KR101001734B1 - 고순도의 메톡시폴리에틸렌글리콜에틸말레이마이드의분석방법 - Google Patents

고순도의 메톡시폴리에틸렌글리콜에틸말레이마이드의분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고순도의 메톡시폴리에틸렌글리콜에틸말레이마이드(Methoxy Polyethylene Glycol Ethylmaleimide, 이하 mPEG-에틸말레이마이드(mPEG-ethylmaleimide))의 순도 및 불순물의 함량을 알 수 있는 분석 방법 및 상기 분석 방법에서 얻어지는 새로운 메톡시폴리에틸렌글리콜 유도체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 분석방법은 보다 구체적으로 mPEG-에틸말레이마이드와 머캅토카르복실산을 반응시켜 HPLC(High Performance Liquid Chloromatography)를 사용하여 분석함으로써 mPEG-에틸말레이마이드의 순도를 결정하는 방법에 관한 것으로 종래의 NMR(Nuclear Magnetic Resosnance) 분석법에 비하여 보다 정확한 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다.
mPEG-ethylmaleimide, 정량분석방법, HPLC

Description

고순도의 메톡시폴리에틸렌글리콜에틸말레이마이드의 분석방법{A New Analyzing Method of Methoxypolyethyleneglycol Ethylmaleimide}
본 발명은 고순도의 메톡시폴리에틸렌글리콜에틸말레이마이드(Methoxy Polyethylene Glycol Ethylmaleimide, 이하 mPEG-에틸말레이마이드(mPEG-ethylmaleimide))의 순도 및 불순물의 함량을 알 수 있는 분석 방법 및 상기 분석 방법에서 얻어지는 새로운 메톡시폴리에틸렌글리콜 유도체에 관한 것이다.
폴리에틸렌글리콜(PEG)은 천연고분자, 합성고분자와 더불어 물분자와 수소 결합을 효과적으로 하는 대표적인 친수성 고분자로 알려져 있다.
또한 많은 유기 용매에 녹는 성질이 있으며, 인체독성이 거의 없는 물질이다. PEG는 물에서 완전히 신장된 형태의 구조를 가지므로 다른 의약품(단백질, 펩타이드, 효소, 유전자 등)과 콘쥬게이션(conjugation)을 시킴으로써 입체장애를 이용하여 의약분자의 독성을 감소시키고, 면역시스템으로부터 보호할 수 있다. 따라서 인체 혈장 내 반감기를 늘이는 방법으로 여러 종류의 의약품에 응용될 수 있다.
또한 약효는 우수하나 독성이 높고, 용해도가 떨어져 인체에 적용하기에 까다로운 의약품과 결합시켜 PEG-드럭(PEG-Drug)의 용해도를 증가시키고 독성을 감소시켜 그 효능을 향상시킬 수 있다.
PEG를 다른 의약품에 도입하기 위해서는 PEG사슬의 말단에 다양한 관능기를 부가하여 의약품과 결합하는 방법이 주로 사용되고 있다.
mPEG-에틸말레이마이드(mPEG-ethylmaleimide) 또한 다양한 의약품과 결합하여 의약품의 용해도와 효능을 증가시키는데 사용되는 물질이다.
종래에 mPEG-에틸말레이마이드(mPEG-ethylmaleimide)는 크게 두 가지 방법에 의해서 얻을 수 있었다. mPEG-에틸말레아믹산(mPEG-ethylmaleamic acid)에서 분리 정제 후 염소화(chlorination)나 에스테르화(esterification) 한 후, 고리화 시키는 방법(반응식 1)과 mPEG-아민(mPEG-amine)에서 MCM(Methoxy Carbonyl Maleimide)을 사용하여 고리화시켜 제조하는 방법(반응식 2)이 일반적이다.
[반응식 1]
Figure 112008051865322-pat00001
[반응식 2]
Figure 112008051865322-pat00002
첫번째 방법으로 제조된 mPEG-에틸말레이마이드(mPEG-ethylmaleimide)는 순도 측정 시 두번째 방법에 비하여 상당히 저하되며, 반응 중 PEG 사슬의 분해가 일어날 수 있기 때문에 최종제품의 분자량 분포도가 증가되는 현상이 발생될 수 있으며, 두번째 방법으로 mPEG-말레이마이드(mPEG-maleimide) 제조 시 현재까지의 방법으로는 정확한 반응 종결점을 예측할 수 없으며, 결정화시 디에틸에테르(Diethyl ether)의 사용으로 상업화공정에 적용할 경우에 인체독성과 폭발의 위험성을 내재하고 있다고 할 수 있다. 또한 최종제품에 제거하기 어려운 부산물(mPEG-amide-imide, mPEG maleamic acid)이 다량 함유될 수 있기 때문에 약물 전달 시스템으로 사용되기에는 어렵다고 할 수 있다.
US6,602,498(Shearwater corporation)에서는 위에서 언급된 두가지 방법에 대하여 설명하고 있으나, 반응의 종결시점에 대한 자세한 반응조건(교반기속도에 의한 반응전환율의 영향 및 분석법)과 경제적으로 상업화에 적용가능한 결정화 방법 및 최종제품에서 함유가능한 부산물의 종류에 대하여 자세히 언급하지 못하고 있다.
