CN105380902B - 叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物及其合成方法与应用 - Google Patents

叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物及其合成方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种叶酸修饰的硫酸软骨素‑脱氧胆酸聚合物及其合成方法与应用，本发明以硫酸软骨素为水溶性骨架材料，用脱氧胆酸和叶酸通过己二酸二酰肼作为连接臂对水溶性骨架进行疏水改造制成叶酸介导的具有叶酸受体及CD44(+)受体肿瘤细胞双靶向能力的纳米载体材料。本发明的叶酸修饰的硫酸软骨素‑脱氧胆酸聚合物，具有良好的生物相容性、无免疫原性以及生物可降解性。制备的肿瘤双靶向载药纳米胶束外观圆整且稳定性好，包封率和载药量高，具有优良的缓释性，能增强药物靶向浓集，增强肿瘤杀伤的治疗效果，并降低非特异性毒副作用，具有良好的应有前景。

Description

叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物及其合成方法与 应用
技术领域
本发明涉及一种纳米聚合物自组装胶束材料及其应用，具体涉及一种叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物及其合成方法与应用，属于生物医用材料和纳米药物制剂领域。
背景技术
近年来，肿瘤的发生率和死亡率呈现明显上升趋势，已成为严重威胁人类健康的疾病，具有死亡率高、预后性差的特点。目前，化学疗法仍然是肿瘤治疗的主要方法之一，临床上常用的化疗药物以细胞毒性型药物为主，故药物在通过全身给药方式获得治疗效果的同时对人体正常的脏器也存在着较强的细胞毒性，继而引发严重的毒副作用。因此开发合适的制剂以提高难溶性化疗药物的溶解度，增加其靶向治疗以降低化学疗法带来的潜在危险是目前药物剂型开发和递送领域的研究热点。
聚合物胶束作为药物载体发展于20世纪90年代，是由两亲性的高分子聚合物在水中通过疏水基团的分子内和分子间作用力自发形成的一种具有典型核壳结构的自组装结构。该胶束系统由紧密的疏水内核和亲水性的外壳组成，难溶性药物可以通过疏水作用力包载于内核中。作为低毒、高稳定性的纳米载药系统，聚合物胶束系统可有效地改善难溶性药物的溶解性，延长药物在血液中的循环时间，改变药物的体内分布，提高药物生物利用度，并且具有一定的被动靶向性。这些优点可以有效降低化疗过程中的非特异性不良反应，提高治疗效能，尤为适用于肿瘤的治疗。然而，这些纳米给药系统不能有效地从网状内皮系统逃逸，且在体内很容易被单核巨噬细胞吞噬而清除。另一方面，这种依赖制剂纳米级粒径实现的被动靶向依然无法实现肿瘤部位充分摄取、易引发系统毒副反应甚至多药耐药从而降低疗效的现象。为了完成肿瘤纳米系统的靶向给药，利用体内的特异性分子识别机制，采用靶向纳米载体或在纳米载体表面偶联靶标分子已成为一种较为成熟的靶向策略。
硫酸软骨素是一种硫酸化的线性粘多聚糖，是由糖苷键链接葡糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖构成的二糖单元重复而成。硫酸软骨素广泛分布于动物组织中，主要存在于皮肤、血管、心脏瓣膜和肌腱部分，平均分子量约为2×104道尔顿。具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗凝血等多种生理活性。广泛应用于骨骼相关疾病、脑损伤复合等疾病的治疗。硫酸软骨素具有优良的水溶性，同时骨架中含有大量活泼的可修饰的游离基团，能够通过化学修饰赋予其新的性能。因此对以硫酸软骨素为亲水性基本骨架构架纳米给药系统的研究日益增多。此外，许多肿瘤细胞表面高表达CD44受体，除与透明质酸结合外，相关研究报道CD44也可特异性识别并结合硫酸软骨素。因此，期望以硫酸软骨素为骨架的纳米载体系统用以治疗过表达CD44受体的肿瘤细胞，达到提高药效、靶向治疗的目的。
脱氧胆酸(DOCA)是目前常用的疏水性改性修饰剂，其分子中既含有碳原子侧链末端的羧基及3、12位的羧基这类亲水基，也包含环戊烯菲这种疏水基。因此，期望通过化学手段将疏水性小分子DOCA引入硫酸软骨素骨架中从而构建两亲性聚合物并诱使其在水性介质中发生自组装聚合成为具有疏水内核的核壳结构胶束。
现有技术公开叶酸是一种小分子维生素，分子结构中含有喋呤环，需经内化才能被人体吸收。研究报道叶酸两种内化机制：一是低亲和力的跨膜蛋白，转运四氢叶酸、二氢叶酸进入细胞内；二是高亲和力的叶酸受体，可特异性高效吸收叶酸进入细胞内。叶酸受体是一种糖蛋白膜受体，高度表达于某些实体瘤细胞膜表面，而在正常组织低表达。叶酸受体可特异性识别并结合叶酸或叶酸偶联物，且具有高亲和性、选择性、饱和性和生物效应明显等优点。因此，将叶酸连接到聚合物胶束表面获得靶向癌细胞递送的特性，可以提高药物在病灶部位的浓度，提高疗效，降低毒副反应，达到靶向治疗的目的。
