JP2001525470A - タンパク修飾のためのヘテロ官能化星形ポリ（エチレングリコール） - Google Patents
タンパク修飾のためのヘテロ官能化星形ポリ（エチレングリコール）Info
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Abstract
(57)【要約】
生体適合性のヘテロ官能化星形ポリ（エチレングリコール）が記載されている。そのヘテロ官能化星形ポリ（エチレングリコール）を作る方法及びそれをタンパク質と複合化させるために用いる方法も記載されている。
Description
【０００１】
本発明は、ヘテロ官能化星形ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、それを
作る方法、及び使用する方法に関する。より具体的には、本発明は、タンパク質
又は他の分子との反応を可能にするアミン、カルボキシル、アルデヒド、チオー
ル、ハロゲン、又はエポキシド基をその末端に有する星形ＰＥＧに関する。
作る方法、及び使用する方法に関する。より具体的には、本発明は、タンパク質
又は他の分子との反応を可能にするアミン、カルボキシル、アルデヒド、チオー
ル、ハロゲン、又はエポキシド基をその末端に有する星形ＰＥＧに関する。
【０００２】 最近、組換えＤＮＡ技術が開発されてペプチドやタンパク質を作ることが対応
して容易になってきたため、薬物としてのペプチド及びタンパク質に多くの注目
が寄せられている。サイトカイン及び生物学的応答調節剤、血栓崩壊剤、接着分
子、及び、成長因子のアゴニスト及びアンタゴニスト性ペプチドフラグメントは
、全て広く普及している用途を有している。しかし、薬学的観点からみると、こ
れらの薬物は、短い半減期、タンパク質分解消化に対する低い安定性、及び弱い
アレルギー反応からアナフィラキシーショックにわたる免疫学的副作用のような
いくつかの制限を有している。ポリマーによるタンパク質薬物の化学修飾は、こ
れらの制限を減らす今日の戦略の一つである。ポリ（エチレングリコール）は、
その非毒性、非免疫原性、及び両親媒性のため化学修飾剤として最も広く使用さ
れている。ＰＥＧは体内への使用がＦＤＡによって認可されている。アスパラギ
ナーゼ、グルタミナーゼ、ウリカーゼ、スパーオキシドジスムターゼ、ラクトフ
ェリン、ストレプトキナーゼ、プラスミン−ストレプトキナーゼ複合体、アデノ
シンデアミナーゼ、インターロイキン−２（N. V. Katreら，84 Proc. Nat'l Ac
ad. Sci. USA 1487（1987））；カタラーゼ、アルギナーゼ、インスリン、β− グルクロニダーゼ、トリプシン、キモトリプシン（J. Kopecekら，4 Bioconjuga
te Chem. 290（1993））；ヘモグロビン、組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（
ｒｈＧ−ＣＳＦ）、及び組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）（R. Clarkら，27
1 J. Biol. Chem. 21969-21977（1996））を含む４０を超えるタンパク質が現在
ＰＥＧで修飾されている。目下のところ、モノメトキシＰＥＧで修飾されたアス
パラギナーゼは、フリーの酵素に対する免疫反応を有する患者への使用がＦＤＡ
によって認可されている。
して容易になってきたため、薬物としてのペプチド及びタンパク質に多くの注目
が寄せられている。サイトカイン及び生物学的応答調節剤、血栓崩壊剤、接着分
子、及び、成長因子のアゴニスト及びアンタゴニスト性ペプチドフラグメントは
、全て広く普及している用途を有している。しかし、薬学的観点からみると、こ
れらの薬物は、短い半減期、タンパク質分解消化に対する低い安定性、及び弱い
アレルギー反応からアナフィラキシーショックにわたる免疫学的副作用のような
いくつかの制限を有している。ポリマーによるタンパク質薬物の化学修飾は、こ
れらの制限を減らす今日の戦略の一つである。ポリ（エチレングリコール）は、
その非毒性、非免疫原性、及び両親媒性のため化学修飾剤として最も広く使用さ
れている。ＰＥＧは体内への使用がＦＤＡによって認可されている。アスパラギ
ナーゼ、グルタミナーゼ、ウリカーゼ、スパーオキシドジスムターゼ、ラクトフ
ェリン、ストレプトキナーゼ、プラスミン−ストレプトキナーゼ複合体、アデノ
シンデアミナーゼ、インターロイキン−２（N. V. Katreら，84 Proc. Nat'l Ac
ad. Sci. USA 1487（1987））；カタラーゼ、アルギナーゼ、インスリン、β− グルクロニダーゼ、トリプシン、キモトリプシン（J. Kopecekら，4 Bioconjuga
te Chem. 290（1993））；ヘモグロビン、組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（
ｒｈＧ−ＣＳＦ）、及び組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）（R. Clarkら，27
1 J. Biol. Chem. 21969-21977（1996））を含む４０を超えるタンパク質が現在
ＰＥＧで修飾されている。目下のところ、モノメトキシＰＥＧで修飾されたアス
パラギナーゼは、フリーの酵素に対する免疫反応を有する患者への使用がＦＤＡ
によって認可されている。
【０００３】 ＰＥＧによる化学修飾により、高い生物学的半減期、低い抗原性、及びタンパ
ク質分解に対する高い耐性がほとんど常に達成されることはよく知られている。
高い半減期はＰＥＧ修飾の最も顕著な効果であり、タンパク質の大きいサイズ；
糖鎖のそれらの特異的受容体との相互作用への干渉；それについての細胞性受容
体が存在するマスク性特異的配列；及び、低いタンパク質分解及び抗原性のよう
ないくつかの機構によって説明される。半減期の延長は、一般に一分子当たりに
付着したＰＥＧ分子の数に比例する。しかし、一般に、タンパク質の特異的活性
は修飾の度合いが増加するにつれて一般に減少する。ＰＥＧ修飾による免疫原性
の減少は、生命をおびやかすアレルギー反応の発生が避けられ得ることから臨床
上有意である。その機構は、免疫学的に不活性であることが知られているＰＥＧ
による抗原決定基の遮蔽を介するものであり得る。ＰＥＧ修飾は、そのうえプロ
テアーゼ及び阻害剤による攻撃からタンパク質を保護する。薬物動力学的及び免
疫学的改善に加えて、水及び有機溶媒の両方における溶解性、及び、熱機械的安
定性がＰＥＧ修飾の結果として増加することが報告されてきている。
ク質分解に対する高い耐性がほとんど常に達成されることはよく知られている。
高い半減期はＰＥＧ修飾の最も顕著な効果であり、タンパク質の大きいサイズ；
糖鎖のそれらの特異的受容体との相互作用への干渉；それについての細胞性受容
体が存在するマスク性特異的配列；及び、低いタンパク質分解及び抗原性のよう
ないくつかの機構によって説明される。半減期の延長は、一般に一分子当たりに
付着したＰＥＧ分子の数に比例する。しかし、一般に、タンパク質の特異的活性
は修飾の度合いが増加するにつれて一般に減少する。ＰＥＧ修飾による免疫原性
の減少は、生命をおびやかすアレルギー反応の発生が避けられ得ることから臨床
上有意である。その機構は、免疫学的に不活性であることが知られているＰＥＧ
による抗原決定基の遮蔽を介するものであり得る。ＰＥＧ修飾は、そのうえプロ
テアーゼ及び阻害剤による攻撃からタンパク質を保護する。薬物動力学的及び免
疫学的改善に加えて、水及び有機溶媒の両方における溶解性、及び、熱機械的安
定性がＰＥＧ修飾の結果として増加することが報告されてきている。
【０００４】 しかし、ＰＥＧ修飾タンパク質の大多数は、生物活性のかなりの減少を示しか
つ変性をうけ、それが化学修飾による不活性化をもたらす。それゆえ、タンパク
質をＰＥＧにより化学的に修飾する場合、修飾効果を最大にし、かつタンパク質
不活性化を最小にするため、その反応条件並びにそのＰＥＧ分子の立体配置を慎
重に選ばなければならない。ＰＥＧ修飾の確立した利点のため、反応条件及びＰ
ＥＧの分子量に関するカップリング技術が研究され、文献に報告されている。J.
