CN110628035B - 酶和pH双重响应性共聚物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
酶和pH双重响应性共聚物及其制备方法和应用，属于功能高分子材料领域。本发明产品的分子结构如下：
m为1～4的正整数。经多个步骤制得的本发明产品的应用是做抗癌药物的靶向释放载体，对酶的响应速率快，具有很好的生物相容性。
Description
技术领域
本发明属于功能高分子材料领域，具体涉及四代对酶和pH有双重响应特性的、以苯丙氨酰-赖氨酸二肽连接线形和树枝状嵌段的线形-树枝状嵌段共聚物、其制备方法和作为药物控制释放载体的应用。
背景技术
具有高效抗肿瘤活性的抗肿瘤药物已被大量应用于肿瘤治疗，但由于其非特异性地分布于机体健康组织，这不但带来较大的毒副作用，还降低了药物的生物利用度。应用特殊的药物载体是解决上述问题的重要手段。经过合理有效设计和构建的载体系统能够有效地输送药物到达肿瘤部位，达到特异性靶向输送药物的目的，可减少药物在正常组织中的分布，降低药物的毒副作用，也使药物的生物利用度大为提高。环境响应性聚合物是这类药物靶向输送系统的理想载体。环境响应性聚合物是一类智能型大分子，能够响应外界环境如pH、温度、光、酶等的微小刺激而引起自身结构的变化，从而引起其某些物理化学性质的显著改变。其中，基于pH响应性聚合物的药物载体研究较为广泛。人体正常组织的pH值在7.4左右，而肿瘤细胞具有弱酸性的微环境，pH值在6.5-7.0之间，其溶酶体中的pH值甚至更低(pH＝5.0-6.0)。因此，可以利用上述pH变化，将对酸敏感的化学键(如酯键、肟键)或者化学结构(如腙式结构、缩醛结构)引入聚合物中，制备pH响应性聚合物药物载体，使其在血液循环中结构保持完整不释放药物，而到达肿瘤部位后，弱酸性环境使得载体水解或结构发生变化而释放药物，从而实现抗肿瘤药物的靶向释放。
另一种备受关注的环境响应性聚合物是酶响应性聚合物，因其具有高选择性、高效性和很好的生物相容性，可以被应用于药物传输、疾病诊治、组织工程等生物医学领域。生物酶对底物及其催化反应的严格选择性(专一性)为药物载体的发展提供了新的机制。由于肿瘤细胞基于增殖、扩散的需要，往往过度表达许多生物酶，如基质金属蛋白酶(MMP)、组织蛋白酶B(Cathepsin B)、胰蛋白酶和磷酸酶等。在药物载体中引入能被特异性酶切断的化学键，可以得到具有酶响应性的药物载体，实现抗癌药物的靶向释放。
线形-树枝状嵌段共聚物(LDBCs)是一种具有特殊拓扑结构的共聚物，它由线形高分子与树枝状嵌段通过化学键连接而成，这种共聚物可根据需要调节线形高分子长度，树枝状嵌段的代数、化学组成与结构，在LDBCs的线形链、树枝状嵌段及其外围基团，甚至线形链和树枝状嵌段的连接点上引入对外界环境刺激有响应的化学键或官能团可得到具有环境响应性的LDBCs。环境响应性两亲LDBCs在选择性溶剂中自组装形成的胶束、囊泡等聚集体可以包载难溶性药物，在外界环境的刺激下可以释放出被包载的药物。目前，文献报道的大多数环境响应性LDBCs只能响应一种刺激，而多重响应性药物载体在实际应用中，因为其可同时对多种刺激进行响应，更加有利于在复杂的生理环境下实现其功能，比如在肿瘤的化疗中，往往要求药物在病灶部位集中并快速释放，用同时具有pH和酶双重响应性的聚合物作为抗癌药物载体，可以实现这一功能。因此多种响应性协同作用会具有更加广泛的应用和实际意义。文献检索未见有关pH和酶双重响应性线形-树枝状嵌段共聚物的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶和pH双重响应性共聚物及其制备方法和应用，具体就是提供第一至第四代以苯丙氨酰-赖氨酸二肽连接聚(N-乙烯基吡咯烷酮)线形链和具有缩酮末端基团的脂肪族聚酯树枝化嵌段的线形-树枝状嵌段共聚物及其制备方法和应用。
本发明制备的线形-树枝状嵌段共聚物具有两亲性，在水溶液中能自组装为纳米胶束，能包载难溶性的抗癌药物(紫杉醇、阿霉素)，在胰蛋白酶或组织蛋白酶B存在或/和改变水溶液的pH，这些纳米胶束能解组装释放出包载的抗癌药物。
本发明产品酶和pH双重响应性共聚物的分子结构如下：
本发明酶和pH双重响应性共聚物的制备方法是按如下步骤：
一、制备第一代线形-树枝状嵌段共聚物PNVP-Phe-Lys-b-G1
(1)、制备具有黄原酸酯末端的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-X
按现有技术(例如可参照文献D.H.Wan,K.Satoh,M.Kamigaito and Y.Okamotot,Macromolecules,2005,38(25):10397-10405)，以[1-(O-乙基黄原酸)乙基]苯为链转移剂、偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，引发N-乙烯基吡咯烷酮的可逆加成断裂链转移(RAFT)聚合，制备具有黄原酸酯末端的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-X。
