CN104250282A

CN104250282A - 薯蓣皂苷元氨基酸衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN104250282A
Application number: CN201410250801.3A
Authority: CN
Inventors: 何忠梅; 祝洪艳; 赵岩; 郜玉钢; 陈红岩; 李阔; 南敏伦; 徐冰芳
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2014-06-09
Filing date: 2014-06-09
Publication date: 2014-12-31

Abstract

本发明公开了薯蓣皂苷元作为先导化合物，经相应的化学反应制备了一系列氨基酸衍生物，溶解性考查发现衍生物的溶解性比原料药薯蓣皂苷元有所增加，经药理实验证明，薯蓣皂苷元的氨基酸衍生物具有体外抗肿瘤活性，对人结肠癌细胞Caco-2、人胃腺癌细胞MGC-709、人肺腺癌细胞SPC-A-1、人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y均有不同程度的生长抑制作用，抗肿瘤活性与母核化合物薯蓣皂苷元相当。

Description

薯蓣皂苷元氨基酸衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及薯蓣皂苷元的氨基酸衍生物的制备方法，确切的说是以从中药中提取分离出的原料药薯蓣皂苷元为先导化合物，制备一系列衍生物，以抗肿瘤活性为指标进行结构修饰，属于医药领域。

背景技术

薯蓣皂苷元（diosgenin）是一类甾体皂苷元，广泛存在于薯蓣科、百合科、石竹科、蔷薇科等植物，是多种植物的有效成分，也是合成甾体激素类药物的重要原料，具有抗肿瘤，降血脂，降血糖，抗血栓，抗炎等显著的药理活性，特别它的抗肿瘤作用更是引起了国内外学者的极大关注。

薯蓣皂苷元抗肿瘤机制研究已见很多报道，可能通过调节AKT、MAPK、NF-JB等通路,引起P53活化，增加COX、FAS等表达,发挥诱导肿瘤细胞凋亡或抗增殖活性。

我们在对薯蓣皂苷元进行药代动力学研究过程中发现：口服薯蓣皂苷元因为其强疏水性无法通过胃肠道生物膜进入血液而广泛分布于血管外组织中，如胃肠壁，生物利用度非常差，故只能选择消化道肿瘤为薯蓣皂苷元口服制剂的临床适应症。这不仅限制了薯蓣皂苷元制剂在临床上对其它肿瘤的使用，更限制了薯蓣皂苷元其它生理活性的临床应用。

口服药物在吸收之前必须先溶解于胃肠道消化液中，然后才能以被动扩散或主动转运等方式通过消化道粘膜，进入血液循环。难溶性药物在消化液中的溶出通常为其吸收的限速阶段。因此，提高薯蓣皂苷元及其制剂的溶解度和溶出速度成为改善其口服给药生物利用度的首要步骤。然而诸如超微粉碎技术、自微乳化技术、液固压缩技术等药剂学增溶手段只能在一定程度和范围内改善难溶性药物的溶解度，因此只有在药物设计阶段通过对其进行结构修饰与改造，才能大大提高药物的溶解度和溶出度。目前，常见的方法和手段主要是将有效成分通过与酸或碱生成盐、成酯、或进行化学结构修饰形成以共价键结合亲水性大分子的前体药物。通过这些途径均可增加难溶性药物的水溶性，有利于药物在胃肠道的吸收。吸收后的前体药物在体内通过水解或酶解等作用转化为原药而发挥疗效。然而，与酸或碱成盐的方法有很大局限性，只有具有酸性或碱性的成分才可以使用该方法；而且并不是一味的提高溶解度就可以提高生物利用度，有些难溶性药物尽管吸收缓慢，但生物利用度却很高，分析可能存在主动转运机制，如维生素类药物的吸收就属于需要载体、需要消耗能量的主动转运，它们往往具有较好的口服生物利用度。

