CN103804458A - 基于胆固醇的三种脂质材料的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及三种新型脂质类化合物及其制备方法，该类物质可用于阳离子脂质体的制备和基因类药物的传递。本发明的脂质材料是在胆固醇中有效引入碱性氨基酸多胺基残基，所构建的新型材料具有优良的基因转染活性。本发明化合物的优点是通过己二醇醚键将胆固醇与氨基酸相连，增加脂质材料的稳定性的同时保持胆固醇与氨基酸拼合的优点，从而提高基因转染效果。

Description

基于胆固醇的三种脂质材料的制备及其应用

所属技术领域

本发明涉及三种新型脂质类化合物及其制备方法，该类物质可用于阳离子脂质体的制备和基因类药物的传递。

背景技术

基因治疗在现代医药治疗中发挥越来越重要的作用。有效的基因治疗依赖于外源基因在体内高效、稳定的表达，而这在很大程度上取决基因治疗所采用的载体系统。目前用于基因治疗的载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体转染率高，但其存在免疫原性，具有较大的危险性，限制了它在临床基因治疗上的应用。非病毒载体和病毒载体相比，具有毒性低、免疫原性低，而且所携带的基因不整合至宿主细胞基因组等优点。阳离子脂质体是非病毒载体中最典型的载体，被称为基因治疗领域内最有希望的基因转染载体。因此，开发新型脂质材料是构建基因治疗载体的关键，对进行有效的基因治疗具有重要意义。

阳离子脂质体通常由阳离子脂质材料和其它天然脂质组成。阳离子脂质由可质子化的极性头部、连接臂和疏水基团3部分组成。极性头部为含胺类基团，疏水基团主要由双链烷基或胆固醇组成。目前，多胺与胆固醇的缀合是设计合成新型高效脂质材料的有效途径。多胺的多阳离子易与核酸形成静电复合物而携带基因，胆固醇的亲脂性使其可顺利通过质膜，能够明显提高载体系统的基因转染效率。连接臂通常有氨甲酰键(DC-chol，Biochem Bioph ResCo，1991，1235，296-307；Biomacromolecules，2002，3，1197-1207)、醚键(Eur J Pharm Biopharm，1999，47，175-178)、酯键(CN103159819A；Bioconjugate Chem.1999，10，791-796；Int J Pharm，2011，408，183-190)或酰胺键(WO2011／84721；Int J Pharm，2013，443，221-229)，其中基于胆固醇的DC-chol由于在多种细胞上显示良好的转染效果，已成为商品化试剂被广泛应用基因传递载体。因此，基于胆固醇疏水基团，采用不同方式合理构建多氨基极性头部，将有力地扩展阳离子脂质体的脂质分子种类，有望为基因转染提供载体材料，推动基因治疗在医药学中的进一步应用。

发明内容

本发明的目的是提供三种新型脂质类化合物与其药学上可接受的盐及其制备方法，进一步的目的在于提供该类化合物在制备阳离子脂质体和基因类药物传递中的用途。本发明在系统分析阳离子脂质体结构和转染机制基础上，以廉价易得的天然胆固醇为起始原料，以6-氨基-1-己醇为连接臂，合成中间体胆甾-5-烯-3β-6′-氨基己基醚。并在中间体胆甾-5-烯-3β-6′-氨基己基醚的基础上，与赖氨酸、组氨酸和精氨酸三种碱性氨基酸分别反应，在胆固醇结构中通过碱性氨基酸引入不同的氨基基团，设计合成了三种新型多胺脂质材料。本发明的脂质材料是在胆固醇中有效引入碱性氨基酸多氨基残基，所构建的新型材料材料具有优良的基因转染活性。本发明化合物的优点是采用己二醇连接臂醚键将来源丰富的天然产物胆固醇与氨基酸相连，通过碱性氨基酸引入多胺基，增加脂质材料稳定性的同时保持胆固醇与氨基酸拼合的优点，从而提高了其脂质体的稳定性和基因转染效果。

本发明的化合物结构通式(I)如下

其中：

R为赖氨酸残基

精氨酸残基

或组氨酸残基

上述化合物药学上可接受的盐中所述阴离子为氯负离子、溴负离子、碘负离子、碳酸根离子、硝酸根离子、磷酸根离子、乙酸根离子、硫酸根离子或三氟乙酸根离子。

通式化合物的制备方法：

通式(I)所示的化合物可以用如下方法制备。以胆甾-5-烯-3β-6′-氨基己基醚为原料，经与BOC保护的赖氨酸、组氨酸或精氨酸在四氢呋喃，二氯甲烷，二氧六环，或上述混合溶剂中在室温下经DCC-NHS催化或DCC-DMAP催化反应得系列目标化合物(I)。(I)所示化合物合成时，优选条件为在四氢呋喃中采用DCC-NHS催化的方法。(I)与相应摩尔比盐酸、氢溴酸，氢碘酸、碳酸、硝酸、磷酸、乙酸、硫酸或三氟乙酸在溶剂甲醇、乙醇、乙醚、四氢呋喃、丙酮、水、1，4-二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺或上述溶剂的混合溶剂中成盐反应进一步得药学上可接受的盐。

