CN104844686A - 一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质、合成方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质、合成方法及其用途。系采用常温高效化学偶联反应方法，将作为疏水砌块的天然薯蓣皂苷元和作为阳离子砌块的天然氨基酸或是二肽通过ω-氨基己酸连接砌块分别进行偶联制得，方法简便、高效、易操作，且起始原料为市售试剂，易于模块化制备。本发明的阳离子脂质具有水溶性、两亲性、低细胞毒性、良好生物相容性等优点，能在缓冲液中高效结合基因物质形成纳米尺度的、稳定的复合体。该类阳离子脂质载体负载的绿色荧光蛋白报告基因在人肺癌细胞株H1299内能高效转染、表达目标蛋白,较市售转染试剂聚乙烯亚胺具有明显较低的细胞毒性。可用于低毒、高效的基因输送载体生物材料。

Description

一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质、合成方法及其应用

技术领域

本发明涉及面向生物有机功能材料、制备方法与生物医药应用领域，特别涉及到一种含有天然薯蓣皂苷元结构片段的合成阳离子脂质及其在制备基因转染载体试剂中的应用。

技术背景

薯蓣皂苷元是一种甾体类脂质化合物，其作为重要的次级代谢产物广泛分布在如薯蓣、川地龙、黄姜等多种植物中,具有维持植物正常生理活动、介导自身防御和调控植物生殖的功能。在实际应用中，薯蓣皂苷元是合成许多生理活性物质及其中间体的前体物质，由该前体出发可合成制备系列具有治疗风湿病、心血管疾病、淋巴疾病、皮肤病、以及抗肿瘤等药效功能的药物或前药。其中，合成的代表性药物之一为甾体激素可的松，其可采用薯蓣皂苷元为原料通过黄鸣龙改良合成法经七步连续反应制得。从资源化工的角度而言，由于我国的薯蓣皂苷元资源非常丰富，产量位居世界前列，因此很有必要对薯蓣皂苷元源进行深入的、合理的开发与利用。这首先需要从分子水平上综合考虑薯蓣皂苷元资源转化、衍生过程中的技术可行性、生产经济性和可操作性。其后可利用薯蓣皂苷元所具有的基本分子骨架和官能团，遵照绿色化学和原子经济性的原则，尝试建立简便、实用、低成本的合成及衍生方法进行化学转化，以期提高薯蓣皂苷元资源衍生物的分子多样性和结构利用度。最后，在上述分子多样性平台的基础上，研制开发系列具有实用价值的薯蓣皂苷元衍生产品，拓展该类衍生物的实际应用，并进一步根据实际性能的反馈，对上述薯蓣皂苷元功能分子进行高性能导向的结构优化和功能化修饰，以期继续提高分子的综合应用性能。实现上述目标，对于充分开发利用具有我国特色的薯蓣皂苷元资源、发展具有高附加值、性能优良的精细化工产品、以及减轻天然资源化合物转化过程对环境的污染，具有重要的实际意义和应用价值。

另一方面，近年来随着对天然生物基功能材料研究的深入,一些来源丰富、具有独特分子结构和生理功能的天然产物分子被逐步应用于构建具有基因、药物传输性能的纳米生物载体材料。目前，基于天然阳离子脂质来构建高效、低毒、可控的阳离子基因载体材料受到了人们的广泛关注，因此，作为基因输送载体的天然脂质材料需要满足自身的低毒性、无免疫原性、生物可降解性，还需要能够与治疗用外源基因DNA或RNAi有效地复合形成稳定的纳米尺度的聚集体(通常在50-400nm)，使其具有血液长循环周期，减少器官的选择性滤出以及与血液成份的非特异性相互作用。通常，为了实现阳离子分子载体和基因间的高效结合，需要保证载体分子有较高的阳离子片段分子量及电荷密度。然而，这也导致了载体分子的细胞毒性显著增大，从而不能满足临床基因治疗的实际应用要求。最近的大量研究发现，在阳离子载体中适当的引入生物相容性的疏水砌块，可以同时起到增加基因结合能力和降低毒性的效果。因此，如何采用合适的生物相容性天然脂质为原料，研发具有高效基因复合、负载性能的新型脂质基因载体，是发展高效、低毒基因转染试剂和相关生物载体材料的重要方向。

