CN113018302B - 一种薯蓣皂苷元衍生物与dha自组装纳米粒的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种薯蓣皂苷元衍生物与DHA自组装纳米粒的制备方法及应用，包括如下步骤：取适量薯蓣皂苷元与Boc‑戊氨基5‑酸反应，脱去Boc，形成中间体，进一步反应纯化得DGG；称取1.9mg DGG溶于335μL CH₃OH中，超声溶解；取0.4mg DHA溶于50μL CH₃OH中，将两溶液混合后，超声溶解均匀得到混合液，以500r/min搅拌速度下，以15s/滴的速度将其分散至750μL的水中，滴加完毕后，以500r/min速度搅拌3h后即得，用HA对其表面修饰即得DGG/DHA‑HA自组装纳米粒（DGG/DHA‑HA NPs）。本发明制备的自组装纳米粒不仅能显著增加其协同抗肿瘤活性和神经保护作用，还能显著改善DGG和DHA的溶解性、稳定性等问题。

Description

一种薯蓣皂苷元衍生物与DHA自组装纳米粒的制备方法及 应用

技术领域

本发明主要涉及药剂制备领域，具体涉及一种薯蓣皂苷元衍生物与DHA自组装纳米粒的制备方法及应用。

背景技术

随着我国社会老龄化的加速，神经退行性疾病如阿尔兹海默症（Alzheimer’sdisease, AD），已成为继心血管、癌症、脑卒中之后的第四大危及老年人生命的疾病。目前临床上尚未找到能根治AD或逆转病变进程的药物，只有少数药物可一定程度上减缓症状和延缓疾病进展。

研究表明，二十二碳六烯酸（脑黄金，DHA）具有良好的神经保护作用，除此之外DHA还具有健脑、防治心血管疾病、抗癌、抗炎和抗过敏等作用。但因DHA含多个不饱和双键，容易受光、氧及自由基的影响发生氧化反应，导致溶解度低、稳定性差（血浆蛋白结合高，半衰期短，BBB通透性差），致使其生物利用度低。

薯蓣皂苷元（DG，图1）广泛存在于薯蓣科、百合科和蔷薇科等植物中，是合成各类甾醇激素类药物的重要原料，也被认为是很多中药的药理活性成分。药理学研究表明DG具有抗肿瘤、抗2型糖尿病、抑制多发性硬化症、抗神经炎症和帕金森症、改善淀粉样蛋白引起的学习记忆能力障碍、脑缺血再灌注和心脏保护等作用。此外，DG毒性小、安全性高、价格低廉，是一种极具开发潜力的先导化合物。然而，由于DG溶解度差、生物利用度低、活性弱，关于它的研究只停留在临床前实验阶段。薯蓣皂苷的溶解度和活性都较苷元强，但薯蓣皂苷因价格昂贵，糖分子本身的复杂性和特质性造成质量控制困难而不利于进一步开发利用。含有一分子糖的薯蓣皂苷对神经保护活性也较强。另外，也有许多关于薯蓣皂苷元衍生物的报道，其中DG 3位羟基的修饰因其合成路线简单、产率高、修饰后衍生物溶解度和生物活性显著改善而受到众多学者的青睐。发明人前期研究发现，薯蓣皂苷元衍生物（DGG）能显著抑制炎症引起的认知障碍。此外，薯蓣皂苷元修饰后能显著增强其抗肿瘤活性。

DGG和DHA通过小分子自组装形成纳米递药系统DGG/DHA NPS，将活性药物分子的结构修饰与体内递送相结合，该思路对活性中药单体的开发具有很好的启发。并且超分子自组装体系避免了高分子载体材料的引入，直接由药物成分组装而成，在很大程度上提高了药物的传递效率和生物安全性，提高载药量的同时也避免了高分子赋形剂可能引起的不必要的毒性。

目前，传统纳米药物的载药效率（DL%）相对较低，通常不超过20%，这意味着80%以上的非药物赋形剂用于输送不到20%的药物。在新药研发（R&D）、治疗中添加材料的存在以及这些赋形剂的毒性评估可以大大增加治疗成本。因此，开发含较少或不含赋形剂的纳米药物是很有前景的。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种薯蓣皂苷元衍生物与DHA自组装纳米粒的制备方法及应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种薯蓣皂苷元衍生物与DHA自组装纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

Step 1.取适量薯蓣皂苷元与Boc-戊氨基5-酸反应，脱去Boc，形成中间体，并进一步反应形成目标产物DGG；

Step 1.1.化合物1的合成：称取200 mg 5-氨基戊酸（PA）和662.2 mg的N，N-二异丙基乙胺（DIPEA）溶于3.6 mL乙腈和纯水（V_CH3CN:V_H2O=1.1:1）混合溶剂中；冰浴条件下加入583 mg N，N-二-Boc-1H-1-胍基吡唑（Boc-PC），搅拌0.5 h；室温继续搅拌，薄层色谱法检测反应进程；12 h后，减压旋蒸除去溶剂，加乙酸乙酯溶解，用饱和NaHCO₃溶液、NaCl溶液依次萃取3次；合并有机相，无水硫酸钠干燥、过滤、减压除溶剂，即得化合物1粗产物，共390 mg；

