CN104402818B

CN104402818B - 一种具有肿瘤响应性释放药物的化合物或其药用盐及其制备、应用

Info

Publication number: CN104402818B
Application number: CN201410769419.3A
Authority: CN
Inventors: 王建红; 陈冰; 高凡; 齐建国; 张树峰; 冬海洋
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2014-12-15
Filing date: 2014-12-15
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2034-12-15
Also published as: CN104402818A

Abstract

一种具有肿瘤响应性释放药物的化合物或其药用盐及其制备、应用，属于药物靶向释放技术领域，其结构式如下：

Description

一种具有肿瘤响应性释放药物的化合物或其药用盐及其制备、应用

技术领域

本发明属于药物靶向释放技术领域，具体涉及一种具有肿瘤响应性释放药物的化合物或其药用盐及其制备、应用。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类健康的重要疾病之一。近年来的肿瘤疾病具有发病率高、病死率高、易转移及临床治疗药物副作用大等诸多不利因素。目前，化学药物治疗仍然是大多数恶性肿瘤的主要治疗方法。然而，临床应用的抗肿瘤药物主要基于其本身具有的细胞毒性而产生肿瘤细胞生长抑制作用，进而达到抑制肿瘤发展的目的。但是，这些细胞毒剂往往不能区分正常组织细胞和异化的肿瘤细胞，在应用中产生肿瘤抑制作用的同时，又能够杀死正常的组织细胞，因而产生系统毒副作用，如脱发、骨髓抑制、胃肠道刺激等。靶向抗肿瘤药物设计策略为该问题提出了可行性解决方案。当前的靶向抗肿瘤药物研究主要涉及新型肿瘤特异性蛋白抑制剂、肿瘤细胞专一性识别、转运等方面。其中的肿瘤药物靶向转运、释放策略是目前活跃的研究方向，它既解决了肿瘤细胞特异性识别，又能产生有效的生长抑制作用，具有潜在的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有肿瘤响应性释放药物的化合物或其药用盐及其制备、应用。

基于上述目的，本发明采取了如下技术方案：

一种具有肿瘤响应性释放药物的化合物或其药用盐，该化合物结构式如下：

。

上述化合物或其药用盐的制备方法，具体合成路线如下：

制备步骤如下：

（1）将巯基丙酸溶于二氯甲烷，冰浴条件下加入EDC∙HCl（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）和HOSU（N-羟基琥珀酰亚胺），再加入Boc单保护的丙二胺，后处理得化合物1；

（2）将2-甲氧基-4-硝基苯胺溶于乙醇中，滴加浓盐酸，加入9-氯吖啶的氯仿溶液，经后处理得化合物2；

（3）将SnCl₂溶于浓盐酸中，加入化合物2，反应结束后，用浓氨水调至中性，经后处理得化合物3；

（4）将甲磺酰氯溶二氯甲烷中，滴加三乙胺后，再加入化合物3，反应结束后，经后处理得化合物4；

（5）将化合物4溶于二氯甲烷中，滴加DIPEA（N,N-二异丙基乙胺），然后将光气溶于二氯甲烷中，冰浴条件下，滴加到前述溶液中，反应完全后，依次加入吡啶-2-二硫基乙醇、DMAP（4-二甲氨基吡啶），反应结束后经后处理得化合物5；

（6）将化合物5溶于二氯甲烷中，加入化合物1，反应结束后，经后处理得化合物6；

（7）将化合物6溶于丙酮中，加入盐酸成盐，收集固体，干燥，即得化合物7。

步骤（1）中，巯基丙酸、EDC∙HCl、HOSU和Boc单保护的丙二胺的摩尔比为1︰1︰1︰1.1。

步骤（5）中，化合物4、DIPEA、吡啶-2-二硫基乙醇和DMAP摩尔比为1︰4︰1︰1。

上述化合物或其药用盐在制备新型肿瘤响应性作用的抗肿瘤药物前药中的应用。

本发明设计、合成一种新型肿瘤细胞敏感性化合物，其在正常生理环境中能够稳定存在，进入肿瘤细胞后，在肿瘤细胞内高浓度谷胱甘肽环境下能够发生串联反应从而释放出安吖啶药物，可用于制备新型靶向抗肿瘤药物。此外，本发明所述化合物的制备方法具有操作简便、条件温和、反应收率高等特点。

