KR100658963B1 - 폴리옥시알킬렌 유도체 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

화학식 1의 폴리옥시알킬렌 유도체.
화학식 1
Figure 112002024805656-pat00001
상기 화학식에서,
Z는 2 내지 8개의 하이드록실 그룹을 갖는 화합물의 잔기를 나타내고,
AO는 탄소수 2 내지 18의 옥시알킬렌 그룹을 나타내며,
n 및 m은 각각 0 내지 2000의 정수를 나타내며, 단 n 및 m이 둘다 0을 나타내지 않으며,
a 및 b는 각각 식 2≤a+b≤8 및 1≤b를 만족시키는 정수를 나타내고,
R은 탄소수 1 내지 20의 탄화수소 그룹을 나타내며,
X는 탄소수 3 내지 30의 2가 탄화수소 그룹을 나타낸다.
폴리옥시알킬렌 유도체, 생물학적 물질, 말레이미도 그룹 치환도, GPC 순도

Description

폴리옥시알킬렌 유도체 및 이의 제조방법{Polyoxyalkylene derivative and process of producing the same}
본 발명은 폴리옥시알킬렌 유도체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 생물학적 물질(예: 폴리펩타이드, 생리학적 활성 단백질 또는 효소)의 개질 및 약물 전달 시스템(이후에는 DDS)(예: 리포좀 및 중합체 마이셀)의 개질에 유용한 폴리옥시알킬렌 유도체에 관한 것이다.
말단 개질된 폴리옥시알킬렌 화합물은 최근들어 DDS에 중요한 담체로서 주목받고 있다. 특히, 폴리옥시알킬렌 화합물을 사용한 폴리펩타이드, 생리학적 활성 단백질 또는 효소 등의 개질 및 폴리옥시알킬렌 화합물을 사용한 리포좀 또는 중합체 마이셀 등의 개질은 항원성(면역반응성)의 감소, 약물 안정성의 증가 및 체내 지속시간의 연장과 같은 효과를 나타낸다. 말단 개질된 폴리옥시알킬렌 화합물로는, 펩타이드 또는 단백질의 측쇄 작용 그룹(예: 리신 잔기의 아미노 그룹, 아스파르트산 또는 글루타민산 잔기의 카복실 그룹 및 시스테인 잔기의 티올 그룹) 또는 인지질 또는 중합체 마이셀 출발 물질의 아미노 그룹 또는 카복실 그룹과 반응할 수 있는 말단 작용 그룹으로서 카복시 그룹, 알데하이드 그룹, 아미노 그룹, 티올 그룹, 말레이미도 그룹 등을 갖는 화합물이 포함된다.
특히, 말레이미도-말단화된 폴리옥시알킬렌 화합물을 사용한, 시스테인 잔기의 측쇄 티올 그룹 또는 리신 잔기에 도입된 티올 그룹의 개질은 다른 개질 방법에 의해 형성된 다른 결합보다 강한 티오에테르 결합을 형성한다. 개질에 사용되는 말레이미도 말단 그룹을 갖는 통상의 폴리옥시알킬렌 화합물은 폴리에틸렌 글리콜 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜을 N-하이드록시석신이미드와 6-말레이미도카프론산의 에스테르 등과 반응시킴으로써 제조하였다. 그러나, 이들 폴리옥시알킬렌 화합물은 폴리옥시알킬렌 쇄와 말레이미도 그룹 사이에 에스테르 결합을 함유하므로, 생체내에서 용이하게 가수분해된다.
WO92/16221, WO98/3887, JP-A-12-191700 및 문헌[참조 문헌: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97(15) (2000), pp. 8543-8553 및 Biochem. J., 351 (1) (2000), pp. 87-93]에 기재되어 있는 α-말레이미도에틸옥시-ω-메톡시(폴리옥시알킬렌)은 유사하게 낮은 저장 안정성을 갖는다.
의학용의 말단 개질된 폴리옥시알킬렌 화합물은 목적하는 화합물보다 고분자량의 불순물이 거의 없어야만 하고 활성 그룹의 치환도가 높아야 한다. 따라서, GPC 순도가 높으며 말단 활성 그룹으로의 치환도가 높은 말단 개질된 폴리옥시알킬렌 화합물이 요구되고 있다.
문헌[참조 문헌: Synthetic Communications, 22(16)(1992), pp. 2425-2429] 에는 폴리옥시알킬렌 쇄와 말레이미도 그룹 사이에 C2 알킬 그룹을 갖는, 말레이미도 그룹-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체의 제조방법이 보고되어 있다. 보고된 상기 방법은 점화점이 낮은 다량의 디에틸 에테르를 중간체의 정제에 사용하기 때문에 산업적 제조용으로 적합하지 않은 것으로 간주될 수 있다.
본 발명의 목적은 고순도이며 저장 안정성이 우수하고 생물학적 물질을 개질시키는데 유용한 폴리옥시알킬렌 유도체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 안전한 고순도의 폴리옥시알킬렌 유도체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 하기 화학식 1의 폴리옥시알킬렌 유도체를 제공한다.
Figure 112002024805656-pat00002
상기 화학식에서,
Z는 2 내지 8개의 하이드록실 그룹을 갖는 화합물의 잔기를 나타내고,
AO는 탄소수 2 내지 18의 옥시알킬렌 그룹을 나타내며,
n 및 m은 각각 0 내지 2000의 정수를 나타내며, 단, n 및 m이 둘다 0을 나타 내지 않으며,
a 및 b는 각각 식 2≤a+b≤8 및 1≤b를 만족시키는 정수를 나타내고,
R은 탄소수 1 내지 30의 탄화수소 그룹을 나타내며,
X는 탄소수 3 내지 10의 2가 탄화수소 그룹을 나타낸다.
본 발명에 따르는 폴리옥시알킬렌 유도체는 바람직하게는 GPC 순도가 90% 이상이고 말레이미도 그룹 치환도가 90% 이상이다.
본 발명의 폴리옥시알킬렌 유도체는 바람직하게는 pH 7 및 23℃에서 수행된 가수분해 안정성 시험에서 48 시간 이상의 말레이미도 그룹 치환도 반감기(50% 감소 시간)를 갖는다.
화학식 1의 폴리옥시알킬렌 유도체 중에서, Z가 3 내지 8개의 하이드록실 그룹을 갖는 화합물의 잔기이고 a 및 b가 식 3≤a+b≤8 및 1≤b를 만족시키는 화학식 1의 폴리옥시알킬렌 유도체가 바람직하다.
본 발명에 따르는 폴리옥시알킬렌 유도체는 바람직하게는 생물학적 물질의 개질용으로 사용된다.
화학식 1의 폴리옥시알킬렌 유도체 중에서, X가 탄소수 3의 2가 탄화수소 그룹인 화학식 1의 폴리옥시알킬렌 유도체가 바람직하다.
본 발명은 또한, 화학식 3의 아미노-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체를 말레산 무수물과 반응시켜 화학식 4의 말레아미드산-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체를 형성하는 단계,
화학식 4의 화합물을 화학식 4의 화합물을 기준으로 하여 50 내지 500용적/ 중량%의 유기 용매속에 용해시키는 단계,
화학식 4의 화합물을 기준으로 하여 300 내지 5000용적/중량%의 에틸 아세테이트와 n-헥산의 혼합물로부터 화학식 4의 화합물을 결정화시키는 단계 및
말레아미드산 말단 그룹을 이미드화시키는 단계를 포함하는, 화학식 1의 폴리옥시알킬렌 유도체의 제조방법을 제공한다.
Figure 112002024805656-pat00003
Figure 112002024805656-pat00004
상기 화학식에서,
Z, AO, n, m, a, b, R 및 X는 상기 정의한 바와 같다.
화학식 3의 아미노 말단 폴리옥시알킬렌 유도체는 바람직하게는 하기 화학식 2의 하이드록실-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체로부터 시안화시킨 다음, 수소화시켜 제조한다.
Figure 112002024805656-pat00005
상기 화학식에서,
Z, AO, n, m, a, b 및 R은 상기 정의한 바와 같다.
