CN116589610B - 一种两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纳米生物医学技术领域，具体是一种两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物及其制备和应用。两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物结构式如式（1）所示，其中平均聚合度n取值范围是20‑60，本发明反应高效，操作步骤简单易行，所需设备及原料易得。研究表明以两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物制备的纳米胶束具有良好的包载能力，对抗肿瘤药物呈现氧化还原响应性释放行为，是一种应用价值良好的载体。式（1）。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物医学技术领域，具体是一种两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物及其制备方法和在纳米载体中的应用。
背景技术
壳聚糖(Chitosan)是由甲壳素经过脱乙酰化得到的碱性多糖，作为一种可再生、无毒副作用、生物相容性和降解性良好的多糖，具有很多独特的生理、药理功能性质，因此，壳聚糖在自组装纳米给药系统领域有极大地应用潜力。壳聚糖本身具有一定的亲水性，但是缺乏亲脂性结构无法形成核-壳结构的纳米胶束，壳聚糖本身含有可作为化学修饰位点的氨基和羟基基团，可通过高效化学修饰手段引入疏水基团得到两亲性化合物，进而制备成纳米载体。但是目前以低分子量壳聚糖（平均聚合度n取值范围是20-60）为原料制备两亲性化合物的难度较大、效率较低、报道较少。
发明内容
本发明目的是提供一种可作为疏水性化疗药物载体的两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物，两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物结构式如式（1）所示，式（1），其中平均聚合度n取值范围是20-60。
一种两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物的制备方法：
首先在三氟甲磺酸酐的催化下，壳聚糖与叠氮三甲基硅烷反应得到N-叠氮壳聚糖,而后在N,N'-羰基二咪唑的活化下，丙炔胺与硫辛酸反应得到N-炔丙基硫辛酰胺,然后在碘化亚铜和三乙胺的催化下，N-叠氮壳聚糖与N-炔丙基硫辛酰胺反应得到得式（1）所示产物两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物。
所述三氟甲磺酸酐用量是叠氮三甲基硅烷质量的0.5-5.0倍；叠氮三甲基硅烷用量是壳聚糖质量的1.0-6.0倍；N,N'-羰基二咪唑用量是硫辛酸质量的1.0-6.0倍；丙炔胺用量是硫辛酸质量的1.0-6.0倍；碘化亚铜用量是N-叠氮壳聚糖或N-炔丙基硫辛酰胺质量的0.5-5.0倍。
所述N-叠氮壳聚糖的制备：
1）将三氟甲磺酸酐加入到叠氮三甲基硅烷的乙腈溶液中，冰浴下反应2-8 h,反应所得溶液备用；
2）将无水硫酸铜溶液和三乙胺加入到壳聚糖的二甲基亚砜溶液中混匀，然后将上述溶液缓慢滴入，并于氮气氛围中，40-80℃下反应12-48 h，反应结束后，使用旋蒸仪在50-80℃减压旋蒸掉乙腈、三乙胺和水，所得溶液用丙酮沉淀，洗涤冷却干燥后，即得到N-叠氮壳聚糖。
所述N-炔丙基硫辛酰胺的制备：N,N'-羰基二咪唑充分活化硫辛酸的羧基，然后加入丙炔胺，于室温下反应12-36 h,反应结束后，依次用饱和氯化钠和硫酸氢钠洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，即得到N-炔丙基硫辛酰胺。
在碘化亚铜和三乙胺催化下，将N-叠氮壳聚糖溶于过量的二甲基亚砜中与N-炔丙基硫辛酰胺在氮气氛围中，60-90℃下反应12-60 h，反应结束后，乙醇沉淀，洗涤冷却干燥后，即得到式（1）所示的产物两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物。
一种所述的两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物的应用，以所述式（1）所示两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物在制备纳米胶束中的应用。
一种所述的两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物的应用，以所述式（1）所示两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物在制备纳米胶束作为药物载体中的应用。
本发明所具有的优点：
（1）本发明以两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物制备纳米胶束过程简单高效、所需设备及原料易得、成本较低，而且所制备的纳米胶束安全无毒、生物相容性良好，适合应用于生物医药领域。
（2）本发明以两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物制备的纳米胶束具有良好的包载能力。
