CN109608633A - 一种新型的特异性多臂聚乙二醇衍生物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明设计和合成了新型的特异性多臂聚乙二醇衍生物，所述衍生物具有三条及以上的PEG链，其中至少有两条链具有不同的分子量。与现有的均一化分子量的多臂聚乙二醇衍生物相比，可以在同一分子修饰中实现同种或多种修饰物不同半衰期的控制及不同目标物的修饰。该衍生物可用于小分子药物、蛋白质、多肽等的修饰，以水凝胶或微球等形式广泛应用于医药行业，解决临床急需的创口封闭与粘合、组织粘连及出血等问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有特异性多臂结构聚乙二醇衍生物，它们具有目前多臂PEG衍生物无法比拟的优势，适用于药物、蛋白、多肽等的修饰。
背景技术
PEG修饰剂又称聚乙二醇修饰剂，是带有官能团的聚乙二醇，目前主要用于蛋白质、药物等的修饰以及生物可降解水凝胶、防粘连膜和缓释微球的制备。修饰性PEG在制药研发中应用广泛，在药物药效缓释中起到重要作用。生物大分子在药用过程中的作用由于其半衰期短、容易产生免疫原性抗原性、易被酶解、有一定药理毒性等问题被大大限制。为有效解决该问题，通过对药物分子进行聚乙二醇化学修饰来达到延长药效的目的。因为聚乙二醇链的空间阻碍作用使得被修饰蛋白对蛋白酶酶解的抵抗能力大为提高，同时被修饰分子的分子排阻体积明显增大，使得其肾脏过滤清除率降低显著。同时，聚乙二醇分子的结构特异性使得肝脏网状内皮系统对被修饰蛋白的识别摄取和清除能力有所降低，并且可以降低或者消除诱导产生中和抗体和与抗体结合的能力，使其难以被免疫系统识别和清除。
相对于相同分子量的线性聚乙二醇，多臂聚乙二醇由于其特殊的支链结构可以在修饰物的表层形成一层更严密的保护层，增大了修饰物空间位阻，可以更有效地阻止体内其它物质对修饰物的降解作用，减少了修饰物在生物体内失活或被酶水解的程度，更好的延长修饰物在体内的作用时间。对聚乙二醇分子来说，不同分子量的PEG修饰目标物后，其从血液中的清除率也不相同，修饰物的半衰期出现差异。但是目前市场上的多臂聚乙二醇衍生物存在臂长相同、或者修饰基团相同或单一等问题，不能有效的控制不同修饰物的半衰期或不同修饰物之间的协同作用，如专利CN 103755949 B提供了一种具有不同类型活性基团的多臂聚乙二醇衍生物的制备方法，该方法是通过多活性羟基点的小分子中心引发环氧乙烷聚合制备，因各支链上的羟基活性相同所以聚合物各臂具有相同或相近的分子量，且该方法需要特殊的高压设备；专利CN 1176137C提供了一种由单链PEG与活性中心反应制备多臂树杈型PEG衍生物的方法，然而，它们采用的多官能团中心具有不同活性的基团，结构复杂且价格昂贵；制备的多臂PEG只有一个活性修饰基团，其不同分子量的直链与本发明有类似的表面相似性，但是其多臂结构只有一种活性修饰基团，只能用于单一物质的修饰，因此缺少本发明所披露的独立和有用的实质特征。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中异官能团PEG衍生物制备复杂、修饰的不同目标物只有单一的半衰期的缺点，提供一种简便、缓释可控的具有异官能团的多臂聚乙二醇衍生物，本发明多臂聚乙二醇衍生物具有以下的通式，
X为相同或不同结构的功能基团，选自以下功能基团的一种或几种，-OH，-NH2，-COOH，-SH，-SO3H，琥珀酰亚胺基，丙烯酸基，丙烯酰胺基，醛基，碘乙酰胺基，马来亚酰胺基，三氟乙磺酸基，对硝基苯碳酸酯基，三氯苯碳酸酯基，氧羰基咪唑基；
