CN102985462B - 支链异聚乙二醇和中间体 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种支链异聚乙二醇化合物，其具有两种能够与各种生物功能性物质反应的官能团，并且具有多个所述官能团之一。本发明的支链异聚乙二醇由式[1]表示，其中X和Y各自表示含有至少一个官能团的原子团，所述官能团与生物功能性分子中存在的官能团反应以形成共价键，并且所述原子团X中包含的官能团与所述原子团Y中包含的官能团彼此不同；s是2至8的整数，其表示聚乙二醇链的数量；n是聚乙二醇链的平均添加摩尔数，并且20≤n≤2000；并且，E是分支连接物组成部分，其对所述聚乙二醇链具有s价成键价，并对所述官能团Y具有单价成键价。

Description

支链异聚乙二醇和中间体
技术领域
本发明涉及支链异聚乙二醇。更具体来说，本发明涉及支链异聚乙二醇化合物，其用于生物功能性分子的修饰、药物递送系统中的药物或药物载体、用于诊断的材料和装置等。
背景技术
聚乙二醇自身表现出低毒性和抗原性，并且在水和许多有机溶剂中具有出色溶解性。因此，在末端中引入反应性官能团的末端活化的聚乙二醇化合物已被广泛用于提供各种不同功能，例如提供药物和药物载体在体内的隐蔽性并使它们溶解在药物递送系统中，以及提高材料表面的生物相容性。在这些化合物中，在直链聚乙二醇的两个末端处分别具有反应性不同的官能团的所谓的异双官能度聚乙二醇，可以在各个末端中引入不同分子，例如生物功能性分子如药物、生理活性物质、定向物质等。因此，聚乙二醇被用作异交联剂，其将这些生物功能性分子彼此交联或将生物功能性分子与各种药物载体或装置交联。
将异双官能度聚乙二醇原样用作异交联剂所获得的第一个独特的优点是，（A）能够将作为如上所述的聚乙二醇的性质的低抗原性和出色溶解性提供给被键合的物质这一事实。由于聚乙二醇是具有重复单元的聚合物，因此它具有相当大的分子量和单体单元数量，并且与常见的低分子量异交联剂相比末端之间的距离长。因此，下一个优点是（B）由于空间位阻难以直接键合的物质，或通过直接键合可能失去分子固有功能例如药理活性的分子或物质，或具有不同属性的物质例如分子或物质，以及各种药物载体或装置，能够彼此键合这一事实。
在DDS领域中，有许多关于使用异双官能度聚乙二醇偶联的研究。
Jiang等（非专利文献1）已使用具有N-羟基琥珀酰亚胺基酯基和马来酰亚胺基的异双官能度聚乙二醇，将转铁蛋白键合于β-乳球蛋白。Zhang等（非专利文献2）已使用具有N-羟基琥珀酰亚胺基酯基和马来酰亚胺基的异双官能度聚乙二醇，将作为十肽的NLS（核定位信号）键合于结合有树枝状聚合物的吖啶物质。Kim等（非专利文献3）已使用具有氨基或2-吡啶基二硫化物基团和羧酸的异双官能度聚乙二醇，将siRNA键合于LHRH（促黄体素释放激素）。Anhorn等（非专利文献4）已使用具有N-羟基琥珀酰亚胺基酯基和马来酰亚胺基的异双官能度聚乙二醇，将IgG抗体键合于包含抗癌药剂的纳米粒子。
此外，作为在诊断装置方面的应用，Otsuka等（非专利文献5）显示了作为监测生物功能性分子例如凝集素的生物传感器的应用，其中使用具有缩醛基和羟基的异双官能度聚乙二醇将乳糖键合于聚乳酸，并进一步利用乳糖与凝集素之间的相互作用和聚乳酸与无机物质表面的之间的相互作用，结果，将凝集素与无机基材表面交联。
如上所述，异双官能度聚乙二醇是在药物相关应用例如生物功能性分子的修饰、特别是DDS领域中广泛使用的异交联剂。另一方面，当考虑到通过将异双官能度聚乙二醇与各种不同生物功能性分子、载体等进行反应以改进键合有聚乙二醇的物质的功能时，存在着需要任一种生物功能性分子的多个修饰的情况。例如，在考虑在一端具有药物并在另一端具有与其键合的定向分子键合有聚乙二醇的物质的情况中，当获得药物的多个键合时，提高运输效率变得可能。此外，当获得定向分子的多个键合时，提高朝向配体的定向性能变得可能。
作为考虑到采用这种多个生物功能性分子的修饰的聚乙二醇化合物，在US6362254（专利文献1）中描述了所谓的分叉PEG。
在所述专利中，尽管没有异聚乙二醇衍生物的应用实例，但已经合成了分叉PEG，其中两个官能团被引入到一个聚乙二醇末端中，用于在甲氧基-聚乙二醇的一个末端处产生分支点，并用于生物功能性分子的修饰。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利号6362254
非专利文献
非专利文献1：JournalofDrugTargeting,2007,15(10),672-683
非专利文献2：BioconjugateChem.,2009,20,120-128
非专利文献3：BioconjugateChem.,2008,19,2156-2162
非专利文献4：BioconjugateChem.,2008,19,2321-2331
非专利文献5：Langmuir,2004,20(26),11285-11287
发明内容
本发明待解决的技术问题
然而，在专利文献1中，分支点与多个官能团之间的长度没有明确限定，并且所描述的实例仅限于在两个官能团之间具有非常近距离的实例。当设想在两个官能团中引入相同生物功能性分子，特别是具有非常大分子量的物质例如蛋白或抗体时，这意味着作为异聚乙二醇衍生物的显著特点的优点（B），即“由于空间位阻难以直接键合的分子，或通过直接键合可能失去分子固有功能例如药理活性的分子，可以彼此键合”，在很大程度上受损。因此，当作为主要目的应用于具有两个或以上相同的生物功能性分子，并在另一端具有与上述分子不同的一个生物功能性分子的结合有异聚乙二醇的物质时，用途受到限制。
此外，在设想在异聚乙二醇衍生物中引入两个或以上相同生物功能性分子的情形中，与在常用的单官能度活化聚乙二醇或异双官能度聚乙二醇中引入生物功能性分子极为不同的一点，在于下述事实，即为了将生物功能性分子以高转化率引入到两个相同的官能团中，不能使用相对于双官能度分子来说过量的聚乙二醇衍生物，这是由于会形成许多类型的杂质，并且相反昂贵的生物功能性分子应以过量进行反应。因此，从成本角度来看，在分支点与多个官能团之间长度短的结构也难以应用。
由上可知，从性能和成本两方面来看，为了用生物功能性分子对这种新的异聚乙二醇衍生物进行修饰，发现不仅在不同官能团之间，而且在相同官能团之间具有足够距离的异双官能度聚乙二醇是有利的。