본 발명의 방법으로 수득된 화학식 4의 말레아미드산-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체는 바람직하게는 0.5중량% 미만의 말레산 무수물 함량을 갖는다.
본 발명에 따르는 폴리옥시알킬렌은 생물학적 물질을 개질시키는데 특히 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "생물학적 물질"은 생체내의 생명 활성을 유지하는데 필수적인 물질 및 이와 관련된 물질을 의미한다. 생리학적 활성 물질, 구조 단백질 및 인지질이 상기 용어하에 포함된다. 폴리리신 및 폴리글루타민산과 같은 합성에 의해 제조된 폴리(아미노산)이 추가로 포함된다.
생리학적 활성 물질로는 티올 그룹을 갖는 펩타이드(예: 글루타티온), 생리학적 활성 단백질(예: 헤모글로빈 및 인슐린), 효소(예: 리파제 및 프로테아제)와, 화학적 개질 또는 유전자 재조합에 의해 수득되는 펩타이드, 단백질 및 효소가 포함된다. 구조 단백질로는 생체 조직을 구성하는 콜라겐 및 케라틴이 포함된다.
화학식 1의 폴리옥시알킬렌 유도체를 상세히 기술할 것이다.
화학식 1에서, Z는 2 내지 8개의 하이드록실 그룹, 바람직하게는 3 내지 8개의 하이드록실 그룹을 갖는 화합물의 잔기를 나타낸다. 탄소수 2 내지 8의 화합물로는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 글리세롤, 디글리세롤, 트리글리세롤, 테트라글리세롤, 펜타글리세롤, 헥사글리세롤 및 펜타에리트리톨이 포함된다. 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 디글리세롤, 헥사글리세롤 및 펜타에리트리톨이 바람직하고, 글리세롤, 디글리세롤, 헥사글리세롤 및 펜타에리트리톨이 보다 바람직하다.
AO로 표현되는, 탄소수 2 내지 18의 옥시알킬렌 그룹으로는 옥시에틸렌 그룹, 옥시프로필렌 그룹, 옥시부틸렌 그룹, 옥시테트라메틸렌 그룹, 옥시스티렌 그룹, 옥시도데실렌 그룹, 옥시테트라데실렌 그룹, 옥시헥사데실렌 그룹 및 옥시옥타데실렌 그룹이 포함된다. 탄소수 2 내지 4의 옥시알킬렌 그룹이 바람직하며, 옥시에틸렌 그룹이 보다 바람직하다.
n 및 m은 각각 첨가된 옥시알킬렌 그룹 (AO)의 몰수를 나타내며, 각각 0 내지 2000 범위이며, 단, n 및 m이 둘다 0을 나타내지 않는다. n 및 m은 각각 바람직하게는 20 내지 2,000, 특히 40 내지 1000의 범위이다. n 및 m의 총계는 바람직하게는 20 내지 1,200, 특히 40 내지 400이다.
a 및 b는 각각 식 2≤a+b≤8 및 1≤b, 바람직하게는 3≤a+b≤8 및 1≤b를 만족시키는 폴리옥시알킬렌 쇄의 수를 나타낸다. 생물학적 물질의 면역계로의 혼입은 생리학적 활성에 손상을 주지 않으면서 목적하는 개질 효과를 생성하는 2개 이상의 폴리알킬렌 쇄를 갖는 폴리옥시알킬렌 유도체를 사용한 생리학적 활성 물질의 개질에 의해 억제될 수 있다. 2개 이상의 말레이미도 말단 그룹을 갖는 폴리옥시알킬렌 유도체를 사용한 생리학적 활성 물질의 개질은 분자량을 증가시키며, 이는 면역계내로의 혼입을 억제하는데 보다 효과적이다.
n, m, a 및 b는 폴리옥시알킬렌 유도체의 총 분자량을 결정하는 지표이다. 이들은 식 1≤(n×a+m×b)≤16,000, 바람직하게는 20≤(n×a+m×b)≤5,000, 보다 바람직하게는 40≤(n×a+m×b)≤1,200을 만족시킨다. 이러한 식이 만족되는 경우, 화학식 1의 폴리옥시알킬렌 유도체의 분자량은 250 내지 700,000, 바람직하게는 1000 내지 200,000, 보다 바람직하게는 2000 내지 50,000의 범위에 해당된다.
R로 표현되는 탄소수 1 내지 30의 탄화수소 그룹으로는 지방족 탄화수소 그룹(예: 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 헥실, 헵틸, 2-에틸헥실, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 이소트리데실, 테트라데실, 헥사데실, 이소헥사데실, 옥타데실, 이소옥타데실, 옥타데세닐, 옥틸도데실, 도코실 및 데실테트라데실) 및 방향족 탄화수소 그룹(예: 벤질, 크레실, 부틸페닐, 디부틸페닐, 옥틸페닐, 도데실페닐, 디옥틸페닐, 디노닐페닐, 나프틸, 스티렌화된 페닐, p-메톡시벤질 및 트리페닐메틸)이 포함된다. 이중에서 메틸, 에틸, t-부틸, 옥타데실, 벤질, p-메톡시벤질 및 트리페닐메틸이 바람직하다. 메틸, t-부틸 및 벤질이 보다 바람직하다.
X로 표현되는, 탄소수 3 내지 10의 2가 탄화수소 그룹으로는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 그룹(예: 트리메틸렌, 이소프로필렌, 테트라메틸렌, 이소부틸렌, 디메틸메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌, 헵타메틸렌, 옥타메틸렌, 노나메틸렌 및 데카메 틸렌) 및 방향족 탄화수소(예: 페닐메틸렌)가 포함된다. 이중에서, 트리메틸렌, 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌, 헵타메틸렌, 옥타메틸렌, 노나메틸렌 및 데카메틸렌이 바람직하다. 트리메틸렌, 헥사메틸렌, 헵타메틸렌, 옥타메틸렌, 노나메틸렌 및 데카메틸렌이 보다 바람직하다.
하이드록실 그룹을 갖는 화합물의 시안화를 수행하는 경우, 순도 및 수율의 측면에서 아크릴로니트릴 첨가로 이루어진 시아노에틸화가 우수한 방법이다. 시아노에틸화 화합물은 탄소수 3의 2가 탄화수소 그룹을 갖는 화합물이 된다. 이러한 관점에서, 화학식 1의 폴리옥시알킬렌 유도체는 바람직하게는 X가 탄소수 3의 2가탄화수소 그룹인 폴리옥시알킬렌 유도체이다.
반면에, X가 탄소수 6 내지 10의 2가 탄화수소 그룹인 화학식 1의 폴리옥시알킬렌 유도체는 가수분해 안정성에 있어 우수성을 나타내므로, 생물학적 물질을 개질시켜 약제학적 제제를 개발하는 경우 품질의 동등성을 보증하는데 바람직하다.
약제학적 제제에 적용하는 경우, 폴리옥시알킬렌 유도체는 제제 균질성 및 생물학적 물질과의 반응성에 대한 요구를 충족시키기 위해 고순도이어야만 한다. 제제 균질성의 측면에서, 폴리옥시알킬렌 유도체는, 특히 분자량이 2배 또는 3배 등인 화합물의 함량과 관련된 크로마토그래피 순도인, 의도된 고 GPC 순도를 가져야만 한다.
본 발명에 따르는 폴리옥시알킬렌 유도체가 90% 이상, 특히 95% 이상의 GPC 순도를 갖는 것이 바람직하다.
GPC 순도는 다음 조건하에 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정한다.
컬럼: 일련의 3개의 컬럼 SHODEX KF804L(내부 직경: 8mm, 높이: 30cm, 공급원: Showa Denko K.K.)
용출액: 테트라하이드로푸란
유속: 1.0㎖/분
컬럼 온도: 40℃
검출기: 시차 굴절계
샘플: 0.1중량% 테트라하이드로푸란 용액
주입량: 100㎕
피크가 분리되는 경우 정점 사이의 최소점에서 수직으로 분할한다. 피크가 숄더(shoulder)를 갖는 경우 변곡점에서 수직으로 분할한다. 주 피크의 면적비는 분할된 피크의 면적으로부터 계산한다.