US6,875,841(NOF corporation)에서는 메톡시폴리에틸렌글리콜(Methoxy polyethyleneglycol, 이하 mPEG)에서 시안화(Cyanation), 아민화(Amination) 반응 을 진행하여 mPEG-프로필아민(mPEG-propylamine)을 제조한 다음, 무수말레인산(Maleic anhydride)과 반응하여 mPEG-프로필말레아믹산(mPEG-propylmaleamic acid)을 제조하였다. 제조한 mPEG-프로필말레아믹산(mPEG-propylmaleamic acid)을 무수아세트산/아세트산(acetic anhydride/acetic acid) 조건에서 고리화 반응(ring formation)을 진행하여 mPEG-프로필말레이마이드(mPEG-propylmaleimide)를 제조하였다. 제조된 mPEG-프로필말레이마이드(mPEG-propylmaleimide)는 구조적으로 PEG 백본(backbone)과 말레이마이드(maleimide)사이에 3개의 탄소(carbon)를 포함하고 있기 때문에 mPEG-에틸말레이마이드(mPEG-ethylmaleimide)와 구조적으로 차이가 있고, mPEG로부터 4단계(cyanation -> amination -> maleamic acid 제조 -> maleimide ring 도입)로 제조되어 반응단계가 복잡하고 제조되는 공정 중 고압, 고온(>4 MPa, >130 ℃)조건이 포함되어있기 때문에, PEG 사슬의 분해가 일어나 최종제품의 순도가 다른 방법에 비하여 저하된다.
US 6,828,401(SunBio Inc.)에서는 mPEG-에틸말레아믹산(mPEG-ethylmaleamic acid)을 제조한 후, 디이소프로필에틸아민/펜타플루오로페닐트리플루오로아세세이트/DMF(Diisopropylethylamine/Pentafluorophenyl trifluoroacetate/DMF) 조건에서 mPEG-에틸말레이마이드(mPEG-ethylmaleimide)를 제조하지만, 고가의 반응물을 사용하여 상업적으로 제약이 따르고, 또한 불순물이 많이 생성되는 단점이 있다.
고분자 물질은 그 물질의 순도를 분석하기가 상당히 어려우며, 그 방법 또한 많이 알려져 있지 않기 때문에 고가의 의약용으로 적용시 상당한 제약이 있다고 할 수 있다. 또한 위에서 언급된 대부분의 문헌들에서는 합성된 고분자 물질에 대한 정확한 정량분석에 대하여 언급하지 못하고 있다.
한편, KR10-0771100에서는 메톡시폴리에틸렌글리콜에틸아민과 N-메톡시카보닐말레이미드를 반응시켜 mPEG-에틸말레이마이드를 제조하는 과정에서 NMR로 반응종결점을 결정하여 중간체 및 부산물의 생성을 최소로하는 상업적으로 적용가능한 방법을 개발하였다. 그러나 NMR로 최종제품의 순도 및 부산물을 정량하는 방법은 지금까지의 분석기술로는 상당히 큰 오차범위를 가지고 있다고 할 수 있다.
상술한 바와 같이 종래의 알려진 제조방법으로 제조된 mPEG-에틸말레이마이드 생성물은 mPEG-에틸말레이마이드 이외의 불순물을 함유하고 있으나, mPEG-에틸말레이마이드 순도 및 불순물로 함유된 물질의 함량을 정확히 분석하는 방법이 정립되어 있지 않은 실정이다.
본 발명은 종래의 알려진 제조방법으로 제조된 mPEG-에틸말레이마이드 생성물 내의 mPEG-에틸말레이마이드 순도를 액체 크로마토그래피법으로 정확히 결정하는 분석 방법을 제공하는데 목적이 있으며 더 나아가 mPEG-에틸말레이마이드 외에 mPEG-에틸말레이마이드 생성물 내에 함유된 mPEG 유도체의 함량을 측정할 수 있는 분석 방법을 제공하는데 다른 목적이 있다.
또한 본 발명은 상기 분석 방법의 과정에서 생성되는 새로운 구조의 mPEG 유도체를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
일반적인 제조방법에 의하여 제조된 mPEG-에틸말레이마이드는 하기 화학식 2의 mPEG-아마이드-이마이드, 하기 화학식 3의 mPEG-에틸말레아믹산을 포함하며, 통상적으로는 mPEG-OH 및 mPEG-NH2 중 하나 이상을 더 포함하는 혼합물이다.
따라서, 본 발명은 하기 화학식 1의 mPEG-에틸말레이마이드, 하기 화학식 2의 mPEG-아마이드-이마이드, 및 하기 화학식 3의 mPEG-에틸말레아믹산을 함유하는 혼합물로부터 mPEG-에틸말레이마이드의 순도를 결정하는 방법에 관한 것으로 상기 혼합물을 머캅토카르복실산과 반응시켜 mPEG-에틸말레이마이드를 하기 화학식 5의 화합물로 전환한 후 액체 크로마토그래피, 보다 구체적으로는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 통해 화학식 5의 화합물을 분석함으로써 mPEG-에틸말레이마이드의 순도를 결정하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 하기 화학식 5로 표시되는 신규한 mPEG-유도체를 제공한다, 하기 화학식 5의 화합물은 여러 가지 기능기를 포함하고 있어 새로운 물질의 합성에 사용되는 선구물질 또는 의약 분야에 다양하게 적용될 수 있는 장점이 있다.
[화학식 1]
Figure 112008051865322-pat00003
[화학식 2]
Figure 112008051865322-pat00004
[화학식 3]
Figure 112008051865322-pat00005
[화학식 5]
Figure 112008051865322-pat00006
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다. 또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.
본 발명은 하기의 제조단계를 포함하는 mPEG-에틸말레이마이드의 순도 결정 방법을 제공한다.
a) 하기 화학식 1의 mPEG-에틸말레이마이드, 하기 화학식 2의 mPEG-아마이드-이마이드 및 하기 화학식 3의 mPEG-에틸말레아믹산을 포함하는 혼합물과 하기 화학식 4의 머캅토카르복실산을 반응시켜, 하기 화학식 1의 mPEG-에틸말레이마이드가 하기 화학식 5의 화합물로 전환된 머캅토카르복실산 혼합물을 제조하는 단계; 및
b) 상기 머캅토카르복실산 혼합물의 일부를 액체 크로마토그래피로 분석하여 하기 화학식 5의 화합물의 함량으로부터 하기 화학식 1의 mPEG-에틸말레이마이드의 순도를 결정하는 단계.