(2)、制备(2-丙烯酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯
按现有技术(例如可参照文献Lois J.Hobson,W.James Feast.Polymer,1999,40(5):1279-1297)，以三乙胺为缚酸剂，用(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯与丙烯酰氯反应制备(2-丙烯酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯。(2-丙烯酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯的分子结构如下：
(3)、制备具有末端单Boc保护氨基的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-NHBoc
在反应容器中加入正丁胺、PNVP-X、三-(2-羧乙基)膦(TCEP)，正丁胺，PNVP-X和TCEP三者的物质的量比为1:100～120:280～320，每mL二氯甲烷中溶有0.1～1g PNVP-X，按物质的量计再加入占前述三者总量0.05％～0.25％的三丁基膦(PBu3)，搅拌溶解后，加入(2-丙烯酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯和正己胺，PNVP-X、(2-丙烯酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯和正己胺的物质的量比为1:1～1.5:1～2，搅拌反应4～10h。用石油醚共沉淀2～6次，再在蒸馏水中透析2～5天，冷冻干燥，制得具有单Boc保护氨基末端的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-NHBoc。PNVP-NHBoc的分子结构如下：
(4)、制备具有末端氨基的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-NH2
在反应容器中加入PNVP-NHBoc和CH2Cl2，其中每mL CH2Cl2中含有0.01～0.04mmol的PNVP-NHBoc，搅拌溶解，加入稀盐酸将pH调节为4～5，搅拌反应4～8h，用NaOH溶液调节pH为中性，过滤，在蒸馏水中透析2～5天，冷冻干燥，制得具有末端氨基的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-NH2。PNVP-NH2的分子结构如下：
(5)、制备具有末端Fmoc氨基苯丙氨酸的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-Phe-NHFmoc
在反应容器中加入N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸和浓度v/v＝1/1的乙醇水溶液，每mL乙醇水溶液中含有0.01～0.05g的N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸，搅拌溶解，加入PNVP-NH2和1-羟基苯并三唑(HOBt)，其中PNVP-NH2、HOBt、N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸的物质的量比为1:1～3:3～6，搅拌20～40min后加入N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)，PNVP-NH2与DIC物质的量比为1:4～8，搅拌反应18～30h。粗产物用冷乙醚共沉淀2～5次，在蒸馏水中透析2～5天，冷冻干燥，制得PNVP-Phe-NHFmoc。PNVP-Phe-NHFmoc的分子结构如下：
(6)、制备具有末端氨基苯丙氨酸的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-Phe-NH2
在反应容器中加入PNVP-Phe-NHFmoc、4-甲基哌啶和二甲基甲酰胺(DMF)，其中PNVP-Phe-NHFmoc和4-甲基哌啶的物质的量比为1:15～20，4-甲基哌啶和DMF的体积比为1:3～6，搅拌反应20～40min，用冷乙醚共沉淀2～3次，在蒸馏水中透析2～5天，冷冻干燥，制得PNVP-Phe-NH2。PNVP-Phe-NH2的分子结构如下：
(7)、制备PNVP-Phe-Lys-NHBoc
