KR20230069042A - 원형 rna 조성물 및 방법 - Google Patents

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KR20230069042A
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KR
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circular rna
rna polynucleotide
sequence encodes
virus
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Application number
KR1020227036619A
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로버트 알렉산더 웨셀호르트
브라이언 굿맨
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오나 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

관련 조성물 및 방법과 함께 원형 RNA가 본 명세서에 기재된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 원형 RNA는 포스트 스플라이싱 그룹 I 인트론 단편, 스페이서, IRES, 선택적인 듀플렉스 형성 영역 및 1종 초과의 발현 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 서열은 절단 부위를 암호화하는 1종 초과의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해서 분리되어 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 원형 RNA는 선형 RNA와 비교할 때 개선된 발현, 기능적 안정성, 면역원성, 제조 용이성 및/또는 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 작제물은 기존의 RNA 원형화 접근법과 비교할 때 개선된 원형화 효율, 스플라이싱 효율 및/또는 순도를 초래한다.

Description

원형 RNA 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 가출원 제62/992,518호(출원일: 2020년 3월 20일)의 이익 및 이에 대한 우선권을 주장하며, 상기 기초출원의 내용은 모든 목적을 위해서 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
종래의 유전자 요법은 숙주 세포에 목적하는 유전자 정보를 삽입하기 위해서 DNA의 사용을 포함한다. 세포에 도입된 DNA는 일반적으로 하나 이상의 형질주입된 세포의 게놈에 어느 정도 통합되어, 숙주에서 도입된 유전 물질의 오래 지속되는 작용을 허용한다. 이러한 지속적인 작용에 상당한 이점이 있을 수 있지만, 외인성 DNA를 숙주 게놈에 통합하는 것도 많은 해로운 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 도입된 DNA가 온전한 유전자에 삽입되어, 내인성 유전자의 기능을 방해하거나 심지어 완전히 제거하는 돌연변이를 초래할 수 있다. 따라서, DNA를 이용한 유전자 요법은 예를 들어, 필수 효소의 제거 또는 유해하게 감소된 생산 또는 세포 성장 조절에 중요한 유전자의 중단과 같이, 처리된 숙주에서 중요한 유전 기능의 손상을 초래할 수 있는데, 이는 조절되지 않는 또는 암성 세포 증식을 초래한다. 또한, 종래의 DNA 기반 유전자 요법에서는, 강력한 프로모터 서열을 포함시키기 위해서 목적하는 유전자 산물의 효과적인 발현이 필수적인데, 이는 다시 세포에서 정상적인 유전자 발현의 조절에 바람직하지 않은 변화로 이어질 수 있다. 또한 DNA 기반 유전 물질이 원치 않는 항-DNA 항체를 유도하여 아마도 치명적인 면역 반응을 촉발할 수도 있다. 바이러스 벡터를 사용하는 유전자 요법 접근법은 또한 역 면역 반응을 유발할 수 있다. 일부 상황에서, 바이러스 벡터는 숙주 게놈에 통합될 수도 있다. 또한, 임상 등급 바이러스 벡터의 생산도 비용이 많이 들고 시간 소모적이다. 바이러스 벡터를 사용하여 도입된 유전 물질의 표적화 전달 또한 제어하기 어려울 수 있다. 따라서, DNA 기반 유전자 요법은 바이러스 벡터를 사용하여 분비된 단백질의 전달에 대해 평가되었지만(미국 특허 제6,066,626호; 미국 공개 제2004/0110709호), 이러한 접근법은 이러한 다양한 이유로 제한될 수 있다.
DNA와 달리, RNA는 형질주입된 세포의 게놈에 안정적으로 통합될 위험이 없고, 따라서 도입된 유전 물질이 필수 유전자의 정상적인 기능을 방해하거나 또는 유해하거나 발암성 효과를 초래하는 돌연변이를 유발할 문제를 제거하고, 암호화된 단백질의 효과적인 번역을 위해 외인성 프로모터 서열이 필요하지 않아서, 다시 가능한 유해한 부작용을 피할 수 있기 때문에, 유전자 치료제로 RNA를 사용하는 것이 실질적으로 더 안전하다. 또한 mRNA가 기능을 수행하기 위해 핵으로 들어갈 필요는 없지만, DNA는 이러한 주요 장벽을 극복해야 한다.
원형 RNA는 안정적인 형태의 RNA를 설계하고 생산하는 데 유용하다. RNA 분자의 원형화는 특히 불활성 입체배좌로 접히는 경향이 있는 분자의 경우에 RNA 구조 및 기능 연구에 이점을 제공한다(문헌[Wang and Ruffner, 1998]). 원형 RNA는 또한 생체내 응용, 특히 단백질 대체 요법 및 백신접종을 포함한 유전자 발현 및 치료제의 RNA-기반 제어 연구 분야에서 특히 흥미롭고 유용할 수 있다.
본 발명 이전에, 원형화된 RNA를 시험관내에서 제조하기 위한 주요 기술인 스플린트-매개 방법, 순열 인트론-엑손 방법 및 RNA 리가제-매개 방법의 3가지 주요 기술이 존재하였다. 그러나, 기존의 방법론은 원형화될 수 있는 RNA의 크기에 의해 제한되어 치료적 적용에 제한적이다.
관련 조성물 및 방법과 함께 원형 RNA가 본 명세서에 기재된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 원형 RNA는 포스트 스플라이싱 그룹 I 인트론 단편(post splicing group I intron fragment), 스페이서, IRES, 선택적인 듀플렉스 형성 영역 및 1종 초과의 발현 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 원형 RNA는 듀플렉스 형성 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 서열은 절단 부위를 암호화하는 1종 초과의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해서 분리되어 있다. 일부 실시형태에서, 절단 부위는 자가-절단 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 자가-절단 펩타이드는 2A 자가-절단 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열과 제2 발현 서열은 리보솜 스키핑 요소(ribosomal skipping element)에 의해서 분리되어 있다. 일부 실시형태에서, 각각의 발현 서열은 치료용 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 사이토카인 또는 이의 기능성 단편을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 전사 인자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 면역 관문 저해제를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 키메라 항원 수용체를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 제1 T-세포 수용체(TCR) 쇄를 암호화하고, 제2 발현 서열은 제2 TCR 쇄를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 원형 RNA는 선형 RNA와 비교할 때 개선된 발현, 기능적 안정성, 제조 용이성 및/또는 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 원형 RNA는 감소된 면역원성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 작제물은 기존의 RNA 원형화 접근법과 비교할 때 개선된 원형화 효율, 스플라이싱 효율 및/또는 순도를 초래한다.
일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 마이크로RNA 결합 부위를 포함한다. 마이크로RNA 결합 부위는 간에서 발현되는 마이크로RNA에 의해서 인식된다. 일부 실시형태에서, 마이크로RNA 결합 부위는 miR-122에 의해서 인식된다.
본 출원의 일 양상은 다음 순서로, 포스트 스플라이싱 3' 그룹 I 인트론 단편, 내부 리보솜 유입 부위(Internal Ribosome Entry Site: IRES), 제1 발현 서열, 제2 발현 서열 및 포스트 스플라이싱 5' 그룹 I 인트론 단편을 포함하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 제1 발현 서열과 제2 발현 서열 사이에 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 절단 부위는 자가-절단 스페이서이다. 일부 실시형태에서, 자가-절단 스페이서는 2A 자가-절단 펩타이드이다.
일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 제1 발현 서열과 제2 발현 서열 사이에 제2 IRES를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 IRES는 서열번호 1 내지 72 중 어느 하나에 따른 서열로 이루어지거나 상기 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 IRES는 서열번호 1 내지 72 중 어느 하나에 따른 서열로 이루어지거나 상기 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 제1 치료용 단백질을 암호화하고, 제2 발현 서열은 제2 치료용 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열 또는 제2 발현 서열은 항체를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열 또는 제2 발현 서열은 키메라 항원 수용체를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열 또는 제2 발현 서열은 전사 인자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열 또는 제2 발현 서열은 사이토카인을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열 또는 제2 발현 서열은 면역 저해 분자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열 또는 제2 발현 서열은 공자극 분자의 효능제를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열 또는 제2 발현 서열은 면역 관문 분자의 저해제를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)의 알파쇄를 암호화하고, 제2 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)의 베타쇄를 암호화한다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)의 베타쇄를 암호화하고, 제2 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)의 알파쇄를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)의 감마쇄를 암호화하고, 제2 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)의 델타쇄를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)의 델타쇄를 암호화하고, 제2 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)의 감마쇄를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 케모카인을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 케모카인을 암호화하고, 제2 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하고, 제2 발현 서열은 PD1 또는 PDL1 길항제를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 PD1 또는 PDL1 길항제를 암호화하고, 제2 발현 서열은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하고, 제2 발현 서열은 케모카인을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 케모카인을 암호화하고, 제2 발현 서열은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 전사 인자를 암호화하고, 제2 발현 서열은 사이토카인을 암호화한다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 사이토카인을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 사이토카인을 암호화하고, 제2 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-12 및 IL-15로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하고, 제2 발현 서열은 전사 인자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 전사 인자를 암호화하고, 제2 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 전사 인자는 FOXP3, STAT5B, HELIOS, Tbet, GATA3, RORgt 및 cd25로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하고, 제2 발현 서열은 사이토카인을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 사이토카인을 암호화하고, 제2 발현 서열은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-12 및 IL-15로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 사이토카인을 암호화하고, 제2 발현 서열은 전사 인자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 전사 인자는 FOXP3, STAT5B, HELIOS, Tbet, GATA3, RORgt 및 cd25로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-10, IL-12 및 TGFβ로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 전사 인자를 암호화하고, 제2 발현 서열은 케모카인을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 케모카인을 암호화하고, 제2 발현 서열은 전사 인자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 전사 인자는 FOXP3, STAT5B 및 HELIOS로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 케모카인은 CC 케모카인, CXC 케모카인, C 케모카인 또는 CX3C 케모카인이다. 일부 실시형태에서, 케모카인은 CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL 1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXLC6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, XCL1, XCL2 및 CX3CL1로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 종양 항원을 암호화하고, 제2 발현 서열은 사이토카인을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 사이토카인을 암호화하고, 제2 발현 서열은 종양 항원을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 항원은 신생항원이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IFNγ이다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 CAR을 암호화하고, 제2 발현 서열은 CAR을 암호화한다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 사이토카인을 암호화하고, 제2 발현 서열은 사이토카인을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 발현 서열은 IL-10, TGFβ 및 IL-35로부터 선택된 사이토카인을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 발현 서열은 IFNγ, IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-18로부터 선택된 사이토카인을 암호화한다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하고, 제2 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 케모카인을 암호화하고, 제2 발현 서열은 케모카인을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 발현 서열은 면역억제 효소를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 속도 제한 효소(rate limiting enzyme)를 암호화하고, 제2 발현 서열은 플럭스-제한 효소(flux-limiting enzyme)를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 플럭스-제한 효소를 암호화하고, 제2 발현 서열은 속도 제한 효소를 암호화한다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 전사 인자를 암호화하고, 제2 발현 서열은 생존 인자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 생존 인자를 암호화하고, 제2 발현 서열은 전사 인자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 전사 인자는 FOXP3, STAT5B, HELIOS, Tbet, GATA3, RORgt 및 cd25로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 생존 인자는 BCL-XL로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 발현 서열은 샤페론 단백질 또는 복합체를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 전사 인자를 암호화하고, 제2 발현 서열은 샤페론 단백질 또는 복합체를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 샤페론 단백질 또는 복합체를 암호화하고, 제2 발현 서열은 전사 인자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 샤페론 단백질 또는 복합체는 Skp, Spy, FkpA, SurA, Hsp60, Hsp70, GroEL, GroES, Hsp90, HtpG, Hsp100, ClpA, ClpX, ClpP 및 Hsp104로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 전사 인자는 FOXP3, STAT5B, HELIOS, Tbet, GATA3, RORgt 및 cd25로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 하나 또는 두 발현 서열은 신호전달 단백질을 암호화한다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 효소를 암호화하고, 제2 발현 서열은 상기 제1 발현 서열의 음성 조절 저해제를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 제2 발현 서열에 암호화된 효소의 음성 조절 저해제 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 음성 조절 저해제는 p57kip2, BAX 저해제 및 TIPE2로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 우성 음성 단백질을 암호화하고, 제2 발현 서열은 면역 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 면역 단백질을 암호화하고, 제2 발현 서열은 우성 음성 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 발현 서열은 항-염증 단백질을 암호화한다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 전사 인자를 암호화하고, 제2 발현 서열은 5-플루오로사이토신(5-FC)을 5-플루오로우라실(5-FU)로 전환시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 5-플루오로사이토신(5-FC)을 5-플루오로우라실(5-FU)로 전환시킬 수 있고, 제2 발현 서열은 전사 인자이다. 일부 실시형태에서, 5-플루오로사이토신(5-FC)을 5-플루오로우라실(5-FU)로 전환시킬 수 있는 발현 서열은 사이토신 데아미나제이다.
일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 5' 듀플렉스 형성 영역과 포스트 스플라이싱 3' 그룹 I 인트론 단편 사이에 제1 스페이서, 및 포스트 스플라이싱 5' 그룹 I 인트론 단편과 3' 듀플렉스 형성 영역 사이에 제2 스페이서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서는 각각 약 10 내지 약 60개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제1 듀플렉스 형성 영역 및 제2 듀플렉스 형성 영역은 각각 약 9 내지 약 19개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제1 듀플렉스 형성 영역 및 제2 듀플렉스 형성 영역은 각각 약 30개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, IRES는 타우라 증후군 바이러스(Taura syndrome virus), 트리아토마 바이러스(Triatoma virus), 타일러 뇌척수염 바이러스(Theiler's encephalomyelitis virus), 유인원 바이러스 40, 붉은 불개미 바이러스 1(Solenopsis invicta virus 1), 로팔로시품 파디 바이러스(Rhopalosiphum padi virus), 세망내피증 바이러스(Reticuloendotheliosis virus), 인간 폴리오바이러스 1, 갈색날개 노린재 장 바이러스(Plautia stali intestine virus), 카슈미르 벌 바이러스(Kashmir bee virus), 인간 리노바이러스 2(Human rhinovirus 2), 호말로디스카 코아굴라타 바이러스-1(Homalodisca coagulata virus-1), 인간 면역결핍 바이러스 타입 1, 호말로디스카 코아굴라타 바이러스-1, 히메토비 P 바이러스, C형 간염 바이러스, A형 간염 바이러스, 간염 GB 바이러스, 구제역 바이러스(Foot and mouth disease virus), 인간 엔테로바이러스 71(Human enterovirus 71), 말 비염 바이러스(Equine rhinitis virus), 엑트로피스 오블리쿠아 피코르나-유사 바이러스(Ectropis obliqua picorna-like virus), 뇌심근염 바이러스(Encephalomyocarditis virus), 초파리 C 바이러스(Drosophila C Virus), 인간 콕사키바이러스 B3(Human coxsackievirus B3), 크루시퍼 토바모바이러스(Crucifer tobamovirus), 귀뚜라미 마비병 바이러스(Cricket paralysis virus), 소 바이러스성 설사 바이러스 1(Bovine viral diarrhea virus 1), 블랙 퀸 세포 바이러스(Black Queen Cell Virus), 진딧물 치명 마비 바이러스(Aphid lethal paralysis virus), 조류 뇌척수염 바이러스(Avian encephalomyelitis virus), 급성 벌 마비 바이러스(Acute bee paralysis virus), 히비스커스 위황병 원형반점 바이러스(Hibiscus chlorotic ringspot virus), 돼지 열병 바이러스(Classical swine fever virus), 인간 FGF2, 인간 SFTPA1, 인간 AML1/RUNX1, 초파리 안테나페디아(Drosophila antennapedia), 인간 AQP4, 인간 AT1R, 인간 BAG-1, 인간 BCL2, 인간 BiP, 인간 c-IAPl, 인간 c-myc, 인간 eIF4G, 마우스 NDST4L, 인간 LEF1, 마우스 HIF1 알파, 인간 n.myc, 마우스 Gtx, 인간 p27kipl, 인간 PDGF2/c-sis, 인간 p53, 인간 Pim-1, 마우스 Rbm3, 초파리 리퍼(Drosophila reaper), 캐닌 스캠퍼(Canine Scamper), 초파리 Ubx, 인간 UNR, 마우스 UtrA, 인간 VEGF-A, 인간 XIAP, 털없는 초파리(Drosophila hairless), 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) TFIID, 에스. 세레비지애 YAP1, 담배 식각 바이러스(tobacco etch virus), 터닙 주름 바이러스(turnip crinkle virus), EMCV-A, EMCV-B, EMCV-Bf, EMCV-Cf, EMCV pEC9, 피코비르나바이러스, HCV QC64, 인간 코사바이러스(Human Cosavirus) E/D, 인간 코사바이러스 F, 인간 코사바이러스 JMY, 리노바이러스(Rhinovirus) NAT001, HRV14, HRV89, HRVC-02, HRV-A21, 살리바이러스(Salivirus) A SH1, 살리바이러스 FHB, 살리바이러스 NG-J1, 인간 파레코바이러스(Human Parechovirus) 1, 크로히바이러스(Crohivirus) B, Yc-3, 로사바이러스(Rosavirus) M-7, 산바바이러스(Shanbavirus) A, 파시바이러스(Pasivirus) A, 파시바이러스 A 2, 에코바이러스(Echovirus) E14, 인간 파레코바이러스(Human Parechovirus) 5, 아이치 바이러스(Aichi Virus), A형 간염 바이러스 HA16, 포피바이러스(Phopivirus), CVA10, 엔테로바이러스(Enterovirus) C, 엔테로바이러스 D, 엔테로바이러스 J, 인간 페기바이러스(Human Pegivirus) 2, GBV-C GT110, GBV-C K1737, GBV-C 아이오와(Iowa), 페기바이러스(Pegivirus) A 1220, 파시바이러스(Pasivirus) A 3, 사펠로바이러스(Sapelovirus), 로사바이러스(Rosavirus) B, 바쿤사(Bakunsa) 바이러스, 트레모바이러스(Tremovirus) A, 돼지 파시바이러스(Swine Pasivirus) 1, PLV-CHN, 파시바이러스 A, 시시니바이러스(Sicinivirus), 헤파시바이러스(Hepacivirus) K, 헤파시바이러스 A, BVDV1, 보더병 바이러스(Border Disease Virus), BVDV2, CSFV-PK15C, SF573 디시스트로바이러스(Dicistrovirus), 후베이 피코르나-유사 바이러스(Hubei Picorna-like Virus), CRPV, 살리바이러스 A BN5, 살리바이러스 A BN2, 살리바이러스 A 02394, 살리바이러스 A GUT, 살리바이러스 A CH, 살리바이러스 A SZ1, 살리바이러스 FHB, CVB3, CVB1, 에코바이러스 7, CVB5, EVA71, CVA3, CVA12, EV24 또는 eIF4G에 대한 압타머로부터의 IRES의 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 자연 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 자연 뉴클레오타이드로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 발현 서열은 코돈 최적화된다.
일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 등가의 사전 최적화된 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 적어도 하나의 마이크로RNA 결합 부위가 결여되도록 최적화된다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 등가의 사전 최적화된 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 적어도 하나의 엔도뉴클레아제 민감성 부위가 결여되도록 최적화된다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 등가의 사전 최적화된 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 적어도 하나의 RNA-편집 민감성 부위가 결여되도록 최적화된다.
일부 실시형태에서, 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 약 100개 뉴클레오타이드 내지 약 15킬로베이스 길이인 원형 RNA 뉴클레오타이드이다.
일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 인간에서 적어도 약 20시간의 생체내 치료 효과 기간을 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 적어도 약 20시간의 기능성 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 동일한 발현 서열을 포함하는 등가의 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 인간 세포에서의 치료 효과 기간보다 더 크거나 동일한 인간 세포에서의 치료 효과 기간을 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 동일한 발현 서열을 포함하는 등가의 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 인간 세포에서의 기능성 반감기보다 더 크거나 동일한 인간 세포에서의 기능성 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 동일한 발현 서열을 갖는 등가의 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 인간에서의 생체내 치료 효과 기간보다 큰 인간에서의 생체내 치료 효과 기간을 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 동일한 발현 서열을 갖는 등가의 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 인간에서의 생체내 기능성 반감기보다 큰 인간에서의 생체내 기능성 반감기를 갖는다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 본 명세서에 기재된 바와 같은 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드, 나노입자 및 선택적으로, 나노 입자에 작동 가능하게 연결된 표적화 모이어티를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 지질 나노입자, 코어-쉘 나노입자, 생분해성 나노입자, 생분해성 지질 나노입자, 중합체 나노입자 또는 생분해성 중합체 나노입자이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 표적화 모이어티를 포함하되, 표적화 모이어티는 세포 단리 또는 정제의 부재 하에서 수용체-매개된 엔도사이토시스 또는 선택된 세포 집단 또는 조직의 선택된 세포 내로의 직접 융합을 매개한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 나노입자에 작동 가능하게 연결된 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 scFv, 나노바디, 펩타이드, 미니바디, 폴리뉴클레오타이드 압타머, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 이의 단편이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 이중 가닥 RNA, DNA 플린트 또는 삼인산화된 RNA인 조성물 중에 1중량% 미만의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 이중 가닥 RNA, DNA 스플린트, 삼인산화된 RNA, 포스파타제 단백질, 단백질 리가제 및 캡핑 효소인 약제학적 조성물 중에 1중량% 미만의 폴리뉴클레오타이드 및 단백질을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법으로서, 이 방법은 본 명세서에 기재된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드, 나노입자 및 선택적으로, 상기 나노입자에 작동 가능하게 연결된 표적화 모이어티를 포함하는, 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 표적화 모이어티를 포함하되, 표적화 모이어티는 선택적으로 세포 선택 또는 정제의 부재 하에서 선택된 세포 집단의 세포 내에서 수용체-매개된 엔도사이토시스를 매개한다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 scFv, 나노바디, 펩타이드, 미니바디, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 지질 나노입자, 코어-쉘 나노입자 또는 생분해성 나노입자이다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 1종 이상의 양이온성 지질, 이온화 가능한 지질 또는 폴리 β-아미노 에스터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 1종 이상의 비-양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 1종 이상의 PEG-변형된 지질, 폴리글루탐산 지질 또는 히알루론산 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 콜레스테롤을 포함한다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 아라키돈산 또는 올레산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 1종 초과의 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상체는 급성 림프구성 백혈병; 급성 골수성 백혈병(acute lymphocytic leukemia: AML); 포상횡문근육종; B 세포 악성종양; 방광암(예를 들어, 방광 암종); 골암; 뇌암(예를 들어, 수모세포종); 유방암; 항문, 항문관 또는 항문직장의 암; 안암; 간내담관의 암; 관절암; 두부암; 담낭암; 흉막의 암; 코, 비강 또는 중이의 암; 구강암; 음문암; 만성 림프구성 백혈병; 만성 골수성 암; 결장암; 식도암; 자궁경부암; 섬유육종; 위장 카르시노이드 종양; 두경부암(예를 들어, 두경부 편평　세포 암종); 호지킨 림프종; 하인두암; 신장암; 후두암; 백혈병; 액체 종양; 간암; 폐암(예를 들어, 비소세포 폐 암종 및 폐 선암종); 림프종; 중피종; 비만세포종; 흑색종; 다발성 골수종; 코인두암; 비호지킨 림프종; B-만성 림프구성 백혈병; 털세포 백혈병; 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukemia: ALL); 버킷 림프종, 난소암; 췌장암; 복막암; 대망(omentum)암; 장간막암; 인두암; 전립선암; 직장암; 신장암; 피부암; 소장암; 연조직암; 고형 종양; 활막 육종; 위암; 고환암; 갑상선암; 및 요관암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 경피증, 그레이브스병, 크론병, 쇼그렌병, 다발성 경화증, 하시모토병, 건선, 중증 근무력증, 자가면역 다발성 내분비병증 증후군(autoimmune polyendocrinopathy syndrome), 제I형 당뇨병(TIDM), 자가면역 위염, 자가면역 포도막염, 다발성근염, 대장염, 갑상선염 및 인간 루푸스로 대표되는 전신성 자가면역 질환(generalized autoimmune diseases typified by human Lupus)으로부터 선택되는 자가면역 장애를 갖는다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 제조를 위한 벡터를 제공하며, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 다음 순서로, 5' 듀플렉스 형성 영역, 3' 그룹 I 인트론 단편, 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 제1 발현 서열, 제2 발현 서열, 5' 그룹 I 인트론 단편 및 3' 듀플렉스 형성 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 제1 발현 서열과 제2 발현 서열 사이에 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 절단 부위는 자가-절단 스페이서이다. 일부 실시형태에서, 자가-절단 스페이서는 2A 자가-절단 펩타이드이다.
일부 실시형태에서, 벡터는 5' 듀플렉스 형성 영역과 3' 그룹 I 인트론 단편 사이의 제1 스페이서 및 5' 그룹 I 인트론 단편과 3' 듀플렉스 형성 영역 사이의 제2 스페이서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서는 각각 약 5 내지 약 60개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서스페이서 각각은 적어도 5개 뉴클레오타이드 길이의 비구조화된 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서스페이서 각각은 적어도 7개 뉴클레오타이드 길이의 구조화된 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 듀플렉스 형성 영역 및 제2 듀플렉스 형성 영역은 각각 약 9 내지 약 50개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 벡터는 코돈 최적화된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 등가의 사전 최적화 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 적어도 1개의 마이크로RNA 결합 부위가 결여되어 있다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 본 명세서에 기재된 바와 같은 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 진핵 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 진핵 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 진핵 세포는 면역 세포이다. 일부 실시형태에서, 진핵 세포는 T 세포이다.
양상에서, 본 명세서에는 다음 순서로, 포스트 스플라이싱 3' 그룹 I 인트론 단편, 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 제1 발현 서열, 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 제2 발현 서열 및 포스트 스플라이싱 5' 그룹 I 인트론 단편을 포함하는 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 양상에서, 본 명세서에는 다음 순서로, 포스트 스플라이싱 3' 그룹 I 인트론 단편, 제1 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 제1 발현 서열, 제2 IRES, 제2 발현 서열 및 포스트 스플라이싱 5' 그룹 I 인트론 단편을 포함하는 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열 및 제2 발현 서열은 상이한 치료용 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 발현 서열 및 제2 발현 서열은 동일한 치료용 단백질을 암호화한다.
양상에서, 본 명세서에는 다음 순서로, 선택적인 5' 듀플렉스 형성 영역, 포스트 스플라이싱 3' 그룹 I 인트론 단편, 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 발현 서열, 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 제2 발현 서열, 5' 그룹 I 인트론 단편 및 선택적인 3' 듀플렉스 형성 영역을 포함하는 벡터의 전사로부터 생산된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 양상에서, 본 명세서에는 다음 순서로, 선택적인 5' 듀플렉스 형성 영역, 3' 그룹 I 인트론 단편, 제1 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 발현 서열, 제2 IRES, 제2 발현 서열, 5' 그룹 I 인트론 단편, 및 선택적인 3' 듀플렉스 형성 영역을 포함하는 벡터의 전사로부터 생산된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 3' 및 5' 듀플렉스 형성 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 5' 듀플렉스 형성 영역과 포스트 스플라이싱 3' 그룹 I 인트론 단편 사이에 제1 스페이서, 및 포스트 스플라이싱 5' 그룹 I 인트론 단편과 3' 듀플렉스 형성 영역 사이에 제2 스페이서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서는 각각 약 10 내지 약 60개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 제1 듀플렉스 형성 영역 및 제2 듀플렉스 형성 영역은 각각 약 9 내지 약 19개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 특정 다른 실시형태에서, 제1 듀플렉스 형성 영역 및 제2 듀플렉스 형성 영역은 각각 약 30개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
특정 실시형태에서, IRES는 표 17로부터 선택되거나, IRES의 서열을 갖거나, 이의 기능성 단편 또는 변이체이다. 일부 실시형태에서, IRES는 타우라 증후군 바이러스, 트리아토마 바이러스, 타일러 뇌척수염 바이러스, 유인원 바이러스 40, 붉은 불개미 바이러스 1, 로팔로시품 파디 바이러스, 세망내피증 바이러스, 인간 폴리오바이러스 1, 갈색날개 노린재 장 바이러스, 카슈미르 벌 바이러스, 인간 리노바이러스 2, 호말로디스카 코아굴라타 바이러스-1(Homalodisca coagulata virus-1), 인간 면역결핍 바이러스 타입 1, 호말로디스카 코아굴라타 바이러스-1(Homalodisca coagulata virus-1), 히메토비 P 바이러스(Himetobi P virus), C형 간염 바이러스, A형 간염 바이러스, 간염 GB 바이러스, 구제역 바이러스, 인간 엔테로바이러스 71, 말 비염 바이러스, 엑트로피스 오블리쿠아 피코르나-유사 바이러스, 뇌심근염 바이러스, 초파리 C 바이러스, 인간 콕사키바이러스 B3, 크루시퍼 토바모바이러스, 귀뚜라미 마비병 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스 1, 블랙 퀸 세포 바이러스, 진딧물 치명 마비 바이러스, 조류 뇌척수염 바이러스, 급성 벌 마비 바이러스, 히비스커스 위황병 원형반점 바이러스, 돼지 열병 바이러스, 인간 FGF2, 인간 SFTPA1, 인간 AML1/RUNX1, 초파리 안테나페디아, 인간 AQP4, 인간 AT1R, 인간 BAG-1, 인간 BCL2, 인간 BiP, 인간 c-IAPl, 인간 c-myc, 인간 eIF4G, 마우스 NDST4L, 인간 LEF1, 마우스 HIF1 알파, 인간 n.myc, 마우스 Gtx, 인간 p27kipl, 인간 PDGF2/c-sis, 인간 p53, 인간 Pim-1, 마우스 Rbm3, 초파리 리퍼, 캐닌 스캠퍼 초파리 Ubx, 인간 UNR, 마우스 UtrA, 인간 VEGF-A, 인간 XIAP, 털없는 초파리, 에스. 세레비지애 TFIID, 에스. 세레비지애 YAP1, 담배 식각 바이러스, 터닙 주름 바이러스, EMCV-A, EMCV-B, EMCV-Bf, EMCV-Cf, EMCV pEC9, 피코비르나바이러스, HCV QC64, 인간 코사바이러스 E/D, 인간 코사바이러스 F, 인간 코사바이러스 JMY, 리노바이러스 NAT001, HRV14, HRV89, HRVC-02, HRV-A21, 살리바이러스 A SH1, 살리바이러스 FHB, 살리바이러스 NG-J1, 인간 파레코바이러스 1, 크로히바이러스 B, Yc-3, 로사바이러스 M-7, 산바바이러스 A, 파시바이러스 A, 파시바이러스 A 2, 에코바이러스 E14, 인간 파레코바이러스 5, 아이치 바이러스, A형 간염 바이러스 HA16, 포피바이러스, CVA10, 엔테로바이러스 C, 엔테로바이러스 D, 엔테로바이러스 J, 인간 페기바이러스 2, GBV-C GT110, GBV-C K1737, GBV-C 아이오와, 페기바이러스 A 1220, 파시바이러스 A 3, 사펠로바이러스, 로사바이러스 B, 바쿤사 바이러스, 트레모바이러스 A, 돼지 파시바이러스 1, PLV-CHN, 파시바이러스 A, 시시니바이러스, 헤파시바이러스 K, 헤파시바이러스 A, BVDV1, 보더병 바이러스, BVDV2, CSFV-PK15C, SF573 디시스트로바이러스, 후베이 피코르나-유사 바이러스, CRPV, 살리바이러스 A BN5, 살리바이러스 A BN2, 살리바이러스 A 02394, 살리바이러스 A GUT, 살리바이러스 A CH, 살리바이러스 A SZ1, 살리바이러스 FHB, CVB3, CVB1, 에코바이러스 7, CVB5, EVA71, CVA3, CVA12, EV24 또는 eIF4G에 대한 압타머로부터의 IRES의 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서polyA 서열은 각각 15 내지 50nt의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서polyA 서열은 각각 약 20 내지 25nt의 길이를 갖는다.
특정 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 자연 발생 뉴클레오타이드로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA는 적어도 약 80%, 적어도 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%의 자연 발생 뉴클레오타이드를 함유한다. 특정 실시형태에서, 발현 서열은 코돈-최적화된다. 특정 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 등가의 사전 최적화된 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 적어도 하나의 마이크로RNA 결합 부위가 결여되도록 최적화된다. 특정 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 등가의 사전 최적화된 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 적어도 하나의 엔도뉴클레아제 민감성 부위가 결여되도록 최적화된다. 특정 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 등가의 사전 최적화된 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 적어도 하나의 RNA-편집 민감성 부위가 결여되도록 최적화된다.
일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 약 100개 뉴클레오타이드 내지 약 15킬로베이스 길이이다. 특정 실시형태에서, 보 개시내용의 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 인간에서 적어도 약 20시간의 생체내 치료 효과 기간을 갖는다. 특정 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 적어도 약 20시간의 기능성 반감기를 갖는다. 특정 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 동일한 발현 서열을 포함하는 등가의 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 인간 세포에서의 치료 효과 기간보다 더 크거나 동일한 인간 세포에서의 치료 효과 기간을 갖는다. 특정 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 동일한 발현 서열을 포함하는 등가의 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 인간 세포에서의 기능성 반감기보다 더 크거나 동일한 인간 세포에서의 기능성 반감기를 갖는다. 특정 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 동일한 발현 서열을 갖는 등가의 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 인간에서의 생체내 기능성 반감기보다 큰 인간에서의 생체내 기능성 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 참조 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 cap1 구조 및 polyA 테일을 포함하는 적어도 80nt 길이의 선형, 비변형된 또는 뉴클레오사이드-변형된, 완전-가공된 mRNA이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 미리 결정된 역치 값의 것과 동일하거나 더 큰 인간 세포에서의 기능성 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 인간에서 미리 결정된 역치 값의 것보다 더 큰 생체내 기능성 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 기능성 단백질 검정은 시험과내 루시퍼라제 검정이다. 일부 실시형태에서, 기능성 단백질 검정은 환자 혈청 또는 조직 샘플에서 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 발현 서열에 의해서 암호화된 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 미리 결정된 역치 값은 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드와 동일한 발현 서열을 포함하는 참조 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 기능성 반감기이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 적어도 약 20시간의 기능성 반감기를 갖는다.
양상에서, 본 명세서에는 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드, 나노입자 및 선택적으로, 나노입자에 작동 가능하게 연결된 표적화 모이어티를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 지질 나노입자, 코어-쉘 나노입자, 생분해성 나노입자, 생분해성 지질 나노입자, 중합체 나노입자 또는 생분해성 중합체 나노입자이다. 특정 실시형태에서, 나노입자는 군 C12-200, MC3, DLinDMA, DLinkC2DMA, cKK-E12, ICE(이미다졸계), HGT5000, HGT5001, DODAC, DDAB, DMRIE, DOSPA, DOGS, DODAP, DODMA 및 DMDMA, DODAC, DLenDMA, DMRIE, CLinDMA, CpLinDMA, DMOBA, DOcarbDAP, DLinDAP, DLincarbDAP, DLinCDAP, KLin-K-DMA, DLin-K-XTC2-DMA, HGT4003 및 이들의 조합물로부터 선택된 1종 이상의 양이온성 지질이다.
특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 표적화 모이어티를 포함하되, 표적화 모이어티는 세포 단리 또는 정제의 부재 하에서 수용체-매개된 엔도사이토시스 또는 선택된 세포 집단 또는 조직의 선택된 세포 내로의 직접 융합을 매개한다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 scFv, 나노바디, 펩타이드, 미니바디, 폴리뉴클레오타이드 압타머, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 이의 단편이다. 특정 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 자가면역 장애 또는 암의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 자가면역 장애 또는 암을 치료하기에 효과적인 양이다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 동일한 발현 서열을 암호화하는 외인성 DNA를 포함하는 벡터를 포함하는 약제학적 조성물과 비교하는 경우 향상된 안전성 프로파일을 갖는다.
특정 실시형태에서, 조성물 중의 상기 폴리뉴클레오타이드의 1중량% 미만은 이중 가닥 RNA, DNA 스플린트 또는 삼인산화된 RNA이다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물 중의 폴리뉴클레오타이드 및 단백질의 1중량% 미만은 이중 가닥 RNA, DNA 스플린트, 삼인산화된 RNA, 포스파타제 단백질, 단백질 리가제 및 캡핑 효소이다.
양상에서, 본 명세서에는 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법이 제공되며, 이 방법은 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드, 나노입자 및 선택적으로, 상기 나노입자에 작동 가능하게 연결된 표적화 모이어티를 포함하는, 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 자가면역 장애 또는 암을 갖는다.
일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 scFv, 나노바디, 펩타이드, 미니바디, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 표적화 모이어티를 포함하되, 표적화 모이어티는 세포 단리 또는 정제의 부재 하에서 선택된 세포 집단의 선택적 세포 내에서 수용체-매개된 엔도사이토시스를 매개한다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 지질 나노입자, 코어-쉘 나노입자 또는 생분해성 나노입자이다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 1종 이상의 양이온성 지질, 이온화 가능한 지질 또는 폴리 β-아미노 에스터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 1종 이상의 비-양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 1종 이상의 PEG-변형된 지질, 폴리글루탐산 지질, 구조 지질 또는 히알루론산 지질을 포함한다. 특정 실시형태에서, 나노입자는 콜레스테롤을 포함한다. 일부 실시형태에서, 구조 지질은 베타-시토스테롤이다. 일부 실시형태에서, 구조 지질은 베타 시토스테롤이 아니다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 아라키돈산 또는 올레산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 1종 초과의 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 구조 지질은 C1q에 결합하고/하거나 구조 지질이 없는 대조군 전달 비히클과 비교하여 C1q에 대한 상기 지질을 포함하는 전달 비히클의 결합을 촉진하고/하거나 구조 지질이 없는 대조군 전달 비히클과 비교하여 면역 세포 내로의 C1q-결합된 전달 비히클의 흡수를 증가시킨다.
일부 실시형태에서, PEG-변형된 지질은 DSPE-PEG, DMG-PEG 또는 PEG-1이다. 일부 실시형태에서, PEG-변형된 지질은 DSPE-PEG(2000)이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 헬퍼 지질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 DSPC 또는 DOPE이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 DOPE, 콜레스테롤 및 DSPE-PEG를 포함한다.
일부 실시형태에서, 전달 비히클은 몰비로 약 0.5% 내지 약 4%의 PEG-변형된 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 전달 비히클은 몰비로 약 1% 내지 약 2%의 PEG-변형된 지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질:DSPC:콜레스테롤:DSPE-PEG(2000)의 몰비는 62:4:33:1이다.
일부 실시형태에서, 전달 비히클은 이온화 가능한 지질, DOPE, 콜레스테롤 및 DSPE-PEG(2000)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질:DSPC:콜레스테롤:DSPE-PEG(2000)의 몰비는 50:10:38.5:1.5이다.
일부 실시형태에서, 전달 비히클은 약 3 내지 약 6의 질소:포스페이트(N:P) 비율을 갖는다.
일부 실시형태에서, 전달 비히클은 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 엔도좀 방출을 위해서 제형화된다.
일부 실시형태에서, 전달 비히클은 APOE에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 전달 비히클은 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드와 동일한 발현 서열을 갖는 참조 선형 RNA가 로딩된 등가의 전달 비히클보다 더 적은 아포지질단백질 E(APOE)과 상호작용한다. 일부 실시형태에서, 전달 비히클의 외부 표면은 APOE 결합 부위가 실질적으로 없다.
일부 실시형태에서, 전달 비히클은 약 120㎚ 미만의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 전달 비히클은 300㎚ 초과의 직경을 갖는 응집물을 형성하지 않는다.
일부 실시형태에서, 전달 비히클은 약 120㎚ 미만의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 전달 비히클은 300㎚ 초과의 직경을 갖는 응집물을 형성하지 않는다.
일부 실시형태에서, 전달 비히클은 약 30시간 미만의 생체내 반감기를 갖는다.
일부 실시형태에서, 전달 비히클은 세포 내로의 저밀도 지질단백질 수용체(LDLR) 의존적 흡수가 가능하다. 일부 실시형태에서, 전달 비히클은 세포 내로의 LDLR 의존적 흡수가 가능하다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 선형 RNA가 실질적으로 없다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 전달 비히클에 작동 가능하게 연결된 표적화 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 면역 세포 항원에 또는 간접적으로 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포 항원은 T 세포 항원이다. 일부 실시형태에서, T 세포 항원은 CD2, CD3, CD5, CD7, CD8, CD4, 베타7 인테그린, 베타2 인테그린 및 C1q로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 전달 비히클 결합 모이어티 및 세포 결합 모이어티를 포함하는 어댑터 분자를 추가로 포함하되, 표적화 모이어티는 전달 비히클 결합 모이어티에 특이적으로 결합하고, 세포 결합 모이어티는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포 항원은 면역 세포 항원이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포 항원은 T 세포 항원, NK 세포, NKT 세포, 대식세포 또는 호중구이다. 일부 실시형태에서, T 세포 항원은 CD2, CD3, CD5, CD7, CD8, CD4, 베타7 인테그린, 베타2 인테그린, CD25, CD39, CD73, A2a 수용체, A2b 수용체 및 C1q로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포 항원은 대식세포 항원이다. 일부 실시형태에서, 대식세포 항원은 만노스 수용체, CD206 및 C1q로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 소분자이다. 일부 실시형태에서, 소분자는 면역 세포 상의 엑토효소에 결합하되, 엑토효소는 CD38, CD73, 아데노신 2a 수용체 및 아데노신 2b 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 소분자는 만노스, 레시틴, 아시비신, 바이오틴 또는 다이곡시게닌이다.
일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 단일쇄 Fv(scFv) 단편, 나노바디, 펩타이드, 펩타이드-기재 마크로사이클, 미니바디, 소분자 리간드, 예컨대, 엽산염, 아르기닐글리실아스파트산(RGD) 또는 페놀-용해성 모둘린 알파 1 펩타이드(PSMA1), 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 이의 단편이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 약 2주 미만의 세포 막에서의 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 약 1주 미만의 세포 막에서의 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 약 30시간 미만의 세포 막에서의 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 기능성 반감기보다 짧은 세포 막에서의 반감기를 갖는다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 유효량의 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태는 표 27 또는 표 28로부터 선택된 폴리펩타이드의 비정상적인 발현, 활성 또는 국지화와 연관된다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 치료용 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 비장에서 치료용 단백질 발현은 간에서의 치료용 단백질 발현보다 더 높다. 일부 실시형태에서, 비장에서 치료용 단백질 발현은 간에서의 치료용 단백질 발현의 적어도 약 2.9x이다. 일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 간에서 기능성 수준으로 발현되지 않는다. 일부 실시형태에서, 치료용 단백질은 간에서 검출 가능한 수준으로 발현되지 않는다. 일부 실시형태에서, 비장에서 치료용 단백질 발현은 총 치료용 단백질 발현의 적어도 약 63%이다.
일부 실시형태에서, 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 3' 아나베나 그룹 I 인트론 단편 및 5' 아나베나 그룹 I 인트론 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 RNA 폴리뉴클레오타이드는 참조 3' 아나베나 그룹 I 인트론 단편 및 참조 5' 아나베나 그룹 I 인트론 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 3' 아나베나 그룹 I 인트론 단편 및 참조 5' 아나베나 그룹 I 인트론 단편은 L6-5 순열(permutation) 부위를 사용하여 생성되었다. 일부 실시형태에서, 3' 아나베나 그룹 I 인트론 단편 및 5' 아나베나 그룹 I 인트론 단편은 L6-5 순열 부위를 사용하여 생성되지 않았다. 일부 실시형태에서, 3' 아나베나 그룹 I 인트론 단편은 서열번호 112 내지 123 및 125 내지 150으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 5' 아나베나 그룹 I 인트론 단편은 서열번호 73 내지 84 및 86 내지 111로부터 선택된 상응하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' 아나베나 그룹 I 인트론 단편은 서열번호 73 내지 84 및 86 내지 111로부터 선택된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 3' 아나베나 그룹 I 인트론 단편은 서열번호 112 내지 124 및 125 내지 150으로부터 선택된 상응하는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, IRES는 서열번호 348 내지 351로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 IRES는 CVB3이다. 일부 실시형태에서, IRES는 CVB3이 아니다. 일부 실시형태에서, IRES는 서열번호 1 내지 64 및 66 내지 72로부터 선택된 서열을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 본 명세서에 개시된 선형 RNA로부터 생산된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 개시한다.
또 다른 양상에서, 본 출원은 5'에서부터 3'로, 3' 그룹 I 인트론 단편, IRES, 발현 서열 및 5' 그룹 I 인트론 단편을 포함하는 원형 RNA를 개시하된, IRES는 서열번호 348 내지 351로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 3' 그룹 I 인트론 단편과 IRES 사이에 스페이서를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 듀플렉스를 형성할 수 있는 제1 듀플렉스 형성 영역 및 제2 듀플렉스 형성 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 듀플렉스 형성 영역 및 제2 듀플렉스 형성 영역은 각각 약 9 내지 약 19개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제1 듀플렉스 형성 영역 및 제2 듀플렉스 형성 영역은 각각 약 30개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
양상에서, 본 명세서에는 다음 순서로, 선택적인 5' 듀플렉스 형성 영역, 3' 그룹 I 인트론 단편, 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 제1 발현 서열, 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 제2 발현 서열, 5' 그룹 I 인트론 단편 및 선택적인 3' 듀플렉스 형성 영역을 포함하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 제조하기 위한 벡터가 제공된다. 양상에서, 본 명세서에는 다음 순서로, 선택적인 5' 듀플렉스 형성 영역, 3' 그룹 I 인트론 단편, 제1 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 제1 발현 서열, 제2 IRES, 제2 발현 서열, 5' 그룹 I 인트론 단편 및 선택적인 3' 듀플렉스 형성 영역을 포함하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 제조하기 위한 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 3' 듀플렉스 형성 영역 및 5' 듀플렉스 형성 영역을 함유한다. 특정 실시형태에서, 벡터는 5' 듀플렉스 형성 영역과 3' 그룹 I 인트론 단편 사이의 제1 스페이서 및 5' 그룹 I 인트론 단편과 3' 듀플렉스 형성 영역 사이의 제2 스페이서를 포함한다. 특정 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서는 각각 약 5 내지 약 60개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서는 각각 약 8 내지 약 60개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서스페이서 각각은 적어도 5개 뉴클레오타이드 길이의 비구조화된 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서스페이서 각각은 적어도 7개 뉴클레오타이드 길이의 구조화된 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 제1 듀플렉스 형성 영역 및 제2 듀플렉스 형성 영역은 각각 약 9 내지 50개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 벡터는 코돈 최적화된다. 특정 실시형태에서, 벡터는 등가의 사전 최적화 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 적어도 1개의 마이크로RNA 결합 부위가 결여되어 있다.
양상에서, 본 명세서에는 다음 순서로, 선택적인 5' 듀플렉스 형성 영역, 3' 그룹 I 인트론 단편, 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 제1 발현 서열, 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 제2 발현 서열, 5' 그룹 I 인트론 단편 및 선택적인 3' 듀플렉스 형성 영역을 포함하는 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 제조하기 위한 벡터를 포함하는 원핵 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 3' 듀플렉스 형성 영역 및 5' 듀플렉스 형성 영역을 함유한다. 양상에서, 본 명세서에는 다음 순서로, 선택적인 5' 듀플렉스 형성 영역, 3' 그룹 I 인트론 단편, 제1 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 제1 발현 서열, 제2 IRES, 제2 발현 서열, 5' 그룹 I 인트론 단편 및 선택적인 3' 듀플렉스 형성 영역을 포함하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 제조하기 위한 벡터를 포함하는 원핵 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 3' 듀플렉스 형성 영역 및 5' 듀플렉스 형성 영역을 함유한다.
양상에서, 본 명세서에는 본 개시내용의 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 진핵 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 진핵 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 진핵 세포는 면역 세포이다. 일부 실시형태에서, 진핵 세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 대식세포 또는 호중구이다.
도 1은 가우시아 루시퍼라제 발현 서열 및 다양한 IRES 서열을 포함하는 원형 RNA로 형질주입시킨 지 24시간 후 HEK293(도 1A, 도 1D 및 도 1E), HepG2(도 1B), 또는 1C1C7(도 1C) 세포의 상청액에서의 발광을 도시한 도면.
도 2는 가우시아 루시퍼라제 발현 서열 및 상이한 길이를 갖는 다양한 IRES 서열을 포함하는 원형 RNA로 형질주입시킨 지 24시간 후 HEK293(도 2A), HepG2(도 2B), 또는 1C1C7(도 2C) 세포의 상청액에서의 발광을 도시한 도면.
도 3은 발광에 의해 측정된 바와 같은 3일에 걸친 HepG2(도 3A) 또는 1C1C7(도 3B) 세포에서 선택된 IRES 작제물의 안정성을 도시한 도면.
도 4A 및 도 4B는 세포 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광에 의해 측정된 바와 같은, 주카트 세포에서 선택된 IRES 작제물로부터의 단백질 발현을 도시한 도면.
도 5A 및 도 5B는 발광에 의해 측정된 바와 같은 3일 동안 주카트 세포에서 선택된 IRES 작제물의 안정성을 도시한 도면.
도 6은 가우시아 루시퍼라제를 암호화하는 변형된 선형, 비정제된 원형 또는 정제된 원형 RNA의 24시간 발광(도 6A) 또는 3일에 걸친 상대 발광(도 6B)의 비교를 도시한 도면.
도 7은 변형된 선형, 비정제된 원형 또는 정제된 원형 RNA로 주카트 세포를 전기천공한 후 IFNγ(도 7A), IL-6(도 7B), IL-2(도 7C), RIG-I(도 7D), IFN-β1(도 7E) 및 TNFα(도 7F)의 전사체 유도를 도시한 도면.
도 8은 인간 1차 단핵구(도 8A) 및 대식세포(도 8B 및 도 8C)에서 가우시아 루시퍼라제를 암호화하는 원형 RNA 및 변형된 선형 RNA의 발광의 비교를 도시한 도면.
도 9는 가우시아 루시퍼라제 발현 서열 및 다양한 IRES 서열을 포함하는 원형 RNA를 형질도입한 후 1차 T 세포의 상청액에서 3일에 걸친 상대 발광(도 9A) 또는 24시간 발광(도 9B)을 도시한 도면.
도 10은 가우시아 루시퍼라제 발현 서열을 포함하는 원형 RNA 또는 변형된 선형 RNA를 형질도입한 후 1차 T 세포의 상청액에서 24시간 발광(도 10A) 또는 3일에 걸친 상대 발광(도 10B) 및 PBMC에서 24시간 발광(도 10C)을 도시한 도면.
도 11은 상이한 순열 부위를 갖는 RNA 작제물의 HPLC 크로마토그램(도 11A) 및 원형화 효율(도 11B)을 도시한 도면.
도 12는 상이한 인트론 및/또는 순열 부위를 갖는 RNA 작제물의 HPLC 크로마토그램(도 12A) 및 원형화 효율(도 12B)을 도시한 도면.
도 13은 상동성 아암을 갖거나 갖지 않는 3개의 RNA 작제물의 HPLC 크로마토그램(도 13A) 및 원형화 효율(도 13B)을 도시한 도면.
도 14는 상동성 암이 없거나 다양한 길이 및 GC 함량을 갖는 상동성 아암을 갖지 않거나 상동성 아암을 갖는 3개의 RNA 작제물의 원형화 효율을 도시한 도면.
도 15A 및 도 15B는 개선된 스플라이싱 효율에 대한 강력한 상동성 아암의 기여, 선택된 작제물에서 원형화 효율과 니킹(nicking) 사이의 관계 및 개선된 원형화 효율을 입증하는 것으로 가정된 순열 부위와 상동성 아암의 조합을 도시한 HPLC 크로마토그램을 도시한 도면.
도 16은 모의 전기천공되거나(좌측) 또는 CAR을 암호화하는 원형 RNA로 전기천공된(우측)되고, GFP 및 파이어플라이 루시퍼라제를 발현하는 라지(Raji) 세포와 공배양된 T 세포의 형광 영상을 도시한 도면.
도 17은 모의 전기천공되거나(상단) 또는 CAR을 암호화하는 원형 RNA로 전기천공된(하단)되고, GFP 및 파이어플라이 루시퍼라제를 발현하는 라지 세포와 공배양된 T 세포의 명시야(좌측), 형광(중앙) 및 오버레이(우측) 영상을 도시한 도면.
도 18은 모의 전기천공되거나 상이한 CAR 서열을 암호화하는 원형 RNA로 전기천공된 T 세포에 의한 라지 표적 세포의 특이적 용해를 도시한 도면.
도 19는 가우시아 루시퍼라제 발현 서열 및 다양한 IRES 서열(도 19A)을 포함하는 선형 또는 원형 RNA를 형질도입한 지 24시간 후 주카트 세포(좌측) 또는 휴지기 1차 인간 CD3+ T 세포(우측)의 상청액에서의 발광 및 3일에 걸친 상대 발광(도 19B)을 도시한 도면.
도 20은 변형된 선형, 비정제된 원형, 또는 정제된 원형 RNA로 인간 CD3+ T 세포를 전기천공한 후 IFN-β1(도 20A), RIG-I(도 20B), IL-2(도 20C), IL-6(도 20D), IFNγ(도 20E) 및 TNFα(도 20F)의 전사체 유도를 도시한 도면.
도 21은 파이어플라이 발광의 검출에 의해 결정된 바와 같은 CAR을 암호화하는 circRNA로 전기천공된 인간 1차 CD3+ T 세포에 의한 라지 표적 세포의 특이적 용해(도 21A) 및 상이한 양의 CAR 서열을 암호화하는 원형 또는 선형 RNA로 천기천공한 지 24시간 후 IFNγ 전사체 유도(도 21B)를 도시한 도면.
도 22는 파이어플라이 발광의 검출에 의해 결정된 바와 같은 상이한 E:T 비에서 CAR을 암호화하는 원형 또는 선형 RNA로 전기천공된 인간 1차 CD3+ T 세포에 의한 표적 또는 비-표적 세포의 특이적 용해(도 22A 및 도 22B)를 도시한 도면.
도 23은 전기천공 후 1, 3, 5 및 7일에 CAR을 암호화하는 RNA로 전기천공된 인간 CD3+ T 세포에 의한 표적 세포의 특이적 용해를 도시한 도면.
도 24는 CD19 또는 BCMA 표적화 CAR을 암호화하는 원형 RNA로 전기천공된 인간 CD3+ T 세포에 의한 표적 세포의 특이적 용해를 도시한 도면.
도 25는 FLuc를 암호화하고, 50% 지질 15(표 10b), 10% DSPC, 1.5% PEG-DMG 및 38.5% 콜레스테롤과 제형화된 원형 RNA가 투여된 CD-1 마우스로부터 수거된 기관의 총 플럭스를 도시한 도면.
도 26은 FLuc를 암호화하고, 50% 지질 15(표 10b), 10% DSPC, 1.5% PEG-DMG 및 38.5% 콜레스테롤과 제형화된 원형 RNA가 투여된 CD-1 마우스로부터 수거된 기관의 발광을 강조한 영상을 도시한 도면.
도 27은 표 10a로부터의 지질 26 및 27의 분자 특징규명을 도시한 도면. 도 27A는 지질 26의 양성자 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼을 도시한 도면. 도 27B는 액체 크로마토그래피-질량 분광광도법(LC-MS)에 의해서 측정된 지질 26의 체류 시간을 도시한 도면. 도 27C는 지질 26의 질량 스펙트럼을 도시한 도면. 도 27D는 지질 27의 양성자 NMR 스펙트럼을 도시한 도면. 도 27E는 LC-MS에 의해서 측정된 지질 27의 체류 시간을 도시한 도면. 도 27F는 지질 27의 질량 스펙트럼을 도시한 도면.
도 28은 지질 22-S14 및 이의 합성 중간체의 분자 특징규명을 도시한 도면. 도 28A는 2-(테트라데실티오)에탄-1-올의 NMR 스펙트럼을 도시한 도면. 도 28B는 2-(테트라데실티오)에틸 아크릴레이트의 NMR 스펙트럼을 도시한 도면. 도 28C는 비스(2-(테트라데실티오)에틸) 3,3'-((3-(2-메틸-1H-이미다졸-1-일)프로필)아잔다이일)다이프로피오네이트(지질 22-S14)의 NMR 스펙트럼을 도시한 도면.
도 29는 비스(2-(테트라데실티오)에틸) 3,3'-((3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)아잔다이일)다이프로피오네이트(지질 93-S14)의 NMR 스펙트럼을 도시한 도면.
도 30은 헵타데칸-9-일 8-((3-(2-메틸-1H-이미다졸-1-일)프로필)(8-(노닐옥시)-8-옥소옥틸)아미노)옥탄오에이트(표 10a로부터의 지질 54)의 분자 특징규명을 도시한 도면. 도 30A는 지질 54의 양성자 NMR 스펙트럼을 도시한 도면. 도 30B는 LC-MS에 의해서 측정된 지질 54의 체류 시간을 도시한 도면. 도 30C는 지질 54의 질량 스펙트럼을 도시한 도면.
도 31은 헵타데칸-9-일 8-((3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)(8-(노닐옥시)-8-옥소옥틸)아미노)옥탄오에이트(표 10a로부터의 지질 53)의 분자 특징규명을 도시한 도면. 도 31A는 지질 53의 양성자 NMR 스펙트럼을 도시한 도면. 도 31B는 LC-MS에 의해서 측정된 지질 53의 체류 시간을 도시한 도면. 도 31C는 지질 53의 질량 스펙트럼을 도시한 도면.
도 32A는 파이어플라이 루시퍼라제(FLuc)를 암호화하고, 16:1:4:1 또는 62:4:33:1 몰비의 중량비의 관심 이온화 가능한 지질, DSPC, 콜레스테롤 및 DSPE-PEG 2000(아반티 폴라 리피즈사(Avanti Polar Lipids Inc.))과 제형화된 원형 RNA가 투여된 CD-1 마우스로부터 수거된 비장 및 간의 총 플럭스를 도시한 도면. 도 32B는 단백질 발현의 생체분포에 대한 평균 라디언스를 도시한 도면.
도 33A는 FLuc를 암호화하고, 16:1:4:1 또는 62:4:33:1 몰비의 중량비로 이온화 가능한 지질 22-S14, DSPC, 콜레스테롤 및 DSPE-PEG 2000(아반티 폴라 리피즈사(Avanti Polar Lipids Inc.))과 제형화된 원형 RNA가 투여된 CD-1 마우스로부터 수거된 기간의 발광을 강조한 영상을 도시한 도면. 도 33B는 FLuc를 암호화하고, 16:1:4:1 또는 62:4:33:1 몰비의 중량비로 이온화 가능한 지질 22-S14, DSPC, 콜레스테롤 및 DSPE-PEG 2000(아반티 폴라 리피즈사(Avanti Polar Lipids Inc.))과 제형화된 원형 RNA가 투여된 CD-1 마우스의 전신 IVIS 영상을 도시한 도면.
도 34A는 FLuc를 암호화하고, 16:1:4:1 또는 62:4:33:1 몰비의 중량비로 이온화 가능한 지질 93-S14, DSPC, 콜레스테롤 및 DSPE-PEG 2000(아반티 폴라 리피즈사)과 제형화된 원형 RNA가 투여된 CD-1 마우스로부터 수거된 기간의 발광을 강조한 영상을 도시한 도면. 도 34B는 FLuc를 암호화하고, 16:1:4:1 또는 62:4:33:1 몰비의 중량비로 이온화 가능한 지질 93-S14, DSPC, 콜레스테롤 및 DSPE-PEG 2000(아반티 폴라 리피즈사)과 제형화된 원형 RNA가 투여된 CD-1 마우스의 전신 IVIS 영상을 도시한 도면.
도 35A는 FLuc를 암호화하고, 16:1:4:1 또는 62:4:33:1 몰비의 중량비의 표 10a로부터의 이온화 가능한 지질 26, DSPC, 콜레스테롤 및 DSPE-PEG 2000(아반티 폴라 리피즈사)과 제형화된 원형 RNA가 투여된 CD-1 마우스로부터 수거된 기간의 발광을 강조한 영상을 도시한 도면. 도 35B는 FLuc를 암호화하고, 16:1:4:1 또는 62:4:33:1 몰비의 중량비로 이온화 가능한 지질 26, DSPC, 콜레스테롤 및 DSPE-PEG 2000(아반티 폴라 리피즈사)과 제형화된 원형 RNA가 투여된 CD-1 마우스의 전신 IVIS 영상을 도시한 도면.
도 36은 FLuc를 암호화하고, 표 10b로부터의 지질 15(도 36A), 표 10a로부터의 지질 53(도 36B) 또는 표 10a로부터의 지질 54(도 36C)로 형성된 지질 나노입자에 캡슐화된 원형 RNA가 투여된 c57BL/6J 마우스로부터 수거된 기간의 발광을 강조한 영상. PBS를 대조군으로 사용하였다(도 36D).
도 37A 및 도 37B는 파이어플라이 루시퍼라제를 암호화하는 원형 RNA를 함유하는 시험 지질 나노입자와 함께 24시간 인큐베이션시킨 후 인간 PBMC의 용해물에서의 상대적인 발광을 도시한 도면.
도 38은 GFP 또는 CD19 CAR을 암호화하는 원형 RNA를 함유하는 시험 지질 나노입자와 함께 인큐베이션시킨 후 인간 PBMC에서 GFP(도 38A) 및 CD19 CAR(도 38B)의 발현을 도시한 도면.
도 39는 항-뮤린 CD19 CAR 발현 서열 및 다양한 IRES 서열을 포함하는 원형 RNA가 지질형질주입된(lipotransfected) 1C1C7 세포에서 항-뮤린 CD19 CAR의 발현을 도시한 도면.
도 40은 뮤린 T 세포에 대한 항-뮤린 CD19 CAR의 세포독성을 도시한 도면. CD19 CAR은 뮤린 T 세포에 전기천공된 원형 RNA에 의해서 암호화되고, 이로부터 발현된다.
도 41은 항-뮤린 CD19 CAR을 암호화한 원형 RNA를 캡슐화한 시험 지질 나노입자를 격일로 주사한 C57BL/6J 마우스에서 말초 혈액(도 40A 및 도 40B) 또는 비장(도 40C)에서 B 세포 계수치를 도시한 도면.
도 42A 및 도 42B는 원형 RNA로부터 발현된 항-인간 CD19 CAR의 발현 수준을 선형 mRNA로부터 발현된 것과 비교한 도면.
도 43A 및 도 43B는 원형 RNA로부터 발현된 항-인간 CD19 CAR의 세포독성 효과를 선형 mRNA로부터 발현된 것과 비교한 도면.
도 44는 T 세포에서 단일 원형 RNA로부터 발현된 2개의 CAR(항-인간 CD19 CAR 및 항-인간 BCMA CAR)의 세포독성을 도시한 도면.
도 45A는 표 10a로부터의 지질 27 또는 26 또는 표 10b로부터의 지질 15로 형성된 LNP로의 처리 후 다양한 비장 면역 세포 하위세트에서 tdTomato 발현의 빈도와 함께 대표적인 FACS 플롯을 도시한 도면. 도 45B는 Cre 원형 RNA가 성공적으로 형질주입된 각각의 세포 집단의 비율과 동등한, tdTomato를 발현하는 골수 세포, B 세포 및 T 세포의 비율의 정량(평균 + 표준 편차, n = 3)을 도시한 도면. 도 45C는 지질 27 및 26으로의 처리 후 tdTomato를 발현하는, NK 세포, 전통적인 단핵구, 비전통적인 단핵구, 호중구 및 수지상 세포를 비롯한 추가 비장 면역 세포 집단의 비율(평균 + 표준 편차, n = 3)을 도시한 도면.
도 46A는 인트론 내에 빌트-인 polyA 서열을 갖는 예시적인 RNA 작제물을 도시한 도면. 도 46B는 정제되지 않은 원형 RNA의 크로마토그래피 트레이스. 도 46C는 친화성-정제된 원형 RNA의 크로마토그래피 트레이스. 도 46D는 다양한 IVT 조건 및 정제 방법을 사용하여 제조된 원형 RNA의 면역원성을 도시한 도면(Commercial = 상업적인 IVT 혼합물; Custom = 항문, 항문관형 IVT 혼합물; Aff = 친화성 정제; Enz = 효소 정제; GMP:GTP 비율 = 8, 12.5 또는 13.75).
도 47A는 혼성화 정제를 위한 polyA에 대한 대안으로서 전용 결합 서열을 갖는 예시적인 RNA 작제물 설계를 도시한 도면. 도 47B는 정제되지 않은 원형 RNA의 크로마토그래피 트레이스. 도 46C는 친화성-정제된 원형 RNA의 크로마토그래피 트레이스.
도 48A는 디스트로핀을 암호화하는 정제되지 않은 원형 RNA의 크로마토그래피 트레이스. 도 48B는 디스트로핀을 암호화하는 효소-정제된 원형 RNA의 크로마토그래피 트레이스.
도 49는 주카트 세포에서 3' 인트론 단편/5' 내부 듀플렉스 영역과 IRES 사이에 상이한 5' 스페이서를 갖는 정제된 circRNA의 발현(도 49A) 및 안정성(도 49B)을 비교한 도면. (AC = A 및 C만 스페이서 서열에 사용함; UC = U 및 C만 스페이서 서열에 사용됨).
도 50은 제시된 본래 또는 변형된 IRES 요소를 함유하는 원형 RNA로부터의 1차 T 세포에서의 발광 발현 수준 및 안정성을 도시한 도면.
도 51은 제시된 본래 또는 변형된 IRES 요소를 함유하는 원형 RNA로부터의 HepG2 세포에서의 발광 발현 수준 및 안정성을 도시한 도면.
도 52는 제시된 본래 또는 변형된 IRES 요소를 함유하는 원형 RNA로부터의 1C1C7 세포에서의 발광 발현 수준 및 안정성을 도시한 도면.
도 53은 삽입된 미번역 영역(UTR)을 갖는 IRES 요소 또는 혼성 IRES 요소를 함유하는 원형 RNA로부터의 HepG2 세포에서의 발광 발현 수준 및 안정성을 도시한 도면. "Scr"은 대조군으로 사용된 스크램블드(Scrambled)를 의미한다.
도 54는 가우시아 루시퍼라제 암호 서열에 작동 가능하게 연결된 가변 중단 코돈 카세트 및 IRES를 함유하는 원형 RNA로부터의 1C1C7 세포에서의 발광 발현 수준 및 안정성을 도시한 도면.
도 55는 가우시안 루시퍼라제 암호 서열의 시작 코돈 이전에 삽입된 가변 미번역 영역(UTR) 및 IRES를 함유하는 원형 RNA로부터의 1C1C7 세포에서의 발광 발현 수준 및 안정성을 도시한 도면.
도 56은 hEPO 암호 서열로부터의 하류에 2개의 miR-122 표적 부위를 함유하는 원형 RNA로부터의 Huh7 세포에서의 인간 에리트로포이에틴(hEPO)의 발현 수준을 도시한 도면.
도 57은 항-CD19 CAR을 발현하는 원형 RNA를 캡슐화한 LNP로 처리되는 경우 말초 혈액(도 57A) 및 비장(도 57B)에서 CAR 발현 수준을 도시한 도면. 항-CD20(aCD20) 및 루시퍼라제를 암호화하는 원형 RNA(oLuc)를 비교를 위해서 사용하였다.
도 58은 항-CD19 CAR 발현의 전체 빈도, 세포의 표면 상에서의 항-CD19 CAR 발현의 빈도 및 T-세포 상의 항-CD19 CAR을 암호화하는 IRES 특이적 원형 RNA의 항종양 반응에 대한 효과를 도시한 도면. 도 58A는 항-CD19 CAR 기하 평균 형광 강도를 도시하고, 도 58B는 항-CD19 CAR 발현 백분율을 도시하고, 도 58C는 항-CD19 CAR에 의해 수행된 표적 세포 용해 백분율을 도시한 도면(CK = 염소 코브바이러스; AP = 등줄쥐 피코르나바이러스; CK* = 코돈 최적화를 갖는 염소 코브바이러스; PV = 파라보바이러스; SV = 살리바이러스).
도 59는 IRES 특이적 원형 RNA 작제물로 처리되는 경우 A20 FLuc 표적 세포의 CAR 발현 수준을 도시한 도면.
도 60은 1차 인간 T-세포에서 원형 RNA로부터의 사이토솔(도 60A) 및 표면(도 60B) 단백질에 대한 발광 발현 수준을 도시한 도면.
도 61은 IRES 특이적 원형 작제물로 처리되는 경우 인간 T-세포에서 발광 발현을 도시한 도면. 원형 RNA 작제물에서의 발현을 선형 mRNA와 비교하였다. 도 61A, 도 61B 및 도 61G는 다수의 공여자 세포에서 가우시아 루시퍼라제 발현을 제공한 도면. 도 61C, 도 61D, 도 61E 및 도 61F는 다수의 공여자 세포에서 파이어플라이 루시퍼라제 발현을 제공한 도면.
도 62는 파이어플라이 루시퍼라제 발현 K562 세포를 항-CD19 또는 항-BCMA CAR을 암호화하는 원형 RNA를 포함하는 지질 나노입자로 처리한 후 인간 T-세포에서 항-CD19 CAR(도 62A 및 도 62B) 및 항-BCMA CAR(도 62B) 발현을 도시한 도면.
도 63은 항-CD19 CAR을 암호화하는 원형 RNA의 시험관내 전기천공을 통한 전달로부터 발생하는 특이적 항원-의존성 방식의 항-CD19 CAR 발현 수준을 도시한 도면. 도 63A는 항-CD19 CAR로의 Nalm6 세포 용해를 도시한 도면. 도 63B는 항-CD19 CAR로의 K562 세포 용해를 도시한 도면.
도 64는 LNP 및 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 원형 RNA를 함유하는 용액에서 ApoE3의 사용에 의해서 매개되는 LNP의 형질주입을 도시한 도면. 도 64A는 생-사 결과를 도시한 도면. 도 64B, 도 61C, 도 61D, 및 도 64E는 다수의 공여자에 대한 발현 빈도를 제공한 도면.
본 발명은 특히 원형 RNA 요법에 기초하여 자가면역 장애 또는 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 2종의 치료용 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 조성물을 자가면역 장애 또는 암의 적어도 하나의 증상 또는 특징이 강도, 중증도 또는 빈도가 감소되거나 발병이 지연되도록 하는 유효 용량 및 투여 간격으로 투여함으로써 자가면역 장애 또는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에는 원형 RNA를 제조하기 위한 벡터가 제공되며, 이 벡터는 선택적인 5' 듀플렉스 형성 영역, 3' 그룹 I 인트론 단편, 선택적으로 제1 스페이서, 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 제1 발현 서열, 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 제2 발현 서열, 선택적으로 제2 스페이서, 5' 그룹 I 인트론 단편 및 선택적인 3' 듀플렉스 형성 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에는 원형 RNA를 제조하기 위한 벡터가 제공되며, 이 벡터는 선택적인 5' 듀플렉스 형성 영역, 3' 그룹 I 인트론 단편, 선택적으로 제1 스페이서, 제1 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 제1 발현 서열, 제2 IRES, 제2 발현 서열, 선택적으로 제2 스페이서, 5' 그룹 I 인트론 단편 및 선택적인 3' 듀플렉스 형성 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 요소는 상기 순서로 벡터에 위치된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 3' 듀플렉스 형성 영역 및 5' 듀플렉스 형성 영역을 함유한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 3' 그룹 I 인트론 단편과 IRES 사이의 내부 5' 듀플렉스 형성 영역 및 발현 서열과 5' 그룹 I 인트론 단편 사이의 내부 3' 듀플렉스 형성 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 내부 듀플렉스 형성 영역은 서로 간에 듀플렉스를 형성할 수 있지만, 외부 듀플렉스 형성 영역과는 형성할 수 없다. 일부 실시형태에서, 내부 듀플렉스 형성 영역은 제1 스페이서 및 제2 스페이서스페이서의 일부이다. 추가 실시형태는 본 명세서에 제공된 벡터를 사용하여 제조된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드, 이러한 원형 RNA를 포함하는 조성물, 이러한 원형 RNA를 포함하는 세포, 이러한 벡터, 원형 RNA, 조성물 및 세포의 사용 및 제조 방법을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에는 유용한 단백질의 요법 또는 생산을 위해 본 명세서에 제공된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 리보뉴클레아제에 대한 원형 RNA의 내성으로 인해, 선형 RNA보다 긴 반감기를 갖는 진핵 세포 내부에서 목적하는 폴리펩타이드의 생산을 제공하는 데 유리하다.
원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 엑소뉴클레아제-매개 분해에 필요한 유리 단부가 결여되어 있어서, RNA 분해의 몇몇 기전에 내성을 갖게 하고, 등가의 선형 RNA와 비교할 때 연장된 반감기를 부여한다. 원형화는 일반적으로 짧은 반감기로 고통받는 RNA 폴리뉴클레오타이드의 안정화를 허용할 수 있고, 다양한 응용에서 외인성 mRNA의 전반적인 효능을 개선시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 단백질 합성에 의해서 평가된 바와 같은 진핵 세포(예를 들어, 인간 세포와 같은 포유동물 세포)에서 본 명세서에 제공된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 기능성 반감기는 적어도 20시간(예를 들어, 적어도 80시간)이다.
1. 정의
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "circRNA" 또는 "원형 폴리리보뉴클레오타이드" 또는 "원형 RNA"는 상호 교환적으로 사용되며, 공유 결합을 통해 원형 구조를 형성하는 폴리리보뉴클레오타이드를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "3' 그룹 I 인트론 단편"은 스플라이스 부위 다이뉴클레오타이드 및 선택적으로 자연 엑손 서열의 스트레치를 포함하는 자연 그룹 I 인트론의 3'-근위 단부와 75% 이상의 유사성을 갖는 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "5' 그룹 I 인트론 단편"은 스플라이스 부위 다이뉴클레오타이드 및 선택적으로 자연 엑손 서열의 스트레치를 포함하는 자연 그룹 I 인트론의 5'-근위 단부와 75% 이상의 유사성을 갖는 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "순열 부위"는 절단이 인트론의 순열 이전에 만들어지는 그룹 I 인트론 내의 부위를 지칭한다. 이 절단은 원형화될 전구체 RNA 스트레치의 양측 상에 존재하도록 순열되는 3' 및 5' 그룹 I 인트론 단편을 생성한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "스플라이스 부위"는 그룹 I 인트론에 부분적으로 또는 완전히 포함되고 RNA 원형화 동안 포스포다이에스터 결합이 절단되는 사이에 존재하는 다이뉴클레오타이드를 지칭한다.
폴리뉴클레오타이드 작제물에서 발현 서열은 발현 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드가 일단 번역되면 세포에 의해 별도로 발현될 수 있게 하는 "절단 부위" 서열에 의해 분리될 수 있다.
"자가-절단 펩타이드"는 2개의 인접한 아미노산 사이에 펩타이드 결합 없이 번역되거나, 폴리펩타이드 및 자가-절단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드가 생산될 때, 그것이 임의의 외부 절단 활성에 대한 필요성 없이 별개의 구분되는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드로 즉시 절단 또는 분리되도록 기능하는 펩타이드를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료용 단백질"은 번역된 핵산의 형태로 대상체에게 직접 또는 간접적으로 투여되는 경우 치료, 진단 및/또는 예방 효과를 갖고/갖거나 목적하는 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 도출하는 임의의 단백질을 지칭한다.
αβ TCR의 α 및 β 쇄는 일반적으로 각각 2개의 도메인 및 영역, 즉, 가변 및 불변 도메인/영역을 갖는 것으로 간주된다. 가변 도메인은 가변 영역과 결합 영역의 연결부(concatenation)로 이루어진다. 따라서, 본 명세서 및 청구범위에서, 용어 "TCR 알파 가변 도메인"은 TRAV 영역과 TRAJ 영역의 연결부를 지칭하고, 용어 TCR 알파 불변 도메인은 세포외 TRAC 영역 또는 C-말단 절단된 TRAC 서열을 지칭한다. 마찬가지로, 용어 "TCR 베타 가변 도메인"은 TRBV 및 TRBD/TRBJ 영역의 연결부를 지칭하고, 용어 TCR 베타 불변 도메인은 세포외 TRBC 영역 또는 C-말단 절단된 TRBC 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역원성"은 물질에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 가능성을 지칭한다. 면역 반응은 유기체의 면역계 또는 특정 유형의 면역 세포가 면역원성 물질에 노출될 때 유도될 수 있다. 용어 "비면역원성"은 물질에 대한 검출 가능한 역치를 초과하는 면역 반응의 결여 또는 부재를 지칭한다. 유기체의 면역계 또는 특정 유형의 면역 세포가 비-면역원성 물질에 노출될 때 어떠한 면역 반응도 검출되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 비-면역원성 원형 폴리리보뉴클레오타이드는 면역원성 검정에 의해 측정될 때 미리 결정된 역치를 초과하는 면역 반응을 유도하지 않는다. 일부 실시형태에서, 유기체 또는 특정 유형의 면역 세포의 면역계가 본 명세서에 제공된 바와 같은 비-면역원성 원형 폴리리보뉴클레오타이드에 노출될 때 선천성 면역 반응이 검출되지 않는다. 일부 실시형태에서, 유기체 또는 특정 유형의 면역 세포의 면역계가 본 명세서에 제공된 바와 같은 비-면역원성 원형 폴리리보뉴클레오타이드에 노출될 때 적응성 면역 반응이 검출되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "원형화 효율"은 선형 출발 물질과 비교할 때 생성된 원형 폴리리보뉴클레오타이드의 측정치를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "번역 효율"은 리보뉴클레오타이드 전사체로부터의 단백질 또는 펩타이드 생산의 속도 또는 양을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 번역 효율은 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 전사체의 주어진 양당 생산된 단백질 또는 펩타이드의 양으로 표현될 수 있다.
용어 "뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 이들의 변형된 형태 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 뉴클레오타이드는 퓨린, 예를 들어, 아데닌, 하이포잔틴, 구아닌, 및 이들의 유도체 및 유사체, 뿐만 아니라 피리미딘, 예를 들어, 사이토신, 우라실, 티민 및 이들의 유도체 및 유사체를 포함하는 종을 포함한다. 뉴클레오타이드 유사체는 5'-위치 피리미딘 변형, 8'-위치 퓨린 변형, 사이토신 엑소사이클릭 아민에서의 변형 및 5-브로모-우라실을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 염기, 당 및/또는 인산염의 화학적 구조에 변형; 및 2'-OH가 H, OR, R, 할로, SH, SR, NH2, NHR, NR2 또는 CN(식 중, R은 본 명세서에 정의된 바와 같은 알킬 모이어티임)과 같은 기로 대체된 당-변형된 리보뉴클레오타이드를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 2'-위치 당 변형을 갖는 뉴클레오타이드를 포함한다. 뉴클레오타이드 유사체는 또한 이노신, 퀴오신, 잔틴과 같은 염기를 갖는 뉴클레오타이드; 2'-메틸 리보스 등과 같은 당; 메틸포스포네이트, 포스포로티오에이트 및 펩타이드 연결부와 같은 비-자연 포스포다이에스터 연결부를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하는 의미이다. 뉴클레오타이드 유사체는 5-메톡시우리딘, 1-메틸슈도우리딘 및 6-메틸아데노신을 포함한다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 임의의 길이, 예를 들어, 약 2개 초과의 염기, 약 10개 초과의 염기, 약 100개 초과의 염기, 약 500개 초과의 염기, 1000개 초과의 염기 또는 최대 약 10,000개 초과 염기의 중합체를 설명하기 위해 상호 교환적으로 사용되며, 이것은 뉴클레오타이드, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드로 구성되고 효소적으로 또는 합성적으로 생성될 수 있고(예를 들어, 미국 특허 제5,948,902호 및 이 문헌에 인용된 참고문헌에 기재된 바와 같음), 이것은 2개의 자연 발생 핵산과 유사한 서열 특이적 방식으로 자연 발생 핵산과 혼성화할 수 있고, 예를 들어, 왓슨-크릭 염기 짝지움 상호작용에 참여할 수 있다. 자연 발생 핵산은 구아닌, 사이토신, 아데닌, 티민 및 우라실(각각G, C, A, T 및 U)을 포함하는 뉴클레오타이드로 구성된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "리보핵산" 및 "RNA"는 리보뉴클레오타이드로 구성된 중합체를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "데옥시리보핵산" 및 "DNA"는 데옥시리보뉴클레오타이드로 구성된 중합체를 의미한다.
"단리된" 또는 "정제된"은 일반적으로 물질(예를 들어, 일부 실시형태에서 화합물, 폴리뉴클레오타이드, 단백질, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 조성물 또는 폴리펩타이드 조성물)이 그것이 존재하는 샘플의 상당한 백분율(예를 들어, 1% 초과, 2% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 20% 초과, 50% 초과, 또는 일반적으로 최대 약 90% 내지 100%)을 차지하도록 하는 물질의 단리를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 실질적으로 정제된 성분은 샘플의 적어도 50%, 80% 내지 85%, 또는 90% 내지 95%를 차지한다. 관심 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 정제시키기 위한 기술은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 밀도에 따른 침강을 포함한다. 일반적으로, 물질은 샘플의 다른 성분에 비해 자연적으로 발견되는 양보다 많은 양이 샘플에 존재할 때 정제된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "듀플렉스화", "이중 가닥" 또는 "혼성화"는 상보적 서열을 함유하는 핵산의 2개의 단일 가닥의 혼성화에 의해 형성된 핵산을 지칭한다. 대부분의 경우 게놈 DNA는 이중 가닥이다. 서열은 완전히 상보적이거나 부분적으로 상보적일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, RNA와 관련하여 "비구조화된"은 그 자체 또는 동일한 RNA 분자 내의 다른 서열과 함께 구조(예를 들어, 헤어핀 루프)를 형성하는 것으로 RNAFold 소프트웨어 또는 유사한 예측 도구에 의해 예측되지 않은 RNA 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 비구조화된 RNA는 뉴클레아제 보호 검정을 사용하여 기능적으로 특징규명될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, RNA와 관련하여 "구조화된"은 그 자체 또는 동일한 내의 다른 서열과 함께 구조(예를 들어, 헤어핀 루프)를 형성하는 것으로 RNAFold 소프트웨어 또는 유사한 예측 도구에 의해 예측된 RNA 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 2개의 "듀플렉스 형성 영역", "상동성 아암" 또는 "상동성 영역"은 2개의 영역이 서로의 역상보체에 대해 충분한 수준의 서열 동일성을 공유하여 혼성화 반응에 대한 기질로서 작용하는 경우 서로 보완하거나 상보적이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 폴리뉴클레오타이드 서열은 역상보체 또는 "상보적" 서열과 동일하거나 서열 동일성을 공유할 때 "상동성"을 갖는다. 듀플렉스 형성 영역과 대응 듀플렉스 형성 영역의 역상보체 사이의 백분율 서열 동일성은 혼성화가 일어나도록 하는 서열 동일성의 임의의 백분율일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 내부 듀플렉스 형성 영역은 또 다른 내부 듀플렉스 형성 영역과 듀플렉스를 형성할 수 있고, 외부 듀플렉스 형성 영역과 듀플렉스를 형성하지 않는다.
선형 핵산 분자는 핵산 포스포다이에스터 연결부가 치환체 모노뉴클레오타이드의 당 모이어티의 5' 탄소 및 3' 탄소에서 발생하기 때문에 "5'-말단"(5' 단부) 및 "3'-말단"(3' 단부)을 갖는다고 한다. 새로운 연결부가 5' 탄소에 있을 폴리뉴클레오타이드의 단부 뉴클레오타이드는 이의 5' 말단 뉴클레오타이드이다. 새로운 연결부가 3' 탄소에 있을 폴리뉴클레오타이드의 단부 뉴클레오타이드는 이의 3' 말단 뉴클레오타이드이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 말단 뉴클레오타이드는 3'- 또는 5'-말단의 단부 위치에 존재하는 뉴클레오타이드이다.
"전사"는 DNA 분자를 주형으로 사용하는 RNA 중합효소에 의한 RNA 분자의 형성 또는 합성을 의미한다. 본 발명은 전사에 사용되는 RNA 중합효소에 대해 제한되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, T7-타입 RNA 중합효소가 사용될 수 있다.
"번역"은 RNA 주형에 기초한 리보솜에 의한 폴리펩타이드 분자의 형성을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 내용이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 2개 이상의 세포의 조합, 또는 세포의 전체 배양물을 포함하고; "폴리뉴클레오타이드"에 대한 언급은 실질적으로 그 폴리뉴클레오타이드의 다수의 카피를 포함한다. 구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다. 본 명세서의 상기에서 본 명세서 및 하기에 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
구체적으로 언급되지 않거나 문맥상 명백하지 않은 한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 당업계에서 통상적인 허용 오차 범위 내, 예를 들어, 평균의 2 표준 편차 내로 이해된다. "약"은 제시된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02% 또는 0.01% 이내인 것으로 이해될 수 있다. 문맥상 달리 명백하지 않는 한, 본 명세서에 제공된 모든 수치는 "약"이라는 용어로 수식된다.
본 명세서에 사용된 용어 "암호화하다"는 중합체 매크로분자(polymeric macromolecule)의 정보가 첫 번째 분자와 상이한 두 번째 분자의 생산을 지시하는 데 사용되는 임의의 과정을 광범위하게 지칭한다. 두 번째 분자는 첫 번째 분자의 화학적 성질과 상이한 화학 구조를 가질 수 있다.
"공동 투여"는 본 명세서에 제공된 치료제가 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 향상시킬 수 있도록 또는 그 역이도록 시간이 충분히 근접한 하나 이상의 추가 치료제와 함께 본 명세서에 제공된 치료제를 투여하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료하다" 및 "예방하다" 및 이로부터 파생된 단어는 반드시 100% 또는 완전한 치료 또는 예방을 의미하는 것은 아니다. 오히려, 당업자가 잠재적인 이점 또는 치료 효과를 갖는 것으로 인식하는 다양한 정도의 치료 또는 예방이 존재한다. 본 명세서에 개시된 방법에 의해 제공되는 치료 또는 예방은 질환의 하나 이상의 상태 또는 증상의 치료 또는 예방을 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서의 목적을 위해, "예방"은 질환 또는 이의 증상 또는 병태의 발병을 지연시키는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "자가면역"은 포유동물 및 인간 내에 침입하여 지속하는 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생 유기체로부터의 감염성 비-자가-항원과 구별되는, 비-감염성 자가-항원에 대한 지속적이고 점진적인 면역 반응으로 정의된다. 자가면역 병태는 경피증, 그레이브스병, 크론병, 쇼그렌병, 다발성 경화증, 하시모토병, 건선, 중증 근무력증, 자가면역 다발성 내분비병증 증후군, 제I형 당뇨병(TIDM), 자가면역 위염, 자가면역 포도막염, 다발성근염, 대장염 및 갑상선염, 뿐만 아니라 인간 루푸스로 대표되는 전신성 자가면역 질환을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "자가항원" 또는 "자가-항원"은 포유동물에서 천연이고, 상기 포유동물에서 면역원성인 항원 또는 에피토프를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "발현 서열"은 산물, 예를 들어, 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 조절 핵산, 또는 비-암호 핵산을 암호화하는 핵산 서열을 지칭할 수 있다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 예시적인 발현 서열은 복수의 뉴클레오타이드 트라이어드를 포함할 수 있으며, 이들 각각은 아미노산을 암호화할 수 있고 "코돈"으로 지칭된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "스페이서"는 폴리뉴클레오타이드 서열을 따라 2개의 다른 요소를 분리하는 1개 뉴클레오타이드 내지 수백 또는 수천 개의 뉴클레오타이드 범위의 폴리뉴클레오타이드 서열 영역을 지칭한다. 서열은 정의되거나 무작위일 수 있다. 스페이서는 일반적으로 비-암호화된다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 듀플렉스 형성 영역을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "내부 리보솜 유입 부위" 또는 "IRES"는 10nt 내지 1000nt 또는 그 초과의 크기 범위의 RNA 서열 또는 구조 요소이며, 이것은 전형적인 RNA 캡 구조의 부재 하에서의 폴리펩타이드의 번역을 개시할 수 있다. IRES는 전형적으로 약 500nt 내지 약 700nt 길이이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "miRNA 부위"는 자연 miRNA 서열의 적어도 8개의 뉴클레오타이드와 듀플렉스를 형성할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 내의 뉴클레오타이드의 스트레치를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "엔도뉴클레아제 부위"는 엔도뉴클레아제 단백질에 의해 인식 및 절단될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 내의 뉴클레오타이드의 스트레치를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "바이시스트론성(bicistronic) RNA"는 2개의 구별되는 단백질을 암호화하는 2개의 발현 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 이들 발현 서열은 종종 2A 부위 또는 IRES 서열과 같은 절단 가능한 펩타이드에 의해 분리된다. 이들은 또한 리보솜 스키핑 요소 또는 프로테아제 절단에 의해서 분리될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "리보솜 스키핑 요소"는 하나의 RNA 분자의 번역으로부터 2개의 펩타이드 쇄의 생성을 초래할 수 있는 짧은 펩타이드 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 리보솜 스키핑 요소는 다음에 의해서 기능한다고 가정된다: (1) 제1 펩타이드 쇄의 말단 번역 및 제2 펩타이드 쇄의 재-초기 번역; 또는 (2) 암호화된 펩타이드의 내인성 프로테아제 활성에 의한 또는 환경(예를 들어, 사이토솔) 내의 또 다른 프로테아제에 의한 리보솜 스크핑 요소에 의해서 암호화된 펩타이드 서열 내의 펩타이드 결합의 절단.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "공동제형화하다"는 2개 이상의 핵산 또는 핵산 및 다른 활성 약물 물질을 포함하는 나노입자 제형을 지칭한다. 전형적으로, 비율은 등몰이거나 둘 이상의 핵산 또는 핵산 및 다른 활성 약물 물질의 비율적 양으로 정의된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "전달 비히클"은 일반적으로 핵산을 포함하는 생물학적 활성제의 투여와 관련하여 사용하도록 의도된 임의의 표준 약제학적 담체, 희석제, 부형제 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "지질 나노입자"라는 어구는 하나 이상의 지질(예를 들어, 일부 실시형태에서 양이온성 지질, 비-양이온성 지질 및 PEG-변형된 지질)을 포함하는 전달 비히클을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "양이온성 지질"이라는 어구는 생리 pH와 같은 선택된 pH에서 순 양전하를 갖는 다수의 지질 종 중 임의의 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "비-양이온성 지질"이라는 어구는 임의의 중성, 양쪽이온성 또는 음이온성 지질을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "음이온성 지질"이라는 어구는 생리 pH와 같은 선택된 pH에서 순 음전하를 갖는 다수의 지질 종 중 임의의 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "이온화 가능한 지질"이라는 문구는 생리 pH 4와 같은 선택된 pH에서 순 양전하를 갖고 생리 pH 7과 같은 다른 pH에서 중성 전하를 갖는 다수의 지질 종 중 임의의 것을 지칭한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 지질, 예를 들어, 이온화 가능한 지질은 하나 이상의 절단 가능한 기를 포함한다. 용어 "절단하다" 및 "절단 가능한"은 본 명세서에서 대상 작용기 내의 또는 이에 인접한 원자 사이의 하나 이상의 화학 결합(예를 들어, 공유 결합, 수소 결합, 반데르발스힘 및/또는 이온성 상호작용 중 하나 이상)이 파괴되거나(예를 들어, 가수분해되거나), 선택된 조건에 노출될 때(예를 들어, 효소 조건에 노출될 때) 파괴될 수 있음을 의미하는 데 사용된다. 특정 실시형태에서, 절단 가능한 기는 이황화 작용기이고, 특정 실시형태에서 선택된 생물학적 조건(예를 들어, 세포내 조건)에 노출될 때 절단될 수 있는 이황화기이다. 특정 실시형태에서, 절단 가능한 기는 선택된 생물학적 조건에 노출될 때 절단될 수 있는 에스터 작용기이다. 예를 들어, 이황화기는 효소에 의해 또는 가수분해, 산화 또는 환원 반응에 의해 절단될 수 있다. 이러한 이황화 작용기의 절단 시, 이에 결합된 하나 이상의 작용기 모이어티 또는 기(예를 들어, 헤드기 및/또는 테일기 중 하나 이상)가 해방될 수 있다. 예시적인 절단 가능한 기는 이황화기, 에스터기, 에터기 및 이들의 임의의 유도체(예를 들어, 알킬 및 아릴 에스터)를 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 절단 가능한 기는 에스터기 또는 에터기가 아니다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한 기는 하나 이상의 작용성 모이어티 또는 기(예를 들어, 적어도 하나의 헤드기 및 적어도 하나의 테일기)에 결합된다(예를 들어, 수소 결합, 반 데르 발스 힘, 이온성 상호작용 및 공유 결합 중 하나 이상에 의해 결합된다). 특정 실시형태에서, 작용성 모이어티 또는 기 중 적어도 하나는 친수성이다(예를 들어, 이미다졸, 구아니디늄, 아미노, 이민, 엔아민, 선택적으로-치환된 알킬 아미노 및 피리딜 중 하나 이상을 포함하는 친수성 헤드기).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "친수성"은 작용기가 물-선호적이며, 전형적으로 이러한 기가 수용성임을 정성적 용어로 나타내기 위해 사용된다. 예를 들어, 본 명세서에는 하나 이상의 친수성 기(예를 들어, 친수성 헤드기)에 결합된 절단 가능한 이황화(S-S) 작용기를 포함하는 화합물이 개시되며, 여기서 이러한 친수성 기는 이미다졸, 구아니디늄, 아미노, 이민, 엔아민, 선택적으로 치환된 알킬 아미노(예를 들어, 알킬 아미노, 예컨대, 다이메틸아미노) 및 피리딜을 포함하거나 이들로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물을 포함하는 모이어티의 작용기 중 적어도 하나는 자연에서 소수성이다(예를 들어, 콜레스테롤과 같은 자연 발생 지질을 포함하는 소수성 테일기). 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "소수성"은 작용기가 물-회피성이며, 전형적으로 이러한 기가 수용성이 아님을 정성적 용어로 나타내기 위해 사용된다. 예를 들어, 본 명세서에는 하나 이상의 소수성 기에 결합된 절단 가능한 작용기(예를 들어, 이황화(S-S) 기)를 포함하는 화합물이 개시되며, 여기서 이러한 소수성 기는 콜레스테롤과 같은 하나 이상의 자연 발생 지질 및/또는 선택적으로 치환된, 가변적으로 포화 또는 불포화된 C6-C20 알킬 및/또는 선택적으로 치환된, 가변적으로 포화 또는 불포화된 C6-C20 아실을 포함한다.
본 명세서에 기재된 화합물은 하나 이상의 동위원소 치환을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, H는 1H, 2H(D 또는 중수소) 및 3H(T 또는 삼중수소)를 비롯한 임의의 동위원소 형태로 존재할 수 있고; C는 12C, 13C 및 14C를 비롯한 임의의 동위원소 형태로 존재할 수 있고; O는 16O 및 18O를 비롯한 임의의 동위원소 형태로 존재할 수 있고; F는 18F a및 19F를 비롯한 임의의 동위원소 형태로 존재할 수 있고; 그 등등이다.
화합물 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 이러한 화합물을 함유하는 약제학적 조성물 및 이러한 화합물 및 조성물의 사용 방법을 포함할 수 있는 본 발명을 기재하는 경우, 하기 용어는 존재하는 경우 달리 제시되지 않는 한 다음 의미를 갖는다. 또한, 본 명세서에 기술될 때 하기에 정의된 임의의 모이어티는 다양한 치환체로 치환될 수 있으며, 각각의 정의는 하기에 제시된 범주 내에서 그러한 치환된 모이어티를 포함하도록 의도된다는 것을 또한 이해해야 한다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 "치환된"은 다음과 같이 정의된다. 용어 "기" 및 "라디칼"은 본 명세서에서 사용되는 경우 상호 교환 가능한 것으로 간주될 수 있음을 추가로 이해해야 한다.
값의 범위가 열거되는 경우, 그 범위 내의 각각의 값 및 하위 범위를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, "C1-6 알킬"은 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C1-5, C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-5, C2-4, C2-3, C3-6, C3-5, C3-4, C4-6, C4-5 및 C5-6 알킬을 포함하도록 의도된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 예를 들어, 각각이 적어도 하나의 절단 가능한 기에 결합되어 이러한 화합물을 양친매성으로 만드는 적어도 하나의 친수성 헤드기 및 적어도 하나의 소수성 테일기를 포함한다. 화합물 또는 조성물을 설명하기 위해 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "양친매성"은 극성(예를 들어, 물) 및 비극성(예를 들어, 지질) 환경 모두에서 용해되는 능력을 의미한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 각각 절단 가능한 기(예를 들어, 이황화)에 결합된 적어도 하나의 친유성 테일기(예를 들어, 콜레스테롤 또는 C6-C20 알킬) 및 적어도 하나의 친수성 헤드기(예를 들어, 이미다졸)를 포함한다.
사용되는 바와 같은 용어 "헤드기" 및 "테일기"는 본 발명의 화합물을 기술하고, 특히 이러한 화합물을 포함하는 특정 작용기는 다른 작용기에 비해 하나 이상의 작용기의 배향을 기재하기 위해서 참조의 용이성을 위해서 사용된다는 것을 주목해야 한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서 친수성 헤드기(예를 들어, 구아니디늄)는 절단 가능한 작용기(예를 들어, 이황화기)에 (수소 결합, 반 데르 발스 힘, 이온성 상호작용 및 공유 결합 중 하나 이상에 의해서) 결합되고, 그 다음 소수성 테일기(예를 들어, 콜레스테롤)에 결합된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "알킬"은 직쇄 및 분지쇄 C1-C40 탄화수소(예를 들어, C6-C20 탄화수소) 둘 다를 지칭하고, 포화 및 불포화 탄화수소를 모두 포함한다. 특정 실시형태에서, 알킬은 하나 이상의 환식 알킬 및/또는 하나 이상의 헤테로원자, 예컨대, 산소, 질소 또는 황을 포함할 수 있고 선택적으로 치환체(예를 들어, 알킬, 할로, 알콕실, 하이드록시, 아미노, 아릴, 에터, 에스터 또는 아마이드 중 하나 이상)로 치환될 수 있다. 특정 실시형태에서, 고려되는 알킬은 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔을 포함한다. 예를 들어, "C6-C20"과 같은 명칭의 사용은 언급된 범위의 탄소 원자를 갖는 알킬(예를 들어, 직쇄형 또는 분지쇄형 및 알켄 및 알킬 포함)을 지칭하도록 의도된다. 일부 실시형태에서, 알킬기는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다("C1-10 알킬"). 일부 실시형태에서, 알킬기는 1 내지 9개의 탄소 원자를 갖는다("C1-9 알킬"). 일부 실시형태에서, 알킬기는 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다("C1-8 알킬"). 일부 실시형태에서, 알킬기는 1 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다("C1-7 알킬"). 일부 실시형태에서, 알킬기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다("C1-6 알킬"). 일부 실시형태에서, 알킬기는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다("C1-5 알킬"). 일부 실시형태에서, 알킬기는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다("C1-4 알킬"). 일부 실시형태에서, 알킬기는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다("C1-3 알킬"). 일부 실시형태에서, 알킬기는 1 내지 2개의 탄소 원자를 갖는다("C1-2 알킬"). 일부 실시형태에서, 알킬기는 1개의 탄소 원자를 갖는다("C1 알킬"). C1-6 알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, 펜틸, 헥실 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "알켄일"은 2 내지 20개의 탄소 원자, 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 탄소-탄소 이중 결합), 및 선택적으로 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 탄소-탄소 삼중 결합)을 갖는 직쇄형 또는 분지형 탄화수소기의 라디칼을 지칭한다("C2-20 알켄일"). 특정 실시형태에서, 알켄일은 어떠한 삼중 결합도 함유하지 않는다. 일부 실시형태에서, 알켄일기는 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다("C2-10 알켄일"). 일부 실시형태에서, 알켄일기는 2 내지 9개의 탄소 원자를 갖는다("C2-9 알켄일"). 일부 실시형태에서, 알켄일기는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다("C2-8 알켄일"). 일부 실시형태에서, 알켄일기는 2 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다("C2-7 알켄일"). 일부 실시형태에서, 알켄일기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다("C2-6 알켄일"). 일부 실시형태에서, 알켄일기는 2 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다("C2-5 알켄일"). 일부 실시형태에서, 알켄일기는 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다("C2-4 알켄일"). 일부 실시형태에서, 알켄일기는 2 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다("C2-3 알켄일"). 일부 실시형태에서, 알켄일기는 2개의 탄소 원자를 갖는다("C2 알켄일"). 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합이 내부(예컨대, 2-부텐일에서) 또는 말단(예컨대, 1-부텐일에서)에 존재할 수 있다. C2-4 알켄일기의 예는 에텐일(C2), 1-프로펜일(C3), 2-프로펜일(C3), 1-부텐일(C4), 2-부텐일(C4), 부타다이엔일(C4) 등을 포함한다. C2-6 알켄일기의 예는 상기에 언급된 C2-4 알켄일기뿐만 아니라 펜틸 (C5), 펜타다이엔일(C5), 헥센일(C6) 등을 포함한다. 알켄일의 추가 예는 헵텐일(C7), 옥텐일(C8), 옥타트라이엔일(C8) 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "알킨일"은 2 내지 20개의 탄소 원자, 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 탄소-탄소 삼중 결합), 및 선택적으로 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 탄소-탄소 이중 결합)을 갖는 직쇄형 또는 분지형 탄화수소기의 라디칼을 지칭한다("C2-20 알킨일"). 특정 실시형태에서, 알킨일은 어떠한 이중 결합도 함유하지 않는다. 일부 실시형태에서, 알킨일기는 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다("C2-10 알킨일"). 일부 실시형태에서, 알킨일기는 2 내지 9개의 탄소 원자를 갖는다("C2-9 알킨일"). 일부 실시형태에서, 알킨일기는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다("C2-8 알킨일"). 일부 실시형태에서, 알킨일기는 2 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다("C2-7 알킨일"). 일부 실시형태에서, 알킨일기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다("C2-6 알킨일"). 일부 실시형태에서, 알킨일기는 2 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다("C2-5 알킨일"). 일부 실시형태에서, 알킨일기는 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다("C2-4 알킨일"). 일부 실시형태에서, 알킨일기는 2 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다("C2-3 알킨일"). 일부 실시형태에서, 알킨일기는 2개의 탄소 원자를 갖는다("C2 알킨일"). 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합이 내부(예컨대, 2-부틴일에서) 또는 말단(예컨대, 1-부틴일에서)에 존재할 수 있다. C2-4 알킨일기의 예는 비제한적으로 에틴일(C2), 1-프로핀일(C3), 2-프로핀일(C3), 1-부틴일(C4), 2-부틴일(C4) 등을 포함한다. C2-6 알켄일기의 예는 상기에 언급된 C2-4 알킨일기뿐만 아니라 펜틴일(C5), 헥신일(C6) 등을 포함한다. 알킨일의 추가 예는 헵틴일(C7), 옥틴일(C8) 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "알킬렌", "알켄일렌" 및 "알킨일렌"은 각각 알킬, 알켄일 및 알킨일기의 2가 라디칼을 지칭한다. 탄소의 범위 또는 수가 특정 "알킬렌", "알켄일렌" 또는 "알킨일렌"기에 대해서 제공되는 경우, 그 범위 또는 수는 선형 탄소 2가 쇄 내의 탄소의 범위 또는 수를 지칭한다. "알킬렌", "알켄일렌" 및 "알킨일렌"기는 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 치환체로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "아릴"은 고리 부분에 6 내지 10개의 탄소를 함유하는 방향족 기(예를 들어, 단환식, 이환식 및 삼환식 구조)를 지칭한다. 아릴기는 이용 가능한 탄소 원자를 통해 선택적으로 치환될 수 있고, 특정 실시형태에서 하나 이상의 헤테로원자, 예컨대, 산소, 질소 또는 황을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아릴기는 6개의 고리 탄소 원자("C6 아릴"; 예를 들어, 페닐)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 아릴기는 10개의 탄소 원자("C10 아릴"; 예를 들어, 나프틸 예컨대, 1-나프틸 및 2-나프틸)를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "헤테로아릴"은 방향족 고리 시스템에 제공된 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5 내지 10원의 단환식 또는 이환식 4n+2 방향족 고리 시스템(예를 들어, 환식 배열에 공유된 6 또는 10개의 전자를 가짐)의 라디칼을 지칭하고, 여기서 각각의 헤테로원자는 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된다("5 내지 10원 헤테로아릴"). 하나 이상의 질소 원자를 함유하는 헤테로아릴기에서, 부착점은 원자가가 허용하는 한 탄소 또는 질소 원자일 수 있다. 헤테로아릴 이환식 고리 시스템은 하나 또는 양쪽 고리에 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다. "헤테로아릴"은 상기에 정의된 바와 같은 헤테로아릴 고리가 하나 이상의 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴기와 융합되고, 부착점이 헤테로아릴 고리 상에 존재하는 고리 시스템을 포함하고, 이러한 예에서 고리 구성원의 수는 헤테로아릴 고리 시스템 내의 고리 구성원의 수를 계속 지정한다. "헤테로아릴"은 또한 상기에 정의된 바와 같은 헤테로아릴 고리가 하나 이상의 아릴기와 융합된 고리 시스템을 포함하되, 부착점은 아릴 또는 헤테로아릴 고리 상에 존재하고, 이러한 예에서 고리 구성원의 수는 융합된(아릴/헤테로아릴) 고리 시스템 내의 고리 구성원의 수를 지정한다. 하나의 고리가 헤테로원자를 함유하지 않는 이환식 헤테로아릴기(예를 들어, 인돌릴, 퀴놀리닐, 카바졸릴 등)에서 부착점은 고리, 즉 헤테로원자를 갖는 고리(예를 들어, 2-인돌릴) 또는 헤테로원자를 포함하지 않는 고리(예를 들어, 5-인돌릴) 상에 존재할 수 있다.
용어 "사이클로알킬"은 본 명세서에 언급된 3 내지 12, 3 내지 8, 4 내지 8, 또는 4 내지 6개 탄소의 1가 포화 환식, 이환식 또는 가교된 환식(예를 들어, 아다만틸) 탄화수소 기, 예를 들어, 사이클로알칸으로부터 유래된 "C4-8사이클로알킬"을 지칭한다. 예시적인 사이클로알킬기는 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 사이클로부탄 및 시클로프로판을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "헤테로사이클릴" 또는 "헤테로사이클릭"은 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 3- 내지 10-원 비-방향족 고리 시스템의 라디칼을 지칭하고, 여기서 각각의 헤테로원자는 질소, 산소, 황, 붕소, 인 및 규소("3 내지 10원 헤테로사이클릴")로부터 독립적으로 선택된다. 하나 이상의 질소 원자를 함유하는 헤테로사이클릴기에서, 부착점은 원자가가 허용하는 한 탄소 또는 질소 원자일 수 있다. 헤테로사이클릴기는 단환식("단환식 헤테로사이클릴") 또는 융합, 가교 또는 스피로 고리 시스템, 예컨대, 이환식 시스템("이환식 헤테로사이클릴")일 수 있고, 포화될 수 있거나, 부분적으로 불포화될 수 있다. 헤테로사이클릴 이환식 고리 시스템은 하나 또는 양쪽 고리에 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다. "헤테로사이클릴"은 또한 상기에 정의된 바와 같은 헤테로사이클릴 고리가 하나 이상의 카보사이클릴기와 융합되고, 부착점이 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴 고리 상에 존재하는 고리 시스템, 또는 상기에 정의된 바와 같은 헤테로사이클릴 고리가 하나 이상의 아릴 또는 헤테로아릴기와 융합되고, 부착점이 헤테로사이클릴 고리 상에 존재하는 고리 시스템을 포함하고, 이러한 예에서 고리 구성원의 수는 헤테로사이클릴 고리 시스템 내의 고리 구성원의 수를 계속 지정한다. 용어 "헤테로사이클", "헤테로사이클릴", "헤테로사이클릴 고리", "헤테로사이클릭기", "헤테로사이클릭 모이어티" 및 "헤테로사이클릭 라디칼"은 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "사이아노"는 -CN을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "할로" 및 "할로겐"은 플루오린(플루오로, F), 염소(클로로, Cl), 브로민(브로모, Br) 및 아이오딘(아이오도, I)로부터 선택된 원자를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 할로기는 플루오로 또는 클로로이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "알콕시"는 산소 원자(-O(알킬))를 통해 다른 부분에 부착된 알킬기를 지칭한다. 비제한적인 예는 예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로폭시 및 부톡시를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "옥소"는 -C=O를 지칭한다.
일반적으로, "선택적으로"라는 용어가 앞에 있든 없든, 용어 "치환된"은 기(예를 들어, 탄소 또는 질소 원자) 상에 존재하는 적어도 하나의 수소가 허용 가능한 치환체, 예를 들어, 치환 시 안정적인 화합물, 예를 들어, 변형, 예컨대, 재배열, 고리화, 제거 또는 다른 반응을 자발적으로 겪지 않는 화합물을 생성하는 치환체로 대체된다는 것을 의미한다. 달리 제시되지 않는 한, "치환된" 기는 기의 하나 이상의 치환 가능한 위치에 치환체를 가지며, 임의의 주어진 구조에서 하나 초과의 위치가 치환되는 경우, 치환체는 각각의 위치에서 동일하거나 상이하다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한 염"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합리적인 유익/유해 비율에 상응하는 염을 지칭한다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, Berge 등은 문헌[J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1-19]에서 약제학적으로 허용 가능한 염을 자세히 기재한다. 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염은 적합한 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유래된 것을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 무독성 산 부가염의 예는 무기산, 예컨대, 염산, 브로민화수소산, 인산, 황산 및 과염소산 또는 유기산, 예컨대, 아세트산, 옥살산, 말레산, 타타르산, 시트르산, 석신산 또는 말론산 또는 당업계에서 사용되는 다른 방법, 예컨대, 이온 교환을 사용하여 형성된 아미노기의 염이다. 다른 약제학적으로 허용 가능한 염은 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 다이글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 폼에이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로아이오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타트레이트, 티오사이아네이트, p-톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다. 적절한 염기로부터 유래되는 약제학적으로 허용 가능한 염은 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄 및 N+(C1-4알킬)4 염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 추가의 약제학적으로 허용 가능한 염은 적절한 경우 무독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 반대이온, 예컨대, 할라이드, 하이드록사이드, 카복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 저급 알킬 설포네이트 및 아릴 설포네이트를 사용하여 형성된 아민 양이온을 포함한다.
