CN104774161B - 多肽、蛋白质peg修饰剂合成方法 - Google Patents

多肽、蛋白质peg修饰剂合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了多肽、蛋白质PEG修饰剂的合成路线和操作方法，PEG修饰剂一是用在多肽方面，二是用于药物结构修饰，该方法原料便宜，且能明确聚乙二醇的数量。

Description

多肽、蛋白质PEG修饰剂合成方法
技术领域
本发明涉及医药领域，为多肽药物的间隔剂，提高多肽药物的溶解性。多肽和蛋白经PEG修饰后可以降低它们的免疫原性；保护由RES系统吸收的中介体；阻止蛋白水解酶的识别和降解；并且能增加多肽的表面积，因此降低肾脏的过滤，改变生物分布，具体涉及到R-NH-PEGn-OH合成路线和精致方法。
技术背景
PEG修饰技术从70年代已经开始，起初是对蛋白模型的任一位置进行氨基的PEG修饰，目前FDA已经批准22种经PEG化的药物上市，且还有多个品种处于临床研究阶段，这些年已经提出了许多PEG修饰方法，最近研究比较热门的是修饰位点的选择，第二代PEG修饰剂多为一端是氨基，另外一端是羧基的非天然氨基酸。目前我国处于三期临床阶段第四代长效抗艾新药艾拉博特(专利ZL03816434.5)，就在多肽的药物的某个氨基酸通过Fmoc-NH-PEG2-OH与马来酰亚胺丙酸耦合与gp41肽片断和修饰。表一：
表1gp41肽片断和修饰的类似物
在以上多肽中都运用到PEG修饰剂Fmoc-NH-PEG2-OH
经PEG化的药物往往具有以下优点：(1)更长的半衰期；(2)较低的最大血药浓度；(3)血药浓度波动较小；(4)较少的酶降解作用；(5)较少的免疫原性及抗原性；(6)较小的毒性；(7)更好的溶解性；(8)用药频率减少；(9)提高病人的依从性，提高生活质量；(10)脂质体对肿瘤有更强的被动靶向作用。PEG化对药物而言，具有“点石成金”的效果。
发明内容
本发明R-NH-PEGn-OH涉及到产品有：
Fmoc-PEG3-CH2COOH Fmoc-PEG3CH2CH2COOH…Fmoc-PEGnCH2CH2COOH；
Boc-PEG3-CH2COOH Boc-PEG3CH2CH2COOH…Boc-PEGnCH2CH2COOH；
Cbz-PEG3-CH2COOH Cbz-PEG3CH2CH2COOH…Cbz--PEGnCH2CH2COOH
本发明以廉价的二甘醇胺(简称DEG)为起始原料，对氨基进行保护，所用到的保护剂有(Boc2o or Cbz-osu)，得到中间体2R1-二甘醇胺(以下简称R1-DEG)，R1-DEG与甲基磺酰氯反应得到中间体3R1-NH-DEG-MS；取乙二醇或三甘醇或四甘醇在钠氢的催化条件下与中间体3反应得到中间体4R1-NH-PEGn(“n”的数值取决于您最终产品PEG的个数)，R1-NH-PEGn在钠氢的催化下与溴乙酸或者溴丙酸反应得到R1-NH-PEG-CH2COOH或R1-PEG-CH2CH2COOH。再脱保护基，与Boc2O＼Fmoc-OSU＼Cbz-OSU在碱水条件下反应得R-NH-PEG-CH2CH2COOH见路线二
关于此类化合物近年来的研究很多，如Hoffmann-Roeder[European Journal ofOrganic Chemi stry；nb.20-21；(2011)；p.3878-38871]以及ARDELYX，INC.[WO2012／6474]都有类似化合物的合成报道，均是由以PEGn做原料，“n”代表乙二醇的数量，在金属钠的催化作用下与丙烯酸叔丁酯反应，得到PEG-CH2COOTBU，接着将底物上另一醇羟基做成甲磺酸酯或对甲苯磺酸酯，再与叠氮钠在DMF中加热反应上叠氮基，经氢化，水解后上相应的保护基得产品。由于其采用的试剂叠氮钠剧毒且易爆，属于高危险品，使得此方法在大规模生产上的应用受限。
相对于路线一，我们改用二甘醇胺为起始原料，先上Boc保护氨基，进而成甲磺酸酯在钠氢作用下与多聚乙醇反应，增加乙二醇链单元，然后与溴丙酸作用，再水解，脱保护，上各种保护基得相应产品。
此路线完全避开了路线一的不足，采用更为安全，环保的试剂，后处理方便，适合工业化生产。
路线一、
路线二：
具体实施方案
实施例1
第一步称取二甘醇胺(105.1g，1.0mol)于1L水中，加入100毫升四氢呋喃，在搅拌条件下，缓慢滴加二碳酸二叔丁酯(196.2g，0.9mol)，反应8小时后，TLC确定反应完毕(展开剂石油醚∶乙酸乙酯=1∶1)，用乙酸乙酯萃取萃取2次，干燥乙酸乙酯层，减压回收后得Boc-DEG170.8g(收率为85％)；
第二步取Boc-DEG(102.5g0.5mol)于1L三口瓶中，加入1.5倍量三乙胺(75.7g，0.75mol)和500毫升二氯甲烷，降温至-5°，缓慢滴加甲基磺酰氯(68.4g，0.6mol)，控制反应温度为0°左右，滴加完毕，室温反应3小时，用水洗涤2才反应液，干燥二氯甲烷层，减压回收得Boc-DEG-MS134克(收率为95％)。
