CN102335180A

CN102335180A - 乌苏烷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN102335180A
Application number: CN2010102270736A
Authority: CN
Inventors: 辛海量; 凌昌全; 苏永华; 吴迎春; 盛佳钰
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2010-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2030-07-15
Also published as: CN102335180B

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体公开了乌苏烷类化合物2α，3β，24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸、2α，3α，24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸、2α，3α，19α，24-四羟基乌苏烷-12-烯-28-酸化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。经药理研究表明该3个化合物具有较强的抗肿瘤作用，辅以药学上可接受的辅料，可制备成各种口服、注射、外用制剂，具有较好的开发应用前景。

Description

乌苏烷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及乌苏烷类化合物的医药用途。

背景技术

目前，恶性肿瘤是危害人类健康最为严重的一类疾病，据统计每年约有5000万人死于癌症，中国每年死于癌症的病人约90万人。肿瘤是机体各种致癌因素作用下，局部组织的细胞异常增生而形成的新生物，常表现为局部肿块。目前，肿瘤常用的治疗手段有手术、放射线、抗癌药、中医药及免疫等多种方法。其中，药物治疗是肿瘤临床治疗的最为重要的手段之一。抗肿瘤药物的研发是全球医药产业发展的重要方向，蕴藏着巨大的社会效益和经济效益。

乌苏烷类是三萜类化学成分中重要的结构类型，此类成分大多是乌苏酸的衍生物，在熊果、栀子、女贞叶、石榴叶、地榆、积雪草中都有较多发现。现有的药理研究表明，该类成分具有多方面的药理作用。如乌苏酸对革兰氏阳性菌、阴性菌、酵母菌有抑制活性，能明显降低大鼠的体温，并有安定作用，以及诱导肿瘤细胞凋亡的作用。但尚未见有关本发明所述的乌苏烷类化合物2α，3β，24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸、2α，3α，24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸、2α，3α，19α，24-四羟基乌苏烷-12-烯-28-酸抗肿瘤作用的研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供乌苏烷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

近年来，发明人致力于从天然药物、中药中寻找抗肿瘤活性成分，结果从对萼猕猴桃植物(根、茎、叶)中，获得乌苏烷类化合物，结构见式I。发明人发现，2α，3β，24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸(化合物1)、2α，3α，24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸(化合物2)和2α，3α，19α，24-四羟基乌苏烷-12-烯-28-酸(化合物3)，具有较强的抗肿瘤作用，并且安全性高，具有开发成为抗肿瘤药物的前景。尽管化合物1、2、3在其他植物中也有发现，但是发明人首次研究证实了它们的抗肿瘤作用。

式Ⅰ中，R₁＝OH或H，R₂＝H或OH，R₃＝H或OH。

化合物1、2α，3β，24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸：R₁＝OH，R₂＝H，R₃＝H

化合物2、2α，3α，24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸：R₁＝H，R₂＝OH，R₃＝H

化合物3、2α，3α，19α，24-四羟基乌苏烷-12-烯-28-酸：R₁＝H，R₂＝OH，R₃＝OH

本发明优势在于发掘了已知乌苏烷类化合物1、2、3的新用途，为它们开拓了一个新的应用领域。乌苏烷类化合物1、2、3可以从植物中提取获得，也可以通过化学合成获得，具有来源方便、安全性高的优势，它们单独、两者或三者之间组合用于制备抗肿瘤药物，具有广阔的前景。

可将本发明所述的乌苏烷类化合物1、2、3单独、两者或三者配比组合，再与载体混合或用载体包埋，制成组合物，以便于发挥药效和临床应用。此载体可以是胶囊、或其它装载形式，载体可以是固体、半固体或液体物质，作为它们的稀释剂、赋形剂或介质。制成的组合物可以是片剂、注射剂、悬浮液、溶液等多种形式。在组合物中，化合物1、2、3单独、两者或三者配比组合作为活性成分，重量百分比可为0.1％～99.5％。

多种稀释剂、赋形剂或介质可用于本组合物，如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、聚乙二醇、明胶等。制剂中还可加入润滑剂、湿润剂、矫味剂、悬浮剂、防腐剂等。可采用本领域可接受的制备方法，将本发明所述的化合物制成便于给药的剂型，以达到活性成分发挥最大药效的目的。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修改同样落入本发明权利要求所限定的范围。