附图说明

图1是化合物7在pH=7.4时的稳定性；

图2化合物7在不同谷胱甘肽环境下的稳定性；

图3化合物7在不同浓度谷胱甘肽存在下的变化；

图4安吖啶的HPLC分析；

图5是化合物1的¹HNMR图谱；

图6是化合物2的¹HNMR图谱；

图7是化合物3的¹HNMR图谱；

图8是化合物4的¹HNMR图谱；

图9是化合物5的¹HNMR图谱；

图10是化合物7的¹HNMR图谱。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。

仪器与主要化学试剂

Bruker AV-400型核磁共振仪（德国）；Esquire 3000型LC-MS质谱仪（德国）；Agilent 1200高效液相色谱仪（美国）。

本发明实施过程中所用的原料、溶剂均为商业途径购进。

实施例1 制备化合物7：

1. 化合物1的合成：

将0.32g ( 3mmol)巯基丙酸溶于干燥的30mL二氯甲烷中，在冰水浴条件下加入0.57g（3mmol）EDC∙HCl（中文名：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）和0.34g（3mmol）HOSU（N-羟基琥珀酰亚胺），搅拌3个小时，加入Boc单保护的丙二胺0.574 g(3.3mmol)，室温搅拌12小时。水洗三次后，粗产品柱层析柱分离（洗脱剂：V_石油醚︰V_丙酮= 5︰1），得到化合物1，产率23.6%。

附图5为目标化合物1的¹HNMR图谱，实验数据如下：

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 6.13 (s, 1H), 4.60 (d, J = 91.1 Hz, 1H),3.38 —3.25 (m, 2H), 3.16 —3.08 (m, 2H), 2.85—2.74 (m, 2H), 2.49 (t, J =6.7 Hz, 2H), 1.66 —1.58 (m, 1H), 1.56 —1.47 (m, 2H), 1.44 (s, 9H).

2. 化合物2的合成：

将化合物2-甲氧基-4-硝基苯胺96 mg (0.57 mmol)溶于7 mL无水乙醇中，冰浴中滴加催化量的浓盐酸2滴（约0.05 mL），将9-氯吖啶76 mg (0.35 mmol)溶于13 mL氯仿中，逐滴滴加到上述溶液中，冰浴中搅拌10分钟，放置室温过夜（反应时间为12h）。抽滤，将生成的沉淀用饱和的Na₂CO₃水溶液洗涤，用二氯甲烷萃取，蒸除溶剂，干燥，粗产品柱层析分离（洗脱剂：V_石油醚︰V_丙酮 = 3︰1），得到化合物2，产率68.2%。

附图6为目标化合物2的¹HNMR图谱，实验数据如下：

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.31 (s, 2H), 8.04 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.89(s, 1H), 7.83 (s, 2H), 7.69 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.53 (s, 2H), 7.33 (s, 1H),6.22 (s, 1H), 4.21 (s, 3H).

3. 化合物3的合成：

用3 mL浓HCl将SnCl₂ (117mg, 0.51mmol)溶解，加入化合物2 (60mg, 0.17mmol)，控温100 ℃反应2小时，将反应液倒入冰水中，加浓氨水调至中性，用二氯甲烷萃取，抽滤，滤出有机层，干燥，蒸除溶剂，粗产品柱层析分离（洗脱剂：V_石油醚︰V_丙酮=5︰1），得到化合物3，产率37.0%。

附图7为目标化合物3的¹HNMR图谱，实验数据如下：

¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 11.30 (s, 1H), 7.90 (d, J = 8.6 Hz, 1H),7.86 — 7.76 (m, 3H), 7.56 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.40 (d, J = 8.2 Hz, 2H),7.01 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 3.70 (s, 3H).

4. 化合物4的合成：

将甲磺酰氯(72.9mg 0.63mmol)溶解于60 mL二氯甲烷中，滴加催化量（0.5 mL）的三乙胺，将上述溶液滴加到化合物3(200mg 0.63 mmol)中，反应4小时，用饱和的碳酸钾溶液洗涤三次，旋干有机溶剂，粗产品分离过柱（洗脱剂：V_石油醚︰ V_丙酮 = 3︰1），得到化合物4，产率42.8%。

附图8为目标化合物4的¹HNMR图谱，实验数据如下：

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.21 (s, 2H), 8.06 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.74(s, 2H), 7.43 (s, 2H), 7.04 (s, 1H), 6.48 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.32 (s, 1H),4.06 (s, 3H), 2.97 (s, 3H)

5. 化合物5的合成：

将化合物4(180mg 0.46mmol)溶于干燥的30mL二氯甲烷中，滴加DIPEA(236mg1.84mmol，中文名：N,N-二异丙基乙胺), 然后将三光气(135mg 0.46mmol)溶于干燥的30mL二氯甲烷中，在冰浴条件下，逐滴滴加到上述溶液中，用TLC检测至反应完全，逐滴地加入吡啶-2-二硫基乙醇(86mg 0.46mmol)，滴加少量的DMAP(56.12mg 0.46mol，中文名：4-二甲氨基吡啶)，室温反应过夜（反应时间为12h）。将反应后的产物用水洗，分离有机层，并用无水硫酸钠干燥，粗产品柱层析分离（洗脱剂：V_二氯甲烷︰V_甲醇 = 100︰1），得到化合物5，产率41.4%。

