KR20220069994A - 비대칭 분기형 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체 - Google Patents

비대칭 분기형 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체 Download PDF

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KR20220069994A
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히로키 요시오카
가즈키 오사카마
노부히로 니시야마
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니치유 가부시키가이샤
고쿠리츠다이가쿠호진 토쿄고교 다이가꾸
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Abstract

세포의 공포(空胞)를 야기하지 않는 고분자량의 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 제공하는 것. 세포 내에서 분해되는 올리고펩티드를 분자 내에 갖는 하기 식 (1)로 나타내는 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
Figure pct00057

(식 중, k1 및 k2는 각각 독립적으로 1∼12이며, j1 및 j2는 각각 독립적으로 45∼950이며, R은 수소 원자, 치환 혹은 치환되지 않은 탄소수 1∼12의 알킬기, 치환 아릴기, 아랄킬기 또는 헤테로알킬기이며, Z는 세포 내의 효소로 분해되는 올리고펩티드이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 작용기이며, L1 및 L2는 각각 독립적으로 단결합 혹은 2가의 스페이서이다.)

Description

비대칭 분기형 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체
본 발명은 생체 관련 물질을 수식하는 용도로 사용되는 세포 내에서 분해되는 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체에 관한 발명이다.
호르몬이나 사이토카인, 항체, 효소 등의 생체 관련 물질을 이용한 의약품은, 통상 생체 내에 투여되면 신장에 있어서의 사구체 여과나 간장이나 비장 등에 있어서의 매크로파지에 의한 취입에 의해, 생체 내로부터 빠르게 배출되어 버린다. 그 때문에 혈중 반감기가 짧아, 충분한 약리 효과를 얻기 어려운 경우가 많다. 이 문제를 해결하기 위해, 생체 관련 물질을 당쇄나 폴리에틸렌글리콜 등의 친수성 고분자나 알부민 등에 의해 화학 수식하는 시도가 행해지고 있다. 그 결과, 분자량의 증대나 수화층의 형성 등에 의해 생체 관련 물질의 혈중 반감기를 연장하는 것이 가능해진다. 또한, 폴리에틸렌글리콜로 수식함으로써, 생체 관련 물질의 독성이나 항원성의 저하, 난수용성 약제의 용해성 향상 등의 효과가 얻어지는 것도 잘 알려져 있다.
폴리에틸렌글리콜로 수식된 생체 관련 물질은, 폴리에틸렌글리콜의 에테르 결합과 물 분자의 수소 결합으로 형성되는 수화층으로 덮여, 분자 사이즈가 커지기 때문에, 신장에 있어서의 사구체 여과를 회피할 수 있다. 또한 옵소닌이나 각 조직을 구성하는 세포 표면과의 상호 작용이 저하하여, 각 조직에의 이행이 감소하는 것이 알려져 있다. 폴리에틸렌글리콜은 생체 관련 물질의 혈중 반감기를 연장시키는 우수한 소재이며, 그 성능은 분자량이 클수록 효과가 높은 것을 알고 있다. 지금까지, 분자량 4만 이상의 고분자량의 폴리에틸렌글리콜로 수식한 생체 관련 물질의 연구가 다수 행해져 있고, 유의하게 그 혈중 반감기를 연장할 수 있는 결과가 얻어져 있다.
폴리에틸렌글리콜은 생체 관련 물질의 성능 개선에 이용되는 수식제 중에서 최적 기준으로 되어 있고, 현재에는 폴리에틸렌글리콜 수식 제제가 복수 출시되어, 의료 현장에서 사용되고 있다. 한편, 2012년에 유럽 의약품청(EMA)으로부터, 분자량 4만 이상의 고분자량의 폴리에틸렌글리콜로 수식한 생체 관련 물질을 일정한 투여량 이상으로 장기간 동물에게 투여하면, 일부 조직의 세포 내에 공포(空胞)가 발생한다는 현상이 보고되었다(비특허문헌 1). 현시점에 있어서, 공포의 발생 자체가 인체에 악영향을 부여한다는 보고는 없고, 또한, 앞선 EMA의 보고에 있어서 이용된 투여량은, 의료 현장에서 일반적으로 적용되는 투여량과 비교하여 매우 고용량인 것 등을 고려하면, 현재 제조 판매되고 있는 분자량이 4만 이상인 폴리에틸렌글리콜로 수식된 치료 제제의 안전성은 문제 없다고 할 수 있다. 그러나, 매우 특수한 질환(예컨대, 소인증 등)의 치료에 있어서는, 폴리에틸렌글리콜 수식 제제를 고용량, 또한, 장기간으로 환자에게 투여하는 치료 프로토콜이 채용되는 것도 상정될 수 있다. 따라서, 이러한 특수한 상황에 있어서도 적용 가능한, 세포에 공포를 발생시키지 않는 폴리에틸렌글리콜 수식 제제의 개발에는 잠재적인 수요가 있을 것으로 예상된다.
비특허문헌 2에 있어서는, 통상의 폴리에틸렌글리콜 수식 제제의 투여량에 비해서, 대과잉량의 폴리에틸렌글리콜을 단독으로 동물에게 장기간 투여한 바, 분자량 2만에서는 공포는 보이지 않고, 분자량 4만에 있어서 공포의 발생이 확인되어 있다. 공포를 억제하는 수단 중 하나로서, 폴리에틸렌글리콜의 분자량을 작게 하는 것이 생각되지만, 분자량을 작게 하면 생체 관련 물질의 혈중 반감기를 충분히 개선할 수 없다고 하는 문제가 생긴다.
고분자량의 폴리에틸렌글리콜을 체내에서 저분자량의 폴리에틸렌글리콜로 분해하여, 신장으로부터의 배출을 촉진하는 기술에 대해서는 보고예가 있다. 특허문헌 1에는, 생체 내에서 절단되는 술피드 결합이나 펩티드 결합 부위를 갖는 폴리에틸렌글리콜 유도체에 관한 기재가 이루어져 있다. 상기 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 생체 내에서 신장으로부터의 배출에 알맞은 분자량까지 분해된다는 기재가 있다. 그러나, 구체적인 분해에 관한 데이터는 전혀 나타나 있지 않고, 신장으로부터의 배출이 촉진되었다고 하는 데이터도 없다. 또한 세포의 공포에 관한 기재는 없다.
특허문헌 2에는, 생체 내의 저pH 환경 하에 있어서 가수분해 가능한 아세탈 부위를 갖는 폴리에틸렌글리콜 유도체에 관한 기재가 이루어져 있다. 상기 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 생체 내에서 신장으로부터의 배출에 알맞은 분자량까지 분해된다는 기재가 있다. 그러나, 구체적으로 신장으로부터의 배출이 촉진되었다고 하는 데이터는 없고, 또한 세포의 공포에 관한 기재도 없다. 또한, 이들 가수분해가 가능한 아세탈 부위는 혈중에서도 서서히 분해되는 것이 알려져 있어, 수식한 생체 관련 물질의 혈중 반감기를 충분히 개선할 수 없다고 예상된다.
한편, 약품을 효과적으로 릴리스하기 위해 분해성의 올리고펩티드를 도입한 폴리에틸렌글리콜 유도체나 체내에서 분해되는 하이드로겔 등의 보고예는 있다.
비특허문헌 3에는, 효소에 의해 분해되는 올리고펩티드 부위를 갖는 폴리에틸렌글리콜 유도체에 관한 기재가 이루어져 있다. 여기서는 올리고펩티드는 항암제와 폴리에틸렌글리콜 사이의 링커로서 도입되어 있고, 종양 주변에 특이적으로 발현되고 있는 효소에 의해 올리고펩티드가 분해되어, 효율적으로 항암제를 릴리스하는 것이 보고되어 있다. 목적은 항암제의 릴리스이며, 세포의 공포를 억제할 목적으로 폴리에틸렌글리콜에 분해성을 부여하는 것이 아니다.
비특허문헌 4에는, 효소에 의해 분해되는 올리고펩티드 부위를 갖는 가교 분자와 다분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 이용한 하이드로겔에 관한 기재가 이루어져 있다. 여기서는 올리고펩티드는 다분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 서로 연결하는 가교 분자로서 이용되고, 또한 효소에 의한 분해성을 하이드로겔에 부여할 수 있다. 목적은 분해성의 하이드로겔의 조제이며, 세포의 공포를 억제할 목적으로 폴리에틸렌글리콜에 분해성을 부여하는 것이 아니다.
특허문헌 3에는, 올리고펩티드를 골격으로 한 분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체에 관한 기재가 이루어져 있다. 여기서는 올리고펩티드는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 기본 골격으로서 이용되고 있으며, 효소에 의한 분해성을 부여하는 것이 아니다. 또한, 올리고펩티드에 리신이나 아스파라긴산 등, 측쇄에 아미노기나 카르복실기를 갖는 아미노산을 포함하는 것이 특징이며, 이들을 반응에 이용한 분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 합성하는 것이 목적이다. 세포의 공포를 억제하는 목적의 폴리에틸렌글리콜 유도체가 아니다.
또한 생체 관련 물질을 수식하는 용도로 이용되는 폴리에틸렌글리콜 유도체에 있어서는, 일반적으로 직쇄형과 분기형이 있고, 비특허문헌 5에는, 직쇄형보다 분기형 쪽이 유의하게 생체 관련 물질의 혈중 반감기를 연장시킨다는 기재가 있다. 최근, 출시된 폴리에틸렌글리콜 수식 제제의 대부분은 분기형이 채용되어 있다. 그러나, 지금까지 해당 분야에 있어서, 세포의 공포를 억제하는 분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체에 관한 보고는 없다.
이상과 같이, 혈중에서는 안정적이며, 수식한 생체 관련 물질의 혈중 반감기를 개선하고, 세포에 취입되었을 때에 세포 내에서 특이적으로 분해되어, 세포의 공포의 발생을 억제할 수 있는 분기형의 고분자량의 폴리에틸렌글리콜 유도체가 요구되고 있다.
특허문헌 1: 일본 특허 공표 제2009-527581호 공보 특허문헌 2: WO 2005/108463 특허문헌 3: WO 2006/088248
비특허문헌 1: EMA/CHMP/SWP/647258/2012 비특허문헌 2: Daniel G. Rudmann, et al., Toxicol. Pathol., 41, 970-983(2013) 비특허문헌 3: Francesco M Veronese, et al., Bioconjugate Chem., 16, 775-784(2005) 비특허문헌 4: Jiyuan Yang, et al., Marcomol. Biosci., 10(4), 445-454(2010) 비특허문헌 5: Yulia Vugmeysterang, et al., Bioconjugate Chem., 23, 1452-1462(2012)
본 발명의 과제는, 세포의 공포를 야기하지 않는 고분자량의 분기형 폴리에틸렌글리콜 유도체를 제공하는 것에 있다. 보다 구체적으로는, 생체 관련 물질을 수식하는 용도로 효과적으로 이용할 수 있고, 생체 내의 혈중에서 안정적이며, 또한 세포 내에서 분해되는 분기형 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를, 공업적으로 생산 가능한 제법으로 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 세포 내에서 분해되는 올리고펩티드를 갖는 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 발명하였다.
즉, 본 발명은, 하기 식 (1)로 나타내는 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 제공한다.
[1] 세포 내에서 분해되는 올리고펩티드를 분자 내에 갖는 하기 식 (1)로 나타내는 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
Figure pct00001
(식 중, k1 및 k2는 각각 독립적으로 1∼12이며, j1 및 j2는 각각 독립적으로 45∼950이며, R은 수소 원자, 치환 혹은 치환되지 않은 탄소수 1∼12의 알킬기, 치환 아릴기, 아랄킬기 또는 헤테로알킬기이며, Z는 세포 내의 효소로 분해되는 올리고펩티드이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 작용기이며, L1 및 L2는 각각 독립적으로 단결합 혹은 2가의 스페이서이다.)
[2] Z의 분해성 올리고펩티드가, C 말단의 아미노산으로서 글리신을 갖는 올리고펩티드인 [1]에 기재된 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[3] Z의 분해성 올리고펩티드가, 하이드로파시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산을 적어도 하나 갖는 올리고펩티드인 [1]∼[2] 중 어느 1항에 기재된 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[4] 총분자량이 20,000 이상인 [1]∼[3] 중 어느 1항에 기재된 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[5] L1 및 L2가 각각 독립적으로, 단결합, 우레탄 결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 2급 아미노기, 우레아 결합, 또는 이들의 결합 및/또는 기를 포함하고 있어도 좋은 알킬렌기인 [1]∼[4] 중 어느 1항에 기재된 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[6] X가 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데히드기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭시기, 말레이미드기, 비닐술포닐기, 아크릴기, 술포닐옥시기, 카르복시기, 티올기, 디티오피리딜기, α-할로아세틸기, 알키닐기, 알릴기, 비닐기, 아미노기, 옥시아미노기, 히드라지드기 및 아지드기로 이루어지는 군에서 선택되는, [1]∼[5] 중 어느 1항에 기재된 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
본 발명은 또한, 다른 양태로서, 하기 식 (2)로 나타내는 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 제공한다.
[6] 하기 식 (2)로 나타내는 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
Figure pct00002
(식 중, k1 및 k2는 각각 독립적으로 1∼12이며, j1 및 j2는 각각 독립적으로 45∼950이며, R은 수소 원자, 치환 혹은 치환되지 않은 탄소수 1∼4의 알킬기, 치환 아릴기, 아랄킬기 또는 헤테로알킬기이며, W는 글루타민산 또는 리신을 중심으로 한 대칭 구조의 5∼47 잔기의 올리고펩티드이며, a는 2∼8이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 작용기이며, L1 및 L2는 각각 독립적으로 단결합 혹은 2가의 스페이서이다.)
[7] W의 글루타민산 또는 리신을 중심으로 한 대칭 구조의 올리고펩티드가, 이하의 w1 또는 w2의 구조를 갖는 올리고펩티드인 [6]에 기재된 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
Figure pct00003
Figure pct00004
(식 중, Q는 글루타민산 또는 리신의 잔기이며, 및 Z는 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼5 잔기의 분해성 올리고펩티드이다.)
[8] Z의 분해성 올리고펩티드가, C 말단의 아미노산으로서 글리신을 갖는 올리고펩티드인 [7]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[9] Z의 분해성 올리고펩티드가, 하이드로파시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산을 적어도 하나 갖는 올리고펩티드인 [7] 또는 [8] 중 어느 1항에 기재된 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[10] 총분자량이 20,000 이상인 [6]∼[9] 중 어느 하나에 기재된 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[11] L1 및 L2가 각각 독립적으로, 단결합, 우레탄 결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 2급 아미노기, 우레아 결합, 또는 이들의 결합 및/또는 기를 포함하고 있어도 좋은 알킬렌기인 [6]∼[10] 중 어느 1항에 기재된 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[12] X가 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데히드기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭시기, 말레이미드기, 치환 말레이미드기, 비닐술포닐기, 아크릴기, 치환 술포네이트기, 술포닐옥시기, 카르복시기, 메르캅토기, 피리딜디티오기, α-할로아세틸기, 알킬카르보닐기, 요오드아세트아미드기, 알케닐기, 알키닐기, 치환 알키닐기, 아미노기, 옥시아미노기, 히드라지드기 및 아지드기로 이루어지는 군에서 선택되는, [6]∼[11] 중 어느 1항에 기재된 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
본 발명의 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 생체 내의 혈중에서는 안정적이며, 세포 내의 효소에 의해 분해되는 올리고펩티드를 구조 내에 갖고 있다. 그 때문에, 상기 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 혈중에서는 안정적이며, 종래의 분해성을 갖지 않는 폴리에틸렌글리콜 유도체와 동등한 혈중 반감기를 생체 관련 물질에 부여할 수 있다. 또한, 상기 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 세포 내에 취입된 경우, 올리고펩티드 부위가 빠르게 분해되기 때문에, 지금까지 과제로 되어 있던 세포의 공포의 발생을 억제할 수 있다. 또한, 폴리에틸렌글리콜에 도입하는 올리고펩티드를, C 말단의 아미노산으로서 글리신을 갖는 올리고펩티드 등으로 한정함으로써, 제조 공정 중에서 발생하는 불순물을 저감시켜, 공업적으로 제조하는 것이 가능해진다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 하기 식 (1)로 나타낸다.
Figure pct00005
식 (1) 중, k1 및 k2는 각각 독립적으로 1∼12이며, j1 및 j2는 각각 독립적으로 45∼950이며, R은 수소 원자, 치환 혹은 치환되지 않은 탄소수 1∼12의 알킬기, 치환 아릴기, 아랄킬기 또는 헤테로알킬기이며, Z는 세포 내의 효소로 분해되는 올리고펩티드이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 작용기이며, L1 및 L2는 각각 독립적으로 단결합 혹은 2가의 스페이서이다.