[화학식 1]
Figure 112008051865322-pat00007
[화학식 2]
Figure 112008051865322-pat00008
[화학식 3]
Figure 112008051865322-pat00009
[화학식 4]
HS-R-COOH
[화학식 5]
Figure 112008051865322-pat00010
[상기 화학식 1 내지 화학식 5에서 n은 3~2500의 정수이고, R은 (C1~C20)알킬렌, (C6~C20)아르(C1~C20)알킬렌, 또는 (C6~C20)아릴렌이거나, N, S, P, Si 또는 O로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원소를 포함하는 (C3~C20)헤테로아릴렌으로부터 선택된다.]
상기 아릴렌은 방향족 고리로서 페닐렌, 나프틸렌, 안트릴렌 또는 비페닐렌(biphenylene) 등을 예로 들 수 있으나 반드시 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 헤테로아릴렌은 헤테로 원소를 1 이상 포함하는 방향족 고리를 의미한다.
상기 화학식 4 내지 화학식 5에서 R은 보다 구체적으로는 (C1~C20)알킬렌 또 는 하기의 구조로부터 선택된다.
Figure 112008051865322-pat00011
[상기 구조에서 m은 1 내지 20의 정수로부터 선택된다.]
상기 화학식 4의 머캅토카르복실산에 포함되는 화합물의 예를 들면, 머캅토프로피온산(mercapto propionic acid), 머캅토페닐아세트산(mercapto phenyl acetic acid), 머캅토니코틴산(mercaptonicotinic acid) 등을 들 수 있다.
상기 a) 단계의 혼합물은 하기 화학식 8의 화합물 및 하기 화학식 9의 화합물로부터 선택되는 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
[화학식 8]
Figure 112008051865322-pat00012
[화학식 9]
Figure 112008051865322-pat00013
[상기 화학식 8 및 화학식 9에서 n은 3~2500의 정수이다.]
또한 상기 a)단계의 혼합물은 종래에 알려진 mPEG-에틸말레이마이드 제조방법에 의해 얻어진 생성물일 수 있으며, 보다 구체적으로는 하기 화학식 8의 mPEG-NH2 및 하기 화학식 10의 N-메톡시카보닐말레이마이드의 반응에 의해 상기 화학식 1의 mPEG-에틸말레이마이드를 제조하는 과정으로부터 수득된 생성물일 수 있다.
[화학식 8]
Figure 112008051865322-pat00014
[화학식 10]
Figure 112008051865322-pat00015
[상기 화학식 8에서 n은 3~2500의 정수이다.]
또한 본 발명은 상기 b) 단계 후,
c) 상기 머캅토카르복실산 혼합물을 가수분해하거나, a) 단계의 출발물질인 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3의 화합물을 포함하는 혼합물을 가수분해하여 상기 화학식 8의 화합물 및 상기 화학식 9의 화합물과 분리되지 않고 있던 화학식 2의 mPEG-아마이드-이마이드를 화학식 3의 mPEG-에틸말레아믹산으로 전환함으로써 mPEG-아마이드-이마이드의 함량을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이하 본 발명을 단계별로 보다 상세히 설명한다.
상기 a)단계는 상기 화학식 1 내지 화학식 3의 화합물, 및 부가적으로 상기 화학식 8 및 화학식 9의 화합물을 포함하는 혼합물에 화학식 4의 머캅토카르복실산을 반응시켜, 하기 화학식 1의 mPEG-에틸말레이마이드가 하기 화학식 5의 화합물로 전환된 머캅토카르복실산 혼합물을 제조하는 단계이다.
상기 화학식 4의 머캅토카르복실산은 화학식 1의 mPEG-에틸말레이마이드와 선택적으로 반응하여 화학식 5의 화합물을 형성한다. 이 때 화학식 2의 mPEG-아마이드-이마이드는 반응하지 않으며, 화학식 3의 mPEG-에틸말레아믹산의 경우에는 반응 조건에 따라 일부 반응하여 디카르복실산(diacid) 형태의 물질을 형성한다. 상기 디카르복실산은 하기 화학식 6 화합물, 하기 화학식 7의 화합물 또는 이들의 혼합물이다.
[화학식 5]
Figure 112008051865322-pat00016
[화학식 6]
Figure 112008051865322-pat00017
[화학식 7]
Figure 112008051865322-pat00018
[상기 화학식 5, 화학식 6 및 화학식 7에서 n은 3~2500의 정수이고, R은 (C1~C20)알킬렌, (C6~C20)아르(C1~C20)알킬렌, 또는 (C6~C20)아릴렌이거나, N, S, P, Si 또는 O로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원소를 포함하는 (C3~C20)헤테로아릴렌으로부터 선택된다.]
a) 단계의 반응을 반응식으로 나타내면 하기 반응식 3과 같다.
[반응식 3]
Figure 112008051865322-pat00019
상기 a) 단계의 반응은 디메틸포름아마이드 및 메틸렌클로라이드의 혼합 용매 하에 수행되는 것이 바람직하다. 또한 용매의 혼합비에 따라 반응속도에 영향을 줄 수 있어 상기 디메틸포름아마이드(a) 및 메틸렌클로라이드(b)의 혼합비는 부피비로 a:b가 1 : 0.1 ~ 10, 보다 좋게는 a: b가 1 : 0.1 ~ 2인 것이 바람직하다. 상기 메틸렌클로라이드의 부피비가 0.1 미만인 경우 반응속도가 지나치게 빨라지게 되며 메틸렌클로라이드 부피비가 10을 초과하는 경우에는 반응속도가 너무 느리게 된다. 보다 정확한 분석 결과를 얻기 위해서는 a:b= 1 : 0.5 ~ 1.5인 것이 더욱 바람직하다.