M. Harris，Poly (ethylene glycol) Chemistry：Biotechnical Biomedical Ap
plications (1992)；Y. Inadaら，242 Meth. Enzymology 65-90 (1994)；17 Bio
technol. Appl. Biochem. 115-130 (1993)；K. Yoshingaら，4 Bioactive Bioco
mpatible Polymer 17-24 (1989)。しかし、現在までの大抵の研究は直鎖状のＰ ＥＧを用いる修飾に限定されている。より最近では、新しいタイプのＰＥＧがタ
ンパク質修飾のために探求されている。モノメトキシ直鎖状ＰＥＧをブロモ酢酸
、プロトカテク酸（protocatechnic acid）、及び没食子酸とそれぞれ反応させ ることにより、各々が分子中に１のみのカルボキシル基を有する１、２、及び３
分枝のＰＥＧ誘導体が得られている。I. Fuckら，30 J. Controlled Release 27
-34（1994）。分枝状ＰＥＧで修飾されたトリプシンは、枝の数に直接対応する 保護の度合いでペプシン消化から大きく保護されることが発見された。２分枝の
ＰＥＧで修飾されたアスパラギナーゼが、モノメトキシＰＥＧ５０００のトリク
ロロトリアジンの２つの塩素との反応により得られた。分枝状ＰＥＧによるアス
パラギナーゼの修飾は、in vivo活性、タンパク質分解耐性、安定性、及び半減 期の増加をもたらすことが示されてきている。しかし、これらの分枝状ＰＥＧは
、高い収率及び純度で分枝状ＰＥＧを得るには扱いにくくかつ難しい直鎖状ＰＥ
Ｇと多官能性コア化合物を用いるカップリング反応により調製されている。加え
て、そのようなカップリング方法は、より高いアーム数を有する分枝状ＰＥＧを
産しない。別の不都合は、そのカップリング方法から得られる分枝状ＰＥＧが反
応性官能基をそのＰＥＧ分子内に有し、これが、その分枝状ＰＥＧとタンパク質
の間の複合化を望まれるであろうより低効率にすることである。櫛形ポリエチレ
ンオキシド（ＰＥＯ）も調製され、そして免疫原性を減少させるためウシ血清ア
ルブミン及びアスパラギナーゼと複合化された。H. Sasakiら，197 Biochem. Bi
ophys. Res. Chem. 287-291 (1993)；Y. Koderaら，5 Bioconjugate Chem. 283-
286 (1994)。
つ変性をうけ、それが化学修飾による不活性化をもたらす。それゆえ、タンパク
質をＰＥＧにより化学的に修飾する場合、修飾効果を最大にし、かつタンパク質
不活性化を最小にするため、その反応条件並びにそのＰＥＧ分子の立体配置を慎
重に選ばなければならない。ＰＥＧ修飾の確立した利点のため、反応条件及びＰ
ＥＧの分子量に関するカップリング技術が研究され、文献に報告されている。J.
M. Harris，Poly (ethylene glycol) Chemistry：Biotechnical Biomedical Ap
plications (1992)；Y. Inadaら，242 Meth. Enzymology 65-90 (1994)；17 Bio
technol. Appl. Biochem. 115-130 (1993)；K. Yoshingaら，4 Bioactive Bioco
mpatible Polymer 17-24 (1989)。しかし、現在までの大抵の研究は直鎖状のＰ ＥＧを用いる修飾に限定されている。より最近では、新しいタイプのＰＥＧがタ
ンパク質修飾のために探求されている。モノメトキシ直鎖状ＰＥＧをブロモ酢酸
、プロトカテク酸（protocatechnic acid）、及び没食子酸とそれぞれ反応させ ることにより、各々が分子中に１のみのカルボキシル基を有する１、２、及び３
分枝のＰＥＧ誘導体が得られている。I. Fuckら，30 J. Controlled Release 27
-34（1994）。分枝状ＰＥＧで修飾されたトリプシンは、枝の数に直接対応する 保護の度合いでペプシン消化から大きく保護されることが発見された。２分枝の
ＰＥＧで修飾されたアスパラギナーゼが、モノメトキシＰＥＧ５０００のトリク
ロロトリアジンの２つの塩素との反応により得られた。分枝状ＰＥＧによるアス
パラギナーゼの修飾は、in vivo活性、タンパク質分解耐性、安定性、及び半減 期の増加をもたらすことが示されてきている。しかし、これらの分枝状ＰＥＧは
、高い収率及び純度で分枝状ＰＥＧを得るには扱いにくくかつ難しい直鎖状ＰＥ
Ｇと多官能性コア化合物を用いるカップリング反応により調製されている。加え
て、そのようなカップリング方法は、より高いアーム数を有する分枝状ＰＥＧを
産しない。別の不都合は、そのカップリング方法から得られる分枝状ＰＥＧが反
応性官能基をそのＰＥＧ分子内に有し、これが、その分枝状ＰＥＧとタンパク質
の間の複合化を望まれるであろうより低効率にすることである。櫛形ポリエチレ
ンオキシド（ＰＥＯ）も調製され、そして免疫原性を減少させるためウシ血清ア
ルブミン及びアスパラギナーゼと複合化された。H. Sasakiら，197 Biochem. Bi
ophys. Res. Chem. 287-291 (1993)；Y. Koderaら，5 Bioconjugate Chem. 283-
286 (1994)。
【０００５】 本発明は星形ＰＥＧを作る方法に関する。星形ポリマーは、最も簡単な分枝状
の形態を構成する各々の鎖の一端で一緒につながれた数本の直鎖を含む。星形ポ
リマーを得るための２種の明確な合成アプローチ、すなわち発散アプローチと収
束アプローチが存在する。“アームファースト（arm-first）法”と呼ばれる収 束アプローチは、成長するポリマー鎖を多官能性停止剤で停止させて星形ポリマ
ーを形成することを包含する。新しく開発された技術である、アニオン性リビン
グ重合と組合わされた収束法は、制御されたアームの長さ、狭い分子量分布、及
び容易に変動できるアーム数の星形ポリマーをもたらすことが知られている。こ
のタイプのポリマーを合成するための最も常用的な方法は、均一に有機リチウム
重合をさせてから、そのリチウム鎖末端と、クロロシラン、フタル酸エステル、
及びｍ−及びｐ−ジビニルベンゼンのような連結剤との間で連結反応させること
を包含する。この方法の主要な欠点は、星形分子の諸枝をそれらの外側の末端に
おいて官能基で修飾することができないことである。
の形態を構成する各々の鎖の一端で一緒につながれた数本の直鎖を含む。星形ポ
リマーを得るための２種の明確な合成アプローチ、すなわち発散アプローチと収
束アプローチが存在する。“アームファースト（arm-first）法”と呼ばれる収 束アプローチは、成長するポリマー鎖を多官能性停止剤で停止させて星形ポリマ
ーを形成することを包含する。新しく開発された技術である、アニオン性リビン
