JP2021055079A - マルチアーム型分解性ポリエチレングリコール誘導体 - Google Patents
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Abstract
【課題】細胞の空胞を引き起こさない高分子量のマルチアーム型の分解性ポリエチレングリコール誘導体を提供すること。【解決手段】下式(1):(式中、n1及びn2はそれぞれ独立して45〜950であり、W1及びW2はそれぞれ独立して2〜47残基のオリゴペプチドであり、a1及びa2はそれぞれ独立して1〜8であり、Qは2〜12の炭素原子を有した酸素原子及び/又は窒素原子を含んでも良い炭化水素鎖であり、X1及びX2はそれぞれ独立して生体関連物質と反応可能な官能基であり、L1及びL2及びL3及びL4及びL5及びL6はそれぞれ独立して、2価のスペーサーである。)で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体。【選択図】なし
Description
本発明は、生体関連物質を修飾する用途に使用される細胞内で分解するマルチアーム型の分解性ポリエチレングリコール誘導体に関する発明である。
ホルモンやサイトカイン、抗体、酵素などの生体関連物質を用いた医薬品は、通常生体内へ投与されると腎臓における糸球体濾過や肝臓や脾臓などにおけるマクロファージによる取り込みによって、生体内から速やかに排出されてしまう。そのため血中半減期が短く、十分な薬理効果を得ることが困難であることが多い。この問題を解決するため、生体関連物質を糖鎖やポリエチレングリコールなどの親水性高分子やアルブミンなどによって化学修飾する試みが行われている。その結果、分子量の増大や水和層の形成などにより生体関連物質の血中半減期を延長することが可能となる。また、ポリエチレングリコールで修飾することで、生体関連物質の毒性や抗原性の低下、難水溶性薬剤の溶解性向上などの効果が得られることも良く知られている。
ポリエチレングリコールで修飾された生体関連物質は、ポリエチレングリコールのエーテル結合と水分子との水素結合で形成される水和層で覆われ、分子サイズが大きくなることから、腎臓における糸球体濾過を回避することができる。さらにオプソニンや各組織を構成する細胞表面との相互作用が低下し、各組織への移行が減少することが知られている。ポリエチレングリコールは生体関連物質の血中半減期を延長させる優れた素材であり、その性能は分子量が大きいほど効果が高いことが分っている。これまで、分子量4万以上の高分子量のポリエチレングリコールで修飾した生体関連物質の研究が多数行なわれており、有意にその血中半減期を延長できる結果が得られている。
ポリエチレングリコールは生体関連物質の性能改善に用いられる修飾剤の中で至適基準とされており、現在ではポリエチレングリコール修飾製剤が複数上市され、医療現場で使用されている。一方で、2012年に欧州医薬品庁(EMA)から、分子量4万以上の高分子量のポリエチレングリコールで修飾した生体関連物質を一定の投与量以上で長期間動物に投与すると、一部の組織の細胞内に空胞が発生するとの現象が報告された(非特許文献1)。現時点において、空胞の発生自体が人体に悪影響を与えるとの報告はなく、また、先のEMAの報告において用いられた投与量は、医療現場において一般的に適用される投与量と比べて極めて高用量であること等を考慮すれば、現在製造販売されている分子量が4万以上のポリエチレングリコールで修飾された治療製剤の安全性は問題ないといえる。しかしながら、非常に特殊な疾患(例えば、小人症など)の治療においては、ポリエチレングリコール修飾製剤を高用量、且つ、長期間に患者へ投与する治療プロトコルが採用されることも想定され得る。従って、かかる特殊な状況においても適用可能な、細胞に空胞を発生させないポリエチレングリコール修飾製剤の開発には潜在的な需要があると予想される。
非特許文献2においては、通常のポリエチレングリコール修飾製剤の投与量に比べ、大過剰量のポリエチレングリコールを単独で動物に長期間投与したところ、分子量2万では空胞は見られず、分子量4万において空胞の発生が確認されている。空胞を抑制する手段の一つとして、ポリエチレングリコールの分子量を小さくすることが考えられるが、分子量を小さくすると生体関連物質の血中半減期を十分に改善することができないという問題が生じる。
高分子量のポリエチレングリコールを体内で低分子量のポリエチレングリコールに分解し、腎臓からの排出を促進する技術については報告例がある。特許文献1には、生体内で切断されるスルフィド結合やペプチド結合部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。当該ポリエチレングリコール誘導体は、生体内で腎臓からの排出に適した分子量まで分解されるとの記載がある。しかし、具体的な分解に関するデータは全く示されておらず、腎臓からの排出が促進されたというデータもない。さらに細胞の空胞に関する記載はない。
特許文献2には、生体内の低pH環境下において加水分解可能なアセタール部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。当該ポリエチレングリコール誘導体は、生体内で腎臓からの排出に適した分子量まで分解されるとの記載がある。しかし、具体的に腎臓からの排出が促進されたというデータは無く、さらに細胞の空胞に関する記載もない。また、これら加水分解が可能なアセタール部位は血中でも徐々に分解することが知られており、修飾した生体関連物質の血中半減期を十分に改善することができないと予想される。