상기 a) 단계의 반응시간은 10분 내지 2시간, 보다 좋게는 30분 내지 1시간으로 조절하는 것이 좋다. 10분 미만인 경우에는 충분히 반응이 이루어지지 않을 수 있고 2시간을 초과하는 경우에는 반응 시간이 길어서 경제적으로 불리하거나 머캅토카르복실산의 mPEG-에틸말레이마이드와의 반응 선택성이 저하될 수 있다. 반응 온도는 30 내지 50 ℃, 보다 좋게는 40 내지 55 ℃가 바람직하다. 상기 반응온도가 너무 낮으면 반응속도가 저하되고, 너무 높으면 반응속도가 너무 높아 머캅토카르복실산의 mPEG-에틸말레이마이드와의 반응 선택성이 저하될 수 있다.
상기 a)단계 반응에서 상기 머캅토카르복실산의 사용량은 상기 화학식 1 내지 화학식 3의 화합물을 포함하는 혼합물에 대하여 5당량 이상인 것이 반응속도를 일정하게 유지하기 위하여 적절하다. 5당량 미만인 경우에는 머캅토카르복실산 사용량에 따라 반응속도가 느리고 반응속도를 일정하게 조절하기 어렵다. 따라서 머캅토카르복실산의 상한을 둘 필요는 없으나 경제성을 고려하여 10당량 이하인 것이 바람직하다.
상기 b)단계는 a)단계에서 제조된 머캅토카르복실산 혼합물 내에 포함되어 있는 상기 화학식 5의 함량을 액체 크로마토그래피를 사용하여 분석함으로써 화학식 1의 mPEG-에틸말레이마이드의 순도를 결정하는 단계이다.
상기 b)단계에서는 mPEG-에틸말레이마이드의 순도 뿐만아니라 화학식 3의 mPEG-에틸말레아믹산의 함량도 알 수 있다. 이는 반응 조건에 따라 일부 존재하는 화학식 6의 화합물과 화학식 3의 화합물의 합으로부터 결정된다.
상기 b) 단계에서 사용하는 액체 크로마토그래피는 통상적인 액체 크로마토그래피를 사용할 수 있으나, 보다 좋게는 HPLC 방법을 사용하는 것이 바람직하며, 크기-배제 컬럼(size-exclusion column)을 사용하여 분자량에 따른 분리도 가능하게 하여 mPEG-에틸말레이마이드 제조 과정에서 형성된 분자량이 매우 높은 폴리에틸렌글리콜을 분리해 낼 수 있다. 상기 크기-배제 컬럼을 예로 들면 waters사 ultrahydrogel 250, Shodex사 OHpak SB-803HQ, Shodex사 OHpak SB-800HQ series, waters사 ultrahydrogel series 등 폴리메타크릴레이트계 크기-배제 컬럼(polymethacrylate-based size-exclusion column)이 있다.
본 발명에 따른 mPEG-에틸말레이마이드 순도 결정방법은 상기 화학식 2의 mPEG-아마이드-이마이드의 함량을 측정하기 위한 c) 단계를 상기 b)단계후 더 수행할 수 있다.
일반적인 HPLC 방법으로는 mPEG-에틸말레이마이드 혼합물, 특히 화학식 8의 mPEG-NH2나 화학식 9의 mPEG-OH와, 화학식 2의 mPEG-아마이드-이마이드의 분리는 용이하지 않다. 즉 a)단계에서 머캅토카르복실산을 부가하여 반응시키는 과정에서 mPEG-아마이드-이마이드와 mPEG-OH나 mPEG-NH2은 분리되지 않기 때문에 하기 반응식 4에 나타낸 바와 같은 가수분해를 진행하여 mPEG-아마이드-이마이드를 mPEG-에틸말레아믹산으로 전환한 후 미반응 물질(mPEG-OH, mPEG-NH2)의 분석을 진행한다.
[반응식 4]
Figure 112008051865322-pat00020
b)단계에서 측정된 미반응 물질에는 화학식 2의 mPEG-아마이드-이마이드, 화학식 8의 mPEG-NH2 및 화학식 9의 mPEG-OH를 모두 포함하고 있으나, c) 단계의 미반응 물질에는 화학식 8의 mPEG-NH2 및 화학식 9의 mPEG-OH만 포함되므로 b) 단계에서 측정된 미반응 물질의 함량과 c)단계에서 측정된 미반응 물질의 함량의 차이가 화학식 2의 mPEG-아마이드-이마이드의 함량이 된다.
mPEG-아마이드-이마이드의 함량을 결정할 수 있는 또 다른 방법으로는 아래 반응식 5에 나타낸 바와 같이 머캅토카르복실산 부가 반응 전에 상기 화학식 1 내지 화학식 3의 화합물, 및 상기 화학식 8 및 화학식 9의 화합물을 포함하는 혼합물을 가수분해 하여 화학식 1의 mPEG-에틸말레이마이드 및 화학식 2의 mPEG-아마이드 -이마이드를 화학식 3의 mPEG-에틸말레아믹산으로 전환하여 화학식 8 또는 화학식 9의 화합물 또는 이의 혼합물의 함량을 구한다.