然而，具有多个两种官能团之一，被设计成预先假定使用在药物相关应用、例如这些生物功能性分子的修饰中的异聚乙二醇衍生物，还没有报道。特别是，迄今为止也还没有关于被设计用于修饰具有相对大分子量的生物功能性分子例如蛋白药物和抗体的衍生物的实例。
本发明的目的是提供一种支链异聚乙二醇化合物，其具有能够与各种生物功能性分子进行反应的两种官能团，并具有多个所述官能团中的一个。
对于这样的生物功能性分子来说，可以提到的主要是诸如蛋白药物、多肽、酶、抗体、抗体药物、基因、核酸化合物包括寡核苷酸等、核酸药物、抗癌药剂、低分子量药物的生物功能性分子。此外，除了这些生物功能性分子之外，也可以允许药物投送系统中的载体例如脂质体和聚合物胶束以及用于诊断的其他材料和装置进行反应。其中，特别提供了支链异聚乙二醇化合物，其最适合用于修饰生物功能性分子包括蛋白药物、多肽、酶、抗体、抗体药物等。
解决问题的技术手段
作为为了解决上述问题而进行的深入研究的结果，本发明人开发了一种支链异聚乙二醇化合物，其具有多个两种官能团中的一种官能团，适合用于包括生物功能性分子、药物载体和用于诊断的基质材料的基材表面的药物相关的应用，特别是具有大分子量的生物功能性分子包括蛋白药物、多肽、酶、抗体和抗体药物的修饰。
本发明的最显著特征是下述事实，即在具有一定范围的重复单元数的每个聚乙二醇链的一个末端处，存在多次出现的两种官能团中的一种官能团。由于这种特征，在考虑用两种不同种类的生物功能性分子修饰支链异聚乙二醇化合物的情况下，键合于多个官能团的生物功能性分子彼此之间具有最多两个聚乙二醇链链长的距离，因此在相互空间位阻减小的情况下实现修饰。此外，由于分子结构的复杂性，生物功能性分子与可能由于空间位阻而降低反应性的分支点和在另一种官能团处被修饰的另一种生物功能性分子之间，具有最多一个聚乙二醇链链长的距离。
如上所述，在考虑对两个不同生物功能性分子进行修饰的情况下，由于本发明的支链异聚乙二醇化合物的结构特征，将要在多次出现的一种官能团处被修饰的生物功能性分子，与同一分子中存在的下列三项中的任一项保持足够距离，即（1）相同的生物功能性分子，（2）分支点，和（3）另一种生物功能性分子。因此，能够以较高效率执行修饰并同时抑制由空间位阻产生的不利效应，并且也能够抑制生理活性的降低。
也就是说，本发明体现在下列方面。
（1）一种支链异聚乙二醇，其由式[1]所表示：
（X和Y各自表示含有至少一个官能团的原子团，所述官能团与生物功能性分子中存在的官能团反应以形成共价键，并且所述原子团X中包含的官能团与所述原子团Y中包含的官能团彼此不同；
s是2至8的整数，其表示聚乙二醇链的数量；
n是聚乙二醇链的平均添加摩尔数，并且20≤n≤2000；并且
E是分支连接物组成部分，其对所述聚乙二醇链具有s价成键价，并对所述官能团Y具有单价成键价。)
（2）所述支链异聚乙二醇，其中所述分支连接物组成部分E由式[2]表示：
(CH键合于所述官能团Y；L1是键合于聚乙二醇链的p链的成键组成部分，L2是键合于聚乙二醇链的q链的成键组成部分，并且它们彼此相同或不同；它们各自是醚键、酯键、氨酯键、酰胺键、碳酸酯键、仲胺基或含有这些基团的饱和烃基、单键或饱和烃基；并且
P和q各自是1至7的整数，并且p≥q，p+q=s。)
（3）所述支链异聚乙二醇，其中L1和L2各自是醚键、氨酯键、酰胺键或含有这些基团的饱和烃基、单键或饱和烃基。
（4）所述支链异聚乙二醇，其中L1和L2二者都是含有醚键的饱和烃基、单键或饱和烃基。
（5）所述支链异聚乙二醇，其由式[3]或[4]表示：
（v=0或2，并且w=0或1。）
（6）所述支链异聚乙二醇，其中所述原子团X的官能团和所述原子团Y的官能团各自选自由缩醛基、醛基、马来酰亚胺基、乙烯砜基、碘乙酰胺基、活性酯基、活性碳酸酯基、羧基、氨基、氨氧基、硫醇基、烯丙基、乙烯基、乙炔基和叠氮基组成的组。
（7）所述支链异聚乙二醇，其中所述原子团X的官能团和所述原子团Y的官能团中的至少一个选自由羧基、氨基、氨氧基和硫醇基组成的组。
（8）一种中间体，其是所述支链异聚乙二醇的中间体，并且其中所述原子团X的官能团和所述原子团Y的官能团中的至少一个被保护基团保护。
（9）一种键合有聚乙二醇的物质，其中生物功能性分子键合于所述支链异聚乙二醇的末端。
本发明的优点
本发明提供了一种支链异聚乙二醇化合物，其具有多个两种官能团中的一种官能团，主要用于蛋白药物、多肽、酶、抗体、抗体药物、基因、包括寡核苷酸的核酸化合物、核酸药物、抗癌药剂、其他药物例如低分子量药物的化学修饰，此外还用于药物递送系统中的药物载体例如脂质体和聚合物胶束以及用于诊断的其他材料和装置的功能化。通过使用所述支链异聚乙二醇化合物，能够在修饰时由空间排斥引起的反应抑制和修饰后分子固有的功能例如生理活性的降低，受到抑制的状态下，有效地合成具有多个两种生物功能性分子之一的键合有聚乙二醇的物质。
具体实施方式
异双官能度聚乙二醇是末端活化的聚乙二醇化合物，其在直链聚乙二醇链两个末端的每一个中具有显示出不同反应性的官能团，并且能够将不同生物功能性分子、表面等引入两个末端中。
本发明中的支链异聚乙二醇与异双官能度聚乙二醇类似，在末端处具有两种官能团，并且主要目的是在每个末端中引入不同生物功能性分子。在两种官能团中，其中一种官能团多次出现，并且被引入的一种生物功能性分子可以被多次修饰。所述支链异聚乙二醇由式[1]表示。
由(CH2CH2O)n所表示的聚乙二醇链是具有下面单独定义的重复单元数n的直链聚合物组成部分。
原子团X是位于由式[1]表示的支链异聚乙二醇的每个聚乙二醇链末端处的原子团，并可以含有成键组成部分。原子团X由式[5]表示，具有官能团X'和键合于官能团X'的成键组成部分W。然而，成键组成部分W可以是单键。在这种情况下，原子团X与官能团X'一致。
X-＝X’-W-...[5]
成键组成部分W是具有键合于聚乙二醇链的功能的连接物，并且没有特别限制，只要它是包含共价键的组成部分即可。优选地，可以提到的是酯键、氨酯键、酰胺键、醚键、碳酸酯键、含有仲氨基的饱和烃基、单键或饱和烃基。饱和烃基具有12个或以下的碳原子，并且作为优选的饱和烃基，可以提到的是亚甲基、亚乙基、1,3-亚丙基、1,2-亚丙基、异亚丙基、1,4-亚丁基、1,2-亚丁基、异亚丁基、1,5-亚戊基、1,6-亚己基等。