氨基酸为一种两亲性化合物，引入到药物分子结构中，一方面可改善药物的溶解度；另一方面，氨基酸类化合物（寡肽）在小肠的吸收过程是耗能的主动转运过程，负责转运的载体主要是寡肽转运蛋白，因此，氨基酸类化合物（寡肽）的引入可能会加强药物的主动转运，促进药物的吸收，提高药物的口服生物利用度。

因此，本发明的目的在于对薯蓣皂苷元化合物进行结构改造，制备一系列衍生物，以期寻找口服生物利用度较高的衍生物。根据我国常见肿瘤发病疾病，选择了人结肠癌细胞Caco-2、人胃腺癌细胞MGC-709、人肺腺癌细胞SPC-A-1、人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y等四种肿瘤细胞进行体外活性筛选，从而进行药效学评价。

发明内容

本发明在于提供一种以薯蓣皂苷元为先导化合物合成一系列具有抗肿瘤作用的薯蓣皂苷元氨基酸衍生物。

本发明的目的是通过以下技术方案得以实现：

一种具有抗肿瘤活性的薯蓣皂苷元衍生物，其结构特征为：

其中：R位可以连不同氨基酸基，如L-苯丙氨酸基、L-丙氨酸基、L-缬氨酸基和L-脯氨酸基。其中衍生物L-缬氨酸薯蓣皂苷元酯为新化合物。如上所述的一种具有抗肿瘤活性的薯蓣皂苷元衍生物由以下方法得到：

1.N-BOC-L苯丙氨酸和薯蓣皂苷元反应合成N-BOC-L-苯丙氨酸薯蓣皂苷元酯，如下所示：

2.通过硅胶柱层析纯化，得N-BOC-L-苯丙氨酸薯蓣皂苷元酯纯品。

3.N-BOC-L苯丙氨酸薯蓣皂苷元酯脱保护基得到L-苯丙氨酸薯蓣皂苷元酯，如下所示：

4.通过硅胶柱层析纯化，得L-苯丙氨酸薯蓣皂苷元酯纯品。

以上所述的一种具有抗肿瘤活性的薯蓣皂苷元衍生物，可用于制备治疗肿瘤疾病的药物。

本发明对所合成的衍生物结构采用 IR 、NMR 和 MS 测试技术进行了表征，考查了衍生物的溶解性，采用氮唑盐还原法(MTT 法)进行了人结肠癌细胞Caco-2、人胃腺癌细胞MGC-709、人肺腺癌细胞SPC-A-1、人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y等四种肿瘤细胞的体外活性筛选实验。结果表明，合成的衍生物溶解性比原料药薯蓣皂苷元有所增加，衍生物对人结肠癌细胞Caco-2、人胃腺癌细胞MGC-709、人肺腺癌细胞SPC-A-1、人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y均有不同程度的生长抑制作用，抑制活性与母核薯蓣皂苷元相当，具有明显的技术进步。

薯蓣皂苷元及氨基酸衍生物对肿瘤细胞的生长具有抑制作用，这些药理作用，通过以下药效学试验例得到证实。

细胞 MGC-709、Caco-2、SH-SY5Y和SPC-A-1细胞均购于吉林省肿瘤医院。

药品及试剂 薯蓣皂苷元原料药，南京泽朗医药科技有限公司（批号：20102026）；噻唑蓝（MTT），Sigma公司；DMEM培养液，美国 Invitrogen 公司；胎牛血清，北京元亨金马生物科技技术股份有限公司；胰蛋白酶，美国 Sigma公司；二甲基亚砜（DMSO），分析纯。

仪器酶标仪，美国MD公司；CKX41倒置生物显微镜，日本奥林匹斯；BCN－B60B生物超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司； 96孔培养板，美国Coring公司；小型台式高速离心机5415D，研域（上海）化学试剂有限公司；美国NUAIRE CO₂培养箱，上海凌仪实业有限公司。