생물학적 물질과의 충분한 반응성을 보증하기 위해, 폴리옥시알킬렌 유도체가 활성 말단 그룹인 말레이미도 그룹으로의 높은 치환도를 갖는 것이 바람직하다. 활성 말단 그룹으로의 낮은 치환도에서, 목적하는 개질된 생물학적 물질의 생성율은 감소될 수 있으며, 이는 혈중 지속시간의 감소와 같은 제제의 성능 감소를 초래한다. 생물학적 물질을 개질시키는데 사용되는 폴리옥시알킬렌 유도체는 90% 이상, 특히 92% 이상의, 작용성 말단 그룹인 말레이미도 그룹으로의 치환도를 갖는 것이 바람직하다.
말레이미도 그룹 치환도는 중수소화(deuteric) 클로로포름 0.55㎖속에 용해된 중량이 15 내지 20mg인 샘플상에서 ECP400(공급원: JEOL Ltd.)를 사용하여 400MHz에서 1H-NMR 분석하여 측정한다. 말레이미도 그룹에 부여된 피크(δ 6.69, s), 원료(말레아미드산-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체)에 부여된 피크(δ 6.35, dd) 및 반응 중간체에 부여된 피크(δ 7.22 및 6.62, d) 각각의 적분값은 NMR 스펙트럼으로부터 수득한다. 적분값의 총계에 대한 말레이미도 그룹에 부여된 피크 면적의 백분율은 말레이미도 그룹 치환도를 의미한다.
생물학적 물질과의 반응은 통상적으로 완충 용액속에서 수행한다. 따라서, 폴리옥시알킬렌 유도체는 완충 용액 속에서 가수분해에 대한 우수한 안정성을 가져야만 한다. 그렇지 않은 경우, 폴리옥시알킬렌 유도체는 완충 용액속에서 가수분해되어 생물학적 물질의 개질도가 낮아짐으로써 충분한 개질 효과를 생성할 수 없게 된다. 이러한 경우, 폴리옥시알킬렌 유도체는 충분한 개질 효과를 달성하도록 과량으로 사용되어야 한다.
생물학적 물질을 개질시키는데 사용되는 폴리옥시알킬렌 유도체의 가수분해 안정성은 pH 7 및 23℃에서 가수분해 안정성 시험시 말레이미도 그룹 치환도의 반감기(50% 감소 시간)가 48시간 이상, 바람직하게는 54시간 이상, 보다 바람직하게는 60시간 이상이 되게하는 정도이다. 폴리알킬렌 유도체가 가수분해 안정성 시험시 24시간 이상의 25% 감소 시간 및 67시간 이상의 70% 감소 시간, 바람직하게는 27시간 이상의 25% 감소 시간 및 75시간 이상의 70% 감소 시간을 갖는 것이 또한 바람직하다.
가수분해 안정성 시험은 다음과 같이 수행한다. 중량이 0.02g인 샘플 화합 물을 50㎖들이 스크류 유리병내의 50mM 인산 완충액(pH 7) 20㎖속에 용해시키고 23℃에서 정치시킨다. 용해시켜 24시간, 48시간 또는 72시간 후에 수거된 4㎖ 분취액을 몇 방울의 1% 인산 수용액과 혼합하고 동결건조시킨다. 고체를 클로로포름속에 용해시키고 불용성 물질을 여과하여 제거한다. 여과물을 진공에서 농축시켜 샘플을 제조하고, 이를 1H-NMR로 분석하여 말레이미도 그룹 치환도를 측정한다. 각 측정 시간에서 측정된 말레이미도 그룹 치환도를 초기 말레이미도 그룹 치환도로 나누고, 그 몫에 100을 곱하여 말레이미도 그룹의 잔류비(%)를 수득한다. 잔류비가 75%, 50%(절반) 및 30%인 시간은 각각 25% 감소 시간, 50% 감소 시간(반감기) 및 70% 감소 시간을 의미한다. 25% 감소 시간, 50% 감소 시간(반감기) 및 70% 감소 시간은, 24시간, 48시간 및 72시간 후의 잔류비를 세로축상에, 시간을 가로축상에 좌표로 나타내어 절편이 100인 회귀선을 수득하고, 잔류비가 75%, 50% 및 30%인 시간을 회귀에 기초하여 계산함으로써 수득할 수 있다.
본 발명에 따르는 폴리옥시알킬렌 유도체는 화학식 3의 아미노-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체로부터 제조할 수 있다. 순도의 관점에서, 당해 방법은 바람직하게는 화학식 2의 하이드록실-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체로 시작한다. 당해 방법은 하기 반응식 1로 설명된다.
Figure 112002024805656-pat00006
단계(A)는 알칼리 촉매하에 하이드록실-말단화된 폴리옥시알킬 유도체(2)를 시안화하고 이어서 수소화시켜 아미노-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체(3)을 형성하는 것으로 이루어진다. 시안화는, 예를 들어, 아크릴로니트릴, 또는 니트릴 그룹을 함유하는 탄소수 3 내지 10의 2가 탄화 수소의 할라이드를 첨가하여 수행한다. 수득되는 시아나이드 화합물을 수소화시켜 폴리옥시알킬렌 쇄와 아미노 말단 그룹 사이에 탄소수 3 내지 10의 2가 탄화수소 그룹을 갖는 화합물(3)을 수득한다. 시안화제로서 할라이드는 바람직하게는 브로마이드, 클로라이드 또는 요오다이드, 보다 바람직하게는 클로라이드 또는 브로마이드이다.
시안화는 바람직하게는 출발 화합물(2)을 용해시킬 수 있는 물 또는 유기 용매 속에서 수행한다. 적합한 유기 용매로는, 클로로포름, 톨루엔, 아세토니트릴 및 디메틸포름아미드가 포함되며, 톨루엔 및 아세토니트릴이 바람직하다. 용매는 화합물 (2)를 기준으로 하여 50 내지 500용적/중량%, 바람직하게는 70 내지 300용적/중량%의 양으로 사용한다.
시안화에 사용될 수 있는 알칼리 촉매로는 강 알칼리 금속 수산화물(예: 수산화칼륨 및 수산화나트륨) 및 강 알칼리 알콜레이트(예: 나트륨 메틸레이트)가 포함된다. 촉매는 화합물(2)를 기준으로 하여, 0.5 내지 25중량%, 바람직하게는 3 내지 10중량%의 양으로 사용한다.
아크릴로니트릴과 같은 시안화제는 바람직하게는 화합물(2)의 하이드록실 당량당 1 내지 100당량, 특히 10 내지 60당량의 양으로 사용된다.
시안화 반응은 바람직하게는 -20℃ 내지 150℃, 특히 0 내지 100℃의 온도에서 1시간 내지 10시간, 특히 2시간 내지 6시간 동안 수행한다. 반응 후, 촉매를 물로 세척하거나 흡착 처리하여 제거하고, 용매를 제거하여 폴리옥시알킬렌 시아나이드를 수득한다.
이어서, 수득되는 시아나이드 화합물을 통상적으로 수소화용으로 사용되는 촉매의 존재하에 수소화시켜 아미노-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체(3)를 수득한다. 수소화 반응은 바람직하게는 시아나이드를 용해시킬 수 있는 유기 용매(예: 톨루엔 또는 에탄올)속에서 수행한다. 톨루엔이 특히 바람직하다. 용매는 폴리옥시알킬렌 시아나이드를 기준으로 하여, 50 내지 500용적/중량%, 바람직하게는 70 내지 300용적/중량%의 양으로 사용한다.
수소화에 적합한 촉매로는 니켈 및 코발트가 포함되며, 니켈이 바람직하다. 촉매는 바람직하게는 폴리옥시알킬렌 시아나이드를 기준으로 하여, 0.5 내지 25중량%, 특히 1 내지 10중량%의 양으로 사용된다. 니켈 촉매를 사용하는 경우, 암모니아 가스를 첨가하여 수소화 동안 부반응을 방지하는 것이 바람직하다. 암모니아 가스는 바람직하게는 폴리옥시알킬렌 시아나이드를 기준으로 하여, 5 내지 30중량%, 특히 10 내지 20중량%의 양으로 첨가한다.