전형적인 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 화합물, 및 이러한 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염, 약제학적으로 허용 가능한 에스터, 호변이성질체 형태, 다형체 및 전구약물을 포괄하도록 의도된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 부가염, 약제학적으로 허용 가능한 에스터, 부가염의 용매화물(예를 들어, 수화물), 호변이성질체 형태, 다형체, 거울상이성질체, 거울상이성질체의 혼합물, 입체이성질체 또는 입체이성질체의 혼합물(순수한 것 또는 라세미 또는 비-라세미 혼합물)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 포함할 수 있고, 따라서 다양한 이성질체 형태, 예를 들어, 거울상이성질체 및/또는 부분입체이성질체로 존재할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 화합물은 개별 거울상이성질체, 부분입체이성질체 또는 기하 이성질체의 형태로 존재할 수 있거나, 라세미 혼합물 및 하나 이상의 입체이성질체가 풍부한 혼합물을 비롯한 입체이성질체의 혼합물 형태로 존재할 수 있다. 이성질체는 카이럴 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 카이럴 염의 형성 및 결정화를 비롯한, 당업계에 공지된 방법에 의해서 혼합물로부터 단리될 수 있거나; 바람직한 이성질체는 비대칭 합성에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Jacques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981); Wilen et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); 및 Wilen, Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972)] 참조. 본 발명은 다른 이성질체가 실질적으로 없는 개별 이성질체로서, 그리고 대안적으로 다양한 이성질체의 혼합물로서 본 명세서에 기재된 화합물을 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 화합물 및 이러한 화합물이 성분인 전달 비히클(예를 들어, 지질 나노입자)은 하나 이상의 표적 세포를 형질주입시키는 향상된(예를 들어, 증가된) 능력을 나타낸다. 따라서, 또한 본 명세서에는 하나 이상의 표적 세포를 형질주입시키는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 일반적으로 하나 이상의 표적 세포가 내부에 캡슐화된 원형 RNA로 형질주입되도록 하나 이상의 표적 세포를 본 명세서에 개시된 화합물 및/또는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "형질주입시키다" 또는 "형질주입"은 하나 이상의 캡슐화된 물질(예를 들어, 핵산 및/또는 폴리뉴클레오타이드)을 세포, 또는 바람직하게는 표적 세포로 세포내 도입하는 것을 지칭한다. 용어 "형질주입 효율"은 형질주입에 적용되는 표적 세포에 의해 흡수, 도입 및/또는 발현되는 이러한 캡슐화된 물질(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드)의 상대적인 양을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 효율은 형질주입 후 표적 세포에 의해 생성된 리포터 폴리뉴클레오타이드 산물의 양에 의해 추정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 전달 비히클은 높은 형질주입 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 전달 비히클은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 형질주입 효율을 갖는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "리포솜"은 일반적으로 하나 이상의 구형 이중층 또는 이중층에 배열된 지질(예를 들어, 양친매성 지질)로 구성된 소포를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 리포솜은 지질 나노입자(예를 들어, 본 명세서에 개시된 이온화 가능한 지질 화합물 중 하나 이상을 포함하는 지질 나노입자)이다. 이러한 리포솜은 하나 이상의 표적 세포, 조직 및 기관에 전달될 캡슐화된 circRNA를 함유하는 수성 내부 및 친유성 물질로부터 형성된 막을 갖는 단층 또는 다중층 소포일 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 하나 이상의 지질 나노입자를 포함한다. 고려되는 리포솜 및 지질 나노입자를 형성하는데 사용될 수 있는 적합한 지질(예를 들어, 이온화 가능한 지질)의 예는 본 명세서에 개시된 화합물(예를 들어, HGT4001, HGT4002, HGT4003, HGT4004 및/또는 HGT4005) 중 하나 이상을 포함한다. 이러한 리포솜 및 지질 나노입자는 추가적인 이온화 가능한 지질 예컨대 C12-200, DLin-KC2-DMA 및/또는 HGT5001, 헬퍼 지질, 구조 지질, PEG-변형된 지질, MC3, DLinDMA, DLinkC2DMA, cKK-E12, ICE, HGT5000, DODAC, DDAB, DMRIE, DOSPA, DOGS, DODAP, DODMA, DMDMA, DODAC, DLenDMA, DMRIE, CLinDMA, CpLinDMA, DMOBA, DOcarbDAP, DLinDAP, DLincarbDAP, DLinCDAP, KLin-K-DMA, DLin-K-XTC2-DMA, HGT4003 및 이들의 조합물을 또한 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "비-양이온성 지질", "비-양이온성 헬퍼 지질" 및 "헬퍼 지질"이라는 어구는 상호 교환 가능하게 사용되며, 임의의 중성, 쯔비터이온성 또는 음이온성 지질을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "음이온성 지질"이라는 어구는 생리 pH와 같은 선택된 pH에서 순 음전하를 갖는 다수의 지질 종 중 임의의 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "생분해성 지질" 또는 "분해성 지질"이라는 어구는 숙주 환경에서 수분, 수시간 또는 수일의 정도에서 분해되어 이상적으로는 이것을 독성이 더 적게 만들고, 시간에 따라서 숙주에서 축적될 가능성을 적게 하는 다수의 지질 종 중 임의의 것을 지칭한다. 지질에 대한 일반적인 변형은 지질의 생분해성을 증가시키기 위한 에스터 결합 및 이황화 결합을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "생분해성 PEG 지질" 또는 "분해성 PEG 지질"이라는 어구는 PEG 분자가 숙주 환경에서 수분, 수시간 또는 수일의 정도에서 지질로부터 절단되어 이상적으로는 이들을 면역원성을 더 적게 만드는 다수의 지질 종 중 임의의 것을 지칭한다. PEG 지질에 대한 일반적인 변형은 지질의 생분해성을 증가시키기 위한 에스터 결합 및 이황화 결합을 포함한다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 전달 비히클(예를 들어, 지질 나노입자)은 하나 이상의 물질 또는 치료제(예를 들어, circRNA)를 캡슐화하도록 제조된다. 목적하는 치료제(예를 들어, circRNA)를 전달 비히클 내에 혼입하는 과정은 본 명세서에서 "로딩" 또는 "캡슐화"로 지칭된다(문헌[Lasic, et al., FEBS Lett., 312: 255-258, 1992]). 전달 비히클-로딩된 또는 -캡슐화된 물질(예를 들어, circRNA)은 전달 비히클의 내부 공간, 전달 비히클의 이중층 막인 내에 완전히 또는 부분적으로 위치되거나 또는 전달 비히클의 외부 표면과 완전히 또는 부분적으로 회합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "구조 지질"은 스테롤 및 또한 스테롤 모이어티를 함유하는 지질을 지칭한다.
본 명세서에 정의된 바와 같이, "스테롤"은 스테로이드 알코올로 이루어진 스테로이드의 하위군이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "구조 지질"은 스테롤 및 또한 스테롤 모이어티를 함유하는 지질을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "PEG"는 임의의 폴리에틸렌 글리콜 또는 기타 폴리알킬렌 에터 중합체를 의미한다.
본 명세서에 일반적으로 정의된 바와 같이, "PEG-OH 지질"(또한 본 명세서에서 "하이드록시-PEG화 지질"로 지칭됨)은 지질 상에 하나 이상의 하이드록실(-OH)기를 갖는 PEG화 지질이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "인지질"은 포스페이트 모이어티 및 불포화 지방산 쇄와 같은 하나 이상의 탄소 쇄를 포함하는 지질이다.
본 명세서에 개시된 모든 뉴클레오타이드 서열은 RNA 서열 또는 상응하는 DNA 서열을 나타낼 수 있다. DNA에서 데옥시티미딘(dT 또는 T)은 RNA에서 우리딘(U)으로 전사된다. 따라서, "T" 및 "U"는 뉴클레오타이드 서열에서 본 명세서에서 상효 교환 가능하게 사용된다.
본 발명에서 사용된 것으로서 설명 "서열 동일성" 또는 예를 들어, "와 50% 동일한 서열"을 포함하는 설명은 서열이 비교창에 걸쳐서 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 기준 또는 아미노산-대-아미노산 기준으로 동일한 정도를 지칭한다. 따라서, "서열 동일성의 백분율"은 2개의 최적으로 정렬된 열을 비교창에 걸쳐서 비교하고, 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기(예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 두 서열 모두 나타나는 위치의 수를 결정하여 매치된 위치의 수를 얻고, 매치된 위치의 수를 비교창 내의 위치의 총 수(즉, 창 크기)로 나누어 주고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득함으로써 계산될 수 있다. 본 명세서에 기재된 참조 서열 중 임의의 것과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드가 포함되고, 전형적으로 여기서 폴리펩타이드 변이체는 참조 폴리펩타이드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다.
용어 "항체"(Ab)는 항원에 특이적으로 결합하는 당단백질 면역글로불린을 비제한적으로 포함한다. 일반적으로, 항체는 이황화 결합, 또는 이의 항원 결합 분자에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함할 수 있다. 각각의 H쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함할 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 하나의 불변 도메인, CL을 포함할 수 있다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카복시-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함할 수 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 함유한다. Ab의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 항체는 예를 들어, 단클론성 항체, 재조합 방식으로 생산된 항체, 단일특이적 항체, 다중특이적 항체(이중특이적 항체 포함), 인간 항체, 조작된 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 면역글로불린, 합성 항체, 2개의 중쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 사량체 항체, 항체 경쇄 단량체, 항체 중쇄 단량체, 항체 경쇄 이량체, 항체 중쇄 이량체, 항체 경쇄-항체 중쇄 쌍, 인트라바디, 항체 융합체(본 명세서에서 때때로 "항체 접합체"라고 지칭함), 이종접합체 항체, 단일 도메인 항체, 1가 항체, 단일쇄 항체 또는 단일쇄 가변 단편(scFv), 낙타화 항체, 어피바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, 이황화-연결 가변 단편(sdFv), 항-이디오타입(항-id) 항체(예를 들어, 항-항-Id 항체 포함), 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체(본 명세서에서 때때로 "항체 모방체"라고도 함) 및 상기 중 임의의 것의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 다클론성 항체 집단을 지칭한다.
면역글로불린은 IgA, 분비성 IgA, IgG 및 IgM을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 일반적으로 알려진 임의의 아이소타입으로부터 유래할 수 있다. IgG 서브클래스는 또한 당업자에게 널리 공지되어 있으며 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. "아이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 Ab 클래스 또는 서브클래스(예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다. 용어 "항체"는 예를 들어, 자연 발생 및 비-자연 발생 Ab 둘 다를 포함하고; 단클론성 및 다클론성 Ab; 키메라 및 인간화 Ab; 인간 또는 비인간 Ab; 완전 합성 Ab; 및 단일 쇄 Ab를 포함한다. 비인간 Ab는 인간에서 이의 면역원성을 감소시키기 위한 재조합 방법에 의해 인간화될 수 있다. 명시적으로 언급되지 않은 경우 그리고 문맥에서 달리 나타내지 않는 한, 용어 "항체"는 또한 상기에 언급된 면역글로불린 중 임의의 것의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 부분을 포함하고, 1가 및 2가 단편 또는 부분 및 단일 쇄 Ab를 포함한다.
"항원 결합 분자", "항원 결합 부분" 또는 "항체 단편"은 분자가 유래된 항체의 항원 결합 부분(예를 들어, CDR)을 포함하는 임의의 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자는 항원 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, dAb, 선형 항체, scFv 항체 및 항원 결합 분자로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 펩티바디(즉, 펩타이드 결합 도메인을 포함하는 Fc 융합 분자)는 적합한 항원 결합 분자의 또 다른 예이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 종양 세포 상의 항원에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 과증식성 질환에 관련된 세포 상의 항원 또는 바이러스 또는 박테리아 항원에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 BCMA에 결합한다. 추가 실시형태에서, 항원 결합 분자는 항원에 특이적으로 결합하는, 이의 상보성 결정 영역 (CDR) 중 하나 이상을 포함하는 항체 단편이다. 추가 실시형태에서, 항원 결합 분자는 단일 쇄 가변 단편(scFv)이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 아비머(avimer)를 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 상호 교환 가능하게 사용되며, 당업계에서 일반적이다. 가변 영역은 전형적으로 항체의 일부, 일반적으로 경쇄 또는 중쇄의 일부, 전형적으로 성숙한 중쇄에서 약 아미노-말단 110 내지 120개 아미노산과 성숙한 경쇄에서 약 90 내지 115개 아미노산을 지칭하며, 이들은 항체 중에서 서열이 광범하게 상이하고, 특정 항원에 대한 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다. 서열 변동성은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 불리는 영역에 집중되며, 가변 도메인에서 더 고도로 보존된 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 불린다. 임의의 특정 기전 또는 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 경쇄 및 중쇄의 CDR이 항원과 항체의 상호작용 및 특이성을 주로 담당한다고 여겨진다. 일부 실시형태에서, 가변 영역은 인간 가변 영역이다. 일부 실시형태에서, 가변 영역은 설치류 또는 뮤린 CDR 및 인간 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 가변 영역은 영장류(예를 들어, 비-인간 영장류) 가변 영역이다. 특정 실시형태에서, 가변 영역은 설치류 또는 뮤린 CDR 및 영장류(예를 들어, 비-인간 영장류) 프레임워크 영역(FR)을 포함한다.
용어 "VL" 및 "VL 도메인"은 항체 또는 이의 항원 결합 분자의 경쇄 가변 영역을 지칭하기 위해 상호 교환 가능하게 사용된다.
용어 "VH" 및 "VH 도메인"은 항체 또는 이의 항원 결합 분자의 중쇄 가변 영역을 지칭하기 위해 상호 교환 가능하게 사용된다.
CDR의 다수의 정의가 일반적으로 사용된다: 카바트 넘버링, 코티아 넘버링, AbM 넘버링, 또는 접촉 넘버링. AbM 정의는 옥스포드 몰레큘라사(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되는 2개 사이의 절충안이다. 접촉 정의는 이용 가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기초로 한다. 용어 "카바트 넘버링" 등의 용어는 관련 기술 분야에서 인식되고, 항체 또는 이의 항원-결합 분자의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내의 아미노산 잔기를 넘버링하는 시스템을 지칭한다. 특정 양상에서, 항체의 CDR은 카바트 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 및 Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조). 카바트 넘버링 시스템을 사용하면, 항체 중쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 31 내지 35(이는 선택적으로 35 다음에 1 또는 2개의 추가의 아미노산(카바트 넘버링 체계에서 35A 및 35B로 지칭됨)을 포함할 수 있음)(CDR1), 아미노산 위치 50 내지 65(CDR2), 및 아미노산 위치 95 내지 102(CDR3)에 존재한다. 카바트 넘버링 시스템을 사용하면, 항체 경쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 24 내지 34 (CDR1), 아미노산 위치50 내지 56(CDR2), 및 아미노산 위치 89 내지 97(CDR3)에 존재한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체의 CDR은 카바트 넘버링 체계에 따라 결정되었다. 특정 양상에서, 항체의 CDR은 면역글로불린 구조 루프의 위치를 나타내는 코티아 넘버링 방식에 따라 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B et al, (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al, (1990) J Mol Biol 215(1): 175- 82]; 및 미국 특허 제7,709,226호 참조). 전형적으로, 카바트 넘버링 규정을 사용할 때, 코티아 CDR-H1 루프는 중쇄 아미노산 26 내지 32, 33, 또는 34에 존재하고, 코티아 CDR-H2 루프는 중쇄 아미노산 52 내지 56에 존재하고, 및 코티아 CDR-H3 루프는 중쇄 아미노산 95 내지 102에 존재하는 한편, 코티아 CDR-L1 루프는 경쇄 아미노산 24 내지 34에 존재하고, 코티아 CDR-L2 루프는 경쇄 아미노산 50 내지 56에 존재하고, 코티아 CDR-L3 루프는 경쇄 아미노산 89 내지 97에 존재한다. 코티아 CDR-HI 루프의 단부는 카바트 넘버링 규정을 사용하여 넘버링할 경우 루프의 길이에 따라 H32 및 H34 사이에서 달라진다(이는 카바트 넘버링 스킴이 H35A 및 H35B에 삽입을 두기 때문이고; 35A도 존재하지 않고 35B도 존재하지 않으면, 루프는 32에서 종결되고; 35A만 존재하면, 루프는 33에서 종결되고; 35A와 35B 둘 다가 존재하면, 루프는 34에서 종결된다). 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체의 CDR은 코티아 넘버링 체계에 따라 결정되었다.
본 명세서에 사용된 용어 "불변 영역" 및 "불변 도메인"은 상호 교환 가능하고, 관련 기술분야에서의 통상적인 의미를 갖는다. 불변 영역은 항체 부분, 예를 들어, 항체의 항원에 대한 결합에 직접 수반되지는 않지만 다양한 효과기 기능, 예컨대 Fc 수용체와의 상호작용을 나타낼 수 있는 경쇄 및/또는 중쇄의 카복실 말단 부분이다. 면역글로불린 분자의 불변 영역은 일반적으로 면역글로불린 가변 도메인에 비해 보다 보존된 아미노산 서열을 갖는다.
"결합 친화도"는 일반적으로, 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비-공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD 또는 Kd)로 표현될 수 있다. 친화도는 평형 해리 상수(KD) 및 평형 회합 상수(KA 또는 Ka)를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는, 관련 기술 분야에 공지된 수많은 방식으로 측정되고/거나 표현될 수 있다. KD는 koff/kon의 비율로부터 계산되고, 반면에 KA는 kon/koff의 비율로부터 계산된다. kon은 예를 들어, 항체의 항원에 대한 회합 속도 상수를 지칭하고, koff는 예를 들어, 항체의 항원에 대한 해리 속도 상수를 지칭한다. kon 및 koff는 당업자에게 공지된 기술, 예컨대, BIACORE® 또는 KinExA에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 분자의 CDR(들) 내 또는 프레임워크 영역(들) 내의 1개 이상의 아미노산 잔기는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "이종"은 자연 발생 서열 이외의 다른 임의의 공급원으로부터의 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "에피토프"는 관련 기술분야의 용어이며, 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국지화된 영역을 지칭한다. 에피토프는 예를 들어, 폴리펩타이드의 인접 아미노산일 수 있거나(선형 또는 인접 에피토프), 또는 에피토프는 예를 들어, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들의 2개 이상의 비-인접 영역으로부터 함께 모일 수 있다 (입체배좌적, 비-선형, 불연속적, 또는 비-인접 에피토프). 특정 실시형태에서, 항체가 결합하는 에피토프는 예를 들어, NMR 분광분석법, X선 회절 결정학 연구, ELISA 검정, 질량 분광측정법과 커플링된 수소/중수소 교환 (예를 들어, 액체 크로마토그래피 전기분무 질량 분광측정법), 어레이-기반 올리고-펩타이드 스캐닝 검정 및/또는 돌연변이유발 맵핑(예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발 맵핑)에 의해 결정될 수 있다. X선 결정학의 경우, 결정화는 관련 기술분야에 공지된 방법 중 임의의 것을 사용하여 달성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Giege R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269- 1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303]). 항체:항원 결정은 널리 공지된 X선 회절 기술을 사용하여 연구될 수 있고, 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, X-PLOR(예일 대학교, 1992, 몰레큘라 시뮬레이션즈사(Molecular Simulations, Inc.)에 의해 배포됨; 예를 들어, 문헌[Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.]; 미국 특허 공개 제2004/0014194호), 및 BUSTER(문헌[Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323] 참조)를 사용하여 더 연구될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항원 결합 분자, 항체, 또는 이의 항원 결합 분자는, 항원 및 제1 결합 분자, 항체, 또는 이의 항원 결합 분자 사이의 상호작용이 참조 결합 분자, 참조 항체, 또는 이의 항원 결합 분자가 항원과 상호작용하는 능력을 차단, 제한, 저해 또는 달리 감소시키는 경우에, 참조 항체 또는 이의 항원 결합 분자와 "교차-경쟁"한다. 교차 경쟁은 완전할 수 있고, 예를 들어, 결합 분자의 항원에 대한 결합이 참조 결합 분자가 항원에 결합하는 능력을 완전히 차단하거나, 또는 이는 부분적일 수 있고, 예를 들어, 결합 분자의 항원에 대한 결합이 참조 결합 분자가 항원에 결합하는 능력을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 참조 항원 결합 분자와 교차-경쟁하는 항원 결합 분자는 참조 항원 결합 분자와 동일한 또는 중첩되는 에피토프에 결합한다. 다른 실시형태에서, 참조 항원 결합 분자와 교차-경쟁하는 항원 결합 분자는 참조 항원 결합 분자와 상이한 에피토프에 결합한다. 수많은 유형의 경쟁적 결합 검정, 예를 들어: 고체상 직접 또는 간접 방사선면역검정(RIA); 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정(EIA); 샌드위치 경쟁 검정(문헌[Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253]); 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(문헌[Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619]); 고체상 직접 표지된 검정, 고체상 직접 표지된 샌드위치 검정(문헌[Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press]); 1-125 표지를 사용하는 고체상 직접 표지 RIA(문헌[Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15]); 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(문헌[Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552]); 및 직접 표지된 RIA(문헌[Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82])를 사용하여 하나의 항원 결합 분자가 또 다른 것과 경쟁하는지 여부를 결정할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역특이적으로 결합하다", "면역특이적으로 인식하다", "특이적으로 결합하다", 및 "특이적으로 인식하다"는 항체와 관련하여 유사한 용어이고, 항원(예를 들어, 에피토프 또는 면역 복합체)에 결합하는 분자를 지칭하며, 이러한 결합은 당업자에 의해 이해되는 바와 같다. 예를 들어, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 일반적으로, 예를 들어, 면역검정, BIACORE®, KinExA 3000 기기(사피디네 인스트루먼츠사(Sapidyne Instruments), 아이다호주 보이스 소재), 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 검정에 의해 결정된 바와 같은 보다 낮은 친화도로 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 구체적 실시형태에서, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는, 분자가 또 다른 항원에 결합하는 경우의 KA 보다 적어도 2 log, 2.5 log, 3 log, 4 log 또는 그 초과인 KA로 항원에 결합한다.
"항원"은 면역 반응을 촉발하거나 또는 항체 또는 항원 결합 분자가 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 면역 반응은 항체 생산, 또는 특이적 면역학적-적격 세포의 활성화, 또는 둘 다를 수반할 수 있다. 당업자는 실질적으로 모든 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 임의의 매크로분자가 항원으로서의 역할을 할 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 항원은 내인성으로 발현될 수 있고, 즉 게놈 DNA에 의해 발현될 수 있거나, 또는 재조합 방식으로 발현될 수 있다. 항원은 특정 조직, 예컨대, 암 세포에 특이적일 수 있거나, 또는 광범위하게 발현될 수 있다. 또한, 보다 큰 분자의 단편이 항원으로서 작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 종양 항원이다.
용어 "자가"는 이후에 재-도입될 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 조작된 자가 세포 요법(eACT™) 방법은 환자로부터 림프구를 수집한 후, 이를 예를 들어, CAR 작제물을 발현하도록 조작하고, 이어서 이를 다시 동일한 환자에게 투여하는 것을 수반한다.
용어 "동종"은 한 개체로부터 유래되고 이어서 동일한 종의 또 다른 개체에 도입되는 임의의 물질, 예를 들어, 동종 T 세포 이식을 지칭한다.
"암"은 신체 내에서의 비정상 세포의 비제어된 성장을 특징으로 하는 다양한 질환의 광범위한 군을 지칭한다. 조절되지 않는 세포 분열 및 성장은 이웃하는 조직을 침습하는 악성 종양의 형성을 야기하고, 또한 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 원위 부분으로 전이될 수 있다. "암" 또는 "암 조직"은 종양을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 암의 예는 림프종, 백혈병, 골수종, 및 다른 백혈구 악성종양을 포함한 면역계의 암을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 예를 들어, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위암, 고환암, 자궁암, 다발성 골수종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종(NHL), 원발성 종격 대 B 세포 림프종(PMBC), 미만성 대 B 세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종(FL), 형질전환된 여포성 림프종, 비장 변연부 림프종(SMZL), 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병(ALL)(비 T 세포 ALL 포함), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소아기 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 요관암, 중추 신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척수축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 표피양암, 편평 세포암, T 세포 림프종, 석면에 의해 유발된 것을 포함한 환경적으로 유발된 암, 다른 B 세포 악성종양 및 상기 암의 조합으로부터 유래된 종양의 종양 크기를 감소시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 예를 들어, 육종 및 암종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 카포시 육종, 연조직 육종 다른 육종, 활액종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 폐암, 결장직장암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종(예를 들어, 췌장, 결장, 난소, 폐, 유방, 위, 전립선, 자궁경부 또는 식도의 선암종), 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간세포암, 담관 암종, 융모막암종, 빌름스 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 방광 암종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 음문 암종, 신우 암종, CNS 종양(예컨대 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기신경교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종)으로부터 유래된 종양의 종양 크기를 감소시키는 데 사용될 수 있다. 특정 암은 화학요법 또는 방사선 요법에 대해 반응성일 수 있거나, 또는 암은 불응성일 수 있다. 불응성 암은 수술적 개입으로 변형될 수 없는 암을 지칭하고, 이러한 암은 처음부터 화학요법 또는 방사선 요법에 대해 비반응성이거나 또는 암이 시간의 경과에 따라 비반응성이 된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "항종양 효과"는 종양 부피의 감소, 종양 세포 수의 감소, 종양 세포 증식의 감소, 전이 수의 감 소, 전체 또는 무진행 생존의 증가, 기대 수명의 증가, 또는 종양과 연관된 다양한 생리학적 증상의 호전으로서 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. 항종양 효과는 또한 종양 발생의 방지, 예를 들어, 백신을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "사이토카인"은 특이적 항원과의 접촉에 반응하여 한 세포에 의해서 방출되는 비-항체 단백질을 지칭하고, 여기서 사이토카인은 제2 세포와 상호작용하여 제2 세포에서의 반응을 매개한다. "사이토카인"은 본 명세서에서 사용된 바와 같이 세포간 매개자로서 또 다른 세포 상에서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해서 방출되는 단백질을 지칭하는 의미이다. 사이토카인은 세포에 의해 내인성으로 발현될 수 있거나, 또는 대상체에게 투여될 수 있다. 사이토카인은 대식세포, B 세포, T 세포, 호중구, 수지상 세포, 호산구 및 비만 세포를 비롯한 면역 세포에 의해서 방출되어 면역 반응을 전파할 수 있다. 사이토카인은 수용자 세포에서 다양한 반응을 유도할 수 있다. 사이토카인은 항상성 사이토카인, 케모카인, 전염증성 사이토카인, 효과기 및 급성기 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인터류킨(IL) 7 및 IL-15를 포함하는 항상성 사이토카인은 면역 세포 생존 및 증식을 촉진하고, 전염증성 사이토카인은 염증성 반응을 촉진할 수 있다. 항상성 사이토카인의 예는 IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-15, 및 인터페론(IFN) 감마를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 전염증성 사이토카인의 예는 IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-13, IL-17a, IL-23, IL-27, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor: TNF)-알파, TNF-베타, 섬유모세포 성장 인자(fibroblast growth factor: FGF) 2, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(granulocyte macrophage colony-stimulating factor: GM-CSF), 가용성 세포간 부착 분자 1 (soluble intercellular adhesion molecule 1: sICAM-1), 가용성 혈관 부착 분자 1(soluble vascular adhesion molecule 1: sVCAM-1), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor: VEGF), VEGF-C, VEGF-D 및 태반 성장 인자(placental growth factor: PLGF)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 효과기의 예는 그랜자임 A, 그랜자임 B, 가용성 Fas 리간드(sFasL), TGF-베타, IL-35 및 퍼포린을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 급성기-단백질의 예는 C-반응성 단백질(CRP) 및 혈청 아밀로이드 A(SAA)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "림프구"는 자연 킬러(NK) 세포, T 세포, 또는 B 세포를 포함한다. NK 세포는 선천성 면역계의 주요 성분을 대표하는 세포독성(세포 독성) 림프구 유형이다. NK 세포는 종양 및 바이러스에 감염된 세포를 거부한다. 이는 아폽토시스 또는 세포 예정사의 과정을 통해 작용한다. 이들은 세포를 사멸시키기 위해 활성화를 필요로 하지 않기 때문에 "자연 킬러"로 명명되었다. T-세포는 세포-매개-면역(어떠한 항체도 수반되지 않음)에서 주요 역할을 한다. T 세포 수용체(TCR)는 다른 림프구 유형으로부터 T 세포로 분화한다. 면역계의 전문화된 기관인 흉선은 T 세포 성숙을 위한 주요 부위이다. 헬퍼 T-세포(예를 들어, CD4+ 세포), 세포독성 T-세포(또한 TC, 세포독성 T 림프구, CTL, T-킬러 세포, 세포용해 T 세포, CD8+ T-세포 또는 킬러 T 세포로도 알려짐), 기억 T-세포((i) 줄기 기억 세포(TSCM, 예컨대, 미경험 세포는 CD45RO-, CCR7+, CD45RA+, CD62L+(L-셀렉틴), CD27+, CD28+ 및 IL-7Ra+이지만, 또한 다량의 CD95, IL-2R, CXCR3, 및 LFA-1을 발현하고, 기억 세포 특유의 수많은 기능 속성을 나타냄; (ii) 중심 기억 TCM 세포(TCM)는 L-셀렉틴 및 CCR7을 발현하고, IL-2를 분비하지만 IFNγ 또는 IL-4는 분비하지 않음, (iii) 그러나, 효과기 기억 세포(TEM)는 L-셀렉틴 또는 CCR7을 발현하지 않지만, 효과기 사이토카인, 예컨대 IFNγ 및 IL-4를 생산함), 조절 T-세포 (Treg, 억제자 T 세포, 또는 CD4+CD25+ 또는 CD4+ FoxP3+ 조절 T 세포), 자연 킬러 T-세포(NKT) 및 감마 델타 T-세포를 비롯한 다수의 유형의 T 세포가 존재한다. 다른 한편으로는, B-세포는 체액성 면역(항체가 수반됨)에서 중요한 역할을 한다. B-세포는 항체를 생성하고, 항원-제시 세포(APC)로서 작용할 수 있고, 항원 상호작용에 의한 활성화 후에 둘 다 수명이 짧은 및 수명이 긴 B-세포 및 형질 세포로 변한다. 포유동물에서, 미성숙 B-세포는 골수에서 형성된다.
용어 "유전자 조작된" 또는 "조작된"은 암호 또는 비-암호 영역 또는 이의 부분을 결실시키거나 또는 암호 영역 또는 이의 부분을 삽입하는 것을 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 세포의 게놈을 변형시키는 방법을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 변형되는 세포는 림프구, 예를 들어, T 세포이며, 이는 환자 또는 공여자로부터 수득될 수 있다. 외인성 작제물, 예컨대, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하도록 세포가 변형될 수 있고, 이는 세포의 게놈 내로 혼입된다.
"면역 반응"은 침입 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 또는 다른 비정상 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우에 정상 인간 세포 또는 조직을 선택적으로 표적화하고/하거나, 이에 결합하고/하거나, 이에 대해 손상을 입히고/입히거나, 이를 파괴시키고/시키거나, 이를 척추동물의 신체로부터 제거하는, 면역계의 세포(예를 들어, T 림프구, B 림프구, 자연 킬러(NK) 세포, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 수지상 세포 및 호중구), 및 이들 세포 중 임의의 것 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자(Ab, 사이토카인, 및 보체 포함)의 작용을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "공자극성 신호"는 1차 신호, 예컨대 TCR/CD3 결찰과 조합되어, T 세포 반응, 예컨대 비제한적으로, 증식 및/또는 핵심 분자의 상향조절 또는 하향 조절로 이어지는 신호를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "공자극성 리간드"는 T 세포 상의 동족 공동자극 분자에 특이적으로 결합하는 항원 제시 세포 상의 분자를 포함한다. 공자극성 리간드의 결합은 증식, 활성화, 분화 등을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공한다. 공자극성 리간드는 자극 분자에 의해, 예를 들어, T 세포 수용체(TCR)/CD3 복합체와 펩타이드가 로딩된 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자의 결합에 의해 제공되는 1차 신호에 더하여 신호를 유도한다. 공자극성 리간드는 3/TR6, 4-IBB 리간드, 톨-유사 수용체에 결합하는 효능제 또는 항체, B7-1(CD80), B7-2 (CD86), CD30 리간드, CD40, CD7, CD70, CD83, 포진 바이러스 진입 매개자(herpes virus entry mediator: HVEM), 인간 백혈구 항원 G(human leukocyte antigen G: HLA-G), ILT4, 면역글로불린-유사 전사체(immunoglobulin-like transcript: ILT) 3, 유도성 공자극성 리간드(ICOS-L), 세포간 부착 분자(ICAM), B7-H3과 특이적으로 결합하는 리간드, 림프독소 베타 수용체, MHC 부류 I 쇄-관련 단백질 A(MICA), MHC 부류 I 쇄-관련 단백질 B(MICB), OX40 리간드, PD-L2, 또는 예정사(PD) L1을 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 공자극성 리간드는, 비제한적으로 T 세포 상에 존재하는 공자극성 분자, 예컨대, 비제한적으로 4-1BB, B7-H3, CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, CD7, ICOS, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), 자연 킬러 세포 수용체 C(NKG2C), OX40, PD-1, 또는 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 14(TNFSF14 또는 LIGHT)와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
"공자극성 분자"는 공자극성 리간드와 특이적으로 결합함으로써 T 세포에 의한 공자극성 반응, 예컨대 비제한적으로 증식을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너이다. 공자극성 분자는 4-1BB/CD137, B7-H3, BAFFR, BLAME(SLAMF8), BTLA, CD 33, CD 45, CD100(SEMA4D), CD103, CD134, CD137, CD154, CD16, CD160(BY55), CD 18, CD19, CD19a, CD2, CD22, CD247, CD27, CD276(B7-H3), CD28, CD29, CD3(알파; 베타; 델타; 엡실론; 감마; 제타), CD30, CD37, CD4, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD5, CD64, CD69, CD7, CD80, CD83 리간드, CD84, CD86, CD8알파, CD8베타, CD9, CD96(Tactile), CD1-la, CDl-lb, CDl-lc, CDl-ld, CDS, CEACAM1, CRT AM, DAP-10, DNAM1(CD226), Fc 감마 수용체, GADS, GITR, HVEM(LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, ICOS, Ig 알파(CD79a), IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, 인테그린, ITGA4, ITGA4, ITGA6, IT GAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, LIGHT, LIGHT(종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 14; TNFSF14), LTBR, Ly9(CD229), 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1 (CD1 la/CD18), MHC 클래스 I 분자, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80(KLRF1), OX40, PAG/Cbp, PD-1, PSGL1, SELPLG(CD162), 신호전달 림프구성 활성화 분자, SLAM(SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4(CD244; 2B4), SLAMF6(NTB-A; Lyl08), SLAMF7, SLP-76, TNF, TNFr, TNFR2, 톨 리간드 수용체, TRANCE/RANKL, VLA1 또는 VLA-6 또는 이들의 단편, 절단부 또는 이들의 조합물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 것으로서 설명 "서열 동일성" 또는 예를 들어, "와 50% 동일한 서열"을 포함하는 설명은 서열이 비교창에 걸쳐서 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 기준 또는 아미노산-대-아미노산 기준으로 동일한 정도를 지칭한다. 따라서, "서열 동일성의 백분율"은 2개의 최적으로 정렬된 열을 비교창에 걸쳐서 비교하고, 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, U) 또는 동일한 아미노산 잔기(예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 두 서열 모두 나타나는 위치의 수를 결정하여 매치된 위치의 수를 얻고, 매치된 위치의 수를 비교창 내의 위치의 총 수(즉, 창 크기)로 나누어 주고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득함으로써 계산될 수 있다. 본 명세서에 기재된 참조 서열 중 임의의 것과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드가 포함되고, 전형적으로 여기서 폴리펩타이드의 경우에 폴리펩타이드 변이체는 참조 폴리펩타이드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "백신"은 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 면역 생성을 위한 조성물을 지칭한다. 따라서, 백신은 항원을 포함하는 의약이며, 인간 또는 동물에게 투여 시 특정 방어 및 보호 물질을 생성하기 위해 인간 또는 동물에 사용되도록 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "신생항원"은 발현된 단백질에서 종양-특이적 돌연변이로부터 발생하는 종양 항원의 부류를 지칭한다.
2. 벡터, 전구체 RNA 및 원형 RNA
또한 본 명세서에는 원형 RNA, 원형 RNA로 원형화될 수 있는 전구체 RNA, 및 전구체 RNA 또는 원형 RNA로 전사될 수 있는 벡터(예를 들어, DNA 벡터)가 제공된다.
특정 양상에서, 본 명세서에는 포스트 스플라이싱 3' 그룹 I 인트론 단편, 선택적으로 제1 스페이서, 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 발현 서열, 선택적으로 제2 스페이서 및 포스트 스플라이싱 5' 그룹 I 인트론 단편을 포함하는 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 이들 영역은 그 순서대로 존재한다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA는 본 명세서에 제공된 방법에 의해서 또는 본 명세서에 제공된 벡터로부터 제조된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된(예를 들어, 5' 듀플렉스 형성 영역, 3' 그룹 I 인트론 단편, 선택적으로 제1 스페이서, 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 제1 발현 서열, 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 제2 발현 서열, 선택적으로 제2 스페이서, 5' 그룹 I 인트론 단편 및 3' 듀플렉스 형성 영역을 포함하는) 벡터는 원형화할 수 있는 전구체 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 형성한다. 일부 실시형태에서, 이러한 전구체 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 구아노신 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드(예를 들어, GTP) 및 2가 양이온(예를 들어, Mg2+)의 존재 하에서 인큐베이션되는 경우 원형화된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 벡터 및 전구체 RNA 폴리뉴클레오타이드는 제1(5') 듀플렉스 형성 영역 및 제2(3') 듀플렉스 형성 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 제1 듀플렉스 형성 영역 및 제2 듀플렉스 형성 영역은 완전한 또는 불완전한 듀플렉스를 형성할 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서 제1 듀플렉스 형성 영역 및 제2 듀플렉스 형성 영역의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 서로와 짝지워진 염기일 수 있다. 일부 실시형태에서, 듀플렉스 형성 영역은 RNA(예를 들어, 비-듀플렉스 형성 영역 서열) 내의 의도되지 않은 서열과 짝지워진 50% 미만(예를 들어, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만)의 염기를 갖는다고 예측된다. 일부 실시형태에서, 전구체 RNA 가닥 각각 상에 그리고 그룹 I 인트론 단편에 인접하거나 매우 가깝게 이러한 듀플렉스 형성 영역을 포함시키는 것은 그룹 I 인트론 단편을 서로에 매우 근접하게 하여 스플라이싱 효율을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 듀플렉스 형성 영역은 3 내지 100개 뉴클레오타이드 길이(예를 들어, 3 내지 75개 뉴클레오타이드 길이, 3 내지 50개 뉴클레오타이드 길이, 20 내지 50개 뉴클레오타이드 길이, 35 내지 50개 뉴클레오타이드 길이, 5 내지 25개 뉴클레오타이드 길이, 9 내지 19개 뉴클레오타이드 길이)이다. 일부 실시형태에서, 듀플렉스 형성 영역은 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 듀플렉스 형성 영역은 약 9 내지 약 50개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일 실시형태에서, 듀플렉스 형성 영역은 약 9 내지 약 19개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 듀플렉스 형성 영역은 약 20 내지 약 40개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 듀플렉스 형성 영역은 약 30개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
전구체 RNA 원형화 및/또는 원형 RNA로부터의 유전자 발현을 개선하기 위해 2가지 유형의 스페이서가 설계되었다. 첫 번째 유형의 스페이서는 외부 스페이서인데, 즉, 이것은 전구체 RNA에 존재하지만 원형화 시 제거된다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 외부 스페이서는 리보자임 자체의 구조를 유지하고 다른 이웃하는 서열 요소가 이의 접힘 및 기능을 방해하는 것을 방지함으로써 리보자임-매개 원형화를 개선할 수 있다고 생각된다. 두 번째 유형의 스페이서는 내부 스페이서인데, 즉, 이것은 전구체 RNA에 존재하고 생성된 원형 RNA에 유지된다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 내부 스페이서는 리보자임 자체의 구조를 유지하고 다른 이웃하는 서열 요소, 특히 이웃하는 IRES 및 암호 영역이 이의 접힘 및 기능을 방해하는 것을 방지함으로써 리보자임-매개 원형화를 개선할 수 있다고 생각된다. 내부 스페이서는 이웃하는 서열 요소, 특히, 인트론 요소가 IRES 내의 서열과 혼성화하는 것을 방지하고 가장 바람직하고 활성인 입체배좌로 접히는 능력을 저해함으로써 IRES로부터의 단백질 발현을 개선할 수 있다고 또한 생각된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 벡터, 전구체 RNA 및 원형 RNA는 제1(5') 및/또는 제2(3') 스페이서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 3' 그룹 I 인트론 단편과 IRES 사이에 스페이서를 포함시키는 것은 이들 영역이 상호작용하는 것을 방지함으로써 그 영역에서 2차 구조를 보존하여, 스플라이싱 효율을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1(3' 그룹 I 인트론 단편과 IRES 사이) 및 제2(발현 서열과 5' 그룹 I 인트론 단편 사이) 스페이서는 제1 듀플렉스 형성 영역 및 제2 듀플렉스 형성 영역이 아닌 서로 염기 짝지움을 형성할 것이라고 예측되는 추가 염기 짝지움 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 스페이서 염기 짝지움은 그룹 I 인트론 단편을 서로 매우 근접하게 하여 스플라이싱 효율을 추가로 증가시킨다. 추가로, 일부 실시형태에서, 제1 듀플렉스 형성 영역과 제2 듀플렉스 형성 영역 사이의 염기 짝지움, 및 별도로 제1 스페이서와 제2 스페이서 사이의 염기 짝지움의 조합은 염기 짝지움의 인접한 영역이 측접된 그룹 I 인트론 단편을 함유하는 스플라이싱 버블의 형성을 촉진한다. 전형적인 스페이서는 다음 특성 중 하나 이상을 갖는 연속적인 서열이다: 1) 근위 구조, 예를 들어, IRES, 발현 서열 또는 인트론의 간섭을 피할 것으로 예측됨; 2) 적어도 7nt 길이 내지 100nt 이하임; 3) 3' 인트론 단편 뒤 그리고 이에 인접하여 그리고/또는 5' 인트론 단편 이전 그리고 이에 인접하여 위치함; 그리고 4) a) 적어도 5nt 길이인 비구조화 영역, b) 또 다른 스페이서를 포함하는 원위 서열에 대해 적어도 5nt 길이의 염기 짝지움 영역 및 c) 스페이서의 서열로 범주가 제한되는 적어도 7nt 길이의 구조화 영역 중 하나 이상을 함유함. 스페이서는 비구조화 영역, 염기 짝지움 영역, 헤어핀/구조화 영역 및 이들의 조합을 포함하는 몇몇 영역을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 스페이서는 높은 GC 함량을 갖는 구조화 영역을 갖는다. 일 실시형태에서, 스페이서 내의 영역은 동일한 스페이서 내의 또 다른 영역과 염기 짝지움을 형성한다. 일 실시형태에서, 스페이서 염기 내의 영역은 또 다른 스페이서 내의 영역과 염기 짝지움을 형성한다. 일 실시형태에서, 스페이서는 하나 이상의 헤어핀 구조를 포함한다. 일 실시형태에서, 스페이서는 4 내지 12개 뉴클레오타이드의 줄기 및 2 내지 10개 뉴클레오타이드의 루프를 갖는 하나 이상의 헤어핀 구조를 포함한다. 일 실시형태에서, 3' 그룹 I 인트론 단편과 IRES 사이에 추가 스페이서가 존재한다. 일 실시형태에서, 이러한 추가 스페이서는 IRES의 구조화 영역이 3' 그룹 I 인트론 단편의 접힘을 방해하는 것을 방지하거나 이것이 발생하는 정도를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 5' 스페이서 서열은 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 또는 30개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 5' 스페이서 서열은 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35 또는 30개 이하의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서 5' 스페이서 서열은 5 내지 50, 10 내지 50, 20 내지 50, 20 내지 40 및/또는 25 내지 35개 뉴클레오타이드 길이이다. 특정 실시형태에서, 5' 스페이서 서열은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 뉴클레오타이드 길이이다. 한 실시형태에서, 5' 스페이서 서열은 polyA 서열이다. 다른 실시형태에서, 5' 스페이서 서열은 polyAC 서열이다. 일 실시형태에서, 스페이서는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 polyAC 함량을 포함한다. 일 실시형태에서, 스페이서는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 폴리피리미딘(C/T 또는 C/U) 함량을 포함한다.
특정 실시형태에서, 3' 그룹 I 인트론 단편은 3' 스플라이스 부위 다이뉴클레오타이드 및 선택적으로 적어도 1nt 길이(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30nt 길이) 및 최대 엑손의 길이의 인접한 엑손 서열을 포함하는 자연 그룹 I 인트론의 3' 근위 단편과 적어도 75% 상동성(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성)인 연속적인 서열이다. 전형적으로, 5' 그룹 I 인트론 단편은 5' 스플라이스 부위 다이뉴클레오타이드 및 선택적으로 적어도 1nt 길이(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30nt 길이) 및 최대 엑손의 길이의 인접한 엑손 서열을 포함하는 자연 그룹 I 인트론의 5' 근위 단편과 적어도 75% 상동성(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성)인 연속적인 서열이다. 문헌[Umekage et al. (2012)]에 기재된 바와 같이, 3' 그룹 I 인트론 단편 및 5' 그룹 I 인트론 단편의 외부 부분이 원형화에서 제거되어, 본 명세서에 제공된 원형 RNA가 적어도 1nt 길이인 선택적인 엑손 서열에 의해 형성된 3' 그룹 I 인트론 단편 및 적어도 1nt 길이(이러한 서열이 원형화되지 않은 전구체 RNA에 존재하는 경우)인 선택적인 엑손 서열에 의해 형성된 5' 그룹 I 인트론 단편의 일부만을 포함하도록 한다. 원형 RNA에 의해 유지되는 3' 그룹 I 인트론 단편의 부분은 본 명세서에서 "포스트 스플라이싱 3' 그룹 I 인트론 단편"으로 지칭된다. 원형 RNA에 의해 유지되는 5' 그룹 I 인트론 단편의 부분은 본 명세서에서 "포스트 스플라이싱 5' 그룹 I 인트론 단편"으로 지칭된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 벡터, 전구체 RNA 및 원형 RNA는 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 포함한다. IRES를 포함하면 원형 RNA로부터 하나 이상의 오픈 리딩 프레임(예를 들어, 발현 서열을 형성하는 오픈 리딩 프레임)의 번역이 가능하다. IRES 요소는 진핵의 리보솜 번역 개시 복합체를 끌어당겨 번역 개시를 촉진한다. 예를 들어, 문헌[Kaufman et al., Nuc. Acids Res. (1991) 19:4485-4490; Gurtu et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1996) 229:295-298; Rees et al., BioTechniques (1996) 20: 102-110; Kobayashi et al., BioTechniques (1996) 21 :399-402; 및 Mosser et al., BioTechniques 1997 22 150-161] 참조.
다수의 IRES 서열이 이용 가능하며, 광범위한 바이러스, 예컨대, 피코르나바이러스, 예컨대, 뇌심근염 바이러스(EMCV) UTR의 리더 서열(문헌[Jang et al. J. Virol. (1989) 63: 1651-1660]), 폴리오 리더 서열, A형 간염 바이러스 리더, C형 간염 바이러스 IRES, 인간 리노바이러스 타입 2 IRES(문헌[Dobrikova et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (2003) 100(25): 15125- 15130]), 구제역 바이러스로부터의 IRES 요소(문헌[Ramesh et al., Nucl. Acid Res. (1996) 24:2697-2700]), 지아디아바이러스 IRES(문헌[Garlapati et al., J. Biol. Chem. (2004) 279(5):3389-3397]) 등으로부터 유래된 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, IRES는 타우라 증후군 바이러스, 트리아토마 바이러스, 타일러 뇌척수염 바이러스, 유인원 바이러스 40, 붉은 불개미 바이러스 1, 로팔로시품 파디 바이러스, 세망내피증 바이러스, 인간 폴리오바이러스 1, 갈색날개 노린재 장 바이러스, 카슈미르 벌 바이러스, 인간 리노바이러스 2, 호말로디스카 코아굴라타 바이러스-1, 인간 면역결핍 바이러스 타입 1, 히메토비 P 바이러스, C형 간염 바이러스, A형 간염 바이러스, 간염 GB 바이러스, 구제역 바이러스, 인간 엔테로바이러스 71, 말 비염 바이러스, 엑트로피스 오블리쿠아 피코르나-유사 바이러스, 뇌심근염 바이러스, 초파리 C 바이러스, 인간 콕사키바이러스 B3, 크루시퍼 토바모바이러스, 귀뚜라미 마비병 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스 1, 블랙 퀸 세포 바이러스, 진딧물 치명 마비 바이러스, 조류 뇌척수염 바이러스, 급성 벌 마비 바이러스, 히비스커스 위황병 원형반점 바이러스, 돼지 열병 바이러스, 인간 FGF2, 인간 SFTPA1, 인간 AML1/RUNX1, 초파리 안테나페디아, 인간 AQP4, 인간 AT1R, 인간 BAG-1, 인간 BCL2, 인간 BiP, 인간 c-IAPl, 인간 c-myc, 인간 eIF4G, 마우스 NDST4L, 인간 LEF1, 마우스 HIF1 알파, 인간 n.myc, 마우스 Gtx, 인간 p27kipl, 인간 PDGF2/c-sis, 인간 p53, 인간 Pim-1, 마우스 Rbm3, 초파리 리퍼, 캐닌 스캠퍼, 초파리 Ubx, 인간 UNR, 마우스 UtrA, 인간 VEGF-A, 인간 XIAP, 털없는 초파리, 에스. 세레비지애 TFIID, 에스. 세레비지애 YAP1, 담배 식각 바이러스, 터닙 주름 바이러스, EMCV-A, EMCV-B, EMCV-Bf, EMCV-Cf, EMCV pEC9, 피코비르나바이러스, HCV QC64, 인간 코사바이러스 E/D, 인간 코사바이러스 F, 인간 코사바이러스 JMY, 리노바이러스 NAT001, HRV14, HRV89, HRVC-02, HRV-A21, 살리바이러스 A SH1, 살리바이러스 FHB, 살리바이러스 NG-J1, 인간 파레코바이러스 1, 크로히바이러스 B, Yc-3, 로사바이러스 M-7, 산바바이러스 A, 파시바이러스 A, 파시바이러스 A 2, 에코바이러스 14, 인간 파레코바이러스 5, 아이치 바이러스, A형 간염 바이러스 HA16, 포피바이러스, CVA10, 엔테로바이러스 C, 엔테로바이러스 D, 엔테로바이러스 J, 인간 페기바이러스 2, GBV-C GT110, GBV-C K1737, GBV-C 아이오와, 페기바이러스 A 1220, 파시바이러스 A 3, 사펠로바이러스, 로사바이러스 B, 바쿤사 바이러스, 트레모바이러스) A, 돼지 파시바이러스 1, PLV-CHN, 파시바이러스 A, 시시니바이러스, 헤파시바이러스 K, 헤파시바이러스 A, BVDV1, 보더병 바이러스, BVDV2, CSFV-PK15C, SF573 디시스트로바이러스, 후베이 피코르나-유사 바이러스, CRPV, 살리바이러스 A BN5, 살리바이러스 A BN2, 살리바이러스 A 02394, 살리바이러스 A GUT, 살리바이러스 A CH, 살리바이러스 A SZ1, 살리바이러스 FHB, CVB3, CVB1, 에코바이러스 7, CVB5, EVA71, CVA3, CVA12, EV24 또는 eIF4G에 대한 압타머의 IRES 서열이다.
단백질 발현을 유도하기 위해서, 원형 RNA는 단백질 암호 서열에 작동 가능하게 연결된 IRES를 포함한다. 예시적인 IRES 서열은 하기 표 17에 제공되어 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 원형 RNA는 표 17의 IRES 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 IRES 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 원형 RNA는 표 17의 IRES 서열을 포함한다. 예를 들어, IRES의 5' 및/또는 3' 단부를 절단하고, 스페이서 5'를 IRES에 부가하고, 6개 뉴클레오타이드 5'를 번역 개시 부위(코작 서열)로 변형시키고, 대안적인 번역 개시 부위로 변형시키고, 키메라/혼성 IRES 서열을 생성시킴으로써 IRES를 증가시키거나 감소시키기 위해서 IRES 및 액세서리(accessory) 서열의 변형이 본 명세서에 개시되어 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 원형 RNA에서 IRES 서열은 천연 IRES(예를 들어, 표 17에 개시된 천연 IRES)에 비해서 이들 변형 중 하나 이상을 포함한다.
다수의 IRES 서열이 이용 가능하며, 광범위한 바이러스, 예컨대, 피코르나바이러스, 예컨대, 뇌심근염 바이러스(EMCV) UTR의 리더 서열(문헌[Jang et al. J. Virol. (1989) 63: 1651-1660]), 폴리오 리더 서열, A형 간염 바이러스 리더, C형 간염 바이러스 IRES, 인간 리노바이러스 타입 2 IRES(문헌[Dobrikova et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (2003) 100(25): 15125- 15130]), 구제역 바이러스로부터의 IRES 요소(문헌[Ramesh et al., Nucl. Acid Res. (1996) 24:2697-2700]), 지아디아바이러스 IRES(문헌[Garlapati et al., J. Biol. Chem. (2004) 279(5):3389-3397]) 등으로부터 유래된 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, IRES는 타우라 증후군 바이러스, 트리아토마 바이러스, 타일러 뇌척수염 바이러스, 유인원 바이러스 40, 붉은 불개미 바이러스 1, 로팔로시품 파디 바이러스, 세망내피증 바이러스, 인간 폴리오바이러스 1, 갈색날개 노린재 장 바이러스, 카슈미르 벌 바이러스, 인간 리노바이러스 2, 호말로디스카 코아굴라타 바이러스-1, 인간 면역결핍 바이러스 타입 1, 히메토비 P 바이러스, C형 간염 바이러스, A형 간염 바이러스, 간염 GB 바이러스, 구제역 바이러스, 인간 엔테로바이러스 71, 말 비염 바이러스, 엑트로피스 오블리쿠아 피코르나-유사 바이러스, 뇌심근염 바이러스, 초파리 C 바이러스, 인간 콕사키바이러스 B3, 크루시퍼 토바모바이러스, 귀뚜라미 마비병 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스 1, 블랙 퀸 세포 바이러스, 진딧물 치명 마비 바이러스, 조류 뇌척수염 바이러스, 급성 벌 마비 바이러스, 히비스커스 위황병 원형반점 바이러스, 돼지 열병 바이러스, 인간 FGF2, 인간 SFTPA1, 인간 AML1/RUNX1, 초파리 안테나페디아, 인간 AQP4, 인간 AT1R, 인간 BAG-1, 인간 BCL2, 인간 BiP, 인간 c-IAPl, 인간 c-myc, 인간 eIF4G, 마우스 NDST4L, 인간 LEF1, 마우스 HIF1 알파, 인간 n.myc, 마우스 Gtx, 인간 p27kipl, 인간 PDGF2/c-sis, 인간 p53, 인간 Pim-1, 마우스 Rbm3, 초파리 리퍼, 캐닌 스캠퍼, 초파리 Ubx, 인간 UNR, 마우스 UtrA, 인간 VEGF-A, 인간 XIAP, 털없는 초파리, 에스. 세레비지애 TFIID, 에스. 세레비지애 YAP1, 담배 식각 바이러스, 터닙 주름 바이러스, EMCV-A, EMCV-B, EMCV-Bf, EMCV-Cf, EMCV pEC9, 피코비르나바이러스, HCV QC64, 인간 코사바이러스 E/D, 인간 코사바이러스 F, 인간 코사바이러스 JMY, 리노바이러스 NAT001, HRV14, HRV89, HRVC-02, HRV-A21, 살리바이러스 A SH1, 살리바이러스 FHB, 살리바이러스 NG-J1, 인간 파레코바이러스 1, 크로히바이러스 B, Yc-3, 로사바이러스 M-7, 산바바이러스 A, 파시바이러스 A, 파시바이러스 A 2, 에코바이러스 E14, 인간 파레코바이러스 5, 아이치 바이러스, A형 간염 바이러스 HA16, 포피바이러스, CVA10, 엔테로바이러스 C, 엔테로바이러스 D, 엔테로바이러스 J, 인간 페기바이러스 2, GBV-C GT110, GBV-C K1737, GBV-C 아이오와, 페기바이러스 A 1220, 파시바이러스 A 3, 사펠로바이러스, 로사바이러스 B, 바쿤사 바이러스, 트레모바이러스 A, 돼지 파시바이러스 1, PLV-CHN, 파시바이러스 A, 시시니바이러스, 헤파시바이러스 K, 헤파시바이러스 A, BVDV1, 보더병 바이러스, BVDV2, CSFV-PK15C, SF573 디시스트로바이러스, 후베이 피코르나-유사 바이러스, CRPV, 살리바이러스 A BN5, 살리바이러스 A BN2, 살리바이러스 A 02394, 살리바이러스 A GUT, 살리바이러스 A CH, 살리바이러스 A SZ1, 살리바이러스 FHB, CVB3, CVB1, 에코바이러스 7, CVB5, EVA71, CVA3, CVA12, EV24 또는 eIF4G에 대한 압타머의 IRES 서열이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서의 폴리뉴클레오타이드는 1개 초과의 발현 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA는 이시스트론성 RNA이다. 2개 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 리보솜 스키핑 요소에 의해서 분리될 수 있다. 특정 실시형태에서, 리보솜 스키핑 요소는 토세아 아사인아 바이러스(thosea-asigna virus) 2A 펩타이드(T2A), 돼지 테스코바이러스(porcine teschovirus)-12 A 펩타이드(P2A), 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 2A 펩타이드(F2A), 말 비염(equine rhinitis) A vims 2A 펩타이드(E2A), 세포질 다각체병 vims 2A 펩타이드(BmCPV 2A) 또는 B. mori 2A 펩타이드의 무름병 vims(BmIFV 2A)를 암호화한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 벡터는 3' UTR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 3' UTR은 인간 베타 글로빈, 인간 알파 글로빈 제노푸스 베타 글로빈, 제노푸스 알파 글로빈, 인간 프로락틴, 인간 GAP-43, 인간 eEFlal, 인간 타우, 인간 TNFα, 뎅기열 바이러스, 한타바이러스 작은 mRNA, 부냐바이러스 작은 mRNA, 터닙 황색 모자이크 바이러스, C형 간염 바이러스, 풍진 바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 인간 IL-8, 인간 액틴, 인간 GAPDH, 인간 튜불린, 히비스커스 위황병 원형반점 바이러스, 우드척 간염 바이러스 번역후 조절 요소, 신드비스 바이러스, 터닙 주름 바이러스, 담배 식각 바이러스 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스로부터 유래한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 벡터는 5' UTR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' UTR은 인간 베타 글로빈, 제노푸스 래비스 베타 글로빈, 인간 알파 글로빈, 제노푸스 래비스 알파 글로빈, 풍진 바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 마우스 Gtx, 뎅기열 바이러스, 열 충격 단백질 70kDa 단백질 1A, 담배 알코올 탈수소효소, 담배 식각 바이러스, 터닙 주름 바이러스 또는 아데노바이러스 3엽 리더로부터 유래한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 벡터는 3' 및/또는 5' 그룹 I 인트론 단편의 외부에 polyA 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 polyA 영역은 적어도 15, 30 또는 60개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 하나 또는 두 polyA 영역은 15 내지 50개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 하나 또는 두 polyA 영역은 20 내지 25개 뉴클레오타이드 길이이다. polyA 서열은 원형화 시에 제거된다. 따라서, 고체 표면(예를 들어, 수지)에 접합된 polyA 서열, 예컨대, 데옥시티민 올리고뉴클레오타이드(oligo(dT))와의 올리고뉴클레오타이드 혼성화를 사용하여 이의 전구체 RNA로부터 원형 RNA를 분리할 수 있다. 다른 서열이 또한 3' 그룹 I 인트론 단편에 대해서 5'에 5' 그룹 I 인트론 단편에 대해서 3'에 배치될 수 있고, 상보성 서열이 유사하게 원형 RNA 정제를 위해서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 DNA(예를 들어, 벡터), 선형 RNA(예를 들어, 전구체 RNA) 및/또는 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 300 내지 15000, 300 내지 14000, 300 내지 13000, 300 내지 12000, 300 내지 11000, 300 내지 10000, 400 내지 9000, 500 내지 8000, 600 내지 7000, 700 내지 6000, 800 내지 5000, 900 내지 5000, 1000 내지 5000, 1100 내지 5000, 1200 내지 5000, 1300 내지 5000, 1400 내지 5000 및/또는 1500 내지 5000개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 적어도 300nt, 400nt, 500nt, 600nt, 700nt, 800nt, 900nt, 1000nt, 1100nt, 1200nt, 1300nt, 1400nt, 1500nt, 2000nt, 2500nt, 3000nt, 3500nt, 4000nt, 4500nt, 5000nt, 6000nt, 7000nt, 8000nt, 9000nt, 10000nt, 11000nt, 12000nt, 13000nt, 14000nt 또는 15000nt 길이이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 3000nt, 3500nt, 4000nt, 4500nt, 5000nt, 6000nt, 7000nt, 8000nt, 9000nt, 10000nt, 11000nt, 12000nt, 13000nt, 14000nt, 15000nt 또는 16000nt 이하의 길이이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 DNA, 선형 RNA 및/또는 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 길이는 약 300nt, 400nt, 500nt, 600nt, 700nt, 800nt, 900nt, 1000nt, 1100nt, 1200nt, 1300nt, 1400nt, 1500nt, 2000nt, 2500nt, 3000nt, 3500nt, 4000nt, 4500nt, 5000nt, 6000nt, 7000nt, 8000nt, 9000nt, 10000nt, 11000nt, 12000nt, 13000nt, 14000nt 또는 15000nt이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에는 벡터가 제공된다. 특정 실시형태에서, 벡터는 다음 순서로, a) 5' 듀플렉스 형성 영역, b) 3' 그룹 I 인트론 단편, c) 선택적으로, 제1 스페이서 서열, d) IRES, e) 제1 발현 서열, f) a 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, g) 제2 발현 서열, h) 선택적으로, 제2 스페이서 서열, i) 5' 그룹 I 인트론 단편 및 g) 3' 듀플렉스 형성 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 5' 듀플렉스 형성 영역의 상류에 전사 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에는 벡터가 제공된다. 특정 실시형태에서, 벡터는, 다음 순서로, a) 5' 듀플렉스 형성 영역, b) 3' 그룹 I 인트론 단편, c) 선택적으로, 제1 스페이서 서열, d) 제1 IRES, e) 제1 발현 서열, f) 제2 IRES, g) 제2 발현 서열, h) 선택적으로, 제2 스페이서 서열, i) 5' 그룹 I 인트론 단편, 및 g) 3' 듀플렉스 형성 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 5' 듀플렉스 형성 영역의 상류에 전사 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에는 전구체 RNA가 제공된다. 특정 실시형태에서, 전구체 RNA는 본 명세서에 제공된 벡터의 시험관내 전사에 의해서 생산된 선형 RNA이다. 일부 실시형태에서, 전구체 RNA는 다음 순서로, a) 선택적으로, 5' 듀플렉스 형성 영역, b) 3' 그룹 I 인트론 단편, c) 선택적으로, 제1 스페이서 서열, d) IRES, e) 제1 발현 서열, f) 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, g) 제2 발현 서열, h) 선택적으로, 제2 스페이서 서열, i) 5' 그룹 I 인트론 단편 및 j) 선택적으로, 3' 듀플렉스 형성 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 전구체 RNA는 다음 순서로, a) 5' 듀플렉스 형성 영역, b) 3' 그룹 I 인트론 단편, c) 선택적으로, 제1 스페이서 서열, d) 제1 IRES, e) 제1 발현 서열, f) 제2 IRES, g) 제2 발현 서열, h) 선택적으로, 제2 스페이서 서열, i) 5' 그룹 I 인트론 단편, 및 g) 3' 듀플렉스 형성 영역을 포함한다. 전구체 RNA는 비변형되거나, 부분적으로 변형되거나 완전히 변형될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에는 원형 RNA가 제공된다. 특정 실시형태에서, 원형 RNA는 본 명세서에 제공된 벡터에 의해서 생산된 원형 RNA이다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA는 본 명세서에 제공된 전구체 RNA의 원형화에 의해서 생산된 원형 RNA이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 벡터는 원형화할 수 있는 전구체 선형 RNA를 형성한다. 일부 실시형태에서, 이러한 전구체 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 구아노신 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드(예를 들어, GTP) 및 2가 양이온(예를 들어, Mg2+)의 존재 하에서 인큐베이션되는 경우 원형화된다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA는 다음 순서로, a) 제1 스페이서 서열, b) IRES, c) 제1 발현 서열, d) 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, e) 제2 발현 서열 및 f) 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA는 다음 순서로, 포스트 스플라이싱 3' 그룹 I 인트론 단편, b) 제1 스페이서 서열, c) IRES, d) 제1 발현 서열, e) 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, f) 제2 발현 서열 및 g) 제2 스페이서 서열, h) 포스트 스플라이싱 5' 그룹 I 인트론 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA는 다음 순서로, a) 제1 스페이서 서열, b) 제1 IRES, c) 제1 발현 서열, d) 제2 IRES, e) 제2 발현 서열 및 f) 제2 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA는 3' 스플라이스 부위의 3'인 3' 그룹 I 인트론 단편의 일부를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA는 5' 스플라이스 부위의 5'인 5' 그룹 I 인트론 단편의 일부를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA는 적어도500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000 또는 15000개 뉴클레오타이드 크기이다. 원형 RNA는 비변형되거나, 부분적으로 변형되거나 완전히 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 벡터 및 전구체 RNA 폴리뉴클레오타이드는 제1(5') 듀플렉스 형성 영역 및 제2(3') 듀플렉스 형성 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 제1 상동성 영역 및 제2 상동성 영역은 완전한 또는 불완전한 듀플렉스를 형성할 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서 제1 듀플렉스 형성 영역 및 제2 듀플렉스 형성 영역의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 서로와 짝지워진 염기일 수 있다. 일부 실시형태에서, 듀플렉스 형성 영역은 RNA(예를 들어, 비-듀플렉스 형성 영역 서열) 내의 의도되지 않은 서열과 짝지워진 50% 미만(예를 들어, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만)의 염기를 갖는다고 예측된다. 일부 실시형태에서, 전구체 RNA 가닥 각각 상에 그리고 그룹 I 인트론 단편에 인접하거나 매우 가깝게 이러한 듀플렉스 형성 영역을 포함시키는 것은 그룹 I 인트론 단편을 서로에 매우 근접하게 하여 스플라이싱 효율을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 듀플렉스 형성 영역은 3 내지 100개 뉴클레오타이드 길이(예를 들어, 3 내지 75개 뉴클레오타이드 길이, 3 내지 50개 뉴클레오타이드 길이, 20 내지 50개 뉴클레오타이드 길이, 35 내지 50개 뉴클레오타이드 길이, 5 내지 25개 뉴클레오타이드 길이, 9 내지 19개 뉴클레오타이드 길이)이다. 일부 실시형태에서, 듀플렉스 형성 영역은 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 듀플렉스 형성 영역은 약 9 내지 약 50개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일 실시형태에서, 듀플렉스 형성 영역은 약 9 내지 약 19개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 듀플렉스 형성 영역은 약 20 내지 약 40개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 듀플렉스 형성 영역은 약 30개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA는 동일한 발현 서열을 포함하는 mRNA보다 더 높은 기능적 안정성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA는 동일한 발현 서열, 5moU 변형, 최적화된 UTR, 캡 및/또는 polyA 테일을 포함하는 mRNA보다 더 높은 기능적 안정성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 적어도 5시간, 10시간, 15시간, 20시간, 30시간, 40시간, 50시간, 60시간, 70시간 또는 80시간의 기능성 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 5 내지 80, 10 내지 70, 15 내지 60 및/또는 20 내지 50시간의 기능성 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 동일한 단백질을 암호화하는 등가의 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 기능성 반감기보다 더 큰(예를 들어, 적어도 1.5배 더 큰, 적어도 2배 더 큰) 기능성 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 기능성 반감기는 기능성 단백질 합성의 검출을 통해서 평가될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 벡터, 전구체 RNA 및 원형 RNA는 제1(5') 및/또는 제2(3') 스페이서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 3' 그룹 I 인트론 단편과 IRES 사이에 스페이서를 포함시키는 것은 이들 영역이 상호작용하는 것을 방지함으로써 그 영역에서 2차 구조를 보존하여, 스플라이싱 효율을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1(3' 그룹 I 인트론 단편과 IRES 사이) 및 제2(2개의 발현 서열과 5' 그룹 I 인트론 단편 사이) 스페이서는 제1 듀플렉스 형성 영역 및 제2 듀플렉스 형성 영역이 아닌 서로 염기 짝지움을 형성할 것이라고 예측되는 추가 염기 짝지움 영역을 포함한다. 다른 실시형태에서, 제1(3' 그룹 I 인트론 단편과 IRES 사이) 및 제2(발현 서열 중 하나와 5' 그룹 I 인트론 단편 사이) 스페이서는 제1 듀플렉스 형성 영역 및 제2 듀플렉스 형성 영역이 아닌 서로 염기 짝지움을 형성할 것이라고 예측되는 추가 염기 짝지움 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 스페이서 염기 짝지움은 그룹 I 인트론 단편을 서로 매우 근접하게 하여 스플라이싱 효율을 추가로 증가시킨다. 추가로, 일부 실시형태에서, 제1 듀플렉스 형성 영역과 제2 듀플렉스 형성 영역 사이의 염기 짝지움, 및 별도로 제1 스페이서와 제2 스페이서 사이의 염기 짝지움의 조합은 염기 짝지움의 인접한 영역이 측접된 그룹 I 인트론 단편을 함유하는 스플라이싱 버블의 형성을 촉진한다. 전형적인 스페이서는 다음 특성 중 하나 이상을 갖는 연속적인 서열이다: 1) 근위 구조, 예를 들어, IRES, 발현 서열 또는 인트론의 간섭을 피할 것으로 예측됨; 2) 적어도 7nt 길이 내지 100nt 이하임; 3) 3' 인트론 단편 뒤 그리고 이에 인접하여 그리고/또는 5' 인트론 단편 이전 그리고 이에 인접하여 위치함; 그리고 4) a) 적어도 5nt 길이인 비구조화 영역, b) 또 다른 스페이서를 포함하는 원위 서열에 대해 적어도 5nt 길이의 염기 짝지움 영역 및 c) 스페이서의 서열로 범주가 제한되는 적어도 7nt 길이의 구조화 영역 중 하나 이상을 함유함. 스페이서는 비구조화 영역, 염기 짝지움 영역, 헤어핀/구조화 영역 및 이들의 조합을 포함하는 몇몇 영역을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 스페이서는 높은 GC 함량을 갖는 구조화 영역을 갖는다. 일 실시형태에서, 스페이서 내의 영역은 동일한 스페이서 내의 또 다른 영역과 염기 짝지움을 형성한다. 일 실시형태에서, 스페이서 염기 내의 영역은 또 다른 스페이서 내의 영역과 염기 짝지움을 형성한다. 일 실시형태에서, 스페이서는 하나 이상의 헤어핀 구조를 포함한다. 일 실시형태에서, 스페이서는 4 내지 12개 뉴클레오타이드의 줄기 및 2 내지 10개 뉴클레오타이드의 루프를 갖는 하나 이상의 헤어핀 구조를 포함한다. 일 실시형태에서, 3' 그룹 I 인트론 단편과 IRES 사이에 추가 스페이서가 존재한다. 일 실시형태에서, 이러한 추가 스페이서는 IRES의 구조화 영역이 3' 그룹 I 인트론 단편의 접힘을 방해하는 것을 방지하거나 이것이 발생하는 정도를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 5' 스페이서 서열은 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 또는 30개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 5' 스페이서 서열은 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35 또는 30개 이하의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서 5' 스페이서 서열은 5 내지 50, 10 내지 50, 20 내지 50, 20 내지 40 및/또는 25 내지 35개 뉴클레오타이드 길이이다. 특정 실시형태에서, 5' 스페이서 서열은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 뉴클레오타이드 길이이다. 한 실시형태에서, 5' 스페이서 서열은 polyA 서열이다. 다른 실시형태에서, 5' 스페이서 서열은 polyAC 서열이다. 일 실시형태에서, 스페이서는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 polyAC 함량을 포함한다. 일 실시형태에서, 스페이서는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 폴리피리미딘(C/T 또는 C/U) 함량을 포함한다.
특정 실시형태에서, 3' 그룹 I 인트론 단편은 3' 스플라이스 부위 다이뉴클레오타이드 및 선택적으로 적어도 1nt 길이(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30nt 길이) 및 최대 엑손의 길이의 인접한 엑손 서열을 포함하는 자연 그룹 I 인트론의 3' 근위 단편과 적어도 75% 동일한(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 연속적인 서열이다. 전형적으로, 5' 그룹 I 인트론 단편은 5' 스플라이스 부위 다이뉴클레오타이드 및 선택적으로 적어도 1nt 길이(예를 들어, 적어도 2, 5, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30nt 길이) 및 최대 엑손의 길이의 인접한 엑손 서열을 포함하는 자연 그룹 I 인트론의 5' 근위 단편과 적어도 75% 동일한(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 연속적인 서열이다. 문헌[Umekage et al. (2012)]에 기재된 바와 같이, 3' 그룹 I 인트론 단편 및 5' 그룹 I 인트론 단편의 외부 부분이 원형화에서 제거되어, 본 명세서에 제공된 원형 RNA가 적어도 1nt 길이인 선택적인 엑손 서열에 의해 형성된 3' 그룹 I 인트론 단편 및 적어도 1nt 길이(이러한 서열이 원형화되지 않은 전구체 RNA에 존재하는 경우)인 선택적인 엑손 서열에 의해 형성된 5' 그룹 I 인트론 단편의 일부만을 포함하도록 한다. 원형 RNA에 의해 유지되는 3' 그룹 I 인트론 단편의 부분은 본 명세서에서 포스트 스플라이싱 3' 그룹 I 인트론 단편으로 지칭된다. 원형 RNA에 의해 유지되는 5' 그룹 I 인트론 단편의 부분은 본 명세서에서 포스트 스플라이싱 5' 그룹 I 인트론 단편으로 지칭된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA는 등가의 선형 mRNA보다 더 높은 규모의 발현, 예를 들어, 세포에 RNA를 투여한지 24시간 후에 더 높은 규모의 발현을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA는 동일한 발현 서열, 5moU 변형, 최적화된 UTR, 캡 및/또는 polyA 테일을 포함하는 mRNA보다 더 큰 발현 규모를 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 적어도 5시간, 10시간, 15시간, 20시간, 30시간, 40시간, 50시간, 60시간, 70시간 또는 80시간의 기능성 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 5 내지 80, 10 내지 70, 15 내지 60 및/또는 20 내지 50시간의 기능성 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 동일한 단백질을 암호화하는 등가의 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 기능성 반감기보다 더 큰(예를 들어, 적어도 1.5배 더 큰, 적어도 2배 더 큰) 기능성 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 기능성 반감기는 기능성 단백질 합성의 검출을 통해서 평가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 적어도 5시간, 10시간, 15시간, 20시간, 30시간, 40시간, 50시간, 60시간, 70시간 또는 80시간의 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 5 내지 80, 10 내지 70, 15 내지 60 및/또는 20 내지 50시간의 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 동일한 단백질을 암호화하는 등가의 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 반감기보다 더 큰(예를 들어, 적어도 1.5배 더 큰, 적어도 2배 더 큰) 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 약제학적 조성물은 미리 결정된 역치 값의 것과 동일하거나 더 큰 인간 세포에서의 기능성 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서 기능성 반감기는 기능성 단백질 검정에 의해서 결정된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 기능성 반감기는 시험관내 루시퍼라제 검정에 의해서 결정되며, 여기서 가우시아 루시퍼라제(GLuc)의 활성은 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 인간 세포(예를 들어, HepG2)의 배지에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 14일에 걸쳐서 1, 2, 6, 12 또는 24시간마다 측정된다 다른 실시형태에서, 기능성 반감기는 생체내 검정에 의해서 결정되며, 여기서 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 발현 서열에 의해서 암호화된 단백질의 수준은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 14일에 걸쳐서 1, 2, 6, 12 또는 24시간마다 환자 혈청 또는 조직 샘플에서 측정된다. 일부 실시형태에서, 미리 결정된 역치 값은 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드와 동일한 발현 서열을 포함하는 참조 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 기능성 반감기이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA는 등가의 선형 mRNA보다 더 높은 규모의 발현, 예를 들어, 세포에 RNA를 투여한지 24시간 후에 더 높은 규모의 발현을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA는 동일한 발현 서열, 5moU 변형, 최적화된 UTR, 캡 및/또는 polyA 테일을 포함하는 mRNA보다 더 큰 발현 규모를 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA는 유기체의 면역계 또는 면역 세포의 특정 유형에 노출되는 경우 등가의 mRNA보다 덜 면역원성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA는 유기체의 면역계 또는 면역 세포의 특정 유형에 노출되는 경우 사이토카인의 조절된 생산과 연관된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA는 동일한 발현 서열을 포함하는 mRNA와 비교할 때 유기체의 면역계 또는 면역 세포의 특정 유형에 노출되는 경우 TNFα, RIG-I, IL-2, IL-6, IFNγ 및/또는 타입 1 인터레폰, 예를 들어, IFN-β1의 감소된 생산과 연관된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA는 동일한 발현 서열을 포함하는 mRNA와 비교할 때 유기체의 면역계 또는 면역 세포의 특정 유형에 노출되는 경우 더 적은 TNFα, RIG-I, IL-2, IL-6, IFNγ 및/또는 타입 1 인터페론, 예를 들어, IFN-β1 전사 유도와 연관된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA는 동일한 발현 서열을 포함하는 mRNA보다 더 낮은 면역원성이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA는 동일한 발현 서열, 5moU 변형, 최적화된 UTR, 캡 및/또는 polyA 테일을 포함하는 mRNA보다 더 낮은 면역원성이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 뉴클레오사이드 변형이 필요하지 않은 등가의 선형 RNA보다 더 높은 안정성 또는 기능적 안정성을 갖는 RNA(예를 들어, circRNA)를 제공한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오사이드 변형이 결여된 RNA를 생산하는 방법은 감소된 중단 전사로 인해 뉴클레오사이드 변형을 함유하는 RNA를 생산하는 방법보다 더 높은 백분율의 전장 전사체를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 RNA 함유 뉴클레오사이드 변형과 연관된 추가 중단 전사 없이 큰(예를 들어, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb, 10kb, 11kb, 12kb, 13kb, 14kb 또는 15kb) RNA 작제물을 생산할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA는 그 자체로 세포에 형질주입될 수 있거나 DNA 벡터 형태로 형질주입되고, 세포에서 발현될 수 있다. 형질주입된 DNA 벡터로부터의 원형 RNA의 전사는 첨가된 중합효소 또는 세포에 형질주입된 핵산에 의해서 암호화된 중합효소를 통해서, 바람직하게는 내인성 중합효소를 통해서 일어날 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 변형된 RNA 뉴클레오타이드 및/또는 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 m5C(5-메틸시티딘)이다. 또 다른 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 m5U(5-메틸우리딘)이다. 또 다른 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 m6A(N6-메틸아데노신)이다. 또 다른 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 s2U(2-티오우리딘)이다. 또 다른 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 Ψ(슈도우리딘)이다. 또 다른 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 Um(2'-O-메틸우리딘)이다. 다른 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 m1A(1-메틸아데노신); m2A(2-메틸아데노신); Am(2'-O-메틸아데노신); ms2　m6A(2-메틸티오-N6-메틸아데노신); i6A(N6-아이소펜텐일아데노신); ms2i6A(2-메틸티오-N6　아이소펜텐일아데노신); io6A(N6-(시스-하이드록시아이소펜텐일)아데노신); ms2io6A(2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시아이소펜텐일)아데노신); g6A(N6-글리신일카바모일아데노신); t6A(N6-트레오닐카바모일아데노신); ms2t6A(2-메틸티오-N6-트레오닐 카바모일아데노신); m6t6A(N6-메틸-N6-트레오닐카바모일아데노신); hn6A(N6-하이드록시노르발릴카바모일아데노신); ms2hn6A(2-메틸티오-N6-하이드록시노르발릴 카바모일아데노신); Ar(p)(2'-O-리보실아데노신(포스페이트)); I(이노신); m1I(1-메틸이노신); m1Im(1,2'-O-다이메틸이노신); m3C(3-메틸시티딘); Cm(2'-O-메틸시티딘); s2C(2-티오시티딘); ac4C(N4-아세틸시티딘); f5C(5-폼일시티딘); m5Cm (5,2'-O-다이메틸시티딘); ac4Cm(N4-아세틸-2'-O-메틸시티딘); k2C(리시딘); m1G(1-메틸구아노신); m2G(N2-메틸구아노신); m7G(7-메틸구아노신); Gm(2'-O-메틸구아노신); m2　2G(N2,N2-다이메틸구아노신); m2Gm(N2,2'-O-다이메틸구아노신); m2　2Gm(N2,N2,2'-O-트라이메틸구아노신); Gr(p)(2'-O-리보실구아노신(포스페이트)); yW(위부토신); o2yW(퍼옥시위부토신); OHyW(하이드록시위부토신); OHyW*(언더변형된(undermodified) 하이드록시위부토신); imG(위오신); mimG(메틸위오신); Q(케오신); oQ(에폭시케오신); galQ(갈락토실-케오신); manQ(만노실-케오신); preQ0(7-사이아노-7-데아자구아노신); preQ1(7-아미노메틸-7-데아자구아노신); G+(아르카에오신); D(다이하이드로우리딘); m5Um(5,2'-O-다이메틸우리딘); s4U(4-티오우리딘); m5s2U(5-메틸-2-티오우리딘); s2Um(2-티오-2'-O-메틸우리딘); acp3U(3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘); ho5U(5-하이드록시우리딘); mo5U(5-메톡시우리딘); cmo5U(우리딘 5-옥시아세트산); mcmo5U(우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스터); chm5U(5-(카복시하이드록시메틸)우리딘)); mchm5U(5-(카복시하이드록시메틸)우리딘 메틸 에스터); mcm5U(5-메톡시카보닐메틸우리딘); mcm5Um(5-메톡시카보닐메틸-2'-O-메틸우리딘); mcm5s2U(5-메톡시카보닐메틸-2-티오우리딘); nm5S2U(5-아미노메틸-2-티오우리딘); mnm5U(5-메틸아미노메틸우리딘); mnm5s2U(5-메틸아미노메틸-2-티오우리딘); mnm5se2U(5-메틸아미노메틸-2-셀레노우리딘); ncm5U(5-카바모일메틸우리딘); ncm5Um(5-카바모일메틸-2'-O-메틸우리딘); cmnm5U(5-카복시메틸아미노메틸우리딘); cmnm5Um(5-카복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸우리딘); cmnm5s2U(5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘); m6　2A(N6,N6-다이메틸아데노신); Im(2'-O-메틸이노신); m4C(N4-메틸시티딘); m4Cm(N4,2'-O-다이메틸시티딘); hm5C(5-하이드록시메틸시티딘); m3U(3-메틸우리딘); cm5U(5-카복시메틸우리딘); m6Am(N6,2'-O-다이메틸아데노신); m6　2Am(N6,N6,O-2'-트라이메틸아데노신); m2,7G(N2,7-다이메틸구아노신); m2,2,7G(N2,N2,7-트라이메틸구아노신); m3Um(3,2'-O-다이메틸우리딘); m5D(5-메틸다이하이드로우리딘); f5Cm(5-폼일-2'-O-메틸시티딘); m1Gm(1,2'-O-다이메틸구아노신); m1Am(1,2'-O-다이메틸아데노신); τm5U(5-타우리노메틸우리딘); τm5s2U(5-타우리노메틸-2-티오우리딘)); imG-14(4-데메틸위오신); imG2(아이소위오신); 또는 ac6A (N6-아세틸아데노신)이다.
일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 하기 군으로부터 선택된 화합물을 포함할 수 있다: 피리딘-4-온 리보뉴클레오사이드, 5-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시우리딘, 3-메틸우리딘, 5-카복시메틸-우리딘, 1-카복시메틸-슈도우리딘, 5-프로핀일-우리딘, 1-프로핀일-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 다이하이드로우리딘, 다이하이드로슈도우리딘, 2-티오-다이하이드로우리딘, 2-티오-다이하이드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 5-아자-시티딘, 슈도아이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-폼일시티딘, N4-메틸시티딘, 5-하이드록시메틸시티딘, 1-메틸-슈도아이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도아이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도아이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도아이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도아이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도아이소시티딘, 제불라린, 5-아자-제불라린, 5-메틸-제불라린, 5-아자-2-티오-제불라린, 2-티오-제불라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도아이소시티딘, 4-메톡시-1-메틸-슈도아이소시티딘, 2-아미노퓨린, 2, 6-다이아미노퓨린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-2,6-다이아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-다이아미노퓨린, 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-아이소펜텐일아데노신, N6-(시스-하이드록시아이소펜텐일)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시아이소펜텐일) 아데노신, N6-글리신일카바모일아데노신, N6-트레오닐카바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카바모일아데노신, N6,N6-다이메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 2-메톡시-아데닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 위오신, 위부토신, 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-다이메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신 및 N2,N2-다이메틸-6-티오-구아노신. 또 다른 실시형태에서, 변형은 5-메틸사이토신, 슈도우리딘 및 1-메틸슈도우리딘으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시형태에서, 변형된 리보뉴클레오사이드는 5-메틸시티딘, 5-메톡시우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, N6-메틸아데노신 및/또는 슈도우리딘을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 변형된 뉴클레오사이드는 추가 안정성 및 면역 활성화에 대한 내성을 제공한다.
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 코돈-최적화될 수 있다. 코돈 최적화된 서열은 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 내의 코돈이 폴리펩타이드의 발현, 안정성 및/또는 활성을 증가시키기 위해서 치환된 것일 수 있다. 코돈 최적화에 영향을 미치는 인자는 하기 중 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: (i) 2개 이상의 유기체 또는 유전자 또는 합성에 의해서 작제된 편향 표 사이의 코돈 편향의 변화, (ii) 유기체, 유전자 또는 유전자 세트 내의 코돈 편향 정도의 변화, (iii) 컨텍스트를 포함하는 코돈의 체계적 변화, (iv) 해독 tRNA에 따른 코돈의 변화, (v) 전체 또는 삼중 중 하나의 위치에서의 GC %에 따른 코돈의 변화, (vi) 참조 서열, 예를 들어, 자연 발생 서열과의 유사성 정도의 변화, (vii) 코돈 빈도 컷오프의 변화, (viii) DNA 서열로부터 전사된 mRNA의 구조적 특성, (ix) 코돈 치환 세트의 설계가 기반으로 할 DNA 서열의 기능에 대한 사전 지식 및/또는 (x) 각각의 아미노산에 대한 코돈 세트의 체계적 변화. 일부 실시형태에서, 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드는 리보자임 충돌을 최소화할 수 있고/있거나 발현 서열과 IRES 사이의 구조적 개입을 제한할 수 있다.
특정 실시형태에서 본 명세서에 제공된 원형 RNA는 세포 내에서 생산된다. 일부 실시형태에서, 전구체 RNA는 박테리오파지 RNA 중합효소에 의해서 세포질 내에서 또는 숙주 RNA 중합효소 II에 의해서 핵 내에서 DNA 주형을 사용하여(예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 벡터를 사용하여) 전사되고, 그 다음 원형화된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA는 동물(예를 들어, 인간)에게 주입되어, 원형 RNA 분자에 의해서 암호화된 폴리펩타이드가 동물에서 발현된다.
3. 페이로드
일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 치료용 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제2 발현 서열은 치료용 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 치료용 단백질 중 하나 또는 둘 다는 하기 표에 열거된 단백질로부터 선택된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
일부 실시형태에서, 발현 서열 중 적어도 하나는 치료용 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 발현 서열은 사이토카인, 예를 들어, IL-12p70, IL-15, IL-2, IL-18, IL-21, IFN-α, IFN- β, IL-10, TGF-베타, IL-4 또는 IL-35, 또는 이의 기능성 단편을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 발현 서열은 면역 관문 저해제를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 발현 서열은 효능제(예를 들어, TNFR 패밀리 구성원, 예컨대, CD137L, OX40L, ICOSL, LIGHT 또는 CD70)를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 발현 서열은 키메라 항원 수용체를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 발현 서열은 저해성 수용체 효능제(예를 들어, PDL1, PDL2, 갈렉틴-9, VISTA, B7H4 또는 MHCII) 또는 저해성 수용체(예를 들어, PD1, CTLA4, TIGIT, LAG3 또는 TIM3)를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 발현 서열은 저해성 수용체 길항제를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 발현 서열은 하나 이상의 TCR 쇄(알파 및 베타쇄 또는 감마 및 델타쇄)를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 발현 서열은 분비된 T 세포 또는 면역 세포 인게이저(engager)(예를 들어, 이중특이적 항체, 예컨대, BiTE, 표적화, 예를 들어, CD3, CD137 또는 CD28 및 종양-발현된 단백질, 예를 들어, CD19, CD20 또는 BCMA 등)를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 발현 서열은 전사 인자(예를 들어, FOXP3, HELIOS, TOX1 또는 TOX2)를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 발현 서열은 면역억제 효소(예를 들어, IDO 또는 CD39/CD73)를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 발현 서열은 GvHD (예를 들어, 항-HLA-A2 CAR-Tregs)를 암호화한다.
일부 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)의 알파 및 베타쇄를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서발현 서열은 TCR의 감마 및 델타쇄를 암호화한다. 본 발명은 치료적 유효량의, TCR 알파쇄 및 TCR 베타쇄 또는 TCR 감마쇄 및 TCR 델타쇄를 암호화하는 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서발현 서열은 키메라 항원 수용체(CAR) 및 PD1 또는 PDL1의 길항제를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서발현 서열은 키메라 항원 수용체(CAR) 및 사이토카인을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-12p70, IL-15, IL-2, IL-18, IL-21, IFN-α, IFN- β, IL-10, TGF-베타, IL-4 또는 IL-35, 또는 이의 기능성 단편이다. 본 발명은 치료적 유효량의, CAR 및 PD1 또는 PDL1의 길항제를 암호화하는 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명은 치료적 유효량의, CAR 및 사이토카인을 암호화하는 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서발현 서열은 전사 인자 및 사이토카인을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 전사 인자는 FOXP3, STAT5B 또는 HELIOS이고, 사이토카인은 IL10, IL12 또는 TGF 베타이다. 본 발명은 치료적 유효량의, 전사 인자, 예를 들어, FOXP3 및 사이토카인을 암호화하는 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 장애를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서발현 서열은 전사 인자 및 CAR을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 전사 인자는 FOXP3, STAT5B 또는 HELIOS이다. 본 발명은 치료적 유효량의, 전사 인자, 예를 들어, FOXP3 및 CAR을 암호화하는 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 장애를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서발현 서열은 사이토카인 및 항원을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IFNγ다. 일부 실시형태에서, 항원은 신생항원이다. 본 발명은 치료적 유효량의, 사이토카인, 예를 들어, IFNγ 및 종양 항원 또는 이의 단편을 암호화하는 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 제1 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하고, 제2 발현 서열은 제2 CAR을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 CAR은 제1 항원에 특이적이고, 공자극성 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 함유하고, 제2 CAR은 제2 항원에 특이적이고, 공자극성 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 함유한다. 일부 실시형태에서, 다중 종양 항원을 표적화하는 CAR을 발현시키는 것은 이종 항원 발현을 갖는 종양에 대해 보다 효과적인 요법을 제공한다. 본 발명은 치료적 유효량의, 제1 CAR 및 제2 CAR을 암호화하는 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 서열은 제1 사이토카인을 암호화하고, 제2 발현 서열은 제2 사이토카인을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서사이토카인은 그룹 IL-10, TGFβ 및 IL-35이다. 일부 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서사이토카인은 그룹 IFNγ, IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-18이다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 1종 초과의 유전자에 의해서 암호화되는 소단위로 구성된 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 단백질은 이종이량체일 수 있고, 여기서 단백질의 각각의 쇄 또는 소단위는 별개의 유전자에 의해서 암호화된다. 1종 초과의 circRNA 분자가 전달 비히클로 전달되고, 각각의 circRNA가 단백질의 개별 소단위를 암호화한다. 대안적으로, 단일 circRNA는 1종 초과의 소단위를 암호화하도록 조작될 수 있다. 특정 실시형태에서, 각각의 소단위를 암호화하는 개별 circRNA 분자는 개별 전달 비히클로 투여될 수 있다.
3.1 사이토카인
IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-27β, IFNγ 및/또는 TGFβ1의 설명 및/또는 아미노산 서열이 본 명세서 및 www.uniprot.org 데이터에 수탁 번호: P60568(IL-2), P29459(IL-12A), P29460(IL-12B), P13232(IL-7), P22301(IL-10), P40933(IL-15), Q14116(IL-18), Q14213(IL-27β), P01579(IFNγ) 및/또는 P01137(TGFβ1)에 제공된다.
3.2 PD-1 및 PD-L1 길항제
일부 실시형태에서, PD-1 저해제는 펨브롤리주맙, 피딜리주맙 또는 니볼루맙이다. 일부 실시형태에서, 니볼루맙은 국제 특허 공개 제WO2006/121168호에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 펨브롤리주맙은 국제 특허 공개 제W02009/114335호에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 피딜리주맙은 국제 특허 공개 제WO2009/101611호에 기재되어 있다. 추가적인 항-PD1 항체는 미국 특허 제8,609,089호, 미국 특허 공개 제US 2010028330호 및 제US 20120114649호 및 국제 특허 공개 제WO2010/027827호 및 제WO2011/066342호에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, PD-L1 저해제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, BMS-936559 또는 CK-301이다.
PD-1 및/또는 PD-L1 항체의 중쇄 및 경쇄의 설명 및/또는 아미노산 서열은 본 명세서 및 www.drugbank.ca 데이터베이스에 수탁 번호: DB09037(펨브롤리주맙), DB09035(니볼루맙), DB15383(피딜리주맙), DB11595(아테졸리주맙), DB11945(아벨루맙) 및 DB11714(더발루맙)에 제공된다.
3.3 키메라 항원 수용체
키메라 항원 수용체(CAR 또는 CAR-T)는 유전자 조작된 수용체이다. 이들 조작된 수용체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 원형 RNA를 통해서 T 세포를 포함하는 면역 세포로 용이하게 삽입되고 이에 의해 발현될 수 있다. CAR로, 단일 수용체는 특정 항원을 인식하고, 그 항원에 결합될 때, 면역 세포를 활성화시켜 그 항원을 보유하는 세포를 공격하고 파괴하도록 프로그래밍될 수 있다. 이들 항원이 종양 세포 상에 존재하는 경우, CAR을 발현하는 면역 세포는 종양 세포를 표적하고 사멸시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드에 의해서 암호화된 CAR은 (i) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 분자, (ii) 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인 및 (iii) 활성화 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 CAR의 배향은 공자극성 도메인 및 활성화 도메인과 나란하게 항원 결합 도메인(예컨대, scFv)을 포함한다. 공자극성 도메인은 세포외 부분, 막관통 부분 및 세포내 부분 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 다수의 공자극성 도메인이 나란하게 사용될 수 있다.
항원 결합 도메인 　
CAR은 표적화된 항원과 상호작용하는 항원 결합 분자를 혼입함으로써 항원(예컨대, 세포-표면 항원)에 결합하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 이의 항체 단편, 예를 들어, 1개 이상의 단일 쇄 항체 단편(scFv)이다. scFv는 함께 연결된 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 갖는 단일 쇄 항체 단편이다. 예를 들어, 미국 특허 제7,741,465호 및 제6,319,494호뿐만 아니라 문헌[Eshhar et al., Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131-136] 참조. scFv는 표적 항원과 특이적으로 상호작용하는 모 항체의 능력을 유지한다. scFv는 키메라 항원 수용체에 유용한데, 그 이유는 이들이 다른 CAR 성분과 함께 단일 쇄의 부분으로서 발현되도록 조작될 수 있기 때문이다. 또한 문헌[Krause et al., J. Exp. Med., Volume 188, No. 4, 1998 (619-626); Finney et al., Journal of Immunology, 1998, 161 : 2791-2797] 참조. 항원 결합 분자는 전형적으로 관심 항원을 인식하게 이에 결합할 수 있도록 CAR의 세포외 부분 내에 전형적으로 함유된다는 것을 인식할 것이다. 이중특이적 및 다중특이적 CAR이, 1종 초과의 관심 표적에 대한 특이성과 함께 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 고려된다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 단일 쇄를 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 링커에 의해서 연결된다. 일부 실시형태에서, VH는 링커의 N 말단에 위치하고, VL은 링커의 C 말단에 위치한다. 다른 실시형태에서, VL는 링커의 N 말단에 위치하고, VH는 링커의 C 말단에 위치한다. 일부 실시형태에서, 링커는 적어도 약 5, 적어도 약 8, 적어도 약 10, 적어도 약 13, 적어도 약 15, 적어도 약 18, 적어도 약 20, 적어도 약 25, 적어도 약 30, 적어도 약 35, 적어도 약 40, 적어도 약 45, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90 또는 적어도 약 100개의 아미노산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 나노바디를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 DARPin을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 안티칼린 또는 다른 합성 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 하기 군으로부터 선택된 항원에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다: CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, C-타입 렉틴-유사 분자-1, CD33, 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(epidermal growth factor receptor variant III: EGFRvIII), 강글리오사이드 G2(GD2), 글리오사이드 GD3, TNF 수용체 패밀리 구성원, B 세포 성숙 항원(B cell maturation antigen: BCMA), Tn 항원((Tn Ag) 또는 (GaINAca-Ser/Thr)), 전립선-특이적 막 항원(prostate-specific membrane antigen: PSMA), 수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 1(Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1: ROR1), Fms-유사 티로신 키나제 3(Fms-Like Tyrosine Kinase 3: FLT3), 종양-연관 당단백질 72(Tumor-associated glycoprotein 72: TAG72), CD38, CD44v6, 암배아 항원(Carcinoembryonic antigen: CEA), 상피 세포 접착 분자(Epithelial cell adhesion molecule: EPCAM), B7H3(CD276), KIT(CD117), 인터류킨-13 수용체 소단위 알파-2, 메소텔린, 인터류킨 11 수용체 알파(Interleukin 11 receptor alpha: IL-11Ra), 전립선 줄기세포 항원(prostate stem cell antigen: PSCA), 프로테아제 세린 21, 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(vascular endothelial growth factor receptor 2: VEGFR2), 루이스(Y) 항원, CD24, 혈소판-유래 성장 인자 수용체 베타(Platelet-derived growth factor receptor beta: PDGFR-베타), 단계-특이적 배아 항원-4(Stage-specific embryonic antigen-4: SSEA-4), CD20, 엽산염 수용체 알파, HER2, HER3, 뮤신 1, 세포 표면 연관(MUC1), 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR), 신경 세포 접착 분자(neural cell adhesion molecule: NCAM), 전립선, 전립선 산 포스파타제(fibroblast activation protein alpha: PAP), 돌연변이된 연장 인자 2(elongation factor 2 mutated: ELF2M), 에프린 B2, 섬유모세포 활성화 단백질 알파(FAP), 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(I insulin-like growth factor 1 receptor: GF-I 수용체), 탄산탈수효소 IX(carbonic anhydrase IX: CAIX), 프로테아솜(Prosome, Macropain) 소단위, 베타 타입, 9(LMP2), 당단백질 100(glycoprotein 100: gp100), 중단점 클러스터 영역(BCR)과 아벨슨 뮤린 백혈병 바이러스 암유전자 동족체 1(Abl)로 이루어진 암유전자 융합 단백질(bcr-abl), 티로시나제, 에프린 타입-A 수용체 2(EphA2), 푸코실 GM1, 시알릴 루이스 접착 분자(sialyl Lewis adhesion molecule: sLe), 강글리오사이드 GM3, 트랜스글루타미나제 5(transglutaminase 5: TGS5), 중합체량-흑색종-연관 항원(high molecular weight-melanoma-associated antigen: HMWMAA), o-아세틸-GD2 강글리오사이드(o-acetyl-GD2 ganglioside: OAcGD2), 엽산염 수용체 베타, 종양 내피 마커 1(tumor endothelial marker 1: TEM1/CD248), 종양 내피 마커 7-관련(tumor endothelial marker 7-related: TEM7R), 클라우딘 6(claudin 6: CLDN6), 갑상선 자극 호르몬 수용체(thyroid stimulating hormone receptor: TSHR), G 단백질-커플드 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D(G protein-coupled receptor class C group 5, member D: GPRC5D), 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61(chromosome X open reading frame 61: CXORF61), CD97, CD179a, 역형성 림프종 키나제(anaplastic lymphoma kinase: ALK), 폴리시알산, 태반-특이적 1(PLAC1), globoH 당세라마이드의 육당류 부분(GloboH), 유선 분화 항원(mammary gland differentiation antigen: NY-BR-1), 우로플라킨 2(UPK2), A형 간염 바이러스 세포 수용체 1(Hepatitis A virus cellular receptor 1: HAVCR1), 아드레날린수용체 베타 3(adrenoceptor beta 3: ADRB3), 파넥신 3(pannexin 3: PANX3), G 단백질-커플링된 수용체 20(G protein-coupled receptor 20: GPR20), 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K 9(lymphocyte antigen 6 complex, locus K 9: LY6K), 후각 수용체 51E2(Olfactory receptor 51E2: OR51E2), TCR 감마 대체 리딩 프레임 단백질(TCR Gamma Alternate Reading Frame Protein: TARP), 빌름스 종양 단백질(WT1), 암/고환 항원 1(Cancer/testis antigen 1: NY-ESO-1), 암/고환 항원 2(LAGE-1a), MAGE 패밀리 구성원(MAGE-A1, MAGE-A3 및 MAGE-A4 포함), 염색체 12p에 위치된 ETS 전좌-변이체 유전자 6(ETS translocation-variant gene 6, located on chromosome 12p: ETV6-AML), 정자 단백질 17(sperm protein 17: SPA17), X 항원 패밀리, 구성원 1A(X Antigen Family, Member 1A: XAGE1), 앤지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2(Tie 2), 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1), 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2), Fos-관련 항원 1, 종양 단백질 p53(p53), p53 돌연변이체, 프로스테인, 생존, 텔로머라제, 전립선 암종 종양 항원-1, T 세포 1에 의해서 인식되는 흑색종 항원, 래트 육종(Ras) 돌연변이체, 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), 육종 전좌 파단점, 아폽토시스의 흑색종 저해제(melanoma inhibitor of apoptosis: ML-IAP), ERG(막관통 프로테아제, 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자), N-아세틸 글루코사민일-트랜스퍼라제 V(NA17), 짝지워진 박스 단백질 Pax-3(PAX3), 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, v-myc 조류 골수세포종 바이러스 암유전자 신경모세포종 유래 동족체(v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene neuroblastoma derived homolog: MYCN), Ras 동족체 패밀리 구성원 C(RhoC), 티로시나제-관련 단백질 2(TRP-2), 사이토크롬 P450 1B1(Cytochrome P450 1B1: CYP1B1), CCCTC-결합 인자(아연 핑거 단백질)-유사, T 세포 3에 의해서 인식되는 편평 세포 암종 항원(Squamous Cell Carcinoma Antigen Recognized By T Cells 3: SART3), 짝지워진 박스 단백질 Pax-5(PAX5), 프로아크로신 결합 단백질 sp32(OY-TES1), 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase: LCK), A 키나제 고정 단백질 4 (A kinase anchor protein 4: AKAP-4), 활막 육종, X 파단점 2(SSX2), 최종 당산화물에 대한 수용체(Receptor for Advanced Glycation Endproducts: RAGE-1), 신장 유비쿼터스 1(renal ubiquitous 1: RU1), 신장 유비쿼터스 2(RU2), 레구마인(legumain), 인간 유두종 바이러스 E6(HPV E6), 인간 유두종 바이러스 E7(HPV E7), 장 카복실 에스터라제, 돌연변이된 열 충격 단백질 70-2(mut hsp70-2), CD79a, CD79b, CD72, 백혈구-연관 면역글로불린-유사 수용체 1(LAIR1), IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR 또는 CD89), 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2(Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A member 2: LILRA2), CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f(CD300LF), C-타입 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A(C-type lectin domain family 12 member A: CLEC12A), 골수 기질 세포 항원 2(bone marrow stromal cell antigen 2: BST2), EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2(EMR2), 림프구 항원 75(LY75), 글리피칸-3(GPC3), Fc 수용체-유사 5(FCRL5), MUC16, 5T4, 8H9, αυβθ 인테그린, αvβ6 인테그린, 알파태아단백질(AFP), B7-H6, ca-125, CA9, CD44, CD44v7/8, CD52, E-카드헤린, EMA(상피 막 항원), 상피 당단백질-2(EGP-2), 상피 당단백질-40(EGP-40), ErbB4, 상피 종양 항원(ETA), 엽산염 결합 단백질(FBP), 키나제 삽입부 도메인 수용체(KDR), k-경쇄, L1 세포 접착 분자, MUC18, NKG2D, 암배아 항원(h5T4), 종양/고환-항원 1B, GAGE, GAGE-1, BAGE, SCP-1, CTZ9, SAGE, CAGE, CT10, MART-1, 면역글로불린 람다-유사 폴리펩타이드 1(IGLL1), 간염 B 표면 항원 결합 단백질(HBsAg), 바이러스 캡시드 항원(VCA), 초기 항원(EA), EBV 핵 항원(EBNA), HHV-6 p41 초기 항원, HHV-6B U94 잠복항원, HHV-6B p98 후기 항원, 사이토메갈로바이러스(CMV) 항원, 큰 T 항원, 작은 T 항원, 아데노바이러스 항원, 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus: RSV) 항원, 해마토글루티닌(HA), 뉴라미니다제(NA), 파라인플루엔자 타입 1 항원, 파리인플루엔자 타입 2 항원, 파라인플루엔자 타입 3 항원, 파라인플루엔자 타입 4 항원, 인간 메타뉴모바이러스(HMPV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 코어 항원, HIV p24 항원, 인간 T-세포 림프친화성 바이러스(HTLV-1) 항원, 머켈 세포 폴리오마 바이러스 작은 T 항원, 머켈 세포 폴리오마 바이러스 큰 T 항원 및 카포시 육종-연관 헤르페스 바이러스(KSHV) 용해성 핵 항원 및 KSHV 잠복 핵 항원. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 321 및/또는 322를 포함한다.
힌지/스페이서 도메인
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CAR은 힌지 또는 스페이서 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지/스페이서 도메인은 절단된 힌지/스페이서 도메인(THD)을 포함할 수 있다. THD 도메인은 완전한 힌지/스페이서 도메인("CHD")의 절단된 버전이다. 일부 실시형태에서, 세포외 도메인은 ErbB2, 글리코포린 A(GpA), CD2, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD4, CD7, CD8a, CD8[T CDl la(IT GAL), CDl lb(IT GAM), CDl lc(ITGAX), CDl ld(IT GAD), CD18(ITGB2), CD19(B4), CD27(TNFRSF7), CD28, CD28T, CD29(ITGB1), CD30(TNFRSF8), CD40(TNFRSF5), CD48(SLAMF2), CD49a(ITGA1), CD49d(ITGA4), CD49f(ITGA6), CD66a(CEACAM1), CD66b(CEACAM8), CD66c(CEACAM6), CD66d(CEACAM3), CD66e(CEACAM5), CD69(CLEC2), CD79A(B-세포 항원 수용체 복합체-연관 알파쇄), CD79B(B-세포 항원 수용체 복합체-연관 베타쇄), CD84(SLAMF5), CD96(Tactile), CD100(SEMA4D), CD103(ITGAE), CD134(0X40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD158A(KIR2DL1), CD158B1(KIR2DL2), CD158B2(KIR2DL3), CD158C(KIR3DP1), CD158D(KIRDL4), CD158F1(KIR2DL5A), CD158F2(KIR2DL5B), CD158K(KIR3DL2), CD160(BY55), CD162(SELPLG), CD226(DNAM1), CD229(SLAMF3), CD244(SLAMF4), CD247(CD3-제타), CD258(LIGHT), CD268(BAFFR), CD270(TNFSF14), CD272(BTLA), CD276(B7-H3), CD279(PD-1), CD314(NKG2D), CD319(SLAMF7), CD335(NK-p46), CD336(NK-p44), CD337(NK-p30), CD352(SLAMF6), CD353(SLAMF8), CD355(CRT AM), CD357(TNFRSF18), 유도성 T 세포 공자극인자(ICOS), LFA-1(CDl la/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80(KLRF1), IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS(GrpL), SLP-76(LCP2), PAG1/CBP, CD83 리간드, Fc 감마 수용체, MHC 클래스 1 분자, MHC 클래스 2 분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 활성화 NK 세포 수용체, 톨 리간드 수용체 및 이들의 단편 또는 조합물로부터 기원되거나 유래된다(예를 들어, 이들 모두 또는 이들의 단편을 포함한다). 힌지 또는 스페이서 도메인은 자연 공급원으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 힌지 또는 스페이서 도메인은 항원 결합 분자(예를 들어, scFv)와 막관통 도메인 사이에 위치된다. 이러한 배향에서, 힌지/스페이서 도메인은 항원 결합 분자와 CAR이 발현되는 세포 막의 표면 사이의 거리를 제공한다. 일부 실시형태에서, 힌지 또는 스페이서 도메인은 면역글로불린으로부터 기원되거나 이로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 힌지 또는 스페이서 도메인은 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE 및 IgM 또는 이들의 단편의 힌지/스페이서 영역으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 힌지 또는 스페이서 도메인은 CD8 알파의 힌지/스페이서 영역을 포함하거나 이로부터 기원되거나 이로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 힌지 또는 스페이서 도메인은 CD28의 힌지/스페이서 영역을 포함하거나 이로부터 기원되거나 이로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 힌지 또는 스페이서 도메인은 CD8 알파의 힌지/스페이서 영역의 단편 또는 CD28의 힌지/스페이서 영역의 단편을 포함하고, 여기서 단편은 전체 힌지/스페이서 영역보다 더 작은 임의의 것이다. 일부 실시형태에서, CD8 알파 힌지/스페이서 영역의 단편 또는 CD28 힌지/스페이서 영역의 단편은 CD8 알파 힌지/스페이서 영역 또는 CD28 힌지/스페이서 영역의 N-말단 또는 C-말단 또는 둘 다에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19 또는 적어도 20개의 아미노산을 제외한 아미노산 서열을 포함한다.