基于天然甾醇类(主要包括动物甾醇和植物甾醇)化合物的疏水骨架结构，通过进一步化学修饰连接水溶性天然产物阳离子片段，制备得到系列甾醇衍生的两亲类脂质体功能分子，将有可能同时具有较低细胞毒性和水溶性。近年来，国内外已经报道了一些由动物甾醇衍生的两亲性阳离子功能分子(Bioconjugate Chem,2013,24,487–519)，具体的如胆固醇-生物素偶联的阳离子脂质(Chem Biol Drug Des,2013,82,376–383)，大环取代胺类(ChemPlusChem,2012,77,584–591)等，其性能已经在构建功能基因载体中得到了初步研究。本发明团队在前期的相关工作中开发了系列基于二硫键的胆固醇脂质基因载体(Biomaterials 2011,11,3507-3519；ZL201010182428.4)，发现二硫化学键的引入对降低合成脂质载体的细胞毒性具有重要作用。进一步还发展了系列基于胆固醇的类脂质阳离子有机功能分子作为基因转染试剂(CN 201110138577.5,ZL 201110040189.3)，并成功应用于质粒DNA的高效细胞转染。此外亦深入研究探索了胆固醇功能阳离子脂质体结构-基因转染性能之间的构效关系(Colloid Surfaces B:Biointerface,2014,116,32)，上述工作为研发新型甾醇类功能基因转染试剂提供了良好的基础。

然而，迄今为止，国内外基于薯蓣皂苷元的两亲阳离子类脂质分子的研究与应用开发的相关报道非常少。另一方面，从治疗基因、药物的载体的实际应用考虑，现有已经报道的基于天然甾醇结构的基因载体功能分子普遍存在合成步骤繁琐，产率较低、制备成本高等实际问题。因此，很有必要开发基于天然薯蓣皂苷元的新型阳离子类脂质分子作为高效、低毒的基因载体。在此基础上，发展新型绿色、高效、易操作、原料模块化的制备方法，并通过相关细胞生物学性能评价，进一步反馈指导上述基于天然薯蓣皂苷元的功能基因载体的设计和制备，从而促进其作为基因载体材料(或转染试剂)的应用，这也是本发明所致力解决的目标。

发明的内容

本发明要解决的问题之一在于提供一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质。

本发明要解决的问题之二在于提供一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质的合成方法，即运用常温化学偶联方法高效制备得到所述的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质。

本发明要解决的问题之三是提供一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质作为生物相容性载体材料的用途。本发明的阳离子脂质具有水溶性、两亲性、低细胞毒性、良好生物相容性等优点，能在缓冲液中高效结合基因物质形成纳米尺度的、稳定的复合体。通过相关细胞生物学评价发现该类阳离子脂质载体负载的绿色荧光蛋白报告基因(eGFP)在人肺癌细胞株H1299内能够高效转染、表达目标蛋白,较市售参比转染试剂聚乙烯亚胺(bPEI-25k)具有明显较低的细胞毒性。有望作为低毒、高效的基因输送载体生物材料得到应用。尤其是在制备基因转染载体试剂中的应用。

依据本发明所提供的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质，其结构式(Ⅰ)可以表示如下：

上式中，AA⁺表示氨基酸砌块，包括阳离子型天然氨基酸或阳离子小肽；所述的阳离子型天然氨基酸可以是L-赖氨酸，L-精氨酸，如二叔丁氧羰基-L-赖氨酸叔丁氧羰基-N^ω-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸所述的阳离子小肽可以是L-赖氨酰-L-组氨酸二肽或者L-精氨酰-L-组氨酸二肽如二叔丁氧羰基-L-赖氨酰-Boc-L-组氨酸二肽或者二叔丁氧羰基-L-精氨酰-Boc-L-组氨酸二肽X^-表示阴离子反离子部分，包括氯负离子或三氟乙酸根负离子。

本发明中所提供的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质的合成方法，系采用常温高效化学偶联反应方法，将作为疏水砌块的天然薯蓣皂苷元和作为阳离子砌块的天然氨基酸或是二肽通过ω-氨基己酸连接砌块分别进行偶联制得，方法简便、高效、易操作，且起始原料为市售试剂，易于模块化制备。主要由以下三步骤组成：

第一步：将天然薯蓣皂苷元溶于脱水干燥的有机溶剂中，在催化量的碱存在的条件下加入到溶于有机溶剂中的末端Boc保护氨基的ω-氨基己酸中，在室温下反应10-24h后减压蒸馏除去有机溶剂，然后直接柱层析纯化得到具有末端Boc保护氨基的天然薯蓣皂苷元中间体，其化学结构如式(Ⅱ)所示：

