ましい実施形態では、本発明のカチオン性脂質（複数可）は、対称であり、すなわち、Ｒ_３及びＲ_４は、同じである。別の好ましい実施形態では、Ｒ_３及びＲ_４の両方は、少なくとも２つの不飽和部位を含む。いくつかの実施形態では、Ｒ_３及びＲ_４は、各々、独立して、ドデカジエニル、テトラデカジエニル、ヘキサデカジエニル、リノレイル、及びイコサジエニルから選択される。ある実施形態では、Ｒ_３及びＲ_４はいずれとも、リノレイルである。いくつかの実施形態では、Ｒ_３及び／またはＲ_４は、少なくとも３つの不飽和部位を含み、各々、独立して、ドデカトリエニル、テトラデクトリエニル、ヘキサデカトリエニル、リノレニル、及びイコサトリエニルから選択される。

様々な実施形態では、カチオン性脂質は、以下の式を有するか、

またはその薬学的に許容可能な塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｘ_ａａは、式－ＮＲ^Ｎ－ＣＲ^１Ｒ^２－Ｃ（Ｃ＝Ｏ）－を有するＤ－またはＬ－アミノ酸残基、または式－｛ＮＲ^Ｎ－ＣＲ^１Ｒ^２－Ｃ（Ｃ＝Ｏ）｝_ｎ－（ｎは、２～２０の整数である）を有するアミノ酸残基のペプチドもしくはペプチドであり、
Ｒ^１は、独立して、各存在について、非水素またはアミノ酸の置換もしくは非置換側鎖であり、
Ｒ^２及びＲ^Ｎは、独立して、各存在について、水素、炭素、酸素、窒素、硫黄、及び水素原子または前述のものの任意の組み合わせからなり、かつ１～２０個の炭素原子、Ｃ_{（１－５）}アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、Ｃ_{（１－５）}アルケニル、Ｃ_{（１－５）}アルキニル、Ｃ_{（１－５）}アルカノイル、Ｃ_{（１－５）}アルカノイルオキシ、Ｃ_{（１－５）}アルコキシ、Ｃ_{（１－５）}アルコキシ－Ｃ_{（１－５）}アルキル、Ｃ_{（１－５）}アルコキシ－Ｃ_{（１－５）}アルコキシ、Ｃ_{（１－５）}アルキル－アミノ－Ｃ_{（１－５）}アルキル－、Ｃ_{（１－５）}ジアルキル－アミノ－Ｃ_{（１－５）}アルキル－、ニトロ－Ｃ_{（１－５）}アルキル、シアノ－Ｃ_{（１－５）}アルキル、アリール－Ｃ_{（１－５）}アルキル、４－ビフェニル－Ｃ_{（１－５）}アルキル、カルボキシル、またはヒドロキシルを有する有機基であり、
Ｚは、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＣＨ_２Ｓ－、－ＣＨ_２Ｓ（Ｏ）－、または水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄原子から選択される１～４０個の原子からなる有機リンカーであり（好ましくは、Ｚは、－ＮＨ－または－Ｏ－であり）、
Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、独立して、（ｉ）脂質（天然に存在し、または合成であり得る）、例えば、リン脂質、糖脂質、トリアシルグリセロール、グリセロリン脂質、スフィンゴリピド、セラミド、スフィンゴミエリン、セレブロシド、またはガングリオシドに由来する脂溶性尾部（尾部はステロイドを任意で含む）；（ｉｉ）水素、ヒドロキシル、アミノ、及び有機保護基から選択されるアミノ酸末端基；または（ｉｉｉ）置換または非置換Ｃ_{（３－２２）}アルキル、Ｃ_{（６－１２）}シクロアルキル、Ｃ_{（６－１２）}シクロアルキル－Ｃ_{（３－２２）}アルキル、Ｃ_{（３－２２）}アルケニル、Ｃ_{（３－２２）}アルキニル、Ｃ_{（３－２２）}アルコキシ、またはＣ_{（６－１２）}－アルコキシＣ_{（３－２２）}アルキルである。

いくつかの実施形態では、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙの一方は、上記で定義されている脂溶性尾部であり、他方は、アミノ酸末端基である。いくつかの実施形態では、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙの両方は、脂溶性尾部である。

いくつかの実施形態では、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙの少なくとも１つは、１つ以上の生分解性基（例えば、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＯＣ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）（ＮＲ^５）－、－Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）（ＮＲ^５）－、－Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）－、－Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳｉ（Ｒ^５）_２Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＲ^３Ｒ^４）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ^３Ｒ^４）Ｃ（Ｏ）－、または

によって隔てられている。

いくつかの実施形態では、Ｒ^１１は、Ｃ_２－Ｃ_８アルキルまたはアルケニルである。

いくつかの実施形態では、Ｒ^５の各存在は、独立して、Ｈまたはアルキルである。

いくつかの実施形態では、Ｒ^３及びＲ^４の各存在は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、アルキル、アルコキシ、－ＮＨ_２、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノであり；またはＲ_３及びＲ_４は、それらが直接的に結合している炭素原子と一緒になって、シクロアルキル基を形成する。いくつかの特定の実施形態では、Ｒ^３及びＲ^４の各存在は、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_４アルキルである。

いくつかの実施形態では、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、各々、独立して、１つ以上の炭素－炭素二重結合を有する。

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、以下のうちの１つであるか、

またはその薬学的に許容可能な塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｒ_１及びＲ_２は、各々、独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、その各々は、任意で置換され得、
Ｒ_３及びＲ_４は、各々、独立して、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであり、またはＲ_３及びＲ_４は、一緒になって任意で置換された複素環式環を形成する。

代表的な有用なジリノレイルアミノ脂質は、以下の式を有し、

式中、ｎは、０、１、２、３、または４である。

一実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡである。一実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（ｎが２である上記のＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）である。

一実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造を有するか、

、またはその薬学的に許容可能な塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｒ_１及びＲ_２は、各々、独立して、各存在について任意で置換されたＣ_１０－Ｃ_３０アルキル、任意で置換されたＣ_１０－Ｃ_３０アルケニル、任意で置換されたＣ_１０－Ｃ_３０アルキニルまたは任意で置換されたＣ_１０－Ｃ_３０アシルであり、
Ｒ_３は、Ｈ、任意で置換されたＣ_２－Ｃ_１０アルキル、任意で置換されたＣ_２－Ｃ_１０アルケニル、任意で置換されたＣ_２－Ｃ_１０アルキリル、アルキル複素環、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオエート、アルキルホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω－アミノアルキル、ω－（置換）アミノアルキル、ω－ホスホアルキル、ω－チオホスホアルキル、任意で置換されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ｍｗ１００～４０Ｋ）、任意で置換されたｍＰＥＧ（ｍｗ１２０～４０Ｋ）、ヘテロアリール、または複素環、またはリンカーリガンドであり、例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ_３は、（ＣΗ_３）_２Ν（ＣＨ_２）_ｎ－（ｎは、１、２、３または４である）であり、
Ｅは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｑ）、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）、（Ｑ）Ｎ（ＣＯ）Ｏ、Ｏ（ＣＯ）Ｎ（Ｑ）、Ｓ（Ｏ）、ＮＳ（Ｏ）_２Ｎ（Ｑ）、Ｓ（Ｏ）_２、Ｎ（Ｑ）Ｓ（Ｏ）_２、ＳＳ、Ｏ＝Ｎ、アリール、ヘテロアリール、環式または複素環、例えば、－Ｃ（Ｏ）Ｏであり、－は、Ｒ_３への接続点であり、
Ｑは、Ｈ、アルキル、ω－アミノアルキル、ω－（置換）アミノアルキル、ω－ホスホアルキル、またはω－チオホスホアルキルである。

一特定の実施形態では、実施形態１、２、３、４、または５に記載のカチオン性脂質は、以下の構造を有するか、

またはその薬学的に許容可能な塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｅは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｑ）、Ｃ（Ｏ）、Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）、（Ｑ）Ｎ（ＣＯ）Ｏ、Ｏ（ＣＯ）Ｎ（Ｑ）、Ｓ（Ｏ）、ＮＳ（Ｏ）_２Ｎ（Ｑ）、Ｓ（Ｏ）_２、Ｎ（Ｑ）Ｓ（Ｏ）_２、ＳＳ、Ｏ＝Ｎ、アリール、ヘテロアリール、環式または複素環であり、
Ｑは、Ｈ、アルキル、ω－アミノアルキル、ω－（置換）アミノアルキル、ω－ホスホアルキル、またはω－チオホスホアルキルであり、
Ｒ_１及びＲ_２及びＲ_ｘは、各々、独立して、各存在についてＨ、任意で置換されたＣ_１－Ｃ_１０アルキル、任意で置換されたＣ_１０－Ｃ_３０アルキル、任意で置換されたＣ_１０－Ｃ_３０アルケニル、任意で置換されたＣ_１０－Ｃ_３０アルキニル、任意で置換されたＣ_１０－Ｃ_３０アシル、またはリンカー－リガンドであり、ただし、Ｒ_１、Ｒ_２、及びＲ_ｘの少なくとも１つは、Ｈではなく、
Ｒ_３は、Ｈ、任意で置換されたＣ_１－Ｃ_１０アルキル、任意で置換されたＣ_２－Ｃ_１０アルケニル、任意で置換されたＣ_２－Ｃ_１０アルキニル、アルキル複素環、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオエート、アルキルホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω－アミノアルキル、ω－（置換）アミノアルキル、ω－ホスホアルキル、ω－チオホスホアルキル、任意で置換されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ｍｗ１００～４０Ｋ）、任意で置換されたｍＰＥＧ（ｍｗ１２０～４０Ｋ）、ヘテロアリール、または複素環、またはリンカーリガンドであり、
ｎは、０、１、２、または３である。

一実施形態では、実施形態１、２、３、４、または５のカチオン性脂質は、式Ｉの構造を有するか、

またはその薬学的に許容可能な塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｌ^１またはＬ^２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、または
－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ^１またはＬ^２の他方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、または
－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、または直接結合であり、
Ｒ^ａは、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、各存在で、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキル、または（ｂ）Ｒ^１ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^１ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、各存在で、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキル、または（ｂ）Ｒ^２ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^２ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^２ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂは、各存在で、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキル、または（ｂ）Ｒ^３ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^３ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^３ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂは、各存在で、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキル、または（ｂ）Ｒ^４ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^４ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ^５及びＲ^６は、各々、独立して、メチルまたはシクロアルキルであり、
Ｒ^７は、各存在で、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
Ｒ^８及びＲ^９は、各々、独立して、非置換Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルであるか、またはＲ^８及びＲ^９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、１個の窒素原子を含む５員、６員、または７員の複素環を形成し、
ａ及びｄは、各々、独立して、０～２４の整数であり、
ｂ及びｃは、各々、独立して、１～２４の整数であり、
ｅは、１または２であり、
ｘは、０、１、または２である。

式Ｉのいくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は、独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－または－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。

式Ｉの特定の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、またはＲ^４ａの少なくとも１つは、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルであるか、またはＬ^１またはＬ^２の少なくとも１つは、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－または－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。他の実施形態では、Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、ａが６である場合、イソプロピルではないか、またはａが８である場合、ｎ－ブチルではない。

式Ｉのなおさらなる実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、またはＲ^４ａの少なくとも１つは、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルであるか、またはＬ^１またはＬ^２の少なくとも１つは、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－または－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－であり、
Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、ａが６である場合、イソプロピルではないか、またはａが８である場合、ｎ－ブチルではない。

式Ｉの他の実施形態では、Ｒ^８及びＲ^９は、各々、独立して、非置換Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルであるか、またはＲ^８及びＲ^９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、１個の窒素原子を含む５員、６員、または７員の複素環を形成する。

式Ｉの特定の実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２のいずれか１つは、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－または炭素－炭素二重結合であり得る。Ｌ^１及びＬ^２は、各々、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－であり得るか、または各々、炭素－炭素二重結合であり得る。

式Ｉのいくつかの実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。他の実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は両方とも、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。

式Ｉのいくつかの実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２の一方は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。他の実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は両方とも、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。

式Ｉのいくつかの他の実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２の一方は、炭素－炭素二重結合である。他の実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は両方とも、炭素－炭素二重結合である。

式Ｉのさらに他の実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－であり、Ｌ^１またはＬ^２の他方は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。さらなる実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－であり、Ｌ^１またはＬ^２の他方は、炭素－炭素二重結合である。さらなる実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２の一方は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ^１またはＬ^２の他方は、炭素－炭素二重結合である。

本明細書全体にわたって使用される「炭素－炭素」二重結合は、以下の構造のうちの１つを指すことが理解され、

式中、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、各存在で、独立して、Ｈまたは置換基である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、各存在で、独立して、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルまたはシクロアルキル、例えば、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルである。

他の実施形態では、式Ｉの脂質化合物は、以下の式（Ｉａ）を有する：

。

他の実施形態では、式Ｉの脂質化合物は、以下の式（Ｉｂ）を有する：

。

さらに他の実施形態では、式Ｉの脂質化合物は、以下の式（Ｉｃ）を有する：

。

式Ｉの脂質化合物の特定の実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、各々、独立して、２～１２の整数、または４～１２の整数である。他の実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、各々、独立して、８～１２または５～９の整数である。いくつかの特定の実施形態では、ａは、０である。いくつかの実施形態では、ａは、１である。他の実施形態では、ａは、２である。より多くの実施形態では、ａは、３である。さらに他の実施形態では、ａは、４である。いくつかの実施形態では、ａは、５である。他の実施形態では、ａは、６である。より多くの実施形態では、ａは、７である。さらに他の実施形態では、ａは、８である。いくつかの実施形態では、ａは、９である。他の実施形態では、ａは、１０である。さらなる実施形態では、ａは、１１である。さらに他の実施形態では、ａは、１２である。いくつかの実施形態では、ａは、１３である。他の実施形態では、ａは、１４である。さらなる実施形態では、ａは、１５である。さらに他の実施形態では、ａは、１６である。

式Ｉのいくつかの他の実施形態では、ｂは、１である。他の実施形態では、ｂは、２である。さらなる実施形態では、ｂは、３である。さらに他の実施形態では、ｂは、４である。いくつかの実施形態では、ｂは、５である。他の実施形態では、ｂは、６である。さらなる実施形態では、ｂは、７である。さらに他の実施形態では、ｂは、８である。いくつかの実施形態では、ｂは、９である。他の実施形態では、ｂは、１０である。さらなる実施形態では、ｂは、１１である。さらに他の実施形態では、ｂは、１２である。いくつかの実施形態では、ｂは、１３である。他の実施形態では、ｂは、１４である。さらなる実施形態では、ｂは、１５である。さらに他の実施形態では、ｂは、１６である。

式Ｉのいくつかのさらなる実施形態では、ｃは、１である。他の実施形態では、ｃは、２である。さらなる実施形態では、ｃは、３である。さらに他の実施形態では、ｃは、４である。いくつかの実施形態では、ｃは、５である。他の実施形態では、ｃは、６である。さらなる実施形態では、ｃは、７である。さらに他の実施形態では、ｃは、８である。いくつかの実施形態では、ｃは、９である。他の実施形態では、ｃは、１０である。さらなる実施形態では、ｃは、１１である。さらに他の実施形態では、ｃは、１２である。いくつかの実施形態では、ｃは、１３である。他の実施形態では、ｃは、１４である。さらなる実施形態では、ｃは、１５である。さらに他の実施形態では、ｃは、１６である。

式Ｉのいくつかの特定の他の実施形態では、ｄは、０である。いくつかの実施形態では、ｄは、１である。他の実施形態では、ｄは、２である。さらなる実施形態では、ｄは、３である。さらに他の実施形態では、ｄは、４である。いくつかの実施形態では、ｄは、５である。他の実施形態では、ｄは、６である。さらなる実施形態では、ｄは、７である。さらに他の実施形態では、ｄは、８である。いくつかの実施形態では、ｄは、９である。他の実施形態では、ｄは、１０である。さらなる実施形態では、ｄは、１１である。さらに他の実施形態では、ｄは、１２である。いくつかの実施形態では、ｄは、１３である。他の実施形態では、ｄは、１４である。さらなる実施形態では、ｄは、１５である。さらに他の実施形態では、ｄは、１６である。

式Ｉのいくつかの他の様々な実施形態では、ａ及びｄは、同じである。いくつかの他の実施形態では、ｂ及びｃは、同じである。いくつかの他の特定の実施形態では、ａ及びｄは、同じであり、ｂ及びｃは、同じである。

式Ｉにおけるａ及びｂの合計ならびにｃ及びｄの合計は、所望の特性を有する式Ｉの脂質を得るために変化し得る因子である。一実施形態では、ａ及びｂは、それらの合計が１４～２４の範囲の整数であるように選択される。他の実施形態では、ｃ及びｄは、それらの合計が１４～２４の範囲の整数であるように選択される。さらなる実施形態では、ａ及びｂの合計ならびにｃ及びｄの合計は、同じである。例えば、いくつかの実施形態では、ａ及びｂの合計ならびにｃ及びｄの合計は両方とも、１４～２４の範囲であり得る同じ整数である。なおさらなる実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、ａ及びｂの合計ならびにｃ及びｄの合計が１２以上であるように選択される。

式Ｉのいくつかの実施形態では、ｅは、１である。他の実施形態では、ｅは、２である。

式ＩのＲ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、及びＲ^４ａにおける置換基は、特に限定されない。特定の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、及びＲ^４ａは、各存在でＨである。特定の他の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、及びＲ^４ａの少なくとも１つは、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルである。特定の他の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、及びＲ^４ａの少なくとも１つは、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルである。特定の他の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、及びＲ^４ａの少なくとも１つは、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルである。いくつかの前述の実施形態では、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。

式Ｉの特定の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^１ｂ、Ｒ^４ａ、及びＲ^４ｂは、各存在でＣ_１－Ｃ_１２アルキルである。

式Ｉのさらなる実施形態では、Ｒ^１ｂ、Ｒ^２ｂ、Ｒ^３ｂ、及びＲ^４ｂの少なくとも１つはＨであるか、またはＲ^１ｂ、Ｒ^２ｂ、Ｒ^３ｂ、及びＲ^４ｂは各存在でＨである。

式Ｉの特定の実施形態では、Ｒ^１ｂは、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する。前述のＲ^４ｂの他の実施形態では、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する。

式ＩのＲ^５及びＲ^６の置換基は、前述の実施形態では特に限定されない。特定の実施形態では、Ｒ^５またはＲ^６の一方または両方がメチルである。特定の他の実施形態では、Ｒ^５またはＲ^６の一方または両方がシクロアルキル、例えば、シクロヘキシルである。これらの実施形態では、シクロアルキルは、置換されていてもよく、または置換されていなくてもよい。特定の他の実施形態では、シクロアルキルは、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキル、例えばｔｅｒｔ－ブチルで置換される。

Ｒ^７の置換基は、式Ｉの前述の実施形態では特に限定されない。特定の実施形態では、少なくとも１つのＲ^７は、Ｈである。いくつかの他の実施形態では、Ｒ^７は、存在毎にＨである。特定の他の実施形態では、Ｒ^７は、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルである。

他の特定の式Ｉの前述の実施形態では、Ｒ^８またはＲ^９の一方は、メチルである。他の実施形態では、Ｒ^８及びＲ^９は両方とも、メチルである。

式Ｉのいくつかの異なる実施形態では、Ｒ^８及びＲ^９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、５員、６員、または７員の複素環を形成する。前述のいくつかの実施形態では、Ｒ^８及びＲ^９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、５員複素環、例えば、ピロリジニル環を形成する。

実施形態３のいくつかの実施形態では、第１及び第２のカチオン性脂質は、各々、独立して、式Ｉの脂質から選択される。

様々な異なる実施形態では、式Ｉの脂質は、以下の表１に示される構造のうちの１つを有する。

（表１）式Ｉの代表的脂質

いくつかの実施形態では、実施形態１、２、３、４、または５のカチオン性脂質は、式ＩＩの構造を有するか、

またはその薬学的に許容可能な塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｌ^１またはＬ^２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、または
－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ^１またはＬ^２の他方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、または
－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、または直接結合であり、
Ｇ^１は、Ｃ_１－Ｃ_２アルキレン、－（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、または直接結合であり、
Ｇ^２は、－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、または直接結合であり、
Ｇ^３は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキレンであり、
Ｒ^ａは、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、各存在で、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキル、または（ｂ）Ｒ^１ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^１ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、各存在で、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキル、または（ｂ）Ｒ^２ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^２ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^２ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂは、各存在で、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキル、または（ｂ）Ｒ^３ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^３ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^３ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂは、各存在で、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキル、または（ｂ）Ｒ^４ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^４ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ^５及びＲ^６は、各々、独立して、Ｈまたはメチルであり、
Ｒ^７は、Ｃ_４－Ｃ_２０アルキルであり、
Ｒ^８及びＲ^９は、各々、独立して、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルであるか、またはＲ^８及びＲ^９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、５員、６員、または７員の複素環を形成し、
ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、各々、独立して、１～２４の整数であり、
ｘは、０、１、または２である。

式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は、各々、独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、または直接結合である。他の実施形態では、Ｇ^１及びＧ^２は、各々、独立して、－（Ｃ＝Ｏ）－または直接結合である。いくつかの異なる実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は、各々、独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、または直接結合であり、Ｇ^１及びＧ^２は、各々、独立して、－（Ｃ＝Ｏ）－または直接結合である。

式（ＩＩ）のいくつかの異なる実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は、各々、独立して、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲ^ａＳ（Ｏ）_ｘＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａＳ（Ｏ）_ｘ－、または－Ｓ（Ｏ）_ｘＮＲ^ａ－である。

式（ＩＩ）の他の前述の実施形態では、脂質化合物は、以下の式（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）のうちの１つを有する：

。

式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、脂質化合物は、式（ＩＩＡ）を有する。他の実施形態では、脂質化合物は、式（ＩＩＢ）を有する。

式（ＩＩ）の前述の実施形態のいずれかでは、Ｌ^１またはＬ^２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２の各々は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。

式（ＩＩ）のいくつかの異なる実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２の一方は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２の各々は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。

式（ＩＩ）の異なる実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２の一方は、直接結合である。本明細書で使用される「直接結合」は、基（例えば、Ｌ^１またはＬ^２）が存在しないことを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２の各々は、直接結合である。

式（ＩＩ）の他の異なる実施形態では、Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂの少なくとも１つの存在について、Ｒ^１ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^１ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する。

式（ＩＩ）のさらに他の異なる実施形態では、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂの少なくとも１つの存在について、Ｒ^４ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^４ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する。

式（ＩＩ）のさらなる実施形態では、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂの少なくとも１つの存在について、Ｒ^２ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^２ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^２ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する。

式（ＩＩ）の他の異なる実施形態では、Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂの少なくとも１つの存在について、Ｒ^３ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^３ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^３ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する。

式（ＩＩ）の様々な他の実施形態では、脂質化合物は、以下の式（ＩＩＣ）または（ＩＩＤ）のうちの１つを有し、

式中、ｅ、ｆ、ｇ、及びｈは、各々、独立して、１～１２の整数である。

式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、脂質化合物は、式（ＩＩＣ）を有する。他の実施形態では、脂質化合物は、式（ＩＩＤ）を有する。

式（ＩＩＣ）または（ＩＩＤ）の様々な実施形態では、ｅ、ｆ、ｇ、及びｈは、各々、独立して、４～１０の整数である。

式（ＩＩ）の特定の実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、各々、独立して、２～１２の整数、または４～１２の整数である。他の実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、各々、独立して、８～１２または５～９の整数である。いくつかの特定の実施形態では、ａは、０である。いくつかの実施形態では、ａは、１である。他の実施形態では、ａは、２である。より多くの実施形態では、ａは、３である。さらに他の実施形態では、ａは、４である。いくつかの実施形態では、ａは、５である。他の実施形態では、ａは、６である。より多くの実施形態では、ａは、７である。さらに他の実施形態では、ａは、８である。いくつかの実施形態では、ａは、９である。他の実施形態では、ａは、１０である。さらなる実施形態では、ａは、１１である。さらに他の実施形態では、ａは、１２である。いくつかの実施形態では、ａは、１３である。他の実施形態では、ａは、１４である。さらなる実施形態では、ａは、１５である。さらに他の実施形態では、ａは、１６である。

式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｂは、１である。他の実施形態では、ｂは、２である。さらなる実施形態では、ｂは、３である。さらに他の実施形態では、ｂは、４である。いくつかの実施形態では、ｂは、５である。他の実施形態では、ｂは、６である。さらなる実施形態では、ｂは、７である。さらに他の実施形態では、ｂは、８である。いくつかの実施形態では、ｂは、９である。他の実施形態では、ｂは、１０である。さらなる実施形態では、ｂは、１１である。さらに他の実施形態では、ｂは、１２である。いくつかの実施形態では、ｂは、１３である。他の実施形態では、ｂは、１４である。さらなる実施形態では、ｂは、１５である。さらに他の実施形態では、ｂは、１６である。

式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｃは、１である。他の実施形態では、ｃは、２である。さらなる実施形態では、ｃは、３である。さらに他の実施形態では、ｃは、４である。いくつかの実施形態では、ｃは、５である。他の実施形態では、ｃは、６である。さらなる実施形態では、ｃは、７である。さらに他の実施形態では、ｃは、８である。いくつかの実施形態では、ｃは、９である。他の実施形態では、ｃは、１０である。さらなる実施形態では、ｃは、１１である。さらに他の実施形態では、ｃは、１２である。いくつかの実施形態では、ｃは、１３である。他の実施形態では、ｃは、１４である。さらなる実施形態では、ｃは、１５である。さらに他の実施形態では、ｃは、１６である。

式（ＩＩ）のいくつかの特定の実施形態では、ｄは、０である。いくつかの実施形態では、ｄは、１である。他の実施形態では、ｄは、２である。さらなる実施形態では、ｄは、３である。さらに他の実施形態では、ｄは、４である。いくつかの実施形態では、ｄは、５である。他の実施形態では、ｄは、６である。さらなる実施形態では、ｄは、７である。さらに他の実施形態では、ｄは、８である。いくつかの実施形態では、ｄは、９である。他の実施形態では、ｄは、１０である。さらなる実施形態では、ｄは、１１である。さらに他の実施形態では、ｄは、１２である。いくつかの実施形態では、ｄは、１３である。他の実施形態では、ｄは、１４である。さらなる実施形態では、ｄは、１５である。さらに他の実施形態では、ｄは、１６である。

式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｅは、１である。他の実施形態では、ｅは、２である。さらなる実施形態では、ｅは、３である。さらに他の実施形態では、ｅは、４である。いくつかの実施形態では、ｅは、５である。他の実施形態では、ｅは、６である。さらなる実施形態では、ｅは、７である。さらに他の実施形態では、ｅは、８である。いくつかの実施形態では、ｅは、９である。他の実施形態では、ｅは、１０である。さらなる実施形態では、ｅは、１１である。さらに他の実施形態では、ｅは、１２である。

式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｆは、１である。他の実施形態では、ｆは、２である。さらなる実施形態では、ｆは、３である。さらに他の実施形態では、ｆは、４である。いくつかの実施形態では、ｆは、５である。他の実施形態では、ｆは、６である。さらなる実施形態では、ｆは、７である。さらに他の実施形態では、ｆは、８である。いくつかの実施形態では、ｆは、９である。他の実施形態では、ｆは、１０である。さらなる実施形態では、ｆは、１１である。さらに他の実施形態では、ｆは、１２である。

式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｇは、１である。他の実施形態では、ｇは、２である。さらなる実施形態では、ｇは、３である。さらに他の実施形態では、ｇは、４である。いくつかの実施形態では、ｇは、５である。他の実施形態では、ｇは、６である。さらなる実施形態では、ｇは、７である。さらに他の実施形態では、ｇは、８である。いくつかの実施形態では、ｇは、９である。他の実施形態では、ｇは、１０である。さらなる実施形態では、ｇは、１１である。さらに他の実施形態では、ｇは、１２である。

式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｈは、１である。他の実施形態では、ｅは、２である。さらなる実施形態では、ｈは、３である。さらに他の実施形態では、ｈは、４である。いくつかの実施形態では、ｅは、５である。他の実施形態では、ｈは、６である。さらなる実施形態では、ｈは、７である。さらに他の実施形態では、ｈは、８である。いくつかの実施形態では、ｈは、９である。他の実施形態では、ｈは、１０である。さらなる実施形態では、ｈは、１１である。さらに他の実施形態では、ｈは、１２である。

式（ＩＩ）のいくつかの他の様々な実施形態では、ａ及びｄは、同じである。いくつかの他の実施形態では、ｂ及びｃは、同じである。いくつかの他の特定の実施形態では、ａ及びｄは、同じであり、ｂ及びｃは、同じである。

式（ＩＩ）のａ及びｂの合計ならびにｃ及びｄの合計は、所望の特性を有する脂質を得るために変化し得る因子である。一実施形態では、ａ及びｂは、それらの合計が１４～２４の範囲の整数であるように選択される。他の実施形態では、ｃ及びｄは、それらの合計が１４～２４の範囲の整数であるように選択される。さらなる実施形態では、ａ及びｂの合計ならびにｃ及びｄの合計は、同じである。例えば、いくつかの実施形態では、ａ及びｂの合計ならびにｃ及びｄの合計は両方とも、１４～２４の範囲であり得る同じ整数である。なおさらなる実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、ａ及びｂの合計ならびにｃ及びｄの合計が１２以上であるように選択される。

式（ＩＩ）のＲ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、及びＲ^４ａにおける置換基は、特に限定されない。いくつかの実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、及びＲ^４ａの少なくとも１つは、Ｈである。特定の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、及びＲ^４ａは、各存在でＨである。特定の他の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、及びＲ^４ａの少なくとも１つは、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルである。特定の他の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、及びＲ^４ａの少なくとも１つは、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルである。特定の他の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、及びＲ^４ａの少なくとも１つは、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルである。いくつかの前述の実施形態では、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。

式（ＩＩ）の特定の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^１ｂ、Ｒ^４ａ、及びＲ^４ｂは、各存在でＣ_１－Ｃ_１２アルキルである。

式（ＩＩ）のさらなる実施形態では、Ｒ^１ｂ、Ｒ^２ｂ、Ｒ^３ｂ、及びＲ^４ｂの少なくとも１つはＨであるか、またはＲ^１ｂ、Ｒ^２ｂ、Ｒ^３ｂ、及びＲ^４ｂは各存在でＨである。

式（ＩＩ）の特定の実施形態では、Ｒ^１ｂは、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する。前述のＲ^４ｂの他の実施形態では、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する。

式（ＩＩ）のＲ^５及びＲ^６の置換基は、前述の実施形態では特に限定されない。特定の実施形態では、Ｒ^５またはＲ^６の一方は、メチルである。他の実施形態では、Ｒ^５またはＲ^６の各々は、メチルである。

式（ＩＩ）のＲ^７の置換基は、前述の実施形態では特に限定されない。特定の実施形態では、Ｒ^７は、Ｃ_６－Ｃ_１６アルキルである。いくつかの他の実施形態では、Ｒ^７は、Ｃ_６－Ｃ_９アルキルである。いくつかのこれらの実施形態では、Ｒ^７は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^ｂ、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^ｂ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｂ、－ＯＲ^ｂ、－Ｓ（Ｏ）_ｘＲ^ｂ、－Ｓ－ＳＲ^ｂ、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ^ｂ、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｂ、－ＮＲ^ａＲ^ｂ、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｂ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａＲ^ｂ、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａＲ^ｂ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａＲ^ｂ、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＯＲ^ｂ、－ＮＲ^ａＳ（Ｏ）_ｘＮＲ^ａＲ^ｂ、－ＮＲ^ａＳ（Ｏ）_ｘＲ^ｂ、または－Ｓ（Ｏ）_ｘＮＲ^ａＲ^ｂで置換され、Ｒ^ａは、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^ｂは、Ｃ_１－Ｃ_１５アルキルであり、ｘは、０、１、または２である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^７は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^ｂまたは－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^ｂで置換される。

式（ＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、Ｒ^ｂは、分岐Ｃ_１－Ｃ_１６アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^ｂは、以下の構造のうちの１つを有する：

。

他の特定の式（ＩＩ）の前述の実施形態では、Ｒ^８またはＲ^９の一方は、メチルである。他の実施形態では、Ｒ^８及びＲ^９は両方とも、メチルである。

式（ＩＩ）のいくつかの異なる実施形態では、Ｒ^８及びＲ^９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、５員、６員、または７員の複素環を形成する。前述のいくつかの実施形態では、Ｒ^８及びＲ^９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、５員複素環、例えば、ピロリジニル環を形成する。前述のいくつかの実施形態では、Ｒ^８及びＲ^９は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、６員複素環、例えば、ピロリジニル環を形成する。

実施形態３の特定の実施形態では、第１及び第２のカチオン性脂質は、各々、独立して、式ＩＩの脂質から選択される。

前述の式（ＩＩ）の脂質のさらに他の実施形態では、Ｇ^３は、Ｃ_２－Ｃ_４アルキレン、例えば、Ｃ_３アルキレンである。様々な異なる実施形態では、脂質化合物は、以下の表２に示される構造のうちの１つを有する。

（表２）式（ＩＩ）の代表的脂質

いくつかの他の実施形態では、実施形態１、２、３、４、または５のカチオン性脂質は、式ＩＩＩの構造を有するか、

またはその薬学的に許容可能な塩、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｌ^１またはＬ^２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、または
－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ^１またはＬ^２の他方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、または
－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、または直接結合であり、
Ｇ^１及びＧ^２は、各々、独立して、非置換Ｃ_１－Ｃ_１２アルキレンまたはＣ_１－Ｃ_１２アルケニレンであり、
Ｇ^３は、Ｃ_１－Ｃ_２４アルキレン、Ｃ_１－Ｃ_２４アルケニレン、Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキレン、Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルケニレンであり、
Ｒ^ａは、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
Ｒ^１及びＲ^２は、各々、独立して、Ｃ_６－Ｃ_２４アルキルまたはＣ_６－Ｃ_２４アルケニルであり、
Ｒ^３は、Ｈ、ＯＲ^５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^４または－ＮＲ^５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^４であり、
Ｒ^４は、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
Ｒ^５は、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、
ｘは、０、１、または２である。

式（ＩＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、脂質は、以下の式（ＩＩＩＡ）または（ＩＩＩＢ）のうちの１つを有し、

式中、
Ａは、３～８員シクロアルキルまたはシクロアルキレン環であり、
Ｒ^６は、各存在で、独立して、Ｈ、ＯＨまたはＣ_１－Ｃ_２４アルキルであり、
ｎは、１～１５の範囲の整数である。

式（ＩＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、脂質は、式（ＩＩＩＡ）を有し、他の実施形態では、脂質は、式（ＩＩＩＢ）を有する。

式（ＩＩＩ）の他の実施形態では、脂質は、以下の式（ＩＩＩＣ）または（ＩＩＩＤ）のうちの１つを有し、

式中、ｙ及びｚは、各々、独立して、１～１２の範囲の整数である。

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいずれかでは、Ｌ^１またはＬ^２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２の各々は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。前述のいずれかのいくつかの異なる実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は、各々、独立して、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－または－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２の各々は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。

式（ＩＩＩ）のいくつかの異なる実施形態では、脂質は、以下の式（ＩＩＩＥ）または（ＩＩＩＦ）のうちの１つを有する：

。

式（ＩＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、脂質は、以下の式（ＩＩＩＧ）、（ＩＩＩＨ）、（ＩＩＩＩ）、または（ＩＩＩＪ）のうちの１つを有する：

。

式（ＩＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、ｎは、２～１２、例えば、２～８または２～４の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｎは、３、４、５または６である。いくつかの実施形態では、ｎは、３である。いくつかの実施形態では、ｎは、４である。いくつかの実施形態では、ｎは、５である。いくつかの実施形態では、ｎは、６である。

式（ＩＩＩ）のいくつかの他の前述の実施形態では、ｙ及びｚは、各々、独立して、２～１０の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｙ及びｚは、各々、独立して、４～９または４～６の範囲の整数である。

式（ＩＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、Ｒ^６は、Ｈである。他の前述の実施形態では、Ｒ^６は、Ｃ_１－Ｃ_２４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ^６は、ＯＨである。

式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｇ^３は、非置換である。他の実施形態では、Ｇ３は、置換される。様々な異なる実施形態では、Ｇ^３は、直鎖状Ｃ_１－Ｃ_２４アルキレンまたは直鎖状Ｃ_１－Ｃ_２４アルケニレンである。

式（ＩＩＩ）のいくつかの他の前述の実施形態では、Ｒ^１もしくはＲ^２、またはその両方は、Ｃ_６－Ｃ_２４アルケニルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、各々、独立して、以下の構造を有し、

式中、
Ｒ^７ａ及びＲ^７ｂは、各存在で、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
ａは、２～１２の整数であり、
Ｒ^７ａ、Ｒ^７ｂ及びａは、各々、Ｒ^１及びＲ^２が、各々、独立して、６～２０個の炭素原子を含むように選択される。例えば、いくつかの実施形態では、ａは、５～９または８～１２の範囲の整数である。

式（ＩＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、Ｒ^７ａの少なくとも１つの存在においてＨである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^７ａは各存在においてＨである。前述の他の異なる実施形態では、Ｒ^７ｂの少なくとも１つの存在は、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。

式（ＩＩＩ）の異なる実施形態では、Ｒ^１もしくはＲ^２、またはその両方は、以下の構造のうちの１つを有する：

。

式（ＩＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、Ｒ^３は、－ＯＨ、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^４または－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ^４である。いくつかの実施形態では、Ｒ^４は、メチルまたはエチルである。

実施形態３のいくつかの特定の実施形態では、第１及び第２のカチオン性脂質は、各々、独立して、式ＩＩＩの脂質から選択される。

様々な異なる実施形態では、式（ＩＩＩ）の開示された実施形態のいずれか１つのカチオン性脂質（例えば、カチオン性脂質、第１のカチオン性脂質、第２のカチオン性脂質）は、以下の表３に示される構造のうちの１つを有する。

（表３）式（ＩＩＩ）の代表的な化合物

一実施形態では、実施形態１、２、３、４、または５のいずれか１つのカチオン性脂質は、式（ＩＶ）の構造を有するか、

またはその薬学的に許容可能な塩、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｇ^１またはＧ^２の一方は、各存在で、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｙ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－Ｎ（Ｒ^ａ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）－、－Ｎ（Ｒ^ａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）－、または－Ｎ（Ｒ^ａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｇ^１またはＧ^２の他方は、各存在で、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｙ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－Ｎ（Ｒ^ａ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）－、－Ｎ（Ｒ^ａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）－、または
－Ｎ（Ｒ^ａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、または直接結合であり、
Ｌは、各存在で、～Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－であり、～は、Ｘとの共有結合を表し、
Ｘは、ＣＲ^ａであり、
Ｚは、ｎが１である場合、アルキル、シクロアルキル、または少なくとも１つの極性官能基を含む一価部分であるか、またはＺは、ｎが１を超える場合、アルキレン、シクロアルキレン、または少なくとも１つの極性官能基を含む多価部分であり、
Ｒ^ａは、各存在で、独立して、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１２ヒドロキシアルキル、Ｃ_１－Ｃ_１２アミノアルキル、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルアミノアルキル、Ｃ_１－Ｃ_１２アルコキシアルキル、Ｃ_１－Ｃ_１２アルコキシカルボニル、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルカルボニルオキシ、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルカルボニルオキシアルキル、またはＣ_１－Ｃ_１２アルキルカルボニルであり、
Ｒは、各存在で、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキル、または（ｂ）Ｒが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ^１及びＲ^２は、各存在で、それぞれ、以下の構造を有し、

ａ^１及びａ^２は、各存在で、独立して、３～１２の整数であり、
ｂ^１及びｂ^２は、各存在で、独立して、０または１であり、
ｃ^１及びｃ^２は、各存在で、独立して、５～１０の整数であり、
ｄ^１及びｄ^２は、各存在で、独立して、５～１０の整数であり、
ｙは、各存在で、独立して、０～２の整数であり、
ｎは、１～６の整数であり、
各アルキル、アルキレン、ヒドロキシルアルキル、アミノアルキル、アルキルアミニルアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルカルボニルオキシアルキル、及びアルキルカルボニルは、任意で、１つ以上の置換基で置換される。

式（ＩＶ）のいくつかの実施形態では、Ｇ^１及びＧ^２は、各々、独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－または－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。

式（ＩＶ）の他の実施形態では、Ｘは、ＣＨである。

式（ＩＶ）の異なる実施形態では、ａ^１＋ｂ^１＋ｃ^１の合計またはａ^２＋ｂ^２＋ｃ^２の合計は、１２～２６の整数である。

式（ＩＶ）のさらに他の実施形態では、ａ^１及びａ^２は、独立して、３～１０の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ａ^１及びａ^２は、独立して、４～９の整数である。

式（ＩＶ）の様々な実施形態では、ｂ^１及びｂ^２は、０である。異なる実施形態では、ｂ^１及びｂ^２は、１である。

式（ＩＶ）のさらなる実施形態では、ｃ^１、ｃ^２、ｄ^１、及びｄ^２は、独立して、６～８の整数である。

式（ＩＶ）の他の実施形態では、ｃ^１及びｃ^２は、各存在で、独立して、６～１０の整数であり、ｄ^１及びｄ^２は、各存在で、独立して、６～１０の整数である。

式（ＩＶ）の他の実施形態では、ｃ^１及びｃ^２は、各存在で、独立して、５～９の整数であり、ｄ^１及びｄ^２は、各存在で、独立して、５～９の整数である。

式（ＩＶ）のさらなる実施形態では、Ｚは、ｎが１である場合、アルキル、シクロアルキル、または少なくとも１つの極性官能基を含む一価部分である。他の実施形態では、Ｚは、アルキルである。

前述の式（ＩＶ）の様々な実施形態では、Ｒは、各存在で、独立して、（ａ）Ｈもしくはメチル、または（ｂ）Ｒが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかである。特定の実施形態では、各Ｒは、Ｈである。他の実施形態では、少なくとも１つのＲは、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する。

式（ＩＶ）の化合物の他の実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、独立して、以下の構造のうちの１つを有する：

。

式（ＩＶ）の特定の実施形態では、化合物は、以下の構造のうちの１つを有する：

。

さらに異なる実施形態では、実施形態１、２、３、４、または５のカチオン性脂質は、式（Ｖ）の構造を有するか、

またはその薬学的に許容可能な塩、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｇ^１またはＧ^２の一方は、各存在で、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｙ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－Ｎ（Ｒ^ａ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）－、－Ｎ（Ｒ^ａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）－、または－Ｎ（Ｒ^ａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｇ^１またはＧ^２の他方は、各存在で、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｙ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－Ｎ（Ｒ^ａ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）－、－Ｎ（Ｒ^ａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^ａ）－、または－Ｎ（Ｒ^ａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、または直接結合であり、
Ｌは、各存在で、～Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－であり、～は、Ｘとの共有結合を表し、
Ｘは、ＣＲ^ａであり、
Ｚは、ｎが１である場合、アルキル、シクロアルキル、または少なくとも１つの極性官能基を含む一価部分であるか、またはＺは、ｎが１を超える場合、アルキレン、シクロアルキレン、または少なくとも１つの極性官能基を含む多価部分であり、
Ｒ^ａは、各存在で、独立して、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１２ヒドロキシアルキル、Ｃ_１－Ｃ_１２アミノアルキル、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルアミノアルキル、Ｃ_１－Ｃ_１２アルコキシアルキル、Ｃ_１－Ｃ_１２アルコキシカルボニル、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルカルボニルオキシ、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルカルボニルオキシアルキル、またはＣ_１－Ｃ_１２アルキルカルボニルであり、
Ｒは、各存在で、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキル、または（ｂ）Ｒが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ^１及びＲ^２は、各存在で、それぞれ、以下の構造を有し、

Ｒは、各存在で、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
ａ^１及びａ^２は、各存在で、独立して、３～１２の整数であり、
ｂ^１及びｂ^２は、各存在で、独立して、０または１であり、
ｃ^１及びｃ^２は、各存在で、独立して、２～１２の整数であり、
ｄ^１及びｄ^２は、各存在で、独立して、２～１２の整数であり、
ｙは、各存在で、独立して、０～２の整数であり、
ｎは、１～６の整数であり、
ａ^１、ａ^２、ｃ^１、ｃ^２、ｄ^１、及びｄ^２は、ａ^１＋ｃ^１＋ｄ^１の合計が、１８～３０の整数であり、ａ^２＋ｃ^２＋ｄ^２の合計が、１８～３０の整数であるように選択され、各アルキル、アルキレン、ヒドロキシルアルキル、アミノアルキル、アルキルアミニルアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルカルボニルオキシアルキル、及びアルキルカルボニルは、任意で、１つ以上の置換基で置換される。

式（Ｖ）の特定の実施形態では、Ｇ^１及びＧ^２は、各々、独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－または－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。

式（Ｖ）の他の実施形態では、Ｘは、ＣＨである。

式（Ｖ）のいくつかの実施形態では、ａ^１＋ｃ^１＋ｄ^１の合計が、２０～３０の整数であり、ａ^２＋ｃ^２＋ｄ^２の合計が、１８～３０の整数である。他の実施形態では、ａ^１＋ｃ^１＋ｄ^１の合計が、２０～３０の整数であり、ａ^２＋ｃ^２＋ｄ^２の合計が、２０～３０の整数である。式（Ｖ）のさらなる実施形態では、ａ^１＋ｂ^１＋ｃ^１の合計またはａ^２＋ｂ^２＋ｃ^２の合計は、１２～２６の整数である。他の実施形態では、ａ^１、ａ^２、ｃ^１、ｃ^２、ｄ^１、及びｄ^２は、ａ^１＋ｃ^１＋ｄ^１の合計が、１８～２８の整数であり、ａ^２＋ｃ^２＋ｄ^２の合計が、１８～２８の整数であるように選択される。

式（Ｖ）のさらに他の実施形態では、ａ^１及びａ^２は、独立して、３～１０の整数、例えば、４～９の整数である。

式（Ｖ）のさらに他の実施形態では、ｂ^１及びｂ^２は、０である。異なる実施形態では、ｂ^１及びｂ^２は、１である。

式（Ｖ）の特定の他の実施形態では、ｃ^１、ｃ^２、ｄ^１、及びｄ^２は、独立して、６～８の整数である。

式（Ｖ）の異なる他の実施形態では、Ｚは、ｎが１である場合、アルキル、または少なくとも１つの極性官能基を含む一価部分であるか、またはＺは、ｎが１を超える場合、アルキレン、または少なくとも１つの極性官能基を含む多価部分である。

式（Ｖ）のさらなる実施形態では、Ｚは、ｎが１である場合、アルキル、シクロアルキル、または少なくとも１つの極性官能基を含む一価部分である。他の実施形態では、Ｚは、アルキルである。

式（Ｖ）の他の異なる実施形態では、Ｒは、各存在で、独立して、（ａ）Ｈもしくはメチル、または（ｂ）Ｒが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかである。例えば、いくつかの実施形態では、各Ｒは、Ｈである。他の実施形態では、少なくとも１つのＲは、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する。

さらなる実施形態では、各Ｒ’は、Ｈである。

式（Ｖ）の特定の実施形態では、ａ^１＋ｃ^１＋ｄ^１の合計が、２０～２５の整数であり、ａ^２＋ｃ^２＋ｄ^２の合計が、２０～２５の整数である。

式（Ｖ）の他の実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、独立して、以下の構造のうちの１つを有する：

。

式（Ｖ）のさらなる実施形態では、化合物は、以下の構造のうちの１つを有する：

。

式（ＩＶ）または（Ｖ）の前述の実施形態のいずれかでは、ｎは、１である。式（ＩＶ）または（Ｖ）の前述の実施形態の他の実施形態では、ｎは、１超である。

式（ＩＶ）または（Ｖ）の前述の実施形態のさらにいずれかでは、Ｚは、少なくとも１つの極性官能基を含む一価または多価部分である。いくつかの実施形態では、Ｚは、少なくとも１つの極性官能基を含む一価部分である。他の実施形態では、Ｚは、少なくとも１つの極性官能基を含む多価部分である。

式（ＩＶ）または（Ｖ）の前述の実施形態のさらにいずれかでは、極性官能基は、ヒドロキシル、アルコキシ、エステル、シアノ、アミド、アミノ、アルキルアミニル、ヘテロシクリル、またはヘテロアリール官能基である。

式（ＩＶ）または（Ｖ）の前述の実施形態のいずれかでは、Ｚは、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミニル、アルキルアミニルアルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロシクリルアルキルである。

式（ＩＶ）または（Ｖ）のいくつかの他の実施形態では、Ｚは、以下の構造を有し、

式中、
Ｒ^５及びＲ^６は、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^７及びＲ^８は、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであるか、またはＲ^７及びＲ^８は、それらが結合している窒素原子と一緒になって結合して、３～７員の複素環を形成し、
ｘは、０～６の整数である。

