CN103159819A - 一种胆固醇衍生物的合成及其在基因转染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质、制备方法及其用途。采用化学偶联反应方法合成的一种含有胆固醇结构片段的脂质，方法简便、高效、易操作，并且偶联反应的起始原料，如疏水性胆固醇炔基化合物以及作为阳离子模块的叠氮功能化合物易于模块化设计和制备。同时，本发明获得的脂质分子能够在缓冲液中高效结合基因形成稳定的复合体，并通过活细胞内转染，高效表达目标蛋白或释放出包裹的模型药物。不仅可以作为低毒、高效的基因和药物缓释载体生物材料应用，也可以作为一种高效、低毒阳离子型功能表面活性剂在日用化工、个人护理用品等工业领域应用。

Description

一种胆固醇衍生物的合成及其在基因转染中的应用

技术领域

本发明涉及合成类脂质生物载体材料领域，特别涉及一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子功能分子的制备及其在制备基因转染试剂和生物载体材料中的应用。

背景技术

基因治疗主要是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段以纠正或补偿基因的缺陷或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的，而基因投递系统则是指将目的基因、基因片断或短链干扰RNA导入靶细胞以达到治疗目的的方式。基因投递系统是恶性肿瘤基因治疗最为关键的瓶颈问题，也是制约恶性肿瘤基因治疗从实验研究到临床应用的核心技术问题。基因投递系统主要依赖于载体系统，而理想的基因载体应具备：(1)靶向特异性，并且可被免疫系统识别；(2)高度稳定，容易制备，可浓缩和纯化；(3)无毒性，对病人及环境安全无害；(4)有利于基因高效转移和长期表达。而本发明的主要目的是构建一种制备简单、成本低廉、安全性好、转染效率高的非病毒基因载体系统。

目前，在基因载体的设计上，大致可分为两大类：病毒类和非病毒类。病毒载体效率较高，但存在导向性差、携带能力低、免疫原性和潜在致瘤性等缺点。非病毒性载体主要是针对病毒载体的缺点而研制的，并具有低毒性、低免疫原性、低致瘤性、易制备等优点，其主要包括：真核细胞表达质粒载体、阳离子聚合物、阳离子脂质体、聚合物嵌段共聚物和胶束等。

常用的可用于基因转染的阳离子聚合物包括聚赖氨酸(poly-L-lysine，PLL)、多聚赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺(polyehylenimine，PEI)、天然高分子生物材料壳聚糖、树枝状大分子、及由这些阳性聚合物载体所构建的聚合物胶束系统和聚合物微球(聚乳酸类)；如聚乙二醇(PEG)修饰的PLL(PEG-PLL)、硬脂酰化聚赖氨酸、转铁蛋白修饰的PLL、PEG-PEI、PEG-壳聚糖、PEI-壳聚糖、壳聚糖季铵盐等。这些材料作为转基因的载体有其优越性，然而也或多或少的存在转染效率低、稳定性差、部分材料毒性大、制备工艺复杂等问题；再者微球材料工艺中使用的有机金属催化剂、有机溶剂和稳定剂的残存都可能在转染中引起不容忽视的副作用，微球包裹外源基因也可能在制备消毒过程中受损。

目前，研究采用具有生物相容性的脂质化合物构建新型阳离子生物载体材料成为合成功能脂质分子研究开发应用的重要方向之一。胆固醇是一种具有重要生理活性的天然甾体化合物，其在动物体内多种脂质结构中(如低密度脂蛋白LDL)以及自由分子或者化学键合形态广泛存在，具有较强疏水性的疏水性和良好的生物相容性。因此，充分利用胆固醇类天然产物的疏水性骨架结构，通过进一步化学偶联水溶性阳离子片段，可以合成制备新型合成脂质阳离子有机功能分子，降低合成脂质阳离子的细胞毒性，其不仅有可能应用作为新型生物相容性基因载体功能材料，同时也是一类潜在的生物相容性绿色环保功能表面活性剂。