グ重合と組合わされた収束法は、制御されたアームの長さ、狭い分子量分布、及
び容易に変動できるアーム数の星形ポリマーをもたらすことが知られている。こ
のタイプのポリマーを合成するための最も常用的な方法は、均一に有機リチウム
重合をさせてから、そのリチウム鎖末端と、クロロシラン、フタル酸エステル、
及びｍ−及びｐ−ジビニルベンゼンのような連結剤との間で連結反応させること
を包含する。この方法の主要な欠点は、星形分子の諸枝をそれらの外側の末端に
おいて官能基で修飾することができないことである。
【０００６】 “コアファースト（core-first）法”とも呼ばれる発散アプローチは、多官能
性開始剤からその合成反応を開始し、そして外側に向かって進行する。この技術
は、諸枝をそれらの外側の末端において官能基で修飾することを可能とし、従っ
てブロックコポリマーを形成する更なる反応の可能性又は選択吸着の可能性を提
供する。この方法に関連する問題は、極性溶媒においてでさえ多価有機金属開始
剤の溶解性が乏しいことである。その簡単さのため、発散法は多様な星形ホモポ
リマー及びコポリマーに広く適用されてきた。しかし、ポリマーをヘテロ官能化
にできないことが欠点である。多ホモ官能性星形ＰＥＧをタンパク質にカップリ
ングさせる場合、一般にタンパク質がいくつかのアクセス可能なアミノ基を有す
ることから、架橋反応のためにゲル化が起こり得る。
性開始剤からその合成反応を開始し、そして外側に向かって進行する。この技術
は、諸枝をそれらの外側の末端において官能基で修飾することを可能とし、従っ
てブロックコポリマーを形成する更なる反応の可能性又は選択吸着の可能性を提
供する。この方法に関連する問題は、極性溶媒においてでさえ多価有機金属開始
剤の溶解性が乏しいことである。その簡単さのため、発散法は多様な星形ホモポ
リマー及びコポリマーに広く適用されてきた。しかし、ポリマーをヘテロ官能化
にできないことが欠点である。多ホモ官能性星形ＰＥＧをタンパク質にカップリ
ングさせる場合、一般にタンパク質がいくつかのアクセス可能なアミノ基を有す
ることから、架橋反応のためにゲル化が起こり得る。
【０００７】 先に説明したことから観て、ヘテロ官能化星形ＰＥＧ及びそれを作る方法を提
供することは、当技術分野における有意な前進であることが分かるであろう。
供することは、当技術分野における有意な前進であることが分かるであろう。
【０００８】
ヘテロ官能化末端基をもつ星形ＰＥＧ及びそれを作る方法を提供することが本
発明の目的である。 星形ＰＥＧを作る改善された方法を提供することが本発明の別の目的である。 これらの目的及び他の目的は、式： ［Ｘ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m］a−Ｚ−［（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＯＨ］b （式中、Ｘはアミン、カルボキシル、アルデヒド、チオール、ハロゲン、又はエ
ポキシドであり；Ｚはアミド、カルバメート、又はエステル結合を表し；ｍ及び
ｎは約１０〜２，０００の整数であり；ａは約１〜５の整数であり；そして、ｂ
は約１〜１００の整数である。） により表される生体適合性のヘテロ官能化星形ポリ（エチレングリコール）を提
供することによって達成することができる。
発明の目的である。 星形ＰＥＧを作る改善された方法を提供することが本発明の別の目的である。 これらの目的及び他の目的は、式： ［Ｘ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m］a−Ｚ−［（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＯＨ］b （式中、Ｘはアミン、カルボキシル、アルデヒド、チオール、ハロゲン、又はエ
ポキシドであり；Ｚはアミド、カルバメート、又はエステル結合を表し；ｍ及び
ｎは約１０〜２，０００の整数であり；ａは約１〜５の整数であり；そして、ｂ
は約１〜１００の整数である。） により表される生体適合性のヘテロ官能化星形ポリ（エチレングリコール）を提
供することによって達成することができる。
【０００９】 生体適合性のヘテロ官能化星形ポリ（エチレングリコール）を作る方法は、 （ａ）アルケノールの金属塩で開始されるエチレンオキシドの開環重合により
、アリル末端基を含有する第１ポリ（エチレングリコール）アームを合成するこ
と； （ｂ）酸との反応によりその第１ポリ（エチレングリコール）アームの合成を
終わらせて、ヒドロキシ末端基をもたらすこと； （ｃ）複数のヒドロキシル基を含有する多価化合物との反応により、そのヒド
ロキシ末端基を活性化させること； （ｄ）エチレンオキシド重合により複数の分枝ポリ（エチレングリコール）ア
ームを合成し、その際、それら複数の分枝ポリ（エチレングリコール）アームの
各々がそれら複数のヒドロキシル基の一と結合されてアリル末端基を含有するヘ
テロ官能化星形ポリ（エチレングリコール）をもたらすこと を含む。
、アリル末端基を含有する第１ポリ（エチレングリコール）アームを合成するこ
と； （ｂ）酸との反応によりその第１ポリ（エチレングリコール）アームの合成を
終わらせて、ヒドロキシ末端基をもたらすこと； （ｃ）複数のヒドロキシル基を含有する多価化合物との反応により、そのヒド
ロキシ末端基を活性化させること； （ｄ）エチレンオキシド重合により複数の分枝ポリ（エチレングリコール）ア
ームを合成し、その際、それら複数の分枝ポリ（エチレングリコール）アームの
各々がそれら複数のヒドロキシル基の一と結合されてアリル末端基を含有するヘ
テロ官能化星形ポリ（エチレングリコール）をもたらすこと を含む。
【００１０】
ヘテロ官能化星形ポリ（エチレングリコール）のための本組成物及び方法を開
示し説明する前に、立体配置、処理工程、及び材料は多少変動することができる
ので、本発明は、本明細書中に開示される特定の立体配置、方法工程、及び材料
に限定されるものではないことを理解するべきである。本発明の範囲は、特許請
求の範囲及びそれに相当するものによってのみ限定されるものであるから、本明
細書中で用いられる用語は特定の態様を説明するだけの目的で使用され、限定す
ることを意図するものではないことも理解するべきである。 本発明を説明し特許請求するにあたって、次の用語は本明細書中に述べる定義
に従って使用されるものである。
示し説明する前に、立体配置、処理工程、及び材料は多少変動することができる
ので、本発明は、本明細書中に開示される特定の立体配置、方法工程、及び材料
に限定されるものではないことを理解するべきである。本発明の範囲は、特許請
求の範囲及びそれに相当するものによってのみ限定されるものであるから、本明
細書中で用いられる用語は特定の態様を説明するだけの目的で使用され、限定す