본 발명의 식 (1)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 총분자량은, 통상은 4,000∼160,000이며, 바람직하게는 10,000∼120,000이며, 더욱 바람직하게는 20,000∼80,000이다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 식 (1)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 총분자량은 20,000 이상이다. 여기서 말하는 분자량이란 수평균 분자량(Mn)이다.
식 (1) 중의 k1 및 k2는, 통상은 각각 독립적으로 1∼12이며, 바람직하게는 각각 독립적으로 1∼6이며, 더욱 바람직하게는 각각 독립적으로 1∼2이다.
식 (1) 중의 j1 및 j2는, 각각 폴리에틸렌글리콜의 반복 유닛수이며, 통상 각각 독립적으로 45∼950이며, 바람직하게는 각각 독립적으로 110∼690이며, 더욱 바람직하게는 각각 독립적으로 220∼480이다.
식 (1) 중의 R은, 수소 원자, 치환 혹은 치환되지 않은 탄소수 1∼12의 알킬기, 치환 아릴기, 아랄킬기 또는 헤테로알킬기이다. 「헤테로알킬기」란, 질소 원자, 산소 원자 및 유황 원자에서 선택되는 1∼5개의 헤테로 원자를 포함하는 알킬기이다. R은, 바람직하게는 수소 원자 혹은 탄소수 1∼3의 알킬기이며, 보다 바람직하게는 수소 원자, 메틸기 또는 에틸기이며, 더욱 바람직하게는 수소 원자이다.
식 (1) 중의 L1 및 L2는, 각각 독립적으로, 단결합 혹은 2가의 스페이서인데, 이들 스페이서는 공유 결합을 형성할 수 있는 기이면 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는, 페닐렌기, 아미드 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 우레탄 결합, 2급 아미노기, 카르보닐기, 우레아 결합, 또는 이들의 결합 및/또는 기를 포함하고 있어도 좋은 알킬렌기이며, 보다 바람직하게는, 알킬렌기, 아미드 결합, 에테르 결합, 우레탄 결합, 2급 아미노기, 또는 카르보닐기와 알킬렌기가 결합하여 형성되는 기이며, 특히 바람직한 양태는, 하기의 군 (I)로 나타내는 것이다. 또한, 군 (I)의 스페이서를 2개 내지 5개 조합하여도 좋다. 2가의 스페이서로서 에스테르 결합과 카보네이트 결합은 생체 내의 혈중에서 서서히 분해되기 때문에 알맞지 않다.
군 (I):
Figure pct00006
(z1)∼(z11)에 있어서, 식 중의 s는 0∼10의 정수를 나타내며, 바람직하게는 0∼6의 정수를 나타내며, 더욱 바람직하게는 0∼3의 정수를 나타낸다. 또한, (z2)∼(z11)에 있어서, 식 중의 s는 동일하여도, 달라도 좋다.
식 (1) 중의 L1은, 단결합 혹은 군 (I)의 (z2), (z3), (z4), (z6), (z7), (z8), (z9), (z10), (z2)와 (z6)의 조합이 바람직하고, 단결합, (z3), (z6), (z9), (z10), (z2)와 (z6)의 조합이 보다 바람직하다.
식 (1) 중의 L2는, 군 (I)의 (z1), (z2), (z3), (z4), (z5), (z6), (z7), (z8), (z11)이 바람직하고, (z3), (z5), (z11)이 보다 바람직하다.
식 (1) 중의 Z는, 생체 내의 혈중에서 안정적이며, 또한 세포 내의 효소로 분해되는 올리고펩티드이면 특별히 제한은 없지만, 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼8 잔기의 올리고펩티드가 바람직하고, 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼6 잔기의 올리고펩티드가 보다 바람직하고, 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼4 잔기의 올리고펩티드가 더욱 바람직하다.
또한, 식 (1) 중의 Z는, 측쇄에 아미노기나 카르복실기를 갖는 아미노산, 구체적으로는, 리신, 아스파라긴산, 글루타민산을 포함하지 않는 중성 아미노산으로 구성되는 올리고펩티드인 것이 바람직하다. 여기서 사용되는 아미노산은, α-아미노산이며, 또한 기본적으로는 L형이다.
또한, 중성 아미노산인 시스테인은 티올기를 갖고 있고, 다른 티올기와 디술피드 결합을 형성하기 때문에, 식 (1) 중의 Z는, 시스테인을 포함하지 않는 중성 아미노산으로 이루어지는 올리고펩티드인 것이 바람직하다.
덧붙여, 식 (1) 중의 Z는, C 말단의 아미노산으로서 글리신을 갖는 올리고펩티드인 것이 바람직하다. C 말단의 카르복실기와 폴리에틸렌글리콜 유도체를 반응시킬 때는, 기본적으로 C 말단의 카르복실기를 축합제 등으로 활성화해야 한다. 이 활성화의 공정에서, 글리신 이외의 아미노산에서는 에피머화가 발생하기 쉬워, 입체 이성체가 부생하는 것이 알려져 있다. 올리고펩티드의 C 말단의 아미노산을 아키랄인 글리신으로 함으로써, 입체 이성체의 부생이 없는, 고순도의 목적물을 얻을 수 있다.
또한, 식 (1) 중의 Z는, 하이드로파시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산, 구체적으로는, 페닐알라닌, 류신, 발린, 이소류신을 적어도 하나 갖는 올리고펩티드인 것이 바람직하고, 페닐알라닌을 갖는 올리고펩티드인 것이 더욱 바람직하다. Kyte 와 Doolittle에 의해 작성된, 아미노산의 소수성을 정량적으로 나타내는 하이드로파시 지표(hydropathy index)는, 값이 클수록 소수적인 아미노산인 것을 나타낸다(Kyte J & Doolittle RF, 1982, J Mol Biol, 157: 105-132.).
식 (1) 중의 Z는, 생체 내의 혈중에서 안정적이며, 또한 세포 내의 효소로 분해하는 성능을 갖고, 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼8 잔기의 올리고펩티드이면 특별히 제한은 없지만, 구체적인 예로서는, 글리신-페닐알라닌-류신-글리신, 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신, 글리신-페닐알라닌-글리신, 글리신-류신-글리신, 발린-시트룰린-글리신, 발린-알라닌-글리신, 글리신-글리신-글리신, 페닐알라닌-글리신 등이며, 바람직하게는 글리신-페닐알라닌-류신-글리신, 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신, 글리신-페닐알라닌-글리신, 글리신-글리신-글리신, 발린-시트룰린-글리신, 발린-알라닌-글리신, 페닐알라닌-글리신이며, 보다 바람직하게는 글리신-페닐알라닌-류신-글리신, 글리신-페닐알라닌-글리신, 발린-시트룰린-글리신, 발린-알라닌-글리신이며, 더욱 보다 바람직하게는 글리신-페닐알라닌-류신-글리신, 발린-시트룰린-글리신이다.
식 (1) 중의 X는, 화학 수식의 대상이 되는 생리 활성 단백질, 펩티드, 항체, 핵산 등의 생체 관련 물질에 존재하는 작용기와 반응하여 공유 결합을 형성하는 작용기이면 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 「Harris, J.M. Poly(Ethylene Glycol) Chemistry; Plenum Press: New York, 1992」, 「Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques, 2nd ed.; Academic Press: San Diego, CA, 2008」 및 「PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Applications; Veronese, F.M., Ed.; Birkhauser: Basel, Switzerland, 2009」 등에 기재되어 있는 작용기를 들 수 있다.
식 (1) 중의 X로 나타내는 「생체 관련 물질과 반응 가능한 작용기」는, 생체 관련 물질이 갖는 아미노기, 메르캅토기, 알데히드기, 카르복시기, 불포화 결합 또는 아지드기 등의 작용기와 화학 결합 가능한 작용기이면 특별히 제한되지 않는다.
구체적으로는, 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데히드기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭시기, 카르복시기, 메르캅토기, 말레이미드기, 치환 말레이미드기, 히드라지드기, 디티오피리딜기, 치환 술포네이트기, 비닐술포닐기, 아미노기, 옥시아미노기(H2N-O-기), 요오드아세트아미드기, 알킬카르보닐기, 알케닐기(예컨대, 알릴기, 비닐기), 알키닐기, 치환 알키닐기(예컨대, 후기하는 탄소수 1∼5의 탄화수소기로 치환된 알키닐기), 아지드기, 아크릴기, 술포닐옥시기(예컨대, 알킬술포닐옥시기), α-할로아세틸기 등을 들 수 있으며, 바람직하게는, 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데히드기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭시기, 말레이미드기, 치환 말레이미드기, 비닐술포닐기, 아크릴기, 술포닐옥시기(예컨대, 탄소수 1∼5의 알킬-술포닐옥시기), 치환 술포네이트기, 카르복시기, 메르캅토기, 피리딜디티오기, α-할로아세틸기, 알키닐기, 치환 알키닐기(예컨대, 후기하는 탄소수 1∼5의 탄화수소기로 치환된 탄소수 2∼5의 알키닐기), 알릴기, 비닐기, 아미노기, 옥시아미노기, 히드라지드기 및 아지드기이며, 보다 바람직하게는 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데히드기, 말레이미드기, 옥시아미노기 및 아미노기이며, 특히 바람직하게는 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데히드기, 말레이미드기 및 옥시아미노기이다.
별도의 적합한 실시형태에 있어서, 이러한 작용기 X는, 하기의 군 (II), 군 (III), 군 (IV), 군 (V), 군 (VI) 및 군 (VII)로 분류할 수 있다.
군 (II): 생체 관련 물질이 갖는 아미노기와 반응 가능한 작용기
하기의 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (j), 또는 (k)로 나타내는 기를 들 수 있다.
군 (III): 생체 관련 물질이 갖는 메르캅토기와 반응 가능한 작용기
하기의 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), 또는 (l)로 나타내는 기를 들 수 있다.
군 (IV): 생체 관련 물질이 갖는 알데히드기와 반응 가능한 작용기
하기의 (h), (m), (n), 또는 (p)로 나타내는 기를 들 수 있다.
군 (V): 생체 관련 물질이 갖는 카르복실기와 반응 가능한 작용기
하기의 (h), (m), (n), 또는 (p)로 나타내는 기를 들 수 있다.
군 (VI): 생체 관련 물질이 갖는 불포화 결합과 반응 가능한 작용기
하기의 (h), (m), 또는 (o)로 나타내는 기를 들 수 있다.
군 (VII): 생체 관련 물질이 갖는 아지드기와 반응 가능한 작용기
하기의 (l)로 나타내는 기를 들 수 있다.
Figure pct00007
작용기 (j)에 있어서, 식 중의 W1은 염소 원자(Cl), 브롬 원자(Br) 또는 요오드 원자(I) 등의 할로겐 원자를 나타내며, 바람직하게는 Br, 또는 I, 보다 바람직하게는 I이다.
또한, 작용기 (e) 및 작용기 (l)에 있어서, 식 중의 Y1, Y3은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소수 1∼5의 탄화수소기를 나타내며, 바람직하게는 탄소수 1∼5의 탄화수소기이다. 탄소수 1∼5의 탄화수소기로서는, 구체적으로는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 제3 부틸기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 메틸기, 또는 에틸기이다.
또한, 작용기 (k)에 있어서, 식 중의 Y2는 불소 원자를 포함하고 있어도 좋은 탄소수가 1∼10인 탄화수소기를 나타내며, 구체적으로는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 제3 부틸기, 헥실기, 노닐기, 비닐기, 페닐기, 벤질기, 4-메틸페닐기, 트리플루오로메틸기, 2,2,2-트리플루오로에틸기, 4-(트리플루오로메톡시)페닐기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 메틸기, 비닐기, 4-메틸페닐기, 또는 2,2,2-트리플루오로에틸기이다.
활성 에스테르기란, 탈리능이 높은 알콕시기를 갖는 에스테르기이다. 탈리능이 높은 알콕시기로서는, 니트로페놀, N-히드록시숙신이미드, 펜타플루오로페놀 등으로부터 유도되는 알콕시기를 들 수 있다. 활성 에스테르기는, 바람직하게는 N-히드록시숙신이미드로부터 유도되는 알콕시기를 갖는 에스테르기이다.
활성 카보네이트기란, 탈리능이 높은 알콕시기를 갖는 카보네이트기이다. 탈리능이 높은 알콕시기로서는, 니트로페놀, N-히드록시숙신이미드, 펜타플루오로페놀 등으로부터 유도되는 알콕시기를 들 수 있다. 활성 카보네이트기는, 바람직하게는 니트로페놀 또는 N-히드록시숙신이미드로부터 유도되는 알콕시기를 갖는 카보네이트기이다.
치환 말레이미드기란, 말레이미드기의 이중 결합의 한쪽의 탄소 원자에 탄화수소기가 결합하고 있는 말레이미드기이다. 탄화수소기는, 구체적으로는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 제3 부틸기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 메틸기, 또는 에틸기이다.
치환 술포네이트기란, 술포네이트기의 유황 원자에 불소 원자를 포함하고 있어도 좋은 탄화수소기가 결합하고 있는 술포네이트기이다. 불소 원자를 포함하고 있어도 좋은 탄화수소기로서는, 구체적으로는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 제3 부틸기, 헥실기, 노닐기, 비닐기, 페닐기, 벤질기, 4-메틸페닐기, 트리플루오로메틸기, 2,2,2-트리플루오로에틸기, 4-(트리플루오로메톡시)페닐기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 메틸기, 비닐기, 4-메틸페닐기, 또는 2,2,2-트리플루오로에틸기이다.
본 발명의 식 (1)의 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 적합한 예로서는, 이하의 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 들 수 있다.
[분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체 (1-1)]
k1 및 k2가, 각각 독립적으로 1∼2이며;
j1 및 j2가, 각각 독립적으로 220∼480이며;
R이, 수소 원자이며;
Z가, 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼8 잔기의 올리고펩티드(예, 페닐알라닌-글리신)이며;
X가, 활성 에스테르기(예, N-숙신이미딜옥시카르보닐기), 알데히드기(예, N-(포르밀에틸)카르바모일기), 카르복실기, 말레이미드기(예, N-(N-말레이미딜에틸카르보닐아미노에틸)카르바모일기) 및 아미노기(예, N-(아미노에틸)카르바모일기)로 이루어지는 군에서 선택되며;
L1 및 L2가, 각각 독립적으로, 2급 아미노기 및/또는 카르보닐기를 포함하고 있어도 좋은 알킬렌기(예, 프로필렌기)인;
식 (1)의 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
식 (1)로 나타내는 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 예컨대, 다음과 같은 공정으로 제조할 수 있다.
반응 1
Figure pct00008
반응 1 중의 A는 탈리기이며, R, j1, k1, k2는 상기와 동의이다.
식 (3)에 있어서의 A는, 탈리기이며, 커플링 반응에 있어서 반응성을 갖는 탈리기이면 특별히 제한은 없지만, 예컨대, 클로로기, 브로모기, 요오드기, 메실레이트기, 토실레이트기, 클로로메탄술포네이트기 등을 들 수 있다.
반응 1은, 식 (3)으로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체와 식 (4)로 나타내는 화합물을 무수 용매 중, 강염기 촉매 존재 하에 커플링 반응시켜, 식 (5)로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻는 공정이다.
상기 커플링 반응에 있어서의 강염기 촉매로서는, 반응이 진행되는 강염기 촉매이면 특별히 제한은 없지만, 예컨대 수산화칼륨, 수산화나트륨, 나트륨메톡시드, 나트륨에톡시드 등을 들 수 있다.
상기 커플링 반응에 있어서의 무수 용매로서는, 식 (3) 및 식 (4)로 나타내는 화합물과 반응하지 않는 용매이면 특별히 제한은 없지만, 예컨대, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴, DMF, 디클로로메탄, 클로로포름 등의 비프로톤성 극성 용매 및 이들의 혼합물을 들 수 있다.
반응에서 부생된 불순물, 또한 반응에서 소비되지 않고 잔존한 화합물, 강염기 촉매의 정제 제거를 행하는 것이 바람직하다. 정제는 특별히 제한되지 않지만, 추출, 재결정, 흡착 처리, 재침전, 컬럼 크로마토그래피, 초임계 추출 등으로 정제할 수 있다.
반응 2
Figure pct00009
반응 2 중의 Pro는 보호기이며, Peptide는 올리고펩티드이며, L3은 상기 L1 및 L2와 동의의 단결합 혹은 2가의 스페이서이며, 및 j2는 상기와 동의이다.
반응 2 중의 Pro는, 보호기이며, 여기서 보호기란, 어떤 반응 조건 하에 분자 중의 특정한 화학 반응 가능한 작용기의 반응을 방지 또는 저지하는 성분이다. 보호기는, 보호되는 화학 반응 가능한 작용기의 종류, 사용되는 조건 및 분자 중의 다른 작용기 혹은 보호기의 존재에 의해 변화한다. 보호기의 구체적인 예는 많은 일반적인 출판 서적에서 발견할 수 있지만, 예컨대 「Wuts, P.G.M.; Greene, T.W. Protective Groups in Organic Synthesis, 4th ed.; Wiley-Interscience: New York, 2007」에 기재되어 있다. 또한, 보호기로 보호된 작용기는, 각각의 보호기에 알맞은 반응 조건을 이용하여 탈보호, 즉 화학 반응시킴으로써, 원래의 작용기를 재생시킬 수 있다. 보호기의 대표적인 탈보호 조건은 전술한 문헌에 기재되어 있다.