在反应容器中加入N-9-芴甲氧羰基-N-叔丁氧羰基-L-赖氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)和DMF，每mL的DMF中含有0.02～0.04mmol的Fmoc-Lys(Boc)-OH，搅拌溶解，加入PNVP-Phe-NH2和HOBt，其中PNVP-Phe-NH2、HOBt、Fmoc-Lys(Boc)-OH的三者的物质的量比为1:1～3:2～4，搅拌20～40min后加入N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)，PNVP-NH2与DIC物质的量比为1:3～6，搅拌反应18～30h，粗产物用冷乙醚共沉淀2～5次，在蒸馏水中透析2～5天，冷冻干燥，制得PNVP-Phe-Lys-NHBoc。PNVP-Phe-Lys-NHBoc的分子结构如下：
(8)、制备PNVP-Phe-Lys-NH2
在反应容器中加入PNVP-Phe-Lys-NHBoc和CH2Cl2，其中每mL CH2Cl2中含有0.01～0.04mmol的PNVP-Phe-Lys-NHBoc，搅拌溶解，加入稀盐酸调节pH为4～5，搅拌反应4～10h，用NaOH溶液调节pH为中性，在蒸馏水中透析2～5天，冷冻干燥，制得PNVP-Phe-Lys-NH2。PNVP-Phe-Lys-NH2的分子结构如下：
(9)、制备异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸酐
首先按现有技术(例如可参照文献Movellan J,Urban P,Moles E,et,al.Biomaterials,2014,35(27):7940-7950)，用2,2-二(羟甲基)丙酸与2,2-二甲氧基丙烷反应制备异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸。
再按现有技术(例如可参照文献Movellan J,Urban P,Moles E,et,al.Biomaterials,2014,35(27):7940-7950)，用上述得到的异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸为原料，以N,N'-二环己基碳二亚胺为脱水剂制备异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸酐。
(10)、制备PNVP-Phe-Lys-b-G1
在反应容器中加入PNVP-Phe-Lys-NH2、异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸酐、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、三乙胺(NEt3)和DMF，其中DMAP、PNVP-Phe-Lys-NH2、异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸酐和NEt3四者的物质的量比为1:3～6:6～10:1500～2000，NEt3和DMF的体积比为1:2～5，搅拌反应30～50h后，用冷乙醚共沉淀2～6次，在蒸馏水中透析2～5天，冷冻干燥，制得PNVP-Phe-Lys-b-G1。PNVP-Phe-Lys-b-G1的分子结构如下：
二、制备第二代线形-树枝状嵌段共聚物PNVP-Phe-Lys-b-G2
(1)、制备PNVP-Phe-Lys-b-G1-OH
在反应容器中加入PNVP-Phe-Lys-b-G1和甲醇/四氢呋喃(THF)混合溶液，其中每mL甲醇/四氢呋喃(THF)混合溶液中含有0.001～0.004mmol的PNVP-Phe-Lys-b-G1，甲醇/四氢呋喃(THF)混合溶液的甲醇和THF的体积比为1:1～3，加入浓硫酸调节pH至2～4，搅拌反应15～30h，用氨水中和，过滤，旋蒸，在蒸馏水中透析2～5天，冷冻干燥，制得PNVP-Phoce-Lys-b-G1-OH，PNVP-Phe-Lys-b-G1-OH的分子结构如下：
(2)、制备第二代线形-树枝状嵌段共聚物PNVP-Phe-Lys-b-G2
在反应容器中加入PNVP-Phe-Lys-b-G1-OH、异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸酐、DMAP、吡啶/CH2Cl2混合溶液，其中PNVP-Phe-Lys-b-G1-OH、DMAP、异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸酐的物质的量比为1:1～4:2～5，吡啶与CH2Cl2体积比为v:v＝1～2:1，每mL吡啶/CH2Cl2混合溶液中含有0.01～0.04mmol的PNVP-Phe-Lys-b-G1-OH，搅拌反应36～60h后，用冷乙醚共沉淀2～6次，在蒸馏水中透析2～5天，冷冻干燥，制得PNVP-Phe-Lys-b-G2。PNVP-Phe-Lys-b-G2的分子结构如下：