对官能团X'没有特别限制，只要它是与作为用于修饰的目标物质的生物功能性分子中存在的官能团反应以形成共价键的官能团即可，所述生物功能性分子包括蛋白药物、多肽、酶、抗体、抗体药物、基因、包括寡核苷酸的核酸化合物、核酸药物、抗癌药剂和其他药物例如低分子量药物。在实施例中，X'优选为能够与以蛋白质为代表的天然生物功能性分子中存在的氨基、硫醇基、醛基、羧基或可以人工引入的马来酰亚胺基、酮基、叠氮基、乙炔基等，在温和条件下以高得率进行反应的官能团，具体来说是选自由缩醛基、醛基、马来酰亚胺基、乙烯砜基、碘乙酰胺基、活性酯基、活性碳酸酯基、羧基、氨基、氨氧基、硫醇基、烯丙基、乙烯基、乙炔基和叠氮基组成的组的基团。此外，考虑到反应效率，X'更优选为选自由缩醛基、醛基、马来酰亚胺基、活性酯基、活性碳酸酯基、氨基、氨氧基、乙炔基和叠氮基组成的组的基团。在与作为目标物质的生物功能性分子的氨基进行反应的情况下，缩醛基、醛基、活性羧酸、活性碳酸酯基或羧基是优选的，在与作为目标物质的生物功能性分子的硫醇基进行反应的情况下，马来酰亚胺基、乙烯砜基、碘乙酰胺基、烯丙基或乙烯基是优选的，在与作为目标物质的生物功能性分子的醛基或酮基进行反应的情况下，氨基或氨氧基是优选的，在与作为目标物质的生物功能性分子的羧基进行反应的情况下，氨基、氨氧基或硫醇基是优选的，在与作为目标物质的生物功能性分子的马来酰亚胺基进行反应的情况下，硫醇基是优选的，在与作为目标物质的生物功能性分子的叠氮基进行反应的情况下，乙炔基是优选的，并且在与作为目标物质的生物功能性分子的乙炔基进行反应的情况下，叠氮基是优选的。
原子团Y是可以含有将要键合于分支成键组成部分E的成键组成部分的原子团，并且由式[6]表示，其具有官能团Y'和可以包含在原子团Y中的成键组成部分W'。有时，成键组成部分W'可能是单键。在这种情况下，原子团Y与官能团Y'一致。
Y-=Y'-W'-...[6]
成键组成部分W'与可以包含在上述X中的成键组成部分W具有相同定义。对官能团Y'没有特别限制，只要它是与作为用于修饰的目标物质的生物功能性分子中存在的官能团反应以形成共价键的官能团即可，所述生物功能性分子包括蛋白药物、多肽、酶、抗体、抗体药物、基因、包含寡核苷酸的核酸化合物、核酸药物、抗癌药剂和其他药物例如低分子量药物。在优选实施例中，Y'优选为能够与以蛋白质为代表的天然生物功能性分子中存在的氨基、硫醇基、醛基、羧基或可以人工引入的马来酰亚胺基、酮基、叠氮基、乙炔基等，在温和条件下以高得率进行反应的官能团，具体来说是选自由缩醛基、醛基、马来酰亚胺基、乙烯砜基、碘乙酰胺基、活性酯基、活性碳酸酯基、羧基、氨基、氨氧基、硫醇基、烯丙基、乙烯基、乙炔基和叠氮基组成的组的基团。此外，考虑到反应效率，Y'更优选为选自由缩醛基、醛基、马来酰亚胺基、活性酯基、活性碳酸酯基、氨基、氨氧基、乙炔基和叠氮基组成的组的基团。
本发明中的缩醛基连同成键组成部分由式[7]所表示，其中R是具有8个或以下碳原子的饱和烃基。R优选为具有4个或以下碳原子的饱和烃基，最优选为乙基。一般来说，具有这样的结构的缩醛基是醛基的保护基团，但是由于缩醛基的去保护可以使用弱酸度方便地执行，在与生物功能性分子的反应中使用时的性质与其他官能团非常接近，因此可以几乎相同地处理基团。因此，在本发明中，缩醛基被定义为具有与醛类似的亲电反应性的官能团。
本发明中的马来酰亚胺基连同成键组成部分是由式[8]所表示的基团，并且与亲核基团例如硫醇基具有反应性。R1优选为氢或甲基，更优选为氢。
本发明中的活性酯基连同成键组成部分是由式[9]所表示的基团，并且与亲核基团例如氨基具有反应性。R2优选为苯基、3-吡啶基、琥珀酰亚胺基、2-苯并噻唑基或1-苯并三唑基，更优选为琥珀酰亚胺基或1-苯并三唑基，最优选为琥珀酰亚胺。
本发明中的活性碳酸酯基连同成键组成部分是由式[10]所表示的基团，并且与亲核基团例如氨基具有反应性。R3优选为4-硝基苯基、琥珀酰亚胺基或1-苯并三唑基，更优选为4-硝基苯基或琥珀酰亚胺基，最优选为琥珀酰亚胺基。
本发明中的乙炔基连同成键组成部分是由式[11]所表示的基团，并且与叠氮基等具有反应性。R4优选为具有8个或以下碳原子的饱和烃基或氢，更优选为氢。
-W(或W′)-C≡C-R4...[11]
原子团X中包含的官能团和原子团Y中包含的官能团应该彼此不同。然而，原子团X中包含的成键组成部分W和原子团Y中包含的成键组成部分W'可以彼此相同或不同。
当官能团X'与官能团Y'组合时，当X'是缩醛基时Y'是选自马来酰亚胺基、乙烯砜基、碘乙酰胺基、活性酯基、活性碳酸酯基、氨基、氨氧基的基团，当X'是醛基时Y'是选自马来酰亚胺基、乙烯砜基、乙炔基和叠氮基的基团，当X'是马来酰亚胺基、乙烯砜基或碘乙酰胺基时Y'是选自缩醛基、活性酯基、活性碳酸酯基、乙炔基、叠氮基的基团，当X'是活性酯基或活性碳酸酯基时，Y'是选自缩醛基、马来酰亚胺基、乙烯砜基、碘乙酰胺基、乙炔基和叠氮基的基团，当X'是氨基或氨氧基时Y'是选自缩醛基、乙炔基和叠氮基的基团，当X'是乙炔基或叠氮基时Y'是选自缩醛基、醛基、马来酰亚胺基、乙烯砜基、碘乙酰胺基、活性酯基、活性碳酸酯基、氨基和氨氧基的基团。最优选地，当X'是缩醛基时Y'是选自马来酰亚胺基、活性酯基、活性碳酸酯基、氨基和氨氧基的基团，当X'是马来酰亚胺基时Y'是选自缩醛基、活性酯基、活性碳酸酯基、乙炔基和叠氮基的基团，当X'是活性酯基或活性碳酸酯基时Y'是选自缩醛基、马来酰亚胺基、乙炔基和叠氮基的基团，当X'是氨基或氨氧基时Y'是选自缩醛基、乙炔基和叠氮基的基团，当X'是乙炔基或叠氮基时Y'是选自缩醛基、马来酰亚胺基、活性酯基、活性碳酸酯基、氨基和氨氧基的基团。
在本发明中，有鉴于反应性、稳定性等，原子团X的官能团和原子团Y的官能团中的至少一个优选选自由羧基、氨基、氨氧基和硫醇基组成的组。
E是分支连接物组成部分，其对于在一个末端具有原子团X的聚乙二醇链来说具有s-价的键，对于原子团Y来说具有单价的键，并且对E没有特别限制，只要它是共价键即可，但优选具有由式[2]所表示的结构。
