CN103570942A - 一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物、合成方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物、合成方法及其用途。该类阳离子功能阳离子聚合物中疏水砌块来源于生物相容性的天然甾体化合物胆固醇，进而通过与2-乙基唑啉单体进行阳离子开环聚合后加入功能化的胺获得。本发明的天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物其分子结构为两亲性，且具有分子量和末端功能基团可调控以及高生物相容性的优点，能够在缓冲液中高效率地结合基因药物，并通过细胞内转染实现高效表达目标蛋白。本发明所提供的制备方法具有简便、高效、原料易得的优点，有望作为低成本、高生物相容性的基因药物缓释载体材料得到应用。

Description

一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物、合成方法及其用途

技术领域

本发明涉及面向新型功能聚合物材料的制备及生物材料、制备方法以及该类阳离子聚合物在功能基因和药物输送载体中的应用。 

背景技术

近年来，研究与开发能将负载的治疗基因输送到生物体内的特定细胞、组织或器官发挥靶向治疗作用的非病毒载体(Non-viral Carrier)生物材料已成为生命科学和材料科学等交叉学科领域中最为热门的研究课题之一。与病毒载体相比，非病毒载体以其安全稳定、低免疫反应、外源基因结合能力强等优势获得人们的广泛关注.载体生物材料的作用原理是利用功能阳离子载体分子中氨基基团所带的正电荷与DNA或者RNA中磷酸基团所带负电荷通过静电相互作用，使得载体与基因复合形成稳定的聚集复合物(complex)，从而保护聚集复合体所负载的DNA或者RNA链在体内长时间血液循环中不易被核酸酶特异性降解，并可防止复合体之间聚集形成更大尺寸的聚集体，从而实现治疗基因药物的高效率输送与细胞内转染表达。因此，作为药物或基因转导的生物载体材料既要满足低毒性、无免疫原性、体内可降解吸收，还要能够和治疗外源基因DNA或RNA有效地结合形成一定纳米尺度聚集复合体（小于400纳米），在血液循环中长期稳定存在，减少与血液中蛋白等成份的非特异性相互作用。 

聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是一类阳离子聚合物生物载体材料，就结构而言可分为线性(L-PEI)和枝化PEI(b-PEI)两种，现在研究开发较多的为枝化PEI。其通过高正电荷密度的质子化氨基结合并压缩带负电的DNA分子，形成紧密的PEI／DNA复合物，其既可防止DNA被细胞质中的核酸酶降解，同时此复合物表面正电荷也有利于细胞对PEI／DNA复合物的内吞。当PEI／DNA复合物通过胞吞作用进入细胞后，在溶酶体生理条件下，PEI上的仲氨基和叔胺基发生质子化反应，使的溶酶体因渗透压升高而导致破裂，从而起到“质子海绵”作用，使PEI/DNA复合物得以释放入胞质，很大程度上减少了DNA在吞噬泡内富集并进而被降解的副作用，进而显著提高了转染效率。 

虽然目前用PEI作为载体进行基因转染取得了较大的进展，但仍面临着一系列的问题。首先，要提高PEI的转染效率必须采用较高分子量的PEI（如PEI-25K等），这将导致显著的细胞毒性。其次，在体内转染时，PEI/DNA复合物被肺、肾、肝和脾组织截留后快速由肺内皮细胞、肝窦中库普弗细胞及脾中的巨噬细胞清除。针对上述问题，随着对聚乙烯亚胺类生物载体材料研究的深入，人们开发了多种类型的功能化聚乙烯亚胺，如疏水长链脂质修饰的聚乙烯亚胺、靶向功能基团修饰的聚乙烯亚胺，环境响应型聚乙烯亚胺和纳米粒复合聚乙烯亚胺等。然而到目前为止，功能化聚乙烯亚胺一般多集中于枝化PEI(b-PEI)的化学衍生修饰，其分子结构中具有很多的反应活性氨基，不利于其进一步调控，许多修饰试剂制备条件复杂，且其制备和分离方法难于精确控制和模式化，从而使得其大规模合成与应用受到了限制。而线性(L-PEI)具有聚合条件简便，结构可控，末端可用功能化试剂修饰等优点。因此，进一步探索和开发同时具有分子结构可调控性，较低细胞毒性以及具有端基功能化特性的线性聚乙烯亚胺衍生物，将可在很大程度上丰富和扩展聚乙烯亚胺的分子功能多样性及其作为生物医学材料的应用。 