本发明同时提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐作为脂质材料与其它适合的脂质材料或赋形剂形成的阳离子脂质体。所得阳离子脂质体与DNA、RNA或其它化学药物装载后，可以配制成注射、口服、口腔、舌下、植入或局部用药的药用组合物。本发明优选注射给药。

本发明的三种新型脂质类化合物可用于阳离子脂质体的制备和基因类药物的传递。实验结果表明，上述化合物与已上市的胆固醇衍生脂质材料DC-Chol相比，提高了阳离子脂质体的基因转染效果，在HeLa，293细胞株的基因转染评价中显示良好的转染效率，可望开发应用作为高效低毒的阳离子脂质体材料和基因转染试剂。基因转染效果的评价试验方法是本领域技术人员公知的，参见背景技术相关技术文献，在此引入作为参考。而且，在相关实施方案中，预期本发明的脂质材料与相应脂质体，在化学药物与基因药物共递送联合治疗疾病时，可用于协同治疗或降低每种疗法剂量和药物毒副作用。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步描述，本发明范围不限于以下实例。

实施例1通式(I)中化合物I-1的合成

将546mg(1.57mmol，1.2eq)N，N′-二叔丁氧羰基赖氨酸(2)溶于30mL THF中，冰浴搅拌下加入814mg(3.93mmol，3.0eq)DCC和181mg(1.58mmol，1.2eq)NHS。30min后撤去冰浴，室温反应1h后加入638mg(1.31mmo1)胆甾-5-烯-3β-6′-氨基己基醚(1)。继续反应6h后，抽滤，滤液减压蒸除溶剂后加入50mL氯仿溶解，用15mL×3水洗涤，有机相加入无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸除溶剂，得中间体3.

中间体3不经纯化直接溶于12mL二氯甲烷中，冰浴搅拌下缓慢加入12mL TFA。反应2h后，减压蒸除溶剂。残余物用40mL二氯甲烷溶解，用三乙胺调节pH=7，用15mL×3水洗涤，有机相加入无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸除溶剂，残余物用30mL乙酸乙酯溶解，2mol／L HCl水溶液调节pH至1-2，用20mL×3水萃取。合并水相，用2mol／L的NaOH水溶液调节pH至11-12，用40mL×3乙酸乙酯萃取，合并有机相，40mL水洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸除溶剂，得淡黄色固体429mg。总收率53.2％(以胆甾-5-烯-3β-6′-氨基己基醚计算)。熔点：142℃-144℃。MS得到的准分子离子峰为m／z=615[M+H]⁺。IR(KBr)：3443，3421，3386，1653，1635，1219，771，693，556cm^-1。¹H NMR(CDCl₃)δ=5.35(t，J＝2.4Hz，1H)，4.10-4.08(m，2H)，3.51-3.43(m，3H)，1.95-0.75(m，65H)。经质谱、红外、核磁共振鉴定，所得产物与目标物结构一致。

实施例2通式(I)中化合物I-1盐酸盐的合成

在干燥的50mL圆底烧瓶中加入化合物0.18g I-1和甲醇10mL。冰浴下将温度降至0℃-5℃，加入0.2M盐酸2mL(1.3eq)，搅拌下反应0.5小时后撤去冰浴。室温下继续反应3小时后减压蒸除溶剂。加20mL乙醚，振荡，抽滤，干燥得白色固体二钠盐0.17g。收率87％；mp：220℃(分解)。m／z=615[M+H]⁺。IR(KBr)：3440，2356，2340，1662，1635，1090，762cm^-1.如以其它酸如氢溴酸，氢碘酸、、碳酸、硝酸、磷酸、乙酸、硫酸或三氟乙酸代替盐酸反应时可得其它药学上可接收的盐。

通式(I)中其它化合物及盐类产物参照上述实施例1和2方法以BOC保护的精氨酸或组氨酸为原料，相同摩尔比替换BOC保护赖氨酸2制得。精氨酸连接物I-2：总收率48.5％(以胆甾-5-烯-3β-6′-氨基己基醚计算)。MS得到的准分子离子峰为m／z=643[M+H]⁺。IR(KBr)：3445，3426，3392，1640，1220，775cm^-1。¹H NMR(CDCl₃)5=5.37(t，J=2.2Hz，1H)，4.12-3.47(m，6H)，1.95-0.75(m，63H)。组氨酸连接物I-3：总收率52.4％(以胆甾-5-烯-3β-6′-氨基己基醚计算)。熔点：137℃-139℃。MS得到的准分子离子峰为m／z=638[M+H]⁺。IR(KBr)：3446，3372，1645，1219，1627，1088，771，689，556cm^-1。¹H NMR(CDCl₃)δ=7.55(s，1H)，6.84(s，1H)，5.35(d，J=2.4Hz，1H)，3.60-3.42(m，3H)，3.25(t，J=7.0Hz，2H)，3.25-3.23(m，1H)，2.51(t，J=6.0Hz，2H)，2.02-0.85(m，57H)。