반응 2는, 식 (6)으로 나타내는 N 말단의 아미노기가 보호기로 보호된 올리고펩티드의 카르복실기와, 식 (7)로 나타내는 편말단이 메톡시기인 폴리에틸렌글리콜 유도체의 아미노기를 축합 반응으로 결합시켜, 식 (8)로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻는 공정이다.
올리고펩티드의 N 말단의 아미노기의 보호기는, 특별히 제한은 없지만, 예컨대 아실계 보호기 및 카바메이트계 보호기를 들 수 있으며, 구체적으로는 트리플루오로아세틸기, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc), tert-부틸옥시카르보닐기 등을 들 수 있다.
축합 반응으로서는, 특별히 제한은 없지만, 축합제를 이용하는 반응이 바람직하다. 축합제로서는, 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(EDC) 등의 카르보디이미드계의 축합제를 단독으로 사용하여도 좋고, N-히드록시숙신이미드(NHS), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) 등의 시약과 병용하여도 좋다. 또한, 보다 반응성이 높은 HATU나 HBTU, TATU, TBTU, COMU, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드 n수화물(DMT-MM) 등의 축합제를 사용하여도 좋다. 또한 반응을 촉진시키기 위해, 트리에틸아민이나 디메틸아미노피리딘 등의 염기를 이용하여도 좋다.
반응에서 부생된 불순물, 또는 반응에서 소비되지 않고 잔존한 올리고펩티드나 축합제 등은, 정제 제거를 행하는 것이 바람직하다. 정제는, 특별히 제한되지 않지만, 추출, 재결정, 흡착 처리, 재침전, 컬럼 크로마토그래피, 초임계 추출 등으로 정제할 수 있다.
탈보호 3
Figure pct00010
Peptide, L3 및 j2는 상기와 동의이다.
탈보호 3은, 반응 2로 얻어진 식 (8)로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 보호기를 탈보호하여, 식 (9)로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻는 공정이다. 탈보호 반응으로서는, 종래 공지의 방법을 이용할 수 있지만, 올리고펩티드나 L3의 2가의 스페이서가 분해되지 않는 조건을 이용할 필요가 있다. 또한, 본 공정은, 반응 2의 공정의 일환으로서 실시하는 것도 가능하다.
탈보호 반응에서 부생된 불순물 등은, 정제 제거를 행하는 것이 바람직하다. 정제는, 특별히 제한되지 않지만, 추출, 재결정, 흡착 처리, 재침전, 컬럼 크로마토그래피, 초임계 추출 등으로 정제할 수 있다.
반응 4
Figure pct00011
반응 4 중의 k3은 1∼6의 정수이며, Peptide, j2 및 L3은 상기와 동의이다.
식 (8) 중의 k3은 1∼6의 정수이며, 바람직하게는 2∼4의 정수이다.
반응 4는 탈보호 3으로 얻어진 식 (9)로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 말단의 아미노기를 염기 촉매 존재 하에 식 (10)으로 나타내는 화합물과 반응시켜 카르복실기로 변환하는 공정이다.
반응 4에서 부생된 불순물 등은, 정제 제거를 행하는 것이 바람직하다. 정제는, 특별히 제한되지 않지만, 추출, 재결정, 흡착 처리, 재침전, 컬럼 크로마토그래피, 초임계 추출 등으로 정제할 수 있다.
반응 5
Figure pct00012
반응 5 중의 Peptide, L3, k3 및 j2는 상기와 동의이다.
반응 5는 반응 4로 얻어진 식 (11)로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체에 식 (12)로 나타내는 화합물을 염기 촉매 존재 하에 반응시켜, 활성 에스테르기를 도입한 식 (13)으로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻는 공정이며, 본 공정은 반응 4의 공정의 일환으로서 실시하는 것도 가능하다.
반응 6
Figure pct00013
반응 6 중의 Peptide, R, L3, j1, j2, k1, k2 및 k3은 상기와 동의이다.
반응 6은 반응 1로 얻어진 식 (5)로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 아미노기와 반응 5로 얻어진 식 (13)으로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 활성 에스테르기를 반응으로 결합시켜, 식 (14)로 나타내는 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻는 공정이다.
반응에서 부생된 불순물, 또는 반응에서 소비되지 않고 잔존한 폴리에틸렌글리콜 유도체 등은, 정제 제거를 행하는 것이 바람직하다. 정제는 특별히 제한되지 않지만, 추출, 재결정, 흡착 처리, 재침전, 컬럼 크로마토그래피, 초임계 추출 등으로 정제할 수 있다.
식 (14)로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 말단 카르복실기를 다른 작용기로 변환하는 공정에 대해서, 전형적인 예를 이하에 설명하지만, 변환 방법은 이에 한정되는 것이 아니다.
예컨대, 식 (15)로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 말단 카르복실기를 말레이미드기로 변환하고자 하는 경우는, N-(2-아미노에틸)말레이미드와 염기 촉매 존재 하에 축합 반응시킴으로써, 목적물을 얻을 수 있다.
예컨대, 식 (14)로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 말단 카르복실기를 아미노기로 변환하고자 하는 경우는, N-(9-H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐)-1,2-에탄디아민과 염기 촉매 존재 하에 축합 반응시킨 후, 탈보호 반응시킴으로써 얻을 수 있다.
이들 반응 시약은, 저분자량의 시약이며, 고분자량 폴리머인 폴리에틸렌글리콜 유도체와는 크게 용해성이 상이하기 때문에, 추출이나 정석(晶析) 등의 일반적인 정제 방법으로 용이하게 제거 가능하다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 하기 식 (2)로 나타내는 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 제공한다.
Figure pct00014
식 (2) 중, k1 및 k2는 각각 독립적으로 1∼12이며, j1 및 j2는 각각 독립적으로 45∼950이며, R은 수소 원자, 치환 혹은 치환되지 않은 탄소수 1∼4의 알킬기, 치환 아릴기, 아랄킬기 또는 헤테로알킬기이며, W는 글루타민산 또는 리신을 중심으로 한 대칭 구조의 5∼47 잔기의 올리고펩티드이며, a는 2∼8이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 작용기이며, L1 및 L2는 각각 독립적으로 단결합 혹은 2가의 스페이서이다.
본 발명의 식 (2)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 총분자량은, 통상은 4,000∼160,000이며, 바람직하게는 10,000∼120,000이며, 더욱 바람직하게는 20,000∼80,000이다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 식 (2)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 총분자량은 20,000 이상이다. 여기서 말하는 분자량이란 수평균 분자량(Mn)이다.
식 (2) 중의 k1 및 k2는, 통상은 각각 독립적으로 1∼12이며, 바람직하게는 각각 독립적으로 1∼6이며, 더욱 바람직하게는 각각 독립적으로 1∼2이다.
식 (2) 중의 j1 및 j2는, 각각 폴리에틸렌글리콜의 반복 유닛수이며, 통상 각각 독립적으로 45∼950이며, 바람직하게는 각각 독립적으로 110∼690이며, 더욱 바람직하게는 각각 독립적으로 220∼480이다.
식 (2) 중의 W는, 글루타민산 또는 리신을 중심으로 한 대칭 구조의 5∼47 잔기, 바람직하게는 5∼27 잔기, 보다 바람직하게는 5∼19 잔기의 올리고펩티드이고, 생체 내의 혈중에서 안정적이며, 또한 세포 내의 효소로 분해되는 올리고펩티드이면 특별히 제한은 없지만, 올리고펩티드를 구성하는 아미노산으로서는, 중심 부분을 구성하는 글루타민산 또는 리신 이외에는, 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 것이 바람직하다. 여기서 말하는 글루타민산 또는 리신을 중심으로 한 대칭 구조의 올리고펩티드란, 글루타민산의 α위치의 카르복실기와 γ위치의 카르복실기 또는 리신의 α위치의 아미노기와 ε위치의 아미노기에 동일한 펩티드가 결합한 화합물을 의미하며, 글루타민산 또는 리신을 중심으로 짝을 이루는 펩티드가 대칭 구조를 취하는 올리고펩티드이다. 상기 올리고펩티드 중의 중성 아미노산과 글루타민산 또는 리신의 수의 구성비(중성 아미노산의 수/글루타민산의 수)로서는, 통상은 2∼10이며, 바람직하게는 2∼8이며, 더욱 바람직하게는 2∼6이다. W를 구성하는 아미노산은 기본적으로는 L형이다.
W의 특히 바람직한 양태는, 하기의 군 (VIII)로 나타내는 것이다.
군 (VIII):
Figure pct00015
Figure pct00016
(식 중, Q는 글루타민산 또는 리신의 잔기이며, Z는 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼5 잔기의 분해성 올리고펩티드이다.)
식 (2) 중의 a는, W로 나타내는 올리고펩티드와 결합하고 있는 폴리에틸렌글리콜쇄의 개수이며, 통상은 2∼8이며, 바람직하게는 2 또는 4 또는 8이며, 더욱 바람직하게는 2 또는 4이다.
또한, R, X, L1, L2 및 (w1)∼(w2) 중의 Z의 바람직한 양태는, 상기 식 (1)에 대해서 설명한 바와 같다.
식 (2)의 바람직한 양태 중 하나는, W가 w1이며, a=2의 하기 식 (15)로 나타내는 3분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체이다.
Figure pct00017
(식 중, Q, Z, R, k1, k2, j1, j2, X, L1 및 L2는, 상기와 동의이다.)
식 (2)의 바람직한 양태 중 하나는, W가 w2이며, a=4의 하기 식 (16)으로 나타내는 5분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체이다.
Figure pct00018
(식 중, Q, R, Z, k1, k2, j1, j2, X, L1 및 L2는, 상기와 동의이다.)
본 발명의 식 (2)의 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 적합한 예로서는, 이하의 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 들 수 있다.
[분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체 (2-1)]
k1 및 k2가, 각각 독립적으로 1∼2이며;
j1 및 j2가, 각각 독립적으로 220∼480이며;
R이, 수소 원자이며;
W가, 글루타민산 또는 리신을 중심으로 한 대칭 구조의 5∼9 잔기의 올리고펩티드(예, 글리신-페닐알라닌-글루타민산-페닐알라닌-글리신)이며;
a가, 2 또는 4이며;
X가, 카르복실기이며;
L1 및 L2가, 각각 독립적으로, 에테르 결합, 2급 아미노기 및/또는 카르보닐기를 포함하고 있어도 좋은 알킬렌기(예, 프로필렌기, 펜틸렌기)인;
식 (2)의 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
본 발명의 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, Q가 글루타민산의 잔기인 경우에, 예컨대, 다음과 같은 공정으로 제조할 수 있다.
반응 7
Figure pct00019
반응 7 중의 Pro, Peptide, L3 및 j2는 상기와 동의이다.
반응 7은, 탈보호 3으로 얻어진 식 (9)로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 아미노기와, 식 (17)로 나타내는 아미노기가 보호기로 보호된 글루타민산 유도체의 2개의 카르복실기를 축합 반응으로 결합시켜, 2개의 분해성 폴리에틸렌글리콜쇄가 글루타민산 잔기로 연결된 구조인 식 (18)로 나타내는 분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻는 공정이다.
상기 반응 2와 마찬가지로, 축합제를 이용한 반응이 바람직하고, 반응을 촉진시키기 위해, 트리에틸아민이나 디메틸아미노피리딘 등의 염기를 이용하여도 좋다.
글루타민산의 아미노기의 보호기는, 특별히 제한은 없지만, 예컨대 아실계 보호기 및 카바메이트계 보호기를 들 수 있고, 구체적으로는 트리플루오로아세틸기, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기 및 t-부틸옥시카르보닐기 등을 들 수 있다.
반응에서 부생된 불순물, 또는 반응에서 소비되지 않고 잔존한 폴리에틸렌글리콜 유도체 등은, 정제 제거를 행하는 것이 바람직하다. 정제는, 특별히 제한되지 않지만, 추출, 재결정, 흡착 처리, 재침전, 컬럼 크로마토그래피, 초임계 추출 등으로 정제할 수 있다.
탈보호 8
Figure pct00020
탈보호 8 중의 Peptide, L3 및 j2는 상기와 동의이다.
탈보호 8은, 반응 7로 얻어진 식 (18)로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 보호기를 탈보호하여, 식 (19)로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻는 공정이다. 상기 탈보호 3과 동일한 조건으로 반응과 정제가 가능하다.
식 (19)로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 중으로부터, 분자량이나 작용기가 상이한 폴리에틸렌글리콜 불순물을 제거하는 방법으로서는, 일본 특허 공개 제2014-208786호, 일본 특허 공개 제2011-79934호에 기재된 정제 기술을 이용할 수 있다.
반응 9
Figure pct00021
반응 9 중의 Pro, Peptide, L3 및 j2는 상기와 동의이다.
반응 9는, 탈보호 8로 얻어진 식 (19)로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 아미노기와, 식 (17)로 나타내는 아미노기가 보호기로 보호된 글루타민산 유도체의 2개의 카르복실기를 축합 반응으로 결합시켜, 4개의 분해성 폴리에틸렌글리콜쇄가 글루타민산 잔기로 연결된 구조인 식 (20)으로 나타내는 분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻는 공정이다. 상기 반응 2와 동일한 조건으로 반응과 정제가 가능하다.
탈보호 10
Figure pct00022
탈보호 10 중의 Peptide, L3 및 j2는 상기와 동의이다.
탈보호 10은, 반응 9로 얻어진 식 (20)으로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 보호기를 탈보호하여, 식 (21)로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻는 공정이다. 상기 탈보호 8과 동일한 조건으로 반응과 정제가 가능하다. 또한, 본 공정은, 반응 9의 일련의 공정에서 실시하는 것도 가능하다.
반응 11
Figure pct00023
반응 11 중의 Peptide, L3, j2 및 k3은 상기와 동의이다.
반응 11은 탈보호 8로 얻어진 식 (19)로 나타내는 2분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 말단의 아미노기를 염기 촉매 존재 하에 식 (22)로 나타내는 화합물과 반응시켜 수산기로 변환하여, 식 (23)으로 나타내는 2분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻는 공정이다. 상기 반응 4와 동일한 조건으로 반응과 정제가 가능하다.
또한, 반응 11 중의 식 (19)로 나타내는 2분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체 대신에 탈보호 10으로 얻어진 식 (21)로 나타내는 4분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 원료로 함으로써, 하기 식 (24)로 나타내는 4분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻을 수 있다.
Figure pct00024
식 (24)의 Peptide, L3, j2 및 k3은 상기와 동의이다.
반응 12
Figure pct00025
반응 12 중의 Peptide, L3, j2 및 k3은 상기와 동의이다.
반응 12는 반응 11로 얻어진 식 (23)으로 나타내는 2분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 수산기와 식 (25)로 나타내는 화합물을 반응시켜, 활성 카보네이트기를 도입한 식 (26)으로 나타내는 2분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻는 공정이며, 본 공정은 반응 11의 공정의 일환으로서 실시하는 것도 가능하고, 상기 반응 5와 동일한 조건으로 반응과 정제가 가능하다.
또한, 반응 12 중의 식 (23)으로 나타내는 2분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체 대신에 식 (24)로 나타내는 4분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 원료로 함으로써, 하기 식 (27)로 나타내는 4분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻을 수 있다.
Figure pct00026
식 (27)의 Peptide, L3, j2 및 k3은 상기와 동의이다.
반응 13
Figure pct00027
반응 13 중의 Peptide, R, L3, j1, j2, k1, k2 및 k3은 상기와 동의이다.
반응 13은 반응 1로 얻어진 식 (5)로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 아미노기와 반응 12로 얻어진 식 (26)으로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 활성 에스테르기를 반응으로 결합시켜, 식 (28)로 나타내는 3분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻는 공정이며, 상기 반응 6과 동일한 조건으로 반응과 정제가 가능하다.