Step 1.2.化合物2的合成：称取390 mg化合物1粗品、449 mg薯蓣皂苷元（DG）和133 mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP），溶于4 mL的二氯甲烷中；冰浴条件下，分批加入209 mg乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI），搅拌0.5 h；室温继续搅拌24 h后,加入10mL二氯甲烷稀释，用饱和NaHCO₃、饱和NaCl溶液依次萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩，薄层色谱法分离纯化得化合物2；

Step 1.3.目标化合物DGG的合成：将化合物2溶于2 mL二氯甲烷，低温缓慢加入200 μL三氟乙酸（V_TFA :V_DCM =1:10），室温搅拌4 h；反应完全后，加入1 mL二氯甲烷，将其滴加入30 mL的正己烷中并搅拌，静置过滤，减压除溶剂，真空干燥即得目标产物；

Step 2. DGG/DHA自组装纳米粒制备。包括如下步骤：

Step 2.1. 称取1.9 mg DGG，溶于335 μL CH₃OH中，超声溶解；

Step 2.2. 称取0.4 mg DHA溶于50 μL CH₃OH中，与Step 2.1所得溶液进行混合,再次超声溶解均匀得到混合液；

Step 2.3. 将混合液以500 r/min 搅拌速度下，以15 s/滴的速度将其分散至750μL的水中，滴加完毕后，以500 r/min 速度搅拌3 h后即得。

上述的薯蓣皂苷元衍生物与DHA自组装纳米粒的可作为抗肿瘤药剂、神经保护药剂应用。

本发明采用超分子自组装技术将DHA与薯蓣皂苷元衍生物混合通过纳米沉淀法获得粒径219.3 nm，PDI值为0.270的纳米粒。与传统的纳米药物相比，超分子自组装纳米剂型具有显著的优势，包括（a）由药物自身组装的纳米制剂，DL%可以达到100%，极大改善药物的溶解性和靶向性；（b）工艺简单，易于大规模生产，成本低；（c）无赋形剂，安全性高。基于多学科交叉，整合药物化学及纳米技术开发新药具有创新性。

附图说明

图1为薯蓣皂苷元衍生物DGG的合成路线图。

图2为薯蓣皂苷衍生物的¹H-NMR谱图。

图3为薯蓣皂苷衍生物的13C-NMR谱图。

图4为薯蓣皂苷衍生物的质谱图。

图5为DGG/DHA自组装纳米粒结构表征；

图中：A: DGG/DHA自组装纳米粒形态；B: HA修饰的DGG/DHA自组装纳米粒形态；C-E: 二者DLS粒径分布。

图6为HA修饰DGG/DHA纳米粒稳定性考察；

图中： A: 贮存稳定性考察（PBS，4 ℃）；B: 血浆稳定性考察（10% FBS, 37 ℃）。

图7为 DGG/DHA纳米粒在不同肿瘤细胞株中的抗肿瘤活性，采用CCK-8试剂盒检测，处理时间为48 h。

图8为DGG/DHA纳米粒在胃癌MGC细胞中的摄取，使用香豆素6模拟细胞摄取，处理时间为0.5 h。

图9为DGG/DHA纳米粒抑制LPS-诱导BV2小胶质细胞炎症反应活性；

图中：A: Griess法测NO生成；B: qPCR测iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6和TNF-α表达量。药物预处理时间为0.5 h，100ng/mL LPS诱导24 h。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例

（1）薯蓣皂苷衍生物的合成及结构鉴定

薯蓣皂苷元与Boc-戊氨基5-酸反应，脱去Boc，形成中间体，进一步反应形成目标产物，并进行¹H-NMR、¹³C-NMR和LC/MS，结果见图2-图4。

（2）DGG/DHA自组装纳米粒制备

首先精密称取1.9 mg DGG，溶于335 μL CH₃OH中，超声溶解。再取0.4 mg DHA溶于50 μL CH₃OH中，将两溶液进行混合再次超声溶解均匀得到混合液。将混合液以500 r/min搅拌速度下，以15 s/滴的速度将其分散至750 μL的水中。滴加完毕后，以500 r/min 速度搅拌3 h后测粒径电位。

（3）自组装纳米粒的结构鉴定

采用马尔文电位及粒度分析仪测定样品的粒径及电位分布，结果如下：DGG/DHANPs的平均粒径为219.3 nm，PDI值为0.270。将配制好的DGG/DHA 溶液滴加在表面覆有碳膜的铜网上，静置数分钟，用滤纸吸去多余液体，磷钨酸染色后干燥，使用透射电子显微镜（TEM）观察胶束的形态。其中，中间DHA溶液中存在沉淀，说明DHA溶解度较低。DGG/DHA 溶液为略有乳白色的胶体溶液，具有丁达尔效应，说明了通过纳米沉淀法制备的DGG/DHA 对DHA具有良好的增溶效果，为其应用奠定了良好的基础。

