CN1496255A - 用三萜组合物抑制NF-κB - Google Patents

Abstract

本发明提供了抑制炎症的方法，该方法是通过对有需要的细胞提供抑制NF－κB的单萜组合物。这些组合物还可以含有载体分子，它使得单萜组合物能够透过膜。载体可包括三萜分子、糖、脂类，或甚至其它单萜分子。组合物还可以含有其它化学官能团。描述了用这些化合物预防和治疗各种炎症病况，尤其是恶变前炎症病况的方法。

Description

用三萜组合物抑制NF-κB

发明背景

本申请要求2000年11月17日提交的美国临时申请系列号60/249,710和2001年9月17日提交的美国临时申请系列号60/322,859的优先权，两者的公开内容都在此完整引入以供参考。

1.发明领域

本发明总的涉及药物领域。具体地说，本发明涉及用抑制NF-κB的单萜组合物抑制炎症的方法。

2.相关领域的描述

植物和动物，尤其是海洋动物，是鉴定新的生物活性分子的宝贵来源。已在植物中得到鉴定的一类分子是皂苷类。皂苷是高分子化合物，含有连接于三萜或类固醇苷元的糖部分的糖苷。由于三萜皂苷的生物特性，它们是非常令人感兴趣的对象。

已研究了不同植物的三萜皂苷的药理和生物学特性，包括杀真菌的、抗病毒的、抗诱变的、杀精子的或避孕的、心血管的和抗炎症的活性(Hostettmann等人，1995)。已知通过结合于血浆的脂肪，皂苷和胆固醇形成复合体，从而改变了胆固醇的代谢(Oakenfull等人，1983)。已显示出服用三萜皂苷减少了实验动物血液和组织中的胆固醇量(Cheeke，1971)。已发现皂苷是许多民间土药和一些最近开发的植物药物中的成分。

已知三萜甘草亭酸和它的衍生物有抗溃疡、抗炎症、抗过敏、抗肝炎和抗病毒的作用。例如，某些甘草亭酸衍生物可以预防和治愈胃溃疡(Doll等人，1962)。本领域已知的这些化合物是氢琥珀酸甘草次酸(carbenoxolone)(美国专利No.3,070,623)、在3’位置有取代基的甘草亭酸酯衍生物(美国专利No.3070624)，甘草亭酸的氨基酸盐(日本专利公告JP-A-44-32798)、甘草亭酸的酰胺衍生物(比利时专利No.753773)、和11-脱氧甘草亭酸(deoxoglycyrrhetinic acid)的酰胺衍生物(英国专利NO.1346871)。甘草亭酸已显示出能抑制参与白细胞三烯生物合成中的酶(包括5-脂肪氧合酶)的活力，并且被认为这导致了所报道的抗炎症活性(Inoue等人，1986)。

据报告，桦木酸(一种五环的三萜)是在裸鼠异种移植模型中人黑素瘤生长的选择性抑制剂，且显示出能诱导细胞凋亡而造成细胞毒性(Pisha等人，1995)。已证明一种葫芦科中国药用植物的三萜皂苷有抗肿瘤活性(Kong等人，1993)。三萜的单糖苷已显示出对MOLT-4人白血病细胞有强效和选择性细胞毒性(Kasiwada等人，1993)，而且一些鸢尾科的三萜糖苷，能抑制植入欧利希腹水癌(Ehrlichascites carcinoma)的小鼠的肿瘤生长和延长其生存时间(Nagamoto等人，1988)。从豆科的Dolichos falcatus植物中制备的皂苷，已报道在体外和体内可有效地抗肉瘤-37细胞(Huang等人，1982)。豆科的大豆皂苷也已显示可有效抗许多肿瘤(Tomas-Barbaren等人，1988)。从Swartzia madagascariensis(豆科)的磨碎的豆荚中分离出显示有溶血活性和杀螺活性(molluscicidal)的石竹素和丝石竹配基糖苷(Borel和Hostettmann，1987)。

染料木素(一种从大豆中分离出的自然异黄酮素化合物(isoflavonoid))是酪氨酸激酶的抑制剂，已显现出可抑制雌激素阳性和雌激素阴性的乳房癌细胞系的增殖(Akiyama等人，1987)。在植物王国中非常丰富的烟酸肌醇酯(植酸)是谷物和荚果中一种天然饮食成分，已显现出能造成结肠癌细胞系的终末分化。植酸也表现出在体内对试验性结肠和乳房癌的抗肿瘤活性(Yang等人，1995)。还证明了一些三萜糖苷具有细胞毒性和细胞抑制特性，即Crossopteryx febrifuga(茜草科)植物的茎皮(stem bark)已显现出在ng/ml范围时对Co-115人结肠癌细胞系的细胞抑制作用(Tomas-Barbaren等人，1988)。

虽然以前的报道鉴定了具有多种用途之一种的三萜化合物，但在本领域中依然存在着对鉴定新的有生物活性的三萜化合物的巨大需求。这些化合物许多对正常哺乳动物细胞有毒性。另外，先前鉴定的三萜的生物活性是多种多样的，而且许多在治疗给定的人或哺乳动物病症中受到限制或有效性程度不同。已鉴定的不同三萜间的巨大差异甚至在密切相关的三萜化合物之间观察到生物活性上的大范围差异和不可预测性，强调了获得潜在性治疗剂的三萜中曾遭遇到的困难。若能解决鉴定到具有有益生物活性的新三萜这个难题，就有可能提供治疗多种(现有治疗手段效果有限)人类疾病的全新途径。

NF-κB是一种遍在转录因子，调节许多与免疫和炎症途径有关的基因的转录，例如各种前炎症细胞因子、粘着分子和凋亡，因此是生物体对各种应力信号的中枢调节分子之一。NF-κB功能失调导致许多病理状态，例如脓毒性休克、急性炎症、病毒复制和一些肿瘤。

NF-κB最丰富和活跃的形式是p50/relA的二聚体复合物(p50/p65)。在未受刺激的细胞中，这些因子在细胞质中，与抑制蛋白(IκB)复合，这些蛋白屏蔽其核定位信号。在响应胞外信号，例如炎症细胞因子、有丝分裂原、细菌产物、或氧化性压力时，IκB的特定丝氨酸残基磷酸化，从而通过蛋白体途径传递其遍在化和降解信号。IκB的降解使得无抑制蛋白的NF-κB复合物转到核，与DNA结合，并活化特定基因的转录。

由于其在炎症和致癌以及其它免疫失调上的作用，因此NF-κB的下调剂具有巨大的治疗意义。另外，一些由于抑制NF-κB活性引起的下游作用是降低可诱导氧化氮合成酶(iNOS)和环氧化酶-2(COX-2)表达的水平。iNOS和COX-2在组织对炎症、损伤和致癌作用的反应中有着关键作用。因此，本领域需要NF-κB和iNOS和COX-2的调节剂，因为这些化合物将提供消炎和化学保护作用。

发明简述

本发明克服了本领域现有的缺陷，提供了用单萜组合物抑制炎症的方法。在一些实施例中，这些单萜组合物还可以含有糖类，和甚至还可以含有载体分子，它将单萜组合物运入细胞，赋予膜溶解性或渗透性，或可对组合物赋予所需性质。单萜组合物还可以含有额外的化学组分，例如但不限于三萜糖苷、和/或其它单萜化合物、和/或糖类。

本发明的单萜组合物可从任何来源获得。例如，植物和海洋动物是这些化合物的丰富来源。在一些实施例中，单萜组合物可分离自胜利金合欢(Acaciavictoriae)(Benth.)(豆科)豆荚和根。在其它实施例中，组合物可以是化学或酶合成的。因此，可使用本领域技术人员已知的化学合成方法。可使用其它利用参与单萜组合物合成的酶的生物学方法。这些途径中所用的酶可分离自生物，例如植物、海洋动物等，或可以遗传工程获得。

本发明提供了抑制炎症的方法，包括对细胞施用抑制NF-κB的单萜组合物。在一些实施例中，NF-κB是由TNF诱导的。在方法的优选例中，单萜组合物还含有载体分子。本文中的载体分子定义为一种对单萜组合物提供膜溶解性、膜渗透性或提供胞内通道的分子。本领域技术人员应认识可使用任何提供胞内通道或细胞渗透性的分子，该载体分子的一些非限制性例子包括脂类、可越过/进入膜的亲脂蛋白、三萜糖苷、与其它分子(例如糖类)结合的三萜糖苷、和/或其它单萜单元。

本发明还提供了抑制炎症的方法，包括对细胞施用抑制NF-κB的单萜组合物，其中单萜化合物还与三萜分子和/或糖类和/或第二个单萜分子结合，本领域技术人员应理解本文描述的组合物还可以被其它化学官能团取代。

因此，单萜化合物还可以包括与至少一个，优选二、三、或更多其它单萜结合的三萜分子。当存在一个以上的单萜分子时，这些分子可以各自(i)直接与三萜基团分子结合，(ii)与结合于三萜分子的糖类，或其它连结基团结合，或(iii)和与三萜分子直接结合，或通过糖类或其它连结基团结合的单萜分子结合。连结基团包括糖类、酰基、酰氨基、烷氧基、酮基、烷基、链烯基和其它本领域技术人员明白的相似化学基团。

本方法的三萜基团具有式：

或可以是其异构体，其中a)R₁和R₂选自氢、C1-C5烷基、C1-C5链烯基、C1-C5烷基羰基、糖类、寡糖；b)其中R₃-R₃₆分别独立选自不饱和的点、氢、羟基、C1-C5烷基、C1-C5链烯基、C1-C5烷基羰基、糖、C1-C5烷基酯、和单萜基团；和c)R₃-R₃₆至少一个是单萜基团。异构体可以是光学异构体、立体异构体或顺式异构体或反式异构体。

在本方法的一些实施例中，R₁和R₂分别是寡糖。在该实施例的一些具体方面，R₁和R₂分别是单糖、二糖、三糖或四糖。在该方法的其它具体方面，R₁和R₂分别是寡糖，包括分别独立选自葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、奎诺糖、麦芽糖、葡糖醛酸、核糖、N-乙酰基葡糖胺和半乳糖的糖类。在本方法的另一个具体方面，至少一种糖被甲基化。

在本方法的其它实施例中，R₄与三萜基团通过与三萜基团结合的亚甲基碳之一结合。在另一个方面，三萜基团还含有至少一个双键。

在本方法的其它实施例中，三萜分子是金合欢酸酯(acacic acid ester)、石竹素酸酯(oleanolic acid ester)、桦木酸酯、熊果酸酯、奎诺酸酯、坡摸(pomolic)酸酯、铁冬青酸酯、铁冬青(rotungenic)酸酯、崩大碗酸、积雪草酸酯、优卡(euscaphic)酸酯、季陵菜酸酯、羟基积雪草酸酯、羽扇豆酸酯、杯圆(cylicodiscic)酸酯、莫利(mollic)酸酯、茉莉(jessic)酸酯、刺囊酸酯、或过岗龙酸酯、或其它结构相似的三萜分子。

用于本方法的组合物的单萜分子具有式：

或其异构体，其中

a)R₃选自氢、羟基、C1-C5烷基、C1-C5链烯基、C1-C5烷基羰基、糖、和单萜基团；和

b)该式还包括R₄，R₄选自氢、羟基、C1-C5烷基、C1-C5链烯基、C1-C5烷基羰基、糖、C1-C5烷基酯和单萜基团。

异构体还可以是顺式异构体或反式异构体。

在本方法的其它实施例中，R₃是糖。糖选自葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、奎诺糖、麦芽糖、葡糖醛酸、核糖、N-乙酰基葡糖胺和半乳糖。该方法的组合物还可以含有与糖结合的另一个单萜基团。

在该方法的另一个实施例中，R₃具有下式：

其中R₅选自氢、羟基、C1-C5烷基、C1-C5链烯基、C1-C5烷基羰基、糖、C1-C5烷基酯和单萜基团。

在一些实施例中，R₅是氢或羟基。异构体可以是立体异构体或光学异构体。

在该方法的其它实施例中，R₃具有下式：

在其它实施例中，R₃具有下式：

在该方法的一些具体实施例中，单萜组合物含有下式：

或其异构体，其中：

a)R₁和R₂选自氢、C1-C5烷基和寡糖；

b)R₃选自氢、羟基、C1-C5烷基、C1-C5链烯基、C1-C5烷基羰基、糖和单萜基团；和

c)式还含有R₄，其中R₄选自氢、羟基、C1-C5烷基、C1-C5链烯基、C1-C5烷基羰基、糖、C1-C5烷基酯、和单萜基团，其中R₄可以与三萜基团或单萜基团结合。

异构体是立体异构体或光学异构体。

在该方法的其它特定实施例中，单萜组合物含有式：

在该方法的另一个具体实施例中，单萜组合物含有式：

在该方法的其它实施例中，单萜组合物含有式：

在该方法的其它方面，当以约0.5-2.0微克/毫升的浓度将单萜组合物施给细胞时，炎症反应被抑制。

细胞位于具有炎症性疾病的个体内。在优选方面，个体是人。在其它方面，个体可以是其它物种的动物，可以是小鼠或任何其它哺乳动物。

炎症性疾病选自恶化前炎症性疾病、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、骨关节炎、多发性硬化、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。

恶化前炎症性疾病可以是Barretts食管炎、炎症性肠病、慢性胰腺炎、慢性前列腺炎、家族性息肉病或光化性角化病。通常这些恶化前病况在得不到治疗时引起癌症。因此，预防或治疗这些恶化前病况是重要的。例如，具有某些类型的胃食管反流病的病人易于患正常鳞片衬垫(normal squamous lining)的柱状退变。这种疾病被称为Barretts食管炎，占胃肠道反流病患者的10％，与存在狭窄、深度溃疡和最终产生腺癌有关。光化性角化病是皮肤的恶化前病况，通常由日晒引起，可导致皮肤癌。炎症性肠病包括如Chron病和溃疡性结肠炎之类的病况，这些病况可导致结肠癌。

在一些实施例中，该方法的单萜组合物抑制酶环氧化酶-2(COX-2)。在其它实施例中，该方法的单萜组合物抑制iNOS。这两种酶都是NF-κB的下游效应子，与各种炎症和化学保护反应有关。这两种酶都在对各种细胞因子，例如干扰素γ、有丝分裂原、微生物产物(例如脂多糖等)的反应中被诱导。例如，该方法的单萜组合物显著抑制NF-κB的活化和iNOS与COX-2的表达，这些表达是响应促炎症因子，例如TNF和微生物产物，例如脂多糖(LPS)。

在该方法的其它方面中，单萜组合物的施用是通过局部、外用或全身性途径。给药模式可以通过注射、通过口腔摄取、或通过外部涂用。在其它方面，单萜组合物是在药物学上可解释的介质中的药物组合物。药物学上可接受的介质是缓冲液、溶剂、稀释剂、惰性载体、油、霜、或可食用物质。药物组合物还可以含有靶向剂。靶向剂可以直接将药物组合物传递给特定的细胞类型，例如发炎的细胞。

本文说明书或权利要求中，当与“包括”联用时，“一个”可以指一个或多个。本文所用的“另一种”可以指至少第二种或多种。

下面的详述将使本发明的其它目的、特征和优点更加明白。然而应理解，当表示本发明的优选例时，详述和特定实施例仅是用于说明，因为本领域技术人员根据该详述会明白在本发明的精神和范围内有许多改变和修改。

附图简述

以下附图是本说明书的一部分，用来进一步说明本发明的某些方面。参考一幅或多幅附图并结合本文实施例的详细说明可对本发明有更好的理解：

图1：UA-BRF-004-DELEP-F001对人肿瘤细胞系的作用。图1描述了用荚果植物粗提取物处理的卵巢(SK-OV-3，HEY，OVCAR-3)、乳房(MDA-468)、黑色素瘤(A375-M，Hs294t)和人表皮样癌(A431)细胞系的生长抑制。

图2：UA-BRF-004-DELEP-F023(组分23)对转化的和非转化的细胞系的作用。图2描述了组分23对卵巢(SK-OV-3，OCCl，HEY，OVCAR-3)、T-细胞白血病(Jurkat)、前列腺(LNCaP)、新鲜人卵巢肿瘤细胞(FTC)、人成纤维细胞(FS)和内皮(HUVEC)细胞表现出的细胞毒性。观察到对非转化细胞的细胞毒性只有15-17％，而与此相比，对肿瘤细胞的细胞毒性是50-95％。

图3：组分35(“UA-BRF-004-DELEP-F035”或“F035”)对人肿瘤细胞系的作用。图3描述了组分35处理对人卵巢(HEY，OVCAR-3，C-1，SK-OV-3)、胰(PANC-1)和肾(769-P，786-O，A498)细胞系表现出的细胞毒性。用于这些细胞系的IC₅₀范围为1-6μg/ml。

图4：组分35对白血病细胞系的作用。图4显示了组分35表现出对Jurkat(T-细胞白血病)细胞的强效细胞毒性，IC₅₀为130ng/ml，和1-3μg/ml内对REH、KG-1和NALM-6(B-细胞白血病)细胞的细胞毒性IC₅₀范围。

图5：组分35对内皮细胞增殖的作用。图5显示了组分35是内皮细胞增殖的强效抑制剂(有或无bFGF刺激)。

图6：组分35对毛细血管内皮细胞迁移的作用。图6显示了对毛细血管内皮细胞的迁移没有作用，提示缺少细胞毒性。

图7：显示了幼苗、胼胝体提取物的薄层色谱。泳道1，在BA-IAA培养基上生长的茎胼胝体；泳道2，在BA-IAA培养基上发育的根胼胝体；泳道3，胼胝体胚轴；泳道4，在半固体培养基上用茉莉甲酯(100μM)处理的幼苗；泳道5，在半固体培养基上生长的对照幼苗；泳道6，标准F023；泳道7，在BA培养基上发育的萌芽；泳道8，用50μM茉莉甲酯处理的幼苗；泳道9，用100μM茉莉甲酯处理的幼苗；泳道10，用200μM茉莉甲酯处理的幼苗；泳道11，对照幼苗；和泳道12，标准F023。

图8：显示了左边为SENCAR小鼠、右边为SENCAR和C57B1杂交小鼠的照片。都用100nmol DMBA剂量重复处理了8周。在第15周，这两种小鼠都有许多乳头状瘤，但SENCAR和C57B1杂交小鼠的乳头状瘤较少且较小。C57B1株是抗癌的，不会生肿瘤。

图9A-F：显示了用丙酮、DMBA或DMBA+UA-BR-004-DELEP-F035处理的小鼠的表皮切片。图9A：用丙酮处理4周。图9B：用丙酮处理8周。图9C：用DMBA处理4周。图9D：用DMBA处理8周。图9E：用DMBA+UA-BRF-004-DELEP-F035处理4周。图9F用DMBA+UA-BRF-004-DELEP-F035处理8周。

图10A、B：显示了4周后，UA-BRF-004-DELEP-F035对DNA的抗氧化剂效果。图10A：显示了用低浓度UA-BRF-004-DELEP-F035(0.1mg/0.2ml)处理后的抗氧化剂效果。图10B：显示了用高浓度UA-BRF-004-DELEP-F035(0.3mg/0.2ml)处理后的抗氧化剂效果。

图11A、B：显示了用DMBA和UA-BRF-004-DELEP-F035处理4周后表皮的厚度。图11A：显示了用低浓度UA-BRF-004-DELEP-F035(0.1mg/0.2ml)处理后对表皮厚度的作用。图11B：显示了用高浓度UA-BRF-004-DELEP-F035(0.3mg/0.2ml)处理后对表皮厚度的作用。

图12：显示了用低浓度(0.1mg/0.2ml)或高浓度(0.3mg/0.2ml)UA-BRF-004-DELEP-F035的DMBA处理4周后，表皮厚度的增加百分比。

图13：显示了用低浓度(0.1mg/0.2ml)或高浓度(0.3mg/0.2ml)UA-BRF-004-DELEP-F035的DMBA处理4周后，乳头状瘤的减少百分比。

图14：显示了显示小鼠H-小鼠密码子61突变扩增的PCR反应的放射自显影照片。

图15：显示了用于从胜利金合欢中纯化和分离生物活性三萜化合物的初步策略。

图16：显示了从胜利金合欢中纯化、分离并鉴定活性成分的总的、改进的流程。

图17A、B：图17A：显示了在组分94(“UA-BRF-004Pod-DELEP-F094”或F094)中发现的水解的活性成分中分离出的乙酰化糖的HPLC谱。图17B：显示了从F094中发现的水解的活性成分中分离出的乙酰化糖的HPLC谱。

图18A-F：图18A：显示了UA-BRF-004-DELEP-F035和F035-B2的HPLC谱。图18B：显示了UA-BRF-004Pod-DELEP-F094的HPLC谱。图18C：显示了F140的HPLC谱。图18D：显示了F142的HPLC谱。图18E：显示了F144的HPLC谱。图18F：显示了F145的HPLC谱。

图19A、B：用组分35前处理和后处理(48小时)OVCAR-3细胞的细胞周期分析。该图证明用，组分35后处理在细胞周期的G1期细胞数量增加～8％，在细胞周期的S期细胞减少了～10％，显示了G1停滞。图19A：对未处理的OVCAR-3肿瘤细胞作细胞周期分析。图19B：对组分35处理的OVCAR-3肿瘤细胞作细胞周期分析。

图20：EMSA表明通过将细胞暴露于UA-BRF-004-DELEP-F035和UA-BRF-004Pod-DELEP-F094激活NF-κB而显著抑制了TNF。如下处理：泳道1，未处理；泳道2，TNF(100pM)；泳道3，UA-BRF-004-DELEP-F035(1μg/ml)；泳道4，TNF+F035(1μg/ml)；泳道5，F035(2μg/ml)；泳道6，TNF+F035(2μg/ml)；泳道7，F094(1μg/ml)；泳道8，TNF+F094(1μg/ml)；泳道9，F094(2μg/ml)；泳道10，TNF+F094(2μg/ml)。

图21：脂类激酶试验表明UA-BRF-004-DELEP-F035和渥曼青霉素(wortmannin)抑制PI3-激酶。

图22：用磷特异性AKT和总AKT抗体通过western-ECL作SDS-PAGE凝聚分析。用1和2μg/ml UA-BRF-004-DELEP-F035后处理细胞，导致对AKT磷酸化(活性AKT)的显著抑制，这与用1μM渥曼青霉素处理细胞2小时(的结果)相似。

图23：公开了从四个独立转化的根克隆PCR^TM扩增rol B基因的一部分。泳道，L-R，1：Kb梯，2：阳性对照(R1000株的质粒DNA)，3：阴性对照(未转化根的DNA)。4-7：四个独立转化的根克隆。注意阳性对照和转化根中645bp片段的扩增。

图24：鱼藤糖苷(Elliptoside)A和鱼藤糖苷E的结构(Beutler，1997)。

图25：HPLC分离F094中的成分。

图26：HPLC分离F035中的成分。

图27：F094的半制备HPLC中的第一组分。

图28：F094的半制备HPLC中的第二组分。

图29：F094的制备性-组分。

图30：对制备性-组分D的分析。

图31：对制备性-组分G/H的分析。

图32：第二次PFP柱纯化后的化合物G1。

图33：最终C-18纯化后的化合物G1。

图34：Waters C-18柱纯化后的化合物D1。

图35：最终C-18-Aq纯化后的化合物D1。

图36：对化合物D1降解得到的化合物的描述。

图37：对化合物G1降解得到的化合物的描述。

图38：对化合物B1降解得到的化合物的描述。

图39：三萜糖苷D1的结构。

图40：三萜糖苷G1的结构。

图41：三萜糖苷B1的结构。

图42：三萜糖苷(F035)混合物对癌和正常细胞系的作用：以实施例描述的方法评估了F035的细胞毒性。图中显示在一组癌和正常细胞系中检验了F035的活性。对于癌细胞系IC₅₀的范围为0.2-5.8μg/ml。在正常和无限增殖化细胞系上没有观察到F035的明显的细胞毒性(IC₅₀ 15μg/ml到大于25μg/ml)。

图43：纯化的三萜糖苷D1和G1对人癌细胞系的细胞毒性概况：在以下人癌细胞系上评价纯化的提取物的活性：Jurkat(T-细胞白血病)、C2 Hey突变体(卵巢)、769-P(肾)、MDA-MB-231、MDA-MB-453(乳房)。结果以平均值+SEM显示。

图44：纯化的化合物D1和G1以及三萜糖苷混合物(F035)对细胞凋亡的作用：用膜联蛋白V结合试验测定细胞程序死亡，其中细胞用膜联蛋白V-FITC染色，用碘化丙锭(PI)测定DNA含量，采用流动细胞术分析。用0.5-1.0μg/ml提取物培育细胞16小时。处理16小时后，观察三个群体的细胞。细胞已死亡、或处于凋亡后期(膜联蛋白V-FITC和PI阳性)，细胞正经历凋亡(膜联蛋白V-FITC阳性和PI阴性)，和细胞存活未经历凋亡(膜联蛋白V-FITC和PI阴性；左下象限)。

图45A、B：PI3-激酶活力和AKT磷酸化的抑制：测量从细胞裂解物中获得的P85蛋白免疫沉淀物磷酸化磷脂酰甲醇(PI)的能力。体外激酶试验的放射自显影照片，在用于采用Jurkat细胞作p85免疫沉淀的薄层层析上分离。图45B：用粗制和纯三萜糖苷抑制AKT对Ser-473和Thr-308的磷酸化。使Jurkat细胞与粗制(F035)和纯化的D1和G1提取物37℃培育16小时。在9％SDS-PAGE上分辨细胞裂解物，用抗Ser-473、Thr-308和总AKT抗体作为探针进行Western印迹-ELC分析。

图46A-D：用三萜糖苷抑制TNF诱导的NF-kB和iNOS的诱导：使Jurkat细胞接触不同浓度的F035(1-4μg/ml；图46A)和2μg/ml纯提取物(D1和G1；图46B)16小时，37℃用100pM TNF活化NF-kB15分钟。在7.5％天然聚丙烯酰胺凝胶上分离DNA-蛋白复合物，用PhosphoImager显影和定量测定放射性条带。如在方法中所述，在U-937(图46C)和Jurkat(图46D)中诱导了NOS。细胞蛋白在SDS-PAGE是分辨，用抗iNOS的抗体作Western印迹-ELC分析。

图47：F035和D1对J细胞中PARP裂解的作用。

图48：在Jurkat细胞中z-vad fmk对F035诱导的PARP裂解的作用。

图49：在Jurkat细胞中F035、F094、D1和G1对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性的作用。

图50：F035对Jurkat线粒体释放细胞色素的作用。

图51和51B：F094和单萜/三萜糖苷G1对TNF的作用诱导NF-κB活化。用2μg/ml F094(图51A)或单萜/三萜糖苷G1(图51B)37℃处理Jurkat细胞(1×10⁶/ml)1-16小时。在处理结束时，洗涤细胞，以2×10⁶/ml重悬浮在完全培养基中，用1nM TNF 37℃处理15分钟。制备核提取物，如实施例部分所述测定NF-κB的活化。

图52A和52B：图52A.TNF抑制的剂量应答通过单萜/三萜糖苷G1诱导NF-κB的活化。用不同浓度的单萜/三萜糖苷G1 37℃处理Jurkat细胞(1×10⁶/ml)16小时。在处理结束时，洗涤细胞，以2×10⁶/ml重悬浮在完全培养基中，用1nM TNF37℃处理15分钟。制备核提取物，如实施例部分所述测定NF-κB的活化。图52B.NF-κB的超漂变和特异性分析。TNF处理过的细胞与突变NF-κB寡聚物、未标记的NF-κB寡聚物、抗-p65抗体和免疫前兔血清培育15分钟。然后如实施例部分所述测试NF-κB的活化。

图53A和图53B：单萜/三萜糖苷G1对TNF的作用诱导IκBα(图53A)和p65的核转位(图53B)。用单萜/三萜糖苷G1(2μg/ml 16小时)处理Jurkat细胞，洗涤并与1nM TNF培育培育不同时间。这些细胞的细胞质和核提取物用于通过实施例部分所述的蛋白质印迹分析分别研究IκBα和p65的水平。

图54A、54B和图54C：图54A.体外加入单萜/三萜糖苷G1对NF-κB DNA结合的作用。用不同浓度的单萜/三萜糖苷G1 37℃处理来自TNF刺激的Jurkat细胞的提取物30分钟，并用EMSA分析NF-κB结合。图54B.单萜/三萜糖苷G1对脱氧皮质酮(DOC)的作用诱导NF-κB的活化。用DOC在存在或不存在单萜/三萜糖苷G1的情况下处理来自未处理细胞的胞质提取物，然后分析NF-κB的活化。图54C.DTT对单萜/三萜糖苷G1的作用诱导NF-κB活化的抑制。

图55A和图55B：图55A.单萜/三萜糖苷G1对于NF-κB依赖性荧光酶基因表达活性的作用。用pGL3-NF-κB通过电穿孔转染Jurkat细胞。用LPS(100mg/ml)、PMA(5ng/ml)或TNF(1nM)活化NF-κB。用荧光素酶分析试剂盒(Promega，Madison，WI)根据厂商说明书测定荧光素酶活性。图55B.F094和单萜/三萜糖苷G1对于LPS诱导的iNOS和COX-2表达的作用。用LPS如方法中所述处理用F094和单萜/三萜糖苷G1预处理的RAW264.7细胞。用蛋白质印迹分析分析这些细胞胞质提取物中的iNOS和COX-2表达

图56：(图56A)金合欢素(Avicin)的HPLC情况。(图56B)金合欢素D和金合欢素G的化学结构。

图57：结合在F094或金合欢素处理的Jurkat细胞中的膜联蛋白V-FITC。用2μg/ml F094、金合欢素D和金合欢素G处理Jurkat细胞(1×10⁶/ml)不同时间期。染色细胞，并用流式细胞计数分析。

图58：F094或金合欢素对于从线粒体释放细胞色素c的作用。用F094、金合欢素D或金合欢素G(都是2μg/ml)37℃处理Jurkat细胞(1×10⁷)一定时间。细胞匀浆，并用蛋白质印迹分析测定裂解物的细胞色素c水平。

图59：(图59A)无细胞系统中Jurkat细胞的线粒体组分释放细胞色素c的动力学。如方法所述分离线粒体。37℃用金合欢素G(2μg/ml)处理0、1、2、5、10和20分钟。(图59B)金合欢素G诱导细胞色素c释放的剂量反应。用不同浓度的金合欢素G在37℃处理分离的线粒体10分钟。(图59C)天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)抑制剂对金合欢素G诱导的细胞色素c释放的作用。用DEVD-CH₂F(25μM)和zVAD-fmk(25μM)37℃预处理分离的线粒体5分钟。然后用金合欢素G(2μg/ml)37℃处理10分钟。用蛋白质印迹分析分析细胞色素c的释放。

图60：(图60A)F094或金合欢素诱导的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活化的动力学。用2μg/mlF094、金合欢素D或金合欢素G处理Jurkat细胞(1×10⁶)不同时间。确定这些细胞的细胞质提取物中的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性。(图60B)用F094或金合欢素切割PARP。用2μg/ml药物处理Jurkat细胞(3×10⁶)指定时间。(图60C)zVAD-fmk处理对F094或金合欢素诱导的PARP切割的作用。细胞(3×10⁶)±zVAD-fmk(100μM)37℃培养1小时，然后用2μg/ml F094或金合欢素37℃处理4小时。

图61：F094或金合欢素对于线粒体膜电位的作用。用2μg/mlF094、金合欢素D或金合欢素G处理Jurkat细胞(1×10⁶/ml)不同时间。用DiOC6染色细胞，并用流式细胞计数分析。

图62：F094或金合欢素对活性氧簇的产生的作用。用1、2和4μg/ml F094、金合欢素D或金合欢素G处理Jurkat细胞(5×10⁴/孔)。

发明详述

本发明通过提供抑制炎症的方法寻求克服目前本领域的局限性，该方法是提供给需要的细胞抑制NF-κB的单萜组合物。在一些实施例中本发明的单萜组合物抑制iNOS和COX-2等酶。

本发明的单萜组合物可以通过额外与载体分子结合赋予膜可溶性/渗透性。载体分子可以是任何能够对单萜组合物赋予胞内可接触性或膜渗透性的基团。载体分子在一些实施例中可以是三萜基团。

本发明的单萜组合物可以含有三萜基团，它们在此和说明书的其它部分可称作三萜化合物或三萜糖苷组合物。另外，它们在此和说明书的其它部分也被称作单萜/三萜化合物或组合物。

本发明的方法用于抑制NF-κB介导的炎症。由于NF-κB是一种转录因子，调节许多与免疫和炎症途径有关的基因，例如促炎症细胞因子、粘着分子和凋亡的转录，NF-κB失调导致各种病理情况，例如脓毒性休克、急性炎症、病毒复制和一些肿瘤。因此，NF-κB的调节剂对于预防和处理炎症和恶化前病况是重要的。除了抑制NF-κB，本发明的单萜组合物还抑制iNOS和COX-2酶。

因此，本发明的单萜组合物提供了对许多与炎症有关的疾病，例如恶化前炎症性疾病、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、骨关节炎、多发性硬化、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病的治疗。恶化前炎症性疾病的离子包括Barretts食管炎、炎症性肠病、慢性胰腺炎、慢性前列腺炎、家族性息肉病和光化性角化病等。

I.三萜化合物的纯化和鉴定

还描述了从胜利金合欢鉴定和纯化单萜/三萜化合物。鉴定的化合物在对正常人细胞没有或几乎没有细胞毒性的浓度下，显示强抗肿瘤活性。

本发明的三萜化合物是从干旱或半干旱地区的天然豆科的60种植物提取物中筛选出的。在初步筛选中，一从胜利金合欢(Benth.)(豆科)中分离的命名为UA-BRF-004-DELEP-F001的提取物，显示出对各种人肿瘤细胞系有强效抗肿瘤活性。该提取物随后被进一步纯化成各种组分。在第二轮纯化中鉴定出一种含有纯化的抗肿瘤化合物的提取物。该提取物经鉴定含有纯化的三萜糖苷皂苷。随后开发了一种流程来有效分离该活性化合物。

对更纯的提取物作进一步的测试证明了该提取物的生物活性。纯化的提取物显示出在对正常人细胞有极小或没有毒性的浓度时，较粗制的提取物抗肿瘤活性提高。该提取物进一步显示出对接触致癌物的小鼠有化学保护作用。

分离出该提取物的植物(胜利金合欢)是根据一些因素(包括自然环境)选择的，且受到以前研究的物种所限制。胜利金合欢发源于澳大利亚，但被作为园艺品种引入到世界各地，且被普遍视为是剌篱笆或雅致篱笆植物。该树的生长速度为每年60-120cm，是一种慢干旱落叶植物(tardily drought deciduous)，至少在-15℃生长困难。成熟的植物生长到10-15英尺，有青色二回羽状树叶。在美国的西南部，该植物通常开花期为4月-5月，6月荚果成熟。胜利金合欢有许多农业用途，包括防风带、防田林带、食物、重要区域的稳定化和需较少水的观赏植物。不同的金合欢种子世代被澳大利亚土著人作为食物的来源(Lister等人，1996)。在金合欢中，胜利金合欢是最普遍、分布最广的种类，分布在整个澳大利亚，因此也是最广泛使用的。金合欢的种子通常称为篱笆树种子，作为糕点和面包中的磨碎产品以及甜品中的调味品(尤其是冰淇淋)需求量很大。它们也可用于生产高品质的类咖啡饮料，在金合欢中，胜利金合欢(Benth.)普遍被视为具有最上乘的风味(Lister等人，1996)。然而，该植物的豆荚和根的用途没有记载。

植物提取物作为药物制剂的一个重要方面是各个活性组分的表征和确定。三萜皂苷制剂也同样如此，这通常需要分离、结构阐明和分析其成分和糖苷的先进技术。当对纯化合物进行生物测试时，需要以足够的量和纯度来分离这些化合物。

由于三萜和其它相关的皂苷是具有相对大的分子量和高度极性，它们的分离是复杂的。分离纯皂苷中存在的一个问题是存在紧密相关化合物的复杂混合物，这些相关化合物的微妙差异在于苷元或糖部分的性质(连接于单糖的性质、数量、位置和手性)。对不稳定的取代基(如酯)也遇到了困难。例如，主要的纯大豆皂苷，γ-吡喃酮衍生物(BOA)，只能用含水乙醇在室温提取。加热(80℃)提取将导致酯分子的裂解而形成大豆皂苷(soyasaponin)I(Bb)(Kudou等人，1992)。在植物中，皂苷是与强极性物质伴生的，如糖和着色物，包括酚醛化合物等，它们不易结晶，可能有吸湿性，因而就更难得到晶体了。

特性鉴定纯皂苷也是很困难的，因为缺少结晶材料。熔点不精确，而且经常发生分解。所以，样品纯度的确定不能只以融点、旋光度或其它物理常数为根据。较好的皂苷纯度测试可以通过TLC或HPLC检验获得(如果可能，与可靠样品共同色层分析)。在用适当的试剂喷洒后，在TLC板上诸点的色泽是潜在的各个化合物的辅助指标。例如，本发明三萜糖苷之一的D1，HPLC保留时间为15.2分钟。这与另一相关的化合物鱼藤糖苷E(由John Beutler等人于1997年从Archidendronellipticum中分离)不同，鱼藤糖苷的HPLC保留时间为12.5分钟。本发明三萜的其它特性显示，保留时间上的这种差异是由于D1的手性和双键以及鱼藤糖苷E的特性差异而致。

(i)化学纯化

化学纯化技术是本领域技术人员已知的。在一个水平上，这些技术包括，将植物提取物粗分级分离成本文所述的三萜糖苷化合物。通常从植物原料中分离得到的本发明的化合物，感兴趣的三萜糖苷也可用本文所述的方法进一步纯化，例如层析技术，来实现部分或完全纯化(或纯化至均一)。本文下面具体公开了特别适合制备纯三萜糖苷组合物的分析方法。

本发明的一些方面内容涉及纯化，在一些实施例中，从植物原料中大量纯化了三萜糖苷。在本发明的一个优选实施例中，三萜糖苷是从豆科植物中纯化得到的，较佳的是从金合欢层纯化得到，更佳的是从胜利金合欢中得到，再佳的是从胜利金合欢(Benth.)中纯化得到。本文中的术语“分离的三萜糖苷”是指可从其它组分中分离的组合物，其中此组合物纯化的程度与它天然可获得的状态相关。

一般而言，“分离的”是指相似分子(用于分级分离除去各种其它组分)的有机分子或基团，其中组合物充分保留了其表达的生物活性。所用的术语“基本纯化的”是指一种组合物，其主要成分为单萜或三萜组合物，如该组合物中由约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多的分子组成。

本发明的三萜组合物并非要求以最纯的状态被纯化或提供。事实上，在一些实施例中，次基本纯化的产品将会有用处。例如，发明者设想将干燥的胜利金合欢根和豆荚及它们的提取物作为天然营养物。从定义上说，天然营养物含有由不同生物活性组分组成的混合物，这些生物活性组分的协同对健康是有益处的。本发明的天然营养物可为药片或胶囊形式，可以口服，或者可将该植物提取物包含在可局部施用的油膏中。部分纯化可通过在组合中采用较少的纯化步骤，或采用常用纯化方案的不同形式来完成。例如，较好的是，用HPLC装置进行阳离子交换柱层析，一般将导致比采用低压层析系统的同一技术得到高几倍的纯化。表现出相对较低纯化度的方法在产物总回收或保持三萜化合物生物活性上可能有优点。

(ii)提取和初步纯化

提取方案应尽可能温和，因为一些皂苷会经历转化，包括水提取过程中的酶促水解、乙醇处理时酸性皂苷的酯化、不稳定酯基团的水解和酰基转移。所以，在分离流程的每个步骤(例如在薄层层析中)中都必须小心。

虽然可能有许多变化，现今得到粗制皂苷混合物的一般方案通常包括用甲醇、乙醇、水或含醇的水溶液来提取；脱脂步骤，一般用石油醚在提取步骤前或就在提取步骤本身中进行；提取物用水溶解或悬浮；用水饱和的n-丁醇振荡或洗涤溶液或悬浮液；用乙醚或丙酮沉淀(任选)皂苷。为了去除水溶性小分子(如糖)，可以包括透析步骤(例如见Zhou等人1981；Massiot等人1988)。

从干植物原料中最有效的提取是用甲醇或含水甲醇实现的。甲醇也可用于新鲜的植物原料。虽然，对于皂苷来说水是效果较差的提取溶剂(除非是特别水溶性的糖苷)，但水的优点是易于冻干且可得到较洁净的提取物。根据用于提取的水的比例，可得到单锁链(monodesmosidic)的或双锁链(bidesmosidic)的皂苷(Domon和Hostettmann，1984；Kawamura等人，1988)。新鲜的植物原料含有活性酶(酯酶)，当与溶剂匀化后，能够将双锁链转变为单锁链。即使干的原料也可含有酯酶，当有水的时候，该酶会被激活。就苦瓜定I(一种单锁链石竹酸皂苷)而言，发现它转变成苦瓜定II(相应的双锁链)发生在水、30％和60％的甲醇溶液中，但在80％和100％的甲醇溶液中不发生。相反，新鲜根在甲醇中的匀浆保留了酶活性。然而，也可先在4％盐酸中浸泡新鲜根而使该酶失活，从而显示双锁链为主要组分。因此.显然，对提取方案正确的选择是极其重要的第一步。

通常用于纯化蛋白的方法，如透析、离子交换层析和大小排阻层析，可用于将水溶液中的皂苷与非皂苷组分中部分分离开来，但通常因为皂苷易形成混合的分子团，所以不能有效的分离出单个的皂苷。所以，有效分离通常需要用可将两亲性的皂苷溶解为单体的有机溶剂或溶剂/水系统，这样混合分子团的形成就不会干扰分离了。

对呋甾醇(furostanol)皂苷观察到的普遍问题是用甲醇提取中22-OCH3衍生物的形成。然而，纯22-羟基呋甾醇可以用其它溶剂(如吡啶)提取得到或用沸腾的含水丙酮处理甲氧基化的人工制品得到(Konishi和Shoji，1979)。

(iii)薄层色谱(TLC)

用TCL定性分析三萜皂苷对于皂苷的研究的所有方面都是非常重要的。TLC板(通常为硅胶)可以处理纯皂苷和粗制提取物，而且价格便宜使用迅速，且无需特定的装置。可得到许多显色试剂用于喷涂此板(表2)。以下为制备最普通试剂的方法：●香兰素硫酸(Godin reagent)。将乙醇配制的1％的香兰素以1∶1的比例与3％高氯酸水溶液混合，并喷涂到TLC板上。然后加上用乙醇配制的10％的硫酸溶液，并110℃加热。●伯-李二氏试剂(Liebermann-Burchard reagent)。将浓硫酸(1ml)与乙酸酐(20ml)和氯仿(50ml)混合。85-90℃加热使在TLC板上得到所需的显色。●氯化锑(III)。用氯仿配制的10％氯化锑溶液喷涂TLC板，加热到100℃。●茴香醛硫酸。将茴香醛(0.5ml)与冰醋酸(10ml)、甲醇(85ml)和浓硫酸(5ml)混合。将该溶液喷涂到TLC板上，然后100℃加热。

例如，在存在乙醇和高氯酸时用香兰素硫酸喷涂，与三萜皂苷产生蓝色或紫色显色。用茴香醛-硫酸时，加热TCL板产生蓝色或紫蓝色显色。用硫酸配制的硫酸铈溶液喷涂TCL板，在365nmUV光下产生紫红色、蓝色、绿色的荧光区带(Kitagawa等人，1984b)。在一些试验中，用水简单地喷涂板，足以揭示皂苷的存在。在如Stahl(1969)中也可发现其它喷涂试剂。

最常用于TLC的溶剂是氯仿-甲醇-水(65∶35∶10)，但其它溶剂也是有用的。溶剂n-丁醇-乙醇-氨(7∶2∶5)对于含有糖醛酸残基的糖苷特别有用，即对于非常极性的混合物特别有用。其它被广泛使用的溶剂包括n-丁醇-乙酸-水(4∶1∶5；上层)或氯仿-甲醇-乙酸-水(60∶32∶12∶8)。

用于TLC配糖生物碱的系统通常包括乙酸乙酯-吡啶-水(30∶10∶30；上层)。用类固醇试剂(茴香醛-硫酸)或用生物碱(Dragendorff试剂，硫酸铈(IV))试剂显色观察。其它TLC溶剂和显色试剂由Jadhav等人(1981)和Baerheim Svendsen和Verpoorte(1983)赠给。

用TLC可作许多定量测定。例如，可用密度计直接测量用合适喷涂试剂得到的点的密度。另外，可通过TLC分离、从板上刮掉相关的条带(固定的，例如用碘蒸汽)、洗脱皂苷和在加入合适的试剂(如浓硫酸)后测定UV吸光度来进行定量测定。

也可购得反相TLC板，提供了极佳的分析皂苷的方法，这种方法与硅胶板上进行的TLC互补。单独使用甲醇-水和乙腈-水混合物来显色反相板(如Merck RP-8或RP-18HPTL板)。另外，可用DIOL HPTLC玻璃布底板。这些可以与普通的硅胶TLC型溶剂或与甲醇-水和乙腈-水溶剂一起使用，如用于RP-TLC。

表2中列出了用于TLC检测、发光光度分析和比色分析皂苷的溶剂例子。

1.离心式薄层层析(CTLC)

CTLC技术是关于制备性薄层层析(TLC)的平面法，但无需从TLC板上将条带刮下(Hostettmann等人，1980)。CTLC依赖离心力的作用来加速流动相流过圆形TLC板。该板覆盖有合适的吸着剂(1，2或4mm厚)，以约800r.p.m.通过一个电动机旋转，同时在板中心引入样品，洗脱液被泵压通过吸着剂。溶剂洗脱产生了横跨板的同心条带。这些条带被旋转到边缘，收集用于TLC分析。在2mm吸着剂层上可分离50-500mg混合物。

已描述了用氯仿-甲醇-水(100∶30∶3)的CTLC和柱层析联合分离人参皂苷(Hostettmann等人，1980)。也已用氯仿-甲醇-水混合物在硅胶板上得到皂苷。在硅胶柱层析和葡聚糖凝胶LH-20凝聚过滤后，用CTLC(氯仿-甲醇-水65∶35∶7)纯化得到了Eleutherococcus senticosus根(五加科)的两种原报春花素(protoprimulagenin)A糖苷(Segiet-Kujawa和Kaloga，1991)。从大果西番莲(Passiflora quadrangularis)(西番莲科Passifloraceae)分离环艾烷(cycloartane)糖苷，采用了流速为1ml/min(0rsini等人，1987)或1.5ml/min(Orsini和Verotta，1985)的乙酸乙酯-乙醇-水溶剂系统(8∶2∶1或16∶3∶2)。

已描述了将Hitachi离心式液相层析仪(CLC-5型)用于分离皂苷。用该仪器在硅胶板上用氯仿-甲醇-水(7；3∶1(低相)→65∶35；10(低相))洗脱液进行层析。用该技术，在圆板上层析分离了总量为1g的半纯化皂苷组分(Kitagawa等人，1988；Taniyama等人，1988)。

(iv)开柱层析(Open-Column Chromatography)

先前已描述了许多用于硅胶柱层析皂苷的传统溶剂系统，可参见，例如Woitke等人，1970和Adler和Hiller，1985。开柱层析常被用作粗制皂苷混合物的第一分级分离步骤，但在一些试验中可得到纯产物。一般而言，分离度虽然不高，复杂的混合物只是部分分离。其它问题是由于不可逆吸附和进行分离所需时间长，造成原料的损失。

用氯仿-甲醇-水洗脱液作硅胶层析是最普遍运用的技术之一。当用二相系统时，水饱和的氯仿相为洗脱液。因此，可用氯仿-甲醇-水的梯度(如65∶35∶5→65∶40∶10)，在硅胶上初步分离植物组织的甲醇提取物。可在低压柱上进行进一步的层析，来收获(如)单锁链杀螺剂皂苷，而通过使用如丙酮-n-丙醇-水(35∶35∶5)的溶剂系统的硅胶柱层析，可获得双锁链皂苷(Borel等人，1987)。

已从雄黄兰(Crocosmia crocosmiiflora)(鸢尾科Iridaceae)分离了三萜糖苷的复杂混合物。这些中的三个为远志苦酸(polygalacic acid)的2，9，16-三羟基软脂酸糖苷，通过以下方法得到，在硅胶60(60-230μm)上对粗制皂苷混合物进行开柱层析，用n-丁醇-乙醇-水(5∶1∶4，上层)和氯仿-甲醇-水(60∶29∶6)为洗脱液。用HPLC作最终纯化(Asada等人，1989)。

广泛应用硅胶层析也可将达玛烷糖苷盒子草糖苷(actinostemmoside)A-D从瓣状盒子草(Actinostemma lobatum)(葫芦科)中分离出来。在过MCI(MistsubishiChemical Industries)聚苯乙烯凝胶柱后，用以下各种溶剂层析分离相关组分：氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.5，32∶8∶1)，氯仿-甲醇(9∶1，1∶1)，氯仿-乙醇(17∶3)，乙酸乙酯-甲醇(4∶1)，和氯仿-甲醇-乙酸乙酯-水(3∶3∶4∶1.5，底层)。通过此方法，可以得到盒子草糖苷C，而盒子草糖苷A和B需要另外的低压LC步骤，盒子草糖苷D则需要在C-18柱上用70％甲醇洗脱作最终分离(Iwamoto等人，1987)。

一些酯皂苷已在用2％硼酸浸泡的硅胶上进行过层析分离(Srivastava和Kulshreshtha，1986；1988)。

除了普通硅胶外，现在在皂苷的开柱层析中还用了粗RP吸着剂。只要粒度测量不太细且柱不太长，重力进料的柱是很合适的。在初步硅胶分离步骤后，通常引入RP层析，从而有可能改变对待分离物质的选择性。另一可能是在DCCC步骤后引入反相分离(Higuchi等人，1988)。

1.用聚合吸着剂进行开柱层析

如交联葡聚糖凝胶装柱中所见，使用葡聚糖为载体已投入使用很多年了。发现交联葡聚糖凝胶LH-20是最普遍的运用，但聚合体的‘G’系列是令人感兴趣的。

在最近的皂苷分离研究中，用了新一代的聚合体(尤其在日本)。例如，DiaionHP-20(Mitsubishi chemical Industries，Tokyo)是一种高度多孔的聚合体，被广泛用于初步的纯化步骤中。

通常在加入样品后用水洗涤聚合载体，以洗脱单糖、带电的小分子如氨基酸和其它高水溶性物质。然后开始用甲醇-水梯度(或单用甲醇)液洗脱，以得到皂苷组分。用其它层析技术来分离纯皂苷。

已报道了用丙酮-水混合液洗脱HP-20凝胶。例如，在从赤瓜包(Thladianthadubia)(葫芦科)的块茎中分离皂皮酸的双锁链皂苷中，甲醇提取液流穿过DiaionCHP-20P柱，并用水洗涤。用40％丙酮洗脱得到粗皂苷。进一步的分离包括硅胶层析(乙酸乙酯-甲醇-水6∶2∶1)和HPLC(Nagao等人，1990)。

对于从丝瓜(Luffa cylindrica)(葫芦科)种籽中分离的纤溶性皂苷(fibrinolytic saponin)来说，将水提取物在Amberlite XAD-2柱(用甲醇洗脱)上层析，然后在第二根XAD-2柱上用40-70％甲醇洗脱。在用氯仿-甲醇-水(65∶35∶10，底层→64∶40∶10)的硅胶柱层析后，得到纯净状态的活性成分(Yoshikawa等人，1991)。

(v)中压液相层析(MPLC)

在需要相对大量的纯皂苷时，MPLC是非常有用的。与商业上可得到的LPLC设备不同，将克重量级的样品加样在柱上，在40bar的压力下走样分离。载体的粒度测量一般在25-40μm范围，而且分离迅速，所需的时间也少于开柱层析所需的时间。从分析HPLC向MPLC分离条件的直接转换，可以在反相载体上实现，这样便利了对溶剂的选择(Hostettmann等人，1986)。

例如，通过在C-8吸着剂(用甲醇-水，2∶1)上的MPLC得到了足够生物测试量的Cussonia spicata五甲科(Araliaceae)的杀螺剂皂苷(Gunzinger等人，1986)。事实上，该方法只需两个步骤(一步在硅胶载体上，另一步在RP物质上)，即可从茎皮的丁醇提取物中分离出皂苷。

也可用组合MPLC来分离皂苷，如用LiChroprep RP-8(25-40μm，46×2.6cm)柱(用甲醇-水混合液)与旋转小室逆流层析(RLCC)联合(Dorsaz和hostettmann，1986)。另一MPLC技术采用轴向压缩(Jobin-Yvon)柱(Elias等人，1991)。

下表1列出了从植物提取物中分离三萜所用的载体-溶剂组合实例。

             表1：在三萜皂苷分离中MPLC的运用

植物	载体	溶剂	参考文献
				Cussonia spicata	硅胶	CHCl3-MeOH-H2O(6∶4∶1)	Gunzinger等人，1986
C-8	MeOH-H2O(2∶1)	Gunzinger等人，1986
			欧洲金盏花(Calendula arvensis)		C-8	MeOH-H2O(65∶35，73∶27)	Chemli等人，1987
金盏花(C.officinalis)	硅胶	CHCl3 MeOH H2O(61∶32∶5)		Vidal-Ollivier等人，1989
			C-18		MeOH-H2O(60∶40，80∶20)	Vidal-Ollivier等人，1989
	革叶远志(Polygalachamaebuxus)	硅胶		CHCl3-MeOH H2O(80∶32∶5)			Hamburger和Hostettmann，1986
C-8			MeOH-H2O(55∶45)		Hamburger和Hostettmann，1986
		Swartziamadagascariensis		C-8		MeOH-H2O(65∶35)	Borel和Hostettmann，1987
Talinum tenuissimum	C-8		MeOH-H2O(60∶40)		Gafner等人，1985
		印度田菁(Sesbaniasesban)		C-8		MeOH-H2O(55∶45，60∶40)	Dorsaz等人，1988
Tetrapleuratetraptera	C-8		MeOH-H2O(70∶30)		Maillard等人，1989
		亮叶合欢(Albizzialucida)		C-8		MeOH-H2O(6∶4→9∶1)	Orsini等人，1991
C-18	MeOH-H2O(7∶3)		Orsini等人，1991
				大果西番莲	C-18	MeOH-H2O(17∶3)	Orsini和Verotta，1985

