CN114349811A - 阳离子胆固醇衍生物、纳米复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

阳离子胆固醇衍生物、纳米复合物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN114349811A CN202210009042.6A CN202210009042A CN114349811A CN 114349811 A CN114349811 A CN 114349811A CN 202210009042 A CN202210009042 A CN 202210009042A CN 114349811 A CN114349811 A CN 114349811A
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陈剑
朱照远
张莉
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Abstract

本发明提供一种阳离子胆固醇衍生物、纳米复合物及其制备方法和应用，具体涉及一种阳离子脂质类基因转染试剂，特别是涉及一种含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物合成、纳米复合物制备方法和其作为高效基因载体用于小分子干扰RNA(siRNA)和microRNA转染试剂的应用；本发明提供的含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物选择了最适于siRNA结合的Linker链长，且本发明所提供的纳米复合物优选的采用微流控技术，对多种参数进行系统优化(包括总流速、流速比、缓冲体系、芯片结构等)，形成稳定的纳米复合物，无需辅助脂质即可实现高效的基因递送能力。

Description

阳离子胆固醇衍生物、纳米复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及阳离子脂质类基因转染试剂，具体涉及一种阳离子胆固醇衍生物、纳米复合物及其制备方法和应用，特别涉及一种含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物、及纳米复合物及其制备方法和其作为高效基因载体用于小分子干扰RNA(siRNA)、microRNA转染试剂的应用。
背景技术
构建生物相容性好、基因稳定、转染效率高的基因传递系统是当前研究的热点之一。随着基因治疗和基因药物的成功应用，非病毒载体可能推动基因传递系统的进一步创新。近年来，用于基因传递的非病毒载体发展迅速，其中各种阳离子脂质和阳离子聚合物被报道为有前途的纳米载体。胆固醇是一种重要的天然脂质，经常参与许多重要的生物过程，如膜形成、脂质运输、代谢等。胆固醇是构建功能性基因载体最常用的类固醇脂质之一。由于羟基赋予胆固醇可修饰性，因此多项研究合成了多种胆固醇衍生物，使其凭借卓越的特性，以利于基因载体，如水溶性、正电荷和柔韧性。其中，阳离子胆固醇衍生物成为焦点，其中胆固醇作为疏水位点发挥作用，阳离子头作为基因结合位点发挥作用，包括结合pDNA、siRNA和microRNA。阳离子聚合物、肽、氨基酸等可以作为阳离子头，通过易断裂或稳定的连接物与胆固醇结合。先前的研究表明，多种胆固醇衍生的阳离子脂质具有很高的潜力。胆固醇封端的乙醇胺-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)(Adv Sci(Weinh)2019,6,1900023)、胆固醇取代聚乙烯亚胺(J Biomed Mater Res A 2020,108,565580)、多肽模拟物修饰的胆固醇(Molecules 2019,24)均能有效地传递pDNA、siRNA、microRNA。然而多数合成胆固醇类阳离子脂质用于RNA转染的效果不尽如人意，尤其是在血清环境中的转染效果大打折扣。因此，进一步研究阳离子胆固醇衍生物作为基因递送载体，特别是siRNA、microRNA载体的生物材料是可行且有价值的。研究和开发生物相容性高、转染效率高、细胞毒性低的阳离子胆固醇衍生物，进一步拓宽其作为核酸药物载体的应用，对于开发具有我国自主知识产权的生物功能载体材料具有重要意义，也是本发明致力于解决的目标。
中国专利CN201310138995.3提供一种含有天然胆固醇和赖氨酸的类脂质功能分子，合成方法简单且效率高，其与辅助脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)复合形成的脂质体制备方法简便，易实现规模化制备。然而，其仍有下述缺陷：(1)其在基因转染制剂的应用无法脱离辅助脂质的帮助。根据实施例，单独使用类脂质功能分子几乎无基因沉默效果，而仅在与DOPE复合后表现出一定的基因沉默效果。(2)同样未能提供一种稳定可控的制备方法。该在先专利中的类脂质功能分子的Linker链长较短，与siRNA结合的稳定性可能有所欠缺，所以需要辅助脂质。而本发明的一种含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物选择了最适于siRNA结合的Linker链长，确保该单一脂质能与siRNA形成稳定的纳米复合物，无需辅助脂质即可实现高效的基因递送能力。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明旨在提供一种阳离子胆固醇衍生物、纳米复合物及其制备方法和应用，本发明提供的含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物选择了最适于siRNA结合的Linker链长，确保该单一脂质能与siRNA形成稳定的纳米复合物，无需辅助脂质即可实现高效的基因递送能力。
<第一方面>
本发明提供一种含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物，其化学结构可由通式(Ⅰ)表示：
Figure BDA0003456656440000021
上式结构中，连接基团Linker选自：-(CH2)6-或-(CH2)7-，A-表示阴离子反离子部分：氯负离子、磷酸根负离子、甲磺酸根负离子或三氟乙酸根负离子。
本发明连接基团Linker选自：-(CH2)6-或-(CH2)7-，选择了最适于siRNA结合的Linker链长，确保该单一脂质能与siRNA形成稳定的纳米复合物，无需辅助脂质即可实现高效的基因递送能力。
<第二方面>
本发明还提供上述所述的含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物的合成方法，包括如下步骤：
S1：将烷基二醇溶于充分脱水干燥的有机溶剂中，在碱催化下缓慢滴加到事先溶于有机溶剂的胆固醇氯甲酸酯中，于0-50℃搅拌反应12-24h，得到中间体胆固醇单取代二醇碳酸酯；