一方で、薬物を効果的にリリースするために分解性のオリゴペプチドを導入したポリエチレングリコール誘導体や体内で分解するハイドロゲルなどの報告例はある。
非特許文献3には、酵素によって分解するオリゴペプチド部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。ここではオリゴペプチドは抗癌剤とポリエチレングリコールの間のリンカーとして導入されており、腫瘍周辺に特異的に発現している酵素によってオリゴペプチドが分解し、効率よく抗癌剤をリリースすることが報告されている。目的は抗癌剤のリリースであり、細胞の空胞を抑制する目的でポリエチレングリコールに分解性を付与するものではない。
非特許文献4には、酵素によって分解するオリゴペプチド部位を有した架橋分子と多分岐型のポリエチレングリコール誘導体を用いたハイドロゲルに関する記載がなされている。ここではオリゴペプチドは多分岐型のポリエチレングリコール誘導体を繋ぎ合わせる架橋分子として用いられ、さらに酵素による分解性をハイドロゲルに付与することができる。目的は分解性のハイドロゲルの調製であり、細胞の空胞を抑制する目的でポリエチレングリコールに分解性を付与するものではない。
特許文献3には、オリゴペプチドを骨格とした分岐型のポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。ここではオリゴペプチドはポリエチレングリコール誘導体の基本骨格として用いられており、酵素による分解性を付与するものではない。また、オリゴペプチドにリジンやアスパラギン酸など、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を有したアミノ酸を含むことが特徴であり、それらを反応に利用した分岐型のポリエチレングリコール誘導体を合成することが目的である。細胞の空胞を抑制する目的のポリエチレングリコール誘導体ではない。
さらに生体関連物質を修飾する用途に用いられるポリエチレングリコール誘導体においては、マルチアーム型があり、非特許文献5と非特許文献6に記載があるように、マルチアーム型ポリエチレングリコール誘導体の1分子中に複数の生体関連物質を結合させるこ
とができ、有意に生体関連物質の溶解性の改善や血中半減期を延長させるとの記載がある。マルチアーム型ポリエチレングリコール誘導体は、多くの薬物を搭載できるため薬物の活性を高めることができることが知られており、多くの研究に用いられているが、これまで細胞の空胞を抑制するマルチアーム型のポリエチレングリコール誘導体に関する報告はない。
とができ、有意に生体関連物質の溶解性の改善や血中半減期を延長させるとの記載がある。マルチアーム型ポリエチレングリコール誘導体は、多くの薬物を搭載できるため薬物の活性を高めることができることが知られており、多くの研究に用いられているが、これまで細胞の空胞を抑制するマルチアーム型のポリエチレングリコール誘導体に関する報告はない。
以上のように、血中では安定で、修飾した生体関連物質の血中半減期を改善し、細胞に取り込まれた際に細胞内で特異的に分解して、細胞の空胞の発生を抑制することができる多官能のマルチアーム型の高分子量ポリエチレングリコール誘導体が求められている。
EMA/CHMP/SWP/647258/2012
Daniel G. Rudmann, et al., Toxicol. Pathol., 41, 970−983(2013)
Francesco M Veronese, et al., Bioconjugate Chem., 16, 775−784(2005)
Jiyuan Yang, et al., Marcomol. Biosci., 10(4), 445−454(2010)
Lin Dai, et al., Scientific Reports, 29 July (2014)
M. Eugenia Giorgi, et al., Glycobiology, 22(10), 1363−1373(2012)
本発明の課題は、細胞の空胞を引き起こさない高分子量のマルチアーム型ポリエチレングリコール誘導体を提供することにある。より具体的には、生体関連物質を修飾する用途に効果的に用いることができ、生体内の血中で安定であり、且つ細胞内で分解されるマルチアーム型分解性ポリエチレングリコール誘導体を、工業的に生産可能な製法にて提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、細胞内にて分解するオリゴペプチドを有したマルチアーム型の分解性ポリエチレングリコール誘導体を発明した。
即ち、本発明は以下に示すとおりである。
[1]下式(1):
即ち、本発明は以下に示すとおりである。
[1]下式(1):
(式中、n1及びn2はそれぞれ独立して45〜950であり、W1及びW2はそれぞれ独立して2〜47残基のオリゴペプチドであり、a1及びa2はそれぞれ独立して1〜8であり、Qは2〜12の炭素原子を有した酸素原子及び/又は窒素原子を含んでも良い炭化水素鎖であり、X1及びX2はそれぞれ独立して生体関連物質と反応可能な官能基であり、L1及びL2及びL3及びL4及びL5及びL6はそれぞれ独立して、2価のスペーサーである。)で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[2]W1及びW2のオリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである[1]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[3]W1及びW2のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[1]〜[2]のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[4]下式(2):