洋长春藤(Hedera helix)	C-18	MeOH-H2O梯度	Elias等人，1991
				黄花九轮草(Primulaveris)	C-18	MeOH-H2O(5∶5→7∶3)	Calis等人，1992
硅胶	CHCl3-MeOH-H2O(61∶32∶7)	Calis等人，1992
			类固醇皂苷
Balanites aegyptiaca	硅胶	CHCl3-MeOH-H2O(80∶20∶1 →25∶25∶2和70∶30∶3)		Hosny等人，1992

(vi)高效液相层析(HPLC)

用HPLC作层析是从密切相关的化合物的混合物中得到数毫克量皂苷的高效方法，在这方面常常作为纯化的最后一步。而MPLC采用较大颗粒(25-100μm)，半制备HPLC吸着剂在5-30μm粒度范围内，故允许较高的分离效率。

用半制备HPLC从(石竹素三糖苷的)部分水解产物中分离了石竹素三糖苷。为了确定半乳糖分子是否连接在葡萄糖残基的C-3或C-4位点上，这是必需的。用乙腈-水(38∶62)在7μm LiChrosorb RP-8柱(250×16分钟)进行同分异构皂苷的分离，流速为10ml/分钟。在206nm对50mg的混合物作检测(Decosterd等人，1987)。

在轴向压缩柱(100×11cm I.D.)上大规模地从神荞(Bupleurum falcatum)(扇形科)根分离了柴胡皂苷(saikosaponins)a、c和d。通过溶剂分配和HP-20聚合体上层析对甲醇提取物进行初步纯化。用C-18硅胶(20μm颗粒大小；5kg)装填制备性HPLC柱，以210ml/分钟的流速用含水乙腈分步梯度(step gradient)洗脱。每10g装料足可得到400mg柴胡皂苷c，1200mg柴胡皂苷a和1600mg柴胡皂苷d(Sakuma和Motomura，1987)。

已通过一种两步程序从Panax trifolius(五加科)中分离得到人参皂苷，包括在Waters Prep500系统(放射型压缩柱)上进行层析，该系统中串联排列有三个硅胶柱体(300×57分钟)。洗脱液是n-丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)的上相，注射入4g装料。最终纯化为在糖类柱(Waters，300×7.8mm)上进行半制备性HPLC，使用乙腈-水(86∶14或80∶20)，流速为2ml/分钟(Lee和der Marderosian，1988)。

检测HPLC洗脱液成分的一个最大困难是，对大多数皂苷来说缺少适合UV检测的生色团，虽然这可通过一些技术来克服，如折光指数检测、质量检测和衍生。

然而，估计梯度变化是很小的，一般可用203-210nm的UV检测(用适合的纯溶剂)。用乙腈-水梯度的UV检测也已成功地进行了分离。在低波长中乙腈比甲醇理想，因为它的UV吸收更小。如果测试的一系列皂苷的偏光性差异不太大(例如只有糖链上的小变化)，则可以用等度洗脱。

分离皂苷混合物的有用的方法包括，在辛烷基结合柱上用含水乙腈梯度洗脱分离。乙腈的量在20分钟内从30％增加到40％，产生相对小的基线漂移(在UV吸收下)。极性较强的双锁链皂苷通常较单锁链洗脱快得多，葡糖苷酸比其它糖苷保留得少。无极性辛烷基甲硅烷基载体可用于皂苷亲脂性部分的选择。用该技术，可在极性较弱的石竹素的相同糖苷之前洗脱出长春藤苷元的糖苷(Domon等人，1984)。

1.衍生的三萜的用途

低波长检测因痕量的高UV活性物质的干扰导致产生不稳定基线的问题，可通过使用衍生的三萜进行HPLC得以改进。一种可能是将皂苷中发现的游离羧基功能化，如已报道的定量测定单锁链皂苷那样。在存在碳酸氢钾和冠醚的情况下，用4-溴苯甲酰甲基溴处理石竹素糖苷，形成溴苯甲酰甲基衍生物。该4-溴苯甲酰甲基衍生物在254nm有强吸光度，可在该波长进行检测而无任何来自溶剂的干扰(Slacanin等人，1988)。如下显示该衍生物。

另一检测方法是通过酯化羧酸分子制备荧光香豆素衍生物。通过此法，在各种不同大豆和不同的大豆器官中定量分析和测定了大豆皂苷(soyasaponin)(以蒽为内部标准)(Kitagawa等人，1984a；Tani等人，1985)。

2.样品纯化

为了除去干扰物质(通常是高UV吸收物质)，可能需要一步预纯化步骤。这可通过例如用Sep-Park^RC₁₈(Guedon等人，1989)或Extrelut^R(Sollorz，1985)柱体实现。

对于一些离子化合物，如那些在苷元或葡糖醛酸分子上含有游离羧基的(化合物)，如果要避免峰展宽，需要某些方法来抑制离子形成。这可通过在液体中加入低UV吸收的酸(如磷酸或三氟乙酸)而完成。也可用离子配对HPLC，将反离子加入到流动相中。通过与配对试剂形成离子复合物，增加了离子化合物的容量因子。羧基基团的衍生物(如上述)是流动相的另一添加物，结果大大提高了峰的分辨率。

定量HPLC较光度测量法的优点是可确定混合物或提取物中各种皂苷的数量。在许多试验中，HPLC得到的结果比比色、气相色谱和TLC-荧光技术得到的结果要好。

在皂苷混合物在反相HPLC柱上峰分辨率不充分的情况下，可以采用许多其它方法，包括用羟基磷灰石柱、化学修饰的多孔玻璃柱、硅胶柱和硼酸复合物HPLC。

3.羟基磷灰石

羟基磷灰石(Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)比硅胶更亲水，可用简单的二元含水溶剂系统中，从而便利了用UV检测。它在中性和碱性介质中是稳定的。最近，已制备了耐高压(到150kg/cm²)的羟基磷灰石的硬球状颗粒，扩大了HPLC的运用。那些只在终端戊糖单元中有差异且不能通过RP-HPLC分离的皂苷，可用这种技术分辨(Kasai等人，1987b)。从人参(Panax geinseng)(五加科)中分离人参皂苷在等度模型(乙腈-水，80∶20)得到实现，或用线性梯度(乙腈-水70∶30→90∶10)更好(Kasai等人，1987b)。如硅胶所见，为了增加极性而洗脱糖苷，即与RP-HPLC相反。

4.硼酸离子交换HPLC

已发现这种方法可运用于分析单糖和寡聚糖。获得这项技术最佳的结果是用阴离子交换柱，如Asahipak ES-502N^TM，100×7.6分钟柱(Asahi Kasei Kogyo Co.)，75℃用20％(v/v)乙腈(pH8)配的0.4M H₃BO₃。该层析分离特征取决于糖分子中顺二醇硼酸复合物的形成。分离后，通过用甲醇反复共蒸馏洗脱液可将硼酸除去(如挥发性硼酸甲酯那样)。

5.化学修饰的多孔玻璃

微孔玻璃(MPG)有高的化学耐受性，且在pH2和pH12间是稳定的。已制备了十八烷基多孔玻璃(MPG-ODS)用作反相HPLC的填料，用于迅速高效地分离皂苷。例如，可用乙腈-水(25.5∶74.5)混合物进行分离，从含有人参和柴胡根的组合药提取物中同时分离出人参皂苷和柴胡皂苷(Kanazawa等人，1990a)。比较用于人参提取物和用于人参皂苷混合物HPLC的MPG-ODS和硅-ODS柱，显示它们的保留性能相似，但MPG-ODS柱的容量因子较小。MPG-ODS柱上一些人参皂苷的配对分辨率较好(Kanazawa等人，1993)。

6.硅胶

在分离皂苷时常常不可避免地要用到含水流动相，硅胶HPLC通常本身不参与这种洗脱。然而，对柱填料进行修饰可以分离水溶性糖苷而不损坏柱。这方案包括，首先用甲醇洗涤柱，然后用氯仿-甲醇-乙醇-水(62∶16∶16∶6)混合液洗涤，最后用用于分离的溶剂系统洗涤(Kaizuka和Takahashi，1983)。例如，用5μm硅胶柱，用含水洗脱液∶己烷-乙醇-水(8∶2∶0.5)，可以实现有效分析神茭(Bupleurum falcatum)的人参皂苷和柴胡皂苷。

(vii)其它层析技术

分离纯的皂苷需要一个或更典型地多个层析分离步骤，来除去醇提取物或含水植物提取物的其它极性成分。

已描述了各种分离技术可用于分离三萜皂苷，包括快速层析(flashchromatography)、DCCC、低压液相层析(LPLC)、中压液相层析(MPLC)、HPLC和常规的开柱层析(见，如Hostettmann等人，1986，1991；Marston和Hostettmann，1991b)。对于分离条件、溶剂系统等的观点，本领域技术人员按照这里的公开内容将会知道。最好的(试验)结果将通常采用如本文下面公开的具体方法组合而实现。

由于许多皂苷是酸性的，可形成盐，且在完成层析时，可能需要用离子交换树脂处理以得到游离的皂苷。合适的树脂例子包括Dowex 50Wx8(H⁺形式)(Kitagawa等人，1988；Yoshikawa等人，1991)，Amberlite IRC 84(Okabe等人，1989；Nagao等人，1990)和Amberlite MB-3(Mizutani等人，1984)。然而，如果需要中性pH或仔细控制pH来防止分解，应避免在离子交换树脂上过滤的步骤。

在一些试验中，将粗制皂苷组分甲基化(假设存在游离COOH基团)，以达到满意地分离密切相关的产物(Okabe等人，1989；Nagao等人，1989，1990)。

1.快速层析

快速层析是一种制备性加压液相层析方法，与常规的开柱层析相比，能节约许多时间。用普通的玻璃柱，但洗脱液是用压缩空气或氮气推动通过吸着剂，在柱的顶部达到最大压力2bar。因为在压力下传送溶剂，因此吸着剂的颗粒稍微减小，分辨率也因此较高。

快速层析可用作初步组分的开柱层析方法的快速替代法。用这种方法，只要10分钟就可分离10mg到10g的样品。例如，用这种技术可从Dolichoskilimandscharicus(豆科)根中分离杀螺剂和杀真菌长春藤苷元、bayogenin和medicagenin糖苷。在硅胶(63-200μm粒度分析)60×4cm柱上，用溶剂系统氯仿-甲醇-水(50∶10∶1)分级分离了甲醇提取物，流速为15ml/分钟。这足以除去污染物质，得到两种富含皂苷的组分。在C-8载体上通过DCCC和LPLC组合得到纯三萜糖苷(Marston等人，1988a)

虽然大部分运用中，用到硅胶吸着剂，但递增趋势是采用RP材料。RP快速层析能从其它极性更强的成分(如寡聚糖)中分离皂苷。

2.低压液相层析(LPLC)

LPLC用于分离纯皂苷是因为其分离速度和容易操作。LPLC采用含颗粒大小为40-60μm的吸着剂的柱。在高达10bar压力下的高流速是可能的，且大部分柱由玻璃制成。可购得的预装柱(如Merck的“Lobar”系列)有不同的尺寸，对于50-500mg范围样品皂苷的制备性层析是理想的。均匀的高密度填料保证了良好的分离效率。另外，如果吸着剂的化学性质相似，可相对容易地将分析性HPLC条件转变到LPLC分离(Marston和Hostettmann，1991b)。

在RP吸着剂上已完成了大部分的运用，用甲醇-水混合液洗脱。在这种情况中，一般只有预先纯化的样品被注射入。从Swartzia madagascariensis(豆科)中分离杀螺剂和溶血性石竹素和丝石竹配基糖苷时，得到了很好的LPLC图。用水提取了干燥的磨碎的荚果，该提取物分配在正丁醇和水之间。在有机相的开柱层析后，用甲醇-水(75∶25)作洗脱液在Lobar LiChroprep C-8柱(40-63pro；27×2.5cm)上分离得皂苷(Borel和Hostettmann，1987)。

将LPLC柱串联起来可增加装载量和/或分离能力。当三个Lobar 27×2.5cm柱连接起来时，这种方法用于从Actinostemma lobata(葫芦科)分离达玛烷糖苷。洗脱液也含有少量的水(乙酸乙酯-正丙醇-水20∶3∶0.3)(Iwamoto等人，1987)。

3.逆流层析

已证明液相-液相分配方法运用于皂苷领域是理想的。强极性皂苷本身特别适合逆流层析分离，尤其是不会因不可逆吸附到填料上而损失皂苷。这已被特别地用于粗制提取物的直接分级分离上。

4.小滴逆流层析(DCCC)

DCCC依靠流动相的小液滴连续通过大量垂直玻璃管中含有的不互溶液体固定相。溶解物经历两相之间的连续分配。层析是“递减”还是“递增”模式，分别取决于流动相是被引入到这些管的顶部还是底部。可以用DCCC分离密切相关的皂苷，而且也可分离纯产物(Hostettmann等人，1984)。事实上，那些不能用液相-固相层析的分离可以用这种技术来完成。DCCC能够分离只在糖残基乙酸基团取代位点有差异的同分异构皂苷(Ishii等人，1984)。

许多溶剂系统已用于DCCC分离皂苷(见如Hosstettmann等人，1986)，其中氯仿-甲醇-水(7∶13∶8)是运用最多的系统。氯仿-甲醇-水系统既可以递增模式用于极性皂苷，也可以递减模式用于拥有一个或两个糖和少许游离羟基的皂苷。

已描述了初步纯化的大规模DCCC流程，采用18根柱(30×10mm ID)，以正丁醇-饱和水为固定相，以水-饱和正丁醇为流动相(Komori等人，1983)。在一些试验中，进行两次(或多次)DCCC分离得到纯皂苷。

5.离心分配层析(CPC)

最近介绍了CPC技术，因为其速度和通用性而具有很大的应用前景(Marston等人，1990)。CPC对固定相的保留依赖于离心场(而不是重力场)，该离心场由800-2000r.p.m.(或更快)的旋转产生。这种方法的原理涉及溶解物在旋转螺管或柱体中含有的不互溶的两相之间不均衡分配的连续过程。

以旋转螺管为基础的仪器可能涉及围绕中心轴作行星式或非行星式的运动。其中有一种，高速逆流层析(HSCCC)由1.6或2.6mmI.D的Teflon管组成(围绕转子环绕成螺管)。一个、两个或三个转子组成该仪器的心脏。就柱体仪器而言，柱体固定在离心机转子的周围，且它们的纵轴平行于离心力的方向。柱体的数量和容积可以是不同的，取决于仪器的用途。与可能需要需要2天或更长时间来分离的DCCC和RLCC相比，CPC在几小时内就可得到相同的结果。以旋转螺管或柱体为基础的仪器具有高达克规模的能力。多层螺管行星式仪器已用于如初步纯化Abrus fruticulosus(豆科)的环艾烷糖苷(Fullas等人，1990)。已在不同的仪器(Sanki LLN层析仪，6柱体；总容量为125ml)上分离得到了长春藤(Hederahelix)(五加科)的杀螺剂三萜糖苷。在正丁醇和水之间分配了果实的甲醇提取物。将100mg量的丁醇组分直接注射到仪器中，用氯仿-甲醇-水(7∶13∶8)溶剂系统的底层作为流动相。

积雪草(Centella asiatica)(伞形科)的两个主要皂苷积雪草糖苷(asiaticoside)和madecassoside已借助于Ito多层螺管分离器-提取器(P.C.Inc.)(配备有一个66m×2.6mmI.D.柱(350ml容积))得以分离，转速为800r.p.m.。400mg的样品可用氯仿-甲醇-2-丁醇-水(7∶6∶3∶4，流动相为低相)的溶剂系统分辨。检测用在线TLC(Diallo等人，1991)。在从Sesamumalatum(Pedaliaceae)分离三萜双糖中用到了相同的仪器。选择氯仿-甲醇-异丙醇-水(5∶6∶1∶4)溶剂的低相为流动相，注射了1.25g的装料(Potterat等人，1992)。

6.方法的组合

仅用一个层析步骤就足以从提取物中分离出纯皂苷的情况是很少的。一般规律是，需要若干制备性技术来得到必需产物。传统技术(如开柱层析)和现代高分辨率方法(如HPLC)的组合证明适合于分离多种皂苷。

例如，硅胶和RP材料上的MPLC、LPLC和离心TLC组合来分离皂苷(Hamburger和Hostettmann，1986)。类似地，从Swartzia madagascariensis(豆科)中分离五种三萜皂苷需要开柱层析、LPLC和MPLC(Borel和Hostettman，1987)。

已将CPC和快速层析及OPLC结合起来用于从Abrus fruticulosus(豆科)中分离三萜糖苷。多层螺管仪(7∶13∶8的氯仿-甲醇-水为溶剂，底层为流动相)提供初步纯化，快速层析和OPLC则可有效地得到纯物质(Fullas等人，1990)。

有时将在未修饰硅胶上进行的快速层析与在RP材料上进行的快速层析或开柱层析直接结合，可有效纯化皂苷(Schopke等人，1991)。

另一方法包括使提取物(在初步分配后)通过高度多孔的聚合体，该步骤后进一步分级分离粗制皂苷混合物。这种方法用于从掌叶梁王茶(Nothopanaxdelavayi)(五加科)中分离3β-羟基石竹-12-烯-28，29-二酸(3β-hydroxyolean-12-en-28，29-dioic acid)糖苷。叶和根的甲醇提取物分配在己烷和水间。在DiaionHP-20柱上层析含水层，用水、10％甲醇、50％甲醇、80％甲醇、甲醇和氯仿洗脱。接着用乙酸乙酯-乙醇-水(7∶2∶1)在硅胶柱上进行80％甲醇洗脱液的柱层析，得到糖苷(Kasai等人，1987a)。对于从刺五加(Acanthopanax senticosus)(五加科)中三萜和非三萜皂苷的分离，以在Diaion HP-20聚合体上分级分离叶子的甲醇提取物为开始。在硅胶上层析甲醇洗脱的组分(氯仿-甲醇-水30∶10∶1)，将所有得到的组分进行LiChroprep RP-8柱层析。最终纯化通过TSK-FEL ODS-120T(300×21分钟；甲醇-水70∶30；6ml/分钟；RI检测)上的HPLC或羟基磷灰石柱层析(乙腈-水85∶15)完成(Shao等人，1988)。

分离石竹酸糖苷的方案包括，采用葡聚糖凝胶LH-20(甲醇)、DCCC(氯仿-甲醇-水7∶13∶8)和HPLC(C-18，甲醇-水65∶35)的组合(De Tommasi等人，1991)。

(viii)显色反应

可用三萜与各种试剂之一反应产生有色化合物，来定量或定性测定三萜。例如芳醛，如用强矿物酸(如硫酸、磷酸和高氯酸)配制的茴香醛(aisaldehyde)和香草醛，可与苷元得到有色产物，最大吸光度在510-620nm之间。在这些反应中，据信发生脱水作用，形成不饱和的亚甲基基团，这些亚甲基基团与醛产生有色的缩合产物。在香草醛-硫酸存在的情况下，带有C-23羟基的三萜皂苷的峰位于460和485nm之间(Hiai等人，1976)。

不饱和的和羟基化的三萜和类固醇与乙酸酐和硫酸产生红、蓝或绿色(Abisch和Reichstein，1960)。由于萜类皂苷趋向于产生粉红或紫红色，而类固醇皂苷产生蓝-绿色，用这种技术就可区别它们。

许多其它试剂可用于检测三萜，包括：硫酸铈(IV)或铁(III)盐和无机酸如硫酸，产生紫-红色溶液；用醋酸酐-醋酸试剂配制的30％氯化锑(III)溶液，与羧基三萜和羧基类固醇产生显色反应；用硝基苯-甲醇配制的氯化锑(III)，可用于辨别类固醇糖苷的5，6-脱氢衍生物(薯蓣皂苷元(diosgenin)和茄解定糖苷(solasodine〕)和5α-或5β-H衍生物(如番茄素)；和咔唑，其当存在硼酸酯和浓硫酸时将指示糖醛酸的存在(Bitter和Muir，1962)。

下表2列出了用于检测和分光光度测定和比色测定皂苷的试剂例子。

               表2：三萜皂苷的显色试剂

试剂	参考文献
		香草醛-硫酸	Godin，1954
香草醛-磷酸	Oakenfull，1981
		伯-李二氏试剂(Liebermann-Burchard)(乙酸酐-硫酸)	Abisch和Reichstein，1960Wagner等人，1984
用10％硫酸配制的1％硫酸铈	Kitagawa等人，1984b
		用乙醇配制的10％硫酸	Price等人，1987
50％硫酸	Price等人，1987
		p-茴香醛-硫酸	Wagner等人，1984
Komarowsky(p-羟基苯甲醛-硫酸)	Wagner等人，1985
		氯化锑(III)	Wagner等人，1984
血	Wagner等人，1984
		水

(ix)从胜利金合欢中分离三萜糖苷

在亚利桑那大学(Tucson.AZ)通过氯仿∶甲醇或二氯甲烷∶氯仿提取制备了荚果提取物。从胜利金合欢(Benth.)(豆科)中分离了单萜/三萜糖苷混合物。如下进行UA-BRF-004-DELDP-F001的第一次收集：(1)在Wiley磨上碾磨到3mm颗粒大小，(2)装料到2L的渗滤组件上，(3)用二氯甲烷∶甲醇(1∶1)提取磨碎的生物物质(ground biomass)4小时，然后过夜，真空干燥合并的组分，产生UA-BRF-004-DELEP-F001(52g)。用乙酸乙酯提取F001(51.5g)，得到活性难溶物质(34.7g)，命名为F004。用1.7kg硅胶(Merck，23-220μm颗粒大小)作快速层析来分级分离F004(34.2)，用二氯甲烷∶甲醇(分级梯度95-0％∶甲醇5-100％)洗脱51份670ml组分，用9L甲醇洗涤此柱，然后用6L甲醇∶水(80∶20)洗涤，再用6L添加有1％甲酸的相同洗脱液洗脱。根据TLC，将组分23-34和39-40合并成17.2gF023。用8g F023进行两次中压液相层析(MPLC，Buchi 632 system)，在用Lichroprep C18填料的4.9×46cm柱上，15-25μm颗粒大小，用乙腈∶水(0，10，20，30，50％乙腈水溶液)的分级梯度，然后用100％甲醇洗涤。16克0～20％乙腈产生7克无活性的F027。合并残留的物质用于重复的MPLC(用30-40％乙腈的相同系统)使重叠最小化，产生组分F028-F036。虽然这些组分大部分都显示出抗肿瘤活性，但仅选择F035(组分35)(最高收率为2.19g)用于进一步的测试和评定。

II.单萜/三萜的结构测定

可采用各种不同方法定量和定性测定单萜/三萜和它们的活性，包括杀鱼活性、重量分析、分光光度法、TLC、GC、HPLC、HMQC、HMBC、NOESY、COSY、NMR、X射线晶体图等。以三萜皂苷的典型特性(表明活性、对鱼的毒性)为基础的测定已大部分地被光度测定法所替代，如密度测定法、衍生物的比色法，最近则被GC、HPLC尤其是NMR所替代。分光光度法非常灵敏，但通常并适合植物粗提取物中三萜的估算，因为反应不是特异性的，而且与伴随三萜的化合物(如植物甾醇类和黄酮类)可形成有色产物。在大部分皂苷分析中另一个普遍的问题是，它们从植物原料中提取不完全。然而，已有许多适合定量测定三萜的技术。

在阐明皂苷结构中有若干基本的问题需要解决：真苷元的结构；糖类分子中单糖成分的组成和序列；单糖单元是如何彼此连接的；每个糖苷键连接的单糖单元的端基异构结构；和苷元上糖类分子的位置。

必需的方法是用组合的方法来得到对结构的最终结论。结构的研究一般是一个逐步的过程，其中皂苷被逐步断裂成更小的片段，对这些片段自身作光谱分析。对于这些片段数据的明智分析，可得到皂苷组成的概念。

通常分离的纯化皂苷的量很小，所以宜采用高灵敏性、高分辨率和(如果可能)非降解方法来辅助三萜的结构测定。NMR光谱学和质谱(MS)的革新为复杂的皂苷的研究提供了必需的能力。通过这些技术和其它技术的组合可以进行结构测定。例如，FAB-MS给出了分子量的信息和(在许多情况中)糖序列，而I-D和2-D NMR技术能给糖键定位和提供苷元结构的说明。在Tanaka和Kasai(1984)的叙述中对这种结构测定和化学研究已作过彻底地讨论。

(i)核磁共振(NMR)

在所有研究寡聚糖和糖苷结构的现代方法中，NMR光谱学提供最完整的信息(有或无先前的结构知识)(Agrawal，1992)。从原理上讲，这是唯一无需其它方法辅助就可得到完整结构的方法。

1.¹³C核磁共振

现被广泛用于皂苷结构确定的碳-13NMR光谱学，是一种快速非破坏性方法，但其需要相当数量的样品(mg量)。光谱分析允许绘制出以下有关结论，糖苷链结合于苷元的位点；单糖的序列、性质和数量；糖苷键间的构型和构象；链中酰基糖苷的存在情况；苷元的性质；和结合的酸式酯的结构。

为排布化学位移，将观察到的数据与报道的模型化合物和相关化合物的数据作比较是有帮助的。作为在三萜皂苷的¹³C-NMR光谱中一些典型化学位移的指南，技术人员可以利用已知的bayogenin糖苷的位移(Domon和Hostettmann，1984)。另外，已制作了以下物质的¹³C-NMR信号排布汇编(Nakanishi等人，1983)：石竹烷(Patra等人，1981；Agrawal和Jain，1992)、乌斯烷、羽扇烷(Wenkert等人，1978；Sholichin等人，1980)、何帕烷(Wenkert等人，1978；Wilkins等人，1987)和羊毛甾烷(Parrilli等人，1979)三萜。在一综述中总结了达玛烷糖苷的相关数据(Tanaka和Kasai，1984)，同时描述了saikogenin(Tori等人，1976a)和柴胡皂苷(Tori等人，1976b)的¹³C-NMR光谱学。也已研究了人参皂苷元和相关的达玛烷三萜(Asakawa等人，1977)。也已描述了金合欢酸的¹³C-NMR光谱学(Kinjo等人，1992)。

在¹³C-NMR中，当羟基被衍生，即被糖基化、甲基化(或乙酰化)时，糖和苷元分子的α-和β-碳均经历了特征性转变。例如，α-CH信号被移动到低磁场，而β-C信号被移动到高磁场，一种由γ-高磁场移动造成的移动。因此，苷元的糖基化导致α-碳的低磁场移动和毗邻碳原子的高磁场移动(糖苷化移动)(Tori等人，1976b；Kasai等人，1977)。在石竹烷中，3β-OH基团的糖苷化导致C-3移动到低磁场c.8.0-11.5p.p.m.，C-2和C-4移动+0.9或-0.9到-1.9p.p.m.，C-23移动到高磁场0.5-5.1p.p.m.和C-24移动-0.2到1.6p.p.m.。28-COOH基团的糖苷化导致羧基碳共振移动到高磁场(2.5-5.0p.p.m.)，以及C-17信号移动到低磁场(1.0-2.5p.p.m.)(Agrawal和Jain，1992)。因此苷元和皂苷的¹³C-NMR数据的比较给出了糖键的位置(Seo等人，1978；Tanaka，1985)。

以相似的形式，当与模型化合物比较时，考虑化学位移的取代，¹³C-NMR将给出糖苷键间的指示(在较简单的皂苷中)(Konishi等人，1978)。Seo等人(1978)将甲基β-D-岩藻吡喃糖苷的碳-13NMR数据列表，由Gorin和Mazurek(1975)和Dorman和Roberts(1970)列出了更复杂糖的¹³C-NMR信号。芹菜糖给出了¹³C-NMR的特征信号，并已作为文献资料(Sakuma和Shoji，1982；Adinolfi等人，1987；Reznicek等人，1990)。

2.¹H-核磁共振

虽然¹³C-NMR光谱分析和信号排布已成为皂苷结构测定中特别有用的步骤，它们的¹H-NMR光谱的整个排布却很少被报道。¹H-NMR光谱在特性上已证明对分析来说是复杂和繁琐的。糖类分子的绝大部分质子共振表现出非常小的谱宽3.0-4.2p.p.m.(伴有随后重叠的问题)。这些是从非端基异构的糖次甲基和亚甲基质子堆(在单糖残基中有相似的化学位移)衍生的。

然而，三萜的甲基峰是容易辨别的，且自60年代以来(Kojima和Ogura，1989)已通过各种不同的技术排布了石竹烷、ursene和相关骨架中大部分质子共振位置。例如，已通过¹³C-DEPT、¹³C-APT、2-D相关光谱学(COSY)(¹H-¹³C-COSY、¹H-¹H COSY)和¹H-¹H ROESY(在旋转框中的2-D核欧沃豪斯(Overhauser)增强(NOE))技术的组合，建立了大豆皂草精醇(soyasapogenol)B的完整¹H-和¹³C-NMR光谱排布(33)和C-4羟甲基取代基的构型(Baxter等人，1990)。用¹H-检测的异核多键(HMBV)和单键(HMQC)光谱学证实了这种皂草精醇中季碳共振的排布(Massiot等人，1991b)。也完成了薯蓣皂苷元和茄解定糖苷的¹H-NMR光谱的全面解释(Puri等人，1993)。

可以从¹H-NMR光谱获得关于糖链端基异构构型和连接键的一些有用数据。例如，α-连接的葡萄糖单元的C-1质子的偶联常数约为3Hz，而β-连接的单元的偶联常数为6-7Hz。在其它文章中可发现更详细的端基异构糖质子的偶联常数(Lemieux等人，1958；Capon和Thacker，1964；Kizu和Tomimori，1982)。

当测定石竹烷和ursene三萜的C-2、C-3、C-23、和C-24上羟基构型产生困难时，对携带氧的碳原子上质子的¹H-NMR信号峰作分析提供了有价值的信息(Kojima和Ogura，1989)。

(ii)1-D和2-D NMR技术

在实践中，可以鉴定一些¹H和¹³C NMR光谱，并在移动论证的基础上排布，但为了以严格方式解释NMR试验的结果，应明确地排布NMR光谱，这意味着确定哪个峰与结构中的哪个碳和/或氢相关。在大部分情况中，这种信息不能从一维的¹H和¹³C NMR光谱数据得到，但可借助于二维研究更好地确定。这些研究通过将信息传播到二频畴和揭示核间相互作用而简化了光谱分析。尽管建立各种不同脉冲序列机理可能很复杂，二维NMR光谱的解释通常是简单的。已设计了许多不同的二维NME研究来解决化学结构。这些技术的例子以及本发明者已具体考虑用于本发明的三萜皂苷的化学(结构)说明的其它NMR技术如下述和表3所示。，皂苷

1.HMBC、HMQC

用HMQC和HMBC ¹³C多量子相干光谱不但对苷元排布有用也可用于糖序列的细节。HMBC和HMQC的使用与¹³C-¹H异核相关光谱(HETCOR)类似，但代替观察¹³C，而是检测更多的¹H。例如，在从雏菊(Bellis perennis)(紫苑科)中提取雏菊皂苷(bellissaponins)时，通过将¹³C-NMR的数据与2-D¹H检测的HMQC和HMBC光谱联合起来考虑，可以在¹H-NMR光谱中排布所有的化学位移。对于该分子中几乎所有可能的关联，都观察到对应于偶联双键和三键的交叉峰。类似地，在HMQC和HMBC光谱中的远程¹H-¹³C关联可用于糖分子的序列和结合位点的确定(Schopke等人，1991)。

2.2-D-NOESY

该技术已被运用于，例如仙客来亭(cyclamiretin)A糖苷(ardisiacrispins A和B)中糖序列(Jansakul等人，1987)和点地梅(Androsace saxifragifolia)(报春花科)saxifragifolin A的单糖序列(Waltho等人，1986)的测定。在对过甲基化(permethylated)皂苷的糖序列进行分析后，用NOESY证实了鼠李糖基和葡糖基键合于刺楸属皂苷C的阿拉伯糖分子上的位置。在鼠李糖基分子的H-1和阿拉伯糖基分子的H-2之间以及在葡糖基分子的H-1和阿拉伯糖基分子的H-3之间，观察到交叉峰(Shao等人，1989b)。在400MHz NMR仪器上已用2-D NOESY阐明了Balanites aegyptiaca(Balanitaceae)呋甾醇皂苷糖分子的结构(Kamel等人，1991)。

协同使用2-D NMR技术可产生对萨洒皂草配基糖苷3-O-[{α-L-吡喃鼠李糖基(rhamnopyranosyl)(1→4)}{β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)}-β-D 吡喃葡萄糖基]-(25S)-5β-螺旋甾烷-3β-醇的寡聚糖片段的完整¹³C和¹H排布。将DEPT、HETCOR、远程HETCOR、不同同核技术、NOESY和INEPT的组合运用到阐明结构中，解决了由质子光谱过密造成的问题(Pant等人，1988d)。

用500MHz仪器，可能仅用NMR技术就能鉴定和测序Blighia welwitshii(无患子科)五糖皂苷3-O-[β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-吡喃阿拉伯糖基](1→4)-β-D-吡喃葡糖基(1→3)-α-L-吡喃鼠索糖基(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基]-长春藤苷元中的糖。首先将该皂苷乙酰化，后续的DQF-COSY、NOESY和ROESY光谱分析允许结构排布。从NOE数据得到的信息对建立糖序列是最有帮助的(Penders等人，1989)。

在多步骤RCT研究的基础上，用NMR鉴定了含有高大一枝黄花(Solidagogigantea)(紫苑科)十个糖残基的皂苷。这包括COSY、异核COSY、COSY-型H-H-C相干转移和2-D NOESY研究。这样就避免了广泛的降解研究，且用30mg产物就可确定结构(Reznicek等人，1989a；1989b)。用类似的技术对其它四种来自相同植物的糖苷，紫苑科皂苷(giganteasaponin)1-4(含有九个或十个糖单元的bayogenin的双锁链苷(bidesmoside))作了结构确定(Reznicek等人，1990a)。

2-D COSY、HMBC和ROESY NMR的组合研究足以得到mimonoside A(一种来自Mimosa tenuiflora(豆科)的石竹素皂苷)中己糖的序列和键合位点(Jiang等人，1991)。

过乙酰化和非衍生的菊黄素(chrysantellin)A的2-D NMR允许质子的排布和糖的测序。这种酯化木糖分子显示存在于β形式中，且具有¹C₄构象。在所用的方法中，对过乙酰化衍生物用HMQC、HMBC和ROESY(或，更精确的CAMELSPIN(适合于被锁定旋转仿真小分子的交叉弛豫)，对天然皂苷用HOHAHA、TOCSY。ROSEY研究是特别可用于糖序列的确定(Massiot等人，1991a)。

已从NT₁数据和NOESY研究建立了海洋生物糖的序列和三萜糖苷的糖苷间键(Miyamoto等人，1990)，但该方法受到¹H-NMR光谱(在3-5p.p.m.区域中)复杂性的限制，这通常妨碍了用于大量质子的NOE的测量。然而，用COSY、NOESY和直接和XHCORR NMR光谱的组合允许对海参(Holothuria forskalii)的戊糖三萜皂苷的全部信号排布和结构分析(Rodriguez等人，1991)。

在对山地谷苷(santiagoside)(一种Neosmilaster georgianus南极海星的海星皂苷)结构确定中，广泛地运用了COSY、TOCSY、HMQC和ROESY NMR光谱技术，并用ROESY研究解决糖的精确测序、它们的结合位点和立体化学(Vazquez等人，1992)。

3.COSY

2-D NMR光谱学有两种基本类型：J-分解光谱，其中一个频率轴含有自旋耦合(J)和其它化学位移信息；和相关光谱，其中两个频率轴都含有化学位移(δ)信息(Agrawal，1992)。2-D分析的主要益处之一是提供了一种克服光谱密集问题的方法。在高电场¹H-COSY，这是特别真实的2.5-4.0p.p.m.区域，这样可简化糖质子的排布。在理想的条件中，可以鉴定存在于所给定糖残基中的所有质子。

可从COSY光谱得出若干普遍结论。例如，可以通过相应羟基质子的存在或缺少确定单糖单元的取代位点；可直接测定单糖环的大小；以及交叉峰的特征显示了重叠峰的峰裂数(提供了对偶联常数的估计)。

在一些情况中，仅用¹H-NMR 1-D和2-D光谱就完成了对皂苷和它的糖序列的结构解释(Massiot等人，1986；1988b)。首先将皂苷过乙酰化，如果场强足够(＞300MHz)糖质子共振分裂成两个区带：一个在4.75和5.40p.p.m.间，命名为CHOAc，另一个在3.0和4.3p.p.m.间，命名为CH₂OAc、CHOR和CH₂OR。在醚键或频率高于5.5p.p.m.的酯键中，端基异构质子位于这两个区带之间。

过乙酰化也得到可溶解于氯仿、苯或丙酮的衍生物。在等效全氘化溶剂中，分子的移动率这样的：即观察到的信号更清晰，测量的偶联常数有高精确性。对于乙酰化的苜蓿根皂苷，COSY和远程COSY研究足以鉴定结构(如Ara-²Glc-²Ara-³长春藤苷元²⁸-Glc)(Massiot等人，1986)。

已用与上述类似的技术阐明了紫苜蓿(Medicago sativa)(豆科)苜蓿树叶和Tridesmostemon claessenssi(山榄科)的进一步过乙酰化皂苷的结构。从HMQC(对¹J偶联)和HMBC(对²J和³J偶联)和同核Hartmann-Hahn(HOHAHA)三接替COSY和ROESY研究得到了排布和糖序列的确证(Massiot等人，1990；1991b)。T.claessenssi皂苷的酯糖链含有异常¹C₄构型的β-D-木糖分子(所有取代基都是轴向的)。在600MHz，可足够良好地分辨¹H-NMR光谱以允许所有¹H化学位移排布而无需过乙酰化(Schopke等人，1991)。

4.远程COSY

这项技术用于鸦葱(Allium vineale)(百合科)类固醇皂苷中糖质子的排布(Chen和Snyder，1987；1989)。远程¹H-¹³C COSY已被用于环黄芪皂醇皂苷中苷元结构的确定(Wang等人，1989b)，和上述紫苜蓿皂苷内葡萄糖端基异构质子和内阿拉伯糖H-2之间⁴J内糖偶联的定位(Massiot等人，1986)。

5.双量子过滤、相敏感性COSY(DQF-COSY、DQ-COSY)

这项技术运用于鸦葱类固醇皂苷中糖质子的排布(Chen和Snyder，1987；1989)和Crossopteryx febrifuga(茜草科)根的16α-羟基原-椴树酸糖苷中¹H化学位移的排布(Gariboldi等人，1990)。相同的技术也用于提供石屏无患子(Sapindusrarak)(无患子科)果实乙酰化长春藤苷元衍生物中糖质子的完整排布(Hamburger等人，1992)。用NOE示差分光谱确立了糖苷内的连接键(Hamburger等人，1992)。

6.HOHAHA

HOHAHA研究完整地阐明了丝石竹配基苷元和皂皮酸糖苷的质子偶联网络。除了观察到的相关交叉峰是在同相以外，这些和COSY研究是相似的(且和全相关性光谱-TOCSY相关)，所以防止了重叠峰的偶然零值。对糖链的阐明，从HOHAHA研究得到的邻位偶联常数使得可以确定每个不对称中心的有关立体化学，从而能够鉴定单糖。可用异核H-C接替研究排布HMBC光谱测定的糖分子和糖键中的¹³C共振(Frechet等人，1991)。

7.FLOCK、COLOC和NOE

结合双线旋转解偶脉冲的远程异核相关光谱(FLOCK)已被用于观察Sesamumalatum(胡麻科)alatoside中¹H-¹³C的远距离偶联。因此，观察到C-18上的质子和碳原子C-13、C-17和C-28之间的相互作用。当与远程异核¹³C-¹H相关性(XHCORR)联合时，可以得到很多关于该新颖闭联ursene苷元的结构信息(Potterat等人，1992)。

在茜草科(Rubiaceae)的皂苷结构说明中发现一个将¹³C-¹H-2-D相关性光谱学(COLOC)最优化用于远程偶联(²J_CH和³ _CH)的例子(Gaiboldi等人，1990)。

已发现NOE被广泛用于皂苷的结构测中，例如，用于说明羽扇糖苷(luperoside)I(Okabe等人，1989)和山茶定(camellidin)I和II(Nishino等人，1986)的糖质子和糖序列的排布。阿拉伯糖的H-2和鼠李糖端基异构质子之间的NOE帮助证明ziziphin中有Rha-²Ara-双糖键合(Yoshikawa等人，1991b)。自从常常在该键合位点观察到端基异构质子和苷元质子之间的连接后，这种方法已有广泛的运用。在环黄芪皂醇和其它皂苷中3-O-糖苷残基的C-3位点质子和端基异构质子之间已观察到负NOE(Wang等人，1989b)。

               表3用于三萜皂苷结构确立的选定的NMR方法

NMR研究(首字母缩略词)	注释
		结合质子测试(APT)、通过极化转移无失真提高(DEPT)、通过极化转移不敏感性核提高(INEPT)	在碳类型间的辨别；光谱编辑
惊人的天然充沛的双量子转移研究(INADEQUATE)	13C-13C连接，建立分子骨架
		1C，1H-COSYa)普通b)有滞后c)双量子过滤(DQF)-COSYd)排阻COSY(E.COSY)e)成对COSY(Gem-XOSY)f)三量子过滤(TQF)-COSY	同核位移关联说明直接偶联检测小的偶联确定邻位和成对偶联常数精确测定J鉴定成对自旋系统鉴定三个或多个相互连接的自旋系统
接替的相于转移(RCT)、总相关性(TOCSY)和Hartmann-Hahn研究(HOHAHA)	鉴定属于一个自旋系统的所有质子：跨越标量连接的相干转移(尤其适用于鉴定单糖残基)
		同核核极化和交换光谱(NOESY和ROESY)	鉴定5A中互相相关的质子(1H，1H通过空间的相关性)；立体化学分析(取代基的取向)；残基之间和残基内的连接(糖链中的序列分析，包括糖-苷元键)
1H{13cC}SBC(HETCOR和HMQC)	异核位移相关；直接键合的1H和13C位移的排布
		HMQC-TOCSY和HMQC-RELAY	1H和13C位移的交叉排布
1H{13C}MBC(远程HETCOR和HMBC)	季碳的排布；2-4键长的碳共振与质子共振的相关性；残基之间和残基内的排布(糖苷内和糖-苷元键)；分子结构的证明

(iii)用于结构阐明的光谱和其它技术

皂苷和相应苷元的结构阐明不仅依赖化学方法，也依赖光谱和相关技术，例如IR、UV、NMR、MS、旋光分散(ORD)、圆二向色性(CD)和X射线分析。这些技术的某些(最显著的是NMR光谱和MS)中的当代进展有利于分析皂苷和它们分裂反应得到的相应片段，这样可以整理信息和确定相关的结构。另外，NMR光谱是一种非破坏性技术，而且NMR和MS都可以检验完整的皂苷。

需要一种解释皂苷结构的综合方法，其中每种不同的光谱技术都提供了一定的综合数据。

1.质谱(MS)

MS中电离技术的选择取决于待分析化合物的极性、易感性和分子重量。最重要的是所谓“软”电离技术(如FAB和解吸/化学电离(D/CI))，它们可用于获得天然糖苷的分子量和糖序列信息(Wolfender等人，1992)。这些技术可以无须衍生而对糖苷进行分析。在一些情况中，观察到苷元的断裂，但电子碰撞质谱(EI-MS)对这种目的更有用。

2.快速原子轰击MS(FAB-MS)

在FAB研究中，一束加速的原子(或离子)从枪中朝一靶射去，该靶预先装载了含有待分析样品的黏性液体(“基质”通常为甘油或1-硫代甘油)(Barber等人，1981；1982)。当原子束与基质碰撞时，动能转移到表面分子上(从液体溅射到离子源高真空中的大量分子)。在溅射过程中发生了许多这些分子的电离，产生阳离子和阴离子。它们都可以通过恰当选择的仪器参数加以记录，但已证明在整个皂苷研究中阴离子更有用。

3.次级离子质谱(SIMS)

这是另一种颗粒引起的解吸技术，其中keV离子冲击原生质的薄膜表面引起与PD-MS相同的解吸电离(Benninghoven和Sichtermann，1978)。已显示了将这种方法用于三种新的双锁链苷，乙酰-大豆皂苷A₁、A₂和A₃(从美国大豆种子(大豆，豆科)中分离)的结构研究中。明显碎裂的离子峰提供了关于单糖单元中乙酰化模式和这些单元序列的信息。

4.激光解吸(LD)

在LD中，已证明短时激光脉冲(＜10ns)的激发产生与PD和SIMS相似的解吸分子性离子模式。激光解吸/Fourier变换质谱(LD/FTMS)，也是一种适用于分析复杂糖苷的技术，产生不同于FAB-MS但与其互补的光谱。

5.场解吸MS(FD-MS)

这种技术是用于确定皂苷的分子量和糖残基的数量、性质和序列的实用技术(Komori等人，1985)。然而，因为FD-MS的实验复杂性和FAB-MS产生较长效的光谱这一事实，决定了FD-MS技术最近越来越不流行。FD质谱有另一个缺点，即它们因存在的阳离子片段而复杂化，造成了翻译的困难。但FD-MS仍然非常成功地应用于皂苷的结构阐明(Hostettmann，1980)。

(iv)液相层析-质谱(LC-MS)

已开发了若干类型的有效界面，用于直接或间接将HPLC柱流出液引入到质谱分析中。例如，联合半微量HPLC和跳跃(flit)-快速原子轰击(FRIT-FAB)界面，定性分析了粗制皂苷组分(Hattori等人，1988)。在该运用中，用一个NH₂柱(如，μS-Finepak SIL NH₂，Jasco；25cm×1.5mm内径(I.D.))而不是十八硅柱，流出液为1∶20分流比(100μ/分钟→5μl/分钟)。用含有1％甘油的乙腈和水线性梯度洗脱得到峰的尖锐度比用等度洗脱得到的好。已将负FAB质谱用于分子量高达1235的皂苷。用这种技术观察了假分子(pesudomolecular)(M-1)-离子和由糖分子裂解得到的碎片离子(Hattori等人，1988)。

已将FRIT-FAB LC-MS系统用于分离玫瑰(蔷薇科)端基异构皂苷野蔷薇苷和arjunetin端基异构皂苷的混合物。野蔷薇苷(一种乌斯烷糖苷)和arjunetin(一种石竹烷糖苷)在C-28都有一个葡糖残基，且都以氙气为中性气体的负和正FAB模式作分析。在十八硅柱(250×1.5mm)上作HPLC，以乙腈-水(7∶3，含有0.5％甘油)为溶剂，流速为1ml/分钟。在负FBA质谱中观察到假分子[M+1]-和[M+1]+离子以及由母苷元造成的强峰(Young等人，1988)。

也可用动态次级离子质谱(SIMS)检测皂苷，该技术与动态FAB界面(洗脱液直接通过放射源)相似。因此，已将HPLC与UV(206nm)和SIMS检测组合，来分析一种单和两种双锁链三萜皂苷的混合物(Marston等人，1991)。

FRIT-FAB和CF-FAB类型界面的缺点是其需要低流速(约1-5μl/分钟)。在HPLC分离后，必需分裂流出液。然而，热喷涂(TSP)界面(Balckley和Vestal，1983)的特点是操作简单而且能够承受1-2ml/分钟的流速。这使得这项技术对解决植物组分分析问题更具吸引力。TSP技术的核心是分子的软电离，类似于化学电离MS。这就可以分析非挥发性的和热不稳定的单糖、双糖甚至多糖苷。提供了关于皂苷分子量和糖链性质和序列的信息。TSP LC-MS已被用于分析Tetrapleuratetraptera(豆科)果实甲醇提取物中杀螺剂皂苷(Maillard和Hostettmann，1993)。当后柱(post-column)添加了0.5M醋酸铵(0.2ml/分钟)来提供离子蒸发电离的挥发性缓冲液时，TSP LC-MS总离子流(质量范围450-1000a.m.u.)与HPLC-UV分析(在206nm)相对应得很好。660、676、880和882m/z离子轨迹(ion trace)得到的信号代表了主要皂苷的假分子[M+H]+离子。提取物中每种皂苷所需的TSP质谱对假分子[M+H]+离子表现出主尖峰。对主要杀螺剂皂苷aridanin观察到糖分子的断裂，其中N-乙酰葡糖基分子的缺失产生[A+H]+峰(对苷元)(Maillard和Hostettmann，1993)。

LC-MS用于研究皂苷有很大潜力，因为GC-MS只有很小的实际运用，且仅在HPLC中对诸峰作鉴定时可由它们的保留时间来验证。LC-MS不但适合用于分析植物提取物中的三萜糖苷，而且通过MS-MS，对提取物中各皂苷结构的测定也是有价值的。

(v)红外光谱学(IR)

除了IR的常规运用外，有一或两个特性特别相关于皂苷结构的阐明。IR可用于类固醇皂苷的特性鉴定，因为若干在1350和875cm^-1之间的强光谱带可诊断螺旋缩酮(spiroketal)侧链(Jones等人，1953)。四个光谱带980(A光谱带)、920(B光谱带)、900(C光谱带)和860cm^-1(D光谱带)已被指定为E和F环的特征。对25R-皂苷在B光谱带的吸光度强于C光谱带，而对于25R-系这种关系是相反的。在E和F环或在27位点上有氧取代基的皂苷中，这四个光谱带都明显改变了(Takeda，1972)。

在皂苷中是否存在电离的羧基可由1610和1390cm^-1的IR光谱带来确定(Numata等人，1987)。当非常需要知道分子中羧基是否被电离时，该信息在分离步骤中是非常有用的。

(vi)X射线晶体图学

已用X射线晶体图学来解释积雪草(伞形科)三糖三萜积雪草糖苷的分子几何形态。从二烷结晶(Mahato等人，1987)。X射线衍射分析对证实软酸(mollicacid)3-β-D-葡糖苷结构的构象也很成功(Pegel和Rogers，1985)。

X射线晶体图学也可用于解决苷元结构问题。由X射线衍射分析酸水解后人工产物的结晶三乙酸酯，得到的信息对确定Sesamum alatum(Pedaliaceae)的alatoside A的苷元结构是有用的(Potterat等人，1992)。Dolichoskilimandscharicus(豆科)块茎中medicagenic酸3-O-葡糖苷的medicagenic酸母苷元的X射线晶体学研究，显示该分子有顺式融合的D环和E环。环C有略变形的沙发构型，而环A、B、D和E都是椅型(Stoeckti-Evans，1989)。

(vii)分裂反应

三萜皂苷是糖苷，其中在它们的环形吡喃或呋喃形式中糖的半乙缩醛羟基与三萜或类固醇残基形成醛缩醇。已知半缩醛羟基和三萜或类固醇之间的醚键是糖苷键。寡聚糖的单糖成分也是通过醚键(糖苷内键)连接的。

完全水解糖苷后，糖苷键断裂，释放出单糖和非糖分子(苷元或配基)。水解皂苷后得到的非糖部分称为皂草精醇(sapogenol)或皂苷元(sapogenin)。所有已知的皂苷都是有醚键或酯键的O-糖苷。

已用多种化学反应和方法将皂苷裂解成更小的单元用于较容易的分析(见，例如Kitagawa，1981)。这些方法特别适用于三萜皂苷的结构测定。

1.酸水解

酸水解可以通过将皂苷在酸中回流一段固定的时间来完成，如在2-4M盐酸中回流4小时。水解后残留的水溶液用乙醚、氯仿或乙酸乙酯提取得到苷元。在中和溶液(用碱离子或阳离子交换树脂)(Tschesche和Forstmann，1957；Sandberg和Michel，1962)后，用吡啶从含水层提取糖，然后蒸干。用这种方法皂苷被完全裂解成其组成件，所以可以通过鉴定苷元和存在的单糖的数量和性质获得信息。如果酸水解次皂苷元(用碱水解酯键断裂后得到的)，可以确定糖链(通过醚键连接于苷元)的性质。可用醇或二烷代替含水反应的介质。

除了盐酸外，硫酸也可用于水解皂苷。用硫酸时，分子降解或重排的可能性要小些，但醚键断裂不够充分。例如，从瞿麦(Dianthus)皂苷中得到丝石竹酸(gypsogenic acid)的简便方法，包括用以二烷配制的1M硫酸水解(Oshima等人，1984)。用盐酸和硫酸(水和水-乙醇配制的)作水解条件的比较研究，显示糖的最佳回收率是通过在密封真空安瓿中用5％硫酸/水加热皂苷2小时而得(Kikuchi等人，1987)。可用三氟乙酸作较温和的水解，例如在1M三氟乙酸中回流3小时。