S2：将BOC保护的天然赖氨酸砌块化合物溶于脱水干燥的有机溶剂中，在碱催化下缓慢滴加到溶于有机溶剂的S1制备所得的中间体胆固醇单取代二醇碳酸酯中，加入缩合剂后于0-50℃搅拌反应12-24h，去除有机溶剂，进行柱层析；然后产品溶于过量酸中室温搅拌反应1-2h，加醚沉淀后过滤干燥得到含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物。
步骤S1中，碱、烷基二醇、胆固醇氯甲酸酯的摩尔比为0.05-0.1：4.0-6.0：1.0。
步骤S2中，BOC保护的天然赖氨酸与中间体胆固醇单取代二醇碳酸酯的摩尔比为1.0：1.0-1.5。
所述烷基二醇为1,6-己二醇，1,7-庚二醇。
上述制备步骤中，有机溶剂选自乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯、甲苯中的一种或几种；
所述的碱为吡啶；
所述的缩合剂选自二环己基碳二亚胺、二异内基碳二亚胺、羰基二咪唑中的一种或多种；
所述过量酸为盐酸、磷酸、甲磺酸或三氟乙酸；
所述醚为乙醚；
所述BOC为碳酸二叔丁酯。
<第三方面>
本发明还请求保护所述天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物的应用。
所述应用是将所述天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物作为核酸药物的基因递送载体。
<第四方面>
本发明还提供一种纳米复合物，所述纳米复合物的制备方法为：将上述的天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物，与核酸药物在水相中快速混合，制备成所述纳米复合物。
所述阳离子胆固醇衍生物中带正电氮原子：核酸药物中磷原子比为10-20：1；所述水相选自去离子水、磷酸盐缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、氯化钠中的一种或几种；所述的快速混合为涡旋混合或微流控混合。
涡旋混合具体为：将所述的天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物的水溶液置于涡旋混合器上，随后缓慢滴加核酸药物溶液，涡旋混合器转速为1500-2000转/分，涡旋持续时长15-20秒，转速过低，液体不能完全形成涡流状而导致加入的核酸药物溶液不能及时分散；转速过高时，会导致核酸药物与胆固醇衍生物接触时间过短；涡旋持续时间过短，不能完全将核酸药物溶液与胆固醇衍生物水溶液混合均匀；涡旋持续时间过长，会导致核酸药物结构破坏。
微流控法具体为：将所述的天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物的溶液和核酸药物的溶液分别载入微流控泵的两个注射管内，微流控注射泵的总流速为200-3600μL/min，流速比(核酸药物水溶液:胆固醇衍生物水溶液)为1-9：1，体积为0.2mL-20mL。
优选的，流速比(核酸药物水溶液:胆固醇衍生物水溶液)为9：1。
进一步，微流控注射泵的总流速为1200μL/min。纳米颗粒的循环停留时间、细胞摄取、转染效率和毒性都在一定程度上取决于物理化学属性，如大小、稳定性、电荷，不同大小的纳米颗粒会通过不同途径进入细胞，其在胞内的命运也大不相同，粒径过大的纳米颗粒(如>300纳米)会被细胞排出；纳米颗粒的带电情况也会影响胞内进程，带正电的纳米颗粒容易穿过细胞膜，并实现溶酶体逃逸；因此要求对基因转染制剂的物化属性有更准确的把控。脂质复合物的形成主要通过静电吸附、电荷中和，是一个在毫秒内发生的过程。而传统的制备方法，如整体混合，超声法不能满足在毫秒内的有效把控，导致其再现性和稳定性不足，本发明通过对多种参数进行系统优化(包括总流速、流速比、缓冲体系、芯片结构等)，形成稳定的纳米复合物，无需辅助脂质即可实现高效的基因递送能力。
进一步，所述纳米复合物的制备方法具体为：
在无酶处理的离心管中称取上述合成得到的含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物，用无酶处理的水相溶解为1-10mg/mL；将核酸药物粉末用无酶处理的水相溶解为2-10μmol/L。将两者按不同氮磷比(N/P)快速混合，静置30分钟；所述N/P比为阳离子胆固醇衍生物中带正电氮原子：核酸药物中磷原子＝10-20；所述水相选自去离子水、10mmol/L磷酸盐缓冲液、10mmol/L 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、0.9％氯化钠。
所述核酸药物包括siRNA或microRNA。
所述的纳米复合物作为基因递送载体的应用也属于本发明的保护范围。
包含所述纳米复合物的药物制剂也属于本发明的保护范围。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供一种含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物，连接基团Linker选自：-(CH2)6-或-(CH2)7-，Chol-6C-Lys，Chol-7C-Lys最适合用于siRNA递送；是因为其有最适的灵活度，能满足与siRNA充分结合，并且结合后具有很好的稳定性；而Chol-4C-Lys、Chol-5C-Lys对siRNA的结合能力降低；而选择Chol-8C-Lys时，因为碳链过长，阴离子血清蛋白与siRNA的竞争效率更高，影响siRNA与基因载体Chol-8C-Lys的结合，导致在有血清环境下基因转染效率下降；
2、本发明还提供了一种制备siRNA纳米复合物的方法，该方法通过控制总流速、流速比等参数，利用微流控技术，制备得到粒径均一可控的siRNA纳米制剂；能包载siRNA并形成稳定的纳米制剂，实现高效的基因沉默效果，在低血清环境下仍有显著的转染效果；
3、本发明的应用表明，纳米复合物在体外保护siRNA免于降解，抵抗血清蛋白的干扰，并能将siRNA递送至胞质；
4、本发明的阳离子胆固醇衍生物无需与DOPE等脂质混合使用，在水相中即可一步形成纳米复合物，原料简单，制备方便，易于实现低成本规模化制备；
5、本发明中所提供的一种含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物，与已有商品化的枝化分子结构聚乙烯亚胺相比具有显著降低的细胞毒性；与已有商品化的lipofectamine2000基因转染试剂相比，在无血清和低血清环境下都具有更高的siRNA转染效率。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为微流控法的总流速对纳米复合物粒径和PDI的影响；