또한, 반응 13 중의 식 (26)으로 나타내는 2분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체 대신에 식 (27)로 나타내는 4분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 원료로 함으로써, 하기 식 (29)로 나타내는 5분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻을 수 있다.
Figure pct00028
식 (29)의 Peptide, R, L3, j1, j2, k1, k2 및 k3은 상기와 동의이다.
식 (28) 또는 식 (29)로 나타내는 분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 말단 카르복실기를 다른 작용기로 변환하는 공정에 대해서, 전형적인 예를 이하에 설명하지만, 변환 방법은 이에 한정되는 것이 아니다.
예컨대, 식 (28) 또는 식 (29)로 나타내는 분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 말단 카르복실기를 말레이미드기로 변환하고자 하는 경우는, N-(2-아미노에틸)말레이미드와 염기 촉매 존재 하에 축합 반응시킴으로써, 목적물을 얻을 수 있다.
예컨대, 식 (28) 또는 식 (29)로 나타내는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 말단 카르복실기를 아미노기로 변환하고자 하는 경우는, N-(9-H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐)-1,2-에탄디아민와 염기 촉매 존재 하에 축합 반응시킨 후, 탈보호 반응시킴으로써 얻을 수 있다.
이들 반응 시약은, 저분자량의 시약이며, 고분자량의 폴리머인 폴리에틸렌글리콜 유도체와는 크게 용해성이 상이하기 때문에, 추출이나 정석 등의 일반적인 정제 방법으로 용이하게 제거가 가능하다.
이상과 같은 공정을 거쳐, 얻어진 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜은, 혈중에서 안정적이며, 세포 내에서만 분해되는 성능을 갖는 것이 요구된다. 그 성능을 적절하게 평가하기 위해, 예컨대, 이하에 나타내는 것과 같은 시험을 실시하여, 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜의 혈중에서의 안정성, 그리고 세포 내에서의 분해성을 평가할 수 있다.
또한, 이들 평가에 있어서 폴리에틸렌글리콜 유도체가 갖는 작용기의 종류에 따른 영향을 고려하여, 평가 시료는 전부, 아미노기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 유도체로 통일하여 시험을 실시하였다.
분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 혈중에서의 안정성을 평가하기 위한 시험 방법에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, 예컨대, 마우스, 래트, 인간 등의 혈청을 이용한 시험 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 폴리에틸렌글리콜 유도체를 1∼10 ㎎/mL의 농도가 되도록 혈청에 용해하여, 37℃에서 96시간 인큐베이트 후, 혈청 중에 포함되는 폴리에틸렌글리콜 유도체를 회수하여, GPC를 측정함으로써 분해율을 평가할 수 있다. 분해율은, 안정성 시험 전의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 GPC 메인 프랙션의 피크 면적%와, 안정성 시험 후의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 GPC 메인 프랙션의 피크 면적%로부터 산출한다. 구체적으로는 이하의 식을 이용한다.
분해율=(시험 전의 피크 면적%-시험 후의 피크 면적%)÷시험 전의 피크 면적%×100
예컨대, 안정성 시험 전의 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 GPC 메인 프랙션의 피크 면적%가 95%이며, 시험 후의 GPC 메인 프랙션의 피크 면적%가 90%였다고 하면, 분해율은 이하와 같이 산출된다.
분해율=(95-90)÷95×100=5.26(%)
분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 혈중에서 분해되어 버리면, 목적으로 하는 혈중 반감기를 얻을 수 없기 때문에, 안정성 시험에 있어서, 96시간 후의 분해율은, 10% 이하가 바람직하고, 5% 이하가 더욱 바람직하다.
분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 세포 내에서의 분해성을 평가하기 위한 시험 방법에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, 예컨대, 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 함유한 배지를 이용하여, 세포를 배양시키는 시험 등을 들 수 있다. 여기서 사용하는 세포나 배지에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, 구체적으로는, 폴리에틸렌글리콜 유도체를 1∼20 ㎎/mL의 농도가 되도록 배지인 RPMI-1640에 용해하고, 이 배지를 이용하여, 매크로파지 세포 RAW 264.7을 37℃에서 96시간 배양 후, 세포 중의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 회수하여, GPC를 측정함으로써 분해율을 평가할 수 있다. 분해율은, 안정성 시험과 마찬가지로, 시험 전후의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 GPC 메인 프랙션의 피크 면적%를 이용하여 산출한다.
예컨대, 세포를 이용한 분해성 시험 전의 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 GPC 메인 프랙션의 피크 면적%가 95%이며, 시험 후의 GPC 메인 프랙션의 피크 면적%가 5%였다고 하면, 분해율은 이하와 같이 산출된다.
분해율=(95-5)÷95×100=94.7(%)
분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 세포 내에서 효율적으로 분해되지 않으면, 목적으로 하는 세포의 공포를 억제할 수 없기 때문에, 분해성 시험에 있어서, 96시간 후의 분해율은, 90% 이상이 바람직하고, 95% 이상이 더욱 바람직하다.
비특허문헌 2에서는, 고분자량의 폴리에틸렌글리콜에 의한 세포의 공포화는, 폴리에틸렌글리콜의 조직에의 축적과 관계가 있다는 기재가 있다. 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 세포에의 축적성을 평가하기 위한 시험 방법에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, 상기 세포 내에서의 분해성에 의해 평가할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것이 아니다.
하기 실시예에서 얻어진 1H-NMR은, 니혼덴시데이텀(주) 제조 JNM-ECP400 또는 JNM-ECA600으로부터 얻었다. 측정에는 φ5 ㎜ 튜브를 이용하고, 중수소화 용매에는, D2O 또는 내부 표준 물질로서 테트라메틸실란(TMS)을 함유하는 CDCl3 및 d6-DMSO를 이용하였다. 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체의 분자량 및 말단 작용기 순도는, 액체 크로마토그래피(GPC 및 HPLC)를 이용하여 산출하였다. 액체 크로마토그래피의 시스템은, GPC에는 도소(주) 제조 「HLC-8320GPC EcoSEC」를 이용하고, HPLC에는 WATERS사 제조 「ALLIANCE」를 이용하였다.
[실시예 1]
Figure pct00029
[실시예 1-1]
Figure pct00030
평균 분자량=20,000, 니치유 가부시키가이샤 제조 「SUNBRIGHT MEH-20T」)(10 g)를 톨루엔(40 g)에 용해하여, 110℃에서 1시간 환류 탈수한 후, 40℃까지 냉각하고 트리에틸아민(80 ㎎), 염화메탄술포닐(84 ㎎)을 첨가하여, 40℃에서 3시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 톨루엔(100 g)으로 희석한 후, 헥산(100 g)을 더하고, 실온에서 30분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, 아세트산에틸(200 g)에 용해하고, 헥산(100 g)을 더하고 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, 헥산(100 g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 화합물 (p1)을 얻었다. 수량(收量) 8.9 g.
1H-NMR(CDCl3): 3.08 ppm(s, 3H, -O-SO2-CH 3 ), 3.38 ppm(s, 3H, -O-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)j-O-CH 3 ), 3.64 ppm(m, 약 1,900H, -O-CH2-CH2-(O-CH 2 -CH 2 )j-O-CH3)
[실시예 1-2]
Figure pct00031
염산글리신(5 g)을, 이온 교환수(50 g)에 용해하였다. NaOH(3.0 g)를, 상기 글리신 수용액에 더하여, pH를 10.8로 조정하였다. 그 후, 실시예 1-1로 얻어진 화합물 (p1)(8 g)을 상기 수용액에 첨가하고, 그 용액을 40℃에서 72시간 반응시켰다. 반응 후, 염산 용액으로 반응액의 pH를 약 7로 중화하였다. 중화 후, 클로로포름(50 g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반한 후, 유기층을 회수하였다. 유기층을 농축하고, 아세트산에틸(100 g)에 재용해하고 헥산(50 g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, 헥산(50 g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 화합물 (p2)를 얻었다. 수량 6.8 g.
1H-NMR(d6-DMSO): 2.72 ppm(t, 2H, -NH-CH 2 -CH2-(O-CH2-CH2)j-O-CH3), 3.24 ppm(s, 3H, -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)j-O-CH 3 ), 3.48 ppm(m, 약 1,900H, -CH 2 -NH-CH2-CH 2 -(O-CH 2 -CH 2 )j-O-CH3), 5.52 ppm(broad, 1H, -NH-CH2-COOH)
[실시예 1-3]
Figure pct00032
N 말단을 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc기)로 보호한 L-페닐알라닐-글리신(Fmoc-Phe-Gly)(0.44 g)과 평균 분자량=20,000, 니치유 가부시키가이샤 제조 「SUNBRIGHT MEPA-20T」(10 g)에 아세토니트릴(40 g)을 첨가하여 용해하였다. 그 후, 디이소프로필에틸아민(1.56 g)과 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드 n수화물(DMT-MM)(0.22 g)을 첨가하여, 실온에서 질소 분위기 하에 1시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 40℃에서 농축하고, 농축물에 톨루엔(100 g)을 첨가하여 균일해지도록 교반한 후, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하였다. 얻어진 여액에 헥산(100 g)을 더하고, 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, 재차 톨루엔(100 g)에 용해하고, 헥산(100 g)을 더하고, 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, 헥산(50 g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p3)을 얻었다. 수량 8.6 g.
1H-NMR(d6-DMSO): 1.62 ppm(m, 2H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3), 2.80 ppm(m, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.04 ppm(m, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.10 ppm(m, 2H, -CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3), 3.24 ppm(s, 3H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH 3 ), 3.48 ppm(m, 약 1,900H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)j-CH3), 4.20 ppm(m, 4H), 7.33 ppm(m, 9H), 7.66 ppm(m, 4H, Ar), 7.88 ppm(d, 2H, Ar), 8.27 ppm(t, 1H)
[실시예 1-4]
Figure pct00033
화합물 (p3)(8.0 g)을 아세토니트릴(40 g)에 용해하였다. 그 후, 피페리딘(0.86 g)을 첨가하여, 실온에서 질소 분위기 하에 2시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 20% 식염수(80 g)를 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여 세정을 행하였다. 유기층과 수층을 분리한 후, 재차, 유기층에 20% 식염수(80 g)를 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여 세정을 행하고, 유기층을 회수하였다. 얻어진 유기층을 40℃에서 농축하고, 농축물에 톨루엔(200 g), 황산마그네슘(10 g)을 첨가하고, 실온에서 30분 교반하여 탈수한 후, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하였다. 얻어진 여액에 헥산(100 g)을 첨가하고 실온에서 15분 교반하여, 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, 헥산(100 g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p4)를 얻었다. 수량 7.2 g.
HPLC: 아민 순도 92%.
1H-NMR(d6-DMSO): 1.62 ppm(m, 2H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3), 1.64 ppm(broad, 1H), 2.59 ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 2.98 ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.10 ppm(q, 2H, -CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3), 3.24 ppm(s, 3H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH 3 ), 3.48 ppm(m, 약 1,900H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)j-CH3), 7.24 ppm(m, 6H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 , -NH-), 7.73 ppm(t, 1H), 8.12 ppm(broad, 1H)
[실시예 1-5]
Figure pct00034
실시예 1-4로 얻어진 화합물 (p4)(6.0 g), 초산나트륨(49 ㎎), 무수 글루타르산(51 ㎎)을 톨루엔(25 g)에 용해하여, 질소 분위기 하에 40℃에서 7시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 톨루엔(20 g)으로 희석하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 얻어진 여액에 헥산(30 g)을 첨가하고 실온에서 15분 교반하여, 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수하였다. 얻어진 석출물을 아세트산에틸(100 g)에 용해하고, 헥산(50 g)을 첨가하고 실온에서 15분 교반하여, 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수하고, 헥산(50 g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p5)를 얻었다. 수량 4.8 g.
1H-NMR(d6-DMSO): 1.62 ppm(m, 2H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3), 1.64 ppm(broad, 1H), 2.05 ppm(dd, 2H, -NH-CO-CH2-CH 2 -CH2-COOH), 2.30 ppm(m, 4H, -NH-CO-CH 2 -CH2-CH 2 -COOH), 2.59 ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 2.98 ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.10 ppm(q, 2H, -CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3), 3.24 ppm(s, 3H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH 3 ), 3.48 ppm(m, 약 1,900H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)j-CH3), 7.24 ppm(m, 6H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 , -NH-), 7.73 ppm(t, 1H), 8.12 ppm(broad, 1H)
[실시예 1-6]
Figure pct00035
실시예 1-5로 얻어진 화합물 (p5)(4.5 g) 및 N-히드록시숙신이미드(103 ㎎)를 톨루엔(25 g)에 용해하였다. 그 후, 디시클로헥실카르보디이미드(139 ㎎)를 첨가하여, 40℃에서 질소 분위기 하에 3시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 톨루엔(50 g)을 첨가하여 희석하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 얻어진 여액에 헥산(50 g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여, 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, 아세트산에틸(100 g)에 용해하고, 헥산(50 g)을 첨가하고 실온에서 15분 교반하여, 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, 헥산(50 g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p6)을 얻었다. 수량 3.5 g.
