CN109908363B

CN109908363B - 一种靶向无痕释放药物缀合物及其制备方法与应用

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Publication number: CN109908363B
Application number: CN201711320821.3A
Authority: CN
Inventors: 粟武; 武春雷; 房丽晶; 王伟; 成哲弘
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2017-12-12
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2037-12-12
Also published as: CN109908363A

Abstract

本发明涉及一种靶向无痕释放药物缀合物及其制备方法与应用。具体公开了一种靶向无痕释放药物缀合物，其结构为T‑L‑D，T代表靶向基团，L代表接头，D代表活性成分，其中，T选自RGD肽、环RGD肽，RGD肽衍生物、RGD环肽衍生物、叶酸、穿膜肽、核酸适体、荧光染料；D为具有叔胺基的药物活性成份，优选为柯义巴肽A、柯义巴肽A衍生物；L为A‑BC‑E，BC代表酶切位点。本发明使用具有靶向作用、易合成修饰的环RGD代替价格昂贵、不易合成的抗体作为靶向分子，制备更简单，也达到了很高的特异性靶向作用，同时在酶的特异性切割作用下，通过对氨基苄基季铵盐的自我消除，实现药物活性成分的无痕释放。

Description

一种靶向无痕释放药物缀合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种靶向无痕释放药物缀合物及其制备方法与应用。

背景技术

柯义巴肽A(Coibamide A，Coi A)是一种高度N-甲基化的天然环酯肽，对肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、白血病以及中枢神经癌等细胞都具有纳摩尔级的细胞毒性，同时对乳腺、中枢神经以及卵巢癌细胞具有较好的组织选择性。但是由于Coi A水溶性较差，不易修饰，并且体外实验表明Coi A对正常细胞也具有较大的毒性，因此Coi A作为药物应用于体内研究时受到极大的限制。研究表明，对氨基苄基季铵盐能在酶特异性切割酰胺键或还原剂还原二硫键时，发生自我消除反应，无痕释放叔胺或芳香胺类药物。本课题组的研究表明CoiA的类似物Coi A3与Coi A具有同等的细胞毒性，但合成较Coi A简单。因此本发明拟采用Coi A3为模型，将Coi A3与对酶或还原剂敏感的含有对氨基苄基的臂(linker)连接形成季铵盐，然后将具有靶向作用的环RGD连接在臂的另一端，形成RGD-Coi A3缀合物。当RGD-CoiA3被靶向运输到肿瘤细胞内时，细胞内过表达的酶cathepsin B或谷胱甘肽将连接药物的linker特异性切割，对氨基苄基发生自我消除，从而无痕释放药物。

有效的药物递送体系能够将毒性大，副反应多的疏水药物高效、快速地运送至肿瘤部位。目前研究者们多采用脂质体、聚合物、多肽、纳米材料等，通过包埋或者共价偶联疏水药物的方法形成纳米组装体，实现抗癌药物的靶向递送，提高药物利用度，降低药物毒性。2016年，Nature Chemistry报道了一种抗体-药物缀合物无痕释放药物的方法(NatureChemistry，2016，8，1112-1119)。该方法针对不易修饰的叔胺和芳香胺类药物，这些药物能够与对氨基苄基形成季铵盐，在酶或氧化还原特异性切割linker时，对氨基苄基通过1,6消除，自我牺牲，无痕释放药物。然而该方法采用抗体作为靶向分子，虽然抗体特异性强，但其价格昂贵，不易合成，因此需要发展一种制备简单、价格经济的刺激响应的药物缀合物，为新药开发提供新的模式。Coi A是2008年从巴拿马海洋蓝藻Leptolyngbya sp.中分离得到的一种海洋天然产物。它是一种富含多个N-甲基化氨基酸的环脂肽，对多种癌细胞具有低的纳摩尔级的细胞毒性，是具有潜在优势的抗癌先导化合物。但是Coi A的水溶性差，不易修饰，毒性大，使其发展至临床药物受到限制。本课题组自2015年对Coi A的结构做出正确修正后，不断地对其结构进行改造，合成了一系列Coi A类似物，药效关系研究表明Coi A3(N-Me-Ser(Me)-OH替换为N-Me-Ala-OH)与Coi A具有同等的细胞毒性，合成相对较简单。因此本发明将利用对氨基苄基能够与叔胺形成季铵盐，并在酶等特定条件下发生自我消除，无痕释放叔胺类药物的特点，采用具有靶向作用、易合成得到的小分子肽环RGD作为靶向分子，先将Coi A3连接在含有对氨基苄基和特异性切割位点的linker的一端形成季铵盐，得到的物质再与环RGD连接，形成RGD-Coi A3缀合物。该缀合物被靶向递送至肿瘤细胞，胞内高表达的酶cathepsin B或谷胱甘肽特异性切割linker，Coi A3被无痕释放。