实施例1(化合物1、2、3的制备)

(1)化合物1、2、3的提取分离

对萼猕猴桃叶粗粉(2007年6月采自浙江衢州)2.5kg，以约80L 80％乙醇浸提，提取液减压浓缩至5L，再分别以石油醚(60-90℃)、氯仿、水饱和正丁醇(5L×3次)萃取。氯仿萃取液减压浓缩至干，继以正相硅胶(200-300目，3000g，8×120cm)柱色谱纯化，石油醚-乙酸乙酯(20∶1→1∶1)梯度洗脱，得馏份1-7，氯仿-甲醇(10∶1→3∶1)梯度洗脱，得馏份8-14。馏份4反复经正相硅胶柱色谱纯化，石油醚-乙酸乙酯(20∶1→1∶1)梯度洗脱、SephadexLH-20凝胶柱色谱纯化(洗脱剂∶氯仿-甲醇＝1∶1)、反相ODS柱色谱纯化(50％-80％甲醇梯度洗脱)，均以TLC跟踪检测接收的馏份(硅胶GF254薄层板，氯仿-甲醇＝7∶1作展开剂，显色方法：喷5％硫酸乙醇溶液，加热显色，目视)，含相同目标成分馏份合并、回收、浓缩至干，最终得化合物1、2、3。经组合运用正相硅胶、反相ODS、Sephadex LH-20凝胶柱色谱手段，经多批次投料、提取、纯化，即得化合物1、2、3。

(2)化合物1、2、3的结构鉴定

化合物的鉴定主要采用质谱、¹H NMR、¹³C NMR波谱学方法，结合文献数据分析。{参考文献：Kojima A，Ogura H.Configurational studies onhydroxyl groups at C-2，3 and 23 or 24 of oleanene and ursine-typetriterpenes by NMR spectroscopy[J].Phtochemistry，1989，28：1703-1710；Mahato SB，Kundu PA.¹³C NMR spectra of pentacyclictriterpenoids-A compilation and salient features[J].Phytochemistry，1994，37：1517-1575}

化合物1 2α，3β，24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸：白色粉末，ESI-MS：m/z＝511.3[M+Na]⁺.¹H NMR(500MHz，C₅D₅N)δ：0.92(3H，d，J＝6.4Hz)，0.94(3H，s)，0.98(3H，d，J＝6.2Hz)，1.15(3H，s)，1.31(3H，d，J＝6.2Hz)，1.64(3H，s)，2.70(1H，d，J＝11Hz)，3.60(1H，d，J＝9.1Hz)，3.85(1H，d，J＝11Hz)，4.30(1H，m)，4.51(1H，d，J＝11Hz)，5.50(1H，br).¹³C NMR(125MHz，C₅D₅N)数据见表1。

化合物2 2α，3α，24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸：白色粉末，ESI-MS：m/z＝511.5[M+Na]⁺.¹H NMR(500MHz，C₅D₅N)δ：0.91(3H，d，J＝6.4Hz)，0.96(3H，s)，0.99(3H，d，J＝6.2Hz)，1.01(3H，s)，1.07(3H，s)，1.61(3H，s)，2.80(1H，d，J＝11Hz)，3.61(1H，d，J＝9.1Hz)，3.81(1H，d，J＝11Hz)，4.10(1H，d，J＝11Hz)，4.52(1H，m)，4.70(1H，br)，5.50(1H，br).¹³C NMR(125MHz，C₅D₅N)数据见表1。

化合物3 2α，3α，19α，24-四羟基乌苏烷-12-烯-28-酸：白色粉末，ESI-MS：m/z＝527.3[M+Na]⁺.¹H NMR(500MHz，C₅D₅N)δ：1.04(3H，s)，1.07(3H，s)，1.15(3H，d，J＝6.4Hz)，1.42(3H，s)，1.60(3H，s)，1.65(3H，s)，3.04(1H，s)，3.80(1H，d，J＝22Hz)，4.10(1H，d，J＝22Hz)，4.43(1H，m)，4.58(1H，s)，5.58(1H，br).¹³C NMR(125MHz，C₅D₅N)数据见表1。