수소화 반응은 바람직하게는 1 내지 10MPa, 특히 3 내지 6MPa의 수소압에서 80 내지 200℃, 특히 100 내지 150℃에서 0.5 내지 10시간, 특히 1 내지 5시간 동안 수행한다. 반응 후, 촉매를 여과하여 제거하고, 용매를 제거하여 아미노-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체(3)를 수득한다.
경우에 따라, 단계(A)에서 제조된 폴리옥시알킬렌 시아나이드 및 화합물(3)은 결정화 또는 흡착 등의 과정에 의해 정제될 수 있다.
단계(B)는 단계(A)에서 제조된 화합물(3)을 말레산 무수물과 반응시켜 화학식 4의 말레아미드산-말단화된 폴리옥시알킬렌을 수득하는 것으로 이루어진다.
아미노-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체(3)의 아민 순도는 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상이다. 아민 순도가 낮은 경우, 단계(C)에서 결정화가 실질적으로 발생하지 않으므로 최종 생성물인, 화학식(1)의 폴리옥시알킬렌 유도체의 말레이미도 그룹 치환도가 낮아진다.
아민 순도는 다음 조건하에 액체 크로마토그래피시켜 측정할 수 있다.
컬럼: TSKgel SP-5PW(내부 직경: 7.5mm, 길이: 7.5cm, 공급원: Tosoh Corp.)
용출액: 2mM 인산 완충액(pH 6.5)
유속: 0.5㎖/분
컬럼 온도:40℃
검출기: 시차 굴절계
샘플: 2mM 인산 완충액(pH 6.5)중의 0.5중량% 용액
주입량: 20㎕
피크가 분리되는 경우, 정점 사이의 최소점에서 수직으로 분할한다. 피크가 숄더(shoulder)를 갖는 경우, 변곡점에서 수직으로 분할한다. 주 피크의 면적비는 분할된 피크의 면적으로부터 계산한다.
반응을 수행하는 경우, 화합물(3)은 바람직하게는 화합물(3)을 용해시킬 수 있는 유기 용매, 바람직하게는 클로로포름 또는 톨루엔 속에 용해시킨다. 용매는 바람직하게는 화합물(3)을 기준으로 하여, 50 내지 500용적/중량%, 바람직하게는 70 내지 300용적/중량%의 양으로 사용한다. 말레산 무수물은 바람직하게는 화합물(3)의 아미노 당량당 1.0 내지 20당량, 특히 5 내지 15당량의 양으로 사용한다. 반응 온도는 바람직하게는 20 내지 80℃, 보다 바람직하게는 40 내지 60℃이다. 반응 시간은 바람직하게는 0.5 내지 10시간, 특히 1시간 내지 5시간이다.
수득되는 말레아미드산 말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체(4)를 화합물(4)를 용해시킬 수 있는 유기 용매 속에 용해시키고 에틸 아세테이트와 n-헥산의 혼합물을 사용하여 결정화시킨다.
화합물(4)을 위한 유기 용매로는 바람직하게는 클로로포름, 톨루엔, 아세토니트릴 및 디메틸포름아미드가 포함되며, 클로로포름 및 톨루엔이 특히 바람직하다. 유기 용매는 화합물(4)를 기준으로 하여, 50 내지 500용적/중량%, 바람직하게는 70 내지 300용적/중량%의 양으로 사용한다.
에틸 아세테이트/n-헥산이 혼합된 용매를 화합물(4)를 기준으로 하여, 300 내지 5000용적/중량%, 바람직하게는 500 내지 2000용적/중량%의 양으로 사용한다. 에틸 아세테이트 대 n-헥산의 혼합 비는 용적을 기준으로 하여, 1:9 내지 9:1, 바람직하게는 4:6 내지 6:4이다.
결정화 단계에서, 화합물(4)가 유기 용매로 용해되는 온도는 바람직하게는 0 내지 80℃, 보다 바람직하게는 20 내지 40℃이다. 결정화시키기 위해, 화합물(4)가 유기 용매속에 용해된 당해 용액에 에틸 아세테이트/n-헥산 혼합물을 첨가하는 온도는 바람직하게는 20 내지 35℃이다. 에틸 아세테이트 및 n-헥산을 개별적으로 첨가할 수 있다. 결정화는 반복해서 수행할 수 있다.
수득되는 말레아미드산-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체(4)가 0.5중량% 이하, 특히 0.1중량% 이하의 말레산 무수물 함량을 갖는 것이 바람직하다. 화합물(4)중의 높은 말레산 무수물 함량은, 의도한 분자량보다 분자량이 높은 불순물을 형성시킬 수 있으며, 이는 GPC 순도를 감소시킬 수 있다.
말레산 무수물 함량은 중수소화 클로로포름 0.55㎖중의 샘플 화합물 15 내지 20mg의 용액상에서 ECP400(공급원: JEOL Ltd.)를 사용하여 400MHz에서 1H-NMR 분석으로 측정한다. 기준 피크(예를 들어, 기준으로서 메톡시 그룹에 부여된 피크: δ 3.38, s, 3H)와 비교하여 수득된 NMR 스펙트럼으로부터 말레산 무수물에 부여된 피크의 적분값(δ 7.05, s, 2H)을 수득하고, 이로부터 말레산 무수물 함량을 다음의 수학식 1에 따라 계산한다.
Figure 112005056476546-pat00016
단계(C)는 화합물(4)의 말단 말레아미드산을 폐환(이미드화)시켜 폴리옥시알킬렌 유도체(1)를 수득하는 것으로 이루어진다.
폐환 반응은 화합물(4)를 기준으로 하여 아세트산 무수물 5 내지 1000중량%, 바람직하게는 100 내지 500중량% 속에 화합물(4)를 용해시키고, 이에 화합물 4를 기준으로 하여, 촉매(예: 나트륨 아세테이트 또는 트리에틸아민) 1 내지 50중량%, 바람직하게는 5 내지 40중량%를 첨가하고, 반응계를 60 내지 130℃에서 가열함으로써 수행한다. 경우에 따라, 유기 용매를 사용할 수 있다. 유용한 유기 용매로는 클로로포름, 아세토니트릴 및 톨루엔이 포함된다. 유기 용매는 화합물(4)를 기준으로 하여, 50 내지 500용적/중량%, 바람직하게는 70 내지 300용적/중량%의 양으로 사용한다.
반응 후, 촉매를 여과하여 제거하고, 여과물을 감압하에 60 내지 130℃에서 농축시킨다. 농축물은 유기 용매속에 용해시키고 에틸 아세테이트/n-헥산 혼합물 을 당해 용액에 첨가하여 결정화시킨다. 결정을 여과하여 수집하고 건조시켜 목적하는 화합물(1)을 수득한다.
유기 용매로는 바람직하게는 클로로포름 및 톨루엔이 포함된다. 유기 용매는 화합물(1)을 기준으로 하여, 50 내지 500용적/중량%, 바람직하게는 70 내지 300용적/중량%의 양으로 사용한다.
에틸 아세테이트/n-헥산이 혼합된 용매는 화합물(1)을 기준으로 하여, 300 내지 5000용적/중량%, 바람직하게는 500 내지 2000용적/중량%의 양으로 사용한다. 에틸 아세테이트 대 n-헥산의 혼합비는 용적을 기준으로 하여, 1:9 내지 9:1, 바람직하게는 4:6 내지 6:4이다. 에틸 아세테이트 및 n-헥산은 개별적으로 첨가할 수 있다. 결정화는 반복하여 수행할 수 있다.
본 발명의 폴리옥시알킬렌 유도체를 사용한 생물학적 물질의 개질은 다음 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 물질을 인산 완충액속에 용해시키고 10℃ 이하로 냉각시킨다. 말레이미도-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체를 냉각된 용액에 첨가한 다음, 1시간 내지 10시간 동안 교반한다. 반응계를 탈염시키고 동결건조시켜 폴리알킬렌 유도체-개질된 생물학적 물질을 수득한다.