[반응식 5]
Figure 112008051865322-pat00021
상기 a)단계에서 머캅토카르복실산을 부가하여 반응시키는 과정에서 mPEG-아마이드-이마이드와 mPEG-OH나 mPEG-NH2은 분리되지 않기 때문에 b)단계에서 머캅토카르복실산 혼합물을 액체크로마토그래피로 분석하는 경우 화학식 2의 mPEG-아마이드-이마이드와, 화학식 8의 mPEG-NH2 및 하기 화학식 9의 mPEG-OH로부터 선택되는 1종 이상이 혼합된 혼합물의 함량이 측정된다. 따라서 b)단계에서 측정된 결과와 상기 머캅토카르복실산 부가 반응 전 혼합물을 가수분해하여 측정된 화학식 8 또는 화학식 9의 화합물 또는 이의 혼합물의 함량의 차이로부터 mPEG-아마이드-이마이드의 함량을 결정할 수 있다.
상술한 본 발명에 따른 분석 방법을 통하여 mPEG-에틸말레이마이드 혼합물 내에 존재하는 mPEG-에틸말레이마이드의 순도를 종래의 NMR 방법에 비해 정확한 값을 얻을 수 있고, mPEG-에틸말레아믹산, mPEG-아마이드-이마이드의 함량을 측정할 수 있으며, 더 나아가 고분자량의 PEG 및 미반응 물질(mPEG-OH, mPEG-NH2)의 함량을 알 수 있다.
상기 분석 방법 중에서 제조되는 화학식 5의 화합물은 신규한 메톡시폴리에틸렌글리콜(mPEG) 유도체이다.
[화학식 5]
Figure 112008051865322-pat00022
상기 화학식 5에서 n은 3~2500의 정수이고, R은 (C1~C20)알킬렌, (C6~C20)아르(C1~C20)알킬렌, 또는 (C6~C20)아릴렌이거나, N, S, P, Si 또는 O로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원소를 포함하는 (C3~C20)헤테로아릴렌으로부터 선택되며, 보다 구체적으로는 (C1~C20)알킬렌 또는 하기의 구조로부터 선택된다.
Figure 112008051865322-pat00023
[상기 구조에서 m은 1 내지 20의 정수로부터 선택된다.]
상기 화학식 5의 화합물은 보다 구체적으로 하기 화학식 11의 화합물을 포함한다.
[화학식 11]
Figure 112008051865322-pat00024
[상기 화학식 11에서 n은 3~2500의 정수이다.]
본 발명에 따른 mPEG-에틸말레이마이드의 순도 결정 방법은 mPEG-에틸말레이마이드 혼합물 내에 존재하는 mPEG-에틸말레이마이드의 순도를 종래의 NMR 방법에 비해 정확한 값을 얻을 수 있고, mPEG-에틸말레아믹산, mPEG-아마이드-이마이드의 함량을 측정할 수 있으며, 더 나아가 고분자량의 PEG 및 미반응 물질(mPEG-OH, mPEG-NH2)의 함량을 알 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 새로운 mPEG-유도체는 여러 가지 기능기를 포함하고 있어 새로운 물질의 합성에 사용되는 선구물질 또는 의약 분야에 다양하게 적용될 수 있는 장점이 있다.
이하에서는, 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는 바, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
[제조예 1]
먼저 상온에서 질소로 치환된 300L 반응기에 NaHCO3 5.13kg, 탈이온수(D/W) 56kg를 투입 후, 반응기 내부 온도를 0 ~ 1℃로 냉각 후, 수평균분자량 5000의 mPEG-NH2 6kg을 투입 후 용해하고, 이어서 N-메톡시카보닐말레이마이드 0.94kg을 투 입 후, 50 rpm에서 1시간 교반하고, 이어서 D/W 52kg를 추가로 투입한 후 1시간 간격으로 NMR로 반응 전환율을 확인하면서 반응을 진행한다.
4.5hr 후 반응 완료 후, 염화메틸렌(MC) 55L를 투입하여, 충분히 교반하여 추출하고, 수용성 층에 생성물이 모두 추출되었는지를 PAA(Polyacrylic acid(Wako, 25%, 8,000 - 12,000 cP(30℃)) 5ml, conc. HCl 10ml 및 H2O 105ml를 혼합하여 30분간 흔들어 제조한다.)용액을 수층 50ml에 0.5ml를 투입하여 수층의 mPEG-Maleimide(5K)의 잔류 여부를 확인한 결과 어떠한 현탁도 발생하지 않아 모든 생성물이 염화메틸렌의 유기 상으로 추출된 것을 확인하였다. 이어서, 분리된 MC층을 D/W 55L로 수세하고, 이어서 물 층의 에멀젼화 현탁 현상이 관찰되어, 분산제로 메탄올 12L 을 추가로 투입하여 완전히 층 분리를 유도하였다. 이어서, PAA 테스트를 실시하여 더 이상 물층에 PEG유도체가 검출되지 않음을 확인하고 층분리를 하고 MC층에 MgSO4 6kg을 투입하여 교반한 후, 여과한다. 유기층의 전체 부피가 10L가 되도록 감압 농축한 다음, -5 ~ 0℃로 미리 냉각한, IPA/헵탄(IPA/Heptane)=21kg/41kg 용액에 적가 후, 교반하여 결정화하였다. 여과하여 얻어진 용매를 포함한 결정성 백색입자(wet cake)에 50L의 MC를 다시 투입하여 완전히 용해시킨 다음, 차콜(Charcoal) 1kg을 투입하여 30min 교반한다. 규조토(Celite)를 사용하여 차콜을 제거한 다음 전체 부피를 10리터가 되게 감압농축한 후 IPA/헵탄(IPA/Heptane)=21kg/41kg 용액에 적가 후, 교반하여 결정화하고 여과 및 건조하여 최종 생성물을 수득하였다. 그 결과 수율은 95몰% 이고, 1H-NMR[(500 MHz, CDCl3) : -CH=CH- 6.71 ppm, PEG backbone 3.45~3.8 ppm, -OCH3 3.29 ppm]로 생성물을 확인하였으며, 하기의 특성을 가지는 생성물을 얻을 수 있었다.
mPEG 에틸렌말레이마이드(by 1H-NMR) : 87.19%, mPEG-아마이드-이마이드(by NMR) : 7.36%, mPEG-말레아믹산(by NMR) : 5.45%.