（3）本发明以两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物制备的纳米胶束具氧化还原响应性，可将疏水性化疗药物被动靶向肿瘤细胞，并在肿瘤细胞内高浓度谷胱甘肽（GSH）环境下解体，可实现化疗药物在肿瘤细胞内的快速释放，提高化疗药物的疗效，是一种应用价值良好的载体。
附图说明
图1为壳聚糖的红外光谱图。
图2为本发明实施例提供的N-叠氮壳聚糖的红外光谱图，2115 cm-1为叠氮的吸收峰，证明N-叠氮壳聚糖的成功合成。
图3为本发明实施例提供的N-炔丙基硫辛酰胺的红外光谱图， 3067 cm-1为硫辛酸不饱和杂环的吸收峰，2935、2850 cm-1为硫辛酸和丙炔胺C-H键伸缩振动吸收峰，1641 cm-1为酰胺键的吸收峰，以上数据证明N-炔丙基硫辛酰胺的成功合成。
图4为本发明实施例提供的两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物红外光谱图，与图2相比可知，2115 cm-1处叠氮的吸收峰几乎消失，2935、2850 cm-1处C-H键伸缩振动吸收峰强度增强，1649 cm-1处酰胺键的吸收峰也增强，证明两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物的成功合成。
图5为以两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物制备载药纳米胶束体外释放实验，* p<0.05表示载药胶束在pH=5.5+10mM GSH条件下阿霉素的累计释放量高于在pH=5.5的条件下阿霉素的累计释放量，且具有统计学差异。
具体实施方式
下面结合符合和实施例对本发明作进一步的解释说明。
本发明通过“Click”反应可将低分子量壳聚糖（平均聚合度n取值范围是20-60）和含二硫键的硫辛酸快速、高效的连接形成具有氧化还原响应的两亲性化合物，其结构同时含有亲水和疏水基团，可自组装成氧化还原响应型纳米胶束；本发明制备的两亲性化合物步骤简单、高效，以所合成的两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物制备的氧化还原响应性胶束具有低毒、良好生物相容性的优点，且对抗肿瘤药物呈现较高的包载能力和氧化还原响应性释放行为，因此是一种应用前景良好的载体。
具体：
首先在三氟甲磺酸酐的催化下，壳聚糖与叠氮三甲基硅烷反应得到壳聚糖叠氮衍生物N-叠氮壳聚糖,而后在N,N'-羰基二咪唑的活化下，丙炔胺与硫辛酸反应得到N-炔丙基硫辛酰胺,然后在碘化亚铜和三乙胺的催化下，N-叠氮壳聚糖与N-炔丙基硫辛酰胺反应得到得式（1）所示产物两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物。
以上所得的两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物制备的纳米胶束是一种应用价值良好的药物载体，所制备的载药纳米胶束可被动靶向肿瘤细胞并在肿瘤细胞内快速释放药物，实现高效释药，提高了化疗药物的临床疗效。
两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物合成路线如下：
其中平均聚合度n取值范围是20-60。
实施例1
本实施例按以上合成路线合成目标化合物两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物。
1）N-叠氮壳聚糖的制备：称取8.16mL (57.60 mmol)叠氮三甲基硅烷溶入到60 mL的乙腈溶液中，而后冰浴下加入8.24 mL (48 mmol)三氟甲磺酸酐，在冰浴下反应2 h，得到溶液A。称取6.44 g (40 mmol)壳聚糖溶于40 mL二甲基亚砜中，并加入64 mg(0.40 mmol)无水硫酸铜溶液(以10 mL水为溶剂)和11.2 mL (80 mmol)三乙胺溶液，搅拌30 min得到溶液B，然后将溶液A缓慢加入到溶液B中，在氮气保护下，60℃条件下搅拌反应12 h。而后60℃减压旋蒸掉乙腈、三乙胺和水，用丙酮沉淀、洗涤，冷冻干燥，得到N-叠氮壳聚糖2.41 g，备用。
2）N-炔丙基硫辛酰胺的制备:称取2.10 g (10 mmol)硫辛酸溶于50 mL二氯甲烷中，而后加入2.10 g (13 mmol)N,N'-羰基二咪唑，于室温下搅拌10 min,然后加入0.85 mL(13 mmol)丙炔胺，于室温下搅拌12 h, 反应结束后,分别用饱和氯化钠和硫酸氢钠洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，即得到N-炔丙基硫辛酰胺2.91 g，备用。
3）两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物的制备：称取1.12 g (6 mmol)N-叠氮壳聚糖溶于20 mL二甲基亚砜中，然后依次加入1.46 g (6 mmol) N-炔丙基硫辛酰胺、0.84 mL (6mmol)三乙胺、0.12 g (6 mmol)碘化亚铜，在氮气保护下，75℃条件下搅拌反应24 h，反应结束后,用乙醇沉淀、洗涤，冷冻干燥，得到两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物1.46 g，备用。
实施例2
