CN1400232A - 聚氧化烯衍生物及其制备方法 - Google Patents

聚氧化烯衍生物及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1400232A
CN1400232A CN02127153A CN02127153A CN1400232A CN 1400232 A CN1400232 A CN 1400232A CN 02127153 A CN02127153 A CN 02127153A CN 02127153 A CN02127153 A CN 02127153A CN 1400232 A CN1400232 A CN 1400232A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polyoxyalkylene derivative
expression
chemical formula
compound
carbon atoms
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN02127153A
Other languages
English (en)
Inventor
坂上研二
久保和弘
大橋俊輔
伊藤智佳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JAPAN OIL AND GREASE Ltd
Original Assignee
JAPAN OIL AND GREASE Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by JAPAN OIL AND GREASE Ltd filed Critical JAPAN OIL AND GREASE Ltd
Publication of CN1400232A publication Critical patent/CN1400232A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/04—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring from cyclic ethers only
    • C08G65/22—Cyclic ethers having at least one atom other than carbon and hydrogen outside the ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/33331—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing imide group
    • C08G65/33337—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing imide group cyclic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/321—Polymers modified by chemical after-treatment with inorganic compounds
    • C08G65/325—Polymers modified by chemical after-treatment with inorganic compounds containing nitrogen
    • C08G65/3255—Ammonia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/331—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing oxygen
    • C08G65/332—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing oxygen containing carboxyl groups, or halides, or esters thereof
    • C08G65/3324—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing oxygen containing carboxyl groups, or halides, or esters thereof cyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/33303—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing amino group

Abstract

本发明涉及聚氧化烯衍生物及其制备方法，特别是涉及可用于修饰生物物质(如多肽、生理活性蛋白质、酶)和改性药物传递系统(如脂质体和聚合物胶囊)的聚氧化烯衍生物，由化学式(1)表示其中Z是具有2至8个羟基的化合物的残基；AO是具有2至18个碳原子的氧化烯基；n和m各自是0至2000的整数，只要n和m并不都是0；a和b各自是满足下述关系式的整数：2≤a+b≤8和1≤b；R是具有1至30个碳原子的烃基；以及X是具有3至10个碳原子的二价烃基。

Description

聚氧化烯衍生物及其制备方法
本发明所属技术领域
本发明涉及聚氧化烯衍生物及其制备方法，特别是涉及可用于修饰生物物质(如多肽、生理活性蛋白质、酶)和改性药物传递系统(在下文称作DDS)(如脂质体和聚合物胶囊)的聚氧化烯衍生物。
与本发明相关的背景技术
作为一种重要的DDS载体，目前未端修饰的聚氧化烯化合物引起了研究者的关注。特别是，用聚氧化烯化合物对多肽、生理活性蛋白质、酶等的修饰，以及用聚氧化烯化合物对脂质体、聚合胶囊等的修饰产生了这样的效应，如抗原性(免疫反应性)降低、药物稳定性增加，以及在体内滞留时间延长。未端修饰聚氧化烯化合物包括那些含有羧基、醛基、氨基、硫羟基、马来亚氨基(maleimidogroup)等作为未端官能基团的化合物，这些未端官能基团能与肽或蛋白质的侧链官能基(如，赖氨酸残基的氨基、天冬氨酸或谷氨酸残基的羧基、半胱氨酸残基的硫羟基)起反应，或与磷脂或聚合胶囊原料的氨基或羧基起反应。
特别是，用马来亚氨基封端的聚氧化烯化合物对半胱氨酸残基的侧链硫羟基或引入赖氨酸残基的硫羟基的修饰形成硫醚键，该硫醚键比用其它修饰方法形成的其它键更牢固。传统的具有马来亚氨端基的用于修饰的聚氧化烯化合物是通过聚乙二醇或甲氧聚乙二醇和N-羟基琥珀酰亚胺酯(an ester of N-hydroxysuccinimide)和6-马来亚氨基己酸(6-maleimidocaproic acid)等的反应制成。然而，这些聚氧化烯化合物在聚氧化烯键和马来亚氨基之间含有酯键，因而在生物体内容易水解。
在WO 92/16221、WO 98/3887、JP-A-12-191700、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(15)(2000)，pp.8543-8553和Biochem.J.，351(1)(2000)，pp.87-93中所披露的α-马来亚氨基乙氧基-ω-甲氧(聚氧化烯)类似地具有较低的储藏稳定性。
用于医药用途的末端修饰的聚氧化烯化合物应当尽量避免含有比所希望的化合物具有更高分子量的杂质，并且必需具有高度活性的取代基。因此，末端修饰的聚氧化烯化合物具有高的GPC纯度和较高程度的末端活性基团取代。
“合成通讯”(Synthetic Communications，22(16)(1992)，pp.2425-2429)报道了一种制备马来亚氨基封端的聚氧化烯衍生物的方法，这种衍生物在聚氧化烯键和马来亚氨基之间具有一个C2烷基。该报道的方法不能适用于工业化生产，原因是在纯化中间物时使用了大量的具有低燃点的二乙醚。
发明简述
本发明的目的之一是提供一种聚氧化烯衍生物，该聚氧化烯衍生物具有较高的纯度、极好的储藏稳定性，并可用于修饰生物物质。
本发明的另一个目的是提供一种安全地生产较高纯度聚氧化烯衍生物的方法。