式（ＩＶ）または（Ｖ）のさらに異なる実施形態では、Ｚは、以下の構造を有し、

式中、
Ｒ^５及びＲ^６は、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^７及びＲ^８は、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであるか、またはＲ^７及びＲ^８は、それらが結合している窒素原子と一緒になって結合して、３～７員の複素環を形成し、
ｘは、０～６の整数である。

式（ＩＶ）または（Ｖ）のさらに異なる実施形態では、Ｚは、以下の構造を有し、

式中、
Ｒ^５及びＲ^６は、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^７及びＲ^８は、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであるか、またはＲ^７及びＲ^８は、それらが結合している窒素原子と一緒になって結合して、３～７員の複素環を形成し、
ｘは、０～６の整数である。

式（ＩＶ）または（Ｖ）のいくつかの他の実施形態では、Ｚは、ヒドロキシルアルキル、シアノアルキル、または１つ以上のエステルもしくはアミド基で置換されたアルキルである。

例えば、式（ＩＶ）または（Ｖ）の前述の実施形態のいずれかでは、Ｚは、以下の構造のうちの１つを有する：

。

式（ＩＶ）または（Ｖ）の他の実施形態では、Ｚ－Ｌは、以下の構造のうちの１つを有する：

。

他の実施形態では、Ｚ－Ｌは、以下の構造のうちの１つを有する：

。

さらに他の実施形態では、Ｘは、ＣＨであり、Ｚ－Ｌは、以下の構造のうちの１つを有する：

。

様々な異なる実施形態において、実施形態１、２、３、４、または５のいずれか１つのカチオン性脂質は、以下の表４に示される構造のうちの１つを有する。

（表４）式（ＩＶ）または（Ｖ）の代表的な化合物

一実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造（ＶＩ）を有する化合物であるか、

またはその薬学的に許容可能な塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｌ^１及びＬ^２は、各々、独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、または直接結合であり、
Ｇ^１は、Ｃ_１－Ｃ_２アルキレン、－（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、または直接結合であり、
Ｇ^２は、－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、または直接結合であり、
Ｇ^３は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキレンであり、
Ｒ^ａは、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、各存在で、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキル、または（ｂ）Ｒ^１ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^１ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、各存在で、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキル、または（ｂ）Ｒ^２ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^２ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^２ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂは、各存在で、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキル、または（ｂ）Ｒ^３ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^３ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^３ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂは、各存在で、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキル、または（ｂ）Ｒ^４ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^４ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ^５及びＲ^６は、各々、独立して、Ｈまたはメチルであり、
Ｒ^７は、ＨまたはＣ_１－Ｃ_２０アルキルであり、
Ｒ^８は、ＯＨ、－Ｎ（Ｒ^９）（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^１０、－（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ^９Ｒ^１０、－ＮＲ^９Ｒ^１０、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^１１、または－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^１１であり、ただし、Ｒ^８が－ＮＲ^９Ｒ^１０である場合、Ｇ^３は、Ｃ_４－Ｃ_６アルキレンであり、
Ｒ^９及びＲ^１０は、各々、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
Ｒ^１１は、アラルキルであり、
ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、各々、独立して、１～２４の整数であり、
ｘは、０、１、または２であり、
各アルキル、アルキレン及びアラルキルは、任意で置換される。

構造（ＶＩ）のいくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は、各々、独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、または直接結合である。他の実施形態では、Ｇ^１及びＧ^２は、各々、独立して、－（Ｃ＝Ｏ）－または直接結合である。いくつかの異なる実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は、各々、独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、または直接結合であり、Ｇ^１及びＧ^２は、各々、独立して、－（Ｃ＝Ｏ）－または直接結合である。

構造（ＶＩ）のいくつかの異なる実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は、各々、独立して、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲ^ａＳ（Ｏ）_ｘＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａＳ（Ｏ）_ｘ－、または－Ｓ（Ｏ）_ｘＮＲ^ａ－である。

構造（ＶＩ）の他の前述の実施形態では化合物は、以下の構造（ＶＩＡ）または（ＶＩＢ）のうちの１つを有する：

。

いくつかの実施形態では、化合物は、構造（ＶＩＡ）を有する。他の実施形態では、化合物は、構造（ＶＩＢ）を有する。

構造（ＶＩ）の前述の実施形態のいずれかでは、Ｌ^１またはＬ^２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２の各々は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。

前述のいずれかのいくつかの異なる実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２の各々は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。

構造（ＶＩ）の異なる実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２の一方は、直接結合である。本明細書で使用される「直接結合」は、基（例えば、Ｌ^１またはＬ^２）が存在しないことを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２の各々は、直接結合である。

前述の他の異なる実施形態では、Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂの少なくとも１つの存在について、Ｒ^１ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^１ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する。

構造（ＶＩ）のさらに他の異なる実施形態では、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂの少なくとも１つの存在について、Ｒ^４ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^４ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する。

構造（ＶＩ）のさらなる実施形態では、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂの少なくとも１つの存在について、Ｒ^２ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^２ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^２ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する。

前述のいずれかの他の異なる実施形態では、Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂの少なくとも１つの存在について、Ｒ^３ａが、ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^３ｂが、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^３ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する。

「炭素－炭素」二重結合は、以下の構造のうちの１つを指すことが理解され、

式中、Ｒ^ｃ及びＲ^ｄは、各存在で、独立して、Ｈまたは置換基である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^ｃ及びＲ^ｄは、各存在で、独立して、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルまたはシクロアルキル、例えば、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルである。

様々な他の実施形態では、化合物は、以下の構造（ＶＩＣ）または（ＶＩＤ）のうちの１つを有し、

式中、ｅ、ｆ、ｇ、及びｈは、各々、独立して、１～１２の整数である。

いくつかの実施形態では、化合物は、構造（ＶＩＣ）を有する。他の実施形態では、化合物は、構造（ＶＩＤ）を有する。

構造（ＶＩＣ）または（ＶＩＤ）の化合物の様々な実施形態では、ｅ、ｆ、ｇ、及びｈは、各々、独立して、４～１０の整数である。

他の異なる実施形態では、

または両方が、独立して、以下の構造のうちの１つを有する：

。

前述の特定の実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、各々、独立して、２～１２の整数、または４～１２の整数である。他の実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、各々、独立して、８～１２または５～９の整数である。いくつかの特定の実施形態では、ａは、０である。いくつかの実施形態では、ａは、１である。他の実施形態では、ａは、２である。より多くの実施形態では、ａは、３である。さらに他の実施形態では、ａは、４である。いくつかの実施形態では、ａは、５である。他の実施形態では、ａは、６である。より多くの実施形態では、ａは、７である。さらに他の実施形態では、ａは、８である。いくつかの実施形態では、ａは、９である。他の実施形態では、ａは、１０である。さらなる実施形態では、ａは、１１である。さらに他の実施形態では、ａは、１２である。いくつかの実施形態では、ａは、１３である。他の実施形態では、ａは、１４である。さらなる実施形態では、ａは、１５である。さらに他の実施形態では、ａは、１６である。

構造（ＶＩ）のいくつかの実施形態では、ｂは、１である。他の実施形態では、ｂは、２である。さらなる実施形態では、ｂは、３である。さらに他の実施形態では、ｂは、４である。いくつかの実施形態では、ｂは、５である。他の実施形態では、ｂは、６である。さらなる実施形態では、ｂは、７である。さらに他の実施形態では、ｂは、８である。いくつかの実施形態では、ｂは、９である。他の実施形態では、ｂは、１０である。さらなる実施形態では、ｂは、１１である。さらに他の実施形態では、ｂは、１２である。いくつかの実施形態では、ｂは、１３である。他の実施形態では、ｂは、１４である。さらなる実施形態では、ｂは、１５である。さらに他の実施形態では、ｂは、１６である。

構造（ＶＩ）のいくつかの実施形態では、ｃは、１である。他の実施形態では、ｃは、２である。さらなる実施形態では、ｃは、３である。さらに他の実施形態では、ｃは、４である。いくつかの実施形態では、ｃは、５である。他の実施形態では、ｃは、６である。さらなる実施形態では、ｃは、７である。さらに他の実施形態では、ｃは、８である。いくつかの実施形態では、ｃは、９である。他の実施形態では、ｃは、１０である。さらなる実施形態では、ｃは、１１である。さらに他の実施形態では、ｃは、１２である。いくつかの実施形態では、ｃは、１３である。他の実施形態では、ｃは、１４である。さらなる実施形態では、ｃは、１５である。さらに他の実施形態では、ｃは、１６である。

構造（ＶＩ）のいくつかの特定の実施形態では、ｄは、０である。いくつかの実施形態では、ｄは、１である。他の実施形態では、ｄは、２である。さらなる実施形態では、ｄは、３である。さらに他の実施形態では、ｄは、４である。いくつかの実施形態では、ｄは、５である。他の実施形態では、ｄは、６である。さらなる実施形態では、ｄは、７である。さらに他の実施形態では、ｄは、８である。いくつかの実施形態では、ｄは、９である。他の実施形態では、ｄは、１０である。さらなる実施形態では、ｄは、１１である。さらに他の実施形態では、ｄは、１２である。いくつかの実施形態では、ｄは、１３である。他の実施形態では、ｄは、１４である。さらなる実施形態では、ｄは、１５である。さらに他の実施形態では、ｄは、１６である。

構造（ＶＩ）のいくつかの実施形態では、ｅは、１である。他の実施形態では、ｅは、２である。さらなる実施形態では、ｅは、３である。さらに他の実施形態では、ｅは、４である。いくつかの実施形態では、ｅは、５である。他の実施形態では、ｅは、６である。さらなる実施形態では、ｅは、７である。さらに他の実施形態では、ｅは、８である。いくつかの実施形態では、ｅは、９である。他の実施形態では、ｅは、１０である。さらなる実施形態では、ｅは、１１である。さらに他の実施形態では、ｅは、１２である。

構造（ＶＩ）のいくつかの実施形態では、ｆは、１である。他の実施形態では、ｆは、２である。さらなる実施形態では、ｆは、３である。さらに他の実施形態では、ｆは、４である。いくつかの実施形態では、ｆは、５である。他の実施形態では、ｆは、６である。さらなる実施形態では、ｆは、７である。さらに他の実施形態では、ｆは、８である。いくつかの実施形態では、ｆは、９である。他の実施形態では、ｆは、１０である。さらなる実施形態では、ｆは、１１である。さらに他の実施形態では、ｆは、１２である。

構造（ＶＩ）のいくつかの実施形態では、ｇは、１である。他の実施形態では、ｇは、２である。さらなる実施形態では、ｇは、３である。さらに他の実施形態では、ｇは、４である。いくつかの実施形態では、ｇは、５である。他の実施形態では、ｇは、６である。さらなる実施形態では、ｇは、７である。さらに他の実施形態では、ｇは、８である。いくつかの実施形態では、ｇは、９である。他の実施形態では、ｇは、１０である。さらなる実施形態では、ｇは、１１である。さらに他の実施形態では、ｇは、１２である。

構造（ＶＩ）のいくつかの実施形態では、ｈは、１である。他の実施形態では、ｅは、２である。さらなる実施形態では、ｈは、３である。さらに他の実施形態では、ｈは、４である。いくつかの実施形態では、ｅは、５である。他の実施形態では、ｈは、６である。さらなる実施形態では、ｈは、７である。さらに他の実施形態では、ｈは、８である。いくつかの実施形態では、ｈは、９である。他の実施形態では、ｈは、１０である。さらなる実施形態では、ｈは、１１である。さらに他の実施形態では、ｈは、１２である。

構造（ＶＩ）のいくつかの他の様々な実施形態では、ａ及びｄは、同じである。いくつかの他の実施形態では、ｂ及びｃは、同じである。いくつかの他の特定の実施形態では、ａ及びｄは、同じであり、ｂ及びｃは、同じである。

ａ及びｂの合計ならびにｃ及びｄの合計は、所望の特性を有する脂質を得るために変化し得る因子である。一実施形態では、ａ及びｂは、それらの合計が１４～２４の範囲の整数であるように選択される。他の実施形態では、ｃ及びｄは、それらの合計が１４～２４の範囲の整数であるように選択される。さらなる実施形態では、ａ及びｂの合計ならびにｃ及びｄの合計は、同じである。例えば、いくつかの実施形態では、ａ及びｂの合計ならびにｃ及びｄの合計は両方とも、１４～２４の範囲であり得る同じ整数である。なおさらなる実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、ａ及びｂの合計ならびにｃ及びｄの合計が１２以上であるように選択される。

Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、及びＲ^４ａにおける置換基は、特に限定されない。いくつかの実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、及びＲ^４ａの少なくとも１つは、Ｈである。特定の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、及びＲ^４ａは、各存在でＨである。特定の他の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、及びＲ^４ａの少なくとも１つは、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルである。特定の他の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、及びＲ^４ａの少なくとも１つは、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルである。特定の他の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、及びＲ^４ａの少なくとも１つは、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルである。いくつかの前述の実施形態では、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。

前述の特定の実施形態では、Ｒ^１ａ、Ｒ^１ｂ、Ｒ^４ａ、及びＲ^４ｂは、各存在でＣ_１－Ｃ_１２アルキルである。

前述のさらなる実施形態では、Ｒ^１ｂ、Ｒ^２ｂ、Ｒ^３ｂ、及びＲ^４ｂの少なくとも１つはＨであるか、またはＲ^１ｂ、Ｒ^２ｂ、Ｒ^３ｂ、及びＲ^４ｂは各存在でＨである。

前述の特定の実施形態では、Ｒ^１ｂは、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する。前述のＲ^４ｂの他の実施形態では、それが結合している炭素原子と一緒になって、隣接するＲ^４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって、炭素－炭素二重結合を形成する。

Ｒ^５及びＲ^６の置換基は、前述の実施形態では特に限定されない。特定の実施形態では、Ｒ^５またはＲ^６の一方は、メチルである。他の実施形態では、Ｒ^５またはＲ^６の各々は、メチルである。

Ｒ^７の置換基は、前述の実施形態では特に限定されない。特定の実施形態では、Ｒ^７は、Ｃ_６－Ｃ_１６アルキルである。いくつかの他の実施形態では、Ｒ^７は、Ｃ_６－Ｃ_９アルキルである。いくつかのこれらの実施形態では、Ｒ^７は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^ｂ、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^ｂ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｂ、－ＯＲ^ｂ、－Ｓ（Ｏ）_ｘＲ^ｂ、－Ｓ－ＳＲ^ｂ、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ^ｂ、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｂ、－ＮＲ^ａＲ^ｂ、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｂ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａＲ^ｂ、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａＲ^ｂ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａＲ^ｂ、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＯＲ^ｂ、－ＮＲ^ａＳ（Ｏ）_ｘＮＲ^ａＲ^ｂ、－ＮＲ^ａＳ（Ｏ）_ｘＲ^ｂ、または－Ｓ（Ｏ）_ｘＮＲ^ａＲ^ｂで置換され、Ｒ^ａは、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^ｂは、Ｃ_１－Ｃ_１５アルキルであり、ｘは、０、１、または２である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^７は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^ｂまたは－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^ｂで置換される。

構造（ＶＩ）の様々な前述の実施形態では、Ｒ^ｂは、分岐Ｃ_３－Ｃ_１５アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^ｂは、以下の構造のうちの１つを有する：

。

他の実施形態では、Ｒ^８は、ＯＨである。

構造（ＶＩ）の他の実施形態では、Ｒ^８は、－Ｎ（Ｒ^９）（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^１０である。いくつかの他の実施形態では、Ｒ^８は、－（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ^９Ｒ^１０である。なおさらなる実施形態では、Ｒ^８は、－ＮＲ^９Ｒ^１０である。いくつかの前述の実施形態では、Ｒ^９及びＲ^１０は、各々、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_８アルキル、例えば、ＨまたはＣ_１－Ｃ_３アルキルである。より具体的なこれらの実施形態では、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルまたはＣ_１－Ｃ_３アルキルは、非置換であるか、またはヒドロキシルで置換される。他のこれらの実施形態では、Ｒ^９及びＲ^１０は、各々、メチルである。

構造（ＶＩ）のなおさらなる実施形態では、Ｒ^８は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^１１である。いくつかのこれらの実施形態では、Ｒ^１１は、ベンジルである。

構造（ＶＩ）のさらにより具体的な実施形態では、Ｒ^８は、以下の構造のうちの１つを有する：

。

前述の化合物のさらに他の実施形態では、Ｇ^３は、Ｃ_２－Ｃ_５アルキレン、例えば、Ｃ_２－Ｃ_４アルキレン、Ｃ_３アルキレンまたはＣ_４アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｒ^８は、ＯＨである。他の実施形態では、Ｇ^２は、非存在であり、Ｒ^７はＣ_１－Ｃ_２アルキレン、例えば、メチルである。

様々な異なる実施形態では、化合物は、以下の表５に示される構造のうちの１つを有する。

（表５）構造（ＶＩ）の代表的なカチオン性脂質

一実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造（ＶＩＩ）を有する化合物であるか、

またはその薬学的に許容可能な塩、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｘ及びＸ’は、各々、独立して、ＮまたはＣＲであり、
Ｙ及びＹ’は、各々、独立して、非存在、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、またはＮＲであり、ただし、
ａ）ＸがＮである場合、Ｙは非存在であり、
ｂ）Ｘ’がＮである場合、Ｙ’は非存在であり、
ｃ）ＸがＣＲである場合、Ｙは－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、またはＮＲであり、
ｄ）Ｘ’がＣＲである場合、Ｙ’は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、またはＮＲであり、
Ｌ^１及びＬ^１’は、各々、独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^１、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^１、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^１、－ＯＲ^１、－Ｓ（Ｏ）_ｚＲ^１、－Ｓ－ＳＲ^１、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ^１、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ^１、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｒ^１、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＯＲ^１であり、
Ｌ^２及びＬ^２’は、各々、独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^２、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^２、－ＯＲ^２、－Ｓ（Ｏ）_ｚＲ^２、－Ｓ－ＳＲ^２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ^２、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ^２、－ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）Ｒ^２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆ、－ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆ、－ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）ＯＲ^２、またはＲ^２へとの直接結合であり、
Ｇ^１、Ｇ^１’、Ｇ^２、及びＧ^２’は、各々、独立して、Ｃ_２－Ｃ_１２アルキレンまたはＣ_２－Ｃ_１２アルケニレンであり、
Ｇ^３は、Ｃ_２－Ｃ_２４ヘテロアルキレンまたはＣ_２－Ｃ_２４ヘテロアルケニレンであり、
Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｄ、及びＲ^ｅは、各存在で、独立して、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルまたはＣ_２－Ｃ_１２アルケニルであり、
Ｒ^ｃ及びＲ^ｆは、各存在で、独立して、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルまたはＣ_２－Ｃ_１２アルケニルであり、
Ｒは、各存在で、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
Ｒ^１及びＲ^２は、各々、独立して、分岐Ｃ_６－Ｃ_２４アルキルまたは分岐Ｃ_６－Ｃ_２４アルケニルであり、
ｚは、０、１、または２であり、
各アルキル、アルケニル、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、及びヘテロアルケニレンは、別段の指定がない限り、独立して、置換または非置換である。

構造（ＶＩＩ）の他の異なる実施形態では、
Ｘ及びＸ’は、各々、独立して、ＮまたはＣＲであり、
Ｙ及びＹ’は、各々、独立して、非存在、またはＮＲであり、ただし、
ａ）ＸがＮである場合、Ｙは非存在であり、
ｂ）Ｘ’がＮである場合、Ｙ’は非存在であり、
ｃ）ＸがＣＲである場合、ＹはＮＲであり、
ｄ）Ｘ’がＣＲの場合、Ｙ’はＮＲであり、
Ｌ^１及びＬ^１’は、各々、独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^１、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^１、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^１、－ＯＲ^１、－Ｓ（Ｏ）_ｚＲ^１、－Ｓ－ＳＲ^１、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ^１、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ^１、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｒ^１、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＯＲ^１であり、
Ｌ^２及びＬ^２’は、各々、独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^２、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^２、－ＯＲ^２、－Ｓ（Ｏ）_ｚＲ^２、－Ｓ－ＳＲ^２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ^２、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ^２、－ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）Ｒ^２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆ、－ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆ、－ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）ＯＲ^２、またはＲ^２へとの直接結合であり、
Ｇ^１、Ｇ^１’、Ｇ^２、及びＧ^２’は、各々、独立して、Ｃ_２－Ｃ_１２アルキレンまたはＣ_２－Ｃ_１２アルケニレンであり、
Ｇ^３は、Ｃ_２－Ｃ_２４アルキレンオキシドまたはＣ_２－Ｃ_２４アルケニレンオキシドであり、
Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｄ、及びＲ^ｅは、各存在で、独立して、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルまたはＣ_２－Ｃ_１２アルケニルであり、
Ｒ^ｃ及びＲ^ｆは、各存在で、独立して、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルまたはＣ_２－Ｃ_１２アルケニルであり、
Ｒは、各存在で、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
Ｒ^１及びＲ^２は、各々、独立して、分岐Ｃ_６－Ｃ_２４アルキルまたは分岐Ｃ_６－Ｃ_２４アルケニルであり、
ｚは、０、１、または２であり、
各アルキル、アルケニル、アルキレン、アルケニレン、アルキレンオキシド、及びアルケニレンオキシドは、別段の指定がない限り、独立して、置換または非置換である。

構造（ＶＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｇ^３は、Ｃ_２－Ｃ_２４アルキレンオキシドまたはＣ_２－Ｃ_２４アルケニレンオキシドである。特定の実施形態では、Ｇ^３は、非置換である。他の実施形態では、Ｇ^３は、置換され、例えば、ヒドロキシルで置換される。より具体的な実施形態では、Ｇ^３は、Ｃ_２－Ｃ_１２アルキレンオキシドであり、例えば、いくつかの実施形態では、Ｇ^３は、Ｃ_３－Ｃ_７アルキレンオキシドであり、または他の実施形態では、Ｇ^３は、Ｃ_３－Ｃ_１２アルキレンオキシドである。

構造（ＶＩＩ）の他の実施形態では、Ｇ^３は、Ｃ_２－Ｃ_２４アルキレンアミニルまたはＣ_２－Ｃ_２４アルケニレンアミニル、例えば、Ｃ_６－Ｃ_１２アルキレンアミニルである。いくつかのこれらの実施形態では、Ｇ^３は、非置換である。他のこれらの実施形態では、Ｇ^３は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルで置換される。

構造（ＶＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｘ及びＸ’は、各々、Ｎであり、Ｙ及びＹ’は、各々、非存在である。他の実施形態では、Ｘ及びＸ’は、各々、ＣＲであり、Ｙ及びＹ’は、各々、ＮＲである。いくつかのこれらの実施形態では、Ｒは、Ｈである。

構造（ＶＩＩ）の特定の実施形態では、Ｘ及びＸ’は、各々、ＣＲであり、Ｙ及びＹ’は、各々、独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－または－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。

構造（ＶＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、化合物は、以下の構造（ＶＩＩＡ）、（ＶＩＩＢ）、（ＶＩＩＣ）、（ＶＩＩＤ）、（ＶＩＩＥ）、（ＶＩＩＦ）、（ＶＩＩＧ）、または（ＶＩＩＨ）のうちの１つを有し、

式中、Ｒ^ｄは、各存在で、独立して、Ｈまたは任意で置換Ｃ_１－Ｃ_６アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^ｄは、Ｈである。他の実施形態では、Ｒ^ｄは、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、例えば、メチルである。他の実施形態では、Ｒ^ｄは、置換Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、例えば、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ、－ＮＲＣ（＝Ｏ）Ｒ、または－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２で置換されるＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、Ｒは、各存在で、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルである。

構造（ＶＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、Ｌ^１及びＬ^１’は、各々、独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^１、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^１、または－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃであり、Ｌ^２及びＬ^２’は、各々、独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^２、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^２、または－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^１’は、各々、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^１であり、Ｌ^２及びＬ^２’は、各々、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^２である。他の実施形態では、Ｌ^１及びＬ^１’は、各々、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^１であり、Ｌ^２及びＬ^２’は、各々、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆである。他の実施形態では、Ｌ^１及びＬ^１’は、各々、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃであり、Ｌ^２及びＬ^２’は、各々、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆである。

前述のいくつかの実施形態では、Ｇ^１、Ｇ^１’、Ｇ^２、及びＧ^２は、各々、独立して、Ｃ_２－Ｃ_８アルキレン、例えば、Ｃ_４－Ｃ_８アルキレンである。

構造（ＶＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、Ｒ^１またはＲ^２は、各々、各存在で、独立して、分岐Ｃ_６－Ｃ_２４アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、各存在で、独立して、以下の構造を有し、

式中、
Ｒ^７ａ及びＲ^７ｂは、各存在で、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
ａは、２～１２の整数であり、
Ｒ^７ａ、Ｒ^７ｂ及びａは、各々、Ｒ^１及びＲ^２が、各々、独立して、６～２０個の炭素原子を含むように選択される。例えば、いくつかの実施形態では、ａは、５～９または８～１２の範囲の整数である。

構造（ＶＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、Ｒ^７ａの少なくとも１つの存在においてＨである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^７ａは各存在においてＨである。前述の他の異なる実施形態では、Ｒ^７ｂの少なくとも１つの存在は、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。

構造（ＶＩＩ）の異なる実施形態では、Ｒ^１もしくはＲ^２、またはその両方は、各存在で、独立して、以下の構造のうちの１つを有する：

。

構造（ＶＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｅ、及びＲ^ｆは、存在する場合、各々、独立して、Ｃ_３－Ｃ_１２アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｅ、及びＲ^ｆは、存在する場合、ｎ－ヘキシルであり、他の実施形態では、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｅ、及びＲ^ｆは、存在する場合、ｎ－オクチルである。

構造（ＶＩＩ）の様々な異なる実施形態では、カチオン性脂質は、以下の表６に示される構造のうちの１つを有する。

（表６）構造（ＶＩＩ）の代表的なカチオン性脂質

一実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造（ＶＩＩＩ）を有する化合物であるか、

またはその薬学的に許容可能な塩、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
ＸはＮであり、Ｙは非存在であるか、またはＸはＣＲであり、ＹはＮＲであり、
Ｌ^１は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^１、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^１、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^１、－ＯＲ^１、－Ｓ（Ｏ）_ｘＲ^１、－Ｓ－ＳＲ^１、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ^１、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ^１、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｒ^１、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＯＲ^１であり、
Ｌ^２は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^２、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^２、－ＯＲ^２、－Ｓ（Ｏ）_ｘＲ^２、－Ｓ－ＳＲ^２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ^２、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ^２、－ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）Ｒ^２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆ、－ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆ、－ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）ＯＲ^２、またはＲ^２との直接結合であり、
Ｌ^３は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^３または－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^３であり、
Ｇ^１及びＧ^２は、各々、独立して、Ｃ_２－Ｃ_１２アルキレンまたはＣ_２－Ｃ_１２アルケニレンであり、
Ｇ^３は、Ｃ_１－Ｃ_２４アルキレン、Ｃ_２－Ｃ_２４アルケニレン、Ｃ_１－Ｃ_２４ヘテロアルキレン、またはＣ_２－Ｃ_２４ヘテロアルケニレンであり、
Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｄ、及びＲ^ｅは、各々、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルまたはＣ_１－Ｃ_１２アルケニルであり、
Ｒ^ｃ及びＲ^ｆは、各々、独立して、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルまたはＣ_２－Ｃ_１２アルケニルであり、
各Ｒは、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
Ｒ^１、Ｒ^２、及びＲ^３は、各々、独立して、Ｃ_１－Ｃ_２４アルキルまたはＣ_２－Ｃ_２４アルケニルであり、
ｘは、０、１、または２であり、
各アルキル、アルケニル、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、及びヘテロアルケニレンは、別段の指定がない限り、独立して、置換または非置換である。

構造（１）のさらなる実施形態では、
ＸはＮであり、Ｙは非存在であるか、またはＸはＣＲであり、ＹはＮＲであり、
Ｌ^１は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^１、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^１、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^１、－ＯＲ^１、－Ｓ（Ｏ）_ｘＲ^１、－Ｓ－ＳＲ^１、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ^１、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ^１、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｒ^１、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＯＲ^１であり、
Ｌ^２は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^２、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^２、－ＯＲ^２、－Ｓ（Ｏ）_ｘＲ^２、－Ｓ－ＳＲ^２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ^２、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ^２、－ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）Ｒ^２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆ、－ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆ、－ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）ＯＲ^２、またはＲ^２との直接結合であり、
Ｌ^３は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^３または－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^３であり、
Ｇ^１及びＧ^２は、各々、独立して、Ｃ_２－Ｃ_１２アルキレンまたはＣ_２－Ｃ_１２アルケニレンであり、
Ｇ^３は、ＸがＣＲであり、ＹがＮＲである場合、Ｃ_１－Ｃ_２４アルキレン、Ｃ_２－Ｃ_２４アルケニレン、Ｃ_１－Ｃ_２４ヘテロアルキレン、またはＣ_２－Ｃ_２４ヘテロアルケニレンであり、Ｇ^３は、ＸがＮであり、Ｙが非存在である場合、Ｃ_１－Ｃ_２４ヘテロアルキレン、またはＣ_２－Ｃ_２４ヘテロアルケニレンであり、
Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｄ、及びＲ^ｅは、各々、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルまたはＣ_１－Ｃ_１２アルケニルであり、
Ｒ^ｃ及びＲ^ｆは、各々、独立して、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルまたはＣ_２－Ｃ_１２アルケニルであり、
各Ｒは、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
Ｒ^１、Ｒ^２、及びＲ^３は、各々、独立して、Ｃ_１－Ｃ_２４アルキルまたはＣ_２－Ｃ_２４アルケニルであり、
ｘは、０、１、または２であり、
各アルキル、アルケニル、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、及びヘテロアルケニレンは、別段の指定がない限り、独立して、置換または非置換である。

構造（Ｉ）の他の実施形態では、
ＸはＮであり、Ｙは非存在であるか、またはＸはＣＲであり、ＹはＮＲであり、
Ｌ^１は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^１、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^１、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^１、－ＯＲ^１、－Ｓ（Ｏ）_ｘＲ^１、－Ｓ－ＳＲ^１、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ^１、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ^１、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｒ^１、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＯＲ^１であり、
Ｌ^２は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^２、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^２、－ＯＲ^２、－Ｓ（Ｏ）_ｘＲ^２、－Ｓ－ＳＲ^２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ^２、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ^２、－ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）Ｒ^２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆ、－ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆ、－ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）ＯＲ^２、またはＲ^２との直接結合であり、
Ｌ^３は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^３または－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^３であり、
Ｇ^１及びＧ^２は、各々、独立して、Ｃ_２－Ｃ_１２アルキレンまたはＣ_２－Ｃ_１２アルケニレンであり、
Ｇ^３は、Ｃ_１－Ｃ_２４アルキレン、Ｃ_２－Ｃ_２４アルケニレン、Ｃ_１－Ｃ_２４ヘテロアルキレン、またはＣ_２－Ｃ_２４ヘテロアルケニレンであり、
Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｄ、及びＲ^ｅは、各々、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルまたはＣ_１－Ｃ_１２アルケニルであり、
Ｒ^ｃ及びＲ^ｆは、各々、独立して、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルまたはＣ_２－Ｃ_１２アルケニルであり、
各Ｒは、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
Ｒ^１、Ｒ^２、及びＲ^３は、各々、独立して、分岐Ｃ_６－Ｃ_２４アルキルまたは分岐Ｃ_６－Ｃ_２４アルケニルであり、
ｘは、０、１、または２であり、
各アルキル、アルケニル、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、及びヘテロアルケニレンは、別段の指定がない限り、独立して、置換または非置換である。

構造（ＶＩＩＩ）の特定の実施形態では、Ｇ^３は、非置換である。より具体的な実施形態では、Ｇ^３は、Ｃ_２－Ｃ_１２アルキレンであり、例えば、いくつかの実施形態では、Ｇ^３は、Ｃ_３－Ｃ_７アルキレンであり、または他の実施形態では、Ｇ^３は、Ｃ_３－Ｃ_１２アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｇ^３は、Ｃ_２またはＣ_３アルキレンである。

構造（ＶＩＩＩ）の他の実施形態では、Ｇ^３は、Ｃ_１－Ｃ_１２ヘテロアルキレン、例えば、Ｃ_１－Ｃ_１２アミニルアルキレンである。

構造（ＶＩＩＩ）の特定の実施形態では、Ｘは、Ｎであり、Ｙは、非存在である。他の実施形態では、Ｘは、ＣＲであり、Ｙは、ＮＲであり、例えば、いくつかのこれらの実施形態では、Ｒは、Ｈである。

構造（ＶＩＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、化合物は、以下の構造（ＶＩＩＩＡ）、（ＶＩＩＩＢ）、（ＶＩＩＩＣ）、または（ＶＩＩＩＤ）のうちの１つを有する：

。

構造（ＶＩＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、Ｌ^１は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^１、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^１、または
－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃであり、Ｌ^２は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^２、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^２、または－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｃＲ^ｆである。他の具体的な実施形態では、Ｌ^１は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^１であり、Ｌ^２は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^２である。前述の実施形態のいずれかでは、Ｌ^３は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^３である。

構造（ＶＩＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、Ｇ^１及びＧ^２は、各々、独立して、Ｃ_２－Ｃ_１２アルキレン、例えば、Ｃ_４－Ｃ_１０アルキレンである。

構造（ＶＩＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、Ｒ^１、Ｒ^２、及びＲ^３は、各々、独立して、分岐Ｃ_６－Ｃ_２４アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、
Ｒ^１、Ｒ^２、及びＲ^３は、各々、独立して、以下の構造を有し、

式中、
Ｒ^７ａ及びＲ^７ｂは、各存在で、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
ａは、２～１２の整数であり、
Ｒ^７ａ、Ｒ^７ｂ及びａは、各々、Ｒ^１及びＲ^２が、各々、独立して、６～２０個の炭素原子を含むように選択される。例えば、いくつかの実施形態では、ａは、５～９または８～１２の範囲の整数である。

構造（ＶＩＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、Ｒ^７ａの少なくとも１つの存在においてＨである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^７ａは各存在においてＨである。前述の他の異なる実施形態では、Ｒ^７ｂの少なくとも１つの存在は、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。

構造（ＶＩＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、Ｘは、ＣＲであり、Ｙは、ＮＲであり、Ｒ^３は、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキル、例えば、エチル、プロピル、またはブチルである。いくつかのこれらの実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、各々、独立して、分岐Ｃ_６－Ｃ_２４アルキルである。

構造（ＶＩＩＩ）の異なる実施形態では、Ｒ^１、Ｒ^２、及びＲ^３は、各々、独立して、以下の構造のうちの１つを有する：

。

構造（ＶＩＩＩ）の特定の実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２及びＲ^３は、各々、独立して、分岐Ｃ_６－Ｃ_２４アルキルであり、Ｒ^３は、Ｃ_１－Ｃ_２４アルキルまたはＣ_２－Ｃ_２４アルケニルである。

構造（ＶＩＩＩ）のいくつかの前述の実施形態では、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｅ、及びＲ^ｆは、各々、独立して、Ｃ_３－Ｃ_１２アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｅ、及びＲ^ｆは、ｎ－ヘキシルであり、他の実施形態では、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｅ、及びＲ^ｆは、ｎ－オクチルである。

構造（ＶＩＩＩ）の様々な異なる実施形態では、化合物は、以下の表７に示される構造のうちの１つを有する。

（表７）構造（ＶＩＩＩ）の代表的なカチオン性脂質

一実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造（ＩＸ）を有する化合物であるか、

またはその薬学的に許容可能な塩、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｌ^１は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^１、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^１、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^１、－ＯＲ^１、－Ｓ（Ｏ）_ｘＲ^１、－Ｓ－ＳＲ^１、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ^１、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ^１、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｒ^１、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＯＲ^１であり、
Ｌ^２は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^２、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^２、－ＯＲ^２、－Ｓ（Ｏ）_ｘＲ^２、－Ｓ－ＳＲ^２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ^２、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ^２、－ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）Ｒ^２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆ、－ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆ、－ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）ＯＲ^２、またはＲ^２との直接結合であり、
Ｇ^１及びＧ^２は、各々、独立して、Ｃ_２－Ｃ_１２アルキレンまたはＣ_２－Ｃ_１２アルケニレンであり、
Ｇ^３は、Ｃ_１－Ｃ_２４アルキレン、Ｃ_２－Ｃ_２４アルケニレン、Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキレン、またはＣ_３－Ｃ_８シクロアルケニレンであり、
Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｄ、及びＲ^ｅは、各々、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルまたはＣ_１－Ｃ_１２アルケニルであり、
Ｒ^ｃ及びＲ^ｆは、各々、独立して、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルまたはＣ_２－Ｃ_１２アルケニルであり、
Ｒ^１及びＲ^２は、各々、独立して、分岐Ｃ_６－Ｃ_２４アルキルまたは分岐Ｃ_６－Ｃ_２４アルケニルであり、
Ｒ^３は、－Ｎ（Ｒ^４）Ｒ^５であり、
Ｒ^４は、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
Ｒ^５は、置換Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
ｘは、０、１、または２であり、
各アルキル、アルケニル、アルキレン、アルケニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、アリール、及びアラルキルは、別段の指定がない限り、独立して、置換または非置換である。

構造（ＸＩ）の特定の実施形態では、Ｇ^３は、非置換である。より具体的な実施形態では、Ｇ^３は、Ｃ_２－Ｃ_１２アルキレンであり、例えば、いくつかの実施形態では、Ｇ^３は、Ｃ_３－Ｃ_７アルキレンであり、または他の実施形態では、Ｇ^３は、Ｃ_３－Ｃ_１２アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｇ^３は、Ｃ_２またはＣ_３アルキレンである。

構造（ＩＸ）のいくつかの前述の実施形態では、化合物は、以下の構造（ＩＸＡ）を有し、

式中、ｙ及びｚは、各々、独立して、２～１２の範囲の整数、例えば、２～６、４～１０、または例えば、４もしくは５の整数である。特定の実施形態では、ｙ及びｚは、各々、同じであり、４、５、６、７、８、及び９から選択される。

構造（ＩＸ）いくつかの前述の実施形態では、Ｌ^１は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^１、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^１、または－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃであり、Ｌ^２は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^２、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^２、または－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は、それぞれ、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^１及び－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^２である。他の実施形態では、Ｌ^１は、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^１であり、Ｌ^２は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆである。他の実施形態では、Ｌ^１は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃであり、Ｌ^２は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｅＲ^ｆである。

前述の他の実施形態では、化合物は、以下の構造（ＩＸＢ）、（ＩＸＣ）、（ＩＸＤ）、または（ＩＸＥ）のうちの１つを有する：

。

いくつかの前述の実施形態では、化合物は、構造（ＩＸＢ）を有し、他の実施形態では、化合物は、構造（ＩＸＣ）を有し、さらに他の実施形態では、化合物は、構造（ＩＸＤ）を有する。他の実施形態では、化合物は、構造（ＩＸＥ）を有する。

前述のいくつかの異なる実施形態では、化合物は、以下の構造（ＩＸＦ）、（ＩＸＧ）、（ＩＸＨ）、または（ＩＸＪ）のうちの１つを有し、

式中、ｙ及びｚは、各々、独立して、２～１２の範囲の整数、例えば、２～６の整数、例えば、４である。

構造（ＩＸ）のいくつかの前述の実施形態では、ｙ及びｚは、各々、独立して、２～１０、２～８、４～１０、または４～７の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｙは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２である。いくつかの実施形態では、ｚは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２である。いくつかの実施形態では、ｙ及びｚは、同じであり、他の実施形態では、ｙ及びｚは、異なる。

構造（ＩＸ）のいくつかの前述の実施形態では、Ｒ^１もしくはＲ^２、またはその両方が、分岐Ｃ_６－Ｃ_２４アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、各々、独立して、以下の構造を有し、

式中、
Ｒ^７ａ及びＲ^７ｂは、各存在で、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
ａは、２～１２の整数であり、
Ｒ^７ａ、Ｒ^７ｂ及びａは、各々、Ｒ^１及びＲ^２が、各々、独立して、６～２０個の炭素原子を含むように選択される。例えば、いくつかの実施形態では、ａは、５～９または８～１２の範囲の整数である。

構造（ＩＸ）のいくつかの前述の実施形態では、Ｒ^７ａの少なくとも１つの存在においてＨである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^７ａは各存在においてＨである。前述の他の異なる実施形態では、Ｒ^７ｂの少なくとも１つの存在は、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。

構造（ＩＸ）の異なる実施形態では、Ｒ^１もしくはＲ^２、またはその両方は、以下の構造を有する：

。

構造（ＩＸ）のいくつかの前述の実施形態では、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｅ、及びＲ^ｆは、各々、独立して、Ｃ_３－Ｃ_１２アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｅ、及びＲ^ｆは、ｎ－ヘキシルであり、他の実施形態では、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｅ、及びＲ^ｆは、ｎ－オクチルである。

構造（ＩＸ）の前述の実施形態のいずれかでは、Ｒ^４は、置換または非置換：メチル、エチル、プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－オクチル、またはｎ－ノニルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^４は、非置換である。他のＲ^４は、－ＯＲ^ｇ、－ＮＲ^ｇＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｇＲ^ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｈ、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｈ、及び－ＯＲ^ｉＯＨからなる群から選択される１つ以上の置換基で置換され、式中、
Ｒ^ｇは、各存在で、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^ｈは、各存在で、独立して、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^ｉは、各存在で、独立して、Ｃ_１－Ｃ_６アルキレンである。

構造（ＩＸ）の他の前述の実施形態では、Ｒ^５は、置換：メチル、エチル、プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－オクチル、またはｎ－ノニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ^５は、置換エチルまたは置換プロピルである。他の異なる実施形態では、Ｒ^５は、ヒドロキシルで置換される。なおさらなる実施形態では、Ｒ^５は、－ＯＲ^ｇ、－ＮＲ^ｇＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｇＲ^ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｈ、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｈ、及び－ＯＲ^ｉＯＨからなる群から選択される１つ以上の置換基で置換され、
式中、
Ｒ^ｇは、各存在で、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^ｈは、各存在で、独立して、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^ｉは、各存在で、独立して、Ｃ_１－Ｃ_６アルキレンである。

構造（ＩＸ）の他の実施形態では、Ｒ^４は、非置換メチルであり、Ｒ^５は、置換：メチル、エチル、プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－オクチル、またはｎ－ノニルである。いくつかのこれらの実施形態では、Ｒ^５は、ヒドロキシルで置換される。

構造（ＩＸ）のいくつかの他の特定の実施形態では、Ｒ^３は、以下の構造のうちの１つを有する：

。

構造（ＩＸ）の様々な異なる実施形態では、カチオン性脂質は、以下の表８に示される構造のうちの１つを有する。

（表８）構造（ＩＸ）の代表的なカチオン性脂質

一実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造（Ｘ）を有する化合物であるか、

またはその薬学的に許容可能な塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｇ^１は、－ＯＨ、－ＮＲ^３Ｒ^４、－（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ^５、または－ＮＲ^３（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^５であり、
Ｇ^２は、－ＣＨ_２－または－（Ｃ＝Ｏ）－であり、
Ｒは、各存在で、独立して、ＨまたはＯＨであり、
Ｒ^１及びＲ^２は、各々、独立して、分岐、飽和または不飽和Ｃ_１２－Ｃ_３６アルキルであり、
Ｒ^３及びＲ^４は、各々、独立して、Ｈ、または直鎖もしくは分岐、飽和もしくは不飽和Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^５は、直鎖または分岐、飽和または不飽和Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであり、
ｎは、２～６の整数である。

いくつかの実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、各々、独立して、分岐、飽和または不飽和Ｃ_１２－Ｃ_３０アルキル、Ｃ_１２－Ｃ_２０アルキル、またはＣ_１５－Ｃ_２０アルキルである。いくつかの特定の実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、各々、飽和である。特定の実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２の少なくとも１つは、不飽和である。

構造（Ｘ）のいくつかの前述の実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、以下の構造を有する：

。

構造（Ｘ）のいくつかの前述の実施形態では、化合物は、以下の構造（ＸＡ）を有し、

式中、
Ｒ^６及びＲ^７は、各存在で、独立して、Ｈ、または直鎖もしくは分岐、飽和もしくは不飽和Ｃ_１－Ｃ_１４アルキルであり、
ａ及びｂは、各々、独立して、１～１５の範囲の整数であり、
ただし、Ｒ^６及びａ、ならびにＲ^７及びｂは、各々、独立して、Ｒ^１及びＲ^２が、各々、独立して、分岐、飽和または不飽和Ｃ_１２－Ｃ_３６アルキルであるように選択される。

いくつかの前述の実施形態では、化合物は、以下の構造（ＸＢ）を有し、

式中、
Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、及びＲ^１１は、各々、独立して、直鎖または分岐、飽和または不飽和Ｃ_４－Ｃ_１２アルキルであり、ただし、Ｒ^８及びＲ^９、ならびにＲ^１０及びＲ^１１は、各々、独立して、Ｒ^１及びＲ^２が、各々、独立して、分岐、飽和または不飽和Ｃ_１２－Ｃ_３６アルキルであるように選択される。（ＸＢ）のいくつかの実施形態では、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、及びＲ^１１は、各々、独立して、直鎖または分岐、飽和または不飽和Ｃ_６－Ｃ_１０アルキルである。（ＸＢ）の特定の実施形態では、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、及びＲ^１１の少なくとも１つは、不飽和である。（ＸＢ）の他の特定の実施形態では、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、及びＲ^１１の各々は、飽和である。

いくつかの前述の実施形態では、化合物は、構造（ＸＡ）を有し、他の実施形態では、化合物は、構造（ＸＢ）を有する。

いくつかの前述の実施形態では、Ｇ^１は、－ＯＨであり、いくつかの実施形態では、Ｇ^１は、－ＮＲ^３Ｒ^４である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｇ^１は、－ＮＨ_２、－ＮＨＣＨ_３、または－Ｎ（ＣＨ_３）_２である。特定の実施形態では、Ｇ^１は、－（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ^５である。特定の他の実施形態では、Ｇ^１は、－ＮＲ^３（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^５である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｇ^１は、－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_３または－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３である。

構造（Ｘ）のいくつかの前述の実施形態では、Ｇ^２は、－ＣＨ_２－である。いくつかの異なる実施形態では、Ｇ^２は、－（Ｃ＝Ｏ）－である。

構造（Ｘ）のいくつかの前述の実施形態では、ｎは、２～６の範囲の整数であり、例えば、いくつかの実施形態では、ｎは、２、３、４、５、または６である。いくつかの実施形態では、ｎは、２である。いくつかの実施形態では、ｎは、３である。いくつかの実施形態では、ｎは、４である。

構造（Ｘ）の特定の前述の実施形態では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、及びＲ^５の少なくとも１つは、非置換である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、及びＲ^５は、各々、非置換である。いくつかの実施形態では、Ｒ^３は、置換される。他の実施形態では、Ｒ^４は、置換される。なおさらなる実施形態では、Ｒ^５は、置換される。特定の実施形態では、Ｒ^３及びＲ^４の各々は、置換される。いくつかの実施形態では、Ｒ^３、Ｒ^４、またはＲ^５上の置換基は、ヒドロキシルである。特定の実施形態では、Ｒ^３及びＲ^４は、各々、ヒドロキシルで置換される。

構造（Ｘ）のいくつかの前述の実施形態では、少なくとも１つのＲは、ＯＨである。他の実施形態では、各Ｒは、Ｈである。

構造（Ｘ）の様々な異なる実施形態では、化合物は、以下の表９に示される構造のうちの１つを有する。

（表９）構造（Ｘ）の代表的なカチオン性脂質

実施形態１、２、３、４、または５のいずれかでは、ＬＮＰは、中性脂質をさらに含む。様々な実施形態では、カチオン性脂質対中性脂質のモル比は、約２：１～約８：１の範囲である。特定の実施形態では、中性脂質は、５～１０モルパーセント、５～１５モルパーセント、７～１３モルパーセント、または９～１１モルパーセントの範囲の濃度で前述のＬＮＰのいずれかに存在する。特定の実施形態では、中性脂質は、約９．５、１０、または１０．５モルパーセントの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質対中性脂質のモル比は、約４．１：１．０～約４．９：１．０、約４．５：１．０～約４．８：１．０、または約４．７：１．０～４．８：１．０の範囲である。いくつかの実施形態では、総カチオン性脂質対中性脂質のモル比は、約４．１：１．０～約４．９：１．０、約４．５：１．０～約４．８：１．０、または約４．７：１．０～４．８：１．０の範囲である。

実施形態１、２、３、４、または５のいずれかで使用される例示的な中性脂質には、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１カルボキシラート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアリオイル－２－オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、及び１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（トランスＤＯＰＥ）が含まれる。一実施形態では、中性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭから選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣである。