在现有技术中，无论是通过脂质体、聚合物、多肽、纳米材料等包埋的方法递送药物，还是共价偶联的载药体系，都存在一定的短期和长期的毒性问题，并且很难获得定量、高效的药物装载率。另外，使用纳米材料、多肽等作为载体通过共价结合的方法递送药物时，需要对药物进行修饰，以方便药物与载体进行共价偶联，该方法释放的药物是修饰后的药物，并不是药物本身，药效可能会降低。Nature Chemistry虽然报道了一种抗体-药物缀合物无痕释放药物的方法，但是该方法采用价格昂贵，样品量少，不易合成的抗体作为靶向分子，使该药物缀合物的使用受到极大限制。

发明内容

本发明基于对氨基苄基能够与叔胺形成季铵盐，设计了酶或还原剂特异性切割含有对氨基苄基的linker，该linker与Coi A3形成季铵盐，在linker的另一端接上靶向的环RGD肽，形成RGD-Coi A3缀合物，当RGD-Coi A3缀合物被靶向运送至癌细胞后，在酶或还原剂的特异性切割作用下，对氨基苄基发生1，6消除，自我牺牲，无痕释放药物，以达到降低药物毒性，提高药物利用度的目的。

一种靶向无痕释放药物缀合物，其结构为T-L-D，T代表靶向基团，L代表接头，D代表活性成分，其中，

T选自RGD肽、环RGD肽，RGD肽衍生物、环RGD肽衍生物、叶酸、穿膜肽、核酸适体、荧光染料；优选为RGDyK环肽，其中赖氨酸侧链上偶联有-OCCH₂CH₂SH、-OCCH₂SH、-OCCH₂CH₂CH₂SH；更优选地，所述的T选自

D为具有叔胺基的药物活性成份，优选为柯义巴肽A、柯义巴肽A衍生物、以及公告号为CN105646675A的专利中公开的柯义巴肽A衍生物，具体选自

L为A-BC-E，BC代表酶切位点，A代表与靶向基团连接的基团，E代表与活性成分D连接，并进行无痕释放的基团；

A选自马来酰亚胺基己酰基(MC)、丁二酸、己二酸

E选自对氨基苄基氯、对氨基苄基溴、对氨基苄基碘；

BC选自Val-Cit、Phe-Lys。

在本发明的一个具体的技术方案中，所述靶向无痕释放药物缀合物为

在本发明的一个具体的技术方案中，所述靶向无痕释放药物缀合物为RGD-MC-Val-Cit-PAB-Coi A3。

在本发明的一个具体的技术方案中，所述靶向无痕释放药物缀合物为叶酸-MC-Val-Cit-PAB-Coi A3。

在本发明的一个具体的技术方案中，所述靶向无痕释放药物缀合物为穿膜肽-MC-Val-Cit-PAB-Coi A3。

在本发明的一个具体的技术方案中，所述靶向无痕释放药物缀合物为核酸适体-MC-Val-Cit-PAB-Coi A3。

本发明另一个方面提供了一种靶向无痕释放药物缀合物的制备方法，其包括如下步骤：

1)将接头与活性成分在催化剂和碱剂的作用下在有机溶剂中反应，获得L-D缀合物；

2)将L-D缀合物与靶向基团在于在碱性条件的20％-80％乙腈的NH₄HCO₃缓冲液中反应，获得T-L-D缀合物。

在本发明的技术方案中，所述的催化剂为KI或四丁基碘化铵，碱剂为DIEA或三乙胺。本发明另一个方面提供了一种药物组合物，其含有有效量的本发明的靶向无痕释放药物缀合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。

在本发明的技术方案中，药物组合物的给药方式包括注射或随时间逐渐输注。例如，可以是经口、静脉内、腹膜内、肌内、腔内、肿瘤内、或透皮。

在本发明的技术方案中，药物组合物的制剂类型为注射剂、片剂、口服液、胶囊剂、颗粒剂、透皮制剂、吸入制剂。

在本发明的另一个方面提供了一种药物组合物，其含有有效量的本发明的靶向无痕释放药物缀合物和至少一种其他活性成分。

本发明的另一个方面提供了本发明的无痕释放药物缀合物在制备治疗肿瘤药物用的用途。

所述的肿瘤选自括结肠癌、直肠癌、脑瘤(优选为成胶质细胞瘤)、肺癌(优选为非小细胞肺癌)、表皮鳞癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、结直肠癌、肾细胞癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、皮肤癌、甲状腺癌、头颈癌、前列腺癌、神经胶质瘤及鼻咽癌中的一种或多种；更优选地，所述的过度增殖性疾病为乳腺癌、非小细胞肺癌。

