CN103772469A - 一种含有动物固醇和天然精氨酸结构片段的合成阳离子脂质、合成方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种含有动物固醇和天然精氨酸结构片段的合成阳离子脂质、合成方法及其应用。采用常温高效化学偶联反应方法，将作为疏水砌块的动物固醇和作为阳离子砌块的天然精氨酸通过氨基酸连接砌块分别进行偶联制得，方法简便、高效、易操作，且起始原料为市售试剂，易于模块化制备。本发明获得的阳离子脂质具有水溶性、两亲性、低细胞毒性、良好生物相容性等优点，能在缓冲液中高效结合基因物质形成纳米尺度的、稳定的复合体。通过相关细胞生物学评价发现该类阳离子脂质载体负载的绿色荧光蛋白报告基因(eGFP)在人肺癌细胞株H1299内能够高效转染、表达目标蛋白,较市售参比转染试剂明显较低的细胞毒性。能作为低毒、高效的基因输送载体生物材料。

Description

一种含有动物固醇和天然精氨酸结构片段的合成阳离子脂质、合成方法及其应用

技术领域

本发明涉及面向有机生物功能材料的制备方法与生物医药应用领域，特别涉及到一种含有天然动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质及其在制备基因转染载体试剂中的应用。 

技术背景

天然产物作为次级代谢产物广泛分布在动物、植物和微生物中,其具有维持生理活动、介导自身防御和调控生物生殖的功能。天然产物中，除生物大分子如蛋白质（多肽）、核酸、聚糖之外，还有许多生物小分子化合物，包括氨基酸、核苷酸、糖类、脂类（脂肪和甾体）、萜类化合物等，其复杂的结构骨架和特殊的功能基团赋予了这些天然产物丰富多样的生物活性。近年来随着对生物相容性材料研究的深入,一些来源丰富、具有独特分子结构和多修饰位点的天然产物分子被逐步应用于构建具有基因、药物传输性能的纳米生物材料。目前，基于天然阳离子脂质、类脂质来构建生物相容性基因载体材料受到了人们的广泛关注，该系列阳离子脂质、类脂质基因载体的作用原理是借助其所携带的正电荷与负电性的治疗基因(DNA、RNAi)通过静电相互作用，形成结构与形态稳定的复合体(complex)，保护复合体中DNA或RNAi在体内长时间血液循环中不易被核酸酶特异性降解，同时防止复合体团聚形成更大尺寸的聚集体，实现治疗用基因药物高效率输送与细胞内重组转染表达。因此，作为基因输送载体的天然脂质材料既要满足自身的低毒性、无免疫原性、生物可降解性，还需要能够与治疗用外源基因DNA或RNAi有效地复合形成稳定的纳米尺度的聚集体（通常在50-400nm），使其具有血液长循环周期，减少器官的选择性滤出和与血液成份的非特异性相互作用。一般情况下，为了实现阳离子分子载体和基因间有较强的结合能力(Binding Affinity)，需要保证载体分子有较高的电荷密度。然而，现有的大量研究发现，在提高现有脂质体、类脂质体中阳离子片段分子量和电荷密度的同时，其作为基因输送载体应用时的细胞毒性显著增大，不能满足 临床基因治疗的实际应用要求。因此，如何运用分子工程手段，研发生物相容性好、并具有高效基因复合、负载性能的新型脂质基因载体是发展高效、低毒基因转染试剂的重要方向。 

动物固醇类化合物是一类具有重要生理功能的天然甾族化合物，在动物体内多种脂质如低密度脂蛋白（LDL）中广泛存在，具有较强的疏水性和良好的生物相容性，因此，基于天然动物固醇类化合物的骨架结构，通过进一步化学修饰连接水溶性天然产物阳离子片段，制备得到系列动物固醇衍生的两亲类脂质体功能分子，将有可能同时具有较低细胞毒性和水溶性。近年来，国内外已经报道了一些由动物甾醇衍生的两亲性阳离子功能分子（Bioconjugate Chem,2013,24,487–519)，具体的如胆固醇-生物素偶联的阳离子脂质（Chem Biol Drug Des,2013,82,376–383），大环取代胺类（ChemPlus Chem,2012,77,584–591）等，其性能已经在构建功能基因载体中得到了初步研究。本发明人在前期的相关工作中开发了系列基于二硫键的胆固醇脂质基因载体(Biomaterials2011,11,3507;ZL201010182428.4)，发现二硫化学键的引入对降低合成脂质载体的细胞毒性具有重要作用。进一步还发展了系列基于天然生物相容性胆固醇的类脂质阳离子有机功能分子作为基因转染试剂（CN201110040189.3），并成功应用于质粒DNA的高效细胞转染。此外，还发展了用“Click”方法在温和的条件下快速偶联制备功能阳离子脂质体的方法（ZL201110040189.3）。上述工作为研究开发由天然产物胆固醇衍生的新型载体生物功能材料与生物相容性功能基因转染试剂提供了新的途径。 