활성 에스테르 순도는 98%(1H-NMR).
1H-NMR(d6-DMSO): 1.62 ppm(m, 2H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3), 1.64 ppm(broad, 1H), 2.05 ppm(dd, 2H, -NH-CO-CH2-CH 2 -CH2-CO-), 2.30 ppm(m, 4H, -NH-CO-CH 2 -CH2-CH 2 -COO-), 2.59 ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 2.72 ppm(s, 4H, -CO-CH 2 -CH 2 -CO-), 2.98 ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.10 ppm(q, 2H, -CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3), 3.24 ppm(s, 3H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH 3 ), 3.48 ppm(m, 약 1,900H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)j-CH3), 7.24 ppm(m, 6H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 , -NH-), 7.73 ppm(t, 1H), 8.12 ppm(broad, 1H)
[실시예 1-7]
Figure pct00036
실시예 1-2로 얻어진 화합물 (p2)(3.0 g)와 실시예 1-6으로 얻어진 화합물 (p6)(3.0 g)을 디클로로메탄(60 g)에 용해한 후, 트리에틸아민(95 ㎎)을 첨가하여 실온에서 8시간 반응시켰다. 반응 후, 20% 식염수(50 g)를 첨가하고, 실온에서 15분 교반하고, 반응액을 세정한 후, 유기층을 회수하였다. 유기층에 황산마그네슘(10 g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반한 후, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하였다. 얻어진 여액을 농축한 후, 농축물을 아세트산에틸(100 g)에 용해하고, 헥산(50 g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여, 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, 재차, 아세트산에틸(100 g)에 용해하고, 헥산(50 g)을 첨가하고 실온에서 15분 교반하여, 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, 2,6-디-tert-부틸-p-크레졸(BHT)(10 ㎎)을 함유한 헥산(50 g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p7)을 얻었다. 수량 4.2 g.
HPLC: 카르복실산 순도는 95%.
1H-NMR(d6-DMSO): 1.62 ppm(m, 2H, CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3), 1.64 ppm(broad, 1H), 2.05 ppm(dd, 2H, -NH-CO-CH2-CH 2 -CH2-CO-), 2.30 ppm(m, 4H, -NH-CO-CH 2 -CH2-CH 2 -CO-), 2.59 ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 2.98 ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.24 ppm(s, 3H, -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)j-O-CH 3 ), 3.48 ppm(m, 약 3,800H, -CH2-NH-CH2-CH2-(O-CH 2 -CH 2 )j-O-CH3), 4.61 ppm(-CH 2 -COOH), 7.24 ppm(m, 6H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 , -NH-), 7.73 ppm(t, 1H), 8.12 ppm(broad, 1H))
[실시예 2]
Figure pct00037
실시예 1-7로 얻어진 화합물 (p7)(2.0 g)과 N-Fmoc-에틸렌디아민(32 ㎎)을 아세토니트릴(5.0 g)에 용해하였다. 그 후, 디이소프로필에틸아민(16 ㎎)과 DMT-MM(415 ㎎)을 첨가하여, 실온에서 질소 분위기 하에 2시간 반응시켰다. 그 후, 피페리딘(107 ㎎)을 첨가하여, 실온에서 질소 분위기 하에 2시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 농축하여, 농축물을 클로로포름(50 g)에 재용해하고, 20% 식염수(25 g)를 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여 세정을 행하여, 유기층을 회수하였다. 얻어진 유기층에 황산마그네슘(10 g)을 첨가하고, 실온에서 30분 교반하여 탈수한 후, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하였다. 얻어진 여액을 40℃에서 농축하고, 농축물에 톨루엔(100 g)을 첨가하여 용해하고, 헥산(50 g)을 첨가하고 실온에서 15분 교반하여, 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, BHT를 6 ㎎ 함유한 헥산(30 g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p8)을 얻었다. 수량 1.3 g.
HPLC: 아민 순도는 93%.
1H-NMR(d6-DMSO): 1.62 ppm(m, 2H, CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3), 1.64 ppm(broad, 1H), 2.05 ppm(dd, 2H, -NH-CO-CH2-CH 2 -CH2-CO-), 2.30 ppm(m, 4H, -NH-CO-CH 2 -CH2-CH 2 -CO-), 2.59 ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 2.76 ppm(m, 2H, -NH-CH2-CH 2 -NH2), 2.98 ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.24 ppm(s, 3H, -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)j-O-CH 3 ), 3.48 ppm(m, 약 3,800H, -CH2-NH-CH2-CH2-(O-CH 2 -CH 2 )j-O-CH3), 7.24 ppm(m, 6H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 , -NH-), 7.73 ppm(t, 1H), 7.80 ppm(broad, 1H), 8.12 ppm(broad, 1H)
[실시예 3]
Figure pct00038
실시예 1-7로 얻어진 화합물 (p7)(300 ㎎)을 아세토니트릴(2 g)에 용해하였다. 그 후, N-히드록시숙신이미드(6 ㎎)와 디시클로헥실카르보디이미드(6 ㎎)를 첨가하여, 40℃에서 질소 분위기 하에 3시간 반응시켰다. 그 후, 트리에틸아민(3 ㎎)과 N-(2-아미노에틸)말레이미드염산염(5 ㎎)을 첨가하여, 40℃에서 질소 분위기 하에 3시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 농축하고, 농축물을 아세트산에틸(50 g)에 용해하고, 헥산(30 g)을 첨가하고 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, 재차 아세트산에틸(50 g)에 용해하고, 헥산(30 g)을 첨가하고 실온에서 15분 교반하여, 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, BHT(6 ㎎)를 함유한 헥산(30 g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p9)를 얻었다. 수량 264 ㎎. 말레이미드 순도는 92%(1H-NMR).
1H-NMR(d6-DMSO): 1.62 ppm(m, 2H, CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3), 1.64 ppm(broad, 1H), 2.05 ppm(dd, 2H, -NH-CO-CH2-CH 2 -CH2-CO-), 2.30 ppm(m, 4H, -NH-CO-CH 2 -CH2-CH 2 -CO-), 2.59 ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 2.66 ppm(t, 2H, -NH-CO-CH 2 -CH2-Maleimide), 2.98 ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.24 ppm(s, 3H, -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)j-O-CH 3 ), 3.48 ppm(m, 약 3,800H, -CH2-NH-CH2-CH2-(O-CH 2 -CH 2 )j-O-CH3), 4.76 ppm(t, 2H, -NH-CO-CH2-CH 2 -Maleimide), 6.98 ppm(s, 2H, -CO-CH-CH-CO-), 7.24 ppm(m, 6H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 , -NH-), 7.73 ppm(t, 1H), 7.80 ppm(broad, 1H), 8.01 ppm(broad, 1H), 8.12 ppm(broad, 1H)
[실시예 4]
Figure pct00039
실시예 1-7로 얻어진 화합물 (p7)(1.2 g)에 톨루엔(6 g)을 첨가하여, 40℃에서 가온 용해하였다. 그 후, N-히드록시숙신이미드(24 ㎎)와 디시클로헥실카르보디이미드(24 ㎎)를 첨가하여, 40℃에서 질소 분위기 하에 3시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 얻어진 여액을 아세트산에틸(100 g)로 희석하고, 헥산(50 g)을 첨가하고 실온에서 30분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, BHT(10 ㎎)를 함유한 헥산(50 g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p10)을 얻었다. 수량 1.0 g. 활성 에스테르 순도는 91%(1H-NMR).
1H-NMR(d6-DMSO): 1.62 ppm(m, 2H, CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3), 1.64 ppm(broad, 1H), 2.05 ppm(dd, 2H, -NH-CO-CH2-CH 2 -CH2-CO-), 2.30 ppm(m, 4H, -NH-CO-CH 2 -CH2-CH 2 -CO-), 2.59 ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 2.72 ppm(s, 4H, -CO-CH 2 -CH 2 -CO-), 2.98 ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.24 ppm(s, 3H, -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)j-O-CH 3 ), 3.48 ppm(m, 약 3,800H, -CH2-NH-CH2-CH2-(O-CH 2 -CH 2 )j-O-CH3), 4.61 ppm(-CH 2 -OCO-Succinimide), 7.24 ppm(m, 6H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 , -NH-), 7.73 ppm(t, 1H), 8.12 ppm(broad, 1H)
[실시예 5]
Figure pct00040
[실시예 5-1]
Figure pct00041
실시예 1-7로 얻어진 화합물 (p7)(800 ㎎)을 톨루엔(7 g)에 40℃에서 가온 용해한 후, 3-아미노프로피온알데히드디에틸아세탈(9 ㎎)을 첨가하여, 50℃에서 질소 분위기 하에 2시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 아세트산에틸(100 g)을 첨가하고, 균일해질 때까지 교반하고, 헥산(50 g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, BHT(10 ㎎)를 함유한 헥산(50 g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p11)을 얻었다. 수량 684 ㎎.
1H-NMR(d6-DMSO): 1.20 ppm(t, 6H(CH 3 -CH2-O)2-CH-), 1.62 ppm(m, 2H, CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3), 1.64 ppm(broad, 1H), 1.85 ppm(dd, 2H, -NH-CH2-CH 2 -CH-(O-CH2-CH3)2), 2.05 ppm(dd, 2H, -NH-CO-CH2-CH 2 -CH2-CO-), 2.30 ppm(m, 4H, -NH-CO-CH 2 -CH2-CH 2 -CO-), 2.59 ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 2.98 ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.24 ppm(s, 3H, -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)j-O-CH 3 ), 3.48 ppm(m, 약 3,800H, -CH2-NH-CH2-CH2-(O-CH 2 -CH 2 )j-O-CH3), 3.91 ppm(-CH 2 -CO-NH-CH2-CH2-CH-(O-CH2-CH3)2), 4.55 ppm(t, 1H, -CH-(O-CH2-CH3)2), 7.24 ppm(m, 6H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 , -NH-), 7.73 ppm(t, 1H), 8.12 ppm(broad, 1H)
[실시예 5-2]
Figure pct00042
실시예 5-1로 얻어진 화합물 (p11)(600 ㎎)을 pH 1.90으로 조정한 인산 완충액(6.0 g)에 용해하여, 실온에서 질소 분위기 하에 3시간 반응시켰다. 반응 후, 0.1N 수산화나트륨 수용액을 첨가하여, pH 6.5로 조정한 후, 염화나트륨(1.5 g)을 첨가하여 용해하였다. 얻어진 용액에 0.1N 수산화나트륨 수용액을 첨가하여, pH를 7.10으로 조정한 후, BHT(2 ㎎) 함유의 클로로포름(10 g)을 첨가하고 실온에서 20분 교반하여, 유기층에 생성물을 추출하였다. 유기층과 수층을 분리하여, 유기층을 회수한 후, 수층에 재차 BHT(4 ㎎) 함유의 클로로포름(20 g)을 첨가하고, 실온에서 20분 교반하여, 유기층에 생성물을 추출하였다. 추출 1회째와 2회째에 얻어진 유기층을 합하여 40℃에서 농축하고, 얻어진 농축물을 아세트산에틸(50 g)에 용해하고, 헥산(30 g)을 더하고 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, BHT(6 ㎎)를 함유한 헥산(30 g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p12)를 얻었다. 수량 457 ㎎. 알데히드 순도는 90%(1H-NMR).
1H-NMR(d6-DMSO): 1.62 ppm(m, 2H, CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3), 1.64 ppm(broad, 1H), 2.05 ppm(dd, 2H, -NH-CO-CH2-CH 2 -CH2-CO-), 2.30 ppm(m, 4H, -NH-CO-CH 2 -CH2-CH 2 -CO-), 2.59 ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 2.66 ppm(dd, 2H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CHO), 2.98 ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.24 ppm(s, 3H, -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)j-O-CH 3 ), 3.48 ppm(m, 약 3,800H, -CH2-NH-CH2-CH2-(O-CH 2 -CH 2 )j-O-CH3), 3.91 ppm(s, 2H, -CH 2 -CO-NH-CH2-CH2-CHO), 7.24 ppm(m, 6H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 , -NH-), 7.73 ppm(t, 1H), 8.12 ppm(broad, 1H), 9.72 ppm(s, 1H, -CO-NH-CH2-CH2-CHO)
[실시예 6]
Figure pct00043
[실시예 6-1]
Figure pct00044
N 말단을 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc기)로 보호한 L-글루타민산(Fmoc-Glu-OH)(16.0 ㎎)과 실시예 1-4로 얻어진 화합물 (p4)(2.0 g)에 아세토니트릴(10 g)을 첨가하여, 30℃에서 가온 용해하였다. 그 후, 디이소프로필에틸아민(15 ㎎)과 DMT-MM(39.0 ㎎)을 첨가하여, 실온에서 질소 분위기 하에 1시간 반응시켰다. 그 후, 피페리딘(111 ㎎)을 첨가하여, 실온에서 질소 분위기 하에 2시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응액을 톨루엔(80 g)으로 희석한 후, 헥산(40 g)을 더하고, 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, 재차 톨루엔(100 g)에 용해하고, 헥산(50 g)을 더하고, 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, BHT(10 ㎎)를 함유한 헥산(50 g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p13)을 얻었다. 수량 1.6 g.
HPLC: 아민 순도 92%.