三、制备第三代和第四代线形-树枝状嵌段共聚物PNVP-Phe-Lys-b-G3和PNVP-Phe-Lys-b-G4
用步骤二(2)得到的PNVP-Phe-Lys-b-G2代替步骤二(1)中的PNVP-Phe-Lys-b-G1，重复步骤二(1)和步骤二(2)，得到PNVP-Phe-Lys-b-G3；再以此步骤中得到的PNVP-Phe-Lys-b-G3代替步骤二(1)中的PNVP-Phe-Lys-b-G1，重复步骤二(1)和步骤二(2)，得到PNVP-Phe-Lys-b-G4。
PNVP-Phe-Lys-b-G3的分子结构如下：
PNVP-Phe-Lys-b-G4的分子结构如下：
上述步骤中的过滤，透析，冷冻干燥等工序同常规技术。
本发明中，所制备的四代以苯丙氨酰-赖氨酸二肽连接聚(N-乙烯基吡咯烷酮)线形链和具有缩酮末端基团的脂肪族聚酯树枝化嵌段的线形-树枝状嵌段共聚物PNVP-Phe-Lys-b-Gn(n＝1-4)结构明确，都具有较窄的分子量分布(PDI<1.25)，都可以通过1HNMR和GPC进行详细表征。
本发明产品酶和pH双重响应性共聚物的应用是用做抗癌药物的靶向释放载体。
本发明的有益效果：本发明所提供的以苯丙氨酰-赖氨酸二肽连接聚(N-乙烯基吡咯烷酮)线形链和具有缩酮末端基团的脂肪族聚酯树枝化基元的线形-树枝状嵌段共聚物具有酶和pH双重响应性，在水溶液中自组装形成的球形胶束能包载亲脂性的抗癌药物(例如紫杉醇、阿霉素)，加入胰蛋白酶(或组织蛋白酶B)后或在pH 5.0的缓冲溶液中，胶束解组装释放出包载的抗癌药物的速率比未加酶时或在pH7.4的缓冲溶液中的释药速率快；加入胰蛋白酶(或组织蛋白酶B)并在pH 5.0的缓冲溶液中，该共聚物胶束对抗癌药物的释放速率显著增加。本发明研制的线形-树枝状嵌段共聚物对酶有响应的化学键(苯丙氨酰-赖氨酸二肽)在线形链和树枝状嵌段的连接点，比文献报道的酶响应性化学键在树枝状嵌段或者树枝状嵌段外围基团上的线形-树枝状嵌段共聚物对酶的响应速率更快；而且本发明研制的线形-树枝状嵌段共聚物具有很好的生物相容性；组织蛋白酶B(Cathepsin B)和胰蛋白酶在一些肿瘤组织中过度表达，而肿瘤细胞具有弱酸性的微环境，因此，本发明制备的酶和pH双重响应性线形-树枝状嵌段共聚物可作为抗癌药物的靶向释放载体。
附图说明
图1为实施例得到的PNVP-Phe-Lys-b-G3的核磁共振氢谱。
图2为实施例得到的PNVP-Phe-Lys-b-G3包载紫杉醇胶束在pH7.4缓冲溶液中(pH(7.4))、加入胰蛋白酶(酶)、在pH 5.0缓冲溶液中(pH(5.0))、含有胰蛋白酶的pH 5.0缓冲溶液中(酶+pH(5.0))的释放曲线。
具体实施方式
下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
在圆底烧瓶中加入O-乙基黄原酸钾1.10g，乙醇(13.33mL)，搅拌溶解，加入溶有0.79mL1-溴乙基苯的乙醇溶液，60℃搅拌5h。过滤，蒸去溶剂。加入17mL水，用乙酸乙酯(4×20mL)萃取，有机层用硫酸镁干燥过夜，蒸去溶剂，得到(O-乙基黄原酸)乙基苯，产率75.1％。
在反应瓶中加入N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)(1.10g)，(O-乙基黄原酸)乙基苯(20.15mg，偶氮二异丁腈(AIBN)(3.28mgl)，抽真空、充氮气后，60℃搅拌18h，将得到的聚合物溶于二氯甲烷，用乙酸乙酯沉淀纯化，再蒸馏水中透析3天，冷冻干燥，得到聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-X，产率77.9％。
在圆底烧瓶中加入1mL(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯和1mLTHF，搅拌，置于冰水浴中，滴加溶有0.37mL的THF溶液，滴加三乙胺(TEA)，继续搅拌4h。过滤，蒸除溶剂，加入乙酸乙酯溶解，用1mol/mL柠檬酸、1mol/mL NaOH溶液和饱和NaCl溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，用石油醚重结晶得(2-丙烯酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯，产率为61.2％。