本发明提供了一种化学式(I)表示的聚氧化烯衍生物其中Z代表具有2至8个羟基的化合物的残基；AO代表具有2至18个碳原子的氧化烯基；n和m各自代表0至2000之间的一个整数，只要n和m不同时为0；a和b各自代表满足下述关系式的一个整数：2≤a+b≤8和1≤b；R代表具有1至30个碳原子的烃基；以及X代表具有3至10个碳原子的二价烃基。
根据本发明的聚氧化烯衍生物优选具有90％或更高的GPC纯度，并具有90％或更高的马来亚氨基取代率。
在pH7和23℃下进行的水解稳定性试验中，本发明的聚氧化烯衍生物优选具有48小时或更长时间的马来亚氨基取代率半衰期时间(50％减少时间)。
在化学式(I)所表示的聚氧化烯衍生物中，优选那些聚氧化烯衍生物，其中Z是具有3至8个羟基化合物的残基，以及a和b满足下述关系式：3≤a+b≤8，以及1≤b。
根据本发明聚氧化烯衍生物优选用于修饰生物物质。
在化学式(I)所表示的聚氧化烯衍生物中，优选那些聚氧化烯衍生物，其中X是具有3个碳原子的二价烃基。
本发明还提供了另一种制备化学式(I)所表示的聚氧化烯衍生物的方法，包括使化学式(III)所表示的氨基封端的聚氧化烯衍生物：其中Z、AO、n、m、a、b、R、和X如上述所定义，与马来酐起反应，从而形成化学式(IV)所表示的马来酰胺酸封端的聚氧化烯衍生物：
Figure A0212715300102
其中Z、AO、n、m、a、b、R、和X如上述所定义，把化学式(IV)所表示的化合物溶解于50至500体积/重量％(基于化学式(IV)所表示的化合物)的有机溶剂中，从300至5000体积/重量％(基于化学式(IV)所表示的化合物)的乙酸乙酯和正己烷的混合物中结晶化学式(IV)所表示的化合物，并酰亚胺化马来酰胺酸端基。
化学式(III)所表示的氨基封端的聚氧化烯衍生物，优选通过氰化作用接着通过氢化作用从化学式(II)所表示的羟基封端的聚氧化烯衍生物制成：其中Z、AO、n、m、a、b、和R如上述所定义。
根据本发明的方法获得的化学式(IV)所表示的马来酰胺酸封端的聚氧化烯衍生物优选具有重量的0.5％或更少的马来酐含量。发明简述
本发明的一个目的是提供一种聚氧化烯衍生物，该聚氧化烯衍生物具有较高的纯度、极好的储藏稳定性，并可用于修饰生物物质。
本发明的另一个目的是提供一种安全地生产较高纯度聚氧化烯衍生物的方法。
本发明提供了一种化学式(1)表示的聚氧化烯衍生物其中Z是具有2至8个羟基化合物的残基；AO是具有2至18个碳原子的氧化烯基；n和m各自是0至2000的整数，只要n和m并不都是0；a和b各自是满足下述关系式的整数：2≤a+b≤8和1≤b；R是具有1至30个碳原子的烃基；以及X是具有3至10个碳原子的二价烃基。
根据本发明聚氧化烯衍生物优选具有90％或更高的GPC纯度和具有90％或更高的马来亚氨基取代率。
在pH7和23℃下进行的水解稳定性试验中，本发明的聚氧化烯衍生物优选具有48小时或更长时间的马来亚氨基取代率半衰期时间(50％减少时间)。
在化学式(I)所表示的聚氧化烯衍生物中，优选那些聚氧化烯衍生物，其中Z是具有3至8个羟基化合物的残基，以及a和b满足下述关系式：3≤a+b≤8。
根据本发明聚氧化烯衍生物优选用于修饰生物物质。
在化学式(I)所表示的聚氧化烯衍生物中，优选那些聚氧化烯衍生物，其中X是具有3个碳原子的二价烃基。
本发明还提供了一种制备化学式(I)所表示的聚氧化烯衍生物的方法，包括使化学式(III)所表示的氨基封端的聚氧化烯衍生物：其中Z、AO、n、m、a、b、R、和X如上述所定义，与马来酐起反应，从而形成化学式(IV)所表示的马来酰胺酸封端的聚氧化烯衍生物：其中Z、AO、n、m、a、b、R、和X如上述所定义，把化学式(IV)所表示的化合物溶解于50至500体积/重量％(基于化学式(IV)所表示的化合物)的有机溶剂中，从300至5000体积/重量％(基于化学式(IV)所表示的化合物)的乙酸乙酯和正己烷的混合物中结晶化学式(IV)所表示的化合物，并酰亚胺化(imidating)马来酰胺酸端基。
化学式(III)所表示的氨基封端的聚氧化烯衍生物，优选通过氰化作用接着通过氢化作用从化学式(II)所表示的羟基封端的聚氧化烯衍生物制成：
Figure A0212715300131
其中Z、AO、n、m、a、b、和R如上述所定义。
根据本发明的方法获得的化学式(IV)所表示的马来酰胺酸封端的聚氧化烯衍生物优选具有重量的0.5％或更少的马来酐含量。发明详述
依据本发明，聚氧化烯衍生物是特别有利于修饰生物物质。本说明书中所使用的“生物物质”一词是指维持生物体的生命活性所必需的物质，以及与此相关的物质。生物物质包括生理活性物质、结构蛋白质、和磷脂。生物物质进一步包括合成制备的多聚氨基酸，如聚赖氨酸和聚谷氨酸。
生理活性物质包括：含有硫羟基的肽，如谷胱甘肽；生理活性蛋白质，如血红蛋白和胰岛素；酶，如脂肪酶和蛋白酶；以及通过化学修饰或基因重组所获得的肽、蛋白质、和酶。结构蛋白质包括构成生物组织的胶原蛋白和角蛋白。
化学式(I)所表示的聚氧化烯衍生物将详细讨论。
在化学式(I)中，Z是具有2至8个羟基的化合物的残基，优选具有3至8个羟基。具有2至8个羟基的化合物包括乙二醇、丙二醇、丁二醇、甘油、双甘油、三甘油、四甘油、戊甘油、六甘油、和季戊四醇。较好的是乙二醇、甘油、双甘油、六甘油、和季戊四醇。更好的是甘油、双甘油、六甘油、和季戊四醇。
AO所表示的具有2至18个碳原子的氧化烯基包括氧化乙烯基、氧化丙烯基、氧化丁烯基、氧化四亚甲基、氧化苯乙烯基、氧化十二碳烯基、氧化十四碳烯基、氧化十六碳烯基、和氧化十八碳烯基。较好的是具有2至4个碳原子的氧化烯基，更好的是氧化乙烯基。
n和m各自是加入的氧化烯基(AO)的摩尔数，各自的范围是从0至2000，只要n和m不同时为0。n和m各自的优选范围是从20至2000，特别是40至1000。n和m之和的优选范围是从20至1200，特别是40至400。
a和b各自表示聚氧化烯链的数目，满足下述关系式：2≤a+b≤8且1≤b，优选3≤a+b≤8且1≤b。通过修饰可抑制生物物质结合免疫系统，而用具有两个或更多聚氧化烯链的聚氧化烯衍生物修饰生理活性物质产生了理想的修饰效果，并且没有损害生理活性。用具有两个或更多马来亚氨端基的聚氧化烯衍生物修饰生理活性物质导致分子量的增加，其在抑制结合免疫系统方面是更有效的。
n、m、a、和b是确定聚氧化烯衍生物的整个分子量的系数。它们满足下述关系式：1≤(n×a+m×b)≤16,000，较好的是满足20≤(n×a+m×b)≤5,000，优选是满足40≤(n×a+m×b)≤1,200。当满足这些关系式，化学式(I)的聚氧化烯衍生物的分子量是在250至700,000的范围内，较好的是在1000至200,000的范围内，优选是在2000至50,000的范围内。
R表示的具有1至30个碳原子的烃基包括脂族烃基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、庚基、2-乙基己基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、异十三烷基、十四烷基、十六烷基、异十六烷基、十八烷基、异十八烷基、十八碳烯基、二十烷基、二十二烷基、和二十四烷基；芳烃基，如苄基、羟甲苯基、丁基苯基、二丁基苯基、辛基苯基、十二烷基苯基、二辛基苯基、二壬基苯基、萘基、苯乙烯苯基、对甲氧基苄基、和三苯甲基。较好的是甲基、乙基、叔丁基、十八烷基、苄基、对甲氧基苄基、和三苯甲基。优选的是甲基、叔丁基、和苄基。
X所表示的具有3至10个碳原子的二价烃基，包括直链或支链烃基，如三亚甲基、异丙烯、四亚甲基、异丁烯、二甲基亚甲基、1.5-亚戊基、1，6-亚己基、七亚甲基、1，8-亚辛基、1，9-亚壬基、和1，10-亚癸基；芳烃基，如苯亚甲基。较好的是三亚甲基、四亚甲基、1.5-亚戊基、1，6-亚己基、七亚甲基、1，8-亚辛基、1，9-亚壬基、和1，10-亚癸基。优选的是三亚甲基、1，6-亚己基、七亚甲基、1，8-亚辛基、1，9-亚壬基、和1，10-亚癸基。
在对含有羟基的化合物进行氰化作用时，从纯度和产率的角度看，包括丙烯腈加成的氰乙基化作用是一种极好的方法。一种氰乙基化的化合物被引到含有3个碳原子的二价烃基化合物。从这个角度看，化学式(I)的聚氧化烯衍生物是优选的聚氧化烯衍生物，其中X是含有3个碳原子的二价烃基。
在另一方面，化学式(I)的聚氧化烯衍生物(其中X是含有6至10个碳原子的二价烃基)在水解稳定性方面具有优越性，因而在通过修饰生物物质开发药物制剂时优选用于保证特性相当。
在应用于药物制剂时，需要聚氧化烯衍生物具有高纯度，以满足制剂均一性和与生物物质反应性的要求。从制剂均一性的方面看，聚氧化烯衍生物特别需要具有高GPC纯度，相对于分子量是所指化合物的二倍、三倍等的化合物的含量，它是色谱纯。