在式中，CH（次甲基）直接键合于原子团Y。L1和L2是成键组成部分，其分别键合于上述聚乙二醇链{X-(CH2CH2O)n-}的p链和q链。它们可以彼此相同或不同，并选自醚键、酯键、氨酯键、酰胺键、碳酸酯键、仲胺基或含有这些基团的饱和烃基、单键或饱和烃基。L1和L2各自优选为醚键、氨酯键、酰胺键或含有这些基团的饱和烃基、单键或饱和烃基，更优选为含有醚键的饱和烃基、饱和烃基或单键，并且最优选为饱和烃基或单键。p和q各自表示分别键合于L1和L2的聚乙二醇链{X-(CH2CH2O)n-}的数量。p和q各自为1至7的整数，其中p≥q并具有关系式p+q=s。优选地，p=q=1或p=3，q=1或p=q=2，并且最优选情况下p=q=1。更具体来说，E优选由式[12]或式[13]表示，其中v是0或1至6的整数，w为0或1至3的整数。优选地，v和w分别如下：v=0或2；w=0或1。
当上述E由式[12]或式[13]表示时，本发明的支链异聚乙二醇分别由式[3]或式[4]表示。
s是指示在一端键合于原子团X并在另一端键合于分支连接物组成部分E的聚乙二醇链的聚合物数目的整数，并且是2至8，优选为2或4。
n是每个在末端处具有原子团X的聚乙二醇链的重复单元的数量，并且在本发明中，它被定义为根据化合物的数均分子量（Mn）通过各种理论计算而计算的数量。为了高效修饰生物功能性分子并充分表现出功能，需要对n进行最适合的设置。具体来说，在包括蛋白药物、抗体等的生物功能性分子在原子团X处被修饰并且另一个生物功能性分子、表面等在原子团Y处被修饰的情形中，必需对三种关系中的任一种保持足够的距离，所述关系即（1）在原子团X处被修饰的多个相同的生物功能性分子中的每一个之间，（2）在原子团X处被修饰的生物功能性分子与分支点之间，以及（3）在原子团X处被修饰的生物功能性分子与在原子团Y处被修饰的生物功能性分子或表面之间。从这一点来看，n的下限优选为20，更优选为50，进一步优选为80，最优选为120。此外，归因于由溶液粘度的增加和氧化乙烯加成反应的非均质性造成的分子量分布的增加所引起的操作中的困难，在本发明的中使用的支链异聚乙二醇中的分子量应该被限制到某个值或以下。从这一点来看，n的上限优选为2,000，更优选为1,500，进一步优选为1,000，最优选为500。通过这种对n的适合范围的选择，能够在由在官能团X和Y处被修饰的多个生物功能性分子之间的空间排斥所引起的反应抑制、空间上拥挤的分支连接物组成部分E的影响以及修饰后分子固有的功能例如药理活性的降低被抑制，并且由在键合物质的使用中粘度的增加和分子量分布的增加所引起的对反应或可操作性和质量的其他不利效应，也被抑制的状态下，合成并使用键合的物质。
对于本发明的支链异聚乙二醇来说，作为引入聚乙二醇链的方法，可以选择聚乙二醇链的偶联反应或氧化乙烯的聚合反应。
当通过偶联反应导入聚乙二醇链时，作为典型实例，可以提到的是将具有两个氨基的物质例如赖氨酸，与例如在末端处带有对氨基具有反应性的活性碳酸酯基的甲氧基聚乙二醇进行反应的方法。
为了合成本发明的支链异聚乙二醇，不使用甲氧基聚乙二醇衍生物而是使用异双官能度聚乙二醇作为聚乙二醇是必需的。随后，如果需要，对引入的异双官能度聚乙二醇的两条链的残留末端基团和赖氨酸的羧酸进行官能团转变。作为在官能团转变中使用的反应，可以使用迄今为止任何已知的方法，但是应该适当地选择不使偶联反应所形成的键分解的条件。由偶联形成的键由在反应中使用的官能团的组合所决定，并且在这种情况下是酯键、氨酯键、酰胺键、碳酸酯键、或仲胺基等。
作为通过氧化乙烯的聚合引入聚乙二醇链并随后将官能团引入末端中的典型实例，可以提到的下列步骤。
（A）氧化乙烯的聚合
将氧化乙烯以相对于甘油的3-位处的羟基已被苯甲基取代的式[14]化合物40至4,000摩尔当量的量，在甲苯中或不使用任何溶剂，在金属钠或金属钾、氢化钠、氢化钾、甲醇钠、或叔丁醇钠等的碱性条件下聚合到所述式[14]化合物的剩余两个羟基上，以获得式[15]的支链异聚乙二醇。
在式中，对应于式[1]的E的分支组成部分与在式[2]中所定义的相同。在氧化乙烯的聚合步骤中使用的分支组成部分，优选为在这样的碱性条件下稳定的基团，更优选为饱和烃基或含有醚键的饱和烃基。作为分支组成部分的骨架，最优选地，可以提到的是甘油组成部分、木糖醇组成部分等。此外，也可以使用其他保护基团代替苯甲基，只要它是在上述碱性条件下稳定的基团即可。例如，在用于羟基的保护基团的情况下，可以使用四氢吡喃基、叔丁基等，在用于醛基的保护基团的情况下，可以使用缩醛基例如二乙缩醛基。
（B）聚乙二醇链末端处羟基的官能团转变
随后，在向式[15]的支链聚乙二醇化合物添加甲苯并在常压下回流以实现水的移除后，在碱例如三乙胺存在下添加过量甲磺酰氯以形成甲磺酸酯。允许所述化合物与3,3-二乙氧基-1-丙醇的醇钠化合物进行反应以引入二乙氧基缩醛基，由此获得式[16]的化合物。
除了缩醛基之外，还可以在聚乙二醇链的末端中引入各种保护基团和官能团。然而，在式[16]中，需要指出的一点是下述事实，即必需在分支组成部分附近的保护基团，在这种情况下是苯甲基，能够稳定存在的条件下执行羟基的官能团转变。例如，在使用苯甲基的情况下必需选择不变成还原性条件的反应条件，并且在使用四氢吡喃基、或二乙缩醛基等的情况下，必需选择不变成酸性条件的反应条件。
（C）分支组成部分附近的保护基团的去保护
接下来，在还原催化剂例如Pd/C和氢供体例如氢气或环己烯存在下进行式[16]化合物的催化还原以实现脱苯甲基反应，从而获得式[17]的化合物。
在这种情况下，作为如上述步骤（B）中一次或多次官能团转变的结果，导入到聚乙二醇链末端中的官能团/保护基团，在用于分支组成部分附近的保护基团去保护的去保护条件下应该是稳定的基团。
例如，作为将要导入到聚乙二醇链中的基团，在使用苯甲基作为分支组成部分附近的羟基的保护基团的情形中，需要选择针对作为去保护条件的氢还原稳定的保护基团/官能团，例如缩醛基、四氢吡喃基、邻苯二甲酰亚胺基、氧基邻苯二甲酰亚胺基或硫醇基；在使用四氢吡喃基作为羟基的保护基团或使用缩醛基等作为醛基的保护基团的情形中，选择针对作为去保护条件的弱酸性条件稳定的保护基团/官能团，例如马来酰亚胺基、羧基、氨基、氨氧基或硫醇基；在使用叔丁氧基等的情形中，选择针对作为去保护条件的强酸性条件稳定的保护基团/官能团，例如羧基、氨基、氨氧基或硫醇基。然而，由于对于官能团转变来说存在大量反应，并且随后进一步的官能团转变是可能的，因此该描述不限制在末端处最终获得的官能团种类。