在另一方面，胆固醇具有可天然来源和疏水结构的特点，其可通过进一步修饰功能片段，如水溶性阳离子片段或亲/疏水调控片段合成新的甾醇衍生的类脂质体有机功能分子，这将可能同时具有较低细胞毒性和两亲性，是一类潜在的新型生物相容性基因载体材料（J.Med.Chem.2007，50，2432）与功能表面活性剂，这些阳离子功能分子已经在构建功能药物和基因载体中得到初步应用（Int.J.Pharm.2004，278，143）。近年来，本实验室合成了兼具脂溶性胆固醇骨架和功能阳离子片段以及生物还原响应性二硫化学键的新型有机功能化合物（专利公开号CN101870719A），同时采用Click偶联方法实现快速制备具有胆固醇结构的新型有机阳离子功能化合物（专利公开号CN102161688A），为研究开发新型由天然产物衍生的基因载体生物材料与生物相容性功能表面活性剂提供了新的途径。另一方面，面向药物或者基因治疗的载体实际需求，很有必要建立起一种高效率的、条件温和的、易操作的、结构可控的天然产物衍生的阳离子功能聚合物的制备方法，大量合成具有分子多样性的该类化合物，以便进一步深入进行该类生物材料的性能研究。这也是本发明所致力解决的目标。 

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物。 

本发明的目的之二在于提供一种上述由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物的高效制备方法。 

本发明的目的之三是提供一种上述由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物作为药物、基因载体生物材料的用途。 

本发明所提供的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物可由化学结构通式(Ⅰ)表示： 

上式中，FG表示功能氨基砌块，其结构由脂肪醇、脂肪胺、芳香醇、芳香胺、羟基聚醚、氨基聚醚、氨基糖、氨基酸构成。m，n选自1~200的自然数，进一步推荐m选自1~8的自然数，n选自10~200的自然数；A^-表示阴离子部分，包括氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根离子、硝酸根离子、高氯酸根离子、甲酸根离子、磷酸根离子、焦磷酸根离子、柠檬酸根离子或三氟乙酸根离子(TFA-)。 

所述的功能氨基砌块（FG）选自下列的结构：甲氧基、乙氧基、丙氧基，异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、戊氧基、异戊氧基、己氧基、异己氧基、庚氧基、辛氧基、壬氧基、癸氧基、十一烷氧基、十二烷氧基、十三烷氧基、十四烷氧基、十五烷氧基、十六烷氧基、十七烷氧基、十八烷氧基、乙胺基、丙胺基、异丙胺基、丁胺基、异丁胺基、戊胺基、异戊胺基、己胺基、庚胺基、辛胺基、壬胺基、癸胺基、十一烷胺基、十二烷胺基、十三烷胺基、十四烷胺基、十五烷胺基、十六烷胺基、十七烷胺基、十八烷胺基、单甲基一缩二乙二醇、单甲基二缩三乙二醇、单甲基三缩四乙二醇、单甲基四缩五乙二醇，氨基单甲基一缩二乙二醇、氨基单甲基二缩三乙二醇、氨基单甲基三缩四乙二醇、氨基单甲基四缩五乙二醇、聚乙二醇PEG(优先 的分子量为400，1000，2000，5000)、氨基单甲基聚乙二醇PEG(优先的分子量为400，1000，2000，5000)。 

本发明中所述的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物中，所述重复单元为m，n的分子连接结构片段中，m优选为1~8，n优选为10~200。具体选自下列的结构：m=1时为-(CH₂)₁-、m=2时为-(CH₂)₂-，m=3时为-(CH₂)₃-、m=4时为-(CH₂)₄-、m=5时为-(CH₂)₅-、m=6时为-(CH₂)₆-、m=7时为-(CH₂)₇-、m=8时为-(CH₂)₈-。 

本发明中所述的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物的合成方法步骤是： 

(1)、天然胆固醇功能起始剂的制备： 

首先将胆固醇对甲苯磺酸酯溶解于脱水干燥的有机溶剂中，在碱催化下加入到溶于有机溶剂中的脂肪醇或脂肪氨基醇中，于20-100℃下反应0.5-50h后减压蒸馏除去有机溶剂，过柱分离纯化得到胆固醇单脂肪醇中间体；进一步制备得到的胆固醇单脂肪醇中间体溶于预先脱水干燥的有机溶剂中，滴加对甲苯磺酰氯于20-100℃反应0.5-50h后，减压蒸馏除去有机溶剂，过柱分离纯化得到天然胆固醇功能起始剂，其通式如下式(Ⅱ)所示： 