图2为微流控法的流速比对纳米复合物粒径和PDI的影响；
图3为实施例1和对比例1对siRNA结合稳定性的评价；
图4为验证例4中Notch1 siRNA的转染效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
Figure BDA0003456656440000061
阳离子胆固醇衍生物Chol-6C-Lys的制备
第一步：将1,6-己二醇(23.6g，0.2mol)溶于80mL充分脱水干燥的二氯甲烷中，缓慢滴加至含有0.4mL吡啶的溶于200mL干燥二氯甲烷的胆固醇氯甲酸酯(22.4g，0.05mol)中，于45℃搅拌反应24h后蒸馏除去二氯甲烷，经过柱层析后得到中间体胆固醇单取代己二醇碳酸脂中间体。合成产率为74％。
第二步：将BOC(碳酸二叔丁酯)保护的L-赖氨酸(7.3g，0.05mol)溶于100mL脱水干燥的二氯甲烷中，在吡啶的催化下缓慢滴加到溶于二氯甲烷的第一步骤制备所得的中间体胆固醇单取代己二醇中，加入二环己基碳二亚胺(DCC)缩合剂(8g，0.04mol)后于0℃搅拌反应24h，蒸馏除去二氯甲烷，进行柱层析；然后产品溶于50mL三氟乙酸中室温搅拌反应2h，加乙醚沉淀后过滤干燥得到一种含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物Chol-6C-Lys。合成产率为63％。
1H NMR(d-CD3Cl，400MHz)：8.42(b,H,NH3+)，7.78(b，H，NH3+)，4.00(t,2H,CH2OCO)，1.00(s，3H，CH3，胆固醇)ESI-MS：[M+]＝659.5m/z
实施例2
微流控法制备siRNA/Chol-6C-Lys纳米复合物。
1、试剂制备
无酶处理的水相：将5毫升去离子水用DEPC处理，使其里面不含RNA酶。
2、纳米复合物制备
在无酶处理的离心管中称取实施例1合成得到的含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物Chol-6C-Lys，用无酶处理的水相溶解成衍生物溶液，其中衍生物溶液中Chol-6C-Lys的浓度为2.5mg/mL；将siRNA粉末用无酶处理的水相溶解，制备成至siRNA浓度为8μmol/L的siRNA溶液。在微流控泵的两个注射管内分别载入上述一种衍生物溶液和一种核酸药物溶液。微流控注射泵的总流速为200μL/min，流速比为1，制备体积为2mL。所述的混合比例为N/P比(阳离子胆固醇衍生物中带正电氮原子：核酸药物中磷原子)＝10。得到含有胆固醇和赖氨酸的阳离子胆固醇衍生物的纳米复合物。
表1.siRNA/Chol-6C-Lys纳米复合物的粒径、PDI及电位。
N/P 粒径(nm) PDI Zeta电位(mV)
10 224.4 0.273 15.9
表1结果表明，含有胆固醇和赖氨酸的阳离子胆固醇衍生物Chol-6C-Lys可以用于制备带正电荷的、粒径均一的siRNA纳米复合物。
实施例3
microRNA/Chol-6C-Lys纳米复合物制备过程。
1、试剂制备
无酶处理的水相：将5毫升10mmol/L磷酸盐缓冲液用DEPC处理，使其里面不含RNA酶。
2、纳米复合物制备
在无酶处理的离心管中称取实施例1合成得到的含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物Chol-6C-Lys，用无酶处理的水相溶解成衍生物溶液，其中衍生物溶液中Chol-6C-Lys的浓度为5mg/mL；将microRNA粉末用无酶处理的水相溶解，制备成浓度为8μmol/L的microRNA溶液。取500μL阳离子胆固醇衍生物溶液于离心管中，置于涡旋混合器上，随后缓慢滴加500μL的microRNA溶液，涡旋混合器转速为2000转/分，涡旋持续时长20秒，静置30分钟。所述的混合比例为N/P比(阳离子胆固醇衍生物中带正电氮原子：核酸药物中磷原子)＝20。得到含有胆固醇和赖氨酸的阳离子胆固醇衍生物的纳米复合物。
表2.microRNA/Chol-6C-Lys纳米复合物的粒径、PDI及电位。
Figure BDA0003456656440000071
Figure BDA0003456656440000081
表2表明含有胆固醇和赖氨酸的阳离子胆固醇衍生物Chol-6C-Lys可以用于制备带正电荷的、粒径均一的microRNA纳米复合物。
实施例4
Figure BDA0003456656440000082
阳离子胆固醇衍生物Chol-7C-Lys的制备
第一步：将1,7-庚二醇(39.7g，0.3mol)溶于100mL充分脱水干燥的四氢呋喃中，缓慢滴加至含有0.4mL吡啶的溶于250mL干燥四氢呋喃的胆固醇氯甲酸酯(22.4g，0.05mol)中，于50℃搅拌反应24h后蒸馏除去二氯甲烷，经过柱层析后得到中间体胆固醇单取代庚二醇碳酸脂中间体。合成产率为67％。
第二步：将BOC(碳酸二叔丁酯)保护的L-赖氨酸(7.3g，0.05mol)溶于100mL脱水干燥的四氢呋喃中，在吡啶的催化下缓慢滴加到溶于四氢呋喃的第一步骤制备所得的中间体胆固醇单取代庚二醇中，加入DCC缩合剂(8g，0.04mol)后于0℃搅拌反应24h，蒸馏除去四氢呋喃，进行柱层析；然后产品溶于50mL三氟乙酸中室温搅拌反应2h，加乙醚沉淀后过滤干燥得到一种含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物Chol-7C-Lys。合成产率为58％。
1H NMR(d-CD3Cl，400MHz)：8.42(b,H,NH3+)，7.78(b，H，NH3+)，3.98(t,2H,CH2OCO)，1.00(s，3H，CH3，胆固醇)
ESI-MS：[M+]＝673.5m/z
实施例5
siRNA/Chol-7C-Lys纳米复合物制备过程。
1、试剂制备
无酶处理的水相：将5毫升10mmol/L 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸用DEPC处理，使其里面不含RNA酶。
2、纳米复合物制备
在无酶处理的离心管中称取实施例4合成得到的含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物Chol-7C-Lys，用无酶处理的水相溶解成衍生物溶液，其中衍生物溶液中Chol-7C-Lys的浓度为2.8mg/mL；将siRNA粉末用无酶处理的水相溶解，制备成至siRNA浓度为8μmol/L的siRNA溶液。在微流控泵的两个注射管内分别载入上述一种衍生物溶液和一种核酸药物溶液。微流控注射泵的总流速为3600μL/min，流速比为9，制备体积为2mL。所述的混合比例为N/P比(阳离子胆固醇衍生物中带正电氮原子：核酸药物中磷原子)＝10。得到含有胆固醇和赖氨酸的阳离子胆固醇衍生物的纳米复合物。