実施形態１、２、３、４、または５の様々な実施形態では、開示される脂質ナノ粒子のいずれかは、ステロイドまたはステロイド類似体を含む。特定の実施形態では、ステロイドまたはステロイド類似体は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、ステロイドは、３９～４９モルパーセント、４０～４６モルパーセント、４０～４４モルパーセント、４０～４２モルパーセント、４２～４４モルパーセント、または４４～４６モルパーセントの範囲の濃度で存在する。特定の実施形態では、ステロイドは、４０、４１、４２、４３、４４、４５、または４６モルパーセントの濃度で存在する。

特定の実施形態では、カチオン性脂質対ステロイドのモル比は、１．０：０．９～１．０：１．２、または１．０：１．０～１．０：１．２の範囲である。いくつかのこれらの実施形態では、カチオン性脂質対コレステロールのモル比は、約５：１～１：１の範囲である。特定の実施形態では、ステロイドは、ステロイドの３２～４０モルパーセントの範囲の濃度で存在する。

特定の実施形態では、総カチオン対ステロイドのモル比は、１．０：０．９～１．０：１．２、または１．０：１．０～１．０：１．２の範囲である。いくつかのこれらの実施形態では、総カチオン性脂質対コレステロールのモル比は、約５：１～１：１の範囲である。特定の実施形態では、ステロイドは、ステロイドの３２～４０モルパーセントの範囲の濃度で存在する。

実施形態１、２、３、４、または５のいくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ポリマー複合脂質をさらに含む。実施形態１、２、３、４、または５の様々な他の実施形態では、ポリマー複合脂質は、ペグ化脂質である。例えば、いくつかの実施形態は、ペグ化ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、例えば、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧサクシネートジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）、例えば、４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）、ペグ化セラミド（ＰＥＧ－ｃｅｒ）、またはＰＥＧジアルコキシプロピルカルバメート、例えば、ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル－Ｎ－（２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル）カルバメート、または２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル－Ｎ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）カルバメートを含む。

様々な実施形態において、ポリマー複合脂質は、１．０から２．５モルパーセントの範囲の濃度で存在する。特定の実施形態では、ポリマー複合脂質は、約１．７モルパーセントの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ポリマー複合脂質は、約１．５モルパーセントの濃度で存在する。

特定の実施形態では、カチオン性脂質対ポリマー複合脂質のモル比は、約３５：１～約２５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質対ポリマー複合脂質のモル比は、約１００：１～約２０：１の範囲である。

特定の実施形態では、総カチオン性脂質（すなわち、第１及び第２のカチオン性脂質の合計）対ポリマー結合脂質のモル比は、約３５：１～約２５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、総カチオン性脂質対ポリマー複合脂質のモル比は、約１００：１～約２０：１の範囲である。

実施形態１、２、３、４、または５のいくつかの実施形態では、ペグ化脂質は、存在する場合、以下の式（ＸＩ）を有するか、

またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体であり、式中、
Ｒ^１２及びＲ^１３は、各々、独立して、１０～３０個の炭素原子を含む直鎖または分岐、飽和または不飽和アルキル鎖であり、アルキル鎖は、任意で、１つ以上のエステル結合によって中断され、
ｗは、３０～６０の範囲の平均値を有する。

いくつかの実施形態では、Ｒ^１２及びＲ^１３は、各々、独立して、１２～１６個の炭素原子を含む直鎖、飽和アルキル鎖である。他の実施形態では、平均ｗは、４２～５５の範囲であり、例えば、平均ｗは、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５である。いくつかの特定の実施形態では、平均ｗは、約４９である。

いくつかの実施形態では、ペグ化脂質は、以下の式（ＸＩａ）を有し、

式中、平均ｗは、約４９である。

実施形態１、２、３、４、または５のいくつかの実施形態では、核酸は、アンチセンス及びメッセンジャーＲＮＡから選択される。例えば、メッセンジャーＲＮＡは、例えば免疫原性タンパク質の翻訳により、免疫応答を誘導するために（例えば、ワクチンとして）使用され得る。

実施形態１、２、３ ４、または５の他の実施形態では、核酸はｍＲＮＡであり、ＬＮＰ中のｍＲＮＡ対脂質比（すなわち、Ｎ／Ｐはカチオン性脂質のモルを表し、Ｐは核酸の一部として存在するリン酸塩のモルを表す。

ある実施形態では、輸送ビヒクルは、米国特許公開第２０１９０３１４５２４号に記載されている脂質またはイオン化可能脂質を含む。

本発明のいくつかの実施形態は、インビボで核酸の増加した活性及び組成物の改善した許容性を提供する、表１０に列挙される構造として本明細書に記載の新規カチオン性脂質の１つ以上を含む核酸－脂質ナノ粒子組成物を提供する。

一実施形態では、イオン化可能脂質は、以下の構造（ＸＩＩ）を有するか、

またはその薬学的に許容可能な塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体であり、式中、
Ｌ^１またはＬ^２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ^１またはＬ^２の他方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、または直接結合であり、
Ｇ^１及びＧ^２は、各々、独立して、非置換Ｃ_１－Ｃ_１２アルキレンまたはＣ_１－Ｃ_１２アルケニレンであり、
Ｇ^３は、Ｃ_１－Ｃ_２４アルキレン、Ｃ_１－Ｃ_２４アルケニレン、Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキレン、Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルケニレンであり、
Ｒ^ａは、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
Ｒ^１及びＲ^２は、各々、独立して、Ｃ_６－Ｃ_２４アルキルまたはＣ_６－Ｃ_２４アルケニルであり、
Ｒ^３は、Ｈ、ＯＲ^５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^４または－ＮＲ^５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^４であり、
Ｒ^４は、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
Ｒ^５は、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、
ｘは、０、１、または２である。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、以下の構造（ＸＩＩＡ）または（ＸＩＩＢ）のうちの１つを有し、

式中、
Ａは、３～８員シクロアルキルまたはシクロアルキレン環であり、
Ｒ^６は、各存在で、独立して、Ｈ、ＯＨまたはＣ_１－Ｃ_２４アルキルであり、
ｎは、１～１５の範囲の整数である。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、構造（ＸＩＩＡ）を有し、他の実施形態では、イオン化可能脂質は、構造（ＸＩＩＢ）を有する。

他の実施形態では、イオン化可能脂質は、以下の構造（ＸＩＩＣ）または（ＸＩＩＤ）のうちの１つを有し、

式中、ｙ及びｚは、各々、独立して、１～１２の範囲の整数である。

いくつかの実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２の各々は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。前述のいずれかのいくつかの異なる実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は、各々、独立して、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－または－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２の各々は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、以下の構造（ＸＩＩＥ）または（ＸＩＩＦ）のうちの１つを有する：

。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、以下の構造（ＸＩＩＧ）、（ＸＩＩＨ）、（ＸＩＩＩ）、または（ＸＩＩＪ）のうちの１つを有する：

。

いくつかの実施形態では、ｎは、２～１２、例えば、２～８または２～４の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｎは、３、４、５または６である。いくつかの実施形態では、ｎは、３である。いくつかの実施形態では、ｎは、４である。いくつかの実施形態では、ｎは、５である。いくつかの実施形態では、ｎは、６である。

いくつかの実施形態では、ｙ及びｚは、各々、独立して、２～１０の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｙ及びｚは、各々、独立して、４～９または４～６の範囲の整数である。

いくつかの実施形態では、Ｒ^６は、Ｈである。他の実施形態では、Ｒ^６は、Ｃ_１－Ｃ_２４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ^６は、ＯＨである。

いくつかの実施形態では、Ｇ^３は、非置換である。他の実施形態では、Ｇ３は、置換される。様々な異なる実施形態では、Ｇ^３は、直鎖状Ｃ_１－Ｃ_２４アルキレンまたは直鎖状Ｃ_１－Ｃ_２４アルケニレンである。

いくつかの実施形態では、Ｒ^１もしくはＲ^２、またはその両方は、Ｃ_６－Ｃ_２４アルケニルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、各々、独立して、以下の構造を有し、

式中、
Ｒ^７ａ及びＲ^７ｂは、各存在で、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、
ａは、２～１２の整数であり、
Ｒ^７ａ、Ｒ^７ｂ及びａは、各々、Ｒ^１及びＲ^２が、各々、独立して、６～２０個の炭素原子を含むように選択される。

いくつかの実施形態では、ａは、５～９または８～１２の範囲の整数である。

いくつかの実施形態では、Ｒ^７ａの少なくとも１つの存在においてＨである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^７ａは各存在においてＨである。他の異なる実施形態では、Ｒ^７ｂの少なくとも１つの存在は、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。

異なる実施形態では、Ｒ^１もしくはＲ^２、またはその両方は、以下の構造のうちの１つを有する：

。

いくつかの実施形態では、Ｒ^３は、－ＯＨ、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^４または－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ^４である。いくつかの実施形態では、Ｒ^４は、メチルまたはエチルである。

いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、式（１）の化合物であり、

式中、
各ｎは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５であり、
Ｌ_１及びＬ_３は、各々、独立して、－ＯＣ（Ｏ）－＊または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－＊であり、「＊」は、Ｒ_１またはＲ_３に対する結合点を示し、
Ｒ_１及びＲ_３は、各々、独立して、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルケニル、アルデヒド、ヘテロシクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、ジヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルアミノアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、（ヘテロシクリル）（アルキル）アミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、アルキニル、アルコキシ、アミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルカルボニルアミノ、アミノカルボニルアルキルアミノ、（アミノカルボニルアルキル）（アルキル）アミノ、アルケニルカルボニルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ヘテロシクリルアルキルアミノカルボニル、（アルキルアミノアルキル）（アルキル）アミノカルボニル、アルキルアミノアルキルカルボニル、ジアルキルアミノアルキルカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アルキルスルホキシド、アルキルスルホキシドアルキル、アルキルスルホニル、及びアルキルスルホンアルキルから選択される１つ以上の置換基によって任意で置換された直鎖状または分岐状Ｃ_９－Ｃ_２０アルキルまたはＣ_９－Ｃ_２０アルケニルである。

いくつかの実施形態では、Ｒ_１及びＲ_３は、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ_１及びＲ_３は、異なる。

いくつかの実施形態では、Ｒ_１及びＲ_３は、各々、独立して、分岐状飽和Ｃ_９－Ｃ_２０アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ_１及びＲ_３の一方は、分岐状飽和Ｃ_９－Ｃ_２０アルキルであり、他方は、非分岐状飽和Ｃ_９－Ｃ_２０アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ_１及びＲ_３は、各々、独立して、以下からなる群から選択される：

。

様々な実施形態では、Ｒ_２は、以下からなる群から選択される：

。

いくつかの実施形態では、Ｒ_２は、国際特許公開第ＷＯ２０１９／１５２８４８Ａ１号に記載されているとおりであり得、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、式（１－１）または式（１－２）の化合物であり、

式中、ｎ、Ｒ_１、Ｒ_２、及びＲ_３は、式（１）において定義されているとおりである。

上記化合物及び組成物のための調製方法は、以下に記載されており及び／または当該技術分野で知られている。

本明細書に記載のプロセスにおいて、中間体化合物の官能基は、好適な保護基によって保護される必要があり得ることが当業者によって理解される。かかる官能基には、例えば、ヒドロキシル、アミノ、メルカプト、及びカルボン酸が含まれる。ヒドロキシルのための好適な保護基には、例えば、トリアルキルシリルまたはジアリールアルキルシリル（例えば、ｔ－ブチルジメチルシリル、ｔ－ブチルジフェニルシリルまたはトリメチルシリル）、テトラヒドロチオピラニル、ベンジルなどが含まれる。アミノ、アミジノ、及びグアニジノのための好適な保護基には、例えば、ｔ－ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどが含まれる。メルカプトのための好適な保護基には、例えば、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ’’（式中、Ｒ’’は、アルキル、アリール、またはアリールアルキルである）、ｐ－メトキシベンジル、トリチルなどが含まれる。カルボン酸のための好適な保護基には、例えば、アルキル、アリール、またはアリールアルキルエステルが含まれる。保護基は、当業者に知られており、本明細書に記載される標準的な技術に従って付加または除去され得る。保護基の使用は、例えば、Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｚ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９９），３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙに詳細に記載されている。当業者が理解されるであろうが、保護基はまた、Ｗａｎｇ樹脂、Ｒｉｎｋ樹脂、または２－クロロトリチル－クロリド樹脂などのポリマー樹脂であり得る。

また、本発明の化合物のかかる保護された誘導体は、それ自体では薬理学的活性を有さない場合があるが、それらは、哺乳動物に投与され、その後、体内で代謝されて薬理学的に活性な本発明の化合物が形成され得ることが当業者によって理解される。そのため、かかる誘導体は、プロドラッグとして記載され得る。本発明の化合物の全てのプロドラッグは、本発明の範囲に含まれる。

さらに、遊離塩基または酸形態で存在する本発明の全ての化合物は、当業者に知られている方法によって適切な無機または有機塩基または酸での処置によってそれらの薬学的に許容可能な塩に変換され得る。本発明の化合物の塩はまた、標準的な技術によってそれらの遊離塩基または酸形態に変換され得る。

以下の反応スキームは、式（１）の化合物を作製するための例示的な方法を示している：

。
Ａ１は、購入されるか、または当該技術分野で知られている方法に従って調製される。適切な縮合条件（例えば、ＤＣＣ）下でのＡ１とジオールＡ２との反応は、エステル／アルコールＡ３を生成し、これは次いで、（例えば、ＰＣＣで）アルデヒドＡ４に酸化され得る。還元的アミノ化条件下でのＡ４とアミンＡ５との反応は、式（１）の化合物を生成する。

以下の反応スキームは、Ｒ_１及びＲ_３が同じである式（１）の化合物を作製するための第２の例示的な方法を説明する：

。

例えば、保護基を使用する、上記反応スキームに対する修飾は、Ｒ_１及びＲ_３が異なる化合物を生成し得る。上記反応スキームに対する保護基の使用、及び他の修飾方法は、当業者に容易に明らかとなる。

当業者は、類似の方法によってまたは当業者に知られている他の方法を組み合わせることによってこれらの化合物を作製することが可能であり得ることが理解される。当業者は、適切な出発物質を使用し、合成のパラメータを修飾することによって本明細書に具体的に例示されていない式（１）の他の化合物を作製することができるであろうことが理解される。通常、出発物質は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＴＣＩ、及びＦｌｕｏｒｏｃｈｅｍ ＵＳＡなどの供給源から得られ、または当業者に知られている供給源に従って合成され（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０００））、または本発明に記載されているように調製され得る。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、式（２）の化合物であり、

式中、各ｎは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。

いくつかの実施形態では、式（２）において使用される場合、Ｒ_１及びＲ_２は、式（１）において定義されているとおりである。

いくつかの実施形態では、式（２）において使用される場合、Ｒ_１及びＲ_２は、各々、独立して、以下からなる群から選択される：

。

いくつかの実施形態では、式（２）において使用されるＲ_１及び／またはＲ_２は、国際特許公開第ＷＯ２０１５／０９５３４０Ａ１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているとおりであり得る。いくつかの実施形態では、式（２）において使用されるＲ_１は、国際特許公開第ＷＯ２０１９／１５２５５７Ａ１号に記載されているとおりであり得、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、式（２）において使用される場合、Ｒ_３は、以下からなる群から選択される：

。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、式（３）の化合物であり、

式中、Ｘは－Ｏ－、－Ｓ－、または－ＯＣ（Ｏ）－＊から選択され、＊は、Ｒ_１との結合点を示す。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、式（３－１）の化合物である：

。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、式（３－２）の化合物である：

。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、式（３－３）の化合物である：

。

いくつかの実施形態では、式（３－１）、（３－２）、または（３－３）において使用される場合、各Ｒ_１は、独立して、分岐状飽和Ｃ_９－Ｃ_２０アルキルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ_１は、独立して、以下からなる群から独立して選択される：

。

いくつかの実施形態では、式（３－１）、（３－２）、または（３－３）における各Ｒ_１は、同じである。

いくつかの実施形態では、式（３－１）、（３－２）、または（３－３）において使用される場合、Ｒ_２は、以下からなる群から選択される：

。

いくつかの実施形態では、式（３－１）、（３－２）、または（３－３）において使用されるＲ_２は、国際特許公開第ＷＯ２０１９／１５２８４８Ａ１号に記載されているとおりであり得、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、式（５）の化合物であり、

式中、
各ｎは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５であり、
Ｒ_２は、式（１）において定義されているとおりである。

いくつかの実施形態では、式（５）において使用される場合、Ｒ_４及びＲ_５は、式（１）において、各々、Ｒ_１及びＲ_３として定義されている。いくつかの実施形態では、式（５）において使用される場合、Ｒ_４及びＲ_５は、国際特許公開第ＷＯ２０１９／１９１７８０Ａ１号に記載されているとおりであり得、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能脂質は、表１０ａから選択される。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、表１０ａにおける脂質２６である。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、表１０ａにおける脂質２７である。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、表１０ａにおける脂質５３である。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、表１０ａにおける脂質５４である。

いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能脂質は、以下からなる群から選択される：

。

（表１０ａ）

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、ベータ－ヒドロキシルアミン頭部基を有する。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、ガンマ－ヒドロキシルアミン頭部基を有する。

いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能脂質は、表１０ｂから選択される脂質である。いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能脂質は、表１０ｂからの脂質１５である。ある実施形態では、イオン化可能脂質は、米国特許公開第ＵＳ２０１７／０２１０６９７Ａ１号に記載されている。ある実施形態では、イオン化可能脂質は、米国特許公開第ＵＳ２０１７／０１１９９０４Ａ１号に記載されている。

（表１０ｂ）

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、以下の表１０に示される構造のうちの１つを有する。

（表１０）

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、以下の表１１に示される構造のうちの１つを有する。いくつかの実施形態では、表１１に示されるイオン化可能脂質は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６１０５８号に記載されているとおりである。

（表１１）

いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、脂質Ａ、脂質Ｂ、脂質Ｃ、及び／または脂質Ｄを含む。いくつかの実施形態では、脂質Ａ、脂質Ｂ、脂質Ｃ、及び／または脂質Ｄの包含は、封入及び／またはエンドソーム脱出を改善する。いくつかの実施形態では、脂質Ａ、脂質Ｂ、脂質Ｃ、及び／または脂質Ｄは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２８９８１号に記載されている。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、３－（（４，４４ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ９，１２－ジエノエートとも呼ばれる（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ９，１２－ジエノエートである脂質Ａである。脂質Ａは、以下のように示され得る：

。

脂質Ａは、ＷＯ２０１５／０９５３４０（例えば、８４～８６頁）に従って合成され得、その全体が参照により組み込まれる。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノエート）である脂質Ｂである。脂質Ｂは、以下のように示され得る：

。

脂質Ｂは、ＷＯ２０１４／１３６０８６（例えば、１０７～０９頁）に従って合成され得、その全体が参照により組み込まれる。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、２－（（４－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン－１，３－ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－９，１２－ジエノエート）である脂質Ｃである。脂質Ｃは、以下のように示され得る：

。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、３－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）－１３－（オクタノイルオキシ）トリデシル３－オクチルウンデカノエートである脂質Ｄである。脂質Ｄは、以下のように示され得る：

。

脂質Ｃ及び脂質Ｄは、ＷＯ２０１５／０９５３４０に従って合成され得、その全体が参照により組み込まれる。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、米国特許公開第２０１９０３２１４８９号に記載されている。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、国際特許公開第ＷＯ２０１０／０５３５７２号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、ＷＯ２０１０／０５３５７２の段落［００２２５］に記載されているＣ１２－２００である。

いくつかのイオン化可能脂質は、文献に記載されており、その多くは市販されている。特定の実施形態では、かかるイオン化可能脂質は、本明細書に記載の輸送ビヒクルに含まれる。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム塩化物または「ＤＯＴＭＡ」が使用される。（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号）。ＤＯＴＭＡは、単独で製剤化され得、または脂質ナノ粒子中に中性脂質、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンもしくは「ＤＯＰＥ」または他のカチオン性もしくは非カチオン性脂質と組み合わされ得る。他の好適なカチオン性脂質には、例えば、２０１２年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているイオン化可能なカチオン性脂質、例えば、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－１５，１８－ジエン－１－アミン（ＨＧＴ５０００）、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－４，１５，１８－トリエン－１－アミン（ＨＧＴ５００１）、及び（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－５，１５，１８－トリエン－１－アミン（ＨＧＴ５００２）、Ｃ１２－２００（ＷＯ２０１０／０５３５７２に記載されている）、２－（２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ））（ＷＯ２０１０／０４２８７７；Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２－１７６（２０１０）を参照されたい）、２－（２，２－ジ（（９Ｚ，２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノエート（ＩＣＥ）、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－１５，１８－ジエン－１－アミン（ＨＧＴ５０００）、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－４，１５，１８－トリエン－１－アミン（ＨＧＴ５００１）、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－５，１５，１８－トリエン－１－アミン（ＨＧＴ５００２）、５－カルボキシスペルミルグリシン－ジオクタデシルアミド（ＤＯＧＳ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウム（ＤＯＳＰＡ）（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）；米国特許第５，１７１，６７８号；５，３３４，７６１）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパンまたは（ＤＯＴＡＰ）が含まれる。企図されるイオン化可能脂質にはまた、１，２－ジストカリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５′－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３′－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９′，１－２′－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ′－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、２，３－ジリノレオイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロピルアミン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ′－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアムニノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＣＤＡＰ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ）もしくはＧＬ６７、またはそれらの混合物が含まれる。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６－２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｄ Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３－１００７（２００５）；ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１２１３４８Ａ１）。輸送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）を製剤化するためのコレステロールベースのイオン化可能脂質の使用も本発明によって企図される。かかるコレステロールベースのイオン化可能脂質は、単独でまたは他の脂質と組み合わせて使用され得る。好適なコレステロールベースのイオン化可能脂質には、例えば、ＤＣ－コレステロール（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレステロール）、及び１，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３，１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）が含まれる。

カチオン性脂質、例えば、ジアルキルアミノベース、イミダゾールベース、及びグアニジニウムベースの脂質も企図される。例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８４５７号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているイオン化可能脂質（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノエート（ＩＣＥ）の使用も企図される。

イオン化可能脂質、例えば、ジアルキルアミノベース、イミダゾールベース、及びグアニジニウムベースの脂質も企図される。例えば、所定の実施形態は、１つ以上のイミダゾールベースのイオン化可能脂質、例えば、イミダゾールコレステロールエステルまたは「ＩＣＥ」脂質、（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノエート（以下の構造（ＸＩＩＩ）によって表される）を含む組成物に関する。ある実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの送達のための輸送ビヒクルは、１つ以上のイミダゾールベースのイオン化可能脂質、例えば、イミダゾールコレステロールエステルまたは「ＩＣＥ」脂質（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノエート（構造（ＸＩＩＩ）によって表される）を含み得る。

特定の理論に拘束されることを望まないが、イミダゾールベースのカチオン性脂質ＩＣＥの融合性は、従来のイオン化可能脂質と比べて低いｐＫａを有するイミダゾール基によって容易化されるエンドソーム破壊に関連すると考えられる。エンドソーム破壊は、ひいては、浸透圧膨張及びリポソーム膜の破壊を促進し、続いて、その中にロードされた核酸（複数可）含有物が標的細胞にトランスフェクションまたは細胞内放出される。

イミダゾールベースのイオン化可能脂質はまた、他のイオン化可能脂質と比べてそれらの低下した毒性によって特性化される。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、米国特許公開第２０１９０３１４２８４号に記載されている。特定の実施形態では、イオン化可能脂質は、構造３、４、５、６、７、８、９、または１０（例えば、ＨＧＴ４００１、ＨＧＴ４００２、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ４００４及び／またはＨＧＴ４００５）によって表される。特定の実施形態では、１つ以上の切断可能な官能基（例えば、ジスルフィド）は、例えば、親水性機能的頭部基が、（例えば、酸化、還元または酸性条件への曝露により）化合物の脂溶性機能的尾部基から解離することを可能にし、それにより１つ以上の標的細胞の脂質二重層における相転移を容易化する。例えば、輸送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）が構造３～１０の脂質の１つ以上を含む場合、１つ以上の標的細胞の脂質二重層における相転移は、１つ以上の標的細胞へのｃｉｒｃＲＮＡの送達を容易にする。

特定の実施形態では、イオン化脂質は、構造（ＸＩＶ）によって表され、

式中、
Ｒ_１は、イミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、任意で置換されたアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノなどのアルキルアミノ）及びピリジルからなる群から選択され、
Ｒ_２は、構造ＸＶ及び構造ＸＶＩからなる群から選択され、

式中、Ｒ_３及びＲ_４は、各々、独立して、任意で置換された可変的飽和または不飽和Ｃ_６－Ｃ_２０アルキル及び任意で置換された可変的飽和または不飽和Ｃ_６－Ｃ_２０アシルからなる群から選択され；ｎは、０または任意の正の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上）である。特定の実施形態では、Ｒ_３及びＲ_４は、各々、任意で置換された多不飽和Ｃ_１８アルキルであるのに対し、他の実施形態では、Ｒ_３及びＲ_４は、各々、非置換多不飽和Ｃ_１８アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ_３及びＲ_４の１つ以上は、（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエンである。

構造ＸＩＶ（式中、Ｒ_１は、イミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、任意で置換されたアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノなどのアルキルアミノ）及びピリジルからなる群から選択され；Ｒ_２は、構造ＸＶであり；ｎは、０または任意の正の整数である）の化合物を含む薬学的組成物も本明細書に開示する。さらに、構造ＸＩＶ（式中、Ｒ_１は、イミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、任意で置換されたアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノなどのアルキルアミノ）及びピリジルからなる群から選択され；Ｒ_２は、構造ＸＶＩであり；Ｒ３及びＲ４は、各々、独立して、任意で置換された可変的飽和または不飽和Ｃ_６－Ｃ_２０アルキル及び任意で置換された可変的飽和または不飽和Ｃ_６－Ｃ_２０アシルからなる群から選択され；ｎは、０または任意の正の整数である）の化合物を含む薬学的組成物を本明細書に開示する。特定の実施形態では、Ｒ_３及びＲ_４は、各々、任意で置換された多不飽和Ｃ_１８アルキルであるのに対し、他の実施形態では、Ｒ_３及びＲ_４は、各々、非置換多不飽和Ｃ_１８アルキル（例えば、オクタデカ－９，１２－ジエン）である。

特定の実施形態では、Ｒ_１基または頭部基は、極性または親水性基（例えば、イミダゾール、グアニジニウム及びアミノ基のうちの１つ以上）であり、例えば、構造ＸＩＶに示されるジスルフィド（Ｓ－Ｓ）切断性リンカー基によってＲ_２脂質基に結合されている）。他の企図される切断性リンカー基は、例えば、アルキル基（例えば、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル）に結合（例えば、共有結合）した１つ以上のジスルフィド（Ｓ－Ｓ）リンカー基を含む組成物を含み得る。特定の実施形態では、Ｒ１基は、Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル基によって切断性リンカー基に共有結合され（例えば、ｎは１～２０である）、または代替的に、切断性リンカー基に直接的に結合され得る（例えば、ｎは０である）。特定の実施形態では、ジスルフィドリンカー基は、インビトロ及び／またはインビボで切断可能（例えば、酵素的に切断可能または酸性もしくは還元条件への曝露で切断可能）である。

特定の実施形態では、本発明は、構造ＸＶＩＩ（本明細書で「ＨＧＴ４００１」と称される）を有する化合物５－（（（１０，１３－ジメチル－１７－（６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）ジスルファニル）メチル）－１Ｈ－イミダゾールに関する。

特定の実施形態では、本発明は、構造ＸＶＩＩＩ（本明細書で「ＨＧＴ４００２」と称される）を有する化合物１－（２－（（（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）ジスルファニル）エチル）グアニジンに関する。

特定の実施形態では、本発明は、構造ＸＩＸ（本明細書で「ＨＧＴ４００３」と称される）を有する化合物２－（（２，３－ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ）プロピル）ジスルファニル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミンに関する。

他の実施形態では、本発明は、構造ＸＸ（本明細書で「ＨＧＴ４００４」と称される）の構造を有する化合物５－（（（２，３－ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ）プロピル）ジスルファニル）メチル）－１Ｈ－イミダゾールに関する。

さらに他の実施形態では、本発明は、構造ＸＸＩ（本明細書で「ＨＧＴ４００５」と称される）を有する化合物１－（（（２，３－ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ）プロピル）ジスルファニル）メチル）グアニジンに関する。

特定の実施形態では、構造３～１０として記載される化合物は、イオン化可能脂質である。

化合物、及び特に構造３～８として記載されるイミダゾールベースの化合物（例えば、ＨＧＴ４００１及びＨＧＴ４００４）は、特に従来のイオン化可能脂質と比べて、それらの低減した毒性によって特性化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の輸送ビヒクルは、かかる薬学的またはリポソーム組成物における他のより毒性のイオン化可能脂質の相対的濃度が低減され、またはそうでなければ排除され得るように、１つ以上のイミダゾールベースのイオン化可能脂質化合物を含む。

イオン化可能脂質には、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５２４６号、ならびに米国特許公開第２０１７／０１９０６６１号及び同第２０１７／０１１４０１０号（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に開示されているものが含まれる。イオン化可能脂質は、以下の表１２、１３、１４、または１５から選択される脂質を含み得る。

（表１２）

（表１３）

（表１４）

（表１５）

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１５９１３号に記載されているとおりである。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、以下から選択される：

アミン脂質
特定の実施形態では、環状ＲＮＡの送達のための輸送ビヒクル組成物は、アミン脂質を含む。特定の実施形態では、イオン化可能脂質は、アミン脂質である。いくつかの実施形態では、アミン脂質は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５３５６９号に記載されている。

いくつかの実施形態では、アミン脂質は、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエートである脂質Ｅである。

脂質Ｅは、以下のように示され得る：

。

脂質Ｅは、ＷＯ２０１５／０９５３４０（例えば、８４～８６頁）に従って合成され得る。特定の実施形態では、アミン脂質は、脂質Ｅと同等である。

特定の実施形態では、アミン脂質は、脂質Ｅの類似体である。特定の実施形態では、脂質Ｅ類似体は、脂質Ｅのアセタール類似体である。特定の輸送ビヒクル組成物において、アセタール類似体は、Ｃ４－Ｃ１２アセタール類似体である。いくつかの実施形態では、アセタール類似体は、Ｃ５－Ｃ１２アセタール類似体である。追加の実施形態では、アセタール類似体は、Ｃ５－Ｃ１０アセタール類似体である。さらなる実施形態では、アセタール類似体は、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１及びＣ１２アセタール類似体から選択される。

本明細書に記載の輸送ビヒクル、例えば、脂質ナノ粒子において使用するのに好適なアミン脂質及び他の生分解性脂質は、インビボで生分解性である。本明細書に記載のアミン脂質は、低い毒性を有する（例えば、１０ｍｇ／ｋｇよりも多いまたは同等の量で有害作用を伴わずに動物モデルにおいて忍容される）。特定の実施形態では、アミン脂質を構成する輸送ビヒクルには、アミン脂質の少なくとも７５％が８、１０、１２、２４、もしくは４８時間、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から消失するものが含まれる。

生分解性脂質には、例えば、ＷＯ２０１７／１７３０５４、ＷＯ２０１５／０９５３４０、及びＷＯ２０１４／１３６０８６の生分解性脂質が含まれる。

脂質クリアランスは、当業者に知られている方法によって測定され得る。例えば、Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｌｉｐｉｄｓ Ｅｎａｂｌｉｎｇ Ｒａｐｉｄｌｙ Ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＲＮＡｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１３，２１（８），１５７０－７８を参照されたい。

アミン脂質を含む輸送ビヒクル組成物は、上昇したクリアランス速度をもたらし得る。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は、脂質クリアランス速度、例えば、脂質が血液、血清、または血漿から消失する速度である。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は、ＲＮＡクリアランス速度、例えば、ｃｉｒｃＲＮＡが血液、血清、または血漿から消失する速度である。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は、輸送ビヒクルが血液、血清、または血漿から消失する速度である。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は、輸送ビヒクルが肝臓組織または脾臓組織などの組織から消失する速度である。特定の実施形態では、高いクリアランス速度は、実質的な有害作用を伴わずに安全性プロファイルをもたらす。アミン脂質及び生分解性脂質は、循環及び組織における輸送ビヒクル蓄積を低減し得る。いくつかの実施形態では、循環及び組織における輸送ビヒクル蓄積の低減は、実質的な有害作用を伴わずに安全性プロファイルをもたらす。

脂質は、それらが入っている媒体のｐＨに応じてイオン化可能であり得る。例えば、わずかに酸性の媒体において、アミン脂質などの脂質は、プロトン化され、よって、正電荷を有し得る。逆に、例えば、ｐＨがおよそ７．３５である血液などのわずかに塩基性の媒体において、アミン脂質などの脂質は、プロトン化されず、よって、電荷を有さない場合がある。

脂質が電荷を有する能力は、その固有のｐＫａに関連する。いくつかの実施形態では、本開示のアミン脂質は、各々、独立して、約５．１～約７．４の範囲のｐＫａを有し得る。いくつかの実施形態では、本開示の生物学的に利用可能な脂質は、各々、独立して、約５．１～約７．４の範囲のｐＫａを有し得る。例えば、本開示のアミン脂質は、各々、独立して、約５．８～約６．５の範囲のｐＫａを有し得る。約５．１～約７．４の範囲のｐＫａを有する脂質は、インビボで、例えば、肝臓へのカーゴの送達に有効である。さらに、約５．３～約６．４の範囲のｐＫａを有する脂質は、インビボ、例えば、腫瘍への送達に有効であることが判明した。例えば、ＷＯ２０１４／１３６０８６を参照されたい。

ジスルフィド結合を含有する脂質
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、米国特許第９，７０８，６２８号に記載されている。

本発明は、構造（ＸＸＩＩ）によって表される脂質を提供する：

。

構造（ＸＸＩＩ）において、Ｘ^ａ及びＸ^ｂは、各々、独立して、以下に示されるＸ^１またはＸ^２である。

。

Ｘ^１におけるＲ^４は、直鎖状、分岐状または環状であり得る１～６個の炭素原子を有するアルキル基である。アルキル基は好ましくは、１～３の炭素数を有する。１～６個の炭素原子を有するアルキル基の具体的な例には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔ－ペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、２－メチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２，２－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、シクロヘキシル基などが含まれる。Ｒ^４は好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基またはイソプロピル基、最も好ましくはメチル基である。

Ｘ^２におけるｓは、１または２である。ｓが１である場合、Ｘ^２は、ピロリジニウム基であり、ｓが２である場合、Ｘ^２は、ピペリジニウム基である。ｓは２が好ましい。Ｘ^２の結合方向が限定されない場合、Ｘ^２における窒素原子は好ましくは、Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂに結合する。

Ｘ^ａは、Ｘ^ｂと同じまたは異なり得、Ｘ^ａは好ましくは、Ｘ^ｂと同じ基である。

ｎ^ａ及びｎ^ｂは、各々、独立して、０または１、好ましくは１である。ｎ^ａが１である場合、Ｒ^３ａは、Ｙ^ａ及びＲ^２ａを介してＸ^ａに結合し、ｎ^ａが０である場合、Ｒ^３ａ－Ｘ^ａ－Ｒ^１ａ－Ｓ－の構造がとられる。同様に、ｎ^ｂが１である場合、Ｒ^３ｂは、Ｙ^ｂ及びＲ^２ｂを介してＸ^ｂに結合し、ｎ^ｂが０である場合、Ｒ^３ｂ－Ｘ^ｂ－Ｒ^１ｂ－Ｓ－の構造がとられる。

ｎ^ａは、ｎ^ｂと同じまたは異なり得、ｎ^ａは好ましくは、ｎ^ｂと同じである。

Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、各々、独立して、直鎖状または分岐状、好ましくは直鎖状であり得る１～６個の炭素原子を有するアルキレン基である。１～６個の炭素原子を有するアルキレン基の具体的な例には、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ネオペンチレン基などが含まれる。Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、それぞれ好ましくは、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基またはテトラメチレン基、最も好ましくはエチレン基である。

Ｒ^１ａは、Ｒ^１ｂと同じまたは異なり得、Ｒ^１ａは好ましくは、Ｒ^１ｂと同じ基である。

Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、各々、独立して、直鎖状または分岐状、好ましくは直鎖状であり得る１～６個の炭素原子を有するアルキレン基である。１～６個の炭素原子を有するアルキレン基の例には、Ｒ^１ａまたはＲ^１ｂについて１～６個の炭素原子を有するアルキレン基の例として記述されているものが含まれる。Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、それぞれ好ましくは、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基またはテトラメチレン基である。

Ｘ^ａ及びＸ^ｂがそれぞれＸ^１である場合、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは好ましくは、トリメチレン基である。Ｘ^ａ及びＸ^ｂがそれぞれＸ^２である場合、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは好ましくは、エチレン基である。

Ｒ^２ａは、Ｒ^２ｂと同じまたは異なり得、Ｒ^２ａは好ましくは、Ｒ^２ｂと同じ基である。

Ｙ^ａ及びＹ^ｂは、各々、独立して、エステル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合または尿素結合、好ましくはエステル結合、アミド結合またはカルバメート結合、最も好ましくはエステル結合である。Ｙ^ａ及びＹ^ｂの結合方向は限定されない一方で、Ｙ^ａがエステル結合である場合、Ｒ^３ａ－ＣＯ－Ｏ－Ｒ^２ａ－の構造が好ましく、Ｙ^ｂがエステル結合である場合、Ｒ^３ｂ－ＣＯ－Ｏ－Ｒ^２ｂ－の構造が好ましい。

Ｙ^ａは、Ｙ^ｂと同じまたは異なり得、Ｙ^ａは好ましくは、Ｙ^ｂと同じ基である。

Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂは、各々、独立して、ステロール残基、脂溶性ビタミン残基または１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基、好ましくは脂溶性ビタミン残基または１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基、最も好ましくは脂溶性ビタミン残基である。

ステロール残基の例には、コレステリル基（コレステロール残基）、コレステタリル基（コレスタノール残基）、スチグマステリル基（スチグマステロール残基）、β－シトステリル基（ベータシトステロール残基）、ラノステリル基（ラノステロール残基）、及びエルゴステリル基（エルゴステロール残基）などが含まれる。ステロール残基は好ましくは、コレステリル基またはコレステタリル基である。

脂溶性ビタミン残基として、脂溶性ビタミンに由来する残基、ならびに脂溶性ビタミンにおける官能基であるヒドロキシル基、アルデヒドまたはカルボン酸を他の反応性官能基に適切に変換することによって得られる誘導体に由来する残基が使用され得る。例えば、ヒドロキシル基を有する脂溶性ビタミンに関して、ヒドロキシル基は、コハク酸無水物、グルタル酸無水物などを反応させることによってカルボン酸に変換され得る。脂溶性ビタミンの例には、レチノイン酸、レチノール、レチナール、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、カルシフェロール、コレカルシフェロール、ジヒドロエルゴカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、トコフェロール、トコトリエノールなどが含まれる。脂溶性ビタミンの好ましい例には、レチノイン酸及びトコフェロールが含まれる。

１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基は、直鎖状または分岐状、好ましくは直鎖状であり得る。脂肪族炭化水素基は、飽和または不飽和であり得る。不飽和脂肪族炭化水素基の場合、脂肪族炭化水素基は通常、１～６、好ましくは１～３、より好ましくは１～２個の不飽和結合を含有する。不飽和結合が炭素－炭素二重結合及び炭素－炭素三重結合を含む一方で、それは好ましくは、炭素－炭素二重結合を含む。脂肪族炭化水素基は、好ましくは１２～１８、最も好ましくは１３～１７の炭素数を有する。脂肪族炭化水素基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基などを含む一方で、それは好ましくは、アルキル基またはアルケニル基である。１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基の具体的な例には、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘニコシル基、ドコシル基、ドデセニル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基、ヘプタデセニル基、オクタデセニル基、ノナデセニル基、イコセニル基、ヘニコセニル基、ドコセニル基、デカジエニル基、トリデカジエニル基、テトラデカジエニル基、ペンタデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデカジエニル基、オクタデカジエニル基、ノナデカジエニル基、イコサジエニル基、ヘニコサジエニル基、ドコサジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、イコサペンタエニル基、ドコサヘキサエニル基、イソステアリル基などが含まれる。１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基は、好ましくはトリデシル基、テトラデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ヘプタデカジエニル基またはオクタデカジエニル基、特に好ましくはトリデシル基、ヘプタデシル基またはヘプタデカジエニル基である。

一実施形態では、脂肪酸、脂肪族アルコール、または脂肪族アミンに由来する１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基が使用される。Ｒ^３ａ（またはＲ^３ｂ）が脂肪酸に由来する場合、Ｙ^ａ（またはＹ^ｂ）は、エステル結合またはアミド結合であり、脂肪酸由来カルボニル炭素は、Ｙ^ａ（またはＹ^ｂ）に含まれる。例えば、リノール酸が使用される場合、Ｒ^３ａ（またはＲ^３ｂ）は、ヘプタデカジエニル基である。

Ｒ^３ａは、Ｒ^３ｂと同じまたは異なり得、Ｒ^３ａは好ましくは、Ｒ^３ｂと同じ基である。

一実施形態では、Ｘ^ａは、Ｘ^ｂと同じであり、ｎ^ａは、ｎ^ｂと同じであり、Ｒ^１ａは、Ｒ^１ｂと同じであり、Ｒ^２ａは、Ｒ^２ｂと同じであり、Ｒ^３ａは、Ｒ^３ｂと同じであり、Ｙ^ａは、Ｙ^ｂと同じである。

一実施形態では、
Ｘ^ａ及びＸ^ｂは、各々、独立して、Ｘ１であり、
Ｒ^４は、１～３個の炭素原子を有するアルキル基であり、ｎ^ａ及びｎ^ｂは、各々、１であり、
Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、各々、独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、各々、独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｙ^ａ及びＹ^ｂは、各々、エステル結合またはアミド結合であり、
Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂは、各々、独立して、１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基である。

一実施形態では、
Ｘ^ａ及びＸ^ｂは、それぞれＸ１であり、
Ｒ^４は、１～３個の炭素原子を有するアルキル基であり、ｎ^ａ及びｎ^ｂは、各々、１であり、
Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、各々、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、各々、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｙ^ａ及びＹ^ｂは、各々、エステル結合またはアミド結合であり、
Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂは、各々、１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基であり、
Ｘ^ａは、Ｘ^ｂと同じであり、
Ｒ^１ａは、Ｒ^１ｂと同じであり、
Ｒ^２ａは、Ｒ^２ｂと同じであり、
Ｒ^３ａは、Ｒ^３ｂと同じである。

一実施形態では、
Ｘ^ａ及びＸ^ｂは、各々、Ｘ^１であり、
Ｒ^４は、メチル基であり、ｎ^ａ及びｎ^ｂは、各々、１であり、
Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、各々、エチレン基であり、
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、各々、トリメチレン基であり、
Ｙ^ａ及びＹ^ｂは、各々、－ＣＯ－Ｏ－であり、
Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂは、各々、独立して、１３～１７個の炭素原子を有するアルキル基またはアルケニル基である。

一実施形態では、
Ｘ^ａ及びＸ^ｂは、各々、Ｘ^１であり、
Ｒ^４は、メチル基であり、ｎ^ａ及びｎ^ｂは、各々、１であり、
Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、各々、エチレン基であり、
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、各々、トリメチレン基であり、
Ｙ^ａ及びＹ^ｂは、各々、－ＣＯ－Ｏ－であり、
Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂは、各々、１３～１７個の炭素原子を有するアルキル基またはアルケニル基であり、
Ｒ^３ａは、Ｒ^３ｂと同じである。

一実施形態では、
Ｘ^ａ及びＸ^ｂは、各々、独立して、Ｘ^１であり、
Ｒ^４は、１～３個の炭素原子を有するアルキル基であり、ｎ^ａ及びｎ^ｂは、各々、１であり、
Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、各々、独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、各々、独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｙ^ａ及びＹ^ｂは、各々、エステル結合またはアミド結合であり、
Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂは、各々、独立して、脂溶性ビタミン残基（例えば、レチノイン酸残基、トコフェロール残基）である。

一実施形態では、
Ｘ^ａ及びＸ^ｂは、各々、Ｘ^１であり、
Ｒ^４は、１～３個の炭素原子を有するアルキル基であり、ｎ^ａ及びｎ^ｂは、各々、１であり、
Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、各々、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、各々、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｙ^ａ及びＹ^ｂは、各々、エステル結合またはアミド結合であり、
Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂは、各々、脂溶性ビタミン残基（例えば、レチノイン酸残基、トコフェロール残基）であり、
Ｘ^ａは、Ｘ^ｂと同じであり、
Ｒ^１ａは、Ｒ^１ｂと同じであり、
Ｒ^２ａは、Ｒ^２ｂと同じであり、
Ｒ^３ａは、Ｒ^３ｂと同じである。

一実施形態では、
Ｘ^ａ及びＸ^ｂは、各々、Ｘ^１であり、
Ｒ^４は、メチル基であり、ｎ^ａ及びｎ^ｂは、各々、１であり、
Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、各々、エチレン基であり、
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、各々、トリメチレン基であり、
Ｙ^ａ及びＹ^ｂは、各々、－ＣＯ－Ｏ－であり、
Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂは、各々、独立して、脂溶性ビタミン残基（例えば、レチノイン酸残基、トコフェロール残基）である。

一実施形態では、
Ｘ^ａ及びＸ^ｂは、各々、Ｘ^１であり、
Ｒ^４は、メチル基であり、ｎ^ａ及びｎ^ｂは、各々、１であり、
Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、各々、エチレン基であり、
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、各々、トリメチレン基であり、
Ｙ^ａ及びＹ^ｂは、各々、－ＣＯ－Ｏ－であり、
Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂは、各々、脂溶性ビタミン残基（例えば、レチノイン酸残基、トコフェロール残基）であり、
Ｒ^３ａは、Ｒ^３ｂと同じである。

一実施形態では、
Ｘ^ａ及びＸ^ｂは、各々、独立して、Ｘ^２であり、
ｔは、２であり、
Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、各々、独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、各々、独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｙ^ａ及びＹ^ｂは、各々、エステル結合であり、
Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂは、各々、独立して、脂溶性ビタミン残基（例えば、レチノイン酸残基、トコフェロール残基）または１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基（例えば、１２～２２個の炭素原子を有するアルキル基）である。

一実施形態では、
Ｘ^ａ及びＸ^ｂは、各々、独立して、Ｘ^２であり、
ｔは、２であり、
Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、各々、独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、各々、独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｙ^ａ及びＹ^ｂは、各々、エステル結合であり、
Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂは、各々、独立して、脂溶性ビタミン残基（例えば、レチノイン酸残基、トコフェロール残基）または１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基（例えば、１２～２２個の炭素原子を有するアルキル基）であり、
Ｘ^ａは、Ｘ^ｂと同じであり、
Ｒ^１ａは、Ｒ^１ｂと同じであり、
Ｒ^２ａは、Ｒ^２ｂと同じであり、
Ｒ^３ａは、Ｒ^３ｂと同じである。

一実施形態では、
Ｘ^ａ及びＸ^ｂは、各々、独立して、Ｘ^２であり、
ｔは、２であり、
Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、各々、エチレン基であり、
Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、各々、独立して、１～６個の炭素原子を有するアルキレン基であり、
Ｙ^ａ及びＹ^ｂは、各々、エステル結合であり、
Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂは、各々、独立して、脂溶性ビタミン残基（例えば、レチノイン酸残基、トコフェロール残基）または１２～２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基（例えば、１２～２２個の炭素原子を有するアルキル基）であり、
Ｘ^ａは、Ｘ^ｂと同じであり、
Ｒ^２ａは、Ｒ^２ｂと同じであり、
Ｒ^３ａは、Ｒ^３ｂと同じである。

いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、以下の表１５ｂに示される構造のうちの１つを有する。

（表１５ｂ）

本発明の脂質は、－Ｓ－Ｓ－（ジスルフィド）結合を有し得る。かかる化合物の生成方法には、例えば、
Ｒ^３ａ－（Ｙ^ａ－Ｒ^２ａ）ｎ^ａ－Ｘ^ａ－Ｒ^１ａ－ＳＨ、及び
Ｒ^３ｂ－（Ｙ^ｂ－Ｒ^２ｂ）ｎ^ｂ－Ｘ^ｂ－Ｒ^１ｂ－ＳＨ
を生成すること、及びそれらを酸化（カップリング）に供して－Ｓ－Ｓ－を含有する化合物を得ることを含む方法、－Ｓ－Ｓ－を含有する化合物に必要な部分を順次結合させて最終的に本発明の化合物を得ることを含む方法などが含まれる。後者の方法が好ましい。

後者の方法の具体的な例が以下に示されているが、これは限定として解釈されるべきではない。

出発化合物の例には、－Ｓ－Ｓ－結合を含有する２末端カルボン酸、２末端カルボキシレート、２末端アミン、２末端イソシアネート、２末端アルコール、ＭｓＯ（メシレート基）などの脱離基を有する２末端アルコール、ｐＮＰ（ｐ－ニトロフェニルカルボネート基）などの脱離基を有する２末端カルボネートなどが含まれる。