(2)、酰胺聚合物的制备与功能化封端： 

将步骤（1）所得天然胆固醇功能起始剂溶于有机溶剂中，加入2-乙基唑啉于80-130℃反应2-40h后，加入氨基试剂进行封端，得到功能化封端的酰胺聚合物，其通式如下式（Ⅲ）所示： 

(3)、酰胺聚合物的水解： 

将上述步骤（2）制备所得的功能化封端的酰胺聚合物加入过量酸中于80-130℃反应10-30h旋干，继续加入醚沉淀洗涤，过滤干燥得到一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物，其通式如下式(Ⅰ)所示： 

根据本发明中所提供的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物的合成制备方法，步骤(1)、(2)、(3)中所述的有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯。 

根据本发明中所提供的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物的合成制备方法，所述天然胆固醇功能起始剂的制备步骤(1)中使用的碱包括二乙胺、三乙胺、氨水、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、甲醇钾、磷酸钠、磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷（DABCO）、1，8-二氮杂环[5，4，0]十一烯-7(DBU)、吡啶、甲基吡啶或4-二甲氨基吡啶。 

根据本发明中所提供的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物的合成制备方法，所述天然胆固醇功能起始剂的制备步骤(1)中使用的脂肪醇或脂肪氨基醇包括1，2-乙二醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇、1，6-己二醇、1，7-庚二醇、1，8-辛二醇、1，9-壬二醇、1，10-癸二醇、2-氨基-1-乙醇、3- 氨基-1-丙醇、4-氨基-1-丁醇、5-氨基-1-戊醇或6-氨基-1-已醇。 

根据本发明中所提供的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物的制备方法中，所述天然胆固醇功能起始剂的制备步骤(1)和(2)中柱层析纯化过程使用的有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯，及其按照它们的混合溶剂。 

根据本发明中所提供的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物的合成制备方法，所述酰胺聚合物的制备与功能化封端步骤中使用的氨基封端试剂包括甲胺、二甲胺、乙胺、二乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、异丁胺、叔丁胺、戊胺、异戊胺、叔戊胺、己胺、庚胺、辛胺、壬胺、癸胺、十一烷胺、十二烷胺、十三烷胺、十四烷胺、十五烷胺、十六烷胺、十七烷胺、十八烷胺、氨基一缩二乙二醇、氨基二缩三乙二醇、氨基三缩四乙二醇、氨基四缩五乙二醇、氨基单甲基一缩二乙二醇、氨基单甲基二缩三乙二醇、氨基单甲基三缩四乙二醇、氨基单甲基四缩五乙二醇。氨基单甲基一缩二乙二醇、氨基单甲基二缩三乙二醇、氨基单甲基三缩四乙二醇、氨基单甲基四缩五乙二醇，氨基聚乙二醇PEG(分子量优先为400，1000，2000，5000)，氨基单甲基聚乙二醇PEG(分子量优先为400，1000，2000，5000)。 

根据本发明中所提供的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物的合成制备方法，所述步骤（3）中酰胺聚合物的水解所使用的酸包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、高氯酸、甲酸、磷酸、焦磷酸、柠檬酸或三氟乙酸。 

根据本发明中所提供的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物的合成制备方法，所述酰胺聚合物的水解步骤中使用的醚包括乙醚、丙醚、异丙醚、丁醚、甲基叔丁基醚、甲基乙烯基醚、乙二醇单甲醚、乙二醇二甲醚、乙二醇单丁醚、乙二醇二丁醚、丙二醇丁醚、丙三醇单甲醚、丙三醇二甲醚、丙三醇三甲醚、二苯醚、缩水甘油醚或脂肪醇聚氧乙烯醚。 

根据本发明中所提供的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物的合成制备方法，所述步骤（1）中天然胆固醇功能起始剂的制备步骤中的反应温度，优选但不仅限于20-100℃，特别优选30-80℃。所述步骤（2）中酰胺聚合物的制备与功能化封端步骤中的反应温度，优选但不仅限于80-130℃，特别优选80-100℃。所述步骤（3）中的反应温度，优选但不限于80-130℃，特别优选100-130℃。 

根据本发明中所提供的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物，与已有研究报道相比(Bioconjugate Chem 2008；19：1640)，本发明中所提供的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物具有这样的优点： 

(1)、根据本发明中所提供的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物的合成方法简单高效，功能分子主体可来源于大量存在的胆固醇类天然产物，其余分子结构片段可来源于可工业级大量制备的有机化工原料，合成方法易推广实现低成本规模化制备，可工业生产性好。 