Y是相同或不同的连接基团，选自-O-，-O(CH2CH2)i-,-O(CH2)iCONH-，-OOC(CH2)iCOO-，-OOCNH(CH2)iNHCOO-，-OOC(CH2)iCONH-；i为0-20的整数；
PEG为单链聚乙二醇，其分子量为200-8000，PDI≤1.02；
R为多臂支化中心，支化度为3-16，R选自以下结构中一种或两种以上的组合：(1)其中三臂支化中心包括以下结构
(2)其中四臂支化中心包括以下结构
(3)其中五臂支化中心包括以下结构
(4)其中六臂支化中心包括以下结构
(5)其中八臂支化中心包括以下结构
(6)其中十臂支化中心包括以下结构
(7)其中十一臂支化中心包括以下结构
(8)其中十二臂支化中心包括以下结构
(9)其中十四臂支化中心包括以下结构
(10)其中十六臂支化中心包括以下结构
其它臂数或相同臂数的其它支化中心可以采用商业产品或者能够被简单聚合得到的结构。
本发明所述的窄分布的聚乙二醇，对窄分布的PEG一端羟基进行活化改性，然后再与修饰基团反应制备具有单官能团修饰的PEG；
本发明所述的窄分布的聚乙二醇，先经活性修饰基团修饰后，再与多官能团的中心反应，窄分布的聚乙二醇两端基以不同的官能团进行修饰；
本发明所述的特异性修饰多臂聚乙二醇衍生物，其不同的支化臂采用不同分子量的直链聚乙二醇以不同的官能团进行修饰；
本发明所述的特异性修饰多臂聚乙二醇衍生物以不同臂长的聚乙二醇修饰不同的目标物，且不同的目标修饰物具有不同的降解缓释时间；
本发明所述的特异性修饰多臂聚乙二醇衍生物不仅可可用于小分子药物、蛋白质、多肽等的修饰，还可用于生物降解水凝胶、组织封闭剂、止血海绵的制备、以及载药缓释微球的制备。
本发明提供的一种所述特异性多臂聚乙二醇衍生物的制备方法，包括如下步骤：
a)、以窄分布的线型PEG与活性修饰基团反应制备单活性基团的改性线形PEG，
对不能直接与PEG上羟基反应的活性修饰基团，要先对线型PEG进行单官能团活化，然后再与活性修饰基团反应制备单活性基团的PEG，上述PEG可为同双官能团或异双官能团；
b)、按照a)中的方法对不同分子量的线形PEG进行不同活性基团的单官能团修饰；
c)、根据多支化小分子中心的官能团类型和单官能团修饰后窄分布PEG留存的另一端官能团的类型选择修饰剂对多支化中心进行修饰；
d)、将c)中制备的修饰有不同活性官能团的不同分子量的单官能团活化的线形PEG分别与多活性官能团的小分子中心反应制备具有二种或以上修饰物的不同臂长的多臂PEG衍生物。
本发明提供了新型的对不同修饰物进行个性化可控缓释的多臂PEG及其制备方法。与传统的多臂PEG修饰剂相比，多支链PEG具备多个官能团，可同时携带多个生物活性分子，且不同分子量的PEG可以对所修饰物的缓释时间按照需求进行特异性修饰，进一步改善被修饰药物、蛋白质和多肽等的生物学性能。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但是实施例给出详细的实施方式和具体操作仅用于理解本发明。从上文的论述和这些实施例中，本领域的技术人员可以根据本发明的基本特征，在不背离其精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种变动和修改以使其适应各种用途和条件。
实施例1：四臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯-碘乙酰胺的合成
OH-PEG1-COOH的合成