ることを意図するものではないことも理解するべきである。 本発明を説明し特許請求するにあたって、次の用語は本明細書中に述べる定義
に従って使用されるものである。
【００１１】 本明細書中に使用される“ペプチド”はあらゆる長さのペプチドを意味するの
でタンパク質を含む。“ポリペプチド”及び“オリゴペプチド”の語は、特定の
サイズを別に述べない限り、いずれの特定の意図されたサイズに限定することな
く本明細書中で使用される。利用され得る典型的なペプチドは、オキシトシン、
バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、上皮増殖因子、プロラクチン、ルリベリ
ン又は黄体形成ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、
インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン、インターフェロン、ガストリン、テ
トラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストリン、セクレチン、カルシトニ
ン、エンケファリン、エンドルフィン、アンギオテンシン、レニン、ブラジキニ
ン、バシトラシン、ポリミキシン、コリスチン、チロシジン、グラミシジン、及
び、それらの合成類似物、修飾物及び薬理活性のあるフラグメント、モノクロー
ナル抗体及び溶解性ワクチンからなる群から選択されるものである。利用され得
るペプチド又はタンパク質に対する唯一の制限は官能性に関する制限である。
でタンパク質を含む。“ポリペプチド”及び“オリゴペプチド”の語は、特定の
サイズを別に述べない限り、いずれの特定の意図されたサイズに限定することな
く本明細書中で使用される。利用され得る典型的なペプチドは、オキシトシン、
バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、上皮増殖因子、プロラクチン、ルリベリ
ン又は黄体形成ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、
インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン、インターフェロン、ガストリン、テ
トラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストリン、セクレチン、カルシトニ
ン、エンケファリン、エンドルフィン、アンギオテンシン、レニン、ブラジキニ
ン、バシトラシン、ポリミキシン、コリスチン、チロシジン、グラミシジン、及
び、それらの合成類似物、修飾物及び薬理活性のあるフラグメント、モノクロー
ナル抗体及び溶解性ワクチンからなる群から選択されるものである。利用され得
るペプチド又はタンパク質に対する唯一の制限は官能性に関する制限である。
【００１２】 本発明は、ヘテロ官能化末端基をもつ星形ポリマーと、改善された薬物動力学
的、薬理学的、及び免疫学的特性を得るためタンパク質を修飾するそれらの使用
とに関する。そのヘテロ官能化星形ＰＥＧの合成は、基本的に“アームファース
ト法”及び“コアファースト法”の改良法である“ワンアームファースト（one-
arm-first）法”に基づいている。この方法においては、まず、ヘテロ２官能性 化合物で開始されるエチレンオキシドの開環重合により官能基をもつ一つのアー
ムを調製し、次いで、その成長ポリマー鎖末端を多価化合物により停止させた後
に、エチレンオキシドの逐次重合を行う。この場合においては、その第１アーム
のためのヘテロ２官能性開始剤は、（ａ）エチレンオキシド重合を開始するアル
コキシド及び（ｂ）タンパク質複合化のための官能基をもっている。タンパク質
複合化のための官能基は、エチレンオキシド重合の進行の間は不活性であるが活
性形態に回復しやすい前駆体であることが必要とされる。その結果、その第１Ｐ
ＥＧアームを起源とする末端基がそれら他のＰＥＧアームとは異なることができ
る、ヘテロ官能化された星形ＰＥＧを得ることができる。実際に、その第１アー
ムの官能基は、それら他のアームの官能基よりも高い化学反応性であるようにデ
ザインされる。
的、薬理学的、及び免疫学的特性を得るためタンパク質を修飾するそれらの使用
とに関する。そのヘテロ官能化星形ＰＥＧの合成は、基本的に“アームファース
ト法”及び“コアファースト法”の改良法である“ワンアームファースト（one-
arm-first）法”に基づいている。この方法においては、まず、ヘテロ２官能性 化合物で開始されるエチレンオキシドの開環重合により官能基をもつ一つのアー
ムを調製し、次いで、その成長ポリマー鎖末端を多価化合物により停止させた後
に、エチレンオキシドの逐次重合を行う。この場合においては、その第１アーム
のためのヘテロ２官能性開始剤は、（ａ）エチレンオキシド重合を開始するアル
コキシド及び（ｂ）タンパク質複合化のための官能基をもっている。タンパク質
複合化のための官能基は、エチレンオキシド重合の進行の間は不活性であるが活
性形態に回復しやすい前駆体であることが必要とされる。その結果、その第１Ｐ
ＥＧアームを起源とする末端基がそれら他のＰＥＧアームとは異なることができ
る、ヘテロ官能化された星形ＰＥＧを得ることができる。実際に、その第１アー
ムの官能基は、それら他のアームの官能基よりも高い化学反応性であるようにデ
ザインされる。
【００１３】 星形ポリマーは、それらの変わった立体構造のため独特な物性を示す三次元超
分枝状構造を有している。よく画定された構造の星形ポリマーの研究は、一の特
別な形態の分枝の効果のより定量的な研究を可能にする。従って、よく画定され
た星形ポリマーの合成は非常に価値がある。周知のアニオン重合技術は、分子量
、分子量分布、及び末端基官能化に関してよく画定されたポリマーの合成を可能
にする。
分枝状構造を有している。よく画定された構造の星形ポリマーの研究は、一の特
別な形態の分枝の効果のより定量的な研究を可能にする。従って、よく画定され
た星形ポリマーの合成は非常に価値がある。周知のアニオン重合技術は、分子量
、分子量分布、及び末端基官能化に関してよく画定されたポリマーの合成を可能
にする。
【００１４】 本発明は、ヘテロ官能化星形ＰＥＧ自体とタンパク質に複合化する方法とを提
供する。そのヘテロ官能化星形ＰＥＧは、少なくとも３つのヒドロキシル基を有
する多価化合物から誘導された中心残基と、それらヒドロキシル基分枝化位置に
くっ付いた５００〜１０，０００の平均分子量を有する複数のポリマー枝又はポ
リマーアームとを含み、それらポリマーアームはＰＥＧで形成されている。ポリ
マーアームの末端基はヘテロ官能性であるように調製されるので、一の末端基は
タンパク質に部位特異的に複合化できるほど十分反応性であるが、それら他の末
端基は不活性であるか又は少なくともその反応性末端基よりも低い反応性でなけ