所述的天然薯蓣皂苷元、碱和末端Boc保护氨基的ω-氨基己酸的摩尔比为1.0：1.0～2.0；1.0～1.5；

第二步：将步骤一制备得到的具有末端Boc保护氨基的天然薯蓣皂苷元中间体溶于有机溶剂中，加入酸常温搅拌2-4h后，再加入过量碱将酸中和，然后加入等摩尔比的保护的氨基酸(Protected-AA)，包括二叔丁氧羰基-L-赖氨酸叔丁氧羰基-N^ω-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸二叔丁氧羰基-L-赖氨酰-Boc-L-组氨酸二肽或者二叔丁氧羰基-L-精氨酰-Boc-L-组氨酸二肽然后加入缩合剂常温反应10-24h，蒸馏除去有机溶剂，随后直接柱层析纯化得到具有保护基的天然薯蓣皂苷元阳离子脂质，其化学结构如式(Ⅲ)所示：

所述的具有末端Boc保护氨基的天然薯蓣皂苷元中间体：酸：过量的碱：保护的氨基酸(Protected-AA)的摩尔比为1.0：1:0～2.0：2.0.～3.5：1.0；

第三步：将步骤二所得的具有保护基的天然薯蓣皂苷元阳离子脂质溶于干燥有机溶剂中，随后加入过量酸进行脱保护，常温搅拌2-4h后，蒸馏除去有机溶剂，随后加入醚进行沉淀。最终过滤干燥得到一种如结构式(Ⅰ)所示的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质。所述的具有保护基的天然薯蓣皂苷元阳离子脂质：酸的投料摩尔比为1.0:1.0～100.0。

依据本发明中所提供的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质的合成方法，步骤一、二、三中，所述有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、1,4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、1,2-二氯乙烷、乙腈、丙酮、苯或甲苯。

根据本发明中所提供的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质的合成方法，所述的碱包括二乙胺、三乙胺、氨水、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、甲醇钾、1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)、1,8-二氮杂环[5,4,0]十一烯-7(DBU)、吡啶、甲基吡啶或4-二甲氨基吡啶。

根据本发明中所提供的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质的方法中，所述合成步骤一、二中柱层析纯化过程使用的有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、1,4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、1,2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯或者它们的混合溶剂体系。

本发明中所述的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质的合成方法中，所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、羰基二咪唑(CDI)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)等。

根据本发明中所提供的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质的合成方法，所述合成步骤二、三中使用的酸包括盐酸、三氟甲磺酸或三氟乙酸。

根据本发明中所提供的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质的合成方法，所述合成步骤三中使用的醚包括乙醚、丙醚、异丙醚、丁醚、甲基叔丁基醚、甲基乙烯基醚、乙二醇二甲醚或二苯醚。

根据本发明中所提供的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质，与已有研究报道相比(Eur.J.Med.Chem.，2011，46，4133–4141.)，具有如下的优点：

(1)根据本发明中所提供的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质可应用常温化学偶联法制备得到，合成方法简单、效率高，分子结构主体片段来源于天然薯蓣皂苷元，其余分子结构源于自然界中资源丰富的可再生天然产物，易实现低成本、规模化制备。

(2)根据本发明中所提供的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质具有良好的纯度和水溶性，且其作为基因载体材料的相关性能可通过引入不同的阳离子氨基酸(或二肽)头基片段进行调控。

(3)根据本发明中所提供的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质与已经商品化的支化结构聚乙烯亚胺阳离子基因转染试剂bPEI-25k相比，具有明显优越的生物相容性,可以用作为生物相容性载体材料，尤其是在制备基因转染载体试剂中的应用。

附图说明

图1.本发明实施例1、2中所述的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质分子(Dios-1,Dios-2)与质粒DNA溶液复合阳离子脂质体分子和质粒DNA的正负电荷比为10)形成稳定的纳米粒子，其可通过透射电镜(TEM)技术进行表征，从附图1中的TEM照片可以看出，这些DNA复合物粒子的形貌近似球形，尺度为60-210nm左右。

图2.本发明实施例1-4中所述的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质分子(Dios-1,Dios-2,Dios-3,Dios-4)的细胞毒性评价，对照组采用市售基因转染试剂bPEI-25K，从图中结果可以发现，依据该发明所制备的阳离子脂质分子在相同质量浓度下的细胞毒性远低于参照bPEI-25K。