表1化合物1、2、3的¹³C NMR波谱数据(溶剂：C₅D₅N)

实施例2(化合物1、2、3对肿瘤细胞生长的抑制作用)

选择6种肿瘤细胞株对化合物1、2、3(实施例1制备)的体外抗肿瘤活性进行测试，分别是肝癌细胞：PLC/PRF/5、Hep3B、HepG2；肠癌细胞SW480及宫颈癌细胞HeLa；人乳腺癌细胞MCF-7。所用肿瘤细胞株保存于第二军医大学长海医院中医科实验室，其中PLC/PRF/5、Hep3B、HepG2肿瘤细胞株以含10％FBS(PAA)的MEM培养基(Gibco)培养；SW480、HeLa、MCF-7以含10％FBS(PAA)的RPMI 1640培养基(Gibco)培养；每周传代两次。

实验方法(MTT法)：取处于指数生长期的肿瘤细胞，以含0.05％EDTA的0.25％胰酶消化，重悬并计数。以每孔1×10⁴接种于96孔培养板。培养24h后吸取上清，加入含不同浓度化合物1、2、3的完全培养液100μl继续培养48h。加5mg/ml MTT的PBS溶液10μl，继续培养4h，加10％SDS-5％异丁醇-0.012mol/L盐酸的三联溶液100μl，培养过夜，以酶标仪测定578nm波长下的吸光度。结果表明乌苏烷类化合物1、2、3对所选择的肿瘤细胞株的生长均有不同程度的抑制作用(表2)。

表2化合物1、2、3对肿瘤细胞株增殖的抑制作用

实施例3(化合物1、2、3对动物皮下移植瘤生长的抑制作用)

昆明种小鼠，雌雄各半，体重(18g±2g)，由上海医科大学动物中心提供。动物以颗粒饲料喂养，自由摄食和引水，在第二军医大学药学院动物实验室饲养；H22小鼠肝癌细胞株、HepS小鼠肝癌细胞株由中科院细胞所引进，保存于第二军医大学长海医院中医科实验室；环磷酰胺粉针剂(CTX)系江苏恒瑞医药股份有限公司产品，批号07083021；化合物1、2、3由本实验室自制，纯度大于98％(HPLC法)。

选取已腹腔接种小鼠肝癌细胞(H22小鼠肝癌细胞株、HepS小鼠肝癌细胞株)后一周健康较好的小鼠，颈椎脱臼处死，腹部皮肤消毒后，抽取腹腔积液(乳白色腹水)，台盼蓝染色细胞计数，其活肝癌细胞大于95％，根据活细胞计数，用生理盐水稀释成含细胞数为2×10⁷/ml备用，每只小鼠于右腋皮下接种0.2ml细胞。按常规抑瘤实验进行，分别将H22和HepS实体型肝癌小鼠于接种后次日随机分组，每组10只，次日起给药，给药体积为0.2ml/10g小鼠。生理盐水组：腹腔注射等容积生理盐水注射液，每天两次，连续10天；CTX组：腹腔注射CTX 30mg/kg，隔日一次，连用3次；化合物1、2、3组采用腹腔注射给药，剂量见表3，每日1次，连续10天。末次给药后次日处死动物，解剖并完整分离肿瘤，称瘤重量，按下式计算肿瘤抑制率。

肿瘤抑制率(％)＝(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。

结果表明化合物1、2、3对HepS、H22皮下移植瘤的生长均有显著的抑制作用(表3)。

表3化合物1、2、3对小鼠HepS、H22移植性肝癌的作用

注：^*P＜0.05vs生理盐水组

实施例4(化合物1、2、3对人胃癌移植瘤的抑制作用)

人胃腺痛细胞BGC-823(低分化)由中科院上海细胞库提供。BALB/c(nμ/nμ)裸小鼠，SPF级，7周龄，上海斯莱克实验动物中心提供。裸鼠用带过滤罩的鼠盒饲养于清洁级动物室内的层流柜饲养。动物室光照充足，温度26～28℃，相对湿度40％～60％。环磷酰胺：江苏恒瑞医药股份有限公司产品，批号07083021；改良型RPMI1640培养基和优级胎牛血清均为上海史瑞克生物公司产品。