然而，总体上国内外基于动物固醇的两亲阳离子类脂质分子的研究与应用开发的相关报道较少。另一方面，从药物载体或者治疗基因药物的载体实际应用考虑，现有已经报道的基于天然甾醇结构的基因载体功能分子普遍存在合成步骤繁琐，产率较低、制备成本高等现实问题。因此，基于上述考虑，有必要发展新型高效率、反应条件温和、易操作、结构高度模块化的天然甾醇类功能阳离子分子的制备方法，为大量、低成本合成制备基于天然甾醇类天然产物、且具有分子结构多样性的新型生物相容性阳离子功能基因载体分子提供可能，并在此基础上，通过细胞层次上的生物学性能评价，进一步反馈指导上述基于天然甾醇类天然产物生物功能载体的设计和制备，从而促进其作为基因、药物等生物功能载体材料（或试剂）的应用，这也是本发明所致力解决的目标。 

发明的内容 

本发明的要解决的问题之一在于提供一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质。 

本发明要解决的问题之二在于提供一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，即运用常温化学偶联方法高效制备得到所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质。 

本发明要解决的问题之三是提供一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质作为基因载体材料的用途。尤其是在制备基因转染载体试剂中的应用。 

依据本发明所提供的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质，其结构式(Ⅰ)可以表示如下： 

上式中，n选自1～11的自然数，进一步推荐n选自1～6的自然数。X表示化学键，可以是双键（胆固醇），也可以是单键（氢化胆固醇）；A^-表示阴离子反离子部分，包括氯负离子、高氯酸根负离子、三氟甲磺酸根或三氟乙酸根负离子。 

依据本发明中所提供的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，主要由以下三步骤组成： 

第一步骤：将动物固醇（胆固醇或氢化胆固醇）溶于脱水干燥的有机溶剂中，在催化量的碱存在的条件下加入到溶于有机溶剂中的末端氨基Boc保护的氨基酸中，在室温下反应10-24h后减压蒸馏除去有机溶剂，然后直接柱层析纯化得到具有末端氨基Boc保护的动物固醇中间体，其化学结构如式（Ⅱ）所示： 

所述的动物固醇、碱和末端氨基Boc保护的氨基酸的摩尔比为1.0：1.0～2.0；1.0～1.5；第二步骤：将步骤一制备得到的具有末端氨基Boc保护的动物固醇中间体溶于有机溶剂中，加入的酸常温搅拌2-4h后，加入过量碱将酸中和，然后加入等摩尔比的叔丁氧羰基-N^ω-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸 

其后再加入缩合剂后常温反应10-24h，蒸馏除去有机溶剂，然后直接柱层析纯化得到具有Pbf和Boc保护基的含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质，其化学结构如式（Ⅲ）所示： 

所述的具有末端氨基Boc保护的动物固醇中间体：酸：过量的碱：叔丁氧羰基-N^ω-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨的摩尔比为1.0：1:0～2.0：2.0.～3.5：1.0； 

第三步骤：将步骤二所得的具有Pbf和Boc保护基的含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质溶于干燥有机溶剂中，随后加入过量酸进行脱保护，常温搅拌2-4h后，蒸馏除去有机溶剂，随后加入醚进行沉淀。最终过滤干燥得到一种如结构式（Ⅰ）所示的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质。 

依据本发明中所提供的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，步骤一、二、三中，所述有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、 1,4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、1,2-二氯乙烷、乙腈、丙酮、苯或甲苯。 