막관통 도메인 　
본 개시내용의 CAR은 막관통 도메인 및/또는 세포내 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 막관통 도메인은 CAR의 세포외 도메인에 융합되도록 설계될 수 있다. 그것은 CAR의 세포내 도메인에 유사하게 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR 내의 도메인 중 하나와 자연적으로 연관된 막관통 도메인이 사용된다. 일부 예에서, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 회피하도록 (예를 들어, 아미노산 치환에 의해) 선택되거나 변형될 수 있다. 막관통 도메인은 자연 공급원으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 자연적인 경우, 도메인은 임의의 막-결합된 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다.
막관통 영역은 수용체 티로신 키나제(예를 들어, ErbB2), 글리코포린 A(GpA), 4-1BB/CD137, 활성화 NK 세포 수용체, 면역글로불린 단백질, B7-H3, BAFFR, BFAME(SEAMF8), BTEA, CD100(SEMA4D), CD103, CD160(BY55), CD 18, CD 19, CD 19a, CD2, CD247, CD27, CD276(B7-H3), CD28, CD29, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8알파, CD8베타, CD96(Tactile), CD1 la, CD1 lb, CD1 lc, CD1 Id, CDS, CEACAM1, CRT AM, 사이토카인 수용체, DAP-10, DNAM1(CD226), Fc 감마 수용체, GADS, GITR, HVEM(EIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, Ig 알파(CD79a), IE-2R 베타, IE-2R 감마, IE-7R 알파, 유도성 T 세포 공자극인자(ICOS), 인테그린, ITGA4, ITGA4, ITGA6, IT GAD, ITGAE, ITGAE, IT GAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, EAT, LFA-1, LFA-1, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, LIGHT, LIGHT, LTBR, Ly9(CD229), 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1; CDl-la/CD18), MHC 클래스 1 분자, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80(KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, 예정사-1(PD-1), PSGL1, SELPLG(CD162), 신호전달 림프구성 활성화 분자(SLAM 단백질), SLAM(SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4(CD244; 2B4), SLAMF6(NTB-A; Lyl08), SLAMF7, SLP-76, TNF 수용체 단백질, TNFR2, TNFSF14, 톨 리간드 수용체, TRANCE/RANKL, VLA1 또는 VLA-6 또는 단편, 이들의 절단부 또는 조합물로부터 유래될 수 있다(즉, 이들을 포함할 수 있다).
일부 실시형태에서, 적합한 세포내 신호전달 도메인은 활성화 대식세포/골수 세포 수용체 CSFR1, MYD88, CD14, TIE2, TLR4, CR3, CD64, TREM2, DAP10, DAP12, CD169, DECTIN1, CD206, CD47, CD163, CD36, MARCO, TIM4, MERTK, F4/80, CD91, C1QR, LOX-1, CD68, SRA, BAI-1, ABCA7, CD36, CD31, 락토페린 또는 이들의 단편, 절단부 또는 조합물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 수용체 티로신 키나제는 인슐린 수용체(InsR), 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체(IGF1R), 인슐린 수용체-관련 수용체(IRR), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파(PDGFRa), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타(PDGFRfi). KIT 원종양 유전자 수용체 티로신 키나제(Kit), 집락 자극 인자 1 수용체(CSFR), fms 관련 티로신 키나제 3(FLT3), fms 관련 티로신 키나제 1(VEGFR-1), 키나제 삽입부 도메인 수용체(VEGFR-2), fms 관련 티로신 키나제 4(VEGFR-3), 섬유모세포 성장 인자 수용체 1(FGFR1), 섬유모세포 성장 인자 수용체 2(FGFR2), 섬유모세포 성장 인자 수용체 3(FGFR3), 섬유모세포 성장 인자 수용체 4(FGFR4), 단백질 티로신 키나제 7(CCK4), 신경영양성 수용체 티로신 키나제 1(trkA), 신경영양성 수용체 티로신 키나제 2(trkB), 신경영양성 수용체 티로신 키나제 3(trkC), 수용체 티로신 키나제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 수용체 티로신 키나제 유사 희귀 수용체 2(ROR2), 근육 연관 수용체 티로신 키나제(MuSK), MET 원종양 유전자, 수용체 티로신 키나제(MET), 대식세포 자극 1 수용체(Ron), AXL 수용체 티로신 키나제(Axl), TYR03 단백질 티로신 키나제(Tyro3), MER 원종양 유전자, 티로신 키나제(Mer), 면역글로불린 유사 및 EGF 유사 도메인 1을 갖는 티로신 키나제(TIE1), TEK 수용체 티로신 키나제(TIE2), EPH 수용체 A1(EphAl), EPH 수용체 A2(EphA2),(EPH 수용체 A3) EphA3, EPH 수용체 A4(EphA4), EPH 수용체 A5(EphA5), EPH 수용체 A6(EphA6), EPH 수용체 A7(EphA7), EPH 수용체 A8(EphA8), EPH 수용체 A10(EphAlO), EPH 수용체 B1(EphBl), EPH 수용체 B2(EphB2), EPH 수용체 B3(EphB3), EPH 수용체 B4(EphB4), EPH 수용체 B6(EphB6), ret 원종양 유전자(Ret), 수용체-유사 티로신 키나제(RYK), 디스코이딘 도메인 수용체 티로신 키나제 1(DDR1), 디스코이딘 도메인 수용체 티로신 키나제 2(DDR2), c-ros 암유전자 1, 수용체 티로신 키나제(ROS), 아폽토시스 연관 티로신 키나제(Lmrl), lemur 티로신 키나제 2(Lmr2), 레무(lemur) 티로신 키나제 3(Lmr3), 백혈구 수용체 티로신 키나제(LTK), ALK 수용체 티로신 키나제(ALK) 또는 세린/트레오닌/티로신 키나제 1(STYK1)로부터 유래될 수 있다(이들을 포함할 수 있다).
공자극성 도메인
특정 실시형태에서, CAR은 공자극성 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공자극성 도메인은 4-1BB(CD137), CD28 또는 둘 다 및/또는 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 공자극성 도메인은 인간 CD28, 인간 4-1BB 또는 둘 다이고, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 인간 CD3 제타(ζ)이다. 4-1BB, CD28, CD3 제타 또는 이들 중 임의의 것은 각각 전체 4-1BB, CD28 또는 CD3 제타보다 작은 것을 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체는 이의 효력을 증가시키기 위해서 공자극성(신호전달) 도메인을 혼입할 수 있다. 미국 특허 제7,741,465호 및 제6,319,494호뿐만 아니라 상기 문헌[Krause et al. and Finney et al.], [Song et al., Blood 119:696-706 (2012)]; [Kalos et al., Sci Transl. Med. 3:95 (2011)]; [Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011)] 및 [Gross et al., Amur. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016)] 참조.
일부 실시형태에서, 공자극성 도메인은 서열번호 318 또는 320의 아미노산 서열을 포함한다.
세포내 신호전달 도메인
본 명세서에 개시된 조작된 T 세포의 세포내(신호전달) 도메인은 활성화 도메인에 신호전달을 제공할 수 있고, 이것은 그 다음 면역 세포의 정상 효과기 기능 중 적어도 하나를 활성화시킨다. T 세포의 효과기 기능은 예를 들어, 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다.
일부 실시형태에서, 적합한 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB/CD137, 활성화 NK 세포 수용체, 면역글로불린 단백질, B7-H3, BAFFR, BLAME(SLAMF8), BTLA, CD100(SEMA4D), CD103, CD160(BY55), CD18, CD19, CD 19a, CD2, CD247, CD27, CD276(B7-H3), CD28, CD29, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8알파, CD8베타, CD96(Tactile), CD1 la, CD1 lb, CD1 lc, CD1 Id, CDS, CEACAM1, CRT AM, 사이토카인 수용체, DAP-10, DNAM1(CD226), Fc 감마 수용체, GADS, GITR, HVEM(LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, Ig 알파(CD79a), IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, 유도성 T 세포 공자극인자(ICOS), 인테그린, ITGA4, ITGA4, ITGA6, IT GAD, ITGAE, ITGAL, IT GAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, CD83와 특이적으로 결합하는 리간드, LIGHT, LIGHT, LTBR, Ly9(CD229), Lyl08), 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1; CDl-la/CD18), MHC 클래스 1 분자, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80(KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, 예정사-1(PD-1), PSGL1, SELPLG(CD162), 신호전달 림프구성 활성화 분자(SLAM 단백질), SLAM(SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4(CD244; 2B4), SLAMF6(NTB-A, SLAMF7, SLP-76, TNF 수용체 단백질, TNFR2, TNFSF14, 톨 리간드 수용체, TRANCE/RANKL, VLA1 또는 VLA-6 또는 이들의 단편, 절단부 또는 조합물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다(예를 들어, 이들을 포함한다).
CD3은 천연 T 세포 상의 T 세포 수용체의 요소이고, CAR 내의 중요한 세포내 활성화 요소인 것으로 밝혀져 있다. 일부 실시형태에서, CD3은 CD3 제타이다. 일부 실시형태에서, 활성화 도메인은 서열번호 319의 폴리펩타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
3.4 T 세포 수용체
TCR은 IMGT(International Immunogenetics) TCR 명명법을 사용하여 설명되고, TCR 서열의 IMGT 공개 데이터베이스와 연관된다. 천연 알파-베타 이종이량체 TCR은 알파쇄 및 베타쇄를 갖는다. 광범위하게, 각각의 쇄는 가변, 연결 및 불변 영역을 포함할 수 있으며, 베타쇄는 또한 보통 가변 영역과 연결 영역 사이에 짧은 다양성 영역을 포함하지만, 이러한 다양성 영역은 종종 연결 영역의 일부로 간주된다. 각각의 가변 영역은 프레임워크 서열에 내장된 3개의 CDR(상보성 결정 영역)을 포함할 수 있으며, 하나는 CDR3으로 명명된 초가변 영역이다. 프레임워크, CDR1 및 CDR2 서열에 의해서 그리고 부분적으로 정의된 CDR3 서열에 의해 구별되는 여러 유형의 알파쇄 가변(Vα) 영역 및 여러 유형의 베타쇄 가변(Vβ) 영역이 존재한다. Vα 유형은 IMGT 명명법에서 고유한 TRAV 번호로 지칭된다. 따라서 "TRAV21"은 고유한 프레임워크 및 CDR1 및 CDR2 서열을 갖는 TCR Vα 영역, 및 TCR에서 TCR까지 보존되지만 TCR에서 TCR까지 달라지는 아미노산 서열을 또한 포함하는 아미노산 서열에 의해 부분적으로 정의되는 CDR3 서열을 정의한다. 동일한 방식으로 "TRBV5-1"은 고유한 프레임워크 및 CDR1 및 CDR2 서열을 갖지만 부분적으로만 정의된 CDR3 서열을 갖는 TCR Vβ 영역을 정의한다.
TCR의 결합 영역은 고유한 IMGT TRAJ 및 TRBJ 명명법에 의해 유사하게 정의되고, 불변 영역은 IMGT TRAC 및 TRBC 명명법에 의해 정의된다.
베타쇄 다양성 영역은 IMGT 명명법에서 약어 TRBD로 지칭되며, 언급된 바와 같이 연결된 TRBD/TRBJ 영역은 종종 결합 영역으로 함께 간주된다.
IMGT 명명법에 의해 정의된 고유한 서열은 널리 알려져 있고, TCR 분야에서 일하는 사람들에게 접근 가능하다. 예를 들어, 이들은 IMGT 공개 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 문헌[The "T cell Receptor Factsbook", (2001) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8]은 또한 IMGT 명명법에 의해 정의된 서열을 개시하지만, 이의 출판일 및 이에 따른 시간 지연으로 인해, 그 내의 정보는 때때로 IMGT 데이터베이스를 참조하여 확인할 필요가 있다.
천연 TCR은 이종이량체 αβ 또는 γδ 형태로 존재한다. 그러나, αα 또는 ββ 동종이량체로 이루어진 재조합 TCR은 이전에 펩타이드 MHC 분자에 결합하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 TCR은 이종이량체 αβ TCR일 수 있거나, αα 또는 ββ 동종이량체 TCR일 수 있다.
입양 요법에 사용하기 위해, αβ 이종이량체 TCR은 예를 들어, 세포질 및 막관통 도메인 둘 다를 갖는 전장 쇄로서 형질주입될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 TCR은 예를 들어, 국제 공개 제WO 2006/000830호에 기재된 바와 같이 각각의 불변 도메인의 잔기 사이에 도입된 이황화 결합을 가질 수 있다.
본 발명의 TCR, 특히 알파-베타 이종이량체 TCR은 알파쇄 TRAC 불변 도메인 서열 및/또는 베타쇄 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 포함할 수 있다. 알파 및 베타쇄 불변 도메인 서열은 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1 또는 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 사이의 천연 이황화 결합을 결실시키기 위해 절단 또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 알파 및/또는 베타쇄 불변 도메인 서열(들)은 또한 TRAC의 Thr 48 및 TRBC1 또는 TRBC2의 Ser 57에 대한 시스테인 잔기의 치환에 의해 변형될 수 있으며, 상기 시스테인은 TCR의 알파 불변 도메인과 베타 불변 도메인 사이에 이황화 결합을 형성한다.
결합 친화도(평형 상수 KD에 반비례함) 및 결합 반감기(T½로 표현됨)는 임의의 적절한 방법에 의해 결정될 수 있다. TCR의 친화도가 두 배가 되면 KD가 반으로 줄어든다는 것이 인지될 것이다. T½은 ln 2를 오프-레이트(koff)로 나눈 값으로 계산된다. 따라서 T½이 두 배가 되면 koff가 반으로 줄어든다. TCR에 대한 KD 및 koff 값은 일반적으로 TCR의 가용성 형태, 즉, 세포질 및 막관통 도메인 잔기를 제거하기 위해 절단된 형태에 대해 측정된다. 따라서, 주어진 TCR은 모 TCR의 가용성 형태가 상기 특성을 갖는다면 모 TCR에 대한 개선된 결합 친화도 및/또는 결합 반감기를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 바람직하게는, 주어진 TCR의 결합 친화도 또는 결합 반감기를 동일한 검정 프로토콜을 사용하여 수회, 예를 들어, 3회 이상 측정하고, 결과의 평균을 취한다.
본 발명의 TCR은 입양 요법에서 유용성을 갖기 때문에, 본 발명은 본 발명의 TCR을 제시하는 비-천연 발생 및/또는 정제 및/또는 조작된 세포, 특히 T-세포를 포함한다. 본 발명의 TCR을 암호화하는 핵산(예컨대, DNA, cDNA 또는 RNA)을 T 세포에 형질주입시키는 데 적합한 여러 방법이 존재한다(예를 들어, 문헌[Robbins et al., (2008) J Immunol. 180: 6116-6131] 참조). 본 발명의 TCR을 발현하는 T 세포는 암, 예컨대, 췌장암 및 간암의 입양 요법-기반 치료에 사용하기에 적합할 것이다. 당업자에게 널리 공지된 바와 같이, 입양 요법이 수행될 수 있는 다수의 적합한 방법이 존재한다(예를 들어, 문헌[Rosenberg et al., (2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299-308] 참조).
당업계에 널리 공지된 바와 같이, 본 발명의 TCR은 형질주입된 세포에 의해 발현될 때 번역 후 변형될 수 있다. 글리코실화는 TCR 쇄에서 정의된 아미노산에 대한 올리고당 모이어티의 공유 부착을 포함할 수 있는 그러한 하나의 변형이다. 예를 들어, 아스파라긴 잔기 또는 세린/트레오닌 잔기는 올리고당 부착을 위한 널리 공지된 위치이다. 특정 단백질의 글리코실화 상태는 단백질 서열, 단백질 입체배좌 및 특정 효소의 가용성을 비롯한 여러 요인에 좌우된다. 또한, 글리코실화 상태(즉, 올리고당 유형, 공유 결합 및 총 부착 수)는 단백질 기능에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 재조합 단백질을 생산할 때 글리코실화를 조절하는 것이 종종 바람직하다. 형질주입된 TCR의 글리코실화는 형질주입된 유전자의 돌연변이에 의해 제어될 수 있다(문헌[Kuball J et al. (2009), J Exp Med 206(2):463-475]). 이러한 돌연변이도 본 발명에 포함된다.
TCR은 군 MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-A13, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, BAGE-1, RAGE-1, LB33/MUM-1, PRAME, NAG, MAGE-Xp2(MAGE-B2), MAGE-Xp3(MAGE-B3), MAGE-Xp4(AGE-B4), 티로시나제, 뇌 글리코겐 포스포릴라제, 멜란-A, MAGE-C1, MAGE-C2, NY-ESO-1, LAGE-1, SSX-1, SSX-2(HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1, CT-7, 알파-액티닌-4, Bcr-Abl 융합 단백질, Casp-8, 베타-카테닌, cdc27, cdk4, cdkn2a, coa-1, dek-can 융합 단백질, EF2, ETV6-AML1 융합 단백질, LDLR-푸코실트랜스퍼라제AS 융합 단백질, HLA-A2, HLA-A11, hsp70-2, KIAAO205, Mart2, Mum-2 및 3, 네오-PAP, 미오신 클래스 I, OS-9, pml-RARa 융합 단백질, PTPRK, K-ras, N-ras, 트라이오세포스페이트 아이소머라제, GnTV, Herv-K-mel, Lage-1, Mage-C2, NA-88, Lage-2, SP17 및 TRP2-Int2, (MART-I), gp100(Pmel 17), TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, p15(58), CEA, NY-ESO (LAGE), SCP-1, Hom/Mel-40, p53, H-Ras, HER-2/neu, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, 엡스타인 바 바이러스 항원, EBNA, 인간 파필로마바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p16, TAGE, PSMA, PSCA, CT7, 텔로머라제, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, α-태아단백질, 13HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3(CA 27.29＼BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733(EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB＼170K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90(Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C-연관 단백질), TAAL6, TAG72, TLP 및 TPS 내의 항원에 특이적일 수 있다.
3.5 전사 인자
조절 T 세포(Treg)는 항상성을 유지하고, 염증 반응의 크기 및 기간을 제어하고, 자가면역 및 알레르기 반응을 예방하는 데 중요하다.
일반적으로, Treg는 주로 면역 반응을 억제하는 데 관여하는 것으로 생각되며, 부분적으로는 면역계가 과도한 반응을 방지하는 "자가 점검"으로 기능한다. 특히, Treg는 자가-항원, 무해한 물질, 예컨대, 꽃가루 또는 음식에 대한 내성을 유지하고, 자가면역 질환을 퇴치하는 데 관여한다.
Treg는 비제한적으로 내장, 피부, 폐 및 간을 포함하는 신체 전체에서 발견된다. 추가로, Treg 세포는 비장, 림프절 및 심지어는 지방 조직과 같은 외부 환경에 직접 노출되지 않는 신체의 특정 구획에서도 발견될 수 있다. 이러한 Treg 세포 집단 각각은 하나 이상의 고유한 특징을 갖고 있는 것으로 알려져 있거나 의심되며, 추가 정보는 개시내용 전문이 본 명세서에 포함된 문헌[Lehtimaki and Lahesmaa, Regulatory T cells control immune responses through their non-redundant tissue specific features, 2013, FRONTIERS IN IMMUNOL., 4(294): 1-10]에서 찾아볼 수 있다.
전형적으로, Treg는 적절한 활성화 및 발달을 위해 TGF-β 및 IL-2를 필요로 하는 것으로 알려져 있다. 풍부한 양의 IL-2 수용체(IL-2R)를 발현하는 Treg는 활성화된 T 세포에 의해 생산되는 IL-2에 의존한다. Treg는 강력한 면역 억제 사이토카인인 IL-10과 TGF-β를 둘 다를 생산하는 것으로 알려져 있다. 또한, Treg는 T 세포를 자극하는 항원 제시 세포(APC)의 능력을 저해하는 것으로 알려져 있다. APC 저해에 대해 제안된 기전 중 하나는 Foxp3+ Treg에 의해 발현되는 CTLA-4를 통한 것이다. CTLA-4는 APC 상의 B7 분자에 결합하고 이러한 분자를 차단하거나 내재화를 일으켜 이들을 제거하여 B7의 사용 가능성을 감소시키고 면역 반응에 적절한 공동 자극을 제공할 수 없게 한다고 생각된다. Treg의 기원, 분화 및 기능에 대한 추가 논의는 개시내용 전문이 본 명세서에 포함된 문헌[Dhamne et al., Peripheral and thymic Foxp3+ regulatory T cells in search of origin, distinction, and function, 2013, Frontiers in Immunol., 4 (253): 1-11]에서 찾아볼 수 있다.
FOXP3, STAT5B 및/또는 HELIOS의 설명 및/또는 아미노산 서열이 본 명세서 및 www.uniprot.org 데이터에 수탁 번호: Q9BZS1(FOXP3), P51692(STAT5b) 및/또는 Q9UKS7(HELIOS)에 제공되어 있다.
Foxp3
일부 실시형태에서, 전사 인자는 포크헤드 박스(Forkhead box) P3 전사 인자(Foxp3)이다. Foxp3는 Treg의 분화 및 활성에 있어 핵심 조절자인 것으로 밝혀져 있다. 사실, Foxp3 유전자의 기능 상실 돌연변이는 치명적인 IPEX 증후군(면역 조절장애, 다분비병증, 장병증, X-연관)을 유발하는 것으로 밝혀져 있다. IPEX를 갖는 환자는 심각한 자가면역 반응, 지속적인 습진 및 대장염을 앓고 있다. Foxp3를 발현하는 Treg 세포는 장의 염증 반응을 제한하는 데 중요한 역할을 한다(Josefowicz, S. Z. et al. Nature, 2012, 482, 395-U1510).
STAT
전사의 신호 변환인자 및 전사 활성제(signal transducer and activator of transcription: STAT) 단백질 패밀리의 구성원은 세포 면역, 증식, 아폽토시스 및 분화의 많은 측면을 매개하는 세포내 전사 인자이다. 이들은 주로 막 수용체-연관 야누스 키나제(JAK)에 의해 활성화된다. 이 경로의 조절장애는 원발성 종양에서 흔히 관찰되며 증가된 혈관신생, 향상된 종양의 생존 및 면역억제로 이어진다. 유전자 넉아웃 연구는 STAT 단백질이 면역계의 발달과 기능에 관여하고, 면역 관용 및 종양 감시를 유지하는 역할을 한다는 증거를 제공하였다.
확인된 7개의 포유동물 STAT 패밀리 구성원이 존재한다: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5(STAT5A 및 STAT5B 포함) 및 STATE.
사이토카인 또는 성장 인자의 세포외 결합은 SH2 도메인을 통한 이량체화를 촉진하는 STAT 단백질 내의 특정 티로신 잔기를 인산화하는 수용체-연관 야누스 키나제의 활성화를 유도한다. 그런 다음 인산화된 이량체는 중요한 α/β 삼원 복합체를 통해 핵으로 활발히 수송된다. 본래, STAT 단백질은 인산화가 핵 보유에 필요한 것으로 생각되었기 때문에 잠복 세포질 전사 인자로 기술되었다. 그러나 인산화되지 않은 STAT 단백질은 사이토솔과 핵 사이를 왕복하며, 유전자 발현에 역할을 한다. STAT가 핵에 도달하면, 그것은 사이토카인-유도성 유전자의 프로모터 영역 내의 감마-활성화 부위(GAS)라고 불리는 공통 DNA-인식 모티프에 결합하여 전사를 활성화한다. STAT 단백질은 핵 포스파타제에 의해 탈인산화될 수 있는데, 이는 STAT의 불활성화 및 엑스포틴-RanGTP 복합체에 의한 핵 밖으로의 후속 수송으로 이어진다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 STAT 단백질은 이의 발현 수준 또는 활성을 조절하는 변형을 포함하는 STAT 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 변형은 특히 STAT 이량체화, 신호전달 파트너에 대한 STAT 단백질 결합, STAT 단백질 국지화 또는 STAT 단백질 분해에 영향을 미치는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 STAT 단백질은 구성적으로 활성이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 STAT 단백질은 구성적 이량체화로 인해 구성적으로 활성이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 STAT 단백질은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 문헌[Onishi, M. et al., Mol. Cell. Biol. July 1998 vol. 18 no. 7 3871-3879]에 기재되어 있는 바와 같이 구성적 인산화로 인해서 구성적으로 활성이다.
3.6 백신
실시형태에서, 하나 이상의 발현 서열은 항원, 예를 들어, 종양 항원, 또는 이의 단편을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 서열의 발현은 면역원성 조성물, 예를 들어, 특이적 T-세포 반응을 일으킬 수 있는 백신 조성물을 생산한다. 일부 실시형태에서, 항원은 신생항원이다.
4. 절단 부위
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 작제물에서 2개 이상의 발현 서열은 하나 이상의 절단 부위 서열에 의해 분리될 수 있다.
절단 부위는 2개 이상의 폴리펩타이드가 분리될 수 있게 하는 임의의 서열일 수 있다. 절단 부위는 자가-절단될 수 있어서, 폴리펩타이드가 생산될 때 어떠한 외부 절단 활성에 대한 필요도 없이 개별 폴리펩타이드로 즉시 절단된다.
절단 부위는 푸린 절단 부위일 수 있다.
푸린은 서브틸리신-유사 프로단백질 전환효소 패밀리에 속하는 효소이다. 이 패밀리의 구성원은 잠복 전구체 단백질을 생물학적 활성 생성물로 처리하는 프로단백질 전환효소이다. 푸린은 쌍을 이루는 염기성 아미노산 처리 부위에서 전구체 단백질을 효율적으로 절단할 수 있는 칼슘-의존성 세린 엔도프로테아제이다. 푸린 기질의 예는 부갑상선 호르몬, 변형 성장 인자 베타 1 전구체, 프로알부민, 프로-베타-분비효소, 막 유형-1 기질 메탈로프로테이나제, 프로-신경 성장 인자의 베타 소단위 및 폰 빌레브란트 인자를 포함한다. 푸린은 염기성 아미노산 표적 서열(표준적으로 Arg-X-(Arg/Lys)-Arg)의 바로 하류에 있는 단백질을 절단하고, 골지체에 풍부하다.
절단 부위는 자가-절단 펩타이드를 암호화할 수 있다.
절단 부위는 2A 자가-절단 펩타이드의 C-말단에서 글리실-프로필 결합의 스키핑과 같은 리보솜 스키핑에 의해 작동될 수 있다. 일부 실시형태에서, 입체 장애는 리보솜 스키핑을 유발한다. 일부 실시형태에서, 2A 자가-절단 펩타이드는 서열 GDVEXNPGP(서열번호 324)를 함유하고, 여기서 X는 E 또는 S이다. 일부 실시형태에서, 2A 자가-절단 펩타이드의 상류에 암호화된 단백질은 번역 후 C-말단 프롤린을 제외한 2A 자가-절단 펩타이드에 부착된다. 일부 실시형태에서, 2A 자가-절단 펩타이드의 하류에 암호화된 단백질은 번역 후 이의 N-말단에서 프롤린에 부착된다.
자가-절단 펩타이드는 압토- 또는 카디오바이러스로부터의 2A 자가-절단 펩타이드일 수 있다. 압토- 및 카디오바이러스의 1차 2A/2B 절단은 자체 C-말단에서 2A 절단에 의해 매개된다. 압토바이러스, 예컨대, 구제역 바이러스(FMDV) 및 말 비염 A 바이러스에서, 2A 영역은 단백질 2B의 N-말단 잔기(보존된 프롤린 잔기)와 함께 자체 C-말단에서 절단을 매개할 수 있는 자율적 요소를 나타내는 약 18개 아미노산의 짧은 부분이다(문헌[Donelly et al.(2001)]).
2A-유사 서열은 압토- 또는 카디오바이러스 이외의 피코르나바이러스, '피코르나바이러스-유사' 곤충 바이러스, C형 로타바이러스 및 트리파노소마 종 내의 반복 서열 및 박테리아 서열에서 발견되었다(문헌[Donnelly et al.(2001)]). 절단 부위는 표 8에 열거된 것과 같은 이러한 2A-유사 서열 중 하나를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 자가-절단 펩타이드는 F2A이다. 일부 실시형태에서, 자가-절단 펩타이드는 구제역 바이러스로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 자가-절단 펩타이드는 E2A이다. 일부 실시형태에서, 자가 절단 펩타이드는 말 비염 A 바이러스로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 자가-절단 펩타이드는 P2A이다. 일부 실시형태에서, 자가-절단 펩타이드는 돼지 테스코바이러스-1로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 자가-절단 펩타이드는 T2A이다. 일부 실시형태에서, 자가-절단 펩타이드는 아시그나 바이러스(asigna virus)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 자가-절단 펩타이드는 표 8에 열거된 서열을 갖는다.
실시형태에서, 절단 부위에 의해 분리된 치료용 단백질을 암호화하는 발현 서열은 동일한 수준의 단백질 발현을 갖는다.
일부 실시형태에서, 자가-절단 펩타이드는 문헌[Liu, Z., Chen, O., Wall, J.B.J. et al. Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector. Sci Rep 7, 2193 (2017)]에 기재된 바와 같다.
5. 제2 IRES를 함유하는 폴리뉴클레오타이드
일부 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서발현 서열에 의해서 암호화된 치료용 단백질의 발현 비율은 circRNA에 사용된 IRES 및 절단 부위 또는 제2 IRES가 제1 스페이서 및 제2 스페이서발현 서열을 분리하는지 여부에 의해 제어되거나 영향을 받을 수 있다. 제1 스페이서 및 제2 스페이서발현 서열에 의해 암호화되는 단백질의 동일한 발현이 요구되는 경우, circRNA는 제1 발현 서열과 제2 발현 서열 사이의 절단 부위, 예를 들어, 2A 자가-절단 펩타이드를 암호화할 수 있다. 제1 발현 서열에 의해 암호화된 단백질의 더 큰 발현이 요구되는 경우, circRNA는 제1 IRES 및 제2 IRES를 암호화할 수 있고, 여기서 제1 IRES는 제2 IRES보다 더 큰 발현과 연관되거나, 또는 제2 IRES는 유전자간 영역(IGR) IRES이다. 제2 발현 서열에 의해 암호화된 단백질의 더 큰 발현이 요구되는 경우, circRNA는 제1 IRES 및 제2 IRES를 암호화할 수 있고, 여기서 제2 IRES는 제1 IRES보다 더 큰 발현과 연관되어 있다.
일부 실시형태에서, RNA 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 제1 IRES 및 제2 IRES를 함유한다. 일부 실시형태에서, DNA 벡터는 본 명세서에 기재된 바와 같은 제1 IRES 및 제2 IRES를 암호화한다.
실시형태에서, 제1 IRES 및 제2 IRES는 동일한 서열을 갖는다. 실시형태에서, 제1 IRES 및 제2 IRES는 상이한 서열을 갖는다. 실시형태에서, 제1 IRES는 표 1에 열거된 서열(서열번호 1 내지 72)을 갖는 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 IRES는 살리바이러스 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 IRES는 살리바이러스 SZ1 IRES이다. 실시형태에서, 제2 IRES는 표 1에 열거된 서열(서열번호 1 내지 72)을 갖는 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제2 IRES는 살리바이러스 IRES이다. 일부 실시형태에서, 제1 IRES는 살리바이러스 SZ1 IRES이다.
일부 실시형태에서, 제1 IRES는 제2 IRES보다 더 큰 발현과 연관된다(예를 들어, 단일 IRES를 함유하는 작제물을 사용하는 것과 비교하는 경우 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 큰 발현). 일부 실시형태에서, 제2 IRES는 제1 IRES보다 더 큰 발현과 연관된다(예를 들어, 단일 IRES를 함유하는 작제물을 사용하는 것과 비교하는 경우 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 큰 발현). 일부 실시형태에서, 제2 IRES는 유전자간 영역(IGR) IRES이다.
단일 circRNA 폴리뉴클레오타이드를 갖는 2개의 단백질을 발현시키는 것은 다중 폴리뉴클레오타이드를 사용한 발현보다 이점이 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 circRNA 폴리뉴클레오타이드로부터의 2개의 단백질의 발현은 다중 폴리뉴클레오타이드로부터의 발현보다 더 일관된 발현 비율을 생성한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 circRNA 폴리뉴클레오타이드로부터의 2개의 단백질의 발현은 DNA의 지속적인 발현보다 바람직할 수 있는 일시적인 발현을 생성한다.
6. 폴리뉴클레오타이드의 생산
본 명세서에 제공된 벡터는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 벡터의 다양한 요소는 세포로부터 cDNA 및 게놈 라이브러리를 스크리닝하거나 이를 포함하는 것으로 알려진 벡터로부터 폴리뉴클레오타이드를 유도하는 것과 같은 재조합 방법을 사용하여 얻을 수 있다.
본 명세서에 제공된 벡터의 다양한 요소는 또한 공지된 서열에 기초하여 클로닝되기 보다는 합성에 의해서 생산될 수 있다. 완전한 서열은 표준 방법에 의해 제조된 중첩 올리고뉴클레오타이드로부터 조립되고, 완전한 서열로 조립될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair et al., Science (1984) 223 : 1299; 및 Jay et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:631 1] 참조.
따라서, 특정 뉴클레오타이드 서열은 목적하는 서열을 보유하는 벡터로부터 얻어지거나, 절절한 경우 부위 지정 돌연변이유발 및 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술과 같은 당업계에 공지된 다양한 올리고뉴클레오타이드 합성 기술을 사용하여 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 목적하는 벡터 요소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 얻는 한 가지 방법은 종래의 자동화된 폴리뉴클레오타이드 합성기에서 생성된 중첩 합성 올리고뉴클레오타이드의 상보적 세트를 어닐링하고, 그 다음 적절한 DNA 리가제로 결찰시키고, PCR을 통해 결찰된 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 것이다. 예를 들어, 문헌[Jayaraman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:4084-4088] 참조. 또한, 올리고뉴클레오타이드-지정 합성(문헌[Jones et al., Nature (1986) 54:75-82]), 기존 뉴클레오타이드 영역의 올리고뉴클레오타이드 지정 돌연변이유발(문헌[Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327 및 Verhoeyen et al., Science (1988) 239: 1534-1536]) 및 T4 DNA 중합효소를 사용한 갭핑된 올리고뉴클레오타이드의 효소적 충전(문헌[Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 10029-10033])이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 제공된 전구체 RNA는 벡터에 의해 암호화되는 전구체 RNA의 전사를 허용하는 조건 하에서 본 명세서에서 제공된 벡터를 인큐베이션시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 전구체 RNA는 5' 듀플렉스 형성 영역 및/또는 발현 서열의 상류에 RNA 중합효소 프로모터를 포함하는 본 명세서에 제공된 벡터를 시험관내 전사를 허용하는 조건 하에서 상용성 RNA 중합효소와 인큐베이션시킴으로써 합성된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 박테리오파지 RNA 중합효소에 의해 세포 내부에서 또는 숙주 RNA 중합효소 II에 의해 세포 핵에서 인큐베이션된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 벡터를 주형으로 사용하여 시험관내 전사를 수행함으로써 전구체 RNA를 생성시키는 방법이 본 명세서에 제공된다(예를 들어, 5' 듀플렉스 형성의 상류에 위치한 RNA 중합효소 프로모터와 함께 본 명세서에 제공된 벡터).
특정 실시형태에서, 생성된 전구체 RNA는 RNA 원형화가 일어나는 온도(예를 들어, 20 ㏖ 및 60 ㏖)에서 마그네슘 이온 및 구아노신 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드의 존재 하에서 생성된 전구체 RNA를 인큐베이션시킴으로써 원형 RNA(예를 들어, 본 명세서에 제공된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드)를 생성시키는 데 사용될 수 있다.
따라서, 특정 실시형태에서 원형 RNA를 제조하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 특정 실시형태에서, 이 방법은 주형으로서 본 명세서에 제공된 벡터(예를 들어, 포스트 스플라이싱 3' 그룹 I 인트론 단편, 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 발현 서열, 절단 부위를암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 제2 발현 서열 및 5' 그룹 I 인트론 단편)를 사용한 전사(예를 들어, 유출 전사)에 의해서 전구체 RNA를 합성하는 단계 및 생성된 전구체 RNA를 2가 양이온(예를 들어, 마그네슘 이온) 및 GTP의 존재 하에서 인큐베이션시켜, 이것을 원형화하여 원형 RNA를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 전구체 RNA는 마그네슘 이온 및 GTP의 부재 하에서 그리고/또는 마그네슘 이온 및 GTP와의 인큐베이션 단계 없이 원형화할 수 있다. 적어도 부분적으로 mRNA가 면역원성 5' 캡을 함유하기 때문에 원형 RNA가 상응하는 mRNA에 비해 면역원성을 감소시킨다는 것을 발견하였다. 특정 프로모터(예를 들어, T7 프로모터)로부터 DNA 벡터를 전사시켜 전구체 RNA를 생산하는 경우, 전구체 RNA의 5' 단부가 G인 것으로 이해된다. 낮은 수준의 오염물 선형 mRNA를 함유하는 원형 RNA 조성물의 면역원성을 감소시키기 위해서, 대부분의 전사체가 캡핑될 수 없는 5' GMP를 함유하도록 전사 동안 GTP에 비해 과량의 GMP가 제공될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 전사는 과량의 GMP의 존재 하에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 전사는 GMP 농도 대 GTP 농도의 비율이 약 3:1 내지 약 15:1, 예를 들어, 약 3:1 내지 약 10:1, 약 3:1 내지 약 5:1, 약 3:1, 약 4:1 또는 약 5:1의 범위 내에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 원형 RNA를 포함하는 조성물이 정제되었다. 원형 RNA는 칼럼 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피와 같이 당업계에 일반적으로 사용되는 공지된 방법에 의해 정제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 정제는 다음 단계 중 하나 이상을 포함한다: 포스파타제 처리, HPLC 크기 배제 정제, 및 RNase R 소화. 일부 실시형태에서, 정제는 다음 단계를 순서대로 포함한다: RNase R 소화, 포스파타제 처리, 및 HPLC 크기 배제 정제. 일부 실시형태에서, 정제는 역상 HPLC를 포함한다. 일부 실시형태에서, 정제된 조성물은 비정제된 RNA보다 더 적은 이중 가닥 RNA, DNA 스플린트, 삼인산화된 RNA, 포스파타제 단백질, 단백질 리가제, 캡핑 효소 및/또는 니킹된 RNA를 함유한다. 일부 실시형태에서, 정제된 조성물은 비정제된 조성물보다 덜 면역원성이다. 일부 실시형태에서, 정제된 조성물에 노출된 면역 세포는 비정제된 조성물에 노출된 면역 세포보다 TNFα, RIG-I, IL-2, IL-6, IFNγ 및/또는 1형 인터페론, 예를 들어, IFN-β1을 더 적게 생성한다.
7. 나노입자
특정 양상에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다. 특정 실시형태에서, 이러한 약제학적 조성물은 전달을 용이하게 하기 위해 나노입자와 함께 제형화된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 원형 RNA는 전달 비히클, 예를 들어, 나노입자 또는 나노입자를 포함하는 조성물로 세포에 전달되고/되거나 표적화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA는 또한 전달 비히클 또는 전달 비히클을 포함하는 조성물로 대상체에게 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, 전달 비히클은 나노입자이다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 지질 나노입자, 고체 지질 나노입자, 중합체 코어-쉘 나노입자 또는 생분해성 나노입자이다. 일부 실시형태에서, 전달 비히클은 하나 이상의 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 이온화 가능한 지질, PEG-변형된 지질, 폴리글루탐산 중합체, 히알루론산 중합체, 폴리 β-아미노 에스터, 폴리 베타 아미노 펩타이드, 또는 양으로 하전된 펩타이드를 포함하거나 이들로 코팅된다.
일 실시형태에서, 전달 비히클은 표적 세포로의 circRNA의 전달을 최적화하도록 선택 및/또는 제조될 수 있다. 예를 들어, 표적 세포가 간세포인 경우, 전달 비히클의 특성(예를 들어, 크기, 전하 및/또는 pH)은 이러한 전달 비히클을 표적 세포에 효과적으로 전달하고, 면역 제거를 감소시키고/시키거나 표적 세포 내의 체류를 촉진하도록 최적화될 수 있다.
표적 세포로의 핵산의 전달을 용이하게 하기 위한 전달 비히클의 사용이 본 발명에 의해 고려된다. 리포솜(예를 들어, 리포솜 지질 나노입자)은 일반적으로 연구, 산업 및 의학의 다양한 응용 분야, 특히 생체내 진단 또는 치료 화합물의 전달 비히클로서의 사용에 유용하고(문헌[Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998; Drummond et al., Pharmacol. Rev., 51: 691-743, 1999]), 일반적으로 하나 이상의 이중층의 막에 의해서 외부 매질로부터 격리되는 내부 수성 공간을 갖는 미세한 소포를 특징으로 한다. 리포솜의 이중층 막은 일반적으로 공간적으로 분리된 친수성 및 소수성 도메인을 포함하는 합성 또는 자연 기원의 지질과 같은 양친매성 분자에 의해 형성된다(문헌[Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998]). 리포솜의 이중층 막은 또한 양친매성 중합체 및 계면활성제(예를 들어, 폴리머로솜, 니오솜 등)에 의해 형성될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 전달 비히클은 전형적으로 circRNA를 표적 세포로 수송하는 역할을 한다. 본 발명의 목적을 위해, 전달 비히클은 목적하는 핵산을 함유하거나 캡슐화하도록 준비된다. 목적하는 실체(예를 들어, 핵산)를 리포솜에 혼입하는 과정은 종종 로딩이라고 지칭된다(문헌[Lasic, et al., FEBS Lett., 312: 255-258, 1992]). 리포솜-혼입된 핵산은 리포솜의 내부 공간, 리포솜의 이중층 막 내부에 완전히 또는 부분적으로 위치하거나 리포솜 막의 외부 표면과 회합될 수 있다. circRNA를 리포솜과 같은 전달 비히클에 혼입하는 목적은 종종 핵산을 분해하는 효소 또는 화학물질 및/또는 핵산의 빠른 배설을 유발하는 시스템 또는 수용체를 함유할 수 있는 환경으로부터 핵산을 보호하는 것이다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태에서, 선택된 전달 비히클은 내부에 함유된 circRNA의 안정성을 향상시킬 수 있다. 리포솜은 캡슐화된 circRNA가 표적 세포에 도달하도록 할 수 있거나, 대안적으로 투여된 circRNA의 존재가 쓸모없거나 또는 바람직하지 않을 수 있는 다른 부위 또는 세포로의 이러한 circRNA의 전달을 제한할 수 있다. 또한, 예를 들어, 양이온성 리포솜과 같은 전달 비히클에 circRNA를 혼입하는 것은 또한 표적 세포 내로의 이러한 circRNA의 전달을 촉진한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 전달 비히클은 예를 들어, 전달 비히클(예를 들어, 지질 나노입자) 내에 캡슐화된 내용물의 엔도솜 또는 리소좀 방출을 촉진하는 역할을 할 수 있다.
이상적으로, 전달 비히클은 조성물이 높은 형질주입 효율 및 향상된 안정성을 나타내도록 하나 이상의 목적하는 circRNA를 캡슐화하도록 제조된다. 리포솜은 핵산을 표적 세포에 도입하는 것을 용이하게 할 수 있지만, 일부 예에서, 공중합체로서 다중양이온(예를 들어, 폴리 L-라이신 및 프로타민)을 첨가하면 시험관내 그리고 생체내 둘 다에서 다수의 세포주에서 여러 유형의 양이온성 리포솜의 형질주입 효율을 2 내지 28배만큼 현저하게 향상시킬 수 있다(문헌[N J. Caplen, et al., Gene Ther. 1995; 2: 603; S. Li, et al., Gene Ther. 1997; 4, 891]).
특정 실시형태에서 본 명세서에는 (예를 들어, 이러한 표적 세포의 지질 막을 침투하거나 또는 이와 융합함으로써) 원형 RNA가 하나 이상의 표적 세포로 전달되고, 방출되는 것을 용이하게 하거나 향상시키기 위한 전달 비히클의 성분으로서 사용될 수 있는 이온화 가능한 지질이 개시된다. 특정 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 (예를 들어, 산화성, 환원성 또는 산성 조건 하에서) 예를 들어, 친수성 작용성 헤드기를 화합물의 친유성 작용성 테일기로부터 해리시킴으로써, 하나 이상의 표적 세포의 지질 이중층에서 상 전이를 용이하게 하는 하나 이상의 절단 가능한 작용기(예를 들어, 다이설파이드)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 국제 특허 출원 제PCT/US2018/058555호에 기재된 바와 같은 지질이다.
실시형태 중 일부에서, 양이온성 지질은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00010
식 중,
R1 및 R2는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 선택적으로 치환된 C10-C24 알킬, 선택적으로 치환된 C10-C24 알켄일, 선택적으로 치환된 C10-C24 알킨일 또는 선택적으로 치환된 C10-C24 아실이고;
R3 및 R4는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 선택적으로 치환된 C2-C6 알켄일 또는 선택적으로 치환된 C2-C6 알킨일이거나 R3과 R4는 합쳐져서 4 내지 6개 탄소 원자 및 질소 및 산소로부터 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자의 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성할 수 있고;
R5는 존재하지 않거나 존재하고, 존재하는 경우 수소 또는 C1-C6 알킬이고; m, n 및 p는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 0 또는 1이되, 단 m, n 및 p는 동시에 0은 아니고; q는 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
Y 및 Z는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 O, S 또는 NH이다.
일 실시형태에서, R1 및 R2는 각각 리놀레일이고, 아미노 지질은 다이리놀레일 아미노 지질이다.
일 실시형태에서, 아미노 지질은 다이리놀레일 아미노 지질이다.
다양한 다른 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 구조 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 호변이성질체, 전구약물 또는 입체이성질체를 갖는다:
Figure pct00011
식 중,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 및 C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 약 10 내지 약 20개 탄소 원자를 갖는 알킬기이되, R3 및 R4 중 적어도 하나는 적어도 2개의 불포화 부위를 포함한다.
일부 실시형태에서, R3 및 R4는 각각 독립적으로 도데카다이엔일, 테트라데카다이엔일, 헥사데카다이엔일, 리놀레일 및 이코사다이엔일로부터 선택된다. 실시형태에서, R3 및 R4는 둘 다 리놀레일이다. 일부 실시형태에서, R3 및/또는 R4는 적어도 3개의 불포화 부위를 포함할 수 있다(예를 들어, R3 및/또는 R4는 예를 들어, 도데카트라이엔일, 테트라데카트라이엔일, 헥사데카트라이엔일, 리놀렌일 및 이코사트라이엔일일 수 있다).
일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 구조, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 호변이성질체, 전구약물 또는 입체이성질체를 갖는다:
Figure pct00012
식 중,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 및 C1-C3 알킬로부터 선택되고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 약 10 내지 약 20개 탄소 원자를 갖는 알킬기이되, R3 및 R4 중 적어도 하나는 적어도 2개의 불포화 부위를 포함한다.
일 실시형태에서, R3 및 R4는 동일하고, 예를 들어, 일부 실시형태에서 R3 및 R4 둘 다는 리놀레일(C18-알킬)이다. 또 다른 실시형태에서, R3 및 R4는 상이하고, 예를 들어, 일부 실시형태에서, R3은 테트라데카트라이엔일(C14-알킬)이고, R4는 리놀레일(C18-알킬)이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 양이온성 지질(들)은 비대칭이고, 즉, R3 및 R4는 동일하다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, R3 및 R4 둘 다는 적어도 2개의 불포화 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, R3 및 R4는 각각 독립적으로 도데카다이엔일, 테트라데카다이엔일, 헥사데카다이엔일, 리놀레일 및 이코사다이엔일로부터 선택된다. 실시형태에서, R3 및 R4는 둘 다 리놀레일이다. 일부 실시형태에서, R3 및/또는 R4는 적어도 3개의 불포화 부위를 포함하고, 각각 독립적으로 도데카트라이엔일, 테트라데카트라이엔일, 헥사데카트라이엔일, 리놀렌일 및 이코사트라이엔일로부터 선택된다.
다양한 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 화학식, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 호변이성질체, 전구약물 또는 입체이성질체을 갖는다:
Figure pct00013
식 중,
Xaa는 화학식 -NRN-CR1R2-C(C=O)-를 갖는 D- 또는 L-아미노산 잔기, 또는 펩타이드 또는 화학식 -{NRN-CR1R2-C(C=O)}n-를 갖는 아미노산 잔기의 펩타이드이되, n은 2 내지 20의 정수이고;
R1은 독립적으로, 각각의 경우에 대해서, 비-수소 또는 아미노산의 치환된 또는 비치환된 측쇄이고;
R2 및 RN은 독립적으로, 각각의 경우에 대해서, 수소, 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 탄소, 산소, 질소, 황 및 수소 원자로 이루어진 유기기 또는 이들의 조합물, C(1-5)알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, C(1-5)알켄일, C(1-5)알킨일, C(1-5)알칸오일, C(1-5)알칸오일옥시, C(1-5)알콕시, C(1-5)알콕시- C(1-5)알킬, C(1-5)알콕시- C(1-5)알콕시, C(1-5)알킬-아미노- C(1-5)알킬-, C(1-5)다이알킬-아미노- C(1-5)알킬-, 나이트로-C(1-5)알킬, 사이아노-C(1-5)알킬, 아릴-C(1-5)알킬, 4-바이페닐-C(1-5)알킬, 카복실 또는 하이드록실이고;
Z는 -NH-, -O-, -S-, -CH2S-, -CH2S(O)-, 또는 수소, 탄소, 산소, 질소 및 황 원자로부터 선택된 1 내지 40개의 원자로 이루어진 유기 링커이고(바람직하게는 Z는 -NH- 또는 -O-임);
Rx 및 Ry는, 독립적으로, (i) 지질(이것은 자연 발생이거나 합성일 수 있음), 예를 들어, 인지질, 당지질, 트라이아실글리세롤, 글리세로인지질, 스핑고지질, 세라마이드, 스핑고미엘린, 세레브로사이드 또는 강글리오사이드로부터 유래된 친유성 테일(여기서 테일은 선택적으로 스테로이드를 포함함); (ii) 수소, 하이드록실, 아미노 및 유기 보호기로부터 선택된 아미노산 말단기; 또는 (iii) 치환된 또는 비치환된 C(3-22)알킬, C(6-12)사이클로알킬, C(6-12)사이클로알킬- C(3-22)알킬, C(3-22)알켄일, C(3-22)알킨일, C(3-22)알콕시 또는 C(6-12)-알콕시 C(3-22)알킬이다.
일부 실시형태에서, Rx 및 Ry 중 하나는 상기에 정의된 바와 같은 친유성 테일이고, 나머지는 아미노산 말단기이다. 일부 실시형태에서, Rx 및 Ry 둘 다는 친유성 테일이다.
일부 실시형태에서, Rx 및 Ry 중 적어도 하나는 하나 이상의 생분해성 기(예를 들어, -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(O)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -C(S)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -OC(O)O-, -OSi(R5)2O-, -C(O)(CR3R4)C(O)O-, -OC(O)(CR3R4)C(O)- 또는
Figure pct00014
에 의해서 개재된다.
일부 실시형태에서, R11은 C2-C8알킬 또는 알켄일이다.
일부 실시형태에서, R5의 각각의 경우는, 독립적으로, H 또는 알킬이다.
일부 실시형태에서, R3 및 R4의 각각의 경우는, 독립적으로 H, 할로겐, OH, 알킬, 알콕시, -NH2, 알킬아미노 또는 다이알킬아미노이거나; R3과 R4는이들이 직접 부착되는 탄소 원자와 함께, 사이클로알킬기를 형성한다. 일부 특정 실시형태에서, R3 및 R4의 각각의 경우는, 독립적으로 H 또는 C1-C4알킬이다.
일부 실시형태에서, Rx 및 Ry는 각각 독립적으로, 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는다.
일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 중 하나, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 호변이성질체, 전구약물 또는 입체이성질체이다:
Figure pct00015
식 중,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 알킬, 알켄일 또는 알킨일이고, 이들 각각은 선택적으로 치환될 수 있고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C6 알킬이거나, R3과 R4는 함께 합쳐져서 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
대표적인 유용한 다이리놀레일 아미노 지질은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00016
식 중, n은 0, 1, 2, 3 또는 4이다.
일 실시형태에서, 양이온성 지질은 DLin-K-DMA이다. 일 실시형태에서, 양이온성 지질은 DLin-KC2-DMA(상기 DLin-K-DMA, 식 중, n은 2임)이다.
일 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 구조, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 호변이성질체, 전구약물 또는 입체이성질체를 갖는다:
Figure pct00017
식 중,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 각각의 경우에 대해서 선택적으로 치환된 C10-C30 알킬, 선택적으로 치환된 C10-C30 알켄일, 선택적으로 치환된 C10-C30 알킨일 또는 선택적으로 치환된 C10-C30 아실이고;
R3은 H, 선택적으로 치환된 C2-C10 알킬, 선택적으로 치환된 C2-C10 알켄일, 선택적으로 치환된 C2-C10 알킬릴, 알킬헤테로사이클, 알킬포스페이트, 알킬포스포로티오에이트, 알킬포스포로다이티오에이트, 알킬포스포네이트, 알킬아민, 하이드록시알킬, ω-아미노알킬, ω-(치환된)아미노알킬, ω-포스포알킬, ω-티오포스포알킬, 선택적으로 치환된 폴리에틸렌 글리콜(PEG, mw 100 내지 40K), 선택적으로 치환된 mPEG(mw 120 내지 40K), 헤테로아릴 또는 헤테로사이클 또는 링커 리간드이고, 예를 들어, 일부 실시형태에서, R3은 (CH3)2N(CH2)n-이되, n은 1, 2, 3 또는 4이고;
E는 O, S, N(Q), C(O), OC(O), C(O)O, N(Q)C(O), C(O)N(Q), (Q)N(CO)O, O(CO)N(Q), S(O), NS(O)2N(Q), S(O)2, N(Q)S(O)2, SS, O=N, 아릴, 헤테로아릴, 사이클릭 또는 헤테로사이클, 예를 들어, -C(O)O이되, -는 R3에 대한 연결 지점이고;
Q는 H, 알킬, ω-아미노알킬, ω-(치환된)아미노알킬, ω-포스포알킬 또는 ω-티오포스포알킬이다.
구체적인 일 실시형태에서, 실시형태 1, 2, 3, 4 또는 5의 양이온성 지질은 하기 구조, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 호변이성질체, 전구약물 또는 입체이성질체를 갖는다:
Figure pct00018
식 중,
E는 O, S, N(Q), C(O), N(Q)C(O), C(O)N(Q), (Q)N(CO)O, O(CO)N(Q), S(O), NS(O)2N(Q), S(O)2, N(Q)S(O)2, SS, O=N, 아릴, 헤테로아릴, 사이클릭 또는 헤테로사이클이고;
Q는 H, 알킬, ω-아미노알킬, ω-(치환된)아미노알킬, ω-포스포알킬 또는 ω-티오포스포알킬이고;
R1 및 R2 및 Rx는 각각 독립적으로 각각의 경우에 대해서 H, 선택적으로 치환된 C1-C10 알킬, 선택적으로 치환된 C10-C30 알킬, 선택적으로 치환된 C10-C30 알켄일, 선택적으로 치환된 C10-C30알킨일, 선택적으로 치환된 C10-C30 아실 또는 링커-리간드이되, 단, R1, R2 및 Rx 중 하나는 H가 아니고;
R3은 H, 선택적으로 치환된 C1-C10 알킬, 선택적으로 치환된 C2-C10 알켄일, 선택적으로 치환된 C2-C10 알킨일, 알킬헤테로사이클, 알킬포스페이트, 알킬포스포로티오에이트, 알킬포스포로다이티오에이트, 알킬아민, 하이드록시알킬, ω-아미노알킬, ω-(치환된)아미노알킬, ω-포스포알킬, ω- 티오포스포알킬, 선택적으로 치환된 폴리에틸렌 글리콜(PEG, mw 100 내지 40K), 선택적으로 치환된 mPEG(mw 120 내지 40K), 헤테로아릴, 또는 헤테로사이클 또는 링커-리간드이고;
n은 0, 1, 2 또는 3이고이다.
일 실시형태에서, 실시형태 1, 2, 3, 4 또는 5의 양이온성 지질은 하기 화학식 I의 구조 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 호변이성질체, 전구약물 또는 입체이성질체를 갖는다:
Figure pct00019
식 중,
L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)X-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O-이고, L1 또는 L2 중 나머지는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)X-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O- 또는 직접 결합이고;
Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R1a 및 R1b는 각각의 경우에, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, (b) R1a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R1b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R2a 및 R2b는 각각의 경우에, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, (b) R2a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R2b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R2b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R3a 및 R3b는 각각의 경우에, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, (b) R3a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R3b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R3b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R4a 및 R4b는 각각의 경우에, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, (b) R4a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R4b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R5 및 R6은 각각 독립적으로 메틸 또는 사이클로알킬이고;
R7은, 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R8 및 R9는 각각 독립적으로 비치환된 C1-C12 알킬이거나; R8과 R9는, 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 1개의 질소 원자를 포함하는 5, 6 또는 7-원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
a 및 d는 각각 독립적으로 0 내지 24의 정수이고;
b 및 c는 각각 독립적으로 1 내지 24의 정수이고;
e는 1 또는 2이고;
x는 0, 1 또는 2이다.
화학식 I의 일부 실시형태에서, L1 및 L2는 독립적으로- O(C=O)- 또는 -(C=O)O-이다.
화학식 I의 특정 실시형태에서, R1a, R2a, R3a 또는 R4a 중 적어도 하나는 C1-C12 알킬이거나, L1 또는 L2 중 적어도 하나는 -O(C=O)- 또는 -(C=O)O-이다. 다른 실시형태에서, a가 6인 경우 R1a 및 R1b는 아이소프로필이 아니거나 a가 8인 경우 n-부틸이 아니다.
화학식 I의 더 추가의 실시형태에서, R1a, R2a, R3a 또는 R4a 중 적어도 하나는 C1-C12 알킬이거나, L1 또는 L2 중 적어도 하나는 -O(C=O)- 또는 -(C=O)O-이고;
a가 6인 경우 R1a 및 R1b는 아이소프로필이 아니거나 a가 8인 경우 n-부틸이 아니다.
화학식 I의 다른 실시형태에서, R8 및 R9는 각각 독립적으로 비치환된 C1-C12 알킬이거나; R8과 R9는, 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 1개의 질소 원자를 포함하는 5, 6 또는 7-원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
화학식 I의 특정 실시형태에서, L1 또는 L2 중 임의의 하나는 -O(C=O)- 또는 탄소-탄소 이중 결합일 수 있다. L1 및 L2는 각각 -O(C=O)-일 수 있거나 각각 탄소-탄소 이중 결합일 수 있다.
화학식 I의 일부 실시형태에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이다. 다른 실시형태에서, L1 및 L2 둘 다는 -O(C=O)-이다.
화학식 I의 일부 실시형태에서, L1 또는 L2 중 하나는 -(C=O)O-이다. 다른 실시형태에서, L1 및 L2 둘 다는 -(C=O)O-이다.
화학식 I의 일부 다른 실시형태에서, L1 또는 L2 중 하나는 탄소-탄소 이중 결합이다. 다른 실시형태에서, L1 및 L2 둘 다는 탄소-탄소 이중 결합이다.
화학식 I의 추가의 다른 실시형태에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이고, L1 또는 L2 중 나머지는 -(C=O)O-이다. 추가의 실시형태에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이고, L1 또는 L2 중 나머지는 탄소-탄소 이중 결합이다. 더 추가의 실시형태에서, L1 또는 L2 중 하나는 -(C=O)O-이고, L1 또는 L2 중 나머지는 탄소-탄소 이중 결합이다.
본 명세서 전체에서 사용되는 바와 같은 "탄소-탄소" 이중 결합은 하기 구조 중 하나를 지칭한다는 것이 이해된다:
Figure pct00020
식 중, Ra 및 Rb는 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 치환체이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 Ra 및 Rb는, 각각의 경우에, 독립적으로 H, C1-C12 알킬 또는 사이클로알킬, 예를 들어, H 또는 C1-C12 알킬이다.
다른 실시형태에서, 화학식 I의 지질 화합물은 하기 화학식 (Ia)를 갖는다:
Figure pct00021
다른 실시형태에서, 화학식 I의 지질 화합물은 하기 화학식 (Ib)를 갖는다:
Figure pct00022
추가의 다른 실시형태에서, 화학식 I의 지질 화합물은 하기 화학식 (Ic)를 갖는다:
Figure pct00023
화학식 I의 지질 화합물의 특정 실시형태에서, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 2 내지 12의 정수 또는 4 내지 12의 정수이다. 다른 실시형태에서, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 8 내지 12 또는 5 내지 9의 정수이다. 일부 특정 실시형태에서, a는 0이다. 일부 실시형태에서, a는 1이다. 다른 실시형태에서, a는 2이다. 추가의 실시형태에서, a는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, a는 4이다. 일부 실시형태에서, a는 5이다. 다른 실시형태에서, a는 6이다. 추가의 실시형태에서, a는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, a는 8이다. 일부 실시형태에서, a는 9이다. 다른 실시형태에서, a는 10이다. 추가의 실시형태에서, a는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, a는 12이다. 일부 실시형태에서, a는 13이다. 다른 실시형태에서, a는 14이다. 추가의 실시형태에서, a는 15이다. 추가의 다른 실시형태에서, a는 16이다.
화학식 I의 일부 다른 실시형태에서, b는 1이다. 다른 실시형태에서, b는 2이다. 추가의 실시형태에서, b는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, b는 4이다. 일부 실시형태에서, b는 5이다. 다른 실시형태에서, b는 6이다. 추가의 실시형태에서, b는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, b는 8이다.
일부 실시형태에서, b는 9이다. 다른 실시형태에서, b는 10이다. 추가의 실시형태에서, b는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, b는 12이다. 일부 실시형태에서, b는 13이다. 다른 실시형태에서, b는 14이다. 추가의 실시형태에서, b는 15이다. 추가의 다른 실시형태에서, b는 16이다.
화학식 I의 일부 추가의 실시형태에서, c는 1이다. 다른 실시형태에서, c는 2이다. 추가의 실시형태에서, c는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, c는 4이다. 일부 실시형태에서, c는 5이다. 다른 실시형태에서, c는 6이다. 추가의 실시형태에서, c는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, c는 8이다. 일부 실시형태에서, c는 9이다. 다른 실시형태에서, c는 10이다. 추가의 실시형태에서, c는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, c는 12이다. 일부 실시형태에서, c는 13이다. 다른 실시형태에서, c는 14이다. 추가의 실시형태에서, c는 15이다. 추가의 다른 실시형태에서, c는 16이다.
화학식 I의 일부 특정 다른 실시형태에서, d는 0이다. 일부 실시형태에서, d는 1이다. 다른 실시형태에서, d는 2이다. 추가의 실시형태에서, d는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, d는 4이다. 일부 실시형태에서, d는 5이다. 다른 실시형태에서, d는 6이다. 추가의 실시형태에서, d는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, d는 8이다. 일부 실시형태에서, d는 9이다. 다른 실시형태에서, d는 10이다. 추가의 실시형태에서, d는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, d는 12이다. 일부 실시형태에서, d는 13이다. 다른 실시형태에서, d는 14이다. 추가의 실시형태에서, d는 15이다. 추가의 다른 실시형태에서, d는 16이다.
화학식 I의 일부 다른 다양한 실시형태에서, a 및 d는 동일하다. 일부 다른 실시형태에서, b 및 c는 동일하다. 일두 다른 구체적인 실시형태에서, a 및 d는 동일하고, b 및 c는 동일하다.
화학식 I에서 a와 b의 합 및 c와 d의 합은 목적하는 특성을 갖는 화학식 I의 지질을 얻기 위해서 달라질 수 있는 인자이다. 일 실시형태에서, a 및 b는 이들의 합이 14 내지 24의 범위의 정수이도록 선택된다. 다른 실시형태에서, c 및 d는 이들의 합이 14 내지 24의 범위의 정수이도록 선택된다. 추가 실시형태에서, a와 b의 합 및 c와 d의 합은 동일하다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 a와 b의 합 및 c와 d의 합 둘 다는 14 내지 24의 범위일 수 있는 동일한 정수이다. 더 추가의 실시형태에서, a, b, c 및 d는 a와 b의 합 및 c와 d의 합이 12 이상이도록 선택된다.
화학식 I의 일부 실시형태에서, e는 1이다. 다른 실시형태에서, e는 2이다.
화학식 I의 R1a, R2a, R3a 및 R4a에서 치환체는 특별히 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a는 각각의 경우에 H이다. 특정 다른 실시형태에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C12 알킬이다. 특정 다른 실시형태에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C8 알킬이다. 특정 다른 실시형태에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C6 알킬이다. 상기 실시형태 중 일부에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-부틸, 아이소-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.
화학식 I의 특정 실시형태에서, R1a, R1b, R4a 및 R4b는 각각의 경우에 C1-C12 알킬이다.
화학식 I의 추가 실시형태에서, R1b, R2b, R3b 및 R4b 중 적어도 하나는 H이거나 R1b, R2b, R3b 및 R4b는 각각의 경우에 H이다.
화학식 I의 특정 실시형태에서, R1b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다. 상기 중 다른 실시형태에서, R4b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
화학식 I의 R5 및 R6에서 치환체는 상기 실시형태에서 특별히 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서 R5 또는 R6 중 하나 또는 둘 다는 메틸이다. 특정 실시형태에서 R5 또는 R6 중 하나 또는 둘 다는 사이클로알킬 예를 들어, 사이클로헥실이다. 이들 실시형태에서 사이클로알킬은 치환될 수 있거나 치환되지 않을 수 있다. 특정 실시형태에서 사이클로알킬은 C1-C12 알킬, 예를 들어, tert-부틸로 치환된다.
R7에서 치환체는 화학식 I의 상기 실시형태에서 특별히 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서 적어도 하나의 R7은 H이다. 일부 다른 실시형태에서, R7은 각각의 경우에 H이다. 특정 실시형태에서 R7은 C1-C12 알킬이다.
화학식 I의 상기 실시형태 중 특정 다른 것에서, R8 또는 R9 중 하나는 메틸이다. 다른 실시형태에서, R8 및 R9 둘 다는 메틸이다.
화학식 I의 일부 상이한 실시형태에서, R8 및 R9는 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 5, 6 또는 7-원 헤테로사이클릭 고리를 형성한다. 상기 중 일부 실시형태에서, R8 및 R9는 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 5-원 헤테로사이클릭 고리, 예를 들어, 피롤리딘일 고리를 형성한다.
실시형태 3의 일부 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서양이온성 지질은 하기 화학식 I의 지질로부터 각각 독립적으로 선택된다.
다양한 상이한 실시형태에서, 화학식 I의 지질은 하기 표 1에 제시된 구조 중 하나를 갖는다
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
일부 실시형태에서, 실시형태 1, 2, 3, 4 또는 5의 양이온성 지질은 하기 화학식 II의 구조, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 호변이성질체, 전구약물 또는 입체이성질체를 갖는다:
Figure pct00030
식 중,
L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)X-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O-이고, L1 또는 L2 중 나머지는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)X-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O- 또는 직접 결합이고;
G1은 C1-C2 알킬렌, -(C=O)-, -O(C=O)-, -SC(=O)-, -NRaC(=O)- 또는 직접 결합이고;
G2는 -C(=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)S-, -C(=O)NRa- 또는 직접 결합이고;
G3은 C1-C6 알킬렌이고;
Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R1a 및 R1b는 각각의 경우에, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, (b) R1a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R1b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R2a 및 R2b는 각각의 경우에, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, (b) R2a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R2b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R2b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R3a 및 R3b는 각각의 경우에, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, (b) R3a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R3b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R3b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R4a 및 R4b는 각각의 경우에, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, (b) R4a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R4b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R5 및 R6은 각각 독립적으로 H 또는 메틸이고;
R7은 C4-C20 알킬이고;
R8 및 R9는 각각 독립적으로 C1-C12 알킬이거나; R8과 R9는, 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 5, 6 또는 7-원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 1 내지 24의 정수이고;
x는 0, 1 또는 2이다.
화학식 (II)의 일부 실시형태에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)-, -(C=O)O- 또는 직접 결합이다. 다른 실시형태에서, G1 및 G2는 각각 독립적으로 -(C=O)- 또는 직접 결합이다. 일부 상이한 실시형태에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)-, -(C=O)O- 또는 직접 결합이고; G1 및 G2는 각각 독립적으로 -(C=O)- 또는 직접 결합이다.
화학식 (II)의 일부 상이한 실시형태에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -C(=O)-, -O-, -S(O)X-, -S-S-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -NRa-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)NRa, -OC(=O)NRa-, -NRaC(=O)O-, -NRaS(O)xNRa-, -NRaS (O)x- 또는 -S(O)xNRa-이다.
화학식 (II)의 상기 실시형태 중 다른 것에서, 지질 화합물은 하기 화학식 (IIA) 또는 (IIB) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00031
화학식 (II)의 일부 실시형태에서, 지질 화합물은 화학식 (IIA)를 갖는다. 다른 실시형태에서, 지질 화합물은 화학식 (IIB)를 갖는다.
화학식 (II)의 상기 실시형태 중 임의의 것에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 L1 및 L2 각각은 -O(C=O)-이다.
화학식 (II)의 일부 상이한 실시형태에서, L1 또는 L2 중 하나는 -(C=O)O-이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 L1 및 L2 각각은 -(C=O)O-이다.
화학식 (II)의 상이한 실시형태에서, L1 또는 L2 중 하나는 직접 결합이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "직접 결합"은 기(예를 들어, L1 또는 L2)가 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 L1 및 L2 각각은 직접 결합이다.
화학식 (II)의 다른 상이한 실시형태에서, R1a 및 R1b 중 적어도 하나의 경우에 대해서, R1a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R1b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
화학식 (II)의 추가의 다른 상이한 실시형태에서, R4a 및 R4b 중 적어도 하나의 경우에 대해서, R4a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R4b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
화학식 (II)의 추가의 실시형태에서, R2a 및 R2b 중 적어도 하나의 경우에 대해서, R2a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R2b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R2b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
화학식 (II)의 다른 상이한 실시형태에서, R3a 및 R3b 중 적어도 하나의 경우에 대해서, R3a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R3b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R3b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
화학식 (II)의 다양한 다른 실시형태에서, 지질 화합물은 하기 화학식 (IIC) 또는 (IID) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00032
식 중, e, f, g 및 h는 각각 독립적으로 1 내지 12의 정수이다.
화학식 (II)의 일부 실시형태에서, 지질 화합물은 화학식 (IIC)를 갖는다. 다른 실시형태에서, 지질 화합물은 화학식 (IID)를 갖는다.
화학식 (IIC) 또는 (IID)의 다양한 실시형태에서, e, f, g 및 h는 각각 독립적으로 4 내지 10의 정수이다.
화학식 (II)의 특정 실시형태에서, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 2 내지 12의 정수 또는 4 내지 12의 정수이다. 다른 실시형태에서, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 8 내지 12 또는 5 내지 9의 정수이다. 일부 특정 실시형태에서, a는 0이다. 일부 실시형태에서, a는 1이다. 다른 실시형태에서, a는 2이다. 추가의 실시형태에서, a는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, a는 4이다. 일부 실시형태에서, a는 5이다. 다른 실시형태에서, a는 6이다. 추가의 실시형태에서, a는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, a는 8이다. 일부 실시형태에서, a는 9이다. 다른 실시형태에서, a는 10이다. 추가의 실시형태에서, a는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, a는 12이다. 일부 실시형태에서, a는 13이다.
다른 실시형태에서, a는 14이다. 추가의 실시형태에서, a는 15이다. 추가의 다른 실시형태에서, a는 16이다.
화학식 (II)의 일부 실시형태에서, b는 1이다. 다른 실시형태에서, b는 2이다. 추가의 실시형태에서, b는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, b는 4이다. 일부 실시형태에서, b는 5이다. 다른 실시형태에서, b는 6이다. 추가의 실시형태에서, b는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, b는 8이다.
일부 실시형태에서, b는 9이다. 다른 실시형태에서, b는 10이다. 추가의 실시형태에서, b는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, b는 12이다. 일부 실시형태에서, b는 13이다. 다른 실시형태에서, b는 14이다. 추가의 실시형태에서, b는 15이다. 추가의 다른 실시형태에서, b는 16이다.
화학식 (II)의 일부 실시형태에서, c는 1이다. 다른 실시형태에서, c는 2이다. 추가의 실시형태에서, c는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, c는 4이다. 일부 실시형태에서, c는 5이다. 다른 실시형태에서, c는 6이다. 추가의 실시형태에서, c는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, c는 8이다. 일부 실시형태에서, c는 9이다. 다른 실시형태에서, c는 10이다. 추가의 실시형태에서, c는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, c는 12이다. 일부 실시형태에서, c는 13이다. 다른 실시형태에서, c는 14이다. 추가의 실시형태에서, c는 15이다. 추가의 다른 실시형태에서, c는 16이다.
화학식 (II)의 일부 특정 실시형태에서, d는 0이다. 일부 실시형태에서, d는 1이다. 다른 실시형태에서, d는 2이다. 추가의 실시형태에서, d는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, d는 4이다. 일부 실시형태에서, d는 5이다. 다른 실시형태에서, d는 6이다. 추가의 실시형태에서, d는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, d는 8이다. 일부 실시형태에서, d는 9이다. 다른 실시형태에서, d는 10이다. 추가의 실시형태에서, d는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, d는 12이다.
일부 실시형태에서, d는 13이다. 다른 실시형태에서, d는 14이다. 추가의 실시형태에서, d는 15이다. 추가의 다른 실시형태에서, d는 16이다.
화학식 (II)의 일부 실시형태에서, e는 1이다. 다른 실시형태에서, e는 2이다. 추가의 실시형태에서, e는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, e는 4이다. 일부 실시형태에서, e는 5이다. 다른 실시형태에서, e는 6이다. 추가의 실시형태에서, e는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, e는 8이다. 일부 실시형태에서, e는 9이다. 다른 실시형태에서, e는 10이다. 추가의 실시형태에서, e는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, e는 12이다.
화학식 (II)의 일부 실시형태에서, f는 1이다. 다른 실시형태에서, f는 2이다. 추가의 실시형태에서, f는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, f는 4이다. 일부 실시형태에서, f는 5이다. 다른 실시형태에서, f는 6이다. 추가의 실시형태에서, f는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, f는 8이다. 일부 실시형태에서, f는 9이다. 다른 실시형태에서, f는 10이다. 추가의 실시형태에서, f는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, f는 12이다.
화학식 (II)의 일부 실시형태에서, g는 1이다. 다른 실시형태에서, g는 2이다. 추가의 실시형태에서, g는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, g는 4이다. 일부 실시형태에서, g는 5이다. 다른 실시형태에서, g는 6이다. 추가의 실시형태에서, g는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, g는 8이다. 일부 실시형태에서, g는 9이다. 다른 실시형태에서, g는 10이다. 추가의 실시형태에서, g는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, g는 12이다.
화학식 (II)의 일부 실시형태에서, h는 1이다. 다른 실시형태에서, e는 2이다. 추가의 실시형태에서, h는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, h는 4이다. 일부 실시형태에서, e는 5이다. 다른 실시형태에서, h는 6이다. 추가의 실시형태에서, h는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, h는 8이다. 일부 실시형태에서, h는 9이다. 다른 실시형태에서, h는 10이다. 추가의 실시형태에서, h는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, h는 12이다.
화학식 (II)의 일부 다른 다양한 실시형태에서, a 및 d는 동일하다. 일부 다른 실시형태에서, b 및 c는 동일하다. 일두 다른 구체적인 실시형태에서, a 및 d는 동일하고, b 및 c는 동일하다.
화학식 (II)에서 a와 b의 합 및 c와 d의 합은 목적하는 특성을 갖는 지질을 얻기 위해서 달라질 수 있는 인자이다. 일 실시형태에서, a 및 b는 이들의 합이 14 내지 24의 범위의 정수이도록 선택된다. 다른 실시형태에서, c 및 d는 이들의 합이 14 내지 24의 범위의 정수이도록 선택된다. 추가 실시형태에서, a와 b의 합 및 c와 d의 합은 동일하다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 a와 b의 합 및 c와 d의 합 둘 다는 14 내지 24의 범위일 수 있는 동일한 정수이다. 더 추가의 실시형태에서, a, b, c 및 d는 a와 b의 합 및 c와 d의 합이 12 이상이도록 선택된다.
화학식 (II)의 R1a, R2a, R3a 및 R4a에서 치환체는 특별히 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 H이다. 특정 실시형태에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a는 각각의 경우에 H이다. 특정 다른 실시형태에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C12 알킬이다. 특정 다른 실시형태에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C8 알킬이다. 특정 다른 실시형태에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C6 알킬이다. 상기 실시형태 중 일부에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-부틸, 아이소-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.
화학식 (II)의 특정 실시형태에서, R1a, R1b, R4a 및 R4b는 각각의 경우에 C1-C12 알킬이다.
화학식 (II)의 추가 실시형태에서, R1b, R2b, R3b 및 R4b 중 적어도 하나는 H이거나 R1b, R2b, R3b 및 R4b는 각각의 경우에 H이다.
화학식 (II)의 특정 실시형태에서, R1b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다. 상기 중 다른 실시형태에서, R4b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
화학식 (II)의 R5 및 R6에서 치환체는 상기 실시형태에서 특별히 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서 R5 또는 R6 중 하나는 메틸이다. 다른 실시형태에서 R5 또는 R6 각각은 메틸이다.
화학식 (II)의 R7에서 치환체는 상기 실시형태에서 특별히 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서 R7은 C6-C16 알킬이다. 일부 다른 실시형태에서, R7은 C6-C9 알킬이다. 이들 실시형태 중 일부에서, R7은 -(C=O)ORb, -O(C=O)Rb, -C(=O)Rb, -ORb, -S(O)xRb, -S-SRb, -C(=O)SRb, -SC(=O)Rb, -NRaRb, -NRaC(=O)Rb, -C(=O)NRaRb, -NRaC(=O)NRaRb, -OC(=O)NRaRb, -NRaC(=O)ORb, -NRaS(O)xNRaRb, -NRaS(O)xRb 또는 -S(O)xNRaRb로 치환되고, Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고; Rb는 C1-C15 알킬이고; x는 0, 1 또는 2이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 R7은 -(C=O)ORb 또는 -O(C=O)Rb로 치환된다.
화학식 (II)의 상기 실시형태 중 일부에서, Rb는 분지형 C1-C16 알킬이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 Rb는 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00033
화학식 (II)의 상기 실시형태 중 특정 다른 것에서, R8 또는 R9 중 하나는 메틸이다. 다른 실시형태에서, R8 및 R9 둘 다는 메틸이다.
화학식 (II)의 일부 상이한 실시형태에서, R8 및 R9는 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 5, 6 또는 7-원 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
상기 중 일부 실시형태에서, R8 및 R9는 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 5-원 헤테로사이클릭 고리, 예를 들어, 피롤리딘일 고리를 형성한다. 상기 중 일부 상이한 실시형태에서, R8 및 R9는 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 6-원 헤테로사이클릭 고리, 예를 들어, 피페라진일 고리를 형성한다.
실시형태 3의 특정 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서양이온성 지질은 하기 화학식 II의 지질로부터 각각 독립적으로 선택된다.
화학식 (II)의 상기 지질 중 추가의 다른 실시형태에서, G3은 C2-C4 알킬렌, 예를 들어, C3 알킬렌이다. 다양한 상이한 실시형태에서, 지질 화합물은 하기 표 2에 제시된 구조 중 하나를 갖는다.
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
일부 다른 실시형태에서, 실시형태 1, 2, 3, 4 또는 5의 양이온성 지질은 하기 화학식 III의 구조를 갖는다:
Figure pct00043
또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 전구약물 또는 입체이성질체, 식 중, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)X-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O-이고, L1 또는 L2 중 나머지는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)X-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O- 또는 직접 결합이고;
G1 및 G2는 각각 독립적으로 비치환된 C1-C12 알킬렌 또는 C1-C12 알켄일렌이고;
G3은 C1-C24 알킬렌, C1-C24 알켄일렌, C3-C8 사이클로알킬렌, C3-C8 사이클로알켄일렌이고;
Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 C6-C24 알킬 또는 C6-C24 알켄일이고;
R3은 H, OR5, CN, -C(=O)OR4, -OC(=O)R4 또는 -NR5C(=O)R4이고;
R4는 C1-C12 알킬이고;
R5는 H 또는 C1-C6 알킬이고;
x는 0, 1 또는 2이다.화학식 (III)의 상기 실시형태 중 일부에서, 지질은 하기 화학식 (IIIA) 또는 (IIIB) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00044
식 중,
A는 3 내지 8-원 사이클로알킬 또는 사이클로알킬렌 고리이고;
R6은, 각각의 경우에, 독립적으로 H, OH 또는 C1-C24 알킬이고;
n은 1 내지 15 범위의 정수이다.
화학식 (III)의 상기 실시형태 중 일부에서, 지질은 화학식 (IIIA)를 갖고, 다른 실시형태에서, 지질은 화학식 (IIIB)를 갖는다.
화학식 (III)의 다른 실시형태에서, 지질은 하기 화학식 (IIIC) 또는 (IIID) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00045
식 중, y 및 z는 각각 독립적으로 1 내지 12 범위의 정수이다.
화학식 (III)의 상기 실시형태 중 임의의 것에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 L1 및 L2 각각은 -O(C=O)-이다. 상기 중 임의의 것의 일부 상이한 실시형태에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -(C=O)O- 또는 -O(C=O)-이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 L1 및 L2 각각은 -(C=O)O-이다.
화학 (III)의 일부 다른 실시형태에서, 지질은 하기 화학식 (IIIE) 또는 (IIIF) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00046
화학식 (III)의 상기 실시형태 중 일부에서, 지질은 하기 화학식 (IIIG), (IIIH), (IIII) 또는 (IIIJ) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00047
화학식 (III)의 상기 실시형태 중 일부에서, n은 2 내지 12, 예를 들어, 2 내지 8 또는 2 내지 4 범위의 정수이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, n은 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 실시형태에서, n은 3이다. 일부 실시형태에서, n은 4이다. 일부 실시형태에서, n은 5이다. 일부 실시형태에서, n은 6이다.
화학식 (III)의 상기 실시형태 중 일부 다른 것에서, y 및 z는 각각 독립적으로 2 내지 10 범위의 정수이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, y 및 z는 각각 독립적으로 4 내지 9 또는 4 내지 6 범위의 정수이다.
화학식 (III)의 상기 실시형태 중 일부에서, R6은 H이다. 상기 실시형태 중 다른 것에서, R6은 C1-C24 알킬이다. 다른 실시형태에서, R6은 OH이다.
화학식 (III)의 일부 실시형태에서, G3은 비치환된다. 다른 실시형태에서, G3은 치환된다. 다양한 상이한 실시형태에서, G3은 선형 C1-C24 알킬렌 또는 선형 C1-C24 알켄일렌이다.
화학식 (III)의 일부 다른 상기 실시형태에서, R1 또는 R2, 또는 둘 다는 C6-C24 알켄일이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00048
식 중,
R7a 및 R7b는 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이고;
a는 2 내지 12이고,
R7a, R7b 및 a는 R1 및 R2가 각각 독립적으로 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하도록 각각 선택된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 a는 5 내지 9 또는 8 내지 12 범위의 정수이다.
화학식 (III)의 상기 실시형태 중 일부에서, R7a의 적어도 하나의 경우는 H이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, R7a는 각각의 경우에 H이다. 상기 중 다른 상이한 실시형태에서, R7b 중 적어도 하나의 경우는 C1-C8 알킬이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-부틸, 아이소-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.
화학식 (III)의 상이한 실시형태에서, R1 또는 R2, 또는 이들 둘 다는 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00049
화학식 (III)의 상기 실시형태 중 일부에서, R3은 OH, CN, -C(=O)OR4, -OC(=O)R4 또는 -NHC(=O)R4이다. 일부 실시형태에서, R4는 메틸 또는 에틸이다.
실시형태 3의 일부 구체적인 실시형태에서, 제1 스페이서 및 제2 스페이서양이온성 지질은 각각 독립적으로 화학식 III의 지질로부터 선택된다.
다양한 상이한 실시형태에서, 화학식 (III)의 개시된 실시형태 중 임의의 하나의 양이온성 지질(예를 들어, 양이온성 지질, 제1 양이온성 지질, 제2 양이온성 지질)은 하기 표 3에 제시된 구조 중 하나를 갖는다.
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
일 실시형태에서, 실시형태 1, 2, 3, 4 또는 5 중 어느 하나의 양이온성 지질은 하기 화학식 (IV)의 구조, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 전구약물 또는 입체이성질체를 갖는다:
Figure pct00058
식 중, G1 또는 G2 중 하나는 각각의 경우에, -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)y-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -N(Ra)C(=O)-, -C(=O)N(Ra)-, -N(Ra)C(=O)N(Ra)-, -OC(=O)N(Ra)- 또는 -N(Ra)C(=O)O-이고, G1 또는 G2 중 나머지는, 각각의 경우에, -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)y-, -S-S-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -N(Ra)C(=O)-, -C(=O)N(Ra)-, -N(Ra)C(=O)N(Ra)-, -OC(=O)N(Ra)- 또는 -N(Ra)C(=O)O- 또는 직접 결합이고;
L은, 각각의 경우에, ~O(C=O)-이되, ~는 X에 대한 공유 결합을 나타내고;
X는 CRa이고;
Z는 n이 1인 경우에는 알킬, 사이클로알킬 또는 적어도 하나의 극성 작용기를 포함하는 1가 모이어티이거나; Z는 n이 1보다 큰 경우에는 알킬렌, 사이클로알킬렌 또는 적어도 하나의 극성 작용기를 포함하는 다가 모이어티이고;
Ra는, 각각의 경우에, 독립적으로 H, C1-C12 알킬, C1-C12 하이드록실알킬, C1-C12 아미노알킬, C1-C12 알킬아미닐알킬, C1-C12 알콕시알킬, C1-C12 알콕시카보닐, C1-C12 알킬카보닐옥시, C1-C12 알킬카보닐옥시알킬 또는 C1-C12 알킬카보닐이고;
R은 각각의 경우에, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, (b) R은 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R1 및 R2는, 각각의 경우에, 각각 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00059
a1 및 a2는, 각각의 경우에, 독립적으로 3 내지 12의 정수이고; b1 및 b2는, 각각의 경우에, 독립적으로 0 또는 1이고;
c1 및 c2는, 각각의 경우에, 독립적으로 5 내지 10이고; d1 및 d2는, 각각의 경우에, 독립적으로 5 내지 10의 정수이고;
y는, 각각의 경우에, 독립적으로 0 내지 2의 정수이고;
n은 1 내지 6의 정수이되, 각각의 알킬, 알킬렌, 하이드록실알킬, 아미노알킬, 알킬아미닐알킬, 알콕시알킬, 알콕시카보닐, 알킬카보닐옥시, 알킬카보닐옥시알킬 및 알킬카보닐은 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환된다.
화학식 (IV)의 일부 실시형태에서, G1 및 G2는 각각 독립적으로 -O(C=O)- 또는 -(C=O)O-이다.
화학식 (IV)의 다른 실시형태에서, X는 CH이다.
화학식 (IV)의 상이한 실시형태에서, a1 + b1 + c1의 합 또는 a2 + b2 + c2의 합은 12 내지 26의 정수이다.
화학식 (IV)의 추가의 다른 실시형태, a1 및 a2는 독립적으로 3 내지 10의 정수이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 a1 및 a2는 독립적으로 4 내지 9의 정수이다.
화학식 (IV)의 다양한 실시형태에서, b1 및 b2는 0이다. 상이한 실시형태에서, b1 및 b2는 1이다.
화학식 (IV)의 추가의 실시형태에서, c1, c2, d1 및 d2는 독립적으로 6 내지 8의 정수이다.
화학식 (IV)의 다른 실시형태에서, c1 및 c2는, 각각의 경우에, 독립적으로 6 내지 10이고; d1 및 d2는, 각각의 경우에, 독립적으로 6 내지 10의 정수이다.
화학식 (IV)의 다른 실시형태에서, c1 및 c2는, 각각의 경우에, 독립적으로 5 내지 9이고; d1 및 d2는, 각각의 경우에, 독립적으로 5 내지 9의 정수이다.
화학식 (IV)의 추가의 실시형태에서, n이 1인 경우 Z는 알킬, 사이클로알킬 또는 적어도 하나의 극성 작용기를 포함하는 1가 모이어티이다. 다른 실시형태에서, Z는 알킬이다.
상기 화학식 (IV)의 다양한 실시형태에서, R은 각각의 경우에, 독립적으로 (a) H 또는 메틸이거나, (b) R은 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
특정 실시형태에서, 각각의 R은 H이다. 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 R은 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
화학식 (IV)의 화합물의 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 독립적으로 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00060
화학식 (IV)의 특정 실시형태에서, 화합물은 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
추가의 상이한 실시형태에서 실시형태 1, 2, 3, 4 또는 5의 양이온성 지질은 하기 화학식 (V)의 구조, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 전구약물 또는 입체이성질체를 갖는다:
Figure pct00065
식 중,
G1 또는 G2 중 하나는, 각각의 경우에, -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)y-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -N(Ra)C(=O)-, -C(=O)N(Ra)-, -N(Ra)C(=O)N(Ra)-, -OC(=O)N(Ra)- 또는 -N(Ra)C(=O)O-이고, G1 또는 G2 중 나머지는, 각각의 경우에, -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)y-, -S-S-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -N(Ra)C(=O)-, -C(=O)N(Ra)-, -N(Ra)C(=O)N(Ra)-, -OC(=O)N(Ra)- 또는 -N(Ra)C(=O)O- 또는 직접 결합이고;
L은, 각각의 경우에, ~O(C=O)-이되, ~는 X에 대한 공유 결합을 나타내고;
X는 CRa이고; Z는 n이 1인 경우에는 알킬, 사이클로알킬 또는 적어도 하나의 극성 작용기를 포함하는 1가 모이어티이거나; Z는 n이 1보다 큰 경우에는 알킬렌, 사이클로알킬렌 또는 적어도 하나의 극성 작용기를 포함하는 다가 모이어티이고;
Ra는, 각각의 경우에, 독립적으로 H, C1-C12 알킬, C1-C12 하이드록실알킬, C1-C12 아미노알킬, C1-C12 알킬아미닐알킬, C1-C12 알콕시알킬, C1-C12 알콕시카보닐, C1-C12 알킬카보닐옥시, C1-C12 알킬카보닐옥시알킬 또는 C1-C12 알킬카보닐이고;
R은 각각의 경우에, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, (b) R은 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R1 및 R2는, 각각의 경우에, 각각 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00066
R'는, 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이고;
a1 및 a2는, 각각의 경우에, 독립적으로 3 내지 12의 정수이고; b1 및 b2는, 각각의 경우에, 독립적으로 0 또는 1이고;
c1 및 c2는, 각각의 경우에, 독립적으로 2 내지 12이고; d1 및 d2는, 각각의 경우에, 독립적으로 2 내지 12의 정수이고;
y는, 각각의 경우에, 독립적으로 0 내지 2의 정수이고;
n은 1 내지 6의 정수이고,
a1, a2, c1, c2, d1 및 d2는 a1+c1+d1의 합이 18 내지 30의 정수이고, a2+c2+d2의 합이 18 내지 30의 정수이도록 선택되고, 각각의 알킬, 알킬렌, 하이드록실알킬, 아미노알킬, 알킬아미닐알킬, 알콕시알킬, 알콕시카보닐, 알킬카보닐옥시, 알킬카보닐옥시알킬 및 알킬카보닐은 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환된다.
화학식 (V)의 특정 실시형태에서, G1 및 G2는 각각 독립적으로 -O(C=O)- 또는 -(C=O)O-이다.
화학식 (V)의 다른 실시형태에서, X는 CH이다.
화학식 (V)의 일부 실시형태에서, a1+c1+d1의 합은 20 내지 30이고, a2+c2+d2의 합은 18 내지 30이다. 다른 실시형태에서, a1+c1+d1의 합은 20 내지 30의 정수이고, a2+c2+d2의 합은 20 내지 30의 정수이다. 화학식 (V)의 추가의 실시형태에서, a1+b1+c1의 합 또는 a2+b2+c2의 합은 12 내지 26의 정수이다. 다른 실시형태에서, a1, a2, c1, c2, d1 및 d2는 a1+c1+d1의 합이 18 내지 28의 정수이고, a2+c2+d2의 합이 18 내지 28의 정수이도록 선택된다.
화학식 (V)의 추가의 다른 실시형태에서, a1 및 a2는 독립적으로 3 내지 10의 정수, 예를 들어, 4 내지 9의 정수이다.
화학식 (V)의 추가의 다른 실시형태에서, b1 및 b2는 0이다. 상이한 실시형태에서 b1 및 b2는 1이다.
화학식 (V)의 특정 다른 실시형태에서, c1, c2, d1 및 d2는 독립적으로 6 내지 8의 정수이다.
화학식 (V)의 상이한 다른 실시형태, Z는 n이 1인 경우에는 알킬 또는 적어도 하나의 극성 작용기를 포함하는 1가 모이어티이거나; Z는 n이 1보다 큰 경우에는 알킬렌 또는 적어도 하나의 극성 작용기를 포함하는 다가 모이어티이다.
화학식 (V)의 추가의 실시형태에서, n이 1인 경우 Z는 알킬, 사이클로알킬 또는 적어도 하나의 극성 작용기를 포함하는 1가 모이어티이다. 다른 실시형태에서, Z는 알킬이다.
화학식 (V)의 다른 상이한 실시형태에서, R은 각각의 경우에, 독립적으로 (a) H 또는 메틸이거나, (b) R은 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 각각의 R은 H이다. 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 R은 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
추가의 실시형태에서, 각각의 R'는 H이다.
화학식 (V)의 일부 실시형태에서, a1+c1+d1의 합은 20 내지 25의 정수이고, a2+c2+d2의 합은 20 내지 25의 정수이다.
화학식 (V)의 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 독립적으로 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00067
화학식 (V)의 추가의 실시형태에서, 화합물은 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
화학식 (IV) 또는 (V)의 상기 실시형태 중 임의의 것에서, n은 1이다. 화학식 (IV) 또는 (V)의 상기 실시형태 중 나머지 것에서, n은 1 초과이다.
화학식 (IV) 또는 (V)의 상기 실시형태 중 임의의 것에서, Z는 적어도 하나의 극성 작용기를 포함하는 1가 또는 다가 모이어티이다. 일부 실시형태에서, Z는 적어도 하나의 극성 작용기를 포함하는 1가 모이어티이다. 다른 실시형태에서, Z는 적어도 하나의 극성 작용기를 포함하는 다가 모이어티이다.
화학식 (IV) 또는 (V)의 상기 실시형태 중 임의의 것에서, 극성 작용기는 하이드록실, 알콕시, 에스터, 사이아노, 아마이드, 아미노, 알킬아미닐, 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴 작용기이다.
화학식 (IV) 또는 (V)의 상기 실시형태 중 임의의 것에서, Z는 하이드록실, 하이드록실알킬, 알콕시알킬, 아미노, 아미노알킬, 알킬아미닐, 알킬아미닐알킬, 헤테로사이클릴 또는 헤테로사이클릴알킬이다.
화학식 (IV) 또는 (V)의 일부 다른 실시형태에서, Z는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00072
식 중,
R5 및 R6은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
R7 및 R8은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이거나 또는 R7과 R8은, 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 합쳐져서 3 내지 7원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
x는 0 내지 6의 정수이다.
화학식 (IV) 또는 (V)의 추가의 상이한 실시형태에서, Z는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00073
식 중,
R5 및 R6은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
R7 및 R8은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이거나 또는 R7과 R8은, 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 합쳐져서 3 내지 7원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
x는 0 내지 6의 정수이다.
화학식 (IV) 또는 (V)의 추가의 상이한 실시형태에서, Z는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00074
식 중,
R5 및 R6은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
R7 및 R8은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이거나 또는 R7과 R8은, 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 합쳐져서 3 내지 7원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
x는 0 내지 6의 정수이다.
화학식 (IV) 또는 (V)의 일부 다른 실시형태에서, Z는 하이드록실알킬, 사이아노알킬 또는 하나 이상의 에스터 또는 아마이드기로 치환된 알킬이다.
예를 들어, 화학식 (IV) 또는 (V)의 상기 실시형태 중 임의의 것에서, Z는 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00075
화학식 (IV) 또는 (V)의 다른 실시형태에서, Z-L은 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00076
Figure pct00077
다른 실시형태에서, Z-L은 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00078
추가의 다른 실시형태에서, X는 CH이고, Z-L은 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00079
다양한 상이한 실시형태에서, 임의의 하나의 실시형태 1, 2, 3, 4 또는 5의 양이온성 지질은 하기 표 4에 제시된 구조 중 하나를 갖는다.
Figure pct00080
일 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 구조 (VI)을 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 호변이성질체, 전구약물 또는 입체이성질체이다:
Figure pct00081
식 중,
L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)X-, -S-S-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa-, -NRaC(=O)O- 또는 직접 결합이고;
G1은 C1-C2 알킬렌, -(C=O)-, -O(C=O)-, -SC(=O)-, -NRaC(=O)- 또는 직접 결합이고;
G2는 -C(=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)S-, -C(=O)NRa- 또는 직접 결합이고;
G3은 C1-C6 알킬렌이고;
Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R1a 및 R1b는 각각의 경우에서, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, (b) R1a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R1b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R2a 및 R2b는 각각의 경우에서, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, (b) R2a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R2b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R2b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R3a 및 R3b는 각각의 경우에서, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; (b) R3a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R3b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R3b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R4a 및 R4b는 각각의 경우에서, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; (b) R4a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R4b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고;
R5 및 R6은 각각 독립적으로 H 또는 메틸이고;
R7은 H 또는 C1-C20 알킬이고;
R8은 OH, -N(R9)(C=O)R10, -(C=O)NR9R10, -NR9R10, -(C=O)OR11 또는 -O(C=O)R11이되, 단 R8이 -NR9R10인 경우 G3은 C4-C6 알킬렌이고;
R9 및 R10은 각각 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R11은 아르알킬이고;
a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 1 내지 24의 정수이고;
x는 0, 1 또는 2이고,
각각의 알킬, 알킬렌 및 아르알킬은 선택적으로 치환된다.
구조 (VI)의 일부 실시형태에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)-, -(C=O)O- 또는 직접 결합이다. 다른 실시형태에서, G1 및 G2는 각각 독립적으로 -(C=O)- 또는 직접 결합이다. 일부 상이한 실시형태에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -O(C=O)-, -(C=O)O- 또는 직접 결합이고; G1 및 G2는 각각 독립적으로 -(C=O)- 또는 직접 결합이다.
구조식 (VI)의 일부 상이한 실시형태에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -C(=O)-, -O-, -S(O)X-, -S-S-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -NRa-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)NRa, -OC(=O)NRa-, -NRaC(=O)O-, -NRaS(O)xNRa-, -NRaS (O)x- 또는 -S(O)xNRa-이다.
화학식 (VI)의 상기 실시형태 중 다른 것에서, 화합물은 하기 구조식 (VIA) 또는 (VIB) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00082
일부 실시형태에서, 화합물은 구조식 (VIA)를 갖는다. 다른 실시형태에서, 화합물은 구조식 (VIB)를 갖는다.
구조식 (VI)의 상기 실시형태 중 임의의 것에서, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 L1 및 L2 각각은 -O(C=O)-이다.
상기 중 임의의 것의 일부 상이한 실시형태에서, L1 또는 L2 중 하나는 -(C=O)O-이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 L1 및 L2 각각은 -(C=O)O-이다.
구조식 (VI)의 상이한 실시형태에서, L1 또는 L2 중 하나는 직접 결합이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "직접 결합"은 기(예를 들어, L1 또는 L2)가 존재하지 않는다는 것을 의미한다 예를 들어, 일부 실시형태에서 L1 및 L2 각각은 직접 결합이다.
상기의 다른 상이한 실시형태에서, R1a 및 R1b 중 적어도 하나의 경우에 대해서, R1a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R1b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
구조식 (VI)의 추가의 다른 상이한 실시형태에서, R4a 및 R4b 중 적어도 하나의 경우에 대해서, R4a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R4b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
구조식 (VI)의 추가의 실시형태에서, R2a 및 R2b 중 적어도 하나의 경우에 대해서, R2a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R2b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R2b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
상기 중 임의의 것의 다른 상이한 실시형태에서, R3a 및 R3b 중 적어도 하나의 경우에 대해서, R3a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R3b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R3b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
"탄소-탄소" 이중 결합은 하기 구조 중 하나를 지칭한다는 것이 이해된다:
Figure pct00083
식 중, Rc 및 Rd는 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 치환체이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 Rc 및 Rd는, 각각의 경우에, 독립적으로 H, C1-C12 알킬 또는 사이클로알킬, 예를 들어, H 또는 C1-C12 알킬이다.
다양한 다른 실시형태에서, 화합물은 하기 구조식 (VIC) 또는 (VID) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00084
식 중, e, f, g 및 h는 각각 독립적으로 1 내지 12의 정수이다.
일부 실시형태에서, 화합물은 구조식 (VIC)를 갖는다. 다른 실시형태에서, 화합물은 구조식 (VID)를 갖는다.
구조식 (VIC) 또는 (VID)의 화합물의 다양한 실시형태에서, e, f, g 및 h는 각각 독립적으로 4 내지 10의 정수이다.
다른 실시형태에서,
Figure pct00085
또는 이들 둘 다는 독립적으로 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00086
상기 중 특정 실시형태에서, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 2 내지 12의 정수 또는 4 내지 12의 정수이다. 다른 실시형태에서, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 8 내지 12 또는 5 내지 9의 정수이다. 일부 특정 실시형태에서, a는 0이다. 일부 실시형태에서, a는 1이다. 다른 실시형태에서, a는 2이다. 추가의 실시형태에서, a는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, a는 4이다. 일부 실시형태에서, a는 5이다. 다른 실시형태에서, a는 6이다. 추가의 실시형태에서, a는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, a는 8이다. 일부 실시형태에서, a는 9이다. 다른 실시형태에서, a는 10이다. 추가의 실시형태에서, a는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, a는 12이다. 일부 실시형태에서, a는 13이다. 다른 실시형태에서, a는 14이다. 추가의 실시형태에서, a는 15이다. 추가의 다른 실시형태에서, a는 16이다.
구조식 (VI)의 일부 실시형태에서, b는 1이다. 다른 실시형태에서, b는 2이다. 추가의 실시형태에서, b는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, b는 4이다. 일부 실시형태에서, b는 5이다. 다른 실시형태에서, b는 6이다. 추가의 실시형태에서, b는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, b는 8이다. 일부 실시형태에서, b는 9이다. 다른 실시형태에서, b는 10이다. 추가의 실시형태에서, b는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, b는 12이다. 일부 실시형태에서, b는 13이다. 다른 실시형태에서, b는 14이다. 추가의 실시형태에서, b는 15이다. 추가의 다른 실시형태에서, b는 16이다.
구조식 (VI)의 일부 실시형태에서, c는 1이다. 다른 실시형태에서, c는 2이다. 추가의 실시형태에서, c는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, c는 4이다. 일부 실시형태에서, c는 5이다. 다른 실시형태에서, c는 6이다. 추가의 실시형태에서, c는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, c는 8이다. 일부 실시형태에서, c는 9이다. 다른 실시형태에서, c는 10이다. 추가의 실시형태에서, c는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, c는 12이다. 일부 실시형태에서, c는 13이다. 다른 실시형태에서, c는 14이다. 추가의 실시형태에서, c는 15이다. 추가의 다른 실시형태에서, c는 16이다.
구조식 (VI)의 일부 특정 실시형태에서, d는 0이다. 일부 실시형태에서, d는 1이다. 다른 실시형태에서, d는 2이다. 추가의 실시형태에서, d는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, d는 4이다. 일부 실시형태에서, d는 5이다. 다른 실시형태에서, d는 6이다. 추가의 실시형태에서, d는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, d는 8이다. 일부 실시형태에서, d는 9이다. 다른 실시형태에서, d는 10이다. 추가의 실시형태에서, d는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, d는 12이다.
일부 실시형태에서, d는 13이다. 다른 실시형태에서, d는 14이다. 추가의 실시형태에서, d는 15이다. 추가의 다른 실시형태에서, d는 16이다.
구조식 (VI)의 일부 실시형태에서, e는 1이다. 다른 실시형태에서, e는 2이다. 추가의 실시형태에서, e는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, e는 4이다. 일부 실시형태에서, e는 5이다. 다른 실시형태에서, e는 6이다. 추가의 실시형태에서, e는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, e는 8이다. 일부 실시형태에서, e는 9이다. 다른 실시형태에서, e는 10이다. 추가의 실시형태에서, e는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, e는 12이다.
구조식 (VI)의 일부 실시형태에서, f는 1이다. 다른 실시형태에서, f는 2이다. 추가의 실시형태에서, f는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, f는 4이다. 일부 실시형태에서, f는 5이다. 다른 실시형태에서, f는 6이다. 추가의 실시형태에서, f는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, f는 8이다. 일부 실시형태에서, f는 9이다. 다른 실시형태에서, f는 10이다. 추가의 실시형태에서, f는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, f는 12이다.
구조식 (VI)의 일부 실시형태에서, g는 1이다. 다른 실시형태에서, g는 2이다. 추가의 실시형태에서, g는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, g는 4이다. 일부 실시형태에서, g는 5이다. 다른 실시형태에서, g는 6이다. 추가의 실시형태에서, g는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, g는 8이다. 일부 실시형태에서, g는 9이다. 다른 실시형태에서, g는 10이다. 추가의 실시형태에서, g는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, g는 12이다.
구조식 (VI)의 일부 실시형태에서, h는 1이다. 다른 실시형태에서, e는 2이다. 추가의 실시형태에서, h는 3이다. 추가의 다른 실시형태에서, h는 4이다. 일부 실시형태에서, e는 5이다. 다른 실시형태에서, h는 6이다. 추가의 실시형태에서, h는 7이다. 추가의 다른 실시형태에서, h는 8이다. 일부 실시형태에서, h는 9이다. 다른 실시형태에서, h는 10이다. 추가의 실시형태에서, h는 11이다. 추가의 다른 실시형태에서, h는 12이다.
구조식 (VI)의 일부 다른 다양한 실시형태에서, a 및 d는 동일하다. 일부 다른 실시형태에서, b 및 c는 동일하다. 일두 다른 구체적인 실시형태에서, a 및 d는 동일하고, b 및 c는 동일하다.
a와 b의 합 및 c와 d의 합은 목적하는 특성을 갖는 지질을 얻기 위해서 달라질 수 있는 인자이다. 일 실시형태에서, a 및 b는 이들의 합이 14 내지 24의 범위의 정수이도록 선택된다. 다른 실시형태에서, c 및 d는 이들의 합이 14 내지 24의 범위의 정수이도록 선택된다. 추가 실시형태에서, a와 b의 합 및 c와 d의 합은 동일하다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 a와 b의 합 및 c와 d의 합 둘 다는 14 내지 24의 범위일 수 있는 동일한 정수이다.
더 추가의 실시형태에서, a, b, c 및 d는 a와 b의 합 및 c와 d의 합이 12 이상이도록 선택된다.
R1a, R2a, R3a 및 R4a에서 치환체는 특별히 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 H이다. 특정 실시형태에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a는 각각의 경우에 H이다. 특정 다른 실시형태에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C12 알킬이다. 특정 다른 실시형태에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C8 알킬이다. 특정 다른 실시형태에서 R1a, R2a, R3a 및 R4a 중 적어도 하나는 C1-C6 알킬이다. 상기 실시형태 중 일부에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-부틸, 아이소-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.
상기 중 특정 실시형태에서, R1a, R1b, R4a 및 R4b는 각각의 경우에 C1-C12 알킬이다.
상기 중 추가 실시형태에서, R1b, R2b, R3b 및 R4b 중 적어도 하나는 H이거나 R1b, R2b, R3b 및 R4b는 각각의 경우에 H이다.
상기 중 특정 실시형태에서, R1b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R1b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다. 상기 중 다른 실시형태에서, R4b는 이것이 결합되는 탄소 원자와 함께 인접한 R4b 및 이것이 결합되는 탄소와 함께 취해져서 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.
R5 및 R6에서 치환체는 상기 실시형태에서 특별히 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서 R5 또는 R6 중 하나는 메틸이다. 다른 실시형태에서 R5 또는 R6 각각은 메틸이다.