除了在溶液中水解皂苷外，也可直接在TLC板上水解(用盐酸蒸汽处理)。一旦蒸发掉酸后，就可用TLC溶剂正常洗脱以鉴定单糖的存在(Kartnig和Wegschaider，1971；He，1987)。用这种方法，在部分水解龙舌兰糖苷(agaveside)B后，鉴定了终末糖木糖和半乳糖。用氯仿-甲醇-水(8∶5∶1)溶剂展开TLC板，用苯胺-二苯胺-H₃PO₄-甲醇(1∶1∶5∶48)检测(Uniyal等人，1990)。

2.碱水解

在碱水解条件下进行O-酰基糖苷链裂解，通常用0.5M氢氧化钾回流。另外，可以用1-20％的氢氧化钾乙醇溶液或甲醇溶液，但有甲基化的风险，尤其对三萜酸的羧基。离子交换(柱)如Dowex 1提供了温和的碱水解条件(Bukharov和Karlin，1970)。另一种方法是用可力丁配制的碘化锂(Kochetkov等人，1964)。

通过仔细控制反应条件，有可能选择性切割不同的酯分子。例如，用0.5M氢氧化钾回流30分钟水解kizuta皂苷K₁₁，除去双锁链苷的C-28上的糖。然而，室温在0.1M氢氧化钾中搅拌皂苷20小时，可选择性除去酯糖苷链C-28上的乙酸基团(Kizu等人，1985b)。

3.部分水解

在一些情况中，皂苷有高度分支或长糖链，需要包括部分水解的步骤以得到更易阐明结构的片段。这可以用酸或酶来实现。寡聚糖和/或残留的皂苷部分被分离然后鉴定。

例如，用0.1M盐酸水解Phytolacca dodecandra(商陆科)(Phytolaccaceae)的皂苷45分钟，得到三种产物的混合物。这些化合物用RP-LPLC分离，用MS、¹³C-NMR和GC-MS(乙酸糖醇酯)确定其糖序列。将这些信息综合起来可以得出这种化合物，即一种石竹素衍生物的化学分子式的排布(Dorsaz和Hostettmann，1986)。

在二烷中水解给予更温和的条件且也可进行部分水解。例如，在二烷-0.1M盐酸(1∶3)中回流皂苷6小时(Ikram等人，1981)。部分水解皂苷的另一种方法是在含碱金属(钠或锂)的醇中处理三萜糖苷溶液，然后加入微量水(Ogihara和Nose，1986)。

4.热水解(hydrothermolysis)

热水解三萜糖苷导致形成相应的苷元，从而有助于结构测定。这种方法包括用水或水-二烷在100℃-140℃加热糖苷10-140小时(取决于样品)。例如，加热水解三萜3，28-O-二糖苷得到相应的3-O-糖苷(Kim等人，1992)。

5.酶促水解

一种非常有效且温和的从皂苷中裂解糖残基而无人造物形成的方法是酶促水解。虽然不是所有糖的相关水解酶都可以购得，但用β-葡萄糖苷酶裂解β-葡萄糖是非常理想的。用特异性酶裂解的另一好处是可以自动证明糖分子的端基异构构型。一些具体考虑用于水解三萜糖苷的酶制剂是β-半乳糖苷酶、水解酶、纤维素酶、粗制橙皮苷酶、果胶酶和柚皮苷酶。

包括粗制橙皮苷酶、柚皮苷酶、果胶酶、纤维素酶、淀粉酶和苦杏仁酶的系统研究显示橙皮苷酶、柚皮苷酶和果胶酶对水解人参皂苷最有效(Kohda和Tanaka，1975)。

(viii)水解后苷元的分析

一旦完成水解，就可通过简单的过滤或通过水-有机溶剂分配从水解液中分离出苷元，并对已知的三萜作分析。最普遍的方法是通过TLC，所用溶剂如二异丙醚-丙酮(75∶30)。喷涂剂通常为用于分析皂苷的喷涂剂(见表2)。

气液层析需要将三萜衍生。例如，在装填有30％OV-17或SE-30的玻璃柱上进行GC，分离出石竹酸和熊果酸的甲酯(Fokina，1979)。在用N.O-二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺和氯三甲基硅烷衍生后，可用GC测定三萜，如同对苜蓿的大豆皂草精醇A-E和medicagenic酸(Jurzysta和Jurzysta，1978)。

GC-MS技术也可用于皂苷的特性分析。通常制备三甲基硅衍生物，然后在分光光度仪上作分析。一实施例是应用于研究石竹烷-和乌斯烷-类型的三萜。用OV101填料的GC分离了九种甲硅烷基化的三萜，并研究了它们的质谱图型：都含有经历过特征性的逆第尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应的12-en双键(Burnouf-Radosevich等人，1985)。这种技术也已用于检测甘草(licorice)的三萜(Bombardelli等人，1979)。

HPLC分析无需衍生化，而且对三萜的分析可以得到非常出色的再现性和灵敏性。可用普通相(奎藜籽皂苷配基的分析；Burnouf-Radosevich和Delfel，1984)和RP-HPLC(Lin等人，1981)，但RP-HPLC的缺点是化合物趋于在含水流动相中沉淀。

(ix)水解后糖分析

可以用TLC作单糖的分析，例如在硅胶板上用诸如乙酸乙酯、甲醇-水、醋酸(65∶25∶15∶20)和n-丁醇、乙酸乙酯、i-丙醇、醋酸、水(35∶100∶60∶35∶30)为溶剂(Shiraiwa等人，1991)。检测通常用p-肽酸茴香胺、萘酚雷锁辛(naphthoresorcin)、百里酚磺酸(Kartnig和Wegschaider，1971)或氯化三苯基四氮唑(Wallenfels，1950；Kamel等人，1991)。另外，可用GC或HPLC进行单糖的定量分析。

已报道了许多用于糖分析的HPLC方法，包括：用乙腈-水(75∶25)在NH₂-结合的柱上分析(Glombitza和Kurth，1987)；在C-18柱(乙腈-水4∶1)上用折射指数检测分析，为定量目的将HPLC峰的联合与标准比较(Adinolfi等人，1987)；用0.005M硫酸为洗脱液(0.4ml/分)在Aminex离子排斥HPX-87H柱(BioRad)上分析(Adinolfi等人，1990)；和用HPLC分析糖p-溴苯甲酸酯(先用5％盐酸-甲醇水解皂苷，然后将甲基糖p-溴苯甲酰化得到)，并与可靠的衍生物作比较来鉴定(Kawai等人，1988；Sakamoto等人，1992)。

在GC中，采用过甲硅烷基化糖(Wulff，1965)或进行糖醇乙酸酯衍生物的GC-MS分析。对适合的衍生单糖作GC-Fourier-转化IR(FTIR)分析是另一种方法(Chen和Snyder，1989)。

最常见的糖是D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-岩藻糖、L-鼠李糖、D-奎诺糖、D-葡糖醛酸和D-核糖。

III.化合物的衍生物

如本文所详述，考虑通过制备单萜/三萜糖苷而获得某些益处，以向它们提供新的特性(体内较长的半衰期或其它有益特性)。这些技术包括，但并不限于，操纵或修饰单萜/三萜糖苷混合物或单个单萜/三萜分子，修饰或去除糖，和将单萜/三萜化合物与惰性载体，例如与赋予膜可溶性/渗透性、或进入细胞的组合物偶联，这些组合物包括脂类、载体蛋白、亲脂性蛋白、其它三萜基团、糖等，或与各种蛋白或非蛋白成分(包括免疫球蛋白和Fc部分)偶联。可以理解较长的半衰期并不和用于“缓慢释放”的药用组合物共久远。缓慢释放制剂一般被设计为在一段持续时间内释放恒量水平的药物。增加药物(如本发明的单萜/三萜糖苷)的半衰期，是为给药后导致高血浆水平，并保持该水平一段较长的时间，但这种水平一般依据化合物的药物动力学而衰减。

(i)单萜/三萜和连接分子的偶联

如上述，鉴定的本发明单萜/三萜化合物可以与特殊的分子连接，以改进单萜/三萜糖苷治疗患有可用本发明化合物治疗疾病的患者的效力。这种分子的阐述性实施例包括靶向试剂和增加单萜/三萜化合物体内半衰期的试剂，或者使单萜组合物可以渗透膜的试剂。单萜/三萜化合物可以任何使各区域执行其预定功能(如本文公开的化合物的抗肿瘤活性)而不会显著破坏生物活性的可操作方式与第二种分子相连。

本发明的单萜/三萜组合物可直接与第二化合物连接或通过一个连接基团连接。术语“连接基团”是指一种或多种双功能的分子，其可将单萜/三萜化合物或单萜/三萜混合物共价连接到试剂上，且它们不干扰单萜/三萜化合物生物活性。该连接基团可以和单萜/三萜的任何部分连接，只要连接点不干扰生物活性(如本发明化合物的抗肿瘤活性)。

连接本发明单萜/三萜化合物到第二试剂的实施例，是通过制备一种单萜/三萜活性酯，然后使该活性酯与要连接的试剂上的亲核官能团反应。该活性酯可以如下制备，例如在存在脱水试剂(如二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺(EDC)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基甲碘碳化二亚胺(EDCI))时使单萜/三萜的羧基与醇反应。在美国专利No.4,526,714、PCT申请出版物No.WO91/01750和Arnon等人，1980中公开了用EDC形成偶联物，(本文全部引入作为参考)。然后将要连接到单萜/三萜的试剂(如肿瘤特异性抗体或发炎细胞特异性抗体)和水溶液中的活化酯混合以得到偶联物。

当希望单萜/三萜和试剂间有连接基团时，可如上述制备单萜/三萜糖苷的活性酯，并与连接基团(如2-氨基乙醇、亚烷基二胺、氨基酸如甘氨酸、或羧基保护的氨基酸如甘氨酸叔丁酯)反应。如果接头含有受保护的羧基基团，除去保护基团并制备接头的活性酯(如上述)。然后使活性酯与第二分子反应产生偶联物。另外，第二试剂可以用琥珀酰酐衍生，产生试剂-琥珀酸酯偶联物，在存在EDC或EDI时使该偶联物与接头上有游离氨基或羟基的单萜/三萜-接头衍生物缩合(见，例如WO91/01750，其所公开的内容本文全部引用作为参考)。

也可制备一种单萜/三萜糖苷偶联物，其含有带一个游离氨基的接头，且该游离氨基与一能与蛋白抗原的游离巯基反应的异双功能交联剂(如硫代琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺环己烷)-1-羧酸酯)交联。

单萜/三萜糖苷与连接基团偶联，可通过醛基与氨基接头反应形成中间体亚胺偶联物，然后用硼氢化钠或氰基硼氢化钠还原。这些接头的例子包括氨基醇如2-氨基乙醇和二氨基化合物如乙二胺、1，2-丙二胺、1，5-戊二胺、1，6-己二胺等。然后该单萜/三萜糖苷偶联于接头，可通过首先与琥珀酰酐形成琥珀酸化衍生物，然后用DCC、EDC或EDCI与单萜/三萜糖苷-接头偶联物缩合。

另外，单萜/三萜糖苷或苷元可以用高碘酸盐氧化，然后使产生的二醛与上述氨基醇或二胺基化合物缩合。在存在DCC、EDC或EDCI时，可将接头上游离的羟基或氨基与抗原的琥珀酸衍生物缩合。许多接头类型是本领域已知的，且可用于产生单萜/三萜偶联物。下表4列出了用于本发明的一些接头例子。

表4：异-双功能交联剂

接头

反应方向(reactive toward)

优点和运用

交联后的间隔臂长

SMPT	伯胺巯基	●较好的稳定性	11.2A
				SPDP	伯胺巯基	●硫代化●可断裂的交联	6.8A
LC-SPDP	伯胺巯基	●伸展间隔臂	15.6A
				Sulfo-LC-SPD	伯胺巯基	●伸展间隔臂●水溶性	15.6A
SMCC	伯胺巯基	●稳定的马来酰亚胺反应基团●酶-抗体偶联●半抗原-载体蛋白偶联	11.6A
				Sulfo-SMCC	伯胺巯基	●稳定的马来酰亚胺反应基团●水溶性●酶-抗体偶联	11.6A
MBS	伯胺巯基	●酶抗体偶联●半抗原-载体蛋白偶联	9.9A
				Sulfo-MBS	伯胺巯基	●水溶性	9.9A
SIAB	伯胺巯基	●酶-抗体偶联	10.6A
				Sulfo-SIAB	伯胺巯基	●水溶性	10.6A
SMPB	伯胺巯基	●伸展间隔臂●酶-抗体偶联	14.5A
				Sulfo-SMPB	伯胺巯基	●伸展间隔臂●水溶性	14.5A
EDC/Sulfo-N HS	伯胺羧基基团	●半抗原-载体偶联	0
				ABH	非选择性糖	●与糖基团反应	11.9A

(ii)合理的药物设计

合理的药物设计的目的是为了生产出生物活性化合物的结构类似物。通过创造这种类似物，可以使创造的药物比天然分子更有活性或更稳定，这些药物对于变化具有不同的敏感性或可能影响其它各种分子的功能。在一项研究中，可能产生本发明单萜/三萜化合物或其片段的三维结构。这可以通过X射线晶体图学、计算机模拟或这两种方法的组合来实现。另一研究涉及在整个单萜/三萜分子中随机置换官能团，和确定由此对功能的影响。

也可通过功能性试验选择分离出某单萜/三萜化合物的特异性抗体，然后解决其晶体结构。原则上，这种方法产生一种药物(pharmacore)，且以这种药物为基础可以设计后续的药物。也可通过产生抗功能性、药理活性抗体的独特型抗体(anti-idiotypic antibody)而绕过蛋白的晶体图学。作为对映体的对映体，抗独特型抗体的结合位点预计模拟了原始抗原。然后用该抗独特型抗体从化学或生物学方法产生的肽条带中鉴定和分离肽。选出的肽然后可作为药物。可以用本文所述的产生抗体的方法产生抗独特型型抗体，用此抗体作为抗原。

因此，可以设计具有改进的生物活性(例如抗炎症活性或抗肿瘤活性)的与起始单萜/三萜化合物相关的药物。凭借化学分离过程和本文所述方法，可产生足量的本发明单萜/三萜化合物，用于进行晶体图学研究。另外，对这些化合物化学特性的认识可以用计算机预测结构-功能的关系。

IV.用本发明的单萜/三萜化合物治疗肿瘤

在癌的生长过程中，哺乳动物细胞经历一系列遗传学上可测定的导致异常增殖的基因变化。这是按以下步骤进行的，一般为：(1)引发：当外源因子或刺激触发一种或多种细胞的基因改变时和(2)促进：包括进一步的基因和代谢改变，其中包括炎症。在“促进阶段”，细胞开始从代谢过渡到细胞生长阶段(其中细胞程序死亡被阻断)。

癌细胞的特性是细胞凋亡控制的丧失和细胞周期调节步骤控制的丧失。癌细胞(恶性细胞)在恶性肿瘤发病的引发和促进阶段中通过一系列代谢变化，逃脱了正常生长控制机制。这些变化是细胞中的基因变化的结果。这些基因改变包括(i)激活性突变和/或原癌基因表达的增加，和/或(ii)灭活性突变和/或一种或多种肿瘤抑制基因表达的减少。大多数癌基因和肿瘤抑制基因产物是信号转导途径的成分，该途径控制细胞周期的进入或退出、促进分化、有义DNA的损伤和引发修复机制、和/或调节细胞死亡程序。几乎所有的肿瘤在多个癌基因和肿瘤抑制基因中都有突变。可得出的结论是细胞用多种平行机制来调节细胞生长、分化、DNA损伤控制和细胞凋亡。

可将本发明的三萜化合物给予需要治疗的患者，来预防性防止癌或在诊断出肿瘤后治疗癌。用本发明的方法和组合物抑制癌的引发和进展、杀死癌/恶性细胞、抑制细胞生长、诱导细胞凋亡、抑制转移、减小肿瘤体积和其它逆转或减少肿瘤细胞的恶性表型，一般要使“靶”细胞与本文所述三萜组合物接触。这可以使含有本发明三萜化合物的单一组合物或药学制剂与肿瘤或肿瘤细胞接触，或使一种以上独特的组合物或制剂(其中一种组合物包括本发明的三萜，另一组合物包括另一种试剂)同时接触肿瘤或肿瘤细胞来实现。

宜用本发明治疗的癌细胞包括上皮癌如皮肤、结肠、子宫、卵巢、胰、肺、膀胱、乳房、肾和前列腺肿瘤细胞。其它靶癌细胞包括脑、肝、胃、食道、头和颈、睾丸、子宫颈、淋巴系统、喉、食道、腮腺、胆道、直肠、子宫、子宫粘膜、肾、膀胱、和甲状腺癌；包括磷状细胞癌、腺癌、小细胞性癌、神经胶质瘤、神经母细胞瘤等。然而，这仅是用于说明的(并不限制于)，潜在的任何肿瘤细胞都可用本发明三萜化合物治疗。确认本发明化合物在治疗上述类型肿瘤细胞和其它肿瘤细胞中的相对效力的试验方法也在本文中公开了，这对本发明领域的技术人员是显而易见的。

本发明化合物的给药较佳地是以含有药用或药理可接受的稀释剂或载体的天然营养物组合物或药用组合物形式。载体的特性取决于所用化合物的化学性能，包括溶解性和/或给药模式。例如，如果希望口服，则可选择固体载体，如果静脉注射则可用液态盐溶液载体。

术语“药用或药理可接受”是指那些给予动物或人时，不会产生副作用、过敏或其它不良反应的分子实体或组合物。本文所用的术语“药学上可接受载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包裹、抗细菌和抗真菌制剂、等渗和吸收延迟制剂等。用于药用活性物质的这些介质和制剂的用法是本领域已知的。除了与活性物质不相容的常规介质或制剂外，均可考虑将其用在该治疗性组合物中。辅助的活性组分也可加入到该组合物中。

a.天然营养物(nutraceutical)

天然营养物组合物是天然组分的制剂，这些天然组分是含有较佳天然协同产物和促进健康添加物的多组分系统。天然营养物化合物可从药用植物中衍生。已编写了用于制备天然营养物组合物的多种有关植物和草药的信息，可见于出版物包括German Commission E Monographs、Botanical Safety Handbook和HerbalGram(美国植物协会[American Botanical Council]的一本季刊，其中提到用天然营养物进行的多种临床实验)。

可得到关于多种植物(包括其它越橘、药鼠李、猫爪、辣椒、酸果蔓、devil’sclaw、dong quai、海胆亚目、夜来香油、野甘菊、大蒜、姜、亚洲人参、西伯利亚人参、白毛茛、gotu kola、葡糖种子、绿茶、夏花山楂、麻醉椒、甘草、水飞雉、锯榈、St.John麦芽、和缬草)的描述、组成、现代用途、剂量(各种形式)、作用、禁忌、副作用、与常规药物的相互作用、给药方式、药效持续时间、调节状况、AHPA植物安全率和评论的信息。

这些天然营养物化合物的作用可以是快速或/和短期的，或可帮助达到长期保健目的。本发明的重点是胜利金合欢衍生的植物药物。本发明设想的天然营养物组合物含有在药理上可接受介质中的干燥磨碎的胜利金合欢根和豆荚或这些组织的提取物，作为天然方法预防或治疗癌。这种天然营养物组合物可用于防止癌的发生和发展，也可诱导恶性癌细胞凋亡。本文公开的天然营养物组合物可用作抗炎药、抗真菌药、抗病毒药、抗突变药、杀精子或避孕药、心血管和胆固醇代谢调节制剂。这种天然营养物组合物可含在介质如缓冲液、溶剂、稀释剂、惰性载体、油、奶油、或可食材料中。

这种天然营养物可以口服，也可以药片或胶囊的形式给药。用于治疗结肠癌和其它体内肿瘤较佳的是口服。

另外，该天然营养物也可以在油或奶油中含有胜利金合欢根或豆荚提取物以药膏形式局部涂抹在皮肤上。这种形式的天然营养物组合物是用于防止皮肤癌的发作。这些天然营养物制剂的用途提供了一种方法来抑制哺乳动物上皮细胞发生和发展到恶变前或恶变阶段，其中将治疗有效剂量的天然营养物组合物给予确定的哺乳动物细胞。这对上皮细胞癌如皮肤癌特别有用。

b.药物

本文进一步描述了从胜利金合欢分离的组合物(部分或完全纯化，且结构已鉴定)。在实施例中详述了这些单萜/三萜糖苷化合物的纯化和特征鉴定。D1、G1和B1是三种完全纯化的组合物，且它们的结构特征鉴定也几乎完成(图39、图40和图41)。用这些化合物在癌细胞系上进行的生物试验已显示了细胞生长的抑制和在恶性细胞中诱导细胞凋亡(如43、图44A-E)。另外，胜利金合欢分离出的皂苷的部分纯化组合物也显示出对暴露于致癌物DMBA的小鼠的化学保护作用(图8、9、11、12和13)。因此，这些组合物具有抗癌活性，通过若干机制诱导癌细胞凋亡而起作用。设想这些化合物的药用组合物作为强效化疗药物，可以单独或与其它癌治疗形式(如化疗、放疗、手术、基因治疗和免疫治疗)联合使用。下面将详述这种联合治疗。本领域的技术人员可以确定有效剂量和联合治疗方案。

c.给药方法

(i)肠胃外给药

本发明的一实施例提供了用于肠胃外给予单萜/三萜组合物的制剂，如通过静脉注射、肌内注射、皮下注射或其它途径的注射，包括直接注入肿瘤或疾病剂位。通过本发明公开的内容，本领域的技术人员可知如何制备含有单萜/三萜组合物的含水组合物。通常这些组合物可制备成可注射的，液体溶液或悬浮液；也可制成适合用于在注射前添加液体后制备成溶液或悬浮液的固态形式；并且还可将制剂乳化。

可用适当地混有表面活性剂(如羟丙基纤维素)的水配制该活性化合物(如游离碱基或药理上可接受的盐)的溶液。也可用甘油、液态聚乙二醇和它们的混合物以及油配制分散液。在普通保藏和使用条件下，这些制剂含有防腐剂防止微生物生长。

适合注射用的药用形式包括无菌水溶液或分散液；制剂包括芝麻油、花生油或含水丙二醇；和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉剂。所有的情况中，都必需是无菌形式，且必需是易于注射的液态。在生产和储藏条件必须是稳定的，而且必须防腐能抗微生物(如细菌和真菌)污染作用的。

可将这种单萜/三萜化合物配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括与无机酸(例如，盐酸或磷酸，或有机酸如醋酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等)形成的酸加成盐(acid addition salts)(与蛋白的游离氨基形成)。与游离羧基形成的盐也可从无机碱基如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁和有机碱基如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等衍生。

载体也可是溶剂或分散介质含有(例如)水、乙醇、聚烯烃(如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、它们的适当混合液以及植物油。可维持适当的流动性，例如，通过用(如卵磷脂)包裹和用表面活性剂将分散液维持于所需颗粒大小。防止微生物的作用可通过各种抗细菌和抗真菌制剂，如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，较佳地将包含等渗试剂如糖或氯化钠。可以在该组合物中用延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)，来延长注射用组合物的吸收。

无菌注射用溶液的制备可通过将活性化合物与各种其它上述组分以所需量一起加入适当的溶剂中，然后无菌过滤。一般而言，分散液的制备是通过将各种无菌活性组分加入含有基础分散介质和上述其它所需组分的无菌载体中。制备用于无菌注射溶液的无菌粉剂，较佳的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，此二技术产生该活性组分和前述无菌过滤溶液中其它所需组分的粉剂。

(ii)其它给药方法

其它给药方式也用于本发明。例如，本发明的单萜/三萜组合物可制成栓剂，在一些情况中可制成气雾剂和鼻内(用)组合物。对于栓剂，载体组合物可包括传统的黏合剂和载体如聚乙烯乙二醇或三酸甘油酯。这些栓剂可从含有范围约0.5％到10％(W/W)的(较佳的是约1％到约2％)该活性组分的混合物来配制。

口服组合物可配制成溶液、悬浮液、药片、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉剂形式。这些组合物可以通过，例如吞服或吸入给药。对用于吸入的药物制剂，该组合物较佳的是含有气雾剂。制备用于本发明的含水气雾剂的流程可见于美国专利No.5,409,388，该专利公开的内容本文全部引用作为参考。制备干气雾剂的描述见于，如美国专利No.5,607,915，其所公开的内容本文全部引用作为参考。

还可将本发明化合物直接用于含有渗透增强剂(如DMSO)的透皮制剂中。这些组合物也可类似地含有其它适合的载体、赋形剂或稀释剂。可给予其它局部用制剂治疗一些疾病适应症。例如，可制备含有既不刺激鼻粘膜又不显著干扰睫状功能的载体的鼻内(用)制剂。在本发明中可用的稀释剂如水、盐水或其它已知的物质。鼻(用)制剂也可含有防腐剂如，但并不限制于，氯丁醇和苯扎氯铵。可存在表面活性剂以提高鼻粘膜对该化合物的吸收。

(iii)制剂和治疗

在配制后，将以与剂型相容的形式和治疗有效量给予溶液。选择剂型可用各种赋形剂(包括如药用级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠纤维素、碳酸镁等)来完成。

通常本发明的组合物含有不到1％到约95％的活性组分，较佳的是约10％到约50％。较佳地，每天向患者给药约10mg/kg体重到约25mg/kg体重之间。根据患者的反应确定给药的频率。其它有效剂量可由本领域的技术人员通过建立剂量反应曲线的常规实验确定。

除了给药方式，本发明的适当药物组合物一般包括与药学上可接受的溶剂或赋形剂(如无菌水溶液)混合的许多单萜/三萜组合物，根据预计的用途确定终浓度范围。制备的技术一般是本领域熟知的，可参见Remington’s PharmaceuticalSciences，16th Ed.Mack Publishing Company，1980，其内容纳入本文作为参考。应将内毒素污染物控制在最小的安全水平，例如少于0.5ng/mg蛋白。另外，对用于人给药时，制备应满足FDA Office of Biological Standards所要求的无菌、无致热原性(pyrogenicity)、一般安全和纯化标准。

如本文研究所示，治疗有效剂量可用动物模型确定的。例如，患有实体肿瘤(solid tumor)的实验动物通常用于临床前优化适合的治疗剂量的研究。已知这些动物模型在预测抗癌策略的有效性上是很可靠的。

在一些实施例中，可能希望对患者连续给予治疗组合物。对静脉或动脉途径给药可用滴注系统来完成。对局部给药，可用重复给药。对于各种处理方法，可用缓释制剂在预期的时间或延长时间，提供有限但恒定剂量的治疗剂。对于体内给药来说，较佳的是向感兴趣区域连续灌注。在手术后的一些情况中，这可以通过导管插入术来完成，然后连续给予治疗剂。灌注的时间段可由患者的临床医生和状况选择，但时间范围可为约1-2小时，到2-6小时，到约6-10小时，到约10-24小时，到1-2天，到1-2周或更长。一般而言，通过连续灌注给药的治疗组合物的剂量相当于一针或多针注射所给与的量，按注射的时间调整。据信，通过灌注可达到较高剂量。

1.治疗方案

发明者预想了用本发明的单萜/三萜组合物单独或联合用于治疗的两个主要方案。首先是用于转移性癌，患者先前没有接受过化疗、放疗或生物疗法或先前没有接受过治疗的患者。患者将接受全身给药，即静脉注射、皮下注射、口服或肿瘤内注射。给药的药物剂量较佳的是含有10-25mg的本发明的单萜/三萜组合物/kg患者体重(每天)，包括13、16、19和22mg/kg/天。另外，可用一种或多种含有1mg/kg/天至100mg/kg/天(包括3、6、9、12、15、18、21、28、30、40、50、60、70、80和90mg/kg/天)本发明的单萜/三萜组合物药物制剂来治疗患者。

治疗过程通常包括每天治疗一次最少持续8周或每周一次注射最少持续8周。由临床医生选择，治疗方案可持续同样的时程直到观察到肿瘤发展或缺少反应。

本发明组合物的另一用途是治疗经手术、化疗和/或放疗临床疾病已痊愈的患者。可用上述相同的方案给予辅佐治疗，最少持续1年以防止疾病的复发。

2.预防癌症

本发明单萜/三萜糖苷组合物的化合物和混合物的另一用途是在高危险人群中预防癌。这些患者(例如，那些具有遗传学上定义的癌症[如乳癌、结肠癌、皮肤癌等]诱因的人)的治疗通过口服(肠胃癌)、皮肤上局部治疗(皮肤癌)或全身用药，最少持续1年也可能更长以确定防止了癌。这项用途包括患者和明确为癌前期病变(如结直肠息肉)或皮肤、乳房、肺或其它器官的其它恶变前期病变。通常这些人是患有作为恶化前炎症性疾病的炎症性疾病的病人，例如患有Barretts食管炎、炎症性肠病、慢性胰腺炎、慢性前列腺炎、家族性息肉病或光化性角化病的病人。

3.临床方案

本文描述了临床方案以便利用本发明的三萜化合物治疗癌。按照本方案，选择具有癌(如卵巢癌、胰癌、肾癌、前列腺癌、肺或膀胱癌)组织学证据的患者。患者可能，但并非必需已接受过化疗、放疗或基因治疗。最佳地，患者有足够的骨髓功能(定义为周围血粒细胞绝对数＞2,000/mm³，血小板数为100,000/mm³)，足够的肝功能(胆红素≤1.5mg/dl)和足够的肾功能(肌酸酐＜1.5mg/dl)。

这种方案要求单剂量给药，通过肿瘤内注射含有约10到25mg本发明三萜化合物每kg患者体重的药物制剂。对≥4cm的肿瘤，给药量应为4-10ml(较佳的是10ml)，对于＜4cm的肿瘤，应给予1-3ml体积(较佳的是3ml)。可多点注射单剂，每点0.1-0.5ml，间隔为约1cm或以上。

治疗过程由6个剂量组成，共2周。根据临床医生的选择，可继续这种疗法，每两周6剂量或较少次数(每月、每两月、每季度等)。

当患者适宜手术切除时，可如上述治疗肿瘤至少持续两周疗程。在第二(或更长，如第三、第四、第五、第六、第七、第八等)疗程完成后的一周中，患者可接受手术切除。在缝合切口前，将10ml含本发明三萜化合物的药物制剂送递到手术部位(手术切除处)并保持接触至少60分钟。缝合伤口并在其中安置引流管或导管。在手术后的第三天，通过引流管给予10ml此药物制剂，并保持与手术切除处接触至少2小时。然后抽吸除去，在临床适当时间除去引流管。

4.治疗人工或天然体腔

癌症复发的一个主要源头是肿瘤切除后(局部性和区域性残留在原发性肿瘤部位上的)残留的、微观的疾病(引起的)。另外，存在着微观肿瘤细胞播种的天然人体腔隙的类似情况。这种微观疾病的有效治疗将是疗法上的显著进步。

因此在某些实施例中，手术切除除去癌而产生出一个“腔隙”。在手术之中和手术(周期地或连续地)向该腔隙给予本发明的治疗组合物。这实质上是一种“局部”治疗腔隙的表面。组合物的量应充分确保该表达构建物能接触整个腔隙的表面。

在一实施例中，给药将仅仅需把该治疗组合物注射入肿瘤切除形成的空隙。在另一实施例中，可能需要通过海绵、药签或其它设备进行机械给药。这些方法都可在肿瘤切除后和首次手术期间使用。在另一实施例中，在闭合手术切口前将一导管插入到空隙中。然后连续灌注该空隙一段所需时间。

在这种治疗的另一形式中，“局部”应用该治疗组合物的目标是天然体腔，如口腔、咽、食道、喉、气管、胸膜腔、腹膜腔内或中空的器官腔隙包括膀胱、结肠或其它内脏器官。在这种情况下，体腔内可能有或无显著的原发性肿瘤。治疗目标是体腔中的微观疾病，但可能附带地对原发性肿块(如果该肿块预先未被除去)或可能存在于该体腔中的瘤前病变产生作用。再者，可用各种方法对这些内脏器官或体腔表面“局部地”给药。例如，可简单地用药液的漱口作用于口腔咽喉。然而，喉和气管的局部治疗可能需要内窥镜观察和局部传递治疗组合物。内脏器官如膀胱或结肠粘膜可能需要带有输液的留置导管或也需用膀胱镜或其它内窥镜仪器直接观察。体腔如胸膜腔和腹膜腔可通过留置导管或提供进入这些区域的手术方法进入。

(iv)治疗试剂盒

本发明也提供含有本文所述单萜/三萜组合物的治疗试剂盒。这些试剂盒一般在适合的容器中含有至少一种单萜/三萜化合物的药学上可接受的制剂。这些试剂盒也可含有其它药学上可接受的制剂，如那些含有将单萜/三萜化合物靶向患者需要治疗特定区域的组分，或与单萜/三萜化合物协同作用的一种或多种药物，如化疗剂。

这些试剂盒可有一个含单萜/三萜化合物(有或无其它组分)的简单容器，或也可是每种试剂有单独的容器。当试剂盒的组分以一种或多种液态溶液提供时，这种液态溶液是水溶液，较佳的是无菌水溶液。然而，这种试剂盒组分也可以干燥粉末提供。当试剂或组分以干燥粉末提供时，这种粉末可通过加入适当的溶剂再建。设想这种溶剂可由另一容器提供。这种试剂盒的容器一般包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器，其中可置放单萜/三萜糖苷和其它需要的试剂，较佳的是适当等分的。当包括附加组分时，试剂盒一般含有置放它们的另一个小瓶或其它容器，从而可给予分开的指定剂量。这种试剂盒还可含有第二个/第三个容器来装无菌的药学上可接受的缓冲液或其它稀释剂。

这种试剂盒也可含有将单萜/三萜组合物给予动物或患者的工具，如一个或多个针头或注射器，或滴眼滴管、吸管或其它类似的设备，从而可将制剂注射到动物或给药到身体患病部位。本发明的试剂盒典型地包括小瓶或其它类似物和其它组件，其中在出售时是密封的，如注射或吹塑容器其中置放和保存所需的小瓶和其它设备。

V.化疗联合和治疗

在本发明的一些实施例中，可能理想的是将本发明的三萜组合物与一种或多种其它有抗肿瘤活性的制剂(包括化疗、放疗、和治疗性蛋白质或基因)联合给药。这样可提高单独使用本发明化合物进行治疗获得的总的抗肿瘤活性，或者也可用于防止或制止肿瘤的多药物抗性。

为了将本发明与另一化疗试剂联用，可将三萜组合物与另一化疗剂以使它们在动物中有效产生它们的组合抗肿瘤作用的方式联合给予动物。因此以有效使它们组合存在于肿瘤脉管系统中、且使它们在肿瘤环境中发挥组合作用的剂量和时间提供这些试剂。为了实现这一目的，可以单一组合物或两种不同的组合物用采用不同的给药途径的方式，同时对动物给予三萜化合物和化疗剂。

另外，三萜组合物的治疗可在化疗剂、放疗或蛋白或基因治疗前或后(间隔范围从几分钟到几周)进行。在三萜组合物和另一种制剂分别向动物给药的实施例中，一般要确保各次递药的时间间隔不是很长，这样附加的制剂和三萜组合物依旧能够发挥良好的联合抗肿瘤作用。在这种情况下，考虑两种试剂接触肿瘤的时间为每种约5分钟到约1周，较佳的是约12-72小时(每种)，延迟时间较佳是24-48小时。在一些情况中，可能需要显著地延长治疗时间，在各次给药之间的时间间隔为几天(2、3、4、5、6或7)或几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。可想象三萜糖苷或另一制剂给药一次以上是需要的。为了实现肿瘤的消退，可将两种试剂联合都以有效剂量给药以抑制肿瘤的生长，而不考虑给药的时间。

许多制剂适合用于本文所述的联合治疗。可考虑的化疗剂例子包括，如表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(VP-16)、阿霉素、5-氟尿嘧啶(5-FU)、喜树碱、放线菌素-D、丝裂霉素C和顺氯铂氨(CDDP)。

如本领域的普通技术人员所知，化疗剂的适合剂量一般是单独给予化疗或与其它化疗剂联合给药的临床治疗中所用量的上下。仅用于举例，可用制剂如顺氯铂氨和其它DNA烷化剂。顺氯铂氨已被广泛用于治疗癌症，临床运用的有效剂量是20mg/m²(每三周5天，总共三个疗程)。顺氯铂氨口服不能吸收，所以必需通过静脉、皮下、肿瘤内或腹腔内注射来给药。

其它有用的制剂包括干扰DNA复制、有丝分裂和染色体分离的化合物。这些化疗化合物包括阿霉素(也称为亚德利亚霉素)、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷、异搏定、鬼臼霉素等。这些化合物被广泛用在临床治疗肿瘤，通过丸剂静脉注射给药，剂量范围为阿霉素25-75mg/m² 21天间隔，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷35-50mg/m²静脉注射或以两倍静脉剂量口服。

也可用扰乱多核苷酸前体合成和保真性的制剂。特别有用的制剂是那些经历过广泛测试和易于获得的的制剂。如此，制剂如5-氟尿嘧啶(5-FU)优选地用于肿瘤组织，该试剂对靶向肿瘤细胞特别有效。虽然有毒，但5-FU可配制在各种载体中应用，包括局部应用，一般用的静脉注射剂量范围为3-15mg/kg/天。

表5中列出了用于联合治疗的示范性化疗剂。本文所列出的每种制剂仅是举例不起任何限制。从这一角度说，本领域技术人员可参见“Remington’sPharmaceutical Sciences″第15版，33章，624-652页。不同的剂量应取决于治疗对象的状况。负责给药的人在任何时候都应确定每个患者的适合剂量。另外，对人给药，制剂应满足FDA Office of Biological Standards所要求的无菌、致热原性(pyrogenicity)、一般安全和纯度标准。

表5：用于肿瘤疾病的化疗剂

类别	制剂类型	一般名称	疾病
				烷化剂	氮芥类	甲二氯二乙胺(NH2)	霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤
环磷酰胺异环磷酰胺	急性和慢性淋巴细胞白血症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳房、卵巢、肺、Wilms肿瘤、子宫颈、睾丸、软组织肉瘤
		苯丙氨酸氮芥(L-苯基丙氨酸氮芥)	多发性骨髓瘤、乳房、卵巢
苯丁酸氮芥	慢性淋巴细胞白血病、原发性巨球蛋白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤
		氮丙啶和甲基密胺(methylmelamines)	六甲三聚氰胺			卵巢
硫替派	膀胱、乳房、卵巢

	烷基磺酸盐	二甲磺酸丁酯	慢性粒细胞性白血病
				亚硝基脲	亚硝脲氮芥(BCNU)	霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、原发性脑肿瘤、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤
	环己亚硝脲(CCNU)	霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、原发性脑肿瘤、小细胞性肺癌
			甲基环己亚硝脲(甲基-CCNU)		原发性脑肿瘤、胃、结肠
	链脲菌素(链脲霉素)	恶性胰岛素细胞瘤、恶性类癌瘤
			三嗪类		氮烯唑胺(DTIC二甲基三氮烯基咪唑羧酰胺)	恶性黑色素瘤、霍奇金病、软组织肉瘤
	抗代谢物	叶酸类似物		氨甲喋呤(甲氨喋呤)			急性淋巴细胞白血病、绒毛膜癌、蕈样霉菌病、乳房、头和颈、肺、骨原性肉瘤
咪啶类似物			氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶；5-FU)氟尿苷(氟脱氧尿苷；FUdR)		乳房、结肠、胃、胰、卵巢、头和颈、膀胱、皮肤损害恶变前(局部)
		胞嘧啶阿拉伯糖苷(阿糖胞苷)		急性粒细胞性白血病和急性淋巴细胞白血病
			嘌呤类似物和相关抑制剂		巯基嘌呤(6-巯基嘌呤；6-MP)	急性淋巴细胞白血病、急性和慢性粒细胞性白血病
硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤；TG)		急性粒细胞性白血病、急性淋巴细胞白血病和慢性粒细胞性白血病
				喷司他丁(2-去氧助间型霉素)	毛细胞白血病、蕈样霉菌病、慢性淋巴细胞白血病

天然产物	长春花生物碱	长春花碱(VLB)	霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、乳房、睾丸
				长春花新碱	急性淋巴细胞白血病、成神经细胞瘤、Wilms肿瘤、横纹肌肉瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、小细胞性肺癌
		表鬼臼酯素	表鬼臼毒素吡喃葡糖苷tertiposide			睾丸、小细胞性肺癌和其它肺癌、乳房、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、急性粒细胞性白血病、皮肤多发性出血性肉瘤
	抗菌素			更生霉素(放线菌素D)	绒毛膜癌、Wilms肿瘤、横纹肌肉瘤、睾丸、皮肤多发性出血性肉瘤
		红必霉素(柔红霉素；红比霉素)	急性粒细胞性白血病和急性淋巴细胞白血病
				阿霉素	软组织、骨和其它肉瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、急性白血病、乳房、泌尿生殖系统、甲状腺、肺、胃、成神经细胞瘤
		博来霉素	睾丸、头和颈、皮肤、食道、肺和生殖泌尿道、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤
				普卡霉素(光神霉素)	睾丸、恶性高钙血症
		丝裂霉素(丝裂霉素C)	胃、子宫颈、结肠、乳房、胰、膀胱、头和颈
				酶	L-天门冬酰胺酶	急性淋巴细胞白血病
	生物应答调节剂	干扰素α	毛细胞白血病、皮肤多发性出血性肉瘤、黑色素瘤、类癌、肾细胞、卵巢、膀胱、非霍奇金淋巴瘤、蕈样霉菌病、多发性骨髓瘤、慢性粒细胞性白血病

杂类制剂	铂配位复合物	顺铂(cis-DDP)卡铂	睾丸、卵巢、膀胱、头和颈、肺、甲状腺、子宫颈、子宫粘膜、成神经细胞瘤、骨原性肉瘤
				蒽二酮	米托蒽醌	急性粒细胞性白血病
	取代尿素类	羟基尿素	慢性粒细胞性白血病、真性红细胞增多症、血小板本质增多症、恶性黑色素瘤
				甲基肼衍生物	甲基苄肼(N-甲基肼，MIH)	霍奇金病
	肾上腺皮质遏抑剂	米托坦(o，p’-DDD)	肾上腺皮质
				氨鲁米特	乳房
		激素和拮抗剂	肾上腺皮质类固醇			强的松(若干其它可得的等价制剂	急性和慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、乳房
孕激素	己酸孕酮甲孕酮甲地孕酮			子宫粘膜、乳房
			雌激素		己烯雌酚乙炔雌二醇〔其它可得的制剂〕	乳房、前列腺
抗雌激素药	它莫西芬			乳房
			雄激素		丙酸睾酮氟羟甲睾酮(其它可得的制剂)	乳房
抗雄激素	氟他胺			前列腺
			促性腺激素释放激素类似物		亮丙瑞林	前列腺

其它导致DNA损伤且已被广泛运用的因素包括通常已知的如γ-射线、X-射线和/或直接将放射性同位素传递给肿瘤细胞。DNA损伤因素的其它形式考虑还有例如微波和UV-辐射。所有这些因素很可能大范围损伤DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复、染色体的装配和维持。X-射线的剂量范围为每天50-200伦琴，持续时间为3-4周，单剂量为2000-6000伦琴。放射性同位素的剂量范围差别很大，取决于同位素的半衰期、放射性强度和类型和肿瘤细胞的摄取。

VI.靶向癌的治疗

可将本文描述的单萜/三萜化合物与一种或多种将化合物靶向特定细胞，例如发炎的细胞、肿瘤细胞等的分子连接。靶向的优点是，其可用于增加治疗部位(例如炎症位点或肿瘤部位)药物的总水平，同时使全身对药物的暴露最小化。

与上述一般用化疗剂共同，可将靶向三萜化合物与另一种制剂(如化疗剂)联合使用。三萜和另一种制剂被导向肿瘤环境中同一或不同的靶。这就产生额外的、比额外更大的或显著的协同结果。

用于与本发明单萜/三萜化合物联合的靶向试剂是那些有能力将单萜/三萜分子传递到肿瘤区域，即能够局限于炎症位点或肿瘤部位的靶向试剂。类似地需要那些靶向肿瘤区域脉管系统的试剂。特别期望单萜/三萜糖苷化合物的靶向能在肿瘤区域有更大的有效浓度，而没有产生或产生最小的潜在的副作用(可由单萜/三萜化合物稍广泛或全身的分配观察到)。具体地说，靶向试剂可以是针对炎症细胞的抗体。

(i)肿瘤细胞靶和抗体

因此，发炎或恶化前或肿瘤细胞的靶向可用双特异性抗体，该抗体的一个区域能结合肿瘤细胞相关特异性标记或抗原。例如，对特异性肿瘤细胞的抑制或杀伤可通过抗体-单萜/三萜组合物的偶联物结合靶肿瘤细胞而实现。

已描述了许多的所谓“肿瘤抗原”，任何一个都可用作本发明靶向相关的靶。以下列出了大量实体瘤相关抗原的例子。针对这些抗原制备抗体和用途正是本领域的技术，并且本文也特别公开了。抗体的例子包括那些针对妇科肿瘤部位的抗体(见如ATCC目录)：OC 125；OC 133；OMI；Mo v1；Mo v2；3C2；4C7；ID₃；DU-PAN-2；F 36/22；4F₇/7A₁₀；OV-TL3；B72.3；DF₃；2C₈/2F₇；MF 116；Mov18；CEA11-H5；CA 19-9(1116NS 19-9)；H17-E2；791T/36；NDOG₂；H317；4D5，3H4，7C2，6E9，2C4，7F3，2H11，3E8，5B8，7D3，SB8；HMFG2；3.14.A3；从乳房肿瘤位点：DF3；NCRC-11；3C6F9；MBE6；CLNH5；MAC 40/43；EMA；HMFG1 HFMG2；3.15.C3；M3，M8，M24；M18；67-D-11；D547Sp，D75P3，H222；抗-EGF；LR-3；TA1；H59；10-3D-2；HmAB1，2；MBR 1，2，3；24·17·1；24·17·2(3E1·2)；F36/22.M7/105；C11，G3，H7；B6·2；B1-1；Cam 17-1；SM3；SM4；C-Mul(566)；4D5 3H4，7C2，6E9，2C4，7F3，2H11，3E8，5B8，7D3，5B8；OC 125；MO v2；DU-PAN-2；4F₇/7A₁₀；DF₃；B72·3；cccccCEA 11；H17-E2；3·14·A3；FO23C5；从结肠直肠肿瘤位点：B72·3；(17-1A)1083-17-1A；CO17-1A；ZCE-025；AB2；HT-29-15；250-30.6；44X14；A7；GA73·3；791T/36；28A32；28.19.8；X MMCO-791；DU-PAN-2；ID₃；CEA 11-H5；2C₈/2F₇；CA-19-9(1116NS19-9)；PR5C5；PR4D2；PR4D1；从黑色素瘤位点4·1；8·2 M17；96·5；118·1，133·2，(113·2)；L₁，L₁₀， R₁₀(R₁₉)；I₁₂；K₅；6·1；R24；5·1；225.28S；465.12S；9·2·27；F11；376.96S；465.12S；15·75；15·95；Mel-14；Mel-12；Me3-TB7；225.28SD；763.24TS；705F6；436910；M148；从肠胃肿瘤：ID3；DU-PAN-2；OV-TL3；B72·3；CEA 11-H5；3·14·A3；C COLI；CA-19-9(1116NS 19-9)和CA50；OC125；从肺肿瘤：4D5 3H4，7C2，6E9，2C4，7F3，2H11，3E8，5B8，7D3，SB8；MO v2；B72·3；DU-PAN-2；CEA 11-H5；MUC8-22；MUC 2-63；MUC 2-39；MUC 7-39；和从各种肿瘤：PAb 240；PAb 246；PAb1801；ERIC·1；M148；FMH25；6·1；CA1；3F8；4F₇/7A₁₀；2C₈/2F₇；CEA 11-H5。

其它对肿瘤定义和靶向的方法是根据肿瘤本身的特征，而不是描述由细胞表达的抗原的生化特性。已知有许多肿瘤细胞系例子，可用于制备靶向试剂。例如，已知肿瘤系的全细胞或细胞匀浆可用于制备靶向相关类型肿瘤的抗肿瘤抗体。类似地，这些肿瘤细胞系也可用于执行各种体外试验。关于这一点，本领域技术人员可参见ATCC目录中列举的公众可得到的人肿瘤细胞系(从ATCC目录)。细胞系的例子包括J82；RT4；ScaBER；T24；TCCSUP；5637；SK-N-MC；SK-N-SH；SW 1088；SW 1783；U-87 MG；U-118 MG；U-138 MG；U-373 MG；Y79；BT-20；BT-474；MCF7；MDA-MB-134-VI；MDA-MD-157；MDA-MB-175-VII；MDA-MB-361；SK-BR-3；C-33 A；HT-3；ME-180；MS751；SiHa；JEG-3；Caco-2；HT-29；SK-CO-1；HuTu 80；A-253；FaDu；A-498；A-704；Caki-1；Caki-2；SK-NEP-1；SW 839；SK-HEP-1；A-427；Calu-1；Calu-3；Calu-6；SK-LU-1；SK-MES-1；SW 900；EB1；EB2；P3HR-1；HT-144；Malme-3M；RPMI-7951；SK-MEL-1；SK-MEL-2；SK-MEL-3；SK-MEL-5；SK-MEL-24；SK-MEL-28；SK-MEL-31；Caov-3；Caov-4；SK-OV-3；SW 626；Capan-1；Capan-2；DU 145；A-204；Saos-2；SK-ES-1；SK-LMS-1；SW 684；SW 872；SW 982；SW 1353；U-2 OS；Malme-3；KATO III；Cate-1B；Tera-1；Tera-2；SW579；AN3 CA；HEC-1-A；HEC-1-B；SK-UT-1；SK-UT-1B；SW 954；SW 962；NCI-H69；NCI-H128；BT-483；BT-549；DU4475；HBL-100；Hs 578Bst；Hs 578T；MDA-MB-330；MDA-MB-415；MDA-MB-435S；MDA-MB-436；MDA-MB-453；MDA-MB-468；T-47D；Hs 766T；Hs 746T；Hs 695T；Hs 683；Hs 294T；Hs 602；JAR；Hs 445；Hs 700T；H4；Hs 696；Hs 913T；Hs 729；FHs 738Lu；FHs 173We；FHs 738B1；NIH：0VCAR-3；Hs 67；RD-ES；ChaGo K-1；WERI-Rb-1；NCI-H446；NCI-H209；NCI-H146；NCI-H441；NCI-H82；H9；NCI-H460；NCI-H596；NCI-H676B；NCI-H345；NCI-H820；NCI-H520；NCI-H661；NCI-H510A；D283 Med；Daoy；D341 Med；AML-193和MV4-11。

可以咨询若干年后的ATCC目录以鉴定出其它适合的细胞系。同样，如果需要某一特殊的细胞系，特定领域的技术人员知道获得这些细胞的方法和/或它们直接可得的来源。科学文献的分析将会揭示对需要靶向的任何类型肿瘤细胞系的细胞的正确选择。

如上所述，抗体构成一种直接识别肿瘤抗原靶的手段。已知许多抗体直接针对实体肿瘤抗原。以上列出了一些可用的抗肿瘤抗体。然而，如本领域技术人员所知，所列出的一些抗体对治疗用途来说，没有恰当的生化特性或可能没有足够的肿瘤特异性。一个例子是识别胞质抗原的MUC8-22。这些抗体一般只用于研究性实施例中，如用于模型系统或筛选试验中。

一般而言，用于本发明这些方面的抗体较佳的是能识别细胞表面可接近的抗原(且这些抗原择优地或特异性地由肿瘤细胞表达)。较佳地，这些抗体展现出高亲和力特性，如表现出K_d＜200nM，较佳的是＜100nM，且显示出对维持生命的正常组织无显著反应性，如一种或多种选自心脏、肾、脑、肝、骨髓、结肠、乳房、前列腺、甲状腺、胆囊、肺、肾上腺皮质、肌肉、神经纤维、胰、皮肤或其它人体内的维持生命的器官或组织。从低反应性观点说，对于本发明的目是非常重要的“维持生命”的组织包括心脏、肾、中枢和外周神经系统组织和肝。本文所用的术语“显著反应性”，指在适合免疫组织化学条件下将抗体或抗体片段施加到特定的组织上，不会染色或在大部分阴性细胞的区域中只有少数几个阳性细胞染色而可忽略。

用于本发明的特别有前途的抗体是那些对实体肿瘤有高选择性的抗体。例如，能结合选择性发现于许多乳房、肺和结肠直肠癌表面的TAG 72和HER-2原癌基因蛋白的抗体(Thor等人，1986；Colcher等人，1987；Shepard等人，1991)；MOv18和OV-TL3和结合于乳粘蛋白核心蛋白和人乳脂肪球的抗体(Miotti等人，1985；Burchell等人，1983)；以及结合于高M_r黑色素瘤抗原的抗体9.2.27(Reisfeld等人，1982)。其它有用的抗体是那些针对已知在大多数卵巢癌中相似表达的叶酸结合蛋白的抗体；那些针对磷状细胞癌和大多数神经胶质瘤中过量表达的erb家族的原癌基因的抗体；和其它正在进行的临床前和临床评估中已知的抗体。

按照本领域常规实行的标准临床前测试，抗体B3、KSI/4、CC49、260F9、XMMCO-791、D612和SM3据信特别适合用于临床实施例。B3(美国专利5,242,813；Brinkmann等人，1991)已有ATCC登录号为No.HB 10573；美国专利4,975,369中描述了KS1/4；以及D612(美国专利No.5,183,756)的ATCC登录号为No.HB 9796。

另一种确定肿瘤相关靶的方法是根据肿瘤细胞的特征，而不是描述细胞表达抗原的生化特征。因此，本发明设想任何优先结合肿瘤细胞的抗体可用作单萜/三萜靶向偶联物中的靶向组分。优先结合肿瘤细胞是以显示出对肿瘤细胞有高亲和力，并且与维持生命的正常细胞或组织无显著反应性(如上述)的抗体为基础的。