将硫酸软骨素、脱氧胆酸和叶酸相结合构建复合聚合物，并将其用于肿瘤的诊断和治疗具有很大的研究开发前景。但该设计尚未见相关报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物及其合成方法。以硫酸软骨素作为水溶性骨架材料构建聚合物胶束，在硫酸软骨素分子上引入脱氧胆酸进行疏水改性，使其具备在水性溶液中自组装聚集的性能。通过聚合物表面叶酸的修饰，利用叶酸与叶酸受体、硫酸软骨素与CD44特异性结合，实现聚合物胶束对相关受体高表达的肿瘤组织的双靶向特性，实现纳米胶束的肿瘤细胞靶向药物递送。
本发明的另一个目的是提供该聚合物作为生物可降解性材料用于制备抗肿瘤药物肝靶向纳米制剂的应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物，是由硫酸软骨素接枝己二酸二酰肼后，与活化后的脱氧胆酸按质量比为1：0.3-0.8反应，构建得到硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物，经叶酸修饰后制备而成的具有CD44和叶酸受体双靶向的聚合物胶束。
上述枝接己二酸二酰肼后的硫酸软骨素，其中己二酸二酰肼取代度范围为14-18％。
上述硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物中，脱氧胆酸的取代度范围为4％-9％。
该叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物的合成方法，步骤为：
将硫酸软骨素、己二酸二酰肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺按质量比(0.3-0.4)：(5-7)：(1-1.2)：(0.1-0.2)反应，制备得到硫酸软骨素-己二酸二酰肼；然后与活化后的脱氧胆酸按质量比1：(0.3-0.8)反应，制备得到硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物；向硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物中按质量比1：(0.4-0.5)加入活化后的叶酸进行修饰，即得到叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物。
所述脱氧胆酸的活化方法为：将脱氧胆酸溶解于N,N-二甲基甲酰胺，向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温活化，调节pH7-9；脱氧胆酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(1.5-2.5)：(1.5-2.5)。
所述叶酸的活化方法为：将叶酸溶解于二甲亚砜溶液，向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺，调节pH7-9，室温活化2-6小时；叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(1.5-2.5)：(1.5-2.5)。
该叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物的合成方法，具体步骤如下：
(1)硫酸软骨素-己二酸二酰肼的合成：将硫酸软骨素溶解于蒸馏水中，充分溶解后向其中依次加入己二酸二酰肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺，用氢氧化钠调节反应体系pH至6-7，室温搅拌反应20-30小时，得硫酸软骨素-己二酸二酰肼；
(2)脱氧胆酸的活化：将脱氧胆酸溶解于N,N-二甲基甲酰胺，向其中依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺，室温活化30分钟，然后加入3-5滴有机碱调节pH7-9。
(3)硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物的合成：将步骤(1)中所得的硫酸软骨素-己二酸二酰肼溶于蒸馏水中，搅拌使其充分溶胀、溶解，然后加入等倍体积N,N二甲基甲酰胺稀释，备用；将活化的脱氧胆酸溶液在强烈搅拌下滴入上述硫酸软骨素-己二酸二酰肼溶液中，室温搅拌反应40-50小时，得到反应物溶液，反应溶液经纯化、冷冻干燥即得硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物。