第三步称取乙二醇(93g1.5mol)于三口瓶中，加入500ml干燥的四氢呋喃，冷却至0°以下，少量多次加入钠氢(24克，1mol)，反应1小时后，冷却至-5度，缓慢滴加Boc-DEG-MS(141.2g0.5mol)，滴加完成后于50°加热反应24小时，TLC确定反应完毕(展开剂石油醚∶乙酸乙酯=1∶1)，加入1L水，用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，干燥，减压回收得BOC-NH-PEG389.6g(收率为72％)。
第四步称取钠氢(7.2g0.3mol)于三口瓶中，加入200毫升四氢呋喃，冷却至0°以下，缓慢滴加BOC-NH-PEG3(24.9g0.1mol)，控制反应温度为0°左右。1小时后，继续降温至-5°，缓慢滴加3-溴代丙酸(15.3克，0.1mol)控制反应问在0°以下，滴加完毕后室温反应24小时，用稀盐酸调PH值为3-4，乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液干燥，减压回收得Boc-NH-PEG3-CH2CH2COOH(20.2g收率63％)。
第五步将Boc-NH-PEG3-CH2CH2COOH(6.42g，0.020mol)溶于50mL四氢呋喃中，慢慢加入2mol／L的盐酸溶液(20mL)，再于室温下搅拌过夜。次日，加入50mL乙酸乙酯，分相，再用乙酸乙酯萃洗水相一次，水相蒸干得NH2PEG3-CH2CH2COOH的盐酸盐粗品，再经乙酸乙酯结晶得浅黄色晶体(3.35g，Yield：65％)
第六步将NH2PEG3-CH2CH2COOH.HCL(33.5g，0.13mol)溶于80mL四氢呋喃和120mL水中，加入NaHCO3(27.3g，0.33mol)，于室温搅拌20分钟后，冷至0℃，分批加入Fmoc-OSu(43.9g，0.13mol)。加毕后于室温下搅拌过夜，次日分相，用乙酸乙酯萃洗水相一次。水相用1mol／L的盐酸酸化至pH=3，再用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗两次，干燥蒸干Fmoc-NH-PEG3-CH2CH2COOH粗品(46.04克收率80％)，将粗品20克在加热条件下用50毫升乙酸乙酯溶解，冷却后自然结晶，抽滤得固体16克，收率为80％，HPLC检测含量为99.1％。
实施例2
称取二甘醇(159g1.5mol)于三口瓶中，加入500ml干燥的四氢呋喃，冷却至0°以下，少量多次加入钠氢(24克，1mol)，反应1小时后，冷却至-5°，缓慢滴加Boc-DEG-MS(141.5g0.5mol)，滴加完成后于50°加热反应24小时，TLC确定反应完毕(展开剂石油醚∶乙酸乙酯=1∶1)，加入1L水，用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，干燥，减压回收得BOC-NH-PEG4105g(收率为72％)
称取钠氢(7.2g0.3mol)于三口瓶中，加入200毫升四氢呋喃，冷却至0°以下，缓慢滴加BOC-NH-PEG4(29.3g0.1mol)，控制反应温度为0°左右。1小时后，继续降温至-5°，缓慢滴加3-溴代丙酸(15.3克，0.1mol)控制反应问在0°以下，滴加完毕后室温反应24小时，用稀盐酸调PH值为3-4，乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液干燥，减压回收得Boc-NH-PEG4-CH2CH2COOH(23g收率63％)。
将Boc-NH-PEG4-CH2CH2COOH(7.3g，0.020mol)溶于50mL四氢呋喃中，慢慢加入2mol／L的盐酸溶液(20mL)，再于室温下搅拌过夜。次日，加入50mL乙酸乙酯，分相，再用乙酸乙酯萃洗水相一次，水相蒸干得NH2PEG4-CH2CH2COOH的盐酸盐粗品，再经乙酸乙酯结晶得浅黄色晶体(3.92g，Yield：65％)
将NH2PEG4-CH2CH2COOH.HCL(39.2g，0.13mol)溶于80mL四氢呋喃和120mL水中，加入NaHCO3(27.3g，0.33mol)，于室温搅拌20分钟后，冷至0℃，分批加入Fmoc-OSu(43.9g，0.13mol)。加毕后于室温下搅拌过夜，次日分相，用乙酸乙酯萃洗水相一次。水相用1mol／L的盐酸酸化至pH=3，再用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗两次，干燥蒸干Fmoc-PEG4-CH2CH2COOH粗品(50.64克收率80％)，将粗品20克在加热条件下用50毫升乙酸乙酯溶解，冷却后自然结晶，抽滤得固体16克，收率为80％，HPLC检测含量为99.1％。