表3.siRNA/Chol-7C-Lys纳米复合物的粒径、PDI及电位。
N/P 粒径(nm) PDI Zeta电位(mV)
10 210.0 0.223 18.2
表3表明含有胆固醇和赖氨酸的阳离子胆固醇衍生物Chol-7C-Lys可以用于制备带正电荷的、粒径均一的siRNA纳米复合物。
实施例6
microRNA/Chol-7C-Lys纳米复合物制备过程。
1、试剂制备
无酶处理的水相：将5毫升0.9％氯化钠用DEPC处理，使其里面不含RNA酶。
2、纳米复合物制备
在无酶处理的离心管中称取实施例4合成得到的含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物Chol-7C-Lys，用无酶处理的水相溶解成衍生物溶液，其中衍生物溶液中Chol-7C-Lys的浓度为5.6mg/mL；将microRNA粉末用无酶处理的水相溶解，制备成浓度为8μmol/L的microRNA溶液。取500μL阳离子胆固醇衍生物溶液于离心管中，置于涡旋混合器上，随后缓慢滴加500μL的microRNA溶液，涡旋混合器转速为1800转/分，涡旋持续时长20秒，静置30min。所述的混合比例为N/P比(阳离子胆固醇衍生物中带正电氮原子：核酸药物中磷原子)＝20。得到含有胆固醇和赖氨酸的阳离子胆固醇衍生物的纳米复合物。
表4.microRNA/Chol-7C-Lys纳米复合物的粒径、PDI及电位。
N/P 粒径(nm) PDI Zeta电位(mV)
2 1382.4 0.509 -14.2
4 753.3 0.421 -12.8
6 513.2 0.221 -7.3
8 342.2 0.228 5.6
10 212.4 0.212 15.3
12 176.3 0.212 18.4
15 166.2 0.207 22.1
20 152.3 0.206 24.5
表4说明含有胆固醇和赖氨酸的阳离子胆固醇衍生物Chol-7C-Lys可以用于制备带正电荷的、粒径均一的microRNA纳米复合物。
实施例7
微流控法制备siRNA/Chol-6C-Lys纳米复合物的优化
1、试剂制备
无酶处理的水相：将500mL去离子水用DEPC处理，使其里面不含RNA酶。
2、微流控法制备纳米复合物
称取实施例1合成得到的含天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物Chol-6C-Lys，用无酶处理的水相溶解成衍生物溶液，其中衍生物溶液中Chol-6C-Lys的浓度根据N/P比不同在2-6mg/mL之间，siRNA粉末用无酶处理的水相溶解为8μmol/L。分别将上述两种溶液载入微流控泵的两个注射管内，微流控注射泵的总流速为200-3600μL/min，流速比为1-9：1，制备体积为20mL。
从表5中可知，当控制总流速为1.2ml/min，流速比设定为9时，改变N/P可以得到粒径在100-200nm的纳米复合物(N/P＝10-20)，PDI在0.1以内。与实施例2相比，微流控法可以制备粒径更小、分散性更好的siRNA纳米复合物。如图1和图2，图1表明在200-3600μL/min范围内，1200μL/min条件下形成的纳米复合物既有200nm以内的粒径，也有最佳的PDI。说明最佳选择为总流速1200μL/min。图2表明流速比为siRNA水溶液，与Chol-6C-Lys衍生物水溶液的流速之比。在流速比9：1时，形成的纳米复合物具有最小的粒径和PDI，为最佳流速比。
表5.微流控技术制备的siRNA/Chol-6C-Lys纳米复合物的粒径、PDI及电位。
Figure BDA0003456656440000101
Figure BDA0003456656440000111
表5说明在微流控技术的控制下，含有胆固醇和赖氨酸的阳离子胆固醇衍生物Chol-6C-Lys与siRNA可以大批量地形成粒径可控、分散性极好的纳米复合物，为这种核酸药物制剂的生产提供支撑。
实施例8
微流控法制备microRNA/Chol-7C-Lys纳米复合物的优化
1、试剂制备
无酶处理的水相：将500mL10mmol/L 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液用DEPC处理，使其里面不含RNA酶。
2、微流控法制备纳米复合物
称取实施例4合成得到的含天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物Chol-7C-Lys，用无酶处理的水相溶解成衍生物溶液，其中衍生物溶液中Chol-7C-Lys的浓度根据N/P比不同在2-6mg/mL之间，microRNA用无酶处理的水相溶解为8μmol/L。分别将上述两种溶液载入微流控泵的两个注射管内，微流控注射泵的总流速为1200μL/min，流速比为9，制备体积为20mL。
由表6可知，含天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物Chol-7C-Lys能与microRNA结合形成纳米复合物，与实施例3相比，微流控法可以制备粒径更小、分散性更好的siRNA纳米复合物，粒径在100-200nm(N/P＝10-20)，PDI在0.1左右。
表6.微流控技术制备的microRNA/Chol-7C-Lys纳米复合物的粒径、PDI及电位。
N/P 粒径(nm) PDI Zeta电位(mV)
10 191.0 0.104 22.3
12 172.0 0.101 23.0
15 147.5 0.100 26.3
20 137.3 0.106 27.1
本实施例说明在微流控技术的控制下，含有胆固醇和赖氨酸的阳离子胆固醇衍生物Chol-7C-Lys与microRNA可以大批量地形成粒径可控、分散性极好的纳米复合物，为这种核酸药物制剂的生产提供支撑。
对比例1
Chol-4C-Lys
Figure BDA0003456656440000121
阳离子胆固醇衍生物Chol-4C-Lys的制备
第一步：将丁二醇(9.6g，0.1mol)溶于50mL充分脱水干燥的二氧六环中，缓慢滴加至含有0.2mL吡啶的溶于50mL干燥二氧六环的胆固醇对甲苯磺酸酯中，于40℃搅拌反应24h后蒸馏除去二氧六环，经过柱层析后得到中间体胆固醇单取代丁二醇碳酸脂中间体。合成产率为71％。
第二步：将BOC(碳酸二叔丁酯)保护的L-赖氨酸(3.5g，0.01mol)溶于50mL脱水干燥的四氢呋喃中，在吡啶的催化下缓慢滴加到溶于四氢呋喃的第一步骤制备所得的中间体胆固醇单取代丁二醇中，加入DCC缩合剂(4g，0.02mol)后于20℃搅拌反应24h，蒸馏除去四氢呋喃，进行柱层析；然后产品溶于50mL三氟乙酸中室温搅拌反应2h，加乙醚沉淀后过滤干燥得到一种含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物Chol-4C-Lys。合成产率为75％。