(4)叶酸的活化：将叶酸溶解于二甲亚砜溶液，向其中依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺，加适量三乙胺调节pH7-9，室温活化2-6小时，使叶酸充分溶解。
(5)叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物的合成：将步骤(3)中所得的硫酸软骨素-脱氧胆酸溶于蒸馏水中，搅拌使其充分溶胀、溶解，然后加入二倍体积二甲亚砜稀释，备用；将活化的叶酸溶液在强烈搅拌下滴入上述硫酸软骨素-脱氧胆酸溶液中，室温搅拌反应40-50小时，得到反应物溶液，反应溶液经纯化、冷冻干燥即得叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物。
步骤(1)中，所述硫酸软骨素、蒸馏水、己二酸二酰肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(0.3-0.4)：100：(5-7)：(1-1.2)：(0.1-0.2)。硫酸软骨素的分子量为10kD。硫酸软骨素-己二酸二酰肼的己二酸二酰肼取代度为14-18％(优选为16％)。
本发明将硫酸软骨素接枝己二酸二酰肼之后，引入末端氨基，该氨基与脱氧胆酸的羧基发生酰胺反应，由此构建硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物，这种合成方法可以提高反应活性，获得较为理想的脱氧胆酸取代度。
步骤(2)中，脱氧胆酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、有机碱的摩尔比为1：(1.5-2.5)：(1.5-2.5)：(1.5-2.5)，优选为1：2：2：2；N,N二甲基甲酰胺的用量为每克脱氧胆酸加25-30毫升。所述有机碱为三乙胺、N，N-二异丙基乙胺或N,N,N',N'-四甲基乙二胺。
步骤(3)中，硫酸软骨素-己二酸二酰肼与脱氧胆酸的质量比为1：0.3-0.8。每克硫酸软骨素-己二酸二酰肼溶于100ml蒸馏水。脱氧胆酸的取代度范围为4％-9％(根据所需要的自组装体系的理化性质调整所需要的取代度)。
步骤(4)中，叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、的摩尔比为1：(1.5-2.5)：(1.5-2.5)，优选为1：2：2；二甲亚砜的用量为每克叶酸加50-100毫升。
步骤(5)中，硫酸软骨素-脱氧胆酸与叶酸的质量比为1：0.4-0.5。每克硫酸软骨素-己二酸二酰肼-脱氧胆酸溶于100ml蒸馏水。叶酸的取代度范围为5-7％(根据所需要的自组装体系的理化性质调整所需要的取代度)。
该叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物作为难溶性抗肿瘤药物的载体材料在受体介导的肿瘤靶向载药纳米自组装胶束制剂制备中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种以叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物作为载体的抗肿瘤药物的纳米胶束制剂，该纳米胶束制剂的制备方法为：
将叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物，超声分散于PBS缓冲液中(pH＝7.4)；将抗肿瘤药物，或：抗肿瘤药物和抗肿瘤药物增敏剂溶解于有机溶剂中，在强烈搅拌情况下缓慢滴加至上述叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物溶液中，室温搅拌过夜，然后用探头式超声处理，超声完毕后将溶液转移至透析袋中对水透析，然后将所得溶液离心，以除去未包封的药物，离心获得的上清液过0.8μm滤膜，即得抗肿瘤药物的纳米胶束制剂。
优选的，该纳米胶束制剂的制备方法为：
称取50mg叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物，超声分散于PBS缓冲液中(pH＝7.4)中备用；另将5～20mg抗肿瘤药物，或抗肿瘤药物和抗肿瘤药物增敏剂溶解于1-2mL有机溶剂中使药物溶解完全，在强烈搅拌情况下缓慢滴加至上述叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物水溶液中，室温搅拌过夜(8-12h)后，用探头式超声在120W功率条件下处理三次，每次2min，脉冲开2s停4s，温度4℃～8℃，然后将溶液转移至透析袋中对水透析24小时，然后将所得溶液4000r/min离心20min，以除去未包封的药物。上清液接着过0.8μm滤膜，即得抗肿瘤药物聚合物纳米胶束制剂，4℃保存或冷冻干燥获得载药纳米胶束的冻干粉。