例えば、Ｘ^ａ及びＸ^ｂについてＸ^１またはＸ^２を含有する化合物を生成する場合、－Ｓ－Ｓ－結合を含有する化合物（１）の２つの末端官能基を、末端に－ＮＨ－基及び１つの官能基を有する化合物（２）における－ＮＨ－基と反応させ、反応に寄与しなかった化合物（２）における末端の官能基を、Ｒ^３を含有する化合物（３）における官能基と反応させ、それにより、－Ｓ－Ｓ－結合、Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂ、Ｘ^ａ及びＸ^ｂ、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂ、Ｙ^ａ及びＹ^ｂ、ならびにＲ^３ａ及びＲ^３ｂを含有する本発明の化合物が得られ得る。

化合物（１）及び化合物（２）の反応において、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、カリウムｔ－ブトキシドなどのアルカリ触媒が触媒として使用され得、または反応は、触媒を用いずに実施され得る。好ましくは、炭酸カリウムまたは炭酸ナトリウムが触媒として使用される。

触媒の量は、化合物（１）に対して、０．１～１００モル当量、好ましくは、０．１～２０モル当量、より好ましくは０．１～５モル当量である。導入される化合物（２）の量は、化合物（１）に対して、１～５０モル当量、好ましくは１～１０モル当量である。

化合物（１）及び化合物（２）の反応のために使用される溶媒は、それが反応を阻害しない溶媒または水溶液である限り特に限定されない。例えば、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼン、トルエンなどが挙げられ得る。これらのうち、トルエン及びクロロホルムが好ましい。

反応温度は、－２０～２００℃、好ましくは０～８０℃、より好ましくは２０～５０℃であり、反応時間は、１～４８時間、好ましくは２～２４時間である。

化合物（１）及び化合物（２）の反応生成物を化合物（３）と反応させる場合、アルカリ触媒、例えば、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、カリウムｔ－ブトキシドなど、または酸触媒、例えば、ＰＴＳ（ｐ－トルエンスルホン酸）、ＭＳＡ（メタンスルホン酸）などが、化合物（１）及び化合物（２）の反応のために使用される触媒のように使用され得、または反応は、触媒を用いずに実施され得る。

加えて、化合物（１）及び化合物（２）の反応生成物は、縮合剤、例えば、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）などを使用することによって化合物（３）と直接的に反応させられ得る。代替的に、化合物（３）は、縮合剤で処置されて無水物などに一旦変換され得、その後、それを化合物（１）及び化合物（２）の反応生成物と反応させる。

導入される化合物（３）の量は、化合物（１）及び化合物（２）の反応生成物に対して、１～５０モル当量、好ましくは１～１０モル当量である。

使用される触媒は、反応させる官能基に応じて適切に選択される。

触媒の量は、化合物（１）に対して、０．０５～１００モル当量、好ましくは０．１～２０モル当量、より好ましくは０．２～５モル当量である。

化合物（１）及び化合物（２）の反応生成物と化合物（３）との反応に使用される溶媒は、それが反応を阻害しない溶媒または水溶液である限り特に限定されない。例えば、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼン、トルエンなどが挙げられ得る。これらのうち、トルエン及びクロロホルムが好ましい。

反応温度は、０～２００℃、好ましくは０～１２０℃、より好ましくは２０～５０℃であり、反応時間は、１時間～４８時間、好ましくは２～２４時間である。

上記反応によって得られる反応生成物は、一般的な精製方法、例えば、水での洗浄、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、結晶化、再結晶化、液－液抽出、再沈殿、イオン交換カラムクロマトグラフィーなどによって適切に精製され得る。

構造ＸＸＩＩＩ脂質
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、米国特許第９，７６５，０２２号に記載されている。

本発明は、構造（ＸＸＩＩＩ）によって表される化合物を提供する：

。

構造ＸＸＩＩＩにおいて、親水性及び任意で正に荷電した頭部は、以下であり、

式中、Ｒ_ａ、Ｒ_ａ’、Ｒ_ａ’’、及びＲ_ａ’’’の各々は、独立して、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_２０一価脂肪族ラジカル、Ｃ_１－Ｃ_２０一価ヘテロ脂肪族ラジカル、一価アリールラジカル、または一価ヘテロアリールラジカルであり、Ｚは、Ｃ_１－Ｃ_２０二価脂肪族ラジカル、Ｃ_１－Ｃ_２０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであり；Ｂは、Ｃ_１－Ｃ_２４一価脂肪族ラジカル、Ｃ_１－Ｃ_２４一価ヘテロ脂肪族ラジカル、一価アリールラジカル、一価ヘテロアリールラジカル、または

であり、Ｒ_１及びＲ_４の各々は、独立して、結合、Ｃ_１－Ｃ_１０二価脂肪族ラジカル、Ｃ_１－Ｃ_１０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであり；Ｒ_２及びＲ_５の各々は、独立して、結合、Ｃ_１－Ｃ_２０二価脂肪族ラジカル、Ｃ_１－Ｃ_２０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであり；Ｒ_３及びＲ_６の各々は、独立して、Ｃ_１－Ｃ_２０一価脂肪族ラジカル、Ｃ_１－Ｃ_２０一価ヘテロ脂肪族ラジカル、一価アリールラジカル、または一価ヘテロアリールラジカルであり、

の疎水性尾部、さらに

疎水性尾部の各々は、８～２４個の炭素原子を有し、Ｘ、リンカー、さらにＹ、リンカーの各々は、独立して、以下であり、

式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、及びｔの各々は、独立して、１～６であり、Ｗは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ_ｃであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、またはＲ_５に直接的に連結されているＬ_１、Ｌ_３、Ｌ_５、Ｌ_７、及びＬ_９の各々は、独立して、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ_ｄであり、Ｌ_２、Ｌ_４、Ｌ_６、Ｌ_８、及びＬ_１０の各々は、独立して、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ_ｅであり、Ｖは、ＯＲ_ｆ、ＳＲ_ｇ、またはＮＲ_ｈＲ_ｉであり、Ｒ_ｂ、Ｒ_ｃ、Ｒ_ｄ、Ｒ_ｅ、Ｒ_ｆ、Ｒ_ｇ、Ｒ_ｈ、及びＲ_ｉの各々は、独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｃ_１－_１０オキシ脂肪族ラジカル、Ｃ_１－Ｃ_１０一価脂肪族ラジカル、Ｃ_１－Ｃ_１０一価ヘテロ脂肪族ラジカル、一価アリールラジカル、または一価ヘテロアリールラジカルである。

上記の脂質様化合物のサブセットには、Ａが

であるものが含まれ、Ｒ_ａ及びＲ_ａ’の各々が、独立して、Ｃ_１－Ｃ_１０一価脂肪族ラジカル、Ｃ_１－Ｃ_１０一価ヘテロ脂肪族ラジカル、一価アリールラジカル、または一価ヘテロアリールラジカルであり、ＺがＣ_１－Ｃ_１０二価脂肪族ラジカル、Ｃ_１－Ｃ_１０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであるものが含まれる。

本発明のいくつかの脂質様化合物は、Ｒ_１及びＲ_４の各々が、独立して、Ｃ_１－Ｃ_６（例えば、Ｃ_１－Ｃ_４）二価脂肪族ラジカルまたはＣ_１－Ｃ_６（例えば、Ｃ_１－Ｃ_４）二価ヘテロ脂肪族ラジカルであり、Ｒ_２及びＲ_３の総炭素数が、１２～２０（例えば、１４～１８）であり、Ｒ_５及びＲ_６の総炭素数が、１２～２０（例えば、１４～１８）であり、Ｘ及びＹの各々が、独立して、

である。

Ｘ及びＹの具体例には、

が含まれ、ｍは２～６である。

本発明の範囲内には、タンパク質及び生体内還元性化合物から形成されるナノコンプレックスを含有する薬学的組成物がさらに含まれる。この薬学的組成物において、ナノコンプレックスは、５０～５００ｎｍの粒子サイズを有し；生体内還元性化合物は、ジスルフィド疎水性部位、親水性部位、及びジスルフィド疎水性部位及び親水性部位を連結するリンカーを含有し；タンパク質は、非共有結合性相互作用、共有結合、またはその両方を介して生体内還元性化合物に結合する。

特定の実施形態では、ジスルフィド疎水性部位は、１つ以上の－Ｓ－Ｓ－基及び８～２４個の炭素原子を含有するヘテロ脂肪族ラジカルであり；親水性部位は、１つ以上の親水性基及び１～２０個の炭素原子を含有する脂肪族またはヘテロ脂肪族ラジカルであり、親水性基の各々は、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアミノ、テトラアルキルアンモニウム、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボキシレート、カルバメート、カルバミド、カルボネート、ホスフェート、ホスファイト、スルフェート、スルファイト、またはチオスルフェートであり；リンカーは、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキレン、

であり、変数は上記で定義される。

Ｘ及びＹの具体的な例には、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｃ_１－Ｃ_６アルキレン、

が含まれる。

いくつかの実施形態では、上の構造ＸＸＩＩＩで示される本発明の脂質様化合物は、（ｉ）親水性頭部であるＡ；（ｉｉ）疎水性尾部であるＲ_２－Ｓ－Ｓ－Ｒ_３；及び（ｉｉｉ）リンカーであるＸを含む。任意で、これらの化合物は、第２の疎水性尾部であるＲ_５－Ｓ－Ｓ－Ｒ_６及び第２のリンカーであるＹを含む。

構造ＸＸＩＩＩの親水性頭部は、１つ以上の親水性官能基、例えば、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、アミノ、スルフヒドリル、ホスフェート、アミド、エステル、エーテル、カルバメート、カルボネート、カルバミド、及びホスホジエステルを含有する。これらの基は、水素結合を形成し得、任意で正または負に荷電している。

親水性頭部の例には、以下が含まれる：

。

他の例には、Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２６，５６１－６９（２００８）及びＭａｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願公開第２０１１／０２９３７０３号に記載されているものが含まれる。

構造ＸＸＩＩＩの疎水性尾部は、ジスルフィド結合及び８～２４個の炭素原子を含有する飽和または不飽和、直鎖状または分岐状、非環状または環状、芳香族または非芳香族炭化水素部位である。炭素原子の１つ以上は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｂ、Ｓ、Ｓｉ、Ｓｂ、Ａｌ、Ｓｎ、Ａｓ、Ｓｅ、及びＧｅなどのヘテロ原子で置換され得る。尾部は、上述した１つ以上の基で任意で置換される。このジスルフィド結合を含有する脂質様化合物は、生体内還元性であり得る。

例には、以下が含まれる：

。

構造ＸＸＩＩＩのリンカーは、親水性頭部及び疎水性尾部を連結させる。リンカーは、親水性または疎水性、極性または非極性である任意の化学基、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、アミノ、アルキレン、エステル、アミド、カルバメート、カルバミド、カルボネート、ホスフェート、ホスファイト、スルフェート、スルファイト、及びチオスルフェートであり得る。例には、以下が含まれる：

。

本発明の例示的な脂質様化合物が以下に示されている：

。

構造ＸＸＩＩＩの脂質様化合物は、当該技術分野でよく知られている方法によって調製され得る。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，４０３－０７（２０１２）；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０４２９７３号；及びＺｕｇａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第８，０７１，０８２号を参照されたい。以下に示される経路は、これらの脂質様化合物の合成を例示している：

。

Ｌ_ａ、Ｌ_ａ’、Ｌ、及びＬ’の各々は、Ｌ_１－Ｌ_１０のうちの１つであり得；Ｗ_ａ及びＷ_ｂの各々は、独立して、ＷまたはＶであり得；Ｒ_ａ及びＲ_１－Ｒ_６は、Ｌ_１－Ｌ_１０、Ｗ、及びＶと同様に、上記で定義されている。

この例示的な合成経路において、アミン化合物、すなわち、化合物Ｄは、臭化物Ｅ１及びＥ２と反応して化合物Ｆを形成し、これは次いで、Ｇ１及びＧ２の両方と結合して最終生成物、すなわち、化合物Ｈが生成される。この化合物（上に示されている）における二重結合の一方または両方は、１または２つの単結合に還元されて、構造ＸＸＩＩＩの異なる脂質様化合物が得られ得る。

本発明の他の脂質様化合物は、上述した合成経路及び当該技術分野で知られている他のものを介して他の好適な出発物質を使用して調製され得る。上で示される方法は、脂質様化合物の合成を最終的に可能とするために、好適な保護基を付加または除去するために追加のステップ（複数可）を含み得る。加えて、所望の物質を得るために様々な合成ステップが代替シーケンスまたは順序で実施される。適用可能な脂質様化合物の合成において有用な合成化学変換及び保護基方法論（保護及び脱保護）は、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（２ｎｄ Ｅｄ．，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ １９９９）、Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ ａｎｄ Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（４ｔｈ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ ２００７）、Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９４）、及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ ２００９）ならびにそれらの後続の編集物を含めて、当該技術分野で知られている。特定の脂質様化合物は、非芳香族二重結合及び１つ以上の不斉中心を含有し得る。ゆえに、それらは、ラセミ化合物及びラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマー、ジアステレオマー混合物、ならびにシスまたはトランス異性体形態として存在し得る。全てのかかる異性体形態が企図される。

上記のように、これらの脂質様化合物は、薬学的薬剤の送達に有用である。それらは、インビトロアッセイによって薬学的薬剤の送達におけるそれらの有効性について主にスクリーニングされ、次いで動物実験及び臨床試験によって確認され得る。他の方法が当業者に明らかになる。

いかなる理論にも拘束されないが、構造ＸＸＩＩＩの脂質様化合物は、複合体、例えば、ナノコンプレックス及びマイクロ粒子を形成することによって薬学的薬剤の送達を容易化する。正または負に荷電したかかる脂質様化合物の親水性頭部は、反対に荷電した薬学的薬剤の部位に結合し、その疎水性部位は、薬学的薬剤の疎水性部位に結合する。いずれの結合も共有結合性または非共有結合性であり得る。

上述した複合体は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，４０３－０７（２０１２）などの刊行物に記載されている手順を使用して調製され得る。通常、それらは、酢酸ナトリウム緩衝液またはリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）などの緩衝液中で脂質様化合物及び薬学的薬剤をインキュベートすることによって得られる。

親水性基
特定の実施形態では、選択された親水性官能基または部位は、化合物またはかかる化合物が成分である輸送ビヒクルに対して特性を変化させ、またはそうでなければ特性を付与し得る（例えば、化合物が成分である脂質ナノ粒子のトランスフェクション効率を改善することによって）。例えば、本明細書に開示する化合物における親水性頭部基としてのグアニジニウムの組み込みは、かかる化合物の（またはかかる化合物が成分である輸送ビヒクルの）１つ以上の標的細胞の細胞膜との融合性を促進し得、それにより、例えば、かかる化合物のトランスフェクション効率を向上させる。親水性グアニジニウム部位からの窒素は、相互作用に対する安定性を与える６員環遷移状態を形成し、これにより、封入された物質の細胞取り込みを可能にすると仮定された。（Ｗｅｎｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．（２００８）６０：４５２－４７２）。同様に、開示される化合物への１つ以上のアミノ基または部位の（例えば、頭部基としての）組み込みは、かかるアミノ基の融合性を利用することによって標的細胞のエンドソーム／リソソーム膜の破壊をさらに促進し得る。これは、組成物のアミノ基のｐＫａだけでなく、アミノ基が六方相転移を受け、標的細胞表面、すなわち、ベシクル膜と融合する能力にも基づく。（Ｋｏｌｔｏｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８１：７８－８１）。結果は、ベシクル膜の破壊及び標的細胞への脂質ナノ粒子含有物の放出を促進すると考えられる。

同様に、特定の実施形態では、例えば、本明細書に開示する化合物における親水性頭部基としてのイミダゾールの組み込みは、例えば、本発明の輸送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）に封入された内容物のエンドソームまたはリソソーム放出を促進する機能をし得る。かかる向上した放出は、プロトン－スポンジ媒介破壊メカニズム及び／または向上した融合性メカニズムの一方または両方によって達成され得る。プロトン－スポンジメカニズムは、化合物、特に化合物の機能的部位または基がエンドソームの酸性化を緩衝する能力に基づく。これは、化合物のまたはかかる化合物（例えば、イミダゾール）を含む官能基の１つ以上のｐＫａによって操作され、またはそうでなければ制御され得る。したがって、特定の実施形態では、例えば、本明細書に開示するイミダゾールベースの化合物（例えば、ＨＧＴ４００１及びＨＧＴ４００４）の融合性は、他の従来のイオン化可能脂質と比べて低いｐＫａを有するかかるイミダゾール基によって容易化されるエンドソーム破壊特性に関連する。かかるエンドソーム破壊は、ひいては、浸透圧膨張及びリポソーム膜の破壊を促進し、続いて、その中にロードされたまたは封入されたポリヌクレオチド物質が標的細胞にトランスフェクションまたは細胞内放出される。この現象は、イミダゾール部位に加えて所望のｐＫａプロファイルを有する多様な化合物に当てはまり得る。かかる実施形態にはまた、多窒素ベースの官能基、例えば、ポリアミン、ポリ－ペプチド（ヒスチジン）、及び窒素ベースの樹状構造が含まれる。

例示的なイオン化可能な及び／またはカチオン性脂質は、国際ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１５／０９５３４０号、同第ＷＯ２０１５／１９９９５２号、同第ＷＯ２０１８／０１１６３３号、同第ＷＯ２０１７／０４９２４５号、同第ＷＯ２０１５／０６１４６７号、同第ＷＯ２０１２／０４０１８４号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、同第ＷＯ２０１５／０７４０８５号、同第ＷＯ２０１６／０８１０２９号、同第ＷＯ２０１７／００４１４３号、同第ＷＯ２０１７／０７５５３１号、同第ＷＯ２０１７／１１７５２８号、同第ＷＯ２０１１／０２２４６０号、同第ＷＯ２０１３／１４８５４１号、同第ＷＯ２０１３／１１６１２６号、同第ＷＯ２０１１／１５３１２０号、同第ＷＯ２０１２／０４４６３８号、同第ＷＯ２０１２／０５４３６５号、同第ＷＯ２０１１／０９０９６５号、同第ＷＯ２０１３／０１６０５８号、同第ＷＯ２０１２／１６２２１０号、同第ＷＯ２００８／０４２９７３号、同第ＷＯ２０１０／１２９７０９号、同第ＷＯ２０１０／１４４７４０号、同第ＷＯ２０１２／０９９７５５号、同第ＷＯ２０１３／０４９３２８号、同第ＷＯ２０１３／０８６３２２号、同第ＷＯ２０１３／０８６３７３号、同第ＷＯ２０１１／０７１８６０号、同第ＷＯ２００９／１３２１３１号、同第ＷＯ２０１０／０４８５３６号、同第ＷＯ２０１０／０８８５３７号、同第ＷＯ２０１０／０５４４０１号、同第ＷＯ２０１０／０５４４０６号、同第ＷＯ２０１０／０５４４０５号、同第ＷＯ２０１０／０５４３８４号、同第ＷＯ２０１２／０１６１８４号、同第ＷＯ２００９／０８６５５８号、同第ＷＯ２０１０／０４２８７７号、同第ＷＯ２０１１／０００１０６号、同第ＷＯ２０１１／０００１０７号、同第ＷＯ２００５／１２０１５２号、同第ＷＯ２０１１／１４１７０５号、同第ＷＯ２０１３／１２６８０３号、同第ＷＯ２００６／００７７１２号、同第ＷＯ２０１１／０３８１６０号、同第ＷＯ２００５／１２１３４８号、同第ＷＯ２０１１／０６６６５１号、同第ＷＯ２００９／１２７０６０号、同第ＷＯ２０１１／１４１７０４号、同第ＷＯ２００６／０６９７８２号、同第ＷＯ２０１２／０３１０４３号、同第ＷＯ２０１３／００６８２５号、同第ＷＯ２０１３／０３３５６３号、同第ＷＯ２０１３／０８９１５１号、同第ＷＯ２０１７／０９９８２３号、同第ＷＯ２０１５／０９５３４６号、及び同第ＷＯ２０１３／０８６３５４号、及び米国特許公開第ＵＳ２０１６／０３１１７５９号、同第ＵＳ２０１５／０３７６１１５号、同第ＵＳ２０１６／０１５１２８４号、同第ＵＳ２０１７／０２１０６９７号、同第ＵＳ２０１５／０１４００７０号、同第ＵＳ２０１３／０１７８５４１号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、同第ＵＳ２０１５／０１４１６７８号、同第ＵＳ２０１５／０２３９９２６号、同第ＵＳ２０１６／０３７６２２４号、同第ＵＳ２０１７／０１１９９０４号、同第ＵＳ２０１２／０１４９８９４号、同第ＵＳ２０１５／００５７３７３号、同第ＵＳ２０１３／００９０３７２号、同第ＵＳ２０１３／０２７４５２３号、同第ＵＳ２０１３／０２７４５０４号、同第ＵＳ２０１３／０２７４５０４号、同第ＵＳ２００９／００２３６７３号、同第ＵＳ２０１２／０１２８７６０号、同第ＵＳ２０１０／０３２４１２０号、同第ＵＳ２０１４／０２００２５７号、同第ＵＳ２０１５／０２０３４４６号、同第ＵＳ２０１８／０００５３６３号、同第ＵＳ２０１４／０３０８３０４号、同第ＵＳ２０１３／０３３８２１０号、同第ＵＳ２０１２／０１０１１４８号、同第ＵＳ２０１２／００２７７９６号、同第ＵＳ２０１２／００５８１４４号、同第ＵＳ２０１３／０３２３２６９号、同第ＵＳ２０１１／０１１７１２５号、同第ＵＳ２０１１／０２５６１７５号、同第ＵＳ２０１２／０２０２８７１号、同第ＵＳ２０１１／００７６３３５号、同第ＵＳ２００６／００８３７８０号、同第ＵＳ２０１３／０１２３３３８号、同第ＵＳ２０１５／００６４２４２号、同第ＵＳ２００６／００５１４０５号、同第ＵＳ２０１３／００６５９３９号、同第ＵＳ２００６／０００８９１０号、同第ＵＳ２００３／００２２６４９号、同第ＵＳ２０１０／０１３０５８８号、同第ＵＳ２０１３／０１１６３０７号、同第ＵＳ２０１０／００６２９６７号、同第ＵＳ２０１３／０２０２６８４号、同第ＵＳ２０１４／０１４１０７０号、同第ＵＳ２０１４／０２５５４７２号、同第ＵＳ２０１４／００３９０３２号、同第ＵＳ２０１８／００２８６６４号、同第ＵＳ２０１６／０３１７４５８号、及び同第ＵＳ２０１３／０１９５９２０号に記載されており、これらの全ての内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。国際特許出願第ＷＯ２０１９／１３１７７０号もその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

８．ＰＥＧ脂質
本明細書に記載のリポソーム及び薬学的組成物における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質及び誘導体化脂質、例えば誘導体化セラミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）、例えば、Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）－２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ－２０００セラミド）の、好ましくは、本明細書に開示する化合物及び脂質のうちの１つ以上と組み合わせた、使用及び包含が企図される。企図されるＰＥＧ修飾脂質には、Ｃ６～Ｃ２０長さのアルキル鎖（複数可）を伴う脂質に共有結合的に付着した最大５ｋＤａの長さのポリエチレングリコール鎖が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法において採用されるＰＥＧ修飾脂質は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（２０００ＭＷ ＰＥＧ）「ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００」である。脂質送達ビヒクルへのＰＥＧ修飾脂質の追加は、複雑な凝集を防止し得、循環寿命を延ばし、標的組織への脂質－ポリヌクレオチド組成物の送達を増加させる手段も提供し得る（Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５－２３７）、またはそれらは、インビボで製剤から迅速に交換されるよう選択され得る（米国特許第５，８８５，６１３号を参照されたい）。特に有用な交換可能脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧ－セラミドである。本発明のＰＥＧ修飾リン脂質及び誘導体化脂質は、リポソーム脂質ナノ粒子に存在する総脂質の約０％～約２０％、約０．５％～約２０％、約１％～約１５％、約４％～約１０％、または約２％のモル比を構成し得る。

ある実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１５９１３号に記載されており、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、輸送ビヒクルは、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む。

ＰＥＧ修飾脂質の非限定的な例には、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミド複合（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミン）が含まれる。いくつかのさらなる実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、例えば、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥであり得る。

いくつかのさらに別の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質には、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルメトレイル、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ－ｌ，２－ジミリスチルオキシルプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）が含まれるがこれらに限定されない。

様々な実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質はまた、「ＰＥＧ化脂質」または「ＰＥＧ－脂質」と称され得る。

一実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質の脂質部位には、約Ｃ_１４～約Ｃ_２２、例えば、約Ｃ_１４～約Ｃ_１６の長さを有するものが含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部位、例えば、ｍＰＥＧ－ＮＨ_２は、約１０００、約２０００、約５０００、約１０，０００、約１５，０００または約２０，０００ダルトンのサイズを有する。一実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。

一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧで修飾された脂質を含み得る。非拡散性ＰＥＧの非限定的な例には、ＰＥＧ－ＤＳＧ及びＰＥＧ－ＤＳＰＥが含まれる。

ＰＥＧ－脂質は、当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第８，１５８，６０１号及び国際特許公開第ＷＯ２０１５／１３０５８４Ａ２号に記載されているものであり、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

様々な実施形態では、本明細書に記載の脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質）は、国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９号に記載されているように合成され得、その全体が参照により組み込まれる。

脂質ナノ粒子組成物の脂質成分は、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質などのポリエチレングリコールを含む１つ以上の分子を含み得る。かかる種は、ＰＥＧ化脂質と代替的に称され得る。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む非限定的な群から選択され得る。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。

いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧの修飾形態である。ＰＥＧ－ＤＭＧは、以下の構造を有する：

。

いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ－Ｃ１８の修飾形態、またはＰＥＧ－１である。ＰＥＧ－１は、以下の構造を有する

。

一実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、国際公開第ＷＯ２０１２０９９７５５（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているＰＥＧ化脂質であり得る。本明細書に記載のこれらの例示的なＰＥＧ脂質のいずれかは、ＰＥＧ鎖上のヒドロキシル基を含むように修飾され得る。特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質である。特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨ脂質は、ＰＥＧ鎖上に１つ以上のヒドロキシル基を含む。特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨまたはヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ鎖の末端に－ＯＨ基を含む。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、式（Ｐ１）の化合物であるか、

またはその塩もしくは異性体であり、式中、
ｒは、１～１００の整数であり、
Ｒは、Ｃ_{１０－４０}アルキル、Ｃ_{１０－４０}アルケニル、またはＣ_{１０－４０}アルキニルであり、任意でＲの１つ以上のメチレン基は、独立して、Ｃ_３－１０カルボシクリレン、４～１０員ヘテロシクリレン、Ｃ_６－１０アリーレン、４～１０員ヘテロアリーレン、－Ｎ（Ｒ^Ｎ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^Ｎ）－、－ＮＲ^ＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲ^ＮＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^Ｎ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^Ｎ）－、－ＮＲ^ＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲ^Ｎ）－、－Ｃ（＝ＮＲ^Ｎ）Ｎ（Ｒ^Ｎ）－、－ＮＲ^ＮＣ（＝ＮＲ^Ｎ）－、－ＮＲ^ＮＣ（＝ＮＲ^Ｎ）Ｎ（Ｒ^Ｎ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ^Ｎ）－、－ＮＲ^ＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲ^ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ^Ｎ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）_２－、－Ｓ（Ｏ）_２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）_２Ｏ－、－Ｎ（Ｒ^Ｎ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^Ｎ）－、－Ｎ（Ｒ^Ｎ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^Ｎ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^Ｎ）－、－Ｎ（Ｒ^Ｎ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ^Ｎ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ^Ｎ）－、－Ｎ（Ｒ^Ｎ）Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ^Ｎ）－、－ＯＳ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ^Ｎ）－、または－Ｎ（Ｒ^Ｎ）Ｓ（Ｏ）_２Ｏ－で置き換えられており、
Ｒ^Ｎの各事例は、独立して、水素、Ｃ_１－６アルキル、または窒素保護基である。

例えば、Ｒは、Ｃ１７アルキルである。例えば、ＰＥＧ脂質は、式（Ｐ１－ａ）の化合物であるか、

またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｒは、１～１００の整数である。

例えば、ＰＥＧ脂質は、以下の式の化合物である：

。

９．ヘルパー脂質
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の輸送ビヒクル（例えば、ＬＮＰ）は、１つ以上の非カチオン性ヘルパー脂質を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、リン脂質である。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、リン脂質代替物または代用物である。いくつかの実施形態では、リン脂質またはリン脂質代替物は、例えば、１つ以上の飽和または（ポリ）不飽和リン脂質、またはリン脂質代替物、またはそれらの組み合わせであり得る。通常、リン脂質は、リン脂質部位及び１つ以上の脂肪酸部位を含む。

リン脂質部位は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リソホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。

脂肪酸部位は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。

リン脂質には、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジグリセロール、及びホスファチジン酸が含まれるがこれらに限定されない。リン脂質にはまた、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質が含まれる。

いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、１，２－ジステアロイル－１７７－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）類似体、ＤＳＰＣ代替物、オレイン酸、またはオレイン酸類似体である。

いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、非ホスファチジルコリン（ＰＣ）双性イオン性脂質、ＤＳＰＣ類似体、オレイン酸、オレイン酸類似体、またはＤＳＰＣ代替物である。

いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５３５６９に記載されている。本開示の脂質組成物において使用するのに好適なヘルパー脂質には、例えば、多様な中性、非荷電または双性イオン性脂質が含まれる。かかるヘルパー脂質は好ましくは、本明細書に開示する化合物及び脂質の１つ以上と組み合わせて使用される。ヘルパー脂質の例には、５－ヘプタデシルベンゼン－１，３－ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２－ジステアロイルｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パイミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パイミトイイオイエオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リソホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイロレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リソホスファチジルエタノールアミン及びそれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。一実施形態では、ヘルパー脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）またはジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）であり得る。別の実施形態では、ヘルパー脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であり得る。ヘルパー脂質は、輸送ビヒクルの処理を安定化及び改善するように機能する。かかるヘルパー脂質は好ましくは、他の賦形剤、例えば、本明細書に開示するイオン化可能脂質の１つ以上と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質と組み合わせて使用される場合、ヘルパー脂質は、脂質ナノ粒子に存在する総脂質の５％～約９０％、または約１０％～約７０％のモル比を含み得る。

１０．構造脂質
ある実施形態では、構造脂質は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１５９１３号に記載されている。

本明細書に記載の輸送ビヒクルは、１つ以上の構造脂質を含む。脂質ナノ粒子における構造脂質の組み込みは、粒子における他の脂質の凝集を軽減するのに役立ち得る。構造脂質には、コレステロール、フェコステロール、エルゴステロール、バシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル、アルファ－トコフェロール、及びそれらの混合物が含まれ得るがこれらに限定されない。特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。特定の実施形態では、構造脂質には、コレステロール及びコルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、及びヒドロコルチゾンなど）、またはそれらの組み合わせが含まれる。

いくつかの実施形態では、構造脂質は、ステロールである。特定の実施形態では、構造脂質は、ステロイドである。特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールの類似体である。特定の実施形態では、構造脂質は、アルファ－トコフェロールである。

本明細書に記載の輸送ビヒクルは、１つ以上の構造脂質を含む。輸送ビヒクル、例えば、脂質ナノ粒子における構造脂質の組み込みは、粒子における他の脂質の凝集を軽減するのに役立ち得る。特定の実施形態では、構造脂質には、コレステロール及びコルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、及びヒドロコルチゾンなど）、またはそれらの組み合わせが含まれる。

いくつかの実施形態では、構造脂質は、ステロールである。構造脂質には、ステロール（例えば、フィトステロールまたは動物ステロール）が含まれ得るがこれらに限定されない。

特定の実施形態では、構造脂質は、ステロイドである。例えば、ステロールには、コレステロール、ベータシトステロール、フェコステロール、エルゴステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル酸、またはアルファ－トコフェロールが含まれ得るがこれらに限定されない。

いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、有効量の免疫細胞送達増強脂質、例えば、コレステロール類似体もしくはアミノ脂質またはそれらの組み合わせを含み得、これは、輸送ビヒクル、例えば、脂質ナノ粒子に存在する場合、免疫細胞送達増強脂質を欠く輸送ビヒクルと比べて、細胞会合及び／または取り込み、内在化、細胞内トラフィッキング及び／またはプロセシング、及び／またはエンドソーム脱出を増強することによって機能し得、及び／または免疫細胞による認識及び／または免疫細胞への結合を増強し得る。したがって、いかなる特定のメカニズムまたは理論によって拘束されることを意図するものではないが、一実施形態では、本開示の構造脂質または他の免疫細胞送達増強脂質は、Ｃ１ｑに結合し、またはかかる脂質を含む輸送ビヒクルのＣ１ｑへの結合を促進する。ゆえに、免疫細胞への核酸分子の送達のための本開示の輸送ビヒクルのインビトロ使用は、Ｃ１ｑを含む培養条件が使用される（例えば、血清、または外因性Ｃ１ｑの無血清培地への添加を含む培地の使用）。本開示の輸送ビヒクルのインビボ使用のため、Ｃ１ｑの必要性は、内因性Ｃ１ｑによって供給される。

特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールの類似体である。いくつかの実施形態では、構造脂質は表１６における脂質である。

（表１６）

１１．ＬＮＰ製剤
本明細書に記載の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形成は、当該技術分野で知られている任意の方法によって達成され得る。例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１２／０１７８７０２Ａ１号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。脂質ナノ粒子組成物及びそれらを作製する方法の非限定的な例は、例えば、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１７２－１７６；Ｊａｙａｒａｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，５１：８５２９－８５３３；及びＭａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１，１５７０－１５７８に記載されており、これらの各々の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１１／１２７２５５号または同第ＷＯ２００８／１０３２７６号に記載されている方法によって調製され得、これらの各々の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、ポリカチオン性組成物を含み得る。非限定的な例として、ポリカチオン性組成物は、米国特許公開第ＵＳ２００５／０２２２０６４Ａ１号の式１～６０から選択される組成物であり得、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一実施形態では、脂質ナノ粒子は、米国特許公開第ＵＳ２０１３／０１５６８４５Ａ１号、及び国際特許公開第ＷＯ２０１３／０９３６４８Ａ２号または同第ＷＯ２０１２／０２４５２６Ａ２号に記載されている方法によって製剤化され得、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、米国特許公開第ＵＳ２０１３／０１６４４００Ａ１号に記載されているシステム及び／または方法によって滅菌環境において作製され得、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、米国特許第８，４９２，３５９号に記載されている核酸－脂質粒子などのナノ粒子中で製剤化され得、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ナノ粒子組成物は任意選択で、１つ以上のコーティングを含み得る。例えば、ナノ粒子組成物は、コーティングを有するカプセル、フィルム、または錠剤中で製剤化され得る。本明細書に記載の組成物を含むカプセル、フィルム、または錠剤は、任意の有用なサイズ、引張強度、硬度、または密度を有し得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、マイクロ流体ミキサーを含む方法を使用して合成され得る。例示的なマイクロ流体ミキサーには、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）、Ｍｉｃｒｏｉｎｎｏｖａ（Ａｌｌｅｒｈｅｉｌｉｇｅｎ ｂｅｉ Ｗｉｌｄｏｎ，Ａｕｓｔｒｉａ）によって製造されているものを含むがこれらに限定されないスリット指間マイクロミキサー及び／または交互ヘリングボーンマイクロミキサー（ＳＨＭ）（Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖ，Ｉ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２８：３６３３－４０；Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．（２０１２）１：ｅ３７；Ｃｈｅｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０１２）１３４（１６）：６９４８－５１が含まれ得るがこれらに限定されず、その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＳＨＭを含むＬＮＰ生成の方法は、少なくとも２つのインプットストリームの混合をさらに含み、混合は、マイクロ構造誘導性カオス的移流（ＭＩＣＡ）によって生じる。この方法によれば、流体ストリームは、回転流を引き起こし、互いの周りで流体を折り重ねるヘリングボーンパターンに存在するチャネルを通して流れる。この方法はまた、流体混合用の表面を含み得、その表面は、流体循環中に向きを変える。ＳＨＭを使用してＬＮＰを生成する方法には、米国特許公開第ＵＳ２００４／０２６２２２３Ａ１号及び同第ＵＳ２０１２／０２７６２０９Ａ１号に開示されているものが含まれ、これらの各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一実施形態では、脂質ナノ粒子は、マイクロミキサー、例えば、限定されないが、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ Ｍａｉｎｚ ＧｍｂＨ，Ｍａｉｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＳｌｉｔ Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｍｉｘｅｒ（ＳＩＭＭ－Ｖ２）またはＳｔａｎｄａｒｄ Ｓｌｉｔ Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏ Ｍｉｘｅｒ（ＳＳＩＭＭ）またはＣａｔｅｒｐｉｌｌａｒ（ＣＰＭＭ）またはＩｍｐｉｎｇｉｎｇ－ｊｅｔ（ＩＪＭＭ）を使用して製剤化され得る。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、マイクロ流体技術を使用して生成される（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ．４４２：３６８－３７３；及びＡｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９５：６４７－６５１を参照されたく、その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。非限定的な例として、制御されたマイクロ流体製剤化は、マイクロチャネルにおいて低いレイノルズ数で安定した圧力駆動流のストリームを混合するための受動的方法を含む（例えば、Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９５：６４７６５１を参照されたく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＲＮＡは、マイクロミキサーチップ、例えば、限定されないが、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）、Ｄｏｌｏｍｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｒｏｙｓｔｏｎ，ＵＫ）、またはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｖａｎ Ｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）製のものを使用して生成された脂質ナノ粒子で製剤化され得る。マイクロミキサーチップは、分割及び混和メカニズムでの２つ以上の流体ストリームの急速混合のために使用され得る。

一実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０～約１００ｎｍ、例えば、限定されないが、約１０～約２０ｎｍ、約１０～約３０ｎｍ、約１０～約４０ｎｍ、約１０～約５０ｎｍ、約１０～約６０ｎｍ、約１０～約７０ｎｍ、約１０～約８０ｎｍ、約１０～約９０ｎｍ、約２０～約３０ｎｍ、約２０～約４０ｎｍ、約２０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約２０～約１００ｎｍ、約３０～約４０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約４０～約１００ｎｍ、約５０～約６０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ約５０～約８０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ、約６０～約１００ｎｍ、約７０～約８０ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約７０～約１００ｎｍ、約８０～約９０ｎｍ、約８０～約１００ｎｍ及び／または約９０～約１００ｎｍの直径を有し得る。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０～５００ｎｍの直径を有し得る。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超または１０００ｎｍ超の直径を有し得る。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、１０～５００ｎｍ、２０～４００ｎｍ、３０～３００ｎｍ、または４０～２００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、５０～１５０ｎｍ、５０～２００ｎｍ、８０～１００ｎｍ、または８０～２００ｎｍの平均直径を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、０．１μｍ未満から最大で１ｍｍ、例えば、限定されないが、０．１μｍ未満、１．０μｍ未満、５μｍ未満、１０μｍ未満、１５μｍ未満、２０μｍ未満、２５μｍ未満、３０μｍ未満、３５μｍ未満、４０μｍ未満、５０μｍ未満、５５μｍ未満、６０μｍ未満、６５μｍ未満、７０μｍ未満、７５μｍ未満、８０μｍ未満、８５μｍ未満、９０μｍ未満、９５μｍ未満、１００μｍ未満、１２５μｍ未満、１５０μｍ未満、１７５μｍ未満、２００μｍ未満、２２５μｍ未満、２５０μｍ未満、２７５μｍ未満、３００μｍ未満、３２５μｍ未満、３５０μｍ未満、３７５μｍ未満、４００μｍ未満、４２５μｍ未満、４５０μｍ未満、４７５μｍ未満、５００μｍ未満、５２５μｍ未満、５５０μｍ未満、５７５μｍ未満、６００μｍ未満、６２５μｍ未満、６５０μｍ未満、６７５μｍ未満、７００μｍ未満、７２５μｍ未満、７５０μｍ未満、７７５μｍ未満、８００μｍ未満、８２５μｍ未満、８５０μｍ未満、８７５μｍ未満、９００μｍ未満、９２５μｍ未満、９５０μｍ未満、９７５μｍ未満の直径を有し得る。

別の実施形態では、ＬＮＰは、約１ｎｍ～約１００ｎｍ、約１ｎｍ～約１０ｎｍ、約１ｎｍ～約２０ｎｍ、約１ｎｍ～約３０ｎｍ、約１ｎｍ～約４０ｎｍ、約１ｎｍ～約５０ｎｍ、約１ｎｍ～約６０ｎｍ、約１ｎｍ～約７０ｎｍ、約１ｎｍ～約８０ｎｍ、約１ｎｍ～約９０ｎｍ、約５ｎｍ～約１００ｎｍ、約５ｎｍ～約１０ｎｍ、約５ｎｍ～約２０ｎｍ、約５ｎｍ～約３０ｎｍ、約５ｎｍ～約４０ｎｍ、約５ｎｍ～約５０ｎｍ、約５ｎｍ～約６０ｎｍ、約５ｎｍ～約７０ｎｍ、約５ｎｍ～約８０ｎｍ、約５ｎｍ～約９０ｎｍ、約１０～約５０ｎＭ、約２０～約５０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約５０～約８０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ及び／または約７０～約９０ｎｍの直径を有し得る。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

ナノ粒子組成物は、比較的均質であり得る。ナノ粒子組成物の均一性、例えば、ナノ粒子組成物の粒子サイズ分布を示すために多分散性指数が使用され得る。低い（例えば、０．３未満）多分散性指数は通常、狭い粒子サイズ分布を示す。ナノ粒子組成物は、約０～約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、または０．２５の多分散性指数を有し得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物の多分散性指数は、約０．１０～約０．２０であり得る。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

組成物の界面動電位を示すためにナノ粒子組成物のゼータ電位が使用され得る。例えば、ゼータ電位は、ナノ粒子組成物の表面電荷を表し得る。より高く荷電した種は、細胞、組織、及び身体における他の要素と不要に相互作用し得るので、比較的低い正または負電荷を有するナノ粒子組成物が通常は所望である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物のゼータ電位は、約－２０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－２０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－２０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－２０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－２０ｍＶ～約０ｍＶ、約－２０ｍＶ～約－５ｍＶ、約－２０ｍＶ～約－１０ｍＶ、約－２０ｍＶ～約－１５ｍＶ約－２０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－２０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－２０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－２０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－２０ｍＶ～約０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、または約＋５ｍＶ～約＋１０ｍＶであり得る。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

治療剤の封入の効率は、提供された初期量と比べて、調製後にナノ粒子組成物に封入される、またはそうでなければ関連付けられる治療剤の量を表す。封入効率は、望ましくは高い（例えば、１００％に近い）。封入効率は、例えば、ナノ粒子組成物を１つ以上の有機溶媒または洗浄剤で分解する前及び後にナノ粒子組成物を含有する溶液中の治療剤の量を比較することによって測定され得る。蛍光は、溶液中の遊離治療剤（例えば、核酸）の量を測定するために使用され得る。本明細書に記載のナノ粒子組成物について、治療剤の封入効率は、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、封入効率は、少なくとも８０％であり得る。特定の実施形態では、封入効率は、少なくとも９０％であり得る。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．４未満の多重多様度を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、中性ｐＨで正味中性電荷を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５０～２００ｎｍの平均直径を有する。

脂質ナノ粒子製剤の特性は、カチオン性脂質成分の選択、カチオン性脂質飽和の程度、非カチオン性脂質成分の選択、非カチオン性脂質飽和の程度、構造脂質成分の選択、ＰＥＧ化の特質、全ての成分の比及びサイズなどの生物物理学的パラメータを含むがこれらに限定されない要因によって影響を受け得る。本明細書に記載されるように、ＰＥＧ脂質成分の純度もまた、ＬＮＰの特性及び性能にとって重要である。

１２．方法
一実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、国際公開第ＷＯ２０１１１２７２５５号または同第ＷＯ２００８１０３２７６号に記載されている方法によって調製され得、これらの各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、国際公開第ＷＯ２０１９１３１７７０号に記載されているとおりであり得、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、米国特許出願第１５／８０９，６８０号に記載されているプロセスに従って製剤化される。いくつかの実施形態では、本発明は、輸送ビヒクルに環状ＲＮＡを封入するプロセスであって、事前に形成した輸送ビヒクル（すなわち、ＲＮＡの非存在下で形成した）内に脂質を形成し、次いで事前に形成した輸送ビヒクルをＲＮＡと組み合わせるステップを含む、プロセスを提供する。いくつかの実施形態では、新規の製剤化プロセスは、脂質ナノ粒子を予形成するステップを伴わずに調製された（例えば、脂質をＲＮＡと直接組み合わせた）同じＲＮＡ製剤と比較して、より高い効力（ペプチドまたはタンパク質発現）及びより高い有効性（生物学的に関連するエンドポイントの改善）を、インビトロ及びインビボの両方で有し、潜在的により良好な忍容性を伴う、ＲＮＡ製剤をもたらす。

ＲＮＡの特定のカチオン性脂質ナノ粒子製剤の場合、ＲＮＡの高い封入を達成するために、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液）中のＲＮＡを加熱する必要がある。これらのプロセスまたは方法では、製剤化後（ナノ粒子の形成後）の加熱は脂質ナノ粒子へのＲＮＡの封入効率を増加させないため、製剤化プロセスの前に加熱を行う必要がある（すなわち、別個の成分を加熱する）。対照的に、本発明の新規プロセスのいくつかの実施形態では、ＲＮＡの加熱の順序は、ＲＮＡ封入パーセンテージに影響を与えるようには見えない。いくつかの実施形態では、予形成脂質ナノ粒子を含む溶液、ＲＮＡを含む溶液、及び脂質ナノ粒子に封入されたＲＮＡを含む混合溶液のうちの１つ以上の加熱は、製剤化プロセスの前後で生じる必要がない（すなわち、周囲温度で維持される）。

ＲＮＡは、ＲＮＡが脂質ナノ粒子に封入され得るように、脂質溶液と混合される溶液にて提供され得る。好適なＲＮＡ溶液は、様々な濃度で封入されるＲＮＡを含有する任意の水溶液であり得る。例えば、好適なＲＮＡ溶液は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．０６ｍｇ／ｍｌ、０．０７ｍｇ／ｍｌ、０．０８ｍｇ／ｍｌ、０．０９ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、または１．０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度でＲＮＡを含有し得る。いくつかの実施形態では、好適なＲＮＡ溶液は、約０．０１～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．７ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．６ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．４ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．３ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．２ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．７ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．６ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．４ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．３ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．２ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．１ｍｇ／ｍｌ、０．１～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．２～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．３～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．４～０．７ｍｇ／ｍｌ、または０．５～０．６ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でＲＮＡを含有し得る。

典型的には、好適なＲＮＡ溶液はまた、緩衝剤及び／または塩を含有し得る。通常、緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ、トリス、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウムまたはリン酸ナトリウムを含み得る。いくつかの実施形態では、緩衝剤の好適な濃度は、約０．１ｍＭ～１００ｍＭ、０．５ｍＭ～９０ｍＭ、１．０ｍＭ～８０ｍＭ、２ｍＭ～７０ｍＭ、３ｍＭ～６０ｍＭ、４ｍＭ～５０ｍＭ、５ｍＭ～４０ｍＭ、６ｍＭ～３０ｍＭ、７ｍＭ～２０ｍＭ、８ｍＭ～１５ｍＭ、または９～１２ｍＭの範囲であり得る。

例示的な塩には、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、及び塩化カリウムが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ溶液における塩の好適な濃度は、約１ｍＭ～５００ｍＭ、５ｍＭ～４００ｍＭ、１０ｍＭ～３５０ｍＭ、１５ｍＭ～３００ｍＭ、２０ｍＭ～２５０ｍＭ、３０ｍＭ～２００ｍＭ、４０ｍＭ～１９０ｍＭ、５０ｍＭ～１８０ｍＭ、５０ｍＭ～１７０ｍＭ、５０ｍＭ～１６０ｍＭ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ、または５０ｍＭ～１００ｍＭの範囲であり得る。

いくつかの実施形態では、好適なＲＮＡ溶液は、約３．５～６．５、３．５～６．０、３．５～５．５、３．５～５．０、３．５～４．５、４．０～５．５、４．０～５．０、４．０～４．９、４．０～４．８、４．０～４．７、４．０～４．６、または４．０～４．５の範囲のｐＨを有し得る。

様々な方法が、本発明に好適なＲＮＡ溶液を調製するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、本明細書に記載の緩衝溶液に直接的に溶解され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ溶液は、封入のための脂質溶液と混合する前に、ＲＮＡストック溶液を緩衝液と混合することによって生成され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ溶液は、封入のための脂質溶液と混合する直前に、ＲＮＡストック溶液を緩衝液と混合することによって生成され得る。

本発明によれば、脂質溶液は、ＲＮＡの封入のための輸送ビヒクルを形成するのに好適な脂質の混合物を含有する。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、エタノールベースである。例えば、好適な脂質溶液は、純粋なエタノール（すなわち、１００％エタノール）に溶解した所望の脂質の混合物を含有し得る。別の実施形態では、好適な脂質溶液は、イソプロピルアルコールベースである。別の実施形態では、好適な脂質溶液は、ジメチルスルホキシドベースである。別の実施形態では、好適な脂質溶液は、エタノール、イソプロピルアルコール及びジメチルスルホキシドを含むがこれらに限定されない好適な溶媒の混合物である。