图3.本发明实施例1-3中所述的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质分子(Dios-1,Dios-2,Dios-3)作为基因载体转染绿色荧光蛋白(eGFP)的荧光显微成像结果。其中：(b)、(c)、(d)分别为Dios-1,Dios-2和Dios-3在正负电荷比为10的条件下在H1299细胞中转染eGFP的荧光显微成像图片，(a)为参照转染试剂bPEI-25K在正负电荷比为10的条件下在H1299细胞中转染eGFP的荧光图片。(在Nikon-TS荧光显微镜下观察得到，放大倍数×200)

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。而这些都属于本发明的保护范围。

实施例中Boc表示叔丁氧羰基；Pbf表示2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基

实施例1

阳离子脂质Dios-1的合成

第一步：将天然薯蓣皂苷元(4.14g,1mmol)溶于30mL脱水干燥的三氯甲烷中，在加入1mL三乙胺催化剂的条件下滴加到溶于30mL三氯甲烷中的Boc保护的ω-氨基己酸(2.30g,1mmol)中，在室温下反应24h后减压蒸馏除去有机溶剂，然后直接柱层析纯化(乙酸乙酯：石油醚v:v＝1:5)，得到末端具有Boc保护基的ω-氨基己酸薯蓣皂苷元酯中间体。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：5.32(s，1H，C＝CH，薯蓣皂苷元)，4.51(m，1H，COOCH)，4.36(t，1H，⁺NH₃CHCONH)，3.29(t，2H，BocNHCH ₂)，2.32(t，2H，CH ₂COO)，2.30-0.95(m，43H，薯蓣皂苷元)

第二步：将第一步得到的末端具有Boc保护基的ω-氨基己酸薯蓣皂苷元酯中间体溶于20mL二氯甲烷中，加入10mL三氟甲磺酸常温搅拌4h后，加入过量吡啶(15mL)将酸中和，然后加入等摩尔比的叔丁氧羰基-N^ω-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸其后再加入1mmol的缩合剂二环己基碳二亚胺(DCC)后常温反应24h，蒸馏除去有机溶剂，然后直接柱层析纯化(乙酸乙酯：正己烷v:v＝1:1)得到具有N(Pbf),N(Boc)-精氨酰-N-ω-氨基己酸薯蓣皂苷元酯。

第三步：将步骤二所得的N(Pbf)，N(Boc)-精氨酰-N-ω-氨基己酸薯蓣皂苷元酯溶于20mL干燥的二氯甲烷中，随后加入10mL三氟乙酸进行脱保护，常温搅拌2h后，蒸馏除去有机溶剂，随后加入乙醚进行沉淀。最终过滤干燥得到合成阳离子脂质Dios-1(3.02g,产率32.8％)。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：8.50-7.52(t,精氨酸胍基)，7.50-6.93(b,精氨酸氨基)，5.32(s，1H，C＝CH，薯蓣皂苷元)，4.51(m，1H，COOCH)，4.36(t，1H，⁺NH₃CHCONH)，3.29(t，2H，BocNHCH ₂)，2.32(t，2H，CH ₂COO)，2.30-0.95(m，43H，薯蓣皂苷元)

ESI-MS：[M⁺]＝684.5m/z。

实施例2

阳离子脂质Dios-2的合成

第一步：将天然薯蓣皂苷元(4.14g,1mmol)溶于20mL脱水干燥的四氢呋喃中，在加入1g 1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)催化剂的条件下滴加到溶于20mL四氢呋喃中的Boc保护的ω-氨基己酸(2.30g,1mmol)中，在室温下反应24h后减压蒸馏除去有机溶剂，然后直接柱层析纯化(乙酸乙酯：石油醚v:v＝1:5)，得到具有Boc保护基的ω-氨基己酸薯蓣皂苷元酯中间体。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：4.51(m，1H，COOCH)，4.36(t，1H，⁺NH₃CHCONH)，3.29(t，2H，BocNHCH ₂)，2.32(t，2H，CH ₂COO)，2.30-0.95(m，45H，薯蓣皂苷元)