实验方法 MTT法 4种人的肿瘤细胞株按常规方法培养传代，取对数生长期细胞用于实验。将细胞以1×10⁵个/mL浓度接种于96孔板（100μL/孔），培养12h后，实验组加入薯蓣皂苷元各衍生物（或5-氟尿嘧啶20μg/mL作为阳性对照组），实验样品分别按照7.5，15，30，60μg/mL进行实验，阴性对照组加入培养液，每组各设4个平行孔，并分别设空白孔（即只加入药液和培养液，不加细胞）以调零。将薯蓣皂苷元衍生物组培养20h，加入5mg/mL MTT 20μL，继续培养4h，弃上清，每孔加入DMSO150μL，混匀，酶标仪（λ=492nm）测定吸光度（A₄₉₂），利用SPSS统计软件，计算细胞死亡率，求取IC₅₀。

实验结果

溶解性考查结果表明，薯蓣皂苷元易溶于亲脂性溶剂中，如氯仿、二氯甲烷，微溶于有机溶剂中，如乙醚、四氢呋喃中，在乙醇、甲醇中几乎不能溶解。但4种薯蓣皂苷元氨基酸衍生物L-苯丙氨酸薯蓣皂苷元酯（Dio-1-1）、L-丙氨酸薯蓣皂苷元酯（Dio-1-2）、L-脯氨酸薯蓣皂苷元酯（Dio-1-3）、L-缬氨酸薯蓣皂苷元酯（Dio-1-4）的溶解性与薯蓣皂苷元相比有一定的提高，它们易溶于氯仿、二氯甲烷溶解中，在乙醚、正丁醇、四氢呋喃中能够溶解，在石油醚、丙酮中略溶，而在无水乙醇及甲醇中略溶或者不溶。结果表明，薯蓣皂苷元氨基酸衍生物的溶解性与薯蓣皂苷元比较有所增加。具体结果见表1。

表1 薯蓣皂苷元及其氨基酸衍生物在不同溶剂中的溶解性

	diosgenin	Dio-1-1	Dio-1-2	Dio-1-3	Dio-1-4
						氯仿	溶解	易溶	易溶	易溶	易溶
二氯甲烷	溶解	易溶	易溶	易溶	易溶
						乙醚	微溶	溶解	溶解	溶解	溶解
正丁醇	不溶	略溶	略溶	略溶	略溶
						四氢呋喃	微溶	溶解	溶解	溶解	溶解
乙酸乙酯	不溶	溶解	略溶	略溶	溶解
						石油醚	不溶	略溶	略溶	略溶	略溶
丙酮	不溶	略溶	略溶	略溶	略溶
						无水乙醇	不溶	不溶	略溶	略溶	略溶
甲醇	不溶	不溶	略溶	略溶	略溶

MTT试验结果表明，经SPSS软件统计, 薯蓣皂苷元及衍生物对Caco-2、MGC-709、SPC-A-1、SH-SY5Y等4种肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用，薯蓣皂苷元及衍生物对4种肿瘤细胞的IC₅₀值详见表2。从表中可以看出，薯蓣皂苷元及衍生物对4种肿瘤细胞生长均有抑制作用，衍生物抑制活性与母核相当。