附图9为目标化合物5的¹HNMR图谱，实验数据如下：

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.45 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 8.17 (d, J = 8.6Hz, 2H), 8.06 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.78 —7.67 (m, 2H), 7.61 — 7.52 (m, 2H),7.45—7.33 (m, 2H), 7.13 —7.02 (m, 1H), 6.90 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.59 (d, J= 6.6 Hz, 1H), 6.47 (s, 1H), 4.46 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 4.01 (s, 3H), 3.47 (s,3H), 3.04 (t, J = 6.2 Hz, 2H).

6. 化合物6的合成：

将化合物5(138mg0.22mmol) 溶于20 mL二氯甲烷中，加入化合物1(75mg0.26mmol) ，在室温条件下，搅拌反应6小时。层析柱分离(洗脱剂：二氯甲烷︰甲醇=100︰1)，得到化合物6。化合物6粗分离后直接进行下一步反应，产率66.4%。

7. 化合物7的合成：

将0.2 mmol化合物6溶于20 mL丙酮中，滴加0.8mL、2mol/L的稀盐酸，室温搅拌反应12小时。将生成的沉淀分离，用丙酮洗涤3次，收集固体干燥，得到化合物7，产率72.7%。

附图10为目标化合物7的¹HNMR图谱，实验数据如下：

¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ 7.74 – 7.65 (m, 2H), 7.57 (s, 2H), 7.45 (t, J= 11.0 Hz, 2H), 7.19 – 7.08 (m, 2H), 7.03 (s, 2H), 6.90 (t, J = 10.0 Hz, 1H),4.40 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 3.46 (d, J = 26.7 Hz,3H), 3.34 (d, J = 4.6 Hz, 3H),3.14 – 3.01 (m, 2H), 2.90 – 2.72 (m, 6H), 2.54 – 2.43 (m, 2H), 1.77 – 1.57(m, 2H).

采用本发明的方法合成了一种具有肿瘤响应性释放药物的化合物，目前尚未见有文献报道。该化合物具有如下用途：本发明所述化合物的盐酸盐在正常生理环境中稳定存在，在肿瘤细胞内高谷胱甘肽环境下能够发生串联反应从而释放出安吖啶药物，对实体瘤的生长抑制率明显高于对照药物，可用于制备新型肿瘤响应性作用的抗肿瘤药物前药。

应用实验

稳定性实验：将化合物7溶于3mL 0.02 M缓冲液(PBS, pH=7.4)中，使化合物7的浓度为50 μmol/L，在37℃恒温条件下培养，分别取0、30、60、120、150、180、210、240、270 分钟的培养液（即上述化合物7和磷酸缓冲液组成的溶液），用HPLC检测化合物7的变化情况。HPLC条件：安捷伦1200型高效液相色谱仪(C-18柱)，柱温25℃，流速 0.5mL/分钟；流动相：乙腈-缓冲盐，梯度洗脱(0~15 min：20v% 乙腈—80v% 缓冲盐，15~30 min：35v%乙腈-65v%缓冲盐，所述缓冲盐为180 mL0.02 M磷酸二氢钾加三乙胺调pH到6.5 )。实验结果见图1。

将化合物7、谷胱甘肽溶于3mL 0.02 M缓冲液(PBS, pH=7.4)中，使化合物7的浓度为50 μmol/L，谷胱甘肽的浓度为10 μmol/L~500 μmol/L，在37℃恒温条件下培养，分别取0、1h、2h、3h的培养液，用HPLC检测化合物7的变化情况。HPLC条件：安捷伦1200型高效液相色谱仪(C-18柱)，柱温25℃，流速 0.5mL/分钟；流动相：乙腈(50v%)-缓冲盐(50v%)（所述缓冲盐为180 mL0.02 M磷酸二氢钾加三乙胺调pH到6.5），在上述条件下测试化合物7在不同谷胱甘肽存在时的稳定性。实验结果见图2。

从图1所示结果可以看出，在生理条件下(pH=7.4)，化合物7 在4.5小时内保留时间和峰面积基本保持不变，这说明化合物7具有生理环境中的稳定性。

从图2结果可以看出，化合物7在不同谷胱甘肽环境下稳定性存在差别，在正常生理条件下(谷胱甘肽浓度约为10 μmol/L)化合物7比较稳定，随着谷胱甘肽的浓度增加，化合物7开始出现降解反应，表明化合物7对谷胱甘肽具有响应性降解性质。