第二步：将第一步得到的末端具有Boc保护基的ω-氨基己酸薯蓣皂苷元酯中间体溶于15mL二氯甲烷中，加入10mL三氟甲磺酸常温搅拌4h后，加入过量吡啶(15mL)将酸中和，然后加入等摩尔比的2-叔丁氧羰基-L-赖氨酸其后再加入1mmol的缩合剂二环己基碳二亚胺(DCC)后常温反应24h，蒸馏除去有机溶剂，然后直接柱层析纯化(乙酸乙酯：正己烷v:v＝1:1)得到2-叔丁氧羰基-L-赖氨酰-N-ω-氨基己酸薯蓣皂苷元酯。

第三步：将步骤二所得的2-叔丁氧羰基-L-赖氨酰-N-ω-氨基己酸薯蓣皂苷元酯溶于20mL干燥的1,4-二氧六环中，随后加入5mL盐酸(质量百分比浓度37％)进行脱保护，常温搅拌2h后，蒸馏除去有机溶剂，随后加入乙醚进行沉淀。最终过滤干燥得到合成阳离子脂质Dios-2(2.96g,产率40.5％)。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：8.50-7.52(s,赖氨酸氨基)，7.50-6.93(s,赖氨酸氨基)，5.32(s，1H，C＝CH，薯蓣皂苷元)，4.54(t，2H，J＝6.3Hz，CH ₂ OCO)，4.51(m，1H，OCOCH)，4.36(t，2H，J＝6.3Hz，CH ₂ OCO)，3.79(t，2H，J＝6.3Hz，CH ₂ O)，2.30-0.95(m，45H，薯蓣皂苷元)

ESI-MS：[M⁺]＝657.5m/z。

实施例3

阳离子脂质Lipid 3的合成

第一步：将天然薯蓣皂苷元(4.2g,1mmol)溶于20mL脱水干燥的二甲基亚砜中，在加入1mL吡啶催化剂的条件下滴加到溶于20mL丙酮中的Boc保护的ω-氨基己酸(2.3g,1mmol)中，在室温下反应24h后减压蒸馏除去有机溶剂，然后直接柱层析纯化(乙酸乙酯：石油醚v:v＝1:5)，得到末端具有Boc保护基的ω-氨基己酸薯蓣皂苷元酯中间体。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：4.51(m，1H，COOCH)，4.36(t，1H，⁺NH₃CHCONH)，3.29(t，2H，BocNHCH ₂)，2.32(t，2H，CH ₂COO)，2.30-0.95(m，45H，薯蓣皂苷元)

第二步：将第一步得到的末端具有Boc保护基的ω-氨基己酸薯蓣皂苷元酯中间体溶于10mL二氯甲烷中，加入10mL三氟乙酸常温搅拌4h后，加入过量吡啶(15mL)将酸中和，然后加入等摩尔比的二叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Boc-L-组氨酸二肽其后再加入1mmol的缩合剂二异丙基碳二亚胺(DIC)后常温反应20h，蒸馏除去有机溶剂，然后直接柱层析纯化(乙酸乙酯：正己烷v:v＝1:1)得到二叔丁氧羰基-L-赖氨酰-Boc-L-组氨酰-N-α-氨基乙酸薯蓣皂苷元酯。

第三步：将步骤二所得的二叔丁氧羰基-L-赖氨酰-Boc-L-组氨酰-N-α-氨基乙酸薯蓣皂苷元酯溶于20mL四氢呋喃中，随后加入20mL盐酸(质量百分比浓度37％)进行脱保护，常温搅拌4h后，蒸馏除去有机溶剂，随后加入乙醚进行沉淀。最终过滤干燥得到合成阳离子脂质Dios-3(3.17g,产率35.3％)。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：8.50-7.52(t,赖氨酸氨基，组氨酸咪唑基)，7.50-6.93(b,赖氨酸氨基)，4.54(t，2H，J＝6.3Hz，CH ₂ OCO)，4.51(m，1H，OCOCH)，4.36(t，2H，J＝6.3Hz，CH ₂ OCO)，3.79(t，2H，J＝6.3Hz，CH ₂ O)，2.30-0.95(m，45H，薯蓣皂苷元)

ESI-MS：[M⁺]＝795.5m/z。

实施例4

阳离子脂质Dios-4的合成

第一步：将天然薯蓣皂苷元(4.2g,1mmol)溶于20mL脱水干燥的三氯甲烷中，在加入1.0g 4-二甲氨基吡啶催化剂的条件下滴加到溶于20mL三氯甲烷中的Boc保护的ω-氨基己酸(2.3g,1mmol)中，在室温下反应24h后减压蒸馏除去有机溶剂，然后直接柱层析纯化(乙酸乙酯：石油醚v:v＝1:5)，得到具有Boc保护基的ω-氨基己酸薯蓣皂苷元酯中间体。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：4.51(m，1H，COOCH)，4.36(t，1H，⁺NH₃CHCONH)，3.29(t，2H，BocNHCH ₂)，2.32(t，2H，CH ₂COO)，2.30-0.95(m，45H，薯蓣皂苷元)