近年来，国内外合成报道了多种由天然胆固醇衍生的阳离子表面活性剂，如胆固醇季胺盐(J.Med.Chem.2007，50，2432)、胆固醇取代胺类(Int.J.Pharm.2004，278，143)等，这些合成阳离子脂质在药物和基因输送载体应用得到广泛研究。一些基于天然胆固醇的阳离子脂质表面活性剂表现出了良好的药物负载、可控缓释和以及基因的输送与细胞内转染效果，提高了载体与药物或者基因复合纳米粒子的细胞内吞能力。在此基础上，人们又相继合成了由核苷酸或者氯喹修饰的胆固醇衍生物阳离子脂质，发展更为有效可控的基因输送载体体系。

另一方面，在实际应用中，许多由胆固醇衍生的基因输送载体合成步骤复杂繁琐，其合成制备方法的通用性欠佳。因此，进一步研究和开发由天然胆固醇构建新型生物相容性类脂质阳离子有机功能分子，尤其能同时具有较低细胞毒性和良好亲/疏水性以及易于化学衍生的类脂质有机功能分子，将有力地扩展合成基于胆固醇脂质分子种类，推动脂质简便低成本合成方法的创新，拓展其作为生物医药功能载体以及新型表面活性剂的应用，这些是本发明所致力解决的目标。

发明详述

本发明的目的是提供一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子作为基因输送载体功能材料及生物相容性表面活性剂的用途。

根据本发明所提供的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子，其化学结构可由通式(I)表示：

式(I)

其中，AA+表示氨基酸砌块，包括阳离子型天然氨基酸、阳离子树枝状天然氨基酸、阳离子小肽、阳离子氨基酸类衍生物；

n为1-20自然数；

M-表示阴离子反离子部分，包括氯负离子、溴负离子、碘负离子、硫酸根负离子、硝酸根负离子、高氯酸根负离子、甲酸根负离子、磷酸根负离子、焦磷酸根负离子、柠檬酸根负离子或三氟乙酸根负离子(TFA-)。

在一种优选实施方案中，本发明所提供的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子，其脂质分子化学结构可由通式(I)表示：

式(I)

其中，AA+是L-精氨酸等；

n是1-3自然数；

M-是三氟乙酸根。

依据本发明中所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的合成制备方法，主要由以下步骤制备：

第一步，将Boc侧链保护的氨基酸或氨基酸多聚物溶于充分脱水干燥的有机溶剂中，在碱催化下缓慢滴加到事先溶于有机溶剂的胆固醇氯甲酸酯或胆固醇对甲苯磺酸酯中，于合适温度下搅拌反应一定时间，然后蒸馏除去有机溶剂，然后用柱层析分离纯化制备得到胆固醇单取代结构的中间体。

第二步，使用三氟乙酸做溶剂，催化量EDT和苯甲硫醚，室温下脱去侧链保护基Boc，反应时间为2-8小时。加6倍体积的冷的乙醚沉淀。过滤，冷乙醚洗，干燥可得阳离子胆固醇。

所述有机溶剂为乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯，优选四氢呋喃。

所述碱选自二乙胺、三乙胺、氨水、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、甲醇钾、磷酸钠、磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、吡啶、甲基吡啶、4-二甲氨基吡啶、DMAP，优选DMAP。

所述的碱、氨基酸、胆固醇氯甲酸酯或胆固醇对甲苯磺酸酯的摩尔比为0.05～0.1∶3.0～5.0.1.0。

所述合适温度为0～80℃，优选室温下。

第一步中所述一定时间为3～30小时，优选12小时。

第二步中所述反应时间优选为4小时。

本发明所述的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的用途，其作为新型高效低毒的类脂质基因转染试剂和生物载体材料。

根据本发明提供的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子，与已有的相关报道相比(例如，Proc.Nat.Acad.Sci.USA.1996，93，9682；GeneTher.2001，8，855；Mol.Pharmaceutics.2008，5，128)，具有如下的优点：

(1)根据本发明中所提供的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子的疏水结构片段来源于资源丰富的天然产物胆固醇，亲水阳离子结构片段来源于可大量获得的天然氨基酸，相关合成制备方法简单高效，易于实现低成本规模化制备与应用推广；

