CN103142934A - 一种抗肺癌和肝癌的中药组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗肺癌和肝癌的中药组合物，由质量比为1:15-25:5-15的重楼提取物、姜黄提取物和白芍提取物组成。经试验证明，本发明的中药组合物可显著抑制LA795等肺癌细胞株以及Hep-B3等肝癌细胞株的生长，IC50分别可达20μg/mL以下；对肺腺癌和肝癌荷瘤小鼠模型试验显示，抑瘤率分别均在50%以上，提高小鼠脾指数与肝指数，与单独应用原药材相比，该药物组合物抗肺癌和肝癌的活性更高且作用明确，对肺癌、肝癌具有很好的抑制作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗肺癌和肝癌的中药组合物及其制备方法，属于中药技术领域。
背景技术
中药重楼为百合科植物云南重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.或七叶一枝花Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根茎，具有清热解毒，消肿止痛、凉肝定惊之功效，用于治疗疔疮痈肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、凉风抽搐等症，是中成药云南白药、宫血宁胶囊、季德胜蛇药片等的主要组成药物。现代药理研究表明重楼具有细胞毒活性、抑菌抗炎、镇痛、止血、镇静、抗早孕、杀精、对呼吸系统以及心血管系统作用等，在临床应用于治疗肺系疾病、功能性子宫出血、淋巴结结核溃疡、神经性皮炎和外科炎症以及治疗肿瘤等疗效显著。目前有重楼入药的上市中成药复方有金复康口服液、软坚口服液、楼莲胶囊、肝复乐片等。近年来，重楼及其抗肿瘤有效成分重楼总皂苷的文献报道日益增多。中国中药杂志，2008，33（16）：2057-2060公开了滇重楼皂苷对10种肿瘤细胞株的细胞毒谱及构效关系研究；黄贤校等在中草药杂志2009，40（3）：483-489发表了重楼属药用植物皂苷类化学成分及其生源途径的研究进展；陈志红等考察了重楼总皂苷对人肺癌细胞A549的增殖抑制作用及对细胞周期的影响；朱丽丽等对重楼皂苷抑制SGC-7901细胞增殖及诱导凋亡进行了研究；林云华研究发现重楼和奥沙利铂在体外、体内实验中可能具有一定抗血管生成的作用，两者联合应用可能具有协同增效作用。贾科等发现重楼总皂苷可显著抑制MGC-803细胞的生长并呈时间-剂量依赖关系，可阻滞细胞于S期，诱导细胞凋亡率的升高；可显著抑制EphA2、survivin蛋白的表达，同时上调Caspase-3蛋白的表达，进而得出结论其作用机制可能与下调EphA2和survivin的表达以及促进Caspase-3的表达有关。中国专利200610052223.8公开了重楼总皂苷的制备方法，200810052092.2也公开了以重楼总皂苷为有效成分的药物制剂及其制备方法。
姜黄始载于《唐本草》，为姜科植物姜黄Curcuma longa L.的干燥根茎，其性味辛、苦、温，归脾、肝经，具有破血行气，通经止痛之功效，可用于胸胁刺痛，胸痹心痛，痛经经闭，癥瘕，风湿肩臂疼痛，跌扑肿痛等病症的治疗。姜黄含有多种化学成分，主要成分为姜黄素类化合物：姜黄素、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、二氢姜黄素等；倍半萜类化合物：姜黄新酮、姜黄酮醇A、B等；挥发油(4.2%)：姜黄酮、姜黄烯、莪术醇等。姜黄素等有效成分的药理作用广泛，其抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗抑郁、抗肿瘤等作用已被普遍认可，其中抗肿瘤作用自1985年首次提出后，已有大量的实验研究证实，作用机制主要包括诱导肿瘤细胞凋亡，抑制血管生成，有阻滞细胞周期进程，逆转肿瘤细胞多药耐药等方面。黄东生等研究发现，姜黄素能够增强caspase-8的表达，从而启动外源性凋亡途径，诱导人肺癌细胞凋亡。方悦等报道姜黄素具有抗食道癌、胃癌、肝癌、结肠癌等消化系统肿瘤的作用。中国专利CN1931353A公开了姜黄素提取及其药物组合物制备方法。