本发明还提供了若干方法以产生用于将单萜/三萜糖苷靶向肿瘤细胞(如上述)的抗体。为了产生肿瘤细胞特异性抗体，用含有肿瘤细胞抗原的组合物免疫接种动物并选择所产生的有适当特异性的抗体(下文将更充分地描述)。免疫接种组合物可含有纯化的或部分纯化的上文列出的抗原的制剂；组合物，如富含上文列出的抗原的膜制剂；任何上文列出的细胞；或包括上文列出的任何类型的细胞群或混合物。

当然，不论抗体的来源，在本发明的人体治疗实践中，应事先确认临床靶向的发炎位点或肿瘤表达了最终选定的抗原。这通过用适当地直接试验(包括测试肿瘤组织样品抗原性)来完成，例如，测试手术活样品或测试循环液中脱落的肿瘤抗原。这可通过免疫筛检试验如ELISA(酶联免疫吸附试验)进行，其中测试杂交瘤“库”抗体对肿瘤反应性的结合亲和力。然后选择出显示具有适合的肿瘤选择性和亲和力的抗体，用于本发明的双特异性抗体的制备。

由于熟知交叉反应的现象，设想有用的抗体可以从免疫接种过程产生，在该过程中所用的最初抗原是从动物(如小鼠或灵长类动物)衍生的，(此外，最初的抗原可从人细胞获得)。在用人来源的抗原时，它们是从人肿瘤细胞系中获得的，或是从所述特定患者获得的生物样品制备的。事实上，研制对患者肿瘤“为顾客定制”的抗体的方法是已知的(Stevenson等人，1990)，并且设想用于本发明。

1.抗体制造的方法

如所示，抗体可用于本发明的具体实施例中。例如，可产生对患者特定区域或特定类型组织有特异性的抗体。然后这些抗体可偶联于本发明的单萜/三萜混合物，从而可使单萜/三萜混合物特异性靶向抗体针对的组织。在这种抗体的一个实施例中，抗体结合于肿瘤细胞。在本发明的优选实施例中，抗体是单克隆抗体。制备和鉴定单克隆和多克隆抗体的方法是本领域熟知的，且下文也具体公开了(参见Howell和Lane，1988)。

简而言之，用含有所需靶抗原的免疫原免疫接种动物并收集免疫接种动物的抗血清制备多克隆抗体。大范围的动物品种可用于生产抗血清。典型地用于抗-抗血清制备的非人动物包括兔、小鼠、大鼠、仓鼠、猪或马。由于兔的血液量相对大，所以兔是制备多克隆抗体的优选动物。

对抗原同工型特异性的多克隆和单克隆抗体可用常规的免疫接种技术制备，这对本领域的技术人员是熟知的。含有特定类型细胞的抗原表位或本发明化合物的组合物可用于免疫接种一种或多种实验动物，如兔或小鼠，这些动物随后将产生针对这些抗原的特异性抗体。在让抗体产生一段时间后，通过简单的动物放血和制备全血的血清样品，可得到多克隆抗血清。

相信本发明的单克隆抗体可用于从胜利金合欢以外品种筛选本发明的三萜化合物的免疫化学过程，或运用对特定抗原的特异性抗体的其它过程。如所述，用本发明抗体的实施例包括制备针对肿瘤特异性抗原的抗体，将该抗体结合于本发明的三萜化合物，和用抗原-三萜偶联物治疗患者，从而本发明的三萜化合物被特异性靶向肿瘤细胞或其它细胞(包括可用本发明三萜化合物治疗的病症的细胞)。一般而言，针对各种抗原的多克隆和单克隆抗体可用于本发明的不同实施例。例如，它们可用于在抗体亲和柱上纯化三萜化合物。制备和鉴定这些抗体的方法是本领域熟知的，并且也已公开，例如Harlow和Lane，1988，且其公开的内容本文全部纳入作为参考。

如本领域熟知的，给定的组合物的免疫原性可能是不同的。因此通常需要强化刺激宿主的免疫系统，这可将肽或多肽免疫原偶联于载体上来实现。示范性和优选的载体是匙孔_血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。也可用其它白蛋白如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白作为载体。将多肽偶联于载体蛋白的方法是本领域已知的，包括戊二醛、m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳化二亚胺和二-biazotized二氨基联苯。

同样如本领域熟知的，可用免疫应答的非特异性刺激物(称为佐剂)提高特定免疫原组合物的免疫原性。示范性和优选的佐剂包括完全弗式佐剂(一种含死结核分枝杆菌的免疫应答的非特异性刺激物)、不完全弗式佐剂和氢氧化铝佐剂。

用于多克隆抗体制造的免疫原组合物的量取决于免疫原的性质和用于免疫接种的动物的性质而不同。可用各种途径给予免疫原(皮下注射、肌注、真皮内注射和腹膜腔内注射)。多克隆抗体的制造可用在免疫接种后的不同时间点采取免疫接种动物的血液样品进行监测。可给予第二次加强注射。重复加强免疫和滴定的过程直到得到适合的滴定度。当得到理想的免疫原性水平时，可将免疫接种的动物放血，分离血清并保存和/或将动物用于产生mAbs。

MAbs可用熟知的技术制备，如美国专利No.4,196,265例举的技术，其公开的内容纳入本文内容作为参考。通常该技术包括用选定的免疫原组合物(例如纯化的或部分纯化的肿瘤特异性抗原、多肽或肽或肿瘤细胞)免疫接种适合的动物。免疫接种组合物的给药形式应能够有效刺激抗体产生细胞。啮齿动物如小鼠和大鼠都是优选动物，当然也可用兔、羊或蛙细胞。用大鼠可提供某些优点(Goding，1986)，但小鼠是优选，BALB/c小鼠是最佳的，因为其是最常规用的动物且可以产生较高比例的稳定的融合。

在免疫接种后，选择有潜力产生抗体的体细胞，具体是B-淋巴细胞(B-细胞)用于mAb产生过程。这些细胞可从活体脾、扁桃体或淋巴结、或从外周血液样品中获得。脾细胞和外周血液细胞是优选的，前者是因为它们是产生抗体细胞(处于分裂的浆母细胞阶段)的丰富来源，后者是因为容易获得外周血液。通常先免疫接种一组动物，然后取出最高抗体滴度动物的脾脏，用注射器匀浆化脾得到脾淋巴细胞。通常一个免疫接种小鼠的脾脏可得到约5×10⁷到2×10⁸个淋巴细胞。

然后将免疫接种动物的产生抗体的B淋巴细胞与永生的骨髓瘤细胞融合，该骨髓瘤细胞通常与接受免疫接种的动物同品系。适合用于产生杂交瘤融合过程的骨髓瘤细胞系较佳的是不产生抗体的、具有高融合效力和酶缺陷的(致使它们不能在某些只支持所需融合细胞(杂交瘤)生长的选择性培养基上生长)。

可用的许多骨髓瘤细胞都是本领域已知的。例如，当免疫接种动物为小鼠时，可用P3-X63/Ag8，P3-X63-Ag8.653，NS1/1.Ag 41，Sp210-Ag14，FO，NSO/U，MPC-11，MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XXo Bul；对大鼠，则用R210.RCY3，Y3-Ag1.2.3.IR983F和4B210；和U-266，GM1500-GRG2，LICR-LON-HMy2和UC729-6均可用于细胞融合(参见Goding，1986；Campbell，1984；和ATCC目录)。

产生抗体-产生脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂交体的方法包括，以2∶1的比例将体细胞和骨髓瘤细胞混合，虽然该比例也可在20∶1到1∶1之间变化，加入一种或多种促进细胞膜融合的试剂(化学或电的)。(Kohler和Milsterin，1975；1976)已描述了用仙台病毒的融合技术，和由Gefter等人描述的用聚乙二醇(PEG)的融合，如37％(v/v)PEG。也可用电诱导的融合技术(Goding，1986)。

融合过程通常低频率产生活杂交体，约1×10^-6到1×10^-8。然而，这并不是问题，因为可通过在选择培养基中培养，从亲代、未融合的细胞(尤其是通常继续无限分裂的未融合骨髓瘤细胞)中区别出活的融合杂交瘤。这些选择培养基一般是含有能阻断核苷酸从头合成的试剂的组织培养基。示范性和优选试剂是氨基喋呤、氨甲喋呤和重氮丝氨酸。氨基喋呤和氨甲喋呤阻断嘌呤和嘧啶的从头合成，而重氮丝氨酸只阻断嘌呤的合成。当用氨基喋呤或氨甲喋呤时，培养基要补充次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷作为核苷酸的来源(HAT培养基)。当用重氮丝氨酸时，培养基要补充次黄嘌呤。

优选的培养基为HAT。只有能操纵核苷酸补救途径的细胞才能在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞缺少补救途径的关键酶，如次黄嘌呤磷酸转移酶(HPRT)，所以它们不能存活。B-细胞可操纵该途径，但它们在培养中生存时间有限，一般约2周死亡。所以，在选择培养基上可存活的细胞只有那些骨髓瘤和B-细胞杂交的细胞。

这种培育提供了一群特异性选出的杂交瘤细胞群。通常杂交瘤的选择是通过在微量滴定板上单克隆稀释培育细胞，测试各个克隆的上清液(约2到3周后)有无期望的反应性。试验必须敏感、简单和快速的，如放射免疫试验、酶免疫试验、细胞毒性试验、噬斑试验、斑点免疫结合试验等。

然后将选定的杂交瘤作系列稀释并克隆成各个抗体产生细胞系，可无限增殖这些克隆提供mAbs。可以两种基本方法开发这些细胞系来生产mAb。可将杂交瘤样品注射(通常注入腹膜腔内)入组织相容的动物(该类动物曾用于提供初始融合的体细胞和骨髓瘤细胞)。接受注射的动物生长了分泌特异性单克隆抗体(由融合细胞杂交体产生的)的肿瘤。可抽出动物的体液如血浆或腹水以提供高浓度的mAbs。也可在体外培育各个细胞系，则mAbs被自然地分泌到培养基中，从该培养基可方便地获得高浓度的mAbs。用这两种方法产生的mAbs都要进一步纯化，如果需要，可用过滤、离心和各种层析技术如HPLC或亲和层析法。

(iii)其它肿瘤细胞靶和结合配体

除了用抗体外，也可用其它配体，通过结合于肿瘤细胞抗原，将本发明的单萜/三萜化合物靶向肿瘤部位。对于肿瘤抗原是过量表达的受体(如雌激素受体、EGF受体)或突变受体的情况，可用相应的配体作为靶向试剂。

以类似于内皮细胞受体配体的方式，有一些组分能特异性或优先结合肿瘤细胞。例如，如果肿瘤抗原是过量表达的受体，肿瘤细胞可在体内被特异性配体包被。所以，该配体可成为针对该配体的抗体的靶子，或受体本身成为靶子。这些类型靶向试剂的具体例子是抗TIE-1或TIE-2配体的抗体、针对血小板因子4的抗体和白血球黏附结合蛋白。

(iv)毒素

在一些运用中，设想与本文所述的单萜/三萜化合物联合应用的另一种治疗试剂可以是偶联于抗体或生长因子的药理制剂，具体地说，是细胞毒性的或其它抗细胞制剂(具有杀死或抑制内皮细胞生长或细胞分裂的能力)。一般而言，本发明设想用任何药理制剂(包含在和补充本文所述的单萜/三萜化合物)，其可偶联于靶向试剂(较佳的是抗体)并以活性形式传递到肿瘤靶细胞。抗细胞制剂的例子包括化疗剂、放射性同位素和细胞毒素。在化疗剂中，本发明相信特别优选的制剂是甾类激素；抗代谢试剂，如胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶、氨甲喋呤或甲氨喋呤；氨茴霉素；丝裂霉素C；长春花生物碱；地美可辛；表鬼臼毒素吡喃葡糖苷；光辉霉素；或抗肿瘤烷化剂如苯丁酸氮芥或苯丙氨酸氮芥。在其它实施例中可能包括的制剂如细胞因子、生长因子、细菌内毒素或细菌内毒素的脂类A分子。据信这样的试剂(如果需要)可成功地与本发明的单萜/三萜化合物一起，以已知的偶联技术，以让它们在靶细胞部位寻靶、内化、释放或向血(细胞)组分提呈的方式连接于靶向制剂(较佳的是抗体)(参见，Ghose等人，1983和Ghose等人，1987)。

现已成功地将各种化疗剂和其它药理制剂偶联于抗体，并显示出药理功能(参见Vaickus等人，1991)。已作过研究的抗肿瘤制剂的例子包括阿霉素、柔红霉素、氨甲喋呤、长春花碱和其它各种制剂(Dillman等人，1988；Pietersz等人，1988)。另外，已描述了其它试剂的结合如新制癌菌素(Kimura等人，1983)，巨毛霉素(Manabe等人，1984)、三来胺醌(Ghose，1982)和α-蝇蕈素(Davis和Preston，1981)。上面具体公开了制备本发明单萜/三萜化合物和适当靶分子偶联物的具体方法。

VII.外用组合物和化妆品

本发明的一些方面涉及外用组合物，它含有本文所述的化合物，及其使用方法。通过将本发明的化合物加到外用组合物中，可在预防和/或治疗上获得化合物的有益生理活性。例如，本发明的化合物在本文中以显示能够减少各种类型的细胞损伤，包括但不限于各种类型的氧化损伤，致癌物导致的损伤，和UV介导的损伤。

本发明化合物的一种特别用途是作为外用组合物，包括化妆品的活性成分，这些外用组合物是设计用于治疗皮肤老化的。可能是老化导致的、并可根据本文预防或治疗的皮肤的特定变化(不论是慢性的(chronologically)还是表观的)包括：皱纹、皮革化(leatheriness)、发黄、松弛、粗糙、干燥、斑点(色素沉着过度)和各种恶化前生长，它们通常是亚临床的；微血管系统的降解；肌肉松弛和皱纹产生，部分是由于胶原的减少和交联，葡糖胺聚糖(基础物质)的聚集和极性弹性组织变性(弹性蛋白团集)；视网膜锥变平；表皮受限制的再生力周转，与Horny层的缺陷性发育有关(受干扰的角化)，导致皮肤干燥、皮肤粗糙和皲裂；表皮中细胞分裂的缺陷型调节(增生)和细胞成熟(分化)，导致非典型细胞和萎缩，丧失极性；和局部高和低色素沉着以及异常色素沉着(老年斑)。因此，发明人特别考虑用本发明提供的化合物治疗这些病况。

对此，本发明的一些方面涉及逆转皮肤损伤的方法或其作用。例如，本发明提供了预防性和/或治疗性使皮肤变厚，从而减少皮肤萎缩的方法，调节皮肤弹性的方法，和调节可见和/或可触摸的皮肤纹理断裂，包括细纹、皱纹、毛孔变大、粗糙、干燥和其它与老化皮肤有关的皮肤纹理不连结性的方法；这些方法包括对需要的皮肤施用安全和有效量的含有本发明化合物的外用组合物。还提供了减少哺乳动物皮肤色素过度沉着的方法，包括对需要这种治疗的皮肤施用安全和有效量的皮肤护理组合物，它含有本发明的化合物。色素过度沉着可以是由于皮肤的非-黑素变色引起的。

本发明因此涉及治疗和预防皮肤老化的产品，特别是对于由于光线而老化的皮肤和由于内部机制慢性变老的皮肤，以及由于其它外部因素造成的损伤的治疗。一般，在设计用于涂在皮肤上的化妆或皮肤科外用配方中施用本发明的化合物是理想的。

(i)皮肤的保护

本文所述的外用组合物可用于保护皮肤抵抗能损伤皮肤的各种因素。特别是，本发明的化合物在本文中显示了预防外源刺激的各种形式，包括辐射、致癌物和氧化压力导致的损伤。因此，本发明的一个方面预防或逆转由于外源因素导致的皮肤损伤，包括用安全和有效量的本发明的组合物接触皮肤。

由于本发明的化合物在本文中显示了活化抗氧化应答元件(ARE)，这些化合物将特别用于预防或减少活性氧簇、基团、自由基、氧化压力、氧化损伤导致及其组合导致的损伤。如本文所述，许多疾病过程是由身体针对提高水平的活性氧簇(ROS)的存在产生不良反应而导致，因而可用本发明的组合物治疗。

空气携带的工业和基于石油化工的污染物，例如臭氧、氧化氮、放射性颗粒和卤化烃也诱导皮肤、肺、胃肠道和其它器官的氧化性损伤。工业来源的辐射中毒，包括核反应堆的泄漏和接触核武器是辐射和辐射损伤的其它途径。接触的其它途径可来自生活或工作在电磁辐射源附近，例如电站和高压输电线、x光机、粒子加速器、雷达天线、无线电天线等，以及使用电子产品和装置，它们发射电磁辐射，例如电视和计算机显示器。因此，需要保护细胞，尤其是皮肤细胞免受这些病因的伤害，并且是本发明的一部分。

(ii)外用和化妆品配方

本发明所提供的活性物质组合或活性物质可以自己总重量的约0.001-99％重量存在于外用制剂中，也可以是0.001-50％重量。本发明的活性物质组合或活性物质可优选以制剂总重量的0.001-10％重量，特别是0.1-1％重量存在于外用制剂中。组合中两种成分的重量比可以在很大的范围内，例如1∶100-100∶1的比例，优选1∶10-10∶1的比例变化。组分还可以1∶2-2∶1或1∶1的比例存在。

一般对于外用溶液，帮助水化皮肤的润滑剂或润滑性载体，例如油质物质是理想的成分。本文所用的术语“润滑剂”应理解为组合物的整体无刺激性特征。即应选择载体的性质和其中活性化合物的量，以提供外用的低刺激性剂量。润滑剂水平可以是总组合物的0.5-50％，或更多，优选在5-30％重量。润滑剂可以分类成以下几类化学物质，酯、脂肪酸和醇、多元醇和烃类。

酯可以是单或二酯。脂肪二酯的可接受例子包括己二酸二丁酯、癸二酸二乙酯、dimerate二异丙酯和琥珀酸二辛酯。可接受的支链脂肪酯包括十四酸2-乙基己酯、硬脂酸异丙酯和棕榈酸异硬脂酯。可接受的三元酸酯包括三亚油酸三异丙酯和柠檬酸三月桂酯。可接受的直链脂肪酸酯包括棕榈酸月桂酯、乳酸肉豆蔻基酯和油酸硬脂酰基酯。优选的酯包括椰油基-辛酸酯/癸酸酯(椰油基-辛酸酯和癸酸酯的混合物)、乙酸丙二醇肉豆蔻基醚、己二酸二异丙酯和辛酸十六烷酯。

可用作润滑剂的多元醇包括直链或支链烷基多羟基化合物。例如优选丙二醇、山梨醇和甘油。还优选聚合的多元醇，例如聚丙二醇和聚乙二醇。丁二醇和丙二醇也是特别优选的渗透增强剂。

对冬季和具有非常干燥的皮肤的个体使用设计的配方，油基(不含水)是理想的。合适的油基例子是矿脂、矿脂加挥发性硅酮、羊毛脂和油包水乳液，例如Eucerin(Beiersdorf)。在温暖天气和用于较年轻的人时，可能理想的是用水包油乳液(霜)基底。合适的霜的例子是Nivea霜(Beiersdorf)、冷霜(USP)、Purpose霜(Johnson & Johnson)、亲水软膏(USP)和Lubriderm(Warner-Lambert)。

含有本发明的组合和活性物质的本发明的外用制剂或组合物包括所有惯用形式，例如霜(W/O、O/W或W/O/W)、凝胶、洗液或乳。本发明的外用制剂可配制成液体、膏状或固态制剂，例如水或醇溶液、水悬液、乳液、软膏、霜、油、粉末或棒。根据所需的配方，活性物质可掺入用于外用的药物和化妆品基底，它包含额外的成分，例如油成分、脂肪和石蜡、乳化剂、阴离子、阳离子、两性、兼性和/或非离子表面活性剂、低级单和多元醇、水、防腐剂、缓冲物质、增稠剂、香料、着色剂和乳浊剂。本发明的活性物质还有利的用于透皮治疗系统。

更有利的是在制剂中加入抗氧化剂(例如α-生育酚、维生素E和C)、黄酮、类黄酮、咪唑、α-羟基羧酸(例如苹果酸、乙醇酸、葡糖醛酸、唾液酸及其衍生物)，和/或离子复合剂(例如EDTA和α-羟基脂肪酸)和/或已知的紫外光保护滤剂，其量是例如0.1-10％重量，以确保氧化敏感性活性物质的稳定性。

可有利的在制剂中加入0.01-10％重量好氧菌细胞能量代谢物质或物质组合，例如细胞能量传递剂(例如肌酸、鸟嘌呤、鸟苷、腺嘌呤、腺苷、烟碱、烟酰胺或维生素B2)、辅酶(例如泛酸、泛醇、硫辛酸或烟酸)、辅助因子(例如L-肉碱、多萜醇或尿苷)、底物(例如己糖、戊糖或脂肪酸)和中间代谢产物(例如柠檬酸或丙酮酸)和/或谷胱甘肽。

还有利的是在制剂中加入渗透促进剂，特别是油酸、顺-6-十六烯酸或棕榈酸。渗透促进剂可以0.01-10％重量存在于制剂中。

本发明的制剂还可有利的含有其它物质，它吸收UVA和/或UVB区的紫外辐射，滤剂物质的总量是总制剂重量的例如0.1-30％重量，优选0.5-10％重量，尤其是1.0-6.00％重量，以提供保护皮肤不受整个紫外辐射区的损伤的化妆品制剂。它们可用作皮肤防晒产品。在制剂中，紫外吸收剂可作为活性物质中的抗氧化剂。

如果本发明的组合物含有UVB过滤物质。它们可以是油溶性或水溶性的。对于本发明有利的油溶性UVB滤剂的例子是：3-亚苯甲基樟脑衍生物，优选3-(4-甲基亚苯甲基)樟脑和3-亚苯甲基樟脑。有利的水溶性UVB滤剂的例子是：2-苯基苯并咪唑-5-磺酸，例如其钠、钾或其三乙醇铵盐，和磺酸本身。还可以用的是PABA的衍生物、肉桂酸盐和唾液酸盐。例如，可使用甲氧基肉桂酸辛酯和2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮(也称作氧苯酮)。甲氧基肉桂酸辛酯和2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮分别以Parsol MCX和Benzophenone-3的商标出售。

还有利的是，将本发明的活性物质和在化妆品配方中常见的UVA滤剂混合在一起。这些物质优选是二苯甲酰甲烷的衍生物，特别是1-(4’-叔丁基苯基)-3-(4’-甲氧基苯基)丙-1，3-二酮和1-苯基-3-(4’-异丙基苯基)丙-1，3-二酮。本发明还提供了这些组合和含有这些组合的配方。可使用用于UVB组合的量。

本发明因此涉及本发明的活性物质与抗氧化剂、好氧菌细胞能量代谢物质和/或紫外吸收剂的组合，用它们可改善例如制剂的稳定性和作用。可与所述组的活性物质混合的上述活性物质的例子是为了描述本发明，而不是要把本发明限于这些例子。

还可以保护性制剂形式使用；本发明的物质可以封入(装入胶囊)例如氢化两亲物质的脂质体、微胶粒、纳米球等之中，这些两亲物质是例如神经酰胺、脂肪酸、鞘磷脂和磷酸甘油酯，或者封入环糊精中。在配制过程中可用保护性气体(例如N₂、CO₂)和气密包装提供额外的保护。其它辅助剂和添加剂可以是水结合物质、增稠剂、填充剂、香水、染料、乳化剂、活性物质例如维生素、防腐剂、水和/或盐。

在活性物质或其它可能的氧化敏感物质的加工过程中，温度应该一般不超过约40℃。关于本领域技术人员已知的制备组合物的习惯方法另有评述。

本发明的化合物可以掺入所有化妆品基底。可以存在油或油性物质和乳化剂，以提供油包水乳液或水包油乳液，视所用乳化剂的平均亲水-亲脂平衡(HLB)而定。特别是，W/O、O/W和W/O/W乳液可能是有利的。本发明的组合可特别有利的用于护理产品，例如O/W霜、W/O霜、O/W乳液、W/O洗液等。

除了水，可用的载体包括液体或固体润滑剂、溶剂、湿润剂、增稠剂和粉末。尤其有用的非水载体是聚二甲基硅烷和/或聚二甲基苯基硅烷。所用的硅酮通常可以是25℃时粘度在约10-10,000,000mm²/s(厘沲)的那些。低和高粘度硅酮的混合物也是理想的。这些硅酮购自General Electric Company，商标为Vicasil，DowCorning Company，SE和SF，200和550系列。可用于本发明组合物的硅酮的量占组合物重量的5-95％，优选25-90％重量。

可用作润滑剂的示范性烃类是具有12-30个碳原子的烃链的那些。具体的例子包括矿物油、凡士林胶冻、角鲨烯和异链烷烃。

本发明化妆品组合物中另一类功能性成分是增稠剂。增稠剂通常以组合物的0.1-20％重量，优选约0.5-10％重量存在。示范性增稠剂是以商标Carbopol从B.F.Goodrich公司购得的交联聚丙烯酸酯。可使用的胶是例如黄原胶、角叉菜胶、明胶、卡拉牙胶、果胶和刺槐豆胶。在一些环境下，可通过也作为硅酮或润滑剂的物质来实现增稠功能。例如，超过10厘沲的硅酮胶和酯(例如硬脂酸甘油酯)具有双重功效。

粉末可掺入本发明的化妆品组合物。这些粉末包括白垩、滑石、高岭土、淀粉、蒙脱石陶土、化学修饰的硅酸镁铝、有机修饰的微晶高岭土、水合硅酸铝、热解法二氧化硅、淀粉辛烯基琥珀酸铝及其混合物。

其它附加剂少量组分也可掺入化妆品组合物。这些成分可包括着色剂、乳浊剂和香水。这些其它附加剂少量组分的量是组合物重量的0.001-20％。

化妆上可接受的载体常常占5-99.9％，优选25-80％组合物重量，而且在不存在其它化妆品附加剂的情况下可形成组合物平衡。优选的是，载体至少含占其重量80％的水。优选水占发明组合物的至少50％重量，最优选组合物的60-80％重量。

(iii)外用和化妆品组合物的用途

本发明的外用和化妆品组合物主要用作人皮肤的外用产品，尤其作为调理、湿润和使皮肤光滑的用品，以预防和减少纹理、皱纹或老化皮肤的出现。在使用中，在皮肤接触面积上涂用装在合适的容器或给药器中的少量组合物，例如1-100毫升，如果需要，可以用手或手指或合适的装置在皮肤上涂开和/或按摩入皮肤。另外，组合物可以任何其它外用方式传递，包括透粘膜给药，例如口腔、直肠和鼻给药。

(iv)产物形式和包装

可将本发明的外用皮肤和化妆品组合物配制成例如洗液、霜或凝胶。组合物可包装在适合其粘度和消费者使用的合适容器中。例如，洗液或霜可以包装在瓶或滚珠涂药器中，或适合手指操作的推进剂驱动的气溶胶装置或装有泵的容器中。当组合物是霜时，可简单储藏在不变形的瓶子或挤压容器，例如软管或有盖容器中。组合物还可以包裹在胶囊，例如美国专利号5,063,507所述的那些中，在此引入以供参考。本发明因此还提供一种含有本文所提供的化妆上可接受的组合物的密封容器。

VII.单萜/三萜化合物的用途

认为本文所述的单萜/三萜化合物还能用于除了消炎和抗肿瘤的各种应用，例如作为溶剂、作为抗真菌和抗病毒剂、作为毒鱼剂或灭螺药、作为避孕药、作为抗蠕虫药、作为紫外防护剂、作为祛痰剂、作为利尿剂、作为胆固醇代谢调节剂、作为心血管效应剂、作为抗溃疡剂、作为麻醉剂、作为镇静剂、作为免疫调节剂、作为退热剂、作为血管生成调节剂、作为降低毛细血管脆性的药物、作为对抗衰老作用的药物、和作为改善认知和记忆的药物。

本发明提供了以本文单萜/三萜化合物为例的强消炎药。发明人显示了本发明的单萜/三萜化合物是转录因子NF-κB的强抑制剂，它在炎症应答中起到了重要作用。由于越来越多的证据标明炎症应答在致癌作用中的中心作用，该发现非常重要。因此，用本文提供的单萜/三萜化合物治疗病人可以大大减轻与炎症有关的不同程度的病症，包括肿瘤审查和组织损伤。

炎症反应的引发阶段特征为血管通透性增加和组织胺、血清素、碱性多肽和蛋白的释放(流出)。还伴随充血和浮肿的形成。结果，细胞浸润和新结缔组织形成。发明人相信，用本发明的单萜/三萜化合物治疗可限制这些炎症的早期阶段，因此减少与炎症相关的消极作用。

本发明的化合物具有调节血管生成的作用。血管生成和血管再生的定义是新血管的生长。肿瘤和癌诱导血管生成，为肿瘤成长提供传送氧气和营养的命脉。新血管的生长同样也为恶性细胞向体内其它部分扩散提供了出路。因此抑制血管生成对癌症患者是有益的。另一方面，血管生成在如伤口愈合中也是需要的。这些创伤可以是意外伤害、烧伤、损伤和手术造成的外伤和内部器官创伤。因此，促进血管生长的制剂有很大的潜力用于创伤愈合的治疗。

也设想了将本发明的化合物用于调节胆固醇代谢。具体地说，设想将本发明的化合物和天然营养物用于降低患者血液胆固醇水平。因此，相信用本发明的三萜化合物治疗患者(口服或静脉注射)可减少与高胆固醇相关疾病的和心血管疾病的发病率。

对治疗心血管病症，设想本发明的化合物可用于治疗心率失常，并且还可用作血管松弛剂产生抗高血压活性。

在鉴定的本发明化合物的植物品种中选择了胜利金合欢，部分是因为它在干旱区域天然生长。这些区域生长的植物的一个重要代谢功能是产生具有保护细胞抗紫外辐射功能的化合物。本发明者特别考虑到本发明的单萜/三萜化合物能够起UV-保护剂作用。因此，相信本发明的化合物将在需要进行抗紫外辐射的应用中找到广泛的用途。例如，恰当的运用包括将本发明的单萜/三萜化合物作为防晒霜的组分，或涂抹在人皮肤上的其它类似乳液。

本文证明的本发明化合物化学保护作用表明这类组合物的潜在优点。因此，含有本发明单萜/三萜化合物的乳液和防晒霜特别适合于有各种形式皮肤癌易发素质的人。这些人包括具有白皮肤和那些有皮肤癌遗传倾向的人。这些素质包括可遗传的癌基因突变或细胞机制中介导对UV-诱导损伤进行修复的DNA的突变。特别显著的是控制基因修复机制的基因的突变，如UV-诱导的胸腺嘧啶-胸腺嘧啶二聚体的切除。类似地，可将本发明的单萜/三萜化合物加入任何其它需要增加UV-保护的组合物中，这些化合物可应用于任何希望UV-保护的生物或非生物。

单萜/三萜化合物的其它可能应用包括有效地保护中枢神经系统的损伤，记忆丧失或提高认识功能，用作抗氧化剂(监控血液氧化分子的水平)，或增加一氧化氮(NO)，治疗高血压病或动脉粥样硬化。另外，发明者还具体设想将本发明的三萜化合物局部运用提高阴茎的功能。发明者也设想了局部施用本发明的化合物来增加皮肤的胶原，从而抗皮肤衰老。

IX.炎症的抑制

NF-κB，一种在进化上从苍蝇转移到哺乳动物的遍在转录因子，是生物体对各种压力信号应答的中心调节子之一。与免疫和炎症途径有关的几种基因的转录是NF-κ B调节的。例如，各种促炎症细胞因子、粘着分子和凋亡因子的基因是由NF-κB调节的，因此NF-κB的失调导致各种病理状况，例如脓毒性休克、急性炎症、病毒复制和一些肿瘤。

NF-κB最丰富和活跃的形式是p50/relA的二聚体复合物(p50/p65)。在未受刺激的细胞中，这些因子在细胞质中，与抑制蛋白，例如IκB复合，这些蛋白屏蔽其核定位信号。当细胞收到胞外信号，例如炎症细胞因子、有丝分裂原、细菌产物、或氧化性压力介导的信号时，IκB的特定丝氨酸残基磷酸化。通过蛋白体途径传递该遍在化和降解信号。IκB的降解使得NF-κB的核定位区域暴露，使得无抑制剂的NF-κB复合物转位到核，与DNA结合，并活化特定基因的转录。由于NF-κB对于炎症、致癌作用和几种免疫疾病途径中的基因转录的控制/调节很重要，本发明人构思NF-κB的下调剂将提供对于炎症性疾病的治疗作用。因此，例如施用根据本发明的方法抑制NF-κB的单萜组合物抑制细胞中炎症应答的活化，因此预防/抑制/减轻了炎症。在许多情况下，长期或慢性炎症通常导致其它病症。在一个例子中，炎症性肠病(IBD)(如下详述)(从大肠发炎开始)可最终导致结肠癌。因此，发明人考虑用本发明所述的单萜/三萜组合物，通过本文所述的方法治愈和治疗炎症性疾病、恶化前病况等。

X.凋亡

哺乳动物细胞的死亡线路有两种主要的凋亡途径。一种是受体介导的途径，涉及Fas和其它肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员，它们激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8，而另一种涉及细胞色素c，Apaf-1和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-9。近来，显示了几种线粒体事件对于程序性细胞死亡是必需的。凋亡过程中的早期关键步骤之一是通过外线粒体膜将细胞色素c释放到胞质中。在胞质中，细胞色素c解放天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的活化，该酶是具有天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶。已报道了许多天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的底物，包括聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)，它是116kDa的DNA修复酶，在凋亡过程中被切开。发明人还在本文中描述了本发明的单萜/三萜组合物对线粒体凋亡事件的作用。

XI.恶化前炎症性疾病

下文描述了可用单萜/三萜组合物治疗的炎症性病况的一些例子。

Barretts食管炎。具有胃食管反流病的病人易于患食管炎、溃疡、狭窄形成，和正常鳞片衬垫(normal squamous lining)的柱状退变。大约10％的胃肠道反流病患者患有Barretts食管炎，并且与狭窄、深度溃疡的存在和腺癌的发生有关。在美国每年有500,000人以上诊断出胃食管反流病，仅约35,000进行了正确的抗反流。

光化性角化病。一种通常由日晒引起的皮肤的恶化前病况。光化性角化病最常见发生于良好的皮肤中，尤其是浅色皮肤的老人和年轻人中。生长发生在接触阳光的皮肤区域。生长一开始是平坦的鳞片区域，然后发展成硬疣状表面。它们归类为前癌症生长。大约20％光化性角化病发展成鳞状细胞癌。相关病症包括衰老性皮肤、日光性弹性组织变性、和其它阳光诱导的皮肤改变。

炎症性肠病(IBD)指导致大肠发炎的慢性疾病，例如溃疡性结肠炎(UC)和Crohn氏病(CD)。UC导致结肠和直肠内壁的炎症和溃疡。该内壁称作粘膜。Crohn氏病(CD)导致延伸到小肠壁深层的炎症。UC在西方世界相当普遍，单美国就至少有250,000人患有该疾病。该病最常发生在15-30岁的人中，虽然儿童和老人有时也会产生该疾病。Crohn氏病(CD)是可影响消化道任何部分的炎症过程，但最常见(大约所有情况的一半)，是在小肠最后部分，也称作末端回肠和盲肠。其它情况可影响以下的一个或多个：仅结肠、仅小肠(十二指肠、空肠和/或回肠)、肛门、胃或食道。这些病况中许多导致结肠癌。

XII.抗氧化反应元件的活化

许多化学致癌物必需在引发致癌作用前经过代谢活化。活化是通过形成亲电反应物发生的(Ramos-Gomez等，2001)。哺乳动物细胞中针对致癌作用的两种主要抵抗线是(1)能对亲电物质解毒，并作为抗氧化剂的2相酶，和(2)谷胱甘肽。2相酶和谷胱甘肽水平能通过各种天然或合成物质诱导。本发明人特别考虑本发明的化合物可用于这种诱导。即，考虑本发明的化学保护作用可能是由于诱导2相酶，它中和反应性亲电物质，并作为间接抗氧化剂，和/或能活化1相酶。

通过施用本发明的化合物，可以调节2相酶的水平，实现调节的生理作用，例如增加或减少解毒，并抵抗化学物质侵害。抗氧化剂反应元件涉及介导对各种致癌物和其它毒素的抵抗的2相酶介导的表达。该类中的可诱导2相蛋白质的家族是多样的，不同酶在细胞保护中起到不同的作用。除了诱导“经典的”2相药物代谢性酶，例如生物异源物质与内源液体偶联的谷胱甘肽S-转移酶(GST)和UDP-葡糖苷酸转移酶(Benson等，1978；Cha等，1979)的诱导外，可诱导蛋白质组还包括NAD(P)H：醌还原酶(NQO1)(Benson等，1980)；环氧化物水解酶(Benson等，1979)；亚铁血红素氧化酶1(prestera等，1995；Primiano等，1996)；铁蛋白(Primiano等，1996)；γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶(Mulcahy等，1997；Moinova等，1998和Otieno等，2000)；黄曲霉素醛还原酶(Ellis等，1996；Kelly等，2000)；接触酶和超氧化物歧化酶(Otieno等，2000)；二氢二醇脱氢酶(Ciaccio等，1994)；白细胞三烯B4脱氢酶(Primiano等，1999)；醛基-酮基还原酶家族，包括醛糖还原酶和醛还原酶；和谷胱甘肽S-偶联物流出泵(见Hayes等，1999的综述)。可通过施用本文公开的化合物实现一种、所有或这些或其它抗氧化反应元件介导的酶的任何组合的调节，这种应用特别形成本发明的一部分。

除了癌症，许多其它疾病状态也与一种或多种2相酶的异常功能有关。因此，用本文公开的化合物治疗这些疾病是本发明的一部分。例如，不能解除有毒的醛的毒性，例如通过醛-酮还原酶，与包括巨细胞性动脉炎和帕金森氏病在内的疾病有关。已知亚铁血红素对于神经元和其它组织(包括肾和肺细胞)不受氧化压力的伤害是重要的。另外，已知谷胱甘肽S-偶联物流出泵涉及癌细胞对化疗剂的多药物抗性(MDR)和细菌的抗生素抗性。因此，用本发明化合物进行的治疗可以用于调节谷胱甘肽S偶联物流出泵的功能，以消除或减少MDR或抗生素抗性。本发明的化合物还可用于调节细菌中的谷胱甘肽S-偶联物流出泵介导的信号传递。

如所述的，编码许多2相酶的基因含有5’-上游抗氧化反应元件(ARE/EpRE；共有序列TGACNNNGC)，它同时调节基础和可诱导表达。研究了与ARE元件相互作用的转录因子的相同性(见Hayes等，1999综述)，但据信转录因子的碱性亮氨酸拉链家族成员在2相酶表达中起了中心作用(Ramos-Gomez等，2001)。细胞接触诱导物破坏了Keapl-Nrf2复合物，Nrf2迁移到核，在那它与其它转录因子以异二聚体形式，与2相基因的ARE增强子区域结合，并刺激其转录。近来，显示了Michael反应受体诱导2相酶，其化学保护作用依赖于其与巯基的反应性(Dinkova-Kostova等，2001)。因此，本发明化合物的结构可负责抑制核因子-κB-p65与DNA结合，诱导化学保护性酶。对此如上所述，本发明的化合物可在许多以慢性炎症、氧化压力和肿瘤深层的高危险的临床背景中用作重要的预防性药物。

本发明化合物的一种具体用途是预防反应性氧簇(ROS)和反应性氮簇(RNS)造成的细胞损伤。例如，通过对包括活化反应性元件(ARE)的细胞或组织施用本发明的化合物，可预防或缓和ROS和RNS的损伤。类似的，这些方法可包括同时减轻炎症。治疗或减少ROS和RNS导致的损伤的能力在许多与ROS/RNS活性有关的病况中是重要的。这些条件的一些特定实施例，各自可用本发明通过对需要的病人施用本文所述的化合物来治疗，这些疾病如表6所示。

表6与ROS/RNS有关的临床病况

类别	例子
		炎症/免疫损伤	肾小球肾炎、脉管炎、自身免疫疾病、类风湿性关节炎、肝炎
缺血-复流状态	中风、心肌梗塞/心律失常/心绞痛/抑顿，器官移植、发炎的类风湿性关节、冻疮、Dupuytren挛缩、可卡因诱导的胎儿损伤
		铁超负荷(组织和血浆)	特发性血色病、饮食铁超负荷(Bantu)、珠蛋白深层障碍性贫血和其它用多次输血治疗的慢性贫血、营养缺陷(kwashiorkor)、酒精中毒、多器官衰竭、心肺分流、暴发性肝衰竭、早熟、酒精相关的铁超负荷、癌症化疗/放疗
辐射损伤	核爆炸的后果、偶然接触、化疗或接触低氧性细胞敏化剂或氡气
		老化	早衰症、自身老化、年龄相关的疾病，例如癌症
红血细胞	苯肼、伯氨喹和相关药物、铅中毒、原卟啉光氧化、疟疾、镰刀状红细胞贫血、fauvism、Fanconi氏贫血、早熟的溶血性贫血、化疗
		呼吸道	吸烟的后果、嗅吸吸入、其它烟雾吸入、肺气肿(COPD)、氧过多、支气管肺发育不良、接触空气污染物(O3、NO2、SO2、柴油机废气)、ARDS、矿石粉末肺尘埃沉着病、石棉致癌、博来霉素中毒、百草枯中毒、类臭素中毒、哮喘、囊性纤维化
心脏和心血管系统	酒精心肌病、Keshan病(硒缺乏)、动脉粥样硬化、蒽环霉素心脏毒性、心脏铁超负荷
		肾脏	自身免疫性肾病综合征、氨基糖苷中毒性肾损害、重金

	属中毒性肾损害(Pb、Cd、Hg)、肌红蛋白/血红素损伤、血液透析、移植储藏/排斥
		胃肠道	槟榔相关口腔癌、内毒素或卤化烃(例如溴苯、CCI4)导致的肝脏损伤、接触糖尿病发生物质、胰腺炎、NSAID-诱导的胃肠道病变、口腔铁中毒
大脑/神经系统/神经肌肉疾病	高压氧、维生素E缺陷、接触神经毒素、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病、中风、神经元蜡样脂褐质沉积症、过敏性脑脊髓炎、铝超负荷、损伤的后遗症、肌肉营养不良、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、Guam痴呆；还可以在保护移植的胎儿多巴胺产生细胞的过程中发生
		眼睛	白内障，眼球出血，退行性视网膜损害//视网膜黄斑退化、早熟的视网膜病变(晶体后纤维增生症)、光视网膜病变、金属物质刺穿
皮肤	紫外辐射、热损伤、卟啉病、金丝桃素、接触其它光敏化剂、接触性皮炎、秃发

缩写：ARDS，成人呼吸窘迫综合征；COPD，慢性阻塞性肺部疾病；NSAID、非甾体类抗炎药。

与氧化压力有关的病况一般是由下面的一种或两种导致的：(1)减弱的抗氧化剂，例如影响抗氧化物防御酶(例如CuZnSOD、MnSOD和谷胱甘肽过氧化物酶)的突变，或耗竭这些防御的疾病。许多生物异源物质是通过与GSH偶联代谢的；高剂量可耗竭GSH并导致氧化压力，即使生物异源物质本身不产生ROS或RNS。耗竭饮食中的抗氧化剂和其它必需的饮食组成也可导致氧化压力。(2)ROS/RNS的生产增加，例如通过接触增加的O₂，本身是反应性物质(例如NO₂)，或代谢产生ROS/RNS的毒素，或过量活化“天然”ROS/RNS-生产系统(例如在慢性炎症疾病中不合适的活化吞噬细胞)的存在。

组织损伤尤其是氧化压力的一个来源。可导致氧化压力，因此要用本发明的化合物治疗的受伤的例子包括：缺血-再灌注；热；创伤；冷冻；过度锻炼；毒素；辐射和感染。对于氧化压力的产生提出了许多样式，包括：巨噬细胞补充和活化(产生O₂、H₂O₂、NO^-、HOCl)；花生四烯酸释放，酶过氧化物形成(通过活化脂肪加氧酶、环氧化酶)；酶形成的和非酶形成的过氧化物降解成过氧化/烷氧化自由基，将损伤散布到其它脂类/蛋白质；储藏位点释放的金属离子(Fe²⁺、Cu²⁺)释放的金属离子刺激H₂O₂转化成OH^-，脂过氧化物分解成RO₂/RO^-；和“自身氧化”反应；血蛋白释放(肌红蛋白、血蛋白、细胞色素)；血蛋白与过氧化物反应，以刺激自由基损伤和(如果过氧化物过量)，释放FE²和haem，它们都能够将过氧化物分解成RO₂和RO；用抗过氧化物防御系统(例如GSH和细胞的抗坏血酸损失)；胞外液的抗坏血酸损失；黄嘌呤脱氢酶在一些组织中转化成氧化酶，可能是由于受伤的细胞释放黄嘌呤氧化酶，以导致全身性损伤，由于破坏能量代谢提高次黄嘌呤水平，增加了电子渗漏形成O₂ ^-；和产生胞内Ca²⁺，刺激钙激活蛋白酶，Ca²⁺依赖性核酶和Ca²⁺/钙调素依赖性氧化氮合成酶，提供了更多的NO，提高了形成ONOO^-的危险。

XII.筛选活性化合物的试验和方法

许多试验方法为本领域技术人员已知，可用于进一步特性分析本发明的单萜/三萜化合物。这些方法包括生物活性试验和化学特性试验。这些试验的结果提供了关于化合物性能和它们在治疗人或其它哺乳动物中的潜在用途的重要推论。这些试验被认为是在这方面包括体内和体外筛选生物活性和免疫试验的特定用途。

(i)体内试验

本发明包括使用各种动物模型。这里人和小鼠之间的同一性提供了非常好的机会来检验潜在治疗剂如本发明的单萜/三萜化合物的功能。可以用患癌小鼠模型来高度预测人和其它哺乳动物癌症。这些模型采用常位或全身给予肿瘤细胞来模仿原发性和/或转移性癌。另外，可通过向动物提供已知能引起与恶性转化和/或肿瘤发展相关活动的试剂，以诱导癌症。

用测试的化合物治疗动物包括以适当的形式将化合物给予动物。给药可以通过用于临床或非临床目的的任何途径包括，但并不限制于口服、鼻内、颊、阴道或局部。或者，给药可以是气管滴注、支气管滴注、真皮内、皮下、肌注、腹膜腔内或静脉内注射。具体地设想是全身静脉内注射，通过血液或淋巴供应区域性给药和肿瘤内注射。

体内化合物效力的确定涉及到各种不同的标准。这些标准包括，但并不限于，存活、肿瘤负荷或瘤块减少、肿瘤发展停止或减缓、肿瘤的消除、转移的抑制或防止、减少的活性水平、免疫效应功能的改善和食物吸收的改善。

体内抗肿瘤活性试验的一个特别有用的类型包括使用小鼠皮肤模型。这种小鼠皮肤模型，代表一种最熟知的多阶段癌发生的实验模型，可将癌发展分成三个不同阶段：启动、促进和发展。显然细胞演变到恶性涉及原癌基因和/或肿瘤抑制基因的一系列改变，这些基因的产物参与信号转导和/或基因表达调节的关键途径。皮肤肿瘤的促进和发展阶段的特征是选择性和持续增生、分化改变和基因不稳定性导致启动细胞特异性扩展为乳头状瘤和癌瘤。已表明持续增生的诱导与各种因子(如佛波酯、几种过氧化物和驱虫豆素)的皮肤肿瘤促进活性密切相关。在小鼠皮肤模型中，所有已知的致癌物和肿瘤促进剂已显示出能产生持续的表皮增生。通常，这通过炎症反应进行。

大量的数据揭示致癌性和致突变性密切相关。大部分肿瘤-引发因子要么产生亲电子的反应物，或通过代谢转化成亲电子的反应物，该反应物共价结合于细胞的DNA。一些游离基和修饰的DNA碱基是癌发生的肿瘤引发和/或肿瘤促进阶段涉及的游离基。强有力的证据表明在小鼠皮肤癌发生的过程早期发生了Ha-ras基因的激活，也许这等价于癌引发活动。例如，已显示由7，12-二甲基苯并[a]蒽诱导的小鼠皮肤乳头瘤和癌中活化c-Ha-ras基因的存在与密码子61的高频率A-T颠换相关。随后的研究显示这种类型的突变依赖于化学引发剂而不依赖于促进剂，提示引发剂对c-Ha-ras的直接作用。另外，用病毒激活的Ha-ras基因(v-Ha-ras)感染小鼠皮肤可能起着二阶段癌发生的触发作用。需要强调的是，所有的皮肤化学致癌物和皮肤肿瘤引发剂已显示出能产生Ha-ras癌基因的突变。而皮肤肿瘤促进剂不引起Ha-ras的突变。

(ii)体内验证和临床研究

本领域技术人员将理解，治疗剂，包括本发明的单萜/三萜化合物或带有这种添加剂的组合物，一般在用于人体前应在动物体内进行测试。这种临床前动物体内测试是本领域的常规。为了进行这种确证实验，需要本领域可接受的患所述疾病的动物模型，如患炎症疾病或实体肿瘤的动物。可使用任何动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、狗、黑猩猩等。在本文的炎症疾病和癌症治疗中，研究用的小动物如小鼠是被广泛接受的，因为其可预测人体中的临床效果，因此这些动物模型在本发明中是优选的，因为它们易得且相对便宜，至少与其它实验动物相比。

进行实验性动物测试的方法对本领域技术人员而言是简单易懂的。进行这种测试要求建立相等的治疗组，并将测试化合物给予一组动物，同时其它各对照组研究在剩下的组中相等动物上平行地进行。监测研究过程中的动物，最后处死动物分析治疗的效果。

在治疗炎症中，设想本发明单萜/三萜化合物的治疗有效剂量一般是导致发炎位点上至少约10％细胞显示炎症减轻的剂量。较佳地，至少有约20％、约30％、约40％或约50％细胞显示炎症减轻。最佳地，细胞100％显示炎症减轻。

较佳的是单萜/三萜化合物的用量可诱导至少约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％和100％的炎症减轻，只要所用的剂量不会在动物体内导致明显的副作用和其它不良反应。本领域的普通技术人员可以进行这种确定和恰当的评估。例如，研究辅助人员、科学家和医生可用这些实验动物的数据优化人体治疗的适当剂量。对于晚期病人，一定程度的副作用可能耐受；而对早期阶段的患者可用较温和的剂量治疗以在无副作用的情况下获得显著的治疗效果。在实验动物研究中观察到的效果与对照水平相比应具有统计学意义，且应在重复研究中可重现。

本领域技术人员将理解，产生较低程度有效范围炎症减轻的本发明化合物的组合和剂量，对于本发明仍然是有用的。例如，在连续给予活性制剂的实施例中，设想只产生10％炎症减轻的初剂量也是有用的。另外，考虑一种单萜/三萜化合物的剂量也可以对于接受治疗的病人是治疗有益的，它可以预防或减少作为炎症病况晚期的肿瘤形成，或重新致癌作用的可能性。

如与体外测试系统结合的上文所述，自然可理解应一起测试和优化欲一起使用的制剂。本发明的化合物可直接与一种或多种化疗剂、免疫毒素、凝固配体(coaguligand)等联合分析。可按照上述准则确定和评估这些制剂的联合效果。

(iii)体外试验

在本发明的一实施例中，在体外筛选植物提取物以鉴定这些化合物抑制炎症和/或肿瘤细胞的生长或杀死肿瘤细胞的能力。

可通过例如，测定与炎症有关的各种基因和/或蛋白质的表达和诱导，来体外确定化合物对减轻炎症的效率。因此，NF-κB转录因子减少，涉及控制炎症途径中的许多基因，或酶(例如iNOS和COX-2)减少。这两种酶都被诱导，以响应各种细胞因子，例如白细胞介素γ、有丝分裂原、微生物产物，例如脂多糖等。因此，它们形成重要的炎症应答、修复损伤和致癌的组分。

关于肿瘤细胞的杀死或细胞毒性，一般表现为坏死或细胞凋亡。坏死一般是由外部信号触发的较共同途径。在该过程中，细胞膜和细胞区室丢失了完整性。另一方面，细胞调亡或编程性细胞死亡是高度组织化的形态活动过程，并同步发生特异性基因的活化或失活(Thompson等人，1992；Wyllie，1985)。

细胞毒性体外试验的有效方法包括使一组肿瘤细胞系统性接触于选定的植物提取物。适合于实施该试验的方法和肿瘤细胞系对本领域技术人员来说是熟知的。特别适用于体外抗肿瘤活性试验的人肿瘤细胞系包括人卵巢癌细胞系SKOV-3、HEY、OCC1和OVCAR-3；Jurkat T-白血病细胞；MDA-468人乳房癌细胞系；LNCaP人前列腺癌细胞、人黑色素瘤系A375-M和Hs294t；和人肾癌细胞769-P、786-0和A498。较佳的用于对照的正常细胞系类型是人FS或Hs27包皮成纤维细胞。

可如下实现体内测定化合物杀死肿瘤细胞的效力，通过分析参与细胞周期停滞(p21、p27；细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂)和凋亡(bcl-2、bcl-x_L和bax)的各种基因的表达和诱导。为了进行该试验，用测试化合物处理细胞，裂解细胞，分离蛋白，然后在SDS-PAGE凝胶上分离并将结合于凝胶的蛋白转移到硝酸纤维膜上。先用第一抗体(如p21、p27、bax、bcl-2和bcl-x₁等的抗体)探测该膜，然后用稀释的辣根过氧化物酶偶联的第二抗体检测，将膜暴露在ELC探测试剂中，然后在ELC-摄影胶片上观察。在分析相关蛋白比例时，可按给定阶段(如G0/G1期、S期或G2/M期)的细胞比例作出估计。