1H-NMR(d6-DMSO): 1.54 ppm(m, 2H, -NH-CO-CH(NH2)-CH 2 -CH2-), 1.62 ppm(m, 4H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-), 1.97 ppm(m, 2H, -NH-CO-CH(NH2)-CH2-CH 2 -), 2.74 ppm(dd, 1H, -CO-NH-CH-CH 2 -C6H5), 2.81 ppm(dd, 1H, -CO-NH-CH-CH 2 -C6H5), 3.11 ppm(m, 11H), 3.24 ppm(s, 6H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH 3 ), 3.64 ppm(m, 약 3,800H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)j-CH3), 4.49 ppm(m, 1H, -CO-NH-CH-CH2-C6H5), 4.57 ppm(m, 1H, -CO-NH-CH-CH2-C6H5), 7.25 ppm(m, 10H, -CO-NH-CH-CH2-C 6 H 5 ), 7.74 ppm(m, 2H), 8.44 ppm(m, 2H), 8.61 ppm(m, 2H)
[실시예 6-2]
Figure pct00045
ε-카프로락톤(114 ㎎)을 1N NaOH(0.8 mL)에 용해하여 2시간 반응시켜, 6-히드록시카프론산 수용액(0.88 M)을 조제하였다. 또한, 실시예 6-1로 얻어진 화합물 (p13)(1.5 g)을 아세토니트릴(6 g)에 용해하였다. 그 후, 상기 6-히드록시카프론산 수용액(80 μL)과 디이소프로필에틸아민(15 ㎎)과 DMT-MM(16 ㎎)을 첨가하여, 실온에서 질소 분위기 하에 1시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응액을 40℃에서 농축하고, 얻어진 농축물에 클로로포름(30 g)을 첨가하여 용해하였다. 포화 탄산수소나트륨 수용액(15 g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여 세정을 행하였다. 수층과 유기층을 분리한 후, 재차, 유기층에 포화 탄산수소나트륨 수용액(15 g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여 세정을 행하고, 유기층을 회수하였다. 얻어진 클로로포름 용액에 황산마그네슘(5 g)을 첨가하고, 30분 교반하여 탈수한 후, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여액을 40℃에서 농축하고, 농축물에 아세트산에틸(50 g)을 첨가하고 균일해지도록 교반한 후, 헥산(25 g)을 더하고, 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, 재차 아세트산에틸(50 g)에 용해하고, 헥산(25 g)을 더하고, 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, BHT(10 ㎎) 함유의 헥산(50 g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p14)를 얻었다. 수량 1.2 g.
1H-NMR(CDCl3): 1.37 ppm(m, 2H, HO-CH2-CH2-CH 2 -CH2-CH2-CO-NH-), 1.55 ppm(m, 4H, HO-CH2-CH 2 -CH2-CH 2 -CH2-CO-NH-), 1.77 ppm(m, 4H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3), 1.85 ppm(m, 1H), 2.01 ppm(m, 2H, HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH 2 -CO-NH-), 3.01 ppm(m, 1H), 3.24 ppm(m, 8H), 3.38 ppm(s, 6H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH 3 ), 3.64 ppm(m, 약 3,800H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)j-CH3), 4.03 ppm(m, 4H), 4.14 ppm(m, 1H), 4.48 ppm(m, 2H, -CO-NH-CH-CH2-C6H5), 6.95 ppm(broad, 1H), 7.00 ppm(broad, 1H), 7.26 ppm(m, 10H, -CO-NH-CH-CH2-C 6 H 5 ), 7.66 ppm(broad, 1H), 8.29 ppm(broad, 1H)
[실시예 6-3]
Figure pct00046
실시예 6-2로 얻어진 화합물 (p14)(500 ㎎)를 디클로로메탄(3.5 g)에 용해하였다. 그 후, 탄산디(N-숙신이미딜)(51 ㎎)과 피리딘(20 ㎎)을 첨가하여, 실온에서 질소 분위기 하에 8시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 5% 식염수(5 g)로 반응액을 세정하고 황산마그네슘(0.1 g)을 더하고, 25℃에서 30분 교반한 후, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여액을 농축한 후, 농축물에 아세트산에틸(100 g)을 첨가하여 용해한 후, 헥산(50 g)을 더하고 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, BHT(5 ㎎) 함유의 헥산(25 g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p15)를 얻었다. 수량 286 ㎎. 활성 카보네이트 순도는 91%(1H-NMR)
1H-NMR(CDCl3): 1.38 ppm(m, 2H, Succinimide-OCO-CH2-CH2-CH 2 -CH2-CH2-CO-NH-), 1.59 ppm(m, 2H, Succinimide-OCO-CH2-CH2-CH2-CH 2 -CH2-CO-NH-), 1.75 ppm(m, 6H), 1.85 ppm(m, 1H), 2.13 ppm(m, 2H, Succinimide-OCO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH 2 -CO-NH-), 2.83 ppm(s, 4H, -CO-CH 2 -CH 2 -CO-), 3.01 ppm(m, 1H), 3.19 ppm(m, 6H), 3.38 ppm(s, 6H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH 3 ), 3.64 ppm(m, 약 3,800H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)j-CH3), 4.03 ppm(m, 3H), 4.18 ppm(m, 1H), 4.31 ppm(t, 2H, Succinimide-OCO-CH 2 -CH2-CH2-CH2-CH2-CO-NH-), 4.50 ppm(m, 2H, -CO-NH-CH-CH2-C6H5), 6.98 ppm(broad, 1H), 7.15 ppm(broad, 1H), 7.26 ppm(m, 10H, -CO-NH-CH-CH2-C 6 H 5 ), 7.81 ppm(broad, 1H), 8.37 ppm(broad, 1H)
[실시예 6-4]
Figure pct00047
실시예 1-2로 얻어진 화합물 (p2)(125 ㎎)와 실시예 6-3으로 얻어진 화합물 (p15)(250 ㎎)를 디클로로메탄(50 g)에 용해한 후, 트리에틸아민(0.5 g)을 첨가하여 실온에서 8시간 반응시켰다. 반응 후, 20% 식염수(20 g)를 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여, 반응액을 세정한 후, 유기층을 회수하였다. 유기층에 황산마그네슘(5 g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반한 후, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하였다. 얻어진 여액을 농축한 후, 농축물을 아세트산에틸(100 g)에 용해하고, 헥산(50 g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여, 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, BHT(4 ㎎)를 함유한 헥산(20 g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p16)을 얻었다. 수량 242 ㎎.
HPLC: 카르복실산 순도는 90%
1H-NMR(d6-DMSO): 1.29 ppm(m, 2H, -NH-CO-CH2-CH2-CH 2 -CH2-CH2-OCO-), 1.58 ppm(m, 4H, -NH-CO-CH2-CH 2 -CH2-CH 2 -CH2-OCO-), 1.75 ppm(m, 6H), 1.85 ppm(m, 1H), 2.13 ppm(m, 2H, -NH-CO-CH 2 -CH2-CH2-CH2-CH2-OCO-), 3.01 ppm(m, 1H), 3.19 ppm(m, 6H), 3.38 ppm(s, 6H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH 3 ), 3.64 ppm(m, 약 5,700H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)j-CH3), 3.90 ppm(t, 2H, -NH-CO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH 2 -OCO-), 4.03 ppm(m, 3H), 4.18 ppm(m, 1H), 4.37 ppm(s, 2H, -CH 2 -COOH), 4.50 ppm(m, 2H, -CO-NH-CH-CH2-C6H5), 6.98 ppm(broad, 1H), 7.15 ppm(broad, 1H), 7.26 ppm(m, 10H, -CO-NH-CH-CH2-C 6 H 5 ), 7.81 ppm(broad, 1H), 8.37 ppm(broad, 1H)
[비교예 1]
Figure pct00048
[비교예 1-1]
Figure pct00049
실시예 1-2로 얻어진 화합물(1 g)과 평균 분자량이 20,000인 니치유 가부시키가이샤 제조 「SUNBRIGHT ME-200GS3」(1 g)을 디클로로메탄(20 g)에 용해한 후, 트리에틸아민(0.2 g)을 첨가하여 실온에서 8시간 반응시켰다. 반응 후, 20% 식염수(10 g)를 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여, 반응액을 세정한 후, 유기층을 회수하였다. 유기층에 황산마그네슘(3 g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반한 후, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하였다. 얻어진 여액을 농축한 후, 농축물을 아세트산에틸(100 g)에 용해하고, 헥산(50 g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여, 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, BHT(6 ㎎)를 함유한 헥산(30 g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p17)을 얻었다. 수량 1.2 g.
HPLC: 카르복실산 순도는 93%.
1H-NMR(d6-DMSO): 1.73 ppm(m, 2H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-(O-CH2-CH2)j-), 2.03 ppm(m, 2H, -NH-CO-CH2-CH 2 -CH2-CO-N-), 2.34 ppm(t, 4H, -NH-CO-CH 2 -CH2-CH 2 -CO-N-), 3.40 ppm(s, 6H, -(O-CH2-CH2)j-O-CH 3 ), 3.55 ppm(m, 약 3,800H, -CH2-(O-CH 2 -CH 2 )j-O-CH3), 4.61 ppm(s, 2H, -CH 2 -COOH), 7.70 ppm(broad, 1H, -CH2-NH-CO-CH2-CH2-CH2-CO-)
[비교예 1-2]
Figure pct00050
비교예 1-1로 얻어진 화합물 (p17)(1.0 g)과 N-Fmoc-에틸렌디아민(16 ㎎)을 아세토니트릴(2.5 g)에 용해하였다. 그 후, 디이소프로필에틸아민(8 ㎎)과 DMT-MM(208 ㎎)을 첨가하여, 실온에서 질소 분위기 하에 2시간 반응시켰다. 그 후, 피페리딘(107 ㎎)을 첨가하여, 실온에서 질소 분위기 하에 2시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 농축하고, 농축물을 클로로포름(50 g)에 재용해하고, 20% 식염수(25 g)를 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여 세정을 행하고, 유기층을 회수하였다. 얻어진 유기층에 황산마그네슘(10 g)을 첨가하고, 실온에서 30분 교반하여 탈수한 후, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하였다. 얻어진 여액을 40℃에서 농축하고, 농축물에 톨루엔(100 g)을 첨가하여 용해하고, 헥산(50 g)을 첨가하고 실온에서 15분 교반하여, 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하여, 석출물을 회수한 후, BHT를 6 ㎎ 함유한 헥산(30 g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p8)을 얻었다. 수량 581 ㎎.
HPLC: 아민 순도는 90%.
1H-NMR(d6-DMSO): 1.73 ppm(m, 2H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-(O-CH2-CH2)j-), 2.03 ppm(m, 2H, -NH-CO-CH2-CH 2 -CH2-CO-N-), 2.34 ppm(t, 4H, -NH-CO-CH 2 -CH2-CH 2 -CO-N-), 2.76 ppm(m, 2H, -CH2-CO-NH-CH2-CH 2 -NH2), 3.40 ppm(s, 6H, -(O-CH2-CH2)j-O-CH 3 ), 3.55 ppm(m, 약 3,800H, -CH2-(O-CH 2 -CH 2 )j-O-CH3), 3.66 ppm(m, 2H, -CH2-CO-NH-CH 2 -CH2-NH2), 3.91 ppm(s, 2H, -N-CH 2 -CO-NH-), 7.70 ppm(broad, 1H, -CH2-NH-CO-CH2-CH2-CH2-CO-), 7.83 ppm(broad, 1H, -CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH2)
[실시예 8]
혈청 중에서의 안정성 시험
1.5 mL의 에펜도르프 튜브에, 마우스 또는 인간 혈청 1 mL를 더하고, 실시예 2로 얻어진 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체인 화합물 (p8), 비교예 1-2로 얻어진 비분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체인 화합물 (p18) 및 메톡시 PEG 아민 40 kDa를 각각 5.0 ㎎/mL의 농도가 되도록 첨가하였다. 37℃에서 96시간 인큐베이션 후, 200 μL를 샘플링하고, 거기에 아세토니트릴을 첨가하고, 볼텍스로 1분간 교반하여, 혈청 중의 단백질을 석출시키고, 원심 분리 후, 상청을 회수하였다. 다음으로 지방산 등의 소수성 물질을 제거하기 위해, 회수액에 헥산을 첨가하고, 볼텍스로 1분간 교반하여, 원심 분리 후, 하층을 회수하였다. 이 용액을 진공 조건에서 농축하여, 혈청 중으로부터 폴리에틸렌글리콜 유도체의 회수를 행하였다. 그 후, GPC 분석을 행하여, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 분해율을 산출하였다.
분해율은 이하의 식으로 산출하였다.
분해율=(시험 전의 40 kDa의 피크 면적%-시험 후의 40 kDa의 피크 면적%)÷(시험 전의 40 kDa의 피크 면적%)×100
결과를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00051
표 1에 따르면, 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체인 화합물 (p8)은, 비분해성의 폴리에틸렌글리콜 유도체인 화합물 (p18), 메톡시 PEG 아민 40 kDa와 마찬가지로, 혈청 중에 있어서 분해는 보이지 않았다. 즉, 상기 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체가 혈중에서는 안정적인 것으로 나타났다.
[실시예 9]
세포를 이용한 분해성 시험
배지 RPMI-1640(10% FBS Pn/St) 10 mL를 이용하고, 100 ㎜ 디쉬에 RAW 264.7을 10×106 cell 파종하여, 37℃에서 24시간 배양한 후, 실시예 2로 얻어진 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체인 화합물 (p8), 비교예 1-2로 얻어진 비분해성의 폴리에틸렌글리콜 유도체인 화합물 (p18) 및 메톡시 PEG 아민 40 kDa를 10 ㎎/mL의 농도가 되도록 용해한 배지로 각각 교환하여, 37℃에서 96시간 배양하였다. 배양 후, 세포를 1% SDS 용액으로 용해하고, PBS로 희석하고, 거기에 아세토니트릴을 첨가하고, 볼텍스로 1분간 교반하여, 세포 용해액 중의 단백질을 석출시키고, 원심 분리 후, 상청을 회수하였다. 다음으로 지방산 등의 소수성 물질을 제거하기 위해, 회수액에 헥산을 첨가하고, 볼텍스로 1분간 교반하여, 원심 분리 후, 하층을 회수하였다. 이 용액을 진공 조건에서 농축하여, 세포 내에서 폴리에틸렌글리콜 유도체의 회수를 행하였다.
또한, 세포 배양에 사용한 배지 중에서의 분해를 확인하기 위해, 각종 폴리에틸렌글리콜 유도체를 10 ㎎/mL의 농도가 되도록 용해한 배지에서만 37℃에서 96시간 배양하여, 상기와 동일한 조작으로 폴리에틸렌글리콜 유도체의 회수를 행하였다.
그 후, 회수한 각종 폴리에틸렌글리콜 유도체의 GPC 분석을 행하여, 실시예 8과 동일한 계산식으로 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 분해율을 산출하였다.
결과를 표 2에 나타낸다.
Figure pct00052
표 2에 따르면, 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체인 화합물 (p8)은, 세포 내에서 효과적으로 분해되어(분해율 99%), 분자량 4만에서 2만으로 분해되는 것을 확인할 수 있었다. 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 세포 배양에서 이용한 배지에서는 분해되지 않은 것으로부터, 세포 내에서 특이적으로 분해된 것을 확인할 수 있었다. 한편, 비분해성의 폴리에틸렌글리콜 유도체인 화합물 (p18) 및 메톡시 PEG 아민 40 kDa에 있어서는, 모두 세포 내에서의 분해는 보이지 않았다.
본 발명의 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 세포의 공포를 야기하지 않는 고분자량의 폴리에틸렌글리콜 유도체이며, 생체 관련 물질을 수식하는 용도로 효과적으로 이용할 수 있고, 생체 내의 혈중에서 안정적이며, 또한 세포 내에서 분해된다.
본 출원은 일본에서 출원된 일본 특허 출원 제2019-176251호를 기초로 하며, 그 내용은 본 명세서에 전부 포함되는 것이다.