三口瓶中加入180mL二氯甲烷，搅拌下依次加入48.00g分子量为2000的PEG-OH、7.2g丁二酸酐、0.37g DMAP，氮气保护下升温至40℃回流反应5h，反应结束后，将物料降至室温，加入100mL 0.5N稀盐酸洗涤一次、然后水洗两次(200mL×2)，分液，有机相30～40℃减压浓缩，得粘稠油状物。向油状物中加入100mL乙酸乙酯，搅拌至溶液澄清后加入到将500mL正己烷中，抽滤，用正己烷淋洗滤饼。滤饼35～40℃鼓风箱干燥，得白色固体OH-PEG1-COOH。
OH-PEG1-NHS的合成
三口瓶中加入100ml二氯甲烷，然后加入20g分子量为2000的OH-PEG1-COOH、30gNHS，通氩气保护，然后在0℃下将50g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)的二氯甲烷溶液(100ml)缓慢加入到三口瓶中，上述混合物在室温下搅拌16h。所得产物转移至乙醚中沉淀，沉淀物用乙醚洗涤三次后干燥得活化后的PEG衍生物OH-PEG1-NHS。
OH-PEG2-碘乙酰胺的合成
称取1.8g的碘乙酸溶于100ml干燥的二氯甲烷中，加入2.5g的DCC，室温避光搅拌1h，然后加入40g分子量为4000的OH-PEG2-NH2，再次避光反应24h，反应混合物经硅藻土过滤后加入400ml乙醚过滤，收集的产物用乙醚洗涤数次，真空干燥后得OH-PEG2-碘乙酰胺。
四臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯-碘乙酰胺的合成
将15g季戊四醇和100g六亚甲基二异氰酸酯溶于80mlDMF中，搅拌加热至80℃反应10h，所得产物减压蒸馏除去溶剂，柱色谱纯化得修饰后的四臂小分子中心。将7g该小分子和60gOH-PEG1-NHS溶于80mlDMF中，按上述方法进行聚合反应，柱色谱分离纯化得双臂修饰的聚乙二醇衍生物。将4.8g经双臂修饰的活性中心和9gOH-PEG2-碘乙酰胺溶于80mlDMF中，搅拌加热至80℃反应10h，所得产物减压蒸馏除去溶剂，柱色谱纯化得修饰后的四臂聚乙二醇修饰物。
1H NMR(300MHz,DMSO-d-6):2.89ppm3.82ppm
实施例2：四臂聚乙二醇-羧酸-琥珀酰亚胺酯的合成
OH-PEG1-COOH的合成
三口瓶中加入180mL二氯甲烷，搅拌下依次加入24.00g分子量为1000的PEG1-OH、7.2g丁二酸酐、0.37g DMAP，氮气保护下升温至40℃回流反应5h，反应结束后，将物料降至室温，加入100mL 0.5N稀盐酸洗涤一次、然后水洗两次(200mL×2)，分液，有机相30～40℃减压浓缩，得粘稠油状物。向油状物中加入100mL乙酸乙酯，搅拌至溶液澄清后加入到将500mL正己烷中，抽滤，用正己烷淋洗滤饼。滤饼35～40℃鼓风箱干燥，得白色固体OH-PEG1-COOH。同样方法得分子量为5000的OH-PEG2–COOH。
OH-PEG1-NHS的合成
三口瓶中加入100ml二氯甲烷，然后加入10g分子量为1000的OH-PEG1-COOH、30gNHS，通氩气保护，然后在0℃下将50g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)的二氯甲烷溶液(100ml)缓慢加入到三口瓶中，上述混合物在室温下搅拌16h。所得产物转移至乙醚中沉淀，沉淀物用乙醚洗涤三次后干燥得活化后的PEG衍生物OH-PEG1-NHS。
四臂聚乙二醇-羧酸-琥珀酰亚胺酯的合成
将15g季戊四醇和100g六亚甲基二异氰酸酯溶于80mlDMF中，搅拌加热至80℃反应10h，所得产物减压蒸馏除去溶剂，柱色谱纯化得修饰后的四臂小分子中心。将该小分子7g和30gOH-PEG1-NHS溶于80mlDMF中，按上述方法进行聚合反应，柱色谱分离纯化得双臂修饰的聚乙二醇衍生物。将12g经双臂修饰的活性中心和2gOH-PEG2-COOH溶于80mlDMF中，搅拌加热至80℃反应10h，所得产物减压蒸馏除去溶剂，柱色谱纯化得修饰后的四臂聚乙二醇修饰物。