表2 薯蓣皂苷元及衍生物对4种肿瘤细胞的IC₅₀（μg/mL）

为了支持本发明，举例说明本发明中薯蓣皂苷元氨基酸衍生物的制备过程，但并不意味这本发明就限于此，具体实施方法如下。

实例1

L-苯丙氨酸薯蓣皂苷元酯的制备：

称取diosgenin 0.1000 g（0.24 mmol）、0.1280 g（0.48 mmol）N-BOC-L苯丙氨酸、0.1000 g（0.48 mmol）DCC、0.058 g（0.48 mmol）DMAP、适量的分子筛加入到50 mL反应瓶中，加入25 mL二氯甲烷，在室温下，将反应混合液置于磁力搅拌器上，加速反应，利用TLC（石油醚-乙酸乙酯 = 4:1 v：v）检测反应进程，每15 min检测一次。反应过程中会有新物质产生，至反应完全时，停止反应，反应时间约为2 h。将反应瓶中的液体过滤，减压蒸除溶剂至圆底烧瓶中残留2-3 mL液体时停止反应，将残余液体倒入蒸发皿中，于水浴锅（温度45 ℃）在通风橱内蒸发，蒸发到呈黏液状为止，通过硅胶柱层析（石油醚-乙酸乙酯=4:1 v:v），纯化，得纯品。将纯品溶解于8 mL二氯甲烷中，加入2当量三氟乙酸，利用TLC（石油醚-乙酸乙酯=1:4 v:v）检测反应进程，每15 min检测一次。反应过程中会有新物质产生，至反应完全时，停止反应，反应时间约为0.5 h。将反应瓶中的液体过滤，滤液减压蒸除溶剂，柱层析(展开剂为石油醚-乙酸乙酯=4:1 v:v)得L-苯丙氨酸薯蓣皂苷元酯，收率为79.76%，¹³CNMR谱中，薯蓣皂苷元骨架上各碳原子化学位移值与文献值大致一致，3位碳的化学位移由71.6 ppm变为74.43 ppm，δ174.40 ppm为羰基峰，137.26，129.29，128.42，126.68 ppm为芳香环上的碳信号。

实例2

L-丙氨酸薯蓣皂苷元酯的制备：

称取diosgenin 0.1000 g（0.24mmol）、0.0908 g（0.48 mmol）N-BOC-L-丙氨酸、0.1000 g（0.48 mmol）DCC、0.058 g（0.48 mmol）DMAP、适量的分子筛加入到50 mL反应瓶中，加入25 mL二氯甲烷，反应混合液在室温磁力搅拌下反应，利用TLC（石油醚-乙酸乙酯=4:1 v:v）检测反应进程，每15 min检测一次。反应过程中会有新物质产生，至反应完全时，停止反应，反应时间约为24 h。将反应瓶中的液体过滤，减压蒸除溶剂至圆底烧瓶中残留2-3 mL液体时停止反应，将残余液体倒入蒸发皿中，于水浴锅（温度45 ℃）在通风橱内蒸发，蒸发到呈黏液状为止，通过硅胶柱层析（石油醚-乙酸乙酯=4:1 v:v），纯化，得纯品。将纯品溶解于5 mL二氯甲烷中，加入2当量TFA，利用TLC（氯仿-甲醇=95:5 v:v）检测反应进程，每15 min检测一次。反应过程中会有新物质产生，至反应完全时，停止反应，反应时间约为1 h。将反应瓶中的液体过滤，滤液减压蒸除溶剂，柱层析(展开剂为石油醚-乙酸乙酯=4:1)得L-丙氨酸薯蓣皂苷元酯，收率为80.35%，¹HNMR谱中，薯蓣皂苷元结构上各特征峰化学位移基本一致，在图谱上增加了2个三重峰，为丙氨酸上的甲基和亚甲基信号：δ2.25 ppm(t，3H,J=7.6Hz)；1.05 ppm(t，J=7.6 Hz）。在¹³CNMR图谱中，薯蓣皂苷元结构上各碳化学位移值与文献值基本一致，3位碳的化学位移由71.6 ppm变为75.08 ppm，增加的174.21 ppm为羰基峰。