(2)、根据本发明中所提供的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物具有良好的水溶性，可用作药物载体尤其是作为基因载体的生物材料，其在体内细胞环境中降解后可释放出负载的具有治疗效果的药物、基因等，而且与已经商品化的枝化结构聚乙烯亚胺阳离子高分子转染试剂PEI-25k相比，具有明显较高的生物相容性。 

(3)、根据本发明中所提供的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物，具有较强的基因结合能力，并且化合物的生物相容性良好，有望在作为功能基因载体材料在基因转染中得到实际应用。 

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行具体说明，将有助于对本发明的理解，但并不以此限制本发明的内容。 

实施例1 

(1)聚合物Cho-PEI-1 

(1)、天然胆固醇功能起始剂（Cho-2C-OTS）的制备：首先将胆固醇对甲苯磺酸酯（8.7g，0.015mol）和5ml吡啶溶于20ml脱水干燥的四氢呋喃中，然后加入到溶于20ml四氢呋喃中的1，2-乙二醇（9.3g，0.15mol）中，于100℃反应10h后减压 蒸馏除去有机溶剂，过柱分离（乙酸乙酯：正己烷v：v=1：2）纯化得到胆固醇1，2-乙二醇单醚；接着将上一步制备得到的胆固醇1，2-乙二醇单醚（4.6g，0.01mol）溶于脱水干燥的四氢呋喃20ml中，滴加溶于10ml 1，4-二氧六环的对甲苯磺酰氯（2.85g，0.015mol）中，于70℃反应20h后减压蒸馏除去有机溶剂，过柱分离（乙酸乙酯：正己烷v：v=1：2）纯化得到天然胆固醇功能起始剂Cho-2C-OTS(总产率：15％)。 

(2).酰胺聚合物的制备与功能化封端：将上述步骤（1）制备所得的天然胆固醇功能起始剂Cho-2C-OTS（0.6g，1mmol）溶于5ml乙腈中，加入2-乙基唑啉(2g，20mmol)于80℃反应8h后，加入正丙胺(0.09g，1.5mmol)反应3h进行封端，得到功能化封端的酰胺聚合物（1.3g）。 

(3).酰胺聚合物的水解：将上述制备步骤（2）制备所得的功能化封端的酰胺聚合物加入10ml三氟乙酸中于80℃反应10h旋干，进一步加入异丙醚沉淀洗涤，过滤干燥得到一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物Cho-PEI-1（0.8g）。 

实施例2 

(2)化合物Cho-PEI-2 

(1).天然胆固醇功能起始剂（Cho-2C-OTS）的制备：首先将胆固醇对甲苯磺酸酯（8.7g，0.015mol）和5g碳酸钾溶于20ml脱水干燥的二甲基亚砜中，然后加入到溶于20ml四氢呋喃中的1，2-乙二醇（9.3g，0.15mol）中，于80℃反应15h后减压蒸馏除去有机溶剂，过柱分离（乙酸乙酯：正己烷v：v=1∶2）纯化得到胆固醇1，2-乙二醇单醚。进一步将制备得到的胆固醇1，2-乙二醇单醚（4.6g，0.01mol）溶于脱水干燥的四氢呋喃20ml中，滴加溶于10ml1，4-二氧六环的对甲苯磺酰氯（2.85g，0.015mol）中于70℃反应20h后减压蒸馏除去有机溶剂，过柱分离（乙酸乙酯：正己烷v：v=1：2）纯化得到天然胆固醇功能起始剂Cho-2C-OTS(总产率：21％)。 

(2).酰胺聚合物的制备与功能化封端：将上述步骤（1）制备所得的天然胆固醇功 能起始剂Cho-2C-OTS（0.6g，1mmol）溶于5ml乙腈中，加入2-乙基唑啉(4g，40mmol)于80℃反应8h后，加入正辛胺(0.2g，1.5mmol)反应3h进行封端，得到功能化封端的酰胺聚合物（3.6g）。 

(3).酰胺聚合物的水解：将上述步骤（2）制备所得的功能化封端的酰胺聚合物加入10ml磷酸中于80℃反应10h旋干，进一步加入甲基叔丁基醚沉淀洗涤，过滤干燥得到一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物Cho-PEI-2(2.2g)。 