在干燥的反应瓶中加入0.1mmol PNVP-X，用二氯甲烷溶解后，在氮气保护下，加入1.04mL正丁胺、微量(1滴)三丁基膦(PBu3)、三-(2-羧乙基)膦(TCEP)(0.086g)，继续充氮气抽真空后，加入(2-丙烯酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.021g)、正己胺(0.164mL)，搅拌6h。用石油醚共沉淀3次，在蒸馏水中透析3天，冷冻干燥得具有末端单Boc保护氨基的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-NHBoc，产率82.5％。
在圆底烧瓶中加入0.1mmol PNVP-NHBoc和4mL二氯甲烷，搅拌溶解，用稀盐酸将pH调节为4-5，搅拌反应6h，用NaOH调节pH为中性，过滤，蒸出溶剂，用蒸馏水透析3天，冷冻干燥得具有末端氨基的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-NH2，产率84.4％。
将0.12g Fmoc-L-苯丙氨酸溶于10mL 50％的乙醇溶液中，加入0.1mmol PNVP-NH2和13.5mg 1-羟基苯并三唑(HOBt)，搅拌30min后，加入0.06mL N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)，搅拌反应24h。用冷乙醚共沉淀3次，在蒸馏水中透析3天，冷冻干燥得具有末端Fmoc氨基苯丙氨酸的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-Phe-NHFmoc，产率79.5％。
在圆底烧瓶中加入PNVP-Phe-NHFmoc(0.01mmol)、适量4-甲基哌啶/二甲基甲酰胺(DMF)溶液(v/v＝1/4)，搅拌30min，用冷乙醚共沉淀3次，在蒸馏水中透析3天，冷冻干燥得具有末端氨基苯丙氨酸的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-Phe-NH2，产率92.1％。
将Fmoc-Lys(Boc)-OH(0.18g)溶于DMF(10mL)中，加入PNVP-Phe-NH2(0.1mmol)和1-羟基苯并三唑(HOBt)(13.51mg)，搅拌30min后加入N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(0.06mL)，搅拌反应24h。用冷乙醚共沉淀3次，在蒸馏水中透析3天，冷冻干燥得PNVP-Phe-Lys-NHBoc，产率97.5％。
将0.1mmol PNVP-Phe-Lys-NHBoc溶于CH2Cl2(4mL)，用稀盐酸调节pH至4-5，搅拌反应6h，用NaOH调节pH为中性，除去有机溶剂，在蒸馏水中透析3天，冷冻干燥得PNVP-Phe-Lys-NH2，产率88.7％。
在圆底烧瓶中加入30.1g 2,2-二(羟甲基)丙酸、41.4mL 2,2-二甲氧基丙烷、2.3g对苯磺酸水合物(TsOH)、150mL丙酮，搅拌反应2h，用3mL的NH4OH/EtOH(4/1)中和催化剂，蒸去丙酮，将残留物溶解在500mL CH2Cl2中，用3×100mL蒸馏水萃取，无水硫酸镁干燥，蒸去溶剂得到异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸，产率85.2％。
将1g异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸溶解在3mL二氯甲烷中，加入1mL溶有0.59gN,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)的二氯甲烷溶液，搅拌48h，过滤，用少量二氯甲烷洗涤，蒸除溶剂，用20mL正己烷重结晶得异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸酐，产率69.2％。
将PNVP-Phe-Lys-NH2(0.1mmol)，异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸酐(49.6mg)，DMAP(2.4mg)溶解于DMF/NEt3(v/v＝3/1，20mL)中，搅拌40h，用冷乙醚共沉淀3次，在蒸馏水中透析3天，冷冻干燥得PNVP-Phe-Lys-b-G1，产率92.3％。
将PNVP-Phe-Lys-b-G1(0.1mmol)溶于THF/甲醇(v/v＝4/3，50mL)溶液，加入浓硫酸调节pH＝3，搅拌反应20h，用氨水中和，过滤，除去有机溶剂，在蒸馏水中透析3天，冷冻干燥得PNVP-Phe-Lys-b-G1-OH，产率为80.08％。
在圆底烧瓶中异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸酐(99mg)，DMAP(24mg)，PNVP-Phe-Lys-b-G1-OH(0.1mmol)，加入吡啶/CH2Cl2(v/v＝3/2)溶液(4mL)，搅拌48h，用冷乙醚共沉淀3次，在蒸馏水中透析3天，冷冻干燥，得到PNVP-Phe-Lys-b-G2，产率89.2％。