白芍是毛茛科植物芍药属的去皮干燥根，性微寒，味苦、酸。有养血柔肝、缓中止痛、敛阴收汗的功效。白芍的药效成分包括芍药苷、羟基芍药苷、芍药花苷、芍药内酯苷，苯甲酰芍药苷等，统称为白芍总苷（total glucosides of peony,TGP）。研究发现，其可以在多个环节影响自身免疫疾病的细胞免疫、体液免疫以及炎症过程，并有镇痛、保肝的作用。芍药苷作为占TGP90%以上的化合物，近年来发现亦有抗肿瘤活性。其作用机制除了增强机体的免疫力,还有体内外引起肿瘤细胞周期停滞、诱导肿瘤细胞凋亡、对化疗药物减毒增效等。杨加域等发现白芍醇提液超滤膜分离药效部位在体外具有抗肿瘤活性；詹可顺等报道TGP联合化疗治疗非小细胞肺癌优于单纯化疗，并能提高患者生存质量、改善患者细胞免疫功能和升高外周血象。200510045840.0公开了一种具有升高白细胞作用的芍药苷与芍药内酯苷的组合物，适合用于制备治疗各种原因引起的白细胞减少、血小板和血红球蛋白降低的病症的药物。高小蓉等采用水提醇沉、膜分离、DEAE-纤维素柱层析分离纯化等方法得到白芍多糖BSP，对小鼠Lewis肺癌和S180肉瘤模型均有较好的抑制率。
目前，重楼皂苷与黄芪多糖的药物组合物（CN101152408A）的专利已见诸报道，而尚未发现具有抗肺癌和肝癌作用且由重楼提取物、姜黄提取物以及白芍提取物三者混合而成的中药组合物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗肺癌和肝癌的中药组合物。
本发明的技术方案概述如下：
一种抗肺癌和肝癌的中药组合物，由质量比为1:15-25:5-15的重楼提取物、姜黄提取物和白芍提取物组成。
所述重楼提取物、姜黄提取物和白芍提取物的质量比优选为1:20:10。
本发明的优点：
经试验证明，本发明的中药组合物可显著抑制LA795等肺癌细胞株以及Hep-B3等肝癌细胞株的生长，IC50分别可达20μg/mL以下；对肺腺癌和肝癌荷瘤小鼠模型试验显示，抑瘤率分别均在50%以上，提高小鼠脾指数与肝指数，与单独应用原药材相比，该药物组合物抗肺癌和肝癌的活性更高且作用明确，对肺癌、肝癌具有很好的抑制作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
重楼提取物：为市售重楼提取物（规格5:1或10:1或20:1）。
姜黄提取物的制备：
将姜黄药材或饮片粉碎成小块，按比例，将1g姜黄小块浸泡于7ml的质量浓度为1.3%的NaOH水溶液中，浸泡1小时，于90℃回流提取1小时，过滤，并且按第1次回流提取操作条件再进行回流提取2次，过滤，合并3次提取液，滤液经减压浓缩至25℃下相对密度为1.0，用质量浓度为1.7%的盐酸-乙醇溶液调节pH至中性，加入无水乙醇至无水乙醇的浓度占总体积的65%，混合，静置24小时，过滤得到沉淀，沉淀冷冻干燥得到姜黄提取物。
白芍提取物的制备：
将白芍药材或饮片粉碎成粗粉，采用9倍白芍粗粉干重的质量浓度为65%的乙醇水溶液，浸泡1小时，于95℃回流提取2小时，过滤，并且按第1次回流提取操作条件再进行回流提取2次，过滤，合并3次提取液；滤液经减压浓缩至原体积的1/2，加入1.5倍体积的水，加热至微沸后于阴凉处静置12小时后过滤，沉淀物在85℃下蒸发干燥，得到白芍提取物。
实施例1
一种抗肺癌和肝癌的中药组合物的制备，按质量比将1份的重楼提取物（规格10:1），20份的姜黄提取物和10份的白芍提取物混匀。
实施例2
一种抗肺癌和肝癌的中药组合物的制备，按质量比将1份的重楼提取物（规格20:1），15份的姜黄提取物和5份的白芍提取物混匀。
实施例3
一种抗肺癌和肝癌的中药组合物的制备，按质量比将1份的重楼提取物（规格5:1），25份的姜黄提取物和15份的白芍提取物混匀。
本发明的中药组合物的药效试验如下：
一．抗肿瘤活性试验方法
1.体外抗肿瘤活性试验
1.1细胞株及培养
小鼠肺腺癌LA795细胞株，培养于含10%灭活胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素的RPMn640培养基中，于37℃，5%CO2培养箱及饱和湿度条件下培养，3-4天传代一次。
人肺腺癌A549细胞株，培养于含10%灭活胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，于37℃，5%CO2培养箱及饱和湿度条件下培养，3～4天传代一次。