好適な脂質溶液は、様々な濃度で所望の脂質の混合物を含有し得る。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、約０．１～１００ｍｇ／ｍｌ、０．５～９０ｍｇ／ｍｌ、１．０～８０ｍｇ／ｍｌ、１．０～７０ｍｇ／ｍｌ、１．０～６０ｍｇ／ｍｌ、１．０～５０ｍｇ／ｍｌ、１．０～４０ｍｇ／ｍｌ、１．０～３０ｍｇ／ｍｌ、１．０～２０ｍｇ／ｍｌ、１．０～１５ｍｇ／ｍｌ、１．０～１０ｍｇ／ｍｌ、１．０～９ｍｇ／ｍｌ、１．０～８ｍｇ／ｍｌ、１．０～７ｍｇ／ｍｌ、１．０～６ｍｇ／ｍｌ、または１．０～５ｍｇ／ｍｌの範囲の総濃度で所望の脂質の混合物を含有し得る。

１３．ターゲティング
本発明は、受動的及び能動的ターゲティング手段の両方による標的細胞及び組織の差別的ターゲティングも企図する。受動的ターゲティングの現象は、標的細胞による輸送ビヒクルの認識を向上するための追加の賦形剤または手段の使用に依存することなく、インビボでの輸送ビヒクルの天然分布パターンを利用する。例えば、細網内皮系の細胞による食作用に供される輸送ビヒクルは、肝臓または脾臓に蓄積する可能性が高く、したがって、かかる標的細胞への組成物の送達を受動的に導く手段を提供し得る。

代替的に、本発明は、輸送ビヒクルに（共有結合または非共有結合のいずれかで）結合し得るターゲティング部分を使用して、ある特定の標的細胞または標的組織でのかかる輸送ビヒクルの局在化を助長することを含む、能動的ターゲティングを企図する。例えば、ターゲティングは、標的細胞または組織への分布を助長するために、輸送ビヒクルの中または上に１つ以上の内因性ターゲティング部分を含めることによって媒介され得る。標的組織によるターゲティング部分の認識は、標的細胞及び組織における輸送ビヒクル及び／またはその内容物の組織分布及び細胞取り込みを能動的に容易にする（例えば、輸送ビヒクルの中または上にアポリポタンパク質－Ｅターゲティングリガンドを含めることは、肝細胞によって発現される内因性低密度リポタンパク質受容体への輸送ビヒクルの認識及び結合を助長する）。本明細書に提供するように、組成物は、標的細胞に対する組成物の親和性を向上することができる部分を含むことができる。ターゲティング部分は、製剤化中または製剤化後に脂質粒子の外側の二重層に連結され得る。これらの方法は、当該技術分野で周知である。加えて、一部の脂質粒子製剤は、融合性ポリマー、例えばＰＥＡＡ、血球凝集素、他のリポペプチド（米国特許出願第０８／８３５，２８１号、及び同第６０／０８３，２９４号を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる）ならびにインビボ及び／または細胞内送達に有用である他の特性を採用し得る。他のいくつかの実施形態では、本発明の組成物は、改善されたトランスフェクション効率を実証する、及び／または目的の標的細胞もしくは組織に対する選択性の向上を示す。したがって、標的細胞または組織に対する組成物及びその核酸内容物の親和性を向上することができる１つ以上の部分（例えば、ペプチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド、ビタミンまたは他の分子）を含む組成物が企図される。好適な部分は、任意で、輸送ビヒクルの表面に結合または連結され得る。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、輸送ビヒクルの表面に広がり得る、または輸送ビヒクル内に封入され得る。好適な部分は、それらの物理的、化学的または生物学的特性（例えば、選択的親和性及び／または標的細胞表面マーカーもしくは特徴の認識）に基づいて選択される。細胞特異的標的部位及びその対応するターゲティングリガンドは、大きく異なり得る。好適なターゲティング部分は、標的細胞の固有の特徴を利用するように選択され、ゆえに、組成物が標的細胞と非標的細胞とを差別することを可能にする。例えば、本発明の組成物は、（例えば、かかる表面マーカーの受容体媒介認識及びかかる表面マーカーへの結合によって）肝細胞の認識、または肝細胞に対する親和性を選択的に向上する表面マーカー（例えば、アポリポタンパク質Ｂまたはアポリポタンパク質Ｅ）を含み得る。例として、ターゲティング部分としてのガラクトースの使用は、本発明の組成物を、肝実質細胞に指向させると予想され得る、また代替的にターゲティングリガンドとしての糖残基を含有するマンノースの使用は、本発明の組成物を、肝臓内皮細胞に指向させると予想され得る（例えば、肝細胞に存在するアシアロ糖タンパク質受容体に優先的に結合し得る糖残基を含有するマンノース）。（Ｈｉｌｌｅｒｙ Ａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．“Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ”（２００２）Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい。）輸送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する部分に複合されているかかるターゲティング部分の提示はそれゆえ、標的細胞及び組織における本発明の組成物の認識及び取り込みを容易にする。好適なターゲティング部分の例としては、１つ以上のペプチド、タンパク質、アプタマー、ビタミン及びオリゴヌクレオチドが挙げられる。

特定の実施形態では、輸送ビヒクルは、ターゲティング部分を含む。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、受容体媒介性エンドサイトーシスを特定の細胞集団に選択的に媒介する。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、Ｔ細胞抗原に結合することができる。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、ＮＫ、ＮＫＴ、またはマクロファージ抗原に結合することができる。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、群ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＰＤ－１、４－１ＢＢ、及びＣＤ２から選択されるタンパク質に結合することができる。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、ナノボディ、ペプチド、ペプチドベースの大環状化合物、ミニボディ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、Ｔ細胞受容体モチーフ抗体、Ｔ細胞α鎖抗体、Ｔ細胞β鎖抗体、Ｔ細胞γ鎖抗体、Ｔ細胞δ鎖抗体、ＣＣＲ７抗体、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ５抗体、ＣＤ７抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ２０抗体、ＣＤ２１抗体、ＣＤ２２抗体、ＣＤ２５抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ３５抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ４５ＲＯ抗体、ＣＤ５２抗体、ＣＤ５６抗体、ＣＤ６２Ｌ抗体、ＣＤ６８抗体、ＣＤ８０抗体、ＣＤ９５抗体、ＣＤ１１７抗体、ＣＤ１２７抗体、ＣＤ１３３抗体、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）抗体、ＣＤ１６３抗体、Ｆ４／８０抗体、ＩＬ－４Ｒα抗体、Ｓｃａ－１抗体、ＣＴＬＡ－４抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＧＡＲＰ抗体、ＬＡＰ抗体、グランザイムＢ抗体、ＬＦＡ－１抗体、トランスフェリン受容体抗体、及びそれらのフラグメントから選択される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、リンパ球上のエクト酵素の小分子結合因子である。エクト酵素の小分子結合因子には、Ａ２Ａ阻害剤ＣＤ７３阻害剤、ＣＤ３９またはアデシン受容体Ａ２ａＲ及びＡ２ｂＲが含まれる。潜在的な小分子には、ＡＢ９２８が含まれる。

いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、Ｓｈｏｂａｋｉ Ｎ，Ｓａｔｏ Ｙ，Ｈａｒａｓｈｉｍａ Ｈ．Ｍｉｘｉｎｇ ｌｉｐｉｄｓ ｔｏ ｍａｎｉｐｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｉｓｓｕｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１８；１３：８３９５－８４１０．２０１８年１２月１０日に公開に記載されるように、製剤化及び／またはターゲティングされる。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、３つの脂質タイプから構成される。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、４つの脂質タイプから構成される。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、５つの脂質タイプから構成される。いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、６つの脂質タイプから構成される。

１４．標的細胞
核酸を免疫細胞に送達することが所望である場合、免疫細胞は、標的細胞を表す。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、標的細胞を差別的にトランスフェクションする（すなわち、非標的細胞をトランスフェクトしない）。本発明の組成物はまた、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及び樹状細胞が含まれるがこれらに限定されない多様な標的細胞を優先的に標的とするように調製され得る。

いくつかの実施形態では、標的細胞は、目的のタンパク質または酵素が欠損している。例えば、核酸を肝細胞に送達することが望まれる場合、肝細胞は標的細胞を表す。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、標的細胞を差別的にトランスフェクトする（すなわち、非標的細胞をトランスフェクトしない）。本発明の組成物はまた、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞（例えば、髄膜、星状膠細胞、運動ニューロン、後根神経節細胞及び前角運動ニューロン）、光受容体細胞（例えば、杆体及び錐体）、網膜色素上皮細胞、分泌細胞、心細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑膜ライニング細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、及び腫瘍細胞を含むが、これに限定されない様々な標的細胞を優先的に標的とするように調製され得る。

本発明の組成物は、心臓、肺、腎臓、肝臓、及び脾臓などの標的細胞に優先的に分布するように調製され得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、肝臓または脾臓の細胞に分布して、肝臓の細胞（例えば、肝細胞）または脾臓の細胞（例えば、免疫細胞）による組成物に含まれるｃｉｒｃＲＮＡの送達及びその後の発現を容易にする。標的とされる細胞は、機能的タンパク質または酵素を産生する、及び全身的に排泄することができる生物学的「貯蔵所」または「デポー」として機能し得る。したがって、本発明の一実施形態では、輸送ビヒクルは、肝細胞または免疫細胞を標的とし得る及び／または送達時に肝臓または脾臓の細胞に優先的に分布される。ある実施形態では、標的肝細胞または免疫細胞のトランスフェクションに続いて、ビヒクルにロードされたｃｉｒｃＲＮＡが翻訳され、機能的タンパク質産物が産生され、排泄され、全身に分布される。他の実施形態では、肝細胞以外の細胞（例えば、肺、脾臓、心臓、眼球、または中枢神経系の細胞）は、タンパク質産生のためのデポー場所として機能することができる。

一実施形態では、本発明の組成物は、対象の、１つ以上の機能的タンパク質及び／または酵素の内因性産生を容易にする。本発明のある実施形態では、輸送ビヒクルは、欠損タンパク質または酵素をコードするｃｉｒｃＲＮＡを含む。かかる組成物の標的組織への分布、及び続くかかる標的細胞のトランスフェクションの際、輸送ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）にロードされた外因性ｃｉｒｃＲＮＡは、インビボで翻訳されて、外因的に投与されたｃｉｒｃＲＮＡ（例えば、対象が欠損しているタンパク質または酵素）によってコードされる機能的タンパク質または酵素を産生し得る。したがって、本発明の組成物は、外因的にまたは組換えにより調製されたｃｉｒｃＲＮＡを翻訳して内因的に翻訳されたタンパク質または酵素を産生し、それによって機能的タンパク質または酵素を産生する（及び該当する場合は排泄する）対象の能力を利用する。発現または翻訳されたタンパク質または酵素は、組換えにより調製されたタンパク質または酵素にはしばしば存在しない場合がある天然の翻訳後修飾をインビボで含み、それにより、翻訳されたタンパク質または酵素の免疫原性がさらに低下することも特徴とし得る。

欠損タンパク質または酵素をコードするｃｉｒｃＲＮＡの投与は、標的細胞内の特定の細胞小器官に核酸を送達する必要性を回避する。むしろ、標的細胞のトランスフェクション及び標的細胞の細胞質への核酸の送達の際に、輸送ビヒクルのｃｉｒｃＲＮＡ内容物が翻訳され、機能的タンパク質または酵素が発現され得る。

いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、１つ以上の非標的細胞または非標的細胞型（例えば、クッパー細胞または肝細胞）に存在し、１つ以上の標的細胞または標的細胞型（例えば、肝細胞またはＴ細胞）に存在しないｍｉＲＮＡによって認識される１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、１つ以上の標的細胞または標的細胞型（例えば、肝細胞またはＴ細胞）と比較して、１つ以上の非標的細胞または非標的細胞型（例えば、クッパー細胞または肝細胞）にて増加した濃度で存在するｍｉＲＮＡによって認識される１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含む。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ分子内の相補的な配列と対形成することによって機能し、遺伝子サイレンシングをもたらすと考えられている。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、標的細胞を差別的にトランスフェクションまたは分配する（すなわち、非標的細胞をトランスフェクトしない）。本発明の組成物はまた、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞（例えば、髄膜、星状膠細胞、運動ニューロン、後根神経節細胞及び前角運動ニューロン）、光受容体細胞（例えば、杆体及び錐体）、網膜色素上皮細胞、分泌細胞、心細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑膜ライニング細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、及び腫瘍細胞を含むが、これに限定されない様々な標的細胞を優先的に標的とするように調製され得る。

１５．薬学的組成物
特定の実施形態では、本明細書に提供する治療剤を含む組成物（例えば、薬学的組成物）を本明細書に提供する。いくつかの実施形態では、治療剤は、本明細書に提供する環状ＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、治療剤は、本明細書に提供するベクターである。いくつかの実施形態では、治療剤は、本明細書に提供する環状ＲＮＡまたはベクターを含む細胞（例えば、ヒトＴ細胞などのヒト細胞）である。特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する組成物は、本明細書に提供する治療剤を、他の薬学的に活性な作用物質または薬物、例えば、Ｂ細胞抗原を標的とすることができる抗炎症薬物または抗体、例えば、抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブと組み合わせて含む。

薬学的組成物に関して、薬学的に許容可能な担体は、慣習的に使用されるものいずれかであることができ、化学物理的考慮、例えば溶解度及び活性剤（複数可）との反応性の欠如、ならびに投与経路によってのみ、限定される。本明細書に記載の薬学的に許容可能な担体、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、及び希釈剤は、当業者に周知であり、一般に容易に入手可能である。薬学的に許容可能な担体は、治療剤（複数可）に対して化学的に不活性であり、使用条件下で有害な副作用または毒性を有さないものであることが好ましい。

担体の選択は、特定の治療剤、ならびに治療剤を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定されるだろう。したがって、本明細書に提供する薬学的組成物の様々な好適な製剤が存在する。

特定の実施形態では、薬学的組成物は、防腐剤を含む。特定の実施形態では、好適な防腐剤は、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、及び塩化ベンザルコニウムを含み得る。任意で、２つ以上の防腐剤の混合物を使用し得る。防腐剤またはその混合物は、典型的には、総組成物の約０．０００１重量％～約２重量％の量で存在する。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、好適な緩衝剤には、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、ならびに様々な他の酸及び塩が含まれ得る。２つ以上の緩衝剤の混合物を、任意で使用してよい。緩衝剤またはその混合物は、典型的には、総組成物の約０．００１重量％～約４重量％の量で存在する。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物中の治療剤の濃度は、変動することができ、例えば、約１重量％未満、または少なくとも約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、もしくは約５０重量％以上であることができ、選択された特定の投与様式に従って、流体容量、及び粘度によって主に選択することができる。

経口、エアロゾル、非経口（例えば、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び髄腔内）、及び局所投与のための以下の製剤は、単なる例示であり、決して限定するものではない。本明細書に提供する治療剤を投与するために１つより多い経路を使用することができ、ある特定の例では、特定の経路は、別の経路よりも迅速及びより効果的な応答を提供することができる。

経口投与に好適な製剤は、（ａ）液体溶液、例えば水、生理食塩水またはオレンジジュースなどの希釈剤中に溶解させた有効量の治療剤；（ｂ）各々が所定量の活性成分を固体または顆粒として含有する、カプセル、サシェ、錠剤、舐剤及びトローチ；（ｃ）粉末；（ｄ）適切な液体中の懸濁液；ならびに（ｅ）好適なエマルジョンを含むまたはこれからなることができる。液体製剤は、希釈剤、例えば水及びアルコール、例えば、エタノール、ベンジルアルコール及びポリエチレンアルコールを、薬学的に許容可能な界面活性剤の添加を伴ってまたは伴わずに含み得る。カプセル形態は、例えば、界面活性剤、滑剤、ならびに不活性充填剤、例えばラクトース、スクロース、リン酸カルシウム及びコーンスターチを含有する通常のハードシェルまたはソフトシェルゼラチンタイプのものであることができる。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモでんぷん、アルギン酸、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、防腐剤、香味料、ならびに他の薬理学的に適合する賦形剤のうちの１つ以上を含むことができる。舐剤の形態は、香味料、通常はスクロース、アカシアまたはトラガカントを伴う治療剤を含むことができる。香錠は、当該技術分野で知られているような賦形剤に加えて、不活性塩基、例えばゲラチン及びグリセリン、またはスクロース及びアカシア、エマルジョン、ゲルなどを有する治療剤を含むことができる。

非経口投与に好適な製剤には、製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする抗酸化剤、緩衝剤、制菌剤、及び溶質を含有し得る水性及び非水性の等張滅菌注射液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び防腐剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する治療剤は、水、生理食塩水、デキストロース水溶液及び関連糖溶液、アルコール、例えばエタノールもしくはヘキサデシルアルコール、グリコール、例えばプロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、ケタール、例えば２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－メタノール、エーテル、ポリ（エチレングリコール）４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステルもしくはグリセリド、またはアセチル化脂肪酸グリセリドを含む滅菌の液体または液体の混合物などの医薬担体中の生理学的に許容可能な希釈剤にて、薬学的に許容可能な界面活性剤、例えば石鹸剤もしくは洗剤、懸濁剤、例えばペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、もしくはカルボキシメチルセルロース、または乳化剤及び他の医薬アジュバントの添加を、伴ってまたは伴わずに投与できる。

油は、いくつかの実施形態では非経口製剤で使用することができ、石油、動物油、植物油、または合成油を含む。油の具体例としては、ピーナッツ、大豆、ゴマ、綿実、トウモロコシ、オリーブ、ワセリン、及び鉱油が含まれる。非経口製剤での使用に好適な脂肪酸には、オレイン酸、ステアリン酸、及びイソステアリン酸が含まれる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルは、好適な脂肪酸エステルの例である。

非経口製剤の特定の実施形態での使用に好適な石鹸には、脂肪アルカリ金属、アンモニウム、及びトリエタノールアミン塩が含まれ、好適な洗剤には、（ａ）カチオン性洗剤、例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライド、及びアルキルピリジニウムハライド、（ｂ）アニオン性洗剤、例えば、アルキル、アリール、及びオレフィンスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル、及びモノグリセリド硫酸塩、及びスルホサクシネート、（ｃ）非イオン性洗剤、例えば、脂肪アミン酸化物、脂肪酸アルカノールアミド、及びポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー、（ｄ）両性洗剤、例えば、アルキル－β－アミノプロピオネート、及び２－アルキル－イミダゾリン四級アンモニウム塩、ならびに（ｅ）その混合物が含まれる。

いくつかの実施形態では、非経口製剤は、例えば、約０．５重量％～約２５重量％の治療剤を溶液中に含有するだろう。防腐剤及び緩衝液を使用してよい。注射部位での刺激を最小限に抑えるまたは排除するために、かかる組成物は、例えば、約１２～約１７の親水性－親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１つ以上の非イオン性界面活性剤を含有し得る。かかる製剤中の界面活性剤の量は、典型的には、例えば、約５重量％～約１５重量％の範囲であるだろう。好適な界面活性剤には、ポリエチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステル、例えばソルビタンモノオレエート、及びプロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合によって形成される疎水性塩基とのエチレンオキシドの高分子量付加物が含まれる。非経口製剤は、アンプル及びバイアルなどの単位用量または複数用量の密封コンテナで提供することができ、注射のために、使用直前に、滅菌液体賦形剤、例えば水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管することができる。即時注射溶液及び懸濁液は、前述の種類の滅菌散剤、顆粒剤、及び錠剤から調製することができる。

特定の実施形態では、注射可能な製剤を本明細書に提供する。注射可能な組成物のための有効な医薬担体の要件は、当業者に周知である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ ２３８－２５０（１９８２）、及びＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ ｅｄ，ｐａｇｅｓ ６２２－６３０（１９８６）を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、局所製剤を本明細書に提供する。経皮薬物放出に有用なものを含む局所製剤は、皮膚への適用のために本明細書に提供する特定の実施形態の状況において好適である。いくつかの実施形態では、治療剤は、単独で、または他の好適な成分と組み合わせて、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤にすることができる。これらのエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容可能な推進剤に入れることができる。それらはまた、ネブライザーまたはアトマイザーなどの非加圧調製物用の医薬品として製剤化され得る。かかる噴霧製剤も、粘膜を噴霧するために使用され得る。

特定の実施形態では、本明細書に提供する治療剤は、包接複合体、例えばシクロデキストリン包接複合体、またはリポソームとして製剤化することができる。リポソームは、治療剤が特定の組織を標的とするのに役立ち得る。リポソームは、治療剤の半減期を延長するために使用することもできる。リポソームを調製するために多くの方法が利用可能であり、例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９，４６７（１９８０）ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、及び同第５，０１９，３６９号に記載のとおりである。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供する治療剤は、組成物の送達が処置される部位の感作の前に、それを引き起こすのに十分な時間で起こるように、時間放出、遅延放出、または持続放出送達システムで製剤化される。かかるシステムは、治療剤の反復投与を回避することができ、それにより、対象及び医師に対する利便性が増加し、本明細書に提供するある特定の組成物の実施形態に特に好適であり得る。一実施形態では、本発明の組成物は、そこに含有されるｃｉｒｃＲＮＡの徐放に好適であるように製剤化される。かかる徐放性組成物は、対象に、延長された投薬間隔で好都合に投与され得る。例えば、一実施形態では、本発明の組成物は、対象に、１日２回、毎日または隔日で投与される。ある実施形態では、本発明の組成物は、対象に、週２回、週１回、１０日毎に、２週毎に、３週毎に、４週毎に、月１回、６週毎に、８週毎に、３か月毎に、４か月毎に、６か月毎に、８か月毎に、９か月毎に、または毎年投与される。

いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、持続量の時間にわたって、標的細胞によって産生される。例えば、タンパク質は、投与後１時間より長く、４時間より長く、６時間より長く、１２時間より長く、２４時間より長く、４８時間より長く、または７２時間より長く産生され得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、投与から約６時間後にピークレベルで発現される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの発現は、少なくとも治療レベルで持続される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも治療レベルで、投与後１時間より長く、４時間より長く、６時間より長く、１２時間より長く、２４時間より長く、４８時間より長く、または７２時間より長く発現される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、患者の組織（例えば、肝臓または肺）において治療レベルで検出可能である。いくつかの実施形態では、検出可能なポリペプチドのレベルは、投与後１時間より長く、４時間より長く、６時間より長く、１２時間より長く、２４時間より長く、４８時間より長く、または７２時間より長い時間にわたる、ｃｉｒｃＲＮＡ組成物からの継続的な発現からである。

特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、正常な生理学的レベルを超えるレベルで産生される。タンパク質のレベルは、対照と比較して増加し得る。いくつかの実施形態では、対照は、正常な個体または正常な個体の集団におけるポリペプチドのベースライン生理学的レベルである。他の実施形態では、対照は、関連するタンパク質もしくはポリペプチドに欠損を有する個体または関連するタンパク質もしくはポリペプチドに欠損を有する個体の集団におけるポリペプチドのベースライン生理学的レベルである。いくつかの実施形態では、対照は、組成物が投与される個体における関連するタンパク質またはポリペプチドの正常レベルであることができる。他の実施形態では、対照は、１つ以上の比較可能な時点での、他の治療的介入時、例えば、対応するポリペプチドの直接注射時のポリペプチドの発現レベルである。

特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質のレベルは、投与後３日、４日、５日、または１週間以上で検出可能である。組織（例えば、肝臓または肺）においてタンパク質のレベルの増加が観察され得る。

いくつかの実施形態では、本方法は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の持続的な循環半減期をもたらす。例えば、タンパク質は、タンパク質またはタンパク質をコードするｍＲＮＡの皮下注射を介して観察される半減期よりも長い時間または日数にわたって検出され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質の半減期は、１日、２日、３日、４日、５日、または１週間以上である。

多くのタイプの放出送達システムが利用可能であり、当業者に公知である。それらは、ポリマーをベースとしたシステム、例えばポリ（ラクチド－グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシブチル酸、及びポリ無水物を含む。薬剤を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルが、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。送達システムはまた、コレステロール、コレステロールエステル及び脂肪酸などのステロールまたはモノ－ジ－及びトリ－グリセリドなどの中性脂肪を含む脂質；ヒドロゲル放出システム；シラスティックシステム；ペプチドをベースとしたシステム；ワックス被覆剤；従来の結合剤及び賦形剤を使用する圧縮錠剤；部分的に融合した移植片；などを含む非ポリマーシステムを含む。具体例としては、これに限定されないが、（ａ）侵食システム、ここで、活性組成物は、米国特許第４，４５２，７７５号、同第４，６６７，０１４号、同第４，７４８，０３４号、及び同第５，２３９，６６０号に記載のものなどのマトリックス内の形状にて含有される、ならびに（ｂ）拡散システムが含まれ、ここで、活性成分は、米国特許第３，８３２，２５３号及び同第３，８５４，４８０号に記載されるようなポリマーから制御された速度で浸透する。加えて、ポンプをベースとしたハードウェア送達システムを使用することができ、そのうちいくつかは、移植に適合している。

いくつかの実施形態では、治療剤は、ターゲティング部分に連結部分を通して直接的または間接的に複合することができる。治療剤をターゲティング部分に複合するための方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｗａｄｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ，Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ３：１１１（１９９５）及び米国特許第５，０８７，６１６号を参照されたい。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供する治療剤は、治療剤が、それが投与される体内に放出される様式が、体内の時間及び位置に関して制御されるように、デポー形態へと製剤化される（例えば、米国特許第４，４５０，１５０号を参照されたい）。治療剤のデポー形態は、例えば、治療剤及びポリマーなどの多孔質または非多孔質物質を含む埋め込み型組成物であることができ、治療剤は物質によって封入される、もしくは物質全体に拡散される、及び／または非多孔質物質の分解。デポーは次に体内の所望の位置に埋め込まれ、治療剤は、埋め込み物から所定の速度で放出される。

１６．治療方法
特定の態様では、状態、例えば、自己免疫障害またはがんを処置及び／または予防する方法を本明細書において提供する。

特定の実施形態では、本明細書に提供する治療剤は、１つ以上の追加の治療剤と（例えば、同じ薬学的組成物にて、または別個の薬学的組成物にて）共投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する治療剤を最初に投与することができ、１つ以上の追加の治療剤を次に投与することができ、またはその逆も可能である。代替的に、本明細書に提供する治療剤及び１つ以上の追加の治療剤を同時に投与することができる。

いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、本明細書で言及される哺乳動物は、げっ歯目の哺乳動物、例えばマウス及びハムスター、またはウサギ目（Ｌｏｇｏｍｏｒｐｈａ）の哺乳動物、例えばウサギを含むがこれに限定されない任意の哺乳動物であり得る。哺乳動物は、ネコ科（ネコ）及びイヌ科（イヌ）を含む食肉目からであり得る。哺乳動物は、ウシ科（ウシ）及びイノシシ科（ブタ）を含む偶蹄目、またはウマ科（ウマ）を含む奇蹄目からであり得る。哺乳動物は、霊長目、セボイド目、もしくはシモイド目（サル）、または類人猿目（ヒト及び類人猿）であり得る。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。

１７．配列
（表１７）ＩＲＥＳ配列

いくつかの実施形態では、本発明のＩＲＥＳは、表１７に列挙される配列（配列番号１～７２及び３４８～３８９）を有するＩＲＥＳを有する。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、サリウイルスＩＲＥＳである。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、サリウイルスＳＺ１ ＩＲＥＳである。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、ＡＰ１．０（配列番号３４８）である。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、ＣＫ１．０（配列番号３４９）である。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、ＰＶ１．０（配列番号３５０）である。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、ＳＶ１．０（配列番号３５１）である。

（表１８）アナベナ順列置換部位５’イントロンフラグメント配列

いくつかの実施形態では、５’イントロンフラグメントは、表１８に列挙される配列を有するフラグメントである。典型的には、表１８に列挙された５’イントロンフラグメントを含有する構築物は、表１９に列挙されるような対応する３’イントロンフラグメントを含有するだろう（例えば、両方ともＬ９ａ－８順列置換部位を伴うフラグメントを表す）。

（表１９）アナベナ順列置換部位３’イントロンフラグメント配列

いくつかの実施形態では、３’イントロンフラグメントは、表１９に列挙される配列を有するフラグメントである。いくつかの実施形態では、表１９に列挙された３’イントロンフラグメントを含有する構築物は、表１８に列挙されるような対応する５’イントロンフラグメントを含有するだろう（例えば、両方ともＬ９ａ－８順列置換部位を伴うフラグメントを表す）。

（表２０）非アナベナ順列置換部位５’イントロンフラグメント配列

いくつかの実施形態では、５’イントロンフラグメントは、表２０に列挙される配列を有するフラグメントである。表２０に列挙された５’イントロンフラグメントを含有する構築物は、表２１における対応する３’イントロンフラグメントを含有するだろう（例えば、両方ともＡｚｏｐ１イントロンを伴うフラグメントを表す）。

（表２１）非アナベナ順列置換部位３’イントロンフラグメント配列

いくつかの実施形態では、３’イントロンフラグメントは、表２１に列挙される配列を有するフラグメントである。表２１に列挙された３’イントロンフラグメントを含有する構築物は、表２０に列挙されるような対応する５’イントロンフラグメントを含有するだろう（例えば、両方ともＡｚｏｐ１イントロンを伴うフラグメントを表す）。

（表２２）スペーサー及びアナベナ５’イントロンフラグメント配列

いくつかの実施形態では、スペーサー及び５’イントロンフラグメントは、表２２に列挙される配列を有するスペーサー及びフラグメントである。

（表２３）スペーサー及びアナベナ３’イントロンフラグメント配列

いくつかの実施形態では、スペーサー及び３’イントロンフラグメントは、表２３に列挙される配列を有するスペーサー及びフラグメントである。

（表２４）ＣＡＲ配列

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、表２４に列挙されるヌクレオチド配列によってコードされる。

（表２５）ＣＡＲドメイン配列

いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるＣＡＲドメインは、表２５に列挙される配列を有する。

（表２６）ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１配列

いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる発現配列を分離する切断部位は、表２６に列挙される配列を有する。

（表２７）サイトカイン配列

いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるサイトカインは、表２７に列挙される配列を有する。

（表２８）転写因子配列

いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる転写因子は、表２８に列挙される配列を有する。

（表２９）追加のアクセサリ配列

いくつかの実施形態では、本明細書に開示する環状ＲＮＡまたは前駆体ＲＮＡ（例えば、直鎖状前駆体ＲＮＡ）は、表２９に列挙される配列を含む。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、本明細書に開示する１つ以上の配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の類似性を有する配列を含有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、本明細書に開示する１つ以上の配列と同一の配列を含有する。

好ましい実施形態を本明細書に記載する。これらの好ましい実施形態の変形は、前述の説明を読めば、当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がかかる変形を適切に用いることを予期しており、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されるのとは別様に実践されることを意図している。したがって、本発明は、準拠法によって容認されているように、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載される主題の全ての改変及び等価物を含む。さらに、その全ての可能な変形における上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書に別様に示されない限りまたは別様に文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。

Ｗｅｓｓｅｌｈｏｅｆｔ ｅｔ ａｌ．（２０１９）ＲＮＡ Ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｓ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｃａｎ Ｅｘｔｅｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ．７４（３），５０８－５２０及びＷｅｓｓｅｌｈｏｅｆｔ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｒ ＲＮＡ ｆｏｒ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｔａｂｌｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．９，２６２９は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、以下の実施例を参照することによってさらに詳細に説明されるが、以下の実施例に限定されることを意図するものではない。これらの実施例は、主題の発明の作製方法及び使用方法を当業者に完全な開示及び説明を提供することを目的として例示のありとあらゆる変形を包含し、本発明とみなすものの範囲を限定することを意図しない。

実施例１
実施例１Ａ：外部相同領域は、順列置換イントロンエクソン（ＰＩＥ）環状化戦略を使用して長い前駆体ＲＮＡの環状化を可能にする。
全長脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳを含有する１，１００ｎｔ配列、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）発現配列、及び順列置換イントロン－エクソン（ＰＩＥ）構築物の２つの短いエクソンフラグメントを、Ｔ４ファージのチミジル酸シンターゼ（Ｔｄ）遺伝子の順列置換グループＩ触媒イントロンの３’と５’イントロンとの間に挿入した。前駆体ＲＮＡは、ランオフ転写によって合成した。環状化を、前駆体ＲＮＡを、マグネシウムイオン及びＧＴＰの存在下で加熱することにより試みたが、スプライシング産物は得られなかった。

完全に相補的な９ヌクレオチド及び１９ヌクレオチド長の相同領域を設計し、前駆体ＲＮＡの５’及び３’末端に追加した。これらの相同アームの追加により、前駆体ＲＮＡバンドの消失によって評価されるように、スプライシング効率が、９ヌクレオチド相同領域で０から１６％に、１９ヌクレオチド相同領域で４８％に増加した。

スプライシング産物をＲＮａｓｅ Ｒで処理した。ＲＮａｓｅ Ｒで処理したスプライシング反応物の推定スプライスジャンクションにわたって配列決定すると、ライゲーションされたエクソンが明らかになり、ＲＮａｓｅ Ｒで処理したスプライシング反応物を、オリゴヌクレオチドを標的としたＲＮａｓｅ Ｈで消化すると、ＲＮａｓｅ Ｈで消化された直鎖状前駆体によって得られた２つのバンドとは対照的に、単一のバンドが生じた。これは、環状ＲＮＡが、９または１９ヌクレオチド長の外部相同領域を含有する前駆体ＲＮＡのスプライシング反応物の主要な産物であることを示す。

実施例１Ｂ：ＩＲＥＳ及びＰＩＥスプライス部位の二次構造を保存するスペーサーは、環状化の効率を増加する。
一連のスペーサーを設計し、３’ＰＩＥスプライス部位とＩＲＥＳとの間に挿入した。これらのスペーサーは、ＩＲＥＳ、３’ＰＩＥスプライス部位、及び／または５スプライス部位のイントロン配列内の二次構造を保存するまたは破壊するように設計した二次構造を保存するように設計された。スペーサー配列の追加は、８７％スプライシング効率をもたらしたが、破壊的なスペーサー配列の追加は、検出可能なスプライシングをもたらさなかった。

実施例２
実施例２Ａ：外部相同領域に加えて内部相同領域は、スプライシングバブルを作製し、いくつかの発現配列の翻訳を可能にする。
スペーサーは、非構造化、イントロン及びＩＲＥＳ配列に非相同であり、スペーサー－スペーサー相同領域を含有するように設計した。これらを、外部相同領域、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、及びガウシアルシフェラーゼ（全長：１２８９ｎｔ）、ホタルルシフェラーゼ（２３８４ｎｔ）、ｅＧＦＰ（１４５１ｎｔ）、ヒトエリスロポエチン（１３１３ｎｔ）、及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（４９３４ｎｔ）の発現配列を含有する構築物の５’エクソンとＩＲＥＳとの間ならびに３’エクソン及び発現配列間に挿入した。５つの構築物全ての環状化を達成した。Ｔ４ファージ及びアナベナイントロンを利用した構築物の環状化は、ほぼ同等であった。環状化効率は、配列が短いほど高かった。翻訳を測定するために、各構築物を、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。ガウシア及びホタルルシフェラーゼをトランスフェクトした細胞は、発光によって測定されるように強い応答を示し、ヒトエリスロポエチンは、エリスロポエチンｃｉｒｃＲＮＡでトランスフェクトした細胞の培地で検出可能であり、ＥＧＦＰ蛍光は、ＥＧＦＰ ｃｉｒｃＲＮＡでトランスフェクトした細胞から観察された。Ｃａｓ９ ｃｉｒｃＲＮＡとＧＦＰに対するｓｇＲＮＡの、ＧＦＰを構成的に発現する細胞への同時トランスフェクションにより、ｓｇＲＮＡのみの対照と比較して、細胞の最大９７％で蛍光が消失した。

実施例２Ｂ：ＣＶＢ３ ＩＲＥＳの使用は、タンパク質産生を増加させる。
内部及び外部相同領域、ならびにガウシアルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼ発現配列のいずれかを含有する異なるＩＲＥＳを有する構築物を作製した。タンパク質産生は、トランスフェクションから２４時間後のＨＥＫ２９３細胞の上清における発光によって測定した。コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）ＩＲＥＳ構築物は、両方の場合において最も多くのタンパク質を産生した。

実施例２Ｃ：ポリＡまたはポリＡＣスペーサーの使用は、タンパク質産生を増加させる。
３０ヌクレオチド長のポリＡまたはポリＡＣスペーサーを、実施例２Ｂでタンパク質を産生した各ＩＲＥＳを伴う構築物のＩＲＥＳとスプライスジャンクションとの間に追加した。ガウシアルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションから２４時間後のＨＥＫ２９３細胞の上清における発光によって測定した。両方のスペーサーは、スペーサーを伴わない対照構築物よりも、全ての構築物で発現を改善した。

実施例３
環状ＲＮＡでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３またはＨｅＬａ細胞は、同等の未修飾または修飾直鎖状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞よりも多くのタンパク質を産生する。
ＨＰＬＣで精製したガウシアルシフェラーゼをコードするｃｉｒｃＲＮＡ（ＣＶＢ３－ＧＬｕｃ－ｐＡＣ）を、標準的な未修飾５’メチルグアノシンキャップ及び３’ポリＡテール直鎖状ＧＬｕｃ ｍＲＮＡ、ならびに市販のヌクレオシド修飾（シュードウリジン、５－メチルシトシン）直鎖状ＧＬｕｃ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ製）と比較した。トランスフェクション２４時間後に発光を測定し、ｃｉｒｃＲＮＡが、ＨＥＫ２９３細胞において未修飾直鎖状ｍＲＮＡより８１１．２％多いタンパク質を産生し、修飾ｍＲＮＡより５４．５％多いタンパク質を産生したことが明らかになった。同様の結果が、ＨｅＬａ細胞、及びヒトエリスロポエチンをコードする最適化されたｃｉｒｃＲＮＡと５－メトキシウリジンで修飾された直鎖状ｍＲＮＡとの比較において得られた。

発光データは、６日間にわたって収集した。ＨＥＫ２９３細胞では、ｃｉｒｃＲＮＡトランスフェクションは８０時間のタンパク質産生半減期をもたらし、それに対し、未修飾直鎖状ｍＲＮＡは４３時間、及び修飾直鎖状ｍＲＮＡは４５時間であった。ＨｅＬａ細胞では、ｃｉｒｃＲＮＡトランスフェクションは１１６時間のタンパク質産生半減期をもたらし、それに対し、未修飾直鎖状ｍＲＮＡは４４時間、及び修飾直鎖状ｍＲＮＡは４９時間であった。ＣｉｒｃＲＮＡは、両方の細胞型においてその寿命にわたって、未修飾及び修飾直鎖状ｍＲＮＡの両方よりも実質的に多くのタンパク質を産生した。

実施例４
実施例４Ａ：ＲＮａｓｅ消化、ＨＰＬＣ精製、及びホスファターゼ処理によるｃｉｒｃＲＮＡの精製は、免疫原性を低減する。完全に精製された環状ＲＮＡは、未精製または部分的に精製された環状ＲＮＡよりも免疫原性が有意に低い。タンパク質発現安定性及び細胞生存率は、細胞型及び環状ＲＮＡ純度に依存する。
ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）及びヒト肺癌Ａ５４９細胞を以下でトランスフェクトした：
・未精製ＧＬｕｃ環状ＲＮＡスプライシング反応物の産物、
・スプライシング反応物のＲＮａｓｅ Ｒ消化の産物、
・スプライシング反応物のＲＮａｓｅ Ｒ消化及びＨＰＬＣ精製の産物、または
・スプライシング反応物のＲＮａｓｅ消化、ＨＰＬＣ精製、及びホスファターゼ処理の産物。

スプライシング反応物のＲＮａｓｅ Ｒ消化は、トランスフェクトされていない対照と比較して、Ａ５４９細胞においてサイトカイン放出を防ぐには不十分であった。

ＨＰＬＣ精製の追加は、またサイトカイン放出を防ぐには不十分であったが、未精製スプライシング反応物と比較して、インターロイキン－６（ＩＬ－６）が有意に低下し、インターフェロン－α１（ＩＦＮ－α１）が有意に増加した。

ＨＰＬＣ精製後及びＲＮａｓｅ Ｒ消化前にホスファターゼ処理を追加すると、Ａ５４９細胞において評価された全ての上方制御されたサイトカインの発現が劇的に低下した。分泌された単球化学誘引物質タンパク質１（ＭＣＰ１）、ＩＬ－６、ＩＦＮ－α１、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、及びＩＦＮγ誘導性タンパク質－１０（ＩＰ－１０）は、検出不可能またはトランスフェクトされていないベースラインレベルまで低下した。

ＨＥＫ２９３細胞では実質的なサイトカイン放出はなかった。Ａ５４９細胞は、より高純度の環状ＲＮＡでトランスフェクトすると、ＧＬｕｃ発現安定性及び細胞生存率が増加した。完全に精製された環状ＲＮＡは、トランスフェクトされた２９３細胞と同様の安定性表現型を有した。

実施例４Ｂ：環状ＲＮＡは、有意な免疫原性を引き起こさず、ＲＩＧ－Ｉリガンドではない。
Ａ５４９細胞を、スプライシング反応物の産物でトランスフェクトした。

Ａ５４９細胞を以下でトランスフェクトした：
・未精製環状ＲＮＡ、
・高分子量（直鎖状及び環状連結）ＲＮＡ、
・環状（ニックの入った）ＲＮＡ、
・精製環状ＲＮＡの初期画分（ニックの入ったＲＮＡピークとの重複が多い）、
・精製環状ＲＮＡの後期画分（ニックの入ったＲＮＡピークとの重複が少ない）、
・環状化中に切除されたイントロン、または
・ビヒクル（すなわち、トランスフェクトされていない対照）。

前駆体ＲＮＡは、スプライシング反応物から好適に純粋な直鎖状前駆体ＲＮＡを取得することが困難なため、スプライス部位欠失変異体（ＤＳ）の形態で別個で合成及び精製した。サイトカイン放出及び細胞生存率を、各場合において測定した。

スプライシング反応物内に存在する大半の種、ならびに前駆体ＲＮＡに応答して、強力なＩＬ－６、ＲＡＮＴＥＳ、及びＩＰ－１０の放出が観察された。初期ｃｉｒｃＲＮＡ画分は、他の非ｃｉｒｃＲＮＡ画分に匹敵するサイトカイン応答を誘発した。これは、比較的少量の直鎖状ＲＮＡ夾雑物でさえ、Ａ５４９細胞において実質的な細胞性免疫応答を誘発できることを示す。後期ｃｉｒｃＲＮＡ画分は、トランスフェクトされていない対照からのサイトカイン応答を超えるサイトカイン応答を誘発しなかった。トランスフェクション３６時間後のＡ５４９細胞生存率は、他の全ての画分と比較して、後期ｃｉｒｃＲＮＡ画分で有意に大きかった。

後期ｃｉｒｃＲＮＡ ＨＰＬＣ画分、前駆体ＲＮＡまたは未精製スプライシング反応物を用いたＡ５４９細胞のトランスフェクション時のＲＩＧ－Ｉ及びＩＦＮ－β１転写産物誘導を分析した。ＲＩＧ－Ｉ及びＩＦＮ－β１両方の転写産物の誘導は、前駆体ＲＮＡ及び未精製スプライシング反応物よりも後期ｃｉｒｃＲＮＡ画分で弱かった。スプライシング反応物のＲＮａｓｅ Ｒ処理だけでは、この効果を取り除くのに十分ではなかった。非常に少量のＲＩＧ－Ｉリガンド３ｐ－ｈｐＲＮＡを環状ＲＮＡに加えると、実質的なＲＩＧ－Ｉ転写が誘導された。ＨｅＬａ細胞では、ＲＮａｓｅ Ｒで消化したスプライシング反応物のトランスフェクションは、ＲＩＧ－Ｉ及びＩＦＮ－β１を誘導したが、精製ｃｉｒｃＲＮＡでは誘導されなかった。全体として、ＨｅＬａ細胞は、Ａ５４９細胞よりも夾雑ＲＮＡ種に対する感受性が低かった。

スプライシング反応物または完全に精製されたｃｉｒｃＲＮＡを用いたＡ５４９細胞のトランスフェクションから最初の８時間以内のＲＩＧ－Ｉ、ＩＦＮ－β１、ＩＬ－６、及びＲＡＮＴＥＳ転写産物誘導をモニタリングする経時的実験では、ｃｉｒｃＲＮＡに対する一過性の応答は明らかにならなかった。精製されたｃｉｒｃＲＮＡも同様に、ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージにおいて炎症促進性転写物を誘導できなかった。

Ａ５４９細胞を、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ及びＥＧＦＰ発現配列を含有する精製ｃｉｒｃＲＮＡでトランスフェクトした。これは、炎症促進性転写物の実質的な誘導を生じることはできなかった。これらのデータは、スプライシング反応物の非環状成分が、以前の研究で観察された免疫原性の原因であり、ｃｉｒｃＲＮＡがＲＩＧ－Ｉの天然リガンドではないことを実証する。

実施例５
環状ＲＮＡは、ＴＬＲによる検出を回避する。
ＴＬＲ３、７、及び８レポーター細胞株を、複数の直鎖状または環状ＲＮＡ構築物でトランスフェクトし、分泌された胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を測定した。

直鎖状化ＲＮＡは、イントロン及び相同アームの配列を欠失させることによって構築した。次に、直鎖状ＲＮＡ構築物を、ホスファターゼで処理し（キャップされたＲＮＡの場合、キャップした後）、ＨＰＬＣによって精製した。

試みたトランスフェクションのいずれも、ＴＬＲ７レポーター細胞において応答を生じなかった。ＴＬＲ３及びＴＬＲ８レポーター細胞は、キャップされた直鎖状化ＲＮＡ、ポリアデニル化直鎖状化ＲＮＡ、ニックの入ったｃｉｒｃＲＮＡ ＨＰＬＣ画分、及び初期ｃｉｒｃＲＮＡ画分によって活性化された。後期ｃｉｒｃＲＮＡ画分及びｍ１ψ－ｍＲＮＡは、どの細胞株でもＴＬＲ媒介応答を誘発しなかった。

２番目の実験では、ｃｉｒｃＲＮＡを、２つの方法：マグネシウムイオンの存在下での熱を用いたｃｉｒｃＲＮＡの処理、ならびにＤＮＡオリゴヌクレオチド誘導ＲＮａｓｅ Ｈ消化を使用して直鎖状化した。どちらの方法でも、大部分の完全長直鎖状ＲＮＡと、少量のインタクトなｃｉｒｃＲＮＡが得られた。ＴＬＲ３、７、及び８レポーター細胞を、環状ＲＮＡ、熱により分解された環状ＲＮＡ、またはＲＮａｓｅ Ｈにより分解された環状ＲＮＡでトランスフェクトし、ＳＥＡＰ分泌をトランスフェクションから３６時間後に測定した。ＴＬＲ８レポーター細胞は、分解された環状ＲＮＡの両方の形態に応答してＳＥＡＰを分泌したが、モックトランスフェクションよりも環状ＲＮＡトランスフェクションに対して大きな応答を生じなかった。インビトロで転写された直鎖状化ＲＮＡによるＴＬＲ３の活性化にもかかわらず、分解またはインタクト条件では、ＴＬＲ３及びＴＬＲ７レポーター細胞における活性化は観察されなかった。

実施例６
未修飾環状ＲＮＡは、直鎖状ＲＮＡよりも増加した持続的なインビボタンパク質発現を生じる。
未修飾及びｍ１ψ修飾ヒトエリスロポエチン（ｈＥｐｏ）直鎖状ｍＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡを用いて、マウスに注射し、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。ｍ１ψ－ｍＲＮＡ及び未修飾ｃｉｒｃＲＮＡの等モルトランスフェクションにより、ＨＥＫ２９３細胞で強力なタンパク質発現がもたらされた。ｈＥｐｏ直鎖状ｍＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡは、ＨＥＫ２９３及びＡ５４９細胞の等重量トランスフェクション時のＧＬｕｃ直鎖状ｍＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡと比較して、同様の相対的なタンパク質発現パターン及び細胞生存率を示した。

マウスでは、ｈＥｐｏ ｃｉｒｃＲＮＡまたは直鎖状ｍＲＮＡを内臓脂肪に注射した後、ｈＥｐｏが血清中に検出された。未修飾ｃｉｒｃＲＮＡの注射後に検出されたｈＥｐｏは、未修飾またはｍ１ψ－ｍＲＮＡからのものよりもゆっくりと減衰し、注射後４２時間でも依然として存在していた。血清ｈＥｐｏは、未精製ｃｉｒｃＲＮＡスプライシング反応物または未修飾直鎖状ｍＲＮＡの注射時には急速に下降した。未精製スプライシング反応物の注射は、血清中で検出可能なサイトカイン応答を生じ、これは精製ｃｉｒｃＲＮＡを含む他のＲＮＡでは観察されなかった。