也可用MTT或结晶紫染色有效地辨别某化合物对癌细胞的细胞毒性。在该方法中，接种细胞，并接触不同浓度的样品化合物，培育、用MTT((3-4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑；Sigma Chemical Co.)或结晶紫染色。将裂解缓冲液(用50％DNF配制的20％十二烷基硫酸钠)加入到MTT处理的平板，再培育，然后在570nm进行OD读数。用Sorenson缓冲液(0.1M柠檬酸钠(pH4.2)，50％v/v乙醇)洗涤结晶紫染色的平板，除去染料，在570-600nm读数(Mujoo等人，1996)。相对吸光度提供了对产生的细胞毒性的测量。

(iv)NF-κB抑制的试验

可通过例如，测定NF-κB诱导/调节/调控的各种基因和/或蛋白质的表达，实现对抑制NF-κB的化合物效力的体外测定。例如，测定与炎症途径有关的基因表达或基因的蛋白质表达。在一个具体实施例中，iNOS和COX-2等酶的减少，是响应细胞因子对细胞的刺激的NF-κB活化的下游应答的结果。这些细胞因子是例如干扰素γ、有丝分裂原、微生物产物，例如脂多糖(LPS)等。这些试验可以包括本领域已知的方法，例如蛋白质印迹、基因表达的试验、酶试验等。

例如，NF-κB抑制的试验，包括蛋白质印迹分析，其中，将用抑制性化合物处理的细胞胞质和核蛋白提取物用于研究抑制性蛋白IκB的降解和NF-κB的p65亚基核转位。对于这些试验，将胞质或核蛋白提取物溶于凝胶，并在载体/膜上电泳。可适当地用抗体，例如家兔抗-IκBα或家兔抗-p65抗体(Santa Cruz，CA)，然后用与探测分子，例如辣根过氧化物酶(HRPO)偶联，与氟或放射性核苷结合的抗家兔抗体探测膜。然后可通过合适的方法，例如化学发光、荧光检测、放射性检测等探测和鉴定蛋白质条带。

在其它实施例中，试验可能涉及转染和报道基因，例如荧光素酶或GFP的试验。因此，可以用含有NF-κB的报道构建物通过电穿孔或其它方法转染细胞。然后用抑制性化合物(例如本文所述的单/三萜组合物)处理细胞。然后用刺激剂，例如细胞因子或微球LPS活化NF-κB，测定报道基因活性。

可通过将用抑制剂(例如F094或单萜/三萜糖苷)处理的细胞铺板，并通过例如使细胞接触LPS/细胞因子活化NF-κB，进行NF-κB活化的酶(例如iNOS和COX2)的诱导和测定。然后裂解细胞，提取蛋白质，将细胞蛋白质加到凝胶上，电转移到膜上。用合适的抗体，例如在一个例子中用家兔抗-iNOS(Santa Cruz)和山羊抗-COX-2抗体，通过蛋白质印迹分析分析iNOS和COX-2的水平。在其它实施例中，还可以作为检测NF-κB抑制的方法测定酶活性。

(v)免疫试验

在本发明中可用免疫试验，例如，从胜利金合欢以外的植物品种的提取物中筛选本发明的单萜/三萜化合物。本发明的免疫试验包括，但并不限于，美国专利No.4,367,110(双单克隆抗体夹心试验)和美国专利No.4,452,901(Western印迹法)中公开的。其它试验包括标记配体的免疫沉淀法和免疫细胞化学(体外和体内)。

最简单和直接判断的免疫试验是结合试验。某些优选的免疫试验是本领域已知的各种类型的酶联免疫吸附试验(ELISA)和放射免疫试验(RIA)。用组织切片的免疫组织化学测定也是特别有用的。

在一示范性ELISA中，将抗单萜/三萜抗体固定到表现蛋白亲和力的选定表面上，如聚苯乙烯微量滴定板的孔中。然后，将怀疑含有本发明单萜/三萜化合物的测试组合物如胜利金合欢相关植物的植物提取物，加入到这些孔中。结合并洗涤除去非特异性结合的免疫复合物后，可检测结合的抗原。检测一般是加入对所需抗原有特异性的另一种抗体(它连接了可检测的标记)而实现的。这种类型的ELISA是简单的“夹心ELISA”。检测也可通过加入对所需抗原有特异性的第二抗体，然后再加入对这第二抗体有结合亲和力的第三种抗体(链接了可检测的标记)而实现。

各种不同的ELISA技术是本领域技术人员已知的。在这些(技术的)变化之一中，将怀疑含有所需抗原的样品固定在孔表面，然后与制备的抗体接触。结合并适当洗涤后，检测结合的免疫复合物。当抗原特异性第一抗体连接了可检测标记时，可直接检测免疫复合物。再者，可用对抗原特异性第一抗体具有结合亲和力的第二抗体检测免疫复合物(第二抗体已连接了可检测标记)。

在测试样品竞争结合于已知量的标记抗原或抗体时，也可用竞争ELISA。在样品与包被孔培育之前或培育时，将样品与已知的标记物混合，来测定未知样品中活性物质的量。样品中存在的活性物质其作用为减少结合于孔的标记物量，从而减少了最终的信号。

不论所用的形式，ELISA有若干共同特征，如包被、培育或结合、洗涤除去非特异性结合物质，和检测结合的免疫复合物。这些描述如下。

也可将抗原或抗体连接到固相支持物上，如以平板、玻璃珠、蘸棒(dipstick)、柱基质或薄膜的形式，和将待分析的样品加入到固定的抗原或抗体上。在用抗原或抗体包被平板时，一般将板孔与抗原或抗体溶液培育过夜或一段特定的时间。然后洗涤平板的孔除去未完全吸附的物质。孔上剩下的表面用非特异性蛋白(对测试抗血清来说是抗原中性的)“包被”，这些包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白和奶粉溶液。这种包被封闭了固定表面的非特异性吸收位点，因此减少了抗血清非特异性结合于表面造成的背景。

在ELISA中，较习惯的是用二级或三级检测方法而不是直接检测。因此，在抗原或抗体结合到孔上、用非活性物质包被以减少背景、洗涤除去不结合的物质后，使固定的表面与待测试的临床或生物样品接触在能有效形成免疫复合体(抗原/抗体)的条件下进行。然后免疫复合体的检测需要标记的第二结合配体或抗体、或第二结合配体或抗体加上标记的第三抗体或第三结合配体。

“有效形成免疫复合体(抗原/抗体)的条件”所指的条件较佳地包括用溶液(如BSA、牛丙种球蛋白(BGG)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)/Tween)稀释抗原和抗体。这些加入的试剂将有助于减少非特异性背景。

适合的条件也指在足以有效结合的温度和时间内培育。培育步骤通常从1到2～4小时，较佳温度为25℃到27℃或在4℃左右培育过夜。

在ELISA所有培育步骤后，洗涤被接触的表面以去掉未复合的物质。洗涤通常包括用PBS/Tween或硼酸盐缓冲液洗涤。在测试样品和初始结合物质之间形成特异性免疫复合物和后续的洗涤后，可检测到非常微小量的免疫复合体的存在。

为了提供检测工具，第二或第三抗体应带有结合的标记物以工具便检测。较佳地，该标记物是一种酶，它与适当的产色底物培育时将会产生颜色。因此，例如，在适宜进一步形成免疫复合物的条件下，可期望用偶联于抗体的脲酶、葡糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶来接触和培育第一或第二免疫复合体一段时间，例如在以PBS配的溶液如PBS-Tween中室温培育2小时。

用标记的抗体培育并随后洗涤除去未结合的物质后，定量测定标记的量，如在以过氧化物酶为酶标记时用产色底物(如尿素和溴甲酚紫或2，2’-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[ABTS]和H₂O₂)培育。然后用可见光分光光度计测定产色的程度进行定量分析。另外，标记可以是化学发光标记物。在美国专利No.5,310,687、5,238,808和5,221,605中公开了这些标记的用途。

体外和原位分析方法是已知的，包括评估抗原特异性抗体与组织、细胞或细胞提取物的结合。这些常规技术对本领域技术人员来说是易于掌握的。例如，可用抗肿瘤细胞抗原的抗体结合新鲜冰冻的和福尔马林固定的、石蜡包埋的组织块进行免疫组织化学(IHC)研究。每个组织块可由50mg残留的“粉碎的”肿瘤组成。从这些特定标本制备组织块的方法已成功地用于上述各种预后因素的IHC研究，如乳房癌中，这对本领域技术人员来说是熟知的。

简单地说，制备冷冻切片可在室温下将50mg冷冻的粉末化肿瘤以PBS复水装入小塑料封壳中；离心沉淀；将颗粒重悬于粘稠的包埋介质(OCT)中；反转封壳再离心沉淀；在-70℃异戊烷中快速冷冻；切开塑料封壳，取出冻结的组织柱；将该组织柱在冷冻显微切片卡盘上固定；切成25-50个含有平均约500个明显完整肿瘤细胞的切片。

也可用类似的方法制备永久切片，包括将50mg样品在塑料微量离心管中复水；沉淀；重悬浮于10％福尔马林4小时固定；洗涤/沉淀；重悬浮于温热的2.5％琼脂中；沉淀；在冰水中冷却使琼脂变硬；从管中取出组织/琼脂块；在石蜡中浸润并包埋组织块；切成50个永久切片。

按照本发明所公开的内容，可以用筛选试验鉴定具有本文所述物质相同的化学特性和生物活性的化合物。具体地说，本发明所公开的方法使人们能测试从与胜利金合欢密切相关的植物(例如金合欢属的成员)中提取的生物活性单萜/三萜糖苷。这些试验可能用各种不同的形式，取决于待筛选的物质的“活性”类型。较佳的试验包括那些直接用于筛选抗肿瘤活性物质，如本文所述的胜利金合欢提取物的试验。本文所用的“抗肿瘤活性”指抑制肿瘤细胞中的细胞-到-细胞信号传导、生长、转移、细胞分裂、细胞迁移、软琼脂集落形成、接触抑制、入侵能力、血管生成、肿瘤发展或其它恶性表型，或细胞凋亡的诱导。具体设想的有功能性试验，包括测定本发明化合物的以下用途：抗真菌药、抗病毒药、杀鱼剂或杀螺剂、避孕药、驱蠕虫药、UV-保护剂、祛痰剂、利尿药、抗炎药、胆固醇代谢调节剂、心血管效应物、抗溃疡药、止痛药、镇静剂、免疫调节剂、解热药、血管生成调节剂、和毛细管脆性减少剂。本文所公开的这些试验对本领域技术人员来说是熟知的。这些试验，以及在体内、体外直接测定活性的试验，可包括对本发明化合物抑制与底物、配体、受体或其它结合伙伴的结合的测定。

XIV.胜利金合欢的生长和组织培育

制备单萜/三萜化合物的重要方面是获得胜利金合欢的组织。如前文所述，化合物集中于胜利金合欢的根和豆荚，获得这些组织是非常重要的。小的幼苗是分离本发明化合物的另一个来源。胜利金合欢生长在美国的西南部和澳大利亚，因此这些植物组织是公众可获得的。另外，于1998年5月7日由申请人将胜利金合欢2500种子保存在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd，Manassas，VA 20110-2209。这些保存的种子已被指定为ATCC登录号209835。这些按照符合布达佩斯公约关于微生物保藏的条款和条件进行，且至少可保藏30年，至少需要5年从保管人的保存品制备样品或本专利的有效形式，也可能更长的时间，如果在这段时间内其变为非活性的将被置换。

所以，按照本文所公开的，本领域技术人员可种植这些保存的种子，从它们栽培植物，并从这些植物分离的组织中制备本发明的三萜化合物和天然营养物。同样，也可从天然的胜利金合欢群体中分离组织。然而，如果为胜利金合欢组织的繁殖设计了合适的培育技术，就可更容易地制备组织分离出本发明的单萜/三萜化合物。制备组织的一种选择是大规模的培育品种。但是，更佳的选择包括组织培育胜利金合欢和提供通气培育系统。

(i)通气培育技术

已认识到用通气系统培育胜利金合欢有许多优点。首先，植物生长的速度约是用常规生长技术所达到的两倍。其次，无需损伤植物就可轻易地收获根。根的切除还导致了须根广泛的侧向生长。因此，一年可收获若干次根。而从野生的胜利金合欢收集荚果限于一年中的几周，而且若不损害或杀死植物是很难收获根的。

通气培育系统是一个封闭的系统，其中植物的根悬浮在空气中，并用完全营养液喷雾。根被包围在一个用营养液间歇喷雾的不漏防水盒中。该营养液含有植物种子完成生长周期所需的所有基本元素。尽管不同的植物最佳生长需要不同营养级别和配方，但一种全面的单平衡的溶液可得到满意的结果。

(ii)胜利金合欢的组织培育

组织培育是胜利金合欢培育的另一种选择。为进行组织培育，胜利金合欢的种子用抗微生物的肥皂以自来水充分洗涤，用20％的商品漂白剂溶液处理15分钟。用去离子水反复洗涤后，用沸水处理种子以诱导发芽，培育过夜。次日上午，再用商品漂白剂消毒种子，在无菌去离子水中漂洗2-3次。然后将去污后的种子培育在补充有MS维生素和2％蔗糖(若为外植体培育，则用3％蔗糖)的MS培养基上(Murashige等人，1962)，该培养基用0.7％琼脂或0.2％gelrite凝固。

用于培育的外植体可包括任何组织类型，包括芽尖、结节段、下胚轴或根节段。一般外植体在MS或补充有生长调节剂(如IAA、NAA、IBA、2，4-D和BAP，单独或联合)的MS培养基上培育。培育通常维持在25±2℃，以冷白光日光灯产生的1000lux可见光照射16小时。得到的小苗在温室的喷雾中培育1个月使其生长变硬，然后将它们转移到温室，田野或通气生长系统。

本发明中也用了胜利金合欢毛根培育。用发根土壤杆菌菌株R-1000感染植物，导致植物基因组中T-DNA的整合和表达，从而导致毛根发育。毛根培养物生长得很快，出现斜生根的生长，在无激素的培养基上高度分枝，还展现出高度的遗传稳定性(Aird等人，1988)。在实施例部分详述了胜利金合欢中毛根的基因转化和诱导，以及生长的最优条件。毛根培养物使组织大规模的快速生长，可用于分离本发明的单萜/三萜化合物。

组织培育的一个优点是可制备表达本发明单萜/三萜化合物的克隆培养物。这些培养物可大规模生长，且有可能扩展至产业规模的生长系统，用于制备植物组织分离单萜/三萜化合物。另外，组织培育再生的植物通常表现出显著的变异。所以，用组织培育，可产生从这些培养物再生的克隆细胞系或植物，从生产本发明的单萜/三萜化合物的角度来说是非常好的。产生的植物可自交传代，在繁殖的每代中挑选以产生纯育的优秀品系。

然而，并非必需从组织培养物中产生优秀的变种，因为在胜利金合欢野生群体中存在显著遗传变异。因此，本发明者考虑胜利金合欢野生群体中发现的遗传变异，包括控制单萜/三萜组合物产生的内源性水平的基因变异。所以，应当能鉴定出胜利金合欢中比其它野生型群体成员产生单萜/三萜水平更高的那些品种，并选出这些变异，用于产生植物组织以分离单萜/三萜化合物的培育系统中。这些培育系统可包括，例如常规耕种、通气培育技术、组织培育或其它适合繁殖胜利金合欢组织的技术。另外，也可选择这些植物用于育种过程，以产生更优秀和纯育的变异体。

XV.定义

“一”是指“一种或多种”。因此一个分子可指一个、两个、三个、或更多的分子。

活性组分是指保留活性的最纯提取物。在本发明中，“活性组分”或“活性化合物”是指由本发明者鉴定的活性三萜化合物。这些化合物已被纯化和鉴定，例如组分UA-BRF-004-DELEP-F094。

豆荚是指胜利金合欢的种子豆荚(seedpod)。

细胞毒的是指细胞死亡，而术语“细胞抑制”是指对细胞生长和/或繁殖的抑制。

凋亡是指在胚胎发育过程和维持组织内平衡过程中，编程性细胞死亡的正常生理过程。凋亡过程可分为凋亡细胞的一系列代谢变化。可测定若干调节或信号转导途径中的各个酶促步骤，以证明在一个细胞或细胞群体中发生了凋亡，或在癌细胞中细胞死亡的过程被破坏。也可通过形态特征包括质膜的变化(如丧失不对称)、胞浆和胞核的凝缩和DNA的核小体间断裂，来观察凋亡过程。当细胞退变成“凋亡小体”时达到细胞死亡的顶峰。

已开发了测定若干涉及凋亡的酶促和信号传递过程的技术，作为多参数凋亡研究的标准程序。凋亡早期过程的例子是线粒体释放细胞色素c，然后激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3途径(PharMingen，San Diego，CA)。诱导天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(一系列的胞质蛋白酶)是观察到的最恒定的凋亡特征之一。具体地说，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3在该过程中起中心作用。当天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶被活化，它们裂解靶蛋白；其中最重要的一种是PARP(位于胞核上的一种蛋白，聚-(ADP-核糖)聚合酶)。因此，检测细胞色素c、检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性和检测PARP降解的试验都可有效确定凋亡。

另外，可以认为，有可能将造成恶性细胞的线粒体释放细胞色素c的试剂用于恢复编程性细胞死亡至少某些方面的细胞控制的治疗。

另一凋亡试验是膜联蛋白-V检测(BioWhitaker，Walkerville，MD)。通常，磷脂酰丝氨酸(PS)位于质膜的内膜上。然而，在凋亡初期，发生PS的外表化。膜联蛋白-V是结合于PS的钙结合蛋白，可用膜联蛋白-V-FITC染色后以流式细胞术观察(Martin等人，1995)。用本发明描述的胜利金合欢化合物处理的细胞，其结合膜联蛋白-V的能力可作为细胞经历凋亡的指标。

在另一实施例中，本发明者用PI-3-激酶试验来检测用胜利金合欢分离的抗癌症化合物的混合物处理的细胞的凋亡活性。磷酸肌醇3-激酶(PI3K)是一种细胞膜结合酶，能将磷脂酰肌醇的肌醇环3-位点磷酸化，从而在PI3K活跃的细胞中确定了一种新的脂类信号传递途径。当PI3K活跃时，一种称为AKT的激酶被征集到胞膜上。AKT是癌基因的产物，其在征集于膜上后被催化激活。充分激活的AKT在细胞存活中起决定性作用。PI3K/AKT途径提供了一种细胞逃脱凋亡的机制。因此，抑制恶性细胞中的PI3K可作为至少某种程度恢复细胞凋亡控制的一种治疗方法。

异常增殖是指在已知为癌症的病理状态下哺乳动物细胞中发生的一系列遗传改变。这个过程最终导致丧失对癌细胞的凋亡控制。这通常是分以下几步发生的，一般为1.引发，定义为外因或刺激物触发一个或多个细胞基因改变的阶段，和2.促进，定义为包括进一步遗传和代谢改变的阶段，包括发炎。在“促进阶段”细胞开始代谢过渡到细胞凋亡被阻断的细胞生长阶段。

恶性细胞是指在恶变的引发和促进阶段，通过一系列代谢变化逃脱正常生长控制机制的癌细胞。这些改变是细胞中遗传改变的结果(原癌基因的激活突变和/或表达增加，和/或一种或多种肿瘤抑制基因的失活突变和/或表达减少)。大部分癌基因和肿瘤抑制基因产物是信号转导途径的组分，它们控制细胞周期的进口或出口、促进分化、有义DNA的损伤和引发修复机制、和/或调节细胞死亡程序。细胞用多种平行机制来调节细胞生长、分化、DNA损伤控制和凋亡。几乎所有的肿瘤和恶性细胞在多个癌基因和肿瘤抑制基因中都有突变。

提取物或组分是指用各种方法从组织中收集的连续样品。可分析这些“提取物”或“组分”的所需抗肿瘤活性，可对其进行进一步的“提取”或“分级分离”，产生相应于活性组分的更纯组分。

单萜/三萜化合物或单萜/三萜糖苷是指从胜利金合欢鉴定出的新的和/或生物活性皂苷化合物。这种单萜/三萜化合物或单萜/三萜糖苷并非一定要从胜利金合欢中分离，按照本文所公开的内容，本领域技术人员可从相关的植物品种中分离出这种化合物，或化学合成本文所公开的单萜/三萜化合物或糖苷的类似物。或者，可以生化合成这些化合物。本发明的“单萜”包括本文所述的皂苷化合物，它具有至少一个单萜单元。单萜可额外/可任选的与能使它们运入细胞中的“载体分子”结合，载体可以是三萜糖苷、糖或糖类、脂类或亲脂性蛋白或任何对单萜赋予膜渗透性的分子。另外，单萜可与额外的化学官能团结合，从而修饰不破坏发明简述所述的化合物的生物学活性。由于单萜可以与三萜结合，因此化合物被称作“单萜/三萜化合物或糖苷”。本发明的“三萜”包括本文所公开的皂苷化合物，此种化合物 至少含有一单元三萜，若是三萜糖苷，则含有糖或糖类以及至少一单萜。这些术语也指含有其它分子或化学功能团的化合物，包括，但并不限于，见于本说明书其余部分的单萜单元。所以，本发明的三萜也包括糖单元水解形成的苷元，还包括三萜化合物的其它修饰，其中这种修饰不破坏化合物的生物活性。

XVI.实施例

以下的实施例是用于显示本发明的优选示范例的。本领域的技术人员可理解实施例中公开的技术，代表了本发明者发现的在本发明实施中功能良好的技术，可认为组成了实施本发明的优选模式。然而，按照本发明所公开的内容，本领域技术人员能领会在公开的实施例中作许多改变也可获得相同或类似的结果，而不超出本发明的构思、精神和范围。更具体地说，显然有一些化学和生理性的相关试剂可替代本文所公开的试剂而得到相同或类似的结果。所有类似的取代和修饰对本领域技术人员来说显然都认为是本发明的精神、范围和构思及权利要求范围内的。

                              实施例1

            从胜利金合欢中初步筛选和纯化抗肿瘤活性组分

以鉴定新的具有有益的生物活性化合物为目的，从沙漠豆科植物计划(DELEP)中选出60种植物品种。DELEP(University of Arizona，Tucson)是由亚利桑那大学和Boyce Thompson西南植物园协作培育的沙漠豆科植物品种收集中心。采集每种植物品种的实验地区样品，风干3-4天，用Wiley磨(3mm分离筛)磨碎到3mm颗粒大小，用1∶1二氯甲烷(DCM)和甲醇(MeOH)混合液渗滤提取2到3次。每次渗滤提取经历至少5小时，常常持续过夜。收集前二次渗滤的主要提取生物物质，然后用一体积甲醇对半体积空隙洗涤这些生物物质，分离等份甲醇中所含的粗提取物。通常分离和制备用于生物测定的样品的方法是真空除去甲醇，使水相通过RP-C18颗粒，回收MeOH中的活性组分，然后旋转蒸发MeOH，收集固态提取物。然后将粗提物重悬在H20、DMSO或它们的混合液中(极性较小的化合物重悬于DMSO中，极性较强的化合物重悬于水或水与DMSO的混合液中，苷元重悬于DMSO中)。

然后针对一组人肿瘤和非肿瘤细胞，包括人卵巢癌细胞系、T-白血病细胞、人表皮样瘤细胞、人乳房癌细胞、人前列腺癌细胞、人包皮成纤维细胞、人内皮细胞和人肾癌细胞来筛选每个提取物。首先将细胞接种在96孔板上37℃培育18-24小时。然后使细胞接触各种浓度的植物提取物中，37℃培育72小时，在室温用MTT((3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑；Sigma Chemical Co.)染色4小时或用结晶紫(Sigma Chemical Co.)染色20分钟。MTT平板接受裂解缓冲液(用50％DNF配制的20％十二烷基硫酸钠)，培育6小时，然后在570nm读取OD值。用Sorenson缓冲液(0.1M柠檬酸钠(pH4.2)，50％v/v乙醇)洗涤结晶紫染色的平板3-4小时抽提染料，在570-600nm读数(Mujoo等人，1996)。在单用培养基处理过的和用植物提取物处理的细胞之间作OD读数比较，表明所筛选的提取物的细胞毒性。细胞毒性的百分比以对照为100-％，其中对照％＝[((用植物提取物处理的细胞OD读数(处理的样品))/(仅接触培养基的细胞的OD读数(未处理的样品)))×100]。

在初步筛选中，一种植物提取物显示出对癌细胞的强生长抑制，同时显示对正常人成纤维细胞几乎无毒性。该提取物，编号为UA-BRF-004-DELEP-F001，是从豆科植物胜利金合欢中分离的。该提取物显示出的IC₅₀，用人卵巢癌细胞系为约12μg/ml(SKOV-3)、26μg/ml(OVCAR-3)和13μg/ml〔HEY〕；用人黑色素瘤细胞，则大于50μg/ml(A375-M)和约38μg/ml(HS294T)；对人表皮样瘤细胞(A431)约15μg/ml；和对乳房癌细胞系MDA-468(图1)则大于50μg/ml(见实施例13描述的细胞系)。在用同一提取物处理的正常人包皮成纤维细胞(FS)和小鼠成纤维细胞〔L929〕中未观察到毒性。

用TLC显现出该提取物含有许多组分的混合物。所以，初步努力的重点是纯化该提取物以分离出负责选择性细胞毒性的活性组分。按照图15所示的流程，从初步提取物中分离出富含活性组分的层析组分。

如上所述通过渗滤(两次)从538g胜利金合欢的植物原料中制备出初步提取物UA-BRF-004-DELEP-F001。然后真空干燥该提取物获得约52.0g粉末。然后，用1L乙酸乙酯(“EtOAc”)处理51.5g干燥的物质3次。将约15.75gEtOAc可溶性物质作硅胶柱(1.5kg)层析。用极性递增的己烷、EtOAc和MeOH混合物洗脱670ml的54亚级分。该54亚级分以13个分开的组分收集，标记为UA-BRF-004-F006到UA-BRF-004-F018。然后用上述流程筛选这些组分的抗肿瘤活性。这些被检组分没有一个显现出在UA-BRF-004-F001中观察到的强抗肿瘤活性。

将EtOAc不溶性物质(约34.7g)也在硅胶柱(1.7kg)上作层析。用极性递增的DCM、MeOH和水的混合物洗脱670ml的51亚级分和三个其它的亚级分，共21L。这些亚级分收集为8个分开的组分，标记为UA-BRF-004-F019到UA-BRF-004-F026，见表6。

       表7：UA-BRF-004-F019到UA-BRF-004-F026组分的洗脱

组分标记	从亚级分收集的1	总重(mg)	洗脱液
				F019	1-13	1015	5％MeOH/DCM(1-6)10％MeOH/DCM(7-12)20％MeOH/DCM(13)
F020	14-16	723	20％MeOH/DCM
				F021	17-19	3080	20％MeOH/DCM(17-18)35％MeOH/DCM(19)
F022	20-22	4618	35％MeOH/DCM
				F023	23-3439-40	17216	35％-50％MeOH/DCM(23-34)65％MeOH/DCM(39)100％MeOH(40)
F024	35-3841-51	3030	65％MeOH/DCM(35-38)100％MeOH(41-51)
				F025	9L和6L亚级分	3980	MeOH(9L)20％水/MeOH(6L)
F026	6L亚级分	4507	以MeOH配制的20％水和1％HCOOH

¹除非特别指出，每个亚级分都是670ml。

然后针对上述用于粗提物筛选的一组人肿瘤细胞，筛选每个组分的抗肿瘤活性。其中组分UA-BRF-004-DELEP-F023显示出的抗肿瘤活性比UA-BRF-004-DELEP-F001的更强。这些结果揭示6μg/ml的组分UA-BRF-004-DELEP-F023表现出对人卵巢癌细胞50％(OCC1)、63％(SKOV-3)、85％(HEY)和48％(OVCAR-3)的细胞毒性；对人前列腺癌细胞(LNCaP)约60％的细胞毒性；对白血病细胞(Jurkat)约92％的细胞毒性；和对患者腹水的新鲜人卵巢癌细胞(FTC)约73％的细胞毒性。未转化细胞的生物试验揭示，对FS细胞IC₅₀为10.6μg/ml，对HUVEC细胞为23μg/ml(图2)。

UA-BRF-004-DELEP-F023中的生物活性组分用多重反相(RP)中压液相层析(MPLC)分离纯化，以协助活性组分的分离和特性分析。将该样品以递增浓度的乙腈(ACN)(以水配制，递增量10％，4升)脱气混合液洗脱，即按以下步骤0、10％、20％、30％、40％ACN/水。然后，用MeOH洗脱2-4L组分。重复跑样后收集10组分，标记为UA-BRF-004-DELEP-F027到UA-BRF-004-DELEP-F036，见表8。

表8，组分UA-BRF-004-DELEP-F027到UA-BRF-004-DELEP-F036的洗脱

组分鉴定	总重(g)	洗脱液
			F027	6.95	用水配制的0-20％ACN
F028	0.99	用水配制的30-40％ACN
			F029	1.46	用水配制的30-40％ACN
F030	0.86	用水配制的30-40％ACN
			F031	0.15	用水配制的30-40％ACN
F032	1.01	用水配制的30-40％ACN
			F033	0.54	用水配制的30-40％ACN
F034	0.50	用水配制的30-40％ACN
			F035	2.19	用水配制的30-40％ACN
F036	1.17	用水配制的30-40％ACN

用TLC显示这些组分的几个是相似的。发现一个高收率的组分，UA-BRF-004-DELEP-F035(组分35)显现出强抗肿瘤活性。

筛选UA-BRF-004-DELEP-F035的抗肿瘤活性显示出对卵巢癌细胞系HEY、SKOV-3、OVCAR-3和C-1(顺氯氨铂抗性OVCAR-3)的IC₅₀分别为3.0、1.2、2.0和3.5μg/ml；对胰腺癌细胞(Panc-1)的IC₅₀为2.4μg/ml；对肾癌细胞系769-P、786-0和A498的IC₅₀分别为1.2μg/ml、3.Oμg/ml和3.7μg/ml；对Jurkat T-白血病细胞的IC₅₀为130ng/ml；和对B-白血病细胞系KG1、REH和NALM-6的IC₅₀在1-3μg/ml之间(图3、图4)。如表8所示，植物粗提取物的纯化显著增加了生物活性。

表9：粗制提取物和UA-BRF-004-DELEP-F035的细胞毒性

人癌细胞         IC50(μg/ml)
	粗制提取物 UA-BRF-004-DELEP-F035
HEY        12              3.0SKOV-3     25              1.2OVCAR-3    25              2.0MDA-468    50              9.0

组分35对人正常FS细胞的IC₅₀为约4.7μg/ml，对正常人Hs27细胞的IC₅₀为约13.3μg/ml。当组分35(F035)以人红细胞系和髓样细胞系(myleoid)集落(从骨髓分离的细胞)作评价时3.0μg/ml观察到12-18％的抑制(表10)。

           表10，组分35对红细胞系和髓样细胞系集落的作用

                   红细胞        抑制         骨髓         抑制

                   (#集落)      百分比       (#集落)      百分比

未处理               261          ---          111          ---

F035                 16           94           53           52

(30μg/ml)

F035                 212          18           97           12

(3μg/ml)

F035                 248          5.0          119        7(刺激)

(0.3μg/ml)

鉴于上述表明组分35有强抗肿瘤活性的发现，以0.095μg/ml低浓度的组分35如上述作生物测定。在该研究中，用各种不同浓度的组分35来针对更多肿瘤细胞系。筛选结果表明即使在浓度1.56μg/ml，组分35依然表现出对许多细胞系有强抗肿瘤活性(表11)。

      表11各种浓度UA-BRF-004-DELEP-9F035对不同肿瘤细胞系的细胞毒

                            性

UA-BRF-00    50        25      12.5     6.25    3.12    1.56    0.78    0.39   0.195   0.095

4-D ELEP-F μg/ml    μg/ml   μg/ml   μg/ml  μg/ml  μg/ml  μg/ml  μg/ml  μg/ml  μg/ml

035

SKOV-3       94％    83.40％  78.50％   71％    54％     27％    0％     0％     0％

OVCAF-3      95％    92.80％  91％      87％    79％     46％    9％    21.40    18％

                                                                      ％

C-1          97％    71％     87％      77％    59％     29％    0％     0％     0％

(OVCAR-3

VARIANT)

HEY          97％    79.10％  53.90％   43.30％ 19.20％  0％     0％     0％     0％

C-2(HEY      96％    93.20％  90.50％   88.90％ 86.80％  82.50％ 73.40   50％    36.10％

VARIANT)

A-8(HEY      97.20％ 95.70％  94.80％   89％    75.00％  59.30％ 18％    0％     0％

VARIANT)

MCF-7        79.70％ 23％     5％       3.10％  8.10％   17.20   8.60％  17.40   19.20

BT-20        83％    90％     0％       4％     12.50％  15.50％ 21.30   24％    34％

                                                              ％

MDA-MB-45    98.40％ 97.20％  94.60％   89.90％ 85.40％  81.60％ 65.70   54.90   38.50％

3                                                                 ％      ％

MDA-468      96.50％ 93.80％  82％      65％    39％     8％     8％     8％     8％

SKBR-3       83.90％ 62.70％  51.70％   47.80％ 45.20％  39.60   35.90   28.60   21.90％

PANC-1       97.30％ 90.20％  66.80％   30.40％ 0％      0％      ％      ％      0％

                                                             0％     0％

769-P        96.80％ 97％     90％      95％    94.00％  91.70％ 63％    18％    10％    17.80％

786-O        97.90％ 89％     80.30％   75％    66％     32％    0％     0％     0％

A-498        99％    97％     95.50％   80％    47％     19％    16％    15％    14％

LLC-1        84.70％ 42.70％  17.80％   6.60％  10.70％  10.90％ 3.80％  6.80％  0％

A549         96.60％ 91.10％  59.70％   34.80％ 21.20％  15.60％ 0％     0％     0％

JURKAT       88.40％ 88.70％  88.80％   89.60％ 88.60％  88.50％ 80％    69.30   46.60％ 0％

                                                                      ％

Hs27         88％    83％     47％      0％     6％      11％    11％    13％    18％

FS FIBRO     78.30％ 74.70％  73.70％   66.50％ 42.30％  0％     0％     16％    23.20％

HL-60        63.00％ 22.00％  30.00％   25.00％ 0.00％   0.00％  0.00％  0.00％  0％     0％

MDA-MB-43    96.50％ 96.40％  97％      96％    94％     84.70％ 40.60   15％    14.70％

5                                                                 ％

DOV-13       95.80％ 92.30％  86.70％   77.80％ 57.50％  14.20％ 17.50   11.10   12.20％ 17.20％

                                                              ％      ％

MCF-10F      97.70％ 5.80％   0％       0％     0％      0％     0％     0％     0％

KG-1         77％    75％     72％      67％    59％     44％    35％    13％    0％     0％

OC1-2        46.40％ 21％     12％      12.30％ 9％      12％    3％     0％     0％     0％

OC1-3        71％    60％     45％      41％    30％     5.60％  0％     0％     0％     0％

                                实施例2

                   从胜利金合欢中分离活性组分的步骤

开发了一种直接制备实施例1所述初步纯化分离的UA-BRF-004-DELEP-F035中所含的活性组分的方法。将9665g新鲜收集的胜利金合欢豆荚组织在3mm筛网的锤磨(hammer mill)中磨碎，用H₂O(3X)配制的80％MeOH提取，然后过滤。丢弃8200g废渣。分别收集三次洗液，如下命名组分：F068，21.5L(第一次洗液)；F069，24L(第二次洗液)；和F070，34.3L(第三次洗液)。进一步纯化F068将其分离成1L每份，每份加入400ml H₂O，用CHCl₃(2×250ml)洗涤。组合的极性相(28.5L)命名为组分F078，以及混合的有机相F079(在旋转蒸发除去有机溶剂后，收获42g)。

抽真空从F078除去MeOH，用以530g回收的Bakerbond RP-C18，40μm微粒装料的29×460mm柱作RP MPLC，进一步分级分离F078。将500ml水溶液吸到柱上，收集各组分，如表12所示。

                     表12：组分F091到F094的洗脱

组分鉴定	收集量(L)	总重(g)	洗脱液	说明
					---	4	---	100％水	糖和一些强RBC裂解组分
F091	4	～40	用水配制的10％ACN	从16-29轮获得19.6g
					F092	4	89	用水配制的20％ACN	黄酮
F093	4	351	用水配制的30％ACN	轻蓬松的固体，轻微的呼吸刺激
					F094	1.3	577	100％MeOH	细粉末，呼吸刺激

通过除去MeOH来干燥各组分，通过C-18颗粒，以MeOH回收，真空分离为固体。将这种固体重悬浮于水中，用于测试抗肿瘤效力(对某些极性较小的组分，在水中加入DMSO；将苷元重悬浮于DMSO)。结果表明用100％MeOH洗脱的命名为F094的生物活性与组分UA-BRF-004-DELEP-F035的生物活性基本上相当(表13)。F093也含有活性组分。用TLC和HPLC证明了组分F094和F035的化学相似性，虽然F094看来还含有其它组分。

           表13：各种不同浓度F094对不同肿瘤细胞系的细胞毒性

UA-BRF-004Pod-50      25       12.5    6.25     3.12μg/ml  1.56μg/ml 0.78    0.39    0.19

DELEP-F094    μg/ml  μg/ml   μg/ml  μg/ml                         μg/ml  μg/ml  μg/ml

769-P         96.60％ 93.30％  92.80％ 92.40％  88.30％     63.20％   21.80％ 4.50％  2.10％

PANC-1        97％    93.50％  74.60％ 50.60％  21.90％     1.10％    0％     0％     0％

HEY           95％    66.50％  50.10％ 17.90％  0％         0％       0％     0％     0％

MDA-MB-453  94.20％  92.80％  87.10％  85％     77.30％  58.50％  47％     47％     26.80％

JURKAT      89.60％  89.80％  89.40％  89.30％  89％     88％     73.80％  65.70％  0％

按表14进一步分级分离了F094，用TLC分析和进行生物试验得到纯化的活性组分。表14给出了所得组分(F138-F147)不同量时的生物试验结果。

               表14：组分F138到F147的洗脱

组分鉴定	收集的亚组分(ml))	总重(g)	洗脱液
					1-5(160)	1	用水配制的60％MeOH
F138	6(65)7-8(50)	13	用水配制的60％MeOH(6)用水配制的70％MeOH(7-8)
				F139	9(25)	39	用水配制的70％MeOH
F140	10(20)	93	用水配制的70％MeOH
				F141	11(35)	57	用水配制的70％MeOH
F142	12(50)	54	用水配制的70％MeOH
				F143	13(55)	62	用水配制的70％MeOH
F144	14(70)	29	用水配制的70％MeOH
				F145	15(65)	17	用水配制的70％MeOH
F146	16(80)	54	用水配制的80％MeOH
				F147	17(80)18(100)	7	用水配制的80％MeOH(17)用水配制的100％MeOH(18)

表15：组分F137、F140、F142、F144和F145的生物试验

	50μg/ml	25μg/ml	12.5μg/ml
				F137
769-P酶	81.50	45.50	18.10
				Panc-1	74	1 1	0
HEY	6.2	0	0
				MDA-MB-453	76.70	38.80	26.80
JURKAT	67.70	67.50	67.80
				F138
769-P	96.50	95.60	95.30
				Panc-1	95.50	93.45	73.50
HEY	65.30	58.30	21.50
				MDA-MB-453	96.10	94.20	92.5
JURKAT	87.50	88	87.50
				F139
769-P	97.30	94.20	94.20
				Panc-1	96.60	94.10	86
HEY	89.70	65.80	60.50
				MDA-MB-453	95	95	91.90
JURKAT	88.50	88.50	88.50
				F140
769-P	91.70	88.90	87.50
				Panc-1	95	94.60	92.50
HEY	95.40	72.10	62.80

	50μg/ml	25μg/ml	12.5μg/ml
				MDA-MB-453	86.20	80.20	75.20
JURKAT	68.40	67.80	68.10
				F141
769-P	97.80	95.10	95
				Panc-1	96.80	95	85.60
HEY	96	68.80	60.6
				MDA-MB-453	95	94.50	94
JURKAT	88.50	88.40	88
				F142
769-P	92.50	90.20	88.20
				Panc-1	96	93.60	88.60
HEY	98	74.80	66
				MDA-MB-453	86.10	75.40	72.90
JURKAT	67.90	67.10	66.30
				F143
769-P	98.30	96.80	98.30
				Panc-1	96.70	94.70	85.60
HEY	98.50	73	64
				MDA-MB-453	96.70	95	94.10
JURKAT	88.00	88	88
				F144
769-P	89.80	88.60	89.50

	50μg/ml	25μg/ml	12.5μg/ml
				Panc-1	96.60	93.80	90.90
HEY	98.50	75.30	62.20
				MDA-MB-453	86.70	78.50	75.80
JURKAT	65.70	65.70	65
				F145
769-P	92	90.20	86.30
				Panc-1	96.70	91.40	84.80
HEY	97.50	82.30	58.60
				MDA-MB-453	85.40	74.40	48.90
JURKAT	67.90	68.40	68.60
				F146
769-P	97.30	97.30	63.30
				Panc-1	97	88.90	43.40
HEY	97.60	70.50	22
				MDA-MB-453	95	94.80	78
JURKAT	88.60	88.20	88.10
				F147
769-P	44.30	23.40	5
				Panc-1	40	11	0
HEY	0	0	0
				MDA-MB-453	70	50	57
JURKAT	86.30	84	78.70

生长抑制百分比

虽然上述步骤的重点是从胜利金合欢的豆荚中分离出活性组分，但活性组分也可从根提取。在该实验中，碾磨根1/2小时，用100％的MeOH覆盖。然后过滤混合液，加水稀释到80％MeOH。如果提取的是大量的根，较佳的是通过上述渗滤法提取。这些提取步骤的差异原因在于根通常是新鲜提取的，而豆荚在提取前通常是干的。

                         实施例3

      从组分UA-BRF-004-DELEP-F094中制备活性成分的制备规模程序

采用一种改进的提取/分离程序从组分UA-BRF-004-DELEP-F094(F094)中大规模制备活性成分的混合物。已重复该程序多次，始终产生高活性的组分。通常将20-25g F094或其等价物溶解于150-175ml的50％的MeOH(以水配制)，然后上柱((26mm×460mm)+(70mm×460mm)，RP-C18，40μm，1200g，已用60％MeOH/H₂O平衡)。按以下步骤洗脱诸组分：8L 60％MeOH/H₂O；7.5L 70％MeOH/H₂O；和2L MeOH，以及指定组分的代号，如表16所示。如图18A-18F所示，组分F035-B2含有F094、F133-F136(分离自F093)和F138-147(分离自F094)中所含活性组分的混合物。F094是F035的可接受取代物，药效减少了1到2倍，F035-B2的药效较F094更小。

                     表16：F035-B2的分离

组分鉴定	收集量(L)	总重(g)	洗脱液
				F237	8	1.8	用水配制的60％MeOH
F238	1	8	用水配制的70％MeOH
				F035-B2	3.5	80	用水配制的70％MeOH
F239	3	19	用水配制的70％MeOH
				F240	2	20	用水配制的100％MeOH

由发明者设计了一种程序，来进一步纯化组分F035-B2中的活性组分，以得到具有UA-BRF-004-DELEP-F035的分析性HPLC特征的组分。该程序如下：对组分F035-B2进行额外的制备性HPLC分离，用10μm反相层析柱，以乙腈和水的分步梯度混合液洗脱，以1-2％为一步梯度范围为用水配制的乙腈从26％到40％，然后用100％乙腈洗涤，和100％甲醇洗涤，从而将F035-B2独特地断裂成若干含有0-20分钟峰值的组分(每个标准的6μmHPLC RP-18分析方法)，这些峰在初始F035组分中是不存在的(图18A)。得到的残留组分含有1到3种F035的组成成分。如上述测试所表明，组分F139-F147与这些组分相似，与其它组分相比对某些癌细胞系的抗肿瘤活性有某种程度增强。组分F035中存在的活性组分的独特混合物可批量生产，方法是将前述乙腈水溶液从初始组分改为16％到26％之间(用水配制)，然后进行MPLC纯化以产生数克量的UA-BRF-004-DELEP-F035的等价物。

对上述提取步骤以及本文所公开的其它提取步骤的进一步改进，可用乙腈、甲醇和水的三溶剂混合液来实现。熟悉标准层析技术的任何人员可确定和优化三溶剂的百分比范围。同样，可用RP系统，包括，但并不限于，C-8、CN、二甲基二醇和C-18的组合来改变结合的键合相硅胶。在最后的步骤中，甚至可用普通相硅胶进行最终的纯化步骤。

                            实施例4

              从胜利金合欢中分离活性组分的其它程序

如上所述得到组分F094(250g)、F035(50mg)和胜利金合欢磨碎的豆荚(1Kg)(即种子豆荚粉)。用分析方法学分析组分F094，F094随后的分级分离如本实施例如下所述。

4.1分析方法学

试用了几种方法包括各种梯度和无梯度条件下的C8和C18柱来分辨组分F094。监测包括220nm的UV和蒸发性光散射检测(ELSD)。所见的较佳峰分离度是用含有三氟乙酸(TFA)的流动相得到的。该方法本文称为Acacia 257，描述如下。该方法在短的跑样时间内得到很好的分离度。

用二极管阵列探测器(DAD)或各种波长探测器和4.6×150mm Inertsil C18 3μ柱(MetaChem)装备HPLC。探测器设置在220nm。

以下为跑样梯度。

时间(min)	乙腈％	％H2O0.1％TFA
			0	30	70
36	36	64
			42	42	58
42.1	30	70
			47	30	70

图25显示了用该方法得到的F094的层析谱。F094由三组峰或三簇峰组成，每簇有多个峰，簇-1(8-20分钟，峰A-D)、簇-2(22-35分钟，峰E-H)和簇-3(36-47分钟，峰I-L)。也用该方法分析了组分F035，图26显示了其层析谱。与F094相比，F035的第二簇峰更多，而F094第一簇峰更多。

4.2分级分离

4.2.1第一次分级分离

第一次分级分离的重点是簇-1的诸峰。采用一对称C8半制备柱(7.8×300mm，7μ)(Waters)用于该目的，其梯度洗脱流程如下。如图27显示了七种亚组分。最后的一个组分(#2160-007-31)包括了簇-2和簇-3的所有峰。对这些组分以及起始的物质(F094)都作生物试验。

时间(min)	乙腈％	％H2O0.1％TFA
			0.0	27	73
38.0	30	70
			42.1	90	10
48.0	90	10
			49.0	27	73
65.0	27	73

4.2.2第二次分级分离

这次分级分离的目标是分离化合物第二簇的峰。用相同的C8半制备柱完成。流动相是无梯度的含0.1％TFA的32％乙腈水溶液。图28显示了表明七种组分位置的层析图。此处的第一组分馏分包括簇-1所有的峰。

4.2.3生物试验

表17和18分别显示了第一次和第二次分级分离的各亚组分的生物试验结果。表17：第一次分级分离得到的亚组分对Jurkat细胞的细胞毒性

组分编号	重量(mg)*	细胞毒性IC50(μg/ml)
			2160-007-03	2.7	无活性
2160-007-07	1.9	无活性
			2160-007-11	1.3	无活性
2160-007-15	1.6	无活性
			2160-007-19(峰D1)	1.7	1.2
2160-007-25(峰D2)	2.9	5.7
			2160-007-31	3.2	1.3
2160-007-34(FO94)	9.3	0.17

*这些重量都是近似值±20％。

表18：第二次分级分离得到的亚组分对Jurkat细胞的细胞毒性

组分编号	重量(mg)*	细胞毒性IC50(μg/ml)
			2160-025-01	7.24	1.2
2160-025-02	4.74	2.8
			2160-025-03	3.63	1.0
2160-025-04(峰G1)	1.37	0.64
			2160-025-05(峰G2)	2.07	1.56
2160-025-06	3.64	0.33
			2160-007-34(F094)	12.09	0.17

*这些重量都是近似值±20％。

从金合欢组分F094得到的两种纯化的三萜糖苷，称为D1和G1。D1的酸水解产生苷元。

4.4制备规模分级分离得到D和G/H区域诸峰

在HPLC Prep PFP(五氟苯基)柱(50×250mm，10μm)上分级分离F094(2.3g)。流动相是含有0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈/水，以27％-32％乙腈的梯度模式跑样38分钟。如图29所示，该方法分离了含有D和G/H峰的组分。将本步骤得到的组分作生物试验。图30和31显示了D和G/H的分析性试验结果。这里所用的方法为Acacia257，其在同一章节中已描述过。

先在PFP Prep柱上进一步纯化组分G/H得到68％层析纯的G1，然后再将其在C-18半制备柱上纯化得到纯G1。

如上所述，将约100mg的G/H混合物加到相同的PFP柱上。按如下梯度跑样。

时间(min)	乙腈％	％H2O0.1％TFA
			0	27	73
1	29	71
			40	34	66

收集五种组分(G1、G2、G3、H1和H2)。G1的分析(图32)表明68％层析纯度。将该组分在半制备柱上进一步纯化。

采用YMC C18-Aq柱(10×250mm，5μm)。流动相是含有0.1％TFA的31％乙腈水溶液。最终G1产物的层析纯度为100％(图33)。

将PFP Prep柱得到的组分D(45％D1)先在Waters C-18柱(25×100mm)上分级分离。流动相是含有0.1％TFA的61％甲醇水溶液。HPLC分析显示D1为78％纯(图34)，其含有另一峰值(称为D1.5)。在YMC C18-Aq柱上以含有0.1％TFA的33％乙腈/水为流动相，进一步分级分离不纯的D1，得到100％层析纯的D1样品。观察到40℃时D1在稀释的酸溶液中比在水中稳定。所以，在纯化D1时溶剂中包括0.1％TFA。

4.4.1生物试验

在Jurkat细胞系上进行生物试验，表19、20和21分别显示了各种亚组分和纯D1和G1的效果。D1和G1按两种不同pH值测试。结果表明pH6.5比pH7.5时活性略高。然而，在较低的pH值时，细胞生长被抑制了约40％。

4.4.2酸水解D1

100℃用3N HCl水解皂苷D1的乙醇液3小时。用HPLC纯化产生的苷元。质谱分析显示此苷元的分子量为652。

               表19：Prep PFP柱的细胞毒性组分

组分编号	描述	重量(mg)*	细胞毒性IC50(μg/ml)
				2160-035-22	峰D	1.7	0.52
2160-047-01	峰G/H	1.24	0.12
				2160-047-03	峰I/J/K	1.66	0.19
2160-047-05	峰L区域	1.17	0.18
				2160-047-07	峰M	1.72	0.24
2160-007-34	F094		0.21

    表20：G/H分级分离的细胞毒性组分

组分编号	重量(mg)*	细胞毒性IC50(μg/ml)
			2160-53-8-G1	1.87	1.23
2160-53-11-G2	0.76	2.2
			2160-53-14-G3	0.67	4.35
2160-53-17-H1	0.29	6.25
			2160-53-20-H2	0.45	12.8
2160-007-34(FO94)		0.38

     表21：pH6.5和7.5时D1和G1的细胞毒性

化合物/提取物	重量(mg)*	细胞毒性IC50(μg/ml)
						pH 6.5	pH7.5
2160-69-29(D1)	1.036	1.01	0.98
				2160-083-30(G1)	1.951	0.3	0.49
2160-007-34(F094)		0.15	0.22

                            实施例5

                        D1、G1和B1的结构

5.1 D1的结构

D1是胜利金合欢豆荚的主要成分。该化合物的试验显示其具有相当高的生物活性。

5.1.1 D1的整个分子

D1是从部分纯化的提取物(用以上实施例所述的几种制备型HPLC分离得到的)F094分离的无色非晶体状固体，从MALDI质谱测得的分子量为2104amu(为真实分子量2081加上钠的分子量)。高分辨度FAB质谱证实了比分子量，得到其分子式为C₉₈H₁₅₅NO₄₆。该分子太大只用光谱难以测出其结构，所以用如图36所示的流程1进行降解。在图36中，D1表示为标记‘(1)’的结构。

D1的质子和碳NMR显示，存在一个三萜、两个单萜和约八个糖(见表22，对(1)选定的¹³C-NMR排布)。

表22：D1(1)、G1(14)、B1(21)、苷元(2)和金合欢酸(3)的¹³C NMR(MeOH-d4)排布。(括号内的数字，即1、14、21、2和3，是指在图36、37和图38中分别表示的D1、G1、B1、苷元和金合欢酸的结构。)

碳编号	(1)	(14)	(21)	(2)在DMSO-d6中	(3)
						三萜部分
1	36.13	36.13	36.13	36.07	38.90
						2	27.15	27.15	27.15	29.28	28.03
3	89.86	89.84		76.78	77.94
						4		40.09	39.85	39.71	39.28
5		57.08		54.84	55.78
						6		19.54		18.03	18.71
7	34.59	34.59	34.58	34.27	33.51
						8		40.82	40.09	40.82	39.79
9		48.08		46.11	47.15
						10		37.94	37.94	36.59	37.31
11	24.29	24.54	24.49	26.97	23.77
						12	124.04	124.04	124.09	122.04	122.61
13	143.70	143.7	143.68	142.61	144.29
						14		42.64	42.63		42.01
15	36.20	36.39	36.51		35.74
						16		74.26		72.41	74.22
17		52.29		49.70	51.67
						18		41.64	41.60		40.97
19	48.67	48.3		46.85	48.42
						20		35.88	35.95		36.64
21		78.61		76.78	73.32
						22	39.86	41.7	41.94	38.07	41.97
23	28.62	28.61	28.65	26.60	28.65
						24	17.12	17.11	17.11	16.06	15.55
25	16.22	16.22	16.25	15.19	16.47
						26	17.73	17.72	18.07	16.78	17.43