1H NMR(d-CD3COCD3，300MHz)：8.12(b,H,NH3+)，7.81(b，H，NH3+)，5.33(s,1H,C＝CH，胆固醇)，4.55(t,2H,CH2OCO)，1.00(s，3H，CH3，胆固醇)ESI-MS：[M+]＝631.5m/z
对比例2
Chol-5C-Lys
Figure BDA0003456656440000122
阳离子胆固醇衍生物Chol-5C-Lys的制备。
第一步：将戊二醇(12.2g，0.1mol)溶于30mL充分脱水干燥的乙酸乙酯中，缓慢滴加至含有0.2mL吡啶的溶于100mL干燥乙酸乙酯的胆固醇氯甲酸酯中，于40℃搅拌反应12h后蒸馏除去乙酸乙酯，经过柱层析后得到中间体胆固醇单取代戊二醇碳酸脂中间体。合成产率为67％。
第二步：将BOC(碳酸二叔丁酯)保护的L-赖氨酸(3.5g，0.01mol)溶于50mL脱水干燥的三氯甲烷中，在吡啶的催化下缓慢滴加到溶于三氯甲烷的第一步骤制备所得的中间体胆固醇单取代戊二醇中，加入DCC缩合剂(4g，0.02mol)后于10℃搅拌反应24h，蒸馏除去三氯甲烷，进行柱层析；然后产品溶于40mL三氟乙酸中室温搅拌反应2h，加乙醚沉淀后过滤干燥得到一种含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物Chol-5C-Lys。合成产率为73％。
1H NMR(d-CD3COCD3，300MHz)：8.11(b,H,NH3+)，7.81(b，H，NH3+)，5.30(s,1H,C＝CH，胆固醇)，4.54(t,2H,CH2OCO)，1.00(s，3H，CH3，胆固醇)ESI-MS：[M+]＝646.5m/z
对比例3
Chol-8C-Lys
Figure BDA0003456656440000131
阳离子胆固醇衍生物Chol-8C-Lys的制备
第一步：将辛二醇(14.6g，0.1mol)溶于50mL充分脱水干燥的二氯甲烷中，缓慢滴加至含有0.2mL吡啶的溶于100mL干燥二氯甲烷的胆固醇氯甲酸酯中，于40℃搅拌反应12h后蒸馏除去乙酸乙酯，经过柱层析后得到中间体胆固醇单取代辛二醇碳酸脂中间体。合成产率为63％。
第二步：将BOC(碳酸二叔丁酯)保护的L-赖氨酸(3.5g，0.01mol)溶于50mL脱水干燥的二氯甲烷中，在吡啶的催化下缓慢滴加到溶于二氯甲烷的第一步骤制备所得的中间体胆固醇单取代辛二醇中，加入DCC缩合剂(4g，0.02mol)后于0℃搅拌反应24h，蒸馏除去二氯甲烷，进行柱层析；然后产品溶于20mL三氟乙酸中室温搅拌反应2h，加乙醚沉淀后过滤干燥得到一种含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物Chol-8C-Lys。合成产率为58％。
1H NMR(d-CD3COCD3，300MHz)：8.12(b,H,NH3+)，7.80(b，H，NH3+)，5.27(s,1H,C＝CH，胆固醇)，3.96(t,2H,CH2OCO)，1.00(s，3H，CH3，胆固醇)ESI-MS：[M+]＝687.5m/z
对比例4
脂质体Chol-4C-Lys-DOPE的制备
在250mL圆底烧瓶中称取对比例1中的Chol-4C-Lys(63.3mg，0.1mmol)，加入摩尔比为1：1的二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，充分溶解于无水乙醇中。在旋转蒸发仪中40℃下除去乙醇，瓶底形成均匀的脂质薄膜。加入25mL去离子水，超声水化1h后得到脂质体Chol-4C-Lys-DOPE。
对比例5
脂质体Chol-5C-Lys-DOPE的制备
在250mL圆底烧瓶中称取对比例2中的Chol-5C-Lys(64.7mg，0.1mmol)，加入摩尔比为1：1的DOPE，充分溶解于无水乙醇中。在旋转蒸发仪中40℃下除去乙醇，瓶底形成均匀的脂质薄膜。加入25mL去离子水，超声水化1h后得到脂质体Chol-5C-Lys-DOPE。
对比例6
脂质体Chol-6C-Lys-DOPE的制备
在250mL圆底烧瓶中称取实施例1中的Chol-6C-Lys(66.1mg，0.1mmol)，加入摩尔比为1：1的DOPE，充分溶解于无水乙醇中。在旋转蒸发仪中40℃下除去乙醇，瓶底形成均匀的脂质薄膜。加入25mL去离子水，超声水化1h后得到脂质体Chol-6C-Lys-DOPE。
对比例7
Chol-7C-Lys-DOPE
脂质体Chol-7C-Lys-DOPE的制备
在250mL圆底烧瓶中称取实施例4中的Chol-7C-Lys(67.5mg，0.1mmol)，加入摩尔比为1：1的DOPE，充分溶解于无水乙醇中。在旋转蒸发仪中40℃下除去乙醇，瓶底形成均匀的脂质薄膜。加入25mL去离子水，超声水化1h后得到脂质体Chol-7C-Lys-DOPE。
对比例8
脂质体Chol-8C-Lys-DOPE的制备
在250mL圆底烧瓶中称取对比例3中的Chol-8C-Lys(68.9mg，0.1mmol)，加入摩尔比为1：1的DOPE，充分溶解于无水乙醇中。在旋转蒸发仪中40℃下除去乙醇，瓶底形成均匀的脂质薄膜。加入25mL去离子水，超声水化1h后得到脂质体Chol-8C-Lys-DOPE。
对比例9
Chol-6C-His
Figure BDA0003456656440000151
阳离子胆固醇衍生物Chol-6C-His的制备
第一步：将己二醇(12.2g，0.1mol)溶于50mL充分脱水干燥的二氯甲烷中，缓慢滴加至含有0.2mL吡啶的溶于100mL干燥二氯甲烷的胆固醇氯甲酸酯中，于40℃搅拌反应12h后蒸馏除去乙酸乙酯，经过柱层析后得到中间体胆固醇单取代辛二醇碳酸脂中间体。合成产率为70％。
第二步：将BOC(碳酸二叔丁酯)保护的L-组氨酸(3.5g，0.01mol)溶于50mL脱水干燥的二氯甲烷中，在吡啶的催化下缓慢滴加到溶于二氯甲烷的第一步骤制备所得的中间体胆固醇单取代己二醇中，加入DCC缩合剂(4g，0.02mol)后于0℃搅拌反应24h，蒸馏除去二氯甲烷，进行柱层析；然后产品溶于20mL三氟乙酸中室温搅拌反应2h，加乙醚沉淀后过滤干燥得到一种含有天然胆固醇骨架和组氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物Chol-6C-His。合成产率为68％。
1H NMR(d-CD3COCD3，300MHz)：9.12(s,1H,Im-H)，7.68(s,1H,Im-H)，5.30(s,1H,C＝CH，胆固醇)，4.54(t,2H,CH2OCO)，1.00(s，3H，CH3，胆固醇)ESI-MS：[M+]＝668.4m/z
验证例1核酸结合能力验证
对实施例1制备的Chol-6C-Lys、实施4制备的Chol-7C-Lys、以及对比例1-9的产物的核酸结合能力进行对比。
主要试验方法如下：