実施例７
環状ＲＮＡは、脂質ナノ粒子を介してインビボまたはインビトロで効果的に送達されることができる。
精製環状ＲＮＡを、イオン化可能なリピドイドｃＫＫ－Ｅ１２を用いて脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）へと製剤化した（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｋａｕｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。粒子は、５ｍｏＵで修飾された市販の対照直鎖状ｍＲＮＡを含有する粒子と同様の平均サイズ、多分散度指数、及び封入効率を備えた均一なマルチラメラ構造を形成した。

精製ｈＥｐｏ ｃｉｒｃＲＮＡは、ＬＮＰに封入し、ＨＥＫ２９３細胞に加えた場合、５ｍｏＵ－ｍＲＮＡよりも高い発現を示した。ＨＥＫ２９３細胞におけるＬＮＰ－ＲＮＡからの発現安定性は、５ｍｏＵ－ｍＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡの両方に関する減衰のわずかな遅延を除いて、トランスフェクション試薬によって送達されたＲＮＡの発現安定性と同様であった。未修飾ｃｉｒｃＲＮＡ及び５ｍｏＵ－ｍＲＮＡは両方とも、インビトロでＲＩＧ－Ｉ／ＩＦＮ－β１を活性化できなかった。

マウスでは、ＬＮＰ－ＲＮＡは、内臓脂肪組織への局所注射または肝臓への静脈内送達によって送達された。どちらの場合も、送達から６時間後、ｃｉｒｃＲＮＡからの血清ｈＥｐｏ発現は低かったが、５ｍｏＵ－ｍＲＮＡからの発現と同等であった。未修飾ＬＮＰ－ｃｉｒｃＲＮＡの脂肪注射後に検出された血清ｈＥｐｏは、ＬＮＰ－５ｍｏＵ－ｍＲＮＡからのものよりもゆっくりと減衰し、血清中に存在する発現減衰の遅延はインビトロで認められたものと同様であったが、ＬＮＰ－ｃｉｒｃＲＮＡまたはＬＮＰ－５ｍｏＵ－ｍＲＮＡの静脈内注射後の血清ｈＥｐｏは、およそ同じ速度で減衰した。これらの場合のいずれにおいても、血清サイトカインまたは局所ＲＩＧ－Ｉ、ＴＮＦα、もしくはＩＬ－６転写産物誘導において増加はなかった。

実施例８
実施例８Ａ：ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、及び１Ｃ１Ｃ７細胞におけるＩＲＥＳによる発現と機能安定性。
アナベナイントロン／エクソン領域、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、及び様々なＩＲＥＳを含む構築物を環状化した。１００ｎｇの各環状化反応物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを使用して、２０，０００個のＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、及び１Ｃ１Ｃ７細胞に別個にトランスフェクトした。各上清における発光は、タンパク質発現の尺度として２４時間後に評価した。ＨＥＫ２９３細胞では、クロヒウイルスＢ、サリウイルスＦＨＢ、アイチウイルス、サリウイルスＨＧ－Ｊ１、及びエンテロウイルスＪ ＩＲＥＳを含む構築物が、２４時間で最も多くの発光を生じた（図１Ａ）。ＨｅｐＧ２細胞では、アイチウイルス、サリウイルスＦＨＢ、ＥＭＣＶ－Ｃｆ、ＣＶＡ３ ＩＲＥＳを含む構築物が、２４時間で高い発光を生じた（図１Ｂ）。１Ｃ１Ｃ７細胞では、サリウイルスＦＨＢ、アイチウイルス、サリウイルスＮＧ－Ｊ１、及びサリウイルスＡ ＳＺ－１ ＩＲＥＳを含む構築物が、２４時間で高い発光を生じた（図１Ｃ）。

より大きなＩＲＥＳが、２４時間でより大きな発光を生じる傾向が観察された。総配列長が短いと環状化効率が増加する傾向があるため、高い発現及び比較的短いＩＲＥＳの選択は、構築物の改善をもたらし得る。ＨＥＫ２９３細胞では、クロヒウイルスＢ ＩＲＥＳを使用した構築物が、特に同様の長さの他のＩＲＥＳと比較して、最も高い発光を生じた（図２Ａ）。ＩＲＥＳサイズに対してプロットされたＨｅｐＧ２及び１Ｃ１Ｃ７細胞におけるＩＲＥＳ構築物からの発現を、図２Ｂ及び２Ｃに示す。

ＨｅｐＧ２及び１Ｃ１Ｃ７細胞における選択されたＩＲＥＳ構築物の機能安定性を、３日間にわたって測定した。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を、２０，０００個の細胞を１００ｎｇの各環状化反応物でトランスフェクトした後２４時間毎に測定し、その後完全に培地を交換した。サリウイルスＡ ＧＵＴ及びサリウイルスＦＨＢは、ＨｅｐＧ２細胞で最も高い機能安定性を呈し、サリウイルスＮ－Ｊ１及びサリウイルスＦＨＢは、１Ｃ１Ｃ７細胞で最も安定した発現を生じた（図３Ａ及び３Ｂ）。

実施例８Ｂ：追加のＩＲＥＳのスクリーニング
ＨＥＫ２９３細胞における追加のＩＲＥＳ構築物の機能安定性を測定した。簡潔には、目的の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）をＧｅｎＢａｎｋから特定した。選択されたＵＴＲを５’末端から６７５ｎｔに切断し、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）をコードする環状ＲＮＡ骨格構築物内にＧｌｕｃコーディング領域の前に挿入した。環状ＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。２４時間後、上清を収集し、分泌されたＧｌｕｃタンパク質からの発光を市販の試薬を使用して測定した。結果が図１Ｄ及び１Ｅならびに表３０に示されており、多くの天然ＩＲＥＳ配列が、環状ＲＮＡの状況でタンパク質発現を向上させることを示唆している。

（表３０）

実施例９
Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＩＲＥＳによる発現及び機能安定性。
アナベナイントロン／エクソン領域、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、及び以前に試験したＩＲＥＳのサブセットを含む２セットの構築物を環状化した。６０，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞を、１μｇの各環状化反応物でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションから２４時間後に、上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を測定した。セット間の比較及び以前に定義されたＩＲＥＳの有効性との比較のために、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ構築物を両方のセットに含んだ。ＣＶＢ１及びサリウイルスＡ ＳＺ１ ＩＲＥＳ構築物は、２４時間で最も多くの発現を生じた。データは、図４Ａ及び４Ｂに見出すことができる。

各ラウンドのエレクトロポレーションしたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＩＲＥＳ構築物の機能安定性を、３日間にわたって測定した。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を、６０，０００個の細胞を１μｇの各環状化反応物でエレクトロポレーションした後２４時間毎に測定し、その後完全に培地を交換した（図５Ａ及び５Ｂ）。

サリウイルスＡ ＳＺ１及びサリウイルスＡ ＢＮ２ ＩＲＥＳ構築物は、他の構築物と比較して高い機能安定性を有した。

実施例１０
Ｊｕｒｋａｔ細胞における環状及び直鎖状ＲＮＡの発現、機能安定性、及びサイトカイン放出。
アナベナイントロン／エクソン領域、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、及びサリウイルスＦＨＢ ＩＲＥＳを含む、構築物を環状化した。ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び約１５０ｎｔポリＡテールを含むｍＲＮＡ、ならびに１００％のウリジンを５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）に置き換えるように修飾されたものは市販されており、Ｔｒｉｌｉｎｋから購入した。５ｍｏＵヌクレオチド修飾は、ｍＲＮＡの安定性及び発現を改善することが示されている（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２０１６ Ｍａｒ １６；２７（３）：８４９－５３）。Ｊｕｒｋａｔ細胞における修飾ｍＲＮＡの発現、環状化反応物（未純化）、及びサイズ排除ＨＰＬＣによって精製されたｃｉｒｃＲＮＡ（純粋）を測定し、比較した（図６Ａ）。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を、６０，０００個の細胞を１μｇの各ＲＮＡ種でエレクトロポレーションしてから２４時間後に測定した。

上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光は、６０，０００個の細胞を１ｕｇの各ＲＮＡ種でエレクトロポレーションした後２４時間毎に測定し、その後完全に培地を交換した。３日間にわたるＪｕｒｋａｔ細胞における修飾ｍＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡの機能安定性データの比較を、図６Ｂに示す。

ＩＦＮγ（図７Ａ）、ＩＬ－６（図７Ｂ）、ＩＬ－２（図７Ｃ）、ＲＩＧ－Ｉ（図７Ｄ）、ＩＦＮ－β１（図７Ｅ）、及びＴＮＦα（図７Ｆ）転写産物誘導を、６０，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞を１μｇの上記の各ＲＮＡ種及び３ｐ－ｈｐＲＮＡ（ＲＩＧ－Ｉアゴニストとして知られる５’三リン酸ヘアピンＲＮＡ）でエレクトロポレーションしてから１８時間後に測定した。

実施例１１
単球及びマクロファージにおける環状及び直鎖状ＲＮＡの発現。
アナベナイントロン／エクソン領域、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、及びサリウイルスＦＨＢ ＩＲＥＳを含む構築物を環状化した。ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び約１５０ｎｔポリＡテールを含むｍＲＮＡ、ならびに１００％のウリジンを５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）に置き換えるように修飾されたものは、Ｔｒｉｌｉｎｋから購入した。環状及び修飾ｍＲＮＡの発現を、ヒト初代単球（図８Ａ）及びヒト初代マクロファージ（図８Ｂ）において測定した。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を、６０，０００個の細胞を１μｇの各ＲＮＡ種でエレクトロポレーションしてから２４時間後に測定した。発光は、ヒト初代マクロファージをエレクトロポレーションしてから４日後にも測定し、培地は２４時間毎に交換した（図８Ｃ）。結果は、図８に見出すことができる。発光における差異は、いずれの場合も統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。

実施例１２
初代Ｔ細胞におけるＩＲＥＳによる発現及び機能安定性。
アナベナイントロン／エクソン領域、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、及び以前に試験したＩＲＥＳのサブセットを含む構築物を環状化し、反応産物をサイズ排除ＨＰＬＣによって精製した。１５０，０００個の初代ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を、１μｇの各ｃｉｒｃＲＮＡでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションから２４時間後に、上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を測定した（図９Ａ）。アイチウイルス及びＣＶＢ３ ＩＲＥＳ構築物は、２４時間で最も多く発現した。

発光はまた、各構築物の機能安定性を比較するために、エレクトロポレーション後２４時間毎に３日間にわたって測定した（図９Ｂ）。サリウイルスＡ ＳＺ１ ＩＲＥＳを伴う構築物が最も安定していた。

実施例１３
初代Ｔ細胞及びＰＢＭＣにおける環状及び直鎖状ＲＮＡの発現及び機能安定性。
アナベナイントロン／エクソン領域、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、及びサリウイルスＡ ＳＺ１ ＩＲＥＳまたはサリウイルスＦＨＢ ＩＲＥＳを含む構築物を環状化した。ガウシアルシフェラーゼ発現配列及び約１５０ｎｔポリＡテールを含むｍＲＮＡ、ならびに１００％のウリジンを５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）に置き換えるように修飾されたものは、Ｔｒｉｌｉｎｋから購入した。サリウイルスＡ ＳＺ１ ＩＲＥＳ ＨＰＬＣ精製環状及び修飾ｍＲＮＡの発現を、ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞において測定した。サリウイルスＦＨＢ ＨＰＬＣ精製環状、未精製環状及び修飾ｍＲＮＡの発現を、ヒトＰＢＭＣにおいて測定した。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を、１５０，０００個の細胞を１μｇの各ＲＮＡ種でエレクトロポレーションしてから２４時間後に測定した。初代ヒトＴ細胞に関するデータを図１０Ａ及び１０Ｂに示し、ＰＢＭＣに関するデータを図１０Ｃに示す。精製環状ＲＮＡ及び未精製環状ＲＮＡまたは直鎖状ＲＮＡ間の発現における差異は、いずれの場合も有意であった（ｐ＜０．０５）。

初代Ｔ細胞上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を、構築物の機能安定性を比較するために、エレクトロポレーション後２４時間毎に３日間にわたって測定した。データを、図１０Ｂに示す。精製環状ＲＮＡと直鎖状ＲＮＡとの間の１日目の測定からの相対発光における差異は、初代Ｔ細胞に関して２日目及び３日目の両方で有意であった。

実施例１４
アナベナイントロンにおける順列置換部位による環状化効率。
ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、アナベナイントロン／エクソン領域、スペーサー、内部相同領域、及び相同アームを含むＲＮＡ構築物を産生した。従来のアナベナイントロン順列置換部位及びＰ９における５つの連続した順列置換部位を使用した構築物の環状化効率を、ＨＰＬＣによって測定した。Ｐ９における５つの連続した順列置換部位に関するＨＰＬＣクロマトグラムを、図１１Ａに示す。

環状化効率は、様々な順列置換部位で測定した。環状化効率は、ｃｉｒｃＲＮＡ／（ｃｉｒｃＲＮＡ＋前駆体ＲＮＡ）のそれぞれに関するＨＰＬＣクロマトグラム曲線下面積として定義する。各順列置換部位での環状化効率のランク付けされた定量化を、図１１Ｂに示す。３つの順列置換部位（図１１Ｂに示している）を、さらなる調査のために選択した。

この実施例における環状ＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって環状化し、次にスピンカラムを介して精製した。環状化効率は、全ての構築物に関して、Ｍｇ２＋及びグアノシンヌクレオチドとのインキュベーションの追加ステップを含めると、高くなる可能性があり得る；ただし、このステップの除去は、環状ＲＮＡ構築物間の比較、及び環状ＲＮＡ構築物の最適化を可能にした。このレベルの最適化は、キメラ抗原受容体をコードするものなどの大きなＲＮＡ構築物で高い環状化効率を維持するのに特に有用である。

実施例１５
代替イントロンの環状化効率。
様々な種起源の順列置換グループ１イントロンまたは順列置換部位及び、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、スペーサー、内部相同領域、及び相同アームを含むいくつかの定常エレメントを含有する前駆体ＲＮＡを作製した。環状化データは、図１２に見出すことができる。図１２Ａは、前駆体、ＣｉｒｃＲＮＡ及びイントロンを分解するクロマトグラムを示す。図１２Ｂは、イントロン構築物の関数として、図１２Ａに示されるクロマトグラムに基づいて、環状化効率のランク付けされた定量化を提供する。

この実施例における環状ＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって環状化し、次にスピンカラム精製を行った。環状化効率は、全ての構築物に関して、Ｍｇ２＋及びグアノシンヌクレオチドとのインキュベーションの追加ステップを含めると、高くなる可能性があり得る；ただし、このステップの除去は、環状ＲＮＡ構築物間の比較、及び環状ＲＮＡ構築物の最適化を可能にする。このレベルの最適化は、キメラ抗原受容体をコードするものなどの大きなＲＮＡ構築物で高い環状化効率を維持するのに特に有用である。

実施例１６
相同アームの存在または長さによる環状化効率。
ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、アナベナイントロン／エクソン領域、スペーサー、及び内部相同領域を含むＲＮＡ構築物を産生した。３つのアナベナイントロン順列置換部位を表す構築物を、３０ｎｔ、２５％ＧＣ相同アームを用いて、または相同アームを用いずに（「ＮＡ」）試験した。これらの構築物は、Ｍｇ^２＋インキュベーションステップを伴わずに環状化することが可能であった。環状化効率を測定し、比較した。データは、１３Ａ及び１３Ｂに見出すことができる。環状化効率は、相同アームを欠く各構築物でより高かった。図１３Ａは、環状化効率のランク付けされた定量化を提供する；図１３Ｂは、前駆体、ｃｉｒｃＲＮＡ及びイントロンを分解するクロマトグラムを提供する。

３つの順列置換部位のそれぞれについて、構築物を、１０ｎｔ、２０ｎｔ、及び３０ｎｔのアーム長ならびに２５％、５０％、及び７５％ＧＣ含量で作製した。これらの構築物のスプライシング効率を測定し、相同アームを伴わない構築物と比較した（図１４）。スプライシング効率は、スプライシング反応物における総ＲＮＡに対する遊離イントロンの割合として定義する。

図１５Ａ（左）は、スプライシング効率の改善に対する強い相同アームの寄与を示すＨＰＬＣクロマトグラムを示す。左上：７５％ＧＣ含量、１０ｎｔ相同アーム。中央左：７５％ＧＣ含量、２０ｎｔ相同アーム。左下：７５％ＧＣ含量、３０ｎｔ相同アーム。

図１５Ａ（右）は、ニッキングの増加と対になったスプライシング効率の増加を示すＨＰＬＣクロマトグラムを示し、ｃｉｒｃＲＮＡピークのショルダーとして現れている。右上：７５％ＧＣ含量、１０ｎｔ相同アーム。中央右：７５％ＧＣ含量、２０ｎｔ相同アーム。右下：７５％ＧＣ含量、３０ｎｔ相同アーム。

図１５Ｂ（左）は、改善された環状化効率を実証すると仮定された順列置換部位及び相同アームの選択された組み合わせを示す。

図１５Ｂ（右）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼで処理された、改善された環状化効率を実証すると仮定された順列置換部位及び相同アームの選択された組み合わせを示す。

この実施例における環状ＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって環状化し、次にスピンカラム精製を行った。環状化効率は、全ての構築物に関して、グアノシンヌクレオチドとの追加のＭｇ２＋インキュベーションステップを含めると、高くなる可能性があり得る；ただし、このステップの除去は、環状ＲＮＡ構築物間の比較、及び環状ＲＮＡ構築物の最適化を可能にした。このレベルの最適化は、キメラ抗原受容体をコードするものなどの大きなＲＮＡ構築物で高い環状化効率を維持するのに特に有用である。

実施例１７
キメラ抗原受容体をコードする環状ＲＮＡ
アナベナイントロン／エクソン領域、キムリアキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現配列、及びＣＶＢ３ ＩＲＥＳを含む構築物を環状化した。１００，０００個のヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、５００ｎｇのｃｉｒｃＲＮＡでエレクトロポレーションし、ＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼを安定して発現するＲａｊｉ細胞と２４時間共培養した。エフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ比）０．７５：１。１００，０００個のヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、モックエレクトロポレーションし、対照として共培養した（図１６）。

１００，０００個のヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞のセットを、モックエレクトロポレーションした、または１μｇのｃｉｒｃＲＮＡでエレクトロポレーションし、次にＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼを安定して発現するＲａｊｉ細胞と４８時間共培養した、Ｅ：Ｔ比１０：１（図１７）。

Ｒａｊｉ標的細胞の特異的溶解の定量化は、ホタル発光の検出によって決定した（図１８）。モックエレクトロポレーションした、または異なるＣＡＲ配列をコードするｃｉｒｃＲＮＡでエレクトロポレーションした１００，０００個のヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼを安定して発現するＲａｊｉ細胞と４８時間共培養した。特異的溶解％を１－［ＣＡＲ条件発光］／［モック条件発光］として定義した。Ｅ：Ｔ比１０：１。

実施例１８
Ｊｕｒｋａｔ細胞及び休止ヒトＴ細胞における環状及び直鎖状ＲＮＡの発現及び機能安定性。
アナベナイントロン／エクソン領域、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、及び以前に試験したＩＲＥＳのサブセットを含む構築物を環状化し、反応産物をサイズ排除ＨＰＬＣによって精製した。１５０，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞を、１μｇの環状ＲＮＡまたは５ｍｏＵ－ｍＲＮＡでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションから２４時間後に、上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を測定した（図１９Ａ左）。１５０，０００個の休止初代ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞（刺激後１０日）を、１μｇの環状ＲＮＡまたは５ｍｏＵ－ｍＲＮＡでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションから２４時間後に、上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を測定した（図１９Ａ右）。

上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光は、エレクトロポレーション後２４時間毎に測定し、その後完全に培地を交換した。機能安定性データを、図１９Ｂに示す。環状ＲＮＡは、いずれの場合も直鎖状ＲＮＡよりも機能安定性が高く、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてより顕著な差異があった。

実施例１９
直鎖状ＲＮＡまたは様々な環状ＲＮＡ構築物でエレクトロポレーションした細胞のＩＦＮ－β１、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮγ、及びＴＮＦα転写産物誘導。
アナベナイントロン／エクソン領域、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、及び以前に試験したＩＲＥＳのサブセットを含む構築物を環状化し、反応産物をサイズ排除ＨＰＬＣによって精製した。１５０，０００個のＣＤ３＋ヒトＴ細胞を、１μｇの環状ＲＮＡ、５ｍｏＵ－ｍＲＮＡ、または免疫刺激陽性対照ポリイノシン：シトシンでエレクトロポレーションした。ＩＦＮ－β１（図２０Ａ）、ＲＩＧ－Ｉ（図２０Ｂ）、ＩＬ－２（図２０Ｃ）、ＩＬ－６（図２０Ｄ）、ＩＦＮγ（図２０Ｅ）、及びＴＮＦα（図２０Ｆ）転写産物誘導を、エレクトロポレーションから１８時間後に測定した。

実施例２０
異なる量の環状または直鎖状ＲＮＡでエレクトロポレーションしたＣＡＲ発現細胞による標的細胞の特異的溶解及びＩＦＮγ転写産物誘導；異なるＥ：Ｔ比でのＣＡＲ発現細胞による標的及び非標的細胞の特異的溶解。
アナベナイントロン／エクソン領域、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現配列、及びＣＶＢ３ ＩＲＥＳを含む構築物を環状化し、反応産物をサイズ排除ＨＰＬＣによって精製した。モックエレクトロポレーションした、または抗ＣＤ１９ ＣＡＲ配列をコードする異なる量のｃｉｒｃＲＮＡでエレクトロポレーションした１５０，０００個のヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、２：１のＥ：Ｔ比にて、ＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼを安定して発現するＲａｊｉ細胞と１２時間共培養した。Ｒａｊｉ標的細胞の特異的溶解率は、ホタル発光の検出によって決定した（図２１Ａ）。特異的溶解％を、１－［ＣＡＲ条件発光］／［モック条件発光］として定義した。ＩＦＮγ転写産物誘導は、エレクトロポレーションから２４時間後に測定した（図２１Ｂ）。

１５０，０００個のヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、モックエレクトロポレーションした、または抗ＣＤ１９ ＣＡＲ配列をコードする５００ｎｇのｃｉｒｃＲＮＡもしくはｍ１ψ－ｍＲＮＡでエレクトロポレーションし、次に異なるＥ：Ｔ比にて、ホタルルシフェラーゼを安定して発現するＲａｊｉ細胞と２４時間共培養した。Ｒａｊｉ標的細胞の特異的溶解％をホタル発光の検出によって決定した（図２２Ａ）。特異的溶解％を、１－［ＣＡＲ条件発光］／［モック条件発光］として定義した。

ＣＡＲを発現するＴ細胞をさらに、異なるＥ：Ｔ比にて、ホタルルシフェラーゼを安定して発現するＲａｊｉまたはＫ５６２細胞と２４時間共培養した。Ｒａｊｉ標的細胞またはＫ５６２非標的細胞の特異的溶解は、ホタル発光の検出によって決定した（図２２Ｂ）。特異的溶解％を、１－［ＣＡＲ条件発光］／［モック条件発光］として定義した。

実施例２１
ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡまたは直鎖状ＲＮＡでエレクトロポレーションしたＴ細胞による標的細胞の特異的溶解。
アナベナイントロン／エクソン領域、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現配列、及びＣＶＢ３ ＩＲＥＳを含む構築物を環状化し、反応産物をサイズ排除ＨＰＬＣによって精製した。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、５００ｎｇの環状ＲＮＡまたは等モル量のｍ１ψ－ｍＲＮＡでエレクトロポレーションし、それぞれがＣＤ１９を標的としたＣＡＲをコードした。Ｒａｊｉ細胞をＣＡＲ－Ｔ細胞培養物に７日間にわたって１０：１のＥ：Ｔ比にて加えた。特異的溶解％を、両方の構築物について、１、３、５、及び７日目に測定した（図２３）。

実施例２２
抗ＣＤ１９ ＣＡＲまたは抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するＴ細胞によるＲａｊｉ細胞の特異的溶解。
アナベナイントロン／エクソン領域、抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現配列、及びＣＶＢ３ ＩＲＥＳを含む構築物を環状化し、反応産物をサイズ排除ＨＰＬＣによって精製した。１５０，０００個の初代ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を、５００ｎｇのｃｉｒｃＲＮＡでエレクトロポレーションし、次にＲａｊｉ細胞と２：１のＥ：Ｔ比にて共培養した。特異的溶解％をエレクトロポレーションの１２時間後に測定した（図２４）。

実施例２３
実施例２３Ａ：化合物の合成
本発明の代表的なイオン化可能脂質の合成は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６１０５８、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５８５５５、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５３５６９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２８９８１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５２４６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３５４１９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１５９１３、ならびに米国出願公開第２０１９０３１４５２４号、同第２０１９０３２１４８９号、及び同第２０１９０３１４２８４号に記載されており、それぞれの内容が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

実施例２３Ｂ：化合物の合成
本発明の代表的なイオン化可能脂質の合成は、米国特許公開第ＵＳ２０１７０２１０６９７Ａ１号に記載されており、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

実施例２４
器官によるタンパク質発現
ＦＬｕｃをコードする環状または直鎖状ＲＮＡを生成し、以下の配合：５０％の表１０ｂにおけるイオン化可能脂質１５、１０％のＤＳＰＣ、１．５％のＰＥＧ－ＤＭＧ、３８．５％のコレステロールともに輸送ビヒクルにロードした。ＣＤ－１マウスに０．２ｍｇ／ｋｇで投薬し、発光を６時間（生ＩＶＩＳ）及び２４時間（生ＩＶＩＳ及びエクスビボＩＶＩＳ）の時点で測定した。肝臓、脾臓、腎臓、肺、及び心臓の総フラックス（目的の領域にわたる光子／秒）を測定した（図２５及び２６）。

実施例２５
脾臓における発現の分布
ＧＦＰをコードする環状または直鎖状ＲＮＡを生成し、以下の配合：５０％の表１０ｂにおけるイオン化可能脂質１５、１０％のＤＳＰＣ、１．５％のＰＥＧ－ＤＭＧ、３８．５％のコレステロールともに輸送ビヒクルにロードした。製剤をＣＤ－１マウスに投与する。細胞タイプにわたる発現の分布を決定するために脾臓細胞についてフローサイトメトリーを実行する。

実施例２６
ナノ粒子組成物の産生
細胞への環状ＲＮＡの送達に使用するための安全及び効果的なナノ粒子組成物を調査するために、一連の製剤を調製し、試験する。具体的には、ナノ粒子組成物の脂質成分中の特定のエレメント及びその比率を最適化する。

ナノ粒子は、１つの流体ストリーム中で、または一方が環状ＲＮＡを含有し、他方が脂質成分を有する２つの流体ストリームの混合プロセス、例えばマイクロフルイディクス及びＴジャンクション混合で作製できる。

脂質組成物は、イオン化可能脂質、任意でヘルパー脂質（例えばＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬから入手可能な、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、またはオレイン酸）、ＰＥＧ脂質（例えばＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬから入手可能な、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール、ＰＥＧ－ＤＭＧとしても知られる）、及び構造脂質、例えばコレステロールを、約、例えば、溶媒、例えば、エタノール中４０または５０ｍＭの濃度にて組み合わせることにより調製される。溶液は、例えば、－２０℃で保管するために冷蔵するべきである。脂質を組み合わせて、所望のモル比を生成し（例えば、下の表３１ａ及び３１ｂを参照されたい）、水及びエタノールで希釈して、最終脂質濃度を、例えば、約５．５ｍＭ及び約２５ｍＭ間にする。

（表３１ａ）

いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、表３１ａに記載するような製剤を有する。

（表３１ｂ）

いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、表３１ｂに記載するような製剤を有する。

ｃｉｒｃＲＮＡを含むナノ粒子組成物の場合、脱イオン水中０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のｃｉｒｃＲＮＡの溶液を、緩衝液、例えば、ｐＨ３～４の５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液に希釈して、ストック溶液を形成する。代替的に、脱イオン水中０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度のｃｉｒｃＲＮＡの溶液を、緩衝液、例えば、ｐＨ３～４．５の６．２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に希釈して、ストック溶液を形成する。

環状ＲＮＡ及び脂質成分を含むナノ粒子組成物を、脂質溶液を、環状ＲＮＡを約５：１～約５０：１の脂質成分対ｃｉｒｃＲＮＡの重量：重量比率にて含む溶液と組み合わせることによって調製する。脂質溶液は、例えば、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒマイクロ流体ベースのシステムを使用して、約１０ｍｌ／分～約１８ｍｌ／分または約５ｍｌ／分～約１８ｍｌ／分の流速でｃｉｒｃＲＮＡ溶液に迅速に注射して、約１：１～約４：１間の水対エタノール比率を伴う懸濁液を産生する。

ナノ粒子組成物を、透析によって処理して、エタノールを除去して、緩衝液交換を達成することができる。製剤を、分子量カットオフが１０ｋＤａまたは２０ｋＤａのＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒカセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、一次生成物の２００倍の容量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に対して、２回透析する。次いで製剤を４℃で一晩透析した。結果得られたナノ粒子懸濁液を、０．２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してガラスバイアルに濾過し、圧着クロージャーで密閉する。０．０１ｍｇ／ｍｌ～０．１５ｍｇ／ｍｌのナノ粒子組成物溶液が、一般的に取得される。

上記の方法は、ナノ沈殿及び粒子形成を誘導する。

Ｔジャンクション及び直接注射を含むがこれに限定されない代替的なプロセスを使用して、同じナノ沈殿を達成し得る。

Ｂ．ナノ粒子組成物の特徴評価
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、ナノ粒子組成物の粒径、多分散性指数（ＰＤＩ）及びゼータ電位を、粒径の決定においては１×ＰＢＳ、及びゼータ電位の決定においては１５ｍＭのＰＢＳで決定することができる。

紫外可視分光法を使用して、ナノ粒子組成物中のｃｉｒｃＲＮＡの濃度を決定することができる。１×ＰＢＳに希釈した１００μＬの製剤を４：１（ｖ／ｖ）のメタノール及びクロロホルムの混合物９００μＬに加える。混合後、溶液の吸光度スペクトルを、例えば、ＤＵ ８００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）で、２３０ｎｍ～３３０ｎｍで記録する。ナノ粒子組成物中のｃｉｒｃＲＮＡの濃度は、その組成物中に使用されているｃｉｒｃＲＮＡの吸光係数ならびに、波長、例えば、２６０ｎｍでの吸光度及び、波長、例えば、３３０ｎｍでのベースライン値間の差に基づいて計算することができる。

ＱＵＡＮＴ－ＩＴ（商標）ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ナノ粒子組成物によるｃｉｒｃＲＮＡの封入を評価することができる。試料を、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中およそ約５μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬの濃度まで希釈する。５０μＬの希釈試料を、ポリスチレン９６ウェルプレートに移し、５０μＬのＴＥ緩衝液または５０μＬの２～４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液のいずれかをウェルに加える。プレートを、３７℃の温度にて１５分間インキュベートした。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）試薬を、１：１００または１：２００でＴＥ緩衝液に希釈し、１００μＬのこの溶液を各ウェルに加える。蛍光強度は、蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、励起波長、例えば、約４８０ｎｍ及び発光波長、例えば、約５２０ｎｍにて測定することができる。試薬ブランクの蛍光値を試料の各値から引き、遊離ｃｉｒｃＲＮＡのパーセンテージを、インタクトな試料（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加しない）の蛍光強度を破壊試料（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の添加によって生じる）の蛍光値で除することで決定した。

Ｃ．インビボ製剤研究：
様々なナノ粒子組成物がどのように効果的にｃｉｒｃＲＮＡを標的細胞に送達するのかをモニターするために、ｃｉｒｃＲＮＡを含む異なるナノ粒子組成物を調製し、げっ歯類集団に投与する。マウスに、脂質ナノ粒子製剤を伴うナノ粒子組成物を含む単回用量を、静脈内、筋肉内、動脈内、または腫瘍内投与する。一部の例では、マウスに用量を吸入させ得る。用量サイズは、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲であってよく、この場合１０ｍｇ／ｋｇは、マウスの体質量１ｋｇ毎にナノ粒子組成物に１０ｍｇのｃｉｒｃＲＮＡを含む用量を説明する。ＰＢＳを含む対照組成物も採用し得る。

ナノ粒子組成物をマウスに投与する際、特定の製剤及びその用量の用量送達プロファイル、用量応答、及び毒性を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、生物発光イメージング、または他の方法によって測定することができる。タンパク質発現の時間経過も評価することができる。評価のためにげっ歯類から収集した試料には、血液及び組織（例えば、筋肉内注射部位からの筋肉組織及び内部組織）が含まれ得る；試料収集には、動物の犠牲が含まれ得る。

ｃｉｒｃＲＮＡを含む組成物の投与によって誘導されるより高いレベルのタンパク質発現は、より高いｃｉｒｃＲＮＡ翻訳及び／またはナノ粒子組成物ｃｉｒｃＲＮＡ送達効率を示すだろう。非ＲＮＡ成分は翻訳機構自体に影響を与えるとは考えられていないため、タンパク質発現のレベルが高いことは、他のナノ粒子組成物またはその非存在と比べて、所与のナノ粒子組成物によるｃｉｒｃＲＮＡの送達効率が高いことを示している可能性が高い。

実施例２７
ナノ粒子組成物の特徴評価
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、輸送ビヒクル組成物の粒径、多分散性指数（ＰＤＩ）及びゼータ電位を、粒径の決定においては１×ＰＢＳ、及びゼータ電位の決定においては１５ｍＭのＰＢＳで決定することができる。

紫外可視分光法を使用して、輸送ビヒクル組成物中の治療剤及び／または予防剤（例えば、ＲＮＡ）の濃度を決定することができる。１×ＰＢＳに希釈した１００μＬの製剤を４：１（ｖ／ｖ）のメタノール及びクロロホルムの混合物９００μＬに加える。混合後、溶液の吸光度スペクトルを、例えば、ＤＵ ８００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）で、２３０ｎｍ～３３０ｎｍで記録する。輸送ビヒクル組成物中の治療剤及び／または予防剤の濃度は、その組成物中に使用されている治療剤及び／または予防剤の吸光係数ならびに、波長、例えば、２６０ｎｍでの吸光度及び、波長、例えば、３３０ｎｍでのベースライン値間の差に基づいて計算することができる。

ＲＮＡを含む輸送ビヒクル組成物の場合、ＱＵＡＮＴ－ＩＴ（商標）ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、輸送ビヒクル組成物によるＲＮＡの封入を評価することができる。試料を、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中およそ約５μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬの濃度まで希釈する。５０μＬの希釈試料を、ポリスチレン９６ウェルプレートに移し、５０μＬのＴＥ緩衝液または５０μＬの２～４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液のいずれかをウェルに加える。プレートを、３７℃の温度にて１５分間インキュベートした。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）試薬を、１：１００または１：２００でＴＥ緩衝液に希釈し、１００μＬのこの溶液を各ウェルに加える。蛍光強度は、蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、励起波長、例えば、約４８０ｎｍ及び発光波長、例えば、約５２０ｎｍにて測定することができる。試薬ブランクの蛍光値を試料の各値から引き、遊離ＲＮＡのパーセンテージを、インタクトな試料（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加しない）の蛍光強度を破壊試料（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の添加によって生じる）の蛍光値で除することで決定した。

実施例２８
Ｔ細胞ターゲティング
輸送ビヒクルをＴ細胞に標的するために、Ｔ細胞抗原結合剤、例えば、抗ＣＤ８抗体を、輸送ビヒクルの表面にカップリングする。抗Ｔ細胞抗原抗体は、ＰＢＳ中のＥＤＴＡの存在下で過剰なＤＴＴにより穏やかに還元され、遊離ヒンジ領域チオールを露出させる。ＤＴＴを除去するために、抗体を、脱塩カラムに通過させる。ヘテロ二官能性クロスリンカーＳＭ（ＰＥＧ）２４を使用して、抗体を、ｃｉｒｃＲＮＡをロードした輸送ビヒクルの表面に係留する（アミン基は、ＰＥＧ脂質の頭部基に存在し、抗体上の遊離チオール基は、ＤＴＴによって作製され、ＳＭ（ＰＥＧ）２４は、アミン及びチオール基間で架橋する）。輸送ビヒクルを最初に過剰のＳＭ（ＰＥＧ）２４とインキュベートし、遠心分離して、未反応のクロスリンカーを除去する。次いで、活性化輸送ビヒクルを、過剰の還元抗Ｔ細胞抗原抗体とともにインキュベートした。未結合抗体は、遠心濾過デバイスを使用して除去した。

実施例２９
ＲＶ８８を使用するＲＮＡ含有輸送ビヒクル。
この実施例では、ＲＮＡ含有輸送ビヒクルを、ｃｉｒｃＲＮＡの送達のためにカチオン性脂質ＲＶ８８を含む２－Ｄボルテックスマイクロ流体チップを使用して合成する：

。

（表３２ａ）

ＲＶ８８、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを全て、ホウケイ酸バイアル中１０ｍｇ／ｍｌの濃度にてエタノール中で調製する。脂質１４：０－ＰＥＧ２Ｋ ＰＥは、ホウケイ酸ガラスバイアル中４ｍｇ／ｍｌの濃度にて調製する。ストック濃度での脂質の溶解は、脂質をエタノール中で２分間超音波処理することによって達成した。次に、溶液を、１７０ｒｐｍに設定したオービタル傾斜シェーカー上で、３℃にて１０分間加熱した。次に、バイアルを２６℃で最低４５分間平衡化した。次に、表３２ｂに示される量のストック脂質を添加することによって脂質を混合した。次に、溶液をエタノールで調整して、最終脂質濃度を７．９２ｍｇ／ｍｌとした。

（表３２ｂ）

ＲＮＡを、ｐＨ６．０の７５ｍＭクエン酸緩衝液を用いて、ＲＮＡの濃度は１．２５０ｍｇ／ｍｌで、ストック溶液として調製する。次に、ＲＮＡの濃度を、ｐＨ６．０の７５ｍＭクエン酸緩衝液を用いて０．１０３７ｍｇ／ｍｌに調整し、２６℃に平衡化する。次に、溶液を、２６℃にて最低２５分間インキュベートする。

マイクロ流体チャンバーを、エタノールで洗浄し、ｎｅＭＹＳＩＳシリンジポンプを、シリンジにＲＮＡ溶液をロードし、別のシリンジにエタノール脂質をロードすることによって調製する。両方のシリンジはロードされ、ｎｅＭＥＳＹＳソフトウェアの制御下にある。次に、溶液を、２の水相対有機相比率で、２２ｍｌ／分の総流速（ＲＮＡに関しては１４．６７ｍｌ／分及び脂質溶液に関しては７．３３ｍｌ／分で、混合チップに適用する。両方のポンプを同期して起動した。マイクロ流体チップから流出したミキサー溶液は、４×１ｍｌ画分で収集し、最初の画分は廃棄物として廃棄する。ＲＮＡ－リポソームを含有する残りの溶液は、Ｇ－２５ミニ脱塩カラムを使用して、１０ｍＭトリス－ＨＣＩ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５に交換する。緩衝液の交換後、物質を、サイズ及びＲＮＡ捕捉について、それぞれ、ＤＬＳ分析及びＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイを通して特徴評価する。

実施例３０
ＲＶ９４を使用するＲＮＡ含有輸送ビヒクル。
この実施例では、ＲＮＡ含有リポソームを、ｃｉｒｃＲＮＡの送達のためにカチオン性脂質ＲＶ９４を含む２－Ｄボルテックスマイクロ流体チップを使用して合成する：

。

（表３３）

脂質は、実施例２９と同様に調製し、表３４に挙げた物質量を使用して、最終脂質濃度を７．９２ｍｇ／ｍｌとした。

（表３４）

ｃｉｒｃＲＮＡの水溶液を、ｐＨ６．０の７５ｍＭクエン酸緩衝液を用いて、ｃｉｒｃＲＮＡは１．２５０ｍｇ／ｍｌで、ストック溶液として調製する。次に、ＲＮＡの濃度を、ｐＨ６．０の７５ｍＭクエン酸緩衝液を用いて０．１０３７ｍｇ／ｍｌに調整し、２６℃に平衡化する。次に、溶液を、２６℃にて最低２５分間インキュベートする。

マイクロ流体チャンバーを、エタノールで洗浄し、ｎｅＭＹＳＩＳシリンジポンプを、シリンジにＲＮＡ溶液をロードし、別のシリンジにエタノール脂質をロードすることによって調製する。両方のシリンジはロードされ、ｎｅＭＥＳＹＳソフトウェアの制御下にある。次に、溶液を、２の水相対有機相比率で、２２ｍｌ／分の総流速（ＲＮＡに関しては１４．６７ｍｌ／分及び脂質溶液に関しては７．３３ｍｌ／分で、混合チップに適用する。両方のポンプを同期して起動した。マイクロ流体チップから流出したミキサー溶液は、４×１ｍｌ画分で収集し、最初の画分は廃棄物として廃棄する。ｃｉｒｃＲＮＡ輸送ビヒクルを含有する残りの溶液は、Ｇ－２５ミニ脱塩カラムを使用して、上記のように、１０ｍＭ トリス－ＨＣＩ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５に交換する。緩衝液の交換後、物質を、サイズ及びＲＮＡ捕捉について、それぞれ、ＤＬＳ分析及びＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイを通して特徴評価する。リポソームの生物物理学的分析を、表３５に示す。

（表３５）

実施例３１
インライン混合の一般的プロトコル。
個々及び別個のストック溶液を調製する－１つは脂質を含有し、他方はｃｉｒｃＲＮＡを含有する。所望の脂質または脂質混合物、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ脂質を含有する脂質ストックを、９０％エタノールに可溶化することによって調製する。残りの１０％は、低ｐＨクエン酸緩衝液である。脂質ストックの濃度は、４ｍｇ／ｍＬである。このクエン酸緩衝液のｐＨは、採用する脂質の種類に応じて、ｐＨ３～ｐＨ５の範囲であることができる。ｃｉｒｃＲＮＡも、４ｍｇ／ｍＬの濃度にてクエン酸緩衝液に可溶化する。５ｍＬの各ストック溶液を調製する。

ｃｉｒｃＲＮＡと組み合わせる前、ストック溶液は完全に透明であり、脂質は完全に可溶化されることが確認されている。ストック溶液を加熱して、脂質を完全に可溶化し得る。このプロセスで使用されるｃｉｒｃＲＮＡは、未修飾または修飾オリゴヌクレオチドであってよく、コレステロールなどの親油性部分と複合し得る。

個々のストックは、各溶液をＴジャンクションにポンプで送り込むことによって組み合わされる。デュアルヘッドのＷａｔｓｏｎ－Ｍａｒｌｏｗポンプを使用して、２つのストリームの開始と停止を同時に制御した。１．６ｍｍポリプロピレンチューブを、線流速を増加させるために、０．８ｍｍチューブにさらにサイズを小さくする。ポリプロピレンライン（ＩＤ＝０．８ｍｍ）を、Ｔジャンクションのいずれかの側に取り付ける。ポリプロピレンＴは、１．６ｍｍの直鎖状先端を有して、４．１ｍｍ^３の容量を結果得る。ポリプロピレンラインの大きい端（１．６ｍｍ）の各々を、可溶化脂質ストックまたは可溶化ｃｉｒｃＲＮＡのいずれかを含有する。試験管の中に入れるＴジャンクションの後に、組み合わされたストリームが流れ出る単一のチューブを配置する。次に、チューブを、２×容量のＰＢＳを含有する容器に伸ばし入れ、これを急速撹拌する。ポンプの流速は、３００ｒｐｍまたは１１０ｍＬ／分の設定とする。エタノールを除去し、透析によってＰＢＳに交換する。次に、脂質製剤を、遠心分離またはダイアフィルトレーションを使用して、適切な作業濃度に濃縮する。

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ，ＭＡ）に、尾静脈注射を介して生理食塩水または製剤化されたｃｉｒｃＲＮＡのいずれかを与える。投与後の様々な時点で、血清試料を後眼窩採血によって収集する。第ＶＩＩ因子タンパク質の血清レベルは、発色アッセイ（Ｂｉｏｐｈｅｎ ＦＶＴＩ，Ａｎｉａｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＯＨ）を使用して試料中で決定する。第ＶＩＩ因子の肝臓ＲＮＡレベルを決定するために、動物を犠牲にし、肝臓を採取して液体窒素で瞬間凍結する。組織溶解物を、凍結組織から調製し、第ＶＩＩ因子の肝臓ＲＮＡレベルを分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ａｓｓａｙ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ，ＣＡ）を使用して定量化する。

ＦＶＩＩ活性を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける静脈内（ボーラス）注射から４８時間後に、ＦＶＴＩ ｓｉＲＮＡ処理動物において評価する。ＦＶＩＩは、マイクロプレートスケールで、製造元の指示に従って、血清または組織中のタンパク質レベルを決定するための市販のキットを使用して測定する。ＦＶＩＩの低下を、未処置対照マウスに対して決定し、結果を残存ＦＶＩＩ率（％）として表す。２つの用量レベル（０．０５及び０．００５ｍｇ／ｋｇ ＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ）を、各新規リポソーム組成物のスクリーニングに使用する。

実施例３２
予形成ベシクルを使用するｃｉｒｃＲＮＡ製剤。
カチオン性脂質含有輸送ビヒクルを、予形成ベシクル法を使用して作製する。カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ－脂質を、エタノールに、それぞれ、４０／１０／４０／１０のモル比にて可溶化する。脂質混合物を、水性緩衝液（５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４）に混合しながら加えて、それぞれ、最終エタノール濃度が３０％（容量／容量）、最終脂質濃度が６．１ｍｇ／ｍＬになるようにし、室温で２分間平衡化してから押し出す。Ｎｉｃｏｍｐ分析によって決定して、ベシクルの直径が７０～９０ｎｍになるまで、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）を使用して、２２℃にて、ポアサイズ８０ｎｍのフィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）を２枚積み重ねたものに水和脂質を通して押し出し、取得する。小ベシクルを形成しないカチオン性脂質混合物では、脂質混合物を低ｐＨ緩衝液（５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３）で水和させて、ＤＳＰＣ頭部基上のホスフェート基をプロトン化することによって、安定的な７０～９０ｎｍのベシクルの形成を助ける。

ＦＶＩＩ ｃｉｒｃＲＮＡ（５０ｍＭクエン酸塩に可溶化した、３０％エタノールを含有するｐＨ４水溶液）を、混合しながら、３５℃に予め平衡化したベシクルに、約５ｍＬ／分の速度で加える。最終的な標的ｃｉｒｃＲＮＡ／脂質比０．０６（ｗｔ ｗｔ）を達成した後、混合物をさらに３０分間、３５℃にてインキュベートして、ベシクルの再構成及びＦＶＩＩ ＲＮＡの封入を可能にする。次に、エタノールを除去し、透析またはタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションのいずれかによって、外部緩衝液をＰＢＳ（１５５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）と置き換える。サイズ排除スピンカラムまたはイオン交換スピンカラムを使用して、非封入ＲＮＡを除去した後、封入ｃｉｒｃＲＮＡ対脂質の最終的な比率を決定する。

実施例３３
操作された環状ＲＮＡからの三重特異性抗原結合タンパク質の発現
環状ＲＮＡを、（１）３’スプライシング後グループＩイントロンフラグメント；（２）配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；（３）三重特異性抗原結合タンパク質コード領域；及び（４）３’相同性領域を含むように設計する。三重特異性抗原結合タンパク質領域を、標的抗原、例えば、ＧＰＣ３に結合する例示的な三重特異性抗原結合タンパク質を産生するように構築する。

ｓｃＦｖ ＣＤ３結合ドメインの生成
ヒトＣＤ３イプシロン鎖標準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０７７６６である。ヒトＣＤ３ガンマ鎖標準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０９６９３である。ヒトＣＤ３デルタ鎖標準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０４３２３４である。ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマまたはＣＤ３デルタに対する抗体を、親和性成熟などの既知の技術を介して生成する。ネズミ抗ＣＤ３抗体を出発物質として使用する場合、マウス特異的残基が、本明細書に記載の三重特異性抗原結合タンパク質の処置を受けた対象においてヒト－抗マウス抗原（ＨＡＭＡ）反応を誘導し得る場合、ネズミ抗ＣＤ３抗体のヒト化が臨床環境のために所望である。ヒト化は、適切なヒト生殖系列アクセプターフレームワークに対するネズミ抗ＣＤ３抗体からのＣＤＲ領域のグラフト化（任意でＣＤＲ及び／またはフレームワーク領域に対する他の修飾を含む）によって達成される。