생성물의 HPLC 분석 결과 mPEG 에틸렌말레이마이드, mPEG-아마이드-이마이드, mPEG-NH2 및 mPEG-OH이 분리되지 않고 혼합물(E-1)로 검출되었으며 함량은93.18%이었고, mPEG 에틸렌말레아믹산(B)이 5.79%, 수평균분자량 10K인 폴리에틸렌글리콜(D)가 1.02%로 나타났다.
[실시예 1] mPEG-에틸렌말레이마이드 및 mPEG-말레아믹산의 함량 분석
Figure 112008051865322-pat00025
250ml 반응기에 제조예 1에서 제조된 mPEG(5K) 에틸렌말레이마이드 혼합물 5g, 3-머캅토프로피온산(3-Mercaptopropionic acid, MPA) 0.53g을 혼합용매(Methylene Chloride 25ml + DMF 25ml)에 용해시킨 후 45~50 ℃에서 30 분간 교반한다. 상온으로 냉각 후 다이에틸이써(diethyl ether) 150ml를 투입하여 10분간 결정화한 다음 여과 및 건조를 진행한다. 건조된 고체를 크기-배제 컬럼(size-exclusion column, SEC)을 사용하여 아래와 같은 분석 조건 하에서 분석하였다.
<분석조건>
Column : Polymethacrylate-based size-exclusion column(제조사 : Waters , 제품명 : Ultrahydrogel 250)
Mobile phase : 5mM Phosphate buffer(pH=7.2)
Detector : Refractive Index
Flow rate : 0.7㎖/min
Injection Volume : 20㎕
Run Time : 30min
Sample 0.5% : 0.01g of sample / 2ml of mobile phase
<분석 결과>
하기 분석 결과에서 %는 중량%를 의미한다.
mPEG(5K) 에틸말레이마이드 MPA 혼합물(MPA 부가 반응 후)
:HPLC 순도(A:1.05%, B: 6.03%, C: 84.46%, D:0.35%, E-2:8.12%)
E-2 : mPEG-아마이드-이마이드, mPEG-NH2 및 mPEG-OH의 혼합물
상기의 결과로부터 MPA 부가 반응에 의해 mPEG-에틸렌말레이마이드는 모두 물질 C로 전환되므로 MPA의 순도는 84.46%인 것을 알 수 있고, mPEG-말레아믹산은 MPA 부가에 의해 일부가 디카르복실산(diacid) 형태의 물질 A로 전환되므로 A+B로부터 7.08%임을 알 수 있다. 그리고 수평균분자량 10K의 고분자량의 PEG(D)의 함량은 0.35%임을 알 수 있다.
[실시예 2] mPEG-아마이드-이마이드의 함량 분석-1
Figure 112008051865322-pat00026
실시예 1의 MPA 부가 반응에 의해서 얻어진 혼합물 2.5g을 100ml 반응기에 투입한 다음 상온에서 증류수 50ml를 투입하여 완전히 용해한다. 반응기에 NaOH 2.5g을 투입한 후, 1hr 동안 교반한다. 반응기에 메틸렌클로라이드(Methylene Chloride) 100ml를 투입한 다음 층 분리를 진행한다. 분리된 메틸렌클로라이드층을 1N HCl 100ml로 산세 후, 증류수 50ml로 세척, MgSO4처리 및 감압증류를 진행한 다음 건조된 고체를 폴리아크릴레이트계 크기 배제 컬럼(polymethacrylate-based size-exclusion column)을 사용하여 실시예 1과 동일조건으로 분석한다.
<분석 결과>
mPEG(5K) 에틸말레이마이드 MPA 혼합물(MPA 부가 반응 후)
:HPLC 순도(A:1.05%, B: 6.03%, C: 84.46%, D:0.35%, E-2:8.12%)
E-2 : mPEG-아마이드-이마이드, mPEG-NH2 및 mPEG-OH의 혼합물
본 실시예 2의 가수분해 후 물질
: HPLC순도(A+B:96.07%, D:0.35%, E-3:3.62%)
E-3 : mPEG-NH2 및 mPEG-OH의 혼합물
상기 가수분해 과정을 통해 물질 C은 물질 A로 전환되고 E-2에 포함되어 있던 mPEG-아마이드-이마이드는 mPEG-에틸말레아믹산(B)로 전환되고, mPEG-NH2 및 mPEG-OH는 가수분해되지 않는다. 따라서, E-3는 mPEG-NH2 및 mPEG-OH의 함량을 나타내며, E-2의 함량과 E-3의 함량의 차이로부터 mPEG-아마이드-이마이드의 함량이 4.5%임을 알 수 있다.
[실시예 3] mPEG-아마이드-이마이드의 함량 분석-2
본 실시예에서는 mPEG-아마이드-이마이드의 함량을 구하는 또 다른 방법을 예시하는 것으로서 제조예 1에서 제조한 mPEG(5K) 에틸렌말레이마이드 혼합물을 가수분해하여 얻어지는 물질의 HPLC 결과와, 실시예 1의 MPA 부가 반응에 의해서 얻어진 혼합물의 HPLC 결과로부터 mPEG-아마이드-이마이드의 함량을 구하는 방법이다.