将人胃癌细胞BGC-823于体积分数10％灭活胎牛血清的RPMII640培养液中(青霉素100U/ml，链霉素100mg/L)，在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养。收集对数生长期细胞，用0.4％台盼蓝染色、检测细胞活力高于95％，调整成浓度为1.0×10⁷/ml的细胞悬液。无菌条件下将细胞悬液以0.2ml/只接种于裸鼠右腋皮下，继续饲养2周，建立荷瘤裸鼠模型。将模型荷瘤裸鼠分组及给药见表4，每组6只，环磷酰胺隔日腹腔注射1次，其余各组均按相应药物和剂量每天腹腔注射1次，连续14天。末次给药后次日，脱颈椎处死动物，剖取瘤体组织，电子天平称重瘤块，按公式计算抑瘤率。抑瘤率(％)＝(模型组平均瘤重-实验组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100％。结果表明化合物1、2、3对荷瘤裸鼠移植瘤的生长均有显著的抑制作用(表4)。

表4化合物1、2、3对荷瘤裸鼠移植瘤的抑瘤率

注：^*P＜0.05vs生理盐水组

实施例5(化合物1、2、3的急性毒性研究)

按最大给药容量、最大药物溶解浓度，分别给ICR小鼠单次灌胃给予化合物1、2、3(2.5g/kg体重)，分别给ICR小鼠单次腹腔注射给予化合物1、2、3(1.5g/kg体重)，观察给药后动物14天内的毒性反应及死亡情况。结果小鼠单次灌胃给药，4小时内小鼠未见异常，给药后14天内，小鼠未出现死亡，第15天，全部小鼠处死，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病变；小鼠腹腔注射给药，5只小鼠出现精神萎靡、蜷缩，活动减少，给药后10小时后，全部小鼠恢复正常，给药后14天内，小鼠未出现死亡，第15天，全部小鼠处死，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病变。急性毒性试验结果表明化合物1、2、3的急性毒性较低。

实施例6(化合物1、2、3片剂的制备)

分别取化合物1、2、3各50g，羟丙基甲基纤维素10g，微晶纤维素50g、交联羧甲基纤维素钠5g，混匀，加入适量60％乙醇制成软材，过24目筛制粒，50℃干燥2小时，干燥颗粒过30目筛整粒，加入硬脂酸镁2.5g，混匀，分别压成1000片。

实施例7(化合物1、2、3注射剂的制备)

化合物1(或化合物2、或化合物3) 0.1g

注射用磷脂 5g

注射用大豆油 50g

甘油 22g

注射用水加至 1000ml

称取处方量已粉碎的化合物1(或化合物2、或化合物3)，加入处方量的注射用豆油中，充分混匀，成为油相；称取处方量的注射用磷脂、甘油及适量(至少使磷脂完全溶解为水相)的注射用水，混合后高速搅拌，使磷脂完全溶解为水相；在高速搅拌条件下，将油相以线状加入水相中，加完后，再继续搅拌15分钟，以0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.5～7.0，再加注射用水至1000ml，得乳白色初乳；将制得的初乳移入高压匀质机，匀化；乳液以0.45μm微孔滤膜过滤；将乳剂灌封于适当的容器内；置100℃条件下灭菌30分钟，即得。

Claims

1.结构如式I所示的乌苏烷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，式I中R₁＝OH或H，R₂＝H或OH，R₃＝H或OH。

2.根据权利要求1的用途，其特征是，式I中，R₁＝OH，R₂＝H，R₃＝H，乌苏烷类化合物为2α，3β，24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸。

3.根据权利要求1的用途，其特征是，式I中，R₁＝H，R₂＝OH，R₃＝H，乌苏烷类化合物为2α，3α，24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸。

4.根据权利要求1的用途，其特征是，式I中，R₁＝H，R₂＝OH，R₃＝OH，乌苏烷类化合物为2α，3α，19α，24-四羟基乌苏烷-12-烯-28-酸。

5.以结构如式I所示的乌苏烷类化合物为活性成分的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5的用途，其特征是，组合物中乌苏烷类化合物的重量百分比为0.1％～99.5％。