ればならない。その反応性基は、アミン、カルボキシル、アルデヒド、チオール
、ハロゲン、及びエポキシド基からなる群から選択され、カルボキシル官能基が
タンパク質のアミノ基との反応に最も好ましい。
供する。そのヘテロ官能化星形ＰＥＧは、少なくとも３つのヒドロキシル基を有
する多価化合物から誘導された中心残基と、それらヒドロキシル基分枝化位置に
くっ付いた５００〜１０，０００の平均分子量を有する複数のポリマー枝又はポ
リマーアームとを含み、それらポリマーアームはＰＥＧで形成されている。ポリ
マーアームの末端基はヘテロ官能性であるように調製されるので、一の末端基は
タンパク質に部位特異的に複合化できるほど十分反応性であるが、それら他の末
端基は不活性であるか又は少なくともその反応性末端基よりも低い反応性でなけ
ればならない。その反応性基は、アミン、カルボキシル、アルデヒド、チオール
、ハロゲン、及びエポキシド基からなる群から選択され、カルボキシル官能基が
タンパク質のアミノ基との反応に最も好ましい。
【００１５】 “ワンアームファースト法”と呼ばれるヘテロ官能化星形ＰＥＧの合成は、ア
ルケノールの金属塩で開始されるエチレンオキシドの開環重合による一のＰＥＧ
アームの調製から着手される。アルケノールは、ビニルアルコール、２−プロペ
ン−１−オール（アリルアルコール）、３−ブテン−１−オール（アリルカルビ
ノール）、４−ペンテン−１−オール（２−アリルエチルアルコール）、５−ヘ
キセン−１−オール、６−ヘプテン−１−オール、及び７−オクテン−１−オー
ルなどからなる群から選択される。エチレンオキシドのアニオン重合のためには
、そのアルケノールは、速い重合速度を達成するために、高い反応性の有機金属
化合物に転化される必要がある。その金属は、カリウム、ナトリウム、リチウム
、イットリウム、及びランタニド系希土類金属からなる群から選択され、周囲温
度を少し超える温度において許容できる重合速度を得るためにはカリウムが対イ
オンとして好ましい。アルコキシド部位は、不飽和化の攻撃を避けるように選ば
れる条件下で、アルケノールをフルオレニルカリウム、ジフェニルメチルカリウ
ム、カリウムナフチリド、又はカリウム第３ブトキシドなどの金属有機求核体と
反応させることにより得られる。その重合は、バルクで行っても溶液中で行って
もよい。カチオンの十分な溶媒和を可能にし、従って塩基の求核性を促進する好
ましい溶媒は、高い極性のものである。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）が最も好
ましい。溶液重合に適する反応温度は−５０〜１５０℃であり、２０〜８０℃が
好ましい範囲である。バルク重合に好ましい温度は０〜６０℃である。重合度は
、一般に開始剤濃度に対するモノマーの比率により制御される。
ルケノールの金属塩で開始されるエチレンオキシドの開環重合による一のＰＥＧ
アームの調製から着手される。アルケノールは、ビニルアルコール、２−プロペ
ン−１−オール（アリルアルコール）、３−ブテン−１−オール（アリルカルビ
ノール）、４−ペンテン−１−オール（２−アリルエチルアルコール）、５−ヘ
キセン−１−オール、６−ヘプテン−１−オール、及び７−オクテン−１−オー
ルなどからなる群から選択される。エチレンオキシドのアニオン重合のためには
、そのアルケノールは、速い重合速度を達成するために、高い反応性の有機金属
化合物に転化される必要がある。その金属は、カリウム、ナトリウム、リチウム
、イットリウム、及びランタニド系希土類金属からなる群から選択され、周囲温
度を少し超える温度において許容できる重合速度を得るためにはカリウムが対イ
オンとして好ましい。アルコキシド部位は、不飽和化の攻撃を避けるように選ば
れる条件下で、アルケノールをフルオレニルカリウム、ジフェニルメチルカリウ
ム、カリウムナフチリド、又はカリウム第３ブトキシドなどの金属有機求核体と
反応させることにより得られる。その重合は、バルクで行っても溶液中で行って
もよい。カチオンの十分な溶媒和を可能にし、従って塩基の求核性を促進する好
ましい溶媒は、高い極性のものである。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）が最も好
ましい。溶液重合に適する反応温度は−５０〜１５０℃であり、２０〜８０℃が
好ましい範囲である。バルク重合に好ましい温度は０〜６０℃である。重合度は
、一般に開始剤濃度に対するモノマーの比率により制御される。
【００１６】 第１アームの重合を終わらせる場合、その成長鎖末端部位を塩酸又は酢酸のよ
うな酸で停止させてヒドロキシル末端基をもたらす。そのヒドロキシル末端部位
は、エチレンオキシドの逐次重合のための多価化合物で再び末端キャップされる
。その多価化合物は、同じ分子中に１つのアミン及び複数のヒドロキシ基を含有
する化合物から選択されるので、好ましくは、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタンのようなポリヒドロキシアルキルモノアミンと、グルコサミン、ガラク
トサミン、及びラクトサミンなどのアミノ糖とからなる群から選択される。種々
のカップリング法をその末端キャップ法に使用することができる。本発明の一の
特定の態様においては、末端ヒドロキシル基を４−ニトロフェニルクロロホーメ
ートで活性化させ、次いでトリ（ヒドロキシメチル）アミノメタンと結合させて
α−ビニル−ω−トリス（ヒドロキシメチル）ＰＥＧをもたらす。トリス（ヒド
ロキシメチル）基の金属塩で開始されるエチレンオキシド重合は、１のみのアー
ムがその鎖の末端にアリル基を有し、残りの３つのアームがヒドロキシル基を有
する４アーム星形ＰＥＧをもたらす。その重合は第１アームの場合と同じ条件で
行うことができる。それら個々のアームセグメントは、概して約５００〜５０，
０００の分子量を有する。星形ＰＥＧの全分子量は、概して約１，０００〜１０
０，０００であるだろう。第１アームの分子量は、それら他のアームと同じであ
っても異なっていてもよい。本発明に適用されるアニオン重合の特徴のため、ア
ームの数及び長さは広い範囲で正確に制御可能である。
うな酸で停止させてヒドロキシル末端基をもたらす。そのヒドロキシル末端部位
は、エチレンオキシドの逐次重合のための多価化合物で再び末端キャップされる
。その多価化合物は、同じ分子中に１つのアミン及び複数のヒドロキシ基を含有
する化合物から選択されるので、好ましくは、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタンのようなポリヒドロキシアルキルモノアミンと、グルコサミン、ガラク
トサミン、及びラクトサミンなどのアミノ糖とからなる群から選択される。種々
のカップリング法をその末端キャップ法に使用することができる。本発明の一の
特定の態様においては、末端ヒドロキシル基を４−ニトロフェニルクロロホーメ