Figure 112008051865322-pat00027
250ml 반응기에 제조예 1에서 제조한 mPEG(5K) 에틸렌말레이마이드 혼합물 2.5g/순수 50ml에 NaOH 2.5g을 투입한 다음 상온에서 1시간 동안 교반한다. 메틸렌클로라이드(Methylene Chloride) 100ml로 추출한 다음 분리된 메틸렌클로라이드층을 1N HCl 100ml로 산세 후 순수 50ml로 세척후 MgSO4로 처리한다. 진공 건조 후 건조된 고체를 폴리아크릴레이트계 크기 배제 컬럼(polymethacrylate-based size-exclusion column)을 사용하여 실시예 2 와 동일조건으로 분석한다.
<분석 결과>
제조예 1에서 제조한 mPEG(5K) 에틸말레이마이드 혼합물
: HPLC 순도(B:5.79%, D:1.02%, E-1:93.18%)
E-1 : mPEG 에틸렌말레이마이드, mPEG-아마이드-이마이드, mPEG-NH2 및 mPEG-OH의 혼합물
본 실시예 3의 가수분해 후 물질
: HPLC순도(B:95.39%, D:0.25%, E-4:3.52%)
E-4 : mPEG-NH2 및 mPEG-OH의 혼합물
실시예 1의 MPA 부가 반응에 의해서 얻어진 혼합물
:HPLC 순도(A:1.05%, B: 6.03%, C: 84.46%, D:0.35%, E-2:8.12%)
E-2 : mPEG-아마이드-이마이드, mPEG-NH2 및 mPEG-OH의 혼합물
상기 가수분해 과정을 통해 물질 G, F는 물질 B로 전환되고, mPEG-NH2 및 mPEG-OH는 가수분해되지 않으므로 E-4는 mPEG-NH2 및 mPEG-OH의 함량을 나타낸다. 또한 실시예 1의 MPA 부가 반응에 의해서 얻어진 혼합물의 HPLC 결과에서 E-2는 mPEG-아마이드-이마이드, mPEG-NH2 및 mPEG-OH의 혼합물이므로 E-2 함량과 E-4의 함량의 차이로부터 mPEG-아마이드-이마이드의 함량이 4.6%임을 알 수 있다.
[실시예 4]
실시예 1에서의 용매의 부피비 및 반응 시간을 하기 표 1과 같이 조절한 것을 제외하고는 동일하게 MPA 부가 반응을 하여 생성물을 동일한 조건으로 분석하였 으며 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure 112008051865322-pat00028
상기 표 1에서 나타난 바와 같이 mPEG-에틸말레이마이드 혼합물에 대한 MPA부가 반응은 DMF 양이 상대적으로 높은 경우에 반응속도가 증가하는 것으로 보이고 반응속도를 증가시키거나 반응시간을 증가시키면 물질 B가 물질 A 로 전환되고, 또한 E-2에 포함되어 있던 mPEG-아마이드-이마이드 중 일부가 mPEG-에틸말레이마이드로 전환된 다음 물질 C로 전환되기 때문에 분석상 오류가 발생될 여지가 있다. 따라서 단시간에 보다 정확한 분석을 위하여 mPEG-에틸말레이마이드 혼합물에 대하여 MPA는 5당량을 사용하고 반응온도 45~55 ℃, 반응시간 30~60min, 및 용매 50ml(MC:DMF=1:1)의 조건이 매우 바람직하다고 할 수 있다.
[실시예 5]
제조예 1에서 얻어진 생성물(mPEG 에틸렌말레이마이드(by 1H-NMR) : 87.19%, mPEG-아마이드-이마이드(by NMR) : 7.36%, mPEG-말레아믹산(by NMR) : 5.45%.)10g을 음이온교환수지 컬럼을 이용하여 분리, 정제하여 순도 98%(by NMR)이상의 mPEG 에틸렌말레이마이드 5g을 수득하였다. 얻어진 mPEG 에틸렌말레이마이드 5g을 실시 예 2와 동일한 방법으로 3-머캅토프로피온산(3-Mercaptopropionic acid, MPA)을 부가하여 순도 98%(by NMR)의 카르복시에틸 머캅토(mPEG-숙신이미드)(Carboxy ethyl mercapto(mPEG-succinimide), 화합물 C)를 90 Mol%의 수율로 수득하였다.
화합물 C, 1H-NMR(400 MHz, CDCl3) : 3.45~3.90 ppm(m,PEG backbone), 3.4 ppm(s, -OCH3), 3.19 ppm(dd,-C(O)CH 2 -(ring) ,3.15 ppm(m, -S-CH2-),3.00 ppm(m, -S-CH2-), 2.71 ppm(td,-S-CH2 CH 2 C(O)O- ), 2.57 ppm(dd,-C(O)CH 2 -(ring)

Claims (14)

  1. a) 하기 화학식 1의 mPEG-에틸말레이마이드, 하기 화학식 2의 mPEG-아마이드-이마이드 및 하기 화학식 3의 mPEG-에틸말레아믹산을 포함하는 혼합물과 하기 화학식 4의 머캅토카르복실산을 반응시켜 하기 화학식 1의 mPEG-에틸말레이마이드를 하기 화학식 5의 화합물로 전환하여 머캅토카르복실산 혼합물을 제조하는 단계; 및
    b) 상기 머캅토카르복실산 혼합물을 액체 크로마토그래피로 분석하여 하기 화학식 5의 화합물의 함량으로부터 하기 화학식 1의 mPEG-에틸말레이마이드의 순도를 결정하는 단계;
    를 포함하는 mPEG-에틸말레이마이드의 순도 결정 방법.