根据本发明，聚氧化烯衍生物较好具有至少90％的GPC纯度，优选是95％或更高。
GPC纯度是在下述条件下用凝胶渗透色谱法(GPC)进行测量。
柱：一系列的三柱SHODEX KF804L(内径：8mm；高度：30cm；可从Showa Denko K.K.获得)
洗脱液：四氢呋喃
流速：1.0毫升/分钟
柱温度：40℃
检测器：差示折光计
试样：0.1％(重量百分数)的四氢呋喃溶液
填充量：100μl
在峰是分离的情况下，峰是在顶点之间的最低点被竖直地分开。在峰有肩峰的情况下，是在拐点被竖直地分开。主峰的面积比是从分离的子峰的面积计算而来。
为了确保与生物物质有足够的反应性，聚氧化烯衍生物优选具有高程度的马来亚氨基(活性端基)取代。在较低程度的活性端基取代时，所希望的修饰生物物质的生产率将降低，这将导致制剂性能的降低，如在血液中滞留时间的减少。用于修饰生物物质的聚氧化烯衍生物优选具有90％或更高、特别是92％或更高的马来亚氨基(官能端基)取代程率。
马来亚氨基取代率的测量如下：对溶解于0.55毫升含氘氯仿中的重量在15和20毫克之间的试样，用ECP 400(由JEOL有限公司提供)，在400MHz处进行1H-NMR(核磁共振)分析。从NMR谱获得归因于马来亚氨基(δ6.69，s)的峰，归因于原料(马来酰胺酸端基的聚氧化烯衍生物)(δ6.35，dd)的峰、归因于反应中间产物(δ7.22和6.62，d)的峰的积分。归因于马来亚氨基的峰面积和总积分面积的百分比看作是马来亚氨基取代率。
与生物物质的反应通常是在缓冲溶液中进行。因而，聚氧化烯衍生物在缓冲溶液中需要具有极好的水解稳定性。如果不是这样，聚氧化烯衍生物在缓冲溶液中将发生水解，从而对生物物质仅获得低程度的修饰，进而不能产生足够的修饰效应。在这种情况下，聚氧化烯衍生物将不得不大量过量使用，以获得足够的修饰效应。
用来修饰生物物质的聚氧化烯衍生物的水解稳定性是如此，因而在水解稳定性试验(pH7和23℃)中马来亚氨基取代率的半衰期时间(50％减少时间)是48小时或更长，较好是54小时或更长，优选是60小时或更长。在水解稳定性试验中，聚氧化烯衍生物较好具有24小时或更长时间的25％减少时间和67小时或更长时间的70％减少时间，最好具有27小时或更长时间的25％减少时间和75小时或更长时间的70％减少时间。
水解稳定性试验按照下述方法进行。在50毫升螺旋玻璃瓶中，把重量为0.02克的试样化合物溶解于20毫升的50mM磷酸缓冲液(pH7)中，并使其在23℃静置。在24小时、48小时、或72小时后，从溶解的溶液中得到的4毫升等分试样与几滴1％磷酸水溶液进行混合并冷冻干燥。得到的固体溶解于氯仿中，并过滤除去不溶物质。在蒸发器中浓缩滤液以制得试样，用1H-NMR分析试样从而确定马来亚氨基取代率。在每个测量时间的马来亚氨基取代率除以初始的马来亚氨基取代率，再乘以100，从而得到马来亚氨基的残余率(％)。残余率是75％、50％(一半)、和30％的时间被分别看作是25％减少时间、50％减少时间(半衰期时间)、和70％减少时间。在纵坐标上标出24、48、和72小时后的残余率，并以时间为横坐标可得到截距为100的一个回归线，然后基于该回归线计算残余率是75％、50％、和30％的时间，从而获得25％减少时间、50％减少时间(半衰期时间)、和70％减少时间。
根据本发明，聚氧化烯衍生物可从化学式(III)表示的氨基封端的聚氧化烯衍生物制成。从纯度的角度看，该方法优选从化学式(II)表示的羟基封端的聚氧化烯衍生物开始。该方法通过下述示意图加以说明。
步骤[A]包括在存在碱催化剂下羟基封端的聚氧化烯衍生物(II)的氰化作用和之后的氢化作用，从而形成氨基封端的聚氧化烯衍生物(III)。氰化作用是通过加入如丙烯腈或含腈基的二价烃(含有3至10个碳原子)的卤化物来完成。所获氰化物的氢化作用产生化合物(III)，该化合物在聚氧化烯链和氨端基之间具有含有3至10个碳原子的二价烃基。作为氰化剂的卤化物较好是溴化物、氯化物、或碘化物，优选是氯化物或溴化物。
氰化作用优选在水或能够溶解起始化合物(II)的有机溶剂中进行。适合的有机溶剂包括氯仿、甲苯、乙腈、和二甲基甲酰胺，优选甲苯和乙腈。基于化合物(II)，溶剂使用的量是50至500体积/重量％，优选70至300体积/重量％。
可用于氰化作用的碱催化剂包括：强碱性金属氢氧化物，如氢氧化钾和氢氧化钠；和强碱性醇化物，如甲醇钠。基于化合物(II)，催化剂使用的量是0.5至25％(重量)，优选3至10％(重量)。
基于化合物(II)的每羟基当量，氰化剂，如丙烯腈，其优选的使用量是1至100当量，特别是10至60当量。
优选地，氰化反应在-20℃至150℃下进行，特别是0至100℃，时间是1至10小时，特别是2至6小时。在反应后，通过用水洗涤或吸附处理除去催化剂，并除去溶剂，从而得到聚亚氧烷基氰化物(polyoxyalkylene cyanide)。
然后，在通常用于氢化作用的催化剂的存在下对获得的氰化物进行氢化，从而制得氨基封端的聚氧化烯衍生物(III)。氢化反应优选在能够溶解氰化物的有机溶剂中进行，如甲苯或乙醇。特别优选的是甲苯。基于聚亚氧烷基氰化物，溶剂的使用量是50至500体积/重量％，优选70至300体积/重量％。
适用于氢化作用的催化剂包括镍和钴，优选的是镍。基于聚亚氧烷基氰化物，催化剂的使用量优选是0.5至25％(重量)，特别是1至10％(重量)。在应用镍催化剂时，建议加入氨气以阻止在氢化作用过程中发生不希望的副反应。基于聚亚氧烷基氰化物，氨气的加入量优选是5至30％(重量)，特别是10至20％(重量)。
氢化反应优选在1至10MPa的氢气压下进行，特别是3至6MPa，温度为80至200℃，特别为100至150℃，反应时间为0.5至10小时，特别为1至5小时。反应后，过滤除去催化剂，并除去溶剂，从而得到氨基封端的聚氧化烯衍生物(III)。
如果需要的话，可通过结晶、吸附、或类似步骤纯化在步骤[A]制得的聚亚氧烷基氰化物和化合物(III)。
步骤[B]包括使在步骤[A]制得的化合物(III)与马来酐起反应，从而得到化学式(IV)的马来酰胺酸封端的聚氧化烯。
氨基封端的聚氧化烯衍生物(III)的胺纯度较好为90％或更高，优选为95％或更高。如果胺纯度较低，在步骤[C]的环化作用就不会有效进行，进而导致最终产物(化学式(I)的聚氧化烯衍生物)的较低的马来亚氨基取代率。
可在下述条件下，通过液相层析法测定胺纯度。
柱：TSKgel SP-5PW(内径：7.5mm；长度：7.5cm，可从Tosoh公司获得)
洗脱液：2mM磷酸缓冲液(pH6.5)
流速：0.5毫升/分钟
柱温度：40℃
探测器：差示折光计
试样：在2mM磷酸缓冲液(pH6.5)中的0.5％(重量百分数)溶液
填充量：20μl
在峰是分离的情况下，峰是在顶点之间的最低点处竖直地被分开。在峰有肩峰的情况下，峰是在转折点处被竖直地分开。主峰的面积比是从分开的子峰的面积进行计算。
在进行反应时，化合物(III)是优选溶解于能够溶解化合物(III)的有机溶剂中，优选氯仿或甲苯。基于化合物(III)，溶剂的使用量是50至500体积/重量％，优选70至300体积/重量％。优选地，马来酐的使用量，基于化合物(III)的每氨基当量，是1.0至20当量，特别是5至15当量。反应温度较好为20至80℃，优选为40至60℃。反应时间优选是0.5至10小时，特别是1至5小时。
形成的马来酰胺酸封端的聚氧化烯衍生物(IV)溶解于能够溶解化合物(IV)的有机溶剂中，并通过使用乙酸乙酯和正己烷的混合物进行结晶。
用于化合物(IV)的有机溶剂较好包括氯仿、甲苯、乙腈、和二甲基甲酰胺，优选的是氯仿和甲苯。基于化合物(IV)，有机溶剂的用量为50至500体积/重量％，优选为70至300体积/重量％。
基于化合物(IV)，乙酸乙酯/正己烷混合溶剂的用量为300至5000体积/重量％，优选为500至2000体积/重量％。乙酸乙酯与正己烷的体积混合比是1∶9至9∶1，优选4∶6至6∶4。
在结晶步骤，化合物(IV)溶解于有机溶剂的温度较好为0至80℃，优选为20至40℃。加入乙酸乙酯/正己烷混合溶剂至化合物(IV)进行结晶所溶解的有机溶剂时，温度优选为20至35℃。乙酸乙酯和正己烷可分别加入。结晶可重复进行。
我们所期望的是，形成的马来酰胺酸封端的聚氧化烯衍生物(IV)具有0.5％(重量百分数)或更少的马来酐含量，特别是0.1％(重量百分数)或更少。在化合物(IV)中的较高的马来酐含量可导致形成比所希望的分子量具有更大分子量的杂质，进而导致GPC纯度的降低。