实施例3 

(3)化合物Cho-PEI-3 

(1).天然胆固醇功能起始剂（Cho-6C-OTS）的制备：首先将胆固醇对甲苯磺酸酯（8.7g，0.015mol）和10ml吡啶溶于脱水干燥的四氢呋喃20ml中，然后加入到溶于20ml四氢呋喃中的1，6-乙二醇（18g，0.15mol）中，于100℃反应10h后减压蒸馏除去有机溶剂，过柱分离（三氯甲烷：正己烷v：v=1：3）纯化得到胆固醇1，6-己二醇单醚。进一步将制备所得的胆固醇1，6-己二醇单醚（4.9g，0.01mol）溶于脱水干燥的四氢呋喃20ml中，滴加对甲苯磺酰氯（3g，0.017mol）于40℃反应12h后减压蒸馏除去有机溶剂，过柱分离（三氯甲烷：石油醚v：v=1：3）纯化得到天然胆固醇功能起始剂Cho-6C-OTS(总产率：14％)。 

(2).酰胺聚合物的制备与功能化封端：将上述步骤（1）制备所得的天然胆固醇功能起始剂Cho-6C-OTS（0.64g，1mmol）溶于5ml甲苯中，加入2-乙基唑啉(6g，60mmol)于120℃反应8h后，加入异戊胺(0.13g，1.5mmol)反应3h进行封端，得到功能化封端的酰胺聚合物(4.2g)。 

(3).酰胺聚合物的水解：将上述步骤（2）制备所得的功能化封端的酰胺聚合物加入20ml盐酸中于80℃反应12h旋干，进一步加入乙醚沉淀洗涤，过滤干燥得到一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物Cho-PEI-3(1.8g)。 

实施例4 

(4)化合物Cho-PEI-4 

(1).天然胆固醇功能起始剂（Cho-6C-OTS）的制备：首先将胆固醇对甲苯磺酸酯（8.7g，0.015mol）和10ml吡啶溶于脱水干燥的四氢呋喃20ml中，然后加入到溶于20ml四氢呋喃中的1，6-乙二醇（18g，0.15mol）中，于100℃反应10h后减压蒸馏除去有机溶剂，过柱分离（三氯甲烷：正己烷v：v=1：3）纯化得到胆固醇1，6-己二醇单醚。进一步将制备得到的胆固醇1，6-己二醇单醚（4.9g，0.01mol）溶于脱水干燥的四氢呋喃20ml中，滴加对甲苯磺酰氯（3g，0.017mol）于40℃反应12h后减压蒸馏除去有机溶剂，过柱分离（三氯甲烷：石油醚v：v=1：3）得到天然胆固醇功能起始剂Cho-6C-OTS(总产率：15％)。 

(2).酰胺聚合物的制备与功能化封端：将上述步骤（1）制备所得的天然胆固醇功能起始剂Cho-6C-OTS（0.64g，1mmol）溶于5ml甲苯中，加入2-乙基唑啉(8g，80mmol)于100℃反应8h后，加入异戊胺(0.13g，1.5mmol)反应3h进行封端，得到功能化封端的酰胺聚合物(5.8g)。 

(3).酰胺聚合物的水解：将上述步骤（2）制备所得的功能化封端的酰胺聚合物加入20ml盐酸中于80℃反应12h旋干，进一步加入乙醚沉淀洗涤，过滤干燥得到一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物Cho-PEI-4(2.7g)。 

实施例5 

(5)化合物Cho-PEI-5 

(1).天然胆固醇功能起始剂（Cho-2C-OTS）的制备：首先将胆固醇对甲苯磺酸酯（8.7g，0.015mol）和5g氢氧化钾溶于20ml脱水干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入到溶于20mlN，N-二甲基甲酰胺中的1，2-乙二醇（15g，0.2mol）中，于110℃反应12h后减压蒸馏除去有机溶剂，过柱分离（乙酸乙酯：正己烷v：v=1：2）纯化得到胆固醇1，2-乙二醇单醚。进一步将制备得到的胆固醇1，2-乙二醇单醚（4.6g，0.01mol）溶于脱水干燥的四氢呋喃20ml中，滴加溶于10ml1，4-二氧六环的对甲苯磺酰氯（2.85g，0.015mol）于80℃反应20h后减压蒸馏除去有机溶剂，过柱分离（三氯甲烷：正己烷v：v=1：3）纯化得到天然胆固醇功能起始剂Cho-2C-OTS(总产率：23％)。 

(2).酰胺聚合物的制备与功能化封端：将上述步骤（1）制备所得的天然胆固醇功能起始剂Cho-2C-OTS（0.6g，1mmol）溶于5ml乙腈中，加入2-乙基唑啉(4.6g，46mmol)于80℃反应8h后，加入氨基单甲基一缩二乙二醇(0.32g，2mmol)反应5h进行封端，得到功能化封端的酰胺聚合物(3.8g)。 