본 발명의 폴리옥시알킬렌 유도체는 고순도이며 이의 말레이미도 잔기의 안정성으로 인해 저장 안정성이 우수하다. 따라서, 이를 사용하여 생물학적 물질을 개질하는 경우, 수득되는 폴리옥시알킬렌 유도체-개질된 생물학적 물질도 우수한 안정성을 나타낸다. 본 발명에 따르는 방법은 안정성을 갖는 목적하는 고순도 폴리옥시알킬렌 유도체를 산출한다. 생물학적 물질이 본 발명의 폴리옥시알킬렌 유도체를 사용하여 개질된 개질 물질은 안정성이 우수하며 유용하다.
본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 보다 상세히 설명할 것이다.
실시예 1
시안화:
교반기, 적하 깔때기, 온도계 및 질소-버블링 시험관이 장착된 3ℓ들이 4목 플라스크내에, n+m이 112이고 a가 1이며 b가 1인 화학식 2의 메톡시폴리옥시에틸렌(MEH-50H, 공급원: NOF Corp.) 640g을 넣고 이온 교환된 물 640g을 첨가하여 당해 화합물을 용해시킨다. 용액을 10℃ 이하로 냉각시키고, 50% 수산화칼륨 40g을 상기 용액에 첨가한다. 용액을 추가로 5℃ 이하로 냉각시키고, 아크릴로니트릴 340g을 2시간에 걸쳐 상기 용액에 적가하면서 액체 온도를 5℃ 이하로 유지시킨다. 첨가 후, 추가로 2시간 동안 지속적으로 교반한다. 반응을 종결시킨 후, 반응 혼합물은 85% 인산 24g으로 중화시킨다. 반응 혼합물 842g에 이온 교환된 물 2800g중의 염화나트륨 500g의 용액을 첨가하고, 혼합물을 클로로포름 1000㎖로 추출한다. 클로로포름 층을 분리하고, 수성 층을 클로로포름 500㎖으로 다시 추출한다. 합한 클로로포름 추출물을 여과하고, 0.3kPa의 감압하에 90℃에서 용매를 제거하여 조 시아노에틸화 메톡시폴리옥시에틸렌 640g을 수득한다.
교반기 및 질소 밀봉 시험관이 장착된 10ℓ들이 비이커내에, 조 시아노에틸화 메톡시폴리옥시에틸렌 600g을 넣고 클로로포름 500㎖속에 용해시킨다. 에틸 아세테이트 4ℓ와 n-헥산 4ℓ의 혼합물을 당해 용액속에 부은 다음, 30분 동안 교반하여 결정화시킨다. 결정을 여과하여 수집한다. 클로로포름 400㎖ 및 또 다른 에 틸 아세테이트(4ℓ)와 n-헥산(4ℓ)의 혼합물을 사용하여 결정화를 반복한다. 수득되는 결정을 건조시켜 시아노에틸화 메톡시폴리옥시에틸렌 540g을 수득한다.
아미노화:
교반기, 온도계, 질소 도입 시험관, 수소 도입 시험관 및 암모니아 도입 시험관이 장착된 1ℓ들이 오토클레이브내에, 시아노에틸화 메톡시폴리옥시에틸렌 200g, 톨루엔 400g 및 니켈 촉매 4g을 놓는다. 오토클레이브를 질소로 세정한 후, 혼합물을 60℃로 가열하여 당해 화합물을 용해시킨다. 당해 용액속에 암모니아 가스 30g을 도입한 다음, 수소 가스를 4MPa까지 도입한다. 오토클레이브의 온도를 130℃로 상승시키고, 혼합물을 3시간 동안 교반한다. 오토클레이브 후, 80℃로 냉각시키고 촉매를 여과하여 제거하고, 여과물로부터 0.3kPa의 감압하에 90℃에서 1시간 동안 용매를 제거하여 메톡시폴리옥시에틸렌 프로필아민 170g을 수득하며, 이의 아민 순도는 95.2%인 것으로 밝혀졌다.
말레이미드화:
교반기, 온도계, 콘덴서 및 질소-버블링 시험관이 장착된 1ℓ들이 4목 플라스크내로, 메톡시폴리에틸렌 프로필아민 164g 및 톨루엔 325㎖을 충전시키고 50℃로 가열하여 용액을 제조한다. 당해 용액에 말레산 무수물 32g을 첨가한 다음, 4시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 40℃로 냉각시키고, 에틸 아세테이트 800㎖와 헥산 800㎖의 혼합물을 상기 반응 혼합물에 부은 다음, 30분 동안 교반하여 결정화시킨다. 여과하여 수집된 결정을 다시 톨루엔 325㎖ 속에 용해시키고, 에틸 아세테이트 800㎖와 헥산 800㎖의 혼합물을 상기 톨루엔에 부은 다음, 30분 동안 교반하여 결정화시킨다. 여과하여 수집된 결정을 건조시켜 메톡시폴리옥시에틸렌 프로필말레아미드산 167g을 수득하며, 이의 말레산 무수물 함량은 0.0011중량%인 것으로 밝혀졌다.
교반기, 온도계, 콘덴서 및 질소 버블링 시험관이 장착된 1ℓ들이 4목 플라스크내로, 수득된 메톡시폴리옥시에틸렌 프로필말레아미드산 167g, 아세트산 무수물 500㎖ 및 나트륨 아세테이트 64g을 충전시킨다. 혼합물을 90℃로 가열하고, 3시간 동안 교반하여 반응을 수행한다. 50℃로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 여과하여 나트륨 아세테이트를 제거하고 여과물을 0.3kPa의 감압하에 90℃에서 농축시킨다. 농축물을 클로로포름 330㎖ 속에 용해시키고, 임의 불용성 물질을 여과하여 제거한다. 에틸 아세테이트 1ℓ와 헥산 1ℓ의 혼합물을 여과물에 부은 다음, 30분 동안 교반하여 결정화시킨다. 결정을 여과하여 수집한다. 결정을 다시 클로로포름 330㎖ 속에 용해시키고, 30분 동안 교반하여 또 다른 에틸 아세테이트(1ℓ)와 헥산(1ℓ)의 혼합물로부터 결정화시킨다. 여과하여 수집된 결정을 건조시켜 연분홍색의 메톡시 폴리옥시에틸렌 프로필말레이미드 160g을 수득한다.
실시예 2
시안화:
교반기, 적하 깔때기, 온도계 및 질소 버블링 시험관이 장착된 5ℓ들이 4목 플라스크내에, a가 0이고, m이 113이며, b가 2인 화학식 2의 폴리에틸렌 글리콜(PEG 11000, 공급원: NOF Corp., 분자량: 10000) 1600g를 넣고, 이온 교환된 물 1600g을 첨가하여 당해 화합물을 용해시킨다. 용액을 10℃ 이하로 냉각시키고 50% 수산화칼륨 100g을 상기 용액에 첨가한다. 용액을 추가로 5℃ 이하로 냉각시키고 아크릴로니트릴 850g을 2시간에 걸쳐 상기 용액에 적가하면서 액체 온도를 5℃ 이하로 유지시킨다. 첨가 후, 추가로 2시간 동안 지속적으로 교반한다. 반응을 종결시킨 후, 반응 혼합물을 85% 인산 60g을 첨가하여 중화시킨다. 이온 교환된 물 7000g중의 염화나트륨 1250g의 용액, 클로로포름 2500㎖ 및 클로로포름 1250㎖을 사용하여 실시예 1과 동일한 방식으로 반응 혼합물을 후처리하여 조 디시아노에틸화 폴리옥시에틸렌 1600g을 수득한다.
교반기 및 질소 밀봉 시험관이 장착된 30ℓ들이 비이커내에, 조 디시아노에틸화 폴리옥시에틸렌(1600g)을 넣고 클로로포름 1.4ℓ속에 용해시킨다. 에틸 아세테이트 11.1ℓ와 헥산 11.1ℓ의 혼합물을 당해 용액에 부은 다음, 30분 동안 교반하여 결정화시킨다. 결정을 여과하여 수집한다. 결정을 다시 클로로포름 1.4ℓ속에 용해시키고, 또 다른 에틸 아세테이트(11.1ℓ)와 n-헥산(11.1ℓ)의 혼합물을 상기 클로로포름에 부은 다음, 교반한다. 앞서 침전된 결정을 여과하여 수집하고 건조시켜 디시아노에틸화 폴리옥시에틸렌 1400g을 수득한다.