(2)根据本发明中所提供的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子具有良好的化合物纯度和水溶性，与已有商品化的枝化分子结构聚乙烯亚胺阳离子高分子基因转染试剂bPEI-25k相比具有明显较低的细胞毒性。同时采用上述系列类脂质阳离子有机功能分子作为基因功能载体的COS-7，HeLa，A549等多种来源细胞株的基因转染效率评价结果表明具有较高的基因转染效率，可望开发应用作为新型高效低毒的类脂质基因转染试剂和生物载体材料；

(3)根据本发明中所提供的一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子具有较强的乳化能力和良好的生物相容性，可应用作为生物相容性绿色环保的特种功能表面活性剂用于化妆品以及个人护理用品的生产制造。

附图说明

图1、实施例1-3中所述的合成脂质阳离子有机功能分子与对照组为市售转染试剂bPEI-25K、赖氨酸阳离子合成磷脂的COS-7细胞体外细胞毒性评价结果。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步描述本发明，但并没有限制本发明的范围。

实施例1

将BOC-Arg(Pbf)-OH(52.7g，0.1mol)溶于400ml干燥的四氢呋喃中，在5g DMAP的催化下缓慢滴加到溶于200ml干燥四氢呋喃的胆固醇(38.7g，0.1mol)中，加入EDC缩合剂(38.4g，0.2mol)后于室温搅拌反应24h，蒸馏除去有机溶剂，萃取，过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚)，粗产品溶于150ml三氟乙酸，3.8ml EDT，7.6ml苯甲硫醚中，室温搅拌反应4h后，加入乙醚沉淀，过滤干燥得到一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子，合成产率为61％。

1H NMR(CDCl₃，300MHz)：5.38(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.55(m，1H，CHOCO)，4.53(m，1H，OCOCH)，3.35(t，2H，CH2NH)，2.32-0.98(m，45H，胆固醇)，2.32-0.98(m，4H，精氨酸)。

ESI-MS：543.9(M+H).

实施例2

将BOC-Arg(Pbf)-OH二聚体(87.4g，0.1mol)溶于600ml干燥的四氢呋喃中，在5g DMAP的催化下缓慢滴加到溶于200ml干燥四氢呋喃的胆固醇(38.7g，0.1mol)中，加入EDC缩合剂(38.4g，0.2mol)后于室温搅拌反应24h，蒸馏除去有机溶剂，萃取，过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚)，粗产品溶于150ml三氟乙酸，3.8ml EDT，7.6ml苯甲硫醚中，室温搅拌反应4h后，加入乙醚沉淀，过滤干燥得到一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子，合成产率为53％。

1H NMR(CDCl3，300MHz)：5.36(s，1H，C＝CH，胆固醇)，4.58(m，2H，CHOCO)，4.50(m，1H，OCOCH)，3.36(t，4H，CH2NH)，2.32-0.96(m，45H，胆固醇)，2.32-0.96(m，8H，精氨酸)。

ESI-MS：700.2(M+H).

实施例3

将BOC-Arg(Pbf)-OH二聚体(122.1g，0.1mol)溶于800ml干燥的四氢呋喃中，在5g DMAP的催化下缓慢滴加到溶于200ml干燥四氢呋喃的胆固醇(38.7g，0.1mol)中，加入EDC缩合剂(38.4g，0.2mol)后于室温搅拌反应24h，蒸馏除去有机溶剂，萃取，过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚)，粗产品溶于150ml三氟乙酸，3.8ml EDT，7.6ml苯甲硫醚中，室温搅拌反应4h后，加入乙醚沉淀，过滤干燥得到一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子，合成产率为55％。ESI-MS：856.4(M+H).

实施例4类脂质阳离子有机功能分子细胞毒性的评价方法

本发明实施例1-3中所述的类脂质阳离子有机功能分子的细胞毒性评估采用MTT法，主要试验方法如下：将COS-7细胞以每孔5×103个细胞的密度接种于96孔培养板中，其中每孔加入100μL含有10％FBS的DMEM培养基。然后将该96孔板于37℃和5％CO2浓度条件下孵育24小时后，加入不同浓度的类脂质阳离子有机功能分子继续孵育48小时，其后每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)后继续孵育4小时。进一步每孔加入100L DMSO溶解生成的甲臢化合物，用酶标仪(BioTek，ELx800，USA)测定490/630nm波长处的吸光度值。实验中以枝化bPEI-25K为参比样品评价根据本发明所提供的类脂质阳离子有机功能分子的细胞毒性。