对15至20毫克的试样化合物在0.55毫升含氘氯仿中溶液，用ECP 400(由JEOL有限公司提供)，在400MHz处进行1H-NMR分析，从而可以确定马来酐含量。通过与标准峰比较(如，归因于甲氧基的峰作为标准；δ3.38，s，3H)，从形成的NMR谱可获得归因于马来酐的峰(δ7.05，s，2H)的积分，进而依据下述方程计算马来酐含量：
马来酐含量(重量百分数)＝[(积分/2)×98/马来酰胺酸封端的聚氧化烯的分子量]×100
步骤[C]包括化合物(IV)的末端马来酰胺酸的环化作用(酰亚胺化)，以生成聚氧化烯衍生物(I)。
环化反应按下述条件进行：把化合物(IV)溶解于(基于化合物(IV))5至1000％(重量)、优选100至500％(重量)的乙酸酐中，并加入(基于化合物(IV))1至50％(重量)、优选5至40％(重量)的催化剂如乙酸钠或三乙胺，把反应系统在60℃到130℃之间的某一温度加热。如果需要的话，可使用有机溶剂。有用的有机溶剂包括氯仿、乙腈、和甲苯。基于化合物(IV)，有机溶剂的用量为50至500体积/重量％、优选为70至300体积/重量％。
反应后，过滤除去催化剂，并在60至130℃和减压下浓缩滤液。把浓缩液溶解于有机溶剂中，并在溶液中加入乙酸乙酯/正己烷混合液，以析出晶体，过滤收集晶体并干燥，从而制成所希望的化合物(I)。
有机溶剂优选包括氯仿和甲苯。基于化合物(I)，有机溶剂的用量为50至500体积/重量％、优选为70至300体积/重量％。
基于化合物(I)，乙酸乙酯/正己烷混合溶剂的用量为300至5000体积/重量％、优选为500至2000体积/重量％。乙酸乙酯与正己烷的体积混合比是1∶9至9∶1，优选4∶6至6∶4。乙酸乙酯和正己烷可分别加入。结晶可重复进行。
可用以下的方法完成利用本发明的聚氧化烯衍生物修饰生物物质。例如，生物物质溶解于磷酸缓冲液并冷却至10℃或更低。把马来亚氨基封端的聚氧化烯化合物加入冷却的溶液中，接着搅拌1至10小时。对反应系统进行脱盐并冷冻干燥，从而得到聚氧化烯衍生物修饰的生物物质。
本发明的聚氧化烯衍生物具有较高的纯度，并且由于其马来亚氨基部分的稳定性而具有极好的储藏稳定性。因而，当其用于修饰生物物质时，生成的经由聚氧化烯衍生物修饰的生物物质也表现出极好的稳定性。依据本发明该方法可安全地制成所期望的高纯度聚氧化烯衍生物。用本发明的聚氧化烯衍生物修饰或改性的生物物质具有良好的稳定性和应用性。
参照下述实施例，将对本发明进行更详细的说明。
实施例1氰化作用：
在3升四颈烧瓶(装备有搅拌器、滴液漏斗、温度计、和氮气泡管)中放入640克化学式(II)的甲氧聚氧化乙烯(methoxypolyoxyethylene)，其中n+m＝112、a＝1、和b＝1(MEH-50H，可从NOF公司获得)，加入640克离子交换水以溶解化合物。溶液冷却至10℃或更低，并加入40克50％的氢氧化钾。溶液进一步冷却至5℃或更低，并经过2小时滴入340克的丙烯腈，同时保持液体温度至5℃或更低。滴加完毕后，持续搅拌2小时。反应完毕后，通过加入24克85％的磷酸中和反应混合物。在842克的反应混合物中加入500克的氯化钠在2800克离子交换水中的溶液，用1000毫升的氯仿提取混合物。分离氯仿层，并用500毫升的氯仿再次提取水层。过滤合并的氯仿提取液，并在90℃和减压(0.3kPa)下除去溶剂，从而得到640克粗制的氰乙基化的甲氧聚氧化乙烯。
在一个装备有搅拌器和氮气密封管的10升烧杯中放入600克上述的粗制氰乙基化的甲氧聚氧化乙烯并加入500毫升的氯仿溶解。把4升乙酸乙酯和4升正己烷的混合液加入溶液中，接着搅拌30分钟，以析出晶体，并过滤收集。通过使用400毫升的氯仿和另一份乙酸乙酯(4升)和正己烷(4升)的混合液进行重复结晶。干燥生成的晶体，从而获得540克氰乙基化的甲氧聚氧化乙烯。胺化作用：
在一个装置有搅拌器、温度计、氮气引入管、氢气引入管、和氨引入管的1升高压釜中放入200克氰乙基化的甲氧聚氧化乙烯、400克甲苯、和4克镍催化剂。将高压釜用氮气驱气后，加热混合物至60℃以溶解化合物。把30克氨气引入溶液中，然后引入氢气至4MPa。将高压釜的温度上升至130℃，并搅拌混合物3小时。在高压釜冷却至80℃后，过滤除去催化剂，并在90℃和低压(0.3kPa)下1小时，除去溶剂，从而获得170克甲氧聚氧化乙烯丙胺，其胺纯度为95.2％。马来酰亚胺化作用：
在一个装备有搅拌器、温度计、冷凝器、和氮气泡管的1升四颈烧瓶中放入164克甲氧聚氧化乙烯丙胺和325毫升甲苯并加热至50℃，从而制成溶液。在溶液中加入32克马来酐，接着搅拌4小时。反应混合物冷却至40℃，并加入800毫升乙酸乙酯和800毫升己烷的混合液，接着搅拌30分钟，以析出晶体。过滤收集的晶体再次溶解于325毫升甲苯中，并加入800毫升乙酸乙酯和800毫升己烷的混合液，接着搅拌30分钟，以析出晶体。对过滤收集的晶体进行干燥，从而获得167克甲氧聚氧化乙烯丙基马来酰胺酸，其马来酐含量为0.0011％(重量百分数)。
在一个装备有搅拌器、温度计、冷凝器、和氮气泡管的1升四颈烧瓶中加入167克生成的甲氧聚氧化乙烯丙基马来酰胺酸、500毫升乙酸酐、和64克乙酸钠。加热混合物至90℃，并在该温度搅拌3小时，以进行反应。在冷却至50℃后，过滤反应混合物以除去乙酸钠，并在90℃和低压(0.3kPa)下浓缩滤液。浓缩液溶解于330毫升的氯仿中，并过滤除去任何不溶物质。把1升乙酸乙酯和1升己烷的混合物加入滤液中，接着搅拌30分钟以析出晶体，并过滤收集。将晶体再次溶解于330毫升的氯仿中，并通过搅拌30分钟后从另一份乙酸乙酯(1升)和己烷(1升)的混合物中再次结晶。对过滤收集的晶体进行干燥，从而获得160克甲氧聚氧化乙烯丙基马来酰胺酸，它是一种浅桃红晶体。
实施例2氰化作用：
在一个装备有搅拌器、滴液漏斗、温度计、和氮气泡管的5升四颈烧瓶中放入1600克化学式(II)的聚乙二醇，其中a＝0、m＝113、且b＝2(PEG 11000，可从NOF公司获得；分子量：10000)，加入1600克离子交换水以溶解该化合物。溶液冷却到10℃或更低，并加入100克50％的氢氧化钾。溶液进一步冷却至5℃或更低，并经过2小时滴入850克的丙烯腈，同时保持液体温度在5℃或更低。滴加完毕后，持续搅拌2小时。反应完毕后，通过加入60克85％的磷酸来中和反应混合物。用1250克氯化钠溶解在7000克离子交换水中所形成的溶液、2500毫升氯仿、和1250毫升氯仿，以与实施例1同样的方式对反应混合物进行处理，从而获得1600克粗制的二氰乙基化的聚氧化乙烯。
在一个装备有搅拌器和氮气密封管的30升烧杯中放入粗制的二氰乙基化的聚氧化乙烯(1600克)并用1.4升的氯仿溶解。把11.1升乙酸乙酯和11.1升己烷的混合液加入溶液中，接着搅拌30分钟，以析出晶体，并过滤收集。晶体再次溶解于1.4升的氯仿中，并加入另一份乙酸乙酯(11.1升)和正己烷(11.1升)的混合物，接着搅拌。如此析出的晶体通过过滤收集并干燥，从而获得1400克二氰乙基化的聚氧化乙烯。胺化作用：
在一个装置有搅拌器、温度计、氮气引入管、氢气引入管、和氨引入管的1升高压釜中放入200克二氰乙基化的聚氧化乙烯、400克甲苯、和9克镍催化剂。使混合物进行反应，并以与实施例1同样的方式进行处理，从而获得170克聚氧化乙烯二丙胺，其胺纯度为93.7％。马来酰亚胺化作用：
在一个装备有搅拌器、温度计、冷凝器、和氮气泡管的1升四颈烧瓶中放入164克聚氧化乙烯二丙胺和325毫升甲苯并加热至50℃，从而制成溶液。在溶液中加入32克马来酐，接着搅拌4小时。反应混合物冷却至40℃，并加入800毫升乙酸乙酯和800毫升己烷的混合液，接着搅拌30分钟，以析出晶体。过滤收集的晶体再次溶解于325毫升甲苯中，并加入800毫升乙酸乙酯和800毫升己烷的混合液，接着搅拌30分钟，以析出晶体。对过滤收集的晶体进行干燥，从而获得165克聚氧化乙烯二丙基马来酰胺酸，其马来酐含量为0.0018％(重量百分数)。
在一个装备有搅拌器、温度计、冷凝器、和氮气泡管的1升四颈烧瓶中加入165克生成的聚氧化乙烯二丙基马来酰胺酸、500毫升乙酸酐、和63克乙酸钠。加热混合物至90℃，并在该温度搅拌3小时，以进行反应。在冷却至50℃后，过滤反应混合物以除去乙酸钠，并在90℃和减压(0.3kPa)下浓缩滤液。浓缩液溶解于360毫升的氯仿中，并过滤除去任何不溶物质。把1升乙酸乙酯和1升己烷的混合物加入滤液中，接着搅拌30分钟以析出晶体，并过滤收集。晶体再次溶解于360毫升的氯仿中，并通过搅拌30分钟从乙酸乙酯(1升)和己烷(1升)的混合物中再次结晶。对过滤收集的晶体进行干燥，从而提供160克聚氧化乙烯二丙基马来酰亚胺，它是一种浅桃红晶体。