ートで活性化させ、次いでトリ（ヒドロキシメチル）アミノメタンと結合させて
α−ビニル−ω−トリス（ヒドロキシメチル）ＰＥＧをもたらす。トリス（ヒド
ロキシメチル）基の金属塩で開始されるエチレンオキシド重合は、１のみのアー
ムがその鎖の末端にアリル基を有し、残りの３つのアームがヒドロキシル基を有
する４アーム星形ＰＥＧをもたらす。その重合は第１アームの場合と同じ条件で
行うことができる。それら個々のアームセグメントは、概して約５００〜５０，
０００の分子量を有する。星形ＰＥＧの全分子量は、概して約１，０００〜１０
０，０００であるだろう。第１アームの分子量は、それら他のアームと同じであ
っても異なっていてもよい。本発明に適用されるアニオン重合の特徴のため、ア
ームの数及び長さは広い範囲で正確に制御可能である。
【００１７】 一のみの利用可能なビニル基を有する星形ＰＥＧを合成したら、複合化条件に
依存して、そのビニル基をタンパク質との複合化に直接使用しても他の適する官
能基に転化してもよい。以下の式１に示すようなスルフヒドリル選択的反応がそ
のビニル基の直接使用に好ましい。
依存して、そのビニル基をタンパク質との複合化に直接使用しても他の適する官
能基に転化してもよい。以下の式１に示すようなスルフヒドリル選択的反応がそ
のビニル基の直接使用に好ましい。
【００１８】
【化１】
【００１９】 ビニル基は、アミン、カルボキシル、アルデヒド、チオール、ハロゲン、エポ
キシド、及びシアノ基などの種々の官能基に更に転化させることができる。これ
らの転化反応を次の諸式に記載する。
キシド、及びシアノ基などの種々の官能基に更に転化させることができる。これ
らの転化反応を次の諸式に記載する。
【００２０】
【化２】
【００２１】 カルボキシル基を生成させる反応は、以下に示すように、タンパク質のアミノ
基との複合化に好ましく、アミド連結基をもたらすことになる。
基との複合化に好ましく、アミド連結基をもたらすことになる。
【００２２】
【化３】
【００２３】 生ずるアミド連結基は、直接カップリングによっても、適する活性化剤でフリ
ーのカルボキシル基を活性化させた後でも形成することができる。直接カップリ
ングは、水溶性カルボジイミド、すなわち−（３−ジメチルアミノプロピル）−
Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩によって触媒されることができる。そのフリ
ーのカルボキシル基は、活性エステル法又は混合無水物法などの当技術分野にお
いて周知の方法を用いて活性化される。
ーのカルボキシル基を活性化させた後でも形成することができる。直接カップリ
ングは、水溶性カルボジイミド、すなわち−（３−ジメチルアミノプロピル）−
Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩によって触媒されることができる。そのフリ
ーのカルボキシル基は、活性エステル法又は混合無水物法などの当技術分野にお
いて周知の方法を用いて活性化される。
【００２４】 結論として、本発明はタンパク質修飾のための星形ＰＥＧを提供する。より選
択的で効率のよいタンパク質修飾のために必要とされるよく画定された分枝状Ｐ
ＥＧを得ることができることは有益である。加えて、星形ＰＥＧのアームの数及
び重合度を変更することによって、タンパク質との複合化に最も適する星形ＰＥ
Ｇの立体配置を選択することができる。
択的で効率のよいタンパク質修飾のために必要とされるよく画定された分枝状Ｐ
ＥＧを得ることができることは有益である。加えて、星形ＰＥＧのアームの数及
び重合度を変更することによって、タンパク質との複合化に最も適する星形ＰＥ
Ｇの立体配置を選択することができる。
【００２５】
実施例１ 本実施例においては、その末端にカルボキシル基をもつ３アーム星形ＰＥＧの
調製を説明する。 アリルアルコールのカリウム塩 開始剤溶液を使用の前に新しく調製した。ア
リルアルコール１ミリモルを乾燥ＴＨＦ（１０ｍｌ）中に溶解した後に、窒素雰
囲気下で等モル量のカリウム第３ブトキシド（ＴＨＦ中１Ｍ；アルドリッチ（Al
drich），ミルウォーキー，ウィスコンシン州）と反応させた。乾燥ＴＨＦを添 加することによりその濃度を０．１Ｍに調節した後、更に単離することなくその
溶液をエチレンオキシド重合に直接使用した。
調製を説明する。 アリルアルコールのカリウム塩 開始剤溶液を使用の前に新しく調製した。ア
リルアルコール１ミリモルを乾燥ＴＨＦ（１０ｍｌ）中に溶解した後に、窒素雰
囲気下で等モル量のカリウム第３ブトキシド（ＴＨＦ中１Ｍ；アルドリッチ（Al
drich），ミルウォーキー，ウィスコンシン州）と反応させた。乾燥ＴＨＦを添 加することによりその濃度を０．１Ｍに調節した後、更に単離することなくその
溶液をエチレンオキシド重合に直接使用した。
【００２６】 第１ＰＥＧアームの合成 アリルアルコールのカリウム塩で開始したエチレン
オキシド（Fluka）重合により、第１ＰＥＧアームを合成した。重合は、あらか じめ火炎に曝し前もって排気した反応フラスコ内でＴＨＦ中で攪拌しながら行っ
た。まず、エチレンオキシドを水酸化カリウムから蒸留し、続いてドライアイス
−アセトン混合物をエチレンオキシドの凝縮に使用するトラップトゥトラップ（
trap-to-trap）蒸留法により水素化カルシウムから蒸留した。前もって決めた量
（４５ミリモル）のエチレンオキシドをメスシリンダーに集めた後、トラップト
ゥトラップ蒸留法により再びその反応フラスコに移した。次いで、ＴＨＦ中のア
リルアルコールのカリウム塩を、減圧下でＧＡＳＴＩＧＨＴシリンジ（アルドリ
ッチ）でその反応フラスコに導入した。モノマー濃度の反応開始剤に対する比は
４５：１であって、約２０００の分子量のＰＥＧを産した。新しく乾燥したＴＨ
Ｆを添加することにより最終的なモノマー濃度を２Ｍに調節し、次いで、４０℃
で３日間重合を行った。過剰量（開始剤に比べて）の１Ｎ ＨＣｌ溶液を添加す ることにより、重合を停止させた。その第１ＰＥＧアーム生成物をジエチルエー
テル中で沈殿させ、水に対して透析して凍結乾燥した。
オキシド（Fluka）重合により、第１ＰＥＧアームを合成した。重合は、あらか じめ火炎に曝し前もって排気した反応フラスコ内でＴＨＦ中で攪拌しながら行っ
た。まず、エチレンオキシドを水酸化カリウムから蒸留し、続いてドライアイス
−アセトン混合物をエチレンオキシドの凝縮に使用するトラップトゥトラップ（
trap-to-trap）蒸留法により水素化カルシウムから蒸留した。前もって決めた量
（４５ミリモル）のエチレンオキシドをメスシリンダーに集めた後、トラップト
ゥトラップ蒸留法により再びその反応フラスコに移した。次いで、ＴＨＦ中のア
リルアルコールのカリウム塩を、減圧下でＧＡＳＴＩＧＨＴシリンジ（アルドリ
ッチ）でその反応フラスコに導入した。モノマー濃度の反応開始剤に対する比は