Claims (12)

  1. 세포 내에서 분해되는 올리고펩티드를 분자 내에 갖는 하기 식 (1)로 나타내는 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
    Figure pct00053

    (식 중, k1 및 k2는 각각 독립적으로 1∼12이며, j1 및 j2는 각각 독립적으로 45∼950이며, R은 수소 원자, 치환 혹은 치환되지 않은 탄소수 1∼12의 알킬기, 치환 아릴기, 아랄킬기 또는 헤테로알킬기이며, Z는 세포 내의 효소로 분해되는 올리고펩티드이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 작용기이며, L1 및 L2는 각각 독립적으로 단결합 혹은 2가의 스페이서이다.)
  2. 제1항에 있어서, Z의 올리고펩티드가, 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼8 잔기의 분해성 올리고펩티드인 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Z의 올리고펩티드가, C 말단의 아미노산에 글리신을 갖는 펩티드인 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Z의 올리고펩티드가, 하이드로파시 지표가 2.5 이상인 소수성의 아미노산을 적어도 하나 갖는 올리고펩티드인 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, L1 및 L2가 각각 독립적으로, 단결합, 우레탄 결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 2급 아미노기, 우레아 결합, 또는 이들 결합 및/또는 기를 포함하는 알킬렌기인 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, X가 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데히드기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭시기, 말레이미드기, 비닐술포닐기, 아크릴기, 술포닐옥시기, 카르복시기, 티올기, 디티오피리딜기, α-할로아세틸기, 알키닐기, 알릴기, 비닐기, 아미노기, 옥시아미노기, 히드라지드기 및 아지드기로 이루어지는 군에서 선택되는, 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  7. 하기 식 (2)로 나타내는 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
    Figure pct00054