所述难溶性抗肿瘤药物为紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素等；所述抗肿瘤药物增敏剂为姜黄素、槲皮素等。
所述有机溶剂为甲醇、四氢呋喃、N,N二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。
本发明的有益效果：
本发明的叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物，采用水溶性的硫酸软骨素作为基本骨架，对其进行疏水性修饰，得到的两亲性聚合物可以在水性介质中进行自组装过程形成纳米胶束，具有以下优点：
1.本发明制备的叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物作为载体材料，具有优良的生物相容性、可降解性和无免疫原性，而且原料廉价易得，制备工艺简单易行，条件温和，是一种优良抗癌药物靶向纳米载体。
2.本发明制备的载药纳米胶束粒径较小，形态圆整且呈现均匀的球形，具有较高的包封率和载药量，稳定性好。
3.本发明制备的纳米胶束在自组装构建过程中，作为亲水基团的硫酸软骨素在形成稳定亲水骨架及外壳的同时，赋予载体材料潜在的CD44高表达肿瘤靶向特性，设计思路合理、操作易行。
4.本发明制备的硫酸软骨素-脱氧胆酸纳米胶束表面由叶酸修饰，赋予载体材料叶酸受体高表达的肿瘤细胞的靶向特性，设计思路合理、操作易行。此外，可联合亲水骨架硫酸软骨素的潜在靶向特性，实现双靶向目标，能够实现更好的药物靶向递送及更低的毒副作用。
5.本发明制备的载药纳米胶束克服了难溶性药物水溶性差的缺陷，大大改善了难溶性抗肿瘤药物的溶解度，为其靶向治疗提供了一个理想新型载体。
6.本发明制备的载药纳米胶束制剂同时将难溶性的抗肿瘤药物及其增敏剂包载于胶束制剂中，能够有效控制多药耐药的产生，降低给药剂量，提供药物治疗效果。
综上，本发明以硫酸软骨素为水溶性骨架材料，用脱氧胆酸和叶酸通过己二酸二酰肼作为连接臂对水溶性骨架进行疏水改造，制成叶酸介导的具有叶酸受体及CD44(+)受体肿瘤细胞双靶向能力的纳米载体材料。本发明的叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物，具有良好的生物相容性、无免疫原性以及生物可降解性。制备的肿瘤双靶向载药纳米胶束外观圆整且稳定性好，包封率和载药量高，具有优良的缓释性，能增强药物靶向浓集，增强肿瘤杀伤的治疗效果，并降低非特异性毒副作用，具有良好的应有前景。
附图说明
图1：硫酸软骨素(CS)，载体材料硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物(CS-DOCA)和载体材料叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物(FA-CS-DOCA)的核磁共振氢谱；
图2：载多西紫杉醇的叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸纳米胶束的粒径分布图；
图3：载多西紫杉醇的叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸米胶束的电镜照片；
图4：载多西紫杉醇的叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸纳米胶束的Zeta电位图。
图5：载多西紫杉醇的叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸纳米粒胶束的体外释放图。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物的合成
(1)硫酸软骨素-己二酸二酰肼的合成：称取0.5g硫酸软骨素溶解于150mL蒸馏水中，搅拌使其充分溶胀、溶解，然后依次向该溶液中加入5.0g己二酸二酰肼，1.6g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.23g N-羟基琥珀酰亚胺，用氢氧化钠调节反应体系pH值为6.8，室温反应24小时，用蒸馏水透析三天，冷冻干燥得到中间产物硫酸软骨素-己二酸二酰肼。