1H NMR(300MHz,DMSO-d-6):2.89ppm4.03ppm(CH2COOH)，
实施例3：四臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯-羧酸-碘乙酰胺的合成
OH-PEG1-NHS的合成
三口瓶中加入100ml二氯甲烷，然后加入20g分子量为2000的OH-PEG1-COOH、30gNHS，通氩气保护，然后在0℃下将50g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)的二氯甲烷溶液(100ml)缓慢加入到三口瓶中，上述混合物在室温下搅拌16h。所得产物转移至乙醚中沉淀，沉淀物用乙醚洗涤三次后干燥得活化后的PEG衍生物OH-PEG1-NHS。
OH-PEG2-COOH的合成
三口瓶中加入150mL二氯甲烷，搅拌下依次加入19.2g分子量为8000的PEG-OH、5.76g丁二酸酐、2.96g DMAP，氮气保护下升温至40℃回流反应5h，反应结束后，将物料降至室温，加入100mL 0.5N稀盐酸洗涤一次、然后水洗两次(200mL×2)，分液，有机相30～40℃减压浓缩，得粘稠油状物。向油状物中加入100mL乙酸乙酯，搅拌至溶液澄清后加入到将500mL正己烷中，抽滤，用正己烷淋洗滤饼。滤饼35～40℃鼓风箱干燥，得白色固体OH-PEG2-COOH。
OH-PEG3-碘乙酰胺的合成
称取1.8g的碘乙酸溶于100ml干燥的二氯甲烷中，加入2.5g的DCC，室温避光搅拌1h，然后加入40g分子量为4000的OH-PEG3-NH2，再次避光反应24h，反应混合物经硅藻土过滤后加入400ml乙醚过滤，收集的产物用乙醚洗涤数次，真空干燥后得OH-PEG3-碘乙酰胺。
将15g季戊四醇和100g六亚甲基二异氰酸酯溶于80mlDMF中，搅拌加热至80℃反应10h，所得产物减压蒸馏除去溶剂，柱色谱纯化得修饰后的四臂小分子中心。将该小分子7g和60gOH-PEG1-NHS溶于80mlDMF中，按实施例1的方法进行聚合反应，柱色谱分离纯化得双臂修饰的聚乙二醇衍生物。
同样的方法将修饰后的OH-PEG2-COOH、OH-PEG3-碘乙酰胺接到上述径双臂修饰的活性聚合中心上，柱色谱纯化得三种不同活性基团修饰的具有不同臂长的活性聚合物。
1H NMR(300MHz,DMSO-d-6):2.89ppm3.82ppm4.03ppm(CH2COOH)。
实施例4：四臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯的合成
OH-PEG1-COOH的合成
三口瓶中加入180mL二氯甲烷，搅拌下依次加入48.00g分子量为2000的PEG1-OH、7.2g丁二酸酐、0.37g DMAP，氮气保护下升温至40℃回流反应5h，反应结束后，将物料降至室温，加入100mL 0.5N稀盐酸洗涤一次、然后水洗两次(200mL×2)，分液，有机相30～40℃减压浓缩，得粘稠油状物。向油状物中加入100mL乙酸乙酯，搅拌至溶液澄清后加入到将500mL正己烷中，抽滤，用正己烷淋洗滤饼。滤饼35～40℃鼓风箱干燥，得白色固体OH-PEG1-COOH。同样方法得分子量为2500的OH-PEG2-COOH、分子量为3000的OH-PEG3-COOH。
OH-PEG1-NHS的合成