아미노화:
교반기, 온도계, 질소 도입 시험관, 수소 도입 시험관 및 암모니아 도입 시험관이 장착된 1ℓ들이 오토클레이브내에, 디시아노에틸화 폴리옥시에틸렌 200g, 톨루엔 400g 및 니켈 촉매 9g을 넣는다. 혼합물을 반응시키고 실시예 1과 동일한 방식으로 후처리하여 폴리옥시에틸렌 디프로필아민 170g을 수득하며, 이의 아민 순도는 93.7%인 것으로 밝혀졌다.
말레이미드화:
교반기, 온도계, 콘덴서 및 질소-버블링 시험관이 장착된 1ℓ들이 4목 플라스크내로, 폴리옥시에틸렌 디프로필아민 164g 및 톨루엔 325㎖을 충전시키고 50℃로 가열하여 용액을 제조한다. 당해 용액에 말레산 무수물 32g을 첨가한 다음, 4시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 40℃로 냉각시키고 에틸 아세테이트 800㎖와 헥산 800㎖의 혼합물을 상기 반응 혼합물에 부은 다음, 30분 동안 교반하여 결정화시킨다. 여과하여 수집된 결정을 톨루엔 325㎖ 속에 다시 용해시키고, 에틸 아세테이트 800㎖와 헥산 800㎖의 혼합물을 상기 톨루엔에 부은 다음, 30분 동안 교반하여 결정화시킨다. 여과하여 수집된 결정을 건조시켜 폴리옥시에틸렌 디프로필말레아미드산 165g을 수득하며, 이의 말레산 무수물 함량은 0.0018중량%인 것으로 밝혀졌다.
교반기, 온도계, 콘덴서 및 질소 버블링 시험관이 장착된 1ℓ들이 4목 플라스크내로, 수득된 폴리옥시에틸렌 디프로필말레아미드산 165g, 아세트산 무수물 500㎖ 및 나트륨 아세테이트 63g을 충전시킨다. 혼합물을 90℃로 가열하고, 이 온도에서 3시간 동안 교반하여 반응을 수행한다. 50℃로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 여과하여 나트륨 아세테이트를 제거하고 여과물을 0.3kPa의 감압하에 90℃에서 농축시킨다. 농축물을 클로로포름 360㎖ 속에 용해시키고, 임의 불용성 물질을 여과하여 제거한다. 에틸 아세테이트 1ℓ와 헥산 1ℓ의 혼합물을 여과물에 부은 다음, 30분 동안 교반하여 결정화시킨다. 결정을 여과하여 수집한다. 결정을 클로 로포름 360㎖ 속에 다시 용해시키고, 30분 동안 교반하여 또 다른 에틸 아세테이트(1ℓ)와 헥산(1ℓ)의 혼합물로부터 결정화시킨다. 여과하여 수집된 결정을 건조시켜 연분홍색 폴리옥시에틸렌 디프로필말레이미드 160g을 수득한다.
실시예 3
시안화:
교반기, 적하 깔때기, 온도계 및 질소-버블링 시험관이 장착된 5ℓ들이 4목 플라스크내에, a가 0이고 m이 56이며 b가 4인 테트라(폴리옥시에틸렌) 디글리세롤 에테르(DEG-10000, 공급원: NOF Corp., 분자량: 10000)을 넣고 이온 교환된 물 1600g을 첨가하여 당해 화합물을 용해시킨다. 용액을 10℃ 이하로 냉각시키고 50% 수산화칼륨 100g을 상기 용액에 첨가한다. 용액을 5℃ 이하로 추가로 냉각시키고, 아크릴로니트릴 850g을 2시간에 걸쳐 상기 용액에 적가하면서 액체 온도를 5℃ 이하로 유지한다. 첨가 후, 추가로 2시간 동안 지속적으로 교반한다. 반응을 종결시킨 후, 반응 혼합물은 85% 인산 60g을 첨가하여 중화시킨다. 이온 교환된 물 7000g중의 염화나트륨 1250g의 용액, 클로로포름 2500㎖ 및 클로로포름 1250㎖을 사용하여 실시예 1과 동일한 방식으로 반응 혼합물을 후처리하여 조 테트라시아노에틸화 테트라(폴리옥시에틸렌) 디글리세롤 1600g을 수득한다.
교반기 및 질소 밀봉 시험관이 장착된 30ℓ들이 비이커내에, 조 테트라시아노에틸화 테트라(폴리옥시에틸렌) 디글리세롤(1600g)을 넣고 클로로포름 1.4ℓ속에 용해시킨다. 에틸 아세테이트 11.1ℓ와 헥산 11.1ℓ의 혼합물을 당해 용액에 부은 다음, 30분 동안 교반하여 결정화시킨다. 결정을 여과하여 수집한다. 결정을 다 시 클로로포름 1.4ℓ속에 용해시키고, 에틸 아세테이트(11.1ℓ)와 n-헥산(11.1ℓ)의 다른 혼합물을 상기 클로로포름에 부은 다음, 30분 동안 교반하여 결정화시킨다. 여과하여 수집된, 수득된 결정을 건조시켜 테트라시아노에틸화 테트라(폴리옥시에틸렌) 글리세롤 1400g을 수득한다.
아미노화:
교반기, 온도계, 질소 도입 시험관, 수소-도입 시험관 및 암모니아-도입 시험관이 장착된 1ℓ들이 오토클레이브내에, 테트라시아노에틸화 테트라(폴리옥시에틸렌) 디글리세롤 200g, 톨루엔 400g 및 니켈 촉매 9g을 넣는다. 혼합물을 반응시키고 실시예 1과 동일한 방식으로 후처리하여 테트라(폴리옥시에틸렌) 디글리세롤 테트라프로필 아민 170g을 수득하며, 이의 아민 순도는 93.1%인 것으로 밝혀졌다.
말레이미드화
교반기, 온도계, 콘덴서 및 질소 버블링 시험관이 장착된 1ℓ들이 4목 플라스크내로 테트라(폴리옥시에틸렌) 디글리세롤 테트라프로필아민 164g 및 톨루엔 325㎖를 충전시키고 50℃로 가열하여 용액을 제조한다. 용액에 말레산 무수물 64g을 첨가한 다음, 4시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 40℃로 냉각시키고, 에틸 아세테이트 800㎖와 헥산 800㎖의 혼합물을 상기 반응 혼합물에 부은 다음, 30분 동안 교반하여 결정화시킨다. 여과하여 수집된 결정을 다시 톨루엔 325㎖ 속에 용해시키고, 에틸 아세테이트 800㎖와 헥산 800㎖의 혼합물을 상기 톨루엔에 붓고 혼합물을 30분 동안 교반하여 결정화시킨다. 여과하여 수집된 결정을 건조시켜 테트 라(폴리옥시에틸렌) 디글리세롤 테트라프로필말레아미드산 167g을 수득하며, 이의 말레산 무수물 함량은 0.025중량%인 것으로 밝혀졌다.
교반기, 온도계, 콘덴서 및 질소 버블링 시험관이 장착된 1ℓ들이 4목 플라스크내로, 수득된 테트라(폴리옥시에틸렌) 디글리세롤 테트라프로필말레아미드산 167g, 아세트산 무수물 500㎖ 및 나트륨 아세테이트 63g을 충전시킨다. 혼합물을 90℃로 가열하고, 3시간 동안 교반하여 반응을 수행한다. 50℃로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 여과하여 나트륨 아세테이트를 제거하고 여과물을 0.3kPa의 감압하에 90℃에서 농축시킨다. 농축물을 클로로포름 360㎖속에 용해시키고, 임의 불용성 물질을 여과하여 제거한다. 에틸 아세테이트 1ℓ와 헥산 1ℓ의 혼합물을 여과물에 부은 다음, 30분 동안 교반하여 결정화시킨다. 결정을 여과하여 수집한다. 결정을 다시 클로로포름 360㎖ 속에 용해시키고, 30분 동안 교반하여 또 다른 에틸 아세테이트(1ℓ)와 헥산(1ℓ)의 혼합물로부터 결정화시킨다. 여과하여 수집된 결정을 건조시켜 연분홍색 테트라(폴리옥시에틸렌) 디글리세롤 테트라프로필말레이미드 162g을 수득한다.