1）N-叠氮壳聚糖的制备：称取16.32 mL (115.2 mmol)叠氮三甲基硅烷溶入到60mL的乙腈溶液中，而后冰浴下加入16.48 mL g (96 mmol)三氟甲磺酸酐，在冰浴下反应2h，得到溶液A。称取6.44 g (40 mmol)壳聚糖溶于40 mL二甲基亚砜中，并加入64 mg(0.4mmol)无水硫酸铜溶液(以10 mL水为溶剂)和11.20 mL (80 mmol)三乙胺溶液，搅拌30 min得到溶液B，然后将溶液A缓慢加入到溶液B中，在氮气保护下，70℃条件下搅拌反应12 h。而后60℃减压旋蒸掉乙腈、三乙胺和水，用丙酮沉淀、洗涤，冷冻干燥，得到N-叠氮壳聚糖2.88g，备用。
2）N-炔丙基硫辛酰胺的制备:称取2.10 g (10 mmol)硫辛酸溶于60 mL二氯甲烷中，而后加入4.20 g (26 mmol)N,N'-羰基二咪唑，于室温下搅拌20 min,然后加入1.70 mL(26 mmol)丙炔胺，于室温下搅拌18 h,反应结束后,分别用饱和氯化钠和硫酸氢钠洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，即得到N-炔丙基硫辛酰胺3.52 g，备用。
3）两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物的制备：称取1.12 g (6 mmol)N-叠氮壳聚糖溶于20 mL二甲基亚砜中，然后依次加入2.19 g (9 mmol) N-炔丙基硫辛酰胺、1.26 mL (9mmol)三乙胺、0.18 g (9 mmol)碘化亚铜，在氮气保护下，85℃条件下搅拌反应36 h，反应结束后,用乙醇沉淀、洗涤，冷冻干燥，得到两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物2.28 g，备用。
实施例3
1）N-叠氮壳聚糖的制备：称取24.48 mL (172.80 mmol)叠氮三甲基硅烷溶入到60mL的乙腈溶液中，而后冰浴下加入24.72 mL g (144 mmol)三氟甲磺酸酐，在冰浴下反应2h，得到溶液A。称取6.44 g (40 mmol)壳聚糖溶于40 mL二甲基亚砜中，并加入64 mg(0.4mmol)无水硫酸铜溶液(以10 mL水为溶剂)和11.20 mL (80 mmol)三乙胺溶液，搅拌30 min得到溶液B，然后将溶液A缓慢加入到溶液B中，在氮气保护下，80℃条件下搅拌反应12 h。而后60℃减压旋蒸掉乙腈、三乙胺和水，用丙酮沉淀、洗涤，冷冻干燥，得到N-叠氮壳聚糖3.66g，备用。
2）N-炔丙基硫辛酰胺的制备:称取2.10 g (10 mmol)硫辛酸溶于60 mL二氯甲烷中，而后加入6.30 g (39 mmol)N,N'-羰基二咪唑，于室温下搅拌30 min,然后加入2.55 mL(39 mmol)丙炔胺，于室温下搅拌24 h,反应结束后,分别用饱和氯化钠和硫酸氢钠洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，即得到N-炔丙基硫辛酰胺3.93 g，备用。
3）两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物的制备：称取1.12 g (6 mmol)N-叠氮壳聚糖溶于20 mL二甲基亚砜中，然后依次加入2.92 g (12 mmol) N-炔丙基硫辛酰胺、1.68 mL(12 mmol)三乙胺、0.24 g (12 mmol)碘化亚铜，在氮气保护下，90℃条件下搅拌反应48 h，反应结束后,用乙醇沉淀、洗涤，冷冻干燥，得到两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物3.12 g，备用。
应用例1
以两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物制备纳米胶束
（1）采用透析/超声法制备纳米胶束。称取10 mg实施例1的两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物溶于2 mL二甲基亚砜中，然后边搅拌边加水定容至5 mL,随后将溶液转入透析袋中(Mwco=100)，室温条件下在水中透析12 h(透析3次，每4 h换一次水)，透析完毕，将透析液置于探头超声仪(135 W, 2s开,1s关)超声(30 min),即得到氧化还原响应型纳米胶束。
（2）对两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物制备纳米胶束进行表征
采用动态光散射法（DLS）对上述（1）所得的氧化还原响应型胶束进行表征。分别取1 mL上述（1）制备纳米胶束置于比色皿中，在Litesizer 500纳米粒度测量仪中测量的粒径、电位和PDI值；
实验结果：本发明实施例1合成的两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物制备纳米胶束的表征如表1所示，本发明以两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物制备纳米胶束的粒径分别为135.20±3.66，其粒径小于500 nm可避免血液系统的清除，可更好的被病灶区细胞吞噬进而入胞发挥药效；PDI均小于30，说明所制备的纳米胶束分布均匀；电位均为正值，这与壳聚糖正电荷密切相关。
表1，实施例1所制备纳米胶束的粒径、PDI和电位测试结果
（3）对利用实施例1合成的两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物制备纳米胶束的包封率与载药量的测定。