第二步：将第一步得到的末端具有Boc保护基的α-氨基乙酸薯蓣皂苷元酯中间体溶于10mL二氯甲烷中，加入10mL三氟乙酸常温搅拌4h后，加入过量吡啶(15mL)将酸中和，然后加入等摩尔比的二叔丁氧羰基-L-精氨酰-Boc-L-组氨酸其后再加入1mmol的缩合剂二异丙基碳二亚胺(DIC)后常温反应20h，蒸馏除去有机溶剂，然后直接柱层析纯化(乙酸乙酯：正己烷v:v＝1:1)得到二叔丁氧羰基-L-精氨酰-Boc-L-组氨酰-N-α-氨基乙酸薯蓣皂苷元酯。

第三步：将步骤二所得的二叔丁氧羰基-L-精氨酰-Boc-L-组氨酰-N-α-氨基乙酸薯蓣皂苷元酯溶于20mL四氢呋喃中，随后加入10mL三氟乙酸进行脱保护，常温搅拌4h后，蒸馏除去有机溶剂，随后加入乙醚进行沉淀。最终过滤干燥得到合成阳离子脂质Dios-4(4.61g,产率39.6％)。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：8.50-7.52(t,精氨酸胍基；s,组氨酸咪唑基)，7.50-6.93(b,精氨酸氨基)，4.54(t，2H，J＝6.3Hz，CH ₂ OCO)，4.51(m，1H，OCOCH)，4.36(t，2H，J＝6.3Hz，CH ₂ OCO)，3.79(t，2H，J＝6.3Hz，CH ₂ O)，2.30-0.95(m，45H，薯蓣皂苷元)

ESI-MS：[M⁺]＝822.5m/z。

实施例5

合成脂质体的MTT细胞毒性评价方法

本发明实施例1-4中所述的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质Dios-1、Dios-2、Dios-3、Dios-4的细胞毒性评估采用MTT法，主要试验方法如下：将人肺癌细胞株H1299以每孔4×10³个细胞的密度接种于96孔培养板中，其中每孔加入100μL含有10％胎牛血清(FBS)的培养基(DMEM)。然后将该96孔板于37℃和5％CO₂浓度条件下孵育24h后，分别加入不同浓度的含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质Dios-1、Dios-2、Dios-3、Dios-4后继续孵育24h，其后每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)后继续孵育4h。进一步在每孔中加入100μL DMSO以溶解生成的甲臢化合物，用酶标仪(BioTek，ELx800，USA)测定490/630nm波长处的吸光度值。实验中以支化bPEI-25K为参比样品评价根据本发明所提供的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质Dios-1、Dios-2、Dios-3、Dios-4的细胞毒性。结果表明合成阳离子脂质分子(Dios-1、Dios-2、Dios-3、Dios-4)的细胞毒性评价，对照组采用市售基因转染试剂bPEI-25K，从图2中结果可以发现，本发明所制备的阳离子脂质分子在相同质量浓度下的细胞毒性远低于参照bPEI-25K。

实施例6

合成脂质作为基因载体的绿色荧光蛋白转染效率评价实验方法

本发明实施例1-3中所述的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质(Dios-1、Dios-2、Dios-3)作为基因载体转染效率，同时采用绿色荧光蛋白(eGFP)的质粒DNA为评价工具，通过eGFP蛋白的荧光显微镜成像法进行基因转染效率评价，其主要方法如下：将人肺癌细胞株H1299以每孔5×10³个细胞的密度接种于12孔板中，其中每孔加入培养基500μL(培养基：含有10％FBS的DMEM)，该12孔板于37℃和5％的CO₂条件下孵育24h后，在不同N/P比条件下加入合成脂质体(Dios-1、Dios-2、Dios-3)与绿色荧光蛋白质粒DNA的复合物后，孵育48h，采用用Nikon Ti-S荧光倒置显微镜在明场和荧光条件下观察和显微成像。结果表明本发明所制备的阳离子脂质分子具有较好的绿色荧光蛋白基因转染效率，有望作为基因转染试剂得到应用。