本发明实施例1和实施例3中所述的合成脂质阳离子有机功能分子的COS-7细胞体外细胞毒性评价与对照组为市售转染试剂bPEI-25K，从图1中MTT法细胞毒性评价结果显示依据该发明所制备的脂质阳离子有机功能分子相同质量浓度下COS-7细胞毒性远低于参照bPEI-25K，也低于赖氨酸阳离子合成磷脂。

实施例5类脂质阳离子有机功能分子作为基因载体的荧光素酶法基因转染效率评价方法

按常规方法，进行基因转染实验，结果表明，所制备的阳离子高分子脂质体系统在293T(市购)和NIH-3T3(市购)细胞中的转染效率与阳性对照阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000相当.在乳腺癌MCF-7细胞中的转染效率明显高于阳性对照阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000；在肝癌Huh-7和SMMC-7721细胞中的转染效率高于阳性对照阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000。

本发明公开和揭示的靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体、制备方法及应用，可通过借鉴本文公开内容。尽管本发明的靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体、制备方法及应用已通过较佳实施例进行了描述，但是本领域技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法改动，更具体地说，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims (10)

1.一种由天然胆固醇和氨基酸偶联合成的类脂质阳离子有机功能分子，其化学结构可由通式(I)表示：

式(I)

其中，AA+表示氨基酸砌块，包括阳离子型天然氨基酸、阳离子树枝状天然氨基酸、阳离子小肽、阳离子氨基酸类衍生物；

n为1-20自然数；

M-表示阴离子反离子部分，包括氯负离子、溴负离子、碘负离子、硫酸根负离子、硝酸根负离子、高氯酸根负离子、甲酸根负离子、磷酸根负离子、焦磷酸根负离子、柠檬酸根负离子或三氟乙酸根负离子(TFA-)。

2.根据权利要求1所述的类脂质阳离子有机功能分子，

其中，AA+是L-精氨酸等；

n是1-3自然数；

M-是三氟乙酸根。

3.根据权利要求1或2所述的类脂质阳离子有机功能分子，其特征在于所述类脂质阳离子有机功能分子制备方法包括以下步骤：

第一步，将Boc侧链保护的氨基酸或氨基酸多聚物溶于充分脱水干燥的有机溶剂中，在碱催化下缓慢滴加到事先溶于有机溶剂的胆固醇氯甲酸酯或胆固醇对甲苯磺酸酯中，于合适温度下搅拌反应一定时间，然后蒸馏除去有机溶剂，然后用柱层析分离纯化制备得到胆固醇单取代结构的中间体；

第二步，使用三氟乙酸做溶剂，催化量EDT和苯甲硫醚，室温下脱去侧链保护基Boc，反应时间为2-8小时。加6倍体积的冷的乙醚沉淀。过滤，冷乙醚洗，干燥可得阳离子胆固醇。

4.根据权利要求3所述的类脂质阳离子有机功能分子制备方法，其中所述有机溶剂为乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯，优选四氢呋喃。

5.根据权利要求3所述的类脂质阳离子有机功能分子制备方法，其中所述碱选自二乙胺、三乙胺、氨水、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、甲醇钾、磷酸钠、磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、吡啶、甲基吡啶、4-二甲氨基吡啶、DMAP，优选DMAP。

6.根据权利要求3所述的类脂质阳离子有机功能分子制备方法，其中所述的碱、氨基酸、胆固醇氯甲酸酯或胆固醇对甲苯磺酸酯的摩尔比为0.05～0.1∶3.0～5.0∶1.0。

7.根据权利要求3所述的类脂质阳离子有机功能分子制备方法，其中所述的合适温度为0～80℃，优选室温下。

8.根据权利要求3所述的类脂质阳离子有机功能分子制备方法，其中所述的第一步中所述一定时间为3～30小时，优选12小时。

9.根据权利要求3所述的类脂质阳离子有机功能分子制备方法，其中所述的第二步中所述反应时间优选为4小时。

10.权利要求1-2所述的类脂质阳离子有机功能分子，其作为基因转染试剂和生物载体材料中的应用。

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