비교 실시예 1
메톡시폴리옥시에틸렌 에틸말레이미드를 문헌[참조: Synthetic Communications, 22(16) (1992), pp. 2425-2429]에 기재되어 있는 방법에 의해 메톡시폴리옥시에틸렌 프로필아민(분자량: 5000)으로부터 합성한다.
출발 메톡시폴리옥시에틸렌 프로필아민은 실시예 1과 동일한 물질 및 방법을 사용하여 시안화 및 아미노화에 의해 제조한다. 수득되는 메톡시폴리옥시에틸렌 프로필아민은 아민 순도가 96.8%이다.
50㎖들이 플라스크내로 메톡시폴리옥시에틸렌 프로필아민 2.5g, 말레산 무수물 460mg 및 디옥산 10㎖을 충전시키고 80℃에서 30분 동안 교반하여 반응시킨다. 냉각시킨 후, 디에틸 에테르 500㎖를 상기 반응 혼합물에 붓고, 혼합물을 밤새 정치시켜 결정화시킨다. 결정을 여과하여 수집하고 디에틸 에테르로 세척하고 진공에서 건조시켜 메톡시폴리옥시에틸렌 프로필말레아미드산을 수득하며, 이의 말레산 무수물 함량은 0.086중량%인 것으로 밝혀졌다.
50㎖들이 플라스크에, 수득된 메톡시폴리옥시에틸렌 프로필말레아미드산, 아세트산 무수물 20㎖ 및 나트륨 아세테이트 1.0g을 넣고, 혼합물을 100℃에서 45분 동안 교반하여 반응을 수행한다. 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 증발시켜 용매를 제거한다. 잔사를 디클로로메탄 50㎖속에 용해시키고 활성탄으로 처리하고, 이후에 상기 활성탄을 여과하여 제거한다. 여과물에 디에틸 에테르 500㎖을 첨가하고, 당해 시스템을 밤새 정치시킨다. 침전된 결정을 여과하여 수집하고 디에틸 에테르로 세척하고 진공에서 건조시켜 연분홍색 메톡시폴리옥시에틸렌 프로필말레이미드 2.2g을 수득한다.
비교 실시예 2
메톡시폴리에틸렌 프로필아민은 실시예 1과 동일한 물질 및 동일한 방법을 사용하여 시안화 및 아미노화에 의해 제조하다. 수득되는 메톡시폴리옥시에틸렌 프로필아민은 아민 순도가 98.8%이다.
교반기, 온도계, 콘덴서 및 질소 버블링 시험관이 장착된 1ℓ들이 4목 플라 스크에 메톡시폴리옥시에틸렌 프로필아민 164g 및 톨루엔 325㎖을 놓은 다음, 50℃로 가열하여 용액을 제조한다. 상기 용액에 말레산 무수물 32g을 첨가하고, 혼합물을 4시간 동안 교반하여 반응을 수행한다. 반응을 종결시킨 후, 반응 혼합물의 분취액을 분석하여 말레산 무수물 함량이 15중량%임을 밝혀낸다. 반응 혼합물에 아세트산 무수물 500㎖ 및 나트륨 아세테이트 64g을 첨가하고, 혼합물을 90℃로 가열한다. 반응 혼합물을 실시예 1과 동일한 방식으로 후처리하여 진갈색 메톡시폴리옥시에틸렌 프로필말레이미드 결정 164g을 수득한다.
비교 실시예 3
시판되는 메톡시프로필에틸렌 글리콜 말레이미드(메톡시폴리에틸렌 글리콜 5,000 말레이미드, 제품 번호 63187, 공급원: Fluka, 분자량: 5000)을 비교 실시예 3과 같이 분석한다.
실시예 1 내지 3 및 비교 실시예 1 내지 3의 폴리옥시알킬렌 유도체를 GPC 순도 및 말레이미도 그룹 치환도에 대해 분석한다. 결과는 하기 표 1에 제시한다.
GPC 순도(%) 말레이미도 그룹 치환도(%) 말레산 무수물 함량(중량%)
실시예 1 97.7 95.7 0.0011
실시예 2 94.4 93.1 0.0018
실시예 3 92.8 92.2 0.025
비교 실시예 1 99.2 84.7 0.086
비교 실시예 2 51.6 94.3 15
비교 실시예 3 98.4 78.0 -

본 발명의 방법에 의해 수득된 폴리옥시알킬렌 유도체는 고 GPC 순도 및 고 말레이미도 그룹 치환도를 나타내는 반면, 본 발명의 범주에서 벗어나는 비교 실시 예의 폴리옥시알킬렌 유도체는 특성 둘다가 불만족스러운 것으로 보인다.
실시예 1 및 비교 실시예 3에서 제조된 폴리옥시알킬렌 유도체를 다음 시험 방법에 따라서 가수분해 안정성 및 이를 사용하여 개질시킨 리소자임의 안정성에 대해 시험한다.
(1) 가수분해 안정성
중량이 0.1g인 샘플을 50㎖들이 스크류 유리병에 넣고 pH 7로 조정된 50mM 인산 완충액 100㎖ 속에 용해시키고, 당해 용액을 23℃에서 정치시킨다. 24시간, 48시간 또는 72시간 동안 정치시킨 후에 수거된 4㎖ 분취액을 몇 방울의 1% 인산 수용액과 혼합하고 동결건조시킨다. 고체를 클로로포름속에 용해시키고 불용성 물질을 여과하여 제거한다. 여과물을 진공에서 농축시켜 샘플을 제조하고, 이를 1H-NMR로 분석하여 말레이미도 그룹 치환도를 측정한다. 초기 값과 비교하여, 각 측정 시간에서의 말레이미도 그룹 치환도의 잔류비(%)는 하기 표 2에 제시된 바와 같다.
말레이미도 치환도의 잔류비
24시간 후(%) 48시간 후(%) 72시간 후(%)
실시예 1 81.8 63.2 47.4
비교 실시예 3 73.4 42.7 26.0

당해 결과로부터 계산된, 실시예 1의 50% 감소 시간(반감기), 25% 감소 시간 및 70% 감소 시간은 각각 67시간, 33시간 및 94시간이며, 비교 실시예 1의 50% 감소 시간(반감기), 25% 감소 시간 및 70% 감소 시간은 각각 46시간, 23시간 및 64시 간이다.
(2) 개질된 리소자임의 안정성
닭의 난백 리소자임을 인산 완충액(pH 7.4)속에 용해시켜 0.5mM 용액을 제조하고 이를 4℃로 냉각시킨다. 상기 용액에 리소자임으로서 2-이미노티올란 하이드로클로라이드(공급원: Aldrich Chemical Co.)의 몰량의 2.5배를 첨가하고 당해 시스템을 밤새 교반하여 리신 잔기의 측쇄 아미노 그룹을 티올 그룹으로 전환시킨다. 이어서 반응 혼합물에 리소자임으로서 2배 몰 과량의 실시예 1 또는 비교 실시예 3의 말레이미도-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체를 첨가하고 당해 시스템을 3시간 동안 반응시키면서 냉각시킨다. 무기 염을 탈염시킨 후, 여과물을 동결건조시켜 폴리옥시알킬렌 유도체로 개질된 리소자임을 수득한다.
개질된 리소자임의 0.1g 분취액을 칭량하고 10mM 인산 완충액(pH 7.0; 0.1% 메틸 4-하이드록시벤조에이트를 함유함) 20㎖속에 용해시키고, 용액을 40℃에서 보관한다. 규정된 시간 동안 보관한 후 개질된 리소자임의 활성을 다음과 같은 측정한다.
마이크로코커스 리소데이크틱스(Micrococcus lysodeiktics)의 무수 미생물 세포의 적당량과 75mM 인산나트륨(pH 6.2)을 진탕시켜 혼합함으로써, 75mM 인산나트륨 수용액을 대조군으로서 사용하여 640nM에서 1.00의 흡광도를 수득하도록 농도를 조정한 기질 용액을 제조한다. 개질된 리소자임을 정제수속에 용해시켜 리소자임 5 내지 15㎍/g을 함유하는 샘플 용액을 제조한다.