４５：１であって、約２０００の分子量のＰＥＧを産した。新しく乾燥したＴＨ
Ｆを添加することにより最終的なモノマー濃度を２Ｍに調節し、次いで、４０℃
で３日間重合を行った。過剰量（開始剤に比べて）の１Ｎ ＨＣｌ溶液を添加す ることにより、重合を停止させた。その第１ＰＥＧアーム生成物をジエチルエー
テル中で沈殿させ、水に対して透析して凍結乾燥した。
【００２７】 ３アーム星形ＰＥＧの合成 第１ＰＥＧアーム、すなわちα−アリル−ω−ヒ
ドロキシＰＥＧ２０００のヒドロキシル末端基をトリエチルアミンの存在下にお
いて４−ニトロフェニルクロロホーメートで活性化させ、次いで、ジメチルホル
ムアミド中の等モル量のセリノール（２−アミノ−１，３−プロパンジオール）
と反応させた。ジエチルエーテル中で沈殿させて水に対する透析により精製した
後、そのα−アリル−ω−ビス（ヒドロキシメチル）メチルアミノＰＥＧ２００
０をカリウム第３ブトキシドを用いてその対応するアルコキシドに転化し、次い
で、モノマーの開始剤に対する濃度比が９０：１であることを除いては、上記の
通りにエチレンオキシド重合を行った。０．１Ｎ塩酸で酸性化した後、過剰量の
ジエチルエーテル中で沈殿させることにより生成物を得た。
ドロキシＰＥＧ２０００のヒドロキシル末端基をトリエチルアミンの存在下にお
いて４−ニトロフェニルクロロホーメートで活性化させ、次いで、ジメチルホル
ムアミド中の等モル量のセリノール（２−アミノ−１，３−プロパンジオール）
と反応させた。ジエチルエーテル中で沈殿させて水に対する透析により精製した
後、そのα−アリル−ω−ビス（ヒドロキシメチル）メチルアミノＰＥＧ２００
０をカリウム第３ブトキシドを用いてその対応するアルコキシドに転化し、次い
で、モノマーの開始剤に対する濃度比が９０：１であることを除いては、上記の
通りにエチレンオキシド重合を行った。０．１Ｎ塩酸で酸性化した後、過剰量の
ジエチルエーテル中で沈殿させることにより生成物を得た。
【００２８】 アリル末端基の修飾 そのアリル末端基をカルボキシル基に修飾した。これは
、その星形ＰＥＧのタンパク質への複合化を可能にする。そのポリマー（１ミリ
モル）をジメチルホルムアミド中の２−カルボキシエタンチオール（１．５ミリ
モル）の溶液に添加した。室温で５時間攪拌した後、その生成物を過剰量のジエ
チルエーテル中での沈殿により回収した後、水に対する透析により精製した。
、その星形ＰＥＧのタンパク質への複合化を可能にする。そのポリマー（１ミリ
モル）をジメチルホルムアミド中の２−カルボキシエタンチオール（１．５ミリ
モル）の溶液に添加した。室温で５時間攪拌した後、その生成物を過剰量のジエ
チルエーテル中での沈殿により回収した後、水に対する透析により精製した。
【００２９】 ポリマーの特性決定 ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、1Ｈ−ＮＭＲ 、及び末端基滴定法を使用して、この星形ＰＥＧの特性を明らかにした。ＧＰＣ
は、Waters 501ポンプ、712 WISPオートサンプラー、745データモジュール、R40
1示差屈折計、及び、ＵＬＴＲＡＳＴＹＲＡＧＥＬカラム（直線及び５００Åの 気孔サイズ、Waters社）とＰＥＯ標準液（Polysciences Inc.）とのセットを備 えたWaters液体クロマトグラフィーシステムを使用して行った。1Ｈ−ＮＭＲス ペクトルは、内部標準としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を有するＤＭＳＯ−
ｄ6中でBruker AS200 FT分光計を用いて記録した。ＰＥＯのヒドロキシル基末端
は、ＤＭＳＯ−ｄ6中で４．５６ｐｐｍにきれいなトリプレットを示した。ＰＥ Ｏ誘導体のヒドロキシル基及びカルボキシル基の末端基は、視覚による滴定法に
より決定した。カルボキシル基の場合には、指示薬としてエタノール中の１％フ
ェノールフタレインの２、３滴を用いて、蒸留水に溶解したサンプル（各１．５
０×１０-3モル）を水酸化ナトリウム標準水溶液（０．０３Ｎ）で滴定した。Ｐ
ＥＯ誘導体により消費された水酸化ナトリウムの最終的な量は、ＰＥＯ誘導体１
分子当たりのカルボキシル基の数についての情報を与えた。ヒドロキシル基は、
有機相中での過剰量の塩化アセチルでのアシル化によりカルボン酸エステルに転
化した後に、上記のように滴定してから加水分解した。
は、Waters 501ポンプ、712 WISPオートサンプラー、745データモジュール、R40
1示差屈折計、及び、ＵＬＴＲＡＳＴＹＲＡＧＥＬカラム（直線及び５００Åの 気孔サイズ、Waters社）とＰＥＯ標準液（Polysciences Inc.）とのセットを備 えたWaters液体クロマトグラフィーシステムを使用して行った。1Ｈ−ＮＭＲス ペクトルは、内部標準としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を有するＤＭＳＯ−
ｄ6中でBruker AS200 FT分光計を用いて記録した。ＰＥＯのヒドロキシル基末端
は、ＤＭＳＯ−ｄ6中で４．５６ｐｐｍにきれいなトリプレットを示した。ＰＥ Ｏ誘導体のヒドロキシル基及びカルボキシル基の末端基は、視覚による滴定法に
より決定した。カルボキシル基の場合には、指示薬としてエタノール中の１％フ
ェノールフタレインの２、３滴を用いて、蒸留水に溶解したサンプル（各１．５
０×１０-3モル）を水酸化ナトリウム標準水溶液（０．０３Ｎ）で滴定した。Ｐ
ＥＯ誘導体により消費された水酸化ナトリウムの最終的な量は、ＰＥＯ誘導体１
分子当たりのカルボキシル基の数についての情報を与えた。ヒドロキシル基は、
有機相中での過剰量の塩化アセチルでのアシル化によりカルボン酸エステルに転
化した後に、上記のように滴定してから加水分解した。
【００３０】 実施例２ この実施例においては、第１ＰＥＧアーム、すなわちα−アリル−ω−ヒドロ
キシＰＥＧ２０００のヒドロキシル末端基をトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタンで修飾して、末端に１つのアミノ基をもつ４アーム星形ＰＥＧを生じさせ
た以外は実施例１の手順に従い、その末端にカルボキシル基をもつ４アーム星形
ＰＥＧを調製した。各アームの個々の分子量は約２，０００であり、従って全分
子量は約８，０００であった。
キシＰＥＧ２０００のヒドロキシル末端基をトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタンで修飾して、末端に１つのアミノ基をもつ４アーム星形ＰＥＧを生じさせ
た以外は実施例１の手順に従い、その末端にカルボキシル基をもつ４アーム星形
ＰＥＧを調製した。各アームの個々の分子量は約２，０００であり、従って全分
子量は約８，０００であった。
【００３１】 実施例３ この実施例においては、その末端にカルボキシル基をもつ４アーム星形ＰＥＧ
の調製を説明する。第１ＰＥＧアームをグルコサミンで末端キャップして、α−
アリル−ω−グルコシルＰＥＧ２０００を生じさせた。α−アリル−ω−グルコ
シルＰＥＧ２０００で開始するエチレンオキシド重合を実施例１に記載したのと
同じやり方で行った。新しく蒸留したエチレンオキシドをトラップトゥトラップ
蒸留反応に加えた後、その反応フラスコを４０℃で３日間インキュベートして重
合を起こさせた。停止及び単離は、３アーム星形ＰＥＧについて上に記載した通
りに行った。その反応で、５本のうち１本がカルボキシル末端基をもつ５アーム
星形ＰＥＧ１０，０００が生成した。
の調製を説明する。第１ＰＥＧアームをグルコサミンで末端キャップして、α−
アリル−ω−グルコシルＰＥＧ２０００を生じさせた。α−アリル−ω−グルコ
シルＰＥＧ２０００で開始するエチレンオキシド重合を実施例１に記載したのと
同じやり方で行った。新しく蒸留したエチレンオキシドをトラップトゥトラップ
蒸留反応に加えた後、その反応フラスコを４０℃で３日間インキュベートして重
合を起こさせた。停止及び単離は、３アーム星形ＰＥＧについて上に記載した通
りに行った。その反応で、５本のうち１本がカルボキシル末端基をもつ５アーム
星形ＰＥＧ１０，０００が生成した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
Claims (18)
- 【請求項１】 式： ［Ｘ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m］a−Ｚ−［（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＯＨ］b （式中、Ｘはアミン、カルボキシル、アルデヒド、チオール、ハロゲン、又はエ
ポキシドであり；Ｚはアミド、カルバメート、又はエステル結合を表し；ｍ及び
ｎは約１０〜２，０００の整数であり；ａは約１〜５の整数であり；そして、ｂ
は約１〜１００の整数である。） により表される生体適合性のヘテロ官能化星形ポリ（エチレングリコール）。 - 【請求項２】 生体適合性のヘテロ官能化星形ポリ（エチレングリコール）
を作る方法であって、 （ａ）アルケノールの金属塩で開始されるエチレンオキシドの開環重合により
、アリル末端基を含有する第１ポリ（エチレングリコール）アームを合成するこ
と； （ｂ）酸との反応により該第１ポリ（エチレングリコール）アームの合成を終
わらせて、ヒドロキシ末端基をもたらすこと； （ｃ）複数のヒドロキシル基を含有する多価化合物との反応により、前記ヒド
ロキシ末端基を活性化させること； （ｄ）エチレンオキシド重合により複数の分枝ポリ（エチレングリコール）ア
ームを合成し、その際、前記複数の分枝ポリ（エチレングリコール）アームの各
々が前記複数のヒドロキシル基の一と結合されてアリル末端基を含有する該ヘテ
ロ官能化星形ポリ（エチレングリコール）をもたらすこと を含んでなる方法。 - 【請求項３】 アルケノールが、ビニルアルコール、２−プロペン−１−オ
ール（アリルアルコール）、３−ブテン−１−オール（アリルカルビノール）、
４−ペンテン−１−オール（２−アリルエチルアルコール）、５−ヘキセン−１
−オール、６−ヘプテン−１−オール、及び７−オクテン−１−オールからなる
群から選択されるメンバーである、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 金属塩の金属が、カリウム、ナトリウム、リチウム、イット
リウム、及びランタニドからなる群から選択されるメンバーである、請求項２記
載の方法。 - 【請求項５】 金属がカリウムである、請求項４記載の方法。
- 【請求項６】 酸が塩酸又は酢酸である、請求項２記載の方法。
- 【請求項７】 多価化合物がポリヒドロキシアルキルモノアミン及びアミノ
糖からなる群から選択されるメンバーである、請求項２記載の方法。 - 【請求項８】 ポリヒドロキシアルキルモノアミンがトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタンである、請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 アミノ糖が、グルコサミン、ガラクトサミン、及びラクトサ
ミンからなる群から選択されるメンバーである、請求項７記載の方法。 - 【請求項１０】 星形ポリ（エチレングリコール）のアリル末端基を末端の
チオール基及びアミノ基を含有するアルキル化合物のチオール基と反応させ、そ
れによって末端アミノ基を含有する星形ポリ（エチレングリコール）を得ること
を更に含んでなる、請求項２記載の方法。 - 【請求項１１】 星形ポリ（エチレングリコール）のアリル末端基を末端の
チオール基及びカルボキシル基を含有するアルキル化合物のチオール基と反応さ
せ、それによって末端カルボキシル基を含有する星形ポリ（エチレングリコール
）を得ることを更に含んでなる、請求項２記載の方法。 - 【請求項１２】 星形ポリ（エチレングリコール）のアリル末端基を２の末
端チオール基を含有するアルキル化合物のチオール基と反応させ、それによって
末端チオール基を含有する星形ポリ（エチレングリコール）を得ることを更に含
んでなる、請求項２記載の方法。 - 【請求項１３】 星形ポリ（エチレングリコール）のアリル末端基を酸化さ
せ、それによって末端カルボキシル基を含有する星形ポリ（エチレングリコール
）を得ることを更に含んでなる、請求項２記載の方法。 - 【請求項１４】 星形ポリ（エチレングリコール）のアリル末端基を酸化さ
せ、それによって末端エポキシド基を含有する星形ポリ（エチレングリコール）
を得ることを更に含んでなる、請求項２記載の方法。 - 【請求項１５】 星形ポリ（エチレングリコール）のアリル末端基を酸化さ
せ、それによって末端アルデヒド基を含有する星形ポリ（エチレングリコール）
を得ることを更に含んでなる、請求項２記載の方法。 - 【請求項１６】 星形ポリ（エチレングリコール）のアリル末端基をハロゲ
ン化水素と反応させ、それによって末端メチルハロゲン基を含有する星形ポリ（
エチレングリコール）を得ることを更に含んでなる、請求項２記載の方法。 - 【請求項１７】 チオール基を含有するタンパク質を末端アリル基を含有す
る星形ポリ（エチレングリコール）と反応させることを含んでなる、タンパク質
を星形ポリ（エチレングリコール）と複合化させる方法。 - 【請求項１８】 アミノ基を含有するタンパク質を末端カルボキシル基を含
有する星形ポリ（エチレングリコール）と反応させることを含んでなる、タンパ
ク質を星形ポリ（エチレングリコール）と複合化させる方法。
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