（4）抗肿瘤活性评价

1）CCK-8法检测细胞增殖。用添加10% FBS、1% 抗生素的DMEM或RPMI 1640培养基培养不同类型的肿瘤细胞。待细胞融合至70~80%，将小胶质BV2 细胞接种于96 孔板内，细胞密度为3×10⁴ cells/mL，于37 ℃，5% CO₂ 的培养箱内培养12 h。首先，不同浓度目标化合物的（0~100 μM）培养液处理细胞48小时后，加入含有CCK-8试剂的新鲜培养液继续培养2h，450 nm 波长处测量吸光度，计算细胞存活率。同时观察药物处理对小胶质细胞形态的影响。

2）细胞摄取。将一定量胃癌MGC细胞种于U-培养皿，12 h后，加入含有相同浓度游离香豆素6或DGG/DHA NPs包载的细胞培养液继续培养0.5 h，移除含药培养基，PBS润洗，冷无水甲醇洗固定，加入DAPI染核，封片，显微镜下观察。

（5）神经保护作用评价

合成的薯蓣皂苷元衍生物在LPS-诱导神经小胶质细胞炎症有显著的抑制作用。

1）NO生成测定。用添加10% FBS、1%抗生素的DMEM 培养基培养的小鼠小胶质BV2细胞。待细胞融合至70~80%，将小胶质BV2 细胞接种于96 孔板内，细胞密度为2×10⁴cells/mL，于37 ℃，5% CO₂ 的培养箱内培养12 h。用含有不同浓度目标化合物的（0~100 μM）培养液处理细胞24 h后，取50 μL 相应上清培养液与Griess 试剂混合，室温避光反应30min，在490 nm 波长处测定其吸光度值。计算所有目标化合物在不同浓度下抑制LPS 诱导BV2 细胞释放NO 的量。

2）iNOS、COX-2、TNF-、IL-1β、IL-6等在mRNA和蛋白水平的表达情况检测。细胞培养条件同上，将细胞接种于6 孔板，细胞密度为2×10⁵cells/mL 培养12 h。先用含有不同浓度的目标化合物培养液预处理1 h，再加入100 ng/mL LPS 联合培养24 h。用5 mL 冷PBS润洗两次，TRIzol 试剂提取RNA。根据已建立的实验条件，采用qPCR检测目标化合物对LPS诱导小胶质细胞产生的iNOS、COX-2、IL-1β、IL-6 和TNF-α的mRNA 和蛋白表达量的影响。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (2)

1.一种薯蓣皂苷元衍生物与DHA自组装纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

Step 1.取适量薯蓣皂苷元与Boc-戊氨基5-酸反应，脱去Boc，形成中间体，并进一步反应形成目标产物DGG；

Step 1.1.化合物1的合成：称取200 mg 5-氨基戊酸（PA）和662.2 mg的N，N-二异丙基乙胺（DIPEA）溶于3.6 mL乙腈和纯水混合溶剂中，其中，V_CH3CN:V_H2O=1.1:1；冰浴条件下加入583 mg N，N-二-Boc-1H-1-胍基吡唑（Boc-PC），搅拌0.5 h；室温继续搅拌，薄层色谱法检测反应进程；12 h后，减压旋蒸除去溶剂，加乙酸乙酯溶解，用饱和NaHCO₃溶液、NaCl溶液依次萃取3次；合并有机相，无水硫酸钠干燥、过滤、减压除溶剂，即得化合物1粗产物，共390 mg；所述化合物1的结构式如下：

；

Step 1.2.化合物2的合成：称取390 mg化合物1粗品、449 mg薯蓣皂苷元（DG）和133 mg4-二甲氨基吡啶（DMAP），溶于4 mL的二氯甲烷中；冰浴条件下，分批加入209 mg乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI），搅拌0.5 h；室温继续搅拌24 h后,加入10 mL二氯甲烷稀释，用饱和NaHCO₃、饱和NaCl溶液依次萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩，薄层色谱法分离纯化得化合物2；所述化合物2的结构式如下：

；

Step 1.3.目标化合物DGG的合成：将化合物2溶于2 mL二氯甲烷，低温缓慢加入200 μL三氟乙酸，V_TFA :V_DCM =1:10，室温搅拌4 h；反应完全后，加入1 mL二氯甲烷，将其滴加入30mL的正己烷中并搅拌，静置过滤，减压除溶剂，真空干燥即得目标产物；所述目标化合物DGG的结构式如下：

；

Step 2. DGG/DHA自组装纳米粒制备，包括如下步骤：

Step 2.1. 称取1.9 mg DGG，溶于335 μL CH₃OH中，超声溶解；

Step 2.2. 称取0.4 mg DHA溶于50 μL CH₃OH中，与Step 2.1所得溶液进行混合,再次超声溶解均匀得到混合液；

Step 2.3. 将混合液以500 r/min 搅拌速度下，以15 s/滴的速度将其分散至750 μL的水中，滴加完毕后，以500 r/min 速度搅拌3 h后即得。

2.如权利要求1所述的制备方法制备所得的纳米粒在制备抗神经炎症药剂中的应用。