    [화학식 1]
    Figure 112008051865322-pat00029
    [화학식 2]
    Figure 112008051865322-pat00030
    [화학식 3]
    Figure 112008051865322-pat00031
    [화학식 4]
    HS-R-COOH
    [화학식 5]
    Figure 112008051865322-pat00032
    [상기 화학식 1 내지 화학식 5에서 n은 3~2500의 정수이고, R은 (C1~C20)알킬렌, (C6~C20)아르(C1~C20)알킬렌, 또는 (C6~C20)아릴렌이거나, N, S, P, Si 또는 O로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원소를 포함하는 (C3~C20)헤테로아릴렌으로부터 선택된다.]
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 화학식 4 내지 화학식 5에서 R은 (C1~C20)알킬렌 또는 하기의 구조로부터 선택되는 mPEG-에틸말레이마이드의 순도 결정 방법.
    Figure 112008051865322-pat00033
    [상기 구조에서 m은 1 내지 20의 정수로부터 선택된다.]
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 a) 단계의 반응은 디메틸포름아마이드 및 메틸렌클로라이드의 혼합 용매 하에 수행되는 mPEG-에틸말레이마이드의 순도 결정 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 디메틸포름아마이드(a) 및 메틸렌클로라이드(b)의 혼합비는 부피비로 a:b= 1 : 0.1 ~ 10인 mPEG-에틸말레이마이드의 순도 결정 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 디메틸포름아마이드(a) 및 메틸렌클로라이드(b)의 혼합비는 부피비로 a:b= 1 : 0.5 ~ 1.5인 mPEG-에틸말레이마이드의 순도 결정 방법.
  6. 제 3 항에 있어서,
    상기 머캅토카르복실산의 사용량은 상기 화학식 1 내지 화학식 3의 화합물을 포함하는 혼합물에 대하여 5당량 내지 10당량인 mPEG-에틸말레이마이드의 순도 결정 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 a)단계에서 화학식 3의 mPEG-에틸말레아믹산은 하기 화학식 6의 화합물, 하기 화학식 7의 화합물 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 디카르복실산과, 화학식 3의 mPEG-에틸말레아믹산으로 이루어진 혼합물로 전환되는 mPEG-에틸말레이마이드의 순도 결정 방법.
    [화학식 6]
    Figure 112008051865322-pat00034
    [화학식 7]
    Figure 112008051865322-pat00035
    [상기 화학식 6 및 화학식 7에서 n은 3~2500의 정수이고, R은 (C1~C20)알킬렌, (C6~C20)아르(C1~C20)알킬렌, 또는 (C6~C20)아릴렌이거나, N, S, P, Si 또는 O로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원소를 포함하는 (C3~C20)헤테로아릴렌으로부터 선택된다.]
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 b)단계에서 화학식 3의 화합물, 화학식 6의 화합물 및 화학식 7의 화합물의 함량의 합으로부터 혼합물 내의 mPEG-에틸말레아믹산 함량을 결정하는 mPEG-에틸말레이마이드의 순도 결정 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 a)단계 혼합물은 하기 화학식 8의 화합물 및 하기 화학식 9의 화합물로부터 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 mPEG-에틸말레이마이드의 순도 결정 방법.
    [화학식 8]
    Figure 112008051865322-pat00036
    [화학식 9]
    Figure 112008051865322-pat00037
    [상기 화학식 8 및 화학식 9에서 n은 3~2500의 정수이다.]
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 b) 단계 후,
    상기 머캅토카르복실산 혼합물을 가수분해하거나, a) 단계의 화학식 1, 화학 식 2, 및 화학식 3의 화합물을 포함하는 혼합물을 가수분해하여 상기 화학식 8의 화합물 및 상기 화학식 9의 화합물로 인해 분리되지 않고 있던 화학식 2의 mPEG-아마이드-이마이드를 화학식 3의 mPEG-에틸말레아믹산의 화합물로 전환함으로써 mPEG-아마이드-이마이드의 함량을 결정하는 단계;
    를 더 포함하는 mPEG-에틸말레이마이드의 순도 결정 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 화학식 1 내지 화학식 3의 화합물의 혼합물은 하기 화학식 8의 mPEG-NH2 및 하기 화학식 10의 N-메톡시카보닐말레이마이드의 반응에 의해 상기 화학식 1의 mPEG-에틸말레이마이드를 제조하는 과정으로부터 수득된 생성물인 mPEG-에틸말레이마이드의 순도 결정 방법.
    [화학식 8]
    Figure 112010051509780-pat00038
    [화학식 10]
    Figure 112010051509780-pat00039
    [상기 화학식 8에서 n은 3~2500의 정수이다.]
  12. 하기 화학식 5로 표시되는 메톡시폴리에틸렌글리콜(mPEG) 유도체.
    [화학식 5]
    Figure 112008051865322-pat00040
    [상기 화학식 5에서 n은 3~2500의 정수이고, R은 (C1~C20)알킬렌, (C6~C20)아르(C1~C20)알킬렌, 또는 (C6~C20)아릴렌이거나, N, S, P, Si 또는 O로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원소를 포함하는 (C3~C20)헤테로아릴렌으로부터 선택된다.]
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 화학식 5에서 R은 (C1~C20)알킬렌 또는 하기의 구조로부터 선택되는 메톡시폴리에틸렌글리콜(mPEG) 유도체.
    Figure 112008051865322-pat00041
    [상기 구조에서 m은 1 내지 20의 정수로부터 선택된다.]
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 화학식 5의 화합물은 하기 화학식 11의 화합물인 메톡시폴리에틸렌글리콜(mPEG) 유도체.
    [화학식 11]
    Figure 112008051865322-pat00042
    [상기 화학식 11에서 n은 3~2500의 정수이다.]
KR1020080070180A 2008-06-05 2008-07-18 고순도의 메톡시폴리에틸렌글리콜에틸말레이마이드의분석방법 KR101001734B1 (ko)

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