具体步骤：称取10 mg实施例1的产物溶于二甲基亚砜中，浓度为2 mg/mL，然后将溶液转入透析袋中(Mwco=100)，室温条件下在水中透析12 h，透析完后备用。将67 uL（15mg/mL）阿霉素/二甲基亚砜溶液缓慢滴加至上述化合物水溶液，在135 W功率条件下用探头超声处理30 min,超声结束后，将所得溶液12000rpm离心30 min，取上清液用紫外分光光度法在484 nm处测定吸收度,按以下公式式计算载药纳米胶束的包封率与载药量。
包封率＝(药物总量-游离药)/药物总量×100％
载药量＝(药物总量-游离药)/(载体+药物总量)×100％
表2，实施例1所制备纳米胶束包封率与载药量测定结果
实验结果：本发明实施例1合成的两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物制备纳米胶束的包封能力如表2所示，可见实施例1合成的两亲性化合物制备纳米胶束对化疗药物有较好的包载能力。
（4）对利用实施例1合成的两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物制备的载药纳米胶束体外释药性能的考察。具体步骤：移取适量上述步骤3所制备的载药纳米胶束溶液（约含0.9mg阿霉素）于透析袋（Mwco=8000-12000 Da，同时取等量阿霉素溶于PBS溶液作为对照组，透析袋两端夹紧后，对照组置于150 mL缓冲液（pH = 5.5），载药纳米胶束置于150 mL释放介质中（pH=5.5缓冲液和pH=5.5+10mmolGSH缓冲液），在37℃，100rpm水浴条件下振荡，定时取样3 mL，并补充等体积释放介质。测定各样品在484 nm处的吸收度。
实验结果：本发明实施例1合成的两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物制备的载药纳米胶束体外释药性能如图5所示，游离阿霉素在释放介质中呈现“突释”现象，24 h基本完全释放；与游离阿霉素相比，将阿霉素包载于实施例1制备的纳米胶束中阿霉素释放速率明显减低，呈现“缓释”现象；而载药纳米胶束中的阿霉素在10 mM的GSH条件下释放速率明显提高，这说明实施例1制备的纳米胶束具有“氧化还原响应性”，因而在到达肿瘤组织后能快速的释放阿霉素，以杀死肿瘤细胞。
Claims (5)
1.一种两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物的制备方法，其特征在于：
首先在三氟甲磺酸酐的催化下，壳聚糖与叠氮三甲基硅烷反应得到N-叠氮壳聚糖，具体为：
1）将三氟甲磺酸酐加入到叠氮三甲基硅烷的乙腈溶液中，冰浴下反应2-8 h,反应所得溶液备用；
2）将无水硫酸铜和三乙胺加入到壳聚糖的二甲基亚砜溶液中混匀，然后将步骤1）所得的溶液缓慢滴入，并于氮气氛围中，40-80℃下反应12-48 h，反应结束后，去除溶剂乙腈、三乙胺和水，而后经丙酮沉淀，洗涤冷却干燥后，即得到N-叠氮壳聚糖；
而后在N,N'-羰基二咪唑的活化下，丙炔胺与硫辛酸反应得到N-炔丙基硫辛酰胺, 然后在碘化亚铜和三乙胺的催化下，N-叠氮壳聚糖与N-炔丙基硫辛酰胺反应得到式（1）所示两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物；
所述三氟甲磺酸酐用量是叠氮三甲基硅烷质量的0.5-5.0倍；叠氮三甲基硅烷用量是壳聚糖质量的1.0-6.0倍；N,N'-羰基二咪唑用量是硫辛酸质量的1.0-6.0倍；丙炔胺用量是硫辛酸质量的1.0-6.0倍；碘化亚铜用量是N-叠氮壳聚糖或N-炔丙基硫辛酰胺质量0.5-5.0倍；
式（1）
其中，平均聚合度n取值范围是20-60。
2. 按权利要求1所述的两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物的制备方法，其特征在于：N,N'-羰基二咪唑活化硫辛酸的羧基，然后加入丙炔胺，于室温下反应12-36 h,反应结束后，依次用饱和氯化钠和硫酸氢钠洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，即得到N-炔丙基硫辛酰胺。
3. 按权利要求1所述的两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物的制备方法，其特征在于：在三乙胺和碘化亚铜的催化下，将N-叠氮壳聚糖溶于过量的二甲基亚砜中与N-炔丙基硫辛酰胺在氮气氛围中，60-90℃下反应12-60 h，反应结束后，乙醇沉淀，洗涤冷却干燥后，即得到式（1）所示的产物两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物。
4.一种权利要求1所述方法制备的两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物的应用，其特征在于：以所述式（1）所示两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物在制备纳米胶束中的应用。
5.一种权利要求1所述方法制备的两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物的应用，其特征在于：以所述式（1）所示两亲性壳聚糖硫辛酸接枝衍生物在制备纳米胶束作为药物载体中的应用。
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