(3).酰胺聚合物的水解：将上述步骤（2）制备所得的功能化封端的酰胺聚合物加入10ml磷酸中于90℃反应10h旋干，进一步加入乙醚沉淀洗涤，过滤干燥得到一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物Cho-PEI-5。 

实施例6 

(6)化合物Cho-PEI-6 

(1).天然胆固醇功能起始剂（Cho-2C-OTS）的制备：首先将胆固醇对甲苯磺酸酯（8.8g，0.015mol）和3g1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷（DABCO）溶于20ml脱水干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入到溶于20ml N，N-二甲基甲酰胺中的1，2-乙二醇（15g，0.2mol）中，于110℃反应12h后减压蒸馏除去有机溶剂，过柱分离（乙酸乙酯：正己烷v：v=1：2）纯化得到胆固醇1，2-乙二醇单醚。进一步将制备得到的胆固 醇1，2-乙二醇单醚（4.6g，0.01mol）溶于脱水干燥的四氢呋喃20ml中，滴加溶于10ml1，4-二氧六环的对甲苯磺酰氯（2.85g，0.015mol）于80℃反应20h后减压蒸馏除去有机溶剂，过柱分离（三氯甲烷：正己烷v：v=1：3）纯化得到胆固醇功能起始剂Cho-2C-OTS(总产率：17％)。 

(2).酰胺聚合物的制备与功能化封端：将上述步骤（1）制备所得的胆固醇功能起始剂（0.62g，1mmol）溶于5ml乙腈中，加入2-乙基唑啉(4.6g，46mmol)于100℃反应8h后，加入4g氨基单甲基聚乙二醇PEG2000反应3h进行封端，得到功能化封端的酰胺聚合物(3.1g)。 

(3).酰胺聚合物的水解：将上述步骤（2）制备所得的功能化封端的酰胺聚合物加入10ml硫酸中于80℃反应10h旋干，进一步加入甲基叔丁基醚沉淀洗涤，过滤干燥得到一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物Cho-PEI-6(1.3g)。 

实施例7 

聚合物毒性测试方法 

本发明实施例1-4中所述的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物(Cho-PEI-1、Cho-PEI-2、Cho-PEI-3、Cho-PEI-4)的生物相容性（细胞毒性）评估采用MTT法，主要方法如下：将非洲绿猴肾细胞COS-7以每孔6×10³个细胞的密度接种于96孔培养板中，其中每孔加入培养基100μL（培养基：含有10％ FBS的RPML1640），该96孔板于37℃和5％的CO₂条件下孵育24小时后，加入不同浓度的由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物继续孵育24小时。然后每孔加入20μL MTT（5mg/mL）溶液，孵育4小时后，每孔加入100μL DMSO溶解生成的甲臢化合物，最后用酶标仪(BioTek，ELx800，USA)测定490/630nm处的吸光度值。本实验中以枝化PEI-25K和PEI-800为对比参照，评价根据本发明所提供的化合物的毒性。 

聚合物作为基因载体的荧光素酶Luciferase基因转染试验方法 

本发明实施例1-4中所述的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物(Cho-PEI-1、Cho-PEI-2、Cho-PEI-3、Cho-PEI-4)作为基因载体的细胞转染效率采用荧光素酶报告基因分析试剂盒（Luciferase pDNA assay kit）进行评价，主要试验方法如下：将非洲绿猴肾细胞COS-7以每孔4×10³细胞的密度接种于24孔培养板 中，每孔加入500μL含有10％FBS血清的RPML1640培养基。将该24孔培养板于37℃和5％浓度CO₂条件下孵育24小时后弃去培养基，然后每孔重新加入500μL不含血清的DMEM培养基，再加入按不同聚合物载体/基因摩尔比（N/p比）所需质量的天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物(Cho-PEI-1、Cho-PEI-2、Cho-PEI-3、Cho-PEI-4)与基因(Luciferase pDNA)结合形成脂质复合物，并继续孵育24小时。随后，在每孔中加入200μl荧光素酶分析试剂盒的细胞裂解液(Promega，USA)进行裂解。裂解后移取50μL裂解液加入到20μL荧光素酶分析试剂盒所带底物混合，最后采用Glomax20/20化学发光测定仪(Promega，USA)测定混合液的化学发光值。本实验中以枝化bPEI-25K为对比参照载体，评价根据本发明所制备的阳离子基因输送载体的细胞转染效率。 

聚合物作为基因载体的绿色荧光蛋白eGFP转染试验方法 

本发明实施例1-4中所述的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物(Cho-PEI-1、Cho-PEI-2、Cho-PEI-3、Cho-PEI-4)作为基因载体转染绿色荧光蛋白（eGFP）的荧光显微镜成像，主要方法如下：将COS-7细胞以每孔6×10³个细胞的密度接种于96孔板中，其中每孔加入培养基100μL（培养基：含有10％FBS的DMEM），该96孔板于37℃和5％的CO₂条件下孵育24小时后，加入不同N/P比条件下的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物与绿色荧光蛋白基因（eGFP)复合物孵育48小时后，用Nikon Ti-S荧光倒置显微镜在明场和荧光条件下观察和成像，评价基因转染的效率。 

附图说明

图1、本发明实施例1-4中一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物(Cho-PEI-1、Cho-PEI-2、Cho-PEI-3、Cho-PEI-4)的生物相容性（细胞毒性）评估。对照组为市售基因转染试剂分子量为25000的枝化聚乙烯亚胺PEI-25K以及分子量为800的枝化聚乙烯亚胺PEI-800，从图中曲线可看出，天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物Cho-PEI-1、Cho-PEI-2、Cho-PEI-3和Cho-PEI-4的细胞毒性明显小于同等质量浓度的PEI-25K。 

图2、本发明实施例1-4中一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物 (Cho-PEI-1、Cho-PEI-2、Cho-PEI-3、Cho-PEI-4)作为基因载体转染荧光素酶（Luciferase）基因的荧光显微镜成像，左图为明场下的COS-7细胞，右图为波长405nm的荧光激发下的COS-7细胞，可以看出有明显的绿色荧光，证明天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物Cho-PEI-1、Cho-PEI-2、Cho-PEI-3和Cho-PEI-4具有良好的基因转染性能。 

图3、本发明实施例1-4中一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物(Cho-PEI-1、Cho-PEI-2、Cho-PEI-3、Cho-PEI-4)作为基因载体转染绿色荧光蛋白（eGFP）基因的荧光显微镜成像，左图为明场下的COS-7细胞，右图为波长405nm的荧光激发下的COS-7细胞，从结果可以观察到明显的绿色荧光，证明该类由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物(Cho-PEI-1、Cho-PEI-2、Cho-PEI-3、Cho-PEI-4)具有良好的基因转染活性。 

虽然本发明已将较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明的内容，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发明的主要精神和内容范围内，当可作各种更动与润饰，因此发明的保护范围应以申请专利的实际权利要求范围为准。 

Claims (11)

1.一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物，其结构可由化学结构通式(Ⅰ)表示：

其中，FG表示功能氨基砌块，其结构由脂肪醇、脂肪胺、芳香醇、芳香胺、羟基聚醚、氨基聚醚、氨基糖、氨基酸构成；m，n选自1~200的自然数；Aˉ表示阴离子部分，选自氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根离子、硝酸根离子、高氯酸根离子、甲酸根离子、磷酸根离子、焦磷酸根离子、柠檬酸根离子或三氟乙酸根离子。

2.如权利要求1所述的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物，其所述功能氨基砌块（FG）选自下列的结构：甲氧基、乙氧基、丙氧基，异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、戊氧基、异戊氧基、己氧基、异己氧基、庚氧基、辛氧基、壬氧基、癸氧基、十一烷氧基、十二烷氧基、十三烷氧基、十四烷氧基、十五烷氧基、十六烷氧基、十七烷氧基、十八烷氧基、乙胺基、丙胺基、异丙胺基、丁胺基、异丁胺基、戊胺基、异戊胺基、己胺基、庚胺基、辛胺基、壬胺基、癸胺基、十一烷胺基、十二烷胺基、十三烷胺基、十四烷胺基、十五烷胺基、十六烷胺基、十七烷胺基、十八烷胺基、单甲基一缩二乙二醇、单甲基二缩三乙二醇、单甲基三缩四乙二醇、单甲基四缩五乙二醇，氨基单甲基一缩二乙二醇、氨基单甲基二缩三乙二醇、氨基单甲基三缩四乙二醇、氨基单甲基四缩五乙二醇，分子量为400，1000，2000或5000的聚乙二醇PEG，分子量为400，1000，2000或5000的氨基单甲基聚乙二醇PEG。

3.如权利要求1所述的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物，其所述分子结构中的m，n，m优选为1~8，n优选为10~200。

4.如权利要求1所述的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物的合成方法，其特征通过下述步骤制备得到：