三口瓶中加入100ml二氯甲烷，然后加入分子量为20g分子量为2000的OH-PEG1-COOH、30g NHS，通氩气保护，然后在0℃下将50g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)的二氯甲烷溶液(100ml)缓慢加入到三口瓶中，上述混合物在室温下搅拌16h。所得产物转移至乙醚中沉淀，沉淀物用乙醚洗涤三次后干燥得活化后的PEG衍生物OH-PEG1-NHS。同样方法得OH-PEG2-NHS、OH-PEG3-NHS。
四臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯的合成
将15g季戊四醇和100g六亚甲基二异氰酸酯溶于80mlDMF中，搅拌加热至80℃反应10h，所得产物减压蒸馏除去溶剂，柱色谱纯化得修饰后的四臂小分子中心。将该小分子7g和30gOH-PEG1-NHS溶于80mlDMF中，按上述方法进行聚合反应，柱色谱分离纯化得单臂修饰的聚乙二醇衍生物。同样的方法将OH-PEG2-NHS、OH-PEG3-NHS修饰至中心分子上得四臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯。
1H NMR(300MHz,DMSO-d-6):2.89ppm
实施例5五臂聚合物的制备
三聚丙三醇的溴化
称取24.5g三聚丙三醇放置于250mL三颈烧瓶内作为主反应器，副反应器中加入102.9g溴化钠，联通两个反应器，用恒压滴液漏斗将90mL浓硫酸缓慢滴加到副反应器中，生成的气体通入主反应器，至无气体生成断开连接，回流7h后，旋蒸反应液得棕黄色粘稠物，将其转移到蒸馏水中，经超声波振动，有白色沉淀浮于液面上，静置抽滤，干燥。
OH-PEG1-环氧乙烷的制备
取10g分子量为1000的PEG1，溶于100mL脱水N,N-二甲基甲酰胺中，取1.0g三乙醇胺加入到上述溶液中，在40℃下搅拌4小时恒定条件。称量9.252g环氧氯丙烷加入上述反应液中室温反应24h。反应液在冷乙醚中沉淀，然后用冷乙醚洗涤三次，真空干燥。
OH-PEG2-对硝基苯碳酸酯的制备
取10g分子量为5000的PEG2溶解于无水二氯甲烷中，加入4.02g对硝基苯氯甲酸酯和1.48g三乙胺，调整pH值在7.5和8之间，在室温下反应24小时后加几滴TFA，直到溶液变成无色为止；然后旋蒸反应液得浓稠状混合物，加入到冷乙醚中沉淀。过滤收集的固体再次溶解在二氯甲烷中，并从冷乙醚中沉淀，重复两次后收集固体，得到白色粉末真空干燥。
OH-PEG3-CHO的制备
5mL醋酸在N2保护下加入到含有10gPEG3(分子量2000)的30ml无水二甲基亚砜中，然后加入1.8ml的CHCl3，在室温下搅拌反应9小时。然后将反应混合物倒入到400毫升的冷乙醚中沉淀，过滤收集沉淀物，收集的沉淀物溶解在氯仿中，再用冷乙醚沉淀，重复此操作两次。
OH-PEG4-三氟乙磺酸的制备
8gPEG4(分子量8000)与4μl三乙胺(TEA)溶于50mL四氢呋喃溶液中，冷却至0℃后于氮气保护下滴加5ml三氟乙磺酰氯(10μL)的THF溶液。室温反应4小时，过滤后除去三乙胺盐。滤液减压旋蒸，再溶解于少量的乙醚中-27℃储存过夜。在-10℃离心收集白色沉淀物，然后用柱色谱进一步纯化。将含有产品的组分混合并真空干燥。
OH-PEG5-碘乙酰胺的制备
称取1.8g的碘乙酸溶于100ml干燥的二氯甲烷中，加入2.5g的DCC，室温避光搅拌1h，然后加入4g分子量为200的OH-PEG3-NH2，再次避光反应24h，反应混合物经硅藻土过滤后加入400ml乙醚过滤，收集的产物用乙醚洗涤数次，真空干燥后得OH-PEG-碘乙酰胺。
聚合物的制备