用PNVP-Phe-Lys-b-G2代替上述实验中的PNVP-Phe-Lys-b-G1重复上面的相关步骤进行实验，得到PNVP-Phe-Lys-b-G3。
用PNVP-Phe-Lys-b-G3代替上述实验中的PNVP-Phe-Lys-b-G1重复上面的相关步骤进行实验得到PNVP-Phe-Lys-b-G4。
将50mg PNVP-Phe-Lys-b-Gn(n＝2～4)和15mg紫杉醇溶于10mL乙醇，缓慢加入10mL去离子水，除去乙醇，剩余溶液高速离心30min，取上层清液冷冻干燥后制得PNVP-Phe-Lys-b-Gn(n＝2～4)包载紫杉醇胶束。
将PNVP-Phe-Lys-b-Gn(n＝2～4)包载紫杉醇胶束分散于pH 7.4的缓冲溶液中制成1.0mg/mL载药胶束溶液，加入胰蛋白酶溶液(终浓度为75U/mL)，置于透析袋内，密封，置于pH 7.4的缓冲溶液中透析，以未加入胰蛋白酶的PNVP-Phe-Lys-b-Gn(n＝2～4)包载紫杉醇胶束溶液为对照，进行紫外光谱分析。结果表明，加入胰蛋白酶后，PNVP-Phe-Lys-b-Gn(n＝2～4)胶束对紫杉醇的释放速率明显增加。
取两份一定量的PNVP-Phe-Lys-b-Gn(n＝2～4)包载紫杉醇胶束溶液(1.0mg/mL)，置于透析袋内，密封，分别置于pH 5.0和pH 7.4的缓冲溶液中透析，进行紫外光谱分析。结果表明，PNVP-Phe-Lys-b-Gn(n＝2～4)胶束对紫杉醇的释放速率在pH 5.0缓冲溶液中明显比在pH 7.4缓冲溶液中的释放速率快。
取一定量的PNVP-Phe-Lys-b-Gn(n＝2～4)包载紫杉醇胶束溶液(1.0mg/mL)置于透析袋内，密封，置于含有胰蛋白酶的pH 5.0缓冲溶液中透析，进行紫外光谱分析。结果表明，PNVP-Phe-Lys-b-Gn(n＝2～4)胶束对紫杉醇的释放速率在含有胰蛋白酶的pH 5.0缓冲溶液中比在含有胰蛋白酶的pH 7.4缓冲溶液中的释放速率快。
将胰蛋白酶换成组织蛋白酶B(Cathepsin B)重复上述有关步骤进行实验，结果表明，加入Cathepsin B后，与未加入Cathepsin B的对照相比，PNVP-Phe-Lys-b-Gn(n＝2～4)胶束对紫杉醇的紫杉醇的释放速率明显增加。
将胰蛋白酶换成组织蛋白酶B(Cathepsin B)重复上述有关步骤进行实验，结果表明，PNVP-Phe-Lys-b-Gn(n＝2～4)胶束对紫杉醇的释放速率在含有Cathepsin B的pH 5.0缓冲溶液中比在含有Cathepsin B的pH 7.4缓冲溶液中的释放速率快。
将紫杉醇换成阿霉素重复上述有关步骤进行实验，结果表明，PNVP-Phe-Lys-b-Gn(n＝2～4)胶束也能包载阿霉素，与未加入胰蛋白酶的对照相比，加入胰蛋白酶后，PNVP-Phe-Lys-b-Gn(n＝2～4)胶束对阿霉素的释放速率明显增加；PNVP-Phe-Lys-b-Gn(n＝2～4)胶束对阿霉素的释放速率在pH 5.0缓冲溶液中比在pH 7.4缓冲溶液中的释放速率快；PNVP-Phe-Lys-b-Gn(n＝2～4)胶束对阿霉素的释放速率在含有胰蛋白酶的pH 5.0缓冲溶液中比在含有胰蛋白酶的pH 7.4缓冲溶液中的释放速率快。
将紫杉醇换成阿霉素、胰蛋白酶换成组织蛋白酶B(Cathepsin B)重复上述有关步骤进行实验，结果表明，与未加入Cathepsin B的对照相比，加入Cathepsin B后，PNVP-Phe-Lys-b-Gn(n＝2～4)胶束对阿霉素的释放速率明显增加；PNVP-Phe-Lys-b-Gn(n＝2～4)胶束对阿霉素的释放速率在含有Cathepsin B的pH 5.0缓冲溶液中比在含有Cathepsin B的pH7.4缓冲溶液中的释放速率快。
Claims (3)
1.一种酶和pH双重响应性共聚物，其特征在于分子结构如下：
2.一种酶和pH双重响应性共聚物的制备方法，其特征在于按如下步骤：
(一)、制备第一代线形-树枝状嵌段共聚物PNVP-Phe-Lys-b-G1
(1)、制备具有黄原酸酯末端的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-X；
(2)、制备(2-丙烯酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯
以三乙胺为缚酸剂，用(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯与丙烯酰氯反应制备(2-丙烯酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯，(2-丙烯酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯的分子结构如下：