(1).天然胆固醇功能起始剂的制备：

在有机溶剂中，胆固醇对甲苯磺酸酯在碱催化下，和脂肪醇或脂肪氨基醇于20-100℃反应0.5-50h得到胆固醇单脂肪醇中间体；其中胆固醇对甲苯磺酸酯、脂肪醇或脂肪氨基醇、碱的投料摩尔比为1.0：1.0~4.0：1.0；所述的碱是三乙胺、1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷、1，8-二氮杂环[5，4,0]十一烯-7、吡啶、甲基吡啶或4-二甲氨基吡啶；将制备得到的胆固醇单脂肪醇溶于脱水干燥的有机溶剂中，滴加对甲苯磺酰氯于20-100℃反应0.5-50h得到天然胆固醇功能起始剂，其中胆固醇单脂肪醇、对甲苯磺酰氯、碱的投料摩尔比为1.0：1.0~4.0：1.0；

(2).酰胺聚合物的制备与功能化封端：

在有机溶剂中，将上述步骤（1）制备所得的天然胆固醇功能起始剂与2-乙基唑啉于80-130℃反应2-40h，加入氨基试剂进行封端，得到功能化封端的酰胺聚合物，其中天然胆固醇功能起始剂、2-乙基唑啉和氨基试剂的投料摩尔比为1.0：10.0-60.0：2.0；

(3).酰胺聚合物的水解：

将上述步骤（2）制备所得的功能化封端的酰胺聚合物加入过量酸中，于80-130℃反应10-30h得到一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物。

5.如权利要求4所述的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物的合成方法，其特征是所述有机溶剂选自乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯。

6.如权利要求4所述的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物的合成方法，其特征是所述天然胆固醇功能起始剂的制备步骤（1）中使用的脂肪醇或脂肪氨基醇选自1，2-乙二醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇、1，6-己二醇、1，7-庚二醇、1，8-辛二醇、1，9-壬二醇、1，10-癸二醇、2-氨基-1-乙醇、3-氨基-1-丙醇、4-氨基-1-丁醇、5-氨基-1-戊醇或6-氨基-1-已醇。

7.如权利要求4所述的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物的合成方法，其特征是所述天然胆固醇功能起始剂的制备步骤（1）的产物经过蒸馏，过柱分离纯化；柱层析纯化过程使用的有机溶剂选自乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯、及其按照它们的混合溶剂。

8.如权利要求4所述的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物的合成方法，其特征是所述步骤（2）中使用的氨基封端试剂选自甲胺、二甲胺、乙胺、二乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、异丁胺、叔丁胺、戊胺、异戊胺、叔戊胺、己胺、庚胺、辛胺、壬胺、癸胺、十一烷胺、十二烷胺、十三烷胺、十四烷胺、十五烷胺、十六烷胺、十七烷胺、十八烷胺。氨基一缩二乙二醇、氨基二缩三乙二醇、氨基三缩四乙二醇、氨基四缩五乙二醇、氨基单甲基一缩二乙二醇、氨基单甲基二缩三乙二醇、氨基单甲基三缩四乙二醇、氨基单甲基四缩五乙二醇、氨基单甲基一缩二乙二醇、氨基单甲基二缩三乙二醇、氨基单甲基三缩四乙二醇、氨基单甲基四缩五乙二醇，分子量为400，1000，2000或5000的氨基聚乙二醇PEG，分子量为400，1000，2000或5000的氨基单甲基聚乙二醇。

9.如权利要求4所述的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物的合成方法，其特征是所述步骤（3）的产物经过干燥、过滤、醚沉淀纯化；所述的酸选自盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、高氯酸、甲酸、磷酸、焦磷酸、柠檬酸或三氟乙酸；所述的醚选自乙醚、丙醚、异丙醚、丁醚、甲基叔丁基醚、甲基乙烯基醚、乙二醇单甲醚、乙二醇二甲醚、乙二醇单丁醚、乙二醇二丁醚、丙二醇丁醚、丙三醇单甲醚、丙三醇二甲醚、丙三醇三甲醚、二苯醚或缩水甘油醚或脂肪醇聚氧乙烯醚。

10.如权利要求4所述的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物的合成方法，其特征是所述天然胆固醇功能起始剂的制备步骤（1）中的反应温度为30-80℃；所述酰胺聚合物的制备与功能化封端步骤（2）中的反应温度为80-100℃；所述步骤（3）中的反应温度为100-130℃。

11.一种如权利要求1所述的一种由天然胆固醇衍生的聚乙烯亚胺功能阳离子聚合物作为治疗基因药物的载体生物材料在细胞基因转染中的应用。

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