根据本发明中所提供的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，所述合成中使用的碱包括二乙胺、三乙胺、氨水、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、甲醇钾、1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷（DABCO）、1,8-二氮杂环[5,4,0]十一烯-7(DBU)、吡啶、甲基吡啶或4-二甲氨基吡啶。 

根据本发明中所提供的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，所述合成步骤一中使用的末端氨基Boc保护的氨基酸包括α-氨基乙酸

β-氨基丙酸ω-氨基丁酸 

ω-氨基戊酸ω-氨基己酸ω-氨基庚酸

ω-氨基辛酸

ω-氨基壬酸 

ω-氨基癸酸

ω-氨基-十一酸

ω-氨基十二酸

所述的Boc表示叔丁氧羰基；所述的Pbf表示2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基。 

根据本发明中所提供的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的方法中，所述合成步骤一、二中柱层析纯化过程使用的有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、1,4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、1,2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯、及其按照不同配比的混合溶剂体系。 

本发明中所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法中，所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺（DCC）、二异丙基碳二亚胺 （DIC）、羰基二咪唑（CDI）、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)等。 

根据本发明中所提供的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，所述合成步骤中使用的酸包括盐酸、高氯酸、三氟甲磺酸或三氟乙酸。 

根据本发明中所提供的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，所述合成步骤三中使用的醚包括乙醚、丙醚、异丙醚、丁醚、甲基叔丁基醚、甲基乙烯基醚、乙二醇二甲醚、二苯醚。 

根据本发明中所提供的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质，与已有研究报道相比(International Journal of Pharmaceutics，2011，408，183–190)，具有如下的优点： 

(1)根据本发明中所提供的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质可应用常温化学偶联法制备得到，合成方法简单、效率高，分子结构主体片段来源于天然产物动物固醇（包括胆固醇和氢化胆固醇），其余分子结构源于自然界中资源丰富的可再生天然产物，易实现低成本、规模化制备。 

(2)根据本发明中所提供的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质具有良好的纯度和水溶性，且其作为基因载体材料的相关性能可通过引入不同碳链长度的亲疏水连接片段进行调控。 

(3)根据本发明中所提供的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质与已经商品化的枝化结构聚乙烯亚胺阳离子基因转染试剂bPEI-25k相比，具有明显优越的生物相容性。 

附图说明

图1.本发明实施例1、2中所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质分子(Lipid1,Lipid2)与质粒DNA溶液复合（脂质体分子和质粒DNA的正负电荷比为20）形成稳定的纳米粒子，其可通过透射电镜（TEM）技术进行表征，从附图1中的TEM照片可以看出，这些DNA复合物粒子的形貌近似球形，尺度为60-210纳米左右。 

图2.本发明实施例1、2中所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的 合成阳离子脂质分子(Lipid1,Lipid2)的细胞毒性评价，对照组采用市售基因转染试剂bPEI-25K，从图中结果可以发现，依据该发明所制备的阳离子脂质分子在相同质量浓度下的细胞毒性远低于参照bPEI-25K。 

图3.本发明实施例1、2中所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质分子(Lipid1,Lipid2)作为基因载体转染绿色荧光蛋白（eGFP）的荧光显微成像结果。其中：(a)和(b)分别为Lipid1和Lipid2在正负电荷比为20的条件下在H1299细胞中转染eGFP的荧光显微成像图片，(c)为参照转染试剂bPEI-25K在正负电荷比为10的条件下在H1299细胞中转染eGFP的荧光图片。(荧光显微镜型号:Nikon-TS，放大倍数×200) 

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。而这些都属于本发明的保护范围。 

实施例1 

阳离子脂质Lipid1的合成 

第一步骤：将胆固醇(3.86g,1mmol)溶于30mL脱水干燥的三氯甲烷中，在加入1mL三乙胺催化剂的条件下滴加到溶于30mL三氯甲烷中的Boc保护的ω-氨基己酸 (2.30g,1mmol)中，在室温下反应24h后减压蒸馏除去有机溶剂，然后直接柱层析纯化(乙酸乙酯：石油醚v:v=1:5)，得到具有Boc保护基的ω-氨基己酸 胆固醇酯中间体。 