实施例3通式(I)中脂质类化合物的应用

1、阳离子脂质体的制备

按照摩尔比为1∶1称取适量的阳离子脂质材料(I)或阳性对照DC-Chol和DOPE溶于5mL氯仿中，在旋转蒸发仪上减压除去溶剂，在瓶壁形成一层薄膜。加入适量的去离子水溶胀12h后超声30min，配成终浓度为1mmol／L空白脂质体溶液。分别用0.8um、0.45um、0.22um的滤膜过滤三次后得阳离子脂质体，置于4℃的冰箱中保存备用。

2、阳离子脂质体／DNA复合物的制备及转染活性评价

用移液枪取一定量的空白阳离子脂质体稀释于一定体积的去离子水中，取一定量的质粒pEGFP-N1稀释于一定体积的去离子水中，静止5min后，将含质粒pEGFP-N1去离子水缓慢加入到含有阳离子脂质体的溶液中，混合均匀，配成一定比例的阳离子脂质体／DNA复合物溶液，用于转染活性评价。每孔DNA的用量为0.8ug，稀释到50uL无血清的DMEM培养液中，轻轻混匀，静止5min。将上述阳离子脂质体分为六个梯度3.6uL，10.8uL，18uL，21.6uL，25.2uL，28.8uL分别加入到50uL无血清的DMEM培养液，将稀释的脂质体加入DNA溶液中混匀，室温静置20min。相对应的N／P=1∶1、3∶1、9∶1、15∶1、20∶1、24∶1。

培养Hela细胞或293细胞，传入24孔板，密度为0.5x10⁵个／mL，待细胞达到50-60％进行转染。在转染前，将24孔板的培养液换成500uL不含抗生素的培养液培养。将100uL脂质体／DNA复合物加入到细胞中，补加无血清DMEM300ul，轻轻混匀，常规条件培养，细胞孵育24小时后，换成含10％血清DMEM培养液。继续培养24小时后常规处理后流式细胞仪观测。

3、实验结果

转染评价实验结果表明，上述三种脂质材料I-1、I-2和I-3都有良好的基因转染效果，在HeLa，293细胞株的pEGFP基因转染评价中显示出好的基因表达效率。与已上市的胆固醇衍生脂质材料DC-Chol相比，在最佳N／P比时，脂质材料I-2在HeLa细胞中转染效率与DC-Chol阳性对照组相当，脂质材料I-1和I-3转染效果明显优于DC-Chol阳性对照组。在293细胞中I-1、I-2和I-3转染效果均优于DC-Chol阳性对照组。研究表明多胺头部的引入可明显提高转染效果，可望开发应用作为高效的阳离子脂质体材料和基因转染试剂，部分活性测定结果如表1。

表1.脂质材料对不同细胞株的转染效果

Claims (6)

1.通式(I)所示的脂质类化合物或其药学上可接受的盐类，

其中：

R为赖氨酸残基精氨酸残基

和组氨酸残基

2.根据权利要求1所述脂质类化合物(I)药学上可接受的盐中所述阴离子为氯负离子、溴负离子、碘负离子、碳酸根离子、硝酸根离子、磷酸根离子、乙酸根离子、硫酸根离子或三氟乙酸根离子。

3.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于：以胆甾-5-烯-3β-6′-氨基己基醚为原料，经与BOC保护的赖氨酸、组氨酸或精氨酸在四氢呋喃，二氯甲烷，二氧六环，或上述混合溶剂中在室温下经DCC-NHS催化或DCC-DMAP催化反应制得目标化合物(I)。

4.权利要求2所述化合物药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于：通式(I)所述的化合物与相应摩尔比盐酸、氢溴酸，氢碘酸、碳酸、硝酸、磷酸、乙酸、硫酸或三氟乙酸在溶剂甲醇、乙醇、乙醚、四氢呋喃、丙酮、水、1，4-二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺或上述溶剂的混合溶剂中成盐反应得药学上可接受的盐。

5.一种阳离子脂质体，其含有权利要求1或2中所述的通式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐类，以及一种或多种其他脂质材料或赋形剂。

6.权利要求1或2中所述的通式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐类在制备阳离子脂质体及传递基因方面的用途。