顺便提一句，在作为醛的保护基团的缩醛基例如二乙缩醛基被用作分支组成部分附近的保护基团的情形中，由于可以在上面提到的反应系统中将所述基团原样用于去保护和反应，因此不总是必需在该阶段执行去保护。
（D）分支组成部分附近的官能团转变
接下来，如下所述对式[17]的化合物进行官能团转变以引入各种官能团。在添加甲苯并在常压下回流以实现除水后，在三乙胺存在下加入过量甲磺酰氯以形成甲磺酸酯。然后允许该化合物与氨反应以引入氨基，从而获得式[18]的化合物。
此外，在碱例如N-甲基吗啉存在下，允许式[18]的化合物与N-琥珀酰亚胺基马来酰亚胺酰基丙酸反应，以引入马来酰亚胺基，由此获得式[19]的化合物。
如式[18]和[19]所示的在聚乙二醇链末端处具有多个官能团并在其中引入在分支组成部分附近的官能团的支链异聚乙二醇，可用于与生物功能性分子反应。
（E）聚乙二醇链末端处的官能团转变/去保护
由式[18]或[19]所表示的支链异聚乙二醇可以在这种状态下用于与生物功能性分子进行反应。然而，例如对于式[19]的化合物来说，通过选择适合的酸性条件，也可以通过使马来酰亚胺基离去来执行去保护，以将缩醛基转变成醛基。
也能够将例如上述（D）和（E）的官能团转变步骤重复几次以引入各个任意官能团，并且也能够通过在上述条件下执行官能团转变来引入各种不同官能团。
将要键合于本发明的支链异聚乙二醇的目标物质是生物功能性分子，包括蛋白药物、多肽、酶、抗体、抗体药物、基因、包含寡核苷酸的核酸化合物、核酸药物、抗癌药剂、其他药物例如低分子量药物或其他分子，或药物递送系统中的载体例如脂质体和聚合物胶束，以及用于诊断的其他材料和装置。作为典型实例可以提到下述实例，其中定向分子例如抗体或肽配体被引入到原子团X中，并且药物例如抗癌药剂或蛋白药物或含有包含在其中的药物的载体例如脂质体或聚合物胶束，被键合于另一个原子团Y。在这种情况下，与使用键合有一个定向分子的常规异双官能度聚乙二醇的情况相比，预期将显著提高药物或载体向目标组织迁移的能力。作为另一个实例可以提到下述实例，其中药物被引入到原子团X中，定向分子被引入到另一个原子团Y中。在这种情况下可以引入大量药物，因此与使用异双官能度聚乙二醇的情况相比，预期将增加被运输的药物的量。对将要反应并引入到原子团X和原子团Y中的生物功能性分子没有特别限制。然而，当考虑到本发明的支链异聚乙二醇的每个具有原子团X的聚乙二醇链的重复单元数量n和结构特征时，使用具有分子量为2,000或以上、进一步优选为3,000或以上的原子团X的生物功能性分子，可以获得更大优势。此外，尽管没有特别限制，但是从上面的观点来看，使用具有分子量为3,000或以下、进一步优选为2,000或以下的原子团Y的生物功能性分子，可以获得更大优势。
实施例
下面将参考实施例对本发明进行更详细描述。
通过在凝胶渗透色谱（GPC）上进行分析，确定包括支链异聚乙二醇或其中间体的聚乙二醇化合物的分子量和分子量分布。在本发明中，测量如下所述进行：使用SHODEXGPCSYSTEM-11作为GPC系统，SHODEXRIX8差示折光计作为检测器，串联连接了三个柱SHODEXKF801L、KF803L和KF804L（φ8mn×300mm），将柱温箱温度设定为40℃，使用四氢呋喃作为洗脱剂，将流速设定为1ml/分钟，将样品浓度设定为以质量计0.1%，并将进样体积设定为0.1ml。作为校准曲线，使用了用KantoChemicalCo.,Inc.制造的乙二醇、二乙二醇和三乙二醇，以及PolymerLaboratory制造的各自具有600至70,000的分子量的用于聚乙二醇或聚氧化乙烯的GPC的聚合物标准品制作的曲线。对于数据分析来说，使用了BORWINGPC计算程序。Mn表示数均分子量，Mw表示重均分子量，Mp表示峰尖分子量。对于分子量分布来说，其计算值被显示为Mw/Mn。
对于1H-NMR分析来说，使用由JEOLDATUMLtd.制造的JNM-ECP400或JNM-ECA600。使用CDCl3作为氘化溶剂，使用φ5mm管并使用TMS作为内部标准物质执行测量。
（实施例1）
向装备有温度计、氮气入口管和搅拌器的300ml四颈烧瓶加入18.2g（0.1mol）3-苯甲氧基-1,2-丙二醇、150g无水甲苯、0.9g（39mmol：以摩尔计26%）金属钠，并在室温下在导入氮气下对整体进行搅拌，直至金属钠溶解。将溶液装入5L自压釜中，并且在将系统内部用氮气替换后，将温度升高至100℃。在100至130℃和1MPa或更低压力下向其加入1,982g（45mol）氧化乙烯后，将反应进一步继续2小时。在减压下除去未反应的氧化乙烯气体后，将整体冷却至60℃，并使用85%磷酸水溶液将pH调整至7.5，以获得下列化合物（a1）。
1H-NMR；δ(ppm)：
3.40-3.90(1785H,m,HO(CH 2 CH 2 O)n-CH 2 ,HO(CH 2 CH 2 O)n-CH,CH 2 O-CH2Ph),4.54(2H,s,-CH 2 Ph),7.27-7.38(5H,m,-CH2 Ph)
GPC分析：
数均分子量（Mn）：19,654，重均分子量（Mw）：20,285，多分散性（Mw/Mn）：1.032。
（a1）n=约221
（实施例2）
在装配有温度计、氮气入口管、搅拌器、Dean-stark管和冷却管的的3L四颈烧瓶中装入372g（18.6mmol）上述化合物（a1）和1,860g甲苯。将整体在回流下加热并将水作为共沸物移除。在冷却至室温后，向其加入6.02g（59.5mmol）三乙胺和5.54g（48.4mmol）甲磺酰氯，并使其在40℃反应3小时。随后，向其加入含有溶解在其中的2.58g（112mmol）钠的85.6g（465mmol）3,3-二乙氧基-1-丙醇的甲苯（256.8g）溶液，然后在70℃下反应5小时。在将反应溶液过滤后，将滤液转移至10L不锈钢罐，通过添加1.488g乙酸乙酯、1,488g乙醇和2,976g己烷执行结晶。在将沉淀的晶体过滤以除去溶剂后，将晶体转移至10L不锈钢罐。在向其加入1,488g乙酸乙酯和1,488g乙醇并在40℃下加热溶解晶体后，将溶液冷却至20℃，并通过添加2.976g己烷执行结晶。随后将类似的结晶重复三次，并且在用己烷洗涤后，通过过滤收集晶体并干燥，以获得下列化合物（a2）。