实例3

L-脯氨酸薯蓣皂苷元酯的制备：

称取diosgenin 0.1000 g（0.24mmol）、0.1033 g（0.48mmol）N-BOC-L-脯氨酸、0.1000 g（0.48mmol）DCC、0.058 g（0.48mmol）DMAP、适量的分子筛加入到50 mL反应瓶中，加入25 mL四氢呋喃，反应混合液在室温磁力搅拌下反应，利用TLC（石油醚-乙酸乙酯=4:1 v:v）检测反应进程，每15 min检测一次。反应过程中会有新物质产生，至反应完全时，停止反应，反应时间约为2 h。将反应瓶中的液体过滤，减压蒸除溶剂至圆底烧瓶中残留2-3 mL液体时停止反应，将残余液体倒入蒸发皿中，于水浴锅（温度45 ℃）在通风橱内蒸发，蒸发到呈黏液状为止，通过硅胶柱层析（石油醚-乙酸乙酯=4:1 v:v），纯化，得纯品。将纯品溶解于8 mL二氯甲烷中，加入2当量TFA，利用TLC（氯仿-甲醇=95:5 v:v）检测反应进程，每15 min检测一次。反应过程中会有新物质产生，至反应完全时，停止反应，反应时间约为0.5 h。将反应瓶中的液体过滤，滤液减压蒸除溶剂，柱层析(展开剂为石油醚-乙酸乙酯=4:1)得L-脯氨酸薯蓣皂苷元酯，收率为81.26%，在¹³CNMR图谱中，薯蓣皂苷元结构上各碳化学位移值与文献值基本一致，3位碳的化学位移由71.6 ppm变为74.49 ppm，δ174.68 ppm为羰基峰。

实例4

L-缬氨酸薯蓣皂苷元酯的制备：

称取diosgenin 0.1000 g（0.24mmol）、0.0908 g（0.48mmol）N-BOC-缬氨酸、0.1000 g（0.48mmol）DCC、0.058 g（0.48mmol）DMAP、适量的分子筛加入到50 mL反应瓶中，加入25 mL四氢呋喃，反应混合液在室温磁力搅拌下反应，利用TLC（石油醚-乙酸乙酯=4:1 v:v）检测反应进程，每15 min检测一次。反应过程中会有新物质产生，至反应完全时，停止反应，反应时间约为2 h。将反应瓶中的液体过滤，减压蒸除溶剂至圆底烧瓶中残留2-3 mL液体时停止反应，将残余液体倒入蒸发皿中，于水浴锅（温度45 ℃）在通风橱内蒸发，蒸发到呈黏液状为止，通过硅胶柱层析（石油醚-乙酸乙酯=4:1 v:v），纯化，得纯品。将纯品溶解于8 mL二氯甲烷中，加入2当量TFA，利用TLC（氯仿-甲醇=95:5 v:v）检测反应进程，每15 min检测一次。反应过程中会有新物质产生，至反应完全时，停止反应，反应时间约为0.5 h。将反应瓶中的液体过滤，滤液减压蒸除溶剂，柱层析(展开剂为石油醚-乙酸乙酯=4:1)得L-缬氨酸薯蓣皂苷元酯，收率为73.16%，在¹³CNMR图谱中，薯蓣皂苷元结构上各碳化学位移值与文献值基本一致。3位碳的化学位移由71.6 ppm变为74.14 ppm，δ174.72 ppm为羰基峰。在¹H-NMR谱中，薯蓣皂苷元结构上有四个甲基特征峰，即18、19、21和27位，其中 8、19位甲基峰为单峰，位于高场，而21、27位甲基峰是双峰，位于较高场。若C-25位有OH被取代，那么27位甲基就会成为成为单峰，并且向低场位移。16和26位上的氢为连氧碳上的质子，处于较低场。

Claims

1.本发明涉及一种薯蓣皂苷元衍生物，其结构特征为：

其中：R位可以连不同氨基酸基，如L-丙氨酸基、L-缬氨酸基、L-苯丙氨酸基、L-脯氨酸基。其中衍生物L-缬氨酸薯蓣皂苷元酯为新化合物。详细制备方法见说明书。

2.根据上述权利要求所述的薯蓣皂苷元氨基酸基衍生物在抑制肿瘤细胞生长及其在制备抗肿瘤的药物中的应用。

3.本发明优点是：本发明设计并制备了一系列氨基酸薯蓣皂苷元酯类化合物，原料来源丰富，合成路线简便，产率高，适合规模化生产。该类化合物提高了薯蓣皂苷元的溶解性，与薯蓣皂苷元相比，抗肿瘤活性相当。