R7에서 치환체는 상기 실시형태에서 특별히 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서 R7은 C6-C16 알킬이다. 일부 다른 실시형태에서, R7은 C6-C9 알킬이다. 이들 실시형태 중 일부에서, R7은 -(C=O)ORb, -O(C=O)Rb, -C(=O)Rb, -ORb, -S(O)xRb, -S-SRb, -C(=O)SRb, -SC(=O)Rb, -NRaRb, -NRaC(=O)Rb, -C(=O)NRaRb, -NRaC(=O)NRaRb, -OC(=O)NRaRb, -NRaC(=O)ORb, -NRaS(O)xNRaRb, -NRaS(O)xRb 또는 -S(O)xNRaRb로 치환되고, Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고; Rb는 C1-C15 알킬이고; x는 0, 1 또는 2이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 R7은 -(C=O)ORb 또는 -O(C=O)Rb로 치환된다.
구조식 (VI)의 상기 실시형태 중 다양한 것에서, Rb는 분지형 C3-C15 알킬이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 Rb는 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00087
특정 실시형태에서, R8은 OH이다.
구조식 (VI)의 다른 실시형태에서, R8은 -N(R9)(C=O)R10이다. 일부 다른 실시형태에서, R8은 -(C=O)NR9R10이다. 더 추가의 실시형태에서, R8은 -NR9R10이다. 상기 실시형태 중 일부에서, R9 및 R10은 각각 독립적으로 H 또는 C1-C8 알킬, 예를 들어, H 또는 C1-C3 알킬이다. 이들 실시형태 중 보다 구체적인 것에서, C1-C8 알킬 또는 C1-C3 알킬은 비치환되거나 하이드록실로 치환된다. 이들 실시형태 중 다른 것에서, R9 및 R10은 각각 메틸이다.
구조식 (VI)의 더 추가의 실시형태에서, R8은 -(C=O)OR11이다. 이들 실시형태 중 일부에서, R11은 벤질이다.
구조식 (VI)의 더 추가의 구체적인 실시형태에서, R8은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00088
Figure pct00089
상기 화합물의 추가의 다른 실시형태, G3은 C2-C5 알킬렌, 예를 들어, C2-C4 알킬렌, C3 알킬렌 또는 C4 알킬렌이다. 이들 실시형태 중 일부에서, R8은 OH이다. 다른 실시형태에서, G2는 존재하지 않고, R7은 C1-C2 알킬렌, 예컨대, 메틸이다.
다양한 상이한 실시형태에서, 화합물은 하기 표 5에 제시된 구조 중 하나를 갖는다.
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
일 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 구조식 (VII)을 갖는 화합물이다:
Figure pct00096
또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 전구약물 또는 입체이성질체, 식 중,
X 및 X1은 각각 독립적으로 N 또는 CR이고;
Y 및 Y1은 각각 독립적으로 존재하지 않거나, -O(C=O)-, -(C=O)O- 또는 NR이되,
단,
a) X가 N인 경우 Y는 존재하지 않고;
b) X1이 N인 경우 Y1은 존재하지 않고;
c) X가 CR인 경우 Y는 -O(C=O)-, -(C=O)O- 또는 NR이고;
d) X'가 CR인 경우 Y'는 -O(C=O)-, -(C=O)O- 또는 NR이고;
L1 및 L1'는 각각 독립적으로 -O(C=O)R1, -(C=O)OR1, -C(=O)R1, -OR1, -S(O)ZR1, -S-SR1, -C(=O)SRx, -SC(=O)Rx, -NRaC(=O)R1, -C(=O)NRbRc, -NRaC(=O)NRbRc, -OC(=O)NRbRc 또는 -NRaC(=O)OR1이고;
L2 및 L2'는 각각 독립적으로 -O(C=O)R2, -(C=O)OR2, -C(=O)R2, -OR2, -S(O)ZR2, -S-SR2, -C(=O)SR2, -SC(=O)R2, -NRdC(=O)R2, -C(-O)NRcRr, -NRdC(=O)NReRf, -OC(=O)NReRf; -NRdC(=O)OR2 또는 R2에 대한 직접 결합이고;
G1, G1', G2 및 G2'는 각각 독립적으로 C2-C12 알킬렌 또는 C2-C12 알켄일렌이고;
G3은 C2-C24 헤테로알킬렌 또는 C2-C24 헤테로알켄일렌이고;
Ra, Rb, Rd 및 Re는, 각각의 경우에, 독립적으로 H, C1-C12 알킬 또는 C2-C12 알켄일이고;
Rc 및 Rf는, 각각의 경우에, 독립적으로 C1-C12 알킬 또는 C2-C12 알켄일이고;
R은, 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R1 및 R2는, 각각의 경우에, 독립적으로 분지형 C6-C24 알킬 또는 분지형 C6-C24 알켄일이고;
z는 0, 1 또는 2이고,
각각의 알킬, 알켄일, 알킬렌, 알켄일렌, 헤테로알킬렌 및 헤테로알켄일렌은 달리 명시되지 않는 한 독립적으로 치환되거나 치환되지 않는다.
구조식 (VII)의 다른 상이한 실시형태에서:
X 및 X'는 각각 독립적으로 N 또는 CR이고;
Y 및 Y'는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 NR이되, 단,
a) X가 N인 경우 Y는 존재하지 않고;
b) X'가 N인 경우 Y'는 존재하지 않고;
c) X가 CR인 경우 Y는 NR이고;
d) X'가 CR인 경우 Y'는 NR이고
L1 및 L1'는 각각 독립적으로 -O(C=O)R1, -(C=O)OR1, -C(=O)R1, -OR1, -S(O)ZR1, -S-SR1, -C(=O)SRx, -SC(=O)Rx, -NRaC(=O)R1, -C(=O)NRbRc, -NRaC(=O)NRbRc, -OC(=O)NRbRc 또는 -NRaC(=O)OR1이고;
L2 및 L2'는 각각 독립적으로 -O(C=O)R2, -(C=O)OR2, -C(=O)R2, -OR2, -S(O)ZR2, -S-SR2, -C(=O)SR2, -SC(=O)R2, -NRdC(=O)R2, -C(-O)NRcRr, -NRdC(=O)NReRf, -OC(=O)NReRf; -NRdC(=O)OR2 또는 R2에 대한 직접 결합이고;
G1, G1', G2 및 G2'는 각각 독립적으로 C2-C12 알킬렌 또는 C2-C12 알켄일렌이고;
G3은 C2-C24 알킬렌옥사이드 또는 C2-C24 알켄일렌옥사이드이고;
Ra, Rb, Rd 및 Re는, 각각의 경우에, 독립적으로 H, C1-C12 알킬 또는 C2-C12 알켄일이고;
Rc 및 Rf는, 각각의 경우에, 독립적으로 C1-C12 알킬 또는 C2-C12 알켄일이고;
R'는, 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R1 및 R2는, 각각의 경우에, 독립적으로 분지형 C6-C24 알킬 또는 분지형 C6-C24 알켄일이고;
z는 0, 1 또는 2이고,
각각의 알킬, 알켄일, 알킬렌, 알켄일렌, 알킬렌옥사이드 및 알켄일렌옥사이드는 달리 명시되지 않는 한 독립적으로 치환되거나 치환되지 않는다.
구조식 (VII)의 일부 실시형태에서, G3은 C2-C24 알킬렌옥사이드 또는 C2-C24 알켄일렌옥사이드이다. 특정 실시형태에서, G3은 치환되지 않는다. 다른 실시형태에서, G3은 치환되고, 예를 들어, 하이드록실로 치환된다. 보다 구체적인 실시형태에서 G3은 C2-C12 알킬렌옥사이드이고, 예를 들어, 일부 실시형태에서 G3은 C3-C7 알킬렌옥사이드이거나 다른 실시형태에서 G3은 C3-C12 알킬렌옥사이드이다.
구조식 (VII)의 다른 실시형태에서, G3은 C2-C24 알킬렌아미닐 또는 C2-C24 알켄일렌아미닐, 예를 들어, C6-C12 알킬렌아미닐이다. 이들 실시형태 중 일부에서, G3은 치환되지 않는다. 이들 실시형태 중 다른 것에서, G3은 C1-C6 알킬로 치환된다.
구조식 (VII)의 일부 실시형태에서, X 및 X'는 각각 N이고, Y 및 Y'는 각각 존재하지 않는다. 다른 실시형태에서, X 및 X'는 각각 CR이고, Y 및 Y'는 각각 NR이다. 이들 실시형태 중 일부에서, R은 H이다.
구조식 (VII)의 특정 실시형태에서, X 및 X'는 각각 CR이고, Y 및 Y'는 각각 독립적으로 -O(C=O)- 또는 -(C=O)O-이다.
구조식 (VII)의 상기 실시형태 중 일부에서, 화합물은 하기 구조식 (VIIA), (VIIB), (VIIC), (VIID), (VIIE), (VIIF), (VIIG) 또는 (VIIH) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00097
Figure pct00098
식 중, Rd는, 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 Rd는 H이다. 다른 실시형태에서, Rd는 C1-C6 알킬, 예컨대, 메틸이다. 다른 실시형태에서, Rd는 치환된 C1-C6 알킬, 예컨대, -O(C=O)R, -(C=O)OR, -NRC(=O)R 또는 -C(=O)N(R)2로 치환된 C1-C6 알킬이되,
R는, 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이다.
구조식 (VII)의 상기 실시형태 중 일부에서, L1 및 L1'는 각각 독립적으로 -O(C=O)R1, -(C=O)OR1 또는 -C(=O)NRbRc이고, L2 및 L2'는 각각 독립적으로 -O(C=O)R2, -(C=O)OR2 또는 -C(=O)NReRf이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 L1 및 L1'는 각각 -(C=O)OR1이고, L2 및 L2'는 각각 -(C=O)OR2이다. 다른 실시형태에서 L1 및 L1'는 각각 -(C=O)OR1이고, L2 및 L2'는 각각 -C(=O)NReRf이다. 다른 실시형태에서 L1 및 L1'는 각각 -C(=O)NRbRc이고, L2 및 L2'는 각각 -C(=O)NReRf이다.
상기 중 일부 실시형태에서, G1, G1', G2 및 G2'는 각각 독립적으로 C2-C8 알킬렌, 예를 들어, C4-C8 알킬렌이다.
구조식 (VII)의 상기 실시형태 중 일부에서, R1 또는 R2는 각각, 각각의 경우에, 독립적으로 분지형 C6-C24 알킬이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, R1 및 R2는 각각의 경우에, 독립적으로 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00099
식 중,
R7a 및 R7b는, 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이고;
a는 2 내지 12이고,
R7a, R7b 및 a는 R1 및 R2가 각각 독립적으로 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하도록 각각 선택된다.
예를 들어, 일부 실시형태에서 a는 5 내지 9 또는 8 내지 12 범위의 정수이다.
구조식 (VII)의 상기 실시형태 중 일부에서, R7a의 적어도 하나의 경우는 H이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, R7a는 각각의 경우에 H이다. 상기 중 다른 상이한 실시형태에서, R7b 중 적어도 하나의 경우는 C1-C8 알킬이다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-부틸, 아이소-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.
구조식 (VII)의 상이한 실시형태에서, R1 또는 R2, 또는 이들 둘 다는 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00100
구조식 (VII)의 상기 실시형태 중 일부에서, 존재하는 경우 Rb, Rc, Re 및
Rf는 각각 독립적으로 C3-C12 알킬이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 존재하는 경우 Rb, Rc, Re 및 Rf는 n-헥실이고, 다른 실시형태에서, 존재하는 경우 Rb, Rc, Re 및 Rf는 n-옥틸이다.
구조식 (VII)의 다양한 상이한 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 표 6에 제시된 구조 중 하나를 갖는다.
Figure pct00101
Figure pct00102
일 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 구조식 (VIII)을 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 전구약물 또는 입체이성질체이다:
Figure pct00103
식 중,
X는 N이고, Y는 존재하지 않거나; X는 CR이고, Y는 NR이고;
L1은 -O(C=O)R1, -(C=O)OR1 -C(=O)R1, -OR1, -S(O)XR1, -S-SR1, -C(=O)SR1, -SC(=O)R1, -NRaC(=O)R1, -C(=O)NRbRc, -NRaC(=O)NRbRc, -OC(=O)NRbRc 또는 -NRaC(=O)OR1이고;
L2는 -O(C=O)R2, -(C=O)OR2, -C(=O)R2, -OR2, -S(O)XR2, -S-SR2, -C(=O)SR2, -SC(=O)R2, -NRdC(=O)R2, -C(=O)NReRf, -NRdC(=O)NReRf, -OC(=O)NReRf; -NRdC(=O)OR2 또는 R2에 대한 직접 결합이고;
L3은 -O(C=O)R3 또는 -(C=O)OR3이고;
G1 및 G2는 각각 독립적으로 C2-C12 알킬렌 또는 C2-C12 알켄일렌이고;
G3 은 C1-C24 알킬렌, C2-C24 알켄일렌, C1-C24 헤테로알킬렌 또는 C2-
C24 헤테로알켄일렌이고;
Ra, Rb, Rd 및 Re는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬 또는 C1-C12 알켄일이고;
Rc 및 Rf는 각각 독립적으로 C1-C12 알킬 또는 C2-C12 알켄일이고;
각각의 R은 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 C1-C24 알킬 또는 C2-C24 알켄일이고;
x는 0, 1 또는 2이고,
각각의 알킬, 알켄일, 알킬렌, 알켄일렌, 헤테로알킬렌 및 헤테로알켄일렌은 달리 명시되지 않는 한 독립적으로 치환되거나 치환되지 않는다.
구조식 (1)의 추가의 실시형태에서,
X는 N이고, Y는 존재하지 않거나; X는 CR이고, Y는 NR이고;
L1은 -O(C=O)R1, -(C=O)OR1 -C(=O)R1, -OR1, -S(O)XR1, -S-SR1, -C(=O)SR1, -SC(=O)R1, -NRaC(=O)R1, -C(=O)NRbRc, -NRaC(=O)NRbRc, -OC(=O)NRbRc 또는 -NRaC(=O)OR1이고;
L2는 -O(C=O)R2, -(C=O)OR2, -C(=O)R2, -OR2, -S(O)XR2, -S-SR2, -C(=O)SR2, -SC(=O)R2, -NRdC(=O)R2, -C(=O)NReRf, -NRdC(=O)NReRf, -OC(=O)NReRf; -NRdC(=O)OR2 또는 R2에 대한 직접 결합이고;
L3은 -O(C=O)R3 또는 -(C=O)OR3이고;
G1 및 G2는 각각 독립적으로 C2-C12 알킬렌 또는 C2-C12 알켄일렌이고;
X가 CR이고, Y가 NR인 경우 G3은 C1-C24 알킬렌, C1-C24 알켄일렌, C1-C24 헤테로알킬렌 또는 C2-C24 헤테로알켄일렌이고; X가 N이고 Y가 존재하지 않는 경우 G3은 C1-C24 헤테로알킬렌 또는 C2-C24 헤테로알켄일렌이고;
Ra, Rb, Rd 및 Re는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬 또는 C1-C12 알켄일이고;
Rc 및 Rf는 각각 독립적으로 C1-C12 알킬 또는 C2-C12 알켄일이고;
각각의 R은 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 C1-C24 알킬 또는 C2-C24 알켄일이고;
x는 0, 1 또는 2이고,
각각의 알킬, 알켄일, 알킬렌, 알켄일렌, 헤테로알킬렌 및 헤테로알켄일렌은 달리 명시되지 않는 한 독립적으로 치환되거나 치환되지 않는다.
구조식 (I)의 다른 실시형태에서,
X는 N이고, Y는 존재하지 않거나, X는 CR이고, Y는 NR이고;
L1은 -O(C=O)R1, -(C=O)OR1 -C(=O)R1, -OR1, -S(O)XR1, -S-SR1, -C(=O)SR1, -SC(=O)R1, -NRaC(=O)R1, -C(=O)NRbRc, -NRaC(=O)NRbRc, -OC(=O)NRbRc 또는 -NRaC(=O)OR1이고;
L2는 -O(C=O)R2, -(C=O)OR2, -C(=O)R2, -OR2, -S(O)XR2, -S-SR2, -C(=O)SR2, -SC(=O)R2, -NRdC(=O)R2, -C(=O)NReRf, -NRdC(=O)NReRf, -OC(=O)NReRf; -NRdC(=O)OR2 또는 R2에 대한 직접 결합이고;
L3은 -O(C=O)R3 또는 -(C=O)OR3이고;
G1 및 G2는 각각 독립적으로 C2-C12 알킬렌 또는 C2-C12 알켄일렌이고;
G3은 C1-C24 알킬렌, C1-C24 알켄일렌, C1-C24 헤테로알킬렌 또는 C2-C24 헤테로알켄일렌이고;
Ra, Rb, Rd 및 Re는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬 또는 C1-C12 알켄일이고;
Rc 및 Rf는 각각 독립적으로 C1-C12 알킬 또는 C2-C12 알켄일이고;
각각의 R은 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 분지형 C6-C24 알킬 또는 분지형 C6-C24 알켄일이고;
x는 0, 1 또는 2이고,
각각의 알킬, 알켄일, 알킬렌, 알켄일렌, 헤테로알킬렌 및 헤테로알켄일렌은 달리 명시되지 않는 한 독립적으로 치환되거나 치환되지 않는다.
구조식 (VIII)의 특정 실시형태에서, G3은 치환되지 않는다. 보다 구체적인 실시형태에서 G3은 C2-C12 알킬렌이고, 예를 들어, 일부 실시형태에서 G3은 C3-C7 알킬렌이거나 다른 실시형태에서 G3은 C3-C12 알킬렌이다. 일부 실시형태에서, G3은 C2 또는 C3 알킬렌이다.
구조식 (VIII)의 다른 실시형태에서, G3은 C1-C12 헤테로알킬렌, 예를 들어, C1-C12 아미닐알킬렌이다.
구조식 (VIII)의 특정 실시형태에서, X는 N이고, Y는 존재하지 않는다. 다른 실시형태에서, X는 CR이고, Y는 NR이며, 예를 들어, 이들 실시형태 중 일부에서 R은 H이다.
구조식 (VIII)의 상기 실시형태 중 일부에서, 화합물은 하기 구조식 (VIIIA), (VIIIB), (VIIIC) 또는 (VIIID) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00104
구조식 (VIII)의 상기 실시형태 중 일부에서, L1은 -O(C=O)R1, -(C=O)OR1 또는 -C(=O)NRbRc이고, L2는 -O(C=O)R2, -(C=O)OR2 또는 -C(=O)NReRf이다.
다른 구체적인 실시형태에서, L1은 -(C=O)OR1이고, L2는 -(C=O)OR2이다. 상기
실시형태 중 임의의 것에서, L3은 -(C=O)OR3이다.
구조식 (VIII)의 상기 실시형태 중 일부에서, G1 및 G2는
각각 독립적으로 C2-C12 알킬렌, 예를 들어, C4-C10 알킬렌이다.
구조식 (VIII)의 상기 실시형태 중 일부에서, R1, R2 및 R3
은 각각 독립적으로 분지형 C6-C24 알킬이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00105
식 중,
R7a 및 R7b는, 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이고;
a는 2 내지 12이고,
R7a, R7b 및 a는 R1 및 R2가 각각 독립적으로 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하도록 각각 선택된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 a는 5 내지 9 또는 8 내지 12 범위의 정수이다.
구조식 (VIII)의 상기 실시형태 중 일부에서, R7a의 적어도 하나의 경우는 H이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, R7a는 각각의 경우에 H이다. 상기 중 다른 상이한 실시형태에서, R7b 중 적어도 하나의 경우는 C1-C8 알킬이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-부틸, 아이소-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.
구조식 (VIII)의 상기 실시형태 중 일부에서, X는 CR이고, Y는 NR이고, R3은 C1-C12 알킬, 예컨대, 에틸, 프로필 또는 부틸이다. 이들 실시형태 중 일부에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 분지형 C6-C24 알킬이다.
구조식 (VIII)의 상이한 실시형태에서, R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00106
구조식 (VIII)의 특정 실시형태에서, R1 및 R2 및 R3은 각각 독립적으로, 분지형 C6-C24 알킬이고, R3은 C1-C24 알킬 또는 C2-C24 알켄일이다.
구조식 (VIII)의 상기 실시형태 중 일부에서, Rb, Rc, Re 및 Rf는 각각 독립적으로 C3-C12 알킬이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 Rb, Rc, Re 및 Rf는 n-헥실이고, 다른 실시형태에서 Rb, Rc, Re 및 Rf는 n-옥틸이다.
구조식 (VIII)의 다양한 상이한 실시형태에서, 화합물은 하기 표 7에 제시된 구조 중 하나를 갖는다.
Figure pct00107
Figure pct00108
일 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 구조식 (IX)를 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 전구약물 또는 입체이성질체이다:
Figure pct00109
식 중,
L1은 -O(C=O)R1, -(C=O)OR1 -C(=O)R1, -OR1, -S(O)XR1, -S-SR1, -C(=O)SR1, -SC(=O)R1, -NRaC(=O)R1, -C(=O)NRbRc, -NRaC(=O)NRbRc, -OC(=O)NRbRc 또는 -NRaC(=O)OR1이고;
L2는 -O(C=O)R2, -(C=O)OR2, -C(=O)R2, -OR2, -S(O)XR2, -S-SR2, -C(=O)SR2, -SC(=O)R2, -NRdC(=O)R2, -C(=O)NReRf, -NRdC(=O)NReRf, -OC(=O)NReRf; -NRdC(=O)OR2 또는 R2에 대한 직접 결합이고;
G1 및 G2는 각각 독립적으로 C2-C12 알킬렌 또는 C2-C12 알켄일렌이고;
G3은 C1-C24 알킬렌, C2-C24 알켄일렌, C3-C8 사이클로알킬렌 또는 C3-C8 사이클로알켄일렌이고;
Ra, Rb, Rd 및 Re는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬 또는 C1-C12 알켄일이고;
Rc 및 Rf는 각각 독립적으로 C1-C12 알킬 또는 C2-C12 알켄일이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 분지형 C6-C24 알킬 또는 분지형 C6-C24 알켄일이고;
R3은 -N(R4)R5이고;
R4는 C1-C12 알킬이고;
R5는 치환된 C1-C12 알킬이고;
x는 0, 1 또는 2이고,
각각의 알킬, 알켄일, 알킬렌, 알켄일렌, 사이클로알킬렌, 사이클로알켄일렌, 아릴 및 아르알킬은 달리 명시되지 않는 한 독립적으로 치환되거나 치환되지 않는다.
구조식 (XI)의 특정 실시형태에서, G3은 치환되지 않는다. 보다 구체적인 실시형태에서 G3은 C2-C12 알킬렌이고, 예를 들어, 일부 실시형태에서 G3은 C3-C7 알킬렌이거나 다른 실시형태에서 G3은 C3-C12 알킬렌이다. 일부 실시형태에서, G3은 C2 또는 C3 알킬렌이다.
화학식 (IX)의 상기 실시형태 중 일부에서, 화합물은 하기 구조식 (IXA)를 갖는다:
Figure pct00110
식 중, y 및 z는 각각 독립적으로 2 내지 12의 정수, 예를 들어, 2 내지 6, 4 내지 10의 정수, 또는 예를 들어, 4 또는 5이다. 특정 실시형태에서, y 및 z는 각각 동일하고, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로부터 선택된다.
구조식 (VIII)의 상기 실시형태 중 일부에서, L1은 -O(C=O)R1, -(C=O)OR1 또는 -C(=O)NRbRc이고, L2는 -O(C=O)R2, -(C=O)OR2 또는 -C(=O)NReRf이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 L1 및 L2는 각각 -(C=O)OR1 및 - (C=O)OR2이다. 다른 실시형태에서 L1은 -(C=O)OR1이고, L2는 -C(=O)NReRf이다. 다른 실시형태에서 L1은 -C(=O)NRbRc이고, L2는 -C(=O)NReRf이다.
상기의 다른 실시형태에서, 화합물은 하기 구조식 (IXB), (IXC), (IXD) 또는 (IXE) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00111
상기 실시형태 중 일부에서, 화합물은 구조식 (IXB)를 갖고, 다른 실시형태에서, 화합물은 구조식 (IXC)를 갖고, 추가의 다른 실시형태에서 화합물은 구조식 (IXD)를 갖는다. 다른 실시형태에서, 화합물은 구조식 (IXE)를 갖는다.
상기의 일부 상이한 실시형태에서, 화합물은 하기 구조식 (IXF), (IXG), (IXH) 또는 (IXJ) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00112
식 중, y 및 z는 각각 독립적으로 2 내지 12의 정수, 예를 들어, 2 내지 6, 예를 들어, 4이다.
구조식 (IX)의 상기 실시형태 중 일부에서, y 및 z는 각각 독립적으로 2 내지 10, 2 내지 8, 4 내지 10 또는 4 내지 7 범위의 정수이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, y는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12이다. 일부 실시형태에서, z는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12이다. 일부 실시형태에서, y 및 z는 동일하지만, 다른 실시형태에서 y 및 z는 상이하다.
구조식 (IX)의 상기 실시형태 중 일부에서, R1 또는 R2, 또는 둘 다는 분지형 C6-C24 알킬이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00113
식 중,
R7a 및 R7b는 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이고;
a는 2 내지 12이고,
R7a, R7b 및 a는 R1 및 R2가 각각 독립적으로 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하도록 각각 선택된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 a는 5 내지 9 또는 8 내지 12 범위의 정수이다.
구조식 (IX)의 상기 실시형태 중 일부에서, R7a의 적어도 하나의 경우는 H이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, R7a는 각각의 경우에 H이다. 상기 중 다른 상이한 실시형태에서, R7b 중 적어도 하나의 경우는 C1-C8 알킬이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-부틸, 아이소-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.
구조식 (IX)의 상이한 실시형태에서, R1 또는 R2, 또는 이들 둘 다는 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00114
구조식 (IX)의 상기 실시형태 중 일부에서, Rb, Rc, Re 및 Rf는 각각 독립적으로 C3-C12 알킬이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 Rb, Rc, Re 및 Rf는 n-헥실이고, 다른 실시형태에서 Rb, Rc, Re 및 Rf는 n-옥틸이다.
구조식 (IX)의 상기 실시형태 중 임의의 것에서, R4는 치환된 또는 비치환된 메틸, 에틸, 프로필, n-부틸, n-헥실, n-옥틸 또는 n-노닐이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 R4는 치환되지 않는다. 다른 실시형태에서, R4는 -ORg, -NRgC(=O)Rh, - C(=O)NRgRh, -C(=O)Rh, -OC(=O)Rh, -C(=O)ORh 및 -ORiOH로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환되고,
Rg는, 각각의 경우에 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
Rh는 각각의 경우에 독립적으로 C1-C6 알킬이고;
Ri는 각각의 경우에 독립적으로 C1-C6 알킬렌이다.
구조식 (IX)의 상기 실시형태 중 임의의 것에서, R5는 치환된 메틸, 에틸, 프로필, n-부틸, n-헥실, n-옥틸 또는 n-노닐이다. 일부 실시형태에서, R5는 치환된 에틸 또는 치환된 프로필이다. 다른 상이한 실시형태에서, R5는 하이드록실로 치환된다. 더 추가의 실시형태에서, R5는 -ORg, - NRgC(-O)Rh, -C(=O)NRgRh, -C(=O)Rh, -OC(=O)Rh, -C(=O)ORh 및 -ORiOH로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환되고,
Rg는, 각각의 경우에 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
Rh는 각각의 경우에 독립적으로 C1-C6 알킬이고;
Ri는, 각각의 경우에 독립적으로 C1-C6 알킬렌이다.
구조식 (IX)의 다른 실시형태에서, R4는 비치환된 메틸이고, R5는 치환된 메틸, 에틸, 프로필, n-부틸, n-헥실, n-옥틸 또는 n-노닐이다. 이들 실시형태 중 일부에서, R5는 하이드록실로 치환된다.
구조식 (IX)의 일부 다른 구체적인 실시형태에서, R3은 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00115
Figure pct00116
구조식 (IX)의 다양한 상이한 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 표 8에 제시된 구조 중 하나를 갖는다.
Figure pct00117
Figure pct00118
Figure pct00119
일 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 구조식 (X)을 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 호변이성질체, 전구약물 또는 입체이성질체이다:
Figure pct00120
식 중,
G1은 -OH, -NR3R4, -(C=O)NR5 또는 -NR3(C=O)R5이고;
G2는 -CH2- 또는 -(C=O)-이고;
R은, 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 OH이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 분지형, 포화 또는 불포화 C12-C36 알킬이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H 또는 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 C1-C6 알킬이고;
R5는 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 C1-C6 알킬이고;
n은 2 내지 6의 정수이다.
일부 실시형태에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 분지형, 포화 또는 불포화 C12-C30 알킬, C12-C20 알킬 또는 C15-C20 알킬이다. 일부 구체적인 실시형태에서, R1 및 R2는 각각 포화된다. 특정 실시형태에서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 불포화된다.
구조식 (X)의 상기 실시형태 중 일부에서, R1 및 R2는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00121
화학식 (X)의 상기 실시형태 중 일부에서, 화합물은 하기 구조식 (XA)를 갖는다:
Figure pct00122
식 중,
R6 및 R7은, 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 C1-C14 알킬이고;
a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 15 범위의 정수이되, 단, R6 및 a, 및 R7 및 b는, R1 및 R2 각각이 각각 독립적으로 분지형, 포화 또는 불포화 C12-C36 알킬이도록 각각 독립적으로 선택된다.
상기 실시형태 중 일부에서, 화합물은 하기 구조식 (XB)를 갖는다:
Figure pct00123
식 중,
R8, R9, R10 및 R11은 각각 독립적으로 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 C4-C12 알킬이되, R8 및 R9, 및 R10 및 R11은 R1 및 R2 각각이 각각 독립적으로 분지형, 포화 또는 불포화 C12-C36 알킬이도록 각각 독립적으로 선택된다. (XB)의 일부 실시형태에서, R8, R9, R10 및 R11은 각각 독립적으로 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 C6-C10 알킬이다. (XB)의 특정 실시형태에서, R8, R9, R10 및 R11 중 적어도 하나는 불포화된다. (XB)의 다른 특정 구체적인 실시형태에서, R8, R9, R10 및 R11 각각은 포화된다.
상기 실시형태 중 일부에서, 화합물은 구조식 (XA)를 갖고, 다른 실시형태에서, 화합물은 구조식 (XB)를 갖는다.
상기 실시형태 중 일부에서, G1은 -OH이고, 일부 실시형태에서 G1은 -NR3R4이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, G1은 -NH2, -NHCH3 또는 -N(CH3)2이다. 특정 실시형태에서, G1은 -(C=O)NR5이다. 특정 실시형태에서, G1은 -NR3(C=O)R5이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 G1은 -NH(C=O)CH3 또는 -NH(C=O)CH2CH2CH3이다.
구조식 (X)의 상기 실시형태 중 일부에서, G2는 -CH2-이다. 일부 상이한 실시형태에서, G2는 -(C=O)-이다.
구조식 (X)의 상기 실시형태 중 일부에서, n은 2 내지 6 범위의 정수이고, 예를 들어, 일부 실시형태에서 n은 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 실시형태에서, n은 2이다. 일부 실시형태에서, n은 3이다. 일부 실시형태에서, n은 4이다.
구조식 (X)의 상기 실시형태 중 특별한 것에서, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 적어도 하나는 비치환된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 비치환된다. 일부 실시형태에서, R3은 치환된다. 다른 실시형태에서 R4는 치환된다. 보다 추가의 실시형태에서, R5는 치환된다. 특정 구체적인 실시형태에서, R3 및 R4 각각은 치환된다. 일부 실시형태에서, R3, R4 또는 R5 상의 치환체는 하이드록실이다. 특정 실시형태에서, R3 및 R4는 각각 하이드록실로 치환된다.
구조식 (X)의 상기 실시형태 중 일부에서, 적어도 하나의 R은 OH이다. 다른 실시형태에서, 각각의 R은 H이다.
구조식 (X)의 다양한 상이한 실시형태에서, 화합물은 하기 표 9에 제시된 구조 중 하나를 갖는다.
Figure pct00124
Figure pct00125
Figure pct00126
Figure pct00127
실시형태 1, 2, 3, 4 또는 5 중 임의의 것에서, LNP는 중성 지질을 추가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, 양이온성 지질 대 중성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1 범위이다. 특정 실시형태에서, 중성 지질은 5 내지 10㏖%, 5 내지 15㏖%, 7 내지 13㏖% 또는 9 내지 11㏖% 범위의 농도로 상기 LNP 중 임의의 것에 존재한다. 특정 구체적인 실시형태에서, 중성 지질은 약 9.5, 10 또는 10.5㏖%의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질 대 중성 지질의 몰비는 약 4.1:1.0 내지 약 4.9:1.0, 약 4.5:1.0 내지 약 4.8:1.0 또는 약 4.7:1.0 내지 4.8:1.0 범위이다. 일부 실시형태에서, 총 양이온성 지질 대 중성 지질의 몰비는 약 4.1:1.0 내지 약 4.9:1.0, 약 4.5:1.0 내지 약 4.8:1.0 또는 약 4.7:1.0 내지 4.8:1.0 범위이다.
실시형태 1, 2, 3, 4 또는 5 중 임의의 것에 사용하기 위한 예시적인 중성 지질은 예를 들어, 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 다이올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 다이올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 다이팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 다이올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 다이올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(DOPE-mal), 다이팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 다이미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 다이스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-다이메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE) 및 1,2-다이엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(트랜스DOPE)을 포함한다. 일 실시형태에서, 중성 지질은 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3포스포콜린(DSPC)이다. 일부 실시형태에서, 중성 지질은 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE 및 SM으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 중성 지질은 DSPC이다.
실시형태 1, 2, 3, 4 또는 5의 다양한 실시형태에서, 개시된 지질 나노입자 중 임의의 것은 스테로이드 또는 스테로이드 유사체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 스테로이드 또는 스테로이드 유사체는 콜레스테롤이다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 39 내지 49몰%, 40 내지 46몰%, 40 내지 44몰%, 40 내지 42몰%, 42 내지 44몰% 또는 44 내지 46몰% 범위의 농도로 존재한다. 특정 구체적인 실시형태에서, 스테로이드는 40, 41, 42, 43, 44, 45 또는 46몰% 농도로 존재한다.
특정 실시형태에서, 양이온성 지질 대 스테로이드의 몰비는 1.0:0.9 내지 1.0:1.2 또는 1.0:1.0 내지 1.0:1.2 범위이다. 이들 실시형태 중 일부에서, 양이온성 지질 대 콜레스테롤의 몰비는 약 5:1 내지 1:1 범위이다.
특정 실시형태에서, 스테로이드는 스테로이드의 32 내지 40㏖% 범위의 농도로 존재한다.
특정 실시형태에서, 총 양이온성 대 스테로이드의 몰비는 1.0:0.9 내지 1.0:1.2 또는 1.0:1.0 내지 1.0:1.2 범위이다. 이들 실시형태 중 일부에서, 총 양이온성 지질 대 콜레스테롤의 몰비는 약 5:1 내지 1:1 범위이다.
특정 실시형태에서, 스테로이드는 스테로이드의 32 내지 40㏖% 범위의 농도로 존재한다.
실시형태 1, 2, 3 4 또는 5의 일부 실시형태에서, LNP는 중합체 접합된 지질을 추가로 포함한다. 실시형태 1, 2, 3 4 또는 5의 다양한 다른 실시형태에서, 중합체 접합된 지질은 페길화된 지질이다. 예를 들어, 일부 실시형태는 페길화된 다이아실글리세롤(PEG-DAG) 예컨대, 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-다이미리스토일글리세롤(PEG-DMG), 페길화된 포스파티딜에탄올로아민(PEG-PE), PEG 석시네이트 다이아실글리세롤(PEG- S-DAG), 예컨대, 4-O-(2',3'-다이(테트라데칸오일옥시)프로필-1-O-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄다이오에이트(PEG-S-DMG), 페길화된 세라마이드(PEG-cer) 또는 PEG 다이알콕시프로필카바메이트, 예컨대, 코-메톡시(폴리에톡시)에틸-N-(2,3-다이(테트라데칸옥시)프로필)카바메이트 또는 2,3-다이(테트라데칸옥시)프로필-N-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)카바메이트를 포함한다
다양한 실시형태에서, 중합체 접합된 지질은 1.0 내지 2.5몰% 범위의 농도로 존재한다. 특정 구체적인 실시형태에서, 중합체 접합된 지질은 약 1.7몰%의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 중합체 접합된 지질은 약 1.5몰% 농도로 존재한다.
특정 실시형태에서, 양이온성 지질 대 중합체 접합된 지질의 몰비는 약 35:1 내지 약 25:1 범위이다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질 대 중합체 접합된 지질의 몰비는 약 100:1 내지 약 20:1 범위이다.
특정 실시형태에서, 총 양이온성 지질(즉, 제1 양이온성 지질과 제2 양이온성 지질의 합) 대 중합체 접합된 지질의 몰비는 약 35:1 내지 약 25:1 범위이다. 일부 실시형태에서, 총 양이온성 지질 대 중합체 접합된 지질의 몰비는 약 100:1 내지 약 20:1 범위이다.
실시형태 1, 2, 3 4 또는 5의 일부 실시형태에서, 페길화된 지질은 존재하는 경우 하기 화학식 (XI), 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 호변이성질체 또는 입체이성질체를 갖는다:
Figure pct00128
식 중,
R12 및 R13은 각각 독립적으로 10 내지 30개 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬 쇄이되, 알킬 쇄는 선택적으로 하나 이상의 에스터 결합에 의해서 개재되고;
w는 30 내지 60 범위의 평균 값을 갖는다.
일부 실시형태에서, R12 및 R13은 각각 독립적으로 12 내지 16개 탄소 원자를 함유하는 선형, 포화 알킬 쇄이다. 다른 실시형태에서, 평균 w는 42 내지 55 범위이고, 예를 들어, 평균 w는 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 또는 55이다. 일부 구체적인 실시형태에서, 평균 w는 약 49이다.
일부 실시형태에서, 페길화된 지질은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00129
식 중, 평균 w는 약 49이다.
실시형태 1, 2, 3 4 또는 5의 일부 실시형태에서, 핵산은 안티센스 및 메신저 RNA로부터 선택된다. 예를 들어, 메신저 RNA는 예를 들어, 면역원성 단백질의 번역에 의해서 면역 반응(예를 들어, 백신으로서)을 유도하기 위해서 사용될 수 있다.
실시형태 1, 2, 3 4 또는 5의 다른 실시형태에서, 핵산은 mRNA이고, LNP에서 mRNA 대 지질 비율(즉, N/P)은 N이 양이온성 지질의 몰을 나타내고, P가 핵산의 일부로서 존재하는 인산염의 몰을 나타낸다.
실시형태에서, 전달 비히클은 미국 특허 공개 제20190314524호에 기재된 지질 또는 이온화 가능한 지질을 포함한다.
본 발명의 일부 실시형태는 생체내에서 핵산의 증가된 활성 및 조성물의 개선된 내약성을 제공하는, 표 10에 열거된 구조로서 본 명세서에 기재된 신규한 양이온성 지질 중 하나 이상을 포함하는 핵산-지질 나노입자 조성물을 제공한다.
일 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 하기 구조식 (XII), 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 호변이성질체, 전구약물 또는 입체이성질체를 갖는다:
Figure pct00130
식 중,
L1　또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)x-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, NRaC(=)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O-이고, L1　또는 L2 중 나머지는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)x-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O- 또는 직접 결합이고;
G1 및 G2는 각각 독립적으로 비치환된 C1-C12 알킬렌 또는 C1-C12 알켄일렌이고;
G3은 C1-C24 알킬렌, C1-C24 알켄일렌, C3-C8 사이클로알킬렌, C3-C8 사이클로알켄일렌이고;
Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 C6-C24 알킬 또는 C6-C24 알켄일이고;
R3은 H, OR5, CN, -C(=O)OR4, -OC(=O)R4 또는 -NR5C(=O)R4이고;
R4는 C1-C12 알킬이고;
R5는 H 또는 C1-C6　알킬이고;
x는 0, 1 또는 2이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 하기 구조식 (XIIA) 또는 (XIIB) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00131
식 중,
A는 3 내지 8-원 사이클로알킬 또는 사이클로알킬렌 고리이고;
R6은, 각각의 경우에, 독립적으로 H, OH 또는 C1-C24 알킬이고;
n은 1 내지 15 범위의 정수이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 구조식 (XIIA)를 갖고, 다른 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 구조식 (XIIB)를 갖는다.
다른 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 하기 구조식 (XIIC) 또는 (XIID) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00132
식 중, y 및 z는 각각 독립적으로 1 내지 12 범위의 정수이다.
일부 실시형태에서, L1　또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 L1 및 L2 각각은 -O(C=O)-이다. 상기 중 임의의 것의 일부 상이한 실시형태에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -(C=O)O- 또는 -O(C=O)-이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 L1 및 L2 각각은 -(C=O)O-이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 하기 구조식 (XIIE) 또는 (XIIF) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00133
.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 하기 구조식 (XIIG), (XIIH), (XIII) 또는 (XIIJ 중 하나를 갖는다:
Figure pct00134
일부 실시형태에서, n은 2 내지 12, 예를 들어, 2 내지 8 또는 2 내지 4 범위의 정수이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, n은 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 실시형태에서, n은 3이다. 일부 실시형태에서, n은 4이다. 일부 실시형태에서, n은 5이다. 일부 실시형태에서, n은 6이다.
일부 실시형태에서, y 및 z는 각각 독립적으로 2 내지 10 범위의 정수이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, y 및 z는 각각 독립적으로 4 내지 9 또는 4 내지 6 범위의 정수이다.
일부 실시형태에서, R6은 H이다. 다른 실시형태에서, R6은 C1-C24　알킬이다. 다른 실시형태에서, R6은 OH이다.
일부 실시형태에서, G3은 치환되지 않는다. 다른 실시형태에서, G3은 치환된다. 다양한 상이한 실시형태에서, G3은 선형 C1-C24 알킬렌 또는 선형 C1-C24 알켄일렌이다.
일부 실시형태에서, R1 또는 R2, 또는 둘 다는 C6-C24　알켄일이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00135
식 중,
R7a 및 R7b는 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이고;
a는 2 내지 12이고,
R7a, R7b 및 a는 R1 및 R2가 각각 독립적으로 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하도록 각각 선택된다.
일부 실시형태에서 a는 5 내지 9 또는 8 내지 12 범위의 정수이다.
일부 실시형태에서, R7a의 적어도 하나의 경우는 H이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, R7a는 각각의 경우에 H이다. 다른 상이한 실시형태에서, R7b 중 적어도 하나의 경우는 C1-C8 알킬이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-부틸, 아이소-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.
상이한 실시형태에서, R1　또는 R2, 또는 둘 다는 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00136
일부 실시형태에서, R3은 -OH, -CN, -C(=O)OR4, -OC(=O)R4 또는 -NHC(=O)R4이다. 일부 실시형태에서, R4는 메틸 또는 에틸이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (1)의 화합물이다:
Figure pct00137
화학식 (1)
식 중,
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고;
L1 및 L3은 각각 독립적으로 -OC(O)-* 또는 -C(O)O-*이되, "*"는 R1 또는 R3에 대한 부착점을 나타내고;
R1 및 R3은 각각 독립적으로 옥소, 할로, 하이드록시, 사이아노, 알킬, 알켄일, 알데하이드, 헤테로사이클릴알킬, 하이드록시알킬, 다이하이드록시알킬, 하이드록시알킬아미노알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알킬, (헤테로사이클릴)(알킬)아미노알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 알킬헤테로아릴, 알킨일, 알콕시, 아미노, 다이알킬아미노, 아미노알킬카보닐아미노, 아미노카보닐알킬아미노, (아미노카보닐알킬)(알킬)아미노, 알켄일카보닐아미노, 하이드록시카보닐, 알킬옥시카보닐, 아미노카보닐, 아미노알킬아미노카보닐, 알킬아미노알킬아미노카보닐, 다이알킬아미노알킬아미노카보닐, 헤테로사이클릴알킬아미노카보닐, (알킬아미노알킬)(알킬)아미노카보닐, 알킬아미노알킬카보닐, 다이알킬아미노알킬카보닐, 헤테로사이클릴카보닐, 알켄일카보닐, 알킨일카보닐, 알킬설폭사이드, 알킬설폭사이드알킬, 알킬설포닐 및 알킬설폰알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 의해서 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C9-C20 알킬 또는 C9-C20 알켄일이다.
일부 실시형태에서, R1과 R3은 동일하다. 일부 실시형태에서, R1과 R3은 상이하다.
일부 실시형태에서, R1 및 R3은 각각 독립적으로 분지형 포화 C9-C20 알킬이다. 일부 실시형태에서, R1 및 R3 중 하나는 분지형 포화 C9-C20 알킬이고, 나머지는 부분지형 포화 C9-C20 알킬이다. 일부 실시형태에서, R1 및 R3은 각각 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00138
다양한 실시형태에서, R2는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00139
Figure pct00140
일부 실시형태에서, R2는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 특허 공개 제WO2019/152848 A1호에 기재된 바와 같을 수 있다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 (1-1) 또는 화학식 (1-2)의 화합물이다:
Figure pct00141
식 중, n, R1, R2 및 R3은 화학식 (1)에 정의된 바와 같다.
상기 화합물 및 조성물에 대한 제조 방법은 본 명세서 하기에 기재되어 있고/있거나 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에 기재된 방법에서 중간체 화합물의 작용기는 적절한 보호기에 의해 보호될 필요가 있을 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이러한 작용기는 예를 들어, 하이드록실, 아미노, 머캅토 및 카복실산을 포함한다. 하이드록실에 적합한 보호기는 예를 들어, 트라이알킬실릴 또는 다이아릴알킬실릴 (예를 들어, t-부틸다이메틸실릴, t-부틸다이페닐실릴 또는 트라이메틸실릴), 테트라하이드로피란일, 벤질 등을 포함한다 아미노, 아미딘오 및 구아니딘오에 적합한 보호기는, 예를 들어, t-부톡시카보닐, 벤질옥시카보닐 등을 포함한다. 머캅토에 적합한 보호기는 예를 들어, -C(O)-R"(식 중, R"는 알킬, 아릴 또는 아릴알킬임), p-메톡시벤질, 트리틸 등을 포함한다. 카복실산에 적합한 보호기는 예를 들어, 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 에스터를 포함한다. 보호기는 당업자에게 공지되어 있고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 표준 기술에 따라 첨가 또는 제거될 수 있다. 보호기의 사용은 예를 들어, 문헌[Green, T. W. and P. G. M. Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis (1999), 3rd Ed., Wiley]에 상세하게 기재되어 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 보호기는 또한 중합체 수지, 예컨대, 왕 수지(Wang resin), 링크 수지(Rink resin,) 또는 2-클로로트리틸-클로라이드 수지일 수 있다.
본 발명의 화합물의 보호된 유도체가 그 자체로 약리학적 활성을 갖지 않을 수 있지만, 이들은 포유동물에게 투여된 후 체내에서 대사되어 약리학적으로 활성인 본 발명의 화합물을 형성할 수 있다는 것이 또한 당업자에게 인식될 것이다. 따라서 이러한 유도체는 전구약물로 설명될 수 있다. 본 발명의 화합물의 모든 전구약물은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
또한, 유리 염기 또는 산 형태로 존재하는 본 발명의 모든 화합물은 당업자에게 공지된 방법에 의해 적절한 무기 또는 유기 염기 또는 산으로 처리함으로써 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 전환될 수 있다. 본 발명의 화합물의 염은 또한 표준 기술에 의해 이의 유리 염기 또는 산 형태로 전환될 수 있다.
하기 반응식은 화학식 (1)의 화합물을 제조하는 예시적인 방법을 예시한다:
Figure pct00142
A1은 당업계에 공지된 방법에 따라 구입하거나 제조한다. 적절한 축합 조건(예를 들어, DCC) 하에서 A1과 다이올 A2의 반응은 에스터/알코올 A3를 생성하고, 이어서 이것을 알데하이드 A4로 산화(예를 들어, PCC 사용)시킬 수 있다. 환원성 아민화 조건 하에서 A4와 아민 A5의 반응은 화학식 (1)의 화합물을 생성한다.
하기 반응식은 화학식 1의 화합물을 제조하는 두 번째 예시적인 방법을 예시하며, 여기서 R1과 R3은 동일하다:
Figure pct00143
보호기를 사용하는 것과 같은 상기 반응식에 대한 변형은 R1과 R3이 상이한 화합물을 생성할 수 있다. 상기 반응식에 대한 보호기의 사용뿐만 아니라 다른 변형 방법은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
당업자는 유사한 방법에 의해 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 조합함으로써 이들 화합물을 제조할 수 있다는 것을 이해한다. 또한, 당업자는 적절한 출발 물질을 사용하고, 합성 매개변수를 변형시킴으로써 본 명세서에 구체적으로 예시되지 않은 화학식 (1)의 다른 화합물을 제조할 수 있다는 것을 이해한다. 일반적으로, 출발 물질은 시그마 알드리치사(Sigma Aldrich), 랑카스터 신쎄시스사(Lancaster Synthesis, Inc.), 메이브리지사(Maybridge), 매트릭스 사이언티픽사(Matrix Scientific), TCI, 및 플루오로켐사(Fluorochem USA) 등과 같은 공급원으로부터 얻거나 당업자에게 공지된 출처에 따라 합성되거나(예를 들어, 문헌[Reactions, Mechanisms, and Structure, 5th edition (Wiley, December 2000)]), 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (2)의 화합물이다:
Figure pct00144
화학식 (2),
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (2)에서 사용된 바와 같이, R1 및 R2는 화학식 (1)에 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 화학식 (2)에서 사용된 바와 같이, R1 및 R2는 각각 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00145
Figure pct00146
Figure pct00147
일부 실시형태에서, 화학식 (2)에서 사용된 바와 같은 R1 및/또는 R2는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 특허 공개 제WO2015/095340 A1호에 기재된 바와 같을 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학식 (2)에서 사용된 바와 같은 R1은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 특허 공개 제WO2019/152557 A1호에 기재된 바와 같을 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학식 (2)에서 사용된 바와 같이, R3은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00148
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (3)의 화합물이다:
Figure pct00149
식 중, X는 -O-, -S- 또는 -OC(O)-*로부터 선택되고, 식 중, *는 R1에 대한 부착점을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (3-1)의 화합물이다:
Figure pct00150
(3-1).
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (3-2)의 화합물이다:
Figure pct00151
(3-2).
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (3-3)의 화합물이다:
Figure pct00152
(3-3).
일부 실시형태에서, 화학식 (3-1), (3-2) 또는 (3-3)에서 사용된 바와 같이, 각각의 R1은 독립적으로 분지형 포화 C9-C20 알킬이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R1은 하기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다:
Figure pct00153
일부 실시형태에서, 화학식 (3-1), (3-2) 또는 (3-3)에서 각각의 R1은 동일하다.
일부 실시형태에서, 화학식 (3-1), (3-2) 또는 (3-3)에서 사용된 바와 같이, R2는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00154
Figure pct00155
일부 실시형태에서, 화학식 (3-1), (3-2) 또는 (3-3)에서 사용된 바와 같은 R2는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 특허 공개 제WO2019/152848A1호에 기재된 바와 같을 수 있다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (5)의 화합물이다:
Figure pct00156
(5),
식 중,
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고;
R2는 화학식 (1)에 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 화학식 (5)에서 사용된 바와 같이, R4 및 R5는 각각 화학식 (1)에서 R1 및 R3으로서 정의된다. 일부 실시형태에서, 화학식 (5)에서 사용된 바와 같이, R4 및 R5는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 특허 공개 제WO2019/191780 A1호에 기재된 바와 같을 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 이온화 가능한 지질은 표 10a로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 표 10a의 지질 26이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 표 10a의 지질 27이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 표 10a의 지질 53이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 표 10a의 지질 54이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 이온화 가능한 지질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00157
[표 10a]
Figure pct00158
Figure pct00159
Figure pct00160
Figure pct00161
Figure pct00162
Figure pct00163
Figure pct00164
Figure pct00165
Figure pct00166
Figure pct00167
Figure pct00168
Figure pct00169
Figure pct00170
Figure pct00171
Figure pct00172
Figure pct00173
Figure pct00174
Figure pct00175
Figure pct00176
Figure pct00177
Figure pct00178
Figure pct00179
Figure pct00180
Figure pct00181
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 베타-하이드록실 아민 헤드기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 감마-하이드록실 아민 헤드기를 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 이온화 가능한 지질은 표 10b로부터 선택된 지질이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 이온화 가능한 지질은 표 10b로부터의 지질 15이다. 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 미국 출원 공보 제US20170210697A1호에 기재되어 있다. 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 미국 출원 공보 제US20170119904A1호에 기재되어 있다.
[표 10b]
Figure pct00182
Figure pct00183
Figure pct00184
Figure pct00185
Figure pct00186
Figure pct00187
Figure pct00188
Figure pct00189
Figure pct00190
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 하기 표 10에 제시된 구조 중 하나를 갖는다.
Figure pct00191
Figure pct00192
Figure pct00193
Figure pct00194
Figure pct00195
Figure pct00196
Figure pct00197
Figure pct00198
Figure pct00199
Figure pct00200
Figure pct00201
Figure pct00202
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 하기 표 11에 제시된 구조 중 하나를 갖는다. 일부 실시형태에서, 표 11에 제시된 바와 같은 이온화 가능한 지질은 국제 특허 출원 제PCT/US2010/061058호에 기재된 바와 같다.
Figure pct00203
Figure pct00204
Figure pct00205
Figure pct00206
Figure pct00207
Figure pct00208
Figure pct00209
Figure pct00210
Figure pct00211
Figure pct00212
Figure pct00213
Figure pct00214
Figure pct00215
Figure pct00216
Figure pct00217
Figure pct00218
Figure pct00219
Figure pct00220
Figure pct00221
Figure pct00222
Figure pct00223
Figure pct00224
Figure pct00225
Figure pct00226
Figure pct00227
Figure pct00228
Figure pct00229
Figure pct00230
Figure pct00231
Figure pct00232
Figure pct00233
Figure pct00234
Figure pct00235
Figure pct00236
Figure pct00237
Figure pct00238
Figure pct00239
Figure pct00240
Figure pct00241
Figure pct00242
Figure pct00243
Figure pct00244
Figure pct00245
Figure pct00246
Figure pct00247
Figure pct00248
Figure pct00249
Figure pct00250
Figure pct00251
Figure pct00252
Figure pct00253
Figure pct00254
Figure pct00255
Figure pct00256
Figure pct00257
Figure pct00258
일부 실시형태에서, 전달 비히클은 지질 A, 지질 B, 지질 C 및/또는 지질 D를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 A, 지질 B, 지질 C 및/또는 지질 D의 포함은 캡슐화 및/또는 엔도솜 탈출을 개선시킨다. 일부 실시형태에서, 지질 A, 지질 B, 지질 C 및/또는 지질 D는 국제 특허 출원 제PCT/US2017/028981호에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 3-((4,44비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔오에이트라고도 불리는 (9Z,12Z)-3-((4,4- 비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카9,12-다이엔오에이트인 지질 A이다. 지질 A는 하기로서 도시될 수 있다:
Figure pct00259
지질 A는 전문이 참조에 의해 포함된 국제 공개 제WO2015/095340호(예를 들어, pp. 84 내지 86)에 따라서 합성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 ((5-((다이메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,1-다이일)비스(데칸오에이트)인 지질 B이다. 지질 B는 하기로서 도시될 수 있다:
Figure pct00260
지질 B는 전문이 참조에 의해 포함된 국제 공개 제WO2014/136086호(예를 들어, pp. 107 내지 09)에 따라서 합성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 2-((4-(((3- (다이메틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)헥사데칸오일)옥시)프로판-1,3-다이일(9Z,9'Z,12Z,12'Z)- 비스(옥타데카-9,12-다이엔오에이트)인 지질 C이다. 지질 C는 하기로서 도시될 수 있다:
Figure pct00261
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 3-(((3-(다이메틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)- 13-(옥탄오일옥시)트라이데실 3-옥틸운데칸오에이트인 지질 D이다. 지질 D는 하기로서 도시될 수 있다:
Figure pct00262
지질 C 및 지질 D는 전문이 참조에 의해 포함된 국제 공개 제WO2015/095340호에 따라서 합성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 미국 출원 공보 제20190321489호에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 참조에 의해 본 명세서에 포함된 국제 특허 공개 제WO 2010/053572호에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 WO 2010/053572의 단락 [00225]에 기재된 C12-200이다.
여러 이온화 가능한 지질이 문헌에 기술되어 있으며, 그 중 다수는 상업적으로 이용 가능하다. 특정 실시형태에서, 이러한 이온화 가능한 지질은 본 명세서에 기재된 전달 비히클에 포함된다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질 N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드 또는 "DOTMA"가 사용된다(문헌[Felgner et al. (Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987)]; 미국 특허 제4,897,355호). DOTMA는 단독으로 제형화되거나 중성 지질, 다이올레오일포스파티딜에탄올아민 또는 "DOPE" 또는 다른 양이온성 또는 비-양이온성 지질과 지질 나노입자에 조합될 수 있다. 다른 적합한 양이온성 지질은 예를 들어, 미국 가특허 61/617,468호(출원일 2012년 5월 29일)(참조에 의해 본 명세서에 포함됨)에 기재된 바와 같은 이온화 가능한 양이온성 지질, 예를 들어, (15Z,18Z)-N,N-다이메틸-6-(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일)테트라코사-15,18-다이엔-1-아민(HGT5000), (15Z,18Z)-N,N-다이메틸-6-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일)테트라코사-4,15,18-트라이엔-1-아민(HGT5001) 및 (15Z,18Z)-N,N-다이메틸-6-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일)테트라코사-5,15,18-트라이엔-1-아민(HGT5002), C12-200(WO 2010/053572에 기재됨), 2-(2,2-다이((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일)-1,3-다이옥솔란-4-일)-N,N-다이메틸에탄아민(DLinKC2-DMA))(WO 2010/042877; 문헌[Semple et al., Nature Biotech. 28:172-176 (2010)] 참조), 2-(2,2-다이((9Z,2Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일)-1,3-다이옥솔란-4-일)-N,N-다이메틸에탄아민(DLin-KC2-DMA), (3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(1H-이미다졸-4-일)프로판오에이트(ICE), (15Z,18Z)-N,N-다이메틸-6-(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일)테트라코사-15,18-다이엔-1-아민(HGT5000), (15Z,18Z)-N,N-다이메틸-6-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일)테트라코사-4,15,18-트라이엔-1-아민(HGT5001), (15Z,18 Z)-N,N-다이메틸-6-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일)테트라코사-5,15,18-트라이엔-1-아민(HGT5002), 5-카복시스퍼밀글리신-다이옥타데실아마이드(DOGS), 2,3-다이올레일옥시-N-[2(스퍼민-카복스아미도)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미늄(DOSPA)(문헌[Behr et al. Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989)]; 미국 특허 제5,171,678호; 제5,334,761호), 1,2-다이올레오일-3-다이메틸암모늄-프로판(DODAP), 1,2-다이올레일다이올레오일-3-트라이메틸암모늄-프로판 또는 (DOTAP)을 포함한다. 고려되는 이온화 가능한 지질은 또한 1,2-다이스트카릴옥시-N,N-다이메틸-3-아미노프로판(DSDMA), 1,2-다이올레일옥시-N,N-다이메틸-3-아미노프로판(DODMA), 1,2-다이리놀레일옥시-N,N-다이메틸-3-아미노프로판(DLinDMA), 1,2-다이리놀렌일옥시-N,N-다이메틸-3-아미노프로판(DLenDMA), N-다이올레일-N,N-다이메틸암모늄 클로라이드(DODAC), N,N-다이스테아릴-N,N-다이메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(1,2-다이미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-다이메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), 3-다이메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-1-(시스,시스-9,12-옥타데카다이엔옥시)프로판(CLinDMA), 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-다이메틸-1-(시스,시스-9',1-2'-옥타데카다이엔옥시)프로판(CpLinDMA), N,N-다이메틸-3,4-다이올레일옥시벤질아민(DMOBA), 1,2-N,N'-다이올레일카바밀-3-다이메틸아미노프로판(DOcarbDAP), 2,3-다이리놀레오일옥시-N,N-다이메틸프로필아민(DLinDAP), 1,2-N,N'-Di리놀레일카바밀-3-다이메틸아미노프로판(DLincarbDAP), 1,2-다이리놀레오일카바밀-3-다이메틸아미노프로판(DLinCDAP), 2,2-다이리놀레일-4-다이메틸아미노메틸-[1,3]-다이옥솔란(DLin-K-DMA), 2,2-다이리놀레일-4-다이메틸아미노에틸-[1,3]-다이옥솔란(DLin-K-XTC2-DMA) 또는 GL67 또는 이들의 혼합물을 포함한다. (문헌[Heyes, J., et al., J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, D V., et al., Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005)]; PCT 공개 제WO2005/121348A1호). 전달 비히클(예를 들어, 지질 나노입자)을 제형화하기 위해서 콜레스테롤계 이온화 가능한 지질을 사용하는 것이 또한 본 발명에서 고려된다. 이러한 콜레스테롤계 이온화 가능한 지질은 단독으로 또는 다른 지질과 조합하여 사용될 수 있다. 적합한 콜레스테롤계 이온화 가능한 지질은 예를 들어, DC-콜레스테롤(N,N-다이메틸-N-에틸카복사미도콜레스테롤) 및 1,4-비스(3-N-올레일아미노-프로필)피페라진(문헌[Gao, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf et al. BioTechniques 23, 139 (1997)]; 미국 특허 제5,744,335호)를 포함한다.
또한 양이온성 지질 예컨대, 다이알킬아미노계, 이미다졸계 및 구아니디늄계 지질이 고려된다. 예를 들어, 참조에 의해 본 명세서에 포함된 국제 출원 제PCT/US2010/058457호에 개시된 바와 같은 이온화 가능한 지질 (3S,10R, 13R, 17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵타n-2-일)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(1H-이미다졸-4-일)프로판오에이트(ICE)의 사용이 또한 고려된다.
또한 이온화 가능한 지질, 예컨대, 다이알킬아미노계, 이미다졸계 및 구아니디늄계 지질이 고려된다. 예를 들어, 특정 실시형태는 1종 이상의 이미다졸계 이온화 가능한 지질, 예를 들어, 이미다졸 콜레스테롤 에스터 또는 "ICE" 지질, 하기 구조식 (XIII)에 나타낸 바와 같은 (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(1H-이미다졸-4-일)프로판오에이트를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 실시형태에서, circRNA의 전달을 위한 전달 비히클은 1종 이상의 이미다졸계 이온화 가능한 지질, 예를 들어, 이미다졸 콜레스테롤 에스터 또는 "ICE" 지질, 하기 구조식 (XIII)에 나타낸 바와 같은 (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2, 3, 4, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(1H-이미다졸-4-일)프로판오에이트를 포함할 수 있다.
Figure pct00263
(XIII)
특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이미다졸계 양이온성 지질 ICE의 융합원성(fusogenicity)은 전통적인 이온화 가능한 지질에 비해 더 낮은 pKa를 갖는 이미다졸기에 의해 촉진되는 엔도솜 파괴와 관련이 있는 것으로 여겨진다. 엔도솜 파괴는 결국 삼투성 팽창 및 리포솜 막의 파괴를 촉진하고, 그 다음 그 안에 로딩된 핵산(들) 내용물의 표적 세포 내로의 형질주입 또는 세포내 방출이 뒤따른다.
이미다졸계 이온화 가능한 지질은 또한 다른 이온화 가능한 지질에 비해 감소된 독성을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 미국 특허 공개 제20190314284호에 의해 기재되어 있다. 특정 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 구조 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10(예를 들어, HGT4001, HGT4002, HGT4003, HGT4004 및/또는 HGT4005)에 기재되어 있다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 절단 가능한 작용기(예를 들어, 다이설파이드)는 (예를 들어, 산화성, 환원성 또는 산성 조건 하에서) 예를 들어, 친수성 작용성 헤드기를 화합물의 친유성 작용성 테일기로부터 해리시킴으로써, 하나 이상의 표적 세포의 지질 이중층에서 상 전이를 용이하게 한다. 예를 들어, 전달 비히클(예를 들어, 지질 나노입자)이 구조 3 내지 10의 지질 중 하나 이상을 포함하는 경우, 하나 이상의 표적 세포의 지질 이중층에서의 상 전이는 circRNA를 하나 이상의 표적 세포로 전달하는 것을 촉진한다.
특정 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 하기 구조식 (XIV)에 의해 기재된다:
Figure pct00264
(XIV)
식 중,
R1은 이미다졸, 구아니디늄, 아미노, 이민, 엔아민, 선택적으로 치환된 알킬 아미노(예를 들어, 알킬 아미노, 예컨대, 다이메틸아미노) 및 피리딜을 포함하거나 이들로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 구조식 XV 및 구조식 XVI으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Figure pct00265
XV
Figure pct00266
XVI
R3 및 R4는 각각 독립적으로 선택적으로 치환된, 가변적인 포화 또는 불포화 C6-C20 알킬 및 선택적으로 치환된, 가변적인 포화 또는 불포화 C6-C20 아실로 이루어진 군으로부터 선택되고; n은 0 또는 임의의 양의 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 초과)이다. 특정 실시형태에서, R3 및 R4는 각각 선택적으로 치환된, 다중불포화 C18 알킬이지만, 다른 실시형태에서 R3 및 R4는 각각 비치환된, 다중불포화 C18 알킬이다. 특정 실시형태에서, R3 및 R4 중 하나 이상은 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔이다.
본 명세서에는 또한 구조식 XIV의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물이 개시되며, R1은 이미다졸, 구아니디늄, 아미노, 이민, 엔아민, 선택적으로 치환된 알킬 아미노(예를 들어, 알킬 아미노, 예컨대, 다이메틸아미노) 및 피리딜을 포함하거나 이들로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는 구조식 XV이고; n은 0 또는 임의의 양의 정수이다. 추가로 본 명세서에는 구조식 XIV의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물이 개시되며, R1은 이미다졸, 구아니디늄, 아미노, 이민, 엔아민, 선택적으로 치환된 알킬 아미노(예를 들어, 알킬 아미노, 예컨대, 다이메틸아미노) 및 피리딜을 포함하거나 이들로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는 구조식 XVI이고; R3 및 R4는 각각 독립적으로 선택적으로 치환된, 가변적인 포화 또는 불포화 C6-C20 알킬 및 선택적으로 치환된, 가변적인 포화 또는 불포화 C6-C20 아실로 이루어진 군으로부터 선택되고; n은 0 또는 임의의 양의 정수이다. 특정 실시형태에서, R3 및 R4는 각각 선택적으로 치환된, 다중불포화 C18 알킬이지만, 다른 실시형태에서 R3 및 R4는 각각 비치환된, 다중불포화 C18 알킬(예를 들어, 옥타데카-9,12-다이엔)이다.
특정 실시형태에서, R1기 또는 헤드-기는 극성 또는 친수성 기(예를 들어, 이미다졸, 구아니디늄 및 아미노기 중 하나 이상)이고, 예를 들어, 구조식 XIV에 도시된 바와 같은, 이황화(S-S) 절단 가능한 링커 기에 의해서 R2 지질기에 결합되어 있다. 다른 고려되는 절단 가능한 링커 기는 예를 들어, 알킬기(예를 들어, C1 내지 C10 알킬)에 결합된(예를 들어, 공유 결합된) 하나 이상의 이황화(S-S) 링커 기를 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, R1 기는 C1-C20 알킬기에 의해서 절단 가능한 링커 기에 공유 결합되거나(예를 들어, n은 1 내지 20임), 대안적으로 절단 가능한 링커 기에 직접 결합될 수 있다(예를 들어, n은 0임). 특정 실시형태에서, 이황화 링커 기는 시험관내 및/또는 생체내에서 절단 가능하다(예를 들어, 효소에 의해서 절단 가능하거나 산성 또는 환원 조건에 노출될 때 절단 가능함).
특정 실시형태에서, 본 발명은 구조식 XVII을 갖는 화합물 5-(((10,13-다이메틸-17-(6-메틸헵타n-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일)다이설파닐)메틸)-1H-이미다졸("HGT4001"이라고 지칭됨)에 관한 것이다.
Figure pct00267
XVII
특정 실시형태에서, 본 발명은 구조식 XVIII을 갖는 화합물 1-(2-(((3S,10R,13R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵타n-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일)다이설파닐)에틸)구아니딘("HGT4002"라고 지칭됨)에 관한 것이다.
Figure pct00268
XVIII
특정 실시형태에서, 본 발명은 구조식 XIX를 갖는 화합물 2-((2,3-비스((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일옥시)프로필)다이설파닐)-N,N-다이메틸에탄아민("HGT4003"이라고 지칭됨)에 관한 것이다.
Figure pct00269
XIX
다른 실시형태에서, 본 발명은 구조식 XX의 구조를 갖는 화합물 5-(((2,3-비스((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일옥시)프로필)다이설파닐)메틸)-1H-이미다졸("HGT4004"라고 지칭됨)에 관한 것이다.
Figure pct00270
XX
추가의 다른 실시형태에서, 본 발명은 구조식 XXI을 갖는 화합물 1-(((2,3-비스((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일옥시)프로필)다이설파닐)메틸)구아니딘("HGT4005"라고 지칭됨)에 관한 것이다.
Figure pct00271
XXI
특정 실시형태에서, 구조 3 내지 10으로 기재된 화합물은 이온화 가능한 지질이다.
화합물 및 특히 구조 3 내지 8로서 기재된 이미다졸계 화합물(예를 들어, HGT4001 및 HGT4004)은 특히 전통적인 이온화 가능한 지질과 비교하여 감소된 독성을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 전달 비히클은 이러한 약제학적 또는 리포솜 조성물에서 다른 더 독성인 이온화 가능한 지질이 감소되거나 달리 제거될 수 있도록 1종 이상의 이미다졸계 이온화 가능한 지질 화합물을 포함한다.
이온화 가능한 지질은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 국제 특허 출원 제PCT/US2019/025246호 및 미국 특허 공개 제2017/0190661호 및 제2017/0114010호에 개시된 것을 포함한다. 이온화 가능한 지질은 하기 표 12, 13, 14 또는 15로부터 선택된 지질을 포함할 수 있다.
Figure pct00272
Figure pct00273
Figure pct00274
Figure pct00275
Figure pct00276
Figure pct00277
Figure pct00278
Figure pct00279
Figure pct00280
Figure pct00281
Figure pct00282
Figure pct00283
Figure pct00284
Figure pct00285
Figure pct00286
Figure pct00287
Figure pct00288
Figure pct00289
Figure pct00290
Figure pct00291
Figure pct00292
Figure pct00293
Figure pct00294
Figure pct00295
Figure pct00296
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 국제 특허 출원 제PCT/US2019/015913호에 기재된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00297
Figure pct00298
Figure pct00299
Figure pct00300
Figure pct00301
Figure pct00302
Figure pct00303
Figure pct00304
Figure pct00305
Figure pct00306
Figure pct00307
Figure pct00308
Figure pct00309
Figure pct00310
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Figure pct00312
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Figure pct00319
Figure pct00320
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Figure pct00329
Figure pct00330
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Figure pct00333
Figure pct00334
Figure pct00335
Figure pct00336
Figure pct00337
Figure pct00338
Figure pct00339
Figure pct00340
Figure pct00341
Figure pct00342
Figure pct00343
Figure pct00344
Figure pct00345
Figure pct00346
Figure pct00347
Figure pct00348
Figure pct00349
Figure pct00350
아민 지질
특정 실시형태에서, 원형 RNA의 전달을 위한 전달 비히클 조성물은 아민 지질을 포함한다. 특정 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 아민 지질이다. 일부 실시형태에서, 아민 지질은 국제 특허 출원 제PCT/US2018/053569호에 기재된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 아민 지질은 (9Z, 12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9, 12-다이엔오에이트인 지질 E이다.
지질 E는 하기로서 도시될 수 있다:
Figure pct00351
지질 E는 국제 공개 제WO2015/095340호(예를 들어, 84 내지 86 페이지)에 따라서 합성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 아민 지질은 지질 E에 대한 등가물이다.
특정 실시형태에서, 아민 지질은 지질 E의 유사체이다. 특정 실시형태에서, 지질 E 유사체는 지질 E의 아세탈 유사체이다. 특정 전달 비히클 조성물에서, 아세탈 유사체는 C4-C12 아세탈 유사체이다. 일부 실시형태에서, 아세탈 유사체는 C5-C12 아세탈 유사체이다. 추가 실시형태에서, 아세탈 유사체는 C5-C10 아세탈 유사체이다. 추가 실시형태에서, 아세탈 유사체는 C4, C5, C6, C7, C9, C10, C11 및 C12 아세탈 유사체로부터 선택된다.
전달 비히클, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 지질 나노입자에서 사용하기에 적합한 아민 지질 및 다른 생분해성 지질은 생체내에서 생분해성이다. 본 명세서에 기재된 아민 지질은 낮은 독성을 갖는다(예를 들어, 10㎎/㎏ 이상의 양에서 유해 효과 없이 동물 모델에서 허용됨). 특정 실시형태에서, 아민 지질을 포함하는 전달 비히클은 아민 지질 중 적어도 75%가 8, 10, 12, 24 또는 48시간, 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 10일 이내에 혈장으로부터 제거되는 것을 포함한다.
생분해성 지질은 예를 들어, WO2017/173054, WO2015/095340 및 WO2014/136086의 생분해성 지질을 포함한다.
지질 제거율은 당업자에게 공지된 방법에 의해서 측정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Maier, M.A., et al. Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics. Mol. Ther. 2013, 21(8), 1570-78] 참조.
아민 지질을 포함하는 전달 비히클 조성물은 증가된 제거율을 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제거율은 지질 제거율, 예를 들어, 지질이 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 제거되는 속도이다. 일부 실시형태에서, 제거율은 RNA 제거율, 예를 들어, circRNA가 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 제거되는 속도이다. 일부 실시형태에서, 제거율은 전달 비히클이 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 제거되는 속도이다. 일부 실시형태에서, 제거율은 조직, 예컨대, 간 조직 또는 비장 조직으로부터 전달 비히클이 제거되는 속도이다. 특정 실시형태에서, 높은 제거율은 실질적인 유해 효과가 없는 안전성 프로파일을 유도한다. 아민 지질 및 생분해성 지질은 순환계 및 조직에서 전달 비히클 축적을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 순환계 및 조직에서의 전달 비히클 축적의 감소는 실질적인 유해 효과 없이 안전성 프로파일을 유도한다.
지질은 이들이 있는 매질의 pH에 따라 이온화될 수 있다. 예를 들어, 약산성 매질에서, 아민 지질과 같은 지질은 양성자화되어 양전하를 가질 수 있다. 반대로, pH가 대략 7.35인 혈액과 같은 약 염기성인 매질에서는 아민 지질과 같은 지질이 양성자화되지 않아 전하를 띠지 않을 수 있다.
전하를 갖는 지질의 능력은 이의 고유 pKa와 관련이 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 아민 지질은 각각 독립적으로 약 5.1 내지 약 7.4 범위의 pKa를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 생체 이용 가능한 지질은 각각 독립적으로 약 5.1 내지 약 7.4 범위의 pKa를 가질 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 아민 지질은 각각 독립적으로 약 5.8 내지 약 6.5 범위의 pKa를 가질 수 있다. 약 5.1 내지 약 7.4 범위의 pKa를 갖는 지질은 생체내, 예를 들어, 간으로의 카고 전달에 효과적이다. 또한, 약 5.3 내지 약 6.4 범위의 pKa를 갖는 지질이 생체내, 예를 들어, 종양으로의 전달에 효과적인 것으로 밝혀져 있다. 예를 들어, 국제 특허 제WO2014/136086호 참조.
이황화 결합을 함유하는 지질
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 미국 특허 제9,708,628호에 기재되어 있다.
본 발명은 구조식 (XXII)에 의해 표현된 지질을 제공한다:
Figure pct00352
구조식 (XXII)에서, Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 하기에 도시된 X1 또는 X2이다.
Figure pct00353
X1에서 R4는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬기이며, 선형, 분지형 또는 사이클릭일 수 있다. 알킬기는 바람직하게는 1 내지 3의 탄소수를 갖는다. 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬기의 구체예는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 아이소프로필기, n-부틸기, sec-부틸기, 아이소부틸기, tert-부틸기, 펜틸기, 아이소펜틸기, 네오펜틸기, t-펜틸기, 1,2-다이메틸프로필기, 2-메틸부틸기, 2-메틸펜틸기, 3-메틸펜틸기, 2,2-다이메틸부틸기, 2,3-다이메틸부틸기, 사이클로헥실기 등을 포함한다. R4는 바람직하게는 메틸기, 에틸기, 프로필기 또는 아이소프로필기이고, 가장 바람직하게는 메틸기이다.
X2에서 s는 1 또는 2이다. s가 1인 경우, X2는 피롤리디늄기이고, s가 2인 경우, X2는 피페리디늄기이다. s는 바람직하게는 2이다. X2의 결합 방향은 제한되지 않지만, X2의 질소 원자는 바람직하게는 R1a 및 R1b에 결합한다.
Xa는 Xb와 동일하거나 상이할 수 있고, Xa는 바람직하게는 Xb와 동일한 기이다.
na 및 nb는 각각 독립적으로 0 또는 1, 바람직하게는 1이다. na가 1인 경우, R3a는 Ya 및 R2a를 통해 Xa에 결합하고, na가 0인 경우에는 R3a-Xa-R1a-S-의 구조를 취한다. 유사하게, nb가 1일 경우, R3b는 Yb 및 R2b를 통해 Xb에 결합하고, nb가 0인 경우, R3b-Xb-R1b-S-의 구조를 취한다.
na는 nb와 동일하거나 상이할 수 있고, na는 바람직하게는 nb와 동일하다.
R1a 및 R1b는 각각 독립적으로 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기이며, 선형 또는 분지형일 수 있으며, 바람직하게는 선형일 수 있다. 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기의 구체예는 메틸렌기, 에틸렌기, 트라이메틸렌기, 아이소프로필렌기, 테트라메틸렌기, 아이소부틸렌기, 펜타메틸렌기, 네오펜틸렌기 등을 포함한다. R1a 및 R1b는 각각 바람직하게는 메틸렌기, 에틸렌기, 트라이메틸렌기, 아이소프로필렌기 또는 테트라메틸렌기이고, 에틸렌기가 가장 바람직하다.
R1a는 R1b와 동일하거나 상이할 수 있고, R1a는 바람직하게는 R1b와 동일한 기이다.
R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기이며, 선형 또는 분지형일 수 있으며, 바람직하게는 선형일 수 있다. 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기의 예는 R1a 또는 R1b에 대해서 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기의 예로서 열거된 것을 포함한다. R2a 및 R2b는 각각 바람직하게는 메틸렌기, 에틸렌기, 트라이메틸렌기, 아이소프로필렌기 또는 테트라메틸렌기이다.
Xa 및 Xb가 각각 X1인 경우, R2a 및 R2b는 바람직하게는 트라이메틸렌기이다. Xa 및 Xb가 각각 X2인 경우, R2a 및 R2b는 바람직하게는 에틸렌기이다.
R2a는 R2b와 동일하거나 상이할 수 있고, R2a는 바람직하게는 R2b와 동일한 기이다.
Ya 및 Yb는 각각 독립적으로 에스터 결합, 아마이드 결합, 카바메이트 결합, 에터 결합 또는 유레아 결합이고, 바람직하게는 에스터 결합, 아마이드 결합 또는 카바메이트 결합이고, 가장 바람직하게는 에스터 결합이다. Ya 및 Yb의 결합 방향은 제한되지 않지만, Ya가 에스터 결합인 경우에는 R3a-CO-O-R2a-의 구조가 바람직하고, Yb가 에스터 결합인 경우에는 R3b-CO-O-R2b-의 구조가 바람직하다.
Ya는 Yb와 동일하거나 상이할 수 있고, Ya는 바람직하게는 Yb와 동일한 기이다.
R3a 및 R3b는 각각 독립적으로 스테롤 잔기, 지용성 비타민 잔기 또는 12 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 지방족 탄화수소기, 바람직하게는 지용성 비타민 잔기 또는 12 내지 22의 탄소 원자를 갖는 지방족 탄화수소기, 가장 바람직하게는 지용성 비타민 잔기이다.
스테롤 잔기의 예는 콜레스테릴기(콜레스테롤 잔기), 콜레스테릴기(콜레스탄올 잔기), 스티그마스테릴기(스티그마스테롤 잔기), β-시토스테릴기(β-시토스테롤 잔기), 라노스테릴기(라노스테롤 잔기), 및 에르고스테릴기(에르고스테롤 잔기) 등을 포함한다. 스테롤 잔기는 바람직하게는 콜레스테릴기 또는 콜레스테아릴기이다.
지용성 비타민 잔기로서, 지용성 비타민으로부터 유래된 잔기뿐만 아니라 지용성 비타민의 작용기인 하이드록실기, 알데하이드 또는 카복실산을 다른 반응성 작용기로 적절히 전환시켜 얻어지는 유도체로부터 유래된 잔기가 사용될 수 있다. 하이드록실기를 갖는 지용성 비타민에 대해서, 예를 들어, 하이드록실기는 석신산 무수물, 글루타르산 무수물 등과 반응시킴으로써 카복실산으로 전환될 수 있다. 지용성 비타민의 예는 레티노산, 레티놀, 레티날, 에르고스테롤, 7-데하이드로콜레스테롤, 칼시페롤, 콜레칼시페롤, 다이하이드로에르고칼시페롤, 다이하이드로타키스테롤, 토코페롤, 토코트라이엔올 등을 포함한다. 지용성 비타민의 바람직한 예는 레티노산 및 토코페롤을 포함한다.
12 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 지방족 탄화수소기는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 바람직하게는 선형일 수 있다. 지방족 탄화수소기는 포화 또는 불포화될 수 있다. 불포화 지방족 탄화수소기의 경우, 지방족 탄화수소기는 일반적으로 1 내지 6개, 바람직하게는 1 내지 3개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 2개의 불포화 결합을 함유한다. 불포화 결합은 탄소-탄소 이중 결합 및 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하지만, 바람직하게는 탄소-탄소 이중 결합이다. 지방족 탄화수소기는 바람직하게는 12 내지 18개, 가장 바람직하게는 13 내기 17개의 탄소수를 갖는다. 지방족 탄화수소기는 알킬기, 알켄일기, 알킨일기 등을 포함하지만, 알킬기 또는 알켄일기가 바람직하다. 12 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 지방족 탄화수소기의 구체적인 예는 도데실기, 트라이데실기, 테트라데실기, 펜타데실기, 헥사데실기, 헵타데실기, 옥타데실기, 노나데실기, 아이코실기, 헤니코실기, 도코실기, 도데센일기, 트라이데센일기, 테트라데센일기, 펜타데센일기, 헥사데센일기, 헵타데센일기, 옥타데센일기, 노나데센일기, 아이코센일기, 헤니코센일기, 도코센일기, 데카다이엔일기, 트라이데카다이엔일기, 테트라데카다이엔일기, 펜타데카다이엔일기, 헥사데카다이엔일기, 헵타데카다이엔일기, 옥타데카다이엔일기, 노나데카다이엔일기, 아이코사다이엔일기, 헤니코사다이엔일기, 도코사다이엔일기, 옥타데카트라이엔일기, 아이코사트라이엔일기, 아이코사테트라엔일기, 아이코사펜타엔일기, 도코사헥사엔일기, 아이소스테아릴기 등을 포함한다. 12 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 지방족 탄화수소기는 바람직하게는 트라이데실기, 테트라데실기, 헵타데실기, 옥타데실기, 헵타데카다이엔일기 또는 옥타데카다이엔일기, 특히 바람직하게는 트라이데실기, 헵타데실기 또는 헵타데카다이엔일기이다.
일 실시형태에서, 지방산, 지방족 알코올 또는 지방족 아민으로부터 유래된 12 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 지방족 탄화수소기가 사용된다. R3a(또는 R3b)가 지방산으로부터 유래된 경우, Ya(또는 Yb)는 에스터 결합 또는 아마이드 결합이고, 지방산-유래된 카보닐 탄소가 Ya(또는 Yb)에 포함된다. 예를 들어, 리놀레산 이 사용되는 경우, R3a(또는 R3b)는 헵타데카다이엔일기이다.
R3a는 R3b와 동일하거나 상이할 수 있고, R3a는 바람직하게는 R3b와 동일한 기이다.
일 실시형태에서, Xa는 Xb와 동일하고, na는 nb와 동일하고, R1a는 R1b와 동일하고, R2a는 R2b와 동일하고, R3a는 R3b와 동일하고, Ya는 Yb와 동일하다.
일 실시형태에서,
Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 X1이고,
R4는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는 알킬기이고, na 및 nb는 각각 1이고,
R1a 및 R1b는 각각 독립적으로 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기이고,
R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기이고,
Ya 및 Yb는 각각 에스터 결합 또는 아마이드 결합이고,
R3a 및 R3b는 각각 독립적으로 12 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 지방족 탄화수소이다.
일 실시형태에서,
Xa 및 Xb는 각각 X1이고,
R4는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는 알킬기이고, na 및 nb는 각각 1이고,
R1a 및 R1b는 각각 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기이고,
R2a 및 R2b는 각각 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기이고,
Ya 및 Yb는 각각 에스터 결합 또는 아마이드 결합이고,
R3a 및 R3b는 각각 12 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 지방족 탄화수소이고,
Xa는 Xb와 동일하고,
R1a는 R1b와 동일하고,
R2a는 R2b와 동일하고,
R3a는 R3b와 동일하다.
일 실시형태에서,
Xa 및 Xb는 각각 X1이고,
R4는 메틸기이고, na 및 nb는 각각 1이고,
R1a 및 R1b는 각각 에틸렌기이고,
R2a 및 R2b는 각각 트라이메틸렌기이고,
Ya 및 Yb는 각각 -CO-O-이고,
R3a 및 R3b는 각각 독립적으로 13 내지 17개의 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 알켄일기이다.
일 실시형태에서,
Xa 및 Xb는 각각 X1이고,
R4는 메틸기이고, na 및 nb는 각각 1이고,
R1a 및 R1b는 각각 에틸렌기이고,
R2a 및 R2b는 각각 트라이메틸렌기이고,
Ya 및 Yb는 각각 -CO-O-이고,
R3a 및 R3b는 각각 13 내지 17개의 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 알켄일기이다.
R3a는 R3b와 동일하다.
일 실시형태에서,
Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 X1이고,
R4는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는 알킬기이고, na 및 nb는 각각 1이고,
R1a 및 R1b는 각각 독립적으로 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기이고,
R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기이고,
Ya 및 Yb는 각각 에스터 결합 또는 아마이드 결합이고,
R3a 및 R3b는 각각 독립적으로 지용성 비타민 잔기(예를 들어, 레틴산 잔기, 토코페롤 잔기)이다.
일 실시형태에서,
Xa 및 Xb는 각각 X1이고,
R4는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는 알킬기이고, na 및 nb는 각각 1이고,
R1a 및 R1b는 각각 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기이고,
R2a 및 R2b는 각각 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기이고,
Ya 및 Yb는 각각 에스터 결합 또는 아마이드 결합이고,
R3a 및 R3b는 각각 지용성 비타민 잔기(예를 들어, 레틴산 잔기, 토코페롤 잔기)이다.
Xa는 Xb와 동일하고,
R1a는 R1b와 동일하고,
R2a는 R2b와 동일하고,
R3a는 R3b와 동일하다.
일 실시형태에서,
Xa 및 Xb는 각각 X1이고,
R4는 메틸기이고, na 및 nb는 각각 1이고,
R1a 및 R1b는 각각 에틸렌기이고,
R2a 및 R2b는 각각 트라이메틸렌기이고,
Ya 및 Yb는 각각 -CO-O-이고,
R3a 및 R3b는 각각 독립적으로 지용성 비타민 잔기(예를 들어, 레틴산 잔기, 토코페롤 잔기)이다.
일 실시형태에서,
Xa 및 Xb는 각각 X1이고,
R4는 메틸기이고, na 및 nb는 각각 1이고,
R1a 및 R1b는 각각 에틸렌기이고,
R2a 및 R2b는 각각 트라이메틸렌기이고,
Ya 및 Yb는 각각 -CO-O-이고,
R3a 및 R3b는 각각 지용성 비타민 잔기(예를 들어, 레틴산 잔기, 토코페롤 잔기)이고,
R3a는 R3b와 동일하다.
일 실시형태에서,
Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 X2이고,
t는 2이고,
R1a 및 R1b는 각각 독립적으로 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기이고,
R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기이고,
Ya 및 Yb는 각각 에스터 결합이고,
R3a 및 R3b는 각각 독립적으로 지용성 비타민 잔기(예를 들어, 레틴산 잔기, 토코페롤 잔기) 또는 12 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 지방족 탄화수소기(예를 들어, 12 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 알킬기)이다.
일 실시형태에서,
Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 X2이고,
t는 2이고,
R1a 및 R1b는 각각 독립적으로 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기이고,
R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기이고,
Ya 및 Yb는 각각 에스터 결합이고,
R3a 및 R3b는 각각 독립적으로 지용성 비타민 잔기(예를 들어, 레틴산 잔기, 토코페롤 잔기) 또는 12 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 지방족 탄화수소기(예를 들어, 12 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 알킬기)이고,
Xa는 Xb와 동일하고,
R1a는 R1b와 동일하고,
R2a는 R2b와 동일하고,
R3a는 R3b와 동일하다.
일 실시형태에서,
Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 X2이고,
t는 2이고,
R1a 및 R1b는 각각 에틸렌기이고,
R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기이고,
Ya 및 Yb는 각각 에스터 결합이고,
R3a 및 R3b는 각각 독립적으로 지용성 비타민 잔기(예를 들어, 레틴산 잔기, 토코페롤 잔기) 또는 12 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 지방족 탄화수소기(예를 들어, 12 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 알킬기)이고,
Xa는 Xb와 동일하고,
R2a는 R2b와 동일하고,
R3a는 R3b와 동일하다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 하기 표 15b에 제시된 구조 중 하나를 갖는다.
[표 15b]
Figure pct00354
Figure pct00355
Figure pct00356
Figure pct00357
본 발명의 지질은 -S-S-(이황화) 결합을 가질 수 있다. 상기 화합물의 제조 방법은 예를 들어,
R3a-(Ya-R2a)na-Xa-R1a-SH, 및
R3b-(Yb-R2b)nb-Xb-R1b-SH
를 제조하는 단계, 및 이들을 산화(커플링)시켜 -S-S-를 함유하는 화합물을 제공하는 단계를 포함하는 방법 및 -S-S- 결합을 함유하는 화합물에 필요한 부분을 순차적으로 결합시켜 최종적으로 본 발명의 화합물을 얻는 단계를 포함하는 방법 등을 포함한다. 바람직한 것은 후자 방법이다.
후자 방법의 구체적인 예는 하기에 제시되어 있지만, 이것은 제한으로 간주되지 않는다.
출발 화합물의 예는 -S-S- 결합을 함유하는 2개의 말단 카복실산, 2개의 말단 카복실레이트, 2개의 말단 아민, 2개의 말단 아이소사이아네이트, 2개의 말단 알코올, 이탈기, 예컨대, MsO(메실레이트기) 등을 갖는 2개의 말단 알코올 및 이탈기, 예컨대, pNP(p-나이트로페닐카보네이트기)를 갖는 2개의 말단 카보네이트 등을 포함한다.
예를 들어, Xa 및 Xb의 경우 X1 또는 X2를 함유하는 화합물이 생성되는 경우, -S-S- 결합을 함유하는 화합물 (1)의 2개의 말단 작용기를 말단에 하나의 작용기 및 -NH-기를 갖는 화합물 (2)의 -NH-기와 반응시키고, 그 반응에 기여하지 않은 화합물 (2)의 말단의 작용기를 R3을 함유한 화합물 (3)의 작용기와 반응시키고, 이에 의해서 -S-S- 결합, R1a 및 R1b, Xa 및 Xb, R2a 및 R2b, Ya 및 Yb, 및 R3a 및 R3b를 함유하는 본 발명의 화합물을 얻을 수 있다.
화합물 (1)과 화합물 (2)의 반응에서, 알칼리 촉매, 예컨대, 탄산칼륨, 탄산나트륨, 칼륨 t-부톡사이드 등을 촉매로 사용할 수 있거나, 촉매 없이 반응을 수행할 수 있다. 바람직하게는, 탄산칼륨 또는 탄산나트륨이 촉매로 사용된다.
촉매의 양은 화합물 (1)에 대해 0.1 내지 100몰 당량, 바람직하게는 0.1 내지 20몰 당량, 보다 바람직하게는 0.1 내지 5몰 당량이다. 충전될 화합물 (2)의 양은 화합물 (1)에 대해 1 내지 50몰 당량, 바람직하게는 1 내지 10몰 당량이다.
화합물 (1)과 화합물 (2)의 반응에 사용하는 용매는 반응을 저해하지 않는 용매 또는 수용액이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 에틸 아세테이트, 다이클로로메탄, 클로로폼, 벤젠, 톨루엔 등을 언급할 수 있다. 그 중에서도 톨루엔, 클로로폼이 바람직하다.
반응 온도는 -20 내지 200℃, 바람직하게는 0 내지 80℃, 보다 바람직하게는 20 내지 50℃이고, 반응 시간은 1 내지 48시간, 바람직하게는 2 내지 24시간이다.
화합물 (1)과 화합물 (2)의 반응 생성물을 화합물 (3)과 반응시키는 경우, 알칼리 촉매, 예컨대, 탄산칼륨, 탄산나트륨, 칼륨 t-부톡사이드 등 또는 산 촉매, 예컨대, PTS(p-톨루엔설폰산), MSA(메탄설폰산) 등, 예컨대, 화합물 (1)과 화합물 (2)의 반응에 사용되는 촉매를 사용할 수 있거나, 촉매 없이 반응을 수행할 수 있다.
또한, 화합물 (1) 및 화합물 (2)의 반응 생성물을 축합제, 예컨대, DCC(다이사이클로헥실카보다이이미드), DIC(다이아이소프로필카보다이이미드), EDC(1-에틸 -3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 염산염) 등을 사용함으로써 화합물 (3)과 직접 반응시킬 수 있다. 대안적으로는, 화합물 (3)을 축합제로 처리하여 일단 무수물 등으로 전환시키고, 그 후 그것을 화합물 (1)과 화합물 (2)의 반응 생성물과 반응시킬 수 있다.
충전될 화합물 (3)의 양은 화합물 (1)과 화합물 (2)의 반응 생성물에 대해 1 내지 50몰 당량, 바람직하게는 1 내지 10몰 당량이다.
사용될 촉매는 반응될 작용기에 따라서 적절하게 선택된다.
촉매의 양은 화합물 (1)에 대해 0.05 내지 100몰 당량, 바람직하게는 0.1 내지 20몰 당량, 보다 바람직하게는 0.2 내지 5몰 당량이다.
화합물 (1)과 화합물 (2)의 반응 생성물과 화합물 (3)의 반응에 사용하는 용매는 반응을 저해하지 않는 용매 또는 수용액이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 에틸 아세테이트, 다이클로로메탄, 클로로폼, 벤젠, 톨루엔 등을 언급할 수 있다. 그 중에서도 톨루엔, 클로로폼이 바람직하다.
반응 온도는 0 내지 200℃, 바람직하게는 0 내지 120℃, 보다 바람직하게는 20 내지 50℃이고, 반응 시간은 1시간 내지 48시간, 바람직하게는 2 내지 24시간이다.
상기에 언급된 반응에 의해 수득된 반응 생성물은 일반적인 정제 방법, 예를 들어, 물로의 세척, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피, 결정화, 재결정화, 액체-액체 추출, 재침전, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 등에 의해 적절하게 정제될 수 있다.
구조식 XXIII 지질
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 미국 특허 제9,765,022호에 기재되어 있다.
본 발명은 구조식 (XXIII)에 의해 표현된 화합물을 제공한다:
Figure pct00358
구조식 XXIII에서, 친수성 및 선택적으로 양으로 하전된 헤드는 다음과 같다:
Figure pct00359
식 중, Ra, Ra', Ra" 및 Ra"' 각각은 독립적으로, H, C1-C20 1가 지방족 라디칼, C1-C20 1가 헤테로지방족 라디칼, 1가 아릴 라디칼 또는 1가 헤테로아릴 라디칼이고, Z는 C1-C20 2가 지방족 라디칼, C1-C20 2가 헤테로지방족 라디칼, 2가 아릴 라디칼 또는 2가 헤테로아릴 라디칼이고; B는 C1-C24 1가 지방족 라디칼, C1-C24 1가 헤테로지방족 라디칼, 1가 아릴 라디칼, 1가 헤테로아릴 라디칼 또는
Figure pct00360
이고, R1 및 R4는 독립적으로, 결합, C1-C10 2가 지방족 라디칼, C1-C10 2가 헤테로지방족 라디칼, 2가 아릴 라디칼 또는 2가 헤테로아릴 라디칼이고; R2 및 R5 각각은 독립적으로, 결합, C1-C20 2가 지방족 라디칼, C1-C20 2가 헤테로지방족 라디칼, 2가 아릴 라디칼 또는 2가 헤테로아릴 라디칼이고; R3 및 R6 각각은 독립적으로, C1-C20 1가 지방족 라디칼, C1-C20 1가 헤테로지방족 라디칼, 1가 아릴 라디칼 또는 1가 헤테로아릴 라디칼이고;
Figure pct00361
소수성 테일 및
Figure pct00362
또한 소수성 테일 각각은 8 내지 24개의 탄소 원자를 갖고; X, 링커 및 Y, 또한 링커 각각은 독립적으로 하기이다:
Figure pct00363
식 중, m, n, p, q 및 t 각각은, 독립적으로, 1 내지 6이고; W는 O, S 또는 NRc이고; R1, R2, R4 또는 R5에 직접 연결된 L1, L3, L5, L7 및 L9는 독립적으로 결합, O, S 또는 NRd이고; L2, L4, L6, L8 및 L10 각각은 독립적으로 결합, O, S 또는 NRe이고; V는 ORf, SRg 또는 NRhRi이고; Rb, Rc, Rd, Re, Rf, Rg, Rh 및 Ri 각각은 독립적으로 H, OH, C1-10 옥시지방족 라디칼, C1-C10 1가 지방족 라디칼, C1-C10 1가 헤테로지방족 라디칼, 1가 아릴 라디칼 또는 1가 헤테로아릴 라디칼이다.
상기에 기재된 지질-유사 화합물의 하위세트는 A가
Figure pct00364
또는
Figure pct00365
이고, Ra 및 Ra' 각각이 독립적으로, C1-C10 1가 지방족 라디칼, C1-C10 1가 헤테로지방족 라디칼, 1가 아릴 라디칼 또는 1가 헤테로아릴 라디칼이고; Z가 C1-C10 2가 지방족 라디칼, C1-C10 2가 헤테로지방족 라디칼, 가 아릴 라디칼, 또는 2가 헤테로아릴 라디칼인 것을 포함한다.
본 발명의 일부 지질-유사 화합물은 R1 및 R4 각각이 독립적으로 C1-C6(예를 들어, C1-C4) 2가 지방족 라디칼 또는 C1-C6(예를 들어, C1-C4) 2가 헤테로지방족 라디칼이고, R2 및 R3에 대한 총 탄소 수가 12 내지 20(예를 들어, 14 내지 18)개이고, R5 및 R6의 총 탄소 수가 또한 12 내지 20(예를 들어, 14 내지 18)개이고, X 및 Y 각각이 독립적으로
Figure pct00366
Figure pct00367
인 것을 특징으로 한다.
X 및 Y의 구체적인 예는
Figure pct00368
Figure pct00369
을 포함하고, m은 2 내지 6이다.
추가로 본 발명의 범주 내에는 단백질 및 생체환원성(bioreducible) 화합물로 형성된 나노복합체를 함유하는 약제학적 조성물이 있다. 이러한 약제학적 조성물에서, 나노복합체는 50 내지 500㎚의 입자 크기를 갖고; 생체환원성 화합물은 이황화 소수성 모이어티, 친수성 모이어티 및 이황화 소수성 모이어티와 친수성 모이어티를 연결하는 링커를 함유하고; 단백질은 비-공유 상호작용, 공유 결합 또는 둘 다를 통해 생체 환원성 화합물에 결합한다.
특정 실시형태에서, 이황화 소수성 모이어티는 하나 이상의 -S-S-기 및 8 내지 24개의 탄소 원자를 함유하는 헤테로지방족 라디칼이고; 친수성 모이어티는 1개 이상의 친수성 기 및 1 내지 20개의 탄소 원자를 함유하는 지방족 또는 헤테로지방족 라디칼이며, 친수성 기 각각은 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 트라이알킬아미노, 테트라알킬암모늄, 하이드록시아미노, 하이드록실, 카복실, 카복실레이트, 카바메이트, 카바마이드, 카보네이트, 포스페이트, 포스파이트, 설페이트, 설파이트 또는 티오설페이트이고; 링커는 O, S, Si, C1-C6 알킬렌,
Figure pct00370
Figure pct00371
또는
Figure pct00372
이고, 식 중 변수는 상기에 정의되어 있다.
X 및 Y의 구체적인 예는 O, S, Si, C1-C6 알킬렌,
Figure pct00373
Figure pct00374
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 구조식 XXIII에 도시된 바와 같은 본 발명의 지질-유사 화합물은 (i) 친수성 헤드, A; (ii) 소수성 테일, R2-S-S-R3; 및 (iii) 링커, X를 포함한다. 선택적으로, 이들 화합물은 제2 소수성 테일, R5-S-S-R6 및 제2 링커, Y를 함유한다.
구조식 XXIII의 친수성 헤드는 하나 이상의 친수성 작용기, 예를 들어, 하이드록실, 카보닐, 카복실, 아미노, 설프하이드릴, 포스페이트, 아마이드, 에스터, 에터, 카바메이트, 카보네이트, 카바마이드 및 포스포다이에스터를 함유한다. 이러한 기는 수소 결합을 형성할 수 있고, 선택적으로 양으로 또는 음으로 하전된다.
친수성 헤드의 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00375
Figure pct00376
다른 예는 문헌[Akinc et al., Nature Biotechnology, 26, 561-69 (2008)] 및 Mahon 등의 미국 특허 출원 공개 제2011/0293703호에 기재된 것을 포함한다.
구조식 XXIII의 소수성 테일은 이황화 결합 및 8 내지 24개의 탄소 원자를 함유하는 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 비사이클릭 또는 사이클릭, 방향족 또는 비방향족 탄화수소 모이어티이다. 탄소 원자 중 하나 이상은 헤테로원자, 예컨대, N, O, P, B, S, Si, Sb, Al, Sn, As, Se 및 Ge로 대체될 수 있다. 테일은 상기에 기재된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된다. 이러한 이황화 결합을 함유하는 지질-유사 화합물은 생체 환원성일 수 있다.
예는 하기를 포함한다:
Figure pct00377
.
구조식 XXIII의 링커는 친수성 헤드 및 소수성 테일을 연결한다. 링커는 친수성 또는 소수성, 극성 또는 비극성, 예를 들어, O, S, Si, 아미노, 알킬렌, 에스터, 아마이드, 카바메이트, 카바마이드, 카보네이트, 포스페이트, 포스파이트, 설페이트, 설파이트 및 티오설페이트인 임의의 화학기일 수 있다. 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00378
.
본 발명의 예시적인 지질-유사 화합물이 하기에 제시되어 있다:
Figure pct00379
Figure pct00380
Figure pct00381
.
구조식 XXIII의 지질-유사 화합물은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해서 제조될 수 있다. 문헌[Wang et al., ACS Synthetic Biology, 1, 403-07 (2012); Manoharan 등의 국제 특허 출원 공개 제WO 2008/042973호; 및 Zugates 등의 미국 특허 제8,071,082호 참조. 하기에 도시된 경로는 이들 지질-유사 화합물의 합성을 예시한다:
Figure pct00382
La, La', L 및 L' 각각은 L1 내지 L10 중 하나일 수 있고; Wa 및 Wb 각각은 독립적으로 W 또는 V이고; Ra 및 R1 내지 R6뿐만 아니라 L1 내지 L10, W 및 V는 상기에 정의되어 있다.
이러한 예시적인 합성 경로에서, 아민 화합물, 즉, 화합물 D를 브로마이드 E1 및 E2와 반응시켜 화합물 F를 형성하고, 그 다음 이것을 G1 및 G2 둘 다와 커플링시켜 최종 생성물 즉, 화합물 H를 얻는다. 이 화합물(상기에 도시됨)의 이중 결합 중 하나 또는 둘 다를 1개 또는 2개의 단일 결합으로 환원시켜 구조식 XXIII의 상이한 지질-유사 화합물을 얻을 수 있다.
본 발명의 다른 지질-유사 화합물은 상기에 기재된 합성 경로 및 당업계에 공지된 다른 경로를 통해서 다른 적합한 출발 물질로부터 제조될 수 있다. 상기에 언급된 방법은 지질-유사 화합물의 합성을 궁극적으로 허용하기 위해서 적합한 보호기를 첨가하거나 제거하는 추가 단계(들)를 포함할 수 있다. 또한, 다양한 합성 경로는 대안적인 순서로 또는 목적하는 물질을 제공하기 위해서 수행될 수 있다. 사용 가능한 지질-유사 화합물을 합성하는 데 유용한 합성 화학 변형 및 보호기 방법론은 예를 들어, 문헌[R. Larock, Comprehensive Organic Transformations (2nd Ed., VCH Publishers 1999); P. G. M. Wuts and T. W. Greene, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis (4th Ed., John Wiley and Sons 2007); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser' s Reagents for Organic Synthesis (John Wiley and Sons 1994); 및 L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis (2nd ed., John Wiley and Sons 2009)] 및 이들의 후속 판을 비롯하여 당업계에 공지되어 있다. 특정 지질-유사 화합물은 비-방향족 이중 결합 및 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있다. 따라서, 이들은 라세미체 및 라세미 혼합물, 단일 거울상이성질체, 개별 부분입체이성질체, 부분입체이성질체 혼합물 및 시스 또는 트랜스-이성질체 형태로 발생할 수 있다. 이러한 모든 이성질체 형태가 고려된다.
상기에 언급된 바와 같이, 이러한 지질-유사 화합물은 약제의 전달에 유용하다. 이것은 시험관내 검정에 의해 약제 전달 효능에 대해 사전 스크리닝된 후 동물 실험 및 임상 시험을 통해 확인될 수 있다. 다른 방법도 당업자에게 명백할 것이다.
어떠한 이론에도 얽매이고자 함 없이, 구조식 XXIII의 지질-유사 화합물은 복합체, 예를 들어, 나노복합체 및 마이크로입자를 형성함으로써 약제의 전달을 촉진한다. 양으로 또는 음으로 하전된 이러한 지질-유사 화합물의 친수성 헤드는 반대로 하전된 약제의 모이어티에 결합하고, 이의 소수성 모이어티는 약제의 소수성 모이어티에 결합한다. 결합은 공유 또는 비공유일 수 있다.
상기에 기재된 복합체는 간행물, 예컨대, [Wang et al., ACS Synthetic Biology, 1, 403-07 (2012)]에 기재된 절차를 사용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 이들은 완충액, 예컨대, 아세트산나트륨 완충액 또는 인산염 완충 식염수("PBS")에서 지질-유사 화합물 및 약제를 인큐베이션시킴으로써 얻어진다.
친수성 기
특정 실시형태에서, 선택된 친수성 작용기 또는 모이어티는 (예를 들어, 화합물이 성분인 지질 나노입자의 형질주입 효율을 개선시킴으로써) 화합물 또는 이러한 화합물이 성분인 전달 비히클에 특성을 변경하거나 달리 부여할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 화합물에서 친수성 헤드-기로서 구아니디늄의 혼입은 하나 이상의 표적 세포의 세포막과 이러한 화합물(또는 이러한 화합물이 성분인 전달 비히클)의 융합원성을 촉진할 수 있고, 이에 의해서 예를 들어, 상기 화합물의 형질주입 효율을 향상시킬 수 있다. 친수성 구아니디늄 모이어티의 질소는 상호작용에 안정성을 부여하여 캡슐화된 물질의 세포 흡수를 허용하는 6-원 고리 전이 상태를 형성한다고 가정되었다(문헌[Wender, et al., Adv. Drug Del. Rev. (2008) 60: 452-472]). 유사하게, 하나 이상의 아미노기 또는 모이어티를 개시된 화합물(예를 들어, 헤드-기로서)에 혼입하는 것은 이러한 아미노기의 융합원성을 이용하여 표적 세포의 엔도솜/리소솜 막의 파괴를 추가로 촉진할 수 있다. 이것은 조성물의 아미노기의 pKa뿐만 아니라 육각형 상 전이를 겪고 표적 세포 표면, 즉, 소포막과 융합하는 아미노기의 능력에 기초한다 (문헌[Koltover, et al. Science (1998) 281: 78-81]). 그 결과는 소포막의 파괴 및 표적 세포로의 지질 나노입자 내용물의 방출을 촉진하는 것으로 여겨진다.
유사하게, 특정 실시형태에서, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 화합물에서 친수성 헤드-기로서 이미다졸의 혼입은 예를 들어, 전달 비히클에 캡슐화된 내용물(예를 들어, 지질 나노입자)의 엔도솜 또는 리소좀 방출을 촉진하는 역할을 할 수 있다. 이러한 향상된 방출은 양성자-스폰지 매개 파괴 기전 및/또는 향상된 융합원성 기전 중 하나 또는 둘 모두에 의해 달성될 수 있다. 양성자-스폰지 기전은 엔도솜의 산성화를 완충하는 화합물, 특히 화합물의 작용성 모이어티 또는 기의 능력에 기초한다. 이는 화합물의 pKa 또는 이러한 화합물을 포함하는 하나 이상의 작용기(예를 들어, 이미다졸)의 pKa에 의해 조작되거나 달리 제어될 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 이미다졸계 화합물(예를 들어, HGT4001 및 HGT4004)의 융합원성은 엔도솜 파괴 특성과 관련되는데, 이는 다른 전통적인 이온화 가능한 지질에 비해 더 낮은 pKa를 갖는 이러한 이미다졸기에 의해 촉진된다. 이러한 엔도솜 파괴 특성은 차례로 삼투성 팽창 및 리포솜 막의 파괴를 촉진하고, 그 다음 그 안에 로딩되거나 캡슐화된 폴리뉴클레오타이드 물질의 표적 세포 내로의 형질주입 또는 세포내 방출이 뒤따른다. 이 현상은 이미다졸 모이어티 외에도 바람직한 pKa 프로파일을 갖는 다양한 화합물에 적용할 수 있다. 이러한 구체예는 또한 폴리아민, 폴리펩타이드(히스티딘), 및 질소계 수지상 구조와 같은 다중 질소계 작용기를 포함한다.