(3)、制备具有末端单Boc保护氨基的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-NHBoc
在反应容器中加入正丁胺、PNVP-X、三-(2-羧乙基)膦(TCEP)，正丁胺，PNVP-X和TCEP三者的物质的量比为1:100～120:280～320，每mL二氯甲烷中溶有0.1～1g PNVP-X，按物质的量计再加入占前述三者总量0.05％～0.25％的三丁基膦(PBu3)，搅拌溶解后，加入(2-丙烯酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯和正己胺，PNVP-X、(2-丙烯酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯和正己胺的物质的量比为1:1～1.5:1～2，搅拌反应4～10h；用石油醚共沉淀2～6次，再在蒸馏水中透析2～5天，冷冻干燥，制得具有单Boc保护氨基末端的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-NHBoc，PNVP-NHBoc的分子结构如下：
(4)、制备具有末端氨基的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-NH2
在反应容器中加入PNVP-NHBoc和CH2Cl2，其中每mL CH2Cl2中含有0.01～0.04mmol的PNVP-NHBoc，搅拌溶解，加入稀盐酸将pH调节为4～5，搅拌反应4～8h，用NaOH溶液调节pH为中性，过滤，在蒸馏水中透析2～5天，冷冻干燥，制得具有末端氨基的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-NH2，PNVP-NH2的分子结构如下：
(5)、制备具有末端Fmoc氨基苯丙氨酸的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-Phe-NHFmoc在反应容器中加入N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸和浓度v/v＝1/1的乙醇水溶液，每mL乙醇水溶液中含有0.01～0.05g的N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸，搅拌溶解，加入PNVP-NH2和1-羟基苯并三唑(HOBt)，其中PNVP-NH2、HOBt、N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸的物质的量比为1:1～3:3～6，搅拌20～40min后加入N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)，PNVP-NH2与DIC物质的量比为1:4～8，搅拌反应18～30h；粗产物用冷乙醚共沉淀2～5次，在蒸馏水中透析2～5天，冷冻干燥，制得PNVP-Phe-NHFmoc，PNVP-Phe-NHFmoc的分子结构如下：
(6)、制备具有末端氨基苯丙氨酸的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)PNVP-Phe-NH2
在反应容器中加入PNVP-Phe-NHFmoc、4-甲基哌啶和二甲基甲酰胺(DMF)，其中PNVP-Phe-NHFmoc和4-甲基哌啶的物质的量比为1:15～20，4-甲基哌啶和DMF的体积比为1:3～6，搅拌反应20～40min，用冷乙醚共沉淀2～3次，在蒸馏水中透析2～5天，冷冻干燥，制得PNVP-Phe-NH2，PNVP-Phe-NH2的分子结构如下：
(7)、制备PNVP-Phe-Lys-NHBoc
在反应容器中加入N-9-芴甲氧羰基-N-叔丁氧羰基-L-赖氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)和DMF，每mL的DMF中含有0.02～0.04mmol的Fmoc-Lys(Boc)-OH，搅拌溶解，加入PNVP-Phe-NH2和HOBt，其中PNVP-Phe-NH2、HOBt、Fmoc-Lys(Boc)-OH的三者的物质的量比为1:1～3:2～4，搅拌20～40min后加入N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)，PNVP-NH2与DIC物质的量比为1:3～6，搅拌反应18～30h，粗产物用冷乙醚共沉淀2～5次，在蒸馏水中透析2～5天，冷冻干燥，制得PNVP-Phe-Lys-NHBoc，PNVP-Phe-Lys-NHBoc的分子结构如下：