1、分别将实施例1制备的Chol-6C-Lys、实施4制备的Chol-7C-Lys、以及对比例1-9的产物制备成siRNA纳米复合物和microRNA纳米复合物，具体步骤如下：
(1)对于实施例1、4及对比例1-3、9，称取相应制备得到的含天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物，用无酶处理的去离子水溶解成衍生物溶液，其浓度按N/P＝5配制。siRNA和microRNA分别用无酶处理的去离子水溶液溶解为8μmol/L核酸药物溶液。对于每种纳米复合物，在微流控泵的两个注射管内分别载入一种衍生物溶液和一种核酸药物溶液。微流控注射泵的总流速为1200μL/min，流速比为9，制备体积为2mL。制备得到siRNA纳米复合物和microRNA纳米复合物。
(2)对于对比例4-8，将制备得到的脂质体溶液按N/P＝5与siRNA或microRNA混合。取1mL脂质体于离心管中，置于涡旋混合器上，随后缓慢滴加1mL的siRNA或microRNA溶液，涡旋混合器转速为1500转/分，涡旋持续时长15秒，静置30min。制备得到siRNA纳米复合物和microRNA纳米复合物。
2、取步骤1制备的各纳米复合物10μL与RNA上样缓冲液(2μL)混合，并加到含有1‰Gelred的1％(w/v)琼脂糖凝胶上。在TBE缓冲液中，110V下进行20分钟的电泳。在紫外线照射下观察siRNA条带，并使用自动凝胶图像分析系统拍照。用ImageJ对游离条带的亮度进行计算，以相同质量的siRNA的亮度为100％。由于siRNA与胆固醇衍生物或脂质体结合后，从游离态变为结合态，所以游离条带亮度越低，说明结合能力越好。表7可看出在N/P＝5条件下，含天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物实施例1(Chol-6C-Lys)和实施例4(Chol-7C-Lys)几乎能100％结合siRNA和microRNA。而对比例1、2、3对siRNA的结合下降至65-75％，说明6C和7C是最有利于与siRNA结合的链长。对比例6、7分别与实施例1、4相比，结合能力没有差异，而对比例4、5、8比对比例1、2、3的结合能力更好，说明结合DOPE对4C、5C、8C链长的胆固醇衍生物有较大影响。对比例9的结合能力弱于实施例1，即赖氨酸比组氨酸的质子化能力好，导致结合能力更好。
表7.凝胶电泳对核酸结合能力的评价
Figure BDA0003456656440000161
Figure BDA0003456656440000171
验证例2核酸结合稳定性评价
对实施例1和对比例1的核酸结合稳定性进行评价。
主要试验方法如下：
(1)参照实施例7中所述微流控法制备纳米复合物，将实施例1和对比例1合成得到的含天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物Chol-6C-Lys和Chol-4C-Lys，分别与siRNA去离子水溶液混合。
(2)将制备得到的纳米复合物与不同质量比的肝素钠溶液混合(w/w＝0-20)，于37℃孵育1h。
(3)取步骤(2)中的混合液10μL与RNA上样缓冲液(2μL)混合，并加到含有1‰Gelred的1％(w/v)琼脂糖凝胶上。在TBE缓冲液中，110V下进行20分钟的电泳。在紫外线照射下观察siRNA条带，并使用自动凝胶图像分析系统拍照。结果表明，相同肝素钠处理下，Chol-4C-Lys更容易与siRNA脱离，即Chol-4C-Lys与siRNA的结合稳定性比不上Chol-6C-Lys与siRNA的结合。
如图3所示，对于siRNA/Chol-4C-Lys和siRNA/Chol-6C-Lys，相同量的肝素钠处理下，Chol-4C-Lys组的siRNA游离条带更加明显。
验证例3细胞毒性评价
对实施例1制备的Chol-6C-Lys、实施4制备的Chol-7C-Lys、以及对比例1-9的产物的细胞毒性进行评价。
采用CCK8法，主要试验方法如下：将H1299细胞以每孔8*103个细胞的密度接种到96孔培养板中，并在37℃和5％CO2下在100μL DMEM培养基(含10％FBS)中培养24小时。随后，替换新鲜DMEM培养基(含10％FBS)，并将一系列浓度下的含天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物(实施例1和4)及对比例1-9分别添加到孔中。在进一步培养48小时后，每孔添加10μLCCK-8检测试剂，并继续培养1.5小时。用酶标仪(Tecan infinite M200Pro，
Figure BDA0003456656440000181
)检测450nm处的紫外吸收。以市售bPEI-25k作为参比。计算各实施例和对比例中产物的细胞活性抑制率，以IC50表示。IC50越高，说明该产物对细胞的毒性作用越小，越有利于作为基因药物载体。从表8中可以看出各组的细胞毒性均大大低于市售bPEI-25k，说明含天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物是一种低毒性的基因药物载体。
表8.CCK8法检测细胞毒性
组别 细胞活性抑制率(IC50：μg/mL)
PEI25k 5.10
实施例1 68.57
实施例4 63.69
对比例1 67.72
对比例2 62.33
对比例3 59.23
对比例4 69.25
对比例5 66.21
对比例6 70.50
对比例7 64.88
对比例8 70.77
对比例9 65.34
表8中可以看出各组的的细胞毒性均大大低于市售bPEI-25k，说明含天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物是一种低毒性的基因药物载体。
验证例4 siRNA基因载体的转染效果测试
对实施例1的siRNA基因载体的转染效果测试。
本发明实施例1中所述的含天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物Chol-6C-Lys，其纳米复合物siRNA/Chol-6C-Lys的siRNA转染性能亦可采用qRT-PCR法测试，主要试验方法如下：将SKOV3细胞接种在六孔板(2×105细胞/孔)中，培养24小时。将N/P比为15的阳离子胆固醇衍生物Chol-6C-Lys与Notch1 siRNA复合物形成纳米复合物。未经任何处理的SKOV3细胞用作对照，而使用非特异性siRNA/脂质复合物培养的SKOV3细胞被分组为NC。Notch1 siRNA/Lipo2000作为阳性对照PC。加入无FBS的DMEM培养基后孵育4h。更换为DMEM(10％FBS)继续孵育至48h，使用Trizol试剂从SKOV3细胞中提取总RNA。按照SYBR预混料Ex-Tap试剂盒程序说明进行qRT-PCR。计算2-ΔΔCt值来估计Notch1 mRNA的表达。qrt-PCR结果表明，含天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物Chol-6C-Lys可以将Notch1 siRNA递送至细胞中，而降低Notch1 mRNA的表达，从而沉默Notch1基因，并且沉默效果比Lipo2000更好。