[2]W1及びW2のオリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである[1]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[3]W1及びW2のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[1]〜[2]のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[4]下式(2):
(式中、n3及びn4はそれぞれ独立して110〜950であり、W3及びW4はそれぞれ独立して2〜5残基のオリゴペプチドであり、Qは2〜12の炭素原子を有した酸素原子及び/又は窒素原子を含んでも良い炭化水素鎖であり、X1及びX2はそれぞれ独立して生体関連物質と反応可能な官能基であり、L1及びL2及びL3及びL4及びL5及びL6はそれぞれ独立して、2価のスペーサーである。)で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[5]W3及びW4のオリゴペプチドが、中性アミノ酸のみで構成され、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである[4]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[6]W3及びW4のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[4]〜[5]のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[7]下式(3):
[5]W3及びW4のオリゴペプチドが、中性アミノ酸のみで構成され、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである[4]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[6]W3及びW4のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[4]〜[5]のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[7]下式(3):
(式中、n1及びn2はそれぞれ独立して45〜950であり、W5及びW6はそれぞれ独立してグルタミン酸を中心とした対称構造の5〜47残基のオリゴペプチドであり、b1及びb2はそれぞれ独立して2〜8であり、Qは2〜12の炭素原子を有した酸素原子及び/又は窒素原子を含んでも良い炭化水素鎖であり、X1及びX2はそれぞれ独立して生体関連物質と反応可能な官能基であり、L1及びL2及びL3及びL4及びL5及びL6はそれぞれ独立して、2価のスペーサーである。)で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[8]W5及びW6のグルタミン酸を中心とした対称構造のオリゴペプチドが、以下のv1またはv2またはv3の構造を有するオリゴペプチドである[7]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[8]W5及びW6のグルタミン酸を中心とした対称構造のオリゴペプチドが、以下のv1またはv2またはv3の構造を有するオリゴペプチドである[7]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
(式中、Gluはグルタミン酸の残基であり、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜5残基の分解性オリゴペプチドである。)
[9]Zの分解性オリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである[8]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[10]Zの分解性オリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[7]〜[9]のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[11]総分子量が20,000以上である[1]〜[10]のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[12]X1及びX2が、それぞれ独立して、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、ビニルスルホニル基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシル基、チオール基、ジチオピリジル基、α−ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基及びアジド基よりなる群から選択される、[1]〜[11]のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[13]下式(4):