    (식 중, k1 및 k2는 각각 독립적으로 1∼12이며, j1 및 j2는 각각 독립적으로 45∼950이며, R은 수소 원자, 치환 혹은 치환되지 않은 탄소수 1∼4의 알킬기, 치환 아릴기, 아랄킬기 또는 헤테로알킬기이며, W는 글루타민산 또는 리신을 중심으로 한 대칭 구조의 5∼47 잔기의 올리고펩티드이며, a는 2∼8이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 작용기이며, L1 및 L2는 각각 독립적으로 단결합 혹은 2가의 스페이서이다.)
  8. 제7항에 있어서, W의 글루타민산 또는 리신을 중심으로 한 대칭 구조의 올리고펩티드가, 이하의 w1 또는 w2의 구조를 갖는 올리고펩티드인 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
    Figure pct00055

    Figure pct00056

    (식 중, Q는 글루타민산 또는 리신의 잔기이며, Z는 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼5 잔기의 분해성 올리고펩티드이다.)
  9. 제8항에 있어서, Z의 분해성 올리고펩티드가, C 말단의 아미노산으로서 글리신을 갖는 올리고펩티드인 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, Z의 분해성 올리고펩티드가, 하이드로파시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산을 적어도 하나 갖는 올리고펩티드인 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, L1 및 L2가 각각 독립적으로, 단결합, 우레탄 결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 2급 아미노기, 우레아 결합, 또는 이들의 결합 및/또는 기를 포함하고 있어도 좋은 알킬렌기인 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, X가 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데히드기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭시기, 말레이미드기, 비닐술포닐기, 아크릴기, 술포닐옥시기, 카르복시기, 티올기, 디티오피리딜기, α-할로아세틸기, 알키닐기, 알릴기, 비닐기, 아미노기, 옥시아미노기, 히드라지드기 및 아지드기로 이루어지는 군에서 선택되는, 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11477490B2 (en) 2020-01-03 2022-10-18 Mediatek Inc. Video processing method with sample adaptive offset filtering disabled across virtual boundary in reconstructed frame and associated video processing apparatus

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005108463A2 (en) 2004-05-03 2005-11-17 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polyethylen glycol derivates comprising an acetal or ketal branching point
WO2006088248A1 (ja) 2005-02-18 2006-08-24 Nof Corporation ポリオキシアルキレン誘導体
JP2009527581A (ja) 2006-02-21 2009-07-30 ネクター セラピューティックス エイエル，コーポレイション 分割型の分解性重合体とそれから生成される複合体

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5618248B2 (ja) 2009-10-06 2014-11-05 日油株式会社 カルボキシル基含有ポリオキシエチレン誘導体の精製方法
CN105189606B (zh) 2013-03-27 2017-06-09 日油株式会社 具有一个氨基的聚乙二醇的纯化方法
CN106421806B (zh) * 2016-11-14 2019-10-18 四川大学 一种逐级响应纳米自组装树枝状前药及制备方法和应用
JP6960362B2 (ja) 2018-03-27 2021-11-05 株式会社日立情報通信エンジニアリング 認証システム及び認証方法
CN112135838A (zh) * 2018-03-29 2020-12-25 日油株式会社 分解性聚乙二醇键合物
US20220387609A1 (en) * 2019-03-29 2022-12-08 Nof Corporation Branched degradable polyethylene glycol binder
WO2020203625A1 (ja) * 2019-03-29 2020-10-08 日油株式会社 分岐型分解性ポリエチレングリコール誘導体

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005108463A2 (en) 2004-05-03 2005-11-17 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polyethylen glycol derivates comprising an acetal or ketal branching point
WO2006088248A1 (ja) 2005-02-18 2006-08-24 Nof Corporation ポリオキシアルキレン誘導体
JP2009527581A (ja) 2006-02-21 2009-07-30 ネクター セラピューティックス エイエル，コーポレイション 分割型の分解性重合体とそれから生成される複合体

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Daniel G. Rudmann, et al., Toxicol. Pathol., 41, 970-983(2013)
EMA/CHMP/SWP/647258/2012
Francesco M Veronese, et al., Bioconjugate Chem., 16, 775-784(2005)
Jiyuan Yang, et al., Marcomol. Biosci., 10(4), 445-454(2010)
Yulia Vugmeysterang, et al., Bioconjugate Chem., 23, 1452-1462(2012)

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