1H-NMR；δ(ppm)：
1.16-1.24(12H,t,(CH 3 CH2O)2-CHCH2CH2-),1.85-1.95(4H,q,(CH3CH2O)2-CHCH 2 CH2-),3.40-3.90(1725H,m,-(CH 2 CH 2 O)n-CH 2 ,-(CH 2 CH 2 O)n-CH,CH 2 O-CH2Ph,(CH3 CH 2 O)2-CHCH2 CH 2 -),4.54(2H,s,-CH 2 Ph),4.60-4.68(2H,t,(CH3CH2O)2-CHCH2CH2-),7.27-7.38(5H,m,-CH2 Ph)
GPC分析：
数均分子量（Mn）：19,190，重均分子量（Mw）：19,496，多分散性（Mw/Mn）：1.016。
（a2）n=约213
（实施例3）
在装配有温度计、氮气入口管、搅拌器和冷却管的1L四颈烧瓶中装入50g上述化合物（a2）和25g5%钯-碳（50%水合产品）。在用氮气替换后，向其加入400g甲醇和67g环己烯，升高温度，在52至55℃下执行轻柔回流，以将反应进行2小时。在将反应溶液冷却至室温后，过滤掉钯-碳，并将滤液浓缩。向浓缩物加入400g甲苯和200g己烷，并执行结晶。通过过滤收集得到的晶体并干燥，以获得下列化合物（a3）。
1H-NMR；δ(ppm)：
1.16-1.24(12H,t,(CH 3 CH2O)2-CHCH2CH2-),1.85-1.95(4H,q,(CH3CH2O)2-CHCH 2 CH2-),3.40-3.90(1673H,m,-(CH 2 CH 2 O)n-CH 2 ,-(CH 2 CH 2 O)n-CH,CH 2 OH,(CH3 CH 2 O)2-CHCH2 CH 2 -),4.60-4.68(2H,t,(CH3CH2O)2-CHCH2CH2-)
GPC分析：
数均分子量（Mn）：18,573，重均分子量（Mw）：19,123，多分散性（Mw/Mn）：1.030。
（a3）n=约207
（实施例4）
在装配有温度计、氮气入口管、搅拌器、Dean-stark管和冷却管的200mL三颈烧瓶中装入13.1g（0.66mmol）上述化合物（a3）和79g甲苯。将整体在回流下加热，并将水作为共沸物移除。在冷却至室温后，向其加入0.33g（3.3mmol）三乙胺和0.30g（2.6mmol）甲磺酰氯，并使其在40℃下反应3小时。在将反应溶液过滤后，将滤液转移至300mL烧杯，并通过添加100g乙酸乙酯和50g己烷执行结晶。在将沉淀的晶体过滤以除去溶剂后，将晶体转移至10L不锈钢罐。在向其加入1,488g乙酸乙酯和1,488g乙醇并在40℃下加热以溶解晶体后，将溶液冷却至20℃，并通过添加2,976g己烷执行结晶。随后将类似的结晶重复三次，并且在用己烷洗涤后，通过过滤收集晶体并干燥，以获得下列化合物（a4）。
1H-NMR；δ(ppm)：
1.16-1.24(12H,t,(CH 3 CH2O)2-CHCH2CH2-),1.85-1.95(4H,q,(CH3CH2O)2-CHCH 2 CH2-),3.08(3H,s,-OSO2 CH 3 ),3.40-3.90(1732H,m,-(CH 2 CH 2 O)n-CH 2 ,-(CH 2 CH 2 O)n-CH,CH 2 OH,(CH3 CH 2 O)2-CHCH2 CH 2 -),4.24-4.44(2H,m,-CH 2 O-OSO2CH3),4.60-4.68(2H,t,(CH3CH2O)2-CHCH2CH2-)
GPC分析：
数均分子量（Mn）：19,274，重均分子量（Mw）：20,046，多分散性（Mw/Mn）：1.040。
（a4）n=约214
（实施例5）
在装配有温度计、氮气入口管、搅拌器、Dean-stark管和冷却管的100mL三颈烧瓶中装入10.0g（0.50mmol）上述化合物（a4）、80g氨水和20g去离子水，然后在55℃反应8小时。在55℃下轻微减压10小时将氨移除，然后通过添加100g氯仿进行萃取。在将氯仿溶液浓缩后，向其加入52g甲苯，并将浓缩物在40℃下溶解，然后过滤。随后，在室温下，在200mL烧杯中，通过添加30g己烷进行结晶。在将沉淀的晶体过滤以除去溶剂后，将晶体用己烷洗涤，通过过滤收集并干燥，以获得下列化合物（a5）。
1H-NMR；δ(ppm)：
1.16-1.24(12H,t,(CH3CH2O)2-CHCH2CH2-),1.85-1.95(4H,q,(CH3CH2O)2-CHCH 2 CH2-),2.70-2.95(2H,m,-CH 2 NH2),3.40-3.90(1730H,m,-(CH 2 CH 2 O)n-CH 2 ，-(CH 2 CH 2 O)n-CH,CH 2 OH,(CH3 CH 2 O)2-CHCH2 CH 2 -),4.60-4.68(2H,t,(CH3CH2O)2-CHCH2CH2-)
GPC分析：
数均分子量（Mn）：19,217，重均分子量（Mw）：20,362，多分散性（Mw/Mn）：1.060。
（a5）n=约214
（实施例6）
在装配有温度计、氮气入口管、搅拌器、Dean-stark管和冷却管的100mL三颈烧瓶中装入5.0g（0.25mmol）上述化合物（a5）、26g甲苯、4.0g乙腈、N-甲基吗啉（1.25mmol）和N-琥珀酰亚胺基3-马来酰亚胺酰丙酸酯（0.375mmol），然后在室温下反应4小时。在将溶液过滤后，在室温下，在300mL烧杯中通过添加100g乙酸乙酯和50g己烷执行结晶。然后，在添加100g乙酸乙酯后，将晶体在40℃下溶解，将溶液冷却至室温，并加入100g己烷以沉淀晶体。在将结晶再重复两次后，将晶体用己烷洗涤，通过过滤收集并干燥，以获得下列化合物（a6）。
1H-NMR；δ(ppm)：
1.16-1.24(12H,t,(CH 3 CH2O)2-CHCH2CH2-),1.85-1.95(4H,q,(CH3CH2O)2-CHCH 2 CH2-),2.51(2H,t,NHCOCH 2 CH2),3.40-3.90(1736H,m,-(CH 2 CH 2 O)n-CH 2 ,-(CH 2 CH 2 O)n-CH,CH 2 OH,(CH3 CH 2 O)2-CHCH2 CH 2 -,CH 2 NHCOCH2 CH 2 ),4.60-4.68(2H,t,(CH3CH2O)2-CHCH2CH2-),6.70(2H,s,CH=CH)