虽然本发明已将较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明的内容，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发明的主要精神和内容范围内，当可作各种更动与润饰，因此发明的保护范围应以申请专利的实际权利要求范围为准。

Claims (11)

1.一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质，其具有如下结构式(I)：

上式中，AA⁺表示氨基酸砌块，包括阳离子型天然氨基酸和阳离子小肽；X_-表示阴离子反离子部分：氯负离子、三氟甲磺酸根或三氟乙酸根负离子。

2.如权利要求1所述的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质，其特征是所述的阳离子型天然氨基酸是二叔丁氧羰基-L-赖氨酸叔丁氧羰基-N^ω-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸所述的阳离子小肽是二叔丁氧羰基-L-赖氨酰-Boc-L-组氨酸二肽或者二叔丁氧羰基-L-精氨酰-Boc-L-组氨酸二肽

3.一种如权利要求1所述的天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质的合成方法，其特征是由以下三步骤组成：

第一步：在有机溶剂中和室温下，天然薯蓣皂苷元，催化量的碱和末端Boc保护氨基的ω-氨基己酸中反应10-24h，得到具有末端Boc保护氨基的天然薯蓣皂苷元中间体，其化学结构如式(Ⅱ)所示；所述的天然薯蓣皂苷元、碱和末端Boc保护氨基的ω-氨基己酸的摩尔比为1.0：1.0～2.0；1.0～1.5；

第二步：在有机溶剂中，步骤一制备得到的具有末端Boc保护氨基的天然薯蓣皂苷元和酸常温反应2-4h后，再加入过量碱将酸中和，然后加入等摩尔比的保护的氨基酸Protected-AA和缩合剂，在常温反应10-24h，得到具有保护基的含有天然薯蓣皂苷元结构片段的合成阳离子脂质，其化学结构如式(Ⅲ)所示；所述的具有末端Boc保护氨基的薯蓣皂苷元中间体：酸：过量的碱：Protected-AA的摩尔比为1.0：1:0～2.0：2.0～3.5：1.0；所述的等摩尔比的保护的氨基酸Protected-AA是二叔丁氧羰基-L-赖氨酸叔丁氧羰基-N^ω-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸二叔丁氧羰基-L-赖氨酰-Boc-L-组氨酸二肽或二叔丁氧羰基-L-精氨酰-Boc-L-组氨酸二肽所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、羰基二咪唑或苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；

第三步：将步骤二所得的具有保护基的天然薯蓣皂苷元结构片段的合成阳离子脂质溶于干燥有机溶剂中，随后加入过量酸进行脱保护，常温搅拌2-4h，得到一种如结构式(Ⅰ)所示的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质；所述的脂质和酸的投料摩尔比为1.0:1.0～100.0；

所述的Boc表示叔丁氧羰基；所述的Pbf表示2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基。

4.如权利要求3所述的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质的合成方法，其特征是在步骤一、二、三中，所述有机溶剂是乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、乙腈、丙酮、苯或甲苯。

5.如权利要求3所述的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质的合成方法，其特征是步骤一或二中所述合成中使用的碱是二乙胺、三乙胺、氨水、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、甲醇钾、1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷、1,8-二氮杂环[5,4,0]十一烯-7、吡啶、甲基吡啶或4-二甲氨基吡啶。

6.如权利要求3所述的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质的合成方法，其特征是所述步骤二、三中使用的酸为盐酸、三氟甲磺酸或三氟乙酸。

7.如权利要求3所述的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质的合成方法，其特征是所述步骤一或二的产物经过蒸馏除有机溶剂、柱层析纯化。

8.如权利要求7所述的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质的方法，其特征是所述柱层析纯化使用的有机溶剂是乙酸乙酯、四氢呋喃、1,4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、1,2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯、或者它们的混合溶剂。

9.如权利要求3所述的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质的合成方法，其特征是所述步骤三的产物经过蒸除有机溶剂、加入醚进行沉淀后过滤干燥纯化；所述的醚是乙醚、丙醚、异丙醚、丁醚、甲基叔丁基醚、甲基乙烯基醚、乙二醇二甲醚或二苯醚。

10.一种如权利要求1所述的一种天然薯蓣皂苷元衍生的合成阳离子脂质作为基因传输载体材料的应用。

11.如权利要求10所述的应用是用于制备基因转染载体试剂。