Claims (4)

1.R-NH-PEG-CH2CH2COOH的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以二甘醇胺为起始原料，使用保护基R1对二甘醇胺的氨基进行保护，得到中间体2R1-NH-DEG，其结构为HOCH2CH2OCH2CH2NHR1，中间体2与甲基磺酰氯反应得到中间体3R1-NH-DEG-MS，其结构为MSOCH2CH2OCH2CH2NHR1；取乙二醇或三甘醇或四甘醇在催化条件下与中间体3反应得到中间体4R1-NH-PEG，其结构为HO[CH2CH2O]n CH2CH2OCH2CH2NHR1,R1-NH-PEG在催化剂的催化下与溴丙酸反应得到R1-NH-PEG-CH2CH2COOH，其结构为R1-NH-[CH2CH2O]n+2CH2CH2COOH，再脱保护基，与二碳酸二叔丁酯，芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺，苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺在碱水条件下反应得R-NH-PEG-CH2CH2COOH，其结构为R-NH-[CH2CH2O]n+2CH2CH2COOH；
其中，R代表芴甲氧羰酰、叔丁氧羰基或甲酸苄酯基；R1为叔丁氧羰基或甲酸苄酯基；“n”的数值取决于乙二醇、三甘醇或四甘醇中乙氧基的个数。
2.根据权利要求1所述的制备方法，R1-NH-DEG-MS与乙二醇或三甘醇或四甘醇反应所用到的催化剂为：金属钠、钠氢、叔丁醇钾、叔丁醇钠。
3.根据权利要求1所述的制备方法，R1-NH-DEG-MS与乙二醇或三甘醇或四甘醇的投料比例为：1∶1-1∶10。
4.根据权利要求1所述的制备方法，R1-NH-PEG在催化下与溴丙酸反应得到R1-NH-PEG-CH2CH2COOH所用到的催化剂为：金属钠、氢化钠、氢化钾、叔丁醇钾、叔丁醇钠。
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