实施例3氰化作用：
在一个装备有搅拌器、滴液漏斗、温度计、和氮气泡管的5升四颈烧瓶中放入1600克化学式(II)的四(聚氧化乙烯)双甘油醚，其中a＝0、m＝56、且b＝4(DGE-11000，可从NOF公司获得；分子量：10000)，加入1600克离子交换水以溶解该化合物。溶液冷却到10℃或更低，并加入100克50％的氢氧化钾。溶液进一步冷却至5℃或更低，并经过2小时滴入850克的丙烯腈，同时保持液体温度在5℃或更低。滴加完毕后，持续搅拌2小时。反应完毕后，通过加入60克85％的磷酸中和反应混合物。用1250克氯化钠在7000克离子交换水中的溶液、2500毫升氯仿、和1250毫升氯仿，以与实施例1同样的方式对反应混合物进行处理，从而获得1600克粗制的四氰乙基化的四(聚氧化乙烯)双甘油。
在一个装备有搅拌器和氮气密封管的30升烧杯中放入粗制的四氰乙基化的四(聚氧化乙烯)双甘油(1600克)并溶解于1.4升的氯仿中。把11.1升乙酸乙酯和11.1升己烷的混合液加入溶液中，接着搅拌30分钟，以析出晶体，并过滤收集。晶体再次溶解于1.4升的氯仿中，并加入另一份乙酸乙酯(11.1升)和正己烷(11.1升)的混合物，接着搅拌30分钟以析出晶体。生成的晶体通过过滤收集并干燥，从而获得1400克四氰乙基化的四(聚氧化乙烯)双甘油。胺化作用：
在一个装置有搅拌器、温度计、氮气引入管、氢气引入管、和氨引入管的1升高压釜中放入200克四氰乙基化的四(聚氧化乙烯)双甘油、400克甲苯、和9克镍催化剂。使混合物进行反应，并以与实施例1同样的方式进行处理，从而获得170克四(聚氧化乙烯)双甘油四丙胺，其胺纯度为93.1％。马来酰亚胺化作用：
在一个装备有搅拌器、温度计、冷凝器、和氮气泡管的1升四颈烧瓶中放入164克四(聚氧化乙烯)双甘油四丙胺和325毫升甲苯并加热至50℃，从而制成溶液。在溶液中加入64克马来酐，接着搅拌4小时。反应混合物冷却至40℃，并加入800毫升乙酸乙酯和800毫升己烷的混合液，接着搅拌30分钟，以析出晶体。过滤收集的晶体再次溶解于325毫升甲苯中，并加入800毫升乙酸乙酯和800毫升己烷的混合液，搅拌混合物30分钟，以析出晶体。对过滤收集的晶体进行干燥，从而获得167克四(聚氧化乙烯)双甘油四丙基马来酰胺酸，其马来酐含量为0.025％(重量百分数)。
在一个装备有搅拌器、温度计、冷凝器、和氮气泡管1升四颈烧瓶中加入167克生成的四(聚氧化乙烯)双甘油四丙基马来酰胺酸、500毫升乙酸酐、和63克乙酸钠。加热混合物至90℃，并在该温度搅拌3小时，以进行反应。在冷却至50℃后，过滤反应混合物以除去乙酸钠，并在90℃和减压(0.3kPa)下浓缩滤液。浓缩液溶解于360毫升的氯仿中，并过滤除去任何不溶物质。把1升乙酸乙酯和1升己烷的混合物加入滤液中，接着搅拌30分钟以析出晶体，并过滤收集。晶体再次溶解于360毫升的氯仿中，并通过搅拌30分钟从乙酸乙酯(1升)和己烷(1升)的混合物中再次结晶。对过滤收集的晶体进行干燥，从而提供162克四(聚氧化乙烯)双甘油四丙基马来酰亚胺，它是一种浅桃红色晶体。比较实施例1
通过在文献(“合成通讯”，Synthetic Communications，22(16)(1992)，pp.2425-2429)中所披露的方法，从甲氧聚氧化乙烯丙胺(分子量：5000)合成了甲氧聚氧化乙烯乙基马来酰亚胺。
用与实施例1相同的材料和相同的方法，通过氰化作用和胺化作用制成起始的甲氧聚氧化乙烯丙胺。生成的甲氧聚氧化乙烯丙胺的胺纯度为96.8％。
在50毫升的烧瓶中加入2.5克甲氧聚氧化乙烯丙胺、460毫克马来酐、和10毫升二氧杂环己烷，并通过在80℃搅拌30分钟使其反应。冷却后，把500毫升二乙醚加入反应混合物，使混合物静置过夜以析出晶体，过滤收集晶体，用二乙醚洗涤并真空干燥，从而获得甲氧聚氧化乙烯丙基马来酰胺酸，其马来酐含量为0.086％(重量百分数)。
在50毫升的烧瓶中放入生成的甲氧聚氧化乙烯丙基马来酰胺酸、20毫升乙酸酐、和1.0克乙酸钠，在100℃搅拌混合物45分钟以引导进行反应。冷却后，蒸发反应混合物以除去溶剂。残留物溶解于50毫升的二氯甲烷中并用活性炭处理，之后通过过滤除去活性炭。在滤液中加入500毫升二乙醚，并使该系统静置过夜。通过过滤收集析出的晶体，用二乙醚洗涤，并真空干燥，从而获得2.2克甲氧聚氧化乙烯丙基马来酰亚胺，它是一种浅桃红色晶体。比较实施例2
用与实施例1相同的材料和相同的方法，通过氰化作用和胺化作用制成甲氧聚氧化乙烯丙胺。生成的甲氧聚氧化乙烯丙胺的胺纯度为98.8％。
在一个装备有搅拌器、温度计、冷凝器、和氮气泡管的1升四颈烧瓶中放入164克甲氧聚氧化乙烯丙胺和325毫升甲苯，接着加热至50℃，从而制成溶液。在溶液中加入32克马来酐，并搅拌混合物4小时引导进行反应。反应完毕后，分析了反应混合物的等分试样并测得马来酐含量为15％(重量百分数)。在反应混合物中加入500毫升乙酸酐和64克乙酸钠，并加热混合物到90℃。以与实施例1同样的方式对反应混合物进行处理，从而获得164克甲氧聚氧化乙烯丙基马来酰亚胺晶体，它是一种深棕色晶体。比较实施例3
作为比较实施例3，分析了商业上可获得的甲氧聚乙二醇马来酰亚胺(甲氧聚乙二醇5,000马来酰亚胺，产品编号63187，可从Fluka公司获得；分子量：5000)。
就GPC纯度和马来亚氨基取代率，分析了实施例1至3和比较实施例1至3的聚氧化烯衍生物。结果列于下面的表1中。表1
 GPC纯度(％) 马来亚氨基取代率(％)  马来酐含量(重量％)
实施例1     97.7     95.7      0.0011
实施例2     94.4     93.1      0.0018
实施例3     92.8     92.2      0.025
比较实施例1     99.2     84.7      0.086
比较实施例2     51.6     94.3      15
比较实施例3     98.4     78.0      -
可以看到，通过本发明的方法获得的聚氧化烯衍生物具有较高的GPC纯度和较高的马来亚氨基取代率，而在比较实施例中涉及的聚氧化烯衍生物(它们不在本发明的范围内)在两种特性上都是不能令人满意的。
依据下述试验方法，检测了在实施例1和比较实施例3中制备的聚氧化烯衍生物的水解稳定性和它们修饰的溶菌酶的稳定性。1)水解稳定性
把重量为0.1克的试样放入50毫升螺旋玻璃瓶中，并溶解于100毫升的50mM磷酸缓冲液(调节到pH为7)，使生成的溶液在23℃静置。将静置24小时、48小时、或72小时后得到的4毫升等分试样与几滴1％的磷酸水溶液进行混合并冷冻干燥。得到的固体溶解于氯仿中，并过滤除去不溶物质。在蒸发器中浓缩滤液以制得试样，用1H-NMR分析试样从而确定马来亚氨基取代率。马来亚氨基取代的残余率(％)(每次测量是与初始值相比较)列于表2中。
表2  马来亚氨基取代的残余率
  24小时后(％)  48小时后(％)   72小时后(％)
实施例1     81.8     63.2     47.4
比较实施例3     73.4     42.7     26.0
实施例1的50％减少时间(半衰期时间)、25％减少时间、和70％减少时间(如从这些结果所计算的)分别是67小时、33小时、和94小时；而比较实施例1的50％减少时间(半衰期时间)、25％减少时间、和70％减少时间分别是46小时、23小时、和64小时。2)修饰的溶菌酶(lysozyme)的稳定性
把鸡蛋清溶菌酶溶解于磷酸缓冲液(pH7.4)中以制成0.5mM溶液，该溶液被冷却到4℃。在该溶液中加入2.5倍摩尔量的2-亚氨基硫羟烷氢氯化物(2-iminothiolane hydrochloride)(来自Aldrich化学制品公司)作为溶菌酶，该系统被搅拌过夜，从而把赖氨酸残基的侧链氨基转化成硫羟基。然后在反应混合物中加入两倍摩尔过量(twice molar-excess)的实施例1或比较实施例3的马来亚氨基封端的聚氧化烯衍生物作为溶菌酶的修饰剂，使该系统反应3小时，同时冷却。除去形成的无机盐后，冷冻干燥滤液，从而获得聚氧化烯衍生物修饰的溶菌酶。
称取0.1克修饰后溶菌酶的等分试样并溶解于20毫升的10mM磷酸缓冲液(pH7.0；包含0.1％甲基4-羟基苯甲酸酯)中，溶液在40℃保藏。在规定的保藏时间后，按下述方法测定修饰后溶菌酶的活性。