在本发明的技术方案中，所述的Val为缬氨酸，Cit为瓜氨酸，PAB为对氨基苄基，MC为马来酰亚胺基己酰基，Coi A3为

Coibamide A或Coi A为

RGD为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽，cRGDyK为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-酪氨酸-赖氨酸环五肽。DMF为N，N-二甲基甲酰胺，DIEA为N,N-二异丙基乙胺，Pd(PPh₃)₄为四(三苯基膦)钯，HATU为2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，Alloc为烯丙氧羰基，EDCI为1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺，HOAt为1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑，TFA为三氟乙酸，TIS为三异丙基硅烷，KI为碘化钾，Fmoc为9-芴甲氧羰基，DIC为N,N'-二异丙基碳二亚胺。

有益效果

1、本发明使用具有靶向作用、易合成修饰的环RGD代替价格昂贵、不易合成的抗体作为靶向分子，制备更简单，也达到了很高的特异性靶向作用。

2、本发明采用的Coi A3没有活性基团，而本发明采用的方法无需对Coi A3进行额外修饰，即可将其与接头进行偶联，降低了制备难度，提高了药物效率。

3、本发明的接头能够特异性释放活性成分，在酶或还原剂特异性切割linker时，基于对氨基苄基发生的自我消除，将Coi A3无痕释放，降低Coi A3的毒性。该方法有望发展成一种高效低毒的具有刺激响应性的载药体系。

附图说明

图1：cyclo RGDyK的HRMS图。

图2：MC-Val-Cit-PAB-OH的HRMS图。

图3：MC-Val-Cit-PAB-Cl的1H-NMR图。

图4：Coi A3的HRMS图。

图5：cRGDyK-linker-Coi A3缀合物的HRMS图。

图6：cRGDyK-linker-Coi A3缀合物体外酶切HPLC分析。

图7：cRGDyK-linker-Coi A3缀合物的细胞毒性分析。

具体实施方式

下面通过实施例进一步描述本发明，而不应理解为对本发明的限制。

实施例1环RGDyK的合成

环RGDyK的合成路线如下路线所示：

步骤一、线性肽的合成

于一个50mL的固相反应器中加入TCP树脂(1mmol/g，2g，2mmol)及CH₂Cl₂(6ml)，溶胀树脂30min。抽除CH₂Cl₂，用无水DMF(2×6mL)洗涤树脂。同时将Fmoc-Gly-OH((297mg,1mmol，0.5eq.)溶于无水DMF(4ml)加入树脂中，向树脂中加入DIEA(520μL,3mmol，1.5eq.)，N₂鼓泡混匀，缩合反应2h。抽除反应液，用DMF(4×6mL)洗涤树脂，再用无水DMF(6mL)洗涤树脂。向树脂中加入乙酸(230μL,4mmol,2eq.)和DIEA(2ml,12mmol,6eq.)的DMF(4mL)溶液，反应30min，抽除反应液，用DMF(4×6mL)洗涤树脂，得到树脂的取代度为0.50mmol/g(2g，1mmol，1eq.)。

Fmoc-Gly-OH连接至树脂后，随后肽链上每一个氨基酸的加入都通过以下方法A、方法B和方法C进行脱保护，氨基酸的偶联以及茚三酮循环进行，依次偶联Arg、Lys、Tyr、Asp直至得到线性五肽(1a)。脱保护，氨基酸的偶联，茚三酮的检测方法如下：

方法A：脱掉Fmoc

20％哌啶/DMF溶液(6ml)加入树脂中，鼓气5min，抽去溶剂，再加入20％哌啶/DMF溶液(6ml)加入树脂，鼓气5min，抽去溶剂，用DMF(4x 6mL)洗涤树脂，再用无水DMF(2x 6mL)洗涤树脂。

方法B:Fmoc-Xaa-OH的偶联

Fmoc-Xaa-OH(4.0eq.)和HATU(4.0eq.)溶于无水DMF(4ml)，向该溶液中加入DIEA(12eq.)，混匀，将该反应液转移到脱除Fmoc的TCP树脂中，N₂鼓泡混匀，缩合反应0.5h(茚三酮试剂检测至反应完全)。抽除反应液，用DMF(4x 6mL)洗涤树脂。

方法C:茚三酮检测

偶联反应时，取出少量树脂，DMF洗两遍，加入两滴茚三酮检测液(茚三酮15g,乙酸3ml,正丁醇100ml)，90℃加热3min，树脂不发生颜色变化表明反应完全。树脂变蓝表明存在初级氨。