验证例5 siRNA基因载体的转染性能对比
对实施例1、4和对比例1-9的siRNA基因载体的转染性能对比。主要试验方法如下：
1、分别将实施例1制备的Chol-6C-Lys、实施4制备的Chol-7C-Lys、以及对比例1-9的产物制备成siRNA纳米复合物，具体步骤如下：
(1)对于实施例1、4及对比例1-3、9，称取相应制备得到的含天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物，用无酶处理的去离子水溶解成衍生物溶液，其浓度按N/P＝15配制。siRNA用无酶处理的去离子水溶液溶解为8μmol/L。对于每种纳米复合物，在微流控泵的两个注射管内分别载入一种衍生物溶液和siRNA药物溶液。微流控注射泵的总流速为1200μL/min，流速比为9：1，制备体积为2mL；制备得到siRNA纳米复合物。
(2)对于对比例4-8，将制备得到的脂质体溶液按N/P＝15与siRNA混合。取1mL脂质体于离心管中，置于涡旋混合器上，随后缓慢滴加1mL的siRNA溶液，涡旋混合器转速为1500转/分，涡旋持续时长15秒，静置30min。制备得到siRNA纳米复合物。
2.制备成siRNA纳米复合物后，采用荧光素酶报告基因分析试剂检测细胞转染性能，主要试验方法如下：将稳定表达萤火虫荧光素酶的H1299-Luc细胞以每孔3*105个细胞的密度接种在48孔培养皿中，并在37℃和5％CO2下与DMEM(10％FBS)孵育过夜。将纳米复合物加入无FBS的DMEM培养基后孵育4h。更换为DMEM(10％FBS)继续孵育至48h，测定luciferase表达。未经任何处理的H1299-Luc细胞用作对照(untreated)，而使用非特异性siRNA纳米复合物培养的H1299-Luc细胞被分组为NC，以市售的Lipofectamine2000(Lipo2000)处理的细胞作为阳性对照PC。按照Promega荧光素酶检测系统的方案进行荧光素酶转染检测。加入细胞裂解缓冲液(80μL)进行裂解。在50μL上清液中添加50μL荧光素酶分析试剂测定化学发光值，并通过BCA分析试剂盒测定总蛋白。计算荧光素酶表达水平(相对光单位(RLU)/μg蛋白质)，以对照组的荧光素酶表达水平为100％进行百分比处理，得到相对荧光素酶表达量。
对比有无结合DOPE的纳米复合物在无血清环境中对于人肺癌细胞株H1299的基因转染效果。具体地，实施例1，4及对比例1-8纳入比较。结果表明，单独使用Chol-6C-Lys、Chol-7C-Lys的基因转染效果最好。结合DOPE后，Chol-4C-Lys和Chol-5C-Lys的基因转染效果有所增强，而Chol-6C-Lys、Chol-7C-Lys的基因转染效果削弱。
表9.不同链长的siRNA基因载体的转染性能对比
Figure BDA0003456656440000201
对比不同链长的Chol-Linker-Lys在有血清环境中对于人肺癌细胞株H1299的基因转染效果。具体步骤如上所述，不同之处在于转染环境从无FBS的DMEM培养基孵育4h，更改为10％FBS或20％FBS的DMEM培养基孵育4h。具体地，实施例1，4及对比例1-3纳入比较。表10结果表明，在有血清环境下，Chol-6C-Lys、Chol-7C-Lys的基因沉默效果最好，优于市售的Lipofectamine2000(PC组)。Chol-8C-Lys在血清条件下的基因沉默效果受到较大影响。
表10.不同链长的siRNA基因载体在低血清中的转染性能对比
Figure BDA0003456656440000202
Figure BDA0003456656440000211
对比不同氨基酸端的胆固醇衍生物在无血清环境中对于人肺癌细胞株H1299的基因转染效果，具体地，实施例1和对比例9纳入比较。表11结果表明，Chol-6C-Lys在三种N/P比下的基因转染效果均优于Chol-6C-His。说明赖氨酸头基在基因转染中具有优势。
表11.不同氨基酸端的siRNA基因载体的转染性能对比
Figure BDA0003456656440000212
综上所述，本申请通过试验发现：
Chol-6C-Lys，Chol-7C-Lys最适合用于siRNA递送的；是因为其有最适的灵活度，能满足与siRNA充分结合，并且结合后具有很好的稳定性；而Chol-4C-Lys，Chol-5C-Lys在这一方面不如6C和7C；而选择Chol-8C-Lys时，效果变差，是因为碳链过长时，阴离子血清蛋白与siRNA的竞争效率更高，影响siRNA与载体材料的结合，这也会导致在有血清环境下基因转染效率下降。
与DOPE共同组成脂质纳米颗粒的结构和性能与单独使用有所不同；Chol-4C-Lys，Chol-5C-Lys更适用于与DOPE共用，因为其穿插于DOPE形成的脂质膜中，有利于膜稳定性，并能提供阳离子加强与siRNA的结合。而单独使用时稳定性不足，不能稳定地将siRNA包载并抵抗外界环境的干扰，是影响其有效性的最主要原因。
而Chol-6C-Lys，Chol-7C-Lys在单独使用时就能保护siRNA免受酶降解，并且单独使用时可以改变纳米复合物的入胞途径，从而实现高效的胞内递送。纳米复合物能通过小窝/脂筏介导的内吞途径被细胞快速摄取，而较少进入溶酶体阶段，在胞内能有效释放siRNA并发挥生物作用。而与DOPE结合的脂质纳米颗粒进入细胞后受限于溶酶体，胞内释放效果受到影响，因而其基因转染效率比非DOPE结合时更低。
本申请选择特定的氨基酸是因为不同氨基酸的等电点不同，将氨基酸连接到胆固醇后，胆固醇衍生物的pKa不同，因此氨基酸的选择关系到胆固醇衍生物在细胞培养液(pH＝7.4)的质子化能力；譬如赖氨酸端的质子化能力比组氨酸强，质子化的赖氨酸端带正电荷，更容易与负电荷的siRNA发生静电吸附；赖氨酸端的胆固醇衍生物与siRNA结合后形成的纳米复合物带有一定程度的正电荷密度，有利于促进与细胞膜的静电相互作用；而正电荷过高会导致细胞毒性上升，譬如精氨酸端的正电荷高，但细胞毒性大于赖氨酸，导致细胞转染效率下降。
本发明提供了一种稳定可控的制备方法，利用微流控技术，对多种参数进行系统优化(包括总流速、流速比、缓冲体系、芯片结构等)，掌握了微流控技术制备胆固醇衍生物类脂质纳米颗粒的方法。本发明将一种含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物应用于siRNA基因递送，表现出前所未有的基因沉默效果。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物，其特征在于，其化学结构可由通式(Ⅰ)表示：