把适量的溶壁微球菌(Micrococcus Lysodeiktics)的无水微生物细胞与75mM磷酸钠溶液(pH6.2)混合，通过摇动而制成一种基质溶液。该基质溶液的浓度经调节因而在640纳米处的吸收度为1.00，而75mM磷酸钠水溶液作为对照。把修饰后的溶菌酶溶解于纯化水中从而制得含有5至15μg/g溶菌酶的试样溶液。
在3.0毫升基质溶液(保持在37℃)中加入0.1毫升试样溶液。搅拌后，测量了在640纳米处的吸收度，而75mM磷酸钠水溶液作为对照。起初的溶菌酶活性看作是100，在规定时间后，活性残余率(％)是从吸收度进行计算。结果列于下面的表3中。
表3
 1个月后(％) 2个月后(％) 3个月后(％) 4个月后(％)
实施例1     98     91     85     78
比较实施例3     80     64     46     31
表2和表3所列结果证明，比较实施例3的聚氧化烯衍生物(在聚氧化烯链和马来亚氨端基之间有一个C2烷基)在稳定性方面(修饰一种酶的前后)不如实施例1的化合物。
本专利申请是基于日本专利申请JP 2001-231045(2001年7月31日提交)，其整个内容结合于此作为参考，与详细陈述效力相同。

Claims (15)

1.一种化学式(I)表示的聚氧化烯衍生物：
Figure A0212715300021
其中Z是具有2至8个羟基化合物的残基；AO是具有2至18个碳原子的氧化烯基；n和m各自是0至2000的整数，只要n和m并不都是0；a和b各自是满足下述关系式的整数：2≤a+b≤8和1≤b；R是具有1至30个碳原子的烃基；以及X是具有3至10个碳原子的二价烃基。
2.根据权利要求1所述的聚氧化烯衍生物，具有90％或更高的GPC纯度和90％或更高的马来亚氨基取代率。
3.根据权利要求1所述的聚氧化烯衍生物，在pH7和23℃下进行的水解稳定性试验中，具有48小时或更长时间的马来亚氨基取代率半衰期时间(50％减少时间)。
4.根据权利要求2所述的聚氧化烯衍生物，在pH7和23℃下进行的水解稳定性试验中，具有48小时或更长时间的马来亚氨基取代率半衰期时间(50％减少时间)。
5.根据权利要求1所述的聚氧化烯衍生物，其中Z是具有3至8个羟基的化合物的残基，以及a和b满足下述关系式：3≤a+b≤8。
6.根据权利要求2所述的聚氧化烯衍生物，其中Z是具有3至8个羟基化合物的残基，以及a和b满足下述关系式：3≤a+b≤8。
7.根据权利要求3所述的聚氧化烯衍生物，其中Z是具有3至8个羟基化合物的残基，以及a和b满足下述关系式：3≤a+b≤8。
8.根据权利要求1所述的聚氧化烯衍生物，是用于修饰生物物质。
9.根据权利要求1所述的聚氧化烯衍生物，其中X是具有3个碳原子的二价烃基。
10.根据权利要求2所述的聚氧化烯衍生物，其中X是具有3个碳原子的二价烃基。
11.根据权利要求3所述的聚氧化烯衍生物，其中X是具有3个碳原子的二价烃基。
12.一种制备化学式(I)表示的聚氧化烯衍生物的方法：
Figure A0212715300031
其中Z是具有2至8个羟基化合物的残基；AO是具有2至18个碳原子的氧化烯基；n和m各自是0至2000的整数，只要n和m并不都是0；a和b各自是满足下述关系式的整数：2≤a+b≤8和1≤b；R是具有1至30个碳原子的烃基；以及X是具有3至10个碳原子的二价烃基，
所述方法包括：
使化学式(III)表示的氨基封端的聚氧化烯衍生物：其中Z、AO、n、m、a、b、R、和X如上述所定义，与马来酐起反应从而生成化学式(IV)表示的马来酰胺酸封端的聚氧化烯衍生物：其中Z、AO、n、m、a、b、R、和X如上述所定义；
基于化学式(IV)表示的所述化合物，把化学式(IV)表示的所述化合物溶解于50至500体积/重量％的有机溶剂中；
基于所述化学式(IV)表示的化合物，从300至5000体积/重量％的乙酸乙酯和正己烷的混合物中结晶化学式(IV)表示的所述化合物；以及
对所述化学式(IV)表示的化合物的马来酰胺酸端基进行酰亚胺化。
13.一种制备化学式(I)表示的聚氧化烯衍生物的方法：
Figure A0212715300051
其中Z是具有2至8个羟基化合物的残基；AO是具有2至18个碳原子的氧化烯基；n和m各自是0至2000的整数，只要n和m并不都是0；a和b各自是满足下述关系式的整数：2≤a+b≤8和1≤b；R是具有1至30个碳原子的烃基；以及X是具有3至10个碳原子的二价烃基，
所述方法包括：
把化学式(II)表示的羟基封端的聚氧化烯衍生物：
Figure A0212715300052
其中Z、AO、n、m、a、b、和R如上述所定义，通过氰化作用接着通过氢化作用，转化成化学式(III)表示的氨基封端的聚氧化烯衍生物：
其中Z、AO、n、m、a、b、和R如上述所定义；以及X是具有3至10个碳原子的二价烃基；
使化学式(III)表示的所述化合物与马来酐起反应从而生成化学式(IV)表示的马来酰胺酸封端的聚氧化烯衍生物：
Figure A0212715300061
其中Z、AO、n、m、a、b、R、和X如上述所定义；
基于化学式(IV)表示的所述化合物，把化学式(IV)表示的所述化合物溶解于50至500体积/重量％的有机溶剂中；
基于化学式(IV)表示的所述化合物，从300至5000体积/重量％的乙酸乙酯和正己烷的混合物中结晶化学式(IV)表示的所述化合物；以及
对化学式(IV)表示的所述化合物的马来酰胺酸端基进行酰亚胺化。
14.根据权利要求12所述的制备聚氧化烯衍生物的方法，其中所述化学式(IV)表示的马来酰胺酸封端的聚氧化烯衍生物具有重量的0.5％或更少的马来酐含量。
15.根据权利要求13所述的制备聚氧化烯衍生物的方法，其中所述化学式(IV)表示的马来酰胺酸封端的聚氧化烯衍生物具有重量的0.5％或更少的马来酐含量。
CN02127153A 2001-07-31 2002-07-31 聚氧化烯衍生物及其制备方法 Pending CN1400232A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001232045 2001-07-31
JP2001232045 2001-07-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1400232A true CN1400232A (zh) 2003-03-05

Family

ID=19064019

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN02127153A Pending CN1400232A (zh) 2001-07-31 2002-07-31 聚氧化烯衍生物及其制备方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US6875841B2 (zh)
EP (1) EP1283233B1 (zh)
JP (1) JP4123856B2 (zh)
KR (1) KR100658963B1 (zh)
CN (1) CN1400232A (zh)
DE (1) DE60221201T2 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102378775A (zh) * 2009-03-31 2012-03-14 日油株式会社 多支链聚氧化亚烷基化合物及其生产方法
CN101268118B (zh) * 2005-07-19 2012-09-19 尼克塔治疗公司 用于制备马来酰亚胺聚合物的方法
CN102822235A (zh) * 2010-03-31 2012-12-12 日油株式会社 多官能聚氧化烯化合物、其生产方法及其中间体
CN102985462A (zh) * 2010-06-25 2013-03-20 日油株式会社 支链异聚乙二醇和中间体
US10040761B2 (en) 2010-06-25 2018-08-07 Nof Corporation Branched hetero polyethylene glycol and intermediate
CN109843972A (zh) * 2016-10-07 2019-06-04 国立大学法人东京工业大学 分支型异单分散聚乙二醇及其制造方法和其缀合物