得到五肽的树脂(1a)后，将溶有Pd(PPh₃)₄(0.1eq.)，PhSiH₃(10eq.)的二氯甲烷溶液8ml加入树脂中，N₂鼓泡8min，抽除二氯甲烷，用二氯甲烷洗涤树脂(4×6mL)，用DMF洗涤树脂(4×6mL)，再用无水的DMF(2x 6mL)洗涤树脂。同时将HOOCCH₂CH₂STrt(4.0eq.)和HATU(4.0eq.)溶于无水DMF(4ml)，向该溶液中加入DIEA(12eq.)，混匀，将该反应液转移到脱除Alloc的TCP树脂中，N₂鼓泡混匀，缩合反应0.5h(茚三酮试剂检测至反应完全)。抽除反应液，用DMF(4×6mL)洗涤树脂。然后脱除N端的Fmoc(使用方法A)，随后用二氯甲烷洗涤(4×6mL)，将三氟乙醇：乙酸：二氯甲烷为1:1:8的切割液加入树脂中，切割过夜。切割产物经半制备型HPLC纯化，冻干，得到白色固体的线性六肽(1b)。

步骤二、环化

将EDCI(10eq.)，HOAt(10eq.),DIEA(40eq.)溶于CH₂Cl₂(30mL)中，在冰浴下冷却至0℃。将线性六肽(1b)(1eq.)溶于CH₂Cl₂(2mL)中，0℃缓慢滴加至EDCI/HOAt/DIEA的反应液中，反应1h后撤去冰浴，将反应混合物继续在室温下搅拌反应48h，减压蒸除溶剂，用制备型HPLC纯化，收集产物，冷冻干燥，得到白色固体的环肽(1c)。

步骤三、最终脱保护

将得到的环肽1c溶于TFA:TIS:H₂O为95:2.5:2.5的切割液中，室温搅拌2h,减压除去TFA，产物经半制备型HPLC纯化，冻干，得到白色固体的cyclo RGD。HRMS(ESI)m/z:calcdfor C₃₀H₄₆N₉O₉S[M+H]⁺708.3139,found 708.3137；calcd for C₃₀H₄₅N₉O₉SNa[M+Na]⁺730.2959,found 730.2940.

实施例2接头MC-Val-Cit-PAB-Cl的合成

MC-Val-Cit-PAB-Cl由MC-Val-Cit-PAB-OH的氯代得到。MC-Val-Cit-PAB-OH的合成参见专利“Antibody drug conjugates,WO2014/191578 A1”。HRMS(ESI)m/z:calcd forC₂₈H₄₁N₆O₇[M+H]⁺573.3073,found 573.3044；calcd for C₂₈H₄₀N₆O₇Na[M+Na]⁺595.2856,found595.2849。

将得到的MC-Val-Cit-PAB-OH溶于无水DMF中，冰浴下加入二氯亚砜(2eq.)，冰浴搅拌2h。减压除去DMF，反应产物经硅胶柱分离，得到MC-Val-Cit-PAB-Cl。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.82(d,J＝60Hz,3H),0.85(d,J＝6.8Hz,3H),1.16-1.25(m,2H),1.28-1.40(m,1H),1.40-1.54(m,5H),1.54-1.78(m,1H),1.81-2.02(m,1H),2.05-2.31(m,2H),2.86-3.09(m,3H),4.11-4.22(m,1H),4.29-4.45(m,2H),4.71(s,2H),5.42(s,2H),5.91-6.04(t,J＝5.6Hz,1H),7.01(s,2H),7.16-7.25(d,J＝8.4Hz,1H),7.30-7.39(d,J＝8.4Hz,2H),7.49-7.67(m,2H),7.73-7.85(d,J＝8.8Hz,1H),8.04-8.17(d,J＝7.6Hz,1H),10.05(s,1H)ppm.

实施例3Coi A3药物的合成

Coi A3是天然产物Coibamide A的类似物，即将Coibamide A中的N-Me-Ser(Me)-OH替换为N-Me-Ala-OH，其合成方法参见文献“Yao,G.Y.；Pan,Z.Y.；Wu,C.L.；Wang,W.；Fang,L.J.；Su,W.Efficient synthesis and stereochemical revision of coibamideA.J.Am.Chem.Soc.,2015,137,13488-13491.”HRMS(ESI)m/z:calcd for C₆₃H₁₀₇N₁₀O₁₄[M+H]⁺1227.7968,found 1227.7971；calcd for C₆₃H₁₀₆N₁₀O₁₄Na[M+Na]⁺1249.7788,found1249.7751。