そのため、ヒトまたはヒト化抗ＣＤ３抗体を使用して、三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインのためのｓｃＦｖ配列を生成する。ヒトまたはヒト化ＶＬ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を得て、構築物のためのコドンを、ホモサピエンスからの細胞における発現のために任意で最適化する。ｓｃＦｖにおいてＶＬ及びＶＨドメインが現れる順序は様々であり（すなわち、ＶＬ－ＶＨ、またはＶＨ－ＶＬ配向）、３コピーの「Ｇ４Ｓ」または「Ｇ_４Ｓ」サブユニット（Ｇ_４Ｓ）_３が可変ドメインを接続させてｓｃＦｖドメインを生成する。抗ＣＤ３ｓｃＦｖプラスミド構築物は、任意のＦｌａｇ、Ｈｉｓまたは他の親和性タグを有し得、ＨＥＫ２９３または他の好適なヒトまたは哺乳動物細胞株にエレクトロポレーションし、精製する。バリデーションアッセイには、ＦＡＣＳによる結合分析、Ｐｒｏｔｅｏｎを使用する動態分析、及びＣＤ３を発現する細胞の染色が含まれる。

ｓｃＦｖグリピカン－３（ＧＰＣ３）結合ドメインの生成
グリピカン－３（ＧＰＣ３）は、肝細胞癌に存在するが、健康な正常な肝臓組織には存在しない細胞表面タンパク質の１つである。それは肝細胞癌において上昇することが頻繁に観察され、ＨＣＣ患者にとって予後不良に関連する。それは、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化することが知られている。ＭＤＸ－１４１４、ＨＮ３、ＧＣ３３、及びＹＰ７を含むＧＰＣ３抗体が生成されている。

ＧＰＣ－３または別の標的抗原に結合するｓｃＦｖは、ＣＤ３に対するｓｃＦｖ結合ドメインの生成のための上記方法と同様に生成される。

インビトロでの三重特異性抗原結合タンパク質の発現
ＣＨＯ－Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ－６１）（Ｋａｏ ａｎｄ Ｐｕｃｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９６８；６０（４）：１２７５－８１）の誘導体であるＣＨＯ細胞発現システム（Ｆｌｐ－Ｉｎ（登録商標），Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって提供される標準的な細胞培養プロトコルに従って接着細胞を継代培養する。

懸濁液における成長に対する適合のため、細胞を組織培養フラスコから脱着させ、無血清培地に入れる。１０％ＤＭＳＯを有する培地中で懸濁液適合細胞を凍結保存する。

分泌される三重特異性抗原結合タンパク質を安定的に発現する組換えＣＨＯ細胞株を、懸濁液適合細胞のトランスフェクションによって生成する。抗生物質ハイグロマイシンＢでの選択中に生存細胞密度を週２回測定し、細胞を遠心分離し、新たな選択培地に０．１×１０^６生存細胞／ｍＬの最大密度で再懸濁する。三重特異性抗原結合タンパク質を安定的に発現する細胞プールを選択から２～３週間後に回収し、その時点で細胞を振盪フラスコ中の標準培地に移す。組換え分泌タンパク質の発現は、タンパク質ゲル電気泳動またはフローサイトメトリーを実施することによって確認する。安定な細胞プールをＤＭＳＯ含有培地中で凍結乾燥する。

三重特異性抗原結合タンパク質を、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株の１０日流加培養物において細胞培養上清への分泌によって産生する。細胞培養上清を１０日後に典型的には＞７５％の培養生存率で採取する。試料を産生培養物から１日おきに収集し、細胞密度及び生存率を評価する。採取の日に、細胞培養上清を、さらなる使用の前に遠心分離及び真空濾過によって清浄化する。

細胞培養上清におけるタンパク質発現力価及び産物全体性をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析する。

三重特異性抗原結合タンパク質の精製
三重特異性抗原結合タンパク質を、２ステップの手順でＣＨＯ細胞培養上清から精製する。構築物を、第１のステップにおけるアフィニティークロマトグラフィーと、第２のステップにおけるＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００での分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に共する。試料を緩衝液交換し、限外濾過によって＞１ｍｇ／ｍＬの純度の典型的な濃度まで濃縮し、最終試料の均一性（典型的には＞９０％）を還元及び非還元条件下でＳＤＳ ＰＡＧＥによって評価し、続いて抗（半減期延長ドメイン）または抗イディオタイプ抗体を使用した免疫ブロット及び分析的ＳＥＣをそれぞれを行う。精製されたタンパク質を、使用するまで一定分量で－８０℃で保存する。

実施例３４
半減期延長ドメインを有する操作された環状ＲＮＡの発現は、半減期延長ドメインを有さないものと比べて改善した薬物動態パラメータを有する。
実施例２３のｃｉｒｃＲＮＡ分子でコードされた三重特異性抗原結合タンパク質を、０．５ｍｇ／ｋｇボーラス注射としてカニクイザルに筋肉内投与する。別のカニクイザル群に、ＣＤ３及びＧＰＣ－３に対する結合ドメインを有するが半減期延長ドメインを欠くサイズのｃｉｒｃＲＮＡ分子でコードされる同等のタンパク質を与える。第３及び第４の群に、ＣＤ３及び半減期延長ドメイン結合ドメインを有するｃｉｒｃＲＮＡ分子でコードされるタンパク質及びＧＰＣ－３及び半減期延長ドメインを有するタンパク質をそれぞれ与える。ｃｉｒｃＲＮＡによってコードされる両方のタンパク質は、サイズが三重特異性抗原結合タンパク質と同等である。各試験群は、５匹のサルからなる。血清試料を示された時点で採取し、段階希釈し、タンパク質の濃度を、ＣＤ３及び／またはＧＰＣ－３に対する結合ＥＬＩＳＡを使用して決定する。

薬物動態分析を、試験品血漿濃度を使用して実施する。各試験品についての群平均血漿データは、投薬後の時間に対してプロットした場合、多指数プロファイルに適合する。データを、ボーラスインプットならびに分配相及び排泄相についての一次速度定数を用いて標準的な２コンパートメントモデルによってフィッティングさせる。静脈内投与についてのデータの最良あてはめのための一般方程式は、ｃ（ｔ）＝Ａｅ^～ａｔ＋Ｂｅ^～ｐｔ（式中、ｃ（ｔ）は時間ｔにおける血漿濃度であり、Ａ及びＢはＹ軸上の切片であり、α及びβは、各々、分布相及び消失相の見かけの一次速度定数である）である。α相はクリアランスの初期相であり、動物の全ての細胞外液へのタンパク質の分布を反映する一方で、減衰曲線の第２またはβ相の部分は真の血漿クリアランスを表す。かかる方式を当てはめるための方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ａ＝Ｄ／Ｖ（ａ－ｋ２１）／（ａ－ｐ）、Ｂ＝Ｄ／Ｖ（ｐ－ｋ２１）／（ａ－ｐ）、ａ及びβ（α＞βの場合）は、二次方程式：ｒ^２＋（ｋ１２＋ｋ２１＋ｋ１０）ｒ＋ｋ２１ｋ１０＝０の根であり、Ｖ＝分布容積、ｋ１０＝排出速度、ｋ１２＝コンパートメント１からコンパートメント２への移動速度及びｋ２１＝コンパートメント２からコンパートメント１への移動速度、及びＤ＝投与された用量の推定されるパラメータを使用する。

データ分析：濃度対時間プロファイルのグラフをＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（商標）Ｖ．３．０９ Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９８６－１９９７．Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｐａ．）を使用して作製する。報告可能ではない（ＬＴＲ）ものとして報告された値は、ＰＫ分析に含めず、グラフで表されない。薬物動態パラメータは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｖ．３．１ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９８－１９９９．Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ）を使用してコンパートメント分析によって決定する。薬物動態パラメータは、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ Ｗ Ａ ａｎｄ Ｋｅａｒｎｓ Ｇ Ｌ，１９９９，ＥＳＴ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ Ｃ記載されているように計算する。

実施例２３のｃｉｒｃＲＮＡ分子でコードされる三重特異性抗原結合タンパク質は、半減期延長ドメインを欠くタンパク質と比較して、消失半減期の延長などの改善した薬物動態パラメータを有することが予期される。

実施例３５
三重特異性抗原結合タンパク質の細胞傷害
実施例２３のｃｉｒｃＲＮＡ分子でコードされる三重特異性抗原結合タンパク質を、ＧＰＣ－３＋標的細胞に対するＴ細胞依存性細胞傷害のその媒介についてインビトロで評価する。

蛍光標識されたＧＰＣ３標的細胞を、実施例２３の三重特異性抗原結合タンパク質の存在下で、エフェクター細胞としてのランダムドナーの単離されたＰＢＭＣまたはＴ細胞とインキュベートする。加湿インキュベーター内での３７℃で４時間のインキュベーション後、標的細胞から上清への蛍光色素の放出を蛍光光度計で決定する。実施例２３の三重特異性抗原結合タンパク質を用いずにインキュベートされた標的細胞及びインキュベーションの最後にサポニンの添加によって全体的に溶解した標的細胞は、それぞれ陰性対照及び陽性対照として機能する。

測定された残存する生存標的細胞に基づいて、特異的細胞溶解のパーセンテージを、以下の式：［１－（生存標的の数（試料）／生存標的の数（自発））］×１００％に従って計算する。シグモイド用量反応曲線及びＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して非線形回帰／４パラメータロジスティックフィットによって計算する。所与の抗体濃度について得られた溶解値を使用して、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して４パラメータロジスティックフィット分析によってシグモイド用量－反応曲線を計算する。

実施例３６
イオン化可能脂質の合成
３８．１ （（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（脂質２７、表１０ａ）及び（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート））（脂質２６、表１０ａ）の合成
凝縮器と接続された１００ｍＬの丸底フラスコ内で、３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロパン－１－アミン（１００ｍｇ、０．７９９ｍｍｏｌ）または３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロパン－１－アミン（０．７９９ｍｍｏｌ）、６－ブロモヘキシル２－ヘキシルデカノエート（７３７．２ｍｇ、１．７５７ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（４８５ｍｇ、３．５１５ｍｍｏｌ）及びヨウ化カリウム（１３ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３０ｍＬ）中で混合し、反応混合物を８０℃に４８時間加熱した。混合物を室温に冷却し、セライトのパッドを介して濾過した。濾液を酢酸エチルで希釈した。水、ブラインで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させ、粗残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２：ＣＨ_２Ｃｌ_２＝ＣＨ_２Ｃｌ_２中の１００％～１０％のメタノール）によって精製し、無色の油生成物が得られた（９２ｍｇ、１５％）。（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート））の分子式はＣ_５０Ｈ_９５Ｎ_３Ｏ_４であり、分子量（Ｍ_ｗ）は８０１．７である。

（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート））（脂質２６、表１０ａ）の合成のための反応スキーム。

脂質２６の特徴評価をＬＣ－ＭＳによって実施した。図２７Ａ～Ｃは、脂質２６の特徴評価を示している。図２７Ａは、脂質２６について観察されたプロトンＮＭＲを示している。図２７Ｂは、示される総イオン及びＵＶクロマトグラムを伴う脂質２６についての代表的なＬＣ／ＭＳトレースである。

３８．２ 脂質２２－Ｓ１４の合成
３８．２．１ ２－（テトラデシルチオ）エタン－１－オールの合成
アセトニトリル（２００ｍＬ）中の２－スルファニルエタノール（５．４０ｇ、６９．１１ｍｍｏｌ、４．８２ｍＬ、０．８７１ｅｑ）の混合物に１－ブロモテトラデカン（２２ｇ、７９．３４ｍｍｏｌ、２３．６６ｍＬ、１ｅｑ）及び炭酸カリウム（１７．５５ｇ、１２６．９５ｍｍｏｌ、１．６ｅｑ）を２５℃で添加した。反応混合物を４０℃に加温し、１２時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル／石油エーテル＝２５／１、Ｒ_ｆ＝０．３、Ｉ_２によって染色）は、出発物質が完全に消費され、新たな主要なスポットが生成されたことを示した。反応混合物を濾過し、フィルターケーキをアセトニトリル（５０ｍＬ）で洗浄し、次いで濾液を真空下で濃縮して残渣を得、これをシリカゲル上のカラム（酢酸エチル／石油エーテル＝１／１００～１／２５）によって精製して２－（テトラデシルチオ）エタン－１－オール（１４ｇ、収率６４．２８％）を白色の固体として得た。

^１Ｈ ＮＭＲ （ＥＴ３６３８７－４５－Ｐ１Ａ， ４００ ＭＨｚ， クロロホルム－ｄ） δ ０．８７ －０．９１ （ｍ， ３ Ｈ） １．２７ （ｓ， ２０ Ｈ） １．３５ －１．４３ （ｍ， ２ Ｈ） １．５３ －１．６４ （ｍ， ２ Ｈ） ２．１６ （ｂｒ ｓ， １ Ｈ） ２．４９ －２．５６ （ｍ， ２ Ｈ） ２．７４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．９３ Ｈｚ， ２ Ｈ） ３．７２ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ４．８９ Ｈｚ， ２ Ｈ）．図２８は、対応する核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示している。

３８．２．２ ２－（テトラデシルチオ）エチルアクリレートの合成
ジクロロメタン（２４０ｍＬ）中の２－（テトラデシルチオ）エタン－１－オール（１４ｇ、５１．００ｍｍｏｌ、１ｅｑ）の溶液にトリエチルアミン（７．７４ｇ、７６．５０ｍｍｏｌ、１０．６５ｍＬ、１．５ｅｑ）及びプロプ－２－エノイルクロリド（５．５４ｇ、６１．２０ｍｍｏｌ、４．９９ｍＬ、１．２ｅｑ）を０℃で窒素下で滴下して添加した。反応混合物を２５℃に温め、１２時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル／石油エーテル＝２５／１、Ｒｆ＝０．５、Ｉ_２によって染色）は、出発物質が完全に消費され、新たな主要なスポットが生成されたことを示した。反応溶液を真空下で濃縮して残渣を得、これをシリカゲル上のカラム（酢酸エチル／石油エーテル＝１／１００～１／２５）によって精製して２－（テトラデシルチオ）エチルアクリレート（１２ｇ、収率７１．６１％）を無色の油として得た。

^１Ｈ ＮＭＲ （ＥＴ３６３８７－４９－Ｐ１Ａ， ４００ ＭＨｚ， クロロホルム－ｄ） δ ０．８５ －０．９３ （ｍ， ３ Ｈ） １．２６ （ｓ， １９ Ｈ） １．３５ －１．４３ （ｍ， ２ Ｈ） １．５３ －１．６５ （ｍ， ２ Ｈ） ２．５３ －２．６２ （ｍ， ２ Ｈ） ２．７９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０３ Ｈｚ， ２ Ｈ） ４．３２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０３ Ｈｚ， ２ Ｈ） ５．８６ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．３９， １．４７ Ｈｚ， １ Ｈ） ６．０９ －６．１９ （ｍ， １ Ｈ） ６．４３ （ｄｄ， Ｊ ＝ １７．３０， １．４１ Ｈｚ， １ Ｈ）．図２９は、対応する核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示している。

３８．２．３ ビス（２－（テトラデシルチオ）エチル）３，３’－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ジプロピオネート（脂質２２－Ｓ１４）の合成
フラスコに３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロパン－１－アミン（３００ｍｇ、２．１６ｍｍｏｌ）及び２－（テトラデシルチオ）エチルアクリレート（１．７０ｇ、５．１７ｍｍｏｌ）を入れた。そのままの反応混合物を８０℃に加熱し、４８時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル、Ｒ_ｆ＝０．３、Ｉ_２によって染色、１滴の水酸化アンモニウムを添加）は、出発物質が完全に消費され、新たな主要なスポットが形成されたことを示した。反応混合物をジクロロメタン（４ｍＬ）で希釈し、シリカゲル上のカラム（石油エーテル／酢酸エチル＝３／１～０／１、０．１％水酸化アンモニウムを添加）によって精製してビス（２－（テトラデシルチオ）エチル）３，３’－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ジプロピオネート（５０１ｍｇ、収率２９．１％）を無色の油として得た。

^１Ｈ ＮＭＲ （ＥＴ３６３８７－５１－Ｐ１Ａ， ４００ ＭＨｚ， クロロホルム－ｄ） δ ０．８７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７３ Ｈｚ， ６ Ｈ） １．２５ （ｓ， ４０ Ｈ） １．３３ －１．４０ （ｍ， ４ Ｈ） １．５２ －１．６１ （ｍ， ４ Ｈ） １．８１ －１．９０ （ｍ， ２ Ｈ） ２．３６ （ｓ， ３ Ｈ） ２．３９ －２．４６ （ｍ， ６ Ｈ） ２．５３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．３９ Ｈｚ， ４ Ｈ） ２．７０ －２．７８ （ｍ， ８ Ｈ） ３．８４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１７ Ｈｚ， ２ Ｈ） ４．２１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９５ Ｈｚ， ４ Ｈ） ６．８５ （ｓ， １ Ｈ） ６．８９ （ｓ， １ Ｈ）．図３０は、対応する核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示している。

３８．３ ビス（２－（テトラデシルチオ）エチル）３，３’－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ジプロピオネート（脂質９３－Ｓ１４）の合成
フラスコに３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロパン－１－アミン（３００ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ、１ｅｑ）及び２－（テトラデシルチオ）エチルアクリレート（１．８９ｇ、５．７５ｍｍｏｌ、２．４ｅｑ）を入れた。そのままの反応混合物を８０℃に加熱し、４８時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル、Ｒ_ｆ＝０．３、Ｉ_２によって染色、１滴の水酸化アンモニウムを添加）は、出発物質が完全に消費され、新たな主要なスポットが形成されたことを示した。反応混合物をジクロロメタン（４ｍＬ）で希釈し、シリカゲル上のカラム（石油エーテル／酢酸エチル＝１／２０～０／１００、０．１％水酸化アンモニウムを添加）によって精製してビス（２－（テトラデシルチオ）エチル）３，３’－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アザネジル）ジプロピオネート（５１２ｍｇ、収率２７．２２％）を無色の油として得た。

^１Ｈ ＮＭＲ （ＥＴ３６３８７－５４－Ｐ１Ａ， ４００ ＭＨｚ， クロロホルム－ｄ） δ ０．８９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８４ Ｈｚ， ６ Ｈ） １．２６ （ｓ， ４０ Ｈ） １．３４ －１．４１ （ｍ， ４ Ｈ） １．５８ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ７．５０ Ｈｚ， ４ Ｈ） １．９２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６２ Ｈｚ， ２ Ｈ） ２．３６ －２．４６ （ｍ， ６ Ｈ） ２．５５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５０ Ｈｚ， ４ Ｈ） ２．７５ （ｑ， Ｊ ＝ ６．８４ Ｈｚ， ８ Ｈ） ３．９７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９５ Ｈｚ， ２ Ｈ） ４．２３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９５ Ｈｚ， ４ Ｈ） ６．９５ （ｓ， １ Ｈ） ７．０６ （ｓ， １ Ｈ） ７．５１ （ｓ， １ Ｈ）．図３１は、対応する核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示している。

３８．４ ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（脂質５４、表１０ａ）の合成
３８．４．１ ノニル８－ブロモオクタノエート（３）の合成

ＣＨ_２Ｃｌ_２（５００ｍＬ）中の８－ブロモオクタン酸（２）（１８．６ｇ、８３．１８ｍｍｏｌ）及びノナン－１－オール（１）（１０ｇ、６９．３２ｍｍｏｌ）の混合物にＤＭＡＰ（１．７ｇ、１３．８６ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（４８ｍＬ、２７７．３ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（１６ｇ、８３．１８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。反応混合物の濃縮後、粗残渣を酢酸エチル（５００ｍＬ）に溶解し、１ＮのＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ_３、水及びブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、粗残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２：ヘキサン＝ヘキサン中の１００％～３０％のＥｔＯＡｃ）によって精製し、無色の油生成物３が得られた（９ｇ、３７％）。

３８．４．２ ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノエート（５）の合成

ＣＨ_２Ｃｌ_２（３００ｍＬ）中の８－ブロモオクタン酸（２）（１０ｇ、４４．８２ｍｍｏｌ）及びヘプタデカン－９－オール（４）（９．６ｇ、３７．３５ｍｍｏｌ）の混合物にＤＭＡＰ（９００ｍｇ、７．４８ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２６ｍＬ、１４９．７ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（１０．７ｇ、５６．０３ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。反応混合物の濃縮後、粗残渣を酢酸エチル（３００ｍＬ）に溶解し、１ＮのＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ_３、水及びブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、粗残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２：ヘキサン＝ヘキサン中の１００％～３０％のＥｔＯＡｃ）によって精製し、無色の油生成物５が得られた（５ｇ、２９％）。

３８．４．３ ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アミノ）オクタノエート（７）の合成

凝縮器に接続された１００ｍＬの丸底フラスコ内で、ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノエート（５）（８６０ｍｇ、１．８６８ｍｍｏｌ）及び３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロパン－１－アミン（６）（１．３ｇ、９．３３９ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）中で混合した。反応混合物を一晩加熱して還流した。ＭＳ（ＡＰＣＩ）は、予期された生成物を示した。混合物を室温に冷却し、濃縮した。粗残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２：ＣＨ_２Ｃｌ_２＝ＣＨ_２Ｃｌ_２中の１００％～１０％のメタノール＋１％ＮＨ_４ＯＨ）によって精製し、無色の油生成物７が得られた（６６５ｍｇ、６９％）。

３８．４．４ ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（脂質５４、表１０ａ）の合成

凝縮器に接続された１００ｍＬの丸底フラスコ内で、ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）アミノ）オクタノエート（７）（６６５ｍｇ、１．２７９ｍｍｏｌ）及びノニル８－ブロモオクタノエート（３）（５３６ｍｇ、１．５３５ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）中で混合し、次いでＤＩＰＥＡ（０．５５ｍＬ、３．１９８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩加熱して還流した。ＭＳ（ＡＰＣＩ）及びＴＬＣ（ＣＨ_２Ｃｌ_２中の１０％ＭｅＯＨ＋１％ＮＨ_４ＯＨ）はいずれも、生成物及びいくつかの未反応出発物質を示した。混合物を室温に冷却し、濃縮した。粗残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２：ＣＨ_２Ｃｌ_２＝ＣＨ_２Ｃｌ_２中の１００％～１０％のメタノール＋１％ＮＨ_４ＯＨ）によって精製し、無色の油が得られた（１７０ｍｇ、１７％）。

３８．５ ヘプタデカン－９－イル８－（（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）アミノ）オクタノエート（脂質５３、表１０ａ）の合成

表１０ａからの脂質５３を上のスキームに従って合成する。反応条件は、イミダゾールアミンとしての３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロパン－１－アミンを除き、脂質５４と同一である。

実施例３７
環状ＲＮＡを有する脂質ナノ粒子製剤
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を「ＮｅｘｔＧｅｎ」混合チャンバーを有するＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｇｎｉｔｅ装置を使用して形成した。表１０ａからのイオン化可能脂質２６、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）を１６：１：４：１の重量比または６２：４：３３：１のモル比で含有していたエタノール相を、環状ＲＮＡ及び２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を含有する水相とｐＨ５．２で組み合わせた。３：１の水対エタノールの混合比を使用した。次いで製剤化されたＬＮＰを１Ｌの水で透析し、１８時間にわたって２回交換した。透析したＬＮＰを０．２μｍフィルターで濾過した。インビボ投薬の前に、ＬＮＰをＰＢＳに希釈した。ＬＮＰサイズは、動的光散乱によって決定した。１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２０μｇ／ｍＬのＬＮＰを有するキュベットをＭａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｐｒｏを使用してＺ平均について測定した。Ｚ平均及び多分散性指数を記録した。

３９．１ 表１０ａからの脂質２６及び２７の製剤
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を「ＮｅｘｔＧｅｎ」混合チャンバーを有するＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｇｎｉｔｅ装置を使用して形成した。表１０ａからのイオン化可能脂質２６または脂質２７、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）を１６：１：４：１の重量比または６２：４：３３：１のモル比で含有していたエタノール相を、環状ＲＮＡ及び２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を含有する水相とｐＨ５．２で組み合わせた。３：１の水対エタノールの混合比を使用した。次いで製剤化されたＬＮＰを１Ｌの水で透析し、１８時間にわたって２回交換した。透析したＬＮＰを０．２μｍフィルターで濾過した。インビボ投薬の前に、ＬＮＰをＰＢＳに希釈した。ＬＮＰサイズは、動的光散乱によって決定した。１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２０μｇ／ｍＬのＬＮＰを有するキュベットをＭａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｐｒｏを使用してＺ平均について測定した。Ｚ平均及び多分散性指数を記録した。

３９．２ 表１０ａからの脂質５３及び５４の製剤
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を「ＮｅｘｔＧｅｎ」混合チャンバーを有するＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｇｎｉｔｅ装置を使用して形成した。表１０ａのイオン化可能脂質５３または５４、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）を５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含有していたエタノール相を、環状ＲＮＡ及び２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を含有する水相とｐＨ５．２で組み合わせた。３：１の水対エタノールの混合比を使用した。次いで製剤化されたＬＮＰを１Ｌの１ｘＰＢＳで透析し、１８時間にわたって２回交換した。透析したＬＮＰを０．２μｍフィルターで濾過した。インビボ投薬の前に、ＬＮＰをＰＢＳに希釈した。ＬＮＰサイズは、動的光散乱によって決定した。１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２０μｇ／ｍＬのＬＮＰを有するキュベットをＭａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｐｒｏを使用してＺ平均について測定した。Ｚ平均及び多分散性指数を記録した。

ＬＮＰのゼータ電位は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｐｒｏを使用して測定した。水中の２００μＬの粒子溶液及び８００μＬの蒸留したＲＮＡｓｅ非含有水を含有する混合物（４００μｇ／ｍＬの最終粒子濃度を有する）を分析のためのゼータサイザーキャピラリーセルにロードした。

ＲＮＡ封入をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイを使用して決定した。ナノ粒子溶液を２μｇ／ｍＬの理論的ｏＲＮＡ濃度でトリス－エチレンジアミン四酢酸（ＴＥ）緩衝液に希釈した。２μｇ／ｍＬ～０．１２５μｇ／ｍＬの範囲の、ＴＥ緩衝液に希釈された標準ｏＲＮＡ溶液を作製した。粒子及び標準を全てのウェルに添加し、第２のインキュベーションを実施した（３分間３５０ｒｐｍで３７℃）。蛍光を、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ（登録商標）ＧＥＭＩＮＩ ＸＳマイクロプレート蛍光光度計を使用して測定した。各粒子溶液中の環状ＲＮＡの濃度を標準曲線を使用して計算した。封入効率を、溶解した粒子と溶解していない粒子の間で検出されたｏＲＮＡの比から計算した。

（表３６ａ）ＬＮＰの特徴評価

（表３６ｂ）ＬＮＰの特徴評価

実施例３８
インビボ分析
２２～２５ｇの範囲の雌ＣＤ－１または雌ｃ５７ＢＬ／６Ｊ＿マウスに０．５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡを静脈内に投薬した。注射から６時間後、マウスに２００μＬのＤ－ルシフェリンを１５ｍｇ／ｍＬ濃度で腹腔内に注射した。注射から５分後、マウスをイソフルランを使用して麻酔し、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ インビボ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）内に背面を上にして入れた。脂質２２－Ｓ１４、９３－Ｓ１４、脂質２６（表１０ａ）の全身総ＩＶＩＳフラックスが図３２Ａに示されている。注射から１０分後、マウスを発光についてスキャンした。マウスを安楽死させ、器官をルシフェリン注射から２５分以内に抽出して肝臓、脾臓、腎臓、肺、及び心臓における発光についてスキャンした。画像（図３３Ａ～Ｂ、３４Ａ～Ｂ、３５Ａ～Ｂ）をＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）ソフトウェアを使用して分析した。目的の領域を描画してフラックス及び平均輝度を得、タンパク質発現の生体内分布について分析した（図３２Ａ～Ｂ）。

図３２Ａは、脂質２２－Ｓ１４及び９３－Ｓ１４を用いて作製されたＬＮＰと比較して、脂質２６（表１０ａ）ＬＮＰでルシフェラーゼｏＲＮＡから観察された増加した全身総フラックスを示している。図３２Ｂは、発現を改善するために設計された有意な構造変化にもかかわらず、脂質２２－Ｓ１４及び９３－Ｓ１４で観察された所望の脾臓対肝臓比を維持しながら、脂質２６（表１０ａ）を用いて増加した全体的発現をさらに強調する組織のエクスビボＩＶＩＳ分析を示している。これらのデータは、先行して報告された脂質と比較して、脂質２６（表１０ａ）によって得られた改善を強調する。

表１０ｂからの脂質１５または表１０ａからの脂質５３もしくは５４を用いて形成されたＬＮＰに封入されたｏＲＮＡで上述した同様の分析も実施した。図３６Ａ～Ｃは、発現を改善するために設計された有意な構造変化にもかかわらず、所望の脾臓対肝臓比を維持しながら、脂質１５、５３、及び５４を用いて全体的発現をそれぞれ強調する組織のエクスビボＩＶＩＳ分析を示している。図３６Ｄは、ＰＢＳ対照についての結果を示している。これらのデータは、９３－Ｓ１４及び２２－Ｓ１４などの先行して報告された脂質と比較した、表１０ａからの脂質１５、５３、及び５４によって得られる改善を実証している。

実施例３９
ルシフェラーゼの送達
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ホタルルシフェラーゼ（ｆ．ｌｕｃ）環状ＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）でトランスフェクトし、ルシフェラーゼ発現について試験した。２人の異なるドナーからのＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ、２％ヒト血清、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）、及び５０ｕＭのＢＭＥ中で３７℃で、ホタルルシフェラーゼをコードする環状ＲＮＡ（２００ｎｇ）を含有する５つの異なるＬＮＰ組成物とインキュベートした。ＬＮＰを用いずにインキュベートされたＰＢＭＣを陰性対照として使用した。２４時間後、細胞を溶解し、生物発光（Ｐｒｏｍｅｇａ ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ）に基づいてホタルルシフェラーゼ発現について分析した。

代表的なデータが図３７Ａ及び３７Ｂに示されており、試験されたＬＮＰは、初代ヒト免疫細胞へ環状ＲＮＡを送達し、タンパク質発現をもたらすことが可能であることを示している。

実施例４０
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のインビトロ送達
ヒトＰＢＭＣ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＧＦＰを封入しているＬＮＰでトランスフェクトし、フローサイトメトリーによって試験した。５人の異なるドナーからのＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ Ａ～Ｅ）を、ＲＰＭＩ、２％ヒト血清、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）、及び５０ｕＭのＢＭＥ中で３７℃で、ＧＦＰまたはＣＤ１９－ＣＡＲのいずれかをコードする環状ＲＮＡ（２００ｎｇ）を含有する１つのＬＮＰ組成物とインキュベートした。ＬＮＰを用いずにインキュベートされたＰＢＭＣを陰性対照として使用した。ＬＮＰインキュベーションから２４、４８、または７２時間後、細胞をＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、固定可能ライブデッド（ｌｉｖｅ ｄｅａｄ）、及びペイロード（ＧＦＰまたはＣＤ１９－ＣＡＲ）について分析した。

代表的なデータが図３８Ａ及び３８Ｂに示されており、試験されたＬＮＰは、初代ヒト免疫細胞へ環状ＲＮＡを送達し、タンパク質発現をもたらすことが可能であることを示している。

実施例４１
複数のＩＲＥＳバリアントは、インビトロでネズミＣＤ１９ ＣＡＲの発現を媒介し得る
抗ネズミＣＤ１９ ＣＡＲをコードする複数の環状ＲＮＡ構築物は、独自のＩＲＥＳ配列を含有し、これを１Ｃ１Ｃ７細胞株にリポトランスフェクトした。リポトランスフェクションの前に、１Ｃ１Ｃ７細胞を完全ＲＰＭＩで数日間増殖させ、細胞が適切な数に増殖したら、１Ｃ１Ｃ７細胞を４つの異なる環状ＲＮＡ構築物でリポトランスフェクトした（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＲＮＡｉＭＡＸ）。２４時間後、１Ｃ１Ｃ７細胞をＨｉｓタグ化組換えネズミＣＤ１９（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）タンパク質とインキュベートし、次いで二次抗Ｈｉｓ抗体で染色した。その後、細胞をフローサイトメトリーで分析した。

代表的なデータが図３９に示されており、示されたウイルス（セスジネズミピコルナウイルス、ヤギコブウイルス、パラボウイルス、及びサリウイルス）に由来するＩＲＥＳは、ネズミＴ細胞において抗マウスＣＤ１９ ＣＡＲの発現を誘導することが可能であることを示している。

実施例４２
ネズミＣＤ１９ ＣＡＲは、インビトロで腫瘍細胞殺傷を媒介する
抗マウスＣＤ１９ ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡをネズミＴ細胞にエレクトロポレーションしてＣＡＲ媒介細胞傷害を評価した。エレクトロポレーションのため、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用してＴ細胞を抗マウスＣＤ１９ ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡでエレクトロポレーションし、次いで一晩放置した。細胞傷害アッセイのため、エレクトロポレーションされたＴ細胞を、１０％ＦＢＳ、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）、及び５０ｕＭのＢＭＥを含有する完全ＲＰＭＩ中でＦｌｕｃ＋標的及び非標的細胞と１：１の比で共培養し、３７℃で一晩インキュベートした。Ｆｌｕｃ＋標的及び非標的細胞の溶解を検出するために、共培養から２４時間後にルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｒｉｇｈｔｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して細胞傷害を測定した。示された値は、トランスフェクトされていないモックシグナルと比べて計算される。

代表的なデータが図４０に示されており、環状ＲＮＡから発現した抗マウスＣＤ１９ ＣＡＲは、インビトロでネズミＴ細胞において機能的であることを示している。

実施例４３
ネズミＣＤ１９ ＣＡＲをコードする脂質封入環状ＲＮＡでのＢ細胞の機能的枯渇
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、抗ネズミＣＤ１９ ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡを封入している、表１０ｂにおける脂質１５を用いて形成されたＬＮＰを注射した。対照として、ホタルルシフェラーゼ（ｆ．Ｌｕｃ）をコードする環状ＲＮＡを封入している表１０ｂにおける脂質１５を異なる群のマウスに注射した。２０～２５ｇの範囲の雌のＣ５７ＢＬ．６Ｊに、０．５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰの５用量を１日おきに静脈内に注射した。注射間で、採血物を固定可能ライブ／デッド、ＣＤ４５、ＴＣＲｖｂ、Ｂ２２０、ＣＤ１１ｂ、及び抗ネズミＣＡＲについてフローサイトメトリーを介して分析した。最後の注射から２日後、脾臓を採取し、フローサイトメトリー分析のために処理した。脾細胞を固定可能ライブ／デッド、ＣＤ４５、ＴＣＲｖｂ、Ｂ２２０、ＣＤ１１ｂ、ＮＫ１．１、Ｆ４／８０、ＣＤ１１ｃ、及び抗ネズミＣＡＲで染色した。抗ネズミＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＮＰを注射したマウスからのデータを、ｆ．Ｌｕｃ ＬＮＰを摂取したマウスに対して正規化した。

代表的なデータが図４１Ａ、４１Ｂ、及び４１Ｃに示されており、ＬＮＰを用いてインビボで送達された環状ｏＲＮＡから発現した抗マウスＣＤ１９ ＣＡＲは、インビボでネズミＴ細胞において機能的であることを示している。

実施例４４
環状ＲＮＡから発現したＣＤ１９ ＣＡＲは、ｍＲＮＡから発現したものと比較してより高い収率及び高い細胞傷害効果を有する。
Ｎ末端からＣ末端まで、ＦＭＣ６３由来ｓｃＦｖ、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体をコードする環状ＲＮＡをヒト末梢Ｔ細胞にエレクトロポレーションして、表面発現及びＣＡＲ媒介細胞傷害を評価した。比較のため、環状ＲＮＡがエレクトロポレーションされたＴ細胞を、この実験ではｍＲＮＡがエレクトロポレーションされたＴ細胞と比較した。エレクトロポレーションのため、ドナーヒトＰＢＭＣから市販のＴ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＣＤ３＋Ｔ細胞をヒトＰＢＭＣから単離した。単離後、Ｔ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で刺激し、１０％ＦＢＳ、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）、及び５０ｕＭのＢＭＥを含有する完全ＲＰＭＩ中で３７℃で５日にわたって増殖させた。刺激から５日後、Ｔ細胞を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡでエレクトロポレーションし、次いで一晩放置した。細胞傷害アッセイのため、エレクトロポレーションされたＴ細胞を、１０％ＦＢＳ、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）、及び５０ｕＭのＢＭＥを含有する完全ＲＰＭＩ中でＦｌｕｃ＋標的及び非標的細胞と１：１の比で共培養し、３７℃で一晩インキュベートした。Ｆｌｕｃ＋標的及び非標的細胞の溶解を検出するために、共培養から２４時間後にルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｒｉｇｈｔｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して細胞傷害を測定した。さらに、エレクトロポレーションされたＴ細胞の一定分量を採取し、分析の日にライブデッド固定可能染色、ＣＤ３、ＣＤ４５、及びキメラ抗原受容体（ＦＭＣ６３）について染色した。

代表的なデータが図４２及び４３に示されている。図４２Ａ及び４２Ｂは、環状ＲＮＡから発現した抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲが、直鎖状ｍＲＮＡから発現した抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲより高いレベル及び長いレベルで発現することを示している。図４３Ａ及び４３Ｂは、環状ＲＮＡから発現した抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲが、直鎖状ｍＲＮＡから発現した抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲと比べて高い細胞傷害効果を発揮することを示している。

実施例４５
単一の環状ＲＮＡからの２つのＣＡＲの機能的発現
キメラ抗原受容体をコードする環状ＲＮＡをヒト末梢Ｔ細胞にエレクトロポレーションして表面発現及びＣＡＲ媒介細胞傷害を評価した。この研究の目的は、２つのＣＡＲをコードする環状ＲＮＡが、２Ａ（Ｐ２Ａ）またはＩＲＥＳ配列で確率的に発現し得るかどうかを評価することである。エレクトロポレーションのため、ＣＤ３＋Ｔ細胞を商業的に購入し（Ｃｅｌｌｅｒｏ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で刺激し、１０％ＦＢＳ、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）、及び５０ｕＭのＢＭＥを含有する完全ＲＰＭＩ中で３７℃で５日にわたって増殖させた。刺激から４日後、Ｔ細胞を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲ、抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲ－２Ａ－抗ヒトＢＣＭＡ ＣＡＲ、及び抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲ－ＩＲＥＳ－抗ヒトＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡでエレクトロポレーションし、次いで一晩放置した。細胞傷害アッセイのため、エレクトロポレーションされたＴ細胞を、１０％ＦＢＳ、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）、及び５０ｕＭのＢＭＥを含有する完全ＲＰＭＩ中でヒトＣＤ１９またはＢＣＭＡ抗原を発現するＦｌｕｃ＋Ｋ５６２細胞と１：１の比で共培養し、３７℃で一晩インキュベートした。Ｆｌｕｃ＋標的細胞の溶解を検出するために、共培養から２４時間後にルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して細胞傷害を測定した。

代表的なデータが図４４に示されており、２つのＣＡＲが、同じ環状ＲＮＡ構築物から機能的に発現し、細胞傷害性エフェクター機能を発揮し得ることを示している。

実施例４６
Ｃｒｅレポーターマウスを使用したインビボ環状ＲＮＡトランスフェクション
Ｃｒｅリコンビナーゼ（Ｃｒｅ）をコードする環状ＲＮＡを前述したように脂質ナノ粒子に封入する。雌の６～８週齢のＢ６．Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ９（ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊ（Ａｉ９）マウスに脂質ナノ粒子を０．５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡで静脈内に投薬した。蛍光ｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質は、Ｃｒｅ組換えによりＡｉ９マウスにおいて転写及び翻訳され、これは、環状ＲＮＡがｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞に送達され、そこで翻訳されたことを意味する。４８時間後、マウスを安楽死させ、脾臓を採取し、シングルセル懸濁液へと処理し、フローサイトメトリーによるイムノフェノタイピングのための様々なフルオロフォアが複合された抗体で染色した。

図４５Ａは、表１０ａからの脂質２７もしくは２６または表１０ｂからの脂質１５を用いて形成されたＬＮＰでの処置後の総骨髄（ＣＤ１１ｂ＋）、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、及びＴ細胞（ＴＣＲ－Ｂ＋）を含む様々な脾臓免疫細胞（ＣＤ４５＋、生）サブセットにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ発現の頻度とともに代表的なＦＡＣＳプロットを示している。ＰＢＳが注射されたＡｉ９マウスは、バックグラウンドのｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を表していた。図４５Ｂは、ｔｄＴｏｍａｔｏを発現する骨髄細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞の割合を定量し（平均＋標準偏差、ｎ＝３）、これは、Ｃｒｅ環状ＲＮＡで成功裏にトランスフェクトされた各細胞集団の割合と同等である。表１０ａからの脂質２７及び２６で作製されたＬＮＰは、脂質９３－Ｓ１４と比較して有意に高い骨髄及びＴ細胞トランスフェクションを示し、脂質構造修飾によって付与される改善を強調している。

図４５Ｃは、表１０ａからの脂質２７及び２６とともにｔｄＴｏｍａｔｏを発現する追加の脾臓免疫細胞集団の割合を示しており（平均＋標準偏差、ｎ＝３）、それにはまた、ＮＫ細胞（ＮＫｐ４６＋、ＴＣＲ－Ｂ－）、古典的単球（ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ－６Ｇ－、Ｌｙ－６Ｃ＿ｈｉ）、非古典的単球（ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ－６Ｇ－、Ｌｙ－６Ｃ＿ｌｏ）、好中球（ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ－６Ｇ＋）、及び樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋、ＭＨＣ－ＩＩ＋）が含まれる。これらの実験は、表１０ａからの脂質２７及び２６ならびに表１０ｂからの脂質１５で作製されたＬＮＰが、マウスにおいて環状ＲＮＡを多くの脾臓免疫細胞サブセットに送達するのに有効であり、それらの細胞において環状ＲＮＡからの成功したタンパク質発現をもたらすことを実証している。

実施例４７
実施例４７Ａ：免疫抑制環状ＲＮＡを産生するためのビルトインポリＡ配列及びアフィニティー精製
ポリＡ配列（２０～３０ｎｔ）をＲＮＡ構築物（イントロンにおいてビルトインポリＡ配列を有する前駆体ＲＮＡ）の５’及び３’末端に挿入した。前駆体ＲＮＡ及びイントロンは、代替的に、例えば、大腸菌ポリＡポリメラーゼまたは酵母ポリＡポリメラーゼを使用して転写後にポリアデニル化され得、これは追加の酵素の使用を必要とする。

この実施例における環状ＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって環状化し、市販のオリゴ－ｄＴ樹脂で洗浄することによってアフィニティー精製して、スプライシング反応からポリＡタグ化配列（フリーのイントロン及び前駆体ＲＮＡを含む）を選択的に取り除いた。ＩＶＴは、市販のＩＶＴキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）またはカスタマイズされたＩＶＴミックス（Ｏｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）及びグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を異なる比（ＧＭＰ：ＧＴＰ＝８、１２．５、または１３．７５）で含有する）を用いて実施した。いくつかの実施形態では、高いＧＭＰ：ＧＴＰ比のＧＭＰが第１のヌクレオチドとして優先的に含まれ、大多数の一リン酸でキャップされた前駆体ＲＮＡを生成し得る。比較として、環状ＲＮＡ産物を代替的に、Ｘｒｎ１、Ｒｎａｓｅ Ｒ、及びＤｎａｓｅ Ｉでの処置（酵素精製）によって精製した。

次いでアフィニティー精製または酵素精製プロセスを使用して調製された環状ＲＮＡの免疫原性を評価した。簡潔には、調製された環状ＲＮＡをＡ５４９細胞にトランスフェクトした。２４時間後、細胞を溶解し、モック試料に対するインターフェロンベータ－１誘導をｑＰＣＲによって測定した。三リン酸化ＲＮＡである３ｐ－ｈｐＲＮＡを陽性対照として使用した。

図４６Ｂ及び４６Ｃは、スプライシング中に取り除かれ、スプライシングされていない前駆体分子に存在するエレメントにポリＡ配列が含まれる場合、ネガティブセレクションアフィニティー精製がスプライシング反応から非環状産物を取り除くことを示している。図４６Ｄは、試験されたＩＶＴ条件及び精製方法で調製された環状ＲＮＡが全て免疫不活性であることを示す。これらの結果は、ネガティブセレクションアフィニティー精製が、環状ＲＮＡ精製のための酵素精製と同等または優れていること、及びカスタマイズされた環状ＲＮＡ合成条件（ＩＶＴ条件）がＧＭＰ余剰に対する依存性を低下させて、最大の免疫不活性を達成し得ることを示唆している。

実施例４７Ｂ：環状ＲＮＡ産生のための特殊結合部位及びアフィニティー精製
ポリＡタグの代わりに、特殊設計配列（ＤＢＳ、専用結合部位）を含めることができる。

ポリＡタグの代わりに、樹脂に結合し得る特殊設計された相補性オリゴヌクレオチドなどの専用結合部位（ＤＢＳ）を使用して、前駆体ＲＮＡ及びフリーのイントロンを選択的に枯渇させ得る。この実施例では、ＤＢＳ配列（３０ｎｔ）を前駆体ＲＮＡの５’及び３’末端に挿入した。ＲＮＡを転写し、転写された産物を樹脂に連結されたカスタム相補性オリゴヌクレオチド上で洗浄した。

図４７Ｂ及び４７Ｃは、スプライシング中に除去されるエレメントに設計されたＤＢＳ配列を含めることにより、ネガティブアフィニティー精製を介して、スプライシング反応においてスプライシングされていない前駆体ＲＮＡ及びフリーのイントロン成分を取り除くことが可能になることを実証している。

実施例４７Ｃ：ジストロフィンをコードする環状ＲＮＡの産生
ジストロフィンをコードする１２ｋｂ１２，０００ｎｔ環状ＲＮＡを、前駆体ＲＮＡのインビトロ転写と、それに続く、残存する直鎖状成分を分解するためのＸｒｎ１、ＤＮａｓｅ １、及びＲＮａｓｅ Ｒの混合物を使用する酵素精製によって産生した。図４８は、ジストロフィンをコードする環状ＲＮＡが成功裏に産生されたことを示している。

実施例４８
３’イントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間の５’スペーサーは、環状ＲＮＡ発現を改善する
Ｊｕｒｋａｔ細胞における３’イントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間に異なる５’スペーサーを有する精製されたｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルを比較した。簡潔には、２５０ｎｇの各ＲＮＡ種での６０，０００細胞のエレクトロポレーションから２４時間後に上清において分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を測定した。

また、Ｊｕｒｋａｔ細胞における３’イントロンフラグメントとＩＲＥＳとの間に異なる５’スペーサーを有する精製されたｃｉｒｃＲＮＡの安定性を比較した。簡潔には、２５０ｎｇの各ＲＮＡ種での６０，０００細胞のエレクトロポレーションから２日にわたって上清において分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を測定し、１日目の発現に対して正規化した。

結果が図４９Ａ及び４９Ｂに示されており、スペーサーの付加が、ＩＲＥＳ機能ならびに付加されたスペーサーの配列同一性及び長さの重要性を向上させ得ることを示している。スペーサーは、ＩＲＥＳの直前に付加され、おそらく、ＩＲＥＳがイントロンフラグメントなどの他の構造化エレメントから孤立して折り畳まれることを可能にすることによって機能するということが潜在的な説明である。

実施例４９
この実施例は、ヤギコブウイルスＩＲＥＳの５’または３’末端からの欠失スキャンを説明する。ＩＲＥＳボーダーは通常、十分に特性化されておらず、経験的分析を必要とし、この実施例は、翻訳を誘導するために必要とされるコアの機能的配列を突き止めるために使用され得る。簡潔には、環状ＲＮＡ構築物を、ガウシアルシフェラーゼをコードする配列に機能可能に連結された切断されたＩＲＥＳエレメントを用いて生成した。切断されたＩＲＥＳエレメントは、５’または３’末端から除去された示された長さのヌクレオチド配列を有していた。ＲＮＡでの初代ヒトＴ細胞のエレクトロポレーションから２４及び４８時間後に上清において分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を測定した。発現の安定性を、２４時間の時点における発現レベルに対する４８時間時点における発現レベルの比として計算した。

図５０に示されているように、ＩＲＥＳの５’末端からの４０超のヌクレオチドの欠失は、発現を減少させ、ＩＲＥＳ機能を崩壊させた。発現の安定性は、ＩＲＥＳエレメントの切断によって比較的影響を受けなかったが、発現レベルは、ＩＲＥＳの３’末端から１４１ヌクレオチドの欠失によって実質的に低下した一方で、３’末端からの５７または１２２ヌクレオチドの欠失は、発現レベルに対して良好な影響を及ぼした。

６ヌクレオチドプレ開始配列の欠失は、ルシフェラーゼレポーターの発現レベルを低下させることも観察された。その６ヌクレオチド配列の古典的コザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）での置き換えは、有意な影響を有さなかったが、少なくとも発現は維持した。