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7543018B2 (en) * 1996-04-11 2009-06-02 Aol Llc, A Delaware Limited Liability Company Caching signatures
JP4412461B2 (ja) 2002-11-20 2010-02-10 日油株式会社 修飾された生体関連物質、その製造方法および中間体
US8828373B2 (en) 2002-11-20 2014-09-09 Nof Corporation Polyalkylene glycol derivative and modified bio-related substance
US8003117B2 (en) 2002-11-20 2011-08-23 Nof Corporation Polyalkylene glycol derivative and modified bio-related substance
US7432331B2 (en) 2002-12-31 2008-10-07 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
KR101025143B1 (ko) * 2002-12-31 2011-04-01 넥타르 테라퓨틱스 가수분해상으로 안정한 말레이미드－종결 중합체
AU2003300139B2 (en) * 2002-12-31 2008-08-28 Nektar Therapeutics Maleamic acid polymer derivatives and their bioconjugates
US7482376B2 (en) 2003-07-03 2009-01-27 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Conjugated complement cascade inhibitors
PT1656410E (pt) 2003-07-22 2010-06-11 Nektar Therapeutics Processo para preparação de polímeros funcionalizados a partir de álcoois poliméricos
WO2005056636A2 (en) 2003-12-03 2005-06-23 Nektar Therapeutics Al, Corporation Method of preparing maleimide functionalized polymers
CN101238142B (zh) * 2005-02-18 2012-11-14 国立大学法人德岛大学 含聚氧化烯链的脂质衍生物及含有该衍生物的脂质膜结构体
JP4877225B2 (ja) * 2005-02-18 2012-02-15 日油株式会社 ポリオキシアルキレン誘導体
EP2412744B1 (en) * 2005-07-18 2014-01-22 Nektar Therapeutics Method for preparing branched functionalised polymers using branched polyol cores
US7462627B2 (en) * 2006-02-09 2008-12-09 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Multi-arm polymeric conjugates of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin for treatment of breast, colorectal, pancreatic, ovarian and lung cancers
US7671067B2 (en) * 2006-02-09 2010-03-02 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Treatment of non-hodgkin's lymphomas with multi-arm polymeric conjugates of 7-ethyl-10-hydroxycamtothecin
AU2007216998B8 (en) 2006-02-21 2013-12-19 Nektar Therapeutics Segmented degradable polymers and conjugates made therefrom
US7816484B2 (en) * 2006-02-28 2010-10-19 Dr. Reddy's Laboratories Limited Method for making polyethylene glycol carbonates
CN101511944B (zh) * 2006-06-30 2011-08-24 东丽株式会社 热塑性树脂组合物和它的模制品
KR20090108082A (ko) * 2007-02-09 2009-10-14 엔존 파마슈티컬즈, 인코포레이티드 7-에틸-10-하이드록시캄토테신 다분지형 고분자 접합체를 이용한 내성 또는 불응성 암의 치료방법
JP5428017B2 (ja) * 2007-03-23 2014-02-26 国立大学法人 熊本大学 ワクチン剤
KR100771100B1 (ko) * 2007-07-18 2007-10-29 아이디비켐(주) 고순도의 메톡시폴리에틸렌글리콜에틸말레이미드의제조방법
CA2701612A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited Neuromedin u derivative
WO2009045148A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-09 Telefonaktiebolaget L M Ericsson (Publ) Method and apparatus for multiple description coding
KR101001734B1 (ko) 2008-06-05 2010-12-15 아이디비켐(주) 고순도의 메톡시폴리에틸렌글리콜에틸말레이마이드의분석방법
WO2010025337A1 (en) * 2008-08-29 2010-03-04 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Method of treating ras associated cancer
WO2010048018A1 (en) * 2008-10-21 2010-04-29 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Treatment of neuroblastoma with multi-arm polymeric conjugates of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin
JP5569787B2 (ja) * 2009-03-31 2014-08-13 日油株式会社 高分子量ポリエチレングリコール化合物の精製方法
AU2010340067B2 (en) 2009-12-15 2015-03-19 Incept, Llc Implants and biodegradable fiducial markers
PE20130527A1 (es) 2010-03-03 2013-05-09 Boehringer Ingelheim Int Polipeptidos de union a a-beta biparatopicos
US20120135912A1 (en) 2010-05-10 2012-05-31 Perseid Therapeutics Llc Polypeptide inhibitors of vla4
MX349192B (es) 2012-02-27 2017-07-18 Boehringer Ingelheim Int Polipeptidos de union a cx3cr1.