肿瘤细胞响应性释放药物实验：将化合物7溶于3mL 0.02 M磷酸缓冲液(PBS, pH=7.4)中，使化合物7的浓度为50 μmol/L，另加入谷胱甘肽使之终浓度为500 μmol/L。在37℃恒温条件下培养，取不同时间间隔(1h、2h、3h)的培养液，用HPLC检测化合物7的变化情况。HPLC条件：安捷伦1200型高效液相色谱仪(C-18柱)，柱温25℃，流速 0.5mL/分钟；流动相：乙腈(50v%)-缓冲盐(50v%，所述缓冲盐为180 mL0.02 M磷酸二氢钾加三乙胺调pH到6.5)。实验结果见图3。

本发明所述化合物7中包含了抗肿瘤药物安吖啶的结构，创造该化合物的目的就是使安吖啶在生物体内能够有效释放，从而达到响应性释药的作用。因此，在该实验中也对安吖啶进行了HPLC测试，用以验证化合物7是否能够释放出安吖啶。安吖啶的HPLC结果见图4。

图3表明，化合物7在终浓度为500 μmol/L的谷胱甘肽存在下，能够发生降解。随着时间延长，化合物7的峰高(保留时间t=3min)逐渐降低。同时，保留时间t= 5.3min的逢高逐渐增强，而t=5.3min的信号峰与药物安吖啶的保留时间一致(见图4，t=5.3)。该实验表明，化合物7在高浓度谷胱甘肽(肿瘤细胞通常高表达谷胱甘肽，其浓度约在0.5~10 mmol/L范围)作用下，发生降解反应，能够释放出安吖啶药物。

肿瘤生长抑制实验：选取7天雌性昆明鼠(购自河南省实验动物中心)为测试模型，腹腔注射数量为2×10⁶的H22腹水瘤细胞，随机分为3组，每组10只。按空白对照组、化合物7(1.25 mg/kg/d)、对照物氨菲奈特 (5mg/kg/d)分别以腹腔注射连续7天给药。然后杀死小鼠，分别称重并按照下式计算肿瘤抑制率：抑瘤率(%)=[(空白对照组小鼠平均体重-给药组小鼠平均体重)/空白组小鼠平均体重] ×100%；测试结果见表1。

表1 化合物7 的抑瘤率

从表1的实验结果可以看出，化合物7在1.25 mg/kg/d剂量连续7天给药后，对肿瘤的抑制率达到51.3%，而作为阳性对照的氨菲奈特组，在5 mg/kg/d剂量下，抑制率为13.3%。这表明化合物7能够显著抑制荷瘤小鼠体内肿瘤的增长，其肿瘤生长抑制能力明显优于对照组，因此，化合物7具备作为抗肿瘤前药应用的潜力。

Claims

1.一种具有肿瘤响应性释放药物的化合物，其特征在于，所述化合物的结构式如下：

。

2.根据权利要求1所述的具有肿瘤响应性释放药物的化合物的制备方法，其特征在于，具体合成路线如下：

具体制备步骤如下：

（a）将巯基丙酸溶于二氯甲烷，冰浴条件下加入EDC∙HCl和HOSU，再加入Boc单保护的丙二胺进行反应，反应结束经后处理得化合物1；

（b）将2-甲氧基-4-硝基苯胺溶于乙醇中，滴加浓盐酸，再加入9-氯吖啶的氯仿溶液进行反应，反应结束经后处理得化合物2；

（c）将SnCl₂溶于浓盐酸中，加入化合物2，反应结束后，用浓氨水调至中性，经后处理得化合物3；

（d）将甲磺酰氯溶二氯甲烷中，滴加三乙胺后，再加入化合物3，反应结束后，经后处理得化合物4；

（e）将化合物4溶于二氯甲烷中，滴加DIPEA，然后将光气溶于二氯甲烷中，冰浴条件下滴加到前述溶液中，反应完全后，依次加入吡啶-2-二硫基乙醇、DMAP，反应结束后经后处理得化合物5；

（f）将化合物5溶于二氯甲烷中，加入化合物1，反应结束后，经后处理得化合物6；

（g）将化合物6脱Boc保护，即得目标化合物，或者将化合物6溶于丙酮中，加入盐酸成盐，收集固体，干燥，即得目标化合物的盐酸盐即化合物7。

3.根据权利要求2所述的具有肿瘤响应性释放药物的化合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，巯基丙酸、EDC∙HCl、HOSU和Boc单保护的丙二胺的摩尔比为1︰1︰1︰1.1。

4.根据权利要求2所述的具有肿瘤响应性释放药物的化合物的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，化合物4、DIPEA、吡啶-2-二硫基乙醇和DMAP摩尔比为1︰4︰1︰1。

5.根据权利要求1所述的具有肿瘤响应性释放药物的化合物在制备肿瘤响应性作用的抗肿瘤药物前药中的应用。