实施例4RGD-Coi A3缀合物的制备

RGD-linker-Coi A3

将MC-Val-Cit-PAB-Cl和Coi A3(1.1eq.)溶于无水DMF中，加入KI(0.2eq.)，随后加入DIEA(2.5eq)，室温震荡12h。反应产物经半制备型HPLC纯化，冻干，得到白色固体的MC-Val-Cit-PAB-Coi A3。

将得到的MC-Val-Cit-PAB-Coi A3和cyclo RGDyK(2eq.)溶于30％乙腈的NH₄HCO₃缓冲液(pH＝8)，冰浴搅拌2h。反应产物经半制备型HPLC纯化，冻干，得到白色固体的RGD-Coi A3缀合物。HRMS(ESI)m/z:calcd for C₁₂₁H₁₉₀N₂₅O₂₉S[M]⁺2489.3882,found 2489.3612.

实施例5体外药物释放研究

将RGD-Coi A3缀合物溶于10％DMF的柠檬酸盐缓冲液，pH＝5.5，向该溶液中加入半胱氨酸，终浓度为5mM，然后加入组织蛋白酶B，37℃培育。24h后，取少量样品进行HPLC分析。

实施例6体内细胞毒性研究

将肿瘤细胞MDA-MB-231和正常细胞HFL分别接种于96孔板，接种24h后，去掉培养基，加入新的培养基，然后将新的含有不同浓度的RGD-Coi A3缀合物(0.04μM-4μM)的培养基加至细胞中，用DMSO做对照。细胞在5％的CO₂培养箱中，37℃培育。72h后，细胞用MTT(20μL/孔，5mg/ml)处理，继续培育4h。然后去掉培养基，加入DMSO，轻轻振摇10min，用全波长读数仪(Thermol Multiskan GO)测490nm处的吸收。每个实验独立重复三次。生长抑制速率计算公式如下：生长抑制速率(％)＝[1-缀合物样品的吸光度/对照样品的吸光度]*100％。最小抑制浓度定义为相比于对照细胞，缀合物使细胞减少50％时的药物浓度。

RGD-Coi A3缀合物的细胞毒性实验结果表明，RGD-Coi A3缀合物对MDA-MB-231癌细胞的最小抑制浓度为110nM，与原药Coi A3(IC₅₀＝5nM)相比，毒性降低了25倍，对正常细胞HFL的最小抑制浓度为990nM，与原药Coi A3(IC₅₀＝0.1nM)相比，毒性降低了9900倍，说明RGD-Coi A3缀合物能够有效抑制癌细胞的生长，同时降低对正常细胞的杀伤能力。

上述具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。

Claims

1.一种靶向无痕释放药物缀合物，其结构为T-L-D，T代表靶向基团，L代表接头，D代表活性成分，其中，

T选自RGD肽、RGDyK环肽；

D为具有叔胺基的药物活性成份，选自柯义巴肽A3；

A选自马来酰亚胺基己酰基(MC)、丁二酸、己二酸

E选自对氨基苄基氯、对氨基苄基溴、对氨基苄基碘；

BC选自Val-Cit。

2.根据权利要求1所述的靶向无痕释放药物缀合物，所述靶向无痕释放药物缀合物为cRGDyK-MC-Val-Cit-PAB-Coi A3、RGD-MC-Val-Cit-PAB-Coi A3。

3.一种权利要求1-2任一项所述的靶向无痕释放药物缀合物的制备方法，其包括如下步骤：

2)将L-D缀合物与靶向基团在碱性条件的20％-80％乙腈的NH₄HCO₃缓冲液中反应，获得T-L-D缀合物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，所述的催化剂为KI或四丁基碘化铵，碱剂为DIEA或三乙胺。

5.一种药物组合物，其含有有效量的权利要求1-2任一项所述的靶向无痕释放药物缀合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，所述药物组合物的制剂类型为注射剂、片剂、口服液、胶囊剂、颗粒剂、透皮制剂、吸入制剂。

7.一种药物组合物，其含有有效量的权利要求1-2任一项所述的靶向无痕释放药物缀合物和至少一种其他活性成分。

8.根据权利要求1-2任一项所述的无痕释放药物缀合物在制备治疗肿瘤药物中的用途，

所述的肿瘤选自括结肠癌、直肠癌、脑瘤、肺癌、表皮鳞癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、结直肠癌、肾细胞癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、皮肤癌、甲状腺癌、头颈癌、前列腺癌、神经胶质瘤及鼻咽癌中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的用途，其中，脑瘤为成胶质细胞瘤、肺癌为非小细胞肺癌。