27	27.40	27.32	27.40	28.24	27.11
						28	173.39	175.34	175.39	176.64	179.14
29	29.41	29.43	29.41	28.77	29.97
						30	19.42	19.42	19.53	18.65	18.26
外单萜
						1	168.69	168.68	168.74
2	132.92	132.92	132.82
						3	148.48	148.02
4	24.49	24.58	24.56
						5	41.95	41.33	40.83
6	81.01	81.0
						7	145.93	144.01
8	112.53	112.44	112.53
						9	16.75	16.7	16.74
10	56.51	12.49
						内单萜
1	168.17	169.01	168.19	164.0
						2	132.49	128.52	132.49	135.20
3	148.03	145.95		137.05
						4	24.29	24.29	24.30	22.86
5	41.33	39.86	39.73	76.03
						6		73.61		129.41
7	144.03	144.43		119.80
						8	116.0	116.0	115.33	11.86
9	23.76	23.7	24.21	12.81
						10	56.62	56.61		64.28

5.1.2强酸水解D1

100℃用3N HCl水解D1 2小时，得到“D1苷元”，如图36(2)所示，质谱显示其分子量为652。D1苷元的NMR显示存在一个三萜和一个修饰过的单萜，但没有糖。通过皂化进一步降解该物质(100℃，在MeOH中用1.3N NaOH30分钟)，然后分离得以下物质：

5.1.2.a三萜该物质的C-13NMR等同于以前报道的金合欢酸(见图36由(3)显示的结构，且见表22中(3)的¹³C-NMR排布)，其质谱分子量为488与该结构相一致。

5.1.2b环化的单萜该化合物的分子量和NMR表明存在一个羧酸、连接于双键的两个甲基和产生所示吡喃结构的乙烯基质子。虽然图36(4)显示了该结构的单元结构，其同样存在于“D1苷元”中，但在亲代D1中不存在。D1含有非环化的单萜，如图36中的结构(5)，如下所示，在酸水解中该结构被环化：

这些结构和D1的初始分子量和光谱特征，与图36中标记的结构(2)显示的D1苷元的结构非常吻合。见表22的对(2)的选择性¹³C-NMR排布。

5.1.3温和皂化D1

室温用0.5N NH₄OH处理D1一小时，其完全转变成两种新的化合物。

5.1.3.a单萜该分子的分子量为200，NMR表明其非环状单萜结构，表明有可以的降解。图36中显示了该结构，标记为(5)。

5.1. 3.b三萜单萜寡糖该化合物的极性比D1大，其NMR与其含有金合欢酸、一种单萜和几个单糖相一致。图36中显示了该结构，标记为(6)。

5.1.4 D1的糖分析

强酸水解D1(2N HCl，100℃2小时)，然后衍生(三甲基硅醚)和GC/MS分析，证明在初始分子中存在八个糖残基：阿拉伯糖、鼠李糖、岩藻糖、木糖、6-脱氧葡萄糖(即奎诺糖)，N-乙酰葡糖胺和两分子的葡萄糖。

5.1.5更剧烈地皂化三萜单萜寡聚糖

当该三萜单萜寡聚糖在60℃用0.3N NaOH处理1小时时，形成三种化合物：

5.1.5.a寡糖分离和分析这种极性片段显示其是一种寡糖。用酸水解(2NHCl，100℃，2小时)进行糖分析，GC/MS分析单糖的三甲基硅醚，证明该寡糖是由两分子葡萄糖和一分子阿拉伯糖和一分子鼠李糖构成的四糖。

5.1.5.b单糖糖苷该物质的NMR与图36中显示的结构(8)一致。酸水解(2NHCl，100℃，2小时)该化合物鉴定该糖为6-脱氧葡萄糖。用β-葡糖苷酶处理该单萜糖苷，得到图36中(9)结构的单萜，其NMR与反式-2-羟甲基-6-羟基-6-甲基-2，7-辛二烯酸一致。用“β”葡糖苷酶水解该键，显示这两基团之间的键是β键。

5.1.5.c三萜糖苷该化合物的分子量为951，其NMR与在C-3位点含有三糖的金合欢酸内酯(图36中的结构(10b))一致。酸水解(2N HCl，100℃，2小时)该化合物，用GC/MS鉴定出其组成糖为N-乙酰葡糖胺、岩藻糖和木糖(为三甲基硅醚衍生物)。发现该分子有开环酸/醇，图36中标出的结构为(10a)，和闭环内酯形式，图36中标出的结构为(10b)。

该片段的糖分析和分子量与完整分子D1中的相比，证明D1的所有部分都在图36标出为(5)、(7)、(8)和(10a)结构显示的片段中。

5.1.6.温和酸水解D1

温和酸水解(1N HCl，16小时，25℃)D1，形成两种新的化合物：

5.1.6.a.单萜糖分子量、NMR光谱和糖分析都与单萜-6-脱氧葡萄糖一致。该分子的结构描述于图36，标出的结构为(11)。

5.1.6.b.三萜-单萜-糖苷第二个分子鉴定为三萜-单萜-糖苷，该分子的结构描述于图36，标出的结构为(12)。

5.1.7.D1内的亚组连接

NMR研究表明外单萜的羧酸被酯化成6-脱氧葡萄糖(奎诺糖)的C-4。NMR和水解研究显示奎诺糖的端基异构碳连接于内单萜的C-6羟基。奎诺糖端基异构碳的立体化学表明为“β”键。

水解(2N HCl，100℃，2小时)和糖异构化研究表明四糖中的糖是两分子的葡萄糖，和一分子的鼠李糖和一分子的阿拉伯糖。该单元被直接酯化成三萜C-28羧酸(如图39所示)。铁阱(iron trap)质谱研究表明该四糖结构为两分子的葡萄糖，一分子的阿拉伯糖连接于中心的鼠李糖(如图39所示)。这些糖之间的连接键未知。

NMR研究表明N-乙酰葡糖胺(NAG)直接连接于三萜的C-3碳。由LC/MS研究部分水解物(1N HCl，1小时，60℃，在50％的MeOH中)显示，其余糖序列在中间为岩藻糖，端部为木糖。这些糖之间的连接键也是未知的。

5.1.8鱼藤糖苷E

D1含有通常在其它种类(包括其它金合欢)报道的皂苷中共同发现的一个三萜和两个单萜。虽然D1的结构与据报道从Archidendron ellipticum中分离的鱼藤糖苷E(图24)类似，(Beutler等人，1997)。在本发明中，D1的比旋光度测定为[α]_D＝-30.0°，不同于报道的鱼藤糖苷E的值(-24.3°)。

Beutler等人(1997)描述的鱼藤糖苷E和D1的HPLC保留时间不同(D1-15.2分钟，鱼藤糖苷E-12.5分钟)。所以，这两个分子在一些方面肯定有差异，如它们亚基的特异性连接上或光学或结构异构体的存在。

本发明者观察到内单萜(图36中描述的结构(9))的比旋光度，在MeOH中为+11.2°，在氯仿中为+16°。据报道鱼藤糖苷E中的相同片段在氯仿中为-9.1°。另外，确定D1内单萜的唯一手性中心有“S”构型，这与鱼藤糖苷E中发现的相反。目前正在测定D1外单萜的比旋光度。另外，质子NMR显示D1中单萜双键是“反式”，而Beutler等人，1997中显示的鱼藤糖苷E的单萜双键是“顺式”的。这两个特征构成了D1和鱼藤糖苷E之间的第一个结构差异。酶催化水解特异性糖苷显示，糖的排列与鱼藤糖苷E中的相同。

5.2.G1的结构

该物质的生物试验显示G1的生物活性比D1强。

5.2.1.G1的整个分子(14)

本发明中确定的第二个结构是G1，它也是用制备型HPLC从F094中分离得到的，但化合物收率低。G1的极性比D1略小。MALDI质谱显示分子量为2065，比D1少16amu。G1的比旋光度为-26.9°(MeOH)。质子NMR显示G1也是皂苷，非常类似于D1，表明它与D1的差异仅在于外单萜少了一个氧，其现为反式-2，6-二甲基-6-羟基-2，7-辛二烯酸。见图37，标记结构(14)，和表22选出的¹³C-NMR排布(14)。图37的流程2显示了G1的降解。

5.2.2.G1的温和皂化

当G1用0.5N NH₄OH在室温处理几分钟后，完全转变为极性更强的温和皂化产物和一个单萜。

5.2.2.a.单萜该物质的分子量和NMR表明其在原来为羟甲基的C-2位点有一个甲基。见图37中的描述，标记的结构为(15)。

5.2.2.b.三萜单萜寡糖HPLC的保留时间和质子NMR表明该化合物的NMR与图37中标出的结构(16)相同，类似于由D1制得的图36中标记结构(6)，其含有D1中见到的一个金合欢酸、一个单萜和八个单糖。(16)和(6)相似表明D1内单萜中所见的类似立体化学。

5.2.3.G1的糖分析

强酸水解(2N HCl，100℃，2小时)G1产生与D1中存在的相同单糖：阿拉伯糖、鼠李糖、岩藻糖、木糖、6-脱氧葡萄糖、N-2酰葡糖胺和两分子的葡萄糖。

5.2.4.G1的酸水解

酸水解温和皂化产物从而以D1中的形式分离了三种分子。对每种进行NMR和糖分析(2N HCl，100℃，2小时)。见图37，标记结构(16)。

5.2.4.a.寡糖含有两分子的葡萄糖和一分子的阿拉伯糖和一分子的鼠李糖，见图37，标记结构(17)。

5.2.4.b.单萜糖苷含有无环单萜(描述于图37，标出的结构(5))，和6-脱氧葡萄糖且其整个结构见图37，标记结构(18)。

5.2.4.c.三萜糖苷含有金合欢酸和一分子的N-乙酰葡糖胺、一分子的岩藻糖和一分子的木糖。这些片段中糖的排列与D1中的排列相同。该结构见图37，标记结构(19)。

5.2.5.鱼藤糖苷A

G1含有与鱼藤糖苷A相同的萜含量和糖(见图24和Beutler，1997)。然而，发现鱼藤糖苷A有显著不同的HPLC保留时间(G1-29.09分钟，和鱼藤糖苷A-26.04分钟)，这表明两种分子在一些方面肯定有差异，如它们亚基的连接上或光学异构体的存在，或两者都有。G1和鱼藤糖苷A的质子和碳NMR光谱比较也显示在化学位移上存在差异。设想这些化合物的内和外单萜的比旋光度也有区别。图37的结构(14)代表G1的结构。

5.3.B1的结构

生物活性数据表明B1的活性比D1或G1要低许多。

5.3.1.B1的整个分子(21)

通过植物提取、C-18快速层析、C-18制备和半制备层析完成了B1的分离。B1的NMR表明与在整个皂苷家族中可见到的相同的三萜/单萜/奎诺糖/单萜结构。NMR也表明存在四个脱氧糖和一个N-乙酰基团，意味着该分子必定在糖部分区别于D1。特异性¹³C-NMR排布(21)见表22。降解该分子如图38所示。

5.3.2.B1的糖分析

NMR数据表明存在一个以上的6-脱氧甲基糖的拷贝(即岩藻糖、鼠李糖、6-脱氧葡萄糖)。在水解后(2N HCl，100℃，2小时)，分析整个分子的糖，表明存在九个糖：岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、奎诺糖和葡糖胺各一分子和两分子的葡萄糖和鼠李糖。N-乙酰葡糖胺的残基，即葡糖胺，存在于初始分子中。B1的结构见图38，结构(21)。

5.3.3.B1的温和皂化

室温用0.5N NH₄OH处理B1若干分钟，将其完全转变为极性更强的化合物、温和的皂化产物和单萜。

5.3.3.a.单萜该物质的分子量和NMR表明其具有与图37，标记结构(5)的D1的单萜相同结构。其结构见图38，标记结构(22)。

5.3.3.b.三萜单萜寡糖该化合物的NMR表明其含有金合欢酸、一个单萜和若干单糖。见图38，标记结构(23)。

5.3.4.更剧烈地皂化三萜单萜寡糖

更剧烈地皂化(0.3N NaOH，60℃，1小时)温和皂化的产物，从而分离得到与D1和G1类似形式的三种分子。从每种分子获得糖分析和NMR数据。

5.3.4.a.寡糖含有葡萄糖、阿拉伯糖和两分子的鼠李糖。见图38，标记结构(24)。

5.3.4.b.单萜糖苷含有6-脱氧葡萄糖和一个单萜。见图38，标记结构(25)。

5.3.4.c.三萜糖苷含有金合欢酸，有一四糖连接于其C-3位上。该四糖由各一分子的N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、葡萄糖和木糖组成。见图38，标记结构(26)。

                           实施例6

                      三萜化合物的脱酯化

将F094脱酯化，对脱脂产物进行生物试验以阐明活性组分。将1.00g F094溶解于100ml H₂O中，加入1g KOH，回流1.5小时。让溶液冷却到室温，用1N HCl调节pH至7，然后用己烷洗涤(2×50ml)。然后将水溶液作进一步的分步提取，产生组分159-162。例如，先用正丁醇抽提该溶液，真空干燥后产生0.127g可溶性有机固体(F159)。用1N HCl酸化含水层，使pH为5，用EtOAc抽提(2×50ml)产生0.397g EtOAc溶解性固体(F160)，然后移去有机溶剂后，用正丁醇(2×50L)产生0.338g固体(F161)。最终用1N NaOH中和含水层。从最后的含水层分离得到1.808g固体(F162)。

生物试验揭示脱酯化产物只有很小或没有活性。用F159-162作针对769-P、Panc-1、HEY、MDA-MB-453和Jurkat细胞系的细胞毒性生物试验。仅发现F161有活性，其表现的细胞毒性在50μg/ml时对MDA-MB-453为1.6％，而F159在浓度为50μg/ml、25μg/ml、和12.5μg/ml时对Jurkat细胞的细胞毒性分别为15.50％、6.60％和3.80％。这些结果表明酯侧链为生物活性所必需。据信本发明化合物的酯侧链显示出抗肿瘤活性和/或与本发明化合物的三萜骨架一起作用产生强抗肿瘤活性。

                             实施例7

                         化合物的糖水解

水解F094中所含的糖以帮助鉴定其中的活性组分。将12g F094溶解于400ml2N H₂SO₄中，回流75分钟，在该时间段中形成不溶物质。冷却溶液，用烧结玻璃过滤。用水洗涤残留物，收获4.8g苷元(F191)(用TLC分析确定)。用KOH或NaOH中和深琥珀色滤液。形成并收集白色沉淀。将异丙醇加入琥珀色滤液中引起第二次白色沉淀。真空去除溶剂，将该溶剂重悬浮于MeOH，结果形成白色沉淀，火焰试验确定其可能相应于硫酸盐。真空干燥几乎澄清的滤液，将残留物乙酰化，用HPLC分析得到如图17A和17B所示的糖的混合物。该混合物约含有至少5个糖。这些糖的鉴定可通过用于GC-MS分析的TMS衍生物的分裂；纸色谱；用于HPLC分离或DEPT NMR的苄基衍生物的分裂；或本文详述的C¹³ NMR而进行进一步的表征。通过标准1-D和2-D纤维素、纸相和普通相的TLC，确定了主要的糖为葡萄糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖以及若干小的附加糖，和存在可能性极强的氨基糖苷，尤其是乙酰氨基取代的糖。

不同糖的数量可解释复杂的HPLC光谱，该光谱显示存在数十个密切相关的化合物。具体地说，一些活性组分看来在两个不同位点(醇和羧酸位点)被糖基化。因此与这两个位点连接的六个糖的各种组合将产生大量密切相关的难以分离的化合物。

另外，温和水解条件用100％乙醇(与5％水的共沸物)和0.1-2.0N H₂SO₄(残留的污物是相同的)温和加热到回流点，但不剧烈回流，产生苷元的类似混合物。一些组分丢失了，意味着在较强的条件下发生了某种异构反应。

然后用甲基碘(1ml)和溶解于无水丙酮的无水K₂CO₃(1g)回流5-7小时，而甲基化苷元F191(1g)。其结果是产生0.315g不溶物质和0.54g甲基酯，命名为F197。用15×460mm柱(45g SiO₂，15-25μm)，以MPLC进一步分离500mg F197，其中将样品预先吸附到1.5gSiO₂，15-25μm。按照表22，用790ml以己烷配制的7％异丙醇(亚级分1-10)、470ml用己烷配制的10％IPA(亚级分1-14)、275ml20％IPA/己烷(亚级分14-15)，200ml二氯甲烷和100mlDCM/MeOH(1∶1)洗脱该化合物。

表23显示了在相应剂量下生物试验中F191和F197对卵巢癌细胞(HEY系)、肾癌细胞(769-P系)、胰癌细胞(Panc-1系)、Jurkat T-白血病细胞和MDA-MB-453乳房癌细胞产生的细胞毒性。

            表23：分级分离F197产生的组分F198-F208

组分鉴定	收集的亚组分(体积(ml))	总重(mg)	注释
				F198	1(100)	14
F199	2-3(120)	126	进一步分离成F209-214.
				F200	4(40)	8
F201	5-6(110)	86	进一步分离成F215-219.
				F202	7-8(170)	37
F203	9-10(250)	17
				F204	11(100)	5
F205	12(150)	38
				F206	13(150)	10
F207	14-15(345)	86
				F208	16-18(300)	105

              表24：组分F191和F197的生物试验

	50μg/ml	25μg/ml	12.5μg/ml
				F191
769-P	82.3	56.3	33.7
				Panc-1	90	64	40.3
HEY	94.5	71.6	0
				MDA-MB-453	53.5	22.3	7.3
JURKAT	69.6	68.6	45.3
				F197
769-P	84.3	61.1	40.5
				Pane-1	93.5	84.4	53.8
HEY	94.4	94.7	62.1
				MDA-MB-453	76.8	79.2	68.8
JURKAT	70.2	70.6	56.9

以用于分级分离F191的同一柱进一步分级分离F199(116mg)，并用100ml 2％IPA/己烷、525ml 4％IPA/己烷和250ml 10％IPA/己烷洗脱(按照表25)。

          表25：分级分离F199产生的组分F209-F214。

组分鉴定	收集的亚组分(体积(ml))	总重(mg)	注释
				F209	1-7(225)	5
F210	8(20)	1
				F211	9(20)	2
F212	10-14(140)	90	进一步离分成F220-F228.
				F213	15-17(220)	17
F214	18(250)	10

在22×500mm柱(Alltech Econosil C18，10μm，用75％ACN/水平衡)上，用Waters Prep LC 4000 HPLC进一步分级分离F212(85mg)，用80％ACN/水洗脱，用ACN洗涤，流速为40ml/分钟，检测极限为220nm，每30秒收集亚级分(20ml)，如表26所示。

初步纯化F223的甲基酯衍生物得到C-191。将C-191用于传统的乙酰化流程。具体地说，在2∶1乙酸酐和吡啶的混合物中室温搅拌C191(47mg)过夜。用水淬灭反应，用乙醚和5N HCl分配该溶液。然后洗涤有机层直到中性，旋转蒸发和将残留物用于PTLC-每20cm用90∶10己烷∶异丙醇洗脱20cm制备型平板，然后用二氯甲烷∶甲醇(98∶2)洗脱后续的PTLC得到C-191乙酸盐(F229，其后来所给的编号为C-194)。

         表26：分级分离F212产生的组分F220-F228。

组分鉴定	收集的亚组分(体积(ml))	总重(mg)	注释
				F220	A(940)	12
F221	1-24	1
				F222	25-27	3
F223	28-38	55	“C191”-目标是通过13C-和1H-DEPTNMR，HPLC，RP18 TLC和MS，作为其乙酰化衍生物而进行表征
				F224	39-41	3
F225	42-54	4
				F226	55-74	1
F227	75-102	5
				F228	103	2	ACN洗涤

以用于分级分离F199类似的柱作MPLC进一步分级分离F201(85mg)，如表27用2％IPA/己烷(120ml)、4％IPA/己烷(330ml)、7％IPA/己烷(460ml)、20％IPA/己烷(150ml)、DCM(50ml)和DCM/MeOH(1∶1)(70ml)洗脱和收集。

          表27：分级分离F201产生的组分F215-F219。

组分鉴定	收集的亚组分(量(ml))	总重(mg)	注释
				F215	1-5(510)	3
F216	6-10(175)	54	“苷配基II甲基酯”-目标同样是用于表征.
				F217	11-14(225)	4
F218	15(150)	14
				F219	16(120)	10

                              实施例8

                        活性三萜的生物特征

血管生成或新管再生是个过程，通过这个过程，由肿瘤产生的细胞因子召集细胞，为肿瘤提供了营养滋补的脉管系统。抑制血管生成通过限制对肿瘤的血供而抑制了肿瘤的扩展。对以组分35(UA-BRF-004-DELEP-F035)处理过的牛毛细血管内皮细胞进行增殖试验检测了该功能。如下进行该试验：用标准方案(Folkman等人，1979)获得并培养牛毛细血管内皮细胞。用PBS洗涤这些细胞，以0.05％胰蛋白酶溶液分散。用DMEM+10％BCS+1％GPS制得细胞悬浮液，接种于明胶化的24孔培养板中(0.5ml/孔)，37℃培育悬浮液24小时。用0.25ml的DMEM+10％BCS+1％GPS置换培养基，加入不同浓度的UA-BRF-004-DELEP-F035。培育20分钟后，加入培养基和bFGF，得到总体积为0.5ml的DMEM+5％BCS+1％GPS+1ng/ml bFGF。72小时后，细胞用胰蛋白酶分散，重悬浮于Hematall(FischerScientific，Pittsburg，PA)中，用库尔特计数器计数(O’Reilly等人，1997)。

试验结果显示内皮细胞的增殖被显著地抑制了(有或无碱性成纤维细胞生长因子)(图5)。这些结果显示植物提取物的活性组分是内皮细胞增殖的强抑制剂，它常常是体内血管生成抑制的一种预报。另外，该组分对毛细血管内皮细胞的迁移没有作用，提示对正常细胞没有毒性(图6)。

类固醇皂苷(即毛地黄皂苷和薯蓣的苷配基-薯蓣皂苷元)遇到的共同问题是红血细胞的裂解。进行一个简单的培养管血样试验，用1mg/ml UA-BRF-004-DELEP-F035处理后几乎没有可检测到的裂解。另外，用10-25μg/ml毛地黄皂苷处理后，用培养管血样试验发现其导致100％的裂解。

另外，为了进一步研究活性组分抑制肿瘤细胞的机制，分析了TNF-α诱导的转录因子NF-κB的激活，采用以1-2μg/ml UA-BRF-004-DELEP-F035和UA-BRF-004Pod-DELEP-F094处理过的Jurkat细胞(3×10⁶)。如下进行研究：在37℃用1-2μg/ml F035或F094预处理Jurkat细胞15小时。收获细胞，将其重悬浮于1mlRPMI中，37℃用100pM TNF-α处理30分钟。用TNF-α处理后，按照Schreiber等人(1989)制备了细胞核提取物。简单地说，细胞用冰冷却的PBS洗涤，悬浮于0.4ml裂解缓冲液(10mM HEPES、pH7.9，10mM KCl，0.1mm EDTA，1mM EDTA，0.1mM EGTA，1mm二硫苏糖醇，0.5mM PMSF，2μg/ml亮肽素，2μg/ml抑肽酶和0.5mg/ml苯甲醚)，将细胞置于冰上15分钟，加入25μl 10％Nonidet-40。在振荡器上混合试管内容物，微量离心30秒，将该沉淀重悬于25μl冰冷的该抽提缓冲液中(20mM HEPES、pH 7.9、0.4M NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1mM二硫苏糖醇、1mM PMSF、2.0μg/ml亮肽素和0.5mg/ml苯甲醚)将试管置冰上，并间歇性地振摇。4℃微量离心细胞核提取物(5次)，将上清液储藏于-70℃。

在存在0.5μg聚di-dc的结合缓冲液(25mM HEPES，pH7.9，0.5mM EDTA，0.5mM二硫苏糖醇，1％Nonidet P-40，5％甘油和50mM NaCl)中，)与³²P-标记的NF-κB寡核苷酸(SEQ ID NO：1；NF-κB共有寡核苷酸；Santa Cruz Biotechnology)37℃培育细胞核提取物(7μg蛋白质)20分钟，进行电泳迁移率试验(Nabel和Baltimore，1987；Collart等人，1990；Hassanain等人，1993)。用含有50mM Tris、200mM甘氨酸和1mM EDTA的缓冲液，在5％天然聚丙烯酰胺凝胶上从游离寡核苷酸中分离出形成的DNA-蛋白质复合物。用10％醋酸固定凝胶、干燥，在-70℃用带有增感屏的放射自显影观察条带。

EMSA的结果显示，在未处理的细胞中，被TNF激活的NF-κ B的基础水平低(图20，泳道1和2)。用1μg/ml F035或F094预处理后用THF激活的细胞(图20，泳道4和8)结果对NF-κB活性没有抑制。当用2μg/ml UA-BRF-004-DELEP-F035或UA-BRF-004Pod-DELEP-F094处理细胞时(图20，泳道6和10)观察到显著抑制了TNF激活NF-κB。该研究的结果表明F035和F094都有能力诱导强抗炎症反应。除了活性三萜化合物为潜在的抗炎症化合物外，结果是特别有意义因为增加的证据证明炎症在癌发生中起中心作用(Sieweke等人，1990；Prehn，1997；Schuh等人，1990)。

                            实施例9

                       研究信号转导途径F035

为了进一步阐明胜利金合欢植物提取物活性组分的分子靶，研究了F035对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-激酶)活性以及对PI3-激酶的下游效应子AKT(蛋白激酶B，一种丝氨酸-苏氨酸激酶)活性的作用。PI3-激酶是一种在生长因子信号转导中涉及与受体和非受体酪氨酸激酶结合的酶。已知有两种PI3-激酶抑制剂：渥曼青霉素(一种真菌代谢物)和LY294002(一种合成的化合物，其结构类似于植物生物类黄酮栎精)。

如下进行该试验：将Jurkat细胞(1×10⁷)饥饿过夜，37℃使它们接触不同浓度(1-8μg/ml，取决于细胞系)的F035不同时间(2-16小时)。在不同的时间点后，收集细胞，2000rpm用PBS洗涤10分钟。4℃将细胞以1％NP-40裂解缓冲液裂解30分钟，4℃、15000rpm离心5分钟分离裂解液。为了进行PI3-激酶免疫沉淀，4℃用1ml细胞裂解物与5μl兔抗p85抗体(酪氨酸激酶受体衔接蛋白；UpstateBiotechnology Inc.)培育90分钟。4℃在100μl 20％蛋白A-琼脂糖珠上分离免疫复合体90分钟。依次用以下物质洗涤免疫沉淀物a)PBS，100mM Na3V04，1％Trion-X100；b)100mM Tris，pH7.6，0.5 LiCl，100mM Na₃VO4；C)100mM Tris，pH7.6，100mM NaCl，1mM EDTA，100mM Na3VO4；和d)20mM Hepes pH7.5，50mM NaCl，5mMEDTA，30mM NaPPi，200mM Na3VO4，1mM PMSF，0.03％Triton X-100。然后将免疫沉淀物重悬于30μl激酶反应缓冲液(33mM Tris，pH7.6，125mM NaCl，15mMMgCl₂，200mM腺苷，20mM ATP，30μCi[g-32P]ATP)。在氮气中干燥磷脂酰肌醇(PI；50μl)，以2mg/ml重悬于20mM HEPES pH7.5中，在冰上超声处理10分钟。加入10μl PI悬浮液和10μl γ-ATP，引发PI3-激酶反应。让该反应在室温中进行30分钟，加入100μl 1N HCl终止反应。用600μl氯仿∶甲醇(1∶1)提取脂类，采用薄层色谱(TLC)，在硅胶(G60)上在氯仿∶甲醇∶NH₄OH∶H₂O(60∶47∶2∶11.3)中解析。用放射自显影观察放射标记的磷酸磷脂酰肌醇，用Storm系统定量测定抑制情况(Okada等人，1994；Vlahos等人，1994)。结果(图21)表明用F035(4μg/ml)处理2和6小时后对PI3-激酶活力有抑制。类似地，当细胞接触2μg/ml F035 15小时后，观察到有95％的抑制，类似于Jurkat细胞中的渥曼青霉素(一种真菌代谢物，已知的PI3-激酶抑制剂)。

接着，研究了F035对PI3-激酶的下游效应物AKT的作用。AKT也称为蛋白激酶B，是一种病毒癌基因v-AKT的细胞类似物，由一些生长因子活化，并在PI3-K活化途径中发挥作用，对渥曼青霉素敏感。AKT编码丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，已显示该激酶在卵巢癌中增加了12.1％、在乳房癌中增加了2.8％。AKT通过磷酸化Bad(一种抗凋亡分子)参与抗凋亡途径。AKT改变的卵巢癌患者显示预后不良(Bellacosa等人，1995)。已显示AKT部分通过p70S6激酶的激活活跃地阻断细胞凋亡(Kennedy等人，1997)。p70S6激酶是细胞生长和G1细胞周期进行所需的促有丝分裂剂激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Chou和Blenis，1996)。p70S6激酶的活性受到位于催化和假底物区域的多种磷酸化活动所控制(Cheatham等人，1995；Weng等人，1995)。

如下分析F035对AKT磷酸化的作用。使Jurkat细胞(5×10⁶)血清饥饿，在37℃接触F035 15小时，以及用渥曼青霉素接触2小时。37℃细胞用cd3XL(cd3交联)诱导，或不进行诱导10分钟，以AKT裂解缓冲液裂解，将蛋白在8％SDS-PAGE凝胶上分离，用磷酸特异性AKT(Ser 473；New England Biolabs)和总AKT抗体作Western-ELC分析。也可类似地进行F035对p70S6激酶的作用的分析，但要用分析p70S6激酶(ser 411，thr421/ser424)的磷酸化的Phosphoplus p70S6激酶抗体试剂盒(New England Biolabs)。AKT分析的结果(图22)显示cd3交联轻微地诱导了磷酸AKT。用1和2μg/ml F035处理细胞后，导致显著地抑制AKT磷酸化(活化AKT)，这类似于用1μM渥曼青霉素处理细胞2小时。然而，总AKT的表达没有变化。也可用卵巢癌细胞OVCAR-3和C-2(HEY突变体)以及用2-4μg/ml F094处理的Jurkat细胞来显示对AKT磷酸化类似的抑制。这些发现证明，F035抑制Jurkat细胞和卵巢癌细胞中的AKT磷酸化。鉴于PI3激酶/AKT信号途径已显现出可传递抗凋亡信号这是有意义的(Kennedy等人，1997)。结果提示F035和F094通过抑制PI3-K信号传递途径介导了肿瘤细胞的凋亡。

                              实施例10

             细胞周期分析和膜联蛋白-V结合试验以检测凋亡

为了进一步鉴定植物提取物的活性化合物的生长抑制和细胞毒性机制，将约1×10⁶OVCAR-3肿瘤细胞接种于60mm³平皿上，用各种浓度的UA-BRF-004-DELEP-F035处理，37℃培育18-24小时。收获细胞，用PBS洗涤两次，重悬为1×10⁶个细胞/ml。将低聚甲醛(终浓度为1％)逐滴加入到缓慢旋涡搅拌的细胞中。在冰上培育15分钟后，再用PBS洗涤细胞，将沉淀重悬于70％冰冷的乙醇中，-20℃培育过夜。最后，用PBS洗一次除去乙醇，细胞重悬于含有0.1％RNase的10μg/ml二碘化丙锭(Sigma Chemical Co.)。再在室温培育细胞30分钟，然后移到4℃，18小时后用流式细胞术分析(Pallavicini，1987)。结果显示，在用UA-BRF-004-DELEP-F035处理细胞前，48％细胞处于G0/G1期，36％细胞为S期，7％细胞为G2/M期。然而，用F035处理OVCAR-3细胞48小时后，～58％细胞处于G1，只有27％细胞处于细胞周期的S期，表明处于G1的细胞增加了8％而处于细胞周期S期的细胞减少了～10％(图19A、B)。结果显示OVCAR-3人卵巢癌细胞明确停滞于G1期。

还检测了F035对人乳房癌细胞细胞周期的作用。将MDA-MB-435和MDA-MB-453乳房癌细胞接触不同浓度的F035，72小时后，如上所述进行细胞周期分析。结果证明，通过出现Sub G0峰，显示F035诱导了MDA-MB-435细胞凋亡(表28)。除了细胞周期调节外，还观察到处于细胞周期S和G2/M期的细胞百分比减少。

表28：用F035处理后的MDA-MB-435乳房癌细胞的细胞周期分析

        对照        F035         F035(3μg/ml)       F035

                  (6μg/ml)                        (1μg/ml)Sub G0   0.82％     16.0％           12.7％           0.90％

  G1    52.0％     50.0％           50.3％           51.0％

  S     35.0％     26.0％           26.0％           36.0％

G2/M    16.0％     10.0％           2.0％            14.0％

用MDA-MB-453细胞，结果显示，用F035处理72小时后，F035诱导细胞周期停滞于G1期，处于细胞周期G1期的细胞增加了～10％，处于S期的细胞减少了4-10％(表29)。这些结果显示植物提取物诱导了细胞周期停滞和肿瘤细胞的凋亡。

          表29：MDA-MB-453乳房癌细胞的细胞周期分析

          对照    F035(6μg/ml)     F035(3μg/ml)   F035(1μg/ml)

Sub G0    0.96％      2.2％             1.8％            1.5％

  G1      62.0％      72.0％            71.0％           69.0％

  S       26.0％      19.0％            16.3％           21.0％

G2/M      12.5％      8.5％             10.4％           10.0％

37℃用不同浓度的UA-BRF-004-DELEP-F035(50-1000ng/ml)处理Jurkat细胞(1×10⁶)18小时。用PBS洗涤细胞一次，重悬于含有5μl膜联蛋白-V-FITC偶联物(Biowhittaker，Walkersville，MD)的结合缓冲液(10mM Hepes/NaOH，140mMNaCl，2mM CaCl₂)中，在暗处培育10分钟。洗涤细胞，重悬于含有10μl 20μg/ml碘化丙锭(Sigma Chemical Co.)的结合缓冲液中，用荧光激活细胞分选仪(FACS)分析(Martin等人，1995)。

结果显示纯化的活性化合物能够引起Jurkat细胞凋亡。受其处理的细胞能结合膜联蛋白-V(一种细胞经历凋亡的指示)进一步证明了该发现(表30)。通常，磷脂酰丝氨酸(PS)位于质膜的内膜上。然而，在凋亡早期，发生了PS的外在化。膜联蛋白-V是结合于PS的一种钙结合蛋白，可进行膜联蛋白-V-FITC染色，采用流式细胞术观察到(Martin等人，1995)。

       表30：在用不同浓度UA-BRF-004-DELEP-F035处理的

           Jurkat细胞中通过膜联蛋白-V结合检测凋亡

UA-BRF-004-DELEP-F035(μg/ml)       ％膜联蛋白-V阳性细胞

           未处理的                            6

       抗-Fas(阳性对照)                      20.0

           1μg/ml                           16.0

           2μg/ml                           18.0

                            实施例11

               UA-BRF-004-DELEP-F035作为化学保护剂

已检测了UA-BRF-004-DELEP-F035对多阶段皮肤癌发生模型(在SENCAR小鼠中)的作用。用丙酮、致癌原DMBA(7，12-二甲基苯并[a]蒽)、DMBA+UA-BRF-004-DELEP-F035和DMBA+组分60(阴性对照)以低剂量(每只小鼠100μg UA-BRF-004-DELEP-F035或组分60)和高剂量(每只小鼠500μg UA-BRF-004-DELEP-F035或组分60)的植物提取物涂抹皮肤处理动物，每周两次，共四周。在施用DMBA前5分钟，将UA-BRF-004-DELEP-F035或对照涂抹在小鼠皮肤上。观察动物乳头瘤的形成，然后处死动物，组织学分析动物组织(图9A-图9F)。分析的结果总结于图10A、图10B、图11A、图11B、图12和图13。

进行这些实验8周后，用DMBA处理的小鼠组每只小鼠有8个乳头瘤，而用DMBA和UA-BRF-004-DELEP-F035处理的小鼠，每只小鼠有0.66个乳头瘤，用DMBA和组分60(阴性对照)处理的动物，每只小鼠有6.9个乳头瘤。这些结果表明UA-BRF-004-DELEP-F035有显著的抗肿瘤保护效果，而组分60基本上没有保护作用。

小鼠体外研究进一步显示，UA-BRF-004-DELEP-F035是一种化学保护剂，通过防止ras癌基因的突变，而抗致癌原诱导的肿瘤。小鼠皮肤癌发生的引发阶段是由致癌原(即DMBA)的直接作用造成的，是基本上不可逆阶段。8周后DMBA诱导的乳头瘤形成减少确定癌发生受到抑制。对处理的皮肤作分子分析显示，UA-BRF-004-DELEP-F035防止了DMBA突变ras癌基因的能力(见下述的实施例14、15和16)。

                            实施例12

                  检测胜利金合欢中活性三萜的方案

用一方案来有效地检测植物组织样品中的活性三萜。如下实施该方案。用剪刀将约5g树叶和树枝剪成小块，或另外用刀将根样品切成小薄片。将植物原料置于小的搅拌器内，并加入约25ml 80％甲醇(v/v)，每小时振摇持续至少2小时。通过10,000g的离心除去不溶物质。然后，将提取物用RP平板(铝TLC片，RP-C18F_254S)和40％乙腈(v/v)进行薄层层析。在TLC平板暴露于0.1％香草醛(4-羟基-3-甲氧苯甲醛)/H₂SO₄喷涂后，70℃烘烤15-30分钟，可看到活性三萜化合物的棕红色斑点(R_f＝0.2-0.3)。

                              实施例13

                  胜利金合欢植物中三萜化合物的定位

在初期的研究中，在初夏收集该植物上述磨碎的干燥部分用于提取。秋季再收集的则没有活性。此后，进行系统研究来确定在胜利金合欢植物的各种不同部位活性三萜化合物的相对存在情况。在监测了植物的化学成分后，确定基本上上述磨碎的植物部分中该活性化合物浓集于豆荚、根和秧苗中，而树枝、树皮、树叶和种子中大都缺乏或完全没有。所以，活性物质收集期只持续约3周，从开始形成荚果至裂开。还确定了该植物的根也产生相同的活性物质(伴有糖与活性化合物比例的波动)。后一特征表明在维持正常植物发育的同时让根旺盛生长的通气系统可能非常适合胜利金合欢。

                            实施例14

                     肿瘤细胞系和它们的生长

从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)获得如下人癌细胞系：SK-OV-3和OVCAR-3(卵巢)、Jurkat(T-细胞白血病)、U-937(组织细胞淋巴瘤)、MDA-MB-468、MDA-MB-453、MDA-MB-435、SK-BP-3、MCF-7、MDA-MB-231、BT-20(乳房)、LNCaP、PC-3、DU145(前列腺)、769-P、786-O、A498(肾)和PANC-1(胰)。从M.D.安德森癌症中心(Anderson Cancer Certer)获得HEY和Dov-13(卵巢)细胞系。以下非转化的人细胞系MCF-10A和10F(乳房上皮)也是从M.D.安德森癌症中心获得的。从ATCC获得Hs27(人包皮成纤维细胞)和L929(小鼠成纤维细胞)。在最低培养基上培养SK-OV-3、MDA-MB-468、Hs27、L929。在RPMI1640培养OVCAR-3、Jurkat、U-937、LNCaP、DU-145、PC-3、HEY、Dov-13、PANG-1、MCF-10A、MCF-10F和其余乳房癌细胞系，F-12培养基用于培养769-P、786-O和A498。本文所用的所有培养基都补充以10％胎牛血清、200mM谷氨酰胺和0.05％庆大霉素。

                               实施例15

      用突变特异性引物(MSP)扩增小鼠Ha-ras密码子61CAA→CTA突变

从Nelson等人(1992)推导出该方案。设计了一种命名为3MSP61mut的反向引物，这样在Ha-ras的密码子61中的3’端核苷酸(A)碱基发生中间核苷酸C AA→C TA(下划线)的颠换，在下述条件中选择性扩增突变的DNA。该试验的根据是Taq聚合酶缺少3’外切核酸酶活性，因此无法修复退火引物3’端的错配。该试验的条件取决于反向引物不能充分退火结合于野生型序列，这样就不会发生延伸。用相同的正向引物，与反向错配引物(3MSP61mut)进行一反应，与反向野生型引物(3MP61wt)进行另一反应。该方案只检测C AA→C TA颠换；然而这些突变是密码子61点突变中最常见的。在该颠换中形成了一Xba I RFLP位点(T/C TAGA)。该突变的验证可用Xba I限制扩增的DNA，或用³²P未端标记的5MSP61引物直接DNA测序。含有错配产物的反应物可在2％低熔点琼脂糖上进行后续的纯化和测序。以下给出了所用的引物序列5MSP61、3MSP61mut和3MSP61wt，分别为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

5MSP61(23-mer)5’-CTA AGC CTG TTG TTT TGC AGG AC-3’(SEQ ID NO：2)

3MSP61mut(20-mer)5’-CAT GGC ACT ATA CTC TTC TA-3’(SEQ ID NO：3)

3MSP61mt(20-mer)5’-CAT GGC ACT ATA CTC TTC TT-3’(SEQ ID NO：4)

3MSP61wt序列与N-ras和K-ras序列分别有2或3个错配，片段大小为110bp。以下为模板DNA和扩增试剂：

DNA(阳性对照)或                                   1.0μg

DNA(阴性对照，即野生型)或                         1.0μg

DNA(样品即石蜡块)或                               5.0μl

无DNA(即H2O)                                      5.0μl

Rxn缓冲液(10X)(10X＝500mM KCl，100mM Tris，       5.0μl

pH8.3，15mM MgCl₂)

dNTP混合液@每个为500μM(终浓度＝20μM)            2.0μl

[³²P]dCTP，3000 Ci/mmol，5uCi，1.7pmol，0.034μM 0.50μl

5′引物(10pmol/μl)，7.5pmol(终浓度0.15μM)       0.75μl

3′引物(10pmol/μl)，7.5pmol(终浓度0.15μM)       0.75μl

Taq聚合酶(5U/μl，3.0U)                           0.60μl

H₂O-50.0μl                                      50.0μl

矿物油                                            2滴

用Perkin Elmer热循环仪进行扩增循环的条件如下：

预热热循环仪到95℃

512-21        95℃               1分30秒       1轮

512-22        95℃               60秒

              57℃               60秒

              72℃               60秒         30轮

512-10        浸泡4℃

运行以下对照进行该试验的验证：野生型(WT)、野生型突变株(MUT)和阴性对照(H₂O)。用质粒pHras61mut的MUT DNA作为阳性对照样品。质粒pHras61含有从Sencar小鼠肿瘤克隆的外显子2 Ha-ras DNA。DNA测序验证了该克隆突变。该突变是小鼠Ha-ras基因(在密码子61中含有Ha-ras突变的肿瘤腺瘤DNA的样品)中密码子61(位于外显子2)中CA→CTA颠换(见图14)。

                           实施例16

           小鼠H-ras密码子12/13的热PCR^TM/RFLP突变试验

该试验是以跨越密码子12的三个bp和密码子13的第一个bp(GGA GGC，大鼠和小鼠Ha-ras编码序列中的核苷酸34-37)天然存在的Mn1 I位点的破裂为基础。Mn1 I的识别位点是N7GGAG。这四个位点之一发生的突变都将导致Mn1 I不能切割含有该区域的PCR^TM片段。该试验的缺点是Mn1 I的不完全消化。这使得很难辨别小百分比的抗消化野生型DNA和低水平的真突变。当DNA的来源含有野生型和突变型DNA的混合物时和当该试验用³²P标记片段以提高敏感性时，有时可观察到这种情况。以下为用于该试验的PCR^TM引物，为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。H-ras12扩增产物的大小为214bp。

引物#3(5′)：5′-CCTTGGCTAAGTGTGCTTCTCATTGG-3′   (SEQ ID NO：5)

引物#6(3′)：5′-ACAGCCCACCTCTGGCAGGTAGG-3′      (SEQ ID NO：6)

用以下反应条件，将引物#6用于55℃测序：

Rxn缓冲液(10X)                                     1.0μl

(10X＝500mM KCl，100mM Tris，pH 8.3，15mM

MgCl2

dNTP混合液@每个0.5mM                               1.0μl

5′引物                                            6pmol

3′引物                                            6pmol

³²P-dCTP(3000Ci/mMol)                             0.5μl

Taq聚合酶(5U/μl，0.65U)                           0.13μl

H₂O                                               到10.0μl

DNA(阳性对照)                                      ＞200.0ng

DNA(阴性对照即野生型)                              ＞200.0ng

DNA(样品即石蜡块)                                  5.0μl

无DNA(即水)                                        5.0μl

矿物油                                             2滴

用Perkin Elmer PCR^TM试剂盒进行扩增循环的条件如下：

  预热热循环仪到94℃

  512-87          94℃          2分钟      1轮

  512-88          94℃          30秒

                  68℃          30秒

                  72℃          1分钟      8轮

  512-89          94℃          30秒

                  60℃          30秒

                  72℃          1分钟      32轮

  File 512-10  浸泡4℃

                            实施例17

                   试验结果：检测c-Ha-ras突变

在最后一次施用DMBA、植物提取物和对照的四天后，从每组5只小鼠的新鲜冷冻组织中分离出的DNA，用PCR^TM分析密码子12和13和c-Ha-ras的密码子61中的突变。本发明者使用4天的标本用于此种分析，因为一些2天的DNA降解了，因此不适合作Ha-ras分析。在密码子12和密码子13中有一Mn1 I限制位点，其跨越野生型序列中密码子12的三个核苷酸和密码子13的第一个核苷酸。这些碱基中任一个发生的突变都将导致Mn1 I位点的缺失。本发明者用Perkin-Elmer热循环仪扩增了基因组DNA的c-Ha-ras基因的外显子1(其含有密码子12和13)。用苯酚-CHCl₃提取反应物，用乙醇沉淀DNA。然后将DNA重悬于酶缓冲液中，用Mn1I限制性内切PCR^TM产物，在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳消化物。没有观察到Mn1 I限制位点的缺失，结论是在测试的物质的密码子12和13中没有突变。同样从在最后一次给药两天后收集的样品切下的8μ石蜡包埋切片获得了用于Ha-ras分析的DNA。将每个石蜡块的25个切片置于微量离心管中，用二甲苯和乙醇除去石蜡，离心，重悬于含有蛋白酶K的5％chelex中。

从Nelson等人(1992)(上述实施例15)推导出第一个用于Ha-ras密码子61的方案。用相同的正向引物，与反向错配引物(3MSP61mut)进行一反应，与反向野生型引物(3MSP61wt)进行另一反应。该方案只检测密码子61点突变中最普遍存在的C AA→C TA颠换突变。在该颠换中生成了一个Xba I RFLP位点(T/C TAGA)。在2％低熔点琼脂糖上作含有错配产物的反应物电泳并进行后续的纯化和测序。切开(野生型DNA)与未切开(突变DNA)数量的比例通过定量测定溴化乙锭染色强度或³²P标记而确定。用质粒pHras61mut的DNA作为阳性对照样品。质粒pHras61含有从Sencar小鼠肿瘤的克隆外显子2 Ha-ras DNA。用DNA测序验证该克隆突变。该突变是小鼠Ha-ras基因密码子61(位于外显子2)中的CAA→CAT颠换。反应条件如实施例15中所述。

                             实施例18

     F035对用氧化偶氮甲烷处理的F344大鼠的异常隐窝引发的作用

从Charles River(Raleigh，NC)获得6周龄的雄性大鼠(Fishcer，3444)。用从Dyets Inc.(Bethlehem，PA)购得的AIN-76A食物随意喂养这些大鼠。该食物由20％酪蛋白、0.3％DL-甲硫氨酸、15％玉米淀粉、50％蔗糖、5％玉米油、5％纤维素、3.5％AIN-76混合盐、1％AIN-76维生素混合物和0.2％酒石酸氢胆碱组成。对动物也随意提供自来水。从Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)购得诱导大鼠异常隐窝的氧化偶氮甲烷(AOM)。检疫期中给大鼠喂食大鼠饲料三天，然后用AIN-76A喂养直到7周龄。将动物随机分成三个试验组(10个动物每组)。第一组动物仅用AIN-76A食物喂养，第二组动物接受AIN-76A食物+5mg/kg F035，第三组动物用AIN-76A食物+10mg/kg F035喂养(表31)。

        表31：用于研究F035对氧化偶氮甲烷引发F344大鼠

                  异常隐窝的作用的试验组

         组号           #动物          F035剂量(mg/kg食物)

         1               10                      0

         2               10                      5

         3               10                      10

在喂养一周后，所有动物接受腹膜腔内注射AOM(15mg/kg体重)。一周后接受第二次注射。在整个研究中每周都称重动物。喂养动物4周。31天后，用CO₂窒息处死动物。切除结肠，用冷PBS冲洗，沿纵向中轴切开，置于滤纸上，用70％酒精固定至少24小时。用亚甲基蓝(0.25％PBS配)染色结肠～1分钟。在20X的解剖显微镜下给异常隐窝病灶评分。从它们尺寸的增加、腔体至细胞基底表面距离的显著增加和隐窝周区的扩大(pericryptal zone)，可将异常的隐窝与周围正常的隐窝区别开来。由两位评分员采用盲法给所有的样品编号和评分。用一路ANOVA核查各组之间的差异，测定统计学显著性。如果发现差异，用bonferronit-检验测试两种F035剂量组与对照组的多重比较。由两位评分员给结肠评分，他们每人都不了解待评分的试验组。两位评分的结果非常一致。

发现在食料中添加F035(10mg/kg食物)时，这粗略地相当于每天摄入F035(1mg/kg体重)，F035显著地减少了异常隐窝症灶的总数(表32、表34)。相同的剂量也显著减少了单一和双重处理中异常隐窝的数量(表33、表35)。F035的较低剂量，5mg/kg食物(粗略地相当于每天每kg体重摄入500微克F035)造成总的、单一和双重处理中异常隐窝数病灶减少，但这种减少与对照值相比差别不显著(表33、表35)。研究过程中试验组和对照组之间的重量没有区别(表35、表36、表37)。

   表32：在AOM处理的大鼠中F035对异常隐窝/结肠数的作用

  F035剂量    异常隐窝/结肠  评分员1&2的平均值

  g/kg食物     平均值±SEM         ％对照    结果    注释

      0           86±5              100

    0.005         73±5               85       -       C

    0.01          43±4               50       +       C

-＝与对照没有显著的差异

+＝显著区别于对照(p＜0.05)

C＝结论性研究

 表33：在AOM处理的大鼠中F035对异常隐窝/病灶数的作用

                            每个病灶的异常隐窝数

                            (评分员1和2的平均值)

                              1              2              ≤3

试剂和剂量    (g/kg食      平均值         平均值          平均值

                 物)    ±SEM    ％    ±SEM     ％    ±SEM    ％

组分35          0       66±5    100   17±1    100     3±1    100

组分35         0.005    56±4    85    15±1    88      3±0    100

组分35         0.01     34±3^*  52    8±1^*   47      1±0    33

*显著区别于对照(p＜0.05)

表34：分析在AOM处理的大鼠中F035对异常隐窝/结肠数

               的作用的原始数据小结

                                      平均异常隐窝/集落±SEM

                         剂量

号    AOM      试剂       g/kg食物     评分员1     评分员2     组合

10     +     仅有致癌物      0         76±4       95±9      86±5

              (4周)^a

10     +       F035        0.005       67±4       80±8      73±5

10     +       F035        0.01        34±3^c     51±7^c    43±4^c

a＝AOM注射大鼠；无测试试剂

b＝混合AOM注射大鼠(n＝10)在第四周的平均值

c＝显著区别于对照(p＜0.05)

 表35：分析在AOM处理的大鼠中F035对异常隐窝/病灶数

                  的作用的原始数据小结

                         每个病灶的异常隐窝数平均值±SEM

试剂   剂量  评分员      1             2         3        总数

F035   5mg   评分员1     49±4         15±2     2±0     67±4

             评分员2     63±7         15±1     3±1     80±8

             合计        56±4         15±1     3±0     73±5

      10mg   评分员1     27±3^*       7±1^*    0±0^*   34±3^*

             评分员2     41±5^*       8±1^*    3±1     51±7^*

             合计        34±3^*       8±1^*    1±0     43±4^*

对照   NA    评分员1     57±4         17±1     3±1     76±4

             评分员2     75±8         18±2     3±1     95±9

             合计        66±5         17±1     3±1     86±5

*显著区别于对照(p＜0.05)