実施例５０
この実施例は、ヤギコブウイルス（ＣＫＶ）ＩＲＥＳ、パラボウイルスＩＲＥＳ、アポデムスピコルナウイルス（ＡＰ）ＩＲＥＳ、コブウイルスＳＺＡＬ６ ＩＲＥＳ、クロヒウイルスＢ（ＣｒＶＢ）ＩＲＥＳ、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、及びＳＡＦＶ ＩＲＥＳを含む、選択されたＩＲＥＳ配列の修飾（例えば、切断）を記載する。ＩＲＥＳエレメントの配列は、配列番号３４８～３８９に提供されている。簡潔には、環状ＲＮＡ構築物を、ガウシアルシフェラーゼをコードする配列に機能可能に連結された切断されたＩＲＥＳエレメントを用いて生成した。ＨｅｐＧ２細胞を環状ＲＮＡでトランスフェクトした。上清における発光をトランスフェクションから２４及び４８時間後に評価した。発現の安定性を、２４時間の時点における発現レベルに対する４８時間時点における発現レベルの比として計算した。

図５１に示されているように、切断は、ＩＲＥＳの同一性に応じて多様な効果を有し、これは、ＩＲＥＳ間でしばしば異なる、翻訳に使用される開始メカニズム及びタンパク質因子に依存し得る。５’及び３’欠失は、例えば、ＣＫＶ ＩＲＥＳとの関連で有効に組み合わされ得る。標準的なコザック配列の付加は、いくつかの場合では、有意に発現を改善し（ＳＡＦＶにおけるＦｕｌｌ対Ｆｕｌｌ＋Ｋのように）、または発現を減弱させた（ＣＫＶにおける５ｄ４０／３ｄ１２２対５ｄ４０／３ｄ１２２＋Ｋのように）。

実施例５１
この実施例は、変異代替翻訳開始部位を含む、ＣＫ－７３９、ＡＰ－７４８、及びＰＶ－７４３ ＩＲＥＳ配列の修飾を記載する。簡潔には、環状ＲＮＡ構築物を、ガウシアルシフェラーゼをコードする配列に機能可能に連結された修飾されたＩＲＥＳエレメントを用いて生成した。ＲＮＡでの１Ｃ１Ｃ７細胞のトランスフェクションから２４及び４８時間後に上清において分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を測定した。

ＣＵＧは、最も一般的に見られる代替開始部位であるが、他の多くのものも特徴評価した。これらのトリプレットは、開始コドンの前のＩＲＥＳスキャニングトラクトに存在し得、正確なポリペプチドの翻訳に影響を及ぼし得る。配列番号３７８～３８０に提供されるＩＲＥＳ配列を用いて、４つの代替開始部位変異を生成した。図５２に示されているように、ＣＫ－７３９ ＩＲＥＳにおける代替翻訳開始部位の変異は、正確なポリペプチドの翻訳に、いくつかの例では正の、他の例では負の影響を及ぼした。全ての代替翻訳開始部位の変異は、翻訳のレベルを低下させた。

開始コドンの前の６ヌクレオチドの代替コザック配列も発現レベルに影響を及ぼし得る。開始コドンの上流の６ヌクレオチド配列は、ＣＫ－７３９ ＩＲＥＳ及び「６ｎｔプレ開始」群における試料番号１～５においてそれぞれ、ｇＴｃａｃＧ、ａａａｇｔｃ、ｇＴｃａｃＧ、ｇｔｃａｔｇ、ｇｃａａａｃ、及びａｃａａｃｃであった。図５２に示されているように、開始コドンの前の所定の６ヌクレオチド配列の置換は、翻訳に影響を及ぼした。

ＡＰ－７４８及びＰＶ－７４３ ＩＲＥＳ配列における５’及び３’末端欠失が発現を減少させたことも観察された。しかしながら、長いスキャニングトラクトを有していたＣＫ－７３９ ＩＲＥＳでは、翻訳は、スキャニングトラクトにおける欠失によって比較的影響を受けなかった。

実施例５２
この実施例は、５’及び／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を挿入し、ＩＲＥＳハイブリッドを生成することによる選択されたＩＲＥＳ配列の修飾を記載する。簡潔には、環状ＲＮＡ構築物を、ガウシアルシフェラーゼをコードする配列に機能可能に連結された修飾されたＩＲＥＳエレメントを用いて生成した。ＲＮＡでのＨｅｐＧ２細胞のトランスフェクションから２４及び４８時間後に上清において分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を測定した。

挿入されたＵＴＲを有するＩＲＥＳ配列は、配列番号３９０～４０１に提供されている。図５３に示されているように、ＩＲＥＳの３’末端の直後かつ開始コドンの前の５’ＵＴＲの挿入は、ヤギコブウイルス（ＣＫ）ＩＲＥＳからの翻訳をわずかに増加させたが、いくつかの例では、サリウイルスＳＺ１ ＩＲＥＳからの翻訳を阻害した。終止カセットの直後の３’ＵＴＲの挿入は、いずれのＩＲＥＳ配列にも影響を有さなかった。

ハイブリッドＣＫ ＩＲＥＳ配列は、配列番号３９０～４０１に提供されている。ＣＫ ＩＲＥＳをベースとして使用し、ＣＫ ＩＲＥＳの特定の領域を、他のＩＲＥＳ配列、例えば、ＳＺ１及びＡＶ（アイチウイルス）からの同様の外観の構造で置き換えた。図５３に示されているように、所定のハイブリッド合成ＩＲＥＳ配列は機能的であり、ハイブリッドＩＲＥＳが、同様の予測される構造を示す異なるＩＲＥＳ配列に由来する部分を使用して構築され得る一方で、これらの構造の欠失はＩＲＥＳ機能を完全に停止させたことを示している。

実施例５３
この実施例は、終止コドンまたはカセットバリアントを導入することによる環状ＲＮＡの修飾を記載する。簡潔には、環状ＲＮＡ構築物を、ガウシアルシフェラーゼをコードする配列に機能可能に連結されたＩＲＥＳエレメントと、それに続く可変終止コドンカセットを用いて生成し、その可変終止コドンカセットは、各フレームにおける終止コドン及びガウシアルシフェラーゼをコードする配列のリーディングフレームにおける２つの終始コドンを含んでいた。１Ｃ１Ｃ７細胞を環状ＲＮＡでトランスフェクトした。上清における発光をトランスフェクションから２４及び４８時間後に評価した。

終止コドンカセットの配列は、配列番号４０６～４１２に示されている。図５４に示されているように、所定の終止コドンカセットは、発現レベルを改善したが、それらは、発現安定性に対してほとんど影響を有さなかった。特に、２つのフレーム１（ガウシアルシフェラーゼをコードする配列のリーディングフレーム）終止コドン（１つ目はＴＡＡである）と、それに続くフレーム２終止コドン及びフレーム３終止コドンを有する終止カセットは、機能的翻訳を促進するのに有効である。

実施例５４
この実施例は、５’ＵＴＲバリアント挿入することによる環状ＲＮＡの修飾を記載する。簡潔には、環状ＲＮＡ構築物を、ＩＲＥＳの３’末端と開始コドンとの間に挿入された５’ＵＴＲバリアントを有するＩＲＥＳエレメントを用いて生成した（ＩＲＥＳは、ガウシアルシフェラーゼをコードする配列に機能可能に連結されている）。１Ｃ１Ｃ７細胞を環状ＲＮＡでトランスフェクトした。上清における発光をトランスフェクションから２４及び４８時間後に評価した。

５’ＵＴＲバリアントの配列は、配列番号４０２～４０５に示されている。図５５に示されているように、標準コザック配列（ＵＴＲ４）を有するＣＫ ＩＲＥＳは、３６ヌクレオチドの非構造化／低ＧＣスペーサー配列が付加された場合（ＵＴＲ２）、より有効であり、ＧＣリッチのコザック配列が、コアのＩＲＥＳの折り畳みと干渉し得ることを示唆している。コザック配列を有するより高いＧＣ／構造化スペーサーを使用すると、同じ利益を示さず（ＵＴＲ３）、これはおそらく、スペーサー自体によるＩＲＥＳの折り畳みとの干渉に起因する。コザック配列のｇＴｃａｃＧへの変異（ＵＴＲ１）は、スペーサーを必要とせずにコザック＋スペーサー代替物と同じレベルまで翻訳を向上させた。

実施例５５
この実施例は、発現レベルに対する環状ＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ標的部位の影響を記載する。簡潔には、環状ＲＮＡ構築物を、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードする配列に機能可能に連結されたＩＲＥＳエレメントを用いて生成し、２つのタンデムｍｉＲ－１２２標的部位が構築物に挿入された。ｍｉＲ－１２２を発現するＨｕｈ７細胞に環状ＲＮＡをトランスフェクトした。上清中のｈＥＰＯ発現を、トランスフェクションの２４時間後及び４８時間後にサンドイッチＥＬＩＳＡによって評価した。

図５６に示されているように、ｈＥＰＯ発現レベルは、ｍｉＲ－１２２標的部位が環状ＲＮＡに挿入された場合に阻止された。この結果は、環状ＲＮＡからの発現がｍｉＲＮＡによって制御され得ることを実証している。このように、細胞タイプまたは組織特異的発現は、組換えタンパク質の発現が望ましくない細胞タイプにおいて発現するｍｉＲＮＡの標的部位を組み込むことによって達成され得る。

実施例５６
実施例５６Ａ：２Ａ部位及び機能的ＲＮＡ安定性を含む１つのｃｉｒｃＲＮＡからの２つのタンパク質の発現。
アナベナイントロン／エクソン領域、様々なＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼをコードする第１の発現配列、２Ａ自己切断ペプチド、及びＧＦＰまたはＥＧＦＰをコードする第２の発現配列を含む構築物を環状化する。２０，０００～４０，０００個の２９３細胞に４０ｎｇのｃｉｒｃＲＮＡをトランスフェクトした。上清中の分泌ガウシアルシフェラーゼからの発光を、各時点で培地を完全に交換したトランスフェクション後、２４時間毎に測定した。トランスフェクションの２４時間後に、発現したＧＦＰまたはＥＧＦＰからの蛍光を測定した。

実施例５６Ｂ：２つのＩＲＥＳ配列及び機能的ＲＮＡ安定性を含む１つのｃｉｒｃＲＮＡからの２つのタンパク質の発現。
アナベナイントロン／エクソン領域、第１のＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼをコードする第１の発現配列、任意でスペーサー、第２のＩＲＥＳ、及びＧＦＰまたはＥＧＦＰをコードする第２の発現配列を含む構築物であり、第１のＩＲＥＳ及び／または第２のＩＲＥＳが構築物によって変化する構築物を環状化する。２９３細胞を、１μｇの各環状化反応物でエレクトロポレーションした。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼ及びＧＦＰまたはＥＧＦＰからの発光／蛍光を、エレクトロポレーションした後２４時間で測定した。各ラウンドのエレクトロポレーションした２９３細胞におけるＩＲＥＳ構築物の機能安定性を、３日間にわたって測定した。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼ及びＧＦＰまたはＥＧＦＰからの発光／蛍光を、細胞を１μｇの各環状化反応物でエレクトロポレーションした後２４時間毎に測定し、その後完全に培地を交換した。

実施例５７
切断部位によって分離された２つの発現配列を含む環状及び直鎖状ＲＮＡの発現及び機能安定性。
アナベナイントロン／エクソン領域、ガウシアルシフェラーゼをコードする第１の発現配列、２Ａ自己切断ペプチド、ＧＦＰまたはＥＧＦＰをコードする発現配列を含む構築物を環状化した。ガウシアルシフェラーゼをコードする第１の発現配列、２Ａ自己切断ペプチド、ＥＧＦＰをコードする第２の発現配列、約１５０ｎｔのポリＡテールをコードし、１００％のウリジンを１－メチルシュードウリジンに置き換えるように修飾されたｍＲＮＡを産生した。環状及び修飾ｍＲＮＡの発現を、２９３細胞において測定した。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼ及びＧＦＰまたはＥＧＦＰからの発光／蛍光を、細胞を１μｇの各ＲＮＡ種でエレクトロポレーションした後２４時間で測定した。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼ及びＧＦＰまたはＥＧＦＰからの発光／蛍光を、構築物の機能安定性を比較するために、エレクトロポレーション後２４時間毎に３日間にわたって測定した。

実施例５８
実施例５８Ａ：単一発現構築物による二重発現の発現及び機能安定性の比較。
アナベナイントロン／エクソン領域、ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、２Ａ自己切断ペプチド、及びＧＦＰまたはＥＧＦＰ発現配列を含む構築物を環状化した。単一発現配列（ガウシアルシフェラーゼまたはＧＦＰまたはＥＧＦＰをコードする）を含む構築物もまた環状化した。単一発現配列（ガウシアルシフェラーゼまたはＧＦＰまたはＥＧＦＰをコードする）を含む直鎖状構築物もまた生成する。２９３細胞を、１μｇの各環状化反応物または等量の直鎖状ＲＮＡでエレクトロポレーションした。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼ及びＧＦＰまたはＥＧＦＰ陽性からの蛍光を、エレクトロポレーションした後２４時間で測定した。

各ラウンドのエレクトロポレーションした２９３細胞における構築物の機能安定性を、３日間にわたって測定した。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を、細胞を１μｇの各環状化反応物または同等のｍＲＮＡでエレクトロポレーションした後２４時間毎に測定し、その後完全に培地を交換した。

実施例５８Ｂ：単一発現構築物による二重発現の発現及び機能安定性の比較。
アナベナのイントロン／エクソン領域、第１のＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ発現配列、第２のＩＲＥＳ、及びＧＦＰまたはＥＧＦＰ発現配列を含む構築物を環状化した。単一発現配列（ガウシアルシフェラーゼまたはＧＦＰまたはＥＧＦＰをコードする）を含む構築物もまた環状化した。単一発現配列（ガウシアルシフェラーゼまたはＧＦＰまたはＥＧＦＰをコードする）を含む直鎖状構築物もまた生成する。２９３細胞を、１μｇの各環状化反応物または等量の直鎖状ＲＮＡでエレクトロポレーションした。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼ及びＧＦＰまたはＥＧＦＰ陽性からの蛍光を、エレクトロポレーションした後２４時間で測定した。

各ラウンドのエレクトロポレーションした２９３細胞における構築物の機能安定性を、３日間にわたって測定した。上清中の分泌されたガウシアルシフェラーゼからの発光を、細胞を１μｇの各環状化反応物または同等のｍＲＮＡでエレクトロポレーションした後２４時間毎に測定し、その後完全に培地を交換した。

実施例５９
実施例５９Ａ：ＩＲＥＳと切断部位を使用して発現されるＴＣＲペイロードとの間の機能的相互作用。
アナベナイントロン／エクソン領域、ＩＲＥＳ、ＴＣＲアルファ鎖発現配列、２Ａ自己切断ペプチド、及びＴＣＲベータ鎖発現配列を含む構築物を環状化した。

ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ｃｉｒｃＲＮＡでエレクトロポレーションし、ＴＣＲ標的、ＧＦＰ、及びホタルルシフェラーゼを安定して発現する細胞と２４時間共培養した。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、モックエレクトロポレーションし、対照として共培養した。標的細胞の特異的溶解の定量化を、ホタル発光の検出によって決定した。特異的溶解％を、１－［ＴＣＲ条件発光］／［モック条件発光］として定義した。

実施例５９Ｂ：２個のＩＲＥＳを使用して発現されるＴＣＲペイロード間の機能的相互作用。
アナベナイントロン／エクソン領域、第１のＩＲＥＳ、ＴＣＲアルファ鎖発現配列、任意のスペーサー、第２のＩＲＥＳ、及びＴＣＲベータ鎖発現配列を含む構築物を環状化した。

ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ｃｉｒｃＲＮＡでエレクトロポレーションし、ＴＣＲ標的、ＧＦＰ、及びホタルルシフェラーゼを安定して発現する細胞と２４時間共培養した。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、モックエレクトロポレーションし、対照として共培養した。標的細胞の特異的溶解の定量化を、ホタル発光の検出によって決定した。特異的溶解％を、１－［ＴＣＲ条件発光］／［モック条件発光］として定義した。

実施例６０
実施例６０Ａ：ＩＲＥＳ及び切断部位を使用して発現されるＣＡＲペイロード。
アナベナイントロン／エクソン領域、ＩＲＥＳ、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現配列、２Ａ自己切断ペプチド、及び抗Ｃ２０ ＣＡＲ発現配列を含む構築物を環状化した。

ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ｃｉｒｃＲＮＡでエレクトロポレーションし、両ＣＡＲ標的、ＧＦＰ、及びホタルルシフェラーゼを安定して発現する細胞と２４時間共培養した。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、モックエレクトロポレーションし、対照として共培養した。標的細胞の特異的溶解の定量化を、ホタル発光の検出によって決定した。特異的溶解％を、１－［ＴＣＲ条件発光］／［モック条件発光］として定義した。

実施例６０Ｂ：２個のＩＲＥＳを使用して発現されるＴＣＲペイロード。
アナベナイントロン／エクソン領域、第１のＩＲＥＳ、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現配列、任意のスペーサー、第２のＩＲＥＳ、及び抗ＣＤ２０ ＣＡＲ発現配列を含む構築物を環状化した。

ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ｃｉｒｃＲＮＡでエレクトロポレーションし、両ＣＡＲ標的、ＧＦＰ、及びホタルルシフェラーゼを安定して発現する細胞と２４時間共培養した。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、モックエレクトロポレーションし、対照として共培養した。標的細胞の特異的溶解の定量化を、ホタル発光の検出によって決定した。特異的溶解％を、１－［ＴＣＲ条件発光］／［モック条件発光］として定義した。

実施例６１
抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含むＬＮＰ及び環状ＲＮＡ構築物は、インビボで血液及び脾臓におけるＢ細胞を低減する。
抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現をコードする環状ＲＮＡ構築物を、上述したように脂質ナノ粒子内に封入した。比較のため、ルシフェラーゼ発現をコードする環状ＲＮＡを別の脂質ナノ粒子内に封入した。

６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１日おきにいずれかのＬＮＰ溶液を注射し、各マウス内に合計４回のＬＮＰ注射を行った。最後のＬＮＰ注射から２４時間後、マウスの脾臓及び血液を採取し、染色し、フローサイトメトリーを介して分析した。図５７Ａ及び図５７Ｂに示されるように、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするＬＮＰ－環状ＲＮＡ構築物を含むマウスは、ルシフェラーゼをコードするＬＮＰ－環状ＲＮＡで処理したマウスと比較して、末梢血及び脾臓におけるＣＤ１９＋Ｂ細胞の統計的に有意な減少をもたらした。

実施例６２
ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡ内に含まれるＩＲＥＳ配列は、ＣＡＲ発現及びＴ細胞の細胞毒性を改善する。
活性化されたネズミＴ細胞を、固有のＩＲＥＳ及びマウス抗ＣＤ１９ １Ｄ３ζ ＣＡＲ発現配列を含む２００ｎｇの環状ＲＮＡ構築物でエレクトロポレーションした。これらの構築物に含まれるＩＲＥＳは、全体的または部分的に、ヤギコブウイルス、アポデムスピコルナウイルス、パラボウイルス、またはサリウイルスのいずれかに由来した。ヤギコブウイルス由来ＩＲＥＳをさらにコドン最適化した。対照として、ＩＲＥＳを有しない野生型ゼータマウスＣＡＲを含む環状ＲＮＡを比較のために使用した。Ｔ細胞を、エレクトロポレーションの２４時間後にＣＤ－１９ ＣＡＲについて染色して表面発現を評価し、次いでＡ２０ Ｆｌｕｃ標的細胞と共培養した。次いで、Ｔ細胞を標的細胞と共培養した２４時間後のＦｌｕｃ＋Ａ２０細胞の細胞傷害性殺傷についてアッセイを評価した。

図５８Ａ、５８Ｂ、５８Ｃ、及び５９に見られるように、固有のＩＲＥＳは、Ｔ細胞がＣＡＲタンパク質を発現する頻度及び細胞の表面でのＣＡＲ発現のレベルを増加させることができた。細胞表面でのＣＡＲタンパク質の発現頻度及びＣＡＲ発現レベルの増加は、改善された抗腫瘍応答をもたらす。

実施例６３
初代ヒトＴ細胞において環状ＲＮＡ構築物から発現した細胞質及び表面タンパク質。
環状ＲＮＡ構築物は、蛍光細胞質レポーターまたは表面抗原レポーターのいずれかをコードする配列が含まれた。蛍光レポーターには、緑色蛍光タンパク質、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｔｓａｐｐｈｉｒｅが含まれた。表面レポーターには、ＣＤ５２及びＴｈｙ１．１^ｂｉｏが含まれた。初代ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で活性化し、レポーター配列を含む環状ＲＮＡの活性化の６日後にエレクトロポレーションした。Ｔ細胞を収集し、エレクトロポレーションの２４時間後にフローサイトメトリーで分析した。表面抗原は、市販の抗体（例えば、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、及びＢＤ）で染色した。

図６０Ａ及び図６０Ｂに見られるように、細胞質及び表面タンパク質は、初代ヒトＴ細胞内のタンパク質をコードする環状ＲＮＡから発現することができる。

実施例６４
固有のＩＲＥＳ配列を含有する環状ＲＮＡは、直鎖状ｍＲＮＡよりも改善された翻訳発現を有する。
環状ＲＮＡ構築物は、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）の発現配列とともに、固有のＩＲＥＳが含まれた。

２人のドナー由来のヒトＴ細胞を濃縮し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で刺激した。数日間の増殖後、活性化Ｔ細胞を採取し、等モルのｍＲＮＡまたはＦＬｕｃペイロードを発現する環状ＲＮＡのいずれかでエレクトロポレーションした。ヤギコブウイルス、アポデムスピコルナウイルス、及びパラボウイルスに由来するものを含む様々なＩＲＥＳ配列を研究し、７日間にわたるペイロード発現レベル及び耐久性を評価した。７日間にわたって、Ｔ細胞をＰｒｏｍｅｇａ Ｂｒｉｇｈｔｇｌｏで溶解して、生物発光について評価した。

図６１Ｃ、６１Ｄ、６１Ｅ、６１Ｆ、及び６１Ｇに示されるように、環状ＲＮＡ内のＩＲＥＳの存在は、細胞質タンパク質の翻訳及び発現を数桁増加させることができ、直鎖状ｍＲＮＡと比較して発現を改善することができる。これは、複数のヒトＴ細胞ドナーにわたって一致することが見出された。

実施例６５
実施例６５Ａ：抗ＣＤ１９をコードするＬＮＰ環状ＲＮＡは、Ｋ５６２細胞のヒトＴ細胞死を媒介する。
環状ＲＮＡ構築物は、抗ＣＤ１９抗体をコードする配列が含まれた。次に、環状ＲＮＡ構築物を脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入した。

ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で刺激し、例えば、最大６日間増殖させた。６日目に、ＬＮＰ環状ＲＮＡ及びＡｐｏＥ３（１μｇ／ｍＬ）をＴ細胞と共培養してトランスフェクションを媒介した。２４時間後、Ｆｌｕｃ＋Ｋ５６２細胞を、抗ＣＤ１９抗体をコードする２００ｎｇの環状ＲＮＡでエレクトロポレーションした後に７日目に共培養した。共培養から４８時間後、アッセイをＦｌｕｃ発現を通じてＫ５６２細胞のＣＡＲ発現及び細胞傷害性殺傷について評価した。

図６２Ａ及び図６２Ｂに示されているように、Ｔ細胞へのインビトロでのＣＡＲのＬＮＰ媒介送達からの抗ＣＤ１９ ＣＡＲのＴ細胞発現、及び操作Ｋ５６２細胞において特異的な抗原依存的な方法で腫瘍細胞を溶解するその能力が存在する。

実施例６５Ｂ：抗ＢＣＭＡ抗体をコードするＬＮＰ環状ＲＮＡは、Ｋ５６２細胞のヒトＴ細胞死を媒介する。
環状ＲＮＡ構築物は、抗ＢＣＭＡ抗体をコードする配列が含まれた。次に、環状ＲＮＡ構築物を脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入した。

ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で刺激し、例えば、最大６日間増殖させた。６日目に、ＬＮＰ環状ＲＮＡ及びＡｐｏＥ３（１μｇ／ｍＬ）をＴ細胞と共培養してトランスフェクションを媒介した。２４時間後、Ｆｌｕｃ＋Ｋ５６２細胞を、抗ＢＣＭＡ抗体をコードする２００ｎｇの環状ＲＮＡでエレクトロポレーションした後に７日目に共培養した。共培養から４８時間後、アッセイをＦｌｕｃ発現を通じてＫ５６２細胞のＣＡＲ発現及び細胞傷害性殺傷について評価した。

図６２Ｂに示されているように、Ｔ細胞へのインビトロでのＣＡＲのＬＮＰ媒介送達からの抗ＢＣＭＡ ＣＡＲのＴ細胞発現、及び操作Ｋ５６２細胞において特異的な抗原依存的な方法で腫瘍細胞を溶解するその能力が存在する。

実施例６６
抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、インビトロで抗腫瘍活性を示す。
ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で活性化し、２００ｎｇの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現環状ＲＮＡで１回エレクトロポレーションした。エレクトロポレーションしたＴ細胞を、ＦＬｕｃ＋Ｎａｌｍ６標的細胞及び非標的Ｆｌｕｃ＋Ｋ５６２細胞と共培養して、ＣＡＲ媒介死滅を評価した。共培養の２４時間後、Ｔ細胞を溶解し、標的及び非標的細胞による残存ＦＬｕｃ発現を調査し、合計８日間にわたる発現及び発現の安定性を評価した。

図６３Ａ及び６３Ｂに示されるように、Ｔ細胞は、抗原依存的に特異的に環状ＲＮＡ ＣＡＲ構築物を発現する。結果は、ＣＡＲをコードする直鎖状ｍＲＮＡと比較して、ＣＡＲをコードする環状ＲＮＡの細胞傷害性の改善、及び機能的な表面受容体の送達も示す。

実施例６７
ＡｐｏＥ３を介した環状ＲＮＡの効果的なＬＮＰトランスフェクション
ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で刺激し、例えば、最大６日間増殖させた。６日目に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、及びＡｐｏＥ３（１μｇ／ｍＬ）を含むまたは含まずに緑色蛍光タンパク質溶液を発現する環状ＲＮＡをＴ細胞と共培養した。２４時間後、Ｔ細胞を生／死Ｔ細胞について染色し、生Ｔ細胞をフローサイトメーターでＧＦＰ発現について分析した。

図６４Ａ、６４Ｂ、６１Ｃ、６１Ｄ、及び６４Ｅに示されるように、効率的なＬＮＰトランスフェクションは、活性化されたＴ細胞上でＡｐｏＥ３によって媒介され、その後に有意なペイロード発現が続き得る。これらの結果は、複数のドナーにわたって示された。

参照による組み込み
この本明細書に言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、明確かつ個別に参照により本明細書に組み込まれることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (126)

1. 環状ＲＮＡポリヌクレオチドであって、以下の順序で、スプライシング後３’グループＩイントロンフラグメント、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、第１の発現配列、第２の発現配列、及びスプライシング後５’グループＩイントロンフラグメントを含む、前記環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
2. 前記第１の発現配列と前記第２の発現配列との間の切断部位をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
3. 前記切断部位が、自己切断スペーサーである、請求項２に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
4. 前記自己切断スペーサーが、２Ａ自己切断ペプチドである、請求項３に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
5. 前記第１の発現配列と前記第２の発現配列との間に第２のＩＲＥＳを含む、請求項１に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
6. 前記第１のＩＲＥＳが、配列番号１～７２のいずれかの配列からなるか、またはそれを含む、請求項５に記載の環状ＲＮＡ。
7. 前記第２のＩＲＥＳが、配列番号１～７２のいずれかの配列からなるか、またはそれを含む、請求項５または６に記載の環状ＲＮＡ。
8. 前記第１の発現配列が、第１の治療用タンパク質をコードし、前記第２の発現配列が、第２の治療用タンパク質をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
9. 前記第１の発現配列または前記第２の発現配列が、抗体をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
10. 前記第１の発現配列または前記第２の発現配列が、キメラ抗原受容体をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
11. 前記第１の発現配列または前記第２の発現配列が、転写因子をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
12. 前記第１の発現配列または前記第２の発現配列が、サイトカインをコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
13. 前記第１の発現配列または前記第２の発現配列が、免疫阻害分子をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
14. 前記第１の発現配列または前記第２の発現配列が、共刺激分子のアゴニストをコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
15. 前記第１の発現配列または前記第２の発現配列が、免疫チェックポイント分子の阻害剤をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
16. 前記第１の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖をコードし、前記第２の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のベータ鎖をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
17. 前記第１の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のベータ鎖をコードし、前記第２の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
18. 前記第１の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のガンマ鎖をコードし、前記第２の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のデルタ鎖をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
19. 前記第１の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のデルタ鎖をコードし、前記第２の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のガンマ鎖をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
20. 前記第１の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードし、前記第２の発現配列が、サイトカインをコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
21. 前記第１の発現配列が、サイトカインをコードし、前記第２の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
22. 前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１５から選択される、請求項２０～２１のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
23. 前記第１の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードし、前記第２の発現配列が、ケモカインをコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
24. 前記第１の発現配列が、ケモカインをコードし、前記第２の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
25. 前記第１の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードし、前記第２の発現配列が、転写因子をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
26. 前記第１の発現配列が、転写因子をコードし、前記第２の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
27. 前記転写因子が、ＦＯＸＰ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＨＥＬＩＯＳ、Ｔｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＲＯＲｇｔ、及びｃｄ２５から選択される、請求項２５～２６のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
28. 前記第１の発現配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、前記第２の発現配列が、ＰＤ１またはＰＤＬ１アンタゴニストをコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
29. 前記第１の発現配列が、ＰＤ１またはＰＤＬ１アンタゴニストをコードし、前記第２の発現配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
30. 前記第１の発現配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、前記第２の発現配列が、サイトカインをコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
31. 前記第１の発現配列が、サイトカインをコードし、前記第２の発現配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
32. 前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１５から選択される、請求項３０～３１のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
33. 前記第１の発現配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、前記第２の発現配列が、ケモカインをコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
34. 前記第１の発現配列が、ケモカインをコードし、前記第２の発現配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
35. 前記第１の発現配列が、転写因子をコードし、前記第２の発現配列が、サイトカインをコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
36. 前記第１の発現配列が、サイトカインをコードし、前記第２の発現配列が、転写因子をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
37. 前記転写因子が、ＦＯＸＰ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＨＥＬＩＯＳ、Ｔｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＲＯＲｇｔ、及びｃｄ２５から選択される、請求項３５～３６のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
38. 前記サイトカインが、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、及びＴＧＦβから選択される、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
39. 前記第１の発現配列が、転写因子をコードし、前記第２の発現配列が、ケモカインをコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
40. 前記第１の発現配列が、ケモカインをコードし、前記第２の発現配列が、転写因子をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
41. 前記転写因子が、ＦＯＸＰ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、及びＨＥＬＩＯＳから選択される、請求項３９～４０のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡ。
42. 前記ケモカインが、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、Ｃケモカイン、またはＣＸ３Ｃケモカインである、請求項３９～４１のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
43. 前記ケモカインが、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９／ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＬＣ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、及びＣＸ３ＣＬ１から選択される、請求項３９～４２のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
44. 前記第１の発現配列が、腫瘍抗原をコードし、前記第２の発現配列が、サイトカインをコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
45. 前記第１の発現配列が、サイトカインをコードし、前記第２の発現配列が、腫瘍抗原をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
46. 前記抗原が、新生抗原である、請求項４４～４５のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
47. 前記サイトカインが、ＩＦＮγである、請求項４４～４６のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
48. 前記第１の発現配列が、ＣＡＲをコードし、前記第２の発現配列が、ＣＡＲをコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
49. 前記第１の発現配列が、サイトカインをコードし、前記第２の発現配列が、サイトカインをコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
50. 前記第１または第２の発現配列が、ＩＬ－１０、ＴＧＦβ、及びＩＬ－３５から選択されるサイトカインをコードする、請求項４９に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
51. 前記第１または第２の発現配列が、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８から選択されるサイトカインをコードする、請求項４９～５０のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
52. 前記第１の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードし、前記第２の発現配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
53. 前記第１の発現配列が、ケモカインをコードし、前記第２の発現配列が、ケモカインをコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
54. 前記第１または第２の発現配列が、免疫抑制酵素をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
55. 前記第１の発現配列が、律速酵素をコードし、前記第２の発現配列が、フラックス制限酵素をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
56. 前記第１の発現配列が、フラックス制限酵素をコードし、前記第２の発現配列が、律速酵素をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
57. 前記第１の発現配列が、転写因子をコードし、前記第２の発現配列が、生存因子をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
58. 前記第１の発現配列が、生存因子をコードし、前記第２の発現配列が、転写因子をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
59. 前記転写因子が、ＦＯＸＰ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＨＥＬＩＯＳ、Ｔｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＲＯＲｇｔ、及びｃｄ２５から選択される、請求項５７～５８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
60. 前記生存因子が、ＢＣＬ－ＸＬから選択される、請求項５７～５９のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
61. 前記第１または第２の発現配列が、シャペロンタンパク質または複合体をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
62. 前記第１の発現配列が、転写因子をコードし、前記第２の発現配列が、シャペロンタンパク質または複合体をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
63. 前記第１の発現配列が、シャペロンタンパク質または複合体をコードし、前記第２の発現配列が、転写因子をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
64. 前記シャペロンタンパク質または複合体が、Ｓｋｐ、Ｓｐｙ、ＦｋｐＡ、ＳｕｒＡ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、Ｈｓｐ９０、ＨｔｐＧ、Ｈｓｐ１００、ＣｌｐＡ、ＣｌｐＸ、ＣｌｐＰ、及びＨｓｐ１０４から選択される、請求項６１～６３のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
65. 前記転写因子が、ＦＯＸＰ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＨＥＬＩＯＳ、Ｔｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＲＯＲｇｔ、及びｃｄ２５から選択される、請求項６１～６４のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
66. 一方または両方の発現配列が、シグナル伝達タンパク質をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
67. 前記第１の発現配列が、酵素をコードし、前記第２の発現が、前記第１の発現配列の負の制御性阻害剤をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
68. 前記第１の発現配列が、前記第２の発現配列にコードされる酵素の負の制御性阻害剤タンパク質をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
69. 前記負の制御性阻害剤が、ｐ５７ｋｉｐ２、ＢＡＸ阻害剤、及びＴＩＰＥ２から選択される、請求項６７～６８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
70. 前記第１の発現配列が、ドミナントネガティブタンパク質をコードし、前記第２の発現配列が、免疫タンパク質をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
71. 前記第１の発現配列が、免疫タンパク質をコードし、前記第２の発現配列が、ドミナントネガティブタンパク質をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
72. 前記第１または第２の発現配列が、抗炎症タンパク質をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
73. 前記第１の発現配列が、転写因子をコードし、前記第２の発現配列が、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）を５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）に変換することができる、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
74. 前記第１の発現配列が、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）を５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）に変換することができ、前記第２の発現配列が、転写因子である、請求項１～８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
75. 前記５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）を５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）に変換することできる発現配列が、シトシンデアミナーゼである、請求項７３～７４のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
76. ５’二重鎖形成領域と前記スプライシング後３’グループＩイントロンフラグメントとの間の第１のスペーサー、及び前記スプライシング後５’グループＩイントロンフラグメントと３’二重鎖形成領域との間の第２のスペーサーを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
77. 前記第１及び第２のスペーサーが、各々、約１０～約６０ヌクレオチドの長さを有する、請求項７６に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
78. 前記第１及び第２の二重鎖形成領域が、各々、約９～約１９ヌクレオチドの長さを有する、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
79. 前記第１及び第２の二重鎖形成領域が、各々、約３０ヌクレオチドの長さを有する、請求項７７～７８のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
80. 前記ＩＲＥＳが、タウラ症候群ウイルス、トリアトーマウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、シミアンウイルス４０、ヒアリ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ）ウイルス１、ムギクビレアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉ）ウイルス、細網内皮症ウイルス、ヒトポリオウイルス１、チャバネアオカメムシ（Ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ）腸ウイルス、カシミールハチウイルス、ヒトライノウイルス２、ホマロディスカ・コアグラタ（Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ ｃｏａｇｕｌａｔａ）ウイルス－１、ヒト免疫不全ウイルス１型、ホマロディスカ・コアグラタウイルス－１、ヒメトビＰウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ＧＢ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒトエンテロウイルス７１、ウマ鼻炎ウイルス、ウスジロエダシャク（Ｅｃｔｒｏｐｉｓ ｏｂｌｉｑｕａ）ピコルナ様ウイルス、脳心筋炎ウイルス、ショウジョウバエＣウイルス、ヒトコクサッキーウイルスＢ３、アブラナ科トバモウイルス、コオロギ麻痺ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス１、黒色女王蜂児ウイルス、アブラムシ致死麻痺ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、急性ミツバチ麻痺ウイルス、ハイビスカス退緑輪点ウイルス、古典的ブタ熱ウイルス、ヒトＦＧＦ２、ヒトＳＦＴＰＡ１、ヒトＡＭＬ１／ＲＵＮＸ１、ショウジョウバエアンテナペディア、ヒトＡＱＰ４、ヒトＡＴ１Ｒ、ヒトＢＡＧ－１、ヒトＢＣＬ２、ヒトＢｉＰ、ヒトｃ－ＩＡＰｌ、ヒトｃ－ｍｙｃ、ヒトｅＩＦ４Ｇ、マウスＮＤＳＴ４Ｌ、ヒトＬＥＦ１、マウスＨＩＦ１アルファ、ヒトｎ．ｍｙｃ、マウスＧｔｘ、ヒトｐ２７ｋｉｐｌ、ヒトＰＤＧＦ２／ｃ－ｓｉｓ、ヒトｐ５３、ヒトＰｉｍ－１、マウスＲｂｍ３、ショウジョウバエ リーパー（ｒｅａｐｅｒ）、イヌ スキャンパー（Ｓｃａｍｐｅｒ）、ショウジョウバエＵｂｘ、ヒトＵＮＲ、マウスＵｔｒＡ、ヒトＶＥＧＦ－Ａ、ヒトＸＩＡＰ、ショウジョウバエ ヘアレス（ｈａｉｒｌｅｓｓ）、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＦＩＩＤ、出芽酵母ＹＡＰ１、タバコエッチウイルス、カブクリンクルウイルス、ＥＭＣＶ－Ａ、ＥＭＣＶ－Ｂ、ＥＭＣＶ－Ｂｆ、ＥＭＣＶ－Ｃｆ、ＥＭＣＶ ｐＥＣ９、ピコビルナウイルス、ＨＣＶ ＱＣ６４、ヒトコサウイルスＥ／Ｄ、ヒトコサウイルスＦ、ヒトコサウイルスＪＭＹ、ライノウイルスＮＡＴ００１、ＨＲＶ１４、ＨＲＶ８９、ＨＲＶＣ－０２、ＨＲＶ－Ａ２１、サリウイルスＡ ＳＨ１、サリウイルスＦＨＢ、サリウイルスＮＧ－Ｊ１、ヒトパレコウイルス１、クロヒウイルスＢ、Ｙｃ－３、ロザウイルスＭ－７、シャンバウイルスＡ、パシウイルスＡ、パシウイルスＡ ２、エコーウイルスＥ１４、ヒトパレコウイルス５、アイチウイルス、Ａ型肝炎ウイルスＨＡ１６、フォピウイルス、ＣＶＡ１０、エンテロウイルスＣ、エンテロウイルスＤ、エンテロウイルスＪ、ヒトペギウイルス２、ＧＢＶ－Ｃ ＧＴ１１０、ＧＢＶ－Ｃ Ｋ１７３７、ＧＢＶ－Ｃ Ｉｏｗａ、ペギウイルスＡ １２２０、パシウイルスＡ ３、サペロウイルス、ロザウイルスＢ、バクンサ（Ｂａｋｕｎｓａ）ウイルス、トレモウイルスＡ、ブタパシウイルス１、ＰＬＶ－ＣＨＮ、パシウイルスＡ、シシニウイルス、ヘパシウイルスＫ、ヘパシウイルスＡ、ＢＶＤＶ１、ボーダー病ウイルス、ＢＶＤＶ２、ＣＳＦＶ－ＰＫ１５Ｃ、ＳＦ５７３ジシストロウイルス、フーペイピコルナ様ウイルス、ＣＲＰＶ、サリウイルスＡ ＢＮ５、サリウイルスＡ ＢＮ２、サリウイルスＡ ０２３９４、サリウイルスＡ ＧＵＴ、サリウイルスＡ ＣＨ、サリウイルスＡ ＳＺ１、サリウイルスＦＨＢ、ＣＶＢ３、ＣＶＢ１、エコーウイルス７、ＣＶＢ５、ＥＶＡ７１、ＣＶＡ３、ＣＶＡ１２、ＥＶ２４、またはｅＩＦ４Ｇに対するアプタマーからのＩＲＥＳの配列を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
81. 天然ヌクレオチドからなる、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
82. 前記発現配列が、コドン最適化されている、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
83. 同等の最適化前ポリヌクレオチドに存在する少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠くように最適化されている、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
84. 同等の最適化前ポリヌクレオチドに存在する少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ感受性部位を欠くように最適化されている、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
85. 同等の最適化前ポリヌクレオチドに存在する少なくとも１つのＲＮＡ編集感受性部位を欠くように最適化されている、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
86. 約１００ヌクレオチド～約１５キロベースの長さである、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
87. 少なくとも約２０時間の、ヒトにおけるインビボでの治療効果の持続期間を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
88. 少なくとも約２０時間の機能的半減期を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
89. 同じ発現配列を含む同等の直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドのものよりも長いかそれと同じ、ヒト細胞における治療効果の持続期間を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
90. 同じ発現配列を含む同等の直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドのものよりも長いかそれと同じ、ヒト細胞における機能的半減期を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
91. 同じ発現配列を有する同等の直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドのものよりも長い、ヒトにおけるインビボでの治療効果の持続期間を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
92. 同じ発現配列を有する同等の直鎖状ＲＮＡポリヌクレオチドのものよりも長い、ヒトにおけるインビボでの機能的半減期を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド。
93. 先行請求項のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド、ナノ粒子、及び任意で、前記ナノ粒子と作動可能に接続されたターゲティング部分を含む、薬学的組成物。
94. 前記ナノ粒子が、脂質ナノ粒子、コア・シェルナノ粒子、生分解性ナノ粒子、生分解性脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、または生分解性ポリマーナノ粒子である、請求項９３に記載の薬学的組成物。
95. ターゲティング部分を含み、前記ターゲティング部分が、細胞単離または精製なしで、選択された細胞集団または組織のうちの選択された細胞への受容体媒介エンドサイトーシスまたは直接融合を媒介する、請求項９３または９４に記載の薬学的組成物。
96. 前記ナノ粒子と作動可能に接続されたターゲティング部分を含む、請求項９３～９５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
97. 前記ターゲティング部分が、ｓｃＦｖ、ナノボディ、ペプチド、ミニボディ、ポリヌクレオチドアプタマー、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはそれらのフラグメントである、請求項９３～９６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
98. 前記組成物における前記ポリヌクレオチドの１重量％未満が、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡスプリント、または三リン酸化ＲＮＡである、請求項９３～９７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
99. 前記薬学的組成物における前記ポリヌクレオチド及びタンパク質の１重量％未満が、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡスプリント、三リン酸化ＲＮＡ、ホスファターゼタンパク質、タンパク質リガーゼ、及びキャッピング酵素である、請求９３～９８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
100. 処置を必要とする対象を処置する方法であって、請求項１～９２のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチド、ナノ粒子、及び任意で、前記ナノ粒子と作動可能に接続されたターゲティング部分を含む治療的有効量の組成物を投与することを含む、前記方法。
101. 前記ターゲティング部分が、ｓｃＦｖ、ナノボディ、ペプチド、ミニボディ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはそれらのフラグメントである、請求項１００に記載の方法。
102. 前記ナノ粒子が、脂質ナノ粒子、コア・シェルナノ粒子、または生分解性ナノ粒子である、請求項１００～１０１のいずれか１項に記載の方法。
103. 前記ナノ粒子が、１つ以上のカチオン性脂質、イオン化可能脂質、またはポリβ－アミノエステルを含む、請求項１００～１０２のいずれか１項に記載の方法。
104. 前記ナノ粒子が、１つ以上の非カチオン性脂質を含む、請求項１００～１０３のいずれか１項に記載の方法。
105. 前記ナノ粒子が、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質、ポリグルタミン酸脂質、またはヒアルロン酸脂質を含む、請求項１００～１０４のいずれか１項に記載の方法。
106. 前記ナノ粒子が、コレステロールを含む、請求項１００～１０５のいずれか１項に記載の方法。
107. 前記ナノ粒子が、アラキドン酸またはオレイン酸を含む、請求項１００～１０６のいずれか１項に記載の方法。
108. 前記組成物が、ターゲティング部分を含み、前記ターゲティング部分が、細胞選択または精製なしで、選択された細胞集団のうちの細胞への受容体媒介エンドサイトーシスを選択的に媒介する、請求項１００～１０７のいずれか１項に記載の方法。
109. 前記ナノ粒子が、１つを超える環状ＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項１００～１０８のいずれか１項に記載の方法。
110. 前記対象が、急性リンパ性白血病；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；胞巣状横紋筋肉腫；Ｂ細胞悪性腫瘍；膀胱癌（例えば、膀胱癌腫）；骨癌；脳癌（例えば、髄芽腫）；乳癌；肛門、肛門管、または肛門直腸の癌；眼の癌；肝内胆管の癌；関節の癌；首の癌；胆嚢癌；胸膜癌；鼻、鼻腔、または中耳の癌；口腔の癌；外陰の癌；慢性リンパ性白血病；慢性骨髄性癌；結腸癌；食道癌；子宮頸癌；線維肉腫；消化管カルチノイド腫瘍；頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌）；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；腎臓癌；喉頭癌；白血病；液性腫瘍；肝臓癌；肺癌（例えば、非小細胞肺癌及び肺腺癌）；リンパ腫；中皮腫；肥満細胞腫；黒色腫；多発性骨髄腫；上咽頭癌；非ホジキンリンパ腫；Ｂ慢性リンパ球性白血病；有毛細胞白血病；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；バーキットリンパ腫；卵巣癌；膵臓癌；腹膜の癌；大網の癌；腸間膜癌；咽頭癌；前立腺癌；直腸癌；腎癌；皮膚癌；小腸癌；軟部組織癌；固形腫瘍；滑膜肉腫；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；ならびに尿管癌からなる群から選択されるがんを有する、請求項１００～１０９のいずれか１項に記載の方法。
111. 前記対象が、強皮症、バセドウ病、クローン病、シェーグレン病、多発性硬化症、橋本病、乾癬、重症筋無力症、自己免疫性多腺性内分泌不全症候群、Ｉ型糖尿病（ＴＩＤＭ）、自己免疫性胃炎、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎、大腸炎、甲状腺炎、及びヒトループスによって典型的に表される全身性自己免疫疾患から選択される自己免疫障害を有する、請求項１００～１０９のいずれか１項に記載の方法。
112. 環状ＲＮＡポリヌクレオチドを作製するためのベクターであって、以下の順序で、５’二重鎖形成領域、３’グループＩイントロンフラグメント、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、第１の発現配列、第２の発現配列、５’グループＩイントロンフラグメント、及び３’二重鎖形成領域を含む、前記ベクター。
113. 前記第１の発現配列と前記第２の発現配列との間の切断部位をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１１２に記載のベクター。
114. 前記切断部位が、自己切断スペーサーである、請求項１１２または１１３に記載のベクター。
115. 前記自己切断スペーサーが、２Ａ自己切断ペプチドである、請求項１１２～１１４のいずれか１項に記載のベクター。
116. 前記５’二重鎖形成領域と前記３’グループＩイントロンフラグメントとの間の第１のスペーサー、及び前記５’グループＩイントロンフラグメントと前記３’二重鎖形成領域との間の第２のスペーサーを含む、請求項１１２～１１５のいずれか１項に記載のベクター。
117. 前記第１及び第２のスペーサーが、各々、約５～約６０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１１２～１１６のいずれか１項に記載のベクター。
118. 前記第１及び第２のスペーサーが、各々、少なくとも５ヌクレオチドの長さの非構造化領域を含む、請求項１１２～１１７のいずれか１項に記載のベクター。
119. 前記第１及び第２のスペーサーが、各々、少なくとも７ヌクレオチドの長さの構造化領域を含む、請求項１１２～１１８のいずれか１項に記載のベクター。
120. 前記第１及び第２の二重鎖形成領域が、各々、約９～５０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１１２～１１９のいずれか１項に記載のベクター。
121. コドン最適化されている、請求項１１２～１２０のいずれか１項に記載のベクター。
122. 同等の最適化前ポリヌクレオチドに存在する少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠く、請求項１１２～１２１のいずれか１項に記載のベクター。
123. 請求項１～９２のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡポリヌクレオチドを含む、真核細胞。
124. ヒト細胞である、請求項１２３に記載の真核細胞。
125. 免疫細胞である、請求項１２４に記載の真核細胞。
126. Ｔ細胞である、請求項１２５に記載の真核細胞。

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