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：5.32(s，1H，C=CH，胆固醇)，4.51(m，1H，COOCH)，4.36(t，1H，+NH₃CHCONH)，3.29(t，2H，BocNHCH ₂)，2.32(t，2H，CH ₂COO)，2.30-0.95(m，43H，胆固醇) 

第二步骤：将第一步得到的末端具有Boc保护基的ω-氨基己酸胆固醇酯中间体溶于20mL二氯甲烷中，加入10mL三氟甲磺酸常温搅拌4h后，加入过量吡啶（15mL)将酸中和，然后加入等摩尔比的叔丁氧羰基-N^ω-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸

其后再加入1mmol的缩合剂二环己基碳二亚胺（DCC）后常温反应24h，蒸馏除去有机溶剂，然后直接柱层析纯化(乙酸乙酯：正己烷v:v=1:1)得到具有N(Pbf),N(Boc)-精氨酰-N-ω-氨基己酸胆固醇酯。 

第三步骤：将步骤二所得的N(Pbf),N(Boc)-精氨酰-N-ω-氨基己酸胆固醇酯溶于20mL干燥的二氯甲烷中，随后加入10mL三氟乙酸进行脱保护，常温搅拌2h后，蒸馏除去有机溶剂，随后加入乙醚进行沉淀。最终过滤干燥得到合成阳离子脂质Lipid1。 

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：8.50-7.52(t,精氨酸胍基)，7.50-6.93（b,精氨酸氨基)，5.32(s，1H，C=CH，胆固醇)，4.51(m，1H，COOCH)，4.36(t，1H，+NH₃CHCONH)，3.29(t，2H，BocNHCH ₂)，2.32(t，2H，CH ₂COO)，2.30-0.95(m，43H，胆固醇)ESI-MS：[M⁺]=657.5m/z 

实施例2 

阳离子脂质Lipid2的合成 

第一步骤：将氢化胆固醇(3.88g,1mmol)溶于20mL脱水干燥的三氯甲烷中，在 加入1mL三乙胺催化剂的条件下滴加到溶于20mL三氯甲烷中的Boc保护的ω-氨基己酸

(2.30g,1mmol)中，在室温下反应24h后减压蒸馏除去有机溶剂，然后直接柱层析纯化(乙酸乙酯：石油醚v:v=1:5)，得到具有Boc保护基的ω-氨基己酸氢化胆固醇酯中间体。 

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：4.51(m，1H，COOCH)，4.36(t，1H，+NH₃CHCONH)，3.29(t，2H，BocNHCH ₂)，2.32(t，2H，CH ₂COO)，2.30-0.95(m，45H，氢化胆固醇) 

第二步骤：将第一步得到的末端具有Boc保护基的ω-氨基己酸胆固醇酯中间体溶于15mL二氯甲烷中，加入10mL三氟甲磺酸常温搅拌4h后，加入过量吡啶（15mL)将酸中和，然后加入等摩尔比的叔丁氧羰基-N^ω-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸其后再加入1mmol的缩合剂二环己基碳二亚胺（DCC）后常温反应24h，蒸馏除去有机溶剂，然后直接柱层析纯化(乙酸乙酯：正己烷v:v=1:1)得到N(Pbf),N(Boc)-精氨酰-N-ω-氨基己酸氢化胆固醇酯。 

第三步骤：将步骤二所得的N(Pbf),N(Boc)-精氨酰-N-ω-氨基己酸胆固醇酯溶于20mL干燥的二氯甲烷中，随后加入10mL三氟乙酸进行脱保护，常温搅拌2h后，蒸馏除去有机溶剂，随后加入乙醚进行沉淀。最终过滤干燥得到合成阳离子脂质Lipid2。 

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：8.50-7.52(t,精氨酸胍基)，7.50-6.93（b,精氨酸氨基)，4.54(t，2H，J=6.3Hz，CH₂OCO)，4.51(m，1H，OCOCH)，4.36(t，2H，J=6.3Hz，CH₂OCO)，3.79(t，2H，J=6.3Hz，CH₂O)，2.30-0.95(m，45H，氢化胆固醇)ESI-MS：[M⁺]=659.5m/z 