JP6935059B2 (ja) * 2017-03-30 2021-09-15 日油株式会社 カルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコールの精製方法
CA3093645A1 (en) * 2018-03-13 2019-09-19 Nof Corporation Heterobifunctional compound having monodispersed polyethylene glycol in main chain and side chain

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0273545A1 (en) 1987-01-02 1988-07-06 Texaco Development Corporation Novel reaction product and ORI-inhibited motor fuel composition
EP0318162A3 (en) * 1987-11-25 1990-11-07 Texaco Development Corporation Novel bismaleimide derivatives
EP0575545B1 (en) * 1991-03-15 2003-05-21 Amgen Inc. Pegylation of polypeptides
JP3562000B2 (ja) * 1994-12-14 2004-09-08 日本油脂株式会社 ポリオキシアルキレンモノアミンの製造方法
US5585484A (en) * 1995-04-19 1996-12-17 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University, A Division Of Yeshiva University Hemoglobin crosslinkers
JP3092531B2 (ja) * 1996-11-05 2000-09-25 日本油脂株式会社 コハク酸イミジル基置換ポリオキシアルキレン誘導体の製造方法
EP1881005B1 (en) 1997-07-14 2013-04-03 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of G-CSF and related proteins
JP2000191700A (ja) 1998-12-28 2000-07-11 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 持続型消化管運動ペプチド
WO2001062827A2 (en) * 2000-02-22 2001-08-30 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101268118B (zh) * 2005-07-19 2012-09-19 尼克塔治疗公司 用于制备马来酰亚胺聚合物的方法
CN102378775A (zh) * 2009-03-31 2012-03-14 日油株式会社 多支链聚氧化亚烷基化合物及其生产方法
CN102378775B (zh) * 2009-03-31 2013-10-09 日油株式会社 多支链聚氧化亚烷基化合物及其生产方法
CN102822235B (zh) * 2010-03-31 2015-11-25 日油株式会社 多官能聚氧化烯化合物、其生产方法及其中间体
CN102822235A (zh) * 2010-03-31 2012-12-12 日油株式会社 多官能聚氧化烯化合物、其生产方法及其中间体
US8816099B2 (en) 2010-03-31 2014-08-26 Nof Corporation Polyfunctional polyoxyalkylene compound, and producing method and intermediate thereof
CN102985462A (zh) * 2010-06-25 2013-03-20 日油株式会社 支链异聚乙二醇和中间体
CN102985462B (zh) * 2010-06-25 2016-06-15 日油株式会社 支链异聚乙二醇和中间体
US10040761B2 (en) 2010-06-25 2018-08-07 Nof Corporation Branched hetero polyethylene glycol and intermediate
US10494340B2 (en) 2010-06-25 2019-12-03 Nof Corporation Branched hetero polyethylene glycol and intermediate
CN109843972A (zh) * 2016-10-07 2019-06-04 国立大学法人东京工业大学 分支型异单分散聚乙二醇及其制造方法和其缀合物
CN109843972B (zh) * 2016-10-07 2021-08-13 国立大学法人东京工业大学 分支型异单分散聚乙二醇及其制造方法和其缀合物
US11613607B2 (en) 2016-10-07 2023-03-28 Tokyo Institute Of Technology Branched type hetero monodispersed polyethylene glycol, production method thereof, and conjugate thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20030065134A1 (en) 2003-04-03
US6875841B2 (en) 2005-04-05
JP2003113241A (ja) 2003-04-18
EP1283233A1 (en) 2003-02-12
DE60221201T2 (de) 2008-02-14
EP1283233B1 (en) 2007-07-18
JP4123856B2 (ja) 2008-07-23
DE60221201D1 (de) 2007-08-30
KR20030013256A (ko) 2003-02-14
KR100658963B1 (ko) 2006-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1400232A (zh) 聚氧化烯衍生物及其制备方法
CN1243779C (zh) 具有y形分支的亲水性聚合物衍生物、其制备方法、与药物分子的结合物以及包含该结合物的药物组合物
KR100948532B1 (ko) 분지형 중합체 및 그의 공액체
JP5273589B2 (ja) 生体関連物質、その製造方法およびその中間体
EP0824126B2 (en) Preparation of carboxylic acid-containing polyether and biologically active substances derived thereof
JP6051998B2 (ja) マルチアーム型ポリエチレングリコール誘導体、その中間体及び製造方法
EP2692771B1 (en) Polyoxyethylene derivative having a plurality of hydroxyl groups at end
EP1976896B1 (en) High efficiency method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids
JP5418360B2 (ja) ポリオキシアルキレン誘導体の製造方法
EP2586811A1 (en) Branched hetero-polyethylene glycol and intermediate
US10494340B2 (en) Branched hetero polyethylene glycol and intermediate
JPH11335460A (ja) オキシラン誘導体及びその製造方法
EP2045282B1 (en) A method of modifying a macromolecular system
JP5866789B2 (ja) 多官能性ポリオキシアルキレン化合物、その製造方法及び中間体
CN1660920A (zh) 末端连接ω－氨基酸的聚乙二醇酸或活性酯及制法和应用
JP2013075975A (ja) 分岐型ヘテロ多官能性ポリオキシアルキレン化合物、及びその中間体
US11905367B2 (en) Branched monodispersed polyethylene glycol, intermediate and methods for producing same
EP3950776A1 (en) Branched and degradable polyethylene glycol derivative
KR20220069994A (ko) 비대칭 분기형 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체
JPH1087815A (ja) ポリアルキレンオキシドカルボン酸の改良製造方法
JP2017186543A (ja) 環状ベンジリデンアセタール構造を有する生分解性ヒドロゲル
CN1280298C (zh) 含磷脂酰胆碱二元醇及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication