CN102321140A

CN102321140A - 一种由天然胆固醇和氨基酸合成的类脂质阳离子功能分子、制备方法及其用途

Info

Publication number: CN102321140A
Application number: CN201110138577.5A
Authority: CN
Inventors: 曹阿民; 盛瑞隆; 罗挺; 李慧; 孙景景
Original assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Priority date: 2011-05-26
Filing date: 2011-05-26
Publication date: 2012-01-18

Abstract

本发明涉及一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子、制备方法及其用途。本发明的类脂质阳离子有机功能分子同时具有疏水和亲水特性，其疏水砌块来源于资源丰富的天然类脂质化合物胆固醇，亲水阳离子砌块取自于具有良好生物相容性的天然氨基酸及其衍生物，其合成方法简单且效率高，易实现规模化制备。与市售商品化基因转染试剂bPEI-25k相比，不仅具有明显较低的细胞毒性，而且可以作为基因载体在多种细胞内实现高效率的基因转染，有望作为新型合成脂质生物载体功能材料应用于基因与药物的负载和体内传输，作为低毒性高效阳离子表面活性剂，可应用于水剂或乳液化妆品以及个人护理用品的制备生产。

Description

一种由天然胆固醇和氨基酸合成的类脂质阳离子功能分子、制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及合成类脂质生物载体材料领域，特别涉及一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子功能分子的制备及其在制备基因载体与功能表面活性剂中的应用。

背景技术

近年来，研究开发应用面上基因输送的类脂质功能载体材料已成为生命科学和材料科学领域中最为活跃的研究课题之一，这些载体材料可将功能基因输送到体内的特定细胞或者组织发挥治疗作用。目前作为基因载体应用的材料大多为脂质阳离子功能分子，其负载输送原理是利用脂质阳离子功能分子中质子化氨基的正电荷与基因序列中磷酸基团所带负电荷的静电相互作用，集合组装形成稳定的聚集体复合物纳米粒子，保护负载的基因不易被核酸酶降解，同时提高聚集复合体粒子在体内的稳定性，从而提高转染的效率。由脂质阳离子功能分子与基因复合后形成的纳米尺度转染体系具有以下优势：(1)脂质分子能够与质粒DNA有效地结合形成纳米尺度的聚集复合物粒子(50-400nm)，其较小的尺寸和表面携带的正电荷有助于提高细胞对纳米粒子的内吞能力。(2)其疏水性结构的存在有利于纳米粒子透过毛细血管及血脑屏障被病变组织和器官吸收。(3)阳离子脂质结构相对简单，结构精确可控，容易程序化和模块化合成制备。到目前为止，虽然国内外已经开发多种脂质阳离子功能分子，并应用与体外或者体内细胞/组织水平的基因输送与转染研究，但是在应用中仍然存在着一系列科学和技术问题，如大多数脂质阳离子功能分子在血液循环环境中不稳定，容易被网状内皮系统吞噬后被肝、脾等器官清除。同时在脂质阳离子介导的基因输送研究中发现，许多阳离子脂质功能分子具有免疫原性，刺激、诱导细胞的免疫应急反应，从而导致毒副作用。以上这些因素限制了脂质阳离子功能分子在基因治疗中的进一步应用。因此，如何合理地优化脂质阳离子功能分子结构，改善其生物相容性以及相关应用性能，实现其与基因的高效复合负载和细胞内的输送与基因转染具有重要的研究和实际应用价值。

目前，研究采用具有生物相容性的脂质化合物构建新型阳离子生物载体材料成为合成功能脂质分子研究开发应用的重要方向之一。胆固醇是一种具有重要生理活性的天然甾体化合物，其在动物体内多种脂质结构中(如低密度脂蛋白LDL)以及自由分子或者化学键合形态广泛存在，具有较强疏水性的疏水性和良好的生物相容性。因此，充分利用胆固醇类天然产物的疏水性骨架结构，通过进一步化学偶联水溶性阳离子片段，可以合成制备新型合成脂质阳离子有机功能分子，降低合成脂质阳离子的细胞毒性，其不仅有可能应用作为新型生物相容性基因载体功能材料，同时也是一类潜在的生物相容性绿色环保功能表面活性剂。近年来，国内外合成报道了多种由天然胆固醇衍生的阳离子表面活性剂，如胆固醇季胺盐(J.Med.Chem.2007，50，2432)、胆固醇取代胺类(Int.J.Pharm.2004，278，143)等，这些合成阳离子脂质在药物和基因输送载体应用得到广泛研究。一些基于天然胆固醇的阳离子脂质表面活性剂表现出了良好的药物负载、可控缓释和以及基因的输送与细胞内转染效果，提高了载体与药物或者基因复合纳米粒子的细胞内吞能力。在此基础上，人们又相继合成了由核苷酸或者氯喹修饰的胆固醇衍生物阳离子脂质，发展更为有效可控的基因输送载体体系。另一方面，在实际应用中，许多由胆固醇衍生的基因输送载体合成步骤复杂繁琐，其合成制备方法的通用性欠佳。因此，进一步研究和开发由天然胆固醇构建新型生物相容性类脂质阳离子有机功能分子，尤其能同时具有较低细胞毒性和良好亲/疏水性以及易于化学衍生的类脂质有机功能分子，将有力地扩展合成基于胆固醇脂质分子种类，推动脂质简便低成本合成方法的创新，拓展其作为生物医药功能载体以及新型表面活性剂的应用，这些是本发明所致力解决的目标。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子。

本发明的目的之二是提供一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的制备方法。

本发明的目的之三是提供一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子作为基因输送载体功能材料及生物相容性表面活性剂的用途。

根据本发明所提供的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子，其脂质分子化学结构可由通式(I)表示：

上式结构中，AA⁺表示氨基酸砌块，包括阳离子型天然氨基酸、阳离子树枝状天然氨基酸、阳离子小肽、阳离子氨基酸类衍生物；Linker表示连接基团，包括亚烷基链(-(CH₂)_n-)或亚烷氧基链(-(CH₂CH₂O)_m-)，其中n为2-16的自然数其中m为1-7的自然数；X₁和X₂表示链接原子或基团，包括氧原子O、氮原子N、碳酸酯-OCOO-、氨基甲酸酯-NHCOO-；M^-表示阴离子反离子部分，包括氯负离子、溴负离子、碘负离子、硫酸根负离子、硝酸根负离子、高氯酸根负离子、甲酸根负离子、磷酸根负离子、焦磷酸根负离子、柠檬酸根负离子或三氟乙酸根负离子(TFA-)。

本发明中所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子，其所述天然氨基酸砌块AA⁺选自下列的一种或多种：赖氨酸阳离子、精氨酸阳离子、组氨酸阳离子、0-3代树枝状赖氨酸阳离子、0-3代树枝状精氨酸阳离子、0-3代树枝状组氨酸阳离子、赖氨酸-组氨酸二肽阳离子、赖氨酸-精氨酸二肽阳离子、组氨酸-精氨酸二肽阳离子等。

本发明中所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子，其所述连接基团(Linker)选自下列的一种或多种：1，2-乙二烷基、1，3-丙二烷基、1，4-丁二烷基、1，5-戊二烷基、1，6-己二烷基、1，7-庚二烷基、1，8-辛二烷基、1，9-壬二烷基、1，10-癸二烷基、1，4-环己二烷基、一缩二乙二醇基、二缩三乙二醇基、三缩四乙二醇基、四缩五乙二醇基。

依据本发明中所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的合成制备方法，主要由以下两个步骤组成：

第一步：将末端取代的烷基化合物(包括二醇、二胺及氨基醇)溶于充分脱水干燥的有机溶剂中，在碱催化下缓慢滴加到事先溶于有机溶剂的胆固醇氯甲酸酯或胆固醇对甲苯磺酸酯中，于0～100℃搅拌反应3～30h后蒸馏除去有机溶剂，然后用有机溶剂柱层析，分离纯化制备得到胆固醇单取代结构的中间体。所述的碱、末端取代的烷基化合物、胆固醇氯甲酸酯或胆固醇对甲苯磺酸酯的摩尔比为0.05～0.1∶3.0～5.0∶1.0；所述的末端取代的烷基化合物是1，2-乙二醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇、1，6-己二醇、1，7-庚二醇、1，8-辛二醇、1，9-壬二醇、1，10-癸二醇、1，4-环己二醇、一缩二乙二醇、二缩三乙二醇、三缩四乙二醇、四缩五乙二醇、1，2-乙二胺、1，3-丙二胺、1，4-丁二胺、1，5-戊二胺、1，6-己二胺、1，7-庚二胺、1，8-辛二胺、1，9-壬二胺、1，10-癸二胺、1，4-环己二胺、2-氨基乙醇、3-氨基丙醇、4-氨基丁醇、5-氨基戊醇、6-氨基己醇、7-氨基庚醇、8-氨基辛醇。

第二步：将BOC保护的天然氨基酸合成砌块化合物溶于脱水干燥的有机溶剂中，在碱催化下缓慢滴加到溶于有机溶剂的上一步骤制备所得的胆固醇单取代的中间体中，加入一定量的缩合剂后于0～50℃搅拌反应12～24h，蒸馏除去有机溶剂，进行柱层析，然后产品溶于过量酸中室温搅拌反应3～10h，加醚沉淀后过滤干燥得到由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子。所述的碱、BOC保护的天然氨基酸砌块化合物、胆固醇单取代烷基中间体和缩合剂的摩尔比为0.05～0.1∶1.0∶1.0～1.5∶1.5～3.0；所述的BOC保护的天然氨基酸砌块化合物是BOC-赖氨酸、BOC-精氨酸、BOC-组氨酸、0-3代BOC-树枝状赖氨酸、0-3代BOC-树枝状精氨酸、0-3代BOC-树枝状组氨酸、BOC-赖氨酸-组氨酸二肽、BOC-赖氨酸-精氨酸二肽、BOC-组氨酸-精氨酸二肽；所述的BOC表示叔丁氧羰基。

本发明中所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的合成制备步骤(一)和(二)中，所述的有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯，所述催化剂碱包括二乙胺、三乙胺、氨水、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)、1.8-二氮杂二环(DBU)、甲醇钠、甲醇钾、磷酸钠、磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、吡啶、甲基吡啶、4-二甲氨基吡啶，所述柱层析所用的有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯及其按照不同配比混合所得的溶剂体系。

本发明中所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的合成制备步骤(二)中，所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、羰基二咪唑(CDI)等。

本发明中所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的合成制备步骤(二)中，所述的过量酸包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、高氯酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、柠檬酸、酒石酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、三氟乙酸等。

本发明中所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的合成制备步骤(二)中，所述的醚包括乙醚、丙醚、异丙醚、丁醚、甲基叔丁基醚、甲基乙烯基醚、乙二醇单甲醚、乙二醇二甲醚、乙二醇单丁醚、乙二醇二丁醚、丙二醇丁醚、丙三醇单甲醚、丙三醇二甲醚、丙三醇三甲醚、二苯醚、缩水甘油醚、脂肪醇聚氧乙烯醚等。

本发明中所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的合成制备步骤(一)中的反应温度优选但不限于0～100℃，特别优选60～100℃；所述合成制备步骤(二)中的反应温度优选但不限于0～50℃，特别优选20～40℃。

根据本发明提供的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子、制备方法，与已有的相关报道相比(Proc.Nat.Acad.Sci.USA.1996，93，9682；Gene Ther.2001，8，855；Mol.Pharmaceutics.2008，5，128)，具有如下的优点：

(1)根据本发明中所提供的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的疏水结构片段来源于资源丰富的天然产物胆固醇，亲水阳离子结构片段来源于可大量获得的天然氨基酸，相关合成制备方法简单高效，易于实现低成本规模化制备与应用推广。

(2)根据本发明中所提供的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子具有良好的化合物纯度和水溶性，与已有商品化的枝化分子结构聚乙烯亚胺阳离子高分子基因转染试剂bPEI-25k相比具有明显较低的细胞毒性。同时采用上述系列类脂质阳离子有机功能分子作为基因功能载体的COS-7，HeLa，A549等多种来源细胞株的基因转染效率评价结果表明具有较高的基因转染效率，可望开发应用作为新型高效低毒的类脂质基因转染试剂和生物载体材料。

(3)根据本发明中所提供的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子具有较强的乳化能力和良好的生物相容性，可应用作为生物相容性绿色环保的特种功能表面活性剂用于化妆品以及个人护理用品的生产制造。

附图说明

图1、本发明实施例1和实施例3中所述的合成脂质阳离子有机功能分子CHO-AA-1和CHO-AA-3的COS-7细胞体外细胞毒性评价。

图2、本发明实施例1和实施例3中所述的合成脂质阳离子有机功能分子CHO-AA-1和CHO-AA-3的荧光素酶法基因转染效率评价结果。

图3、本发明的合成脂质阳离子有机功能分子CHO-AA-1和CHO-AA-3作为基因载体的COS-7细胞绿色荧光蛋白(eGFP)基因转染效率评价与荧光显微镜成像。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行具体说明，将有助于对本发明的理解，但并不限制本发明的内容。

实施例1

脂质化合物CHO-AA-1

第一步：将己二醇(12.2g，0.1mmol)溶于30ml干燥二氯甲烷，上述溶液缓慢滴加到含有10ml三乙胺的溶于100ml干燥二氯甲烷的胆固醇氯甲酸酯(4.5g，0.01mol)溶液中，于40℃搅拌反应5h后蒸馏除去有机溶剂，过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/2v/v)，制备得到胆固醇己二醇单醚碳酸酯中间体，合成产率为80％。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：5.32(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.54(t，2H，J＝6.3Hz，CH₂OCO)，4.51(m，1H，OCOCH)，4.36(t，2H，J＝6.3Hz，CH₂OCO)，3.79(t，2H，J＝6.3Hz，CH₂O)，2.30-0.95(m，45H，胆固醇)ESI-MS：[M⁺]＝531.1m/z

第二步：将BOC-赖氨酸(3.5g，0.01mol)溶于50ml干燥的二氯甲烷中，在1ml吡啶的催化下缓慢滴加到溶于有机溶剂的上一步所得胆固醇己二醇单醚碳酸酯中间体(5.1g，0.01mol)中，加入DCC缩合剂(4g，0.02mol)后于0℃搅拌反应24h。蒸馏除去有机溶剂，过柱层析(洗脱剂：洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/2v/v)，所得粗产品溶于20ml三氟乙酸中室温搅拌反应3h后，加入乙醚沉淀，过滤干燥得到一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子CHO-AA-1，合成产率为60％。

¹H NMR (d-CD₃COCD₃，300MHz)：8.1(b，H，NH₃ ⁺)，7.8(b，H，NH₃ ⁺)，5.30(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.54(t，2H，J＝6.3Hz，CH₂OCO)，4.51(m，1H，OCOCH)，4.36(t，2H，J＝6.3Hz，CH₂OCO)，3.79(t，2H，J＝6.3Hz，CH₂O)，2.30-0.95(m，45H，胆固醇)

ESI-MS：[M⁺]＝659.5m/z

实施例2

脂质化合物CHO-AA-2

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：5.32(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.54(t，2H，J＝6.3Hz，CH₂OCO)，4.51(m，1H，OCOCH)，4.36(t，2H，J＝6.3Hz，CH₂OCO)，3.79(t，2H，J＝6.3Hz，CH₂O)，2.30-0.95(m，45H，胆固醇)

ESI-MS：[M⁺]＝531.1m/z

第二步：将BOC-组氨酸(3.5g，0.01mol)溶于50ml干燥的有机溶剂中，在吡啶的催化下缓慢滴加到溶于有机溶剂的上一步所得胆固醇己二醇单醚碳酸酯中间体中，加入DCC缩合剂(4g，0.02mol)后于0℃搅拌反应24h后蒸馏除去有机溶剂，过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/2v/v)，粗产品溶于20ml三氟乙酸中室温搅拌反应3h后，加入乙醚沉淀，过滤干燥得到一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子CHO-AA-2，合成产率为60％。

¹H NMR(d-CD₃COCD₃，300MH z)9.1(s，1H，Im-H)，7.6(s，1H，Im-H)，5.30(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.54(t，2H，J＝6.3Hz，CH₂OCO)，4.51(m，1H，OCOCH)，4.36(t，2H，J＝6.3Hz，CH₂OCO)，3.79(t，2H，J＝6.3Hz，，CH₂O)，2.30-0.95(m，45H，胆固醇)

ESI-MS：[M⁺]]＝668.4m/z

实施例3

脂质化合物CHO-AA-3

第一步：将己二醇(12.2g，0.1mmol)溶于30ml干燥二氧六环，上述溶液缓慢滴加到含有20ml吡啶的溶于50ml干燥二氧六环的胆固醇对甲苯磺酸酯(5.4g，0.01mol)溶液中，于80℃搅拌反应24h后蒸馏除去有机溶剂，过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/2v/v)得到胆固醇己二醇单醚中间体，合成产率62％。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：5.32(s，1H，C＝CH，胆固醇)，3.50(t，2H，J＝6.3H z，CH₂OH)，3.37(t，2H，J＝5.1Hz，CHOCH₂)，2.30-0.95(m，45H，胆固醇)

ESI-MS：[M⁺]＝486.4m/z

第二步：将BOC-赖氨酸(3.5g，0.01mol)溶于50ml干燥的四氢呋喃中，在0.5g 4-二甲氨基吡啶的催化下缓慢滴加到溶于20ml干燥四氢呋喃的上一步所得胆固醇己二醇单醚中间体(4.9g，0.01mol)中，加入DIC缩合剂(2.5g，0.02mol)后于0℃搅拌反应24h，蒸馏除去有机溶剂，过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/2v/v)，粗产品溶于20ml三氟乙酸中室温搅拌反应3h后，加入乙醚沉淀，过滤干燥得到一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子CHO-AA-3，合成产率为63％。

¹H NMR (d-CD₃COCD₃，300MHz)：8.1(b，H，NH₃ ⁺)，7.8(b，H，NH₃ ⁺)，5.32(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.54(t，2H，J＝6.3Hz，CH₂OCO)，3.50(t，2H，J＝6.3Hz，CH₂OH)，3.37(t，2H，J＝5.1Hz，CHOCH²)，2.30-0.95(m，45H，胆固醇)

ESI-MS：[M⁺]＝615.3m/z

实施例4

脂质化合物CHO-AA-4

第一步：将己二醇(12.2g，0.1mmol)溶于30ml干燥二氧六环，上述溶液缓慢滴加到含有20ml吡啶的溶于50ml干燥二氧六环的胆固醇对甲苯磺酸酯(5.4g，0.01mol)溶液中，于80℃搅拌反应24h，蒸馏除去有机溶剂，过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/2v/v)分离得到胆固醇己二醇单醚中间体，合成产率为62％。

¹H NMR(CDCl ₃，300MH z)：5.32(s，1H，C＝CH，胆固醇)，3.50(t，2H，J＝6.3Hz，CH₂OH)，3.37(t，2H，J＝5.1H z，CHOCH₂)，2.30-0.95(m，45H，胆固醇)

ESI-MS：[M⁺]＝486.4m/z

第二步：将BOC-组氨酰-赖氨酸二肽(5.8g，0.01mol)溶于50ml干燥的三氯甲烷中，在0.5g 4-二甲氨基吡啶的催化下缓慢滴加到溶于50ml干燥的三氯甲烷中的上一步所得胆固醇己二醇单醚中间体(4.9g，0.01mol)中，加入DCC缩合剂(4g，0.02mol)后于30℃搅拌反应20h，蒸馏除去有机溶剂，过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/2v/v)，粗产品溶于20ml三氟乙酸中室温搅拌反应5h后，加入甲基叔丁基醚沉淀，过滤干燥得到一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子CHO-AA-4，合成产率为34％。

¹H NMR(d-CD₃COCD₃，300MH z)：9.1(s，1H，Im-H)，8.1(b，H，NH₃ ⁺)，7.6(s，1H，Im-H)，5.32(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.54(t，2H，J＝6.3Hz，CHCOOCH₂)，3.50(t，2H，J＝6.3H z，CH₂OH)，3.37(t，2H，J＝5.1H z，CHOCH₂)，3.20(t，2H，J＝6.1H z，CHCONHCH₂)，2.30-0.95(m，45H，胆固醇)

ESI-MS：[M⁺]＝753.3m/z

实施例5

脂质化合物CHO-AA-5

第一步：将己二胺(3.2g，10mmol)溶于30ml干燥二氯甲烷，上述溶液缓慢滴加到含有10ml三乙胺的溶于100ml干燥二氯甲烷的胆固醇氯甲酸酯(4.5g，0.01mol)溶液中，于40℃搅拌反应5h后蒸馏除去有机溶剂，过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/2v/v)分离得到胆固醇己二胺单酰胺中间体，合成产率为82％。

¹H NMR (CDCl₃，300MH z)：5.32(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.51(m，1H，OCOCH)，3.26(t，2H，J＝6.3Hz，CH₂NHCOO)，2.80(t，2H，J＝6.3Hz，NH₂CH₂)，2.30-0.95(m，45H，胆固醇)

ESI-MS：[M⁺]＝529.7m/z

第二步：将二代BOC-树枝状赖氨酸(7.9g，0.01mol)溶于50ml干燥二氯甲烷中，在0.5g 4-二甲氨基吡啶的催化下缓慢滴加到溶于干燥二氯甲烷的上一步所得胆固醇己二胺单酰胺中间体(5.3g，0.01mol)中，加入DCC缩合剂(4g，0.02mol)后于30℃搅拌反应24h，蒸馏除去有机溶剂，过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/2v/v)，粗产品溶于20ml三氟乙酸中室温搅拌反应3h后，加入乙醚沉淀，过滤干燥得到一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子CHO-AA-5，合成产率为36％。

¹H NMR (d-CD₃COCD₃，300MHz)：8.1(b，H，NH₃ ⁺)，7.8(b，H，NH₃ ⁺)，5.32(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.51(m，1H，OCOCH)，3.30(m，H，NH₃ ⁺CH₂)，3.26(m，H，CH₂NHCOO)，2.30-0.95(m，45H，胆固醇)

ESI-MS：[M⁺]＝872.3m/z

实施例6

类脂质阳离子有机功能分子细胞毒性的评价方法

本发明实施例1和3中所述的类脂质阳离子有机功能分子CHO-AA-1和CHO-AA-3的细胞毒性评估采用MTT法，主要试验方法如下：将COS-7细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔培养板中，其中每孔加入100μL含有10％FBS的DMEM培养基。然后将该96孔板于37℃和5％CO₂浓度条件下孵育24小时后，加入不同浓度的类脂质阳离子有机功能分子CHO-AA-1和CHO-AA-3继续孵育48小时，其后每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)后继续孵育4小时。进一步每孔加入100L DMSO溶解生成的甲臢化合物，用酶标仪(BioTek，ELx800，USA)测定490/630nm波长处的吸光度值。实验中以枝化bPEI-25K为参比样品评价根据本发明所提供的类脂质阳离子有机功能分子的细胞毒性。

本发明实施例1和实施例3中所述的合成脂质阳离子有机功能分子CHO-AA-1和CHO-AA-3的COS-7细胞体外细胞毒性评价如附图1所示。对照组为市售转染试剂bPEI-25K，从图中MTT法细胞毒性评价结果显示依据该发明所制备的脂质阳离子有机功能分子相同质量浓度下COS-7细胞毒性远低于参照bPEI-25K。

类脂质阳离子有机功能分子作为基因载体的荧光素酶法基因转染效率评价方法

本发明实施例1和3中所述的阳离子有机功能分子CHO-AA-1和CHO-AA-3作为基因载体的细胞转染效率评价采用荧光素酶报告基因分析试剂盒(LuciferasepDNA assay kit)，主要试验方法如下：将人子宫颈癌细胞株Hela细胞以每孔4×10³细胞的密度接种于24孔培养板中，每孔加入500μL含有10％FBS血清的DMEM培养基。将该24孔培养板于37℃和5％浓度CO₂条件下孵育24小时后弃去培养基，然后每孔重新加入500μL不含血清的DMEM培养基，再加入按不同N/P(载体/基因)设计摩尔比所需质量的脂质阳离子有机功能分子CHO-AA-1和CHO-AA-3，与基因(Luciferase pDNA)结合形成脂质复合物，并继续孵育24小时。随后在每孔中加入200μl荧光素酶分析试剂盒的细胞裂解液(Promega，USA)进行裂解。裂解后移取50μL裂解液加入到20μL荧光素酶分析试剂盒所带底物混合，最后用Glomax20/20化学发光测定仪(Promega，USA)测定混合液的化学发光值。本实验中以枝化bPEI-25K为对比参照载体，评价根据本发明所制备的脂质阳离子作为基因输送载体的细胞转染效率。

图2显示本发明实施例1和实施例3中所述的合成脂质阳离子有机功能分子CHO-AA-1和CHO-AA-3的荧光素酶法基因转染效率评价结果。

实验对照组采用市售基因转染试剂分子量25000Da的枝化分子结构聚乙烯亚胺bPEI-25K，从图中2结果表明在一定的N/P(载体/基因)摩尔比例下，本发明的脂质阳离子有机功能分子CHO-AA-1和CHO-AA-3作为基因载体和荧光素酶基因作

为报告基因，在人子宫颈癌细胞株Hel a中具有良好的基因转染效率。

类脂质阳离子有机功能分子作为基因载体的绿色荧光蛋白法基因转染效率评价方法

本发明实施例1和3中所述的脂质阳离子有机功能分子CHO-AA-1和CHO-AA-3作为基因输送载体进行绿色荧光蛋白(eGFP)的细胞转染荧光显微镜成像，主要实验方法如下：将COS-7细胞以每孔5×103个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL含有10％FBS的DMEM培养基。该96孔板于37℃和5％CO2条件下孵育24小时后，加入按不同N/P(载体/基因)设计摩尔比所需质量的脂质阳离子有机功能分子CHO-AA-1和CHO-AA-3与绿色荧光蛋白基因(eGFP)。载体/基因复合物孵育48小时后，用Nikon Ti-S荧光倒置显微镜在明场和荧光条件下观察和细胞生物成像。本实验中以枝化分子结构bPEI-25K为参比基因转染载体，评价根据本发明所提供的脂质阳离子有机功能分子作为基因输送载体的细胞转染效率。

图3显示脂质阳离子有机功能分子CHO-AA-1和CHO-AA-3作为基因载体的COS-7细胞绿色荧光蛋白(eGFP)基因转染效率评价与荧光显微镜成像。左图为明场下的COS-7细胞，右图为波长405nm的荧光激发下的COS-7细胞，可以观察到明显的绿色荧光，表明由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子作为载体具有较高的基因转染效率。由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子CHO-AA-1(a)和CHO-AA-3(b)作为绿色荧光蛋白(eGFP)基因载体转染后COS-7细胞的荧光显微镜图像(c为对照组为bPEI-25K，荧光显微镜：Nikon-TS，放大倍数×200)

虽然本发明已将较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种更动与润饰，因此发明的保护范围应以申请专利的权利要求范围为准。

Claims

1.一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子，其具有如下的结构式：

其中，AA⁺表示氨基酸砌块，包括阳离子型天然氨基酸、阳离子树枝状天然氨基酸、阳离子小肽、阳离子氨基酸类衍生物；Linker表示连接基团，包括亚烷基链(-(CH₂)_n-)或亚烷氧基链(-(CH₂CH₂O)_m-)，其中n为2-16的自然数，m为1-7的自然数；X₁和X₂表示链接原子或基团，包括氧原子O、氮原子N、碳酸酯-OCOO-、氨基甲酸酯-NHCOO-；M^-表示阴离子部分，包括氯负离子、溴负离子、碘负离子、硫酸根负离子、硝酸根负离子、高氯酸根负离子、甲酸根负离子、磷酸根负离子、焦磷酸根负离子、柠檬酸根负离子或三氟乙酸根负离子。

2.如权利要求1所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子，其特征是所述的天然氨基酸砌块AA⁺选自下列的一种或多种：赖氨酸阳离子、精氨酸阳离子、组氨酸阳离子、0-3代树枝状赖氨酸阳离子、0-3代树枝状精氨酸阳离子、0-3代树枝状组氨酸阳离子、赖氨酸-组氨酸二肽阳离子、赖氨酸-精氨酸二肽阳离子或组氨酸-精氨酸二肽阳离子。

3.如权利要求1所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子，其特征是所述的连接基团Linker选自下列的一种或多种：1，2-乙二烷基、1，3-丙二烷基、1，4-丁二烷基、1，5-戊二烷基、1，6-己二烷基、1，7-庚二烷基、1，8-辛二烷基、1，9-壬二烷基、1，10-癸二烷基、1，4-环己二烷基、一缩二乙二醇基、二缩三乙二醇基、三缩四乙二醇基或四缩五乙二醇基。

4.一种如权利要求1所述的由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的制备方法，其特征是由以下(a)和(b)两个步骤组成：

(a)、在有机溶剂中和0～100℃下，在碱催化下末端取代的烷基化合物、胆固醇氯甲酸酯或胆固醇对甲苯磺酸酯反应3～30h获得胆固醇单取代烷基中间体；所述的碱、末端取代的烷基化合物、胆固醇氯甲酸酯或胆固醇对甲苯磺酸酯的摩尔比为0.05～0.1∶3.0～5.0∶1.0；所述的末端取代的烷基化合物是1，2-乙二醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇、1，6-己二醇、1，7-庚二醇、1，8-辛二醇、1，9-壬二醇、1，10-癸二醇、1，4-环己二醇、一缩二乙二醇、二缩三乙二醇、三缩四乙二醇、四缩五乙二醇、1，2-乙二胺、1，3-丙二胺、1，4-丁二胺、1，5-戊二胺、1，6-己二胺、1，7-庚二胺、1，8-辛二胺、1，9-壬二胺、1，10-癸二胺、1，4-环己二胺、2-氨基乙醇、3-氨基丙醇、4-氨基丁醇、5-氨基戊醇、6-氨基己醇、7-氨基庚醇或8-氨基辛醇；

(b)、在0～50℃和有机溶剂中，在碱催化下，BOC保护的天然氨基酸砌块化合物、(a)步骤获得的胆固醇单取代烷基中间体和缩合剂反应12～24h，蒸馏除去有机溶剂，过柱层析分离，粗产品溶于过量酸中室温搅拌反应3～10h后，加入醚沉淀，最终过滤干燥得到一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的获得类脂质阳离子有机功能分子；所述的碱、BOC保护的天然氨基酸砌块化合物、胆固醇单取代烷基中间体和缩合剂的摩尔比为0.05～0.1∶1.0∶1.0～1.5∶1.5～3.0；所述的BOC保护的天然氨基酸砌块化合物是BOC-赖氨酸、BOC-精氨酸、BOC-组氨酸、0-3代BOC-树枝状赖氨酸、0-3代BOC-树枝状精氨酸、0-3代BOC-树枝状组氨酸、BOC-赖氨酸-组氨酸二肽、BOC-赖氨酸-精氨酸二肽、BOC-组氨酸-精氨酸二肽；所述的BOC表示叔丁氧羰基；所述的BOC表示叔丁氧羰基；所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺或羰基二咪唑；

5.如权利要求4所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的制备方法，其特征是步骤(a)和(b)中，所述的有机溶剂是乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯。

6.如权利要求4所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的制备方法，其特征是步骤(a)和(b)中所述的催化剂碱是二乙胺、三乙胺、氨水、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)、1.8-二氮杂二环(DBU)、甲醇钠、甲醇钾、磷酸钠、磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、吡啶、甲基吡啶、4-二甲氨基吡啶。

7.如权利要求4所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的制备方法，其特征是步骤(a)和(b)中，所述柱层析分离纯化用的有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯、甲苯及其它们的混合溶剂。

8.如权利要求4所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的制备方法，其特征是步骤(b)中，过柱层析分离纯化产物再溶于过量酸中室温搅拌反应3～10h后，加入醚沉淀，最终过滤干燥。

9.如权利要求8所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的制备方法，其特征是述的酸包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、高氯酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、柠檬酸、酒石酸、马来酸、富马酸、琥珀酸或三氟乙酸；所述的醚包括乙醚、丙醚、异丙醚、丁醚、甲基叔丁基醚、甲基乙烯基醚、乙二醇单甲醚、乙二醇二甲醚、乙二醇单丁醚、乙二醇二丁醚、丙二醇丁醚、丙三醇单甲醚、丙三醇二甲醚、丙三醇三甲醚、二苯醚、缩水甘油醚或脂肪醇聚氧乙烯醚。

10.一种如权利要求1所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的用途，其特征是作为基因输送载体和药物输送载体材料、化妆品中的功能表面活性或高效乳化剂的应用。