实施例3 

阳离子脂质Lipid3的合成 

第一步骤：将氢化胆固醇(3.88g,1mmol)溶于20mL脱水干燥的三氯甲烷中，在加入1mL三乙胺催化剂的条件下滴加到溶于20mL三氯甲烷中的Boc保护的α-氨基乙酸(1.76g,1mmol)中，在室温下反应24h后减压蒸馏除去有机溶剂，然后直接柱层析纯化(乙酸乙酯：石油醚v:v=1:5)，得到具有Boc保护基的α-氨基乙酸氢化胆固醇酯中间体。 

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：4.51(m，1H，COOCH)，4.36(t，1H，+NH₃CHCONH)，3.29(t，2H，BocNHCH ₂)，2.32(t，2H，CH ₂COO)，2.30-0.95(m，45H，氢化胆固醇) 

第二步骤：将第一步得到的末端具有Boc保护基的α-氨基乙酸氢化胆固醇酯中间体溶于10mL二氯甲烷中，加入10mL三氟乙酸常温搅拌4h后，加入过量吡啶（15mL)将酸中和，然后加入等摩尔比的叔丁氧羰基-N^ω-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸

其后再加入1mmol的缩合剂二异丙基碳二亚胺（DIC）后常温反应20h，蒸馏除去有机溶剂，然后直接柱层析纯化(乙酸乙酯：正己烷v:v=1:1)得到N(Pbf),N(Boc)-精氨酰-N-α-氨基乙酸氢化胆固醇酯。 

第三步骤：将步骤二所得的N(Pbf),N(Boc)-精氨酰-N-α-氨基乙酸氢化胆固醇酯溶于20mL四氢呋喃中，随后加入20mL盐酸（质量百分比浓度37%）进行脱保护，常温搅拌4h后，蒸馏除去有机溶剂，随后加入乙醚进行沉淀。最终过滤干燥得到合成阳离子脂质Lipid3。 

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：8.50-7.52(t,精氨酸胍基)，7.50-6.93（b,精氨酸氨基)，4.54(t，2H，J=6.3Hz，CH₂OCO)，4.51(m，1H，OCOCH)，4.36(t，2H，J=6.3Hz，CH₂OCO)，3.79(t，2H，J=6.3Hz，CH₂O)，2.30-0.95(m，45H，氢化胆固醇) ESI-MS：[M⁺]=609.5m/z 

实施例4 

合成脂质体的MTT细胞毒性评价方法 

本发明实施例1和2中所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质Lipid1和Lipid2的细胞毒性评估采用MTT法，主要试验方法如下：将人肺癌细胞株H1299以每孔4×10³个细胞的密度接种于96孔培养板中，其中每孔加入100μL含有10%FBS的DMEM培养基。然后将该96孔板于37℃和5%CO₂浓度条件下孵育24小时后，分别加入不同浓度的含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质Lipid1和Lipid2后继续孵育24小时，其后每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)后继续孵育4小时。进一步在每孔中加入100μL DMSO以溶解生成的甲臢化合物，用酶标仪(BioTek，ELx800，USA)测定490/630nm波长处的吸光度值。实验中以枝化bPEI-25K为参比样品评价根据本发明所提供的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质Lipid1和Lipid2的细胞毒性。结果表明合成阳离子脂质分子(Lipid1,Lipid2)的细胞毒性评价，对照组采用市售基因转染试剂bPEI-25K，从图2中结果可以发现，本发明所制备的阳离子脂质分子在相同质量浓度下的细胞毒性远低于参照bPEI-25K。 

实施例5 

合成脂质作为基因载体的绿色荧光蛋白转染效率评价实验方法 

本发明实施例1、2中所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质(Lipid1和Lipid2)作为基因载体转染效率，同时采用绿色荧光蛋白（eGFP）的质粒DNA为评价工具，通过eGFP蛋白的荧光显微镜成像法进行基因转染效率评价，其主要方法如下：将人肺癌细胞株H1299以每孔5×10³个细胞的密度接种于12孔板中，其中每孔加入培养基500μL（培养基：含有10%FBS的DMEM），该12孔板于37℃和5%的CO₂条件下孵育24小时后，在不同N/P比条件下加入合成脂质体(Lipid1或Lipid2)，其与绿色荧光蛋白质粒DNA复合后，孵育48小时，采用用Nikon Ti-S荧光倒置显微镜在明场和荧光条件下观察和显微成像。本实验中以枝化bPEI-25K为基因转染载体的参比试剂，比较评价根据本发明所提供的合成脂质作为 基因载体的基因转染效率。结果表明本发明所制备的阳离子脂质分子具有与市售转染试剂bPEI-25K相接近的转染效率，是一类高效的基因转染试剂。 