예시적인 이온화 가능한 및/또는 양이온성 지질은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 국제 PCT 특허 공개 제WO2015/095340호, 제WO2015/199952호, 제WO2018/011633호, 제WO2017/049245호, 제WO2015/061467호, 제WO2012/040184호, 제WO2012/000104호, 제WO2015/074085호, 제WO2016/081029호, 제WO2017/004143호, 제WO2017/075531호, 제WO2017/117528호, 제WO2011/022460호, 제WO2013/148541호, 제WO2013/116126호, 제WO2011/153120호, 제WO2012/044638호, 제WO2012/054365호, 제WO2011/090965호, 제WO2013/016058호, 제WO2012/162210호, 제WO2008/042973호, 제WO2010/129709호, 제WO2010/144740호, 제WO20 12/099755호, 제WO2013/049328호, 제WO2013/086322호, 제WO2013/086373호, 제WO2011/071860호, 제WO2009/132131호, 제WO2010/048536호, 제WO2010/088537호, 제WO2010/054401호, 제WO2010/054406호, 제WO2010/054405호, 제WO2010/054384호, 제WO2012/016184호, 제WO2009/086558호, 제WO2010/042877호, 제WO2011/000106호, 제WO2011/000107호, 제WO2005/120152호, 제WO2011/141705호, 제WO2013/126803호, 제WO2006/007712호, 제WO2011/038160호, 제WO2005/121348호, 제WO2011/066651호, 제WO2009/127060호, 제WO2011/141704호, 제WO2006/069782호, 제WO2012/031043호, 제WO2013/006825호, 제WO2013/033563호, 제WO2013/089151호, 제WO2017/099823호, 제WO2015/095346호 및 제WO2013/086354호, 및 미국 특허 공개 호US2016/0311759호, 제US2015/0376115호, 제US2016/0151284호, 제US2017/0210697호, 제US2015/0140070호, 제US2013/0178541호, 제US2013/0303587호, 제US2015/0141678호, 제US2015/0239926호, 제US2016/0376224호, 제US2017/0119904호, 제US2012/0149894호, 제US2015/0057373호, 제US2013/0090372호, 제US2013/0274523호, 제US2013/0274504호, 제US2013/0274504호, 제US2009/0023673호, 제US2012/0128760호, 제US2010/0324120호, 제US2014/0200257호, 제US2015/0203446호, 제US2018/0005363호, 제US2014/0308304호, 제US2013/0338210호, 제US2012/0101148호, 제US2012/0027796호, 제US2012/0058144호, 제US2013/0323269호, 제US2011/0117125호, 제US2011/0256175호, 제US2012/0202871호, 제US2011/0076335호, 제US2006/0083780호, 제US2013/0123338호, 제US2015/0064242호, 제US2006/0051405호, 제US2013/0065939호, 제US2006/0008910호, 제US2003/0022649호, 제US2010/0130588호, 제US2013/0116307호, 제US2010/0062967호, 제US2013/0202684호, 제US2014/0141070호, 제US2014/0255472호, 제US2014/0039032호, 제US2018/0028664호, 제US2016/0317458호 및 제US2013/0195920에 기재되어 있다. 국제 특허 출원 제WO 2019/131770호 또한 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
8. PEG 지질
바람직하게는 본 명세서에 개시된 화합물 중 하나 이상 및 지질과 조합하여, 본 명세서에 기재된 리포솜 및 약제학적 조성물에서 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-변형된 인지질 및 유도체화된 지질, 예컨대 유도체화된 세라마이드(PEG-CER), 예컨대, N-옥탄일-스핑고신-1-[석신일(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-2000](C8 PEG-2000 세라마이드)을 사용하고, 이를 포함시키는 것이 고려된다. 고려되는 PEG-변형된 지질은 C6-C20 길이의 알킬 쇄(들)를 갖는 지질에 공유 부착된 최대 5kDa 길이의 폴리에틸렌 글리콜 쇄를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 PEG-변형된 지질은 1,2-다이미리스토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜(2000 MW PEG) "DMG-PEG2000"이다. PEG-변형된 지질을 지질 전달 비히클에 첨가하는 것은 복합체 응집을 방지할 수 있고, 또한 원형화 수명을 증가시키고, 표적 조직으로의 지질-폴리뉴클레오타이드 조성물의 전달을 증가시키기 위한 수단을 제공할 수 있거나(문헌[Klibanov et al. (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237]) 또는 이들은 생체내에서 제형 외부로 신속하게 교환되도록 선택될 수 있다(미국 특허 제5,885,613호 참조). 특히 유용한 교환 가능한 지질은 더 짧은 아실 쇄를 갖는 PEG-세라마이드(예를 들어, C14 또는 C18)이다. 본 발명의 PEG-변형된 인지질 및 유도체화된 지질은 리포솜 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 약 0% 내지 약 20%, 약 0.5% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 15%, 약 4% 내지 약 10% 또는 약 2%의 몰비를 차지할 수 있다.
실시형태에서, PEG-변형된 지질은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 국제 특허 출원 제PCT/US2019/015913호에 기재되어 있다. 일 실시형태에서, 전달 비히클은 하나 이상의 PEG-변형된 지질을 포함한다.
PEG-변형된 지질의 비제한적인 예는 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티드산, PEG-세라마이드 접합체(예를 들어, PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20), PEG-변형된 다이알킬아민 및 PEG-변형된 1,2-다이아실옥시프로판-3-아민을 포함한다. 일부 추가 실시형태에서, PEG-변형된 지질은 예를 들어, PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC 또는 PEG-DSPE일 수 있다.
일부 더 추가의 실시형태에서, PEG-변형된 지질은 1,2-다이미리스토일-sn-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜(PEG-DMG), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)](PEG-DSPE), PEG-다이스테릴 글리세롤(PEG-DSG), PEG-다이팔메톨레일, PEG-다이올레일, PEG-다이스테아릴, PEG-다이아실글리카마이드(PEG-DAG), PEG-다이팔미토일 포스파티딜에탄올아민(PEG-DPPE) 또는 PEG-1,2-다이미리스틸옥실프로필-3-아민(PEG-c-DMA)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
다양한 실시형태에서, PEG-변형된 지질은 또한 "PEGylated 지질" 또는 "PEG-지질"이라고 지칭될 수 있다.
일 실시형태에서, PEG-지질은 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형된 포스파티드산, PEG-변형된 세라마이드, PEG-변형된 다이알킬아민, PEG-변형된 다이아실글리세롤, PEG-변형된 다이알킬글리세롤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, PEG-지질의 지질 모이어티는 약 C14 내지 약 C22, 예컨대 약 C14 내지 약 C16의 길이를 갖는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG 모이어티, 예를 들어, mPEG-NH2는 약 1000, 약 2000, 약 5000, 약 10,000, 약 15,000 또는 약 20,000달톤의 크기를 갖는다. 일 실시형태에서, PEG-지질은 PEG2k-DMG이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 지질 나노입자는 비확산성 PEG로 변형된 지질을 포함할 수 있다. 비확산성 PEG의 비제한적인 예는 PEG-DSG 및 PEG-DSPE를 포함한다.
PEG-지질은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대, 미국 특허 제8,158,601호 및 국제 공개 제WO2015/130584 A2호에 기재된 것이고, 이들은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 지질(예를 들어, PEG-지질)은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 국제 특허 공개 제PCT/US2016/000129호에 기재된 바와 같이 합성될 수 있다.
지질 나노입자 조성물의 지질 성분은 폴리에틸렌 글리콜, 예컨대 PEG 또는 PEG-변형된 지질을 포함하는 하나 이상의 분자를 포함할 수 있다. 이러한 종은 대안적으로 PEG화된 지질이라고 지칭될 수 있다. PEG 지질은 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 지질이다. PEG 지질은 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형된 포스파티드산, PEG-변형된 세라마이드, PEG-변형된 다이알킬아민, PEG-변형된 다이아실글리세롤, PEG-변형된 다이알킬글리세롤 및 이들의 혼합물을 포함하는 비제한적인 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, PEG 지질은 PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC 또는 PEG-DSPE 지질일 수 있다.
일부 실시형태에서 PEG-변형된 지질은 PEG-DMG의 변형된 형태이다. PEG-DMG는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00383
.
일부 실시형태에서 PEG-변형된 지질은 PEG-C18 또는 PEG-1의 변형된 형태이다. PEG-1은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00384
.
일 실시형태에서, 본 발명에 유용한 PEG 지질은 국제 공개 제WO2012099755호에 기재된 PEG화된 지질일 수 있고, 이의 내용은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 기재된 이러한 예시적인 PEG 지질 중 임의의 것이 PEG 쇄 상에 하이드록실기를 포함하도록 변형될 수 있다. 특정 실시형태에서, PEG 지질은 PEG-OH 지질이다. 특정 실시형태에서, PEG-OH 지질은 PEG 쇄 상에 하나 이상의 하이드록실기를 포함한다. 특정 실시형태에서, PEG-OH 또는 하이드록시-PEG화된 지질은 PEG 쇄의 말단에 -OH기를 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 개별 실시형태를 나타낸다.
일부 실시형태에서, PEG 지질은 화학식 (P1)의 화합물 또는 이의 염 또는 이성질체이다:
Figure pct00385
(P1)
식 중,
r은 1 내지 100의 정수이고;
R은 C10-40 알킬, C10-40 알켄일 또는 C10-40 알킨일; 선택적으로 R의 하나 이상의 메틸렌기는 C3-10 카보사이클릴렌, 4 내지 10원 헤테로사이클릴렌, C6-10　아릴렌, 4 내지 10원 헤테로아릴렌, -N(RN)-, -O-, -S-, -C(O)-,-C(O)N(RN)-, -NRNC(O)-, -NRNC(O)N(RN)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(RN)-, -NRNC(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NRN)-, -C(=NRN)N(RN)-, -NRNC(=NRN)-, -NRNC(=NRN)N(RN)-, -C(S)-, -C(S)N(RN)-, -NRNC(S)-, -NRNC(S)N(RN)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(RN)S(O)-, -S(O)N(RN)-, -N(RN)S(O)N(RN)-, -OS(O)N(RN)-, -N(RN)S(O)O-, -S(O)2-, -N(RN)S(O)2-, -S(O)2N(RN)-, -N(RN)S(O)2N(RN)-, -OS(O)2N(RN)- 또는 -N(RN)S(O)2O-로 독립적으로 대체되고;
RN의 각각의 경우는 독립적으로 수소, C1-6 알킬 또는 질소 보호기이다.
예를 들어, R은 C17 알킬이다. 예를 들어, PEG 지질은 화학식 (P1-a)의 화합물 또는 이의 염 또는 이성질체이다:
Figure pct00386
식 중, r은 1 내지 100의 정수이다.
예를 들어, PEG 지질은 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00387
9. 헬퍼 지질
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 전달 비히클(예를 들어, LNP)은 하나 이상의 비-양이온성 헬퍼 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 인지질이다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 인지질 치환체 또는 대체물이다. 일부 실시형태에서, 인지질 또는 인지질 치환체는 예를 들어, 하나 이상의 치환된 또는 (폴리)비치환된 인지질 또는 인지질 치환체 또는 이들의 조합물일 수 있다. 일반적으로, 인지질은 인지질 모이어티 및 하나 이상의 지방산 모이어티를 포함한다.
인지질 모이어티는 예를 들어, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 세린, 포스파티드산, 2-리소포스파티딜 콜린, 및 스핑고미엘린으로 이루어진 비제한적인 군으로부터 선택될 수 있다.
지방산 모이어티는 예를 들어, 라우르산, 미리스트산, 미리스트올레산, 팔미트산, 팔미트올레산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 에루스산, 피탄산, 아라키드산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 베헨산, 도코사펜타엔산 및 도코사헥사엔산으로 이루어진 비제한적인 군으로부터 선택될 수 있다.
인지질은 글리세로인지질, 예컨대, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜 글리세롤 및 포스파티드산을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 인지질은 또한 포스포스핑고지질, 예컨대, 스핑고미엘린을 포함한다.
일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 1,2-다이스테아로일-177-글리세로-3-포스포콜린(DSPC) 유사체, DSPC 치환체, 올레산 또는 올레산 유사체이다.
일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 비-포스파티딜 콜린(PC) 쯔비터이온성 지질, DSPC 유사체, 올레산, 올레산 유사체 또는 DSPC 치환체이다.
일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 PCT/US2018/053569에 기재되어 있다. 본 개시내용의 지질 조성물에 사용하기에 적합한 헬퍼 지질은 예를 들어, 다양한 중성, 비하전 또는 쯔비터이온성 지질을 포함한다. 이러한 헬퍼 지질은 본 명세서에 개시된 화합물 중 하나 이상 및 지질과 조합하여 바람직하게 사용된다. 헬퍼 지질의 예는 5-헵타데실벤젠-1,3-다이올(레소르시놀), 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 포스포콜린(DOPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 포스파티딜콜린(PLPC), 1,2-다이스테아로일sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 난 포스파티딜콜린(EPC), 다이라우릴로일포스파티딜콜린(DLPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린(PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린(PSPC), 1,2-다이아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DBPC), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(SPPC), 1,2-다이에이코센오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC), 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린(POPC), 리소포스파티딜 콜린, 다이올레오일 포스파티딜에탄올 아민(DOPE) 다이리놀레오일포스파티딜콜린 다이스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 다이미리스토일 포스파티딜에탄올아민 (DMPE), 다이팔미토일 포스파티딜에탄올아민(DPPE), 팔미토일올레오일 포스파티딜에탄올아민 (POPE), 리소포스파티딜에탄올아민 및 이들의 조합물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 헬퍼 지질은 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 또는 다이미리스토일 포스파티딜 에탄올아민(DMPE)일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 헬퍼 지질은 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)일 수 있다. 헬퍼 지질은 전달 비히클을 안정화시키고, 이의 가공을 개선시키는 기능을 한다. 이러한 헬퍼 지질은 다른 부형제, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 이온화 가능한 지질과 조합하여 바람직하게 사용된다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질과 조합하여 사용되는 경우, 헬퍼 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 5% 내지 약 90% 또는 약 10% 내지 약 70%의 몰비를 차지할 수 있다.
10. 구조 지질
일 실시형태에서, 구조 지질은 국제 특허 출원 제PCT/US2019/015913호에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 전달 비히클은 하나 이상의 구조 지질을 포함한다. 지질 나노입자에 구조 지질을 혼입하는 것은 입자 내의 다른 지질의 응집을 완화시키는 데 도움이 될 수 있다. 구조 지질은 콜레스테롤, 페코스테롤, 에르고스테롤, 바시카스테롤, 토마티딘, 토마틴, 우르솔릭, 알파-토코페롤 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 구조 지질은 콜레스테롤이다. 특정 실시형태에서, 구조 지질은 콜레스테롤 및 코티코스테로이드(예컨대, 예를 들어, 프레드니솔론, 덱사메타손, 프레드니손 및 하이드로코티손) 또는 이들의 조합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 구조 지질은 스테롤이다. 특정 실시형태에서, 구조 지질은 스테로이드이다. 특정 실시형태에서, 구조 지질은 콜레스테롤이다. 특정 실시형태에서, 구조 지질은 콜레스테롤의 유사체이다. 특정 실시형태에서, 구조 지질은 알파-토코페롤이다.
본 명세서에 기재된 전달 비히클은 하나 이상의 구조 지질을 포함한다. 전달 비히클, 예를 들어, 지질 나노입자에 구조 지질을 혼입하는 것은 입자 내의 다른 지질의 응집을 완화시키는 데 도움이 될 수 있다. 특정 실시형태에서, 구조 지질은 콜레스테롤 및 코티코스테로이드(예컨대, 예를 들어, 프레드니솔론, 덱사메타손, 프레드니손 및 하이드로코티손) 또는 이들의 조합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 구조 지질은 스테롤이다. 구조 지질은 스테롤(예를 들어, 피토스테롤 또는 주스테롤)을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 구조 지질은 스테로이드이다. 예를 들어, 스테롤은 콜레스테롤, β-시토스테롤, 페코스테롤, 에르고스테롤, 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 에르고스테롤, 토마티딘, 토마틴, 우르솔산 또는 알파-토코페롤을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 전달 비히클은 전달 비히클, 예를 들어, 지질 나노입자에 존재하는 경우, 세포 회합/흡수, 내재화, 세포내 전달 및/또는 가공 및/또는 엔도솜 탈출을 향상시킴으로써 기능할 수 있고/있거나 면역 세포 전달 강화 지질이 없는 전달 비히클에 비해서 면역 세포에 의한 인식 및/또는 면역 세포에 대한 결합을 향상시킬 수 있는 면역 세포 전달 강화 지질, 예를 들어, 콜레스테롤 유사체 또는 아미노 지질 또는 이들의 조합물을 유효량으로 포함한다. 따라서, 어떠한 특정 기전 또는 이론에도 얽매이고자 함 없이, 일 실시형태에서, 본 개시내용의 구조 지질 또는 다른 면역 세포 전달 강화 지질은 C1q에 결합하거나, 이러한 지질을 포함하는 전달 비히클의 C1q에 대한 결합을 촉진시킨다. 따라서, 면역 세포로의 핵산 분자의 전달을 위해서 본 개시내용의 전달 비히클을 시험관내에서 사용하는 경우, C1q를 포함하는 배양 조건이 사용된다(예를 들어, 혈청을 포함하거나 무혈청 배지에 외인성 C1q를 첨가한 배양 배지 사용). 본 개시내용의 전달 비히클의 생체내 사용의 경우, C1q의 요건은 내인성 C1q에 의해서 공급된다.
특정 실시형태에서, 구조 지질은 콜레스테롤이다. 특정 실시형태에서, 구조 지질은 콜레스테롤의 유사체이다. 일부 실시형태에서, 구조 지질은 표 16의 지질이다:
Figure pct00388
Figure pct00389
Figure pct00390
Figure pct00391
Figure pct00392
Figure pct00393
Figure pct00394
Figure pct00395
Figure pct00396
Figure pct00397
Figure pct00398
Figure pct00399
Figure pct00400
Figure pct00401
Figure pct00402
Figure pct00403
Figure pct00404
Figure pct00405
Figure pct00406
11. LNP 제형
본 명세서에 기재된 지질 나노입자(LNP)는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해서 달성될 수 있다. 예를 들어, 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 공개 제US2012/0178702 A1호에 기재된 바와 같음. 지질 나노입자 조성물 및 이의 제조 방법의 비제한적인 예는 예를 들어, 문헌[Semple et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:172-176; Jayarama et al. (2012), Angew. Chem. Int. Ed., 51:8529-8533; 및 Maier et al. (2013) Molecular Therapy 21, 1570-1578](이들 각각의 내용은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함됨)에 기재되어 있다.
일 실시형태에서, LNP 제형은 예를 들어, 각각의 내용 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 국제 특허 공개 제WO 2011/127255호 또는 제WO 2008/103276호에 기재된 방법에 의해서 제조될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 LNP 제형은 다양이온성 조성물을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 다양이온성 조성물은 내용 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 공개 제US2005/0222064 A1호의 화학식 1 내지 60으로부터 선택된 조성물일 수 있다.
일 실시형태에서, 지질 나노입자는 각각의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 공개 제US2013/0156845 A1호 및 국제 특허 공개 제WO2013/093648 A2호 또는 제WO2012/024526 A2호에 기재된 방법에 의해서 제형화될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 지질 나노입자는 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 공개 제US2013/0164400 A1호에 기재된 시스템 및/또는 방법에 의해서 멸균 환경으로 제조될 수 있다.
일 실시형태에서, LNP 제형은 나노입자, 예컨대, 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제8,492,359호에 기재된 핵산-지질 입자로 제형화될 수 있다.
나노입자 조성물은 선택적으로 1종 이상의 코팅을 포함할 수 있다. 예를 들어, 나노입자 조성물은 코팅을 갖는 캡슐, 필름 또는 정제로 제형화될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물을 포함하는 캡슐, 필름 또는 정제는 임의의 유용한 크기, 인장 강도, 경도 또는 밀도를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 지질 나노입자는 미세유체 혼합기를 포함하는 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 예시적인 미세유체 혼합기는 프리시젼 나노시스템즈사(Precision Nanosystems)(캐나다 BC주 밴쿠버 소재), 마이크로이노바사(Microinnova)(Allerheiligen bei Wildon, Austria)에서 제조된 것을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 슬릿 인터디지털(slit interdigitial) 마이크로혼합기 및/또는 스태거드 헤링본 마이크로혼합기(staggered herringbone micromixer: SHM)을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다(전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 문헌[Zhigaltsev, I.V. et al. (2012) Langmuir. 28:3633-40; Belliveau, N.M. et al. Mol. Ther. Nucleic. Acids. (2012) 1:e37; Chen, D. et al. J. Am. Chem. Soc. (2012) 134(16):6948-51]).
일부 실시형태에서, SHM을 포함하는 LNP 생성 방법은 적어도 2개의 투입 스트림의 혼합을 추가로 포함하는데, 여기서 혼합은 마이크로구조-유도 카오스 이류(microstructure-induced chaotic advection: MICA)에 의해서 발생한다. 이 방법에 따르면, 유체 스트림이 헤링본 패턴으로 존재하는 채널을 통해 유동하여 회전 유동을 유도하고, 유체를 서로 주변에서 폴딩한다. 이러한 방법은 또한 유체 혼합을 위한 표면을 포함할 수 있는데, 여기서 표면은 유체 순환 동안 배향을 변화시킨다. SHM을 사용한 LNP의 생성 방법은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 공개 제US2004/0262223 A1호 및 제US2012/0276209 A1호에 개시된 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 지질 나노입자는 마이크로혼합기 예컨대, 비제한적으로 인스티튜트 퍼 마이크로네크닉 마인즈사(the Institut fur Mikrotechnik Mainz GmbH)(독일 마인즈 소재)로부터의 Slit Interdigital Microstructured Mixer(SIMM-V2) 또는 Standard Slit Interdigital Micro Mixer(SSIMM) 또는 Caterpillar(CPMM) 또는 Impinging-jet(IJMM)를 사용하여 제형화될 수 있다. 일 실시형태에서, 지질 나노입자는 마이크로유체 기술을 사용하여 생성된다(각각 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 문헌[Whitesides (2006) Nature. 442: 368-373; 및 Abraham et al. (2002) Science. 295: 647-651] 참조). 비제한적인 예로서, 제어된 마이크로유체 제형은 낮은 레이놀드 수에서 마이크로 채널에서 정상 압력-구동 유동의 스트림을 혼합하기 위한 수동 방법을 포함한다(예를 들어, 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 문헌[Abraham et al. (2002) Science. 295: 647651] 참조).
일 실시형태에서, 본 발명의 circRNA는 마이크로믹서 칩, 예컨대, 비제한적으로 하버드 어패러터스사(Harvard Apparatus)(미국 매사추세츠주 홀리스톤 소재), 돌로마이트 마이크로플루이딕스사(Dolomite Microfluidics)(영국 로이스톤 소재) 또는 프리시젼 나노시스템즈사(Precision Nanosystems)(캐나다 BC주 밴쿠버 소재)로부터의 제품을 사용하여 생성된 지질 나노입자에 제형화될 수 있다. 마이크로믹서 칩은 2종 이상의 유체 스트림을 분할 및 재조합 메커니즘으로 신속하게 혼합하기 위해서 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 지질 나노입자는 약 10 내지 약 100㎚, 예컨대, 비제한적으로, 약 10 내지 약 20㎚, 약 10 내지 약 30㎚, 약 10 내지 약 40㎚, 약 10 내지 약 50㎚, 약 10 내지 약 60㎚, 약 10 내지 약 70㎚, 약 10 내지 약 80㎚, 약 10 내지 약 90㎚, 약 20 내지 약 30㎚, 약 20 내지 약 40㎚, 약 20 내지 약 50㎚, 약 20 내지 약 60㎚, 약 20 내지 약 70㎚, 약 20 내지 약 80㎚, 약 20 내지 약 90㎚, 약 20 내지 약 100㎚, 약 30 내지 약 40㎚, 약 30 내지 약 50㎚, 약 30 내지 약 60㎚, 약 30 내지 약 70㎚, 약 30 내지 약 80㎚, 약 30 내지 약 90㎚, 약 30 내지 약 100㎚, 약 40 내지 약 50㎚, 약 40 내지 약 60㎚, 약 40 내지 약 70㎚, 약 40 내지 약 80㎚, 약 40 내지 약 90㎚, 약 40 내지 약 100㎚, 약 50 내지 약 60㎚, 약 50 내지 약 70㎚ 약 50 내지 약 80㎚, 약 50 내지 약 90㎚, 약 50 내지 약 100㎚, 약 60 내지 약 70㎚, 약 60 내지 약 80㎚, 약 60 내지 약 90㎚, 약 60 내지 약 100㎚, 약 70 내지 약 80㎚, 약 70 내지 약 90㎚, 약 70 내지 약 100㎚, 약 80 내지 약 90㎚, 약 80 내지 약 100㎚ 및/또는 약 90 내지 약 100㎚의 직경을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 지질 나노입자는 약 10 내지 500㎚의 직경을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 지질 나노입자는 100㎚ 초과, 150㎚ 초과, 200㎚ 초과, 250㎚ 초과, 300㎚ 초과, 350㎚ 초과, 400㎚ 초과, 450㎚ 초과, 500㎚ 초과, 550㎚ 초과, 600㎚ 초과, 650㎚ 초과, 700㎚ 초과, 750㎚ 초과, 800㎚ 초과, 850㎚ 초과, 900㎚ 초과, 950㎚ 초과 또는 1000㎚ 초과의 직경을 가질 수 있다. 각각의 가능성은 본 발명의 개별 실시형태를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 나노입자 (예를 들어, 지질 나노입자)는 10 내지 500㎚, 20 내지 400㎚, 30 내지 300㎚ 또는 40 내지 200㎚의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 나노입자 (예를 들어, 지질 나노입자)는 50 내지 150㎚, 50 내지 200㎚, 80 내지 100㎚ 또는 80 내지 200㎚의 평균 직경을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 지질 나노입자는 0.1㎛ 미만 내지 최대 1mm, 예컨대, 비제한적으로 0.1㎛ 미만, 1.0㎛ 미만, 5㎛ 미만, 10㎛ 미만, 15㎛ 미만, 20㎛ 미만, 25㎛ 미만, 30㎛ 미만, 35㎛ 미만, 40㎛ 미만, 50㎛ 미만, 55㎛ 미만, 60㎛ 미만, 65㎛ 미만, 70㎛ 미만, 75㎛ 미만, 80㎛ 미만, 85㎛ 미만, 90㎛ 미만, 95㎛ 미만, 100㎛ 미만, 125㎛ 미만, 150㎛ 미만, 175㎛ 미만, 200㎛ 미만, 225㎛ 미만, 250㎛ 미만, 275㎛ 미만, 300㎛ 미만, 325㎛ 미만, 350㎛ 미만, 375㎛ 미만, 400㎛ 미만, 425㎛ 미만, 450㎛ 미만, 475㎛ 미만, 500㎛ 미만, 525㎛ 미만, 550㎛ 미만, 575㎛ 미만, 600㎛ 미만, 625㎛ 미만, 650㎛ 미만, 675㎛ 미만, 700㎛ 미만, 725㎛ 미만, 750㎛ 미만, 775㎛ 미만, 800㎛ 미만, 825㎛ 미만, 850㎛ 미만, 875㎛ 미만, 900㎛ 미만, 925㎛ 미만, 950㎛ 미만, 975㎛ 미만의 직경을 가질 수 있다.
또 다른 실시형태에서, LNP는 약 1㎚ 내지 약 100㎚, 약 1㎚ 내지 약 10㎚, 약 1㎚ 내지 약 20㎚, 약 1㎚ 내지 약 30㎚, 약 1㎚ 내지 약 40㎚, 약 1㎚ 내지 약 50㎚, 약 1㎚ 내지 약 60㎚, 약 1㎚ 내지 약 70㎚, 약 1㎚ 내지 약 80㎚, 약 1㎚ 내지 약 90㎚, 약 5㎚ 내지 약 from 100㎚, 약 5㎚ 내지 약 10㎚, 약 5㎚ 내지 약 20㎚, 약 5㎚ 내지 약 30㎚, 약 5㎚ 내지 약 40㎚, 약 5㎚ 내지 약 50㎚, 약 5㎚ 내지 약 60㎚, 약 5㎚ 내지 약 70㎚, 약 5㎚ 내지 약 80㎚, 약 5㎚ 내지 약 90㎚, 약 10 내지 약 50㎚, 약 20 내지 약 50㎚, 약 30 내지 약 50㎚, 약 40 내지 약 50㎚, 약 20 내지 약 60㎚, 약 30 내지 약 60㎚, 약 40 내지 약 60㎚, 약 20 내지 약 70㎚, 약 30 내지 약 70㎚, 약 40 내지 약 70㎚, 약 50 내지 약 70㎚, 약 60 내지 약 70㎚, 약 20 내지 약 80㎚, 약 30 내지 약 80㎚, 약 40 내지 약 80㎚, 약 50 내지 약 80㎚, 약 60 내지 약 80㎚, 약 20 내지 약 90㎚, 약 30 내지 약 90㎚, 약 40 내지 약 90㎚, 약 50 내지 약 90㎚, 약 60 내지 약 90㎚ 및/또는 약 70 내지 약 90㎚의 직경을 가질 수 있다. 각각의 가능성은 본 발명의 개별 실시형태를 나타낸다.
나노입자 조성물은 비교적 균질할 수 있다. 다분산도 지수를 사용하여 나노입자 조성물의 균질성, 예를 들어, 나노입자 조성물의 입자 크기 분포를 나타낼 수 있다. 작은(예를 들어, 0.3 미만) 다분산도 지수는 일반적으로 좁은 입자 크기 분포를 나타낸다. 나노입자 조성물은 약 0 내지 약 0.25, 예컨대, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.20, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24 또는 0.25의 다분산도 지수를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 나노입자 조성물의 다분산도 지수는 약 0.10 내지 약 0.20일 수 있다. 각각의 가능성은 본 발명의 개별 실시형태를 나타낸다.
나노입자 조성물의 제타 전위를 사용하여 조성물의 동전기적 전위를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 제타 전위는 나노입자 조성물의 표면 전하를 설명할 수 있다. 양전하 또는 음전하의 비교적 낮은 전하를 갖는 나노입자 조성물이 일반적으로 바람직한데, 그 이유는 더 높게 하전된 종은 신체의 세포, 조직 및 다른 요소와 바람직하지 않게 상호작용할 수 있기 때문이다. 일부 실시형태에서, 나노입자 조성물의 제타 전위는 약 -20mV 내지 약 +20mV, 약 -20mV 내지 약 +15mV, 약 -20mV 내지 약 +10mV, 약 -20mV 내지 약 +5mV, 약 -20mV 내지 약 0mV, 약 -20mV 내지 약 -5mV, 약 -20mV 내지 약 -10mV, 약 -20mV 내지 약 -15mV 약 -20mV 내지 약 +20mV, 약 -20mV 내지 약 +15mV, 약 -20mV 내지 약 +10mV, 약 -20mV 내지 약 +5mV, 약 -20mV 내지 약 0mV, 약 0mV 내지 약 +20mV, 약 0mV 내지 약 +15mV, 약 0mV 내지 약 +10mV, 약 0mV 내지 약 +5mV, 약 +5mV 내지 약 +20mV, 약 +5mV 내지 약 +15mV 또는 약 +5mV 내지 약 +10mV일 수 있다. 각각의 가능성은 본 발명의 개별 실시형태를 나타낸다.
치료제의 캡슐화 효율은 제공된 초기 양에 대해, 캡슐화되거나 제조 후 나노입자 조성물과 다른 방식으로 회합되는 치료제의 양을 설명한다. 캡슐화 효율은 높은 것(예를 들어, 100%에 가까운 것)이 바람직하다. 캡슐화 효율은, 예를 들어, 나노입자 조성물을 1종 이상의 유기 용매 또는 세제로 분해시키기 전과 후에 나노입자 조성물을 함유하는 용액 중의 치료제의 양을 비교함으로써 측정될 수 있다. 형광은 용액에서 유리 치료제(예를 들어, 핵산)의 양을 측정하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 나노입자 조성물의 경우, 치료제의 캡슐화 효율은 적어도 50%, 예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 일부 실시형태에서, 캡슐화 효율은 적어도 80%일 수 있다. 특정 실시형태에서, 캡슐화 효율은 적어도 90%일 수 있다. 각각의 가능성은 본 발명의 개별 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 0.4 미만의 다분산도 값을 갖는다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 중성 pH에서 순 중성 전하를 갖는다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 50 내지 200㎚의 평균 직경을 갖는다.
지질 나노입자 제형의 특성은 양이온성 지질 성분의 선택, 양이온성 지질 포화도, 비-양이온성 지질 성분의 선택, 비양이온성 지질 포화도, 구조 지질 성분의 선택, PEG화의 성질, 모든 성분의 비율 및 생물물리학적 매개변수, 예컨대, 크기를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 인자에 의해서 영향을 받을 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, PEG 지질 성분의 순도가 또한 LNP의 특성 및 성능에 중요하다.
12. 방법
일 실시형태에서, 지질 나노입자 제형은 국제 공개 제WO2011127255호 또는 제WO2008103276호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자 제형은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 국제 공개 제WO2019131770호에 기재된 바와 같을 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 RNA는 미국 특허 출원 15/809,680에 기재된 공정에 따라 제형화된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 지질을 사전 형성된 전달 비히클(즉, RNA의 부재 하에 형성됨)로 형성한 다음 사전 형성된 전달 비히클을 RNA와 조합하는 단계를 포함하는 원형 RNA를 전달 비히클에 캡슐화하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 신규 제형 공정은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 지질 나노입자의 사전 형성 단계 없이(예를 들어, 지질을 직접 RNA와 배합함) 제조된 동일한 RNA 제형에 비해 잠재적으로 더 양호한 내약성을 갖는 더 높은 효력(펩타이드 또는 단백질 발현) 및 더 높은 효능(생물학적으로 관련된 종점의 개선)을 갖는 RNA 제형을 생성시킨다.
RNA의 특정 양이온성 지질 나노입자 제형의 경우, RNA의 높은 캡슐화를 달성하기 위해서, 완충액(예를 들어, 시트르산염 완충액)에서 RNA를 가열시켜야 한다. 이러한 공정 또는 방법에서, 가열은 제형화 후(나노입자의 형성 후) 가열이 지질 나노입자에서 RNA의 캡슐화 효율을 증가시키지 않기 때문에, 제형 공정 이전에 일어날 필요가 있다(즉, 개별 성분 가열). 이에 비해서, 본 발명의 신규한 방법의 일부 실시형태에서, RNA의 가열 순서는 RNA 캡슐화 백분율에 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다. 일부 실시형태에서, 사전 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액, RNA를 포함하는 용액 및 지질 나노입자 캡슐화된 RNA를 포함하는 혼합 용액 중 하나 이상의 가열은 제형 공정 이전에 또는 이후에 수행될 필요가 없다(즉, 주위 온도에서 유지).
RNA는 RNA가 지질 나노입자에 캡슐화될 수 있도록 지질 용액과 혼합될 용액에 제공될 수 있다. 적합한 RNA 용액은 다양한 농도로 캡슐화될 RNA를 함유하는 임의의 수용액일 수 있다 예를 들어, 적합한 RNA 용액은 약 0.01㎎/㎖, 0.05㎎/㎖, 0.06㎎/㎖, 0.07㎎/㎖, 0.08㎎/㎖, 0.09㎎/㎖, 0.1㎎/㎖, 0.15㎎/㎖, 0.2㎎/㎖, 0.3㎎/㎖, 0.4㎎/㎖, 0.5㎎/㎖, 0.6㎎/㎖, 0.7㎎/㎖, 0.8㎎/㎖, 0.9㎎/㎖ 또는 1.0㎎/㎖ 초과의 농도로 RNA를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적합한 RNA 용액은 약 0.01 내지 1.0㎎/㎖, 0.01 내지 0.9㎎/㎖, 0.01 내지 0.8㎎/㎖, 0.01 내지 0.7㎎/㎖, 0.01 내지 0.6㎎/㎖, 0.01 내지 0.5㎎/㎖, 0.01 내지 0.4㎎/㎖, 0.01 내지 0.3㎎/㎖, 0.01 내지 0.2㎎/㎖, 0.01 내지 0.1㎎/㎖, 0.05 내지 1.0㎎/㎖, 0.05 내지 0.9㎎/㎖, 0.05 내지 0.8㎎/㎖, 0.05 내지 0.7㎎/㎖, 0.05 내지 0.6㎎/㎖, 0.05 내지 0.5㎎/㎖, 0.05 내지 0.4㎎/㎖, 0.05 내지 0.3㎎/㎖, 0.05 내지 0.2㎎/㎖, 0.05 내지 0.1㎎/㎖, 0.1 내지 1.0㎎/㎖, 0.2 내지 0.9㎎/㎖, 0.3 내지 0.8㎎/㎖, 0.4 내지 0.7㎎/㎖ 또는 0.5 내지 0.6㎎/㎖의 범위의 농도로 RNA를 함유할 수 있다.
전형적으로, 적합한 RNA 용액은 또한 완충제 및/또는 염을 함유할 수 있다. 일반적으로, 완충액은 HEPES, Tris, 황산암모늄, 중탄산나트륨, 시트르산나트륨, 아세트산나트륨, 인산칼륨 또는 인산나트륨을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 완충제의 적합한 농도는 약 0.1mM 내지 100mM, 0.5mM 내지 90mM, 1.0mM 내지 80mM, 2mM 내지 70mM, 3mM 내지 60mM, 4mM 내지 50mM, 5mM 내지 40mM, 6mM 내지 30mM, 7mM 내지 20mM, 8mM 내지 15 mM 또는 9 내지 12 mM의 범위일 수 있다.
예시적인 염은 염화나트륨, 염화마그네슘 및 염화칼륨을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA 용액 중의 염의 적합한 농도는 약 1mM 내지 500mM, 5mM 내지 400mM, 10mM 내지 350mM, 15mM 내지 300mM, 20mM 내지 250mM, 30mM 내지 200mM, 40mM 내지 190mM, 50mM 내지 180mM, 50mM 내지 170mM, 50mM 내지 160mM, 50mM 내지 150mM 또는 50mM 내지 100 mM의 범위일 수 있다.
일부 실시형태에서, 적합한 RNA 용액은 약 3.5 내지 6.5, 3.5 내지 6.0, 3.5 내지 5.5, 3.5 내지 5.0, 3.5 내지 4.5, 4.0 내지 5.5, 4.0 내지 5.0, 4.0 내지 4.9, 4.0 내지 4.8, 4.0 내지 4.7, 4.0 내지 4.6 또는 4.0 내지 4.5의 범위의 pH를 가질 수 있다.
본 발명에 적합한 RNA 용액을 제조하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA는 본 명세서에 기재된 완충 용액에 직접 용해될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA 용액은 캡슐화를 위해 지질 용액과 혼합하기 전에 RNA 스톡 용액을 완충 용액과 혼합함으로써 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA 용액은 캡슐화를 위해 지질 용액과 혼합하기 직전에 RNA 스톡 용액을 완충 용액과 혼합함으로써 생성될 수 있다.
본 발명에 따르면, 지질 용액은 RNA의 캡슐화를 위한 전달 비히클을 형성하기에 적합한 지질의 혼합물을 함유한다. 일부 실시형태에서, 적합한 지질 용액은 에탄올 기재이다. 예를 들어, 적합한 지질 용액은 순수한 에탄올(즉, 100% 에탄올)에 용해된 목적하는 지질의 혼합물을 함유할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 적합한 지질 용액은 아이소프로필 알코올 기재이다. 또 다른 실시형태에서, 적합한 지질 용액은 다이메틸설폭사이드 기재이다. 또 다른 실시형태에서, 적합한 지질 용액은 에탄올, 아이소프로필 알코올 및 다이메틸설폭사이드를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 적합한 용매의 혼합물이다.
적합한 지질 용액은 다양한 농도에서 목적하는 지질의 혼합물을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적합한 지질 용액은 약 0.1 내지 100㎎/㎖, 0.5 내지 90㎎/㎖, 1.0 내지 80㎎/㎖, 1.0 내지 70㎎/㎖, 1.0 내지 60㎎/㎖, 1.0 내지 50㎎/㎖, 1.0 내지 40㎎/㎖, 1.0 내지 30㎎/㎖, 1.0 내지 20㎎/㎖, 1.0 내지 15㎎/㎖, 1.0 내지 10㎎/㎖, 1.0 내지 9㎎/㎖, 1.0 내지 8㎎/㎖, 1.0 내지 7㎎/㎖, 1.0 내지 6㎎/㎖ 또는 1.0 내지 5㎎/㎖의 범위의 총 농도로 목적하는 지질의 혼합물을 함유할 수 있다.
13. 표적화
본 발명은 또한 수동 및 능동 표적화 수단 둘 다에 의한 표적 세포 및 조직의 차별적 표적화를 고려한다. 수동 표적화 현상은 표적 세포에 의한 전달 비히클의 인식을 향상시키기 위한 수단 또는 추가 부형제의 사용에 의존하지 않고 생체내에서 전달 비히클의 자연 분포 패턴을 이용한다. 예를 들어, 세망-내피 시스템의 세포에 의해 식균 작용을 받는 전달 비히클은 간 또는 비장에 축적될 가능성이 있고, 따라서 이러한 표적 세포에 대한 조성물의 전달을 수동적으로 지시하는 수단을 제공할 수 있다.
대안적으로, 본 발명은 특정 표적 세포 또는 표적 조직에서 이러한 전달 비히클의 국지화를 촉진하기 위해 전달 비히클에 (공유적으로 또는 비공유적으로) 결합될 수 있는 표적화 모이어티의 사용을 포함하는 능동 표적화를 고려한다. 예를 들어, 표적화는 표적 세포 또는 조직으로의 분포를 장려하기 위해 전달 비히클 내에 또는 그 상에 하나 이상의 내인성 표적화 모이어티를 포함시킴으로써 매개될 수 있다. 표적 조직에 의한 표적화 모이어티의 인식은 표적 세포 및 조직에서 전달 비히클 및/또는 그 내용물의 조직 분포 및 세포 흡수를 적극적으로 촉진시킨다(예를 들어, 전달 비히클 내에 또는 그 상에 아포지단백질-E 표적화 리간드를 포함시키는 것은 간세포에 의해 발현되는 내인성 저밀도 지단백질 수용체에 대한 전달 비히클의 인식 및 결합을 장려한다). 본 명세서에 제공된 바와 같이, 조성물은 표적 세포에 대한 조성물의 친화도를 향상시킬 수 있는 모이어티를 포함할 수 있다. 표적화 모이어티는 제형 동안 또는 제형 후에 지질 입자의 외부 이중층에 연결될 수 있다. 이들 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 또한, 일부 지질 입자 제형은 PEAA, 혈구응집소, 기타 리포펩타이드(미국 특허 출원 제08/835,281호 및 제60/083,294호 참조, 본 명세서에 참조에 의해 포함됨)와 같은 융합성 중합체 및 생체내 및/또는 세포내 전달에 유용한 기타 특징을 사용할 수 있다. 다른 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 개선된 형질주입 효능을 입증하고/하거나 관심 표적 세포 또는 조직에 대한 향상된 선택성을 입증한다. 따라서 표적 세포 또는 조직에 대한 조성물의 친화도 및 이들의 핵산 함량을 향상시킬 수 있는 하나 이상의 모이어티(예를 들어, 펩타이드, 압타머, 올리고뉴클레오타이드, 비타민 또는 기타 분자)를 포함하는 조성물이 고려된다. 적합한 모이어티는 선택적으로 전달 비히클의 표면에 결합되거나 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 전달 비히클의 표면에 걸쳐 있거나 전달 비히클 내에 캡슐화될 수 있다. 적절한 모이어티는 물리적, 화학적 또는 생물학적 특성(예를 들어, 표적 세포 표면 마커 또는 특징의 선택적 친화성 및/또는 인식)을 기반으로 선택된다. 세포-특이적 표적 부위와 이에 상응하는 표적 리간드는 매우 다양할 수 있다. 표적 세포의 고유한 특성이 이용되어, 조성물이 표적 세포와 비-표적 세포를 구별할 수 있도록 적합한 표적화 모이어티가 선택된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 (예를 들어, 이러한 표면 마커의 수용체-매개 인식 및 결합에 의해) 간세포의 인식 또는 친화성을 선택적으로 향상시키는 표면 마커 (예를 들어, 아포지단백질-B 또는 아포지단백질-E)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적화 모이어티로서 갈락토스의 사용은 본 발명의 조성물을 실질 간세포로 안내할 것으로 예측되거나, 대안적으로 표적 리간드로서 당 잔기를 함유하는 만노스의 사용은 본 발명의 조성물을 간 내피 세포(예를 들어, 간세포에 존재하는 아시알로당단백질 수용체에 우선적으로 결합할 수 있는 당 잔기를 함유하는 만노스)로 안내할 것이라고 예측될 것이다(문헌[Hillery A M, et al. "Drug Delivery and Targeting: For Pharmacists and Pharmaceutical Scientists" (2002) Taylor & Francis, Inc.] 참조) 전달 비히클(예를 들어, 따라서 지질 나노입자)에 존재하는 모이어티에 접합된 이러한 표적화 모이어티의 제시는 표적 세포 및 조직에서 본 발명의 조성물의 인식 및 흡수를 촉진한다. 적합한 표적화 모이어티의 예는 하나 이상의 펩타이드, 단백질, 압타머, 비타민 및 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 전달 비히클은 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 특이적 세포의 집단 내에서 수용체-매개된 엔도사이토시스를 세포의 특정 집단으로 선택적으로 매개한다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어는 T 세포 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 NK, NKT 또는 대식세포 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 군 CD3, CD4, CD8, PD-1, 4-1BB 및 CD2으로부터 선택된 단백질에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 단일 쇄 Fv(scFv) 단편, 나노바디, 펩타이드, 펩타이드-기재 마크로사이클, 미니바디, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 항 T-세포 수용체 모티프 항체, T-세포 α 쇄 항체, T-세포 β 쇄 항체, T-세포 γ 쇄 항체, T-세포 δ 쇄 항체, CCR7 항체, CD3 항체, CD4 항체, CD5 항체, CD7 항체, CD8 항체, CD11b 항체, CD11c 항체, CD16 항체, CD19 항체, CD20 항체, CD21 항체, CD22 항체, CD25 항체, CD28 항체, CD34 항체, CD35 항체, CD40 항체, CD45RA 항체, CD45RO 항체, CD52 항체, CD56 항체, CD62L 항체, CD68 항체, CD80 항체, CD95 항체, CD117 항체, CD127 항체, CD133 항체, CD137(4-1BB) 항체, CD163 항체, F4/80 항체, IL-4Rα 항체, Sca-1 항체, CTLA-4 항체, GITR 항체, GARP 항체, LAP 항체, 그랜자임 B 항체, LFA-1 항체, 트랜스페린 수용체 항체, 및 이들의 단편으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 림프구 상의 체외효소의 소분자 결합제이다. 체외효소의 소분자 결합제는 A2A 저해제 CD73 저해제, CD39 또는 아데신 수용체 A2aR 및 A2bR을 포함한다. 잠재적인 소분자는 AB928을 포함한다.
일부 실시형태에서, 전달 비히클은 문헌[Shobaki N, Sato Y, Harashima H. Mixing lipids to manipulate the ionization status of lipid nanoparticles for specific tissue targeting. Int J Nanomedicine. 2018;13:8395-8410. Published 2018 Dec 10]에 기재된 바와 같이 제형화되고/되거나 표적화된다. 일부 실시형태에서, 전달 비히클은 3개의 지질 유형으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 전달 비히클은 4개의 지질 유형으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 전달 비히클은 5개의 지질 유형으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 전달 비히클은 6개의 지질 유형으로 구성된다.
14. 표적 세포
핵산을 면역 세포로 전달하는 것이 바람직한 경우, 면역 세포가 표적 세포를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 차별적 기반으로 표적 세포를 형질주입시킨다(즉, 비-표적 세포를 형질주입시키지 않는다). 본 발명의 조성물은 또한 T 세포, B 세포, 대식세포 및 수지상 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 표적 세포를 우선적으로 표적으로 하도록 제조될 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 세포는 관심 단백질 또는 효소가 결핍되어 있다. 예를 들어, 핵산을 간세포에 전달하고자 하는 경우, 간세포는 표적 세포를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 차별적 기반으로 표적 세포를 형질주입시킨다(즉, 비-표적 세포를 형질주입시키지 않는다). 본 발명의 조성물은 또한 간세포, 상피 세포, 조혈 세포, 상피 세포, 내피 세포, 폐 세포, 골 세포, 줄기 세포, 중간엽 세포, 신경 세포(예를 들어, 수막, 성상교세포, 운동 뉴런, 후근 신경절 및 전각 운동 뉴런의 세포), 광수용체 세포(예를 들어, 간상체 및 원추체), 망막 색소 상피 세포, 분비 세포, 심장 세포, 지방세포, 혈관 평활근 세포, 심근세포, 골격근 세포, 베타 세포, 뇌하수체 세포, 활액 내막 세포, 난소 세포, 고환 세포, 섬유모세포, B 세포, T 세포, 망상적혈구, 백혈구, 과립구 및 종양 세포을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 표적 세포를 우선적으로 표적으로 하도록 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 심장, 폐, 신장, 간 및 비장과 같은 표적 세포에 우선적으로 분포되도록 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 간 또는 비장의 세포(예를 들어, 간세포)에 의해 그 내에 포함된 circRNA의 전달 및 후속 발현을 촉진하기 위해 간의 세포 또는 비장의 세포(예를 들어, 면역 세포) 내에 분포한다. 표적화 세포는 기능성 단백질 또는 효소를 생산하고 전신에 배출할 수 있는 생물학적 "저장부" 또는 "저장소"로 기능할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태에서 전달 비히클은 간세포 또는 면역 세포를 표적화하고/하거나 전달 시 간 또는 비장의 세포에 우선적으로 분포할 수 있다. 일 실시형태에서, 표적 간세포 또는 면역 세포의 형질주입 후, 비히클에 로딩된 circRNA가 번역되고, 기능성 단백질 산물이 생산되고, 배설되고, 전신에 분포된다. 다른 실시형태에서, 간세포 이외의 세포(예를 들어, 폐, 비장, 심장, 안구 또는 중추 신경계의 세포)는 단백질 생산을 위한 저장소 위치로 작용할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 1종 이상의 기능성 단백질 및/또는 효소의 대상체의 내인성 생산을 촉진한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 전달 비히클은 결핍된 단백질 또는 효소를 암호화하는 circRNA를 포함한다. 표적 조직으로의 이러한 조성물의 분포 및 이러한 표적 세포의 후속적인 형질주입 시, 전달 비히클(예를 들어, 지질 나노입자)에 로딩된 외인성 circRNA는 생체내에서 번역되어 외부에서 투여되는 circRNA(예를 들어, 대상체가 결핍된 단백질 또는 효소) 의해 암호화된 기능적 단백질 또는 효소를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 내인적으로 번역된 단백질 또는 효소를 생산하기 위해 외인성으로 또는 재조합 방식으로 제조된 circRNA를 번역하고, 이에 의해 기능성 단백질 또는 효소를 생산(및 적용 가능한 경우 배설)하는 대상체의 능력을 이용한다. 발현되거나 번역된 단백질 또는 효소는 또한 재조합에 의해서 제조된 단백질 또는 효소에 종종 없을 수 있는 천연 번역후 변형의 생체내 포함을 특징으로 할 수 있으며, 이에 의해 번역된 단백질 또는 효소의 면역원성을 추가로 감소시킬 수 있다.
결핍된 단백질 또는 효소를 암호화하는 circRNA의 투여는 표적 세포 내의 특정 소기관에 핵산을 전달할 필요성을 회피한다. 오히려, 표적 세포의 형질주입 및 표적 세포의 세포질로 핵산의 전달 시에, 전달 비히클의 circRNA 내용물이 번역될 수 있고 기능성 단백질 또는 효소가 발현될 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 RNA는 하나 이상의 miRNA 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA는 하나 이상의 비표적 세포 또는 비표적 세포 유형(예를 들어, 쿠퍼 세포 또는 간세포)에 존재하고 하나 이상의 표적 세포 또는 표적 세포 유형(예를 들어, 간세포 또는 T 세포)에는 존재하지 않는 miRNA에 의해 인식되는 하나 이상의 miRNA 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA는 하나 이상의 표적 세포 또는 표적 세포 유형(예를 들어, 간세포 또는 T 세포)에 비해서 하나 이상의 비표적 세포 또는 비표적 세포 유형(예를 들어, 쿠퍼 세포 또는 간세포)에 증가된 농도로 존재하는 miRNA에 의해 인식되는 하나 이상의 miRNA 결합 부위를 포함한다. miRNA는 RNA 분자 내의 상보적인 서열과 짝을 이루어 기능을 하여 유전자 침묵을 초래한다고 생각된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 차별적 기반으로 표적 세포를 형질주입시키거나 표적 세포에 분포시킨다(즉, 비-표적 세포를 형질주입시키지 않는다). 본 발명의 조성물은 또한 간세포, 상피 세포, 조혈 세포, 상피 세포, 내피 세포, 폐 세포, 골 세포, 줄기 세포, 중간엽 세포, 신경 세포(예를 들어, 수막, 성상교세포, 운동 뉴런, 후근 신경절 및 전각 운동 뉴런의 세포), 광수용체 세포(예를 들어, 간상체 및 원추체), 망막 색소 상피 세포, 분비 세포, 심장 세포, 지방세포, 혈관 평활근 세포, 심근세포, 골격근 세포, 베타 세포, 뇌하수체 세포, 활액 내막 세포, 난소 세포, 고환 세포, 섬유모세포, B 세포, T 세포, 망상적혈구, 백혈구, 과립구 및 종양 세포을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 표적 세포를 우선적으로 표적으로 하도록 제조될 수 있다.
15. 약제학적 조성물
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 치료제를 포함하는 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물)이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 치료제는 본 명세서에 제공된 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서 치료제는 본 명세서에서 제공되는 벡터이다. 일부 실시형태에서, 치료제는 본 명세서에 제공된 원형 RNA 또는 벡터를 포함하는 세포(예를 들어, 인간 세포, 예컨대, 인간 T 세포)이다. 특정 실시형태에서, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 다른 약제학적 활성제 또는 약물, 예컨대, 항염증성 약물 또는 B 세포 항원을 표적으로 할 수 있는 항체, 예를 들어, 항-CD20 항체, 예를 들어, 리툭시맙과 조합하여 본 명세서에 제공된 치료제를 포함한다.
약제학적 조성물과 관련하여, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 통상적으로 사용되는 임의의 것일 수 있으며, 활성제(들)와의 용해도 및 반응성 부족과 같은 화학적-물리적 고려사항 및 투여 경로에 의해서만 제한된다. 본 명세서에 기재된 약제학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어, 비히클, 보조제, 부형제 및 희석제는 당업자에게 잘 알려져 있고 대중에게 용이하게 입수 가능하다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 치료제(들)에 대해 화학적으로 불활성이고 사용 조건 하에서 유해한 부작용 또는 독성이 없는 것이 바람직하다.
담체의 선택은 특정 치료제 뿐만아니라 치료제를 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정될 것이다. 따라서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물의 다양한 적합한 제형이 존재한다.
특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 보존제를 포함한다 특정 실시형태에서, 적합한 보존제는 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산나트륨, 및 염화벤즈알코늄을 포함할 수 있다. 선택적으로, 둘 이상의 보존제의 혼합물이 사용될 수 있다. 보존제 또는 이의 혼합물은 일반적으로 전체 조성물의 약 0.0001중량% 내지 약 2중량%의 양으로 존재한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 완충제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적합한 완충제는, 예를 들어, 시트르산, 시트르산나트륨, 인산, 인산칼륨, 및 다양한 기타 산 및 염을 포함할 수 있다. 둘 이상의 완충제의 혼합물이 선택적으로 사용될 수 있다. 완충제 또는 이들의 혼합물은 일반적으로 총 조성물의 약 0.001중량% 내지 약 4중량%의 양으로 존재한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물 중의 치료제의 농도는 예를 들어, 중량 기준으로 약 1% 미만, 또는 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 약 50% 또는 그 초과이고, 선택된 특정 투여 모드에 따라서, 유체 부피 및 점도에 의해서 주로 선택될 수 있다.
경구, 에어로졸, 비경구(예를 들어, 피하, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내, 복강내 및 척추강내) 및 국소 투여를 위한 하기 제형은 단지 예시적이며 어떠한 방식으로도 제한이 아니다. 하나 이상의 경로가 본 명세서에 제공된 치료제를 투여하는 데 사용될 수 있으며, 특정 경우에 특정 경로는 다른 경로보다 더 즉각적이고 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
경구 투여에 적합한 제형은 (a) 액체 용액, 예컨대, 물, 식염수 또는 오렌지 주스와 같은 희석제에 용해된 유효량의 치료제; (b) 캡슐, 사쉐(sachet), 정제, 로젠지 및 트로키(각각 미리 결정된 양의 활성 성분을 고체 또는 과립 형태로 함유함); (c) 분말 (d) 적절한 액체의 현탁액 및 (e) 적합한 에멀션을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 액체 제형은 약제학적으로 허용 가능한 계면활성제의 첨가 여부에 관계없이 물 및 알코올, 예를 들어, 에탄올, 벤질 알코올 및 폴리에틸렌 알코올과 같은 희석제를 포함할 수 있다. 캡슐 형태는 예를 들어, 계면 활성제, 윤활제 및 락토스, 자당, 인산 칼슘 및 옥수수 전분과 같은 불활성 충전제를 함유하는 일반적인 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 유형일 수 있다. 정제는 하나 이상의 락토스, 수크로스, 만니톨, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산, 미결정 셀룰로오스, 아카시아, 젤라틴, 구아검, 콜로이드성 이산화규소, 크로스카멜로스 소듐, 탤크, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 스테아르 산 아연, 스테아르산, 및 다른 보존제, 향미제, 및 약제학적으로 허용 가능한 분해제, 습윤제, 보존제, 향미제, 및 약리학적으로 호환 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 로젠지 형태는 일반적으로 자당, 아카시아 또는 트래거캔스와 같은 향미제와 치료제를 포함할 수 있다. 알약(pastille)은 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아, 에멀션, 겔 등과 같은 불활성 염기를 갖는 치료제를 포함할 수 있으며, 이에 더하여 당업계에 공지된 이러한 부형제를 함유할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제형은 항산화제, 완충액, 정균제, 및 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁화제, 가용화제, 증점제, 안정제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 치료제는 약제학적 담체, 예컨대, 멸균 액체 또는 물, 염수, 수성 덱스트로스 및 관련 당 용액을 포함하는 액체의 혼합물, 알코올, 예컨대, 에탄올 또는 헥사데실 알코올, 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜, 다이메틸설폭사이드, 글리세롤, ketals 예컨대 2,2-다이메틸-1,3-다이옥솔란-4-메탄올, 에터, 폴리(에틸렌글리콜) 400, 오일, 지방산, 지방산 에스터 또는 글리세리드 또는 아세틸화된 지방산 글리세리드(약제학적으로 허용 가능한 계면활성제, 예컨대, 비누 또는 세제, 현탁화제, 예컨대, 펙틴, 카보머, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 또는 카복시메틸셀룰로스 또는 유화제 및 다른 약제학적 아주반트를 함유하거나 함유하지 않음) 중의 생리학적으로 허용 가능한 희석제로 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서 비경구 제형에 사용될 수 있는 오일은 석유, 동물성 오일, 식물성 오일, 또는 합성 오일을 포함한다. 오일의 특정 예는 땅콩, 대두, 참깨, 면실유, 옥수수, 올리브, 바셀린 및 광유를 포함한다. 비경구 제형에 사용하기에 적합한 지방산은 올레산, 스테아르산, 및 아이소스테아르산을 포함한다. 에틸 올레에이트 및 아이소프로필 미리스테이트는 적합한 지방산 에스터의 예이다.
비경구 제형의 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 비누는 지방 알칼리 금속, 암모늄, 및 트라이에탄올아민 염을 포함하고, 적합한 세제에는 (a) 양이온성 세제, 예를 들어, 다이메틸 다이알킬 암모늄 할라이드 및 알킬 피리디늄 할라이드, (b) 음이온성 세제, 예를 들어, 알킬, 아릴 및 올레핀 설포네이트, 알킬, 올레핀, 에터, 및 모노글리세라이드 설페이트, 및 설포석시네이트, (c) 비이온성 세제, 예를 들어, 지방 아민 산화물, 지방산 알칸올아마이드, 및 폴리옥시에틸렌폴리프로필렌 공중합체, (d) 양쪽성 세제, 예를 들어, 알킬-β-아미노프로피오네이트, 및 2-알킬-이미다졸린 4차 암모늄 염, 및 (e) 이들의 혼합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 비경구 제형은 예를 들어, 용액 중 치료제의 약 0.5 중량% 내지 약 25 중량%를 함유할 것이다. 보존제 및 완충액을 사용할 수 있다. 주사 부위의 자극을 최소화하거나 제거하기 위해, 이러한 조성물은 예를 들어, 친수성-친유성 균형(HLB)이 약 12 내지 약 17인 하나 이상의 비이온성 계면활성제를 함유할 수 있다. 이러한 제형 중 계면활성제의 양은 전형적으로, 예를 들어, 약 5 중량% 내지 약 15 중량%의 범위일 것이다. 적합한 계면활성제는 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄 모노올레에이트와 같은 소르비탄 지방산 에스터, 및 프로필렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 축합에 의해 형성된 소수성 염기를 갖는 에틸렌 옥사이드의 고분자량 부가물을 포함한다. 비경구 제형은 앰플 또는 바이알과 같은 단위 용량 또는 다중 용량 밀봉 용기로 제공될 수 있으며, 주사의 경우 사용 직전에 물과 같은 멸균 액체 부형제만 추가하면 되는 냉동 건조(동결 건조) 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 앞서 설명한 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조할 수 있다.
특정 실시형태에서, 주사 가능한 제형이 본 명세서에 제공된다. 주사 가능한 조성물을 위한 효과적인 약제학적 담체에 대한 요건은 당업자에게 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982), 및 ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed, pages 622-630 (1986))] 참조).
일부 실시형태에서, 국소 제형이 본 명세서에 제공된다. 경피 약물 방출에 유용한 것을 포함하는 국소 제형은 피부에 적용하기 위해 본 명세서에 제공된 특정 실시형태의 맥락에서 적합하다. 일부 실시형태에서, 치료제는 단독으로 또는 다른 적합한 성분과 조합하여 흡입을 통해 투여될 에어로졸 제형으로 제조될 수 있다. 이러한 에어로졸 제형은 다이클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등과 같은 가압된 허용 가능한 추진제에 배치될 수 있다. 이들은 또한 네불라이저 또는 아토마이저와 같은 비압축 제제용 약제로 제형화될 수 있다. 이러한 스프레이 제형은 또한 점막을 스프레이하는 데 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 치료제는 사이클로덱스트린 내포 복합체 또는 리포솜과 같은 내포 복합체로서 제형화될 수 있다. 리포솜은 특정 조직에 치료제를 표적화하는 역할을 할 수 있다. 리포솜은 또한 치료제의 반감기를 증가시키는 데 사용될 수 있다. 리포솜을 제조하기 위한 다양한 방법이 사용 가능하고, 예를 들어, 문헌[Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9, 467 (1980)] 및 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호 및 제5,019,369호에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 치료제는 시간-방출, 지연 방출 또는 지속 방출 전달 시스템으로 제형화되어, 조성물의 전달이 치료될 부위의 감작을 야기하기에 충분한 시간과 함께 일어나도록 한다. 이러한 시스템은 치료제의 반복 투여를 피할 수 있고, 이에 의해 대상체 및 의사에게 편의성을 증가시킬 수 있고, 본 명세서에 제공된 특정 조성물 실시형태에 특히 적합할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 그 내에 함유된 circRNA의 연장 방출에 적합하도록 제형화된다. 이러한 연장 방출 조성물은 연장된 투여 간격으로 대상체에게 편리하게 투여될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 1일 2회, 일 단위로 또는 격일로 대상체에게 투여된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 대상체에게 주 2회, 주 1회, 10일마다, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 1개월에 1회, 6주마다, 8주마다, 3개월마다, 4개월마다, 6개월마다, 8개월마다, 9개월마다 또는 매년 투여된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질은 지속된 시간 동안 표적 세포에 의해 생산된다. 예를 들어, 단백질은 투여 후 1시간 초과, 4시간 초과, 6시간 초과, 12시간 초과, 24시간 초과, 48시간 초과, 또는 72시간 초과 동안 생산될 수 있다. 일부 실시형태에서 폴리펩타이드는 투여 후 약 6시간 후에 최고 수준으로 발현된다. 일부 실시형태에서 폴리펩타이드의 발현은 적어도 치료 수준에서 지속된다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 투여 후 1시간 초과, 4시간 초과, 6시간 초과, 12시간 초과, 24시간 초과, 48시간 초과, 또는 72시간 초과 동안 적어도 치료 수준으로 발현된다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 환자 조직(예를 들어, 간 또는 폐)에서 치료 수준에서 검출 가능하다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 폴리펩타이드의 수준은 투여 후 1시간 초과, 4시간 초과, 6시간 초과, 12시간 초과, 24시간 초과, 48시간 초과, 또는 72시간 초과의 기간에 걸쳐 circRNA 조성물로부터의 연속 발현으로부터 유래한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 단백질은 정상 생리학적 수준보다 높은 수준으로 생산된다. 단백질 수준은 대조군에 비해 증가할 수 있다. 일부 실시형태에서, 대조군은 정상 개체 또는 정상 개체 집단에서 폴리펩타이드의 기준선 생리학적 수준이다. 다른 실시형태에서, 대조군은 관련 단백질 또는 폴리펩타이드가 결핍된 개체 또는 관련 단백질 또는 폴리펩타이드가 결핍된 개체 집단에서 폴리펩타이드의 기준선 생리학적 수준이다. 일부 실시형태에서, 대조군은 조성물이 투여되는 개체에서 관련 단백질 또는 폴리펩타이드의 정상 수준일 수 있다. 다른 실시형태에서, 대조군은 다른 치료적 개입 시, 예를 들어, 하나 이상의 유사한 시점에서 상응하는 폴리펩타이드의 직접 주사 시 폴리펩타이드의 발현 수준이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 단백질의 수준은 투여 후 3일, 4일, 5일, 또는 1주에 또는 그보다 더 긴 시간 후에 검출 가능하다. 증가된 수준의 단백질은 조직(예를 들어, 간 또는 폐)에서 관찰될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 단백질의 지속적인 순환 반감기를 산출한다. 예를 들어, 단백질은 단백질 또는 단백질을 암호화하는 mRNA의 피하 주사를 통해 관찰된 반감기보다 더 긴 시간 또는 수일 동안 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질의 반감기는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 또는 1주 이상이다.
많은 유형의 방출 전달 시스템이 이용 가능하고 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 중합체계 시스템, 예컨대, 폴리(락티드-글리콜리드), 코폴리옥살레이트, 폴리카프로락톤, 폴리에스터아마이드, 폴리오쏘에스터, 폴리하이드록시부티르산 및 폴리무수물을 포함한다. 약물을 함유하는 상기 중합체의 마이크로캡슐은 예를 들어, 미국 특허 제5,075,109호에 기재되어 있다. 전달 시스템은 또한 지질, 예를 들어, 스테롤, 예컨대, 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스터 및 지방산 또는 중성 지방, 예컨대, 모노-다이- 및 트라이-글리세리드인 비중합체 시스템; 하이드로겔 방출 시스템; 시알스틱(sylastic) 시스템; 펩타이드 기반 시스템: 왁스 코팅; 통상적인 결합제 및 부형제를 사용하는 압축 정제; 부분적으로 융합된 임플란트 등을 포함한다. 특정 예는 (a) 활성 조성물이 미국 특허 제4,452,775호, 제4,667,014호, 제4,748,034호 및 제5,239,660호에 기재된 것과 같은 매트릭스 내에 형태로 함유되어 있는 침식 시스템 및 (b) 활성 성분이 미국 특허 제3,832,253호 및 제3,854,480호에 기술된 바와 같이 중합체로부터 제어된 속도로 침투하는 확산 시스템을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 또한, 펌프 기반 하드웨어 전달 시스템을 사용할 수 있고, 그 중 일부는 이식에 적합하다.
일부 실시형태에서, 치료제는 표적화 모이어티에 연결 모이어티를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 치료제를 표적화 모이어티에 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Wadwa et al., J, Drug Targeting 3:111 (1995)] 및 미국 특허 제5,087,616호 참조.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 치료제는 치료제가 투여되는 신체 내로 방출되는 방식이 신체 내 시간 및 위치에 대해 제어되도록 저장소 형태로 제형화된다(예를 들어, 미국 특허 제4,450,150호 참조). 치료제의 저장소 형태는 예를 들어, 치료제 및 중합체와 같은 다공성 또는 비다공성 물질을 포함하는 이식 가능한 조성물일 수 있고, 여기서 치료제는 물질 및/또는 비-다공성 물질의 분해에 의해서 캡슐화거나 그 전체에 확산된다. 그 다음 저장소는 신체 내 원하는 위치에 이식되고 치료제는 미리 결정된 속도로 임플란트에서 방출된다.
16. 치료 방법
특정 양상에서, 본 명세서에는 병태, 예를 들어, 자가면역 장애 또는 암을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 치료제는 (예를 들어, 동일한 약제학적 조성물로 또는 별도의 약제학적 조성물로) 하나 이상의 추가 치료제와 공동 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 치료제가 먼저 투여될 수 있고 하나 이상의 추가 치료제가 두 번째로 투여될 수 있거나, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 대안적으로, 본 명세서에 제공된 치료제 및 하나 이상의 추가 치료제는 동시에 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 언급된 포유동물은 설치목의 포유동물, 예컨대, 마우스 및 햄스터 또는 토끼와 같은 토끼목의 포유동물, 예컨대, 토끼를 포함하는 임의의 포유동물일 수 있다. 포유동물은 고양이과(고양이)와 개과(개)를 포함하여 육식 동물 목에서 유래할 수 있다. 포유동물은 소류(소) 및 돼지류(돼지)를 포함하는 우제류목 또는 말류(말)을 포함하는 말목에 속할 수 있다. 포유동물은 영장류, 세보이드(Ceboids) 또는 시모이드(Simoids(원숭이)) 또는 진원류목(order Anthropoids)(인간 및 원숭이)일 수 있다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
17. 서열
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Figure pct00469
Figure pct00470
Figure pct00471
Figure pct00472
Figure pct00473
일부 실시형태에서, 본 발명의 IRES는 표 17에 열거된 서열(서열번호 1 내지 72 및 348 내지 389)을 갖는 IRES이다. 일부 실시형태에서, IRES는 살리바이러스 IRES이다. 일부 실시형태에서, IRES는 살리바이러스 SZ1 IRES이다. 일부 실시형태에서, IRES는 AP1.0(서열번호 348)이다. 일부 실시형태에서, IRES는 CK1.0(서열번호 349)이다. 일부 실시형태에서, IRES는 PV1.0(서열번호 350)이다. 일부 실시형태에서, IRES는 SV1.0(서열번호 351)이다.
Figure pct00474
Figure pct00475
Figure pct00476
일부 실시형태에서, 5' 인트론 단편은 표 18에 열거된 서열을 갖는 단편이다. 전형적으로, 표 18에 열거된 5' 인트론 단편을 함유하는 작제물은 표 19에 열거된 바와 같은 상응하는 3' 인트론 단편을 함유할 것이다(예를 들어, 둘 다 L9a-8 순열 부위를 갖는 단편을 나타냄).
Figure pct00477
Figure pct00478
Figure pct00479
Figure pct00480
일부 실시형태에서, 3' 인트론 단편은 표 19에 열거된 서열을 갖는 단편이다. 일부 실시형태에서, 표 19에 열거된 3' 인트론 단편을 함유하는 작제물은 표 18에 열거된 바와 같은 상응하는 5' 인트론 단편을 함유할 것이다(예를 들어, 둘 다 L9a-8 순열 부위를 갖는 단편을 나타냄).
Figure pct00481
일부 실시형태에서, 5' 인트론 단편은 표 20에 열거된 서열을 갖는 단편이다. 표 20에 열거된 5' 인트론 단편을 함유하는 작제물은 표 21의 상응하는 3' 인트론 단편을 함유할 것이다(예를 들어, 둘 다 Azop1 인트론을 갖는 단편을 나타냄).
Figure pct00482
Figure pct00483
일부 실시형태에서, 3' 인트론 단편은 표 21에 열거된 서열을 갖는 단편이다. 표 21에 열거된 3' 인트론 단편을 함유하는 작제물은 표 20에 열거된 바와 같은 상응하는 5' 인트론 단편을 함유할 것이다(예를 들어, 둘 다 Azop1 인트론을 갖는 단편을 나타냄).
Figure pct00484
Figure pct00485
Figure pct00486
Figure pct00487
Figure pct00488
일부 실시형태에서, 스페이서 및 5' 인트론 단편은 표 22에 열거된 바와 같은 서열을 갖는 스페이서 및 단편이다.
Figure pct00489
Figure pct00490
Figure pct00491
Figure pct00492
Figure pct00493
Figure pct00494
Figure pct00495
일부 실시형태에서, 스페이서 및 3' 인트론 단편은 표 23에 열거된 바와 같은 서열을 갖는 스페이서 및 인트론 단편이다.
Figure pct00496
Figure pct00497
Figure pct00498
Figure pct00499
Figure pct00500
Figure pct00501
Figure pct00502
Figure pct00503
일부 실시형태에서, CAR은 표 24에 열거된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열에 의해서 암호화된다.
Figure pct00504
일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해서 암호화된 CAR 도메인은 표 25에 열거된 바와 같은 서열을 갖는다.
Figure pct00505
Figure pct00506
일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해서 암호화된 발현 서열을 분리하는 절단 부위는 표 26에 열거된 서열을 갖는다.
Figure pct00507
일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해서 암호화된 사이토카인은 표 27에 열거된 바와 같은 서열을 갖는다.
Figure pct00508
Figure pct00509
일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해서 암호화된 전사 인자는 표 28에 열거된 바와 같은 서열을 갖는다.
Figure pct00510
Figure pct00511
Figure pct00512
Figure pct00513
Figure pct00514
Figure pct00515
Figure pct00516
Figure pct00517
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 원형 RNA 또는 전구체 RNA(예를 들어, 선형 전구체 RNA)는 표 29에 열거된 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 의해서 암호화된 단백질은 본 명세서에 개시된 하나 이상의 서열과 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 유사성을 갖는 서열을 함유한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 의해서 암호화된 단백질은 본 명세서에 개시된 하나 이상의 서열과 동일한 서열을 함유한다.
바람직한 실시형태가 본 명세서에 기재되어 있다. 이러한 바람직한 실시형태의 변형은 전술한 설명을 읽을 때 당업자에게 명백해질 수 있다. 본 발명자들은 숙련된 기술자가 이러한 변형을 적절하게 사용할 것으로 예상하고, 본 발명자들은 본 발명이 본 명세서에 구체적으로 기재된 것과는 달리 실시되기를 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용 가능한 법률이 허용하는 바에 따라 본 명세서에 첨부된 청구범위에 인용된 발명 대상의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 또한, 본 명세서에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 모든 가능한 변형에서 상기에 기재된 요소의 임의의 조합이 본 발명에 포함된다.
실시예
문헌[Wesselhoeft et al. (2019) RNA Circularization Diminishes Immunogenicity and Can Extend Translation Duration In Vivo. Molecular Cell. 74(3), 508-520 및 Wesselhoeft et al. (2018) Engineering circular RNA for Potent and Stable Translation in Eukaryotic Cells. Nature Communications. 9, 2629]은 이의 전문이 참조에 의해 포함된다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더욱 상세하게 설명되지만, 하기 실시예에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 이들 실시예는 본 발명을 만들고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하려는 의도로 예시의 임의의 변형 및 모든 변형을 포함하며, 본 발명으로 간주되는 것의 범주를 제한하려는 것은 아니다.
실시예 1
실시예 1A: 외부 상동성 영역은 순열 인트론 엑손(PIE) 원형화 전략을 사용하여 긴 전구체 RNA의 원형화를 허용한다.
전장 뇌심근염 바이러스(EMCV) IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc) 발현 서열 및 순열 인트론-엑손(PIE) 작제물의 2개의 짧은 엑손 단편을 함유하는 1,100nt 서열을 T4 파지의 티미딜레이트 합성효소(Td) 유전자 내의 순열 그룹 I 촉매적 인트론의 3' 인트론과 5' 인트론 사이에 삽입하였다. 전구체 RNA를 유출 전사에 의해 합성하였다. 마그네슘 이온 및 GTP의 존재 하에서 전구체 RNA를 가열함으로써 원형화를 시도하였지만, 스플라이싱 생성물을 얻지 못했다.
완벽하게 상보적인 9개 뉴클레오타이드 및 19개 뉴클레오타이드 길이 상동성 영역을 설계하고, 전구체 RNA의 5' 단부 및 3' 단부에 추가하였다. 이러한 상동성 아암의 추가는 전구체 RNA 밴드의 소실에 의해 평가된 바와 같이 9개 뉴클레오타이드 상동성 영역의 경우 0에서 16%로, 19개 뉴클레오타이드 상동성 영역의 경우 48%로 스플라이싱 효율을 증가시켰다.
스플라이싱 산물을 RNase R로 처리하였다. RNase R-처리된 스플라이싱 반응의 추정 스플라이스 접합부 전체의 서열결정은 결찰된 엑손을 나타내었고, 올리고뉴클레오타이드-표적화 RNase H로의 RNase R-처리된 스플라이싱 반응의 소화는 RNase H-소화된 선형 전구체에 의해 생성된 2개의 밴드와 대조적으로 단일 밴드를 생성시켰다. 이것은 원형 RNA가 9개 또는 19개 뉴클레오타이드 길이의 외부 상동성 영역을 함유하는 전구체 RNA의 스플라이싱 반응의 주요 산물이라는 것을 나타낸다.
실시예 1B: IRES 및 PIE 스플라이스 부위의 2차 구조를 보존하는 스페이서는 원형화 효율을 증가시킨다.
일련의 스페이서를 설계하고, 3' PIE 스플라이스 부위와 IRES 사이에 삽입하였다. 이 스페이서는 IRES, 3' PIE 스플라이스 부위 및/또는 5' 스플라이스 부위의 인트론 서열 내의 2차 구조를 보존하거나 파괴하도록 설계되었다. 2차 구조를 보존하도록 설계된 스페이서 서열을 추가하면 스플라이싱 효율이 87%인 반면, 파괴적인 스페이서 서열을 추가하면 스플라이싱이 검출되지 않았다.
실시예 2
실시예 2A: 외부 상동성 영역에 더하여 내부 상동성 영역은 스플라이싱 버블을 생성시키고, 여러 발현 서열의 번역을 허용한다.
구조화되지 않고, 인트론 및 IRES 서열과 비-상동성이고, 스페이서-스페이서 상동성 영역을 함유하도록 스페이서를 설계하였다. 이들을 외부 상동성 영역, EMCV IRES 및 가우시아 루시퍼라제(총 길이: 1289nt), 파이어플라이 루시퍼라제(2384nt)에 대한 발현 서열, eGFP(1451nt), 인간 에리쓰로포이에틴(1313 nt) 및 Cas9 엔도뉴클레아제(4934nt)를 함유하는 작제물에서 5' 엑손과 IRES 사이 그리고 3' 엑손과 발현 서열 사이에 삽입하였다. 5개 작제물 모두의 원형화를 달성하였다. T4 파지 및 아나베나 인트론을 사용한 작제물의 원형화는 거의 동일하였다. 원형화 효율은 더 짧은 서열에서 더 높았다. 번역을 측정하기 위해, 각각의 작제물을 HEK293 세포에 형질주입시켰다. 가우시아 및 파이어플라이 루시퍼라제 형질주입된 세포는 발광에 의해 측정된 바와 같이 강력한 반응을 생성시켰고, 인간 에리쓰로포이에틴은 에리쓰로포이에틴 circRNA이 형질주입된 세포의 배지에서 검출 가능하였고, EGFP 형광은 EGFP circRNA가 형질주입된 세포에서 관찰되었다. GFP를 구성적으로 발현하는 세포에 GFP에 지향되는 sgRNA와 함께 Cas9 circRNA를 동시에 형질주입시키는 것은 sgRNA-단독 대조군과 비교하여 최대 97%의 세포에서 형광을 제거하였다.
실시예 2B: CVB3 IRES의 사용은 단백질 생산을 증가시킨다.
내부 및 외부 상동성 영역 및 가우시아 루시퍼라제 또는 파이어플라이 루시퍼라제 발현 서열을 함유하는 상이한 IRES를 갖는 작제물을 제조하였다. 형질주입 24시간 후에 HEK293 세포의 상청액에서 발광에 의해 단백질 생산을 측정하였다. 콕사키바이러스 B3(CVB3) IRES 작제물은 두 경우 모두에서 가장 많은 단백질을 생산하였다.
실시예 2C: polyA 또는 polyAC 스페이서의 사용은 단백질 생산을 증가시킨다.
30개의 뉴클레오타이드 길이의 polyA 또는 polyAC 스페이서를 실시예 2B에서 단백질을 생산한 각각의 IRES를 갖는 작제물의 IRES와 스플라이스 접합부 사이에 추가하였다. 형질주입 24시간 후에 HEK293 세포의 상청액에서 발광에 의해 가우시아 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 두 스페이서 모두 스페이서가 없는 대조군 작제물에 비해 모든 작제물에서 발현을 개선시켰다.
실시예 3
원형 RNA가 형질주입된 HEK293 또는 HeLa 세포는 대등한 비변형 또는 변형된 선형 RNA가 형질주입된 세포보다 더 많은 단백질을 생산한다.
HPLC-정제된 가우시아 루시퍼라제-암호화 circRNA(CVB3-GLuc-pAC)를 표준(canonical) 비변형된 5' 메틸구아노신-캡핑 및 3' polyA-테일 선형 GLuc mRNA 및 상업적으로 입수 가능한 뉴클레오사이드-변형(슈도우리딘, 5-메틸사이토신) 선형 GLuc mRNA(트라이링크사(Trilink) 제품)와 비교하였다. 형질주입 24시간 후에 발광을 측정하였는데, 이는 circRNA가 HEK293 세포에서 비변형된 선형 mRNA보다 811.2% 더 많은 단백질을 생산하고, 변형된 mRNA보다 54.5% 더 많은 단백질을 생산한다는 것을 나타내었다. HeLa 세포에서 유사한 결과가 얻어졌으며, 인간 에리쓰로포이에틴을 암호화하는 최적화된 circRNA를 5-메톡시우리딘으로 변형된 선형 mRNA와 비교하였다.
발광 데이터를 6일에 걸쳐 수집하였다. HEK293 세포에서, circRNA 형질주입은 80시간의 단백질 생산 반감기를 초래하였고, 이는 비변형된 선형 mRNA의 43시간 및 변형된 선형 mRNA의 45시간과 비교된다. HeLa 세포에서, circRNA 형질주입은 116시간의 단백질 생산 반감기를 초래하였고, 이는 비변형된 선형 mRNA의 44시간 및 변형된 선형 mRNA의 49시간과 비교된다. CircRNA는 두 세포 유형 모두에서 수명 동안 비변형된 선형 mRNA 및 변형된 선형 mRNA 둘 다보다 실질적으로 더 많은 단백질을 생산하였다.
실시예 4
실시예 4A : RNase 소화, HPLC 정제 및 포스파타제 처리에 의한 circRNA의 정제는 면역원성을 감소시킨다. 완전히 정제된 원형 RNA는 비정제되거나 부분적으로 정제된 원형 RNA보다 면역원성이 현저히 낮다. 단백질 발현 안정성 및 세포 생존력은 세포 유형 및 원형 RNA 순도에 좌우된다.
인간 배아 신장 293(HEK293) 및 인간 폐 암종 A549 세포를 다음으로 형질주입시켰다:
비정제된 GLuc 원형 RNA 스플라이싱 반응의 산물,
Figure pct00518
스플라이싱 반응의 RNase R 소화의 산물,
Figure pct00519
스플라이싱 반응의 RNase R 소화 및 HPLC 정제의 산물,
Figure pct00520
스플라이싱 반응의 RNase 소화, HPLC 정제 및 포스파타제 처리의 산물.
Figure pct00521
스플라이싱 반응의 RNase R 소화는 형질주입되지 않은 대조군과 비교하여 A549 세포에서 사이토카인 방출을 방지하기에 충분하지 않았다.
비정제된 스플라이싱 반응과 비교하여 인터류킨-6(IL-6)의 상당한 감소 및 인터페론-α1(IFN-α1)의 상당한 증가가 존재하였지만, HPLC 정제의 추가는 사이토카인 방출을 방지하기에 충분하지 않았다.
HPLC 정제 후 그리고 RNase R 소화 전에 포스파타제 처리의 추가는 A549 세포에서 평가된 모든 상향조절된 사이토카인의 발현을 극적으로 감소시켰다. 분비된 단핵구 화학유인물질 단백질 1(MCP1), IL-6, IFN-α1, 종양 괴사 인자 α(TNFα) 및 IFNγ 유도성 단백질-10(IP-10)은 검출 불가능하거나 형질주입되지 않은 기준선 수준으로 떨어졌다.
HEK293 세포에서는 어떠한 실질적인 사이토카인 방출도 존재하지 않았다. A549 세포는 더 높은 순도의 원형 RNA가 형질주입되었을 때 GLuc 발현 안정성 및 세포 생존력이 증가하였다. 완전히 정제된 원형 RNA는 형질주입된 293 세포와 유사한 안정성 표현형을 가졌다.
실시예 4B : 원형 RNA는 유의한 면역원성을 유발하지 않고, RIG-I 리간드가 아니다.
A549 세포에 스플라이싱 반응 산물을 형질주입시켰다.
A549 세포를 다음으로 형질주입시켰다:
Figure pct00522
비정제된 원형 RNA,
Figure pct00523
고분자량(선형 및 원형 연결부) RNA,
Figure pct00524
원형(니킹된(nicked)) RNA,
Figure pct00525
정제된 원형 RNA의 초기 분획(니킹된 RNA 피크와 더 많이 중첩됨),
Figure pct00526
정제된 원형 RNA의 후기 분획(니킹된 RNA 피크와 더 적게 중첩됨),
Figure pct00527
원형화 동안 절단된 인트론, 또는
Figure pct00528
비히클(즉, 비 형질주입되지 않은 대조군).
스플라이싱 반응으로부터 적절하게 순수한 선형 전구체 RNA를 얻는 것이 어렵기 때문에, 전구체 RNA를 스플라이스 부위 결실 돌연변이체(splice site arrival mutation: DS)의 형태로 별도로 합성하고, 정제시켰다. 각각의 경우에 사이토카인 방출 및 세포 생존력을 측정하였다.
스플라이싱 반응 내에 존재하는 대부분의 종뿐만 아니라 전구체 RNA에 대한 응답으로 강력한 IL-6, RANTES 및 IP-10 방출이 관찰되었다. 초기 circRNA 분획은 다른 비-circRNA 분획과 대등한 사이토카인 반응을 유도했는데, 이는 상대적으로 소량의 선형 RNA 오염물이라도 A549 세포에서 실질적인 세포 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다. 후기 circRNA 분획은 형질주입되지 않은 대조군의 것보다 더 많은 사이토카인 반응을 도출하지 못했다. 형질주입 36시간 후 A549 세포 생존력은 다른 모든 분획과 비교하여 후기 circRNA 분획에서 유의하게 더 컸다.
후기 circRNA HPLC 분획, 전구체 RNA 또는 비정제된 스플라이싱 반응을 사용한 A549 세포의 형질주입 시 RIG-I 및 IFN-β1 전사체 유도를 분석하였다. RIG-I 및 IFN-β1 전사체 둘 다의 유도는 전구체 RNA 및 비정제된 스플라이싱 반응보다 후기 circRNA 분획에 대해 더 약했다. 스플라이싱 반응의 RNase R 처리만으로는 이 효과를 제거하기에 충분하지 않았다. 매우 적은 양의 RIG-I 리간드 3p-hpRNA를 원형 RNA에 추가하면 상당한 RIG-I 전사가 유도되었다. HeLa 세포에서, RNase R-소화 스플라이싱 반응의 형질주입은 RIG-I 및 IFN-β1을 유도했지만, 정제된 circRNA는 그렇지 않았다. 전반적으로, HeLa 세포는 A549 세포보다 RNA 종을 오염시키는 데 덜 민감하였다.
스플라이싱 반응 또는 완전히 정제된 circRNA를 A549 세포에 형질주입시킨 후 처음 8시간 이내에 RIG-I, IFN-β1, IL-6 및 RANTES 전사체 유도를 모니터링하는 시간 경과 실험은 circRNA에 대한 일시적인 반응을 나타내지 않았다. 정제된 circRNA는 유사하게 RAW264.7 뮤린 대식세포에서 전염증성 전사체를 유도하는 데 실패하였다.
A549 세포에 EMCV IRES 및 EGFP 발현 서열을 함유하는 정제된 circRNA를 형질주입시켰다. 이것은 전염증성 전사체의 실질적인 유도를 생성하는 데 실패하였다. 이러한 데이터는, 스플라이싱 반응의 비-원형 성분이 이전 연구에서 관찰된 면역원성에 대한 책임이 있으며, circRNA가 RIG-I에 대한 자연 리간드가 아님을 입증한다.
실시예 5
원형 RNA는 TLR에 의한 검출을 회피한다.
TLR 3, 7 및 8 리포터 세포주에 다중 선형 또는 원형 RNA 작제물로 형질주입시키고, 분비된 배아 알칼리 포스파타제(SEAP)를 측정하였다.
인트론 및 상동성 아암 서열을 결실시켜 선형화된 RNA를 작제하였다. 그런 다음 선형 RNA 작제물을 포스파타제로 처리하고(캡핑된 RNA의 경우 캡핑 후) HPLC로 정제시켰다.
시도된 형질주입 중 어느 것도 TLR7 리포터 세포에서 반응을 일으키지 않았다. TLR3 및 TLR8 리포터 세포를 캡핑된 선형화된 RNA, 폴리아데닐화된 선형화된 RNA, 닉킹된 circRNA HPLC 분획 및 초기 circRNA 분획에 의해 활성화시켰다. 후기 circRNA 분획 및 m1ψ-mRNA는 어떤 세포주에서도 TLR 매개 반응을 유발하지 않았다.
제2 실험에서, circRNA를 2가지 방법을 사용하여 선형화시켰다: 마그네슘 이온의 존재 하에 열을 사용한 circRNA의 처리 및 DNA 올리고뉴클레오타이드-가이드 RNase H 소화. 두 방법 모두 소량의 온전한 circRNA를 포함하는 대부분의 전장 선형 RNA를 산출하였다. TLR3, 7, 8 리포터 세포에 원형 RNA, 열에 의해 분해된 원형 RNA 또는 RNase H에 의해 분해된 원형 RNA를 형질주입시키고, 형질주입 36시간 후에 SEAP 분비를 측정하였다. TLR8 리포터 세포는 두 가지 형태 모두의 분해된 원형 RNA에 대한 응답으로 SEAP를 분비했지만, 모의 형질주입보다 원형 RNA 형질주입에 대한 더 큰 응답을 생성하지 않았다. 시험관내 전사된 선형화된 RNA에 의한 TLR3의 활성화에도 불구하고, TLR3 및 TLR7 리포터 세포에서는 분해 조건 또는 온전한 조건에서 활성화가 관찰되지 않았다.
실시예 6
비변형된 원형 RNA는 선형 RNA보다 증가된 지속적인 생체내 단백질 발현을 생성한다.
마우스에 주입하고, HEK293 세포에 비변형된 및 m1ψ-변형된 인간 에리쓰로포이에틴(hEpo) 선형 mRNA 및 circRNA를 형질주입시켰다. m1ψ-mRNA 및 비변형된 circRNA의 등몰 형질주입은 HEK293 세포에서 강력한 단백질 발현을 초래하였다. hEpo 선형 mRNA 및 circRNA는 HEK293 및 A549 세포의 동일한 중량 형질주입 시 GLuc 선형 mRNA 및 circRNA와 비교하여 유사한 상대적 단백질 발현 패턴 및 세포 생존력을 나타냈다.
마우스에서, hEpo circRNA 또는 선형 mRNA를 내장 지방에 주입한 후 혈청에서 hEpo가 검출되었다. 비변형된 circRNA의 주입 후 검출된 hEpo는 비변형된 또는 m1ψ-mRNA로부터의 hEpo보다 더 느리게 붕괴되었고, 주입 후 42시간 동안 여전히 존재하였다. 혈청 hEpo는 비정제된 circRNA 스플라이싱 반응 또는 비변형된 선형 mRNA의 주입 시 신속하게 감소하였다. 비정제된 스플라이싱 반응의 주입은 정제된 circRNA를 포함한 다른 RNA에서는 관찰되지 않은 혈청에서 검출 가능한 사이토카인 반응을 생성시켰다.
실시예 7
원형 RNA는 생체내에서 또는 시험관내에서 지질 나노입자를 통해서 효과적으로 전달될 수 있다.
정제된 원형 RNA를 이온화 가능한 리피도이드 cKK-E12를 사용하여 지질 나노입자(LNP)로 제형하였다(문헌[Dong et al., 2014; Kauffman et al., 2015]). 입자는 5moU로 변형된 상업적으로 이용 가능한 대조군 선형 mRNA를 함유하는 입자의 것과 유사한 평균 크기, 다분산 지수 및 캡슐화 효율을 갖는 균일한 다중층 구조를 형성하였다.
정제된 hEpo circRNA는 LNP에 캡슐화되고 HEK293 세포에 첨가될 때 5moU-mRNA보다 더 큰 발현을 나타냈다. HEK293 세포에서 LNP-RNA의 발현 안정성은 5moU-mRNA 및 circRNA 둘 다에 대해서 약간의 붕괴 지연을 제외하고는 형질주입 시약에 의해 전달된 RNA의 것과 유사하였다. 비변형된 circRNA 및 5moU-mRNA 둘 다는 시험관내에서 RIG-I/IFN-β1을 활성화시키는 데 실패하였다.
마우스에서, LNP-RNA는 내장 지방 조직으로의 국소 주사 또는 간으로의 정맥내 전달에 의해 전달되었다. circRNA로부터의 혈청 hEpo 발현은 더 낮았지만, 두 경우 모두 전달 6시간 후 5moU-mRNA의 발현과 대등하였다. 비변형된 LNP-circRNA의 지방 주입 후 검출된 혈청 hEpo는 LNP-5moU-mRNA로부터의 것보다 더 느리게 붕괴되었고, 혈청에 존재하는 발현 붕괴의 지연은 시험관내에서 언급된 것과 유사하지만, LNP-circRNA 또는 LNP-5moU-mRNA의 정맥내 주입 후 혈청 hEpo는 거의 동일한 속도로 붕괴되었다. 이들 중 어떠한 경우에도 혈청 사이토카인 또는 국소 RIG-I, TNFα 또는 IL-6 전사체 유도의 증가는 존재하지 않았다.
실시예 8
실시예 8A: HEK293, HepG2 및 1C1C7 세포에서 IRES에 의한 발현 및 기능적 안정성.
아나베 인트론/엑손 영역, 가우시아 알루시퍼라제 발현 서열 및 다양한 IRES를 포함하는 작제물을 원형화하였다. 각각의 원형화 반응 100ng을 Lipofect아민 MessengerMax를 사용하여 20,000개의 HEK293 세포, HepG2 세포 및 1C1C7 세포에 개별적으로 형질주입시켰다. 각각의 상청액의 발광을 단백질 발현의 척도로서 24시간 후에 평가하였다. HEK293 세포에서, 크로히바이러스 B, 살리바이러스 FHB, 아이치 바이러스, 살리바이러스 HG-J1 및 엔테로바이러스 J IRES를 포함하는 작제물이 24시간에 가장 큰 발광을 생성시켰다(도 1A). HepG2 세포에서, 아이치 바이러스, 살리바이러스 FHB, EMCV-Cf 및 CVA3 IRES를 포함하는 포함한 작제물이 24시간에 높은 발광을 생성시켰다(도 1B). 1C1C7 세포에서, 살리바이러스 FHB, 아이치 바이러스, 살리바이러스 NG-J1 및 살리바이러스 A SZ-1 IRES를 포함하는 작제물이 24시간에 높은 발광을 생성시켰다(도 1C).
24시간에 더 큰 발광을 생성시키는 더 큰 IRES의 경향이 관찰되었다. 더 짧은 총 서열 길이는 원형화 효율을 증가시키는 경향이 있으므로, 높은 발현 및 상대적으로 짧은 IRES를 선택하면 개선된 작제물을 생성시킬 수 있다. HEK293 세포에서, 크로히바이러스 B IRES를 사용한 작제물이 특히 유사한 길이의 다른 IRES와 비교하여 가장 높은 발광을 생성시켰다(도 2A). IRES 크기에 대해 플로팅된 HepG2 및 1C1C7 세포의 IRES 작제물로부터의 발현을 도 2B 및 도 2C에 도시한다.
HepG2 및 1C1C7 세포에서 선택된 IRES 작제물의 기능적 안정성을 3일에 걸쳐 측정하였다. 20,000개 세포에 100ng의 각각의 원형화 반응을 형질주입시키고, 완전 배지 교체 후 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 24시간마다 측정하였다. 살리바이러스 A GUT 및 살리바이러스 FHB는 HepG2 세포에서 가장 높은 기능적 안정성을 나타내었고, 살리바이러스 N-J1 및 살리바이러스 FHB는 1C1C7 세포에서 가장 안정적인 발현을 생성시켰다(도 3A 및 도 3B).
실시예 8B: 추가 IRES의 스크리닝
HEK293 세포에서 추가 IRES 작제물의 기능적 안정성을 측정하였다. 간략하면, 관심 5' 미번역 영역(UTR)을 GenBank로부터 식별하였다. 선택된 UTR UTR을 5' 단부로부터 675nt로 절단하고, 가우시아 루시퍼라제(Gluc)를 암호화하는 원형 RNA 골격 작제물 내에 그리고 Gluc 암호 영역 앞에 삽입하였다. 원형 RNA를 HEK293 세포에 형질주입하였다. 24시간 후, 상청액을 수집하고, 분비된 Gluc 단백질로부터의 발광을 상업적으로 입수 가능한 시약을 사용하여 측정하였다. 결과를 도 1D 및 도 1E 및 표 30에 제시하며, 이는 다수의 자연 IRES 서열이 원형 RNA 맥락에서 단백질 발현을 향상시킨다는 것을 시사한다.
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실시예 9
주카트 세포에서 IRES에 의한 발현 및 기능성 안정성.
아나베나 인트론/엑손 영역, 가우시아 루시퍼라제 발현 서열 및 이전에 시험된 IRES의 하위세트를 포함하는 2세트의 작제물을 원형화하였다. 60,000개의 주카트 세포에 각각의 원형화 반응 1㎍을 전기천공하였다. 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 전기천공 24시간 후에 측정하였다. 세트 간 비교 및 이전에 정의된 IRES 효능과의 비교를 위해 CVB3 IRES 작제물을 두 세트에 모두에 포함시켰다. CVB1 및 살리바이러스 A SZ1 IRES 작제물은 24시간에 가장 노은 발현을 생성시켰다. 데이터는 도 4A 및 4B에서 찾을 수 있다.
전기천공된 주카트 세포의 각각의 라운드에서 IRES 작제물의 기능적 안정성을 3일에 걸쳐 측정하였다. 60,000개 세포에 1㎍의 각각의 원형화 반응을 전기천공시키고, 그 다음 완전 배지 교체 후 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 24시간마다 측정하였다(도 5A 및 도 5B).
살리바이러스 A SZ1 및 살리바이러스 A BN2 IRES 작제물은 다른 작제물에 비해 높은 기능적 안정성을 가졌다.
실시예 10
주카트 세포에서 원형 RNA 및 선형 RNA의 발현, 기능적 안정성 및 사이토카인 방출.
아나베나 인트론/엑손 영역, 가우시아 루시퍼라제 발현 서열 및 살리바이러스 FHB IRES를 포함하는 작제물을 원형화하였다. 가우시아 루시퍼라제 발현 서열 및 약 150nt polyA 테일을 포함하고, 100%의 우리딘을 5-메톡시 우리딘(5moU)으로 대체하도록 변형된 mRNA를 상업적으로 입수하며, 트라이링크사로부터 구입하였다. 5moU 뉴클레오타이드 변형은 mRNA 안정성 및 발현을 개선시키는 것으로 밝혀져 있다(문헌[Bioconjug Chem. 2016 Mar 16;27(3):849-53]). 주카트 세포에서 변형된 mRNA, 원형화 반응(순수하지 않음) 및 크기 배제 HPLC에 의해 정제된 circRNA(순수함)의 발현을 측정하고, 비교하였다(도 6A). 60,000개 세포에 1㎍의 각각의 RNA 종을 전기천공한 지 24시간 후에 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 측정하였다.
60,000개 세포에 1ug의 각각의 RNA 종을 전기천공하고, 그 다음 완전 배지 교체 후 24시간마다 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 측정하였다. 3일 동안 주카트 세포에서 변형된 mRNA 및 circRNA의 기능적 안정성 데이터의 비교를 도 6B에 도시한다.
60,000개 주카트 세포에 상기에 기재된 각각의 RNA 종 및 3p-hpRNA(공지된 RIG-I 효능제인 5' 트라이포스페이트 헤어핀 RNA) 1㎍를 전기천공한 지 18시간 후에 IFNγ(도 7A), IL-6(도 7B), IL-2(도 7C), RIG-I(도 7D), IFN-β1(도 7E), 및 TNFα(도 7F) 전사 유도를 측정하였다.
실시예 11
단핵구 및 대식세포에서 원형 RNA 및 선형 RNA의 발현.
아나베나 인트론/엑손 영역, 가우시아 루시퍼라제 발현 서열 및 살리바이러스 FHB IRES를 포함하는 작제물을 원형화하였다. 가우시아 루시퍼라제 발현 서열 및 약 150nt polyA 테일을 포함하고, 100%의 우리딘을 5-메톡시 우리딘(5moU)으로 대체하도록 변형된 mRNA를 트라이링크사로부터 구입하였다. 인간 1차 단핵구(도 8A) 및 인간 1차 대식세포(도 8B)에서 원형 mRNA 및 변형된 mRNA의 발현을 측정하였다. 60,000개 세포에 1㎍의 각각의 RNA 종을 전기천공한 지 24시간 후에 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 측정하였다. 24시간마다 배지를 변경하고 인간 1차 대식세포의 전기천공 4일 후에 발광을 또한 측정하였다(도 8C). 결과는 도 8에서 찾을 수 있다. 발광의 차이는 각 경우에 통계학적으로 유의하였다(p < 0.05).
실시예 12
1차 T 세포에서 IRES에 의한 발현 및 기능성 안정성.
아나베나 인트론/엑손 영역, 가우시아 루시퍼라제 발현 서열 및 이전에 시험된 IRES의 하위세트를 포함하는 작제물을 원형화하고, 반응 생성물을 크기 배제 HPLC로 정제시켰다. 150,000개의 1차 인간 CD3+ T 세포에 각각의 circRNA 1㎍을 전기천공하였다. 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 전기천공 24시간 후에 측정하였다(도 9A). 아이치 바이러스 및 CVB3 IRES 작제물은 24시간에 가장 많은 발현을 가졌다.
각각의 작제물의 기능적 안정성을 비교하기 위해서 3일 동안 전기천공 후 24시간마다 발광을 또한 측정하였다(도 9B). 살리바이러스 A SZ1 IRES를 사용한 작제물이 가장 안정적이었다.
실시예 13
1차 T 세포 및 PBMC에서 원형 RNA 및 선형 RNA의 발현 및 기능적 안정성.
아나베나 인트론/엑손 영역, 가우시아 루시퍼라제 발현 서열 및 살리바이러스 A SZ1 IRES 또는 살리바이러스 FHB IRES를 포함하는 작제물을 원형화하였다. 가우시아 루시퍼라제 발현 서열 및 약 150nt polyA 테일을 포함하고, 100%의 우리딘을 5-메톡시 우리딘(5moU)으로 대체하도록 변형된 mRNA를 트라이링크사로부터 구입하였다. 살리바이러스 A SZ1 IRES HPLC 정제된 원형 mRNA 및 변형된 mRNA의 발현을 인간 1차 CD3+ T 세포에서 측정하였다. 살리바이러스 FHB HPLC 정제된 원형, 비정제된 원형 및 변형된 mRNA의 발현을 인간 PBMC에서 측정하였다. 150,000개 세포에 1㎍의 각각의 RNA 종을 전기천공한 지 24시간 후에 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 측정하였다. 1차 인간 T 세포에 대한 데이터를 도 10A 및 도 10B에 도시하고, PBMC에 대한 데이터를 도 10C에 도시한다. 정제된 원형 RNA와 비정제된 않은 원형 RNA 또는 선형 RNA 사이의 발현 차이는 각각의 경우에 유의하였다(p<0.05).
작제물 기능적 안정성을 비교하기 위해서 3일에 걸쳐 전기천공 후 24시간마다 1차 T 세포 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 측정하였다. 데이터를 도 10B에 도시한다. 정제된 원형 RNA와 선형 RNA 사이의 제1일 측정으로부터 상대 발광의 차이는 1차 T 세포에 대해 제2일 및 제3일 둘 다에서 유의하였다.
실시예 14
아나베나 인트론에서 순열 부위에 의한 원형화 효율.
CVB3 IRES, 가우시아 루시퍼라제 발현 서열, 아나베나 인트론/엑손 영역, 스페이서, 내부 상동성 영역 및 상동성 아암을 포함하는 RNA 작제물을 생산하였다. 전통적인 아나베나 인트론 순열 부위 및 P9 내의 5개의 연속 순열 부위를 사용하는 작제물의 원형화 효율을 HPLC로 측정하였다. P9 내의 5개 연속 순열 부위에 대한 HPLC 크로마토그램을 도 11A에 도시한다.
다양한 순열 부위에서 원형화 효율을 측정하였다. 원형화 효율은 circRNA/(circRNA + 전구체 RNA) 각각에 대한 HPLC 크로마토그램 곡선 하 면적으로 정의된다. 각각의 순열 부위에서 원형화 효율의 순위 정량화를 도 11B에 도시한다. 3개의 순열 부위(도 11B에 제시됨)를 추가 조사를 위해 선택하였다.
본 실시예에서 원형 RNA를 시험관내 전사(IVT)에 의해 원형화하고, 그 다음 스핀 칼럼을 통해 정제시켰다. Mg2+ 및 구아노신 뉴클레오타이드와의 추가 인큐베이션 단계가 포함되면 모든 작제물에 대한 원형화 효율이 더 높을 가능성이 있을 것이지만; 이 단계의 제거는 원형 RNA 작제물 간의 비교 및 이의 최적화를 가능하게 하였다. 이러한 최적화 수준은 키메라 항원 수용체를 암호화하는 것과 같은 큰 RNA 작제물로 높은 원형화 효율을 유지하는 데 특히 유용하다.
실시예 15
대안 인트론의 원형화 효율.
가변 종 기원의 순열 그룹 1 인트론 또는 순열 부위 및 CVB3 IRES, 가우시아 루시퍼라제 발현 서열, 스페이서, 내부 상동성 영역 및 상동성 아암을 포함하는 몇몇 불변 요소를 함유하는 전구체 RNA를 생산하였다. 원형화 데이터는 도 12에서 찾을 수 있다. 도 12A는 전구체, CircRNA 및 인트론을 분할하는 크로마토그램을 도시한다. 도 12B는 인트론 작제물의 함수로서, 도 12A에 도시된 크로마토그램에 기초한 원형화 효율의 순위 정량화를 제공한다.
본 실시예에서 원형 RNA를 시험관내 전사(IVT)에 의해 원형화하고, 그 다음 스핀 칼럼 정제시켰다. Mg2+ 및 구아노신 뉴클레오타이드와의 추가 인큐베이션 단계가 포함되면 모든 작제물에 대한 원형화 효율이 더 높을 가능성이 있을 것이지만; 이 단계의 제거는 원형 RNA 작제물 간의 비교 및 이의 최적화를 가능하게 하였다. 이러한 최적화 수준은 키메라 항원 수용체를 암호화하는 것과 같은 큰 RNA 작제물로 높은 원형화 효율을 유지하는 데 특히 유용하다.
실시예 16
상동성 아암 존재 또는 길이에 의한 원형화 효율.
CVB3 IRES, 가우시아 루시퍼라제 발현 서열, 아나베나 인트론/엑손 영역, 스페이서 및 내부 상동성 영역을 포함하는 RNA 작제물을 생산하였다. 30nt, 25% GC 상동성 아암을 갖거나 상동성 아암을 갖지 않는("NA") 3개의 아나베나 인트론 순열 부위를 나타내는 작제물을 시험하였다. 이들 작제물은 Mg2+ 인큐베이션 단계 없이 원형화되도록 하였다. 원형화 효율을 측정하고, 비교하였다. 데이터는 도 13A 및 도 13B에서 찾을 수 있다. 원형화 효율은 상동성 아암이 없는 각각의 작제물에 대해서 더 높았다. 도 13A는 원형화 효율의 순위 정량화를 제공하고; 도 13B는 전구체, circRNA 및 인트론을 분할하는 크로마토그램을 제공한다.
3개의 순열 부위 각각에 대해, 10nt, 20nt 및 30nt의 아암 길이 및 25%, 50% 및 75%의 GC 함량으로 작제물을 생성시켰다. 이들 작제물의 스플라이싱 효율을 측정하고, 상동성 아암이 없는 작제물과 비교하였다(도 14). 스플라이싱 효율은 스플라이싱 반응에서 총 RNA에 대한 유리 인트론의 비율로 정의된다.