将10.6gPEG1-环氧乙烷溶解于50ml二氯甲烷中，然后加入0.2g氢氧化钠固粉末，回流加热搅拌保温30min后，将1.1g溴化改性的三聚丙三醇溶于10.0ml二氯甲烷后用恒压滴液漏斗缓慢滴加到上述反应液中。反应期间用TLC法跟踪反应进程，薄层板上的反应体系只有一个点时反应完成，把溶液冷却、用旋转蒸发仪蒸去溶剂后与乙醚混溶，静置3天得白色产物。
同样方法将OH-PEG2-对硝基苯碳酸酯、OH-PEG3-CHO、OH-PEG4-三氟乙磺酸和OH-PEG5-碘乙酰胺接到五臂中心上。
1H NMR(300MHz,DMSO-d-6):2.74ppm/2.61ppm3.82ppm4.22ppm(CH2CF3)，4.52ppm(CH2OSO2)，7.55/8.31ppm,9.72ppm(-CHO)。
实施例6八臂聚合物的制备
COOH-PEG1-COOH的合成
将6g分子量为600的PEG1溶于30mL二氯甲烷中，搅拌条件下加入2g丁二酸酐和0.1g DMAP，氮气保护下升温至回流。回流反应5h后将物料降至室温，加入100mL 1N稀盐酸洗涤两次，有机相30～40℃减压浓缩，得粘稠油状物。油状物溶于10mL二氯甲烷中，冷乙醚中沉淀，重复操作三次，沉淀物鼓风箱干燥得白色固体。
同样方法制备COOH–PEG2-COOH、COOH-PEG4-COOH、COOH-PEG8-COOH，其中PEG2-PEG8的分子量分别为200、3000、8000。
OH-PEG3-COOH的合成
制备方法同实施例1，同样方法制备OH-PEG5-COOH、OH-PEG6-COOH、OH-PEG7-COOH，其中PEG3、PEG5、PEG6、PEG7的分子量分别为1000、5000、6000、7000。
COOH-PEG2-NHS(COOH-PEG4-NHS)的制备
将20mL二氯甲烷加到三口瓶中，搅拌下依次加入2g OH-PEG2-COOH、1.15g N-羟基琥珀酰亚胺、2.8g EDCII，氮气保护下升温至30℃，保温反应4～6h，反应液减压浓缩后的粘稠油状物加入无水乙醇中溶解，然后加入冷乙醚析出固体，重复操作三次，抽滤收集滤饼，将所得固体真空干燥得白色固体。COOH-PEG3-CHO(COOH-PEG7-CHO)的制备
制备方法同实施例5
COOH-PEG5-环氧乙烷
制备方法同实施例5
COOH-PEG6-三氟乙磺酸
制备方法同实施例5
聚合物的制备
称取3.42g二糖分散于30mDMF中，将6g COOH-PEG1-COOH加入到上述溶液中，搅拌30min后将0.97g DCC和0.37g吡啶加入到反应液中，在50℃下搅拌反应5天。减压浓缩溶液后用无水乙醚沉淀出产品，冷乙醚中洗涤三次，沉淀物鼓风箱干燥得白色固体。
同样方法将其它七条链接到中心多臂分子上。
1H NMR(300MHz,DMSO-d-6):2.74ppm/2.61ppm2.89ppm3.82ppm4.03ppm(CH2COOH)，4.22ppm(CH2CF3)，4.52ppm(CH2OSO2)，7.55/8.31ppm9.72ppm(-CHO)。
实施例7八臂聚合物的制备
COOH-PEG1-COOH的合成
制备方法同实施例6。
同样方法制备COOH-PEG2-COOH、COOH-PEG4-COOH、COOH-PEG5-COOH、COOH-PEG6-COOH、COOH-PEG8-COOH，其中PEG1、PEG2、PEG4、PEG5、PEG6、PEG8的分子量分别为400、200、2000、5000、6000、8000。
COOH-PEG1-NHS的制备