虽然本发明已将较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明的内容，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发明的主要精神和内容范围内，当可作各种更动与润饰，因此发明的保护范围应以申请专利的实际权利要求范围为准。 

Claims (10)

1.一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质，其具有如下结构式(I)：

上式中，n选自1～11的自然数；X表示化学键：双键或单键；A^-表示阴离子反离子部分：氯负离子、高氯酸根负离子、三氟甲磺酸根或三氟乙酸根负离子。

2.如权利要求1所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子

脂质的合成方法，由以下三步骤组成：

第一步骤：将动物固醇溶于脱水干燥的有机溶剂中，在催化量的碱存在的条件下加入到溶于有机溶剂中的末端氨基Boc保护的氨基酸中，在室温下反应10-24h得到具有末端氨基Boc保护的动物固醇中间体，其化学结构如式（Ⅱ）所示；所述的动物固醇、碱和末端氨基Boc保护的氨基酸的摩尔比为1.0：1.0～2.0；1.0～1.5；所述的动物固醇为胆固醇或氢化胆固醇；

第二步骤：将具有末端氨基Boc保护的动物固醇中间体溶于有机溶剂中，加入酸常温搅拌2-4h后，加入过量碱将酸中和，然后加入等摩尔比的叔丁氧羰基-N^ω-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸再加入缩合剂常温反应10-24h得到具有Pbf和Boc保护基的含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质，其化学结构如式（Ⅲ）所示；所述的具有末端氨基Boc保护的动物固醇中间体：酸：过量的碱：叔丁氧羰基-N^ω-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨的摩尔比为1.0：1:0～2.0：2.0～3.5：1.0；所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、羰基二咪唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；

第三步骤：将步骤二所得的具有Pbf和Boc保护基的含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质溶于干燥有机溶剂中，加入过量酸进行脱保护，常温搅拌2-4h得到一种如结构式（Ⅰ）所示的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质;所述的脂质和酸的投料摩尔比为1:2.0～3.5；

所述的Boc表示叔丁氧羰基；所述的Pbf表示2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基。

3.如权利要求2所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，其特征是步骤一、二、三中，所述有机溶剂是乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、乙腈、丙酮、苯或甲苯。

4.如权利要求2所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，其特征是步骤一或二中所述合成中使用的碱是二乙胺、三乙胺、氨水、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、甲醇钾、1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷、1,8-二氮杂环[5,4,0]十一烯-7、吡啶、甲基吡啶或4-二甲氨基吡啶。

5.如权利要求2所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，其特征是步骤一中使用的末端氨基Boc保护的氨基酸是ω-氨基乙酸

ω-氨基丙酸

ω-氨基丁酸

ω-氨基戊酸

ω-氨基己酸ω-氨基庚酸

ω-氨基辛酸

ω-氨基壬酸

ω-氨基癸酸ω-氨基-十一酸ω-氨基十二酸

6.如权利要求2所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，其特征是所述步骤二、三中使用的酸为盐酸、高氯酸、三氟甲磺酸或三氟乙酸。

7.如权利要求2所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，其特征是所述步骤一或二的产物经过蒸馏、柱层析纯化。

8.如权利要求2所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，其特征是所述步骤三的产物经过蒸除有机溶剂、加入醚进行沉淀好过滤干燥纯化；所述的醚是乙醚、丙醚、异丙醚、丁醚、甲基叔丁基醚、甲基乙烯基醚、乙二醇二甲醚或二苯醚。

9.如权利要求7所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的方法，其特征是所述柱层析纯化使用的有机溶剂是乙酸乙酯、四氢呋喃、1,4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、1,2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯、或者它们的混合溶剂。

10.一种如权利要求1所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质作为基因传输载体材料的应用。

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