BEL-7402肝癌细胞株，培养于含10%灭活胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素的RPMn640培养基中，于37℃，5%CO2培养箱及饱和湿度条件下培养，3-4天传代一次。
Hep-B3肝癌细胞株，培养于含10%灭活胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，于37℃，5%CO2培养箱及饱和湿度条件下培养，3～4天传代一次。
1.2药物抗肿瘤活性测定
MTT法：将对数生长期细胞用胰酶消化后配制成浓度为3×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔酶标板，每孔加200μL。24h后换不含血清培养液使细胞同步化生长，每孔200μL。第三天向孔中加入受试药，即分别加入重楼提取物水溶液（简称重楼组），姜黄提取物水溶液（简称姜黄组），白芍提取物水溶液（简称白芍组）和本发明实施例1制备的组合物水溶液（简称组合物组实施例1制备）；另设对照组：0.1%二甲基亚砜（DMSO）每孔加200μL。受试药每组分别设0.01，0.1，1，10，100，1000μg/mL六个浓度，每个浓度设8个平行孔，于37℃下培养24h后，每孔加无血清无酚红培养液新鲜配制的0.5mg/mL MTT100μL，继续培养4h，然后，每孔加100μL DMSO溶解MTT甲臜颗粒，用微型振荡器振荡混匀后，于酶标仪上测定光密度值（OD），实验重复三次，取平均值。以溶剂对照处理肿瘤细胞为对照组，由OD值计算抑制率，公式为：细胞生长抑制率=（对照组OD值—实验组OD值）/对照组OD×100%，并以药物浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线，并求得IC50（半数抑制率），IC50=细胞生长抑制率为50%的药物浓度。结果见表1。
表1体外抗肿瘤活性试验结果
2.体内抗肿瘤活性试验
2.1LA795肺腺癌转移模型实验
2.1.1动物造模
用100只（随机分成10组，每组10只，各组名称见2.1.2）T739小鼠（雌性，18-20g）给予实施例1制备的药物组合物进行小鼠LA795肺腺癌转移模型体内药效试验。
取接种LA795肺腺癌细胞后第6-8天肿瘤生长良好的T739荷瘤鼠，拉断颈椎处死小鼠，在无菌条件下剥离肿瘤，选择新鲜无坏死的瘤组织剪碎置玻璃研磨器中，加适量生理盐水轻轻研磨制备成瘤细胞悬液，细胞筛过滤后加生理盐水稀释、计数，调配成细胞浓度为1000万/毫升的细胞悬液，0.2mL/每只接种于健康小鼠右前肢腋窝皮下。
2.1.2动物分组及给药
接种次日开始给药，每日1次：（1）模型组，灌服生理盐水，每只0.2mL；（2）化疗组：按20mg/kg·bw腹腔注射环磷酰胺；（3）重楼高剂量组：按5g（生药量）/kg灌服重楼提取物0.2mL；（4）重楼低剂量组：按2.5g（生药量）/kg灌服重楼提取物0.2mL；（5）姜黄高剂量组：按5g（生药量）/kg·bw灌服；（6）姜黄低剂量组：按2.5g（生药量）/kg·bw灌服；（7）白芍高剂量组：按5g（生药量）/kg·bw灌服；（8）白芍低剂量组：按2.5g（生药量）/kg·bw灌服；（9）药物组合物高剂量组：按5g（生药量）/kg·bw灌服；（10）药物组合物低剂量组：按2.5g（生药量）/kg·bw灌服；给药两周，于给药结束后次日颈部脱臼处死小鼠，解剖取其瘤组织，摘取肝，脾并称重。
测抑瘤率：（i）抑瘤率（%）=（1-给药组平均瘤重/生理盐水组平均瘤重）×100%，摘取脾，肝，并称重。肝指=（肝脏重量/体重）*1000，脾指=（脾脏重量/体重）*1000。结果见表2和表3。
表2对T739肺癌转移小鼠抑瘤率试验结果
表3组合物对T739肺癌转移小鼠免疫器官重量指数比较
2.2HepA肝癌模型实验
注：和模型组相比，*P<0.05，**P<0.01
2.2.1动物造模
用100只（随机分成10组，每组10只，各组名称见2.2.2）昆明小鼠（雌性，18-20g）给予实施例1制备的药物组合物进行小鼠HepA肝癌模型体内药效试验。