将100mL二氯甲烷加到三口瓶中，搅拌下依次加入4g COOH-PEG1-COOH、1.15g N-羟基琥珀酰亚胺、2.8g EDCI，氮气保护下升温至30℃，保温反应4～6h，反应液减压浓缩后的粘稠油状物加入无水乙醇中溶解，然后加入冷乙醚析出固体，重复操作三次，抽滤收集滤饼，将所得固体真空干燥得白色固体。
同样方法制备COOH-PEG2-NHS、COOH-PEG4-NHS、COOH-PEG5-NHS、COOH-PEG6-NHS、COOH-PEG8-NHS。
OH-PEG3-COOH和OH-PEG7-COOH的合成
制备方法同实施例1，PEG3、PEG7的分子量分别为2000、8000。
COOH-PEG3-CHO和COOH-PEG7-CHO的制备
制备方法同实施例5
聚合物的制备
制备方法同实施例6
1H NMR(300MHz,DMSO-d-6):2.89ppm9.72ppm(-CHO)。
实施例8：四臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯的合成
OH-PEG1-NHS的合成
制备方法同实施例5。同样方法得OH-PEG2-NHS、OH-PEG3-NHS、OH-PEG4-NHS，其中PEG1、PEG2、PEG3和PEG4的分子量分别为600、2000、6000、8000。四臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯的合成
制备方法同实施例5
1H NMR(300MHz,DMSO-d-6):2.89ppm
对比例
以实施例5的制备方法合成OH-PEG-NHS，PEG的分子量为2500。
四臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯的合成
制备方法同实施例5
1H NMR(300MHz,DMSO-d-6):2.89ppm
实施例9：四臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯用于干扰素的修饰
将四臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯(P1实施例4)溶于pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，得到溶液A；将重组人干扰素α-2b加入到溶液A中，充分混合搅拌，反应2h后将SP-SepharoseFF色谱柱连接到explorer 100液相色谱系统进行纯化。
同样方法以实施例8的聚合物(P2)和对比例的聚合物(P3)分别修饰重组人干扰素。
生物学活性的测定：采用SD大鼠皮下注射，静脉采血，不同时间取样，细胞病变抑制法分别测定未修饰及分别以P1、P2和P3修饰的干扰素的生物学活性(以最大活性为100％)，结果如下表所示；
Claims (18)
1.一种多臂聚乙二醇衍生物，为具有不同臂长的功能化聚乙二醇，其具有如下通式，
X为相同或不同结构的功能基团，选自以下功能基团的一种或几种，-OH，-NH2，-COOH，-SH，-SO3H，琥珀酰亚胺基，丙烯酸基，丙烯酰胺基，醛基，碘乙酰胺基，马来亚酰胺基，三氟乙磺酸基，对硝基苯碳酸酯基，三氯苯碳酸酯基，氧羰基咪唑基；
Y是相同或不同的连接基团，选自-O-，-O(CH2CH2)i-,-O(CH2)iCONH-，-OOC(CH2)iCOO-，-OOCNH(CH2)iNHCOO-，-OOC(CH2)iCONH-；i为0-20的整数；
R为多臂支化中心，支化度n为3-16，R选自以下结构中一种或两种以上的组合：
(1)其中三臂支化中心包括以下结构
(2)其中四臂支化中心包括以下结构
(3)其中五臂支化中心包括以下结构