(2)称取80mg脱氧胆酸溶解于5mL N,N-二甲基甲酰胺，向其中依次加入相当于脱氧胆酸2倍摩尔量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、相当于脱氧胆酸2倍摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌30分钟，然后加入相当于脱氧胆酸2倍摩尔量的生物碱，以活化脱氧胆酸。
(3)硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物的合成：称取100mg步骤(1)中所得的硫酸软骨素-己二酸二酰肼溶于10mL蒸馏水中，搅拌使其充分溶胀、溶解，然后加入等倍体积的N,N二甲基甲酰胺稀释，备用。将步骤(3)中所得脱氧胆酸活性酯溶液在强烈搅拌下滴入上述硫酸软骨素-己二酸二酰肼溶液中，室温搅拌反应48小时，得到反应物溶液。反应溶液对甲醇与水的混合溶液(体积比4：1)中透析三天，以除去其中的游离脱氧胆酸及副产物，然后对蒸馏水透析三天除去有机溶剂。冷冻干燥即得硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物。1H NMR定量分析得到脱氧胆酸的取代度为7.9％。
硫酸软骨素(CS)与所得的硫酸软骨素-己二酸二酰肼(CS-ADH)以及硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物(CS-DOCA)的1H NMR结构谱图见图1，相对于CS，在CS-ADH核磁氢谱中，位于1.0-1.6ppm，2.1-2.5ppm的新的特征峰归属于己二酸二酰肼枝接链的质子峰，这也证实了己二酸二酰肼已经成功偶联到了CS骨架上。而对于CS-DOCA，化学位移在0.5-1.22ppm，出现的新质子峰归属为脱氧胆酸残基18、19及21位角甲基的特征质子峰。上述结果证明脱氧胆酸成功的通过己二酸二酰肼偶联在了硫酸软骨素上。
实施例2：叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物的合成
(1)硫酸软骨素-己二酸二酰肼的合成：称取0.5g硫酸软骨素溶解于150mL蒸馏水中，搅拌使其充分溶胀、溶解，然后依次向该溶液中加入5.0g己二酸二酰肼，1.6g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.23g N-羟基琥珀酰亚胺，用氢氧化钠调节反应体系pH值为6.8，室温反应24小时，用蒸馏水透析三天，冷冻干燥得到中间产物硫酸软骨素-己二酸二酰肼。
(2)称取80mg脱氧胆酸溶解于5mL N,N-二甲基甲酰胺，向其中依次加入相当于脱氧胆酸2倍摩尔量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、相当于脱氧胆酸2倍摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌30分钟，然后加入相当于脱氧胆酸2倍摩尔量的生物碱，以活化脱氧胆酸。
(3)硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物的合成：称取100mg步骤(1)中所得的硫酸软骨素-己二酸二酰肼溶于10mL蒸馏水中，搅拌使其充分溶胀、溶解，然后加入二倍体积的N,N二甲基甲酰胺稀释，备用。将步骤(3)中所得脱氧胆酸活性酯溶液在强烈搅拌下滴入上述硫酸软骨素-己二酸二酰肼溶液中，室温搅拌反应48小时，得到反应物溶液。反应溶液对甲醇与水的混合溶液(体积比4：1)中透析三天，以除去其中的游离脱氧胆酸及副产物，然后对蒸馏水透析三天除去有机溶剂。冷冻干燥即得硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物。1H NMR定量分析得到脱氧胆酸的取代度为7.9％。
(4)称取22mg的叶酸溶解于2mL二甲亚砜溶液，搅拌使溶解完全，向其中依次加入相当于叶酸2倍摩尔量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、相当于叶酸2倍摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺，加适量三乙胺调节pH7-9，避光条件室温搅拌2-6小时，以活化叶酸。
(5)叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物的合成：称取步骤(3)中所得的硫酸软骨素-脱氧胆酸100mg溶于10mL蒸馏水中，搅拌使其充分溶胀、溶解，然后加入等倍体积二甲亚砜稀释，备用；将步骤(4)活化的叶酸溶液在强烈搅拌下滴入上述硫酸软骨素-脱氧胆酸溶液中，室温搅拌反应48小时，得到反应物溶液，反应溶液对甲醇与水的混合溶液(体积比4：1)中透析三天，以除去其中的游离叶酸及副产物，然后对蒸馏水透析三天除去有机溶剂。冷冻干燥即得叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物。紫外法测得叶酸的取代度为5.4％。
叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物(FA-CS-DOCA)的1H NMR结构谱图见图1，在核磁氢谱中，位于6.7,7.6ppm的新的特征峰归属于叶酸分子H13/15和H12/16位的质子峰，位于8.7ppm的峰归属于叶酸分子喋呤环7位质子。这也证实了叶酸已经成功偶联到了CS-DOCA骨架上。此外，实施例1中脱氧胆酸的特征吸收峰也出现于氢谱中。上述结果证明叶酸及脱氧胆酸成功的偶联在了硫酸软骨素上。
实施例3：载多西紫杉醇的叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物纳米胶束制备
将50mg叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸(实施例2制备)，超声分散于10mL去离子水中，备用；另称取15mg多西紫杉醇溶解于2mL甲醇中，在强烈搅拌情况下缓慢滴加至上述叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物水溶液中，室温继续强烈搅拌过夜后(8-12)后，用探头式超声在120W功率条件下处理三次，每次2min，脉冲开2s停4s，温度保持在4℃～8℃，然后将溶液转移至透析袋中对水透析24小时，然后将所得溶液4000r/min离心20min，以除去未包封的药物。上清液接着过0.8μm滤膜，即得载多西紫杉醇的纳米胶束制剂，冻干获得载紫杉醇纳米胶束的冻干粉。高效液相色谱法检测结果显示其载药量为9.1％，包封率为33.3％。
将制备的载多西紫杉醇的纳米胶束溶液稀释适当倍数后，以Malvern ZetasizerNano-ZS型激光电位粒度仪测定胶束的粒径和Zeta电位，所测得胶束粒子平均粒径为93.4nm，多分散系数PDI为0.30，Zeta电位值为-23.2mV，图2为载多西紫杉醇的叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸纳米胶束的粒径分布图。以H-7000型透射电子显微镜观察胶束表面形态，如图3所示，所制备的载药胶束形态圆整，大小均一，黏连较小。图4为该载药纳米胶束的Zeta电位图。
实施例4：联合载多西紫杉醇、姜黄素的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物纳米胶束制备
将50mg叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸(实施例2制备)，超声分散于10mL去离子水中，备用；另称取15mg多西紫杉醇和10mg姜黄素溶解于5mL四氢呋喃中，在强烈搅拌情况下缓慢滴加至上述叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物水溶液中，室温继续强烈搅拌过夜后(8-12)后，用探头式超声在120W功率条件下处理三次，每次2min，脉冲开2s停4s，温度保持在4℃～8℃，然后将溶液转移至透析袋中对水透析24小时，然后将所得溶液4000r/min离心20min，以除去未包封的药物。上清液接着过0.8μm滤膜，即得载多西紫杉醇的纳米胶束制剂，冻干获得载紫杉醇纳米胶束的冻干粉。高效液相色谱法检测结果显示多西紫杉醇的载药量为11.5％，包封率为46.7％，姜黄素的载药量和包封率分别为6.5％和40.0％。
实施例5：载多西紫杉醇的叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸纳米粒胶束的体外释放试验
采用反向动态透析法测定药物的释放度：取1ml纳米胶束(实施例3制备)溶液，装在截留分子量为3500道尔顿的透析袋中，以含0.5％Tween 80的PH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)40ml为释放介质，搅拌速度为100r/min，温度为37±0.5℃，在预定的时间取1ml透析介质并加入等量新鲜的释放介质。取样后进样20μl进行HPLC测定，计算累积释放百分率，如图5所示。结果显示，相比于多西紫杉醇原料药，载多西紫杉醇的叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸纳米粒胶束具有良好的长效缓释特性。

Claims (5)