(8)、制备PNVP-Phe-Lys-NH2
在反应容器中加入PNVP-Phe-Lys-NHBoc和CH2Cl2，其中每mL CH2Cl2中含有0.01～0.04mmol的PNVP-Phe-Lys-NHBoc，搅拌溶解，加入稀盐酸调节pH为4～5，搅拌反应4～10h，用NaOH溶液调节pH为中性，在蒸馏水中透析2～5天，冷冻干燥，制得PNVP-Phe-Lys-NH2，PNVP-Phe-Lys-NH2的分子结构如下：
(9)、制备异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸酐
先用2,2-二(羟甲基)丙酸与2,2-二甲氧基丙烷反应制备异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸，再以得到的异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸为原料，以N,N'-二环己基碳二亚胺为脱水剂制备异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸酐；
(10)、制备PNVP-Phe-Lys-b-G1
在反应容器中加入PNVP-Phe-Lys-NH2、异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸酐、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、三乙胺(NEt3)和DMF，其中DMAP、PNVP-Phe-Lys-NH2、异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸酐和NEt3四者的物质的量比为1:3～6:6～10:1500～2000，NEt3和DMF的体积比为1:2～5，搅拌反应30～50h后，用冷乙醚共沉淀2～6次，在蒸馏水中透析2～5天，冷冻干燥，制得PNVP-Phe-Lys-b-G1，PNVP-Phe-Lys-b-G1的分子结构如下：
(二)、制备第二代线形-树枝状嵌段共聚物PNVP-Phe-Lys-b-G2
(1)、制备PNVP-Phe-Lys-b-G1-OH
在反应容器中加入PNVP-Phe-Lys-b-G1和甲醇/四氢呋喃(THF)混合溶液，其中每mL甲醇/四氢呋喃(THF)混合溶液中含有0.001～0.004mmol的PNVP-Phe-Lys-b-G1，甲醇/四氢呋喃(THF)混合溶液的甲醇和THF的体积比为1:1～3，加入浓硫酸调节pH至2～4，搅拌反应15～30h，用氨水中和，过滤，旋蒸，在蒸馏水中透析2～5天，冷冻干燥，制得PNVP-Phoce-Lys-b-G1-OH，PNVP-Phe-Lys-b-G1-OH的分子结构如下：
(2)、制备第二代线形-树枝状嵌段共聚物PNVP-Phe-Lys-b-G2
在反应容器中加入PNVP-Phe-Lys-b-G1-OH、异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸酐、DMAP、吡啶/CH2Cl2混合溶液，其中PNVP-Phe-Lys-b-G1-OH、DMAP、异亚丙基-2,2-二(羟甲基)丙酸酐的物质的量比为1:1～4:2～5，吡啶与CH2Cl2体积比为v:v＝1～2:1，每mL吡啶/CH2Cl2混合溶液中含有0.01～0.04mmol的PNVP-Phe-Lys-b-G1-OH，搅拌反应36～60h后，用冷乙醚共沉淀2～6次，在蒸馏水中透析2～5天，冷冻干燥，制得PNVP-Phe-Lys-b-G2，PNVP-Phe-Lys-b-G2的分子结构如下：
(三)、制备第三代和第四代线形-树枝状嵌段共聚物PNVP-Phe-Lys-b-G3和PNVP-Phe-Lys-b-G4
用步骤二(2)得到的PNVP-Phe-Lys-b-G2代替步骤二(1)中的PNVP-Phe-Lys-b-G1，重复步骤二(1)和步骤二(2)，得到PNVP-Phe-Lys-b-G3；再以此步骤中得到的PNVP-Phe-Lys-b-G3代替步骤二(1)中的PNVP-Phe-Lys-b-G1，重复步骤二(1)和步骤二(2)，得到PNVP-Phe-Lys-b-G4，
PNVP-Phe-Lys-b-G3的分子结构如下：
PNVP-Phe-Lys-b-G4的分子结构如下：
3.如权利要求1所述的酶和pH双重响应性共聚物的应用，其特征在于用于制备抗癌药物的靶向释放载体。
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| 酶/pH 双重敏感HPMA-DOX 共聚物的设计合成及抗肿瘤研究;欧园;《陆军军医大学硕士论文》;20190118;第1-49页 * |
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