  表36：AOM处理的以5mg/kg F035食物喂养的大鼠体重

大鼠编号    第1周    第2周    第3周    第4周    第5周

1           154.4    198.2    215.0    219.7    235.8

2           149.8    195.1    210.6    210.6    232.9

3           154.1    200.7    228.1    228.1    248.0

4           154.1    199.8    216.2    220.8    242.9

5           158.0    208.4    228.4    231.5    256.8

6           154.8    196.0    208.3    213.4    230.2

7           164.2    210.1    224.4    225.5    246.8

8           161.7    202.3    218.8    220.4    237.8

9           153.0    199.7    217.0    218.1    238.1

10          158.8    198.5    212.8    212.3    231.6

平均值      156.3    200.9    218.0    220.0    240.1

SEM         1.4      1.6      2.2      2.2      2.7

   表37：AOM处理的以10mg/kg F035食物喂养的大鼠体重

大鼠编号    第1周    第2周    第3周    第4周    第5周

1           148.6    187.1    201.9    205.6    224.8

2           148.3    189.9    196.0    199.0    220.8

3           149.0    197.7    211.2    216.2    237.2

4           146.2    189.1    206.1    209.2    230.0

5           151.9    197.2    214.9    218.6    241.2

6           152.2    190.0    205.2    208.1    226.6

7           136.1    187.8    211.8    216.2    241.2

8           157.4    207.1    224.1    224.8    246.0

9           141.9    187.8    207.7    211.1    235.6

10          155.7    185.9    196.4    194.9    213.9

平均值      148.7    192.0    207.5    210.4    231.7

SEM         2.0      2.1      2.7      2.9      3.2

               表38：AOM处理的大鼠体重

大鼠编号    第1周    第2周    第3周    第4周    第5周

1           149.3    195.2    203.2    214.4    240.6

2           166.6    213.8    229.8    231.8    250.7

3           158.6    195.8    209.0    211.2    226.8

4           156.4    200.3    214.3    216.9    231.2

5           151.2    194.7    205.2    207.4    228.5

6           157.3    203.9    217.2    217.8    237.0

7           146.7    192.1    216.6    217.1    235.2

8           145.5    190.3    203.8    204.7    220.3

9           158.1    197.4    212.3    211.3    231.2

10          157.7    201.8    217.9    219.2    240.8

平均值      154.7    198.5    212.9    215.2    234.2

SEM         2.0      2.2      2.6      2.4      2.7

                     实施例19

用完全致癌作用和肿瘤引发/促进方案体内分析F035和F060治疗

18.1完全致癌作用方案

在完全致癌作用方案中，用溶于0.2毫升丙酮的100nmol DMBA对小鼠一周施用2次，共施用4周。在DMBA施用之前15分钟，将F035和F060涂到试验动物剃去毛的区域上，每周两次，共4周。F035和F060以每次涂用0.2ml丙酮中0.5mg和1.0mg的剂量施用。最后一次涂用测试化合物2天后，杀死每组的5只小鼠，评估增生。剩下的小鼠不接受进一步的治疗。再4周后，杀死每组的另5只小鼠，评估增生。剩下的小鼠饲养共16周，以评估肿瘤负荷。研究结果如下文表39所示。

18.2肿瘤引发/促进方案

在肿瘤引发/促进方案中，通过一次施用溶于0.2ml丙酮的10nmol DMBA在小鼠中引发肿瘤。在1周后，每周用0.2ml丙酮中的2微克TPA处理小鼠两次，继续实验。16周后停止促进。在整个实验中，在涂用TPA前15分钟将F035和F060(每次涂溶于0.2ml丙酮中的0.5mg和1.0mg)涂在实验动物剃去毛的背部。对照小鼠用0.2ml丙酮处理。处理8周后杀死每组的5只小鼠。剩余的小鼠维持再8周以评估肿瘤负荷。每周对各小鼠记录肿瘤发病率和多样性。结果如下文表39所示。

18.3组织学评估

当杀死小鼠时，常规将所有皮肤样品固定在甲醛中，加工用于组织学分析。用常规石蜡切片和苏木精-曙红染色制备组织学评估的组织。将各约1平方厘米的皮肤保藏在甲醛中，用于制备玻片；剩余物迅速冷冻在液氮中，以分离DNA。从甲醛固定的皮肤样品的至少20个随机选择的位点测定表皮厚度。还在每只动物最少20个随机选择的位点测定从基底膜到脂肪组织的皮肤厚度。给药停止2天后，在10高倍放大视野(×1000)下，测定每只动物每平方微米的细胞数来确定真皮炎症细胞(多形核白细胞和淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和肥大细胞)的相对比例。该数目定义为总真皮细胞构成的分析实验目的。

另外，用直接细胞遗传技术(Conti等，1986)对12周和16周获得的肿瘤进行染色体分析。匀浆乳头瘤，在含有0.02μg/ml秋水仙胺(GIBCO)的酶溶液中培育。洗涤分散的细胞两次，重悬浮在37℃的低渗的0.075M KCl溶液中10分钟。沉淀细胞，用甲醇-乙酸(3∶1)固定，并用Giemsa染色。在细胞分析系统(Elmhurst，IL)上如所述(Conti等，1986)对染色进行计数。

18.4非整倍体抑制

在完整致癌作用方案中，在12周时乳头瘤充分分化成几乎没有或没有细胞异型的增生病变。细胞是二倍体。在16周时，10％的细胞是发育不良，是超二倍体。用三萜皂苷处理的小鼠中产生的乳头瘤都不是超倍体。在引发/促进实验中，在12周时，30％对照的瘤前(preneoplastic)肿瘤是超二倍体。在16周时，50％的肿瘤是超二倍体。显著的是，在用三萜皂苷处理的小鼠中没有观察到非整倍体的证据(见下文表39)。

结果是显著的，因为可导致基因组不稳定的染色体不平衡的非整倍体是许多人类固体癌的特征(Duesberg等，2000)。虽然单独的基因毒性和非基因毒性的致癌物可导致非整倍体，但是肿瘤促进剂是特别强的染色体损伤诱导物，部分是由于反应性氧簇(ROS)的释放，例如H2O2(Conti等，1986；Duesberg等，2000；Cerutti，1985；Dutton和Bowden，1985)。

修复DNA损伤的机制在进化中广泛的保存下来。另外，可通过凋亡除去损伤的细胞(Whal和Vafa，2000)。针对身体的突变是在非整倍体之前还是之后，一直有争论(Duesberg等，1999)。然而，基因组不稳定性可能是由于活化的癌基因常常与ROS(Whal和Vafa，2000；Denko等，1994；Felsher和Bishop，1999)、异常染色体互补或有丝分裂元件的突变(Cahill等，1999；Lengauer等，1998)有关。因此本文所述的结果，例如金合欢素同时抑制H-ras突变(在出现非整倍体核型之前发生)和非整倍体，是显著的，因为H-ras突变和非整倍体在小鼠皮肤乳头瘤和很可能许多人类皮肤恶性肿瘤的发生中是早期事件。该研究的结果因此表明，利用本发明的化合物可以预防染色体异常。该应用包括用本发明的化合物处理细胞、组织或病人，以预防染色体不稳定和相关的作用。这种不稳定可能与致癌作用有关，也可能与各种可用于治疗增生疾病的治疗有关。通过施用本发明的化合物，不论是预防性或治疗性，可减轻或预防与染色体不稳定有关的有害作用。

表40 SENCAR小鼠的完全致癌作用和引发/促进实验中乳头瘤发生的F035抑制

         12周时患有乳头瘤的  12周时每只小鼠乳头  16周时患有乳头瘤的  16周时每只小鼠的乳

处理               小鼠，％            瘤数目              小鼠％             头瘤数目

完全致癌作用

DMBA^*                100              8.6(0％)             100              10.6(10％)

F035_/DMBA^*         33               0.7(0％)             42                2.4(0％)

F060_/DMBA^*         100              8.2(0％)             100               9.3(10％)

引发/促进

DMBA^§/TPA           100              12.6(30％)           100              20.6(50％)

DMBA^§/F035^‖/TPA^‖39               1.45(0％)            58                2.9(0％)

DMBA^§/F060^**/TPA^‖100              18.2(30％)           100              22.3(51％)

                12周时患有乳头瘤的      12周时每只小鼠乳头      16周时患有乳头瘤的  16周时每只小鼠的乳

处理                      小鼠，％                瘤数目                 小鼠％                头瘤数目

测试化合物的浓度：^*，100nmol(每周两次，4周)；^_，1.0mg(每周两次，4周)；^_，1.0mg(每周两次，4周)；§，10nmol(1x)；‖，1.0mg(每周两次，8周)；‖，2μg(每周两次，8周)；^**，1.0mg(每周两次，8周)，括号中所示为具有非整倍体的乳头瘤百分数。

                             实施例20

                         苷元的抗肿瘤活性

研究证实糖在生物活性中的重要作用，如从核心三萜分子中除去糖将导致生物活性的显著丢失。如表38所示，UA-BRF-004Pod-DELEP-F164(由附着酯的UA-BRF-004Pod-DELEP-F094水解糖产生)和UA-BRF-004Pod-DELEP-F245(UA-BRF-004Pod-DELEP-F094水解产物的甲酯混合物)，显示明显丢失了针对一系列肿瘤细胞系的抗肿瘤活性。类似地，UA-BRF-004Pod-DELEP-F194(苷元1的纯化乙酸盐)与三萜糖苷组分35相比，表现出充分的针对一系列肿瘤细胞系的抗肿瘤活性。因此，本文三萜糖苷的糖单元水解后，将显著丢失生物活性。

           表38：组分F164、F245和C194的生物试验

	50μg/ml	25μg/ml	12.5μg/ml	6.25μg/ml	3.12μg/ml
						F164
769-P	45	20	0	0	0
						Panc-1	57	27	13	0	0
Dov-13	80	56	16	12	10
						MDA-MB-453	66	30	13	0	0
JURKATF245	93	86	55	39	16.5
						769-P	26	14	14	7	0
Panc-1	49	26	4	0	0
						Dov-13	91	90	25	28	13
MDA-MB-453	90	75	8	8	0
						JURKATC194	93	89	64	23	0
769-P	13	6	0	0	0
						Panc-1	6	9	0	0	0

	50μg/ml	25μg/ml	12.5μg/ml	6.25μg/ml	3.12μg/ml
						Dov-13	3	0	0	0	0
MDA-MB-453	16	0	0	0	0
						JURKAT	34	18	9	2	0

                            实施例21

                    分析F035对胆固醇代谢的作用

本研究的目的是为了分析本发明三萜糖苷的生物活性对预防心血管疾病的作用。本研究的长期目的是为了证明将三萜化合物加入到哺乳动物(包括人)的食物中将降低血清胆固醇。为本研究选择的高血脂仓鼠模型是一种啮齿动物模型，与大鼠模型对比，该模型密切地模仿了LDL受体和人血浆脂蛋白在对胆固醇含量反应中的变化(Spady等人，1993)。

以两个不同的浓度将三萜糖苷给予纯化的仓鼠食物中，而食物的钙、钾、磷或其它基本成分的水平没有改变。采用两种不同水平三萜糖苷的供给是为了显示出剂量反应关系。任意给动物喂食按照NRC推荐(Reeves等1993)配制的Dyets纯化仓鼠食物，该食物有或无1％胆固醇(Davis等人，1989)。含有胆固醇的Dyets纯化仓鼠食物用下述浓度的三萜糖苷加以改进。由Dyets，Inc.(Bethlehem，PA)制备丸粒研究食物和对照食物，而钙、磷或其它基本微量营养素的含量没有改变。每周监测动物的食物摄入情况，并测定动物体重。所用的动物是四周龄、雄性远交繁殖的、无病毒的Golden Syrian仓鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)。以Statview程序运行的随机编号产生器按体重将动物随机编号，每笼3只关养，每天照明12小时，并将温度维持在22℃±1.0℃。

在分别用有或无三萜糖苷喂食后的0、4和8周，每组随机选出12只动物，于上午9-11点处死。取出肝、肾，称重、加工，保存于-70℃用于以后的研究。在取出肝和肾前，在处死时通过心脏穿刺获得血液，分析其脂肪。分析处理组和对照组血液的血清脂肪。有两个对照组(组1和2)和两个处理组(组3和4)。所有的动物在2周检疫期都以NRC仓鼠食物喂养。组1连续喂养NRC食物，直到研究结束。组2-4在另两周中喂养NRC食物+1％胆固醇以诱导高胆固醇血。然后，组2连续喂养这种食物直至研究结束，而组3和4喂养同种食物加三萜糖苷(如F035或F094)。在下表41中给出了这些处理组的小结。

                     表41：食物改进的表

组号           初始仓鼠数    标号           食物改进浓度

1                24+12a      无              --

2                24+12a      Chol^b+        1％Chol

3                24          Chol^b+TG^c    1％Chol+0.003％TG

4                24          Chol^b+TG^c    1％Chol+0.075％TG

^a在用三萜糖苷喂养开始时处死

^bChol＝胆固醇

^cTG＝三萜糖苷

在用有或无三萜糖苷的它们各自的食物喂食后0天(仅对照组)、4和8周后，每组随机选出12只动物，于上午9-11点处死。取出仓鼠的肝和肾，称重和加工可能的异常。制备每个显现出异常的器官的一部分用于组织分析，即冻结作石蜡切片和用苏木精和曙红染色切片。在手术取出肝和肾前，通过心脏穿刺获得血液。制备血清并保存在-20℃用于脂肪分析。在处死前让仓鼠禁食过夜。下表42显示了数据。

用研究过程中收集的血样在Roche Biomedical实验室，Burlington，NC.测定总胆固醇、三酸甘油酯、HDL-胆固醇和LD-胆固醇加VLDL-胆固醇(Machness和Durrington，1992)。在Power Macintosh 9600计算机上用Macintosh软件进行数据的统计学分析，包括单向方差分析、p值和线性回归(Armitage，1971)。具体地说，用Newman-Keuls平均值间距方差分析进行每一食物/药物组脂肪的数据分析(Steel和Torrie，1980)。

        表42：对仓鼠连续喂养三萜糖苷(TG)六周的作用

食物组       总胆固醇         三酸甘油酯        HDL胆固醇    LDL胆固醇(mg/dL)

             (mg/dL)          (mg/dL)           (mg/dL)

            平均数  改变    平均数  改变％    平均数  改变    平均数   改变％

                     ％                                ％

对照         141      -       133              141      -        0       -

胆固醇       341      -       247              281      -        31      -

0.015％TG    329     -3.5     260     5.3      250     -11       36     16.1

0.03％TG     303     -11.1    236    -4.4      246     -12.4     15    -51.6

12只仓鼠/组喂养纯化的仓鼠食物加1％胆固醇

                            实施例22

                研究用组分35预防UVB-诱导的癌发生

本研究的重点是在小鼠皮肤模型中用本发明的活性三萜糖苷预防UVB-诱导的癌发生。本研究的长期目的是为了证明在小鼠皮肤模型中三萜糖苷能预防UVB-诱导的病变。用小鼠实验模型是因为该模型非常类似人的状况。在研究中，本发明者尝试确定局部施用含本发明的活性三萜化合物的丙酮到受UVB辐照的SKH-1无毛小鼠的背部皮肤，将预防由UVB造成的皮肤病损。

在本研究中，以1.8kJ/m²的剂量用UVB射线照射SKH-1无毛小鼠15分钟。小鼠用两种不同剂量的F035(2mg和4mg/剂)以及阴性对照(F060或仅用丙酮)预处理。据信最少需要10只小鼠/组以得到有统计意义的结果。每种测试的化合物都在照射前10分钟局部给予，每周3次，共6-10周。本研究是为了评价短时间内这种化合物的预防作用。在仅用UVB时，预计不会看到肿瘤，在该特定时间内只产生皮肤病损。可能会观察到轻微的红斑(皮肤上的极小的红色)，其在照射后的第二天会消失。

所用的UV仪器是8台Westinghouse FS40太阳灯、一台IL-1400A辐射计/光度计和一台附有SEL 240/UVB-1/TD检测器的IL-1403 UVB光疗辐射计。中间部分有若干小室，每个小室关一只小鼠。在小室侧面有许多洞以保持小鼠被照射时适当透气。在照射过程中这些小室以圆周运动旋转，这样每只小鼠均一地暴露于UVB光线。这些装置的门可以在开UVB灯时关上，从而将UVB光保持在仪器内。用UVB辐射计测量UVB照射量。小鼠在小室内逗留的时间不多于10-15分钟。

本研究的目的是为了确定抗UVB小鼠皮肤损伤的光照保护作用。UVB直接被细胞DNA吸收，产生病损，该损伤可能导致靶基因的突变，而最终产生癌。这些病损的早期检测和预防可显示化学保护作用(Berton等人，1997；Chatterjee等人，1996；Youn等人，1997；Shirazi等人，1996；Baba等人，1996；Takema等人，1996)。

                     表43：UVB-照射方案

仅UVB                                   每组10只小鼠

丙酮/UVB                                每组10只小鼠

F035(2mg/剂量)5-10min随后UVB            每组10只小鼠

F035(4mg/小鼠)5-10min随后UVB            每组10只小鼠

F060(2mg/小鼠)5-10minUVB                每组10只小鼠

F060(4mg/小鼠)5-10minUVB                每组10只小鼠

表43中显示了用于本研究的处理组。认为这些组的动物数量足以控制所给组中皮肤增生和皮肤炎症的差异，同龄和同发育阶段动物表皮厚度和皮肤炎症的动物间的差异。增生和皮肤炎症是本研究中测量的主要参数。保留剩下的皮肤用于测量其它生物指标，如修饰的DNA碱基(8-OH-dG)和癌基因的表达(Ha-ras癌基因)。

在整个研究中，动物可任意食用丸粒食物和饮用水。每周监测动物的摄食，并测量动物体重。所用的动物为7周龄、雌性远交繁殖的、无病毒的SKH-1无毛小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)。以Statview程序运行的随机编号产生器按体重对动物随机编号，每笼关养5只，每天照明12小时，并将温度维持在22℃±1.0℃。

在Power Macintosh G3计算机上用Macintosh软件对数据作统计学分析，包括单向方差分析、p值和线性回归(Armitage，1971)。具体地说，通过分析方差来分析每药物组中表皮厚度的数据(Armitage，1971)。

                              实施例23

      生物活性三萜对参与细胞周期停滞和细胞凋亡的蛋白表达的作用

凋亡定义为在胚胎发育和维持组织体内平衡时，发生的编程性细胞死亡的正常生理过程。凋亡过程可分为凋亡细胞中一系列的新陈代谢变化。可测试若干调节或信号转导途径的各个酶促步骤，以确定一个细胞或细胞群中发生的凋亡，或癌细胞中破坏性细胞死亡过程。也可通过形态学特征观察凋亡进程，包括质膜的变化(如损失不对称性)、细胞质和胞核的凝缩、和DNA的核小体间断裂。当细胞降解成“凋亡小体”时达到细胞死亡的顶峰。

已开发了测定若干参与凋亡的酶促过程和信号传导过程的技术作为多参数凋亡研究的标准方案。凋亡早期步骤的一个例子是线粒体释放细胞色素c然后激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3途径(PharMingen，San Diego，CA)。诱导天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(一系列的胞质蛋白酶)是观察到的最一致的凋亡特征之一。具体地说，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3在该过程中起中心作用。当天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶被活化，它们裂解靶蛋白；其中最重要的一种是PARP(位于胞核内的蛋白)。因此，检测细胞色素c的释放、检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性和检测PARP降解的试验都可有效确定凋亡。

另外，造成恶性细胞线粒体释放细胞色素c的制剂很可能可用于治疗，以恢复对编程性细胞死亡的某些方面的细胞控制。

另一凋亡试验是膜联蛋白-V的检测(BioWhitaker，Walkerville，MD)。通常，磷脂酰丝氨酸(PS)位于质膜的内膜上。然而，在凋亡初期，发生PS的外在化。膜联蛋白-V是结合于PS的一种钙结合蛋白，可用膜联蛋白-V-FITC染色以流式细胞术观察(Martin等人，1995)。用本发明描述的胜利金合欢化合物处理的细胞结合膜联蛋白-V的能力可作为指示细胞经历凋亡的一种指示。

在其它实施例中，本发明者用PI-3-激酶试验来检测用胜利金合欢中分离的抗癌化合物处理的细胞的凋亡活性。磷酸肌醇3-激酶(PI3K)是一种细胞膜结合酶，能将磷脂酰肌醇中肌醇环的3-位点磷酸化，从而在PI3K发挥活性的细胞中明确了一种新的脂肪信号传导途径。当PI3K发挥活性时，一种称为AKT的激酶被召集到胞膜上。AKT是癌基因的产物，其在召集到膜上后被催化激活。充分激活的AKT在细胞存活中起决定性的作用。PI3K/AKT途径提供了一种细胞逃脱凋亡的机制。因此，抑制恶性细胞中的PI3K可用于治疗，以恢复细胞控制凋亡的至少某些方面。

                             实施例24

                           细胞周期分析

用有一些改进的标准方法通过流式细胞术进行细胞周期分析。简单地说，将1×10⁶细胞接种于60-mm³平皿中，37℃接触各种不同浓度的F035 72小时。用PBS洗涤细胞，以1×10⁶个细胞/ml重悬浮。先用1％低聚甲醛然后用冰冷的70％乙醇固定细胞。然后在室温用含有0.1％RNAse(Sigma)的碘化丙锭(10μg/ml；SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)染色30分钟，在Beckton Dickinson FAC SCAN上分析。

                            实施例25

              膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)结合试验

用膜联蛋白V-FITC结合试验研究了癌细胞中凋亡的诱导。37℃用各种不同浓度的三萜糖苷(F035)、纯提取物D1和G1(0.5-2.0μg/ml)的混合液处理Jurkat细胞(1×10⁶)18小时。用PBS洗涤这些细胞后，将它们重悬于含有5μl膜联蛋白V-FITC偶联物(Bio Whittaker，Walksville，MD)的结合缓冲液(10mMHEPES/INaOH，140mM NaCl，2mM CaCl₂)中，在暗处培育10分钟。然后用碘化丙锭(20μg/ml)染色细胞，用流式细胞术分析(Martin等人，1995)。

                            实施例26

                  磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-激酶)试验

37℃用2μg/ml F035处理血清饥饿的Jurkat细胞2-15小时或用渥曼青霉素处理0.5小时。如(Whitman等人，1985；Royal和Park，1995)所述测定PI3-激酶活性。4℃用5μl兔抗p85抗血清从1mg细胞蛋白中免疫沉淀PI3-激酶90分钟。4℃在20％蛋白A葡聚糖珠上收集免疫复合物90分钟。然后将免疫沉淀物重悬于30μl激酶反应缓冲液中(33mM Tris，pH7.6，125mM NaCl，15mM MgCl₂，200mM腺苷，20mM ATP，20uCi[g-32P]三磷酸腺苷ATP)。加入10μl PI悬液和10μlγ-ATP，引发PI3-激酶反应，并让其在室温中进行30分钟。加入100μl 1N HCl终止反应。用氯仿∶甲醇(1∶1)从反应混合液中提取脂类，在硅胶660平板上以氯仿∶甲醇∶NH₄OH∶H₂O(60∶47∶2∶11.3)薄层色谱分辨。放射自显影观察放射标记的磷酸化磷脂酰肌醇(PI)，用Storm 860系统(Molecular Dynamics)定量测定抑制情况。

                           实施例27

                     分析总AKT和磷酸化形式

用Western印迹分析确定总AKT和磷酸化形式的表达。37℃在含有0.5％FBS的培养基中培育的Jurkat细胞用F035和纯提取物D1和G1(2.0μg/ml)处理15小时。将细胞以AKT裂解缓冲液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1％Triton X-100，2.5mM焦磷酸钠，1mM 8-磷酸甘油，1mM Na₃VO₄，1mM亮肽素，1mM PMSFpH7.5)裂解。在8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离细胞蛋白(40μg)，电转移到硝化纤维膜上。先用磷酸特异性AKT(Ser473)或AKT抗体，然后用偶联于辣根过氧化物酶的山羊抗兔抗体探测膜。化学发光检测这些蛋白(ELC，Amersham，ArlingtonHeights，IL)。

                             实施例28

                     电泳迁移率漂移试验(EMSA)

如先前所述进行EMSA以研究粗制(F035)和纯提取物D1和G1对TNF(GenetechInc.)诱导NF-κB的作用。37℃用不同浓度的粗制和纯提取物处理Jurkat细胞(1×10⁶)15小时。然后，37℃使细胞接触100pM TNF 15分钟。如上所述制备细胞核提取物。37℃在存在2μg聚(dI-dC)时，用人免疫缺陷病毒长末端重复序列

5’-TTGTTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGCTGG3’(SEQ ID NO：9)的16fmol ³²P-末端-标记的、45-聚体双链NF-κB寡聚核苷酸培育细胞核提取物15分钟。在7.5％天然聚丙烯酰胺凝胶上从游离的寡核苷酸分离出DNA蛋白复合物。观察干凝胶上的放射性条带，用以ImageQuant软件运行的PhosphoImager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)定量测定。

                            实施例29

               诱导和分析诱导型氧化氮合成酶(iNOS)

用U-937和Jurkat细胞研究iNOS。通过在37℃用PMA(100nM)培育U-937细胞72小时，使它们分化为巨噬细胞。用F035(2μg/ml)处理该分化细胞15小时，然后用LPS(10μg/ml)处理4小时以诱导iNOS。对于Jurkat细胞，37℃用PHA(10μg/ml)和PMA(10ml)处理0.5×10⁶/ml细胞来诱导iNOS。通过在RIPS缓冲液(含1％NP-40、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS的PBS溶液)中反复冻融来制备细胞裂解液。在7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离细胞蛋白(200μg)，电转移到硝化纤维膜上，用兔抗iNOS抗体，然后用偶联于辣根过氧化物酶的山羊抗兔抗体探测。用化学发光(ECL，Amersham，arlington Heights，IL)检测蛋白条带。

                             实施例30

              混合物和纯三萜糖苷诱导肿瘤细胞细胞毒性

用所述的方法研究混合三萜糖苷(F035)对一组癌和非转化细胞生存力的作用。如图42所示，Jurkat(T-细胞白血病)细胞对F035高度敏感，IC₅₀为0.2μg/ml。类似地，F035抑制许多癌细胞系的生长，抑制浓度IC₃₀的范围为1.7-2.8(对卵巢)、2.0-3.3(肾)、0.93(胰)、1.2-6.5(前列腺)和0.72-4.0μg/ml(一些乳房)癌细胞。然而，其余的乳房癌细胞系耐受F035的细胞毒性作用。图42的最后四个直方图显示需要大于25μg/ml的F035来杀死50％非转化(人和鼠成纤维细胞和无限增殖的乳房上皮)细胞，提示F035对癌细胞有特异性细胞毒性。

另外，测试了两种纯三萜糖苷D1&G1对5种细胞系的细胞毒性。图43显示，D1具有与F035在三种细胞系(769-P、MDA-MB-453、和MDA-MB-231)中的IC₅₀可比的IC₅₀。在C-2(HEY变异体)和Jurkat细胞中，D1比F035有效两倍。然而，在大部分测试的细胞中，G1的细胞毒性显著大于F035和D1，可能因为G1的极性小于提取物D1(图43)。

                           实施例31

             用三萜糖混合物停滞细胞周期和诱导凋亡

为了研究F035对细胞周期的作用，用不同浓度的F035处理癌细胞系MDA-MB-453和MDA-MB-435。表44显示G1期细胞数量增加(7-10％)，伴有S期细胞减少(6-10％)，提示在MDA-MD-453细胞中G1停滞。另外，用F035处理后72小时后，16％的MDA-MD-435细胞(另一种乳房癌细胞系)表现为处于细胞周期的SubGo阶段(表44)，提示细胞正经历凋亡。这一观察进一步用TUNEL试验作凋亡研究得到证实。

              表44：F035处理细胞的细胞周期分析

细胞系           F035(μg/m)  细胞周期阶段

                              (细胞的百分比)

                              SubGo    G1    S    G2/M

MDA-MB-453 0                    1.0    62    26    13

           1                    1.5    69    21    10

           3                    1.8    71    16    10

           6                    2.2    72    19    9.0

MDA-MB-435 0                    1.0    52    35    16

           1                    1.0    51    36    14

           3                    13     50    26    12

           6                    16     50    26    10

37℃，MDA-MD-453和MDA-MD-435细胞用不同浓度的F035处理72小时。如方法中所述用碘化丙锭染色后作细胞周期分析。

为了了解F035诱导细胞杀死的基础机制，本发明者用F035、D1和G1处理的Jurkat细胞进行膜联蛋白V-FITC结合试验。表45显示膜联蛋白V与用1mlF035、D1和G1(15-17％)处理的细胞结合，表明这是导致细胞死亡的凋亡途径。

         表45：Jurkat(T细胞白血病)，72小时细胞毒性试验

D1对照，D1苷元，D1 w/o单萜&单萜-糖
剂量μ*g/ml	D1对照	D1苷元	D1减去单萜	D1减去两种单萜	单萜-糖
						25.000		100	56	7	6
12.500		100	55	4	6
						6.250	62	86	54	3	3
3.125	62	0	43	5	2
						1.562	61	0	9	7	1
0.781	61	0	1	4	2
						0.391	57	0	4	4	1
0.195	32	0	1	4	0
						0.097	15	0	1	1	0
0.048		0	0	0	0
						0.000		0	0	0	0
						IC50(μg/ml)	0.329	3.634	5.787	＞25.000	＞25.000

                            实施例32

                 三萜糖苷混合物抑制PI-3激酶活性

为了研究F035的分子靶，本发明者研究了PI-3激酶信号传递途径。用抗p85抗体(衔接蛋白)探针的免疫沉淀试验和后续的脂类激酶试验结果显示，F035抑制了Jurkat细胞中PI-3激酶的活性。图45A显示，用F035处理后2小时，抑制了PI3激酶约50-70％的活性。观察到6小时后92-95％PI3激酶活性受到抑制，持续至处理后15小时。一种已知的PI3-激酶抑制剂渥曼青霉素(1μM，处理后30分钟)显现出在Jurkat细胞中类似的酶活性抑制(图45A)。

                            实施例33

         三萜糖苷、D1和G1混合物抑制AKT的磷酸化

本发明者测定了F035和纯提取物对AKT(一种丝氨酸苏氨酸激酶，也是PI3激酶信号传递途径的下游效应物)的作用。与PI3激酶活性快速抑制不同，AKT磷酸化的抑制在处理后15小时才发生。用F035(2ml)处理Jurkat细胞15小时，导致AKT磷酸化的减少。然而这种处理也导致总AKT蛋白水平的降低，见图45B。发明者证明用纯三萜糖苷抑制了AKT活性。纯三萜糖苷D1和G1(2μg/ml)也可抑制AKT的磷酸化和总AKT蛋白的表达(图45B)。用LY294002和渥曼青霉素(已知的PI3-激酶抑制剂)处理Jurkat细胞显示抑制了AKT磷酸化。

                           实施例34

           三萜糖苷、D1和G1混合物抑制TNF诱导的NF-κB

为了进一步研究凋亡途径的介导物，本发明者评价了F035、D1和G1对转录因子NF-κB(已证明其参与细胞凋亡)的作用。图46A的结果显示，在Jurkat细胞中，F035以剂量依赖性模式抑制了NF-κB的TNF依赖性激活性。未处理的和仅用F035处理的细胞显示不激活NF-κB。本发明者用纯提取物D1和G1也证实了这些结果。用2ml G1和D1预处理细胞分别导致NF-κB水平减少了54％和87％(图46B)。仅用D1或G1处理的细胞显示没有激活NF-κB(图46B)。因为最近已证明PI3-激酶可调节NF-κB，用渥曼青霉素(1μM)预处理细胞导致TNF诱导的NF-κB的几乎全部抑制。

                           实施例35

                        用F035抑制iNOS

由于iNOS的转录是由NF-κB调节的，本发明者研究了F035对iNOS诱导的作用。在已分化成巨噬细胞的U-937细胞中，本发明者在对LPS反应中诱导了iNOS(图46C)。用F035(1μg/ml)预处理这些细胞，完全阻断了iNOS的诱导。在这些细胞中，渥曼青霉素也对LPS诱导的iNOS有类似的作用。

发明者也检验了在Jurkat细胞中，F035对诱导iNOS的作用。按方法中所述用PHA和PMA诱导iNOS。结果显示用F035预处理Jurkat细胞阻断了iNOS的诱导。

                       实施例36

                 免疫印迹分析PARP降解

通过聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的蛋白酶解切割检验了由F035和D1诱导的凋亡。用F035(2μg/ml)和D1(2μg/ml)处理Jurkat细胞(2×10⁶ml)不同时间。在含有20mM HEPES，250Mm NaCl，2mM EDTA，0.1％NP-40，2μg/ml亮肽素，2μg/ml抑蛋白胞肽，0.5μg/ml苄脒，1mM DTT和1mM PMSF的缓冲液中制备细胞裂解液。在7.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离细胞蛋白(60μg/ml)，电转移到硝化纤维膜上。先用单克隆抗PARP抗体(Pharmingen)，然后用偶联于辣根过氧化物酶(HRPO)的抗小鼠抗体探测该膜。用化学发光(ELC，Amersham)检测蛋白条带。以116-kDa PARP切割成85kDa和41kDa肽产物的程度作为凋亡的衡量(Tewari等人，1995)。

                             实施例37

             天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3蛋白酶试验

如先前所述(Enari等人，1995)用一些改进来测量天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性。简单地说，用F035、D1和G1处理Jurkat细胞(1×10⁶/ml)不同的时间。在300μl提取缓冲液(12.5mM Tris，pH7.0，1mM DTT，0.125mM EDTA，5％甘油，1μM PMSF，1μM PMSF，1μg/ml亮肽素，1μg/ml胃酶抑素和1μg/ml抑蛋白酶肽)中反复冻融制备胞质提取物。以1∶2用ICE缓冲液(50mM Tris，pH7.0，0.5mMEDTA，4mM DTT和20％甘油)稀释细胞裂解液，37℃与20μM天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3底物(乙酰-Asp-6lu-Val-Asp氨甲基香豆精)培育。由荧光氨甲基香豆精的产生监测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的活性，即用FluoroscanII(Labsystems，Helsinki，Finland)355nM激发光，460nM发射光来测定。

                           实施例38

                   检测线粒体释放的细胞色素C

用Western印迹法测定线粒体释放的细胞色素C(对F035处理的反应)。37℃用2μg/ml F035处理Jurkat细胞(10×10⁶)4和6小时。用蔗糖缓冲液(0.25M蔗糖，30mM Tris，pH 7.7，1mM EDTA)洗涤细胞沉淀。在细胞沉淀中加入20μl蔗糖缓冲液，其含有1μM PMSF、1μg/ml亮肽素、1μg/ml胃酶抑素和1μg/ml抑蛋白酶素。将细胞在0.3ml带有B捣棒的Kontes匀浆机(Kontes Glass company)中碾磨120次破坏细胞。在15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离细胞蛋白(60μg)，电转移到硝化纤维膜上。先用单克隆抗细胞色素c抗体(Pharmingen)，然后用偶联于辣根过氧化物酶(HRPO)的抗小鼠抗体探测该膜。用化学发光(ELC，Amersham)检测蛋白条带。

                          实施例39

                  F035和D1诱导PARP的断裂

在Jurkat细胞中F035和D1以时间依赖性模式诱导了PARP的断裂。图47中的结果显示4小时后，F035和D1开始诱导PARP断裂，6-8小时接近全部断裂。这表明天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的作用以及引起的凋亡是参与F035和D1诱导细胞死亡的机制。

                           实施例40

                z-vad fmk对F035诱导细胞死亡的作用

为了进一步证明天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶在F035介导的细胞死亡中的作用，本发明者研究了z-vad fmk和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂对经F035处理的细胞的作用。37℃用100μMz-vad fmk预处理Jurkat细胞1小时，完全逆转了F035诱导的PARP断裂(图48)。

                            实施例41

          F035诱导天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的激活

本发明者迄今的结果有力地提示了天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶在F035诱导的凋亡中的作用。由于该蛋白酶以时间依赖性模式紧靠天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3中PARP的上游，发明者进一步研究了在F035、F094、D1和G1处理的细胞中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的激活(图49)。在所有实验中，激活开始于处理后的4小时，在6-8小时达到顶峰，此后下降。

                            实施例42

                 由F305使线粒体释放细胞色素C

细胞色素c释放被认为是某些细胞凋亡途径中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3活化的原因。为了研究在F035诱导的凋亡中该情况是否属实，本发明者观察了F035处理的细胞胞质提取物中细胞色素c的水平。发明者发现从这些细胞线粒体以时间依赖性模式释放细胞色素c(图50)。发明者发现，用F035处理后4小时细胞色素c释放，这与天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3激活和PARP断裂的开始时间相吻合。研究细胞色素c的释放需要更早的时间点，以观察其是否进行天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的激活。

                             实施例43

                           通气生长系统

鉴于发现本发明的三萜化合物集中于胜利金合欢植物的根和豆荚，期望产生一种方法来繁殖适合的组织以从中分离出该化合物。为了完成此目的，设计了一种通气生长系统来培养胜利金合欢根。该通气系统是一封闭的系统，其中植物的根悬浮于空气中，并用完全营养液喷雾。用螺丝将 英寸的胶合板连接起来制成8×4×3.5英尺的盒子，内衬玻璃纤维板制成防水的盒子。在盒子的顶部覆盖两张(2×8英尺)泡沫聚苯乙烯板，钻出12个圆孔，虽然一新设计的结合PVC涂层的用不透明复合(白在黑上)聚乙烯覆盖的家禽铁丝(poultry wire)，被认为是用于进一步研究的小室覆盖物。用一程序化的重复计时器对根喷雾，每4.5分钟喷雾12秒。

用于通气小室的管道工程系统设计是一封闭的系统，由 英寸PVC构成，带有六个旋涡喷射空心圆锥体聚丙烯喷雾管嘴。在小室的底部有一容纳720L营养液的储器，用外部的泵从底部喷雾到植物根上。所用的泵是Little Giant 4-MD 3250RPM，1/12hp泵。

由Tork重复计时器控制泵，每4.5分钟启动30秒。由Taylor电子室内/室外最低/最高温度计监控温度，并人工记录。在冬季，用两个Visi-therm 300W潜水培养缸加热器加热营养液，这样在图森、亚利桑那的无加热和冷却的户外阴暗房间内，无需加热周围的空气仍足以保持植物积极地生长。

营养液含有植物完成其生命周期所需的所有基本元素。因为不同的植物最佳生长需要不同水平营养和配方，一种全面、单平衡的溶液可得到满意的结果。在下面的表46中给出了该溶液的组成成分。

         表46：通气营养液

化合物	元素	浓度(ppm)
			硝酸钙硝酸钾	NCa	150146
硝酸钾	K	200
			磷酸二氢钾	P	90
硫酸镁	MgS	50134
			10％螯合铁	Fe	5
硫酸铜	Cu	0.07
			氯化锰	Mn	0.8
钼酸钠	Mo	0.03
			硼酸	B	0.3
硫酸锌	Zn	0.1

然后划破胜利金合欢种子，将它们播种到由50％泥炭沼和50％蛭石组成的无土混合物中。每天给幼苗浇两次水，并以单剂量的锇酸盐(osmacote)施肥。一旦幼苗长到15-20cm长(这一般需要生长3-4个月)，彻底地冲洗根球除去所有泥炭沼和蛭石。然后将根插入泡沫聚苯乙烯板的孔中，通过从温室结构向下盘绕从上方支撑幼苗的顶部。将7.0cm的管状泡沫片环绕在幼苗冠周围以防止喷雾到树叶及周围区域。然后在盒内装填约30cm的营养液，打开泵。

一旦幼苗到适当的状态并被喷雾，养护仅限于用塑料夹子让幼苗沿着盘绕生长，且一旦营养液水平低于10cm将重新补充。当幼苗在温室内生长时，无需控制营养液的温度。然而，如果该通气盒处在大气环境条件时，推荐提高营养液的温度到70°F，这样植物在冬季的月份中不会休眠。

为收获根，直接用水淋洗通气盒中单株植物的根群，在喷雾器上方几英寸用剪刀剪下根群。用纸巾拍干除去多余的水分，然后样品称重。用剪刀将根群切成3-4英寸的切片，如上所述用于化学方法提取。另外，为了继续收获根，关掉泵，从生长的根群中剪下根。然后将这些根切成3-4英寸的切片，如上所述提取。需小心不要伤害未收获的根。

在通气系统中培养植物有许多益处。首先，植物的生长是用常规培养技术的大约两倍。其次，无需伤害植物将可轻易收获根。根的切除还导致了须根广泛地侧向生长。因此，一年可收获若干次根。另外，通气培养的植物在第一年生长就开花，而户外生长的植物要3-5年。

                               实施例44

                     胜利金合欢的组织培育和发芽

种子/培养基：从亚利桑那大学(Tucson，Arizona)校园农艺中心生长的植物收获得到种子。用抗微生物的肥皂(Vionex，Viro Research International Inc.，USA Durango，Colorado)以自来水彻底洗涤种子，然后用20％(v/v)的商品漂白剂溶液处理15分钟。用去离子水重复洗涤后，用沸水(每100个种子用ca 200ml)处理种子并冷却过夜。再用20％(v/v)商品漂白剂处理种子20分钟，在无菌去离子水中漂洗2-3次，然后在MS(Murashige和Skoog，1962)和1/2强化MS培养基中培养。该培养基补充有MS维生素，2％(w/v)蔗糖，并用0.7％琼脂或0.2％gelrite凝固。在一个研究中，种子用浓硫酸划破皮，无菌水漂洗，在培养基中培养。所有的培养基经121℃蒸汽灭菌15分钟。培养维持在25+2℃，产生冷白光的日光灯产生的1000lux可见光定时照射16小时。每项研究重复18次。

繁殖：将从三周龄幼苗切下的萌芽尖端和结节段在MS培养基上培养，该MS培养基也(分别地或组合地)补充有0.1mg/L植物生长素(IAA、NAA或IBA)和BAP(0.1、0.3、0.5、1.0和1.3mg/L)分别或全用。对根的萌芽，测试了IAA(0.1mg/L)、IBA(0.1和0.6mg/L)和NAA(0.1和0.2mg/L)。为了转移到泥土上，将小苗从培养管中移出，用自来水洗涤根除去黏附在根上的营养，转移到装满沙漠型泥土的盆中。用Magenta盒覆盖植物以维持湿度，并保持喷雾和低照度3周。3周后，移去Magenta盒，将植物从喷雾中转移入较高照度的温室。

诱导胼胝体：从三周龄试管内萌芽幼苗切割下的下胚轴和根节诱导胼胝体组织。在单独或组合补充有2，4-D(1mg/L)、NAA(0.5和1mg/L)、IAA(0.2和1mg/L)、Thidiazuron(0.2mg/L)、Dicamba(0.2和2mg/L)、BAP(0.3mg/L)和KN(0.5和3mg/L)的MS培养基上培养外植体。

种子萌芽：用热水处理的种子在3-4天中胚根突露而发芽，1周内获得完全的小苗。没用热水处理的种子栽培后不发芽。与琼脂(0.7％)相比，在Gelrite(0.2％)固化的培养基上发芽的种子比例高。最大发芽百分比(88.7％)见于以Gelrite固化的半强化MS培养基上。表47中小结了不同培养基上的发芽反应。

                表47：胜利金合欢的种子反芽

  介质              培养的种子数目          发芽种子^a数

MS(用琼脂凝固)                  42               36(85.7)

MS(用琼脂凝固)(用硫酸           41               24(58)

去皮)

1/2强化MS(用琼脂凝固)           60               48(80)

1/2强化MS(用Gelrite凝           133              118(88.7)

固)

^a圆括号内的数字为发芽百分比

3-4周内获得可移植的幼苗。由于种子的高度休眠，胜利金合欢种子在自然条件下发芽率很低(Kaul和Ganguly，1965；Grice和Westoby，1987)。为了克服休眠，种皮必须用尖锐的器具刻痕，接着经酸软化，或以沸水覆盖然后在水中冷却过夜。本发明者发现，用沸水处理然后将种子培养在1/2MS培养基(以0.2％Gelrite固化)上，发芽率可增至88.7％。按照Larsen(1964)在自然条件的胜利金合欢种子用沸水处理，可增加36％的发芽率。没有预处理，发芽百分比为19.4％(Kaul和Ganguly，1965)。另外，胚根需要12天突露，79天后才可收获完全的幼苗。在我们的方案中，增加了发芽百分比(88.7％)，且在3-4周的时间内就可移植幼苗。

萌芽端的培养：为了研究萌芽的繁殖，在单用MS或补充有BA和BA联合IAA的MS上培育萌芽尖(约1.0cm长度)。在单MS上萌芽的长势很差，根的生长也差(1-3个根/培养物)。在含有BA(1.3mg/L)的培养基上，萌芽尖产生多个根(平均为3.94个根/培养物)。在这些根中，一或两个根长大，在4周内达到高度8.6cm。联用BA和IAA也诱导了多根的生长。表48中小结了这些结果。

表48：不同水平的BAA和IAA(0.2mg/L)在胜利金合欢中诱导多根的作用

    介质^*                平均每个芽尖的萌芽数         萌芽长度

   BA(mg/L      IAA(mg/L                                 (cm)

     1.3           0           3.94+1.846              8.6+3.0258

     0.1          0.2          1.6+0.599               6.8+3.002

     0.3          0.2          1.9+0.7071              5.8+2.794

     0.5          0.2          2.8+1.1659              5.1+2.501

     1.0          0.2          4.9+2.075               3.2+1.468

*MS.该数据代表18次重复的平均值+SE。

较高浓度的BA(1.0和1.3mg/L)，增加了根的数量。发现合用BA(1mg/L)+IAA(0.2mg/L)可得到较好的根繁殖。在所有BA-IAA合用的切片端都观察到胼胝体。Kaur等人(1998)报道了BA-NAA对Acacia catechu诱导枝芽的协同作用，而较高水平的NAA(1-2mg/L)是不利的。他们指出IAA不能有效地提高枝芽的形成；而是从这些外植体的基础上产生胼胝体。

为了研究根，切下试管内发育的芽，转移到含有IAA、NAA或IBA的培养基上。表49列出了结果。在这些处理的测试中，发现1/2MS+NAA(0.2mg/L)对生根较有利。几乎100％的萌芽生根了。四周内芽高度达到9-11cm。对于Acaciacatechu，(Kaur等人，1998)报道了在根和萌芽的连接处形成了间断的胼胝体，他们将蔗糖水平从3％降至1.5％来控制胼胝体。类似的结果也报道于木苹果(Feronia limonia)(Purohit和Tak，1992)和Acacia auriculiformis(Das等人，1993)。在本研究中，用3％蔗糖观察到轻微的胼胝体，在2％蔗糖时减到最小。将发根的芽转移到温室。转移后的存活率是100％。小苗在喷雾中驯化3周，然后小苗在常规的温室中培育。

        表49：IAA、NA和IBA对胜利金合欢萌芽发根的作用

介质          培养的萌芽数    生根的萌芽数^a  平均每个培养物的

                                                    生根数

MS                     14            6(42.8)            2+0.816

MS+IAA(0.1)            12            8(66.6)            3.6+1.316

MS+IBA(0.1)            10            6(60)              3+0.816

MS+IBA(0.6)            14            8(57)              1.6+1.111

MS+NAA(0.1)            10            6(60)              2.16+1.067

1/2MS+NAA(0.2)         14            14(100)            3.07+1.032

^a圆括号内的数字为发根百分比

结节段的培育：在补充有0.1mg/L IAA、NAA或IBA的MS培养基上培育从试管内发芽的幼苗上切下的结节段(子叶结)。每个外植体只发育出1或两个腋生芽。然而，这些芽的生长很缓慢。因此，结外植体不能用于进一步的研究。

从下胚轴和根节段诱导胼胝体：从3周龄试管内发芽的幼苗上切下的下胚轴节段诱生胼胝体。在2，4-D(1mg/L)、Thidiazuron(0.2mg/L)、Dicamba(0.2mg/L)上发育的胼胝体是绿色、致密和坚硬的。在大部分试用的浓度中胼胝体发育的量是中等的(表53)。在补充有2，4-D(4mg/L)+IAA(1mg/L)+NAA(1mg/L)的MS培养基上观察到丰富的胼胝体发育。

在单补充2，4-D(1mg/L)和联用KN(0.5mg/L)的MS培养基上培育从三周龄试管内发芽的幼苗切下的根节段，显现长出了浅黄色软胼胝体以及从胼胝体长出一些根。在100％的培养物上观察到胼胝体生长。在加有BA(0.3mg/L)+IAA(0.2mg/L)的培养基上观察到根节段长出白色、软、脆且丰富的胼胝体。在加有2，4-D(4mg/L)以及1mg/L IAA和1mg/L NAA的培养基中培育的根节段上观察到丰富的浅黄色胼胝体。类似类型的胼胝体也在Thidiazuron(0.2mg/L)+DiGamba(2mg/L)和IAA(0.1mg/L)中观察到。在含有Dicamba(2mg/L)+IAA(0.1mg/L)的培养基上培育的根节段形成了浅绿色、致密、坚硬的胼胝体。从胼胝体再生幼苗的尝试失败了。在若干木本品种如阔荚合欢(Albiizzia lebbeck)(Lakshmana Rao和De，1987)和金银花(Lonicera japonica)(Georges等人，1993)中已报道了关于胼胝体诱导的外植体类型的变异。在这些这些发明者的研究中，他们发现在同一培养基上生长的下胚轴-和根-衍生的胼胝体的发育不同。在BA-IAA联合培养基上，从下胚轴发育的胼胝体是浅绿色、坚硬和致密的，而从根节段发育的胼胝体是白色、软、脆的，也显示了在一些联合培养基中从胼胝体发育的根的差异。在印度玫瑰木(Dalbergia latifolia)中，再生培养基上的胼胝体变为致密、坚硬和暗绿色，且枝芽也分化了(Pradhan等人，1998)。在发明者的研究中，观察到类似类型的胼胝体发育，但这种胼胝体不能再生。在此研究中，本发明者显示胜利金合欢可在试管内从节尖繁殖。这种标准化的技术可用于微量繁殖在不均一幼苗群中检测到的精华个体，并维持这种精华系用于将来的研究。

          表50：从胜利金合欢的下胚轴和根节段发育胼胝体

    介质^*                           胼胝特征

                              胚轴                     根

1.MS+2，4-D(1)                中等，绿色               中等，黄色

2.MS+TD(0.2)                  稀疏                     稀疏

3.MS+麦草畏(2)                中等，致密，绿色         中等，软，黄色

4.MS+2，4-D(1)+KN(0.5)        稀疏，绿色               稀疏，浅绿色

5.MS+KN(3)+NAA(0.5)           中等，白色               稀疏，浅绿色，

6.MS+TD(0.2)+                 中等，浅绿色             中等，软，黄色

7.MS+麦草畏(2)+AA(0.2)        稀疏、致密、黄色         稀疏，浅绿色

8.MS+2，4-D(4)+               多，绿色，致密，坚硬     中等，黄色，软

AA(1)+NAA(1)

9.MS+BA(0.3)+IAA(0.2)         中等，致密               多，白色

*圆括号内的数字的单位为mg/L

                             实施例45

               诱导胜利金合欢的毛根以生产抗癌化合物

用发根土壤杆菌感染胜利金合欢植物原料，导致在植物基因组内T-DNA的整合和表达，从而导致毛根表型的发育(Grant等人，1991)。毛根培养物生长迅速，有斜向根生长，且在无激素的培养基上高度分枝。毛根也表现出高度的遗传稳定性(Aird等人，1988)。许多双子叶植物对发根土壤杆菌敏感，且许多品种已从毛根培养物再生了植物(Christey，1997)。

本发明者进行了毛根的遗传转化和诱导，作为从胜利金合欢生产活性三萜的方法。土壤细菌发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)具有将基因转化到宿主植物基因组的天然能力，导致可使用在感染部位形成的根产生毛根培养物。毛根的特征是无数快速生长、高度分枝的不定根，其能在无激素的培养基试管内持续生长。

本发明者证明用发根土壤杆菌菌株R1000(根癌土壤杆菌的一种遗传工程改造菌株，其中插入了发根土壤杆菌质粒pRiA₄，ATCC登录号为43056)。用HPLC证实了毛根中产生有感兴趣化合物。如下进行毛根的诱导。首先，从Tucson，Arizona田野生长的植物中收集胜利金合欢种子。将沸水倾倒在这些种子上，当水冷却后浸泡过夜且在15％商品漂白剂中漂洗30分钟消毒。无菌水重复洗涤后，在250ml锥形瓶中，用50ml补充有MS维生素和2％蔗糖的液体MS培养基(Murashige和Skoog，1962)培育种子。维持该培养物在生长室的旋转摇床上，25±2℃，暗处。培育4天后，从发芽的幼苗上切下胚芽轴，用于农业感染。

在农业感染前，将发根土壤杆菌菌株R1000在YENB培养基上培养过夜。加入7.5g/L酵母提取物和8g/L营养肉汁(Difco Laboratories，Detroit，MI)制备YENB培养基。用事先沾过细菌溶液的细不锈钢针感染外植体的胚芽轴。感染后，将一滴细菌悬液(以1∶20用MS培养基配制)置于外植体的表面。然后将外植体转移到MS培养基和含有乙酰丁香酮(100μM)(3，5二甲氧基-4羟基-乙酰苯，AldrichChem.Co，Milwaukee，WI)的MS培养基进行共培养。在暗处进行共培养3天。共培养3天后，将外植体转移到MS+氨噻肟头孢菌素(500mg/L，Agri-Bio，NorthMiami，F1)上来控制细菌过度生长。在3-4周时间内观察到根萌生大部分位于胚芽轴的新生树叶的感染部位。4周后，将外植体和根移到单MS培养基上，继续暗培养使发根发育。在此后的8周，观察到毛根的发育。通过在MS培养基上的亚培养，常规地繁殖了发根。用一系列引物扩增rol B基因的一部分进行PCR^TM证实了毛根的转基因性质。以下为所用的引物：

1)5’GAGGGGATCCGATTTGCTTTTG3’[SEQ ID NO：7]

2)5’CTGATCAGGCCCCGAGAGTC3’[SEQ ID NO：8]

50μl PCR^TM反应混合物含有引物(1μM终浓度)、Taq聚合酶(1.0U)、125μM的各种dNTP、1X PCR^TM反应缓冲液，1.5mM MgCl₂、300ng分离的DNA。所用的PCR^TM条件是92℃初始变性5分钟，随后是35轮92℃50秒，55℃退火1分钟，72℃1.5分钟延伸和72℃7分钟的终延伸。扩增得645bp的片段。