1.一种叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物，其特征在于，是由硫酸软骨素接枝己二酸二酰肼后，与活化后的脱氧胆酸按质量比为 1 ：0.3-0.8 反应，构建得到硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物，经叶酸修饰后制备而成的具有 CD44 和叶酸受体双靶向的聚合物胶束；
枝接己二酸二酰肼后的硫酸软骨素，其中己二酸二酰肼取代度范围为 14-18％；
所述硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物中，脱氧胆酸的取代度范围为4％-9％；
叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物的合成方法，步骤为：
将硫酸软骨素、己二酸二酰肼、1-(3-二甲氨基丙基 )-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺按质量比 (0.3-0.4) ：(5-7) ：(1-1.2) ：(0.1-0.2) 反应，制备得到硫酸软骨素-己二酸二酰肼；然后与活化后的脱氧胆酸按质量比1：(0.3-0.8) 反应，制备得到硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物；向硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物中按质量比1 ：(0.4-0.5) 加入活化后的叶酸进行修饰，即得到叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物；
所述脱氧胆酸的活化方法为：将脱氧胆酸溶解于N,N-二甲基甲酰胺，向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温活化，调节pH7-9；脱氧胆酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N- 羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(1.5-2.5)：(1.5-2.5)；
所述叶酸的活化方法为：将叶酸溶解于二甲亚砜溶液，向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺，调节pH7-9，室温活化2-6 小时；叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(1.5-2.5) ：(1.5-2.5)；
具体的，硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物的合成方法为：将硫酸软骨素-己二酸二酰肼溶于蒸馏水中，搅拌使其充分溶胀、溶解，然后加入等倍体积 N,N二甲基甲酰胺稀释，备用；将活化的脱氧胆酸溶液在强烈搅拌下滴入上述硫酸软骨素-己二酸二酰肼溶液中，室温搅拌反应 40-50 小时，得到反应物溶液，反应溶液经纯化、冷冻干燥即得硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物。
2.如权利要求1所述的叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物作为难溶性抗肿瘤药物的载体材料在受体介导的肿瘤靶向载药纳米自组装胶束制剂制备中的应用。
3.一种抗肿瘤药物的纳米胶束制剂，其特征在于，该纳米胶束制剂是通过以下制备方法得到的：
将权利要求1所述的叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物，超声分散于 PBS缓冲液中；将抗肿瘤药物，或：抗肿瘤药物和抗肿瘤药物增敏剂溶解于有机溶剂中，缓慢滴加至上述叶酸修饰的硫酸软骨素-脱氧胆酸聚合物溶液中，搅拌过夜，超声处理，超声完毕后将溶液转移至透析袋中对水透析，然后将所得溶液离心，以除去未包封的药物，离心获得的上清液，滤膜过滤，即得抗肿瘤药物的纳米胶束制剂。
4.如权利要求 3 所述的纳米胶束制剂，其特征在于，所述抗肿瘤药物为紫杉醇、多西紫杉醇或阿霉素；所述抗肿瘤药物增敏剂为姜黄素或槲皮素。
5.如权利要求 3所述的纳米胶束制剂，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇、四氢呋喃、N,N 二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。
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