GPC分析：
数均分子量（Mn）：19,395，重均分子量（Mw）：20,600，多分散性（Mw/Mn）：1.062。
（a6）n=约215
（实施例7）
在装配有温度计、氮气入口管和搅拌棒的200mL烧杯中装入2.0g（0.10mmol）上述化合物（a5）和40g去离子水，然后进行溶解。在使用盐酸将溶液制备成pH2并在室温下搅拌2小时后，使用氢氧化钠水溶液将溶液中和至pH6，然后通过添加100g氯仿进行萃取。在将氯仿溶液浓缩后，向其加入40g甲苯，并将浓缩物在40℃下溶解，然后过滤。随后，在室温下，在200mL烧杯中通过添加20g己烷进行结晶。在将沉淀的晶体过滤以除去溶剂后，将晶体用己烷洗涤，通过过滤收集并干燥，以获得下列化合物（a7）。
1H-NMR；δ(ppm)：
2.51(2H,t,NHCOCH 2 CH2),2.63-2.73(4H,HCO-CH 2 CH2-),3.40-3.90(1735H,m,-(CH 2 CH 2 O)n-CH 2 ,-(CH 2 CH 2 O)n-CH,HCO-CH2 CH 2 -,CH 2 NHCOCH2 CH 2 ),6.70(2H,s,CH=CH),9.80(2H,HCO-CH2CH2-)
GPC分析：
数均分子量（Mn）：19,319，重均分子量（Mw）：20,634，多分散性（Mw/Mn）：1.068。
（a7）n=约216
（实施例8）
在装配有温度计、氮气入口管、搅拌器、Dean-stark管和冷却管的1L四颈烧瓶中装入200g（10.0mmol）上述化合物（a1）和600g甲苯。将整体在回流下加热，并将水作为共沸物移除。在冷却至40℃后，向其加入1,000g无水氯仿、8.83g（60.0mmol）邻苯二甲酰亚胺和15.7g（60.0mmol）三苯基膦，然后进行搅拌和溶解。在冷却至室温后，加入12.1g（60.0mmol）偶氮二甲酸二异丙酯，并使其在40℃反应3小时。随后，向其加入含有溶解在其中的2.58g（112mmol）钠的85.6g（465mmol）3,3-二乙氧基-1-丙醇的甲苯（256.8g）溶液，然后使其在70℃下反应5小时。在将反应溶液过滤后，将滤液转移至10L不锈钢罐，通过添加1,488g乙酸乙酯、1,488g乙醇和2,976g己烷执行结晶。在将沉淀的晶体过滤以除去溶剂后，将晶体转移至10L不锈钢罐。在向其加入1,488g乙酸乙酯和1,488g乙醇并在40℃下加热溶解晶体后，将溶液冷却至20℃，并通过添加2,976g己烷执行结晶。随后将类似的结晶重复三次，在用己烷洗涤后，通过过滤收集晶体并干燥，以获得下列化合物（a8）。
1H-NMR；δ(ppm)：
3.40-3.90(1728H,m,-(CH 2 CH 2 O)n-CH 2 ，-(CH 2 CH 2 O)n-CH,CH 2 O-CH2Ph),4.54(2H,s,-CH 2 Ph),7.27-7.38(5H,m,-CH2 Ph),7.65-7.95(4H,m,Ph(CO)2N-)
GPC分析：
数均分子量（Mn）：19,398，重均分子量（Mw）：19,824，多分散性（Mw/Mn）：1.022。
（a8）n=约215
（实施例9）
在装配有温度计、氮气入口管、搅拌器和冷却管的1L四颈烧瓶中装入50g上述化合物（a8）和25g5%钯-碳（50%水合产品）。在用氮气替换后，向其加入500g甲醇和68g环己烯，升高温度，在52至55℃下执行轻柔回流，以将反应进行5小时。在将反应溶液冷却至室温后，过滤掉钯-碳，并将滤液浓缩。向浓缩物加入400g甲苯和200g己烷，并执行结晶。通过过滤收集得到的晶体并干燥，以获得下列化合物（a9）。
1H-NMR；δ(ppm)：
3.40-3.90(1684H,m,-(CH 2 CH 2 O)n-CH 2 ,-(CH 2 CH 2 O)n-CH,CH 2 OH),7.65-7.95(4H,m,Ph(CO)2N-)
GPC分析：
数均分子量（Mn）：18,817，重均分子量（Mw）：19,171，多分散性（Mw/Mn）：1.019。
（a9）n=约210
（实施例10）
在装配有温度计、氮气入口管、搅拌器、Dean-stark管和冷却管的1L四颈烧瓶中装入200g（10.0mmol）上述化合物（a1）和600g甲苯。将整体在回流下加热，并将水作为共沸物移除。在冷却至40℃后，向其加入1,000g无水氯仿、8.83g（60.0mmol）邻苯二甲酰亚胺和15.7g（60.0mmol）三苯基膦，然后进行搅拌和溶解。在冷却至室温后，加入12.1g（60.0mmol）偶氮二甲酸二异丙酯，并使其在40℃反应3小时。随后，向其加入含有溶解在其中的2.58g（112mmol）钠的85.6g（465mmol）3,3-二乙氧基-1-丙醇的甲苯（256.8g）溶液，然后使其在70℃下反应5小时。在将反应溶液过滤后，将滤液转移至10L不锈钢罐，通过添加1,488g乙酸乙酯、1,488g乙醇和2,976g己烷执行结晶。在将沉淀的晶体过滤以除去溶剂后，将晶体转移至10L不锈钢罐。在向其加入1,488g乙酸乙酯和1,488g乙醇并在40℃下加热溶解晶体后，将溶液冷却至20℃，并通过添加2,976g己烷执行结晶。随后将类似的结晶重复三次，在用己烷洗涤后，通过过滤收集晶体并干燥，以获得下列化合物（a10）。
1H-NMR；δ(ppm)：
2.83-2.89(4H,t,NH2-CH 2 CH2-),3.40-3.90(1676H,m,-(CH 2 CH 2 O)n-CH 2 ,-(CH 2 CH 2 O)n-CH,CH 2 OH)
GPC分析：
数均分子量（Mn）：18,559，重均分子量（Mw）：19,264，多分散性（Mw/Mn）：1.038。
（a10）n=约210
（实施例11）
在装配有温度计、氮气入口管、搅拌器、Dean-stark管和冷却管的100mL三颈烧瓶中装入5.0g（0.25mmol）上述化合物（a5）、26g甲苯、4.0g乙腈、N-甲基吗啉（2.50mmol）和N-琥珀酰亚胺基3-马来酰亚胺酰丙酸酯（0.75mmol），然后在室温下反应4小时。在将溶液过滤后，在室温下，在300mL烧杯中通过添加100g乙酸乙酯和50g己烷执行结晶。然后，在添加100g乙酸乙酯后，将晶体在40℃下溶解，将溶液冷却至室温，并加入100g己烷以沉淀晶体。在将结晶再重复两次后，将晶体用己烷洗涤，通过过滤收集并干燥，以获得下列化合物（a11）。
1H-NMR；δ(ppm)：
2.51(2H,t,CH2 CH 2 CONH),3.40-3.90(1767H,m,-(CH 2 CH 2 O)n-CH 2 ,-(CH 2 CH 2 O)n-CH,CH 2 OH,CH 2 CH2CONH),6.50(1H,s,CH2CH2CONH),6.70(2H,s,CH=CH)
GPC分析；
数均分子量（Mn）：19,734，重均分子量（Mw）：21,336，多分散性（Mw/Mn）：1.081。
（a11）n=约220
（实施例12）
在装配有温度计、氮气入口管、搅拌器、Dean-stark管和冷却管的100mL三颈烧瓶中装入4.0g（0.20mmol）上述化合物（a5）、20g二氯甲烷、三乙胺（2.50mmol）和N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯（0.75mmol），然后在室温下反应4小时。在将溶液过滤并浓缩后，在300mL烧杯中通过添加100g乙酸乙酯和50g己烷执行结晶。然后，在添加100g乙酸乙酯后，将晶体在40℃下溶解，将溶液冷却至室温，并加入100g己烷以沉淀晶体。在将结晶再重复三次后，将晶体用己烷洗涤，通过过滤收集并干燥，以获得下列化合物（a12）。
1H-NMR；δ(ppm)：
2.51(2H,t,CH2 CH 2 CONH),2.84(4H,s,-CH2O-COO-琥珀酰亚胺),3.40-3.90(1751H,m,-(CH 2 CH 2 O)n-CH 2 ,-(CH 2 CH 2 O)n-CH,-CH 2 O-COO-琥珀酰亚胺,CH 2 CH2CONH),4.36-4.52(2H,m,-CH 2 O-COO-琥珀酰亚胺),6.37(1H,s,CH2CH2CONH),6.70(2H,s,CH=CH)
GPC分析：
数均分子量（Mn）：19,659，重均分子量（Mw）：21,450，多分散性（Mw/Mn）：1.091
（a12）n=约218
（实施例13）
将GRGDS（Gly-Arg-Gly-Asp-Ser，分子量：490.5）以2.5mg（5.1μmol）的量溶解在1ml10mM的磷酸缓冲液（pH=6.4）中。向200μl该溶液加入10mg（0.5μmol）化合物（a12），并将反应在室温下执行1小时，由此将GRGDS修饰在化合物的一个活性碳酸酯基处。随后，向溶液加入20mg（7.4μmol）Humanin（Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala，分子量：2,687.2），并将反应在室温下执行10小时，由此将Humanin修饰在化合物中的两个马来酰亚胺基处。然后，将200μl反应溶液装载到SP-SepharoseFF（由Amershamplc制造）柱上，并用20mMTris-HCl缓冲液（pH8.2）进行平衡。在平衡后，将其中已添加NaCl至1N的缓冲液通过柱，以获得用一个GRGDS和两个Humanin修饰的PEG化合物的级份。在将20μl级份与20μlTrisSDS样品处理液混合后，将混合物在沸水浴中加热2分30秒，并取20μl溶液在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行分析。通过CBB染色法进行染色。结果，通过与各个标准样品进行比较，显示出化合物是用一个GRGDS和两个Humanin修饰的化合物（a12）。
尽管已参考本发明的特定实施例对本发明进行了详细描述，但对于本技术领域的技术人员来说，显然可以在其中作出各种改变和修改而不背离其精神和范围。
本申请是基于2010年6月25日提交的日本专利申请号2010-145383和2011年3月28日提交的日本专利申请号2011-070735，其内容在此引为参考。此外，所有本文中引述的参考文献作为整体引用。

Claims (5)

1.一种支链异聚乙二醇，该支链异聚乙二醇由式[1]所表示：
其中X和Y各自表示含有至少一个官能团的原子团，所述官能团与生物功能性分子中存在的官能团反应以形成共价键，所述原子团X的官能团和所述原子团Y的官能团各自选自由缩醛基、醛基、马来酰亚胺基、碘乙酰胺基、活性酯基、活性碳酸酯基、羧基、氨基、氨氧基和硫醇基所组成的组，所述原子团X中包含的官能团与所述原子团Y中包含的官能团彼此不同，并且所述活性酯是由式[9]表示的基团，该基团与亲和基团具有反应性：
R2为苯基、3-吡啶基、琥珀酸亚胺基、2-苯并噻唑基或1-苯并三唑基；
s是2至8的整数，其表示聚乙二醇链的数量；
n是聚乙二醇链的平均添加摩尔数，并且20≤n≤2000；并且
E是由式[2]表示的分支连接物组成部分，该分支连接物组成部分对所述聚乙二醇链具有s价成键价，并对所述官能团Y具有单价成键价：
其中，CH键合于所述原子团Y；
L1是键合于所述聚乙二醇链的p链的成键组成部分，L2是键合于所述聚乙二醇链的q链的成键组成部分，并且所述L1和所述L2彼此相同或不同；所述L1和所述L2二者都是含有醚键的饱和烃基、单键或饱和烃基；并且
p和q各自是1至7的整数，并且p≥q，p+q＝s。
2.根据权利要求1所述的支链异聚乙二醇，所述支链异聚乙二醇由式[3]或[4]表示：
其中v＝0或2，并且w＝0或1。
3.根据权利要求1或2所述的支链异聚乙二醇，其中所述原子团X的官能团和所述原子团Y的官能团中的至少一个选自由羧基、氨基、氨氧基和硫醇基所组成的组。
4.一种中间体，该中间体是权利要求1或2所述的支链异聚乙二醇的中间体，并且其中所述原子团X的官能团和所述原子团Y的官能团中的至少一个被保护基团保护。
5.一种键合有聚乙二醇的物质，其中生物功能性分子键合于根据权利要求1或2所述的支链异聚乙二醇的末端。
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