37℃에서 보관한 기질 용액 3.0㎖에 샘플 용액 0.1㎖을 첨가한다. 교반한 후, 640nm에서의 흡광도를 대조군으로서 75mM 인산나트륨 수용액을 사용하여 측정한다. 초기 리소자임 활성을 100으로 하여, 규정된 시간 후의 활성 잔류비(%)를 흡광도로부터 계산한다. 결과는 하기 표 3에 제시한다.
1개월 후(%) 2개월 후(%) 3개월 후(%) 4개월 후(%)
실시예 1 98 91 85 78
비교 실시예 3 80 64 46 31

표 2 및 3에 제시된 결과는 폴리옥시알킬렌 쇄와 말레이미도 말단 그룹 사이에 C2 알킬 그룹을 가지는, 비교 실시예 3의 폴리옥시알킬렌 유도체가 효소의 개질 전 및 후의 안정성에 있어 실시예 1의 화합물보다 불량하다는 것을 입증한다.
본 출원은 2001년 7월 31일자로 출원된 일본 특허원 제JP 2001-231045호에 기초하며, 이의 전문은 본원에서 참조로 인용되며 앞에서 상세히 설명한 바와 같다.
본 발명은, 생물학적 물질 및 약물 전달 시스템을 개질시키는데 유용하며, 저장 안정성이 우수한 고순도 폴리옥시알킬렌 유도체 및 이를 제조하는 방법을 제공한다.

Claims (15)

  1. 화학식 1의 폴리옥시알킬렌 유도체.
    화학식 1
    Figure 112002024805656-pat00008
    상기 화학식에서,
    Z는 2 내지 8개의 하이드록실 그룹을 갖는 화합물의 잔기를 나타내고,
    AO는 탄소수 2 내지 18의 옥시알킬렌 그룹을 나타내며,
    n 및 m은 각각 0 내지 2000의 정수를 나타내며, 단, n 및 m 둘다가 0을 나타내지 않으며,
    a 및 b는 각각 식 2≤a+b≤8 및 1≤b를 만족시키는 정수를 나타내고,
    R은 탄소수 1 내지 30의 탄화수소 그룹을 나타내며,
    X는 탄소수 3 내지 10의 2가 탄화수소 그룹을 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, GPC 순도가 90% 이상이고 말레이미도 그룹 치환도가 90% 이상인 폴리옥시알킬렌 유도체.
  3. 제1항에 있어서, 말레이미도 그룹 치환도 반감기(50% 감소 시간)가 pH 7 및 23℃에서 수행된 가수분해 안정성 시험에서 48시간 이상인 폴리옥시알킬렌 유도체.
  4. 제2항에 있어서, 말레이미도 그룹 치환도 반감기(50% 감소 시간)가 pH 7 및 23℃에서 수행된 가수분해 안정성 시험에서 48시간 이상인 폴리옥시알킬렌 유도체.
  5. 제1항에 있어서, Z가 3 내지 8개의 하이드록실 그룹을 갖는 화합물의 잔기이며 a 및 b가 식 3≤a+b≤8을 만족시키는 폴리옥시알킬렌 유도체.
  6. 제2항에 있어서, Z가 3 내지 8개의 하이드록실 그룹을 갖는 화합물의 잔기이며 a 및 b가 식 3≤a+b≤8을 만족시키는 폴리옥시알킬렌 유도체.
  7. 제3항에 있어서, Z가 3 내지 8개의 하이드록실 그룹을 갖는 화합물의 잔기이며 a 및 b가 식 3≤a+b≤8을 만족시키는 폴리옥시알킬렌 유도체.
  8. 제1항에 있어서, 생물학적 물질을 개질시키는데 사용되는 폴리옥시알킬렌 유도체.
  9. 제1항에 있어서, X가 탄소수 3의 2가 탄화수소 그룹인 폴리옥시알킬렌 유도체.
  10. 제2항에 있어서, X가 탄소수 3의 2가 탄화수소 그룹인 폴리옥시알킬렌 유도체.
  11. 제3항에 있어서, X가 탄소수 3의 2가 탄화수소 그룹인 폴리옥시알킬렌 유도체.
  12. 화학식 3의 아미노-말단화된 폴리옥시알킬렌을 말레산 무수물과 반응시켜 화학식 4의 말레아미드산-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체를 형성시키는 단계,
    화학식 4의 화합물을 화학식 4의 화합물을 기준으로 하여, 50 내지 500용적/중량%의 유기 용매 속에 용해시키는 단계,
    화학식 4의 화합물을 기준으로 하여, 300 내지 5000용적/중량%의 에틸 아세테이트와 n-헥산의 혼합물로부터 화학식 4의 화합물을 결정화시키는 단계 및
    화학식 4의 화합물의 말레아미드산 말단 그룹을 이미드화시키는 단계를 포함하는, 화학식 1의 폴리옥시알킬렌 유도체의 제조방법.
    화학식 1
    Figure 112002024805656-pat00009
    화학식 3
    Figure 112002024805656-pat00010
    화학식 4
    Figure 112002024805656-pat00011
    상기 화학식에서,
    Z는 2 내지 8개의 하이드록실 그룹을 갖는 화합물의 잔기를 나타내고,
    AO는 탄소수 2 내지 18의 옥시알킬렌 그룹을 나타내며,
    n 및 m은 각각 0 내지 2000의 정수를 나타내며, 단, n 및 m이 둘다 0을 나타내지 않으며,
    a 및 b는 각각 식 2≤a+b≤8 및 1≤b를 만족시키는 정수를 나타내고,
    R은 탄소수 1 내지 30의 탄화수소 그룹을 나타내며,
    X는 탄소수 3 내지 10의 2가 탄화수소 그룹을 나타낸다.
  13. 화학식 2의 하이드록실-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체를 시안화 이후 수소화시켜 화학식 3의 아미노-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체로 전환시키는 단계,
    화학식 3의 화합물을 말레산 무수물과 반응시켜 화학식 4의 말레아미드산-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체를 형성하는 단계,
    화학식 4의 화합물을 화학식 4의 화합물을 기준으로 하여, 50 내지 500용적/중량%의 유기 용매 속에 용해시키는 단계,
    화학식 4의 화합물을 기준으로 하여, 300 내지 5000용적/중량%의 에틸 아세테이트와 n-헥산의 혼합물로부터 화학식 4의 화합물을 결정화시키는 단계 및
    화학식 4의 화합물의 말레아미드산 말단 그룹을 이미드화시키는 단계를 포함하는, 화학식 1의 폴리옥시알킬렌 유도체의 제조방법.
    화학식 1
    Figure 112005056476546-pat00012
    화학식 2
    Figure 112005056476546-pat00013
    화학식 3
    Figure 112005056476546-pat00014
    화학식 4
    Figure 112005056476546-pat00015
    상기 화학식에서,
    Z는 2 내지 8개의 하이드록실 그룹을 갖는 화합물의 잔기를 나타내고,
    AO는 탄소수 2 내지 18의 옥시알킬렌 그룹을 나타내며,
    n 및 m은 각각 0 내지 2000의 정수를 나타내며, 단, n 및 m이 둘다 0을 나타내지 않으며,
    a 및 b는 각각 식 2≤a+b≤8 및 1≤b를 만족시키는 정수를 나타내고,
    R은 탄소수 1 내지 30의 탄화수소 그룹을 나타내며,
    X는 탄소수 3 내지 10의 2가 탄화수소 그룹을 나타낸다.
  14. 제12항에 있어서, 화학식 4의 말레아미드산-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체의 말레산 무수물 함량이 0.5중량% 이하인, 화학식 1의 폴리옥시알킬렌 유도체의 제조방법.
  15. 제13항에 있어서, 화학식 4의 말레아미드산-말단화된 폴리옥시알킬렌 유도체의 말레산 무수물 함량이 0.5중량% 이하인, 화학식 1의 폴리옥시알킬렌 유도체의 제조방법.
KR1020020045171A 2001-07-31 2002-07-31 폴리옥시알킬렌 유도체 및 이의 제조방법 KR100658963B1 (ko)

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