도 15A(좌측)는 개선된 스플라이싱 효율에 대한 강한 상동성 아암의 기여를 나타내는 HPLC 크로마토그램을 도시한다. 상단 좌측: 75% GC 함량, 10nt 상동성 아암. 중앙 좌측: 75% GC 함량, 20nt 상동성 아암. 하단 좌측: 75% GC 함량, 30nt 상동성 아암.
도 15A(우측)는 circRNA 피크에서 숄더로 나타나는 증가된 니킹과 쌍을 이루는 증가된 스플라이싱 효율을 나타낸 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 상단 우측: 75% GC 함량, 10nt 상동성 아암. 중앙 우측: 75% GC 함량, 20nt 상동성 아암. 하단 우측: 75% GC 함량, 30nt 상동성 아암.
도 15B(좌측)는 개선된 원형화 효율을 입증하기 위해 가정된 순열 부위 및 상동성 아암의 선택된 조합을 도시한다.
도 15B(우측)는 이. 콜라이(E. coli) polyA 중합효소로 처리된, 개선된 원형화 효율을 입증하기 위해 가정된 순열 부위 및 상동성 아암의 선택된 조합을 도시한다.
본 실시예에서 원형 RNA를 시험관내 전사(IVT)에 의해 원형화하고, 그 다음 스핀 칼럼 정제시켰다. 구아노신 뉴클레오타이드와의 추가적인 Mg2+ 인큐베이션 단계가 포함되면 모든 작제물에 대한 원형화 효율이 더 높을 가능성이 있을 것이지만; 이 단계의 제거는 원형 RNA 작제물 간의 비교 및 이의 최적화를 가능하게 하였다. 이러한 최적화 수준은 키메라 항원 수용체를 암호화하는 것과 같은 큰 RNA 작제물로 높은 원형화 효율을 유지하는 데 특히 유용하다.
실시예 17
키메라 항원 수용체를 암호화하는 원형 RNA
아나베나 인트론/엑손 영역, Kymriah 키메라 항원 수용체(CAR) 발현 서열 및 CVB3 IRES를 포함하는 작제물을 원형화하였다. 100,000개의 인간 1차 CD3+ T 세포에 500ng의 circRNA를 전기천공시키고, GFP 및 파이어플라이 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 라지 세포와 24시간 동안 공배양하였다. 효과기 대 표적 비율(E:T 비율) 0.75:1. 100,000개의 인간 1차 CD3+ T 세포를 모의 전기천공시키고, 대조군으로서 공배양하였다(도 16).
100,000개의 인간 1차 CD3+ T 세포의 세트를 모의 전기천공시키거나 1㎍의 circRNA로 전기천공시킨 다음, GFP 및 파이어플라이 루시퍼라제 E:T 비율 10:1을 안정적으로 발현하는 라지 세포와 48시간 동안 공배양하였다(도 17).
라지 표적 세포의 특이적 용해의 정량화를 파이어플라이 발광의 검출에 의해 결정하였다(도 18). 모의 전기천공되거나 또는 상이한 CAR 서열을 암호화하는 circRNA로 전기천공된 100,000개의 인간 1차 CD3+ T 세포를 GFP 및 파이어플라이 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 라지 세포와 함께 48시간 동안 공배양하였다. 특이적 용해%를 1-[CAR 조건 발광]/[모의 조건 발광]으로 정의하였다. E:T 비율 10:1.
실시예 18
주카트 세포 및 휴지기 인간 T 세포에서 원형 RNA 및 선형 RNA의 발현 및 기능적 안정성.
아나베나 인트론/엑손 영역, 가우시아 루시퍼라제 발현 서열 및 이전에 시험된 IRES의 하위세트를 포함하는 작제물을 원형화하고, 반응 생성물을 크기 배제 HPLC로 정제시켰다. 150,000개의 주카트 세포에 1㎍의 원형 RNA 또는 5moU-mRNA를 전기천공하였다. 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 전기천공 24시간 후에 측정하였다(도 19A 좌측). 150,000개의 휴지기 1차 인간 CD3+ T 세포(자극 후 10일)에 1㎍의 원형 RNA 또는 5moU-mRNA를 전기천공하였다. 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 전기천공 24시간 후에 측정하였다(도 19A 우측).
전기천공하고, 그 다음 완전 배지 교체 후 24시간마다 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 측정하였다. 기능적 안정성 데이터를 도 19B에 도시한다. 원형 RNA는 각각의 경우에 선형 RNA보다 더 높은 기능적 안정성을 가졌고, 주카트 세포에서 더 확연한 차이가 있었다.
실시예 19
선형 RNA 또는 다양한 원형 RNA 작제물로 전기천공된 세포의 IFN-β1, RIG-I, IL-2, IL-6, IFNγ 및 TNFα 전사체 유도.
아나베나 인트론/엑손 영역, 가우시아 루시퍼라제 발현 서열 및 이전에 시험된 IRES의 하위세트를 포함하는 작제물을 원형화하고, 반응 생성물을 크기 배제 HPLC로 정제시켰다. 150,000개의 CD3+ 인간 T 세포에 1㎍의 원형 RNA, 5moU-mRNA 또는 면역자극성 양성 대조군 폴리 이노신:사이토신을 전기천공하였다. IFN-β1(도 20A), RIG-I(도 20B), IL-2(도 20C), IL-6(도 20D), IFNγ(도 20E) 및 TNFα(도 20F) 전사체 유도를 전기천공 18시간 후에 측정하였다.
실시예 20
상이한 양의 원형 RNA 또는 선형 RNA로 전기천공된 CAR 발현 세포에 의한 표적 세포의 특이적 용해 및 IFNγ 전사체 유도; 상이한 E:T 비율에서 CAR 발현 세포에 의한 표적 및 비-표적 세포의 특이적 용해.
아나베나 인트론/엑손 영역, 항-CD19 CAR 발현 서열 및 CVB3 IRES를 포함하는 작제물을 원형화하고, 반응 생성물을 크기 배제 HPLC로 정제시켰다. 모의 전기천공되거나 또는 항-CD19 CAR 서열을 암호화하는 다른 양의 circRNA로 전기천공된 150,000개의 인간 1차 CD3+ T 세포를 2:1의 E:T 비율에서 GFP 및 파이어플라이 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 라지 세포와 함께 12시간 동안 공배양하였다. 라지 표적 세포의 특이적 용해를 파이어플라이 발광의 검출에 의해 결정하였다(도 21A). 특이적 용해 %를 1-[CAR 조건 발광]/[모의 조건 발광]으로 정의하였다. IFNγ 전사체 유도를 전기천공 24시간 후에 측정하였다(도 21B).
150,000개의 인간 1차 CD3+ T 세포를 모의 전기천공시키거나 또는 항-CD19 CAR 서열을 암호화하는 500ng circRNA 또는 m1ψ-mRNA로 전기천공시킨 다음, 상이한 E:T 비율에서 파이어플라이 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 라지 세포와 함께 24시간 동안 공배양하였다. 라지 표적 세포의 특이적 용해 %를 파이어플라이 발광의 검출에 의해 결정하였다(도 22A). 특이적 용해%를 1-[CAR 조건 발광]/[모의 조건 발광]으로 정의하였다.
CAR 발현 T 세포를 또한 상이한 E:T 비율에서 파이어플라이 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 라지 또는 K562 세포와 함께 24시간 동안 공배양하였다. 라지 표적 세포 또는 K562 비-표적 세포의 특이적 용해를 파이어플라이 발광의 검출에 의해 결정하였다(도 22B). 특이적 용해%를 1-[CAR 조건 발광]/[모의 조건 발광]으로 정의한다.
실시예 21
CAR을 암호화하는 원형 RNA 또는 선형 RNA로 전기천공된 T 세포에 의한 표적 세포의 특이적 용해.
아나베나 인트론/엑손 영역, 항-CD19 CAR 발현 서열 및 CVB3 IRES를 포함하는 작제물을 원형화하고, 반응 생성물을 크기 배제 HPLC로 정제시켰다. 인간 1차 CD3+ T 세포에 각각 CD19-표적화 CAR을 암호화하는 500ng의 원형 RNA 또는 등몰량의 m1ψ-mRNA를 전기천공하였다. 라지 세포를 10:1의 E:T 비율로 7일에 걸쳐 CAR-T 세포 배양물에 첨가하였다. 특이적 용해%를 제1일, 제3일, 제5 및 제7일에 두 작제물 모두에 대해서 측정하였다(도 23).
실시예 22
항-CD19 CAR 또는 항-BCMA CAR을 발현하는 T 세포에 의한 라지 세포의 특이적 용해.
아나베나 인트론/엑손 영역, 항-CD19 또는 항-BCMA CAR 발현 서열 및 CVB3 IRES를 포함하는 작제물을 원형화하고, 반응 생성물을 크기 배제 HPLC로 정제시켰다. 150,000개의 1차 인간 CD3+ T 세포에 500ng의 circRNA를 전기천공시킨 다음, 2:1의 E:T 비율로 라지 세포와 공배양하였다. 전기천공 12시간 후 특이적 용해%를 측정하였다(도 24).
실시예 23
실시예 23A: 화합물의 합성
본 발명의 대표적인 이온화 가능한 지질의 합성은 PCT 출원 제 PCT/US2016/052352호, 제PCT/US2016/068300호, 제PCT/US2010/061058호, 제PCT/US2018/058555호, 제PCT/US2018/053569호, 제PCT/US2017/028981호, 제PCT/US2019/025246호, 제PCT/US2018/035419호, 제PCT/US2019/015913호 및 미국 출원 공보 제20190314524호, 제20190321489호 및 제20190314284호에 기재되어 있고, 이들 각각의 내용은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
실시예 23B: 화합물의 합성
본 발명의 대표적인 이온화 가능한 지질의 합성은 내용 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 출원 공보 제US20170210697A1호에 기재되어 있다.
실시예 24
기관에 의한 단백질 발현
FLuc를 암호화하는 원형 또는 선형 RNA를 생성시키고, 하기 제형을 갖는 전달 비히클에 로딩하였다: 50%의 표 10b의 이온화 가능한 지질 15, 10%의 DSPC, 1.5%의 PEG-DMG, 38.5%의 콜레스테롤. CD-1 마우스에게 0.2㎎/㎏을 투여하고, 6시간(라이브 IVIS) 및 24시간(라이브 IVIS 및 생체외 IVIS)에 발광을 측정하였다. 간, 비장, 신장, 폐 및 심장의 총 플럭스(관심 영역에 걸친 광자/초)를 측정하였다(도 25 및 도 26).
실시예 25
비장에서의 발현의 분포
GFP를 암호화하는 원형 또는 선형 RNA를 생성시키고, 하기 제형을 갖는 전달 비히클에 로딩한다: 50%의 표 10b의 이온화 가능한 지질 15, 10%의 DSPC, 1.5%의 PEG-DMG, 38.5%의 콜레스테롤. 제형을 CD-1 마우스에게 투여한다. 유세포 분석법을 비장 세포에서 실시하여 세포 유형에 따른 발현의 분포를 결정한다.
실시예 26
나노입자 조성물의 생성
원형 RNA를 세포로 전달하는데 사용하기 위한 안전하고, 효과적인 나노입자 조성물을 조사하기 위해, 다양한 제형을 제조하고, 시험한다. 구체적으로, 나노입자 조성물의 지질 성분에서 특정 요소 및 이들의 비율을 최적화한다.
나노입자는 1종 유체 스트림으로 또는 2개의 유체 스트림의 미세유체 및 T-접합 혼합과 같은 혼합 공정으로 제조될 수 있는데, 유체 스트림 중 하나가 원형 RNA를 함유하고 다른 하나는 지질 성분을 갖는다.
지질 조성물은 이온화 가능한 지질, 선택적으로 헬퍼 지질(예컨대, DOPE, DSPC 또는 올레산, 미국 앨라배마주 알라바스터 소재의 아반티 폴라 리피즈사(Avanti Polar Lipids)로부터 입수 가능함), PEG 지질(예컨대, PEG-DMG라고도 알려져 있는 1,2-다이미리스토일-sn-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 미국 앨라배마주 알라바스터 소재의 아반티 폴라 리피즈사로부터 입수 가능함) 및 용매, 예를 들어, 에탄올 중의 약, 예를 들어, 40 또는 50mM 농도의 콜레스테롤과 같은 구조 지질을 조합함으로써 제조된다. 용액은 예를 들어, -20℃에서 보관하기 위해 냉동되어야 한다. 지질을 조합하여 목적하는 몰비(예를 들어, 하기 표 31a 및 표 31b 참조)를 생성하고, 물 및 에탄올, 예를 들어, 약 5.5mM 내지 약 25mM의 최종 지질 농도로 희석시킨다.
[표 31a]
Figure pct00535
Figure pct00536
일부 실시형태에서, 전달 비히클은 표 31a에 기재된 바와 같은 제형을 갖는다.
[표 31b]
Figure pct00537
Figure pct00538
일부 실시형태에서, 전달 비히클은 표 31b에 기재된 바와 같은 제형을 갖는다.
circRNA를 포함하는 나노입자 조성물의 경우, 탈이온수 중의 0.1㎎/㎖ 농도의 circRNA 용액을 완충액, 예를 들어, pH 3 내지 4에서 50mM 시트르산나트륨 완충액으로 희석시켜 스톡 용액을 형성한다. 대안적으로, 탈이온수 중의 0.15㎎/㎖ 농도의 circRNA 용액을 완충액, 예를 들어, pH 3 내지 4.5에서 6.25mM 아세트산나트륨 완충액으로 희석시켜 스톡 용액을 형성한다.
원형 RNA 및 지질 성분을 포함하는 나노입자 조성물은 약 5:1 내지 약 50:1의 지질 성분 대 circRNA wt:wt 비율로 원형 RNA를 포함하는 용액과 지질 용액을 조합함으로써 제조된다. 지질 용액을 예를 들어, NanoAssemblr 미세유체 기반 시스템을 사용하여 약 10㎖/분 내지 약 18㎖/분 또는 약 5㎖/분 내지 약 18㎖/분의 유량으로 circRNA 용액에 빠르게 주입하여, 약 1:1 내지 약 4:1의 물 대 에탄올 비율을 갖는 현탁액을 생성시킨다.
나노입자 조성물은 에탄올을 제거하고, 완충액 교환을 달성하기 위해 투석에 의해 처리될 수 있다. 10kDa 또는 20kDa의 분자량 컷오프를 갖는 Slide-A-Lyzer 카세트(미국 일리노이주 락포드 소재의 써모 피셔 사이언티픽사(Thermo Fisher Scientific Inc.))를 사용하여 1차 생성물의 부피의 200배 부피로 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4에 대해 제형을 2회 투석한다. 이어서, 제형을 4℃에서 밤새 투석한다. 생성된 나노입자 현탁액을 0.2㎛ 멸균 필터(독일 늄브레크트 소재의 사르스테트사(Sarstedt)를 통해 유리 바이알로 여과하고, 크림프 마개로 밀봉한다. 0.01㎎/㎖ 내지 0.15㎎/㎖의 나노입자 조성물 용액을 일반적으로 얻는다.
상기에 기재된 방법은 나노-침전 및 입자 형성을 유도한다.
T-접합 및 직접 주입을 포함하지만 이에 제한되지 않는 대안적인 공정을 사용하여 동일한 나노-침전을 달성할 수 있다. B. 나노입자 조성물의 특징규명
Zetasizer Nano ZS(영국 워세스터셔 맬버른 소재의 맬버른 인스트루먼츠사(Malvern Instruments Ltd))를 사용하여 입자 크기, 다분산 지수(PDI) 및 입자 크기를 결정하는 데 있어서 1xPBS 그리고 제타 전위를 결정하는 데 있어서 15mM PBS에서 나노입자 조성물의 제타 전위를 결정할 수 있다.
자외선-가시광선 분광법을 사용하여 나노입자 조성물에서 circRNA의 농도를 결정할 수 있다. 1xPBS에 희석된 제형 100㎕를 메탄올과 클로로폼의 4:1(v/v) 혼합물 900㎕에 첨가한다. 혼합 후, 용액의 흡광도 스펙트럼을 예를 들어, DU 800 분광 광도계(미국 캘리포니아주 브레아 소재의 베크만 쿨터사(Beckman Coulter, Inc.)의 베크만 쿨터)에서 230㎚와 330㎚ 사이에서 기록한다. 나노입자 조성물 중의 circRNA의 농도를 조성물에 사용된 circRNA의 흡광 계수 및 예를 들어, 260㎚의 파장에서의 흡광도와 예를 들어, 330㎚의 파장에서의 기준 값 사이의 차이에 기초하여 계산할 수 있다.
QUANT-IT™ RIBOGREEN® RNA 검정(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠사(Invitrogen Corporation))을 사용하여 나노입자 조성물에 의한 circRNA의 캡슐화를 평가할 수 있다. 샘플을 TE 완충 용액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7.5)에서 대략 5㎍/㎖ 또는 1㎍/㎖의 농도로 희석시킨다. 50㎕의 희석된 샘플을 폴리스티렌 96웰 플레이트로 옮기고, 50㎕의 TE 완충액 또는 50㎕의 2 내지 4% Triton X-100 용액을 웰에 첨가한다. 플레이트를 37℃의 온도에서 15분 동안 인큐베이션시킨다. RIBOGREEN® 시약을 TE 완충액에 1:100 또는 1:200으로 희석시키고, 이 용액 100㎕를 각각의 웰에 첨가한다. 예를 들어, 약 480㎚의 여기 파장 및 예를 들어, 약 520㎚의 방출 파장에서 형광 플레이트 판독기(Wallac Victor 1420 Multilabel Counter; 미국 매사추세츠주 왈텀 소재의 퍼킨 엘머사(Perkin Elmer))를 사용하여 형광 강도를 측정할 수 있다. 각각의 샘플의 형광 값에서 시약 블랭크의 형광 값을 뺀 다음, 무손상 샘플(Triton X-100을 첨가하지 않은 경우)의 형광 강도를 파괴된 샘플(Triton X-100의 첨가로 인해 발생)의 형광 값으로 나누어 유리 circRNA의 백분율을 결정한다.
C. 생체내 제형 연구:
다양한 나노입자 조성물이 표적화 세포에 circRNA를 얼마나 효과적으로 전달하는지를 모니터링하기 위해서, circRNA를 포함하는 상이한 나노입자 조성물을 제조하고, 설치류 집단에 투여한다. 마우스에 지질 나노입자 제형을 갖는 나노입자 조성물을 포함하는 단일 용량을 정맥내, 근육내, 동맥내 또는 종양내 투여한다. 일부 경우에, 마우스가 용량을 흡입하도록 만들 수 있다. 용량 크기는 0.001㎎/㎏에서 10㎎/㎏ 범위일 수 있으며, 여기서 10㎎/㎏은 마우스의 체질량 1㎏마다 나노입자 조성물 중에 10㎎의 circRNA를 포함하는 용량을 기재한다. PBS를 포함하는 대조군 조성물을 또한 사용할 수 있다.
나노입자 조성물을 마우스에게 투여할 때, 특정 제형 및 이의 용량의 용량 전달 프로파일, 용량 반응 및 독성은 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 생물발광 영상화 또는 기타 방법에 의해 측정될 수 있다. 단백질 발현의 시간 경과를 또한 평가할 수 있다. 평가를 위해 설치류로부터 수집한 샘플은 혈액 및 조직(예를 들어, 근육 주사 부위로부터의 근육 조직 및 내부 조직)을 포함할 수 있고; 샘플 수집은 동물 희생을 포함할 수 있다.
circRNA를 포함하는 조성물의 투여에 의해 유도된 더 높은 수준의 단백질 발현은 더 높은 circRNA 번역 및/또는 나노입자 조성물 circRNA 전달 효율을 나타낼 것이다. 비-RNA 성분이 번역 머시너리 자체에 영향을 미치는 것으로 생각되지 않기 때문에, 더 높은 수준의 단백질 발현은 다른 나노입자 조성물 또는 이의 부재에 비해 주어진 나노입자 조성물에 의한 circRNA의 더 높은 전달 효율을 나타낼 가능성이 있다.
실시예 27
나노입자 조성물의 특징규명
Zetasizer Nano ZS(영국 워세스터셔 맬버른 소재의 맬버른 인스트루먼츠사)를 사용하여 입자 크기, 다분산 지수(PDI) 및 입자 크기를 결정하는 데 있어서 1xPBS 그리고 제타 전위를 결정하는 데 있어서 15mM PBS에서 전달 히비클 조성물의 제타 전위를 결정할 수 있다.
자외선-가시광선 분광법은 사용하여 전달 비히클 조성물에서 치료 및/또는 예방(예를 들어, RNA)의 농도를 결정할 수 있다. 1xPBS에 희석된 제형 100㎕를 메탄올과 클로로폼의 4:1(v/v) 혼합물 900㎕에 첨가한다. 혼합 후, 용액의 흡광도 스펙트럼을 예를 들어, DU 800 분광 광도계(미국 캘리포니아주 브레아 소재의 베크만 쿨터사(Beckman Coulter, Inc.)의 베크만 쿨터)에서 230㎚와 330㎚ 사이에서 기록한다. 전달 비히클 조성물에서 치료 및/또는 예방의 농도를 조성물에 사용된 치료 및/또는 예방의 흡광 계수 및 예를 들어, 260㎚의 파장에서의 흡광도와 예를 들어, 330㎚의 파장에서의 기준 값 사이의 차이에 기초하여 계산할 수 있다.
RNA를 포함하는 전달 비히클 조성물의 경우, QUANT-IT™ RIBOGREEN® RNA 검정(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠사(Invitrogen Corporation))을 사용하여 전달 비히클에 의한RNA의 캡슐화를 평가할 수 있다. 샘플을 TE 완충 용액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7.5)에서 대략 5㎍/㎖ 또는 1㎍/㎖의 농도로 희석시킨다. 50㎕의 희석된 샘플을 폴리스티렌 96웰 플레이트로 옮기고, 50㎕의 TE 완충액 또는 50㎕의 2 내지 4% Triton X-100 용액을 웰에 첨가한다. 플레이트를 37℃의 온도에서 15분 동안 인큐베이션시킨다. RIBOGREEN® 시약을 TE 완충액에 1:100 또는 1:200으로 희석시키고, 이 용액 100㎕를 각각의 웰에 첨가한다. 예를 들어, 약 480㎚의 여기 파장 및 예를 들어, 약 520㎚의 방출 파장에서 형광 플레이트 판독기(Wallac Victor 1420 Multilabel Counter; 미국 매사추세츠주 왈텀 소재의 퍼킨 엘머사(Perkin Elmer))를 사용하여 형광 강도를 측정할 수 있다. 각각의 샘플의 형광 값에서 시약 블랭크의 형광 값을 뺀 다음, 무손상 샘플(Triton X-100을 첨가하지 않은 경우)의 형광 강도를 파괴된 샘플(Triton X-100의 첨가로 인해 발생)의 형광 값으로 나누어 유리 RNA의 백분율을 결정한다.
실시예 28
T 세포 표적화
전달 비히클을 T-세포에 표적화하기 위해, T 세포 항원 결합제, 예를 들어, 항-CD8 항체를 전달 비히클의 표면에 커플링시킨다. 항-T 세포 항원 항체를 PBS 중의 EDTA의 존재 하에서 과량의 DTT로 약간 환원시켜 유리 힌지 영역 티올을 노출시킨다. DTT를 제거하기 위해서, 항체를 탈염 칼럼에 통과시킨다. 이종이작용성 가교제 SM(PEG)24를 사용하여 circRNA-로딩된 전달 비히클의 표면에 항체를 고정시킨다(아민기가 PEG 지질의 헤드기에 존재하고, DTT, 아민과 티올기 간의 SM(PEG)24 가교에 의해서 항체 상의 유리 티올기가 생성되었다). 전달 비히클을 먼저 과량의 SM(PEG)24와 함께 인큐베이션시키고, 원심분리시켜 미반응 가교제를 제거한다. 이어서 활성화된 전달 비히클을 과량의 감소된 항-T 세포 항원 항체와 함께 인큐베이션시킨다. 결합되지 않은 항체를 원심 여과 장치를 사용하여 제거한다.
실시예 29
RV88을 사용한 RNA 함유 전달 비히클.
본 실시예에서, RNA 함유 전달 비히클을 circRNA의 전달을 위해 양이온성 지질 RV88과 함께 2-D 보텍스 미세유체 칩을 사용하여 합성한다.
Figure pct00539
[표 32a]
Figure pct00540
RV88, DSPC 및 콜레스테롤을 모두 보로실리카 바이알에서 10㎎/㎖ 농도의 에탄올에서 제조한다. 지질 14:0-PEG2K PE를 보로실리카 유리 바이알에서도 4㎎/㎖의 농도로 제조한다. 스톡 농도에서 지질의 용해를 2분 동안 에탄올에서 지질의 초음파처리에 의해 달성한다. 그런 다음 용액을 10분 동안 37℃에서 170rpm으로 설정된 궤도 틸팅 진탕기에서 가열한다. 그런 다음 바이알을 최소 45분 동안 26℃에서 평형화한다. 이어서, 표 32b에 나타낸 바와 같은 부피의 스톡 지질을 첨가함으로써 지질을 혼합한다. 이어서, 용액을 최종 지질 농도가 7.92㎎/㎖가 되도록 에탄올로 조정한다.
[표 32b]
Figure pct00541
pH 6.0의 75mM 시트르산염 완충액 및 1.250㎎/㎖의 RNA 농도를 갖는 스톡 용액으로서 RNA를 제조한다. 그 다음, RNA의 농도를 26℃로 평형화된 pH 6.0에서 75mM 시트르산염 완충액을 사용하여 0.1037㎎/㎖로 조정한다. 그 다음, 용액을 26℃에서 최소 25분 동안 인큐베이션시킨다.
미세유체 챔버를 에탄올로 세정하고, RNA 용액을 주사기에 로딩하고, 에탄올 지질을 다른 주사기에 로딩하여 neMYSIS 주사기 펌프를 준비한다. 두 주사기 모두를 로딩하고, neMESYS 소프트웨어의 제어 하에 둔다. 그 다음, 용액을 2의 수성상 대 유기의 비율 및 22㎖/분(RNA의 경우 14.67㎖/분, 지질 용액의 경우 7.33㎖/분)의 총 유량으로 혼합 칩에 적용한다. 두 펌프를 동시에 시작한다. 미세유체 칩에서 흘러나온 혼합액을 4×1㎖ 분획으로 수집하고, 첫 번째 분획은 폐기물로 버린다. RNA-리포솜을 함유하는 나머지 용액을 G-25 mini 탈염 칼럼을 사용함으로써 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7.5로 교환한다. 완충액 교환 후, 물질을 각각 DLS 분석 및 Ribogreen 검정을 통해 크기 및 RNA 포획에 대해 특징규명한다.
실시예 30
RV94을 사용한 RNA 함유 전달 비히클.
본 실시예에서, RNA 함유 리포솜을 circRNA의 전달을 위해 양이온성 지질 RV94과 함께 2-D 보텍스 미세유체 칩을 사용하여 합성한다.
Figure pct00542
Figure pct00543
지질을 표 34에 제시된 물질 양을 사용하여 실시예 29에서와 같이 7.92㎎/㎖의 최종 지질 농도로 제조하였다.
Figure pct00544
circRNA의 수용액을 pH 6.0의 75mM 시트레이트 완충액과 1.250㎎/㎖의 circRNA를 포함하는 스톡 용액으로 제조한다. 그 다음, RNA의 농도를 26℃로 평형화된 pH 6.0에서 75mM 시트르산염 완충액을 사용하여 0.1037㎎/㎖로 조정한다. 그 다음, 용액을 26℃에서 최소 25분 동안 인큐베이션시킨다.
미세유체 챔버를 에탄올로 세정하고, RNA 용액을 주사기에 로딩하고, 에탄올 지질을 다른 주사기에 로딩하여 neMYSIS 주사기 펌프를 준비한다. 두 주사기 모두를 로딩하고, neMESYS 소프트웨어의 제어 하에 둔다. 그 다음, 용액을 2의 수성상 대 유기의 비율 및 22㎖/분(RNA의 경우 14.67㎖/분, 지질 용액의 경우 7.33㎖/분)의 총 유량으로 혼합 칩에 적용한다. 두 펌프를 동시에 시작한다. 미세유체 칩에서 흘러나온 혼합액을 4×1㎖ 분획으로 수집하고, 첫 번째 분획은 폐기물로 버린다. circRNA-전달 비히클을 함유하는 나머지 용액을 상기에 기재된 바와 같이 G-25 mini 탈염 칼럼을 사용함으로써 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7.5로 교환한다. 완충액 교환 후, 물질을 각각 DLS 분석 및 Ribogreen 검정을 통해 크기 및 RNA 포획에 대해 특징규명한다. 리포솜의 생물물리학적 분석을 표 35에 제시한다.
Figure pct00545
실시예 31
인라인 혼합을 위한 일반적인 프로토콜.
하나는 지질을 함유하고 다른 하나는 circRNA를 함유하는 개별 및 별개의 스톡 용액을 제조한다. 목적하는 지질 또는 지질 혼합물, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG 지질을 함유하는 지질 스톡을 90% 에탄올에 용해시킴으로써 준비한다. 나머지 10%는 낮은 pH 시트르산염 완충액이다. 지질 스톡의 농도는 4㎎/㎖이다. 이 시트르산염 완충액의 pH는 사용되는 지질의 유형에 따라 pH 3내지 pH 5 범위일 수 있다. circRNA를 또한 4㎎/㎖ 농도의 시트르산염 완충액에 용해시킨다. 5㎖의 각각의 스톡 용액을 준비한다.
스톡 용액은 완전히 투명하고, 지질은 circRNA와 조합하기 전에 완전히 가용화되도록 보장된다. 스톡 용액을 가열하여 지질을 완전히 가용화시킬 수 있다. 이러한 공정에서 사용되는 circRNA는 비변형된 올리고뉴클레오타이드 또는 변형된 올리고뉴클레오타이드일 수 있으며, 콜레스테롤과 같은 친유성 모이어티와 접합될 수 있다.
각각의 용액을 T-접합부로 펌핑하여 개별 스톡을 배합한다. 이중-헤드 Watson-Marlow 펌프를 사용하여 2개의 스트림의 시작 및 중지를 동시에 제어한다. 1.6mm 폴리프로필렌 튜빙을 선형 유량을 증가시키기 위해 0.8mm 튜빙으로 추가로 축소시킨다. 폴리프로필렌 라인(ID=0.8mm)을 T-접합부의 양쪽에 부착한다. 폴리프로필렌 T는 1.6mm의 선형 모서리를 갖고, 결과적인 부피는 4.1mm3이다. 폴리프로필렌 라인의 큰 단부(1.6mm) 각각을 가용화된 지질 스톡 또는 가용화된 circRNA를 함유하는 시험 튜브에 배치한다. T-접합부 이후에, 배합된 스트림이 나가는 곳에 단일 튜브를 배치한다. 그 다음 튜빙을 2배 부피의 PBS가 있는 용기로 연장하고, 이것을 신속하게 교반한다. 펌프의 유량은 300rpm 또는 110㎖/분의 설정이다. 에탄올을 제거하고, 투석에 의해서 PBS에 대해 교환한다. 그 다음 지질 제형을 원심분리 또는 정용여과를 사용하여 적절한 작업 농도로 농축시킨다.
C57BL/6 마우스(미국 매사추세츠주 소재의 찰스 리버 랩스(Charles River Labs))에게 꼬리 정맥 주사를 통해 식염수 또는 제형화된 circRNA를 제공한다. 투여 후 다양한 시점에서, 혈청 샘플을 안와 후 출혈에 의해 수집한다. 인자 VII 단백질의 혈청 수준을 발색 검정(Biophen FVTI, 미국 오하이오주 애니아라사(Aniara Corporation))을 사용하여 샘플에서 결정한다. 인자 VII의 간 RNA 수준을 결정하기 위해서, 동물을 희생시키고, 간을 수거하고, 액체 질소에서 급속 냉동한다. 조직 용해물을 냉동 조직으로부터 준비하고, 인자 VII의 간 RNA 수준을 분지화 DNA 검정(QuantiGene Assay, 미국 캘리포니아주 소재의 파노믹스사(Panomics))을 사용하여 정량한다.
C57BL/6 마우스에서 정맥내(볼러스) 주사 후 48시간에 FVTI siRNA 처리된 동물에서 FVII 활성을 평가한다. 마이크로플레이트 규모에서 제조자의 지시에 따라, 혈청 또는 조직에서 단백질 수준을 결정하기 위한 상업적으로 입수 가능한 키트를 사용하여 FVII를 측정한다. 미처리 대조군 마우스에 대해 FVII 감소를 결정하고, 그 결과를 잔류 FVII%로 표현한다. 2가지 용량 수준(0.05 및 0.005㎎/㎏ FVII siRNA)을 각각의 신규 리포솜 조성물의 스크린에 사용한다.
실시예 32
사전형성된 소포를 사용한 circRNA 제형
사전형성된 비히클을 함유하는 양이온성 지질을 사전 형성된 소포 방법을 사용하여 제조한다. 양이온성 지질, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질을 각각 40/10/40/10의 몰비로 에탄올에 용해시킨다. 최종 에탄올 및 지질 농도가 각각 30%(vol/vol) 및 6.1㎎/㎖가 되도록 혼합하면서 수성 완충액(50mM 시트르산염, pH 4)에 지질 혼합물을 첨가하고, 실온에서 2분 동안 평형을 유지하도록 한 다음 압출한다. Nicomp 분석에 의해 결정된 바와 같이 70 내지 90㎚의 소포 직경이 얻어질 때까지, Lipex 압출기(캐나다 BC주 밴쿠버 소재의 노던 리피즈사(Northern Lipids)를 사용하여 22℃에서 2개의 적층된 80㎚ 기공 크기 필터(Nuclepore)를 통해 수화된 지질을 압출한다. 작은 소포를 형성하지 않는 양이온성 지질 혼합물의 경우, DSPC 헤드기 상의 포스페이트기를 양성자화하기 위해서 더 낮은 pH 완충액(50mM 시트르산염, pH 3)를 사용하여 지질 혼합물을 수화시키는 것이 안정적인 70 내지 90㎚ 소포를 형성하는 데 도움이 된다.
FVII circRNA(50mM 시트르산염, 30% 에탄올을 함유하는 pH 4 수용액에 가용화됨)를 혼합하면서 약 5㎖/분의 속도로 35℃로 미리 평형화된 소포에 첨가한다. 0.06(wt wt)의 최종 표적 circRNA/지질 비율이 달성된 후, 혼합물을 35℃에서 추가로 30분 동안 인큐베이션시켜 FVII RNA의 소포 재조직화 및 캡슐화를 허용한다. 그 다음, 에탄올을 제거하고, 외부 완충액을 투석 또는 접선 유동 정용여과에 의해 PBS(155mM NaCl, 3mM Na2HP04, ImM KH2PO4, pH 7.5)로 교체한다. 크기 배제 스핀 칼럼 또는 이온 교환 스핀 칼럼을 사용하여 캡슐화되지 않은 RNA를 제거한 후 최종 캡슐화된 circRNA-대-지질 비율을 결정한다.
실시예 33
조작된 원형 RNA로부터의 삼중특이적 항원 결합 단백질의 발현
원형 RNA를 하기를 포함하도록 설계한다: (1) 3' 포스트 스플라이싱 그룹 I 인트론 단편; (2) 내부 리보솜 유입 부위(IRES); (3) 삼중특이적　항원-결합 단백질 암호 영역; 및 (4) 3' 상동성 영역. 삼중특이적　항원-결합 단백질 영역을 작제하여 표적 항원, 예를 들어,　GPC3에 결합할 예시적인　삼중특이적　항원-결합 단백질을 생성시킨다.
scFv　CD3 결합 도메인의 생성　
인간 CD3엡실론　쇄 정규 서열은 유니프로트 수탁 번호 P07766이다. 인간 CD3감마　쇄 정규 서열은 유니프로트 수탁 번호 P09693이다. 인간 CD3델타쇄 정규 서열은　유니프로트 수탁 번호 P043234이다. CD3엡실론, CD3감마 또는 CD3델타에 대한 항체를 공지된 기술, 예컨대, 친화도 성숙을 통해 생성시킨다. 뮤린 항-CD3 항체가 출발 물질로 사용되는 경우, 뮤린 항-CD3 항체의 인간화가 임상 환경에서 바람직한데, 여기서 마우스-특이적 잔기는 본 명세서에 기재된 삼중특이적 항원-결합 단백질의 치료를 제공받는 대상체에서 인간-항-마우스 항원(HAMA) 반응을 유도할 수 있다. 인간화는 뮤린 항-CD3 항체로부터의 CDR 영역을, 선택적으로 CDR 및/또는 프레임워크 영역에 대한 다른 변형을 포함하는 적절한 인간 생식계열 억셉터 프레임워크에 이식함으로써 달성된다.
따라서 인간 또는 인간화된 항-CD3 항체를 사용하여 삼중특이적 항원-결합 단백질의 CD3 결합 도메인에 대한 scFv 서열을 생성시킨다. 인간 또는 인간화된 VL 및 VH 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 얻고, 작제물에 대한 코돈을 선택적으로 호모 사피엔스 세포에서의 발현을 위해 최적화한다. VL 및 VH 도메인이 scFv에 나타나는 순서는 다양하며(즉, VL-VH 또는 VH-VL 배향), "G4S" 또는 "G4S" 소단위(G4S)3의 3개 카피가 가변 도메인을 연결하여 scFv 도메인을 생성한다. 항-CD3 scFv 플라스미드 작제물은 선택적인 Flag, His 또는 기타 친화성 태그를 가질 수 있으며, 이를 HEK293 또는 기타 적합한 인간 또는 포유동물 세포주 내에 전기천공하고, 정제시킨다. 검증 분석은 FACS에 의한 결합 분석, Proteon을 사용한 운동 분석 및 CD3 발현 세포의 염색을 포함한다.
scFv 글리피칸-3(GPC3) 결합 도메인의 생성
글리피칸-3(GPC3)은 간세포 암종에 존재하지만 건강한 정상 간 조직에는 존재하지 않는 세포 표면 단백질 중 하나이다.　이것은 간세포 암종에서 흔히 증가하는 것으로 관찰되며 HCC 환자의 나쁜 예후와 관련이 있다.　 그것은 Wnt 신호를 활성화한다고 알려져 있다. MDX-1414, HN3, GC33 및 YP7을 포함하는 GPC3 항체가 생성되었다.
CD3에 대한 scFv 결합 도메인의 생성을 위한 상기 방법과 유사하게 GPC-3 또는 또 다른 표적 항원에 대한 scFv 결합을 생성시킨다.
시험관내에서 삼중특이적　항원-결합 단백질의 발현　
CHO-K1 중국 햄스터 난소 세포(ATCC, CCL-61)의 유도체인 CHO 세포 발현 시스템(Flp-In®; 라이프 테크놀로지즈사)(문헌[Kao and Puck, Proc. Natl.　Acad　Sci USA 1968; 60(4):1275-81])을 사용한다. 부착 세포를 라이프 테크놀로지즈사에서 제공하는 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 계대배양한다.
현탁액에서의 성장에 대한 적응을 위해, 세포를 조직 배양 플라스크에서 탈착시키고, 무혈청 배지에 두었다. 현탁액 적응 세포를 10% DMSO가 포함된 배지에서 동결 보존한다.
분비된 삼중특이적 항원-결합 단백질을 안정적으로 발현하는 재조합 CHO 세포주를 현탁-적응 세포의 형질주입에 의해 생성시킨다. 항생제 하이그로마이신 B로의 선택 동안, 생존 세포 밀도를 주 2회 측정하고, 세포를 원심분리시키고, 0.1 x 106개 생존 세포/㎖의 최대 밀도로 새로운 선택 배지에 재현탁시킨다.　삼중특이적 항원-결합 단백질을 안정적으로 발현하는 세포 풀을 선택 2 내지 3주 후에 회수하고, 그 시점에 세포를 진탕 플라스크에서 표준 배양 배지로 옮긴다. 재조합 분비 단백질의 발현을 단백질 겔 전기영동 또는 유세포 분석을 수행하여 확인한다. 안정적인 세포 풀을 DMSO 함유 배지에서 동결 보존한다.
삼중특이적 항원-결합 단백질을 세포 배양 상청액으로의 분비에 의해 안정적으로 형질주입된 CHO 세포주의 10일 유가식 배양으로 생산한다. 세포 배양 상청액을 전형적으로 75% 초과의 배양 생존율에서 10일 후에 수거한다. 격일로 생산 배양액에서 샘플을 수집하고, 세포 밀도 및 생존력을 평가한다. 수거일에, 세포 배양 상청액을 추가 사용 전에 원심분리 및 진공 여과에 의해 정화시킨다.
세포 배양 상청액에서 단백질 발현 역가 및 생성물 온전성을 SDS-PAGE에 의해 분석한다.
삼중특이적　항원-결합 단백질의 정제　
삼중특이적 항원-결합 단백질을 2-단계 절차로 CHO 세포 배양 상청액으로부터 정제시킨다. 제1 단계에서 작제물을 친화성 크로마토그래피시키고, 제2 단계에서 Superdex 200 상에서 분취용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)시킨다. 샘플을 완충제 교환시키고, 한외여과에 의해 1㎎/㎖ 초과의 전형적인 농도로 농축시키고, 각각 환원 및 비환원 조건 하에서 SDS PAGE한 후 항-(반감기 연장 도메인) 또는 항 이디오타입 항체를 사용하여 면역블로팅함으로써 그리고 분석용 SEC를 사용함으로써 최종 샘플의 순도 및 균질성(전형적으로 90% 초과)을 평가한다. 정제된 단백질을 사용할 때까지 -80℃에서 분취물로 저장한다.　
실시예 34
반감기 연장 도메인을 갖는 조작된 원형 RNA의 발현은 반감기 연장 도메인을 갖지 않는 것보다 개선된 약동학적 매개변수를 갖는다.
실시예 23의 circRNA 분자 상에 암호화된 삼중특이적 항원-결합 단백질을 근육내로 0.5㎎/㎏ 볼러스 주사로서 시노몰거스 원숭이에게 투여한다. 또 다른 시노몰거스 원숭이 군에게 CD3 및 GPC-3에 대한 결합 도메인을 갖지만 반감기 연장 도메인이 없는 크기의 circRNA 분자에 암호화된 대등한 단백질을 제공한다. 제3 및 제4 군에게 각각 CD3 및 반감기 연장 도메인 결합 도메인을 갖는 circRNA 분자에 암호화된 단백질 및 GPC-3 및 반감기 연장 도메인을 갖는 단백질을 제공한다. circRNA에 의해 암호화된 두 단백질은 삼중특이적 항원-결합 단백질과 크기가 대등하다. 각각의 시험군은 5마리의 원숭이로 이루어진다. 혈청 샘플을 제시된 시점에서 취하고, 연속적으로 희석시키고, CD3 및/또는 GPC-3에 대한 결합 ELISA를 사용하여 단백질의 농도를 결정한다.
시험 물품 혈장 농도를 사용하여 약동학 분석을 수행한다. 각각의 시험 항목에 대한 군 평균 혈장 데이터는 투여 후 시간에 대해 플로팅하는 경우 다중-지수 프로파일을 따른다. 이러한 데이터는 분포 및 제거 단계에 대한 1차 속도 상수 및 볼러스 입을 갖는 표준 2-구획 모델에 적합하다. i.v에 대한 데이터의 최적 적합에 대한 일반 수학식은 다음과 같다: c(t)=Ae~at+Be~pt, 식 중, c(t)는 시간 t에서의 혈장 농도이고, A 및 B는 Y축의 절편이고, a 및 β는 각각 분포 및 제거 단계에 대한 겉보기 1차 속도 상수이다. a 단계는 제거의 초기 단계이며, 동물의 모든 세포외 유체로의 단백질 분포를 반영하는 반면, 디케이 곡선의 두 번째 또는 β 단계 부분은 진정한 혈장 제거를 나타낸다. 이러한 수학식에 적합한 방법은 당업계에 공지되어 잇다. 예를 들어, A=D/V(a-k21)/(a-p), B=D/V(p-k21)/(a-p), a 및 β(α>β의 경우)는 이차 방정식의 근이다: r2+(k12+k21+k10)r+k21k10=0, V=분포 부피, k10=제거 속도, k12=구획 1에서 구획 2로의 전달 속도 및 k21=구획 2에서 구획 1로의 전달 속도 및 D = 투여된 용량의 추정 매개변수 사용
데이터 분석: 농도 대 시간 프로파일의 그래프를 KaleidaGraph(KaleidaGraph™ V. 3.09 Copyright 1986-1997. 시너지 소프트웨어사(Synergy Software.), 미국 팬실베니아주 리딩 소재)를 사용하여 작성한다. 보고 가능 한 값보다 작은 것으로 보고된 값(LTR)은 PK 분석에 포함하지 않고, 그래프에 나타내지 않는다. 약동학적 매개변수는 WinNonlin　소프트웨어(WinNonlin® Professional V. 3.1　WinNonlin™ Copyright 1998-1999. 파사이트사(Pharsight Corporation.), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)를 사용한 구획 분석에 의해 결정한다. 약동학적 매개변수는 문헌[Ritschel　W A and Kearns G L, 1999, EST: Handbook　Of　Basic Pharmacokinetics Including Clinical Applications, 5th edition, American Pharmaceutical Assoc., Washington, D C]에 기재된 바와 같이 계산한다.
실시예 23의 circRNA 분자에 암호화된 삼중특이적 항원-결합 단백질은 반감기 연장 도메인이 결여된 단백질과 비교하여 제거 반감기의 증가와 같은 개선된 약동학적 파라미터를 가질 것으로 예상된다.
실시예 35
삼중특이적 항원-결합 단백질의 세포독성
실시예 23의 circRNA 분자에 암호화된 삼중특이적 항원-결합 단백질을 GPC-3+ 표적 세포에 대한 T 세포 의존성 세포독성의 매개에 대해 시험관내에서 평가한다.
형광 표지된 GPC3 표적 세포를 실시예 23의 삼중특이적 항원-결합 단백질의 존재 하에서 효과기 세포로서 무작위 공여자 또는 T-세포의 단리된 PBMC와 함께 인큐베이션시킨다. 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 가습 인큐베이터에서, 표적 세포로부터의 상청액으로 형광 염료의 방출을 분광형광계에서 측정한다. 실시예 23의 삼중특이적 항원-결합 단백질 없이 인큐베이션된 표적 세포 및 인큐베이션 종료 시 사포닌 첨가에 의해 완전히 용해된 표적 세포를 각각 음성 및 양성 대조군으로 제공한다.
측정된 잔류하는 생존 표적 세포에 기초하여, 하기 방정식에 따라 특정 세포 용해의 백분율을 계산한다: [1-(생존 표적(샘플)의 수/생존 표적의 수(자발)의 수)] x 100%. S자형 용량 반응 곡선 및 EC50 값을 GraphPad 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀/4-매개변수 로지스틱 피팅에 의해 계산한다. 주어진 항체 농도에 대해 얻은 용해 값을 사용하여 Prism 소프트웨어를 사용하여 4개 매개변수 로지스틱 피트 분석에 의해 S자형 용량-반응 곡선을 계산한다.
실시예 36
이온화 가능한 지질의 합성
38.1 ((3-(2-메틸-1H-이미다졸-1-일)프로필)아잔다이일)비스(헥산-6,1-다이일) 비스(2-헥실데칸오에이트)( 지질 27, 표 10a ) 및 ((3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)아잔다이일)비스(헥산-6,1-다이일) 비스(2-헥실데칸오에이트))( 지질 26, 표 10a )의 합성
응축기가 연결된 100㎖ 둥근 바닥 플라스크에, 3-(1H-이미다졸-1-일)프로판-1-아민(100㎎, 0.799m㏖) 또는 3-(2-메틸-1H-이미다졸-1-일)프로판-1-아민(0.799m㏖), 6-브로모헥실 2-헥실데칸오에이트(737.2㎎, 1.757m㏖), 탄산칼륨(485㎎, 3.515m㏖) 및 아이오딘화칼륨(13㎎, 0.08m㏖)을 아세토니트릴(30㎖)에서 혼합하고, 반응 혼합물을 48시간 동안 80℃까지 가열시켰다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트 패드로 여과하였다. 여과액을 에틸 아세테이트로 희석시켰다. 물, 염수로 세척한 후, 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시키고, 조 잔류물을 플래시 크로마토그래피(SiO2: CH2Cl2= CH2Cl2 중의 100%에서 10%의 메탄올)로 정제시키고, 무색 오일 생성물을 얻었다(92㎎, 15%). ((3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)아잔다이일)비스(헥산-6,1-다이일) 비스(2-헥실데칸오에이트))의 분식은 C 50 H 95 N 3 O 4 이고, 분자량(Mw)은 801.7이다.
((3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)아잔다이일)비스(헥산-6,1-다이일) 비스(2-헥실데칸오에이트))(지질 26, 표 10a)의 합성에 대한 반응식.
Figure pct00546
지질 26의 특징규명을 LC-MS로 수행하였다. 도 27A 내지 도 27C는 지질 26의 특징규명을 도시한다. 도 27A는 지질 26에 대해서 관찰된 양성자 NMR을 도시한다. 도 27B는 지질 26에 대한 대표적인 LC/MS 트레이스이며, 총 이온 및 UV 크로마토그램이 도시되어 있다.
38.2 지질 22-S14의 합성
38.2.1 2-(테트라데실티오)에탄-1-올의 합성
25℃에서 아세토니트릴(200㎖) 중의 2-설파닐에탄올(5.40g, 69.11m㏖, 4.82㎖, 0.871eq)의 혼합물에 1-브로모테트라데칸(22g, 79.34m㏖, 23.66㎖, 1eq) 및 탄산칼륨(17.55g, 126.95m㏖, 1.6eq)을 첨가하였다.　 반응 혼합물을 40℃까지 가온시키고, 12시간 동안 교반하였다. 　TLC(에틸 아세테이트/석유 에터 = 25/1, Rf = 0.3, I2로 염색)는 출발 물질이 완전히 소모되었고, 새로운 주요 스팟이 생성되었다는 것을 나타내었다. 　반응 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 아세토니트릴(50㎖)로 세척하고, 그 다음 여과액을 진공 하에서 농축시켜 잔류물을 얻었고, 이것을 실리카겔 상의 칼럼(에틸 아세테이트/석유 에터 = 1/100에서 1/25)으로 정제시켜 2-(테트라데실티오)에탄-1-올(14g, 수율 64.28%)을 백색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (ET36387-45-P1A, 400 MHz, 클로로폼-d) δ 0.87 - 0.91 (m, 3 H) 1.27 (s, 20 H) 1.35 - 1.43 (m, 2 H) 1.53 - 1.64 (m, 2 H) 2.16 (br s, 1 H) 2.49 - 2.56 (m, 2 H) 2.74 (t, J = 5.93 Hz, 2 H) 3.72 (br d, J = 4.89 Hz, 2 H). 도 28은 상응하는 핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼을 나타낸다.
38.2.2 2-(테트라데실티오)에틸 아크릴레이트의 합성
다이클로로메탄(240㎖) 중의 2-(테트라데실티오)에탄-1-올(14g, 51.00m㏖, 1eq)의 용액에 트라이에틸아민(7.74g, 76.50m㏖, 10.65㎖, 1.5eq)　및 프로프-2-엔오일 클로라이드(5.54g, 61.20m㏖, 4.99㎖, 1.2eq)를 0℃에서 질소 하에서 적가하였다.　 반응 혼합물을 25℃까지 가온시키고, 12시간 동안 교반하였다. TLC(에틸 아세테이트/석유 에터 = 25/1, Rf = 0.5, I2로 염색)는 출발 물질이 완전히 소모되었고, 새로운 주요 스팟이 생성되었다는 것을 나타내었다. 반응 용액을 감압 하에서 농축시켜 조물질을 얻었고, 이것을 실리카겔 상의 칼럼(에틸 아세테이트/석유 에터 = 1/100 to 1/25)으로 정제시켜 2-(테트라데실티오)에틸 아크릴레이트(12g, 수율 71.61%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1H NMR (ET36387-49-P1A, 400 MHz, 클로로폼-d) δ 0.85 - 0.93 (m, 3 H) 1.26 (s, 19 H) 1.35 - 1.43 (m, 2 H) 1.53 - 1.65 (m, 2 H) 2.53 - 2.62 (m, 2 H) 2.79 (t, J = 7.03 Hz, 2 H) 4.32 (t, J = 7.03 Hz, 2 H) 5.86 (dd, J = 10.39, 1.47 Hz, 1 H) 6.09 - 6.19 (m, 1 H) 6.43 (dd, J = 17.30, 1.41 Hz, 1 H). 도 29는 상응하는 핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼을 나타낸다.
38.2.3 비스(2-(테트라데실티오)에틸) 3,3'-((3-(2-메틸-1H-이미다졸-1-일)프로필)아잔다이일)다이프로피오네이트( 지질 22-S14 )의 합성
플라스크에 3-(2-메틸-1H-이미다졸-1-일)프로판-1-아민(300㎎, 2.16m㏖) 및 2-(테트라데실티오)에틸 아크릴레이트 (1.70g, 5.17m㏖)를 넣었다. 니트 반응 혼합물을 80℃까지 가열시키고, 48시간 동안 교반하였다. TLC(에틸 아세테이트, Rf = 0.3, I2로 염색, 수산화암모늄 1방울 첨가)는 출발 물질이 완전히 소모되었고, 새로운 주요 스팟이 형성되었다는 것을 나타내었다. 반응 혼합물을 다이클로로메탄(4㎖)으로 희석시키고, 실리카겔 상의 칼럼(석유 에터/에틸 아세테이트 = 3/1에서 0/1, 0.1% 수산화암모늄 첨가)으로 정제시켜 비스(2-(테트라데실티오)에틸) 3,3'-((3-(2-메틸-1H-이미다졸-1-일)프로필)아잔다이일)다이프로피오네이트 (501㎎, 수율 29.1%)를 무색 오일로서 얻었다.
1H NMR (ET36387-51-P1A, 400 MHz, 클로로폼-d) δ 0.87 (t, J = 6.73 Hz, 6 H) 1.25 (s, 40 H) 1.33 - 1.40 (m, 4 H) 1.52 - 1.61 (m, 4 H) 1.81 - 1.90 (m, 2 H) 2.36 (s, 3 H) 2.39 - 2.46 (m, 6 H) 2.53 (t, J = 7.39 Hz, 4 H) 2.70 - 2.78 (m, 8 H) 3.84 (t, J = 7.17 Hz, 2 H) 4.21 (t, J = 6.95 Hz, 4 H) 6.85 (s, 1 H) 6.89 (s, 1 H). 도 30은 상응하는 핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼을 나타낸다.
38.3 비스(2-(테트라데실티오)에틸) 3,3'-((3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)아잔다이일)다이프로피오네이트( 지질 93-S14 )의 합성
플라스크에 3-(1H-이미다졸-1-일)프로판-1-아민(300㎎, 2.40m㏖, 1eq)　및 2-(테트라데실티오)에틸 아크릴레이트(1.89g, 5.75m㏖, 2.4eq)를 넣었다. 니트 반응 혼합물을 80℃까지 가열시키고, 48시간 동안 교반하였다. TLC(에틸 아세테이트, Rf = 0.3, I2로 염색, 수산화암모늄 1방울 첨가)는 출발 물질이 완전히 소모되었고, 새로운 주요 스팟이 형성되었다는 것을 나타내었다. 반응 혼합물을 다이클로로메탄(4㎖)으로 희석시키고, 실리카겔 상의 칼럼(석유 에터/에틸 아세테이트 = 1/20에서 0/100, 0.1% 수산화암모늄 첨가)으로 정제시켜 비스(2-(테트라데실티오)에틸) 3,3'-((3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)아잔다이일)다이프로피오네이트(512㎎, 수율 27.22%)를 무색 오일로서 얻었다.
1H NMR (ET36387-54-P1A, 400 MHz, 클로로폼-d) δ 0.89 (t, J = 6.84 Hz, 6 H) 1.26 (s, 40 H) 1.34 - 1.41 (m, 4 H) 1.58 (br t, J = 7.50 Hz, 4 H) 1.92 (t, J = 6.62 Hz, 2 H) 2.36 - 2.46 (m, 6 H) 2.55 (t, J = 7.50 Hz, 4 H) 2.75 (q, J = 6.84 Hz, 8 H) 3.97 (t, J = 6.95 Hz, 2 H) 4.23 (t, J = 6.95 Hz, 4 H) 6.95 (s, 1 H) 7.06 (s, 1 H) 7.51 (s, 1 H). 도 31은 상응하는 핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼을 나타낸다.
38.4 헵타데칸-9-일 8-((3-(2-메틸-1H-이미다졸-1-일)프로필)(8-(노닐옥시)-8-옥소옥틸)아미노)옥탄오에이트(지질 54, 표 10a)의 합성
38.4.1 노닐 8-브로모옥탄오에이트( 3 )의 합성
Figure pct00547
CH2Cl2(500㎖) 중의 8-브로모옥탄산(2)(18.6g, 83.18m㏖) 및 노난-1-올(1)(10g, 69.32m㏖)의 혼합물에 DMAP(1.7g, 13.86m㏖), DIPEA(48㎖, 277.3m㏖) 및 EDC(16g, 83.18m㏖)를 첨가하였다. 반응을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시킨 후, 조 잔류물을 에틸 아세테이트(500㎖)에 용해시키고, 1N HCl, 포화 NaHCO3, 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시키고, 조 잔류물을 플래시 크로마토그래피(SiO2: 헥산 = 헥산 중의 100%에서 30%의 EtOAc)로 정제시키고, 무색 오일 생성물 3을 얻었다(9g, 37%).
38.4.2 헵타데칸-9-일 8-브로모옥탄오에이트( 5 )의 합성
Figure pct00548
CH2Cl2(300㎖) 중의 8-브로모옥탄산(2)(10g, 44.82m㏖) 및 헵타데칸-9-올(4)(9.6g, 37.35m㏖)의 혼합물에 DMAP(900㎎, 7.48m㏖), DIPEA(26㎖, 149.7m㏖) 및 EDC(10.7g, 56.03m㏖)를 첨가하였다. 반응을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시킨 후, 조 잔류물을 에틸 아세테이트(300㎖)에 용해시키고, 1N HCl, 포화 NaHCO3, 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시키고, 조 잔류물을 플래시 크로마토그래피(SiO2: 헥산 = 헥산 중의 100%에서 30%의 EtOAc)로 정제시키고, 무색 오일 생성물 5를 얻었다(5g, 29%).
38.4.3 헵타데칸-9-일 8-((3-(2-메틸-1H-이미다졸-1-일)프로필)아미노)옥탄오에이트( 7 )의 합성
Figure pct00549
응축기가 연결된 100 ㎖ 둥근 바닥 플라스크에서, 헵타데칸-9-일 8-브로모옥탄오에이트(5)(860㎎, 1.868m㏖) 및 3-(2-메틸-1H-이미다졸-1-일)프로판-1-아민(6)(1.3g, 9.339m㏖)을 에탄올(10㎖)에서 혼합하였다. 반응 혼합물을 밤새 환류까지 가열시켰다. MS(APCI)가 예측된 생성물을 나타내었다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 농축시켰다. 조 잔류물을 플래시 크로마토그래피(SiO2: CH2Cl2= CH2Cl2 중의 100%에서 10%의 메탄올+1%NH4OH)로 정제시키고, 무색 오일 생성물 7을 얻었다(665㎎, 69%).
38.4.4 의 합성 헵타데칸-9-일 8-((3-(2-메틸-1 H -이미다졸-1-일)프로필)(8-(노닐옥시)-8-옥소옥틸)아미노)옥탄오에이트(지질 54, 표 10a)
Figure pct00550
응축기가 연결된 100㎖ 둥근 바닥 플라스크에서, 헵타데칸-9-일 8-((3-(2-메틸-1H-이미다졸-1-일)프로필)아미노)옥탄오에이트(7)(665㎎, 1.279m㏖) 및 노닐 8-브로모옥탄오에이트(3)(536㎎, 1.535m㏖)를 에탄올(10㎖) 중에서 혼합하고, 그 다음 DIPEA(0.55㎖, 3.198m㏖ 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 환류까지 가열시켰다. MS(APCI) 및 TLC(CH2Cl2 중의 10%MeOH+1%NH4OH) 둘 다는 생성물 및 일부 미반응 출발 물질을 나타내었다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 농축시켰다. 조 잔류물을 플래시 크로마토그래피(SiO2: CH2Cl2= CH2Cl2 중의 100%에서 10%의 메탄올+1%NH4OH)로 정제시키고, 무색 오일을 얻었다(170㎎, 17%).
38.5 헵타데칸-9-일 8-((3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)(8-(노닐옥시)-8-옥소옥틸)아미노)옥탄오에이트(지질 53, 표 10a)의 합성
Figure pct00551
Figure pct00552
표 10a로부터의 지질 53을 상기 반응식에 따라서 합성한다. 반응 조건은 이미다졸 아민으로서 3-(1H-이미다졸-1-일)프로판-1-아민을 제외하고는 지질 54와 동일하다.
실시예 37
원형 RNA를 갖는 지질 나노입자 제형
'NextGen' 혼합 챔버와 함께 Precision Nanosystems Ignite 장비를 사용하여 지질 나노입자(LNP)를 형성하였다. 표 10a로부터의 이온화 가능한 지질 26, DSPC, 콜레스테롤 및 DSPE-PEG 2000(아반티 폴라 리피즈사)을 16:1:4:1의 중량비 또는 62:4:33:1 몰비로 함유한 에탄올 상을 pH 5.2에서 원형 RNA 및 25mM 아세트산나트륨을 함유하는 수성상과 조합하였다. 3:1의 수성 대 에탄올 혼합 비율을 사용하였다. 그 다음 제형화된 LNP를 1L의 물에서 투석시키고, 18시간에 걸쳐 2회 교환하였다. 투석된 LNP를 0.2㎛ 필터를 사용하여 여과하였다. 생체내 투여 전에, LNP를 PBS에 희석시켰다. LNP 크기를 동적 광 산란에 의해 결정하였다. PBS(pH 7.4) 중의 20㎍/㎖ LNP 1㎖를 갖는 큐벳을 Malvern Panalytical Zetasizer Pro를 사용하여 Z-평균에 대해서 측정하였다. Z-평균 및 다분산도 지수를 기록하였다.
39.1 표 10a로부터의 지질 26 및 27의 제형
'NextGen' 혼합 챔버와 함께 Precision Nanosystems Ignite 장비를 사용하여 지질 나노입자(LNP)를 형성하였다. 표 10a로부터의 이온화 가능한 지질 26 지질 27, DOPE, 콜레스테롤 및 DSPE-PEG 2000(아반티 폴라 리피즈사)을 16:1:4:1의 중량비 또는 62:4:33:1 몰비로 함유한 에탄올 상을 pH 5.2에서 원형 RNA 및 25mM 아세트산나트륨을 함유하는 수성상과 조합하였다. 3:1의 수성 대 에탄올 혼합 비율을 사용하였다. 그 다음 제형화된 LNP를 1L의 물에서 투석시키고, 18시간에 걸쳐 2회 교환하였다.　투석된 LNP를 0.2㎛ 필터를 사용하여 여과하였다.　생체내 투여 전에, LNP를 PBS에 희석시켰다. LNP 크기를 동적 광 산란에 의해 결정하였다. PBS(pH 7.4) 중의 20㎍/㎖ LNP 1㎖를 갖는 큐벳을 Malvern Panalytical Zetasizer Pro를 사용하여 Z-평균에 대해서 측정하였다. Z-평균 및 다분산도 지수를 기록하였다.
39.2 표 10a로부터의 지질 53 및 54의 제형
'NextGen' 혼합 챔버와 함께 Precision Nanosystems Ignite 장비를 사용하여 지질 나노입자(LNP)를 형성하였다. 표 10a로부터의 이온화 가능한 지질 53 또는 54, DOPE, 콜레스테롤 및 DSPE-PEG 2000(아반티 폴라 리피즈사)을 50:10:38.5:1.5의 몰비로 함유한 에탄올 상을 pH 5.2에서 원형 RNA 및 25mM 아세트산나트륨을 함유하는 수성상과 조합하였다.　3:1의 수성 대 에탄올 혼합 비율을 사용하였다. 그 다음 제형화된 LNP를 1L의 1x PBS에서 투석시키고, 18시간에 걸쳐 2회 교환하였다.　투석된 LNP를 0.2㎛ 필터를 사용하여 여과하였다.　생체내 투여 전에, LNP를 PBS에 희석시켰다. LNP 크기를 동적 광 산란에 의해 결정하였다. PBS(pH 7.4) 중의 20㎍/㎖ LNP 1㎖를 갖는 큐벳을 Malvern Panalytical Zetasizer Pro를 사용하여 Z-평균에 대해서 측정하였다. Z-평균 및 다분산도 지수를 기록하였다.
Malvern Panalytical Zetasizer Pro를 사용하여 LNP 제타 전위를 측정하였다. 물 중의 입자 용액 200㎕ 및 최종 입자 농도가 400㎍/㎖인 RNAse-무함유 증류수 800㎕를 함유하는 혼합물을 분석을 위해 zetasizer 모세관 셀에 로딩하였다.
RNA 캡슐화를 Ribogreen 검정을 사용하여 결정하였다. 나노입자 용액을 2㎍/㎖의 이론적인 oRNA 농도에서 트리스-에틸렌다이아민테트라아세트산(TE) 완충액에 희석시켰다. TE 완충액에 희석된 표준 oRNA 용액을 2㎍/㎖ 내지 0.125㎍/㎖ 범위로 만들었다. 입자 및 표준품을 모든 웰에 첨가하고, 두 번째 인큐베이션을 수행하였다(3분 동안 350rpm에서 37℃). SPECTRAmax® GEMINI XS 마이크로플레이트 분광형광계를 사용하여 형광을 측정하였다. 각각의 입자 용액에서 원형 RNA의 농도는 표준 곡선을 사용하여 계산하였다. 용해된 입자와 용해되지 않은 입자 사이에서 검출된 oRNA의 비율로부터 캡슐화 효율을 계산하였다.
[표 36a]
Figure pct00553
[표 36b]
Figure pct00554
실시예 38
시험관내 분석
22 내지 25g 범위의 암컷 CD-1 또는 암컷 c57BL/6J 마우스에게 0.5㎎/㎏ RNA를 정맥내 투여하였다. 주사 6시간 후, 마우스에게 15㎎/㎖ 농도의 D-루시페린 200㎕를 복강내 주사하였다. 주사 5분 후, 마우스를 아이소플루란을 사용하여 마취시키고, IVIS Spectrum In Vivo Imaging System(퍼킨 엘머사(Perkin Elmer)) 내부에 등쪽이 위로 향하게 하여 배치하였다. 지질 22-S14, 93-S14, 지질 26(표 10a)의 전신 총 IVIS 플럭스를 도 32A에 제시한다. 10분 주사 후, 마우스를 발광에 대해 스캔하였다. 마우스를 안락사시키고, 간, 비장, 신장, 폐 및 심장에서 발광을 스캔하기 위해 루시페린 주사 25분 이내에 장기를 적출하였다. 리빙 이미지(퍼킨 엘머사) 소프트웨어를 사용하여 영상(도 33A 및 도 33B, 도 34A 및 도 34B, 도 35A 및 도 35B)를 분석하였다. 관심 영역을 취하여 플럭스 및 평균 광도를 얻었고, 단백질 발현의 생체 분포에 대해 분석하였다(도 32A 및 도 32B).
도 32A는 지질 22-S14 및 93-S14로 제조된 LNP와 비교하여 지질 26(표 10a) LNP를 갖는 루시퍼라제 oRNA로부터 관찰된 증가된 전신 총 플럭스를 도시한다. 도 32B는 발현을 개선하도록 설계된 상당한 구조적 변화에도 불구하고 지질 22-S14 및 93-S14에서 관찰된 원하는 비장 대 간 비율을 유지하면서 지질 26(표 10a)으로 증가된 전체 발현을 추가로 강조하는 조직의 생체외 IVIS 분석을 도시한다. 이러한 데이터는 이전에 보고된 지질과 비교하여 지질 26(표 10a)에 의해 제공되는 개선을 강조한다.
표 10b의 지질 15 또는 표 10a의 지질 53 또는 54로 형성된 LNP에 캡슐화된 oRNA를 사용하여 상기에서 설명한 것과 유사한 분석을 수행하였다. 도 36A 내지 도 36C는 조직의 생체외 IVIS 분석을 나타내는데, 이는 각각 발현을 개선하도록 설계된 상당한 구조적 변화에도 불구하고 원하는 비장 대 간 비율을 유지하면서 지질 15, 53 및 54를 사용한 전체 발현을 강조한다.　도 36D는 PBS 대조군에 대한 결과를 나타낸다. 이들 데이터는 93-S14 및 22-S14와 같은 이전에 보고된 지질과 비교하여 표 10a의 지질 15, 53 및 54에 의해 제공되는 개선을 입증한다.
실시예 39
루시퍼라제의 전달
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)(스템셀 테크놀로지즈사)에 파이어플라이 루시퍼라제(f.luc) 원형 RNA를 캡슐화하는 지질 나노입자(LNP)를 형질주입시키고, 루시퍼라제 발현에 대해 조사하였다. 2명의 상이한 공여자로부터의 PBMC를 파이어플라이 루시퍼라제를 암호화하는 원형 RNA를 포함하는 5개의 상이한 LNP 조성물(200ng)과 함께 시험관 내에서 37℃에서 RPMI, 2% 인간 혈청, IL-2(10ng/㎖) 및 50μM BME에서 인큐베이션시켰다. LNP 없이 배양된 PBMC를 음성 대조군으로 사용하였다. 24시간 후, 세포를 용해시키고 생물발광(프로메가 브라이트글로사(Promega BrightGlo))에 기초한 파이어플라이 루시퍼라제 발현에 대해 분석하였다.
대표적인 데이터를 도 37A 및 도 37B에 제시하는데, 이것은 시험된 LNP가 원형 RNA를 1차 인간 면역 세포에 전달할 수 있어 단백질 발현이 발생함을 나타낸다.
실시예 40
녹색 형광 단백질(GFP) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)의 시험관내 전달
인간 PBMC(스템셀 테크놀로지즈사(스템셀 테크놀로지즈사))에 GFP를 캡슐화하는 LNP를 형질주입시키고, 유세포 분석법에 의해 조사하였다. 5명의 다른 공여자로부터의 PBMC(PBMC A 내지 E)를 GFP 또는 CD19-CAR(200ng)을 암호화하는 원형 RNA를 함유하는 하나의 LNP 조성물과 함께 시험관내에서 37℃에서, RPMI, 2% 인간 혈청, IL-2(10ng/㎖) 및 50μM BME에서 인큐베이션시켰다. LNP 없이 배양된 PBMC를 음성 대조군으로 사용하였다. LNP 인큐베이션 후 24, 48, 또는 72시간 후, 세포를 CD3, CD19, CD56, CD14, CD11b, CD45, fixable live dead 및 페이로드(GFP 또는 CD19-CAR)에 대해 분석하였다.
대표적인 데이터를 도 38A 및 도 38B에 제시하는데, 이것은 시험된 LNP가 원형 RNA를 1차 인간 면역 세포에 전달할 수 있어 단백질 발현이 발생함을 나타낸다.
실시예 41
다중 IRES 변이체는 시험관내에서 뮤린 CD19 CAR의 발현을 매개할 수 있다.
항-뮤린 CD19 CAR을 암호화하는 다중 원형 RNA 작제물은 고유한 IRES 서열을 함유하고, 이것에 1C1C7 세포를 지방형질주입시켰다. 지방형질주입 전에 1C1C7 세포를 완전한 RPMI에서 수 일 동안 확장시켰다. 세포가 적절한 수로 확장되면, 1C1C7 세포를 4개의 상이한 원형 RNA 작제물로 지방형질주입시켰다(Invitrogen RNAiMAX). 24시간 후, 1C1C7 세포를 His-태킹된 재조합 뮤린 CD19(시노 바이올로지컬사(Sino Biological)) 단백질과 함께 인큐베이션시킨 다음, 이차 항-His 항체로 염색하였다. 그 후, 세포를 유세포 분석법을 통해 분석하였다.
대표적인 데이터를 도 39에 제시하는데, 이것은 제시된 바이러스(야생 등줄쥐(Apodemus agrarius) 피코르나바이러스, 카프린 코부바이러스, 파라보바이러스 및 살리바이러스)에서 유래한 IRES가 뮤린 T 세포에서 항-마우스 CD19 CAR의 발현을 유도할 수 있음을 나타낸다.
실시예 42
뮤린 CD19 CAR은 시험관내에서 세포 사멸을 매개한다.
항-마우스 CD19 CAR을 암호화하는 원형 RNA를 뮤린 T 세포에 전기천공하여 CAR-매개 세포독성을 평가하였다. 전기천공을 위해, 써모피셔사의 Neon Transfection System을 사용하여 항-마우스 CD19 CAR을 암호화하는 원형 RNA로 T 세포를 전기천공한 다음 밤새 정치시켰다. 세포독성 검정을 위해 전기천공된 T 세포를 10% FBS, IL-2(10ng/㎖) 및 50uM BME를 함유하는 완전 RPMI에서 1:1 비율로 Fluc+ 표적 및 비표적 세포와 공배양하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. Fluc+ 표적 및 비-표적 세포의 용해를 검출하기 위해 공배양 24시간 후 루시퍼라제 검정 시스템(Promega Brightglo Luciferase System)을 사용하여 세포독성을 측정하였다. 표시된 값은 형질주입되지 않은 모의 신호를 기준으로 계산된다.
대표적인 데이터를 도 40에 제시하는데, 이는 원형 RNA로부터 발현된 항-마우스 CD19 CAR이 시험관내에서 뮤린 T 세포에서 기능적임을 나타낸다.
실시예 43
뮤린 CD19 CAR을 암호화하는 원형 RNA를 캡슐화한 지질을 사용한 B 세포의 기능적 결실
항-뮤린 CD19 CAR을 암호화하는 원형 RNA를 캡슐화하는 표 10b의 지질 15로 형성된 LNP를 C57BL/6J 마우스에 주사하였다. 대조군으로서, 파이어플라이 루시퍼라제(f.Luc)를 암호화하는 원형 RNA를 캡슐화하는 표 10b의 지질 15를 상이한 군의 마우스에게 주사하였다. 20 내지 25g 범위의 암컷 C57BL.6J에게 0.5㎎/㎏의 LNP를 격일로 5회 정맥 주사하였다. 주사 사이에, 혈액 채취물을 fixable live/dead, CD45, TCRvb, B220, CD11b 및 항-뮤린 CAR에 대한 유세포 분석을 통해 분석하였다. 마지막 주사 2일 후, 비장을 수거하고, 유세포 분석을 위해 가공하였다. 비장 세포를 fixable live/dead, CD45, TCRvb, B220, CD11b, NK1.1, F4/80, CD11c 및 항-뮤린 CAR로 염색하였다. 항-뮤린 CD19 CAR LNP를 주사한 마우스의 데이터를 f.Luc LNP를 제공받은 마우스에 대해 정규화하였다.
대표적인 데이터를 도 41A, 도 41B 및 도 41C에 제시하는데, 이것은 LNP와 함께 생체내 전달된 원형 oRNA로부터 발현된 항-마우스 CD19 CAR이 생체내 뮤린 T 세포에서 기능적임을 나타낸다.
실시예 44
원형 RNA로부터 발현된 CD19 CAR은 mRNA로부터 발현된 것에 비해서 더 높은 수율 및 큰 세포독성 효과를 갖는다.
N-말단에서부터 C-말단으로, FMC63-유래 scFv, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 공자극 도메인, 및 CD3ζ 세포내 도메인을 포함하는 항-CD19 키메라 항원 수용체를 암호화하는 원형 RNA를, 표면 발현 및 CAR-매개 세포독성을 평가하기 위해 인간 말초 T 세포에 전기천공하였다. 비교를 위해, 본 실험에서 원형 RNA-전기천공된 T 세포를 mRNA-전기천공된 T 세포와 비교하였다. 전기천공을 위해, 공여자 인간 PBMC로부터의 상업적으로 입수 가능한 T 세포 단리 키트(밀테니이 바이오테크사(Miltenyi Biotec))를 사용하여 인간 PBMC로부터 CD3+ T 세포를 단리시켰다. 단리 후, T 세포를 항-CD3/항-CD28(스템셀 테크놀로지즈사(Stemcell Technologies))로 자극하고, 10% FBS, IL-2(10ng/㎖) 및 50uM BME를 함유하는 완전 RPMI에서 37℃에서 5일 동안 확장시켰다. 자극 5일 후, 써모피셔사의 Neon Transfection System을 사용하여 항-인간 CD19 CAR을 암호화하는 원형 RNA로 T 세포를 전기천공한 다음 밤새 정치시켰다. 세포독성 검정을 위해, 전기천공된 T 세포를 10% FBS, IL-2(10ng/㎖) 및 50uM BME를 함유하는 완전 RPMI에서 1:1 비율로 Fluc+ 표적 및 비표적 세포와 공배양하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 공배양 24시간 후 루시퍼라제 검정 시스템(Promega Brightglo Luciferase System)을 사용하여 세포독성을 측정하여 Fluc+ 표적 및 비-표적 세포의 용해를 검출하였다 또한, 전기천공된 T 세포의 분취물을 취하고, 분석 당일 live dead fixable, CD3, CD45 및 키메라 항원 수용체(FMC63)에 대해 염색하였다.
대표적인 데이터를 도 42 및 도 43에 제시한다. 도 42A 및 42B는 원형 RNA로부터 발현된 항-인간 CD19 CAR이 선형 mRNA로부터 발현된 항-인간 CD19 CAR보다 더 높은 수준으로 더 길게 발현된다는 것을 나타낸다. 도 43A 및 43B는 원형 RNA로부터 발현된 항-인간 CD19 CAR이 선형 mRNA로부터 발현된 항-인간 CD19 CAR에 비해 더 큰 세포독성 효과를 발휘한다는 것을 나타낸다.
실시예 45
단일 원형 RNA로부터의 2개의 CAR의 기능적 발현
키메라 항원 수용체를 암호화하는 원형 RNA를 인간 말초 T 세포 내에 전기천공하여 표면 발현 및 CAR-매개 세포독성을 평가하였다. 본 연구의 목적은 2개의 CAR을 암호화하는 원형 RNA가 2A(P2A) 또는 IRES 서열로 확률적으로 발현될 수 있는지 평가하는 것이다. 전기천공을, 위해 CD3+ T 세포를 상업적으로 구입하고(셀레로사(Cellero)), 항-CD3/항-CD28(스템셀 테크놀로지즈사)로 자극하고, 10% FBS, IL-2(10ng/㎖) 및 50uM BME를 함유하는 완전 RPMI에서 37℃에서 5일 동안 확장시켰다. 자극 4일 후, 써모피셔사의 Neon Transfection System을 사용하여 항-인간 CD19 CAR, 항-인간 CD19 CAR-2A-항-인간 BCMA CAR 및 항-인간 CD19 CAR-IRES-항-인간 BCMA CAR을 암호화하는 원형 RNA로 T 세포를 전기천공한 다음, 밤새 정치시켰다. 세포독성 검정을 위해, 전기천공된 T 세포를 인간 CD19 또는 BCMA 항원을 발현하는 Fluc+ K562 세포와 함께 10% FBS, IL-2(10ng/㎖) 및 50uM BME를 함유하는 완전 RPMI에서 1:1 비율로 공배양하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 공배양 24시간 후 루시퍼라제 검정 시스템(Promega BrightGlo Luciferase System)을 사용하여 세포독성을 측정하여 Fluc+ 표적 세포의 용해를 검출하였다
대표적인 데이터를 도 44에 제시하는데, 이것은 2개의 CAR이 동일한 원형 RNA 작제물로부터 기능적으로 발현될 수 있고 세포독성 효과기 기능을 발휘할 수 있음을 나타낸다.
실시예 46
Cre 리포터 마우스를 사용한 생체내 원형 RNA 형질주입
Cre 재조합효소(Cre)를 암호화하는 원형 RNA를 이전에 기재된 바와 같이 지질 나노입자로 캡슐화한다. 6 내지 8주령의 암컷 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J(Ai9) 마우스에게 0.5㎎/㎏ RNA의 지질 나노입자를 정맥내 투여하였다. 형광성 tdTomato 단백질은 Cre 재조합 시 Ai9 마우스에서 전사 및 번역되었는데, 이는 원형 RNA가 tdTomato+ 세포로 전달되고 번역되었음을 의미한다. 48시간 후, 마우스를 안락사시키고, 비장을 수거하고, 단일 세포 현탁액으로 처리하고, 유세포 분석법을 통한 면역표현형 분석을 위해 다양한 형광단-접합 항체로 염색하였다.
도 45A는 표 10a의 지질 27 또는 지질 26 또는 표 10b의 지질 15로 지질로 형성된 LNP로 처리한 후 총 골수 세포(CD11b+), B 세포(CD19+) 및 T 세포(TCR-B+)를 비롯한 다양한 비장 면역 세포(CD45+, 생) 하위세트에서 tdTomato 발현 빈도와 함께 대표적인 FACS 플롯을 나타낸다. PBS가 주사된 Ai9 마우스는 배경 tdTomato 형광을 나타내었다. 도 45B는 tdTomato를 발현하는 골수 세포, B 세포 및 T 세포의 비율을 정량하는데(평균 + 표준 편차, n = 3), 이는 Cre 원형 RNA가 성공적으로 형질주입된 각각의 세포 집단의 비율과 동등하다. 표 10a의 지질 27 및 지질 26으로 제조된 LNP는 지질 93-S14에 비해서 상당히 더 높은 골수 및 T 세포 형질주입을 나타내는데, 이는 지질 구조 변형에 의해 부여된 개선을 강조한다.
도 45C 표 10a로의 지질 27 및 지질 26을 갖는 tdTomato를 발현하는 추가 비장 면역 세포 집단의 비율(평균 + 표준편차, n = 3)을 도시하는데, 이것은 또한 NK 세포(NKp46+, TCR-B-), 전통적인 단핵구(CD11b+, Ly-6G-, Ly-6C_hi), 비전통적인 단핵구(CD11b+, Ly-6G-, Ly-6C_lo), 호중구(CD11b+, Ly-6G+) 및 수지상 세포(CD11c+, MHC-II+)를 포함한다. 이러한 실험은 표 10a의 지질 27 및 지질 26 및 표 10b의 지질 15로 제조된 LNP가 원형 RNA를 마우스의 많은 비장 면역 세포 하위세트에 전달하고, 그 세포에서 원형 RNA로부터 성공적인 단백질 발현을 유도하는 데 효과적이라는 것을 입증한다.
실시예 47
실시예 47A : 면역-침묵 원형 RNA를 생산하기 위한 빌트-인 polyA 서열 및 친화성-정제
PolyA 서열(20 내지 30nt)을 RNA 작제물(인트론 내에 빌트-인 polyA 서열을 갖는 전구체 RNA)의 5' 및 3' 단부에 삽입하였다. 대안적으로, 예를 들어, 추가 효소의 사용이 필요한 이. 콜라이. polyA 중합효소 또는 효모 polyA 중합효소를 사용하여 전구체 RNA 및 인트론을 전사 후에 폴리아데닐화할 수 있다.
본 실시예에서 원형 RNA를 시험관내 전사(IVT)에 의해 원형화하였고, 스플라이싱 반응으로부터 polyA-태킹된 서열(유리 인트론 및 전구체 RNA 포함)을 선택적으로 제거하기 위해 상업적으로 입수 가능한 올리고-dT 수지 상에서 세척함으로써 친화성-정제시켰다. 상이한 비율(GMP:GTP = 8, 12.5 또는 13.75)의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 및 구아노신 트라이포스페이트(GTP)를 함유하는 상업적인 IVT 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스사(New England Biolabs)) 또는 항문, 항문관형 IVT 믹스(오르나 쎄라퓨틱스사(Orna Therapeutics))로 IVT를 수행하였다. 일부 실시형태에서, 높은 GMP:GTP 비율의 GMP가 제1 뉴클레오타이드로서 우선적으로 포함될 수 있는데, 이것은 대부분의 모노포스페이트-캡핑된 전구체 RNA를 생성한다. 비교로서, 원형 RNA 생성물을 Xrn1, Rnase R 및 Dnase I로의 처리(효소 정제)에 의해 대안적으로 정제시켰다.
이어서, 친화성 정제 또는 효소 정제 공정을 사용하여 제조된 원형 RNA의 면역원성을 평가하였다. 간략하면, 제조된 원형 RNA를 A549 세포에 형질주입시켰다. 24시간 후, 세포를 용해시키고 모의 샘플과 비교하여 인터페론 베타-1 유도를 qPCR에 의해 측정하였다. 삼인산화된 RNA인 3p-hpRNA를 양성 대조군으로 사용하였다.
도 46B 및 도 46C는 polyA 서열이 스플라이싱 동안 제거되고 스플라이싱되지 않은 전구체 분자에 존재하는 요소에 포함될 때 스플라이싱 반응으로부터 비-원형 생성물을 제거하는 음성 선택 친화성 정제를 나타낸다. 도 46D는 시험된 IVT 조건 및 정제 방법으로 제조된 원형 RNA가 모두 면역정지임을 나타낸다. 이러한 결과는 음성 선택 친화성 정제가 원형 RNA 정제를 위한 효소 정제와 동등하거나 더 우수하며, 맞춤형 원형 RNA 합성 조건(IVT 조건)이 최대 면역정지를 달성하기 위해 GMP 과잉에 대한 의존도를 줄일 수 있음을 시사한다.
실시예 47B: 원형 RNA 생산을 위한 전용 결합 부위 및 친화성-정제
polyA 태그 대신 특별하게 설계 서열(DBS, 전용 결합 부위)를 포함할 수 있다.
polyA 태그 대신, 수지에 결합할 수 있는 특별히 설계된 상보적 올리고뉴클레오타이드와 같은 전용 결합 부위(DBS)를 사용하여 전구체 RNA 및 유리 인트론을 선택적으로 고갈시킬 수 있다. 본 실시예에서, DBS 서열(30nt)을 전구체 RNA의 5' 및 3' 단부에 삽입하였다. RNA를 전사시키고, 전사된 산물을 수지에 연결된 맞춤형 상보적 올리고뉴클레오타이드 상에서 세척하였다.
도 47B 및 도 47C는 스플라이싱 동안 제거되는 요소에 설계된 DBS 서열을 포함하는 것이 음성 친화성 정제를 통해 스플라이싱 반응에서 스플라이싱되지 않은 전구체 RNA 및 유리 인트론 성분의 제거를 가능하게 한다는 것을 입증한다.
실시예 47C: 디스트로핀을 암호화하는 원형 RNA의 생산
RNA 전구체의 시험관내 전사에 이어 Xrn1, DNase 1 및 RNase R의 혼합물을 사용하여 효소 정제시켜 잔류하는 선형 성분을 분해시킴으로써 디스트로핀을 암호화하는 12kb 12,000nt 원형 RNA를 생산하였다. 도 48은 디스트로핀을 암호화하는 원형 RNA가 성공적으로 생산되었음을 나타낸다.
실시예 48
3' 인트론 단편과 IRES 사이의 5' 스페이서는 원형 RNA 발현을 개선시킨다.
주카트 세포에서 3' 인트론 단편과 IRES 사이에 상이한 5' 스페이서를 갖는 정제된 circRNA의 발현 수준을 비교하였다. 간략하면, 60,000개 세포에 250ng의 각각의 RNA를 전기천공한 지 24시간 후에 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 측정하였다.
추가로 주카트 세포에서 3' 인트론 단편과 IRES 사이에 상이한 5' 스페이서를 갖는 정제된 circRNA의 안정성을 비교하였다. 간략하면, 60,000개 세포에 250ng의 각각의 RNA를 전기천공한 지 2일 후에 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 측정하고, 제1일 발현에 정규화하였다.
그 결과를 도 49A 및 도 49B에 제시하는데, 이는 스페이서를 추가하면 IRES 기능 및 추가된 스페이서의 서열 동일성 및 길이의 중요성을 향상시킬 수 있음을 나타낸다. 잠재적인 설명은 스페이서가 IRES 바로 앞에 추가되어 IRES가 인트론 단편과 같은 다른 구조화된 요소로부터 단리되어 접힐 수 있도록 함으로써 기능할 가능성이 있다는 것이다.
실시예 49
본 실시예는 염소 코바이러스 IRES의 5' 또는 3' 단부로부터의 결실 스캐닝을 설명한다. IRES 경계는 일반적으로 양호하게 특징규명되어 있지 않아서, 경험적 분석이 필요한데, 본 실시예는 번역을 유도하는 데 필요한 핵심 기능 서열을 찾는 위해서 사용될 수 있다. 간략하면, 가우시아 루시퍼라제 암호 서열에 작동 가능하게 연결된 절단된 IRES 요소를 갖는 원형 RNA 작제물을 생성시켰다. 절단된 IRES 요소는 5' 또는 3' 단부로부터 제거된 제시된 길이의 뉴클레오타이드 서열을 가졌다. 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 RNA로의 1차 인간 T 세포의 전기천공 후 24시간 및 48시간 후에 측정하였다. 24시간 시점에서의 발현 수준에 대한 48시간 시점에서의 발현 수준의 비율로 발현의 안정성을 계산하였다.
도 50에 도시된 바와 같이, IRES의 5' 단부로부터의 40개 초과의 뉴클레오타이드의 결실은 발현을 감소시키고, IRES 기능을 손상시켰다. 발현의 안정성은 IRES 요소의 절단에 의해 상대적으로 영향을 받지 않았지만, 발현 수준은 IRES의 3' 단부로부터의 141개 뉴클레오타이드의 결실에 의해 실질적으로 감소한 반면, 3' 단부로부터의 57 또는 122개 뉴클레오타이드의 결실은 IRES에 긍정적인 영향을 가졌다.
또한 6-뉴클레오타이드 시작 전 서열의 결실이 루시퍼라제 리포터의 발현 수준을 감소시키는 것을 관찰하였다. 6-뉴클레오타이드 서열을 전통적인 코작 서열(GCCACC)로 교체하는 것은 유의미한 영향을 미치지 않았지만 적어도 발현은 유지시켰다.
실시예 50
본 실시예는 염소 코브바이러스(CKV) IRES, 파라보바이러스 IRES, 등줄쥐 피코르나바이러스(AP) IRES, 코브바이러스 SZAL6 IRES, 크로히바이러스 B(CrVB) IRES, CVB3 IRES 및 SAFV IRES를 비롯한, 선택된 IRES 서열의 변형(예를 들어, 절단)을 설명한다. IRES 요소의 서열은 서열번호 348 내지 389에 제공된다. 간략하면, 가우시아 루시퍼라제 암호 서열에 작동 가능하게 연결된 절단된 IRES 요소를 갖는 원형 RNA 작제물을 생성시켰다. HepG2 세포에 원형 RNA를 형질주입시켰다. 상청액의 발광을 형질주입 24시간 및 48시간 후에 평가하였다. 24시간 시점에서의 발현 수준에 대한 48시간 시점에서의 발현 수준의 비율로 발현의 안정성을 계산하였다.
도 51에 도시된 바와 같이, 절단은 IRES의 정체성에 따라 다양한 효과를 가졌으며, 이는 IRES들 간에 종종 상이한 번역에 사용되는 단백질 인자 및 개시 기전에 좌우될 수 있다. 5' 및 3' 결실은 예를 들어, CKV IRES의 맥락에서 효과적으로 조합될 수 있다. 일부 경우에 정규 코작 서열을 추가하면 발현이 상당히 개선되거나(SAFV에서와 같이, Full 대 Full+K) 발현이 감소한다(CKV에서와 같이, 5d40/3d122 대 5d40/3d122+K).
실시예 51
본 실시예는 돌연변이 대체 번역 개시 부위를 비롯한, CK-739, AP-748 및 PV-743 IRES 서열의 변형을 설명한다. 간략하면, 가우시아 루시퍼라제 암호 서열에 작동 가능하게 연결된 변형된 IRES 요소를 갖는 원형 RNA 작제물을 생성시켰다. 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 RNA로의 1C1C7 세포의 전기천공 후 24시간 및 48시간 후에 측정하였다.
CUG는 가장 일반적으로 발견되는 대체 시작 부위이지만 다른 많은 부위도 특징규명되어 있다. 이러한 삼중항은 시작 코돈 이전에 IRES 스캐닝 트랙에 존재할 수 있으며 올바른 폴리펩타이드의 번역에 영향을 미칠 수 있다. 서열번호 378 내지 380에 제공된 IRES 서열을 사용하여 4개의 대체 시작 부위 돌연변이를 생성하였다. 도 52에 도시된 바와 같이, CK-739 IRES에서 대체 번역 개시 부위의 돌연변이는 올바른 폴리펩타이드의 번역에 영향을 미치며, 일부 경우에는 긍정적으로, 다른 경우에는 부정적으로 영향을 미쳤다. 모든 대체 번역 개시 부위의 돌연변이는 번역 수준을 감소시켰다.
시작 코돈 이전의 6개 뉴클레오타이드인 대체 코작 서열도 발현 수준에 영향을 미칠 수 있다. 시작 코돈의 상류의 6개 염기 서열은 각각 CK-739 IRES에서 gTcacG, aaagtc, gTcacG, gtcatg, gcaaac, acaacc였으며 "6nt Pre-Start" 군에서는 샘플 번호 1 내지 5였다. 도 52에 도시된 바와 같이, 시작 코돈 이전의 특정 6-뉴클레오타이드 서열의 치환이 번역에 영향을 미쳤다.
또한 AP-748 및 PV-743 IRES 서열에서 5' 및 3' 말단 결실이 발현을 감소시키는 것을 관찰하였다. 그러나, 긴 스캐닝 트랙을 갖는 CK-739 IRES에서, 번역은 스캐닝 트랙 내의 결실에 의해 상대적으로 영향을 받지 않았다.
실시예 52
본 실시예는 5' 및/또는 3' 미번역 영역(UTR)을 삽입하고 IRES 혼성체를 생성시킴으로써 선택된 IRES 서열의 변형을 설명한다. 간략하면, 가우시아 루시퍼라제 암호 서열에 작동 가능하게 연결된 변형된 IRES 요소를 갖는 원형 RNA 작제물을 생성시켰다. 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 RNA로의 HepG2 세포의 전기천공 후 24시간 및 48시간 후에 측정하였다.
UTR이 삽입된 IRES 서열을 서열번호 390 내지 401에 제공한다. 도 53에 도시된 바와 같이, IRES의 3' 단부 바로 뒤와 시작 코돈 앞에 5' UTR을 삽입하면 염소 코브바이러스(CK) IRES에서 번역이 약간 증가했지만, 일부 경우에 살리바이러스 SZ1 IRES에서 번역이 중단되었다. 정지 카세트 바로 뒤에 3' UTR을 삽입하면 두 IRES 서열에 영향을 미치지 않았다.
혼성 CK IRES 서열을 서열번호 390 내지 401에 제공한다. CK IRES를 염기로 사용하고, CK IRES의 특정 영역을 다른 IRES 서열, 예를 들어, SZ1 및 AV(아이치바이러스)에서 유사하게 보이는 구조로 대체하였다. 도 53에 도시된 바와 같이, 특정 혼성 합성 IRES 서열은 기능적이었는데, 이는 혼성 IRES가 유사한 예측 구조를 나타내는 구별되는 IRES 서열의 부분을 사용하여 작제될 수 있지만 이러한 구조를 결실시키면 IRES 기능을 완전히 제거할 수 있음을 나타낸다.
실시예 53
본 실시예는 정지 코돈 또는 카세트 변이체를 도입함으로써 원형 RNA를 변형시키는 방법을 설명한다. 간략하면, 가우시아 루시퍼라제 암호 서열에 작동 가능하게 연결된 IRES 요소에 이어 가변 정지 코돈 카세트를 사용하여 원형 RNA 작제물을 생성시켰는데, 이는 각각의 프레임에 정지 코돈을 포함하고, 가우시아 루시퍼라제 암호 서열의 판독 프레임에 2개의 정지 코돈을 포함하였다. 1C1C7 세포에 원형 RNA를 형질주입시켰다. 상청액의 발광을 형질주입 24시간 및 48시간 후에 평가하였다.
정지 코돈 카세트의 서열을 서열번호 406 내지 412에 제시한다. 도 54에 도시된 바와 같이, 특정 정지 코돈 카세트는 발현 안정성에 거의 영향을 미치지 않았지만 발현 수준을 개선시켰다. 특히, 2개의 프레임 1(가우시아 루시퍼라제 암호 서열의 판독 프레임) 정지 코돈을 갖는 정지 카세트(첫 번째는 TAA이고 뒤이어 프레임 2 정지 코돈 및 프레임 3 정지 코돈)는 기능적 번역을 촉진하는 데 효과적이다.
실시예 54
본 실시예는 5' UTR 변이체를 삽입하여 원형 RNA의 변형을 설명한다. 간략하면, IRES의 3' 단부와 시작 코돈 사이에 삽입된 5' UTR 변이체가 있는 IRES 요소로 원형 RNA 작제물을 생성시켰고, IRES는 가우시아 루시퍼라제 암호 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 1C1C7 세포에 원형 RNA를 형질주입시켰다. 상청액의 발광을 형질주입 24시간 및 48시간 후에 평가하였다.
5' UTR 변이체의 서열을 서열번호 402 내지 405에 제시한다. 도 55에 도시된 바와 같이, 정규 코작 서열(UTR4)을 갖는 CK IRES는 36개 뉴클레오타이드의 비구조화/낮은 GC 스페이서 서열이 추가될 때(UTR2) 보다 효과적이었는데, 이는 GC-풍부 코작 서열이 코어 IRES 폴딩을 방해할 수 있음을 시사한다. 코작 서열과 함께 더 높은 GC/구조화된 스페이서를 사용하는 것은 동일한 이점(UTR3)을 나타내지 않았는데, 이는 가능하게는 스페이서 자체에 의한 IRES 접힘의 간섭 때문일 수 있다. 코작 서열을 gTcacG(UTR1)로 돌연변이시키는 것은 스페이서에 대한 필요성 없이 코작+스페이서 대안과 동일한 수준으로 번역을 향상시켰다.
실시예 55
본 실시예는 발현 수준에 대한 원형 RNA의 miRNA 표적 부위의 영향을 설명한다. 간략하면, 인간 에리트로포이에틴(hEPO) 암호 서열에 작동 가능하게 연결된 IRES 요소를 사용하여 원형 RNA 작제물을 생성시켰고, 여기서 2개의 직렬 miR-122 표적 부위를 작제물에 삽입하였다. miR-122-발현 Huh7 세포에 원형 RNA를 형질주입시켰다. 상청액에서 hEPO 발현을 샌드위치 ELISA에 의한 형질주입 24시간 및 48시간 후에 평가하였다.
도 56에 도시된 바와 같이, miR-122 표적 부위가 원형 RNA에 삽입된 hEPO 발현 수준은 제거되었다. 이 결과는 원형 RNA의 발현이 miRNA에 의해 조절될 수 있다는 것을 입증한다. 이와 같이, 재조합 단백질의 발현이 바람직하지 않은 세포 유형에서 발현되는 miRNA의 표적 부위를 혼입함으로써 세포 유형 또는 조직 특이적 발현을 달성할 수 있다.
실시예 56
실시예 56A : 2A 부위를 함유하는 하나의 circRNA로부터의 2개의 단백질의 발현 및 기능적 RNA 안정성.
아나베나 인트론/엑손 영역, 다양한 IRES, 가우시아 루시퍼라제를 암호화하는 제1 발현 서열, 2A 자가-절단 펩타이드, 및 GFP 또는 EGFP를 암호화하는 제2 발현 서열을 포함하는 작제물을 원형화하였다. 20,000 내지 40,000개의 293 세포에 40ng의 circRNA를 형질주입한다. 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 각각의 시점에서 완전 배지 교체로 형질주입 후 24시간마다 측정한다. 발현된 GFP 또는 EGFP의 형광을 형질주입 24시간 후에 측정한다.
실시예 56B : 2개의 IRES 서열을 함유하는 하나의 circRNA로부터의 2개의 단백질 발현 및 기능적 RNA 안정성.
아나베나 인트론/엑손 영역, 제1 IRES, 가우시아 루시퍼라제를 암호화하는 제1 발현 서열, 선택적으로 스페이서, 제2 IRES, 및 GFP 또는 EGFP를 암호화하는 제2 발현 서열을 포함하는 작제물(제1 및/또는 제2 IRES는 작제물에 따라 다름)을 원형화하였다. 293개의 세포에 1㎍의 각각의 원형화 반응을 전기천공한다. 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제 및 GFP 또는 EGFP로부터의 발광/형광을 전기천공 후 24시간에 측정한다. 전기천공된 293 세포의 각각의 라운드에서 IRES 작제물의 기능적 안정성을 3일에 걸쳐 측정하였다. 세포에 1㎍의 각각의 원형화 반응을 전기천공시키고, 그 다음 완전 배지 교체 후 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제 및 GFP 또는 EGFP로부터의 발광/형광을 24시간마다 측정한다.
실시예 57
절단 부위에 의해 분리된 2개의 발현 서열을 함유하는 원형 및 선형 RNA의 발현 및 기능적 안정성.
아나베나 인트론/엑손 영역, 가우시아 루시퍼라제를 암호화하는 제1 발현 서열, 2A 자가-절단 펩타이드, GFP 또는 EGFP를 암호화하는 발현 서열을 포함하는 작제물을 원형화한다. 가우시아 루시퍼라제를 암호화하는 제1 발현 서열, 2A 자가-절단 펩타이드, EGFP를 암호화하는 제2 발현 서열, 약 150nt polyA 테일을 암호화하고, 100%의 우리딘을 1-메틸 슈도우리딘으로 대체하도록 변형된 mRNA를 생성시킨다. 원형 및 변형된 mRNA의 발현을 293개 세포에서 측정한다. 세포에 1㎍의 각각의 RNA 종을 전기천공시킨 후 24시간 후에 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제 및 GFP 또는 EGFP로부터의 발광/형광을 측정한다. 작제물 기능적 안정성을 비교하기 위해서, 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제 및 GFP 또는 EGFP로부터의 발광/형광을 3일에 걸쳐 전기천공시킨 후 24시간마다 측정한다.
실시예 58
실시예 58A : 단일 발현 작제물을 사용한 발현과 이중 발현의 기능적 안정성의 비교
아나베나 인트론/엑손 영역, IRES, 가우시아 루시퍼라제 발현 서열, 2A 자가-절단 펩타이드 및 GFP 또는 EGFP 발현 서열을 포함하는 작제물을 원형화한다. 단일 발현 서열(가우시아 루시퍼라제 또는 GFP 또는 EGFP를 암호화함)을 함유하는 작제물을 또한 원형화한다. 단일 발현 서열(가우시아 루시퍼라제 또는 GFP 또는 EGFP를 암호화함)을 함유하는 선형 작제물을 또한 생성시킨다. 293 세포에 1㎍의 각각의 원형화 반응 또는 등가량의 선형 RNA를 전기천공시킨다. 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제 및 GFP 또는 EGFP 양성성으로부터의 형광을 전기천공 후 24시간에 측정한다.
전기천공된 293 세포의 각각의 라운드에서 작제물의 기능적 안정성을 3일에 걸쳐 측정하였다. 세포에 1㎍의 각각의 원형화 반응 또는 등가의 mRNA를 전기천공시키고, 그 다음 완전 배지 교체 후 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 24시간마다 측정한다.
실시예 58B : 단일 발현 작제물을 사용한 이중 발현의 발현 및 기능적 안정성 비교
아나베나 인트론/엑손 영역, 제 IRES, 가우시아 루시퍼라제 발현 서열, 제2 IRES 및 GFP 또는 EGFP 발현 서열을 포함하는 작제물을 원형화한다. 단일 발현 서열(가우시아 루시퍼라제 또는 GFP 또는 EGFP를 암호화함)을 함유하는 작제물을 또한 원형화한다. 단일 발현 서열(가우시아 루시퍼라제 또는 GFP 또는 EGFP를 암호화함)을 함유하는 선형 작제물을 또한 생성시킨다. 293 세포에 1㎍의 각각의 원형화 반응 또는 등가량의 선형 RNA를 전기천공시킨다. 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제 및 GFP 또는 EGFP 양성성으로부터의 형광을 전기천공 후 24시간에 측정한다.
전기천공된 293 세포의 각각의 라운드에서 작제물의 기능적 안정성을 3일에 걸쳐 측정하였다. 세포에 1㎍의 각각의 원형화 반응 또는 등가의 mRNA를 전기천공시키고, 그 다음 완전 배지 교체 후 상청액에서 분비된 가우시아 루시퍼라제로부터의 발광을 24시간마다 측정한다.
실시예 59
실시예 59A : IRES 및 절단 부위를 사용하여 발현된 TCR 페이로드 간의 기능적 상호작용.
아나베나 인트론/엑손 영역, IRES, TCR 알파쇄 발현 서열, 2A 자가 절단 펩타이드, 및 TCR 베타쇄 발현 서열을 포함하는 작제물을 원형화시킨다.
인간 1차 CD3+ T 세포에 circRNA를 전기천공시키고, TCR 표적, GFP 및 파이어플라이 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 세포와 함께 24시간 동안 공배양한다. 인간 1차 CD3+ T 세포를 모의 전기천공시키고, 대조군으로서 공배양한다. 표적 세포의 특이적 용해의 정량화를 파이어플라이 발광의 검출에 의해 결정한다. 특이적 용해 %는 1-[TCR 조건 발광]/[모의 조건 발광]으로 정의된다.
실시예 59B : 2개의 IRES를 사용하여 발현된 TCR 페이로드 간의 기능적 상호 작용.
아나베나 인트론/엑손 영역, 제1 IRES, TCR 알파쇄 발현 서열, 선택적으로 스페이서, 제2 IRES, 및 TCR 베타쇄 발현 서열을 포함하는 작제물을 원형화한다.
인간 1차 CD3+ T 세포에 circRNA를 전기천공시키고, TCR 표적, GFP 및 파이어플라이 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 세포와 함께 24시간 동안 공배양한다. 인간 1차 CD3+ T 세포를 모의 전기천공시키고, 대조군으로서 공배양한다. 표적 세포의 특이적 용해의 정량화를 파이어플라이 발광의 검출에 의해 결정한다. 특이적 용해 %는 1-[TCR 조건 발광]/[모의 조건 발광]으로 정의된다.
실시예 60
실시예 60A : IRES 및 절단 부위를 사용하여 발현된 CAR 페이로드.
아나베나 인트론/엑손 영역, IRES, 항-CD19 CAR 발현 서열, 2A 자가 절단 펩타이드, 및 항-C20 CAR 발현 서열을 포함하는 작제물을 원형화시킨다.
인간 1차 CD3+ T 세포에 circRNA를 전기천공시키고, 두 CAR 표적, GFP 및 파이어플라이 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 세포와 함께 24시간 동안 공배양한다. 인간 1차 CD3+ T 세포를 모의 전기천공시키고, 대조군으로서 공배양한다. 표적 세포의 특이적 용해의 정량화를 파이어플라이 발광의 검출에 의해 결정한다. 특이적 용해 %는 1-[TCR 조건 발광]/[모의 조건 발광]으로 정의된다.
실시예 60B : 2개의 IRES를 사용하여 발현된 TCR 페이로드
아나베나 인트론/엑손 영역, 제1 IRES, 항-CD19 CAR 알파쇄 발현 서열, 선택적으로 스페이서, 제2 IRES, 및 항-CD20 CAR 베타쇄 발현 서열을 포함하는 작제물을 원형시킨다.
인간 1차 CD3+ T 세포에 circRNA를 전기천공시키고, 두 CAR 표적, GFP 및 파이어플라이 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 세포와 함께 24시간 동안 공배양한다. 인간 1차 CD3+ T 세포를 모의 전기천공시키고, 대조군으로서 공배양한다. 표적 세포의 특이적 용해의 정량화를 파이어플라이 발광의 검출에 의해 결정한다. 특이적 용해 %는 1-[TCR 조건 발광]/[모의 조건 발광]으로 정의된다.
실시예 61
항-CD19 CAR을 함유하는 LNP 및 원형 RNA 작제물은 생체내에서 혈액 및 비장의 B 세포를 감소시킨다.
항-CD19 CAR 발현을 암호화하는 원형 RNA 작제물을 상기 기재된 바와 같이 지질 나노입자 내에 캡슐화시켰다. 비교를 위해, 루시퍼라제 발현을 암호화하는 원형 RNA를 별도의 지질 나노입자 내에 캡슐화시켰다.
6주 내지 8주령의 C57BL/6 마우스에 LNP 용액 중 하나를 격일로 주사하여 각각의 마우스 내에서 총 4회의 LNP를 주사하였다. 마지막 LNP 주사 24시간 후, 마우스의 비장 및 혈액을 수거하고, 염색하고, 유세포 분석을 통해 분석하였다. 도 57A 및 도 57B에 도시된 바와 같이, 항-CD19 CAR을 암호화하는 LNP-원형 RNA 작제물을 함유하는 마우스는 루시퍼라제를 암호화하는 LNP-원형 RNA로 처리된 마우스와 비교하여 말초 혈액 및 비장에서 CD19+ B 세포의 통계적으로 유의한 감소를 초래하였다.
실시예 62
CAR을 암호화하는 원형 RNA 내에 함유된 IRES 서열은 CAR 발현 및 T-세포의 세포독성을 개선시킨다.
활성화된 뮤린 T-세포에 고유한 IRES 및 뮤린 항-CD19 1D3ζ CAR 발현 서열을 함유하는 200ng의 원형 RNA 작제물을 전기천공시켰다. 이러한 작제물에 함유된 IRES는 염소 코브바이러스, 등줄쥐 피코르나바이러스, 파라보바이러스 또는 살리바이러스로부터 전체 또는 부분적으로 유래되었다. 염소 코브바이러스 유래 IRES를 추가로 코돈 최적화하였다. 대조군으로서, IRES가 없는 야생형 제타 마우스 CAR을 함유하는 원형 RNA를 비교에 사용하였다. 표면 발현을 평가하기 위해 전기천공 24시간 후 T-세포를 CD-19 CAR에 대해 염색한 다음 A20 Fluc 표적 세포와 공배양하였다. 이어서, T-세포를 표적 세포와 공배양한 후 24시간 후에 Fluc+ A20 세포의 세포독성 사멸에 대해 검정을 평가하였다.
도 58A, 도 58B, 도 58C 및 도 59에 도시된 바와 같이, 고유한 IRES는 T-세포가 CAR 단백질을 발현하는 빈도 및 세포 표면 상에서의 CAR 발현 수준을 증가시킬 수 있었다. CAR 단백질의 발현 빈도가 증가하고 세포 표면 상에서 CAR 발현 수준이 증가하면 항종양 반응이 개선된다.
실시예 63
1차 인간 T 세포에서 원형 RNA 작제물로부터 발현된 사이토솔 및 표면 단백질.
원형 RNA 작제물은 형광 사이토솔 리포터 또는 표면 항원 리포터를 암호화하는 서열을 함유하였다. 형광 리포터는 녹색 형광성 단백질, mCitrine, mWasabi, Tsapphire를 포함하였다. 표면 리포터는 CD52 및 Thy1.1bio를 포함하였다. 1차 인간 T-세포를 항-CD3/항-CD28 항체로 활성화하고, 리포터 서열을 함유하는 원형 RNA의 활성화 6일 후에 전기천공하였다. T-세포를 수거하고, 전기천공 24시간 후에 유세포 분석을 통해 분석하였다. 표면 항원을 상업적으로 입수 가능한 항체(예를 들어, 바이오레전드사, 밀테니이사 및 비디사)로 염색하였다.
도 60A 및 도 60B에 도시된 바와 같이, 사이토솔 및 표면 단백질은 1차 인간 T-세포에서 단백질을 암호화하는 원형 RNA로부터 발현될 수 있다.
실시예 64
고유한 IRES 서열을 함유하는 원형 RNA는 선형 mRNA보다 번역 발현이 개선되었다.
원형 RNA 작제물은 파이어플라이 루시퍼라제(FLuc)에 대한 발현 서열과 함께 고유한 IRES를 함유하였다.
2명의 공여자로부터의 인간 T-세포를 농축시키고, 항-CD3/항-CD28 항체로 자극하였다. 수 일의 증식 후, 활성화된 T 세포를 수거하고, FLuc 페이로드를 발현하는 mRNA 또는 원형 RNA의 동일한 몰로 전기천공하였다. 염소 코브바이러스, 등줄쥐 피코르나바이러스 및 파라보바이러스로부터 유래된 것을 비롯한 다양한 IRES 서열을 연구하여 7일 동안 페이로드 발현의 발현 수준 및 지속성을 평가하였다. 7일에 걸쳐, T-세포를 Promega Brightglo로 용해시켜 생물발광을 평가하였다.
도 61C, 도 61D, 도 61E, 도 61F 및 도 61G에 도시된 바와 같이 원형 RNA 내에 IRES가 존재하면 사이토솔 단백질의 번역 및 발현이 수십 배 증가할 수 있고, 이는 선형 mRNA에 비해 발현이 향상될 수 있다. 이것은 여러 인간 T 세포 공여자에서 일관되게 발견되었다.
실시예 65
실시예 65A: 항-CD19를 암호화하는 LNP-원형 RNA는 K562 세포의 인간 T-세포 사멸을 매개한다.
원형 RNA 작제물은 항-CD19 항체를 암호화하는 서열을 함유하였다. 그 다음 원형 RNA 작제물을 지질 나노입자(LNP) 내에 캡슐화시켰다.
인간 T-세포를 항-CD3/항-CD28로 자극하였고, 최대 6까지 증식되도록 두었다. 제6일에, LNP-원형 RNA 및 ApoE3(1㎍/㎖)를 T-세포와 공배양하여 형질주입을 매개하였다. 24시간 후, Fluc+ K562 세포에 항-CD19 항체를 암호화하는 원형 RNA 200ng를 전기천공시키고, 그 후에 제7일에 공배양하였다. 공배양 후 48시간에, Fluc 발현을 통한 K562 세포의 세포독성 사멸 및 CAR 발현에 검정을 평가하였다.
도 62A 및 도 62B에 도시된 바와 같이, 시험관내에서 T-세포로의 CAR의 LNP-매개 전달로부터의 항-CD19 CAR의 T 세포 발현 및 조작된 K562 세포에서 특이적 항원 의존 방식으로 종양 세포를 용해하는 능력이 존재한다.
실시예 65B : 항-BCMA 항체를 암호화하는 LNP-원형 RNA는 K562 세포의 인간 T-세포 사멸을 매개한다.
원형 RNA 작제물은 항-BCMA 항체를 암호화하는 서열을 함유하였다. 그런 다음 원형 RNA 작제물을 지질 나노입자(LNP) 내에 캡슐화시켰다.
인간 T-세포를 항-CD3/항-CD28로 자극하였고, 최대 6까지 증식되도록 두었다. 제6일에, LNP-원형 RNA 및 ApoE3(1㎍/㎖)를 T-세포와 공배양하여 형질주입을 매개하였다. 24시간 후, Fluc+ K562 세포에 항-BCMA 항체를 암호화하는 원형 RNA 200ng를 전기천공시키고, 그 후에 제7일에 공배양하였다. 공배양 후 48시간에, Fluc 발현을 통한 K562 세포의 세포독성 사멸 및 CAR 발현에 검정을 평가하였다.
도 62B에 도시된 바와 같이, 시험관내에서 T-세포로의 CAR의 LNP-매개 전달로부터의 BCMA CAR의 T 세포 발현 및 조작된 K562 세포에서 특이적 항원 의존 방식으로 종양 세포를 용해하는 능력이 존재한다.
실시예 66
항-CD19 CAR T-세포는 시험관내에서 항종양 활성을 나타낸다.
인간 T-세포를 항-CD3/항-CD28로 활성화하고, 200ng의 항-CD19 CAR-발현 원형 RNA로 1회 전기천공하였다. 전기천공된 T-세포를 FLuc+ Nalm6 표적 세포 및 비-표적 Fluc+K562 세포와 공배양하여 CAR-매개 사멸을 평가하였다. 공배양 후 24시간 후, T-세포를 용해시키고, 표적 및 비-표적 세포에 의한 잔류 FLuc 발현에 대해 조사하여 총 8일에 걸친 발현 및 발현의 안정성을 평가하였다.
도 63A 및 도 63B에 나타낸 바와 같이, T-세포는 특이적 항원-의존적 방식으로 원형 RNA CAR 작제물을 발현한다. 결과는 또한 CAR을 암호화하는 선형 mRNA와 비교하여 CAR을 암호화하는 원형 RNA의 개선된 세포독성 및 기능적 표면 수용체의 전달을 나타낸다.
실시예 67
ApoE3로 매개된 원형 RNA의 효과적인 LNP 형질주입
인간 T-세포를 항-CD3/항-CD28로 자극하고 최대 6일까지 증식되도록 두었다. 제6일에, 지질 나노입자(LNP) 및 ApoE3(1㎍/㎖)가 있거나 없이 녹색 형광 단백질 용액을 발현하는 원형 RNA를 T-세포와 공배양하였다. 24시간 후, T-세포를 생/사 T-세포에 대해 염색하고, 생 T-세포를 유세포 분석기에서 GFP 발현에 대해 분석하였다.
도 64A, 도 64B, 도 61C, 도 61D 및 도 64E에 도시된 바와 같이, 효율적인 LNP 형질주입은 활성화된 T-세포의 ApoE3에 의해 매개될 수 있으며, 이어서 상당한 페이로드 발현이 이어진다. 이 결과는 다수의 공여자에 걸쳐서 나타났다.
참조에 의한 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 참조에 의해 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> ORNA THERAPEUTICS, INC. <120> CIRCULAR RNA COMPOSITIONS AND METHODS <130> WO/2021/189059 <140> PCT/US2021/023540 <141> 2021-03-22 <150> US 62/992,518 <151> 2020-03-20 <160> 793 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 585 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Encephalomyocarditis virus sequence" <400> 1 cccccctctc cctccccccc taacgttact ggccgaagcc gcttggaata aggccggtgt 60 gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt ttggcaatgt gagggcccgg 120 aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct cgccaaagga 180 atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc ttgaagacaa 240 acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga caggtgcctc 300 tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc ccagtgccac 360 gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt attcaacaag 420 gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg gcctcggtgc 480 acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaacgtct aggccccccg aaccacgggg 540 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Unknown: Hepatitis C virus sequence" <400> 7 acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt 60 cttcacgcag aaagcgtcta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc 120 ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccggg 180 aagactgggt cctttcttgg ataaacccac tctatgcccg gacatttggg cgtgcccccg 240 caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg 300 tgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcatc 340 <210> 8 <211> 315 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Human Cosavirus sequence" <400> 8 ctacaagctt tgtgtaaaca aacttttgtt tggcttttct caagcttctc tcacatcagg 60 ccccaaagat gtcctgaagg taccccgtgt atctgaggat gagcaccatc gactacccgg 120 acctgcaaaa ttttgcaaac gcatgtggta tcccagcccc ctcctctcgg ggagggggct 180 ttgctcactc agcacaggat ctgatcagga gatccacctc cggtgcttta caccggggcg 240 tggatttaaa aattgcccaa ggcctggcgc acaacctagg ggactaggtt ttccttatat 300 tttaaagctg tcaat 315 <210> 9 <211> 182 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> 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gaccagtcca gtaatggacg ggccagtgcg tgtagtcgtc ttccggcttg tccggggcat 540 gtttggtgaa ccggtggggt aaggttggtg tgcccaacgc ccgtactttg gtgacacctc 600 aagaccaccc aggaatgcca gggaggtacc ccacctcacg gtgggatctg accctgggct 660 aattgtctac ggtggttctt cttgcttcca cttctttctt ctgttcacg 709 <210> 19 <211> 708 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Human Parechovirus sequence" <400> 19 tttgaaaggg gtctcctaga gagcttggcc gtcgggcctt ataccccgac ttgctgagtt 60 tctctaggag agcccttttc ccagccctga ggcggctggt caataaaagc ctcaaacgta 120 actaacacct aagaagatca tgtaaaccct atgcctggtc tccactattc gaaggcaact 180 tgcaataaga agagtgggat caagacgctt aaagcataga gacagttttc ttttctaacc 240 cacatttgtg tggggtggca gatggcgtgc cataactcta atagtgagat accacgcttg 300 tggaccttat gctcacacag ccatcctcta gtaagtttgt gagacgtctg gtgacgtgtg 360 ggaacttatt ggaaacaaca ttttgctgca aagcatccta ctgccagcgg aaaaacacct 420 ggtaacaggt gcctctgggg ccaaaagcca aggtttaaca gaccctttag gattggttct 480 aaacctgaga tgttgtggaa gatatttagt acctgctgat ctggtagtta tgcaaacact 540 agttgtaagg cccatgaagg atgcccagaa ggtacccgta ggtaacaagt gacactatgg 600 atctgatttg gggccagata cctctatctt ggtgatctgg ttaaaaaaca tctaatgggc 660 caaacccggg ggggatcccc ggtttcctct tattctatca atgccact 708 <210> 20 <211> 508 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Crohivirus B sequence" <400> 20 gtataagaga caggtgtttg ccttgtcttc ggactggcat cttgggacca accccccttt 60 tccccagcca tgggttaaat ggcaataaag gacgtaacaa ctttgtaacc attaagcttt 120 gtaattttgt aaccactaag ctttgtgcac ataatgtaac catcaagctt gttagtccca 180 gcaggaggtt tgcatgcttg tagccgaaat ggggctcgac cccccatagt aggatacttg 240 attttgcatt ccattgtgga cctgcaaact ctacacatag aggctttgtc ttgcatctaa 300 acacctgagt acagtgtgta cctagaccct atagtacggg aggaccgttt gtttcctcaa 360 taaccctaca taataggcta ggtgggcatg cccaatttgc aagatcccag actgggggtc 420 ggtctgggca gggttagatc cctgttagct actgcctgat agggtggtgc tcaaccatgt 480 gtagtttaaa ttgagctgtt catatacc 508 <210> 21 <211> 248 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Picornaviridae sp. sequence" <400> 21 actgaagatc ctacagtaac tactgcccca atgaacgcca cagatgggtc tgctgatgac 60 tacctatctt agtgctagtt gaggtttgaa gtgagccggt ttttagaaga accagtttct 120 gaacattatc atccccagca tctattctat acgcacaaga tagatagtca tcagcagaca 180 catctgtgct actgcttgat agagttgcgg ctggtcaact tagattggta taaccagttg 240 agtggcaa 248 <210> 22 <211> 516 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Rosavirus M-7 sequence" <400> 22 tatgcatcac tggacggcct aacctcggtc gtggcttctt gccgatttca gcgctaccag 60 gctttctggt ctcgccaggc gttgattagt aggtgcactg tctaagtgaa gacagcagtg 120 ctctctgtga aaagttgatg acactcttca ggtttgtagc gatcactcaa ggctagcgga 180 tttccccgtg tggtaacaca cgcctctagg cccagaaggc acggtgttga cagcacccct 240 tgagtggctg gtcttcccca ccagcacctg atttgtggat tcttcctagt aacggacaag 300 catggctgct cttaagcatt cagtgcgtcc ggggctgaag gatgcccaga aggtacccgc 360 aggtaacgat aagctcactg tggatctgat ctggggctgc gggctgggtg tctttccacc 420 cagccaaaac ccgtaaaacg gtagtcgcag ttaaaaaacg tctaggcccc acccccccag 480 ggatgggggg ttcccttaaa ccctcacaag ttcaac 516 <210> 23 <211> 478 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Shanbavirus A sequence" <400> 23 tgaaaagggg gcgcagggtg gtggtggtta ctaaataccc accatcgccc tgcacttccc 60 ttttcccctg tggctcaggg tcacttagcc ccctctttgg gttaccagta gttttctacc 120 cctgggcaca gggttaacta tgcaagacgg aacaacaatc tcttagtccc cctcgccgat 180 agtgggctcg acccccatgt gtaggagtgg ataagggacg gagtgagccg atacggggaa 240 gagtgtgcgg tcacacctta attccatgag cgctgcgaag aaggaagctg tgaacaatgg 300 cgacctgaac cgtacacatg gagctccaca ggcatggtac tcgttagact acgcagcctg 360 gttgggagtg ggtataccct gggtgagccg ccagtgaatg ggagttcact ggttaacaca 420 cactgcctga tagggtcagg gcctcctgtc cccgccgtaa tgaggtagac catatgcc 478 <210> 24 <211> 403 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Pasivirus A sequence" <400> 24 gcggctggat attctggccg tgcaactgct tttgaccagt ggctctgggt aacttagcca 60 aagtgtcctt ctccctttcc ctattatatg ttttatggct ttgtctggtc ttgtttagtt 120 tatatataag atcctttccg ccgatataga cctcgacagt ctagtgtagg aggattggtg 180 atattaattt gccccagaag agtgaccgtg acacatagaa accatgagta catgtgtatc 240 cgtggaggat cgcccgggac tggattccat atcccattgc catcccaaca agcggagggt 300 atacccacta tgtgcacgtc tgcagtggga gtctgcagat ttagtcatac tgcctgatag 360 ggtgtgggcc tgcactctgg ggtactcagg ctgtttatat aat 403 <210> 25 <211> 404 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Pasivirus A sequence" <400> 25 gctggacttt ctggctgcgc aactgctttt aaccagtggc tctgggttac ttagccaaaa 60 ccccctttcc ccgtacccta gtttgtgtgt gtattattat tttgttgttg ttttgtaaat 120 ttttatataa gatcctttcc gccgatatag acctcgacag tctagtgtag gaggattggt 180 gatattaata tgccccagaa gagtgaccgt gacacataga aaccatgagt acatgtgtat 240 ccgtggagga tcgcccggga ctggattcca tatcccattg ccatcccaac aaacggaggg 300 tatacccgct atgtgcgcgt ctacagtggg aatctgtaga tttagtcata ctgcctgata 360 gggtgtgggc ctgcactctg gggtactcag gctgtttata taat 404 <210> 26 <211> 744 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Echovirus E14 sequence" <400> 26 ttaaaacagc ctgtgggttg ttcccatcca cagggcccac tgggcgccag cactctggta 60 ttgcggtacc ttagtgcgcc tgttttatat acccgtcccc caaacgtaac ttagacgcat 120 gtcaacgaag accaatagta agcgcagcac accagctgtg ttccggtcaa gcacttctgt 180 taccccggac cgagtatcaa taagctactc acgtggctga aggagaaaac gttcgttacc 240 cgaccaatta cttcaagaaa cctagtaaca ccatgaaggt tgcgcagtgt ttcgctccgc 300 acaaccccag tgtagatcag gtcgatgagt caccgcattc cccacgggtg accgtggcgg 360 tggctgcgct ggcggcctgc ccatggggaa acccatggga cgcttcaata ctgacatggt 420 gcgaagagtc tattgagcta attggtagtc ctccggcccc tgaatgcggc taatcctaac 480 tgcggagcag atacccacac accagtgggc agtctgtcgt aacgggcaac tctgcagcgg 540 aaccgactac tttgggtgtc cgtgtttctc tttatcctta tactggctgc ttatggtgac 600 aattgagaga ttgttaccat atagctattg gattggccat ccggtgacaa atagagcaat 660 tgtgtatttg tttgttggtt tcgtgccatt aaattacaag gttctaaaca cccttaatct 720 tattatagca ttcaacacaa caaa 744 <210> 27 <211> 663 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Human Parechovirus sequence" <400> 27 gtacattaga tgcgtcatct gcaactttag tcaataaatt acctccaatg tcattaccaa 60 cattccctac cttttcacta acacctaaga caacaagtac ctatgcctgg tctccactat 120 tcgaaggcaa cttgcaataa gaagagtgga attaagacgc ttaaagcata gagctagtta 180 tcttttctaa cccacaaagt tttgtggggt ggcagatggc gtgccataac tctattagtg 240 agataccatg cttgtggatc ttatgctcac acagccatcc tctagtaagt tgataaggtg 300 tctggtgata tgtgggaact cacatgaacc attaatttac cgtaaggtat cctatagcca 360 gcggaatcac atctggtgac agatgcctct ggggccgaaa gccaaggttt aacagaccct 420 ataggattgg tttcaaaacc tgaattgatg tggattgtgt atagtacctg ttgatctggt 480 aacagtgtca acactagttg taaggcccac gaaggatgcc cagaaggtac ccgtaggtaa 540 caagtgacac tatggatctg atctggggcc agctacctct atcatggtga gttggttaaa 600 aaacgtctag tgggccaaac ccagggggga tccctggttt ccttttacct aatcaaagcc 660 act 663 <210> 28 <211> 744 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Aichi virus sequence" <400> 28 tttgaaaagg gggtgggggg gcctcggccc cctcaccctc ttttccggtg gtctggtccc 60 ggaccaccgt tactccattc agcttcttcg gaacctgttc ggaggaatta aacgggcacc 120 catactcccc ccacccccct tttgtaacta agtatgtgtg ctcgtgatct tgactcccac 180 ggaacggacc gatccgttgg tgaacaaaca gctaggtcca catcctccct tcccctggga 240 gggcccccgc cctcccacat cctcccccca gcctgacgta tcacaggctg tgtgaagccc 300 ccgcgaaagc tgctcacgtg gcaattgtgg gtcccccctt catcaagaca ccaggtcttt 360 cctccttaag gctagccccg gcgtgtgaat tcacgttggg caactagtgg tgtcactgtg 420 cgctcccaat ctcggccgcg gagtgctgtt ccccaagcca aacccctggc ccttcactat 480 gtgcctggca agcatatctg agaaggtgtt ccgctgtggc tgccaacctg gtgacaggtg 540 ccccagtgtg cgtaaccttc ttccgtctcc ggacggtagt gattggttaa gatttggtgt 600 aaggttcatg tgccaacgcc ctgtgcggga tgaaacctct actgccctag gaatgccagg 660 caggtacccc acctccgggt gggatctgag cctgggctaa ttgtctacgg gtagtttcat 720 ttccaatcct tttatgtcgg agtc 744 <210> 29 <211> 734 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Hepatitis A virus sequence" <400> 29 ttcaagaggg gtctccggag ttttccggaa cccctcttgg aagtccatgg tgaggggact 60 tgatacctca ccgccgtttg cctaggctat aggctaaatt tccctttccc tgtccttccc 120 ctatttcctt ttgttttgtt tgtaaatatt aattcctgca ggttcagggt tctttaatct 180 gtttctctat aagaacactc aatttttcac gctttctgtc tcctttcttc cagggctctc 240 cccttgccct aggctctggc cgttgcgccc ggcggggtca actccatgat tagcatggag 300 ctgtaggagt ctaaattggg gacgcagatg tttgggacgt cgccttgcag tgttaacttg 360 gctttcatga acctctttga tcttccacaa ggggtaggct acgggtgaaa cctcttaggc 420 taatacttca atgaagagat gccttggata gggtaacagc ggcggatatt ggtgagttgt 480 taagacaaaa accattcaac gccggaggac tggctctcat ccagtggatg cattgaggga 540 attgattgtc agggctgtct ctaggtttaa tctcagacct ctctgtgctt agggcaaaca 600 ctatttggcc ttaaatggga tcctgtgaga gggggtccct ccattgacag ctggactgtt 660 ctttggggcc ttatgtggtg tttgcctctg aggtactcag gggcatttag gtttttcctc 720 attcttaaat aata 734 <210> 30 <211> 638 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Phopivirus sequence" <400> 30 gggagtaaac ctcaccaccg tttgccgtgg tttacggcta cctatttttg gatgtaaata 60 ttaattcctg caggttcagg tctcttgaat tatgtccacg ctagtggcac tctcttaccc 120 ataagtgacg ccttagcgga acctttctac acttgatgtg gttaggggtt acattatttc 180 cctgggcctt ctttggccct ttttcccctg cactatcatt ctttcttccg ggctctcagc 240 atgccaatgt tccgaccggt gcgcccgccg gggttaactc catggttagc atggagctgt 300 aggccctaaa agtgctgaca ctggaactgg actattgaag catacactgt taactgaaac 360 atgtaactcc aatcgatctt ctacaagggg taggctacgg gtgaaacccc ttaggttaat 420 actcatattg agagatactt ctgataggtt aaggttgctg gataatggtg agtttaacga 480 caaaaaccat tcaacagctg tgggccaacc tcatcaggta gatgcttttg gagccaagtg 540 cgtaggggtg tgtgtggaaa tgcttcagtg gaaggtgccc tcccgaaagg tcgtaggggt 600 aatcaggggc agttaggttt ccacaattac aatttgaa 638 <210> 31 <211> 743 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: CVA10 sequence" <400> 31 gctcttccga tctgggttgt tcccacccac agggcccact gggcgccagc actctgattc 60 cacggaatct ttgtgcgcct gttttacaac ccttcccaat ttgtaacgta gaagcaatac 120 acactactga tcaatagtag gcatggcgcg ccagtcatgt catgatcaag cacttctgtt 180 cccccggact gagtatcaat agactgctca cgcggttgaa ggagaaaacg ttcgttaccc 240 ggctaactac ttcgagaaac ctagtagcac catggaagct gcggagtgtt tcgctcagca 300 ctttccccgt gtagatcagg tcgatgagtc actgcaatcc ccacgggcga ccgtggcagt 360 ggctgcgttg gcggcctgcc tatggggcaa cccataggac gctctaatgt ggacatggtg 420 cgaagagtct attgagctag ttagtagtcc tccggcccct gaatgcggct aatcctaact 480 gcggagcaca tgccttcaac ccaggaggtg gtgtgtcgta acgggtaact ctgcagcgga 540 accgactact ttgggtgtcc gtgtttcctt ttatccttat attggctgct tatggtgaca 600 atcacggaat tgttgccata tagctattgg attggccatc cggtgtctaa cagagctatt 660 gtatacctat ttgttggatt tactccccta tcatacaaat ctctgaacac tttgtgcttt 720 atactgaact taaacacacg aaa 743 <210> 32 <211> 746 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Enterovirus C sequence" <400> 32 ttaaaacagc tctggggttg ttcccacccc agaggcccac gtggcggcca gtacaccggt 60 accacggtac ccttgtacgc ctgttttata ctcccctccc cgtaaactag aagcacgaaa 120 cacaagttca atagaagggg gtacagacca gtaccaccac gaacaagcac ttctgttccc 180 ccggtgaggt cacatagact gtccccacgg tcaaaagtga ctgatccgtt atccgctcac 240 gtacttcgga aagcctagta ccaccttgga atctacgatg cgttgcgctc agcactcgac 300 cccggagtgt agcttaggct gatgagtctg gacgttcccc actggtgaca gtggtccagg 360 ctgcgttggc ggcctacctg tggtccaaaa ccacaggacg ctagtagtga acaaggtgtg 420 aagagcccac tgagctacct gagaatcctc cggcccctga atgcggctaa tcccaaccac 480 ggagcaggta atcgcaaacc agcggtcagc ctgtcgtaac gcgtaagtct gtggcggaac 540 cgactacttt gggtgtccgt gtttcctttt atttttatgg tggctgctta tggtgacaat 600 catagattgt tatcataaag caaattggat tggccatccg gagtgagcta aactatctat 660 ttctctgagt gttggattcg tttcacccac attctgaaca atcagcctca ttagtgttac 720 cctgttaata agacgatatc atcacg 746 <210> 33 <211> 726 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Enterovirus D sequence" <400> 33 ttaaaacagc tctggggttg ttcccacccc agaggcccac gtggcggcta gtactccggt 60 accccggtac ccttgtacgc ctgttttata ctccctttcc caagtaactt tagaagaaat 120 aaactaatgt tcaacaggag ggggtacaaa ccagtaccac cacgaacaca cacttctgtt 180 tccccggtga agttgcatag actgtaccca cggttgaaag cgatgaatcc gttacccgct 240 taggtacttc gagaagccta gtatcatctt ggaatcttcg atgcgttgcg atcagcactc 300 taccccgagt gtagcttggg tcgatgagtc tggacacccc acaccggcga cgtggtccag 360 gctgcgttgg cggcctaccc atggctagca ccatgggacg ctagttgtga acaaggtgcg 420 aagagcctat tgagctacct gagagtcctc cggcccctga atgcggctaa tcccaaccac 480 ggagcaaatg ctcacaatcc agtgagtggt ttgtcgtaat gcgcaagtct gtggcggaac 540 cgactacttt gggtgtccgt gtttcctttt atttttatta tggctgctta tggtgacaat 600 ctgagattgt tatcatatag ctattggatt agccatccgg tgatatcttg aaattttgcc 660 ataacttttt cacaaatcct acaacattac actacacttt ctcttgaata attgagacaa 720 ctcata 726 <210> 34 <211> 737 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Enterovirus J sequence" <400> 34 ttaaaatagc ctcagggttg ttcccaccct gagggcccac gtggtgtagt actctggtat 60 tacggtacct ttgtacgcct attttatacc cccttcccca agtaatttag aagcaagcac 120 aaaccagttc agtagtaagc agtacaatcc agtactgtaa tgaacaagta cttctgttac 180 cccggaaggg tctatcggta agctgtaccc acggctgaag aatgacctac cgttaaccgg 240 ctacctactt cgagaagcct agtaatgccg ttgaagtttt attgacgtta cgctcagcac 300 actaccccgt gtgtagtttt ggctgatgag tcacggcact ccccacgggc gaccgtggcc 360 gtggctgcgt tggcggccaa ccaaggagtg caagctcctt ggacgtcata ttacagacat 420 ggtgtgaaga gcctattgag ctaggtggta gtcctccggc ccctgaatgc ggctaatcct 480 aactccggag catatcggtg cgaaccagca cttggtgtgt tgtaatacgt aagtctggag 540 cggaaccgac tactttgggt gtccgtgttt cctgttttaa cttttatggc tgcttatggt 600 gacaatttaa cattgttacc atatagctgt tgggttggcc atccggattt tgttataaaa 660 ccatttcctc gtgccttgac ctttaacaca tttgtgaact tctttaaatc ccttttatta 720 gtccttaaat actaaga 737 <210> 35 <211> 327 <212> DNA <213> Pegivirus sp. <400> 35 aactgttgtt gtagcaatgc gcatattgct acttcggtac gcctaattgg taggcgcccg 60 gccgaccggc cccgcaaggg cctagtagga cgtgtgacaa tgccatgagg gatcatgaca 120 ctggggtgag cggaggcagc accgaagtcg ggtgaactcg actcccagtg cgaccacctg 180 gcttggtcgt tcatggaggg catgcccacg ggaacgctga tcgtgcaaag ggatgggtcc 240 ctgcactggt gccatgcgcg gcaccactcc gtacagcctg atagggtggc ggcgggcccc 300 cccagtgtga cgtccgtgga gcgcaac 327 <210> 36 <211> 281 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: GB virus C sequence" <400> 36 tgacgtgggg gggttgattt tccccccccg gcactgggtg caagccccag aaaccgacgc 60 ctatctaagt agacgcaatg actcggcgcc gactcggcga ccggccaaaa ggtggtggat 120 gggtgatgac agggttggta ggtcgtaaat cccggtcatc ctggtagcca ctataggtgg 180 gtcttaagag aaggtcaaga ttcctcttac gcctgcggcg agaccgcgca cggtccacag 240 gtgttggccc taccggtgtg aataagggcc cgacatcagg c 281 <210> 37 <211> 459 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: GB virus C sequence" <400> 37 gacgtggggg ggttgatccc ccccctttgg cactgggtgc aagccccaga aaccgacgcc 60 tatttaaaca gacgttaaga accggcgccg acccggcgac cggccaaaag gtggtggatg 120 ggtgatgcca gggttggtag gtcgtaaatc ccggtcatct tggtagccac tataggtggg 180 tcttaagggt tggttaaggt ccctctggcg cttgtggcga gaaagcgcac ggtccacagg 240 tgttggccct accggtgtga ataagggccc gacgtcaggc tcgtcgttaa accgagccca 300 ctacccacct gggcaaacaa cgcccacgta cggtccacgt cgcccttcaa tgtctctctt 360 gaccaatagg cttagccggc gagttgacaa ggaccagtgg gggctgggcg gtaggggaag 420 gacccctgcc gctgcccttc ccggtggagt gggaaatgc 459 <210> 38 <211> 350 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: GB virus C sequence" <400> 38 tgacgtgggg gggttgatcc gccccccccg gcactcggtg caagccccat aaaccgacgc 60 ctatctaagt agacgcaatg actcggcgcc gactcggcga ccggccaaaa ggtggtggat 120 gggtggtgac agggttggta ggtcgtaaat cccggtcatc ctggtagcca ctataggtgg 180 gtcttaagag aaggtcaaga ctcctcttgt gcctgcggcg agaccgcgca cggtccacag 240 gtgctggccc taccggtgtg aataagggcc cgacgtcagg ctcgtcgtta aaccgagccc 300 gtcacccacc tgggcaaacg acgcccacgt acggtccacg tcgcccttca 350 <210> 39 <211> 318 <212> DNA <213> Pegivirus A <400> 39 tgtagcaatg cgcatattgc tacttcggta cgcctaattg gtaggcgccc ggccgaccgg 60 ccccgcaagg gcctagtagg acgtgtgaca atgccatgcg ggatcatgac actggggtga 120 gcggaggcag caccgaagtc gggtgaactc gactcccagt gcgaccacct ggcttggtcg 180 ttcatggagg gcatgcccac gggaacgctg atcgtgcaaa gggatgggtc cctgcactgg 240 tgccatgcgc ggcaccactc cgtacagcct gatagggtgg cggcgggccc ccccagtgtg 300 acgtccgtgg agcgcaac 318 <210> 40 <211> 399 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Pasivirus A sequence" <400> 40 attttctggc cgtgtagctg cttttgacca gtggctctgg gttacttagc caaatccccc 60 ttccttcacc cttttaaatt tgatggtctg tgttgtttgt tttgtcttgt ctaaataata 120 tataagatcc ttcccgccga tacagacctc gacagtctgg tgtaggaggg ttggtgttat 180 taatttgccc cagaagagtg accgtgacac atagaaacca tgagtacatg tgtatccgtg 240 gaggatcgcc cgggactgga ttccatatcc cattgccatc ccaacaagcg gagggtatac 300 ccactatgtg cgcgtttgca gtgggaatct gcaaatttag tcatactgcc tgatagggtg 360 tgggcctgca ctctggggta ctcaggctgt tcatataat 399 <210> 41 <211> 430 <212> DNA <213> Sapelovirus sp. <400> 41 cccctccacc cttaaggtgg ttgtatccca cataccccac cctcccttcc aaagtggacg 60 gacaactgga ttttgactaa cggcaagtct gaatggtatg atttggatac gtttaaacgg 120 cagtagcgtg gcgagctatg gaaaaatcgc aattgtcgat agccatgtta gtgacgcgct 180 tcggcgtgct cctttggtga ttcggcgact ggttacagga gagtaggcag tgagctatgg 240 gcaaacctct acagtattac ttagagggaa tgtgcaattg agacttgacg agcgtctctt 300 tgagatgtgg cgcatgctct tggcattacc atagtgagct tccaggttgg gaaacctgga 360 ctgggcctat actacctgat agggtcgcgg ctggccgcct gtaactagta tagtcagttg 420 aaaccccccc 430 <210> 42 <211> 504 <212> DNA <213> Rosavirus B <400> 42 gtctctttag tgtctatgct tcagagagcg gtgaactgac accgttgctt cttgcacagc 60 ccttcgtgcc ggtctttccg gttctcgaca gcgttgggca tcatggctag ttaggctaag 120 atagtggatg atctagtgaa cagttttgga ttgtttggag ttttgtagcg atgctagtag 180 tgtgtgtgga cctccccacg tggtaacacg tgccccacag gccaaaagcc aaggtgttga 240 aagcacccct actagtccca gactcaccca tctgggaact cctctcatga aaaatcttag 300 taacttttga ttcggctatt catcaacctc tctagtcaag ggctgaagga tgcccggaag 360 gtacccgcag gtaacgataa gctcactgtg gatctgatcc ggggctttgg tgcgaccgtc 420 tgtccggcgt agccagagtt aaaaaacgtc taggcccttc caccccaagg gattggggtt 480 tccccaatca tttgaaagtt cact 504 <210> 43 <211> 532 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Bakunsa virus sequence" <400> 43 ttttgaacgc cacctcggag cgatatccgg ggaccccctc ccctttttcc ttcctacctt 60 cttcccaaat ttccctcttc ccttgttatt ttggtttgga tttcctggac atgactcgga 120 cggatctatc tcatttgctt tgtgtctgct ccaccagtgg catggtcgaa agatcatcaa 180 cactggacgt gtactgtaat ggccaaacgt gcccacaggg gaaaccatgc cggtcgctgt 240 agcggcgggt ggacgtggtg gacccctctc cctgctcata aactttgggt aggtgaaggg 300 ttcaagcgac gcttgccgtg agggcgcatc cggatggtgg gaaccaacaa actaggctgt 360 aatggccgac ctcaggtgga tgagctaggg ctgctgcacc aaaagggact cgattcgata 420 tcccggcctg gtagcctagt gcagtggact cgtagttggg aatctacgac tggcctagta 480 cagggtgata gccccgtttc ccacgcccac ctgttgtagg gacacccccc cc 532 <210> 44 <211> 494 <212> DNA <213> Tremovirus A <400> 44 tttgaaagag gcctccggag tgtccggagg ctctctttcg acccaaccca tactgggggg 60 tgtgtgggac cgtacctgga gtgcacggta tatatgcatt cccgcatggc aagggcgtgc 120 taccttgccc cttgacgcat ggtatgcgtc atcatttgcc ttggttaagc cccatagaaa 180 cgaggcgtca cgtgccgaaa atccctttgc gtttcacaga accatcctaa ccatgggtgt 240 agtatgggaa tcgtgtatgg ggatgattag gatctctcgt agagggatag gtgtgccatt 300 caaatccagg gagtactctg gctctgacat tgggacattt gatgtaaccg gacctggttc 360 agtatccggg ttgtcctgta ttgttacggt gtatccgtct tggcacactg aaagggtatt 420 tttgggtaat cctttcctac tgcctgatag ggtggcgtgc ccggccacga gagattaagg 480 gtagcaattt aaac 494 <210> 45 <211> 378 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Swine Pasivirus 1 sequence" <400> 45 gcttttgacc agtggctctg ggttacttag ccaagtccct ttctcttatt ttcactagtt 60 tatgttgtgt gttgtctgtt ttgttttgtt taaattgtat acaagatcct tcccgccgac 120 acagacctcg acagtctggt gtaggagggt tggtgatatt aatttgcccc aaaagagtga 180 ccgtgatacg tggaaaccat gagtacatgt gtatccgtgg aggatcgccc gggactggat 240 tccatatccc attgccatcc caacaaacgg agggtatacc caccacgtgc gcgtttgcag 300 tgggaatctg caaatttagt catactgcct gatagggtgt gggcctgcac tttggggtac 360 tcaggctgtt catataat 378 <210> 46 <211> 319 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Parechovirus-like virus PLV-CHN sequence" <400> 46 acatggggta tgttgtctgt cctgttttgt tgaaacaata tataagatcc tttccgccga 60 tatagacctc gacagtctag tgtaggagga ttggtgatag taacttgccc cagaagagtg 120 accgtgacac atagaaacca tgagtacatg tgtatccgtg gaggatcgcc cgggactgga 180 ttccatatcc cattgccatc ccaacaaacg gagggtatac ccactatgtg cgcgtttgca 240 gtgggagcct gcaaatttag tcatactgcc tgatagggtg tgggcctgca ctctggggta 300 ctcaggctgt ttatataat 319 <210> 47 <211> 420 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Pasivirus A sequence" <400> 47 tgaaaaagtg gttgtgcagc tggattttcc ggctgtgcaa ctgcttttga ccagtggctc 60 tgggttactt agccaaattc ctttccctta tccctattgg tttgtgttgt gtgttgtttg 120 ttttgttttg tcttaactat atacaagatc cttcccgccg atacagacct cgacagtctg 180 gtgtaggagg gttggtgtta ttaatttgcc ccaaaagagt gaccgtgaca cgtggaaacc 240 atgagtacat gtgtatccgt ggaggatcgc ccgggactgg attccatatc ccattgccat 300 cccaacaaac ggagggtata cccaccacgt gcgcgtttgc agtgggaatc tgcaaattta 360 gtcatactgc ctgatagggt gtgggcctgc actttggggt actcaggctg tttatataat 420 <210> 48 <211> 373 <212> DNA <213> Sicinivirus sp. <400> 48 gtgtcattaa ggtgtgtttg gaagttcgaa ttagctggtt tgtggtgatt agtagacccc 60 ctggaggtac ccaattcgga tctgaccagg gacccgtgac tataccgctc cggtaattcg 120 ggtttaaaac aatgaacgtc accacacaat tacttttctc attttatttt catcattgtc 180 ttcctattta ccgattacac tcgatttcct tggatgttcc tggagatttc cctggttacc 240 tggaccctca ttattgttgt tgtttcaccc agcgagctgt cccaattgct tattatttgc 300 gcttacaact tcgtcctaat atttttctgg ttgatcgggt tgattgagct cccgggctat 360 cctgccattc aac 373 <210> 49 <211> 280 <212> DNA <213> Hepacivirus K <400> 49 gggaacaatg gtccgtccgc ggaacgactc tagccatgag tctagtacga gtgcgtgcca 60 cccattagca caaaaaccac tgactgagcc acacccctcc cggaatcctg agtacaggac 120 attcgctcgg acgacgcatg agcctccatg ccgagaaaat tgggtatacc cacgggtaag 180 gggtggccac ccagcgggaa tctgggggct ggtcactgac tatggtacag cctgataggg 240 tgctgccgca gcgtcagtgg tatgcggctg ttcatggaac 280 <210> 50 <211> 384 <212> DNA <213> Hepacivirus A <400> 50 acctccgtgc taggcacggt gcgttgtcag cgttttgcgc ttgcatgcgc tacacgcgtc 60 gtccaacgcg gagggaactt cacatcacca tgtgtcactc cccctatgga gggttccacc 120 ccgcttacac ggaaatgggt taaccatacc caaagtacgg gtatgcgggt cctcctaggg 180 cccccccggc aggtcgaggg agctggaatt cgtgaattcg tgagtacacg aaaatcgcgg 240 cttgaacgtc tttgaccttc ggagccgaaa tttgggcgtg ccccacgaag gaaggcgggg 300 gcggtgttgg gccgccgccc cctttatccc acggtctgat aggatgcttg cgagggcacc 360 tgccggtctc gtagaccata ggac 384 <210> 51 <211> 384 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Bovine viral diarrhea virus 1 sequence" <400> 51 gtatacgaga atttgcctag gacctcgttt acaatatggg caatctaaaa ttataattag 60 gcctaaggga caaatcctcc tcagcgaagg ccgaaaagag gctagccatg cccttagtag 120 gactagcaaa ataagggggg tagcaacagt ggtgagttcg ttggatggct gaagccctga 180 gtacagggta gtcgtcagtg gttcgacgct tcggaggaca agcctcgaga taccacgtgg 240 acgagggcat gcccacagca catcttaacc tggacggggg tcgttcaggt gaaaacggtt 300 taaccaaccg ctacgaatac agcctgatag ggtgctgcag aggcccactg tattgctact 360 gaaaatctct gctgtacatg gcac 384 <210> 52 <211> 372 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Border Disease virus sequence" <400> 52 gtatacggga gtagctcatg cccgtataca aaattggata ttccaaaact cgattgggtt 60 agggagccct cctagcgacg gccgaaccgt gttaaccata cacgtagtag gactagcaga 120 cgggaggact agccatcgtg gtgagatccc tgagcagtct aaatcctgag tacaggatag 180 tcgtcagtag ttcaacgcag gcacggttct gccttgagat gctacgtgga cgagggcatg 240 cccaagactt gctttaatct cggcgggggt cgccgaggtg aaaacaccta acggtgttgg 300 ggttacagcc tgatagggtg ctgcagaggc ccacgaatag gctagtataa aaatctctgc 360 tgtacatggc ac 372 <210> 53 <211> 388 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Bovine viral diarrhea virus 2 sequence" <400> 53 gtatacgaga ttagctaaag tactcgtata tggattggac gtcaacaaat ttttaattgg 60 caacgtaggg aaccttcccc tcagcgaagg ccgaaaagag gctagccatg ccctttagta 120 ggactagcaa aagtaggggg actagcggta gcagtgagtt cgttggatgg ccgaacccct 180 gagtacaggg gagtcgtcaa tggttcgaca ctccattagt cgaggagtct cgagatgcca 240 tgtggacgag ggcatgccca cggcacatct taacccatgc gggggttgca tgggtgaaag 300 cgctaatcgt ggcgttatgg acacagcctg atagggtgta gcagagacct gctattccgc 360 tagtaaaaaa ctctgctgta catggcac 388 <210> 54 <211> 373 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Classical swine fever virus sequence" <400> 54 gtatacgagg ttagttcatt ctcgtatgca ttattggaca aatcaaaatt tcaatttggt 60 tcagggcctc cctccagcga cggccgaact gggctagcca tgcccatagt aggactagca 120 aacggaggga ctagccgtag tggcgagctc cctgggtgtt ctaagtcctg agtacaggac 180 agtcgtcagt agttcgacgt gagcagaagc ccacctcgag atgctatgtg gacgagggca 240 tgcccaagac gcaccttaac cctagcgggg gtcgctaggg tgaaatcaca ccacgtgatg 300 ggagtccgac ctgatagggt gctgcagagg ctcactatta ggctagtata aaaatctctg 360 ctgtacatgg cac 373 <210> 55 <211> 191 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Human blood-associated dicistrovirus sequence" <400> 55 aaaaccgacc ccagagatca gaaagtcgtt gacgcgatct tttattagag gacgttgcgc 60 tggcgcgagc tttaattagc agacgccaaa aataaacaac aaaatgctga tcgcgagact 120 taattgtcag acgattggcc aaatccgatg tgatctttgc tgctcccaga ttgccgaaat 180 aggagtagta g 191 <210> 56 <211> 438 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Hubei Picorna-like virus sequence" <400> 56 ccccaaaacc ccccccttaa actcaacact gtagtggatt cattttccgt tgcaaaacaa 60 aacattacta cccgcattta tgtaggctct gtgttttcta tgcgaccgtt acattaatct 120 ctactctgac ccactagttt ataaaaccga agacctgaat gaaacgattt tccttctttt 180 caacctctaa cgaacctctg acggcttgag aaacctgaag ttagtaatta tgtttaaaag 240 aaaggaaagt caaacgcgat gactcttaca tccctattcc ataccgttgc tccacaatgt 300 gagcgatgcg aggtcgggac tgcagtatta ggggaacgag ctacatggag agttaattat 360 ctctcccctc ctacgggagt ctcatgtgag ctgtagaaag cggttggcac ctctcgttac 420 ctcgcctgta catgatcc 438 <210> 57 <211> 193 <212> DNA <213> Cricket paralysis virus <400> 57 aaaagcaaaa atgtgatctt gcttgtaaat acaattttga gaggttaata aattacaagt 60 agtgctattt ttgtatttag gttagctatt tagctttacg ttccaggatg cctagtggca 120 gccccacaat atccaggaag ccctctctgc ggtttttcag attaggtagt cgaaaaacct 180 aagaaattta cct 193 <210> 58 <211> 752 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Salivirus A sequence" <400> 58 tttcctcctt tcgaccgcct tacggcaggc gggtccgcgg acggcttcgg cctacccgcg 60 acaagaatgc cgtcatctgt ccttatcacc catattcttt cccttccccc gcaaccatca 120 cgcttactcg cgcacgtgtt gagtggcacg tgcgttgtcc aaacagttac actcacaccc 180 ttggggcggg tttgtcccgc cctcgggttc ctcgcggaac cctccctctt ctctctccct 240 ttctatccgc cttcactttc cataactaca gtgctttggt aggtaagcat cctgaccccc 300 cgcggaagct gccaacgtgg caactgtggg gatccaggca ggttatcaaa ggcacccggt 360 ctttccgcct tcaggagtat ccctgccggt gaattccgac agggctctgc ttggtgccaa 420 cctcccccaa atgcgcgctg cgggagtgct cttccccaac tcatcttagt aacctctcat 480 gtgtgtgctt ggtcagcata tctgaggcga cgttccgctg tcccagacca gtccagcaat 540 ggacgggcca gtgtgcgtag tcgctttccg gtttcccggc gcatgtttgg cgaaacgctg 600 aggtaaggtt ggtgtgccca atgcccgtaa tttggtgaca cctcaagacc acccaggaat 660 gccagggagg taccccactt cggtgggatc tgaccctggg ctaattgtct acggtggttc 720 ttcttgcttc cacttctctt ttttctggca tg 752 <210> 59 <211> 708 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Salivirus A sequence" <400> 59 tatggcaggc gggcttgtgg acggcttcgg cccacccaca gcaagaatgc catcatctgt 60 cctcaccccc atgtttcccc tttctttccc tgcaaccgtt acgcttactc gcaggtgcat 120 ttgagtggtg cacgtgttga ataaacagct acactcacat gggggcgggt tttcccgccc 180 tgcggcctct cgcgaggccc acccctcccc ttcctcccat aactacagtg ctttggtagg 240 taagcatcct gatcccccgc ggaagctgct cacgtggcaa ctgtggggac ccagacaggt 300 tatcaaaggc acccggtctt tccgccttca ggagtatccc tgctagtgaa ttctagtagg 360 gctctgcttg gtgccaacct cccccaaatg cgcgctgcgg gagtgctctt ccccaactca 420 ccctagtatc ctctcatgtg tgtgcttggt cagcatatct gagacgatgt tccgctgtcc 480 cagaccagtc cagtaatgga cgggccagtg tgcgtagtcg tcttccggct tttccggcgc 540 atgtttggtg aaccggtggg gtaaggttgg tgtgcccaac gcccgtactt tggtgatacc 600 tcaagaccac ccaggaatgc cagggaggta ccccgcttca cagcgggatc tgaccctggg 660 ctaattgtct acggtggttc ttcttgcttc cacttctttc tactgttc 708 <210> 60 <211> 718 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Salivirus A sequence" <400> 60 tttcgaccgc cttatggcag gcgggcttgt ggacggcttc ggcccaccca cagcaagaat 60 gccatcatct gtcctcaccc ccatttctcc cctccttccc ctgcaaccat tacgcttact 120 cgcatgtgca ttgagtggtg cacgtgttga acaaacagct acactcacgt gggggcgggt 180 tttcccgccc ttcggcctct cgcgaggccc acccttcccc ttcctcccat aactacagtg 240 ctttggtagg taagcatcct gatcccccgc ggaagctgct cgcgtggcaa ctgtggggac 300 ccagacaggt tatcaaaggc acccggtctt tccgcctcca ggagtatccc tgctagtgaa 360 ttctagtggg gctctgcttg gtgccaacct cccccaaatg cgcgctgcgg gagtgctctt 420 ccccaactca ccctagtatc ctctcatgtg tgtgcttggt cagcatatct gagacgatgt 480 tccgctgtcc cagaccagtc cagcaatgga cgggccagtg tgcgtagtcg tcttccggct 540 tgtccggcgc atgtttggtg aaccggtggg gtaaggttgg tgtgcccaac gcccgtactt 600 tggtgacaac tcaagaccac ccaggaatgc cagggaggta ccccgcctca cggcgggatc 660 tgaccctggg ctaattgtct acggtggttc ttcttgcttc catttctttc ttctgttc 718 <210> 61 <211> 699 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Salivirus A sequence" <400> 61 tatggcaggc gggcttgtgg acggtttcgg cccacccaca gcaagaatgc catcatctgt 60 cctcaccccc aattttccct ttcttcccct gcaatcatca cgcttactcg catgtgcatt 120 gagtggtgca tgtgttgaac aaacagctac actcacatgg gggcgggttt tcccgcccta 180 cggcctctcg cgaggcccac ccttcccctc cccttataac tacagtgctt tggcaggtaa 240 gcatcctgat cccccgcgga agctgctcac gtggcaactg tggggaccca gacaggttat 300 caaaggcacc cggtctttcc gccttcagga gcatccccac tagtgaattc tagtggggct 360 ctgcttggtg ccaacctccc ccaaatgcgc gctgcgggag tgctcttccc caacccatcc 420 tagtatcctc tcatgtgtgt gcttggtcag catatctgag acgacgttcc gctgtcccag 480 accagtccag taatggacgg gccagtgtgc gtagtcgtct tccggcttgt ccggcgcatg 540 tttggtgaac cggtggggta aggttggtgt gcccaacgcc cgtactttgg tgacacctca 600 agaccaccca ggaatgccag ggaggtaccc cgcctcacgg cgggatctga ccctgggcta 660 attgtctacg gtggttcttc ttgcttccac ttctttctt 699 <210> 62 <211> 624 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Salivirus A sequence" <400> 62 ttctcctgca accattacgc ttaatcgcat gtgcattgag tggtgcatgt gttgaacaaa 60 cagctacaat cacatggggg cgggttttcc cgccccacgg cttctcgcga ggcccatccc 120 tcccttttct cccataacta cagtgctttg gtaggtaagc atcccgatct cccgcggaag 180 ctgctcacgt ggcaactgtg gggacccaga caggttatca aaggcacccg gtctttccgc 240 cttcaggagt atccctgcta gcgaattcta gtagggctct gcttggtgcc aacctctccc 300 aaatgcgcgc tgcgggagtg ctcttcccca aatcacccca gtatcctctc atgtgtgtgc 360 ctggtcagca tatctgagac gatgttccgc tgtcccagac cagtccagta atggacgggc 420 cagtgtgcgt agtcgtcctc cggcttgtcc ggcgcatgtt tggtgaaccg gtggggtaag 480 gttggtgtgc ccaacgcccg taatcagggg 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aggcagtagc gaaagctgca 120 agagaatgaa aatccgt 137 <210> 84 <211> 136 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 84 atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac cctaacgtca 60 agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccaata ggcagtagcg aaagctgcaa 120 gagaatgaaa atccgt 136 <210> 85 <211> 135 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 85 tagatgactt acaactaatc ggaaggtgca gagactcgac gggagctacc ctaacgtcaa 60 gacgagggta aagagagagt ccaattctca aagccaatag gcagtagcga aagctgcaag 120 agaatgaaaa tccgt 135 <210> 86 <211> 134 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 86 agatgactta caactaatcg gaaggtgcag agactcgacg ggagctaccc taacgtcaag 60 acgagggtaa agagagagtc caattctcaa agccaatagg cagtagcgaa agctgcaaga 120 gaatgaaaat ccgt 134 <210> 87 <211> 133 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 87 gatgacttac aactaatcgg aaggtgcaga gactcgacgg gagctaccct aacgtcaaga 60 cgagggtaaa gagagagtcc aattctcaaa gccaataggc agtagcgaaa gctgcaagag 120 aatgaaaatc cgt 133 <210> 88 <211> 132 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 88 atgacttaca actaatcgga aggtgcagag actcgacggg agctacccta acgtcaagac 60 gagggtaaag agagagtcca attctcaaag ccaataggca gtagcgaaag ctgcaagaga 120 atgaaaatcc gt 132 <210> 89 <211> 131 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 89 tgacttacaa ctaatcggaa ggtgcagaga ctcgacggga gctaccctaa cgtcaagacg 60 agggtaaaga gagagtccaa ttctcaaagc caataggcag tagcgaaagc tgcaagagaa 120 tgaaaatccg t 131 <210> 90 <211> 78 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 90 caagacgagg gtaaagagag agtccaattc tcaaagccaa taggcagtag cgaaagctgc 60 aagagaatga aaatccgt 78 <210> 91 <211> 77 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 91 aagacgaggg taaagagaga gtccaattct caaagccaat aggcagtagc gaaagctgca 60 agagaatgaa aatccgt 77 <210> 92 <211> 76 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 92 agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccaata ggcagtagcg aaagctgcaa 60 gagaatgaaa atccgt 76 <210> 93 <211> 75 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 93 gacgagggta aagagagagt ccaattctca aagccaatag gcagtagcga aagctgcaag 60 agaatgaaaa tccgt 75 <210> 94 <211> 74 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 94 acgagggtaa agagagagtc caattctcaa agccaatagg cagtagcgaa agctgcaaga 60 gaatgaaaat ccgt 74 <210> 95 <211> 40 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 95 aataggcagt agcgaaagct gcaagagaat gaaaatccgt 40 <210> 96 <211> 39 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 96 ataggcagta gcgaaagctg caagagaatg aaaatccgt 39 <210> 97 <211> 38 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 97 taggcagtag cgaaagctgc aagagaatga aaatccgt 38 <210> 98 <211> 37 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 98 aggcagtagc gaaagctgca agagaatgaa aatccgt 37 <210> 99 <211> 36 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 99 ggcagtagcg aaagctgcaa gagaatgaaa atccgt 36 <210> 100 <211> 27 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 100 gaaagctgca agagaatgaa aatccgt 27 <210> 101 <211> 26 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 101 aaagctgcaa gagaatgaaa atccgt 26 <210> 102 <211> 25 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 102 aagctgcaag agaatgaaaa tccgt 25 <210> 103 <211> 24 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 103 agctgcaaga gaatgaaaat ccgt 24 <210> 104 <211> 23 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 104 gctgcaagag aatgaaaatc cgt 23 <210> 105 <211> 22 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 105 ctgcaagaga atgaaaatcc gt 22 <210> 106 <211> 18 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 106 aagagaatga aaatccgt 18 <210> 107 <211> 17 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 107 agagaatgaa aatccgt 17 <210> 108 <211> 16 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 108 gagaatgaaa atccgt 16 <210> 109 <211> 35 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 109 gcagtagcga aagctgcaag agaatgaaaa tccgt 35 <210> 110 <211> 33 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 110 agtagcgaaa gctgcaagag aatgaaaatc cgt 33 <210> 111 <211> 32 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 111 gtagcgaaag ctgcaagaga atgaaaatcc gt 32 <210> 112 <211> 26 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 112 acggacttaa ataattgagc cttaaa 26 <210> 113 <211> 27 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 113 acggacttaa ataattgagc cttaaag 27 <210> 114 <211> 28 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 114 acggacttaa ataattgagc cttaaaga 28 <210> 115 <211> 76 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 115 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatcta 76 <210> 116 <211> 77 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 116 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctag 77 <210> 117 <211> 78 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 117 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagt 78 <210> 118 <211> 79 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 118 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtt 79 <210> 119 <211> 80 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 119 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta 80 <210> 120 <211> 127 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 120 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagtta 127 <210> 121 <211> 128 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 121 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaa 128 <210> 122 <211> 129 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 122 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaac 129 <210> 123 <211> 130 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 123 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca 130 <210> 124 <211> 131 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 124 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca a 131 <210> 125 <211> 132 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 125 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca at 132 <210> 126 <211> 133 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 126 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca ata 133 <210> 127 <211> 134 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 127 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atag 134 <210> 128 <211> 135 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 128 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca ataga 135 <210> 129 <211> 188 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 129 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgt 188 <210> 130 <211> 189 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 130 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtc 189 <210> 131 <211> 190 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 131 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca 190 <210> 132 <211> 191 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 132 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca a 191 <210> 133 <211> 192 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 133 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca ag 192 <210> 134 <211> 226 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 134 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagcc 226 <210> 135 <211> 227 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 135 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagcca 227 <210> 136 <211> 228 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 136 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccaa 228 <210> 137 <211> 229 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 137 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccaat 229 <210> 138 <211> 230 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 138 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccaata 230 <210> 139 <211> 239 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 139 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccaata ggcagtagc 239 <210> 140 <211> 240 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 140 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccaata ggcagtagcg 240 <210> 141 <211> 241 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 141 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccaata ggcagtagcg 240 a 241 <210> 142 <211> 242 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 142 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccaata ggcagtagcg 240 aa 242 <210> 143 <211> 243 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 143 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccaata ggcagtagcg 240 aaa 243 <210> 144 <211> 244 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 144 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccaata ggcagtagcg 240 aaag 244 <210> 145 <211> 248 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 145 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccaata ggcagtagcg 240 aaagctgc 248 <210> 146 <211> 249 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 146 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccaata ggcagtagcg 240 aaagctgca 249 <210> 147 <211> 250 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 147 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccaata ggcagtagcg 240 aaagctgcaa 250 <210> 148 <211> 231 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 148 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccaata g 231 <210> 149 <211> 233 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 149 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccaata ggc 233 <210> 150 <211> 234 <212> DNA <213> Anabaena sp. <400> 150 acggacttaa ataattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggatgct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctagtta tagacaaggc aatcctgagc caagccgaag tagtaattag 120 taagttaaca atagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac 180 cctaacgtca agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccaata ggca 234 <210> 151 <211> 104 <212> DNA <213> Azoarcus sp. <400> 151 tgcgccgatg aaggtgtaga gactagacgg cacccaccta aggcaaacgc tatggtgaag 60 gcatagtcca gggagtggcg aaagtcacac aaaccggaat ccgt 104 <210> 152 <211> 141 <212> DNA <213> Azoarcus sp. <400> 152 ccgggcgtat ggcaacgccg agccaagctt cggcgcctgc gccgatgaag gtgtagagac 60 tagacggcac ccacctaagg caaacgctat ggtgaaggca tagtccaggg agtggcgaaa 120 gtcacacaaa ccggaatccg t 141 <210> 153 <211> 78 <212> DNA <213> Azoarcus sp. <400> 153 acggcaccca cctaaggcaa acgctatggt gaaggcatag tccagggagt ggcgaaagtc 60 acacaaaccg gaatccgt 78 <210> 154 <211> 58 <212> DNA <213> Azoarcus sp. <400> 154 acgctatggt gaaggcatag tccagggagt ggcgaaagtc acacaaaccg gaatccgt 58 <210> 155 <211> 75 <212> DNA <213> Thiomargarita sp. <400> 155 attaaagtta tagaattatc agagaatgat atagtccaag ccttatggta acatgagggc 60 acttgaccct ggtag 75 <210> 156 <211> 195 <212> DNA <213> Staphylococcus virus Twort <400> 156 aagatgtagg caatcctgag ctaagctctt agtaataaga gaaagtgcaa cgactattcc 60 gataggaagt agggtcaagt gactcgaaat ggggattacc cttctagggt agtgatatag 120 tctgaacata tatggaaaca tatagaagga taggagtaac gaacctattc gtaacataat 180 tgaactttta gttat 195 <210> 157 <211> 163 <212> DNA <213> Staphylococcus virus Twort <400> 157 taataagaga aagtgcaacg actattccga taggaagtag ggtcaagtga ctcgaaatgg 60 ggattaccct tctagggtag tgatatagtc tgaacatata tggaaacata tagaaggata 120 ggagtaacga acctattcgt aacataattg aacttttagt tat 163 <210> 158 <211> 133 <212> DNA <213> Staphylococcus virus Twort <400> 158 taggaagtag ggtcaagtga ctcgaaatgg ggattaccct tctagggtag tgatatagtc 60 tgaacatata tggaaacata tagaaggata ggagtaacga acctattcgt aacataattg 120 aacttttagt tat 133 <210> 159 <211> 92 <212> DNA <213> Staphylococcus virus Twort <400> 159 ctagggtagt gatatagtct gaacatatat ggaaacatat agaaggatag gagtaacgaa 60 cctattcgta acataattga acttttagtt at 92 <210> 160 <211> 92 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: LSUp1 sequence" <400> 160 agttaataaa gatgatgaaa tagtctgaac cattttgaga aaagtggaaa taaaagaaaa 60 tcttttatga taacataaat tgaacaggct aa 92 <210> 161 <211> 62 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Bacteriophage Phi I sequence" <400> 161 caaagactga tgatatagtc cgacactcct agtaatagga gaatacagaa aggatgaaat 60 cc 62 <210> 162 <211> 76 <212> DNA <213> Nostoc sp. <400> 162 agtcgagggt aaagggagag tccaattctc aaagcctatt ggcagtagcg aaagctgcgg 60 gagaatgaaa atccgt 76 <210> 163 <211> 76 <212> DNA <213> Nostoc sp. <400> 163 agccgagggt aaagggagag tccaattctc aaagccaata ggcagtagcg aaagctgcgg 60 gagaatgaaa atccgt 76 <210> 164 <211> 89 <212> DNA <213> Nodularia sp. <400> 164 agccgagggt aaagggagag tccaattctc aaagccgaag gttattaaaa cctggcagca 60 gtgaaagctg cgggagaatg aaaatccgt 89 <210> 165 <211> 79 <212> DNA <213> Pleurocapsa sp. <400> 165 agctgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccagca gatggcagta gcgaaagctg 60 cgggagaatg aaaatccgt 79 <210> 166 <211> 76 <212> DNA <213> Planktothrix sp. <400> 166 agccgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccaatt ggtagtagcg aaagctacgg 60 gagaatgaaa atccgt 76 <210> 167 <211> 118 <212> DNA <213> Azoarcus sp. <400> 167 gcggactcat atttcgatgt gccttgcgcc gggaaaccac gcaagggatg gtgtcaaatt 60 cggcgaaacc taagcgcccg cccgggcgta tggcaacgcc gagccaagct tcggcgcc 118 <210> 168 <211> 81 <212> DNA <213> Azoarcus sp. <400> 168 gcggactcat atttcgatgt gccttgcgcc gggaaaccac gcaagggatg gtgtcaaatt 60 cggcgaaacc taagcgcccg c 81 <210> 169 <211> 144 <212> DNA <213> Azoarcus sp. <400> 169 gcggactcat atttcgatgt gccttgcgcc gggaaaccac gcaagggatg gtgtcaaatt 60 cggcgaaacc taagcgcccg cccgggcgta tggcaacgcc gagccaagct tcggcgcctg 120 cgccgatgaa ggtgtagaga ctag 144 <210> 170 <211> 164 <212> DNA <213> Azoarcus sp. <400> 170 gcggactcat atttcgatgt gccttgcgcc gggaaaccac gcaagggatg gtgtcaaatt 60 cggcgaaacc taagcgcccg cccgggcgta tggcaacgcc gagccaagct tcggcgcctg 120 cgccgatgaa ggtgtagaga ctagacggca cccacctaag gcaa 164 <210> 171 <211> 179 <212> DNA <213> Thiomargarita sp. <400> 171 aggattagat actacactaa gtgtccccca gactggtgac agtctggtgt gcatccagct 60 atatcggtga aaccccattg gggtaatacc gagggaagct atattatata tatattaata 120 aatagccccg tagagactat gtaggtaagg agatagaaga tgataaaatc aaaatcatc 179 <210> 172 <211> 84 <212> DNA <213> Staphylococcus virus Twort <400> 172 actactgaaa gcataaataa ttgtgccttt atacagtaat gtatatcgaa aaatcctcta 60 attcagggaa cacctaaaca aact 84 <210> 173 <211> 116 <212> DNA <213> Staphylococcus virus Twort <400> 173 actactgaaa gcataaataa ttgtgccttt atacagtaat gtatatcgaa aaatcctcta 60 attcagggaa cacctaaaca aactaagatg taggcaatcc tgagctaagc tcttag 116 <210> 174 <211> 146 <212> DNA <213> Staphylococcus virus Twort <400> 174 actactgaaa gcataaataa ttgtgccttt atacagtaat gtatatcgaa aaatcctcta 60 attcagggaa cacctaaaca aactaagatg taggcaatcc tgagctaagc tcttagtaat 120 aagagaaagt gcaacgacta ttccga 146 <210> 175 <211> 187 <212> DNA <213> Staphylococcus virus Twort <400> 175 actactgaaa gcataaataa ttgtgccttt atacagtaat gtatatcgaa aaatcctcta 60 attcagggaa cacctaaaca aactaagatg taggcaatcc tgagctaagc tcttagtaat 120 aagagaaagt gcaacgacta ttccgatagg aagtagggtc aagtgactcg aaatggggat 180 taccctt 187 <210> 176 <211> 216 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: LSUp1 sequence" <400> 176 cgctagggat ttataactgt 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aagcgccaga cagtcaact 559 <210> 178 <211> 218 <212> DNA <213> Nostoc sp. <400> 178 acggacttaa gtaattgagc cttaaagaag aaattcttta agtggcagct ctcaaactca 60 gggaaaccta aatctgttca cagacaaggc aatcctgagc caagccgaaa gagtcatgag 120 tgctgagtag tgagtaaaat aaaagctcac aactcagagg ttgtaactct aagctagtcg 180 gaaggtgcag agactcgacg ggagctaccc taacgtaa 218 <210> 179 <211> 165 <212> DNA <213> Nostoc sp. <400> 179 acggacttaa actgaattga gccttagaga agaaattctt taagtgtcag ctctcaaact 60 cagggaaacc taaatctgtt gacagacaag gcaatcctga gccaagccga gaactctaag 120 ttattcggaa ggtgcagaga ctcgacggga gctaccctaa cgtca 165 <210> 180 <211> 181 <212> DNA <213> Nodularia sp. <400> 180 acggacttag aaaactgagc cttgatcgag aaatctttca agtggaagct ctcaaattca 60 gggaaaccta aatctgttta cagatatggc aatcctgagc caagccgaaa caagtcctga 120 gtgttaaagc tcataactca tcggaaggtg cagagactcg acgggagcta ccctaacgtt 180 a 181 <210> 181 <211> 188 <212> DNA <213> Pleurocapsa sp. <400> 181 acggacttaa aaaaattgag ccttggcaga gaaatctgtc atgcgaacgc tctcaaattc 60 agggaaacct aagtctggca acagatatgg caatcctgag ccaagcctta atcaaggaaa 120 aaaacatttt taccttttac cttgaaagga aggtgcagag actcaacggg agctacccta 180 acaggtca 188 <210> 182 <211> 200 <212> DNA <213> Planktothrix sp. <400> 182 acggacttaa agataaattg agccttgagg cgagaaatct ctcaagtgta agctgtcaaa 60 ttcagggaaa cctaaatctg taaattcaga caaggcaatc ctgagccaag cctaggggta 120 ttagaaatga gggagtttcc ccaatctaag atcaatacct aggaaggtgc agagactcga 180 cgggagctac cctaacgtta 200 <210> 183 <211> 166 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 183 agtatataag aaacaaacca ctagatgact tacaactaat cggaaggtgc agagactcga 60 cgggagctac cctaacgtca agacgagggt aaagagagag tccaattctc aaagccaata 120 ggcagtagcg aaagctgcaa gagaatgaaa atccgtggct cgcagc 166 <210> 184 <211> 176 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 184 ctgaaattat acttatactc aaacaaacca 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aaagccaata ggcagtagcg aaagctgcaa gagaatgaaa atccgtggct cgcagc 176 <210> 190 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 190 gtgtgaagct atactcatac tagcgtcagc aaacaaacaa atagatgact tacaactaat 60 cggaaggtgc agagactcga cgggagctac cctaacgtca agacgagggt aaagagagag 120 tccaattctc aaagccaata ggcagtagcg aaagctgcaa gagaatgaaa atccgtggct 180 cgcagc 186 <210> 191 <211> 196 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 191 cctcacctga gtgtgaagct atactcatac tagcgtcagc aaacaaacaa atagatgact 60 tacaactaat cggaaggtgc agagactcga cgggagctac cctaacgtca agacgagggt 120 aaagagagag tccaattctc aaagccaata ggcagtagcg aaagctgcaa gagaatgaaa 180 atccgtggct cgcagc 196 <210> 192 <211> 206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 192 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agacgagggt aaagagagag 120 tccaattctc aaagccaata ggcagtagcg aaagctgcaa gagaatgaaa atccgtggct 180 cgcagc 186 <210> 198 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 198 ctgataataa agtaatacac actataagac aaacaaacca ctagatgact tacaactaat 60 cggaaggtgc agagactcga cgggagctac cctaacgtca agacgagggt aaagagagag 120 tccaattctc aaagccaata ggcagtagcg aaagctgcaa gagaatgaaa atccgtggct 180 cgcagc 186 <210> 199 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 199 ctgaaattat acttatactc tctaagttac aaacaaacca ctagatgact tacaactaat 60 cggaaggtgc agagactcga cgggagctac cctaacgtca agacgagggt aaagagagag 120 tccaattctc aaagccaata ggcagtagcg aaagctgcaa gagaatgaaa atccgtggct 180 cgcagc 186 <210> 200 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 200 ctgaaattat gtgtgttaca tctaagttac aaacaaacca ctagatgact tacaactaat 60 cggaaggtgc agagactcga cgggagctac cctaacgtca agacgagggt aaagagagag 120 tccaattctc aaagccaata ggcagtagcg aaagctgcaa gagaatgaaa atccgtggct 180 cgcagc 186 <210> 201 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 201 gttgatcggt gtgtgttaca tctaagttac aaacaaacca ctagatgact tacaactaat 60 cggaaggtgc agagactcga cgggagctac cctaacgtca agacgagggt aaagagagag 120 tccaattctc aaagccaata ggcagtagcg aaagctgcaa gagaatgaaa atccgtggct 180 cgcagc 186 <210> 202 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 202 ctgaaattat acttatactc agtatatgac aaacaaacca ctagatgact tacaactaat 60 cggaaggtgc agagactcga cgggagctac cctaacgtca agacgagggt aaagagagag 120 tccaattctc aaagccaata ggcagtagcg aaagctgcaa gagaatgaaa atccgtgatt 180 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 213 aaacaaacca cggcagtagc gaaagctgca agagaatgaa aatccgtggc tcgcagc 57 <210> 214 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 214 agtatataag aaacaaacca cggcagtagc gaaagctgca agagaatgaa aatccgtggc 60 tcgcagc 67 <210> 215 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 215 ctgaaattat acttatactc aaacaaacca cggcagtagc gaaagctgca agagaatgaa 60 aatccgtggc tcgcagc 77 <210> 216 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 216 ctgaaattat acttatactc agtatatgac aaacaaacca cggcagtagc gaaagctgca 60 agagaatgaa aatccgtggc tcgcagc 87 <210> 217 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: 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of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 327 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 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<223> /note="Description of Unknown: CK1.0 sequence" <400> 349 gtggccacgc ccgggccacc gatacttccc ttcactcctt cgggactgtt ggggaggaac 60 acaacagggc tcccctgttt tcccattcct tccccctttt cccaacccca accgccgtat 120 ctggtggcgg caagacacac gggtctttcc ctctaaagca caattgtgtg tgtgtcccag 180 gtcctcctgc gtacggtgcg ggagtgctcc cacccaactg ttgtaagcct gtccaacgcg 240 tcgtcctggc aagactatga cgtcgcatgt tccgctgcgg atgccgaccg ggtaaccggt 300 tccccagtgt gtgtagtgcg atcttccagg tcctcctggt tggcgttgtc cagaaactgc 360 ttcaggtaag tggggtgtgc ccaatcccta caaaggttga ttctttcacc accttaggaa 420 tgctccggag gtaccccagc aacagctggg atctgaccgg aggctaattg tctacgggtg 480 gtgtttcctt tttcttttca cacaactcta ctgctgacaa ctcactgact atccacttgc 540 tctgtcacg 549 <210> 350 <211> 630 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: PV1.0 sequence" <400> 350 aacaaaaggc tacaccactt gggctacggc ccgcgccacc ttgtggcgca aagacattag 60 aagaatagca taccgcccac tagggccctg cagccagcag ggtaacgggc aagcacttct 120 gtctccccgg tagaacggta 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Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 355 gtggccacgc ccgggccacc gatacttccc ttcactcctt cgggactgtt ggggaggaac 60 acaacagggc tcccctgttt tcccattcct tccccctttt cccaacccca accgccgtat 120 ctggtggcgg caagacacac gggtctttcc ctctaaagca caattgtgtg tgtgtcccag 180 gtcctcctgc gtacggtgcg ggagtgctcc cacccaactg ttgtaagcct gtccaacgcg 240 tcgtcctggc aagactatga cgtcgcatgt tccgctgcgg atgccgaccg ggtaaccggt 300 tccccagtgt gtgtagtgcg atcttccagg tcctcctggt tggcgttgtc cagaaactgc 360 ttcaggtaag tggggtgtgc ccaatcccta caaaggttga ttctttcacc accttaggaa 420 tgctccggag gtaccccagc aacagctggg atctgaccgg aggctaattg tctacgggtg 480 gtgtttcctt tttcttttca cacaactgcc acc 513 <210> 356 <211> 549 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 356 gtggccacgc ccgggccacc gatacttccc ttcactcctt cgggactgtt ggggaggaac 60 acaacagggc tcccctgttt tcccattcct tccccctttt cccaacccca 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Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 366 gaattaaacg ggcaccctac ccaagggtta catgggacca tattcctcct cccctgtaac 60 tttaagtttt gtgcccgtat tcttgactcc aggcggatgt tgtgtcgccc gtcctgtgaa 120 caaacagcta gacactttcc tcccctccct ctgggctgct ccggcagtcc actccctccc 180 cccagcgtaa catgccccgc tggagtgatg cacctggaag tcgtggacgt gggttagtaa 240 cttcggtgaa aacccactat aatgacaact ggttgacccc cacactcaaa ggactcgagt 300 ctttctccct taaggctagc ccggccacat gaatttgcag ctggcaacta gtgagtccac 360 catgtcccgc aacctcggct gcggagtgct gttccccaag cgtatgcctt ccttctgtaa 420 gagtgcgcct ggcaagcaca tctgagaagt cgttccgctg cgtcgtgcca acctggcgac 480 aggtgaccca gtgtgcgtag acttcttccg gattcgtccg gctcttctct aggaaacatg 540 cgtgtaaggt tcatgtgcca aagccctgcg cgcggtgttc ttctactgcc ctaggaatgt 600 gccgcaggta cccctacttc ggtagggatc tgagcggtag ctaattgtct acgggtagtt 660 tcatttccat cttctcttca ggtcgacatc 690 <210> 367 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 367 tttcacaccc tcttttccgg tggtccggac ccagaccacc gttactccat tcagctactt 60 cggtacctgt tcggaggaat taaacgggca ccctacccaa gggttacatg ggaccatatt 120 cctcctcccc tgtaacttta agttttgtgc ccgtattctt gactccaggc ggatgttgtg 180 tcgcccgtcc tgtgaacaaa cagctagaca ctttcctccc ctccctctgg gctgctccgg 240 cagtccactc cctcccccca gcgtaacatg ccccgctgga gtgatgcacc tggaagtcgt 300 ggacgtgggt tagtaacttc ggtgaaaacc cactataatg acaactggtt gacccccaca 360 ctcaaaggac tcgagtcttt ctcccttaag gctagcccgg ccacatgaat ttgcagctgg 420 caactagtga gtccaccatg tcccgcaacc tcggctgcgg agtgctgttc cccaagcgta 480 tgccttcctt ctgtaagagt gcgcctggca agcacatctg agaagtcgtt ccgctgcgtc 540 gtgccaacct ggcgacaggt gacccagtgt gcgtagactt cttccggatt cgtccggctc 600 ttctctagga aacatgcgtg taaggttcat gtgccaaagc cctgcgcgcg gtgttcttct 660 actgccctag gaatgtgccg caggtacccc tacttcggta gggatctgag cggtagctaa 720 ttggacatc 729 <210> 368 <211> 650 <212> DNA <213> Salivirus sp. <400> 368 tctgtcctca ccccatcttc ccttctttcc tgcaccgtta cgcttactcg 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tccccctttt cccaacccca accgccgtat 120 ctggtggcgg caagacacac gggtctttcc ctctaaagca caattgtgtg tgtgtcccag 180 gtcctcctgc gtacggtgcg ggagtgctcc cacccaactg ttgtaagcct gtccaacgcg 240 tcgtcctggc aagactatga cgtcgcatgt tccgctgcgg atgccgaccg ggtaaccggt 300 tccccagtgt gtgtagtgcg atcttccagg tcctcctggt tggcgttgtc cagaaactgc 360 ttcaggtaag tggggtgtgc ccaatcccta caaaggttga ttctttcacc accttaggaa 420 tgctccggag gtaccccagc aacagctggg atctgaccgg aggctaattg tctacgggtg 480 gtgtttcctt tttcttttca cacaactcta cgtctgacaa ctcactgact atccacttgc 540 tctaaagtc 549 <210> 379 <211> 549 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: GLuc CK dCTG1_2 sequence" <400> 379 gtggccacgc ccgggccacc gatacttccc ttcactcctt cgggactgtt ggggaggaac 60 acaacagggc tcccctgttt tcccattcct tccccctttt cccaacccca accgccgtat 120 ctggtggcgg caagacacac gggtctttcc ctctaaagca caattgtgtg tgtgtcccag 180 gtcctcctgc gtacggtgcg ggagtgctcc cacccaactg ttgtaagcct gtccaacgcg 240 tcgtcctggc aagactatga cgtcgcatgt tccgctgcgg atgccgaccg ggtaaccggt 300 tccccagtgt gtgtagtgcg atcttccagg tcctcctggt tggcgttgtc cagaaactgc 360 ttcaggtaag tggggtgtgc ccaatcccta caaaggttga ttctttcacc accttaggaa 420 tgctccggag gtaccccagc aacagctggg atctgaccgg aggctaattg tctacgggtg 480 gtgtttcctt tttcttttca cacaactcta cgtcgtacaa ctcactgact atccacttgc 540 tctaaagtc 549 <210> 380 <211> 549 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: GLuc CK dCTG1_2_3 sequence" <400> 380 gtggccacgc ccgggccacc gatacttccc ttcactcctt cgggactgtt ggggaggaac 60 acaacagggc tcccctgttt tcccattcct tccccctttt cccaacccca accgccgtat 120 ctggtggcgg caagacacac gggtctttcc ctctaaagca caattgtgtg tgtgtcccag 180 gtcctcctgc gtacggtgcg ggagtgctcc cacccaactg ttgtaagcct gtccaacgcg 240 tcgtcctggc aagactatga cgtcgcatgt tccgctgcgg atgccgaccg ggtaaccggt 300 tccccagtgt gtgtagtgcg atcttccagg tcctcctggt tggcgttgtc cagaaactgc 360 ttcaggtaag tggggtgtgc ccaatcccta caaaggttga ttctttcacc accttaggaa 420 tgctccggag gtaccccagc aacagctggg atctgaccgg 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sequence" <400> 382 gggggtgggg ggggcctcgg ccccctcacc ctcttttccg gtggccacgc ccgggccacc 60 gatacttccc ttcactcctt cgggactgtt ggggaggaac acaacagggc tcccctgttt 120 tcccattcct tccccctttt cccaacccca accgccgtat ctggtggcgg caagacacac 180 gggtctttcc ctctaaagca caattgtgtg tgtgtcccag gtcctcctgc gtacggtgcg 240 ggagtgctcc cacccaactg ttgtaagcct gtccaacgcg tcgtcctggc aagactatga 300 cgtcgcatgt tccgctgcgg atgccgaccg ggtaaccggt tccccagtgt gtgtagtgcg 360 atcttccagg tcctcctggt tggcgttgtc cagaaactgc ttcaggtaag tggggtgtgc 420 ccaatcccta caaaggttga accacccagg aatgccaggg aggtaccccg cttcacagcg 480 ggatctgacc ctgggctaat tgtctacggt ggttcttctt gcttccactt ctttctactg 540 ttcgccacc 549 <210> 383 <211> 553 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: CK Aichi Scan (AV-S) sequence" <400> 383 gggggtgggg ggggcctcgg ccccctcacc ctcttttccg gtggccacgc ccgggccacc 60 gatacttccc ttcactcctt cgggactgtt ggggaggaac acaacagggc tcccctgttt 120 tcccattcct tccccctttt cccaacccca accgccgtat ctggtggcgg 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aggctaattg tctacgggtg gtg 523 <210> 388 <211> 592 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 388 gggggtgggg ggggcctcgg ccccctcacc ctcttttccg gtggccacgc ccgggccacc 60 gatacttccc ttcactcctt cgggactgtt ggggaggaac acaacagggc tcccctgttt 120 tcccattcct tccccctttt cccaacccca accgccgtat ctggtggcgg caagacacac 180 gggtctttcc ctctaaagca caattgtgtg tgtgtcccag gtcctcctgc gtacggtgcg 240 ggagtgctcc cacccaactg ttgtaagcct gtccaacgcg tcgtcctggc aagactatga 300 cgtcgcatgt tccgctgcgg atgccgaccg ggtaaccggt tccccagtgt gtgtagtgcg 360 atcttccagg tcctcctggt tggcgttgtc cagaaactgc ttcaggtaag tggggtgtgc 420 ccaatcccta caaaggttga tttccttttt cttttcacac aactctactg ctgacaactc 480 actgactatc cacttgctct cttgtgcctt tctgctctgg ttcaagttcc ttgattgttt 540 ttgactgctt ttcactgctt ttcttctcac aatccttgct cagttcaaag tc 592 <210> 389 <211> 572 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 389 gggggtgggg ggggcctcgg ccccctcacc ctcttttccg gtggccacgc ccgggccacc 60 gatacttccc ttcactcctt cgggactgtt ggggaggaac acaacagggc tcccctgttt 120 tcccattcct tccccctttt cccaacccca accgccgtat ctggtggcgg caagacacac 180 gggtctttcc ctctaaagca caattgtgtg tgtgtcccag gtcctcctgc gtacggtgcg 240 ggagtgctcc cacccaactg ttgtaagcct gtccaacgcg cgttgtccag aaactgcttc 300 aggtaagtgg ggtgtgccca atccctacaa aggttgattc tttcaccacc ttaggaatgc 360 tccggaggta ccccagcaac agctgggatc tgaccggagg ctaattgtct acgggtggtg 420 tttccttttt cttttcacac aactctactg ctgacaactc actgactatc cacttgctct 480 cttgtgcctt tctgctctgg ttcaagttcc ttgattgttt ttgactgctt ttcactgctt 540 ttcttctcac aatccttgct cagttcaaag tc 572 <210> 390 <211> 167 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 390 ccctgcagcc gtcaccgtaa gtttgaagtt accgcatatc agcctctgct tcccagcgcg 60 tccaattcct gttcttattg tttcccctcc aggcgttacg cgtgacgacg 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cccccccaac ccgtcacg 18 <210> 395 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 395 gtcacg 6 <210> 396 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 396 tctgcgcact cgtaatcagt actaaccccc ctttgtcgga cactatgcga taatcgatcc 60 gcctttttca ccgccttcgg aattttattt acctcaactg atcctggagt ctctcttggt 120 tttcacggag gcctccgccc a 141 <210> 397 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 397 ggagaccgcg gccacgccga gtaggatcga gggtacagtc tcc 43 <210> 398 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 398 ccccttgaaa cccccgcccc aggttcagtc tctcttcatc cctctgtcct gcatggtgat 60 acaaagaccc tttgtggacc ctaagccatg 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 409 tagtagctag gtag 14 <210> 410 <211> 3 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 410 taa 3 <210> 411 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 411 taatagctaa ctag 14 <210> 412 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 412 taactagcta actag 15 <210> 413 <211> 579 <212> DNA <213> Rhopalosiphum padi virus <400> 413 gataaaagaa cctataatcc cttcgcacac cgcgtcacac cgcgctatat gctgctcatt 60 aggaattacg gctccttttt tgtggataca atctcttgta tacgatatac ttattgttaa 120 tttcattgac ctttacgcaa tcctgcgtaa atgctggtat agggtgtact tcggatttcc 180 gagcctatat tggttttgaa aggaccttta agtccctact atactacatt gtactagcgt 240 aggccacgta ggcccgtaag 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taataagaga caaagtacaa 420 tcaagctaag ttctcttgga gttcctgtag gaacttagcc attgtgatag agtcataagt 480 ctatgtgcat agacagctct agctcaccat ttccttccca acccatcttt tcatcagctt 540 aactctatga atccgatgca aaaaccattc taacatctta tggtgctttc caagccaaat 600 gagagctcac tcttttgagc cgctatttaa tggacaataa acgttttata gtgtacatca 660 tattgtaaaa acaaa 675 <210> 415 <211> 636 <212> DNA <213> Oscivirus sp. <400> 415 cctcggtccc tctttccgtc gccgcccacg acgttaaatg cggtgttgtg gtgcttaggt 60 gccacaccac tgctatttgg gtcccccttt cccctatata tgtttgtttg tttatttcaa 120 tttcttgagg attggcacct ccttatgcca aatctaaatc gtggaggatc ccaggctttc 180 tggtctttaa cagaactcca cgtccaggtc atagaaactg gttggtaggc tgcctgagta 240 gtccatttgc tagtagtccc ttgtgaacag ggtggctccc gtttactgct ggtattcccg 300 gtgtaggtcg ccatggtggt aacaccatcc tgcattgtgt gtgaaccagt accgcaagga 360 tagcaaggta tgaacacttg tggacgaaat ggtaagtgat caattcactt tcatggccgg 420 aaggtcacgt ggcaatcatg ccacccaggt accctcctct gggaggatct gagggtgggc 480 taagcagacc ctgccatgtg gctgaacttt tcccttattg ttttactttg taacatttat 540 agttgtgtta gtgatttgtg tgttgtgccc ttgtgagcta tatccagtat aagttcgcag 600 ctagaagtta atccttcgac atcggctgta ttggaa 636 <210> 416 <211> 675 <212> DNA <213> Cadicivirus B <400> 416 caccaaccct tgacctgtaa tgtcagtgga cagagtgctc ctctgttccc ggttaccgtg 60 ttccaggaca cgattgtaat cctgcgcctc accagcgctg cgtgcacgtc tgcataagga 120 aacgtgcctt ccccatgtct ctatcaattc tttggtgagt gaccgcccta gttgctcatc 180 ctatgggatt cttctctcat gggttctttg tggcatgcga atgtcacctt aattggaggt 240 ctttaattag atatcctttc ttcatctttg atatgagtgt cggaatttga ttcctagtct 300 ctgcaaaaca accccacttg atgaattcaa cttttcaacc gcacaaacat aatcaggttt 360 ttaaattgaa tgtttctaaa ttctaaattt agtttattta agtagtttgc catcttgact 420 cgatgtaaaa ttgtcataca agtcttcttt tcttttcttt acactttgaa gtttgcactt 480 agcagtcgtt ctgcacagct ttcgagtttt gtttgatcga catcgcaact tccacccacc 540 tctctttttc tagtgttgaa tgcggctaat cctaacccga gagcaataaa cccaggttta 600 ttgtcgtaac gcgcaagtct tggacggaac cgactataca cacacctctt taccctttag 660 tacacccttg gtacg 675 <210> 417 <211> 570 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 417 gcaaaatggg tacgtagtta accactgcgt atcaggattg caggccacga agggtatttg 60 catatctttc tatgcggtat tacggcttaa aacccgttgt atcttgttgt ttgactgcct 120 gtatcactag tggccatttt atttaggtta gagacccctg atagtaggag agttacaaac 180 tctttaaaaa ttgttgaccc cggaaaagat ggtgacccct gtaagtagtt gatcaagaag 240 atctatgcgc tggcatagta atccagtgtt tcctgtttta ggatgacctc tgaaagtaga 300 tgaccgtgga aagtcacgta gtgccccaat aagcacgttt gggcagcgtg cgctatcaca 360 aggcttgatc tccgaggagc cccttgtttt agctggctgg aagccaatga tcttaagtag 420 ataagtgctg ttgcttgtag ttcaacagaa agctttgagt acgtctttct tgcgagaaag 480 aacacatgca ttcttatgct ctcaattcta ttatttttat tttgggcgaa aggaaagctc 540 tcacgcgagt acgaatagcc aaccctttat 570 <210> 418 <211> 145 <212> DNA <213> Plautia stali intestine virus <400> 418 gctgactatg tgatcttatt aaaattaggt taaatttcga ggttaaaaat agttttaata 60 ttgctatagt cttagaggtc ttgtatattt atacttacca cacaagatgg accggagcag 120 ccctccaata tctagtgtac cctcg 145 <210> 419 <211> 312 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: PV Mahoney sequence" <400> 419 atgagtctgg acatccctca ccggtgacgg tggtccaggc tgcgttggcg gcctacctat 60 ggctaacgcc atgggacgct agttgtgaac aaggtgtgaa gagcctattg agctacataa 120 gaatcctccg gcccctgaat gcggctaatc ccaacctcgg agcaggtggt cacaaaccag 180 tgattggcct gtcgtaacgc gcaagtccgt ggcggaaccg actactttgg gtgtccgtgt 240 ttccttttat tttattgtgg ctgcttatgg tgacaatcac agattgttat cataaagcga 300 attggattgg cc 312 <210> 420 <211> 577 <212> DNA <213> Reticuloendotheliosis virus <400> 420 ggggtcgccg tcctacacat tgttgtgacg tgcggcccag attcgaatct gtaataaaag 60 ctttttcttc tatatcctca gattggcagt gagaggagat tttgttcgtg gtgttggctg 120 gcctactggg tggggtaggg atccggactg aatccgtagt atttcggtac aacatttggg 180 ggctcgtccg ggattcctcc ccatcggcag aggtgcctac tgtttcttcg aactccggcg 240 ccggtaagta agtacttgat tttggtacct cgcgagggtt tgggaggatc ggagtggcgg 300 gacgctgccg ggaagctcca cctccgctca gcaggggacg ccctggtctg agctctgtgg 360 tatctgattg ttgttgaacc gtctctaaga cggtgatact ataagtcgtg gtttgtgtgt 420 ttgtttgtta ccttgtgttt gttcgtcact tgtcgacagc gccctgcgaa ttggtgtacc 480 cacaccgcgc ggcttgcgaa taatactttg gagagtcttt tgcctccagt gtcttccgtt 540 tgtactcgtc ctcctctccc tctccggccg ggatggg 577 <210> 421 <211> 675 <212> DNA <213> Tropivirus A <400> 421 tgtcgcatgt tgccaacatc aaaattctgg gagagtcgcg aactccttaa cactgccttg 60 cctcgacgga gccgttgtta tagtgtcgac gggatacaaa cattaaacta aacccacttg 120 cctcgacgga accccttacc ttttatttta ttttatagta tgaaagtgaa tcttgtatga 180 atgttcatag aaaactgcaa atgagtacca cgtctaacat gagagaatga tactggagaa 240 atccaagttt agaagtcact acgaatccca gcggaaacaa gggaattctg agcttctaat 300 aggcgtttaa gactatttgc aaaattctgg tgcgtaagtg atattttcat tgcgtagaac 360 gctggtaacc actccggcta gtataagcat tgttagtcac ttattatgaa actccacact 420 atcctttctg gagaagcaca caaacttaca tggtaaagct agaccattat cttaagcggt 480 gagtacactg caaccttgta acaatgcttg tatgactact ttttgtatat cttgagcaat 540 attgttgagg tggacatgtc caaaggtaat gttgttggga atggaggggt ccattttccc 600 gtgcacgtag tgtactagta ttgggtgata gccttgcggc ggatcaacca tgtattttaa 660 tccgttgact ttcac 675 <210> 422 <211> 592 <212> DNA <213> Symapivirus A <400> 422 ttgggaaatc cccaatgctt ctttcaacac cgcctgacta tgcggtggcg cttcggctca 60 aacaactagt cacttccccc tcttaactac tacccaagac ttctaactac ccttacctac 120 ttatttgtct aaatttcaaa cttttattct cacgcgtctt ataaacatct tttctatttg 180 ttatggtatg ttttgtgatt tgtgtggtgt atttcattta atgggatcta gtggaccgtg 240 ccccggttgg gtatccgctc cctttaaatg tttgcaagca ctcttgacat tataacctat 300 catttagttt acttgtttgt atgatcgtat ttctgaatcg taacatttat gcaattcttt 360 ctcgccgaga cttgtctagg agataaagtt cctgcatatt tagtgttacg gttgtataat 420 ggagacttag atagcttcac actgaggacg ctttttcgct atccttttga cctgattcag 480 gccagtgtgg agttaatgat tgtatggatg ggccctacaa tttgtctaag acttggtgat 540 agcctcgcgg ccgctcgcca tttatacaac tgaatagcgg ttgaaactct ct 592 <210> 423 <211> 591 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 423 tcacgcgctt ttccggtggt cacccaccgt tagggagcgc cagcgttcgc gcttccgcta 60 ccaggtgaca cactcctttc ccctccccca ttcccgttcc catcctctgg actggtttct 120 cctcacgatt gaccagcagc tgggagctgt taccagacgt tggacagtaa gtcccggatg 180 cactataggg ctggtggcta gtgcttggta agcactcaac gccataccta atgtgtacct 240 cggcttgccc tcctggtcgt ggtgaccggc tgtttctctt cccttggctc cagacgggct 300 ggtgtcctac caccaccgtt gcatgcagac ctccccctgc gcactcgaac gccctgtccc 360 agcagggtta gtatgtgctg tgcagatctg catgtgacac cccatccact ggtagagcag 420 gaagttgccc tagctaacgc ggcaagtatt actttccgct acacgtcctt gagattcctc 480 ggacctctgg aactagggtg actgtgggct tgggaaaacc caccttggtc ctgtactgcc 540 tgatagggtc gcggctggcc gaccagtgga tgtagccagt tgttttggga t 591 <210> 424 <211> 538 <212> DNA <213> Rosavirus C <400> 424 cagggagatc tccatgaata atcttttcca ccctctttag cgtctatgct attgaggacg 60 ggttggagcc ccgttgaccc agcgtcagag tgtgtcggta gcaggctttc tgctctcgcc 120 ccatgccggc cacacctccc attagtgatg 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420 cctccgcact taaagtagaa aaacagctta gtagtcaaat aacatggctt tcctcaagca 480 ttcagtgcta catgggactg aaggatgccc agaaggtacc cgcaggcaac gataagctca 540 ctgtggatct gatctggggc cctgggccag gtgctataca cctggttaaa accaaatctg 600 gtagtcaggg ttaaaaaacg tctaagtccc acccccccgg ggacgggggg ttcccttaaa 660 ccctcaactg acacc 675 <210> 426 <211> 656 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Rhimavirus A sequence" <400> 426 cgaattccgg acatctcctt tcgggggcga gcgtcaccgt gcccctcatg gaggcaactg 60 tgcctctaat cggtgaccca ctgagaaaat tttctttcta cgtggctaaa caatgcaact 120 ttataataac acaaatttaa tgcttaatct taacaccaaa gatttgaaca tatgtttgga 180 aagtggcaca cttcaaacat tgcatagttg ctaggggtga agtcccttta aggggttgca 240 gaggatcttt cctctttatg agcggctagg agtatcttct tgatattatg tggtcgtgca 300 actcacttcc cagatgtatg acggtgtact aagcgattgg aactagtcat aacctctttg 360 aattttggta ttgcgagtct agcaggggga tatttaccgc taaagggtga cacactcgtg 420 agggtggcct ttggtgtgtg tatatttatt ccgcccatct tgcatggggt gctaaaattc 480 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tcactctttt ctatctactt tatatcatgt 120 aataataagt agggaacata ttcaattcat attgttcatc tcactgaacc cgcatgaagg 180 actgcattgc atatcctgga cgaagtgacg tggaatattt ggacatttat ggattggaca 240 ccattacgct ttgtgcctct acggagatgt aaccataatc ttaagtagta gtaccccagc 300 acaagaggat aaagtggcat acacgacaac gggtgttgct cgcaccttag taatgtggat 360 gttcaccctt ggagcgtgct gaaactctgt gggtaaagac acacattagt acaaatgtgg 420 gggaactcac tgaaagggca tgtcccgtgt actggtgtgc cggaaagtgg gggtcgcttt 480 ctggagaact tagtagttct tgttattggg tgatagcctt gcggcggatc aactcacagt 540 tttaatccgt tgttttgcat 560 <210> 429 <211> 675 <212> DNA <213> Poecivirus sp. <400> 429 actacacaat cgcaacacgc gcaagtttgt agtttgattg gcgtgcaaat gtcaaatcaa 60 gcatataaca caatttggtg gctgttggtg tttgttatag gaattttggt tgtgttgaaa 120 ttgtggatgt gtaggaaata tgcacaatta cgtcagcgtc aggagtttta taacctggcg 180 caacaccaaa atggtcttcg cgctttaaca tcaccagcga ggtgtaaaca aattgaagtt 240 gaattagatc gtgtataggc cagggaacca tccctcccaa cgccacatct tgtggggaag 300 ttgggataat ggtgggtcta tatgaattgg tctgtagacc cacagtgaag agtgaatagt 360 atgcttgcgg ttccatttgt taatggtcta gcatgggtgg gggcggcaac cccgtgaggg 420 gttccccact ggccaaaagc ccaggggtta gtcatttcaa ccaaggaagc tggtaacctg 480 gtgacctgaa cttgagtggt gagaccccct tgctagagtg tgtaaaccga ttgtaagcat 540 tttgtttgct tagtatctgt ggtataagca gtcaattttg tataggctca aggctgtggt 600 agttagtaga tgcccggaag gttattactg atccggggac cgtgactata cattaggtaa 660 accggtttaa aaacc 675 <210> 430 <211> 519 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Megirivirus A LY sequence" <400> 430 ttcgggacac tggatgggcg acttggtggg gctgccactc tatcttgacc tttcgttact 60 gactttcgga tctctgactc ctccttgtct cttgcgtttg gtccacggac ggactaattg 120 gaatgtttac tggctaagcc tcgttctgaa ataccctagc caatgggttg tagtaggatc 180 ctggtgtttc cattaaacct cttccgacca tagtagctag agttatggct gtgtaggatg 240 tgggtaagac cgctttttgc gtatctccca caagacaccg gattatggat gtgtccgctg 300 gataaggctc gaaacctccc aactgaaggt ggtgctgaaa tattgcaagc ctaggttgtg 360 tagaggcaag tagatgcctg ccgcgacatt 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Ludopivirus sp. <400> 433 tagaccccca cctagccctt ttccccgtca gtggggggct tactcactgg gcatctgtta 60 atctggccta actagattga caccactccc ttggaacgta actccacgct aactcactgg 120 ctctacgcac agacacacgg tctttctgct atccccgggg aagataccag atggcgaccg 180 gctgtcccag cggcctagta gctactcggg ttgagtaccc accacggttt tgacgcctgc 240 taaaattcaa gagacagagg taggggtgct tagtgtgtgg gggaagttcc cacaagcgag 300 gcaaagcatt gctccctcgc gtcaccgggt gcaaggtaaa ttggctggac ttccgctcta 360 cccttgctac tcgccctctt cggagggttc gaagtgacac taggtatacg catggttggg 420 aaaccatgcc tggcctacta ctgggtgata gcctggcggc gggtccgtct cttggcttat 480 acccgttgat ttgggat 497 <210> 434 <211> 610 <212> DNA <213> Livupivirus sp. <400> 434 tatctacatg gggatccagg ctgtatggaa tgtctgtctt aacaagcact ataccagaaa 60 gatccaccca aagtggtggg actgggactg tgaggtgaga aatcccgaaa ccagccttct 120 caagcgtcgg acgatctttc tgttttagtg aacaccttgc cttttaaatg gatgacaaca 180 ccccttcagc aaatcgcaat ctgaaatccc aaaagactgt ttagccgaac tctggtaatc 240 actccggaga agtaggatac gcagcccctg tggactcttg atttcaggac tcaaggtagc 300 tagagctgga acttcatgga atgacaaagg aatatatgca cattgtgcgc tttcctggcc 360 ttgtagcccg tcgtgaggat atgtcgttgg gaatcgacat cttagtccag tactgcttga 420 tagagtgtcg gctggcacag ttacctgaga ataagtcagt tgtacttaac atgaacaaaa 480 aaaataacta ccacaactac cacaatctac caatacttga attatgctga atctcgtaca 540 gtaaaaacgt tccgtggaag gacaagtatt gaagtgcggt tacatcatcc gatacgcgct 600 ggatccctca 610 <210> 435 <211> 629 <212> DNA <213> Aichivirus A <400> 435 cacccataca cccccacccc cttttctgta actcaagtat gtgtgctcgt aatcttgact 60 cccacggaat ggatcgatcc gctggagaac aaactgctag atccacatcc tccctcccct 120 tgggaggacc tcggtcctcc cacatcctcc ctccagcctg acgtatcaca ggctgtgtga 180 agcccccgcg aaagctgctc acgtggcaat tgtgggtccc cccttcatca agacaccagg 240 tctttcctcc ttaaggctag ccccgatgtg tgaattcaca ttgggcaact agtggtgtca 300 ctgtgcgctc ccaatctcgg ccgcggagtg ctgttcccca agccaaaccc ctggcccttc 360 actatgtgcc tggcaagcat atctgagaag gtgttccgct gtggctgcca gcctggtaac 420 aggtgcccca gtgtgcgtaa ccttcttccg tctccggacg gtagtgattg 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Enterovirus I <400> 500 ttagtacttt ctcacgggga tagtggtatc cctccctagt aatttagaag acttgaaaaa 60 ccgaccaata ggcacctcgc atccagcggg gtaaaggtca agcacttctg tttccccggg 120 tcgagtagcg atagactgtg cccacggtcg aaggtgaaac aacccgttat ccgactttgt 180 acttcgggaa gcctagtacc accaaagatt atgcttgggg tttcgctcag cacgaccctg 240 gtgtagatca ggccgatgga tcaccgcatt cctcacaggc gactgtggcg gtggtcgcgt 300 ggcagcctgc cgatggggca acccatcgga cgccaagcat atgacagggt gtgaagagcc 360 tactgagcta caaagtattc ctccggcccc tgaatgcggc taatcccaac cacggagcat 420 ttgctaccaa accaggtagt ggaatgtcgt aacgggtaac tctgtggcgg aaccgactac 480 tttgggtgtc cgtgtttcct tttaatttat cattctgtat atggtgacaa ctatagtgct 540 atctcgattt gcattactat tgttgagatt aaaactttat tacattgttg cattttaccc 600 tttgagtgag ttttcacctg aacagattaa tttactcatc ctgtttatat attacaagca 660 gaaatacttg caaag 675 <210> 501 <211> 675 <212> DNA <213> Enterovirus sp. <400> 501 gcaatgctgc accagtgcac tggtacgcta gtaccttttc acggagtaga tggtatccct 60 taccccggaa cctagaagat tgcacacaaa ccgaccaata ggcgcaccgc 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of Unknown: SAFV V13C sequence" <400> 519 ttttcgacgt ggttggaatt gccatcattt ccgacgaaag tgctatcatg cctccccgat 60 tatgtgatgt tttctgccct gctgggcgga gcattctcgg gttgagaaac cttgaatctt 120 tttctttgga accttggttc ccccggtcta agccgcttgg aatatgacag ggttattttc 180 ttgatcttat ttctactttt gcgggttcta tccgtaaaaa gggtacgtgc tgccccttcc 240 ttctctggag aattcacacg gcggtctttc cgtctctcaa caagtgtgaa tgcagcatgc 300 cggaaacggt gaagaaaaca gttttctgtg gaaatttaga gtgcacatcg aaacagctgt 360 agcgacctca cagtagcagc ggactcccct cttggcgaca agagcctctg cggccaaaag 420 ccccgtggat aagatccact gctgtgagcg gtgcaacccc agcaccctgg ttcgatgatc 480 attctctatg gaaccagaaa atggttttct caagccctcc ggtagagaag ccaagaatgt 540 cctgaaggta ccccgcgtgc gggatctgat caggagacca attggcggtg ctttacactg 600 tcactttggt ttaaaaattg tcacagcttc tccaaaccaa gtggtcttgg ttttccaatt 660 ttgttgaatg gcaat 675 <210> 520 <211> 675 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: SAV P-113 sequence" <400> 520 ggagatctaa gtcaaccgac tccgacgaaa 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Kobuvirus sp. <400> 550 tttgaaaagg gggtgggggg gcctcggccc cctcaccctc ttttccggtg gccattcgcc 60 cgggccaccg ttactccact ccactccttc gggactggtt tggaggaaca caacagggct 120 tcccatccct gtttaccctt tattccatca tcctttcccc aagtttaccc tatccacacc 180 ccactgactg actcctttgg attttgacct cagaatgcct atttgacctc ccactcgcct 240 ctcccttttc ggattgccgg tggtgcctgg cggaaaaagc acaagtgtgt tgcaggctac 300 caaactccta cccgacaaag gtgcgtgtcc gcgtgctgag taatgggata ggagatgcct 360 acaacaggct cgcccatgag tagagcatgg actgcggtgc atgtgacttc ggtcaccacg 420 ggcatagcat tgctcacccg tgaatcaagt catcgagatt tctctgacct ctgaagtgca 480 ctgtggttgc gtggctggga atccacgctt gaccatgtac tgcttgatag agtcgcggct 540 ggccgactca tgggttaaag tcagttgaca agacac 576 <210> 551 <211> 675 <212> DNA <213> Kobuvirus sp. <400> 551 cctacccaag ggttacatgg gaccatattc ctcctcccct gtaactttaa gttttgtgcc 60 cgtattcttg actccaggcg gatgttgtgt cgcccgtcct gtgaacaaac agctagacac 120 tttcctcccc tccctctggg ctgctccggc agtccactcc ctccccccag cgtaacatgc 180 cccgctggag tgatgcacct ggaagtcgtg gacgtgggtt agtaacttcg gtgaaaaccc 240 actataatga caactggttg acccccacac tcaaaggact cgagtctttc tcccttaagg 300 ctagcccggc cacatgaatt tgcagctggc aactagtgag tccaccatgt cccgcaacct 360 cggctgcgga gtgctgttcc ccaagcgtat gccttccttc tgtaagagtg cgcctggcaa 420 gcacatctga gaagtcgttc cgctgcgtcg tgccaacctg gcgacaggtg acccagtgtg 480 cgtagacttc ttccggattc gtccggctct tctctaggaa acatgcgtgt aaggttcatg 540 tgccaaagcc ctgcgcgcgg tgttcttcta ctgccctagg aatgtgccgc aggtacccct 600 acttcggtag ggatctgagc ggtagctaat tgtctacggg tagtttcatt tccatcttct 660 cttcaggtcg acatc 675 <210> 552 <211> 675 <212> DNA <213> Kobuvirus sp. <400> 552 gaccttctgg tacttcttcg cctgggtcac aaaagcgaag aacctgcctc tctaacgcca 60 gacgagcggc attaaacttg aacttctggc actctccact ctcccttttc cctgtccctt 120 tccccactgc gctctcaagg tcgcgcaatc ctgggactag cccagtttta aaagttcctg 180 gcaccctttg cccctctagg cccttaaggt aggaactgac cttgtgctgt gatctcggtg 240 cgggagtgct accacgtagt catcgtaagc ctcgtttctg gttctgccct ggcaaggcta 300 cagagtaccg tgttccgctg tggatgccat ccgggtaacc ggacccccag tgtgtgtagc 360 ggtatgttca cggtccgccg tgttcaccag attcctgacc tggctttgct agaaatggtg 420 tgtgcccaat ccctgtgacc agtatcaatt acatcaccta ggaatgctag gaaggtaccc 480 cagtcctgag ctgggatctg atcctaggct aattgtctac ggtgatgctc cttttatttt 540 cttacaactg ctattgactg tctgattgct gattctgctc ttgtgctctt ctgctctggc 600 tcattctcaa gggttctctt tgtccaagat cctttggttc tctccttgtt ccacttgcca 660 ctgccaacgc ttgtc 675 <210> 553 <211> 369 <212> DNA <213> Pestivirus sp. <400> 553 gtatacgcag ttagttcatc ctgtgtatac agattggaga ctctaaaaac aacgattcgg 60 aataggggcc cgcggcgaag accgaagaca ggctaaccat gccgttagta gggctagcac 120 caaaacgcgg gaactagaca cttaggagag tggtctggct actctaagag gtgagtacac 180 cttaaccgtc aagggttcta ctcctcagtt gaggactaga gatgccctgt ggacgggggc 240 atgcccaaga gttagcttag ccggggcggg ggttgttccg gtgaaagtag caatattgac 300 cacactgcct gatagggcgg agcaggcccc ctaggtagtc tagtataaaa tgtctgctgt 360 acatggcac 369 <210> 554 <211> 399 <212> DNA <213> Pestivirus sp. <400> 554 tacgcggggt ataacgacag tagttcaagt gtcgttatgc atcattggcc ataacaaatt 60 atctaatttg gaatagggac ctgcgacctg tacgaaggcc gagcgtcggt agccattccg 120 actagtagga ctagtacaaa taggtcaact ggttgagcag gtgagtgtgc tgcagcggct 180 aagcggtgag tacaccgtat tcgtcaacag gtgctactgg aaaggatcac ccactagcga 240 tgcctgtgtg gacgaggaca tgtccaagcc aatgttatca gtagcggggg