Figure FDA0003456656430000011
上式结构中，连接基团Linker选自：-(CH2)6-或-(CH2)7-，A-表示阴离子反离子部分：氯负离子、磷酸根负离子、甲磺酸根负离子或三氟乙酸根负离子。
2.一种如权利要求1所述的含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将烷基二醇溶于充分脱水干燥的有机溶剂中，在碱催化下缓慢滴加到事先溶于有机溶剂的胆固醇氯甲酸酯中，于0-50℃搅拌反应12-24h，得到中间体胆固醇单取代二醇碳酸酯；
S2：将BOC保护的天然赖氨酸砌块化合物溶于脱水干燥的有机溶剂中，在碱催化下缓慢滴加到溶于有机溶剂的S1制备所得的中间体胆固醇单取代二醇碳酸酯中，加入缩合剂后于0-50℃搅拌反应12-24h，去除有机溶剂，进行柱层析；然后产品溶于过量酸中室温搅拌反应1-2h，加醚沉淀后过滤干燥得到含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物。
3.根据权利要求2所述的含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物的合成方法，其特征在于，步骤S1中，碱、烷基二醇、胆固醇氯甲酸酯的摩尔比为0.05-0.1：4.0-6.0：1.0。
4.根据权利要求2所述的含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物的合成方法，其特征在于，步骤S2中，BOC保护的天然赖氨酸与中间体胆固醇单取代二醇碳酸酯的摩尔比为1.0：1.0-1.5。
5.根据权利要求2所述的含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物的合成方法，其特征在于：
所述烷基二醇为1,6-己二醇，1,7-庚二醇；
所述的有机溶剂选自乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯、甲苯中的一种或几种；
所述的碱为吡啶；
所述的缩合剂选自二环己基碳二亚胺、二异内基碳二亚胺、羰基二咪唑中的一种或多种；
所述过量酸为盐酸、磷酸、甲磺酸或三氟乙酸；
所述醚为乙醚；
所述BOC为碳酸二叔丁酯。
6.一种如权利要求1所述的含有天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物的应用，其特征在于，所述应用是将所述天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物作为核酸药物的基因递送载体。
7.一种纳米复合物，其特征在于，所述纳米复合物的制备方法为：将权利要求1所述的天然胆固醇骨架和赖氨酸头基的阳离子胆固醇衍生物，与核酸药物在水相中快速混合，制备成所述纳米复合物。
8.根据权利要求7所述的纳米复合物，其特征在于，所述阳离子胆固醇衍生物中带正电氮原子：核酸药物中磷原子比为10-20：1；所述水相选自去离子水、磷酸盐缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、氯化钠中的一种或几种；所述的快速混合为涡旋混合或微流控混合。
9.如权利要求7所述的纳米复合物，其特征在于，核酸药物包括siRNA或microRNA。
10.一种包含权利要求7-9中任一项所述的纳米复合物在药物制剂中的应用。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102321140A (zh) * 2011-05-26 2012-01-18 中国科学院上海有机化学研究所 一种由天然胆固醇和氨基酸合成的类脂质阳离子功能分子、制备方法及其用途
CN103214541A (zh) * 2013-04-19 2013-07-24 中国科学院上海有机化学研究所 含有天然胆固醇和赖氨酸类脂质阳离子有机功能分子及其脂质体、制备方法和应用
WO2014011644A1 (en) * 2012-07-09 2014-01-16 Trustees Of Tufts College High molecular weight silk fibroin and uses thereof
US20140079563A1 (en) * 2012-09-17 2014-03-20 National Taiwan University Digital microfluidic manipulation device and manipulation method thereof
WO2017027216A1 (en) * 2015-08-13 2017-02-16 The Johns Hopkins University Methods of preparing polyelectrolyte complex nanoparticles
WO2021226597A2 (en) * 2020-05-08 2021-11-11 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102321140A (zh) * 2011-05-26 2012-01-18 中国科学院上海有机化学研究所 一种由天然胆固醇和氨基酸合成的类脂质阳离子功能分子、制备方法及其用途
WO2014011644A1 (en) * 2012-07-09 2014-01-16 Trustees Of Tufts College High molecular weight silk fibroin and uses thereof
US20140079563A1 (en) * 2012-09-17 2014-03-20 National Taiwan University Digital microfluidic manipulation device and manipulation method thereof
CN103214541A (zh) * 2013-04-19 2013-07-24 中国科学院上海有机化学研究所 含有天然胆固醇和赖氨酸类脂质阳离子有机功能分子及其脂质体、制备方法和应用
WO2017027216A1 (en) * 2015-08-13 2017-02-16 The Johns Hopkins University Methods of preparing polyelectrolyte complex nanoparticles
WO2021226597A2 (en) * 2020-05-08 2021-11-11 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods

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