(4)其中六臂支化中心包括以下结构
(5)其中八臂支化中心包括以下结构
(6)其中十臂支化中心包括以下结构
(7)其中十一臂支化中心包括以下结构
(8)其中十二臂支化中心包括以下结构
(9)其中十四臂支化中心包括以下结构
(10)其中十六臂支化中心包括以下结构
2.根据权利要求1所述的多臂聚乙二醇衍生物，X为不同功能基团。
3.根据权利要求1所述的多臂聚乙二醇衍生物，至少有两个链的PEG的分子量是不相同的。
4.根据权利要求1所述的多臂聚乙二醇衍生物，R为四臂支化中心
5.权利要求1所述的多臂聚乙二醇衍生物，X为-COOH、琥珀酰亚胺基、碘乙酰胺基、醛基、三氟乙磺酸基或对硝基苯碳酸酯基。
6.权利要求1所述的多臂聚乙二醇衍生物，结构如下：
其中PEG1、PEG2和PEG3不同，各个结构中相同编号的PEG之间也互不相同。
7.根据权利要求1-6任一项所述的多臂聚乙二醇衍生物，其中的聚乙二醇为单链聚乙二醇，其分子量为200-8000，PDI≤1.02，所述的聚乙二醇为PEG、PEG1、PEG2或PEG3。
8.根据权利要求7所述的多臂聚乙二醇衍生物，其中的聚乙二醇为具有窄分布的聚乙二醇，PDI≤1.02。
9.根据权利要求8所述的多臂聚乙二醇衍生物，其特征在于，窄分布的聚乙二醇先经活性修饰基团修饰后，再与多官能团的支化中心反应制备。
10.根据权利要求9所述的多臂聚乙二醇衍生物，其特征在于，先对窄分布的聚乙二醇一端羟基进行活化改性，然后再与修饰基团反应制备具有单官能团修饰的聚乙二醇。
11.根据权利要求10所述的直链聚乙二醇官能化衍生物，其特征在于不同分子量的直链聚乙二醇以不同的官能团进行修饰。
12.根据权利要求10所述的直链聚乙二醇官能化衍生物，其特征在于聚乙二醇两端基以不同的官能团进行修饰。
13.根据权利要求1-12任一项所述的多臂聚乙二醇衍生物的制备方法，其特征在于多臂支化中心为相同或不同的功能基团，优选为同种官能团。
14.根据权利要求1-12任一项所述的多臂聚乙二醇衍生物的制备方法，其特征在于直链聚乙二醇先经单官能团活化后与多官能团的中心反应制备具有不同活性基团的多臂聚合物，而后再对目标物进行特异性修饰。
15.根据权利要求1-12任一项所述的特异性多臂聚乙二醇衍生物的制备方法，包括如下步骤：
a)、以窄分布的线型PEG与活性修饰基团反应制备单活性基团的改性线形PEG，对不能直接与PEG上羟基反应的活性修饰基团，要先对线型PEG进行单官能团活化，然后再与活性修饰基团反应制备单活性基团的PEG，上述PEG可为同双官能团或异双官能团；
b)、按照a)中的方法对不同分子量的线形PEG进行不同活性基团的单官能团修饰；
c)、根据多支化小分子中心的官能团类型和单官能团修饰后窄分布PEG留存的另一端官能团的类型选择修饰剂对多支化中心进行修饰；
d)、将c)中制备的修饰有不同活性官能团的不同分子量的单官能团活化的线形PEG分别与多活性官能团的小分子中心反应制备具有二种或以上修饰物的不同臂长的多臂PEG衍生物。
16.根据权利要求1-12任一项所述的多臂聚乙二醇衍生物的用途，其特征在于不同臂长的聚乙二醇可修饰不同的目标物，且不同的目标物具有不同的降解缓释时间。
17.根据权利要求1-12任一项所述的多臂聚乙二醇衍生物的用途，其特征在于通过不同的官能团对药物、蛋白质、多肽进行修饰，且同一分子可以对多种目标物进行修饰。
18.根据权利要求1-12任一项所述的多臂聚乙二醇衍生物的用途，其特征在于可用于生物降解水凝胶、组织封闭剂、止血海绵的制备以及载药缓释微球的制备。
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