tcgttactga 300 gaaagctgcc cagaatgggt agttgcacat acagtctgat aggatgccgg cggatgccct 360 gtattttgac cagtataaat attatccgtt gtaaagcat 399 <210> 555 <211> 123 <212> DNA <213> Pestivirus sp. <400> 555 gcagatatcg gtggtggacc tgggggttgg gctcaccgtg ccccttcatg gggtagacct 60 cactgcttga tagagtgccg gcggatgcct caggtaagag tataaaatcc gttgttcact 120 aac 123 <210> 556 <211> 382 <212> DNA <213> Pestivirus sp. <400> 556 gtatacgagt ttagctcaat cctcgtatac aatattgggc gtcaccaaat atagatttgg 60 cataggcaac accccgatgc gaaggccgaa aagggctaac catgccctta gtaggactag 120 caaaaaatcg gggactagcc caggtggtga gcttcctgga tgaccgaagc cctgagtaca 180 gggcagtcgt caacagttca acacgcagaa taggtttgcg tcttgatatg ctgtgtggac 240 gagggcatgc ccacggtaca tcttaaccta tccgggggtc ggataggcga aagtccagta 300 ttggactggg agtacagcct gatagggtgt tgcagagacc catctgatag gctagtataa 360 aaaactctgc tgtacatggc ac 382 <210> 557 <211> 373 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Classical swine fever virus sequence" <400> 557 gtatacgagg ttagttcatt ctcgtatgca tgattggaca aattaaaatt tcaatttgga 60 tcagggcctc cctccagcga cggccgaact gggctagcca tgcccacagt aggactagca 120 aacggaggga ctagccgtag tggcgagctc cctgggtggt ctaagtcctg agtacaggac 180 agtcgtcagt agttcgacgt gagcagaagc ccacctcgat atgctatgtg gacgagggca 240 tgcccaagac acaccttaac cctagcgggg gtcgctaggg tgaaatcaca ccacgtgatg 300 ggagtacgac ctgatagggt gctgcagagg cccactatta ggctagtata aaaatctctg 360 ctgtacatgg cac 373 <210> 558 <211> 222 <212> DNA <213> Pegivirus sp. <400> 558 tcagggttgg taggtcgtaa atcccggtca ccttggtagc cactataggt gggtcttaag 60 agaaggttaa gattcctctt gtgcctgcgg cgagaccgcg cacggtccac aggtgttggc 120 cctaccggtg ggaataaggg cccgacgtca ggctcgtcgt taaaccgagc ccgtcaccca 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ggtccacgtc gcccttttaa tgtctctctt gaccaatagg ttcatccggc gagttgacaa 240 ggaccagtgg gggccggggg tcacagggat ggaccctggg ccctgccctt cccggcgggg 300 tggggaaagc atggggccac ccagctccgc ggcggcctgc agccggggta gcccaagaac 360 cttcgggtga gggcgggtgg catttttctt cctataccga tc 402 <210> 561 <211> 531 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Hepatitis GB virus A sequence" <400> 561 gccgggtgga aggcccggaa ccgccccacc acctcaacta ggtggtaagg gtacgtctat 60 cggtccggct ggcccgaaag gcggtggatc ctgtgtgtta gggttcgtag gtggtaaatc 120 ccagcacagg tggtaatcgc tatagggcag gcttatcccg gtgaccgctt ccctggatcc 180 tggagcgggt cgtggcggca cggtccacag gagtggggcc tccggtgtga ataagccctc 240 gtctggagca tcagacgtta aactgagacg tcccgaagag atcggaacga cgccccacgt 300 atggcaacgc cgcttaaaac ccttcgggga cagctatgcg ggttgacaat gccagtgggg 360 ggccgggccc actattgttg tgggctccga gttcctctag ggatggccga aaggcagcca 420 tggggccacc caggcggcgc cgtgctacag gcggcaaggg gaaaaatcct tcgggtgacc 480 ccgggtggca ttccctccct tagcagcatg 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gtgtgaataa gggttggtgg ttgcggtcca 240 ccttaaacgt agtatgcatt gggcttggta aaacaccgct cgtagtacgg aacgccgcct 300 ttaaagacac agtaggcgta gccggcgggt tgacaatcca tacggggggt ggggtgtggt 360 catggatctg tccacaccac cttcatgcgg ccctctaagc aagccatacc ggggggaggc 420 gcgcggcacc gcactgccgg gcaaggggaa gaaccttcgg gtgacccccc cccaaccacc 480 gtccgatcaa tgctaatgtt gcgtttaggc gtgacaccgg caca 524 <210> 564 <211> 537 <212> DNA <213> Pegivirus K <400> 564 agaatggtgt gatccgtcgc cgctccagcg gaaagcgggc gggatctagt ggttagggtt 60 gttcgcgtaa atcccacact agtggtacgc tcgtataacg tgggagcagc cggtggggtc 120 gaccccccac ctggcggctg ctgagcaccg gacgaagcgc ggggggtgaa cgctaacccg 180 cggcccgggc tgccaacgtt aggcacgtct tggctggaag acgttaaaca cagggccccc 240 cctcaaccct gatccgaggc cagagaccaa ggtacgccgc ccttttaaag gcgttactcg 300 tccaatagga tctctccggc gggttgtcaa accttgctgg ccctggtgat ggttacggga 360 gggggtgggg cggggagtag aagccccgcc cggcatgggg gtaccaagct cggcacgccc 420 agcacgcgtg gcgtagggga aaaatccttc gggtgacccc tggtaccata aagtaattaa 480 catgagcatg ccgctagggt gtgctttttc ttccttcctt gggaaggcgg tggcacc 537 <210> 565 <211> 617 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Theiler's disease-associated virus sequence" <400> 565 tgataccgtg tcccggtacg acctcgcgcg tccccaagct cgccctgagg ggggagcgta 60 agggcgcgta gtggggtagc cccccaaacc gagccaccct agtgagtgac tttagaatgg 120 ttagggagac taccgccttc gctgtttggg gacctaatga tccgcgtgcc agggttcttc 180 gggtaaatcc cggcgcggtg ttttgggttc agggcagtag gggcagacgg gccagcagtc 240 gctggttcct ggtaccacca ccctatccgg acgacctccc tcacgaaagg tcgccacggt 300 ctgtggctcg acgacgccta taattcagtc cgaggggcgc agccctcgtt aaacttaggc 360 aaggttcctc gccattgatt tggccagggg tttaagtgaa cgccgccctt ttaatgttta 420 atagggttct ttcccggcgg gttgacaaac acttccctgg gctcttcgtt ggcctcggtt 480 ccttgatgct tcggcaccca tgagcgcaca ggggggggac cctgcgacag tccgccaaga 540 ggaaaatcct tcgggtgacc tcgtgcgcaa cccaatccct tcttcttcca catggcgtgt 600 ctgtggtgca tgctgtg 617 <210> 566 <211> 349 <212> DNA <213> Pegivirus sp. <400> 566 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cctgggagta atcccagggt gcc 393 <210> 570 <211> 343 <212> DNA <213> Flavivirus sp. <400> 570 atataaatcc cagtttggtt aaacctattt caaggcttaa gttgtttatt attttatcgc 60 cgctcgtgac tataaagttg cctagcggag agagataaag aagaaggagt tcaaggctca 120 gggcagggcg caagttccct ggtccctagg ccgctcgcag gaaggaggag tgaagaagaa 180 gaaagagaag gagaggacca ccgccgaaag aaggcaggtg cctcacaaga gggccaacca 240 gcgtgttgga ccagtggcca acgccggacg gcgtggtggc ctgctgggac gcctggggat 300 tggatggagt gccttcctac aggaagacat cgttcaagcc atc 343 <210> 571 <211> 104 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Bussuquara virus sequence" <400> 571 agtatttctt ctgcgtgaga ccattgcgac agttcgtacc ggtgagtttt gacttaacgc 60 agtgagaaaa gttttcgagg aaagacgaga agcgaattct ctga 104 <210> 572 <211> 106 <212> DNA <213> Zika virus <400> 572 agttgttgat ctgtgtgagt cagactgcga cagttcgagt ctgaagcgag agctaacaac 60 agtatcaaca ggtttaattt ggatttggaa acgagagttt ctggtc 106 <210> 573 <211> 150 <212> DNA <213> Yokose virus <400> 573 agtaaatttt gcgtgctagt cgctgagcgt cagaccgcaa agtgagtttt tagtgatcta 60 aagtgaggag ttattcttac tgtcatcaaa cactacaaat aaacacgttg aaattatttc 120 cggaagaaca actgtccgga atcaaagacg 150 <210> 574 <211> 118 <212> DNA <213> Wesselsbron virus <400> 574 agtatattct gcgtgctaat cgttcgacgt tagtccgtgg agtgagcttc tattagagtc 60 gttaacacgt ttgaataatt tctactgaaa ggagtagaag aaaggagatt cattccca 118 <210> 575 <211> 389 <212> DNA <213> Hepacivirus sp. <400> 575 acctccgtgc tatgcacggt gcgttgtcag cgttttgcgc ttgcatgcgc tacacgcgtc 60 gtccaacgcg gagggattct tccacattac catgtgtcac tccccctatg gagggttcca 120 ccccgcccac acggaaatag gttaaccata cctatagtac gggtgagcgg gtcctcctag 180 ggcccccccg gcaggtcgag ggagctgaaa ttcgtgaatc cgtgagtaca cggaaatcgc 240 ggcttgaacg tcatacgtga ccttcggagc cgaaatttgg gcgtgcccca cgaaggaagg 300 cgggggcggt gttgggccgc cgcccccttt atcccacggt ctgataggat gcttgcgagg 360 gcacctgccg gtctcgtaga ccataggac 389 <210> 576 <211> 445 <212> DNA <213> Hepacivirus B <400> 576 accacaaaca ctccagtttg ttacactccg ctaggaatgc tcctggagca ccccccctag 60 cagggcgtgg gggatttccc ctgcccgtct gcagaagggt ggagccaacc accttagtat 120 gtaggcggcg ggactcatga cgctcgcgtg atgacaagcg ccaagcttga cttggatggc 180 cctgatgggc gttcatgggt tcggtggtgg tggcgcttta ggcagcctcc acgcccacca 240 cctcccagat agagcggcgg cactgtaggg aagaccgggg accggtcact accaaggacg 300 cagacctctt tttgagtatc acgcctccgg aagtagttgg gcaagcccac ctatatgtgt 360 tgggatggtt ggggttagcc atccataccg tactgcctga tagggtcctt gcgaggggat 420 ctgggagtct cgtagaccgt agcac 445 <210> 577 <211> 379 <212> DNA <213> Hepacivirus I <400> 577 cagggtttcg accctggccc ggatacctat cgccttacgc cgaaaggtaa cgagtaggag 60 tcgggtcccc aggcccttac cgccaccaag ccaggtgggg aggtatggga gccggggggt 120 gcagctggta gctccatggg ggacgccccg tgagcggatg ctgcatcgat accgggttag 180 ctctctggga gagcggcact tgacaccacg aatccgggaa ccggacaatc gccggcgtgg 240 gacgcgttgc ctccgtggcc gagcaatttg gcatgcccgt ggtgaagagt gatggtgggg 300 gggggccccc cttccagtac cgtactgcct gatagggtct tgcctcaagc ccagagagtc 360 gaggctgaaa accgccatc 379 <210> 578 <211> 557 <212> DNA <213> Hepacivirus J <400> 578 gccgctcccg aaagggagtc cggcgcgtca tcccactccg aggagtgggg tggcgtcccc 60 gtgtgccggg gaaccatgaa gcctaagggc atccacattt tagaatgaac ttgaagcttc 120 gtttcgctgg ccggaaagtc ctgggttccc atggccaggg ttccgcaggt gggtaaatcc 180 cggtggggtt ccatccagga tatacggcag gcgggcgtag tccggcggtt cggacgacgt 240 gtgggtcgcc tacggtggat tgttcacagg atgggcactc cggtgtgaat aggccccgtc 300 agggtgcgct gacgttaaac tcaggccttg cctggtgttc ggggaggatt gcagggccac 360 gccgcctcta agggccgtat ggcacagtac ttcttcgggc gggttgtcaa ggccctccaa 420 cgcgacacca gtgcctcggc aggcatgggg ccacccagct cggcgtcccg cacacagacg 480 gcgtagggga aaatcagcaa tgtgaccccg ggtggcattt tccttctctc tacttccatg 540 catgatcaac cgcaatc 557 <210> 579 <211> 280 <212> DNA <213> Hepacivirus K <400> 579 gggaacaatg gtccgtccgc ggaacgactc tagccatgag tctagtacga gtgcgtgcca 60 cccattagca caaaaaccac tgactgagcc acacccctcc cggaatcctg agtacaggac 120 attcgctcgg acgacgcatg agcctccatg ccgagaaaat tgggtatacc cacgggtaag 180 gggtggccac ccagcgggaa tctgggggct ggtcactgac tatggtacag cctgataggg 240 tgctgccgca gcgtcagtgg tatgcggctg ttcatggaac 280 <210> 580 <211> 675 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Icavirus sequence" <400> 580 cgaagtttaa gctaagcacc ctcgggcgtt cccggattat gtgatcacat caatttgatg 60 gctggtcacc acgcaacgcc tggagagata ctcttacttt tctcttaaga tccccggtca 120 tttgacgctt gtaggatgat agggttattt tccactataa atactttcat actcttggat 180 gttctatatc caagacggga ggacctaccc cgtacccctt agaggtgaga tgccaagaac 240 aggccctttc tgttctctcg acaatggcat cataggcaac aagcatcaca ccaagattgc 300 taagttttgt taagagttct tcaagctata gggtggctgt agcgaccttc tgatgcctgc 360 ggatttcccc acggagcgat ccgtgccaca ggggccaaaa gccacggcta acgcccatca 420 ggagcggcac ttaccccgtg ccccaccctt gaaacttgaa tgttcacact ggcttctctc 480 ggctttctga actgtctgct tgttggggcc ccgaaggatg ccctggaggt accccatttt 540 atgggatctg accaggggac acctcagctc tctaagttgc tggtgtttaa aaaacgtcta 600 agggccccca ccccttaggt ggagggatcc acctttcctt tattttttaa aactctttta 660 tggtcacaat tgttt 675 <210> 581 <211> 113 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Antarctic penguin virus A sequence" <400> 581 ctaggagact acgcagtggg ataagatgac tatgatgtcg tacgggcaga agccagtaca 60 gtcgaagtcg agaccgacgt cgaggatttg actctgcctg acctagtgcc atc 113 <210> 582 <211> 214 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Forest pouched giant rat arterivirus sequence" <400> 582 tattggatcc gcctccgggc aaaggttact ttcttgtacc tcggcttagc cacagggtga 60 ccccttgtac gtaggggccc cgacgtagca ctggtctgac aacaccttct cggcatttca 120 ccttctgccc gctcttccgg gcggtggtgt caagaagcag cagtgctctt ctcttttctt 180 cctgcagttc accgagccct acggggggta ggtg 214 <210> 583 <211> 561 <212> DNA <213> Avisivirus sp. <400> 583 cattcccctt tccccagcca tgggttaaat ggcccctcac caggttcggt gctgtctagg 60 cttccagtaa agaagtcaac cgagcattga acaaaacctc agtgggtatg gtagttaacc 120 ccgtccactg gacaactttg tcctcttaaa agtggatcaa tccaccccaa ctccccccct 180 agccacctga gccatggtgg atagcagtga 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120 t 121 <210> 586 <211> 302 <212> DNA <213> Bat Hp-betacoronavirus <400> 586 ttaagcttcg gcttgttgca taggaccgga aaggtactat ctaccctaac tcttgtagtt 60 agactctcta aacgaacttt aaaactggtt gtgtccttca gtagtctgta tggccattgg 120 aggcacaccg gtaattatca aatactaaga agattcatag tacatccttg tctagctttt 180 ggttggcagt gagcctacgg tttcgtccgt gtcgctcaca attatccaca cagtaggttt 240 cgtccgctgt ggttgagttg ctagtccgtt gctgtttcgt cagccatcta caactcgaca 300 cc 302 <210> 587 <211> 458 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Basella alba endornavirus sequence" <400> 587 ggaatatggc taatcggctt attctaatca aacgcaaaag acttatgaca cagaccggac 60 ctgaacgagg tgataaaaca cctcgttcag gttcaaaacg tagaagattc attcctccga 120 ttagaaatac aactacgtct aagcacgata gagatggtat caagatcggt tttagaccac 180 gagaaaatcg gcaaatgaaa gtacaagttg ggtggtttaa attaccaaga acagtaacat 240 tcaagaacaa cggcaacccg tttgttacct catttcgtaa attgtttaga agtaacaaag 300 ataaattatt taatggtggg aagaacctaa gtacagtacc agccagaagt agtgaaatga 360 cagaaatgtt tatgttcatg tccacgctag agggccaatt gtcaatccaa gatcgagatc 420 caaaaataat caataagtct atatacatga tagaggta 458 <210> 588 <211> 675 <212> DNA <213> Ball python nidovirus <400> 588 ccccttcacc cataggcact aggagaacag gataacccct aacggggcat cctgcctgtg 60 acctttcaga ttcgctagtt agatatcttc acagactctg ctaggcttct gacccagtcc 120 gttcccaaag tccgttaccg cccgagtagc gcttaggcgc gaaagggacg gaagtacctc 180 cagtaagcga aagctgaagt aagggaaata cggcaagact aacttgttag tcttacagtg 240 tggataacct ggtagttatc cccgacaaga gacctgactc gatgtgaaaa catccaacta 300 ggttggcttc aaactagcta caggcaggat atcccccaac ggggcctcca aggaatcgag 360 aaccaaccct cattccacgt ctgtagtaag caaaaacagg ggcgatcttc accgacacct 420 ctcaccacag agcacaccaa cctctgtgaa gccaatttcc tcgtccaagg acaggttatt 480 gagggtcaac tttcttccga ccagaagaag ggatttccta ccaaaagaaa aaccaaatcc 540 accaacacca caaggtaaaa caacaacttg tgaagccaat acttagtcaa agactaacta 600 ttgagggtca actttctctt caatagagaa gggatttcct ggtaaaacaa ataacaacaa 660 ctaacatcag caact 675 <210> 589 <211> 150 <212> DNA <213> Sapelovirus sp. <400> 589 gacaggtgtt ttggagggcg gatgacgata tctggctggc caccagggaa taacggcaaa 60 tgtctgatca tacggttcac aagtctaccg gcgatagtgg ttcaacacca tgtgtagcag 120 ggattcttgc gtatgtgaag gcgacagtgc 150 <210> 590 <211> 496 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Bat Picornavirus 3 sequence" <400> 590 taagcggaaa gcattcttgt cccccggtca gtaacctata ggctgttccc acggctgaaa 60 gggtgaacat ccgttacccg cctcagtact tcgagaaacc tagtacgcct gatgattcca 120 aattggtatg atccggtcaa ccccagacca gaaactgtgg atgggggtca ccattcctag 180 tatggcaaca tacaggtgtc cccgcgtgtg tcacaggccc ttacgggtgc catttcggat 240 gagtctggcc gaagagtcta ttgagctact gttgatacct ccggccccct gaatgcggct 300 aatctcaacc ccggagccac tgggtggtga accaaccact tggtggtcgt aatgagcaat 360 tctgggacgg aaccgactac tttggggtgt ccgtgtttct tttgttcata ttaaactgtt 420 ttatggtcac aacacaactt ggtacgattt gtgattattc actgctcact tgtcacagta 480 aatatacaca atcatc 496 <210> 591 <211> 419 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Bat Picornavirus 2 sequence" <400> 591 gggttttacg aaacccgtat acaccagacc ttttctcccc tccccctcca cctacctttt 60 ccccctcttt ggaccgaaac aaggacacgt aagtggaaac gcgattttat atgtggttgg 120 ccaccacgga ataacggcaa ttgtctacat gtgggaagtg caacctccct agccgataac 180 ccctgaccgg gtgtgtagga taggaaaggt gcccactgtg ggcgacaggt tatggtagag 240 tggataccta gccaggggca atgggactgc tttgcatatc cctaatgaag tattgagatt 300 tctctgctca ttacccggtg atggttgtgt ggggggggcc ccatacacta gatccatact 360 gcctgatagg gtcgcggctg gccgaccata acctgtatag tcagttgaat tcagccaag 419 <210> 592 <211> 410 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Bat Picornavirus 1 sequence" <400> 592 gaaacccgta tacaccggac cttttctccc ctccctctcc acttaccttt ttcccctctt 60 cggcatgaaa caaggattat tcaagtggaa acgcgattta atatgcggct ggccaccgcg 120 gaataacggc aattgtgtat ctgctggaag ccaagcctgc ctagccgata gcccttgacc 180 gggtgtgtag gatagcccag gaaccagcaa tacgcgacag gttatggtag agtagatacc 240 tagccagggg caatgggact 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atataaatga 660 acactagctt ccaag 675 <210> 594 <211> 210 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Bat dicibavirus sequence" <400> 594 gtatagcacc ggaatggtat tttactactc caagtatacg tactaggagt taaaccctgt 60 aatttacagg ggatttagtg acttttatcc gtaaaagtcg attggacgtt aatcggtaac 120 gaggccaagt accgtgaacc aatttaaaaa cgtattttct catgtggtag aaccaacttg 180 gaaatagcat ggcatatagg ttgtttaggg 210 <210> 595 <211> 212 <212> DNA <213> Betacoronavirus sp. <400> 595 gataaagtgt gaatcgcttc cgtagcatcg caccctcgat ctcttgttag atctaatcta 60 atctaaactt tataaaaaca ctaggtccct gctagcctat gcctgagggt ttaggcgttg 120 catactagtg tcttaggaat ttgactgata acacttccct gctaacggcg tgttgcactc 180 tcagtctaag cctcccaccc ataggaggta tc 212 <210> 596 <211> 277 <212> DNA <213> Betacoronavirus sp. <400> 596 atttaagtga atagcttggc tatctcactt cccctcgttc tcttgcagaa ctttgatttt 60 aacgaactta aataaaagcc ctgttgttta gcgtattgtt gcacttgtct ggtgggattg 120 tggcattaat ttgcctgctc atctaggcag tggacatatg ctcaacactg ggtataattc 180 taattgaata ctatttttca gttagagcgt cgtgtctctt gtacgtctcg gtcacaatac 240 acggtttcgt ccggtgcgtg gcaattcggg gcacatc 277 <210> 597 <211> 675 <212> DNA <213> Cardiovirus sp. <400> 597 tacgatcgct gtacattcca ctactgccaa ttagctcccc cttcccgttg ctcccctcta 60 taaggagagc cttctcttgc aaaggtgaag ccttcacccc cggtcgaagc cgcttggaat 120 aagacagggt tattttctcc tctcctcggc gcttgcctct tctaagctga ataggttcta 180 tctattcagg cggatggtct ggtccgttcc ttcttggaca gagtgtgtat ctgggttttc 240 cggatctcga ccacacactc accagagctc aggagtgatt aagtcaaggc ccgatctgcg 300 gcgaaaagga aatgaagtat tttgcagctg tagcgacctc tcaaggccag cggatttccc 360 cacctggtga caggtgcctc tggggccaaa agccacgtgt taatagcacc cttgagagcg 420 gtggtacccc accaccctgc aaattatgga tttgacttag taactaaaag attgacttgg 480 catacctcaa cctgagcggc ggctaaggat gccctgaagg tacccgtgtt gaaatcgctt 540 cggcgaccat ggatctgatc aggggccctg cctggagtgg ttctatccca cacagcgtag 600 ggttaaaaaa cgtctaaccg ccccacaaag accccggcag ggatgccggt ttccttttta 660 ccaattcttg acact 675 <210> 598 <211> 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Unknown: Bovine viral diarrhea virus 3 sequence" <400> 599 gtatacgccc agttagttca ggtggacgtg tacgattggg tatcccaaat taataatttg 60 gtttagggac taaatcccct ggcgaaggcc gaaacaggtt aaccatacct ttagtaggac 120 gagcataatg ggggactagt ggtggcagtg agctccctgg atcaccgaag ccccgagtac 180 ggggtagtcg tcaatggttc gacgcatcaa ggaatgcctc gagatgccat gtggacgagg 240 gcgtgcccac ggtgtatctt aacccaggcg ggggccgctt gggtgaaata gggttgttat 300 acaagccttt gggagtacag cctgataggg tgttgcagag acctgctaca ccactagtat 360 aaaaactctg ctgtacatgg cac 383 <210> 600 <211> 537 <212> DNA <213> Bovine rhinitis A virus <400> 600 ttttgcggct ctgccgccgt tcgggtttta cctgttttca cagagcaaaa caggacctct 60 agtttcgtgc ttaaacgaga tcatgctcga actagaacta taacgctggt cactggaccc 120 gtgccgcgcc ttgcggatct ttgcgggaat ggtggctagt gggctgtgga agtgactcta 180 accacacgcc cctcaagtgt gggaaaacac gaactggtgt agcgacgacg ataggccttg 240 ggacaccctc tccagtgatg gagacccaag gggccaaaag ccacgccttg tgccctgtcg 300 ttcacaaccc cagtgcagtt cgtgccagta cctgcttttg ggaagtgtgc tttggacagc 360 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gtcctggtgc tagggctagt agagacagtg gtaacttgga caagggtcca gggccacttt 300 agggaatacc ctacggaagg ctaggtccgt aaggaagacc cccgcagttg tccgcggttg 360 agcagagctc ctgcgtagac aaaaggcaaa aagtggatta cattcgcctg caggaaaagg 420 caaacgtcgt tggagtcgga gctaaagtac tggacgattg ataccacgcc tgctgcggta 480 gataaa 486 <210> 603 <211> 293 <212> DNA <213> Hepacivirus sp. <400> 603 ccatcgacac tccaggctca cggattaagt taggttccgc cgaagcgggc taaccaggcc 60 cctagtagga ggcgcctatc ccgtgagccc tttccccacg gattgagtgg agctggagct 120 gggaaggacc gagtacggtc caatcgagaa gaaccctgat gaacattcca ggcctcttcg 180 gtagatttgg atatatccac cagtgaaggc ggggtcgtgg gtacaggccc cctagtccac 240 acagcctgat agggtcctgc cgcaggatcc gtgggtgcgg ctgtacatgt acc 293 <210> 604 <211> 472 <212> DNA <213> Mitovirus sp. <400> 604 gccccgccga ccttcctatt tatttctaaa taggaaggtc ccgactagtc ggataattcg 60 gtttaacgaa ttatggttag atctattaaa gttaaaatag attgaatttc tttctcatcc 120 tccttattcc tatactttgg gagtaaatga caaatgtcta tcctcaaacc gaaatggctt 180 aagtgatgaa tttgaaagaa aggtaggttt taagaatata aggcatcaat atattatacc 240 cttgaatgtt aagtgaccac ggcgtgacga ttagggctat cttaggatag acagccatct 300 aacgcgacag cagtggaaat cagcttagca tctcaagatc atgtataata tatacataac 360 cttacaatta taaaaccaaa ccaaaacaca ctataatttt atataaatta tagaagtatc 420 ggacctggac ggtacctact attaactgat agtagccaaa tgcaggaagc tc 472 <210> 605 <211> 315 <212> DNA <213> Mitovirus sp. <400> 605 ggaacttttc agttccagaa gtggctttat taagccttca aagtttacac tttgaacctg 60 cgattaattc cccatagtga ctcttgttac tgtgaattag gaatagttgt agttcaactt 120 ctaatgaggt gaacaatata ataactcatc ttattaaccc tatacgtaga caattgtcca 180 aagagacagt tggaattctg ccaatctgga atgtttggta cgcgtagaag ataataagag 240 accctctatt cccctgcctc atgactaagt catggcccgg ggtgtaatag agatactttt 300 atatattata caatc 315 <210> 606 <211> 675 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Canine picodicistrovirus strain 209 sequence" <400> 606 cgctctttat acaaatctgt caaccctttg tataactcta agccgaacaa ttatagctag 60 gctttttatt atataacatt aattaggcat 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ttattctggt tactggtgtt ccatcctact tcatgatggt 660 cgccatgacc atgac 675 <210> 615 <211> 675 <212> DNA <213> Orivirus sp. <400> 615 aaaccctcac gagtgcttgt ggtaggtccc aggccaatat tcttcgtaag gcttggttcc 60 aattttccac cactcgtgtt tgggttctgg cctatggtac ccagaggggc ggtttggggg 120 aattaactcc ccctcccctg tggtcctata ccaccccaca cctctgtggg ctttctttac 180 tatcttcttg ttttccgact tttaaacact aggcaggcgc gcctagtcat acaccgcccg 240 gctggtcttt ccagctcttg tgggcggtgc gcgctggtcc atcgtgccca gcgacatagc 300 accttgtgga cacctccgaa cgccctcccc tgtatggggt ggtgcccagg ggtttcagtg 360 tggtgacaca ctccctgggg cccgaaaggc tagtgtgcaa caggtgaggt acagccagct 420 gcccccgtgg ctggagggac caagcttgtg aagcacacct caccttcttg ggggtgggct 480 agtaagtggt gaaagcatag tgtccgtgtc gctggccaac actttgggtc aagtccagcc 540 actcagtgag tagatgccca ggaggtaccc ctagtggatc tgacttgggg cctgttactt 600 aatgcaggtt aaaaactatg aaagctgagt agtgtagccc ggctggtggc ttctcttcct 660 tattcattct atttt 675 <210> 616 <211> 651 <212> DNA <213> Gallivirus sp. <400> 616 ggttaacttg tttaaccaag 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<210> 619 <211> 675 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Falcon picornavirus sequence" <400> 619 cgcttggaat aagttgagag gaattatgca tgctagttgt gtttgtttac aactaattgt 60 tctaatccaa gtgaagctct tcgcttgggg cggcacgaca cttgccgtaa ttcttctacc 120 gtccctccac accttgtgga tgaagggccg gatgtgtggc ctctggctaa cccctctctc 180 tggggtgatg ctactggatg ttttactcct agaccaaatc acatgaactc ctcttgatcc 240 acttcggtgg ggctatgagc ctgcggatta atagctggcg acagctaccc caggggccaa 300 aagccacggt gttagcagca ccctcatagt ctgatgccca agggctgatg ttgggagcta 360 gtagtgtgtg tctggcctat gtttaggact tctggccaag cgcagaggag tggggctgaa 420 ggatgcccag aaggtacccg taggtaacct taagagacta tggatctgat ctggggcccc 480 ctcacgtggc tttaccacgt gttgggggtt aaaaaacgtc taggccccac cagcccacgg 540 gagtgggctt tcccttaaaa agcccaacaa tatttatggt gacaattcac tgtttcttct 600 ttgcaatttt tgtattcttg gactccttat tttttgtttg cttgatttta gtggacattc 660 agattcaaat acaaa 675 <210> 620 <211> 675 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Equine rhinitis B virus 1 sequence" <400> 620 cgacaggcac aggtcgctcc gagttctagt agtgtgggaa cttgttacta ctgatgaaac 60 gaggtagtga cactcagtac ctgcgaacga ggtcggggcc ctcccttctt ccttcaccca 120 actttcactt ttcgttccac tttagcaggg gtcttctttc tatccccctg gcggcattgg 180 aactagccgt cgcgtcttaa cgcgcagccc tgaaggcccc acaccttgtg gatcttgccg 240 tgggtatgtt tctggcatgt gtttctcaag cctgcaaccg aagccgaaca gccacatgaa 300 cagtttgagc gtggtagcgc tgtgtgagtt ggcggtggat ccccctcgtg gtaacacgag 360 cccccgtggc caaaagccca gtgtttacag cacctctcac atccaggacg accccatcct 420 ggcgctcact cttagtagta tggcttagta cgcattaggt ggtaagccga gctctccctc 480 ggccttgttc tgaatgcaca catgtctagg ggctaaggat gtcctacagg tacccgcacg 540 taaccttcag agagtgcgga tctgagtagg agaccgtggt gcactgcttt acagatgcag 600 cccggtttaa aaagcgtcta tgcccctaca gggtagcggt gggccgcgcc ctttcctttt 660 aaaactactt gttct 675 <210> 621 <211> 675 <212> DNA <213> Equine rhinitis A virus <400> 621 aagggttact gctcgtaatg agagcacatg acattttgcc aagatttcct 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tctcgttatt gcgagattcg 120 tcgttagata acggcaagtt ccctttctta ctatcctatt ttcatcttgt ggcttgacgg 180 gtcactgcca tcgtcgtcga tctctatcaa ctacccttgc gact 224 <210> 623 <211> 675 <212> DNA <213> Enterovirus sp. <400> 623 actctggtat cacggtacct ttgcacgcct attttatacc ccttccccat cgtaacttag 60 aagcaacaaa caaactgccc aatagcagca caacacccag ttgtgttagg ggcaagcact 120 tctgtttccc cggaagggtc tgacggtatg ctgtacccac ggcagaagta tgacctaccg 180 ttaaccggcc atgtacttcg agaagcctag taccattatg aaggttgatt gatgttacgc 240 tccccagcaa ccccagctgg tagttctggt cgatgagtct cggcattccc cacgggcgac 300 cgtggccgag gctgcgttgg cggccagcct acaccatacg gtgtaggacg tcaagatact 360 gacatggtgt gaagagccta ttgagctacg tggtagtcct ccggcccctg aatgcggcta 420 atcctaactc cggagcatcc gccagtaagc ccactggaag ggtgtcgtaa tgcgaaagtc 480 tggagcggaa ccgactactt tgggtgtccg tgtttcctgt tttacttatt gtttggctgc 540 ttatggtgac aacttatagt tatcatcata agctacttgg tcttgccaac cggagaatta 600 tttggttatt tgttggtttc ataaacctac agtcgtattt tcctgtctta ttaattgttc 660 tcaaaattaa caaca 675 <210> 624 <211> 675 <212> DNA <213> Enterovirus sp. <400> 624 taccgctgca ccagtgagct ggtacgctag taccttcgca cggagtagat ggcatccccc 60 accccgtaac ttagaagcaa agtacacatc tggccaatag tggcgctgca tccagccgcg 120 caacggtcaa gcacttctgt ttccccggtc cgcaagggtc gttatccgcc cagtccacta 180 cggaaagcct actaaccatt gaagctatcg agaggttgcg ctcggccacg accccggtgg 240 tagctctgag tgatggggct cgcaaacacc cccgtggtaa cacggatgct tgcccgcgcg 300 tgcactcggg ttcagcctat tggttgttca cctcaacata gtgtaaatgg ccaagagcct 360 actgtgctgg attggttttc ctccggagcc gtgaatgctg ctaatcccaa cctccgagcg 420 tgtgcgcaca atccagtgtt gctacgtcgt aacgcgtaag ttggaggcgg aacagactac 480 tttcggtact ccgtgtttct tttgttttat tttgaatttt atggtgacaa ttgctgagat 540 ttgcgaatta gcgactctac cgctgaacat tgccctgtac tacctaatcg catttcacaa 600 aacctcagag ataccaagct cttacattga tctgcttgtt ttcctgaatc tcaaatataa 660 attggaacaa gcaaa 675 <210> 625 <211> 107 <212> DNA <213> Morbillivirus sp. <400> 625 accagacaaa gctggctagg ggtagaataa cagataatga taaattatca tacttaggat 60 taatgatcct atcaattggc acaggatttg gataaaggtt cacagtc 107 <210> 626 <211> 348 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Dianke virus sequence" <400> 626 tgttttcaac cataatacta ctactacaag tataaaaccc cgtccgtctg tcggagacgc 60 taaactctga ccaccaatct agccacatca gttgcttaaa gaacctcttg agacactctc 120 ccacttaaca tcttttagga atcttcgatg ctacaacaac ttggctagtg aacaataaat 180 ccgtacaatt cacagttgta agaggccata ggtccagact ttgaaaggtt tgtttctatt 240 gttacaaata cttagattaa cagaggctat ttaatagtgc tcatcacgtt aacagagtaa 300 ccttgtgcaa tagtatgagc ttgttgtaaa acgtcttgat acgacacc 348 <210> 627 <211> 270 <212> DNA <213> Hepacivirus sp. <400> 627 cactcaatac tacactccgc atttggggag aagcgctggc gttcgcggaa ccgcgttaac 60 catacgcgta gtacgagtgc gacagacccc ggtgctactg gtggtagcga gacacgagcc 120 gaagtctgtg gggggaactc cacttagagg gcatgcccgg gcgtaggctt ctgagttggg 180 atgggcccca acttggcccc tgagtggggg ggtgttacga cctgataggg tgcgggctgg 240 cgcctaccac tttccagtcg tacatgagtc 270 <210> 628 <211> 415 <212> DNA <213> Narnavirus sp. <400> 628 gcccgggggg tgcagtcctg tgaaagggtc tgcaccatac tatatatgta tatgattaca 60 tcccaaaagg cgacttcgtt caggttttaa atctgacgta ggtccagtaa ataagcatgt 120 caaaacatgt aagtttatcc tgtaatctac tctcataaga tgagataaga tgatattgca 180 gttcccatgt aaataaatcc attatgaatt cattcatata aggtagaagt ggtaactatg 240 gttgaaacat taatataaaa cggtcatttt gcatgaacgt cattaaggaa ctggcatacc 300 aatgtctatt tagtgactat gatatttaga gtatccctta tattaattaa caattattcc 360 ttttagcata tcatccgaca acaaatttta aaagaagaaa tattactcat taaaa 415 <210> 629 <211> 675 <212> DNA <213> Torovirus sp. <400> 629 gtacttacaa gcgggttaaa ccgccctccg gaacggttac aaccccctcc cgaacgtgcg 60 cttgacgtga ctggttctca gtctggcttt ctgagaaata ctccagggtt gtatcccacc 120 atcttgacct ctggtcattt tggtaacacc ataaccaaac aaactctaca cacctaaccc 180 acctccagct tgctgcaggc cttttggact aaacgggttt aggtgttttg tgaccaactc 240 gtctacccac ctccagtttt actgcaggcc tttttggact aaacggcttt agacttttgt 300 ggttagtttt taactaccca ctgtttagcc gccaacctga ttttcattgt tgtaaaattt 360 tgtgtttata cactattttc atacggttgg cagtttgttt ggttgtttgc acagtttttg 420 ttgataccaa tttttactgt gcttttagtg tattctgcta aggctgtatt ttacatactt 480 agtttggttg aagcaatttt tacaacattt atattgtttt tgatttctaa ggtaaagagt 540 cttaggaaac accatagacg ccattcttgt ggtgtctagt tccaactaat ctggcaaaca 600 agtaccaagt cattgactca ctttggagtg agacttacga gtaccaattt gcctatttcg 660 gacatccata taaag 675 <210> 630 <211> 675 <212> DNA <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 630 acaagcttga caccgcctgt cccggcgtta aagggaagta accacaagct tacaaccgcc 60 taccccggtg ttaatgggat gtaaccacaa gatacacctt cacccggaag taaaacggca 120 aattcacaca gttttgcccg tttttcatga gaaacgggac gtctgcgcac gaaacgcgcc 180 gtcgcttgag gaggacttgt acaaacacga tctaaacagg tttccccaac tgacatacac 240 cgtgcaattt gaaactccgc ctggtctttc caggtctaga ggggtaacac tttgtactgt 300 gcttgactcc acgctcggtc cactggcgag tgttagtaac agcactggtg cttcgtagcg 360 gagcatggtg gccgtgggaa ctcctccttg gtaacaagga cccacggggc cgaaagccac 420 gtcctgacgg acccaccatg tgtgcaaccc cagcacggca acttttctgt gaaactcact 480 ctaaggtgac actgatactg gtattcaagt actggtgaca ggctaaggat gcccttcagg 540 taccccgagg taacacgcga cactcgggat ctgagaaggg gactggggct tctgtaaaag 600 cgcccagttt aaaaagcttc tatgcctgga taggtgaccg gaggccggcg cctttccatt 660 ataactactg acttt 675 <210> 631 <211> 310 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Feline infectious peritonitis virus sequence" <400> 631 acttttaaag taaagtgagt gtagcgtggc tataactctt cttttacttt aactagcctt 60 gtgctagatt tgtcttcgga caccaactcg aactaaacga aatatttgtc tctctatgaa 120 accatagaag acaagcgttg attatttcac cagtttggca atcactccta ggaacggggt 180 tgagagaacg gcgcaccagg gttccgtccc tgtttggtaa gtcgtctagt attagctgcg 240 gcggttccgc ccgtcgtagt tgggtagacc gggttccgtc ctgtgatctc cctcgccggc 300 cgccaggaga 310 <210> 632 <211> 143 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Farmington virus sequence" <400> 632 acgacgcata agcagagaaa cataagagac tatgttcata gtcaccctgt attcattatt 60 gacttttatg acctattatt agacccttca cgggtaaatc cttctccttg cagttctcgc 120 caagtacctc caaagtcaga acg 143 <210> 633 <211> 528 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Avian infectious bronchitis virus sequence" <400> 633 acttaagata gatattaata tatatctatt acactagcct tgcgctagat ttttaactta 60 acaaaacgga cttaaatacc tacagctggt cctcataggt gttccattgc agtgcacttt 120 agtgccctgg atggcacctg gccacctgtc aggtttttgt tattaaaatc ttattgttgc 180 tggtatcact gcttgttttg ccgtgtctca ctttatacat ctgttgcttg ggctacctag 240 tgtccagcgt cctacgggcg tcgtggctgg ttcgagtgcg aggaacctct ggttcatcta 300 gcggtaggcg ggtgtgtgga agtagcactt cagacgtacc ggttctgttg tgtgaaatac 360 ggggtcacct ccccccacat acctctaagg gcttttgagc ctagcgttgg gctacgttct 420 cgcataaggt cggctatacg acgtttgtag ggggtagtgc caaacaaccc ctgaggtgac 480 aggttctggt ggtgtttagt gagcagacat acaatagaca gtgacaac 528 <210> 634 <211> 626 <212> DNA <213> Rhinovirus sp. <400> 634 ttaaaactgg gtgtgggttg ttcccaccca caccacccaa tgggtgttgt actctgttat 60 tccggtaact ttgtacgcca gtttttccct cccctcccca tccttttacg taacttagaa 120 gttttaaata caagaccaat agtaggcaac tctccaggtt gtctaaggtc aagcacttct 180 gtttccccgg ttgatgttga tatgctccaa cagggcaaaa acaacagata ccgttatccg 240 caaagtgcct acacagagct tagtaggatt ctgaaagatc tttggttggt cgttcagctg 300 catacccagc agtagacctt gcagatgagg ctggacattc cccactggta acagtggtcc 360 agcctgcgtg gctgcctgcg cacctctcat gaggtgtgaa gccaaagatc ggacagggtg 420 tgaagagccg cgtgtgctca ctttgagtcc tccggcccct gaatgcggct aaccttaaac 480 ctgcagccat ggctcataag ccaatgagtt tatggtcgta acgagtaatt gcgggatggg 540 accgactact ttgggtgtcc gtgtttcact ttttccttta ttaattgctt atggtgacaa 600 tatatatatt gatatatatt ggcatc 626 <210> 635 <211> 675 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: EV22 sequence" <400> 635 ccttataacc cgacttgctg agcttctata ggaaaaaacc ctttcccagc cttggggtgg 60 ctggtcaata aaaaccccca tagtaaccaa cacctaagac aatttgatca accctatgcc 120 tggtccccac tattcgaagg caacttgcaa taagaagagt ggaacaagga tgcttaaagc 180 atagtgtaaa tgatcttttc taacctgtat tatgtacagg gtggcagatg gcgtgccata 240 aatctattag tgggatacca cgcttgtgga ccttatgccc acacagccat cctctagtaa 300 gtttgtaaaa tgtctggtga gatgtgggaa cttattggaa acaacaattt gcttaatagc 360 atcctagtgc cagcggaaca acatctggta acagatgcct ctggggccaa aagccaaggt 420 ttgacagacc cattaggatt ggtttcaaaa cctgaattgt tgtggaagat attcagtacc 480 tatcaatctg gtagtggtgc aaacactagt tgtaaggccc acgaaggatg cccagaaggt 540 acccgcaggt aacaagagac actgtggatc tgatctgggg ccaactacct ctatcaggtg 600 agttagttaa aaaacgtcta gtgggccaaa cccagggggg atccctggtt tccttttatt 660 gttaatattg acatt 675 <210> 636 <211> 675 <212> DNA <213> Cardiovirus sp. <400> 636 tccgacgtgg ttggaattaa catcttttcc gacgaaagtg ctattatgcc tccccgattg 60 tgtgatgctt tctgccctgc tgggcggagc gtcctcgggt tgagaaacct tgaatctttt 120 cctttggagc cttggctccc ccggtctaag ccgcttggaa tatgacaggg ttattttcca 180 aactctttat ttctactttc atgggttcta tccatgaaaa gggtatgtgt tgccccttcc 240 ttctttggag aatctgcgcg gcggtctttc cgtctctcaa caggcgtgga tgcaacatgc 300 cggaaacggt gaagaaaaca gttttctgtg gaaatttaga gtggacatcg aaacagctgt 360 agcgacctca cagtagcagc ggattcccct cttggcgaca agagcctctg cggccaaaag 420 ccccgtggat aagatccact gctgtgagcg gtgcaacccc agcaccctgg ttcgatggcc 480 attctctatg gaaccagaaa atggttttct caagccctcc ggtagagaag ccaagaatgt 540 cctgaaggta ccccgcgcgc gggatctgat caggagacca attggcagtg ctttacgctg 600 ccactttggt ttaaaaactg tcacagcttc tccaaaccaa gtggtcttgg ttttccaatt 660 ttgttgactg acaat 675 <210> 637 <211> 292 <212> DNA <213> Human coronavirus 229E <400> 637 acttaagtac cttatctatc tacagataga aaagttgctt tttagacttt gtgtctactt 60 ttctcaacta aacgaaattt ttgctatggc cggcatcttt gatgctggag tcgtagtgta 120 attgaaattt catttgggtt gcaacagttt ggaagcaagt gctgtgtgtc ctagtctaag 180 ggtttcgtgt tccgtcacga gattccattc tacaaacgcc ttactcgagg ttccgtctcg 240 tgtttgtgtg gaagcaaagt tctgtctttg tggaaaccag taactgttcc ta 292 <210> 638 <211> 282 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Hubei zhaovirus-like virus 1 sequence" <400> 638 gtgcaggatg gcctttccca tcttaagtgg tttgtaggat ttcgtgggtc catacccccc 60 gatttcttgg tacgtattcc atgcacggag aatacgacca aaactcttat ttcaaaaaat 120 attatttttt actcttgtgg gctgagtgcg acccaccagt tccagcttag caacctggaa 180 gttgttggag atttatggaa ccaaattaca catgcgtgga gtgccgccac tccgtatctg 240 ttcactcatt acgcgattaa gttctgcgac gagacgagcg aa 282 <210> 639 <211> 600 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Hubei tombus-like virus 9 sequence" <400> 639 ggaccatcca ggcaggtgta ggctagtacc ctcacctgac ctgtcgcgat gtttggcttt 60 gtgaggcttg tgggaggatc ccttggccca tgcattgctg ctgtcatcgt gaaaaatgtt 120 gtatgctcgc acctggcgtg gaggaaacgg catttgacgg atgctaagga ggatttgaag 180 gtcctcaact cccatgcctt attacaagtc ccctttcctt caagcttcga gcccacgtct 240 gtgacgagca gaggtgaggt tggagtcaag aggagtccta ttcaagctgt tcgcagcaag 300 aaccataaaa ctttcattgc tcaatgggca agagcggcta aggctcggtt ctcgtttgca 360 cgacagtgtg agcggagccc tgtaaatgtc gcggcccttc atcggtggtt tgcatcggag 420 tttaagaaaa ttggcatgaa cttgctccag gtttcgtacg tgatcgatga ggttgttgaa 480 cttagtttgg aaccaacgta tgagcgtatg gtgtccgaaa ctaagaagca attccgtcat 540 cgggcacgta tggaatacta caacgagaaa aaatgccttg aaaagatcca ctaggaacgc 600 <210> 640 <211> 251 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Hubei tombus-like virus 32 sequence" <400> 640 ttcgggttta cccgcgtaag cggccacact gactggttgt cggtgttgaa tttgtatacc 60 agatgaggag acgttaccac cgtctcggca gtgctacgtc tgggaaagga ctgtgatagt 120 ggacagtcct accgtcttta gatacattgc gttgtgtata gcccgggagg gattaactaa 180 tagcaacgca atgcacacgg cggttcggat ttgcttgact gatggaaaga catctaagtt 240 ctaattgaac c 251 <210> 641 <211> 341 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Hubei sobemo-like virus 3 sequence" <400> 641 gagatgtttg cgtgggccgt tgcgctgcgg gcggcccacc tccctacggg gaccgtgaga 60 caccgctggg gaaggccccc acccccggcc aaggggatcc tgccgagagg caggagaaag 120 aggcccagcc ctctggggcg cctttagggg tgcctgggag ggaagtaccc gagccgggcg 180 gccggtcggg tgcggctgtg cagttcgagg ctaaccgtaa ggaaggcctg agctgcctcg 240 gcttgtcgga aaggaagacg aaggcactta tcaaggcttt caggaagcag gagcgcaatt 300 acagcgcgcg ccgtgcggcc tggattaacc gcatttggcc g 341 <210> 642 <211> 675 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Hubei picorna-like virus 2 sequence" <400> 642 agcaacttct ttctgaaaac tagctagagt tcgacgatct ctctggctaa tgacaaataa 60 ccaatcaaaa agtcaaatgt tcatgtatat atatatttag tagtgacctt tatttagaaa 120 aactttagat gatttatcgt caagttgccc tttgtgaagc gatcagcttt ttatatcgtt 180 tcatttttgt atacgtctta attgacgttg taagtacgtt ttgcatacct cacattgagg 240 atagtatcgt ttcctgacta agaagttaaa ctagtctacc aatagcaacc atataggata 300 tagctttgtt tttaacaagg tttaatctga tcttatgctc ttgcttacgg tgttttatgt 360 atagaaaagt ttttataaaa actacataat tgtcaaaaga aaaagcgtta cgtactgacg 420 catttatgtt cacagtgtga cacaaacctt ctatattttg attgtaaaat aggctttgcc 480 tgaccattta tcaaatacaa actgtttcaa acgcctctcc gagccatatt ggccgacgcg 540 aatcgacata acagggtgag tttacagctg cagttgcagc cgaggatcca cttatttgag 600 agagaattac tcttaacgaa attttgaagt cacttctaca cagttaagtc tgagtaggcg 660 ttatccaaac gtaaa 675 <210> 643 <211> 174 <212> DNA <213> Hepacivirus sp. <400> 643 acatgggggg gggctgacag tgagtacact gtgccaagca ggtgctacgc tatgcctagg 60 tgctgctgta ggccaaggac atgtcccagt catcccaggt gagggggggg gttcccctca 120 ccgctgccac tgcctgatag ggtcctgccg gagggtctcg gtgtccggct gtac 174 <210> 644 <211> 675 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Harrier picornavirus 1 sequence" <400> 644 gatgtgtgac ggtgtaatta ctttccggat cccactttcc tattataact ctttcatccc 60 aaggttaggg aaagaacctg gctcggtacc accagaccct ccgccacgct agtggactct 120 ccggagataa cggtaccccc tttgtagtca cctgtgctgg tgaagaacca cctagtattg 180 cttgggtgcg tgccgcctag cttccatttc ttctggagca ctgtgcaatg aggtttcccc 240 acttggtaac aagtgcctca ggtcccgcaa ggatactgtg gggtggtgtg accgcaggga 300 gctgtctcca cggctcctct aatgttacgc cgctatccac aggccagtgc gtgtcatcga 360 tcccggatga cagagctagt attgcgaacc cccaagtaag aaaagtggct agtaacctga 420 tagctggtga agagggtggg tcagttgagt agatgcccta gaggtacccg aaaggatctg 480 actagggacc cgtgactata cattaggtaa accgggtata aaaaccatga aaaactgacc 540 acttttcttt taacctcttc tttcttttta tgtgtgttaa gtgttttgag tttggactgt 600 accttgcccg cctttcttgg attttctcta tcgctcttct tacacctact gttatcaagg 660 cactctttag agata 675 <210> 645 <211> 500 <212> DNA <213> Kunsagivirus sp. <400> 645 tttcaaatcg gactccggta gttataccgg agcccggttt ggacgcttgg gccgcgttaa 60 cagcccccca cccctttccc actgactgat ttctcggatt ggactcattt gcattgctaa 120 ctctgattct ggatttcccc gtttatgtcg tcgcggtcgg aagtgcacgt acttcgacgt 180 tgatctgatg gcgtttgttt ccagggggga ggtggcggca gaaacgcccc cgccgtaaac 240 ttcggcgggc cacgcctgtc aagccactcc ctggggccga gcgcctgagg tgatacagag 300 agataagcac actgggcgct gacaacgccc gggacctcag tgagaagagc agtagggccg 360 tgtttatggg actccattgg atatcccccg cttgtcggaa ctcacggcta ctccgggttg 420 ggaagcccgc gactggtact gtactgggtg atagcctggt gccttccctc tcactgttgt 480 atgaaggctg aaaaccccct 500 <210> 646 <211> 675 <212> DNA <213> Kobuvirus sp. <400> 646 tatagtttgc ctgtttctcg caccgttacc gctcgttcgg gaatgtgaaa ctggcacccc 60 tcctctcccc taccaccctt tctccttcgc ccccattcat aatttacaac gccgcacaca 120 gcggcggccg ccaagggcta gcctggcggt tataaaagga acctgggtct ttccctcttc 180 aagccaaaag gtaggttccc tgtgtccctg aatgctcggt gaggaatgct gcaccgtaac 240 gctttgtgaa gtgtttgcaa gttctggccc ggcaagccta cagagtgctg tgatccgctg 300 cggacgccat cctggtaaca ggacccccag tgtgcgcaac agtatgttca gacttcggtt 360 tgttcacttg ctttcatgga ccattgcgcg aaagtgcgtg cgccatatcc ctgtacttca 420 ggtgtgcttc tctggaccct aggaatgctg cgaaggtacc ccgtttcggc gggatctgat 480 cgcaggctaa ttgtctatgg gttcagtttc ctttttcttt actccacaat tgactgctta 540 actgactctg gatcttgtgc ttccactgct ctttctgctc tcaaaacggc ttcacttacc 600 aactctcacc tttcgaccaa caccatttac acactaactt ttttcgactc ttctgactcc 660 tggcttggtg aagac 675 <210> 647 <211> 608 <212> DNA <213> Kashmir bee virus <400> 647 tacgtacaat tttgacgctt cgttcatgca acaatgaact cacatgtggc gctcggtagt 60 aaccagaggg gcgtcattcc cccgtatgga gtggagaata taagctaccg actcgagctg 120 tagaataatt cagcaactta taacgaacac gaattttagt cgacgaaacc attttagcct 180 ttaattctat gatttgatta taatgataaa cagctcatgt aactgtctaa actacataaa 240 tacaactgga ttacgaacct ttaagtaact atcttagatg aagtctagta gtctcccaat 300 atttccgtga aaagaatgag ggacgagata gctctattta aagacgtgag gctttaaatt 360 ctgataaata cattacctga gaattcctcc tttaggagtt agaatttgaa aagattagta 420 cctatactta atagaattta aatatgttaa taatgctgaa gacaagtatt tcgattatta 480 acctctatat ttctatataa agtatctgtg agtctcagtg gacatcacag taaggtcgca 540 gttaacttgt aatcttttca ttcctgtgtc ggagcagtgg taatggagcc ggacgatttc 600 gccaaaac 608 <210> 648 <211> 332 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Jingmen picorna-like virus sequence" <400> 648 tgtgtttttg tcaagataat tgttctgtga ttaacagtga ttgtggttcg tgtaatgcga 60 cgcagtcaaa tgctagtttt gatgaagtgt atgagagagt ggaaaactta tctcataaga 120 agattgaaga gtgtgtagat caggctattg atcgagcttc taagcttcgt gattacaagc 180 ttaatgttca caatggctcc cgacgggaat catctgatcc tctctttatt tcgccccatt 240 cgttgttatc gcttggggta tctaagtttg ttgcgtttga gcagcatcac agtttcgctt 300 cagttgagtc tctgaagttg cttgctctgt ct 332 <210> 649 <211> 145 <212> DNA <213> Mumps orthorubulavirus <400> 649 accaagggga aaatgaagat gggatgttgg tagaacaaat agtgtaagaa acagtaagcc 60 cggaagtggt gttttgcgat ttcgaggccg ggctcgatcc tcacctttca ttgtcgatag 120 gggacatttt gacactacct ggaaa 145 <210> 650 <211> 138 <212> DNA <213> Mosavirus sp. <400> 650 gaagttgatc atgaacttgg ttattggtgg aacgcacatg aactcccaac aatgatcttg 60 aagacacagc gtggtaacaa ttaccatgcc cttgtggctg cccaagacat tgatggctat 120 tgggtgattt atgatgac 138 <210> 651 <211> 675 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Miniopterus schreibersii picornavirus 1 sequence" <400> 651 gttgtcgacc cgttgcttgg tttaagcatg aggtggattc ccccgattat gtctacccgt 60 tactatggcg ggcggtcgtt tcagggtgtt tctactgagg actgcaccaa gtctttatct 120 tttattctca gatctccggc tgtttgacgc ttgtaggaca gcaggactat tttctcttaa 180 tctttttcta cccactaggg tcctatccta gtggagggag ggtgccaccc cttctctctt 240 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source <223> /note="Description of Unknown: Phopivirus strain NewEngland sequence" <400> 655 gggagtaaac ctcaccaccg tttgccgtgg tttacggcta cctatttttg gatgtaaata 60 ttaattcctg caggttcagg tctcttgaat tatgtccacg ctagtggcac tctcttaccc 120 ataagtgacg ccttagcgga acctttctac acttgatgtg gttaggggtt acattatttc 180 cctgggcctt ctttggccct ttttcccctg cactatcatt ctttcttccg ggctctcagc 240 atgccaatgt tccgaccggt gcgcccgccg gggttaactc catggttagc atggagctgt 300 aggccctaaa agtgctgaca ctggaactgg actattgaag catacactgt taactgaaac 360 atgtaactcc aatcgatctt ctacaagggg taggctacgg gtgaaacccc ttaggttaat 420 actcatattg agagatactt ctgataggtt aaggttgctg gataatggtg agtttaacga 480 caaaaaccat tcaacagctg tgggccaacc tcatcaggta gatgcttttg gagccaagtg 540 cgtaggggtg tgtgtggaaa tgcttcagtg gaaggtgccc tcccgaaagg tcgtaggggt 600 aatcaggggc agttaggttt ccacaattac aatttgaa 638 <210> 656 <211> 377 <212> DNA <213> Pestivirus sp. <400> 656 gtatacgaga ttagctcata ctcgtgtaca aattggacgt agcaaattta aaaattcgga 60 tagggtcccc atccagcgac ggccgaacgg 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Unknown: Pigeon picornavirus B sequence" <400> 661 tttatttagc tgttaagttt tatttgtgcc gagaccccat agtaggatct tggtgttcca 60 cattaagctc tcccgaccac acatccaaac gataggcggt gtaagggctc cctggctaag 120 tgtttactca ttgctaggga agtgttgcga cccgttacca gtaggaatac aggaggtctt 180 agttgcctaa ccagataaag tggtgctgaa atattgcaag ctcaatgtct ggcgaacgac 240 ggactaccgt tgaactattg ttaacgcccg cgtgtgtagg caacacacgg gttagtaggt 300 cacttacatt gacatccgtg ccgggaaagc ggatctgagc tatcgattgc ctgatagggt 360 gccggcgggc gcggtacgtg tggtatagtc cgctgtcttg gggtatggcg tctactcggt 420 tttgttgtcg ttttggaatg tcccatgtcg gagatgtcgt taccggtgtt tgctttactt 480 gtgcacgaat aagaaaacag agtttggagt tttggaagtt aatggataac atcaagtttc 540 cattgcgttc ctcgtgcatt ttaggccaga aaatcgacca caaaatcgag a 591 <210> 662 <211> 620 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Picornavirus HK21 sequence" <400> 662 aaacgggagg atcggctttg gcttatcctc ttaatagtct acaaaactgg gctgactggt 60 gggggagcta ctagatccgg gagaggacta gttaccccgc 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cgttaacagt agggttttgt cgacccggac 240 cccttaatgc gcgcgaattc aaccgcgcct agtcggcaat ggtatcattt aatcccatgc 300 actacgggag aaatttgaga ccaaagaatt cctgagggcc actgcttgct ctaagtgcaa 360 tgcctcggga gacttctgtc aggagcctag cggctttcaa ccgcgacagc taactcctgc 420 gggatgtttg gtgtccatac ttactggcgt cctcacaacg ctaagtggat gttgtccaca 480 ggtaggcaaa caccgagccc cacattcagg agacctgtat gaacgatcct atcagcatta 540 gagttggaat tgggtgtgct aacgtccgca taagtgcacc ccgtggtaac gctgggaaac 600 tatccagcgc aacgtactgt cctcaatgtc tagggaagga ccgccctaag cgtacaaccg 660 ggccatgtgt cgagc 675 <210> 664 <211> 549 <212> DNA <213> Hepatovirus sp. <400> 664 ttcaaagagg ggtccgggat tttcctggtc cccctctttg ggcacccttg gctcgggggt 60 gtgaataccg tgctcgcgtt tgccgtgcgt taacggcttc atttatgttt gtttgtctgt 120 tttattatgt tggtttgtct gtttgttatg ttggtattgt tcgtgtttaa tgttatgacc 180 acattacact ccagccaatg aagaacagat ggtgcggtta ttgctggcgg aattcctaac 240 gtcctggatc cgttggtacg catcacaaaa caatttgcag agagagtggt gaaacggctt 300 gggaatccct gagtacaggg aaatcacact 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/note="Description of Unknown: Seneca valley virus sequence" <400> 668 tttgaaatgg ggggctgggc cctgatgccc agtccttcct ttccccttcc ggggggttaa 60 ccggctgtgt ttgctagagg cacagagggg caacatccaa cctgcttttg cggggaacgg 120 tgcggctccg attcctgcgt cgccaaaggt gttagcgcac ccaaacggcg cacctaccaa 180 tgttattggt gtggtctgcg agttctagcc tactcgtttc tcccccgacc attcactcac 240 ccacgaaaag tgtgttgtaa ccataagatt taacccccgc acgggatgtg cgataaccgt 300 aagactggct caagcgcgga aagcgctgta accacatgct gttagtccct ttatggctgc 360 aagatggcta cccacctcgg atcactgaac tggagctcga ccctccttag taagggaacc 420 gagaggcctt cgtgcaacaa gctccgacac agagtccacg tgactgctac caccatgagt 480 acatggttct cccctctcga cccaggactt ctttttgaat atccacggct cgatccagag 540 ggtggggcat gacccctagc atagcgagct acagcgggaa ctgtagctag gccttagcgt 600 gccttggata ctgcctgata gggcgacggc ctagtcgtgt cggttctata ggtagcacat 660 acaaat 666 <210> 669 <211> 675 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Sclerotinia sclerotiorum dsRNA mycovirus-L sequence" <400> 669 ttgaattaat cttttacgtt tacgcgcata aaatcaggac acatctcttg tatactttag 60 tatatcaatg atgtttttgt tttatgcgat taatcgtaag agaacttctt tccatccgcc 120 tgtatgggcg ggataataag ttcaccgcct tggtcgaggc gcaaacttgt atgtgcaaag 180 gtgagctata tgctcgaaat agtcgtaact aacacacagc cactacctgt agagctctat 240 tgatccggaa tcctttagtg ggaatgcaga gctcacaccg gacctgcggg tatcttcggc 300 gttagggact tctgtttcag ccttgaatca tttaccttta taccttctct gaggcgcctg 360 ggccgggcgc gatattaagt acaagtcaag gacatcgcgg gtagtggtct aatcagccgc 420 tagtcctgct ggagagttcc aacttagttg ggtgtggtgc atactagctg gatagagtag 480 gtatgtattg ctaacgtatg ccggaggcta tccgtcctcg gtagaacgtg ccgaggagta 540 gtctctgcag acccccgaac gcgtggggtc tttacttaaa tgtaggcgga gggagcgctc 600 gtaggtggaa cgactgcctc ccagtcgaat gcaagatttt gcacgcggac cagtctgccc 660 ggcaattccc gggtg 675 <210> 670 <211> 675 <212> DNA <213> Enterovirus sp. <400> 670 ctccggcaca gccgcaccag tgcactggta cgctagtacc ttttcacggg gtagtcggta 60 tccccccccg taacttagaa gcatgtaaca aaccgaccaa taggtgcgcg gcagccagct 120 gcgttgcggt caagcacttc tgtctccccg gtccgcaagg atcgttaccc gcccactcca 180 ctacgaggag cctagtaact ggccaagtga ttgcggagtt gcgttcagcc acaaccccag 240 tggtagctct ggaagatggg gctcgcacat cccccgtggt aacacggttg cttgcccgcg 300 tgtgcttccg ggttcagtct ccgactgttc acttcaacat cacgcaacca gccaagagcc 360 gattgtgctg gagtggtctt cctccggggc cgtgaatgct gctaatccta acctccgagc 420 gtgtgcgcac aatccagtgt tgctacgtcg taacgcgtaa gttggaggcg gaacagacta 480 ctttcggcac cccgtgtttc ctttatttta ttcttatttt atggtgacaa ttgcagagat 540 ttgtgatatt gcgactttac cgttaaacat agcactgcat tacctggttg cattccacaa 600 aacttcagag attcctagtt cctacattga cctacttgtt tatttgaatc ttaaatacaa 660 acttgagcaa gtgaa 675 <210> 671 <211> 245 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Wobbly possum disease virus sequence" <400> 671 cggctgtgag tgcttagcat atgctagagt actacagccg ggtgttggag tcatatgcac 60 tggttgcctg tataatagtc gggatctgtc tgacctacat tatctttggg agttgcttat 120 cacgacaatt ctcgaagtgt ctgtcgacag cttacccccg attcgacaag gccccttgtc 180 caccgcagac ctatcgattt tcaacgagaa cactatcaga ggtttaaatt taaaactcac 240 caaca 245 <210> 672 <211> 631 <212> DNA <213> Avian orthoreovirus <400> 672 gctttttcaa tcccttgtgt cgatgttccc gtatgtcatc tggttcatgt aacggtgcaa 60 cttctatttt tggtaacgtt cactgtcagg cagcgcaaaa ctcggcgggt ggtgatcttc 120 aagcgacttc ctctcttgtt gcttattggc cctacttggc tgcgggcggt ggtctgctcg 180 ttgttattat tataattgtt ggcgctgttt gttgttgcaa ggctaaggtt aaagcggacg 240 cagcccgaaa cgttttctac cgagagctgt tcgcacttaa ttcgggtaaa agtgatgcag 300 gacctccgat ttaccaggtt tagtgtacga cgatttgagt tttcaccttt cgtcttagag 360 gagtgcacta ctccatcttt cacgactata actaataccg atccggctct ctactttaac 420 attgagtttc cgtcaagtca tcgtctctcc cccttcattc cagaactgtt gtctcagcct 480 tgtaccgttc acgtttcatt gattcggaga ttcgctctct gtgcaacctt atctagtatt 540 tgtgaatacg actgtgcgct actgccatcc atcaacgcta ttacgacgat ccctacacca 600 ggtgcgtcat catctctgat tgttcattgg g 631 <210> 673 <211> 665 <212> DNA <213> Kobuvirus sp. <400> 673 ggggcctcgg ccccctcacc ctcttttccg gtggccacgc ccgggccacc gatacttccc 60 ttcactcctt cgggactgtt ggggaggaac acaacagggc tcccctgttt tcccattcct 120 tccccctttt cccaacccca accgccgtat ctggtggcgg caagacacac gggtctttcc 180 ctctaaagca caattgtgtg tgtgtcccag gtcctcctgc gtacggtgcg ggagtgctcc 240 cacccaactg ttgtaagcct gtccaacgcg tcgtcctggc aagactatga cgtcgcatgt 300 tccgctgcgg atgccgaccg ggtaaccggt tccccagtgt gtgtagtgcg atcttccagg 360 tcctcctggt tggcgttgtc cagaaactgc ttcaggtaag tggggtgtgc ccaatcccta 420 caaaggttga ttctttcacc accttaggaa tgctccggag gtaccccagc aacagctggg 480 atctgaccgg aggctaattg tctacgggtg gtgtttcctt tttcttttca cacaactcta 540 ctgctgacaa ctcactgact atccacttgc tctcttgtgc ctttctgctc tggttcaagt 600 tccttgattg tttttgactg cttttcactg cttttcttct cacaatcctt gctcagttca 660 aagtc 665 <210> 674 <211> 655 <212> DNA <213> Kobuvirus sp. <400> 674 ccccctcacc ctcttttccg gtggccacgc ccgggccacc gatacttccc ttcactcctt 60 cgggactgtt ggggaggaac acaacagggc tcccctgttt tcccattcct tccccctttt 120 cccaacccca accgccgtat ctggtggcgg caagacacac gggtctttcc ctctaaagca 180 caattgtgtg tgtgtcccag gtcctcctgc gtacggtgcg ggagtgctcc cacccaactg 240 ttgtaagcct gtccaacgcg tcgtcctggc aagactatga cgtcgcatgt tccgctgcgg 300 atgccgaccg ggtaaccggt tccccagtgt gtgtagtgcg atcttccagg tcctcctggt 360 tggcgttgtc cagaaactgc ttcaggtaag tggggtgtgc ccaatcccta caaaggttga 420 ttctttcacc accttaggaa tgctccggag gtaccccagc aacagctggg atctgaccgg 480 aggctaattg tctacgggtg gtgtttcctt tttcttttca cacaactcta ctgctgacaa 540 ctcactgact atccacttgc tctcttgtgc ctttctgctc tggttcaagt tccttgattg 600 tttttgactg cttttcactg cttttcttct cacaatcctt gctcagttca aagtc 655 <210> 675 <211> 645 <212> DNA <213> Kobuvirus sp. <400> 675 ctcttttccg gtggccacgc ccgggccacc gatacttccc ttcactcctt cgggactgtt 60 ggggaggaac acaacagggc tcccctgttt tcccattcct tccccctttt cccaacccca 120 accgccgtat ctggtggcgg caagacacac gggtctttcc ctctaaagca caattgtgtg 180 tgtgtcccag gtcctcctgc gtacggtgcg ggagtgctcc cacccaactg ttgtaagcct 240 gtccaacgcg tcgtcctggc aagactatga cgtcgcatgt tccgctgcgg atgccgaccg 300 ggtaaccggt tccccagtgt gtgtagtgcg atcttccagg tcctcctggt tggcgttgtc 360 cagaaactgc ttcaggtaag tggggtgtgc ccaatcccta caaaggttga ttctttcacc 420 accttaggaa tgctccggag gtaccccagc aacagctggg atctgaccgg aggctaattg 480 tctacgggtg gtgtttcctt tttcttttca cacaactcta ctgctgacaa ctcactgact 540 atccacttgc tctcttgtgc ctttctgctc tggttcaagt tccttgattg tttttgactg 600 cttttcactg cttttcttct cacaatcctt gctcagttca aagtc 645 <210> 676 <211> 635 <212> DNA <213> Kobuvirus sp. <400> 676 gtggccacgc ccgggccacc gatacttccc ttcactcctt cgggactgtt ggggaggaac 60 acaacagggc tcccctgttt tcccattcct tccccctttt cccaacccca accgccgtat 120 ctggtggcgg caagacacac gggtctttcc ctctaaagca caattgtgtg tgtgtcccag 180 gtcctcctgc gtacggtgcg ggagtgctcc cacccaactg ttgtaagcct gtccaacgcg 240 tcgtcctggc aagactatga cgtcgcatgt tccgctgcgg atgccgaccg ggtaaccggt 300 tccccagtgt gtgtagtgcg atcttccagg tcctcctggt tggcgttgtc cagaaactgc 360 ttcaggtaag tggggtgtgc ccaatcccta caaaggttga ttctttcacc accttaggaa 420 tgctccggag gtaccccagc aacagctggg atctgaccgg aggctaattg tctacgggtg 480 gtgtttcctt tttcttttca cacaactcta ctgctgacaa ctcactgact atccacttgc 540 tctcttgtgc ctttctgctc tggttcaagt tccttgattg tttttgactg cttttcactg 600 cttttcttct cacaatcctt gctcagttca aagtc 635 <210> 677 <211> 625 <212> DNA <213> Kobuvirus sp. <400> 677 ccgggccacc gatacttccc ttcactcctt cgggactgtt ggggaggaac acaacagggc 60 tcccctgttt tcccattcct tccccctttt cccaacccca accgccgtat ctggtggcgg 120 caagacacac gggtctttcc ctctaaagca caattgtgtg tgtgtcccag gtcctcctgc 180 gtacggtgcg ggagtgctcc cacccaactg ttgtaagcct gtccaacgcg tcgtcctggc 240 aagactatga cgtcgcatgt tccgctgcgg atgccgaccg ggtaaccggt tccccagtgt 300 gtgtagtgcg atcttccagg tcctcctggt tggcgttgtc cagaaactgc ttcaggtaag 360 tggggtgtgc ccaatcccta caaaggttga ttctttcacc accttaggaa tgctccggag 420 gtaccccagc aacagctggg atctgaccgg aggctaattg tctacgggtg gtgtttcctt 480 tttcttttca cacaactcta ctgctgacaa ctcactgact atccacttgc tctcttgtgc 540 ctttctgctc tggttcaagt tccttgattg tttttgactg cttttcactg cttttcttct 600 cacaatcctt gctcagttca aagtc 625 <210> 678 <211> 675 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Picornavirales sp. isolate RtMruf-PicoV sequence" <400> 678 tttgctcagc gtaacttctc cgggttacgt ggagaccaaa aggctacgga gactcgggct 60 acggccctgg agcacctagg tgctcctaaa gacgttagaa gttgtacaaa ctcgcccaat 120 agggcccccc aaccaggggg gtagcgggca agcacttctg tttccccggt atgatctcat 180 aggctgtacc cacggctgaa agagagatta tcgttacccg cctcactact tcgagaagcc 240 cagtaatggt tcatgaagtt gatctcgttg acccggtgtt tcccccacac cagaaacctg 300 tgatgggggt ggtcatcccg gtcatggcga catgacggac ctccccgcgc cggcacaggg 360 cctcttcgga ggacgagtga catggattca accgtgaaga gcctattgag ctagtgttga 420 ttcctccgcc cccgtgaatg cggctaatcc caactccgga gcaggcgggc ccaaaccagg 480 gtctggcctg tcgtaacgcg aaagtctgga gcggaaccga ctactttcgg gaaggcgtgt 540 ttccttttgt tccttttatc aagttttatg gtgacaactc ctggtagacg ttttattgcg 600 tttattgaga gatttccaac aattgaacag actagaacca cttgttttat caaaccctca 660 cagaataaga taaca 675 <210> 679 <211> 675 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Apodemus agrarius picornavirus strain Longquan-Aa118 sequence" <400> 679 ttactcagcg taactactcc gggttacgtg atgaagaaga ggctacggag attctcgggc 60 tacggccctg gagccactcc ggctcctaaa gatttagaag tttgagcaca cccgcccact 120 agggcccccc atccaggggg gcaacgggca agcacttctg tttccccggt atgatctgat 180 aggctgtaac cacggctgaa acagagatta tcgttatccg cttcactact tcgagaagcc 240 tagtaatgat gggtgaaatt gaatccgttg atccggtgtc tcccccacac cagaaactca 300 tgatgagggt tgccatcccg gctacggcga cgtagcgggc atccctgcgc tggcatgagg 360 cctcttagga ggacggatga tatggatctt gtcgtgaaga gcctattgag ctagtgtcga 420 ctcctccgcc cccgtgaatg cggctaatcc taaccccgga gcaggtgggt ccaatccagg 480 gcctggcctg tcgtaatgcg taagtctggg acggaaccga ctactttcgg gaaggcgtgt 540 ttccatttgt tcattatttg tgtgtttatg gtgacaactc tgggtaaacg ttctattgcg 600 tttattgaga gattcccaac aattgaacaa acgagaacta cctgttttat taaatttaca 660 cagagaagaa ttaca 675 <210> 680 <211> 675 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Niviventer confucianus picornavirus sequence" <400> 680 ccctttcata acccccccct tttaacccaa cccttcgtaa ccgtacgctt cactcgcctt 60 tgggtatagc ggcccaatgt gctgaagaaa aggatacgct ataaggggcc aacgggtggt 120 ggcccttaag accacccaac ctagaagctt gtacactcgg gcaatagtga ggcccacatc 180 cagtgggtca agcccaaagc attcttgttc cccggtatga tctcataagc tgtacccacg 240 gctgaaagag tgattatcgt tatcccactc agtacttcgg agagcctagt acaccacttg 300 gaaatggaag tctgtgatcc ggggttgacc ctgaacccca gaaactcatg atgaggctaa 360 ccttcccgaa cacggcgacg tgtggttagc ctgcgctggc atgaggcctc tttgtaggca 420 gactgaaatg gaagggtgac gaagagccga ctgagctact gttttattcc tccggccccc 480 tgaatgcggc taatcctaac tcctggtcca gtacttgtaa cccaacaggt ggctggtcgt 540 aatgcgtaag ccgggagcgg aaccgactac tttggggcgt ccgtgtttct caatattatt 600 catttctagc ttatggtgac aatttatgat tgcagagatt gtgctgtatt tgtgtctgag 660 agaagaagta acaat 675 <210> 681 <211> 619 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Bat picornavirus isolate BtRs-PicoV sequence" <400> 681 tttcaaaagg ccctgggcat acggcgttat tcgtaacgtc gtatgtccag ggcggtagca 60 tcaggccaag gcctgatgct accacgtgtg gactaaacca cacactcttc ttgtgacacg 120 ttgtgtcacc tatccctttc ttggtaactt agaagcttgt acacttacgc acgtaggtgc 180 cccacatcca gtggggtttg tgcaaagcaa tcttgttccc cggtaaaccc tgataggctg 240 taaccacggc cgaaacaagg tttgtcgtta cccgactcac tactacacaa agcctagtaa 300 agttcaatga aagtgcgcag cgtgatccgg tcaaaacccc cttgaccaga aacacatgat 360 gagggtcacc aacccccact ggcgacagtg tggtgtccct gcgttggcat gtggcctcgt 420 agaggcgttg caatctggat ttgctccgaa gagccccgtg tgctagtgtt tatacctccg 480 gccccttgaa tgcggctaat cctaaccccc gagcatgtac acacaagcca gtgtgtagca 540 tgtcgtaatg agcaatttgg ggatggaacc gactacttta gggtgtccgt gtttctcatt 600 attctttgtt tgatgtttt 619 <210> 682 <211> 593 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Rhinolophus picornavirus strain Guizhou-Rr100 sequence" <400> 682 ttttttttct caggcggtag catccagcca aggcctgatg ctaccaacgt gtgactaaac 60 cacactctct ttttgtgata cattgtgtca cctatccctt tcttggtaac ttagaagctt 120 gtacacccac gcacgtaggt accccacatc cagtggggtt tgtgcaaagc attcttgttc 180 cccggtaaac cctgataggc tgtaaccacg gctgaaacaa ggtttgtcgt tacccgactc 240 actactacgc aaagcctagt aaagttcaat gaaagtgcgc agcgtgatcc ggtcaaaacc 300 cccttgacca gaaacacatg atgagggtca ccaaccccca ctggcgacag tgtggtgtcc 360 ctgcgttggc atgtggcctc atagaggcgt tgcaatctgg atttgctccg aagagccccg 420 tgtgctagtg tttatacctc cggccccttg aatgcggcta atcctaaccc ccgagcatgt 480 acacacacgc cagtgtgcag catgtcgtaa tgagcaattt ggggatggaa ccgactactt 540 tagggtgtcc gtgtttctca ttattctttg tttgatgttt tatggtgaca aca 593 <210> 683 <211> 597 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Rhinolophus picornavirus strain Henan-Rf265 sequence" <400> 683 cggaacgttg tatgctcagg gcgtaggcac cacccacggg tggtgcctac acgtgtggac 60 taaaccacac actcttttca gcacttagtg ctgctatctc tttttgtaac ttagaagttt 120 gtacacaatg cgttagggcc acacatccag tgtggtatcg caaagcactt ctgtttcccc 180 ggtgctagta ggagggtggc tgctccacgg ccacttgccg aacccatcgt tacccgactc 240 attacttcgc aaagcctagt aacccagttg aagcaagccc ggcgtgttcc ggtcaggaaa 300 aaccccccct ggccagaaac atgtgatgag ggtgggctat ccccactggt gacagtgagc 360 cctccctgcg ttggcacatg gcccgatctg ggcgtggttc ttgtggatgc tgccgaagag 420 ccccgtgagc tagtgtttat accgccggcc tcgtgaatgc ggctaaccct aaccccggag 480 cagaggctac tgaagccaca gtagtcgctg tcgtaacgag taattctggg atgggaccga 540 ctactttcga gtgtccgtgt ttcctttatt cttttattgt tgtttatggt gacaaac 597 <210> 684 <211> 636 <212> DNA <213> Enterovirus sp. <400> 684 cccctaggat ccactggatg tcagtacact ggtatcgtgg tacctttgta cgcctgtttt 60 ataccccctt ccccgcaact ttagaagcat caaaagcacc gctcaatagt caccacaccc 120 ccagtgtggt ttcgagcaag cacttctgtt ttcccggttg cgtcccatat gctgtgcaaa 180 cggcaaaaag ggacaatatc gttacccgct tgtatactac gggaaaccta gtaccaccat 240 tgattgtgtt gagagttgcg ctcatcacct ttccccggtg tagctcaggc cgatgaggct 300 cagaatcccc cacaggtgac tgtgtctgag cctgcgttgg cggcctgccc tcgccttatg 360 gcgtgggacg cttgatacat gacatggtgc gaagagtcta ctgtgctatg caagagtcct 420 ccggcccctg aatgtggcta atcctaacca ctgatcccac gcacgcaaac cagtgtgtag 480 tgggtcgtaa cgcgcaagtc ggtggcggaa ccaactactt tgggtgaccg tgtttccttt 540 attacttatt gaatgtttat ggtgacaatt gtttgattca gttgttgcca ttctctacat 600 tcatttaccc agcatcaaac caattgaact gttaca 636 <210> 685 <211> 421 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Human poliovirus 1 strain NIE1116623 sequence" <400> 685 agtctggaca tccctcaccg gcgacggtgg tccaggctgc gctggcggcc tacctgtggt 60 ccaaagccac gggacgctac atgtgaacaa ggtgtgaaga gcctattgag ctacaaaaga 120 gtcctccggc ccctgaatgc ggctaatccc aaccacggat caagggtgca caaaccagtg 180 tacaccttgt cgtaacgcgc aagtctgtgg cggaaccgac tactttgggt gtccgtgttt 240 cctttttaat tttgatggct gcttatggtg acaatcatag attgttatca taaagctaat 300 tggattggcc atccggtgag agtgaaatat attgtttacc tccctgttgg gtttactcta 360 actaacttct ccatttataa acttgtcatc acagttttaa taattagaag tgcagtttac 420 a 421 <210> 686 <211> 663 <212> DNA <213> Enterovirus sp. <400> 686 tttaaaacag cctgggggtt gttcccaccc ccagggccca ctgggcgtta gtactctggt 60 atcgcggtac cttagtatgc ctgttttatg tctcctttcc cccgcaactt tagaagtaat 120 caagttatgg ctcaacagtc gccacacccc cagtgtggtt ccgagcaagc acttctgttc 180 cccggttgcg tcttatatgc tgtgtgaacg gcagaaaggg acaatatcgt tatccgctca 240 actactacgg gaagcctagt accaccatgg attgacctga aagttgcgtt cagcgcaccc 300 ccagcgcagc tcaggccgat gaggctccga ataccccacg ggcgaccgtg tcggagcctg 360 cgttggcggc ctgcccacgt tgcaaaacgt gggacgctca tttcatgaca tggtgcgaag 420 agcctactgt gctagttgag agtcctccgg cccctgaatg tggataatcc taaccactga 480 acctacgggc gcaaaccagc gtctggtagg ccgtaacgcg caagtcggtg gcggaaccaa 540 ctactttggg tgtccgtgtt tccttttatc tttttgaatg tttatggtga caattgttgt 600 gtacagttgt taccatagtt tgcattcaga aataaaccta acactttcca attatttgtt 660 aca 663 <210> 687 <211> 675 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Human poliovirus 2 strain NIE0811460 sequence" <400> 687 ttgtgcgcct gttttatatt ccccccccgc aacttagaag cacgaaacca agttcaatag 60 aagggggtac aaaccagtac caccacgaac aagcacttct gtttccccgg tgacattgca 120 tagactgctc acgcggttga aagtgatcga tccgttaccc gcttgtgtac ttcgaaaagc 180 ctagtattgc cttggaatct tcgacgcgtt gcgctcagca cccgaccccg gggtgtagct 240 taggctgatg agtctggaca ttcctcaccg gtgacggtgg tccaggctgc gttggcggcc 300 tacctatggc taatgccata ggacgctaga tgtgaacaag gtgtgaagag cctattgagc 360 tacataagag tcctccggcc cctgaatgcg gctaatccta accacggagc aggcggtcgc 420 aaaccagtga ctagcttgtc gtaacgcgca agtctgtggc ggaaccgact actttgggtg 480 tccgtgtttc ctgttatttt tattatggct gcttatggtg acaatcagag attgttatca 540 taaagcgaat tggattggcc atccggtgag tgttgtgtca ggtatacaac tgtttgttgg 600 aaccactgtg ttagtttaac ctctctttca accaattagt caaaaacaat acgaagatag 660 aacaacaata ctaca 675 <210> 688 <211> 512 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Bovine picornavirus sequence" <400> 688 ttttctcccc tccccctcca actacctttt ccccctcttg taacgctaga agtttgtgca 60 aaccgcctgt agggtactgc aatccagcag tgcataggct aagcttttct tgttacccca 120 ccccacatta tactgaggag gattgtgaaa ttgtgttagt atgggttagt agcggtgacc 180 cgggtaaccc caacccagaa actcacggat gagatgaaca ggaccccaca tggtaacgtg 240 tgtgttcgtc tgccccgcaa ggtgaggccg tgagagcttt gcacgcgaaa accttgaaaa 300 cccaaaagta ccttgagctc ttcgctattt tgtgtttcct ccaggaccct gaatgcggct 360 aaacctaacc cgcgatccgc acgtagcaac ccagctagag tgtggtcgta atgcgcaagt 420 tgcgggcggt accgactact ttggtgttcc tgtgtttcct ttattttatt ttgaattttt 480 atggtgacaa cagctagaaa ataagagtga ac 512 <210> 689 <211> 675 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Human poliovirus 1 strain EQG1419328 sequence" <400> 689 acccttgtac gcctgtttta tactcccctc cccgtaactt agaagaaaca aaataagttc 60 aataggaggg ggtacaaacc agtaccacca cgaacaagca cttctgtctc cccggtgaca 120 ttgcatagac tgtccccacg gttgaaagca attgatccgt tacccgctct tgtacttcga 180 gaagcctagt accatcttgg aatcatcgat gcgttgcgct ccacactcag tcccagagtg 240 tagcttaggc tgatgagtct ggacattcct caccggcgac ggtggtccag gctgcgttgg 300 cggcctacct gtggcccaaa gccacaggac 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acccaggggg cattgtgtcg taacgggtaa ctctgcagcg gaaccgacta 480 ctttgggtgt ccgtgtttcc ttttattctt ataatggctg cttatggtga caattgaaag 540 attgttacca tatagctatt ggattggcca tccggtgtct aacagagcta ttatatacct 600 ctttgttgga tttgtaccac ttgatctaaa ggaagtcaag acactacaat tcatcataca 660 attgaacaca gcaaa 675 <210> 692 <211> 675 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Coxsackievirus A10 sequence" <400> 692 tttgtgcgcc tgttttacaa cccttcccca acttgtaacg tagaagtaat acacactact 60 gatcaatagc aggcatggcg cgccagtcat gtctcgatca agcacttctg ttcccccgga 120 ctgagtatca atagactgct cacgcggttg aaggagaaaa cgttcgttac ccggctaact 180 acttcgagaa acctagtagc accatagaag ctgcagagtg tttcgctcag cacttccccc 240 gtgtagatca ggctgatgag tcactgcaat ccccacgggt gaccgtggca gtggctgcgt 300 tggcggcctg cctatggggc aacccatagg acgctctaat gtggacatgg tgcgaagagt 360 ctattgagct agttagtagt cctccggccc ctgaatgcgg ctaatcctaa ctgcggagca 420 catgccttca acccagaagg tagtgtgtcg taacgggcaa ctctgcagcg gaaccgacta 480 ctttgggtgt 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Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 789 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 789 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr 100 105 <210> 790 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Claims (126)

  1. 다음 순서로, 포스트 스플라이싱 3' 그룹 I 인트론 단편(post splicing 3’ group I intron fragment), 내부 리보솜 유입 부위(Internal Ribosome Entry Site: IRES), 제1 발현 서열, 제2 발현 서열 및 포스트 스플라이싱 5' 그룹 I 인트론 단편을 포함하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 발현 서열과 상기 제2 발현 서열 사이에 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 절단 부위는 자가-절단 스페이서인, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 자가-절단 스페이서는 2A 자가-절단 펩타이드, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1 발현 서열과 상기 제2 발현 서열 사이에 제2 IRES를 포함하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 제1 IRES는 서열번호 1 내지 72 중 어느 하나에 따른 서열로 이루어지거나 상기 서열을 포함하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 제2 IRES는 서열번호 1 내지 72 중 어느 하나에 따른 서열로 이루어지거나 상기 서열을 포함하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 제1 치료용 단백질을 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 제2 치료용 단백질을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열 또는 상기 제2 발현 서열은 항체를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열 또는 상기 제2 발현 서열은 키메라 항원 수용체를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열 또는 상기 제2 발현 서열은 전사 인자를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열 또는 상기 제2 발현 서열은 사이토카인을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열 또는 상기 제2 발현 서열은 면역 저해 분자를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열 또는 상기 제2 발현 서열은 공자극 분자의 효능제를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열 또는 상기 제2 발현 서열은 면역 관문 분자의 저해제를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)의 알파쇄를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)의 베타쇄를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)의 베타쇄를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)의 알파쇄를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  18. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)의 감마쇄를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)의 델타쇄를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  19. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)의 델타쇄를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)의 감마쇄를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  20. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 사이토카인을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  21. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 사이토카인을 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-12 및 IL-15로부터 선택되는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  23. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 케모카인을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  24. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 케모카인을 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  25. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 전사 인자를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  26. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 전사 인자를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 전사 인자는 FOXP3, STAT5B, HELIOS, Tbet, GATA3, RORgt 및 cd25로부터 선택되는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  28. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 PD1 또는 PDL1 길항제를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  29. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 PD1 또는 PDL1 길항제를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  30. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 사이토카인을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  31. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 사이토카인을 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-12 및 IL-15로부터 선택되는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  33. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 케모카인을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  34. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 케모카인을 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  35. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 전사 인자를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 사이토카인을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  36. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 사이토카인을 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 전사 인자를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 전사 인자는 FOXP3, STAT5B, HELIOS, Tbet, GATA3, RORgt 및 cd25로부터 선택되는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-10, IL-12 및 TGFβ로부터 선택되는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  39. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 전사 인자를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 케모카인을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  40. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 케모카인을 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 전사 인자를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 전사 인자는 FOXP3, STAT5B 및 HELIOS로부터 선택되는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 케모카인은 CC 케모카인, CXC 케모카인, C 케모카인 또는 CX3C 케모카인인, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 케모카인은 CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL 1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXLC6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, XCL1, XCL2 및 CX3CL1로부터 선택되는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  44. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 종양 항원을 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 사이토카인을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  45. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 사이토카인을 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 종양 항원을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 항원은 신생항원인, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인은 IFNγ인, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  48. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 CAR을 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 CAR을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  49. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 사이토카인을 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 사이토카인을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  50. 제49항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 발현 서열은 IL-10, TGFβ 및 IL-35로부터 선택된 사이토카인을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 발현 서열은 IFNγ, IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-18로부터 선택된 사이토카인을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  52. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  53. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 케모카인을 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 케모카인을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  54. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 발현 서열은 면역억제 효소를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  55. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 속도 제한 효소(rate limiting enzyme)를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 플럭스-제한 효소(flux-limiting enzyme)를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  56. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 플럭스-제한 효소를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 속도 제한 효소를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  57. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 전사 인자를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 생존 인자를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  58. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 생존 인자를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 전사 인자를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 전사 인자는 FOXP3, STAT5B, HELIOS, Tbet, GATA3, RORgt 및 cd25로부터 선택되는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생존 인자는 BCL-XL로부터 선택되는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  61. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 발현 서열은 샤페론 단백질 또는 복합체를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  62. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 전사 인자를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 샤페론 단백질 또는 복합체를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  63. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 샤페론 단백질 또는 복합체를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 전사 인자를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샤페론 단백질 또는 복합체는 Skp, Spy, FkpA, SurA, Hsp60, Hsp70, GroEL, GroES, Hsp90, HtpG, Hsp100, ClpA, ClpX, ClpP 및 Hsp104로부터 선택되는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  65. 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 인자는 FOXP3, STAT5B, HELIOS, Tbet, GATA3, RORgt 및 cd25로부터 선택되는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  66. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 두 발현 서열은 신호전달 단백질을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  67. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 효소를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 상기 제1 발현 서열의 음성 조절 저해제를 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  68. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 상기 제2 발현 서열에 암호화된 효소의 음성 조절 저해제 단백질을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 상기 음성 조절 저해제는 p57kip2, BAX 저해제 및 TIPE2로부터 선택되는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  70. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 우성 음성 단백질을 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 면역 단백질을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  71. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 면역 단백질을 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 우성 음성 단백질을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  72. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 발현 서열은 항-염증 단백질을 암호화하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  73. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 전사 인자를 암호화하고, 상기 제2 발현 서열은 5-플루오로사이토신(5-FC)을 5-플루오로우라실(5-FU)로 전환시킬 수 있는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  74. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 서열은 5-플루오로사이토신(5-FC)을 5-플루오로우라실(5-FU)로 전환시킬 수 있고, 상기 제2 발현 서열은 전사 인자인, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 5-플루오로사이토신(5-FC)을 5-플루오로우라실(5-FU)로 전환시킬 수 있는 상기 발현 서열은 사이토신 데아미나제인, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 듀플렉스 형성 영역과 상기 포스트 스플라이싱 3' 그룹 I 인트론 단편 사이의 제1 스페이서, 및 상기 포스트 스플라이싱 5' 그룹 I 인트론 단편과 상기 3' 듀플렉스 형성 영역 사이의 제2 스페이서를 포함하는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  77. 제76항에 있어서, 상기 제1 내부 스페이서 및 상기 제2 스페이서는 각각 약 10 내지 약 60개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  78. 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 듀플렉스 형성 영역 및 제2 듀플렉스 형성 영역은 각각 약 9 내지 약 19개 뉴클레오타이드 길이를 갖는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  79. 제77항 또는 제78항에 있어서, 상기 제1 듀플렉스 형성 영역 및 제2 듀플렉스 형성 영역은 각각 약 30개 뉴클레오타이드 길이를 갖는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IRES는 타우라 증후군 바이러스(Taura syndrome virus), 트리아토마 바이러스(Triatoma virus), 타일러 뇌척수염 바이러스(Theiler's encephalomyelitis virus), 유인원 바이러스 40, 붉은 불개미 바이러스 1(Solenopsis invicta virus 1), 로팔로시품 파디 바이러스(Rhopalosiphum padi virus), 세망내피증 바이러스(Reticuloendotheliosis virus), 인간 폴리오바이러스 1, 갈색날개 노린재 장 바이러스(Plautia stali intestine virus), 카슈미르 벌 바이러스(Kashmir bee virus), 인간 리노바이러스 2(Human rhinovirus 2), 호말로디스카 코아굴라타 바이러스-1(Homalodisca coagulata virus-1), 인간 면역결핍 바이러스 타입 1, 호말로디스카 코아굴라타 바이러스-1(Homalodisca coagulata virus-1), 히메토비 P 바이러스(Himetobi P virus), C형 간염 바이러스, A형 간염 바이러스, 간염 GB 바이러스, 구제역 바이러스(Foot and mouth disease virus), 인간 엔테로바이러스 71(Human enterovirus 71), 말 비염 바이러스(Equine rhinitis virus), 엑트로피스 오블리쿠아 피코르나-유사 바이러스(Ectropis obliqua picorna-like virus), 뇌심근염 바이러스(Encephalomyocarditis virus), 초파리 C 바이러스(Drosophila C Virus), 인간 콕사키바이러스 B3(Human coxsackievirus B3), 크루시퍼 토바모바이러스(Crucifer tobamovirus), 귀뚜라미 마비병 바이러스(Cricket paralysis virus), 소 바이러스성 설사 바이러스 1(Bovine viral diarrhea virus 1), 블랙 퀸 세포 바이러스(Black Queen Cell Virus), 진딧물 치명 마비 바이러스(Aphid lethal paralysis virus), 조류 뇌척수염 바이러스(Avian encephalomyelitis virus), 급성 벌 마비 바이러스(Acute bee paralysis virus), 히비스커스 위황병 원형반점 바이러스(Hibiscus chlorotic ringspot virus), 돼지 열병 바이러스(Classical swine fever virus), 인간 FGF2, 인간 SFTPA1, 인간 AML1/RUNX1, 초파리 안테나페디아(Drosophila antennapedia), 인간 AQP4, 인간 AT1R, 인간 BAG-1, 인간 BCL2, 인간 BiP, 인간 c-IAPl, 인간 c-myc, 인간 eIF4G, 마우스 NDST4L, 인간 LEF1, 마우스 HIF1 알파, 인간 n.myc, 마우스 Gtx, 인간 p27kipl, 인간 PDGF2/c-sis, 인간 p53, 인간 Pim-1, 마우스 Rbm3, 초파리 리퍼(Drosophila reaper), 캐닌 스캠퍼(Canine Scamper), 초파리 Ubx, 인간 UNR, 마우스 UtrA, 인간 VEGF-A, 인간 XIAP, 털없는 초파리(Drosophila hairless), 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) TFIID, 에스. 세레비지애 YAP1, 담배 식각 바이러스(tobacco etch virus), 터닙 주름 바이러스(turnip crinkle virus), EMCV-A, EMCV-B, EMCV-Bf, EMCV-Cf, EMCV pEC9, 피코비르나바이러스, HCV QC64, 인간 코사바이러스(Human Cosavirus) E/D, 인간 코사바이러스 F, 인간 코사바이러스 JMY, 리노바이러스(Rhinovirus) NAT001, HRV14, HRV89, HRVC-02, HRV-A21, 살리바이러스(Salivirus) A SH1, 살리바이러스 FHB, 살리바이러스 NG-J1, 인간 파레코바이러스(Human Parechovirus) 1, 크로히바이러스(Crohivirus) B, Yc-3, 로사바이러스(Rosavirus) M-7, 산바바이러스(Shanbavirus) A, 파시바이러스(Pasivirus) A, 파시바이러스 A 2, 에코바이러스(Echovirus) E14, 인간 파레코바이러스(Human Parechovirus) 5, 아이치 바이러스(Aichi Virus), A형 간염 바이러스 HA16, 포피바이러스(Phopivirus), CVA10, 엔테로바이러스(Enterovirus) C, 엔테로바이러스 D, 엔테로바이러스 J, 인간 페기바이러스(Human Pegivirus) 2, GBV-C GT110, GBV-C K1737, GBV-C 아이오와(Iowa), 페기바이러스(Pegivirus) A 1220, 파시바이러스(Pasivirus) A 3, 사펠로바이러스(Sapelovirus), 로사바이러스(Rosavirus) B, 바쿤사(Bakunsa) 바이러스, 트레모바이러스(Tremovirus) A, 돼지 파시바이러스(Swine Pasivirus) 1, PLV-CHN, 파시바이러스 A, 시시니바이러스(Sicinivirus), 헤파시바이러스(Hepacivirus) K, 헤파시바이러스 A, BVDV1, 보더병 바이러스(Border Disease Virus), BVDV2, CSFV-PK15C, SF573 디시스트로바이러스(Dicistrovirus), 후베이 피코르나-유사 바이러스(Hubei Picorna-like Virus), CRPV, 살리바이러스 A BN5, 살리바이러스 A BN2, 살리바이러스 A 02394, 살리바이러스 A GUT, 살리바이러스 A CH, 살리바이러스 A SZ1, 살리바이러스 FHB, CVB3, CVB1, 에코바이러스 7, CVB5, EVA71, CVA3, CVA12, EV24 또는 eIF4G에 대한 압타머로부터의 IRES의 서열을 갖는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  81. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 자연 뉴클레오타이드로 이루어진, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  82. 제1항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 서열은 코돈 최적화된, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 등가의 사전 최적화된 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 적어도 하나의 마이크로RNA 결합 부위가 결여되도록 최적화된, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  84. 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 등가의 사전 최적화된 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 적어도 하나의 엔도뉴클레아제 민감성 부위가 결여되도록 최적화된, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  85. 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 등가의 사전 최적화된 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 적어도 하나의 RNA-편집 민감성 부위가 결여되도록 최적화된, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  86. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 약 100개 뉴클레오타이드 내지 약 15킬로베이스 길이인, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  87. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 20시간의 인간에서의 생체내 치료 효과 기간을 갖는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  88. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 20시간의 기능성 반감기를 갖는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  89. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 발현 서열을 포함하는 등가의 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 인간 세포에서의 치료 효과 기간보다 더 크거나 동일한 인간 세포에서의 치료 효과 기간을 갖는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  90. 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 발현 서열을 포함하는 등가의 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 인간 세포에서의 기능성 반감기보다 더 크거나 동일한 인간 세포에서의 기능성 반감기를 갖는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  91. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 발현 서열을 갖는 등가의 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 인간에서의 생체내 치료 효과 기간보다 더 큰 인간에서의 생체내 치료 효과 기간을 갖는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  92. 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 발현 서열을 갖는 등가의 선형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 인간에서의 생체내 기능성 반감기보다 큰 인간에서의 생체내 기능성 반감기를 갖는, 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드.
  93. 약제학적 조성물로서, 제1항 내지 제92항 중 어느 한 항의 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드, 나노입자 및 선택적으로, 상기 나노입자에 작동 가능하게 연결된 표적화 모이어티를 포함하는, 약제학적 조성물.
  94. 제93항에 있어서, 상기 나노입자는 지질 나노입자, 코어-쉘 나노입자, 생분해성 나노입자, 생분해성 지질 나노입자, 중합체 나노입자 또는 생분해성 중합체 나노입자인, 약제학적 조성물.
  95. 제93항 또는 제94항에 있어서, 표적화 모이어티를 포함하되, 상기 표적화 모이어티는 세포 단리 또는 정제의 부재 하에서 수용체-매개된 엔도사이토시스 또는 선택된 세포 집단 또는 조직의 선택된 세포 내로의 직접 융합을 매개하는, 약제학적 조성물.
  96. 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자에 작동 가능하게 연결된 표적화 모이어티를 포함하는, 약제학적 조성물.
  97. 제93항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 scFv, 나노바디, 펩타이드, 미니바디, 폴리뉴클레오타이드 압타머, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 이의 단편인, 약제학적 조성물.
  98. 제93 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중의 상기 폴리뉴클레오타이드의 1중량% 미만은 이중 가닥 RNA, DNA 스플린트 또는 삼인산화된 RNA인, 약제학적 조성물.
  99. 제93항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물 중의 상기 폴리뉴클레오타이드 및 단백질의 1중량% 미만은 이중 가닥 RNA, DNA 스플린트, 삼인산화된 RNA, 포스파타제 단백질, 단백질 리가제 및 캡핑 효소인, 약제학적 조성물.
  100. 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법으로서, 제1항 내지 제92항 중 어느 한 항의 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드, 나노입자 및 선택적으로, 상기 나노입자에 작동 가능하게 연결된 표적화 모이어티를 포함하는, 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 scFv, 나노바디, 펩타이드, 미니바디, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 이의 단편인, 치료 방법.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, 상기 나노입자는 지질 나노입자, 코어-쉘 나노입자 또는 생분해성 나노입자인, 치료 방법.
  103. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자는 1종 이상의 양이온성 지질, 이온화 가능한 지질 또는 폴리 β-아미노 에스터를 포함하는, 치료 방법.
  104. 제100항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자는 1종 이상의 비-양이온성 지질을 포함하는, 치료 방법.
  105. 제100항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자는 1종 이상의 PEG-변형된 지질, 폴리글루탐산 지질 또는 히알루론산 지질을 포함하는, 치료 방법.
  106. 제100항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자는 콜레스테롤을 포함하는, 치료 방법.
  107. 제100항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자는 아라키돈산 또는 올레산을 포함하는, 치료 방법.
  108. 제100항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 표적화 모이어티를 포함하되, 상기 표적화 모이어티는 선택적으로 세포 선택 또는 정제의 부재 하에서 선택된 세포 집단의 세포 내에서 수용체-매개된 엔도사이토시스를 매개하는, 치료 방법.
  109. 제100항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자는 1종 초과의 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 치료 방법.
  110. 제100항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기　대상체는 급성 림프구성 백혈병; 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia: AML); 포상횡문근육종; B 세포 악성종양; 방광암(예를 들어, 방광 암종); 골암; 뇌암(예를 들어, 수모세포종); 유방암; 항문, 항문관 또는 항문직장의 암; 안암; 간내담관의 암; 관절암; 두부암; 담낭암; 흉막의 암; 코, 비강 또는 중이의 암; 구강암; 음문암; 만성 림프구성 백혈병; 만성 골수성 암; 결장암; 식도암; 자궁경부암; 섬유육종; 위장 카르시노이드 종양; 두경부암(예를 들어, 두경부 편평　세포 암종); 호지킨 림프종; 하인두암; 신장암; 후두암; 백혈병; 액체 종양; 간암; 폐암(예를 들어, 비소세포 폐 암종 및 폐 선암종); 림프종; 중피종; 비만세포종; 흑색종; 다발성 골수종; 코인두암; 비호지킨 림프종; B-만성 림프구성 백혈병; 털세포 백혈병; 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukemia: ALL); 버킷 림프종, 난소암; 췌장암; 복막암; 대망(omentum)암; 장간막암; 인두암; 전립선암; 직장암; 신장암; 피부암; 소장암; 연조직암; 고형 종양; 활막 육종; 위암; 고환암; 갑상선암; 및 요관암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 갖는, 치료 방법.
  111. 제100항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 경피증, 그레이브스병, 크론병, 쇼그렌병, 다발성 경화증, 하시모토병, 건선, 중증 근무력증, 자가면역 다발성 내분비병증 증후군(autoimmune polyendocrinopathy syndrome), 제I형 당뇨병(TIDM), 자가면역 위염, 자가면역 포도막염, 다발성근염, 대장염, 갑상선염 및 인간 루푸스로 대표되는 전신성 자가면역 질환(generalized autoimmune diseases typified by human Lupus)으로부터 선택되는 자가면역 장애를 갖는, 치료 방법.
  112. 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드의 제조를 위한 벡터로서, 상기 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드는 다음 순서로, 5' 듀플렉스 형성 영역, 3' 그룹 I 인트론 단편, 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 제1 발현 서열, 제2 발현 서열, 5' 그룹 I 인트론 단편 및 3' 듀플렉스 형성 영역을 포함하는, 벡터.
  113. 제112항에 있어서, 상기 제1 발현 서열과 상기 제2 발현 서열 사이에 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 벡터.
  114. 제112항 또는 제113항에 있어서, 상기 절단 부위는 자가-절단 스페이서인, 벡터.
  115. 제112항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가-절단 스페이서는 2A 자가-절단 펩타이드, 벡터.
  116. 제112항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 듀플렉스 형성 영역과 상기 3' 그룹 I 인트론 단편 사이의 제1 스페이서 및 상기 5' 그룹 I 인트론 단편과 상기 3' 듀플렉스 형성 영역 사이의 제2 스페이서를 포함하는, 벡터.
  117. 제112항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 스페이서 및 상기 제2 내부 스페이서는 각각 약 5 내지 약 60개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는, 벡터.
  118. 제112항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 스페이서 및 제2 스페이서스페이서 각각은 적어도 5개 뉴클레오타이드 길이의 비구조화된 영역을 포함하는, 벡터.
  119. 제112항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 스페이서 및 제2 스페이서스페이서 각각은 적어도 7개 뉴클레오타이드 길이의 구조화된 영역을 포함하는, 벡터.
  120. 제112항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 듀플렉스 형성 영역 및 제2 듀플렉스 형성 영역 각각은 약 9 내지 50개 뉴클레오타이드 길이를 갖는, 벡터.
  121. 제112항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 코돈 최적화된, 벡터.
  122. 제112항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 등가의 사전-최적화 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 적어도 하나의 마이크로RNA 결합 부위가 결여된, 벡터.
  123. 제1항 내지 제92항 중 어느 한 항에 따른 원형 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 진핵 세포.
  124. 제123항에 있어서, 상기 진핵 세포는 인간 세포인, 진핵 세포.
  125. 제124항에 있어서, 상기 진핵 세포는 면역 세포인, 진핵 세포.
  126. 제125항에 있어서, 상기 진핵 세포는 T 세포인, 진핵 세포.
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