取接种HepA肝癌细胞后腹水饱满的荷瘤小鼠，消毒腹部，于超净工作台中抽取乳白色腹水为瘤源，生理盐水洗涤，腹水5mL，腹水与生理盐水的比例为1:1，生理盐水5mL，配成细胞悬液，以无菌注射器抽取0.1mL，分别接种于100只小鼠腋下。整个操作在无菌条件下进行。
2.2.2动物分组及给药
接种次日开始给药，每日1次：（1）模型组，灌服生理盐水，每只0.2mL；（2）化疗组：按20mg/kg·bw腹腔注射环磷酰胺；（3）重楼高剂量组：按5g（生药量）/kg灌服重楼提取物0.2mL；（4）重楼低剂量组：按2.5g（生药量）/kg灌服重楼提取物0.2mL；（5）姜黄高剂量组：按5g（生药量）/kg·bw灌服；（6）姜黄低剂量组：按2.5g（生药量）/kg·bw灌服；（7）白芍高剂量组：按5g（生药量）/kg·bw灌服；（8）白芍低剂量组：按2.5g（生药量）/kg·bw灌服；（9）药物组合物高剂量组：按5g（生药量）/kg·bw灌服；（10）药物组合物低剂量组：按2.5g（生药量）/kg·bw灌服；给药两周，于给药结束后次日颈部脱臼处死小鼠，解剖取其瘤组织，摘取肝，脾并称重。
测抑瘤率：（i）抑瘤率（%）=（1-给药组平均瘤重/生理盐水组平均瘤重）×100%，摘取脾，肝，并称重。肝指=（肝脏重量/体重）*1000，脾指=（脾脏重量/体重）*1000。结果见表4和表5。
表4组合物对HepA肝癌荷瘤小鼠抑瘤率试验结果
表5组合物对HepA肝癌荷瘤小鼠免疫器官重量指数比较
注：和模型组相比，*P<0.05，**P<0.01
2.3H22肝癌模型实验
2.3.1动物造模
用100只（随机分成10组，每组10只，各组名称见2.3.2）昆明小鼠（雌性，18-20g）给予实施例1制备的药物组合物进行小鼠H22肝癌模型体内药效试验。
取接种H22细胞后腹水饱满的荷瘤小鼠，消毒腹部，于超净工作台中抽取乳白色腹水为瘤源，生理盐水洗涤，腹水5mL，腹水与生理盐水的比例为1:1，生理盐水5mL，配成细胞悬液，以无菌注射器抽取0.1mL，接种于100只小鼠腋下。整个操作在无菌条件下进行。
2.3.2动物分组及给药
接种次日开始给药，每日1次：（1）模型组，灌服生理盐水，每只0.2mL；（2）化疗组：按20mg/kg·bw腹腔注射环磷酰胺；（3）重楼高剂量组：按5g（生药量）/kg灌服重楼提取物0.2mL；（4）重楼低剂量组：按2.5g（生药量）/kg灌服重楼提取物0.2mL；（5）姜黄高剂量组：按5g（生药量）/kg·bw灌服；（6）姜黄低剂量组：按2.5g（生药量）/kg·bw灌服；（7）白芍高剂量组：按5g（生药量）/kg·bw灌服；（8）白芍低剂量组：按2.5g（生药量）/kg·bw灌服；（9）药物组合物高剂量组：按5g（生药量）/kg·bw灌服；（10）药物组合物低剂量组：按2.5g（生药量）/kg·bw灌服；给药两周，于给药结束后次日颈部脱臼处死小鼠，解剖取其瘤组织，摘取肝，脾并称重。
测抑瘤率：（i）抑瘤率（%）=（1-给药组平均瘤重/生理盐水组平均瘤重）×100%，摘取脾，肝，并称重。肝指=（肝脏重量/体重）*1000，脾指=（脾脏重量/体重）*1000，结果见表6和表7。
表6组合物对H22肝癌荷瘤小鼠抑瘤率试验结果
表7组合物对H22肝癌荷瘤小鼠免疫器官重量指数比较
注：和模型组相比，*P<0.05，**P<0.01
用上面相同的方法对实施例2和实施例3制备的组合物进行实验，实验结果表明，实施例2和实施例3的组合物也具有上述相似的作用。
三、结论
本发明提供抗肺癌和肝癌的中药组合物制备方法简单，经体外MTT试验证明，此药物组合物可显著抑制LA795等肺癌细胞株及Hep-B3等肝癌细胞株生长，IC50达20μg/mL以下；肺腺癌和肝癌荷瘤小鼠模型试验显示，配伍后抑瘤率显著提高（50%以上），小鼠脾指数与肝指数也有所增加，与单独使用相比，该药物组合物活性更高且作用明确，对肺癌、肝癌具有很好的抑制作用。
Claims (2)
1.一种抗肺癌和肝癌的中药组合物，其特征在于，由质量比为1:15-25:5-15的重楼提取物、姜黄提取物和白芍提取物组成。
2.根据权利要求1所述的一种抗肺癌和肝癌的中药组合物，其特征在于所述重楼提取物、姜黄提取物和白芍提取物的质量比为1:20:10。
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