在液体培养基中培养毛根：为了优化生长条件，切下在半固体MS培养基上生长的毛根，在含有液体MS培养基的不同容量的烧瓶(125、250、500和1000ml)中培养，分别含有20、50、100和400ml培养基。初始毛根接种量为6gm/L。还在以下基本培养基中测毛根的生长：MS、Nitsch和Nitsch(N和N)(1969)、Schenk和Hilderbrandt(SH)(1972)和木本植物培养基(WPM)(Lloyd和McCown，1981)。为了测试不同碳源对毛根生长的效果，将以下物质加入到MS培养基中，分别以2％(v/v)：蔗糖、葡萄糖、果糖和甘露糖。测试了赤霉酸(0.1、0.5和1mg/L)对毛根生长的作用，通过在高压灭菌后加入无菌过滤的赤霉酸溶液到MS培养基。

3-4周内观察到在感染部位萌生了根。存在乙酰丁香酮(100μM)时，从用R1000菌株感染的胚芽轴建立了四个独立转化的毛根克隆。用发根土壤杆菌而无乙酰丁香酮共培养的胚芽轴不能发育出毛根。存在乙酰丁香酮共培养三天发现对毛根的诱导最佳。已有报道关于在丹参(Salvia militiorrhiza)(Hu和Alfermann，1993)中乙酰丁香酮的促进作用。该结果显示乙酰丁香酮(一种土壤杆菌vir基因的激活剂)提高了转化频率。类似地，在本研究中需要乙酰丁香酮来诱导毛根。

用一系列引物扩增rol B基因的一部分进行PCR^TM扩增，证实了根的转化性质。在测试的四个毛根克隆中扩增了645bp的诊断片段。

在液体培养基中生长的毛根发育得很旺盛。在测试的不同基础培养基中，发现MS培养基是最适合毛根生长的。在125ml烧瓶中，4周内增加了268倍。用WPM培养基和N与N培养基，分别增加了254和196倍。B₅和SH培养基不适合毛根的最佳生长。在这两个培养基上，毛根缓慢地开始褐变。在一研究中，毛根在分别含有20、50、100和400mL MS培养基的不同容量的烧瓶(125、250、500和1000mL)中生长。表53中小结了其生长动力学。最初，毛根生长旺盛，初始为的150mg接种量，在四周内在125ml烧瓶中增加了25.77倍。当烧瓶的容量增加时，根的生长略有减少。

毛根的生长对培养基的成分是敏感的，特别是无机离子和碳源(Wysokinska和Chmiel，1997)。对于胜利金合欢，测试了五种不同的基本培养基(MS、N和N、SH、WPM和B₅)对毛根生长的效果。发现MS培养基最适于生长。Sasaki等人(1998)比较了在不同营养培养基上毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii)毛根的生长，发现WPM最适于毛根的生长。

在本研究中，与其它碳源(果糖、葡萄糖和甘露糖)相比，蔗糖最适于毛根的生长。在含蔗糖的培养基中发现最大生长(增加了24.52倍)。含有葡萄糖的培养基略微抑制了生长，而甘露糖完全抑制了生长(表54)。对于长春花，用果糖作为培养基的碳源可产生两倍的长春花碱。然而，有作者已报道，与蔗糖相比，用果糖将导致生长减少约40％(Jung等1992)。

毛根无需添加外源生长调节剂来维持持续的生长，因为在Ri质粒中存在增加对生长素的敏感性的基因(Wysokinska和Chmiel，1997)。然而，也有文献报道外源激素可刺激生长。本发明者测试了赤霉酸(0.1、0.5和1.0mg/L)对毛根生长的作用。与含有GA₃的培养基相比，毛根在没有GA₃的培养基中生长最好(增加了15.77倍)。不同水平的GA₃对生长的影响不明显(表55)。在艾属植物中，GA₃不提高总生物量的堆积，但与在无GA₃的培养基上培养物生长相比，其促进迅速达到稳定期(Smith等人，1977)。Rhodes等人(1994)发现Brassica candida毛根对GA₃的反应大部分取决于测试的克隆。然而，他们观察到，一般GA₃对生长起积极作用，减少生物碱的堆积，并伴随生产形式的改变。Ohkawa等人(1989)报道，浓度为10ng/L和1mg/L的GA₃加速了生长，提高了植株的延伸，和增加了毛曼陀罗毛根的侧枝生长。Zobel(1989)提出，GA₃以根生长的CO₂同类物起作用。对于胜利金合欢的毛根，GA₃不能提高其生长，这可能表明对各种基因型的不同反应。

用胜利金合欢毛根培养物可提供适合的方法来统一培养植物组织，从中可分离出本发明的三萜糖苷组合物，包括分离的混合物和单个纯化的化合物。

表51：发根土壤杆菌菌株R1000感染胜利金合欢的胚芽轴来产生毛根

    处理        ^*共培育的   感染的    发育出根的    有毛根形态学

                   介质      胚轴数     外植块^a数     的根数

对照               MS          20          ---           ---

(未感染的)

                   MS+Aceto.   21          ----          ---

感染的             MS          33          5(15)

                   MS+Aceto    38          9(23)       4(17.3)

*在高压灭菌后将乙酰丁香酮(100μM)加入到MS培养基中来共培养

^a括号内的数字代表百分比。

        表52：不同尺寸的烧瓶对胜利金合欢毛根生长的作用

          烧瓶    初始新鲜的重   4周后新鲜的    增加的

          尺寸         量            重量        倍数

          (mL)        (mg)           (mg)^a

          125          150        3866±0.569    25.77

          250          300        6903+0.344     23.01

          500         1200        11817±0.998    9.84

          1000        2400        40080±3.479   16.70

^a数据代表6次重复的平均值±S.E.，125、250、500和1000mL容量的烧瓶分别含有25、50、100和400mL MS培养基。

    表53：不同的基础培养基和烧瓶尺寸对胜利金合欢毛根生长的作用

    介质^a       烧瓶尺寸^b    初始新鲜重量     4周后新鲜重量    增加倍数

                   (mL)            (mg)              (mg)

    MS             125              10               2681          268

    B₅            125              10               1933          193

    N和N           125              10               196           196

    SH             125              10               170           170

    WPM            125              10               2549          254

    MS             250              300              751           25

    B₅            250              300              57            19

    N和N           250              300              591           19.7

    SH             250              300              54            18

    WPM            250              300              659           21

^aMS＝Murashige和Skoog；B₅＝Gamborg’s；N和N＝Nitsh和Nitsch；SH＝Schenk和Hilderbrandt；WPM＝木本植物培养基。^b125和250mL烧瓶含有25和50mL培养基。

表54：MS培养基中的各种不同的碳源对胜利金合欢毛根生长的作用

  碳源^a         4周后的新鲜重量           增加倍数

  (2％W/V)            (gm)^b

  蔗糖             7.356+0.543^c            24.52

  葡萄糖           2.87+0.53                9.56

  果糖             5.85+1.55                19.5

  甘露糖           0.305+0.065              1.01

^a2％(w/v)，^b每次处理的初始F.W.为300mg。^c数据代表6次重复的平均值±S.E.。

    表55：GA₃对胜利金合欢毛根生长的作用

    GA₃        4周后^a的新鲜重量      增加倍数

    (mg/L)            (gm)

    0            6.512+1.569^b          21.70

    0.1          4.732+0.086            15.77

    0.5          4.634+0.088            15.44

    1            4.310+0.344            15.44

^a每次处理的F.W.为300mg。^b数据代表6次重复的平均值±S.E.。

测试了用于毛根生长的不同培养基。在含有2％蔗糖的MS培养基上得到了最好的生长。测试了不同容量的烧瓶和赤霉酸对毛根生长的作用。也在旋转摇床上用含有20ml培养基的125ml锥形烧瓶，测试了在MS液体培养基上毛根的生长。观察到4周内生长增加了84倍。用标准可靠的样品作HPLC分析，证实了产生的三萜皂苷相应于在F035中鉴定出的那些三萜皂苷。

                            实施例46

单萜组合物通过同时抑制核转位和与Dna结合的能力，抑制NF-κB的活化

分析F035和单萜糖苷G1对Jurkat细胞中肿瘤坏死因子(TNF)诱导的NF-κB活化的作用，以鉴定核转录因子-κB(NF-κB)在单萜糖苷诱导的致癌作用抑制中所起的作用。NF-κB是炎症的主要调节剂之一，控制与炎症有关的几种基因的转录。

已发现，进行F035治疗时，自由基导致的DNA损伤减少，这表明F035具有抗氧化功能。该发现与早期的研究，即反应性氧簇(ROS)水平在用单萜糖苷处理的细胞的线粒体中减少这一发现是相关的。ROS水平的提高是几种导致NF-κB活化的原因之一。对此，本发明的一个方面涉及通过对所需的细胞施用本发明的化合物，保护线粒体不受氧化压力。

方法

细胞培养。使Jurkat和RAW 264.7细胞在补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和0.05％庆大霉素的RPMI-1640培养基中生长。

用单萜糖苷治疗细胞。将Jurkat细胞以1×10⁶/ml置于完全培养基中，用2μg/ml F094、单萜/三萜糖苷D1、或单萜/三萜糖苷G1 37℃处理8-16小时。在治疗终点，用完全培养基洗涤细胞并计数。将相等数目的活细胞用于不同的实验。

细胞质和核提取物的制备。37℃将经F094或分离的单萜/三萜糖苷G1和/或D1处理的Jurkat细胞(2×10⁶/ml)暴露于TNF中(1nM，15分钟)。在用冷PBS洗涤细胞后，将其悬浮在冰上的0.4ml胞质提取缓冲液(10mM HEPES，pH7.9，10mMKCl，0.1mM EDTA，0.1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、2μg/ml亮肽素、2μg/ml抗蛋白酶肽、0.5mg/ml苯甲脒)中15分钟。最后在细胞中加入12.5微升10％Nonidet P-40(NP-40)裂解细胞，离心收集胞质提取物。接着，在核沉淀中加入25微升冷的核提取缓冲液(20mM HEPES，pH7.9，0.4M NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，1mM PMSF，2μg/ml亮肽素，2μg/ml抗蛋白酶肽，0.5mg/ml苯甲脒)，并在冰上培育30分钟。4℃离心5分钟，收集核提取物。

电泳迁移率漂移试验(EMSA)。37℃将4微克核提取物与16fmol ³²P-末端标记的45-聚体双链NF-κB寡核苷酸一起培育15分钟培育，该寡核苷酸来自HIV长末端重复：

5′-TTGTTACAAG GGACTTTCCGCTG GGGACTTTCCAGGGAGGCGTGG-3′(下划线表示NF-κB结合位点)。培育培育培养混合物在结合缓冲液(25mM HEPES，pH7.9，0.5mM EDTA，0.5mM DTT，1％NP-40，5％甘油，50mM NaCl)中含有3微克聚(dI：dC)。在7.5％聚丙烯酰胺凝胶上将DNA-蛋白质复合物与游离寡核苷酸分离开。通过与双链突变寡核苷酸、未标记的寡核苷酸竞争，和通过用抗-p65抗体使条带超漂移，检测NF-κB-DNA结合的特异性。在PhosphoImager(MolecularDynamics，Sunnyvale，CA)上显示干燥凝胶上的放射性条带，并用ImageQuant软件定量。

蛋白质印迹分析。用单萜/三萜G1处理过的Jurkat细胞的胞质和核提取物分别研究IκB的降解和NF-κB的p65亚基的核转位。然后，在9％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分辨50微克胞质或核蛋白，并电转移到硝酸纤维素膜上。用家兔抗-IκBα或家兔抗-p65抗体(Santa Cruz，CA)，然后用与辣根过氧化物酶(HRPO)偶联的抗家兔抗体探测膜。通过化学发光检测蛋白质条带(ECL，Amersham)。

荧光酶活性的转染和测试。用pGL3-NF-κB通过电穿孔转染Jurkat细胞。然后用单萜/三萜糖苷G1(1μg/ml)处理细胞16小时。用LPS(100ng/ml)、PMA(5ng/ml)或TNF(1nM)活化NF-κB。用荧光酶测试试剂盒(Promega，Madison，WI)按照厂商说明书测定荧光酶活性。

iNOS和COX-2的诱导和测定。将RAW 264.7细胞(0.5×10⁶/ml)铺在100mm培养皿中，并用F094或单萜/三萜糖苷(2μg/ml)处理16小时。接着，使细胞接触100ng/ml LPS 24小时。在含有50mM Tris，pH7.4，100mM NaCl，0.5％NP-40，10μg/ml亮肽素，5μg/ml抗蛋白酶肽和100μM PMSF的缓冲液中裂解细胞。然后将70微克细胞蛋白质加到7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，并电转移到硝酸纤维素膜上。用蛋白质印迹分析，利用家兔抗-iNOS(Santa Cruz)和山羊抗-COX-2抗体分别分析iNOS和COX-2的水平。

结果

单萜糖苷的混合物，例如三萜皂苷和三萜糖苷G1以时间和剂量依赖性方式抑制TNF诱导的NF-κB。图51A用电泳迁移率漂移试验，显示了F035和单萜/三萜糖苷G1对Jurkat细胞中TNF诱导的NF-κB的时间依赖性作用。在两种情况下，在处理后16小时见到最大抑制。单独用F035或单萜/三萜糖苷G1处理细胞不同时间，不影响这些细胞中的NF-κB基线水平(图51A)。先前的实施例显示，通过混合物或纯单萜/三萜皂苷诱导的导致凋亡的不同过程，是在处理后30分钟到2小时就开始的。为了确定细胞凋亡不引起观察到的NF-κB活化的减少，在处理结束时对细胞进行计数，用等量活细胞研究TNF-诱导的NF-κB活化。另外，用zVAD-fmk，一种天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的广谱细胞可渗透不可逆抑制剂处理细胞，不影响活化的NF-κB水平的抑制。因此，该抑制不依赖于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性。发现单萜/三萜糖苷G1比单萜/三萜皂苷混合物更强。

用单萜/三萜糖苷G1处理16小时，以剂量依赖方式抑制TNF-诱导的NF-κB活化。用0.5μg/ml单萜/三萜糖苷G处理Jurkat细胞16小时，显示TNF-诱导的NF-κB减少50％，对于用2μg/ml处理的jurkat细胞显示几乎完全抑制(图52A)。单萜/三萜糖苷G1本身对于NF-κB在这些细胞中的组成型水平没有影响(图52A)。滞后的条带可以与未标记的寡核苷酸竞争，并被抗-p65抗体超漂移，都证明NF-κB的特异性(图51B)。

单萜/三萜糖苷不抑制IκB的降解但抑制NF-κB的p65亚基的核转位。NF-κB的活化涉及两个重要步骤：(1)释放抑制性IκB亚基，和(2)活化的NF-κB的核转位。为了阐明单萜/三萜糖苷G1对于这两个步骤之一或两者的作用，使未处理的和单萜/三萜糖苷G1处理的Jurkat细胞接触TNF不同的时间。蛋白质印迹分析细胞质提取物研究了IκB降解的动力学。如图53A所示，在用单萜/三萜糖苷G1处理后，没有见到IκB降解的情况有差异。NF-κB的p65亚基在未处理和单萜/三萜糖苷G-处理的细胞的核提取物中的出现证明(图53B)，单萜/三萜糖苷G1处理使得p65亚基的核转位显著变慢。条带的密度分析肯定了单萜/三萜糖苷G处理后，转位进入核的p65量减少。

单萜/三萜糖苷G抑制NF-κB-DNA结合。由于单萜/三萜糖苷G1不完全阻断NF-κ B的p65亚基的核转位，发明人考虑单萜/三萜糖苷G1可能以一种以上的途径影响NF-κB活化。因此，发明人在无细胞系统中分析了单萜/三萜糖苷G1对于活性NF-κB与DNA结合的能力的影响。将来自TNF-刺激的细胞的核提取物与递增浓度的单萜/三萜糖苷G1结合。单萜/三萜糖苷G1以剂量依赖性方式抑制NF-κB与DNA的结合(图54A)。已知去氧胆酸盐(DOC)使NF-κB与IκB分离，因此使其能够以活性核形式存在。在用DOC(0.8％)处理后，单萜/三萜糖苷G1处理过的细胞的胞质提取物显示，与未处理的细胞的提取物相比，DNA结合减少(图54B)。由于IκBα降解没有影响，这些结果显示单萜/三萜糖苷G1修饰NF-κB，使其不与DNA结合。

用100μM DTT处理Jurkat细胞，2小时后，用单萜/三萜糖苷G(2微克/ml 8小时)处理，以测试单萜/三萜糖苷G1的作用是否与半胱氨酸残基上的游离巯基的不可逆烷基化有关。然后使细胞如上所述接触TNF。如图54C所示，DTT不改变NF-κB的TNF-诱导的活化；相反，它逆转单萜/三萜糖苷G1的作用。这些结果显示单萜/三萜糖苷G1通过影响TNF-诱导的NF-κB活化所需的关键巯基，来介导其作用。

单萜/三萜糖苷G1抑制NF-κB依赖性基因表达。为了确定单萜/三萜糖苷G对NF-κB依赖性基因表达的作用，使用了荧光酶报道基因pGL3，它具有与其连结的来自IL-2启动子的NF-κB元件。用LPS、PMA或TNF处理被pGL3-NF-κB瞬时转染的Jurkat细胞，来诱导荧光素酶的活性。用F094或单萜/三萜糖苷G1预处理转染的细胞，明显抑制不同药物诱导的荧光素酶活性(图55A)。

还分析了F094和单萜/三萜糖苷G1对iNOS和COX-2的诱导，NF-κB调节的表达的影响。在RAW264.7细胞中，响应LPS处理诱导了iNOS和COX-2的显著水平。用F094或单萜/三萜糖苷G1预处理细胞大大降低了LPS-诱导的iNOS和COX-2水平(图55B)。

讨论

癌症预防的主要挑战之一，是开发对正常细胞和组织几乎没有或没有影响的有效新药。致癌作用是多步过程，炎症是其中一个组成部分(Sporn等，1986；Ohshima等，1994)。与致癌作用有关的炎症机制受到了广泛研究，也对利用这些机制作为开发新化疗剂的基础作了尝试。早先报道了三萜的消炎作用(Singh等，1992；D’arcy等，1957；和Kim等)。由于小鼠中的皮肤致癌作用研究(实施例11所述)显示了F035能消炎，分析了单萜/三萜糖苷对炎症调节剂NF-κB的作用。

本文显示了混合物或纯单萜/三萜糖苷都是TNF-诱导的NF-κB的强抑制剂。用单萜/三萜糖苷处理Jurkat细胞导致NF-p65的p65亚基更慢转入核，而IκB的降解不受影响。单萜/三萜糖苷还损害NF-κB与DNA的结合，如体外结合试验证明。去氧胆酸盐(DOC)可诱导的NF-κB的水平在单萜/三萜糖苷G1-处理的细胞胞质中降低。用二硫苏糖醇(DTT)处理细胞完全逆转了单萜/三萜糖苷G1诱导的NF-κB活性的抑制，表明影响对NF-κB活性关键的巯基。对Jurkat细胞中NF-κB调节的基因中一些的表达的研究揭示，单萜/三萜糖苷G1处理大大减少了荧光酶和LPS-诱导的氧化氮合成(iNOS)和环氧化酶(COX)-2的水平。有效抑制NF-κB活化的能力，和减少与炎症途径有关的疾病表达的能力受到NF-κ B的控制，解释了单萜/三萜糖苷的体内消炎作用。

NF-κB对于涉及免疫应答、炎症和感染的几种基因，例如白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)和粘着分子的表达是关键的(Bauerle，P.A.等，1977a；1977b；1994)。单萜/三萜糖苷F035、F094、单萜/三萜糖苷D1和单萜/三萜糖苷G1都被发现在Jurkat细胞中是TNF-诱导的NF-κB活化的强抑制剂。单萜/三萜糖苷G1对NF-κB的抑制是剂量和时间依赖性的。NF-κB的广泛作用受到抑制剂和辅助活化剂复杂的网络调节。炎症细胞因子、有丝分裂原、细菌产物或氧化压力对NF-κB的活化需要降解IκBα，它使胞质中的NF-κB处于休眠的复合状态。在IκBα降解滞后，NF-κB从复合物中释放出来，转位入核，在那与DNA结合并活化不同基因。本发明人证明，虽然本发明的单萜/三萜糖苷不影响IκBα的降解，但是它们抑制NF-κB转位入核。体外DNA结合研究显示，本发明的单萜/三萜糖苷还抑制NF-κB与DNA结合。另外，单萜/三萜糖苷G1抑制去氧胆酸盐诱导的NF-κB在体外与DNA结合。该发现表明，NF-κB不从复合物上分解，或其DNA结合性质被改变。NF-κB的单萜/三萜糖苷依赖性抑制被DTT逆转，表明单萜/三萜糖苷修饰了对于NF-κB活化关键的一个或多个巯基。

在炎症中起作用的几种NF-κB蛋白质中，iNOS和COX-2已被深入研究。这两种酶都是响应各种细胞因子(例如干扰素γ)、有丝分裂原、或微生物产物(例如脂多糖)而被诱导的。它们是炎症应答、损伤修复和致癌作用的必要成分(Moncada等，1991；Anggard等，1994；Serbert等，1994)。COX-2在一些结肠癌细胞的生长中起到作用，因为它能够通过刺激血管生成作为肿瘤启动子。iNOS或COX-2的过度表达显示了与几种慢性疾病，例如结肠癌(Oshima等，1994；&Takahashi等，1997)、多发性硬化(Hooper等，1997)、帕金森症(Hantraye等，1996)和阿尔茨海默氏病(Goodwin等，1995)的病理发生有关。积极搜寻了选择性抑制这些酶的可诱导形式，但不影响其组成型同工型的药物。如本文所示，用单萜/三萜糖苷G1处理RAW264.7细胞导致LPS-诱导的iNOS和COX-2水平急剧下降。

因此，本发明人在本文中证明，单萜/三萜糖苷能消炎。响应促炎症剂，例如TNF或LPS，它们显著抑制NF-κB的活性和iNOS和COX-2的表达，它们在炎症过程中起了关键作用。该抑制活性及其诱导肿瘤细胞的凋亡的能力提供了含有本发明单萜/三萜糖苷的治疗剂，用于癌症和/或其它具有炎症的慢性疾病。

                             实施例47

               单萜/三萜糖苷诱导通过线粒体微扰的凋亡

在此描述了将单萜/三萜糖苷的混合物纯化成两种生物学上的纯组分，含有金合欢酸核心和两个通过奎诺糖连结的非环单萜。来自F094的两种活性单萜/三萜皂苷的纯化和结构，被称为金合欢素D和金合欢素G(胜利金合欢三萜皂苷)。分析这些药物对于肿瘤细胞生长抑制的机制，显示线粒体是金合欢素促凋亡功能的主要目标。

方法：

金合欢素的纯化。在20％MeOH中60℃抽提胜利金合欢的研磨豆荚。提取物的溶剂/溶剂分配将生物活性浓缩在一个极性组分(F094)中。利用乙腈和酸化的水梯度洗脱程序，在C-18反相MetaChem Intensil柱(3μ，4.6×150mm)上HPLC分析该组分(图56A)，显示是非常复杂的化合物的混合物。在C-18反相半制备级HPLC柱上对该抽提物进行初始亚分级分离，并进行随后的生物实验，结果表明，在单萜/三萜糖苷D1和G1周围区域含有最高的活性。这些化合物的分离是通过两步制备级HPLC，用五氟苯基柱(50×250mm，10μm，ES Industries)实现的，使用水相甲醇溶剂系统。

细胞培养。Jurkat细胞在补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和0.05％庆大霉素的RPMI-1640中生长。对于所有处理，细胞是1×10⁶/ml。

生长抑制的试验。用MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴]还原试验(Deng等，1999)测定F094和金合欢素的生长抑制作用。37℃，使细胞(1×10⁴/孔)与各种浓度的F094、金合欢素D或金合欢素G在96孔板中培养72小时。用MTT染色细胞2小时，然后与裂解缓冲液(20％十二烷基磺酸钠和50％N，N-二甲基甲酰胺)一起培育培育另外6小时。用570nm的光密度作为细胞存活率的量度。

膜联蛋白V-FITC结合试验。通过膜联蛋白V-FITC结合试验，研究了凋亡的诱导。用2μg/mlF094、金合欢素D或金合欢素G在37℃处理Jurkat细胞(1×10⁶)。在用冷PBS洗涤细胞后，将它们重悬浮在结合缓冲液(10mM HEPES/NaOH、140mMNaCl、2mM CaCl₂)中。加入膜联蛋白V-FITC偶联物(Bio Whittaker，Walkersville，MD)(1μg/ml)，在室温下避光培育15分钟。然后用碘化丙锭(5μg/ml)染色细胞，用流式细胞计数分析(Hansen等，1989)。

线粒体释放的染色体的检测。用蛋白质印迹分析检测线粒体对细胞色素c的释放。用F094、金合欢素D或金合欢素G(2μg/ml)在37℃处理Jurkat细胞(1×10⁷)。在蔗糖缓冲液(0.25M蔗糖，30mM Tris，pH7.7，1mM EDTA)中洗涤细胞沉淀后，将其重悬浮在20微升含有1μM PMSF，1μg/ml亮肽素，1μg/ml胃酶抑素和1μg/ml抑酶肽的的蔗糖缓冲液中。在0.3ml Kontes匀浆器(Kontes GlassCompany，Vineland，NJ)中用B研棒匀浆120次，破碎细胞。在15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分辨细胞蛋白(50微克)，电转移到硝基纤维素膜上。用单克隆抗-细胞色素c抗体(Pharmingen，San Diego，CA)，然后用与辣根过氧化物酶(HRPO)偶联的抗小鼠抗体探测膜。用化学发光探测蛋白质条带(ECL，Amersham)。

亚线粒体组分的分离。将Jurkat(1.5-2.0×10⁷)悬浮在1ml蔗糖缓冲液(250mM蔗糖溶于30mMTris-HCl，pH7.4)中，转移到N₂空化室(cavitation chamber)(PARRInstruments Company，Moline，IL)中。按照厂商说明书，细胞进行N₂空化(300psi，5分钟)。在这些条件下大部分细胞膜被破坏，而不改变线粒体呼吸活性。接着，离心(1500g，30秒)除去DNA和核组分，上清液再次离心(16000g，10分钟)，用沉淀作为亚线粒体组分。

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3蛋白酶试验。如前所述测定天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的活性(Martin等，1995)，稍作修改。简单说，用F094、金合欢素D或金合欢素G(2μg/ml)37℃处理Jurkat细胞(1×10⁶)。通过重复将细胞冻融于300微升提取缓冲液(12.5mM Tris，pH7.0，1mM DTT，0.125mM EDTA，5％甘油，1-PMSF，1μg/ml亮肽素，1μg/ml胃酶抑素和1μg/ml抑酶肽)中，制备了细胞质体提取物。将细胞裂解物用ICE缓冲液(50mM Tris，pH7.0，0.5mM EDTA，4mM DTT和20％甘油)1∶2稀释，并与20μM天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3底物(乙酰基-Asp-Glu-Val-Asp-氨基甲基香豆素)(Calbiochem，La Jolla，CA)在37℃一起培育。通过用Fluoroscan II(Labsystems，Helsinki，Finland)，由在355nm激发，在460nm发射测定的荧光氨基甲基香豆素的产生监测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的活性。

PARP降解的免疫印迹分析。还通过蛋白酶解切割PARP检测了凋亡的诱导(Nicholson和Thomberry，1997)。用2μg/ml F094、金合欢素D或金合欢素G在37℃处理Jurkat细胞(3×10⁶)。在含有20mM HEPES，250mM NaCl，2mM EDTA，0.1％NP-40，2μg/ml亮肽素，2μg/ml抑酶肽，0.5μg/ml苯甲脒，1mM DTT和1mMPMSF的缓冲液中制备细胞裂解液。在7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离细胞蛋白(60微克/毫升)，并电转移到硝基纤维素膜上。首先用单克隆抗-PARP抗体(Pharmingen)探测膜，然后用与辣根过氧化物酶(HRPO)偶联的抗-小鼠抗体探测。通过化学发光(ECL)检测蛋白质条带。用85kDa切割产物的出现作为凋亡的量度。

线粒体膜电势的测定(Δψ_m)。如Zamzami等，1995所述测定了线粒体Δψ_m。在用F094、金合欢素D、或金合欢素G(2μg/ml)37℃处理后，将Jurkat细胞与80nMDiOC6在室温下培育15分钟。然后将其在细胞荧光计(Facsalibar，激发：488nm和发射：522nm)上分析。

反应性氧簇(ROS)产生试验。用氧化敏感性荧光染料二乙酸5，6-羧基-2′，7′-二氯氢化荧光素(DCFH-DA)(Molecular Probes，Eugene，OR)，通过先前描述的方法(Zamzami等，1995)估计ROS的产生。用F094、金合欢素D或金合欢素G(2μg/ml)在含有20mM HEPES，10mM D-葡萄糖，127mM NaCl，5.5mM KCl，1mM CaCl₂和2mM MgSO₄(pH7.4)的Krebs-Ringer缓冲液中处理接种于96孔板的Jurkat细胞(5×10⁴细胞/孔)。以5g/ml的量将DCFH-DA加到各孔中。未处理的细胞仅接受DCFH-DA。在485nm激发细胞，在装有温度控制的Fluoroskan II ELISA平板阅读机(Labsystems，Helsinki，Finland)中，在538nm波长每隔2分钟测定荧光，直到2.5小时。在线性范围内测定荧光。

结果

化学分析阐明了金合欢素D和金合欢素G的结构。F094的主要成分，即分离出的金合欢素D是无色无定形的固体。其分子量在MALDI质谱仪上是2104amu，是2081的钠加合物。高解析FAB质谱仪得到分子式C₉₈H₁₅₅NO₄₆，因此确定了2081的分子量。金合欢素D的质子核磁共振(NMR)分析揭示，它是具有侧链的皂苷，该侧链含有两个单元的非环单萜、反式-2-羟甲基-6-甲基-6-羟基-2，7-十八烷酸(octadienoic acid)，通过奎诺糖连结，并且与金合欢酸在碳21处结合。还在碳3具有三糖，在碳28具有四糖。在各种2D NMR实验和降解研究的帮助下，图56B描述了金合欢素D的结构。另一种F094中的活性成分金合欢素G是与金合欢素D非常相似的皂苷。其MALDI质谱分析得到2065的分子量。质子NMR表明与金合欢素D相似的侧链，但外侧单萜被反式-2，6-二甲基-6-羟基-2，7-十八烷酸替换，如图56B所示(R＝H)。

F094和单萜/三萜糖苷通过诱导凋亡抑制生长。发现F094和金合欢素抑制Jurkat细胞在培养物中生长。F094的抑制性浓度50(IC50)是0.331-0.407μg/ml，而金合欢素D和金合欢素G分别是0.320-0.326μg/ml和0.160-0.181μg/ml。相反，当在正常人成纤维细胞中测试时，F094和金合欢素的IC50值高10-35倍。为了理解生长抑制的机制，分析用F094或单萜/三萜糖苷处理的Jurkat细胞的膜联蛋白V-FITC结合。细胞同时用碘化丙锭染色，以检查其存活率。用全部三种制备物处理得到存活膜联蛋白V阳性细胞的时间依赖性增加(图57)。

F094和金合欢素导致线粒体释放细胞色素c。线粒体释放细胞色素c到胞质中似乎是导致凋亡的早期事件之一。F094处理的细胞显示，在处理后约4小时，细胞色素c的胞质水平增加(1.5倍)(图58)。金合欢素D处理的细胞胞质中细胞色素c的水平显示更快的增加。在30分钟内见到增加了1.5倍，4小时内增加了3倍。有趣的是，在单萜/三萜糖苷G-处理的细胞胞质中，见到细胞色素c水平在处理后30分钟剧烈增加(3.5倍)。在4小时时，见到细胞色素c水平增加了8.4倍(图58)。

为了观察单萜/三萜糖苷皂苷是否直接影响线粒体以诱导凋亡，用金合欢素G在无细胞系统中进行了实验。用N₂空化法从Jurkat细胞中分离了线粒体。用2微克/毫升金合欢素G处理该线粒体组分，导致在处理1分钟内细胞色素c随时间释放，在5-10分钟之间达到峰(图59A)。对该剂量应答的研究揭示，用0.5-2.0微克/毫升金合欢素G培育10分钟，金合欢素可实现大部分细胞色素c释放(图59B)。用DEVD-CH₂F(一种不可逆天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3抑制剂)或z-Val-Ala-Asp-CH2F(zVAD-fmk)(一种广谱细胞可渗透的、广谱特异性的不可逆天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂)预处理线粒体组分，不影响细胞色素c的释放，再次证明药物直接作用于线粒体。

F094和金合欢素诱导天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的活化。细胞色素c从线粒体释放入胞质，触发天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶级联的活化，这在各种细胞死亡途径是关键下游效应物。因此，分析了天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3在处理的Jurkat细胞中的状况。F094和金合欢素D-诱导的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的活化在处理后4-6小时和以后可检测(图60A)。然而，用金合欢素G，在处理后2-4个小时观察到天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的活性的提高。16小时时，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性下降到基线水平(图60A)。

PARP是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3下游目标之一，它由天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶蛋白酶解切割。F094和金合欢素都在处理后4小时诱导PARP切割(图60B)。用金合欢素G，在4小时时几乎完全切开，而用其与金合欢素D的混合物，完全切割需要8-16小时。用zVAD-fmk预处理细胞完全阻断PARP的切割(图60C)。

F094和金合欢素不影响线粒体膜电势(Δψ_w)。细胞色素c释放到胞质中通常在之前有或伴随有线粒体Δψ_w的下降。用F094、金合欢素D或金合欢素G处理Jurkat细胞达8小时，Δψ_w不产生任何显著变化。然而，更长的处理(16小时)诱导Δψ_w的显著下降(图61)。

F094和金合欢素减少反应性氧簇(ROS)的生产。大多数诱导凋亡的药物释放ROS，这是一种凋亡信号传递的关键介导物。然而，用单萜/三萜糖苷处理Jurkat细胞达2.5小时导致ROS的水平以剂量依赖方式而减少(图62)。该ROS水平的下降达到一个平台，而且在接触药物更长时间后也没有观察到进一步的改变(达24小时)。

讨论

真核细胞中的内环境稳定依赖于外部环境的存活和死亡信号的精细平衡(0ridate等，1997)。任何这些信号传递途径中的失常可使细胞生理受损。在癌症中，分裂的细胞不能在持续的DNA损伤后引发凋亡(Raff，M.C.，1997)。鉴定了几条导致凋亡的途径，包括p53的诱导(Raff，M.C.，1992)、神经酰胺的活化(Polyack等，1997)、CD95/CD95配体途径的刺激(Basu等，1998)和最近，线粒体内的信号途径(Hakem等，1998；Fujimura等，1999；Green等，1998；Fulda等，1998)。癌症化疗和预防的目的之一是鉴定新的药物，它能够通过影响一或多种这些促凋亡途径，选择性诱导肿瘤细胞中的凋亡。

本文所示的是在Jurkat人T细胞系中，用单萜/三萜皂苷和单萜/三萜糖苷混合物诱导凋亡是通过影响线粒体功能介导的。对信号转导系统的分析揭示，在处理后30分钟到2小时内释放细胞色素c。在无细胞系统中，金合欢素G诱导细胞色素c在处理后一分钟内释放。用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂DEVD或zVAD-fmk预处理对细胞色素c无作用，显示金合欢素G直接作用于线粒体，而与细胞色素c上游的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶无关。在细胞色素c释放后，在用金合欢素处理后2-6小时之间，产生金合欢素天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的活化，和聚(ADP-核糖)聚合酶(RARP)的切割。用zVAD-fmk预处理细胞完全阻断了PARP的切割。在处理过的细胞中，在细胞色素c释放前或同时，膜电势没有显著变化。还测量到反应性氧簇(ROS)稍有减少。因此，纯单萜/三萜皂苷(在一些植物和海洋生物中是作为防御分子的二级代谢物)干扰线粒体功能，从而诱导人肿瘤细胞的细胞死亡。

如先前实施例所述，从胜利金合欢分离的单萜/三萜糖苷皂苷混合物抑制各种人肿瘤细胞系的生长。PI-3-激酶信号传递途径的抑制是有关的一种机制。然而，在Jurkat细胞中，这些效果需要长期用单萜/三萜皂苷(16小时)处理，这段时间过于延迟，不能解释Jurkat细胞凋亡的很快开始。因此，本发明人不仅用单萜/三萜皂苷混合物，还用两种纯化的分子研究了线粒体的作用。用制备级HPLC将单萜/三萜皂苷混合物(F094)纯化成几种组分。用对Jurkat细胞的毒性作为监视指标，选择金合欢素D和金合欢素G这两种分子用于生物学特征确定。

开始凋亡的细胞将磷酯酰丝氨酸从胞质膜的内侧重新定向到其外侧小叶上。在该暴露条件下，它们可以与膜联蛋白V结合(Friensen等，1996)，该性质被用作凋亡的标记。用F094或金合欢素处理的Jurkat细胞在处理后4小时，开始显示膜联蛋白V阳性细胞随时间增加，表示这些细胞中诱导了凋亡。

引发凋亡的早期事件之一是细胞色素从线粒体释放到细胞液中(Schutte等，1998；Yang等，1997)。在处理过的Jurkat细胞的细胞液中，在30分钟(金合欢素D和金合欢素G)到4小时(F094)探测细胞色素c。一旦在细胞液中，细胞色素c就在dATP的存在下，与APAF-1和促天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-9结合，形成凋亡体(Kluck等，1997；Zou等，1997)。该复合物活化天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-9，它反过来切割从而活化天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3。在处理过的细胞中，线粒体释放细胞色素c后，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活化。该事件后紧接着PARP被切割，它是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的底物，一种116kDa DNA修复酶。PARP的切割使酶灭活，从而使DNA不可能被修复。

细胞色素c的释放可能是凋亡中的引发事件，或者是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活化的下游，例如在CD95(Fas)系统中发生的。后者依赖于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8的释放(Li等，1997)。在用zVAD-fmk(一种广谱天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂)预处理细胞后，可见到完全PARP的切割被完全阻断，但不影响细胞色素c的释放。这证明细胞色素c的释放是这些制剂对线粒体的直接作用，不依赖于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活化。为了确证这些结果，在无细胞系统中使用纯化的线粒体。在该系统中，金合欢素G以剂量和时间依赖的形式诱导细胞色素c释放，不受天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂DEVD-CH2F和zVAD-fmk的影响。

仍然不清楚细胞色素c(位于线粒体外膜和内膜之间)是如何转移到细胞液中。提出了几种理论。证明在凋亡和线粒体渗透性转变(PT)现象之间有很强的联系，后者是由于大导电率通道开放造成的，该通道的开放导致内膜去极化(Kuwana等，1988)。该去极化最终导致线粒体膨胀，外膜破裂和细胞色素c释放。还提出了在线粒体外膜中形成的、导致细胞色素c释放的特定通道(Petit等，1996)。最近，提出可释放细胞色素c，而不丧失跨膜电势，但在这种情况下内膜发生超极化(Manon等，1997)。在F094或金合欢素G处理的细胞中，细胞色素c释放之前或同时，没有线粒体内膜电势的改变。然而，处理16小时后，显示与报道一致的膜显著去极化，表明活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶直接诱导PT(VanderHerden等，1999)。为了进一步理解细胞色素c释放的机制，发明人考虑分析ATP/ADP交换和对F0F1-ATP酶质子泵作用的实验。

线粒体是反应性氧簇(ROS)的丰富来源，它是好氧性生存的有毒副产品，在各种信号转导途径，包括导致凋亡的那些中起着重要作用(Marzo等，1998；Korsmeyer，S.J.，1995；Buttke和Sandstorm，1994)。因此，研究了Jurkat细胞中ROS在用单萜/三萜糖苷处理后的水平。在用单萜/三萜糖苷处理后，观察到ROS产生的下降。一些报道表明ROS产生在细胞色素释放之前(Bredesen，D.E.，1995)，而另一些表明它可以是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶开始后的事件。在本发明中处理后达16个小时对ROS水平的连续观察显示，没有发现进一步的变化。

本发明人考虑在用金合欢素处理细胞后可能由于细胞通过将一些细胞色素c保留在线粒体内，或细胞甚至在凋亡开始后仍然维持糖平衡(glycolyticeven)，从而维持线粒体ATP水平，从而使ROS水平的下降。因此，ATP的维持可以延迟或抑制ROS的产生。还可能通过能量调节中的改变，直接或间接影响ROS水平，这些调节是例如(i)ATP/ADP交换中的失常(Manon等，1997)，(ii)细胞色素将超氧化物氧化成氧(Higuchi等，1998)，或(iii)通过天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶蛋白酶解D4-GDP-分解抑制剂(Skulachev，V.P.，1998)。其它解释可以是抗氧化物，例如还原的谷胱甘肽或超氧化物歧化酶水平的增加。

研究表明对于发现直接影响线粒体的化合物有日益增长的兴趣(Na等，1996；Ravagnan等，1999；Zamzami等，1998；Hirsch等，1998；Chen等，1998)。所有这些药物通过破坏膜电势或释放ROS诱导凋亡，提示线粒体内膜是主要目标。报道桦木酸，一种五环三萜，通过以CD95和p53非依赖性方式(Pisha等，1995)直接作用于线粒体，诱导神经外胚层肿瘤的凋亡(Bantel等，1999)。与三萜糖苷相反，桦木酸显示跨膜电势的下降，ROS水平上升，与细胞色素c从线粒体外膜释放一致(Pisha等，1995)。为什么三萜糖苷维持膜电势，并减少ROS，而与桦木酸的效果相反的确切化学原因仍然未知。桦木酸是一种简单的三萜化合物，具有非常有限的细胞类型特异性。另一方面，三萜糖苷显示了非常广的细胞特异性，含有作为核心三萜的疏水金合欢酸，还具有两个通过奎诺糖连结的非环单萜单元。金合欢素中的疏水性金合欢酸核心可能使其跨越膜，并影响线粒体，但剩余分子的特征可解释其生物化学作用及其与桦木酸的不同。

本发明人考虑切除金合欢素D和金合欢素G的部分，包括侧链和单个糖，以确定哪些组分对于促凋亡功能是关键的。三萜糖苷在结构上与先前从Archidendrom ellipticum中分离的鱼藤糖苷非常相似(Fulda等，1997)。然而，对单萜的NMR评估和手性研究都显示，在本文报道的皂苷和先前所述的作为抗肿瘤的皂苷中有微妙但显著的不同。

金合欢素是一类新的单萜/三萜皂苷，能在Jurkat细胞中不依赖于膜结合死亡受体影响线粒体功能，而诱导凋亡。这些化合物选择性诱导癌细胞的凋亡(例如杀死Jurkat细胞而不是正常的成纤维细胞)，而使其成为有用的化疗剂，因为它们没有杀死其它正常细胞的副作用。

癌蛋白使癌细胞对凋亡信号敏感，而这种途径是正常细胞能抵抗的(Harrington等，1994)。因此，金合欢素的作用是通过放大导致凋亡的早期信号传递事件。显示由AKT引起的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-9的磷酸化抑制其活性(Cardone等，1998)。通过抑制AKT的磷酸化作用，金合欢素可放大在细胞色素c释放后见到的促凋亡作用。近来，证明了APAF和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-9是p53诱导的基因的下游效应物(Soengas等，1999)。AKT磷酸化作用的抑制还可通过提高BAD与Bcl-xL的异二聚化，增强BAD的促凋亡功能(Gross等，1999)。另外，金合欢素还可以作为去污剂，来诱导Bax同二聚物的形成(Hsu等，1999)。由于它们对于线粒体的直接作用，本发明猜想金合欢素将克服由于p53基因突变引起的对凋亡的抗性。这是由本文所用的Jurkat细胞缺乏p53的事实证实的。因此，金合欢素能有效治疗抗性癌症，因为它们能代替丧失或突变的肿瘤抑制蛋白基因的功能。

                           实施例48

               表皮过度增生、炎症和p53突变的减轻

负责产生维生素D的UVB波长也引起DNA损伤，尤其是形成嘧啶二聚体和许多基因突变，也产生进一步损伤DNA的氧自由基。本实施例描述用单萜/三萜皂苷抑制UVB光导致的小鼠皮肤病变。本实施例还描述用于筛选UVB诱导的皮肤癌变的调节剂的新短期小鼠模型。

方法。用180mJ/cm²的UVB照射SKH-1无毛小鼠15分钟，每周5次，共10周。用表皮厚度、淋巴细胞侵袭、标记指数(用BrdU)、p53突变和8-OH-dG形成的终点评估处理的相对效果。在UVB照射15分钟前，在无毛SKH-1小鼠的背部皮肤上单独涂用F035或联合强抗氧化剂维生素E。

结果。单萜/三萜皂苷的混合物(F035)减少了对DNA碱基的损伤，也减少了p53突变。用5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)标记物测定的位于皮肤基底和超基底层中的周期内的细胞数目，在单独用维生素E处理的小鼠中减少了30％，在单独用F035处理的小鼠中减少了35％，在联合用维生素E和F035处理的小鼠中减少了55％。主要位于超基底层中的突变的p53阳性细胞，在辐射过程中用单萜/三萜皂苷和维生素E联合处理的小鼠，它们的这类细胞减少了60％和67％。因此，本发明的单萜/三萜皂苷减少表皮过度增生、炎症和p53突变。另外，本实施例提供了新的短期小鼠模型，它对于评估UVB诱导的皮肤癌变调节剂非常有用。

因此，发明人考虑了通过对个体施用含有本文所述的单萜/三萜糖苷组合物，预防p53突变的诱导的方法。可通过许多途径，例如全身性、局部性或区域性施用单萜/三萜糖苷组合物。特别是，它们可以通过静脉内、肌肉内、皮下、口腔或外用施用。因此，本发明提供了预防p53-诱导的癌症的方法。由于p53与许多癌症类型有关，发明人猜想施给人类的单萜/三萜糖苷组合物将提供针对各种癌症的预防性和可治愈的治疗。

本发明人还猜想了通过对个体施用本文所述的单萜/三萜糖苷组合物，预防/治疗紫外光诱导的癌症和前癌症病况的方法。例如，可用本文所述的单萜/三萜糖苷组合物预防前癌症病况例如光化性角化病、皮肤癌和癌。通过外用含有单萜/三萜糖苷组合物的霜、凝胶或软膏，预防紫外光诱导的皮肤病况。另外，本发明者考虑通过外用含有单萜/单萜糖苷组合物的防晒霜、洗液、霜、凝胶或软膏，预防由紫外光引起的皮肤病况。这些治疗组合物还可以含有额外的组分，例如维生素E。该方法还可以用于经受癌症前或癌症治疗的个人的其它治疗。

本文还提供了筛选UVB-诱导的皮肤致癌作用的调节剂的新小鼠模型。提供了SKH-1无毛小鼠，它是卓越的短期模型。可用UV辐照该小鼠，以诱导皮肤前癌和癌症病变。然后可在治疗前后，如所需用候选的调节剂化合物处理无毛小鼠的背部皮肤。然后可通过监测如表皮厚度、淋巴细胞侵袭、标记指数(例如用BrdU)、p53突变和8-OH-dG形成的端点之类的特征评估疗效。

根据本文所公开的内容，这里所公开的和申明的所有组合物和方法无需过多的实验即可进行和执行。本发明的组合物和方法是以优选实施例的形式描述的，本领域技术人员明白，对本文的组合物和方法和方法中的步骤或步骤的顺序作的改变，均不脱离本发明的构思、精神和范围。更具体地说，显然一些相关的化学和生理试剂可替代本文中的试剂，而得到相同或类似的结果。这些类似替代和修饰对本领域技术人员来说是显然易懂，如权利要求所述，都是在本发明的构思、精神和范围内的。

                            参考文献

以下的参考文献，它们向本文陈述的内容提供了示范性程序或其它详细补充，在这里全部引用作为参考。

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序列表

                                        序列表

<110>J.U.格特曼(GUTTERMAN，JORDAN U.)

     V.哈利德斯(HARIDAS，Valsala)

<120>用单萜组合物抑制NF-κB

<130>CLFR：009US

<140>未知

<141>2001-11-19

<150>60/322,859

<151>2001-09-17

<150>60/249,710

<151>2000-11-17

<160>9

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>1

agttgagggg actttcccag gctcaactcc cctgaaaggg tccg                44

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>2

ctaagcctgt tgttttgcag gac                                       23

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>3

catggcacta tactcttcta                                           20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>4

catggcacta tactcttctt                                           20

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>5

ccttggctaa gtgtgcttct cattgg                                    26

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>6

acagcccacc tctggcaggt agg                                       23

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>7

gaggggatcc gatttgcttt tg                                        22

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>8

ctgatcaggc cccgagagtc                                           20

<210>9

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成引物

<400>9

ttgttacaag ggactttccg ctggggactt tccagggagg ctgg                44

Claims (54)

1.一种抑制炎症的方法，其特征在于，该方法包括对细胞施用抑制NF-κB的单萜组合物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NF-κB被TNF诱导。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组合物还含有载体分子。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述载体分子是脂类。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述载体分子是膜可渗透性组分。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述载体分子是糖。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述载体分子是三萜分子。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单萜组合物还含有三萜分子。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单萜组合物还含有糖。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单萜组合物还含有第二种单萜分子。

11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述三萜分子具有式：

，或其异构体，其中：

a)R₁和R₂选自氢、C1-C5烷基、C1-C5链烯基、C1-C5烷基羰基、糖、寡糖；

b)其中R₃-R₃₆分别和独立选自不饱和的点、氢、羟基、C1-C5烷基、C1-C5链烯基、C1-C5烷基羰基、糖、C1-C5烷基酯和单萜基团；和

c)R₃-R₃₆至少之一是单萜基团。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，R₁和R₂分别是寡糖。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，R₁和R₂分别是单糖、二糖、三糖或四糖。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，R₁和R₂分别是寡糖，包括分别或选自葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、喹诺糖、麦芽糖、葡糖醛酸、核糖、N-乙酰基葡糖胺和半乳糖的糖。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，至少一种糖被甲基化。

16.如权利要求11所述的方法，其特征在于，R₄通过与三萜基团连接的亚甲基碳之一与三萜基团结合。

17.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述三萜基团还含有至少一个双键。

18.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述异构体是立体异构体。

19.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述异构体是光学异构体。

20.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述三萜基团是金合欢酸酯、石竹素酸酯、桦木酸酯、熊果酸酯、奎诺酸酯、坡摸酸酯、铁冬青酸酯、铁冬青酸酯、崩大碗酸、积雪草酸酯、优卡酸酯、季陵菜酸酯、羟基积雪草酸酯、羽扇豆酸酯、杯圆酸酯、莫利酸酯、茉莉酸酯  、刺囊酸酯、或过岗龙酸酯。

21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单萜分子具有式：

，或其异构体，其中：

a)R₃选自氢、羟基、C1-C5烷基、C1-C5链烯基、C1-C5烷基羰基、糖、和单萜基团；和

b)该式还包括R₄，R₄选自氢、羟基、C1-C5烷基、C1-C5链烯基、C1-C5烷基羰基、糖、C1-C5烷基酯和单萜基团。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述异构体是顺式异构体。

23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述异构体是反式异构体。

24.如权利要求21所述的方法，其特征在于，R₃是糖。

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，糖选自葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、奎诺糖、麦芽糖、葡糖醛酸、核糖、N-乙酰基葡糖胺和半乳糖。

26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，还包括与糖结合的单萜分子。

27.如权利要求21所述的方法，其特征在于，R₃具有式：

，其中R₅选自氢、羟基、C1-C5烷基、C1-C5链烯基、C1-C5烷基羰基、糖、C1-C5烷基酯和单萜基团。

28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，R₅是氢或羟基。

29.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述异构体是立体异构体。

30.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述异构体是光学异构体。

31.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述R₃具有式：

32.如权利要求21所述的方法，其特征在于，R₃具有式：

33.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组合物具有式：

，或其异构体，其中：

a)R₁和R₂选自氢、C1-C5烷基和寡糖；

b)R₃选自氢、羟基、C1-C5烷基、C1-C5链烯基、C1-C5烷基羰基、糖和单萜基团；和

c)式还含有R₄，其中R₄选自氢、羟基、C1-C5烷基、C1-C5链烯基、C1-C5烷基羰基、糖、C1-C5烷基酯、和单萜基团，其中R₄可以与三萜基团或单萜基团结合。

34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述异构体是立体异构体。

35.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述异构体是光学异构体。

36.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组合物具有式：

37.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组合物具有式：

38.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组合物具有式：

39.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当对所述细胞以约0.5-2.0微克/毫升的浓度施用所述组合物时，所述炎症应答被抑制。

40.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞在患有炎症性疾病的个体中。

41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述个体是人。

42.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述炎症性疾病选自恶化前炎症性疾病、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、骨关节炎、多发性硬化、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。

43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述恶化前炎症性疾病是Barretts食管炎、炎症性肠病、慢性胰腺炎、慢性前列腺炎、家族性息肉病或光化性角化病。

44.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组合物抑制COX-2。

45.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组合物抑制iNOS。

46.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述给药是局部的。

47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述给药是通过注射。

48.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述给药是外用的。

49.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述给药是全身性的。

50.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述给药是口腔的。

51.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组合物是在药物学可接受的介质中的药物组合物。

52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述药物学上可接受的介质是缓冲液、溶剂、稀释剂、惰性载体、油、霜或可食用物质。

53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述药物组合物还含有靶向剂。

54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述靶向剂指导所述药物组合物传递给发炎的细胞。

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