[9]Zの分解性オリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである[8]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[10]Zの分解性オリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[7]〜[9]のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[11]総分子量が20,000以上である[1]〜[10]のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[12]X1及びX2が、それぞれ独立して、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、ビニルスルホニル基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシル基、チオール基、ジチオピリジル基、α−ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基及びアジド基よりなる群から選択される、[1]〜[11]のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[13]下式(4):
(式中、n1及びn2はそれぞれ独立して45〜950であり、W1及びW2はそれぞれ独立して2〜47残基のオリゴペプチドであり、a1及びa2はそれぞれ独立して1〜8であり、Qは2〜12の炭素原子を有した酸素原子、窒素原子を含んでも良い炭化水素鎖であり、D1及びD2はそれぞれ独立して生体関連物質であり、L3及びL4及びL5及びL6及びL11及びL12はそれぞれ独立して、2価のスペーサーである。)で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
[14]L11及びL12がそれぞれ独立して、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアゾリル基、マレイミドとメルカプトの結合、オキシム結合、またはこれらの結合及び基を含んでいてもよいアルキレン基である[13]記載の生体関連物質。
[15]Dの生体関連物質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素である、[13]〜[14]のいずれか1項記載の生体関連物質。
[14]L11及びL12がそれぞれ独立して、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアゾリル基、マレイミドとメルカプトの結合、オキシム結合、またはこれらの結合及び基を含んでいてもよいアルキレン基である[13]記載の生体関連物質。
[15]Dの生体関連物質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素である、[13]〜[14]のいずれか1項記載の生体関連物質。
本発明のマルチアーム型分解性ポリエチレングリコール誘導体は、生体内の血中では安定であり、細胞内の酵素によって分解するオリゴペプチドを構造内に有している。そのため、当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、血中では安定であり、従来の分解性を有さないポリエチレングリコール誘導体と同等の血中半減期を生体関連物質に付与することができる。さらに、当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞内に取り込まれた場合、オリゴペプチド部位が速やかに分解されるため、これまで課題とされていた細胞の空胞の発生を抑制することができる。また、当該ポリエチレングリコール誘導体は官能基を複数有することから1分子中に複数の生体関連物質を導入することができ、その薬理活性を増強させることができる特徴を有する。また、オリゴペプチドのC末端のアミノ酸としてグリシンを用いることで、製造工程中で発生する不純物を低減させることができ、それにより、本発明のマルチアーム型分解性ポリエチレングリコール誘導体を工業的に製造することが可能となる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る分解性ポリエチレングリコール誘導体は、下式(1)で示される。
本発明に係る分解性ポリエチレングリコール誘導体は、下式(1)で示される。
(式中、n1及びn2はそれぞれ独立して45〜950であり、W1及びW2はそれぞれ独立して2〜47残基のオリゴペプチドであり、a1及びa2はそれぞれ独立して1〜8であり、Qは2〜12の炭素原子を有した酸素原子、窒素原子を含んでも良い炭化水素鎖であり、X1及びX2はそれぞれ独立して生体関連物質と反応可能な官能基であり、L1及びL2及びL3及びL4及びL5及びL6はそれぞれ独立して、2価のスペーサーである。)
本発明の式(1)のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は、通常は4,000〜160,000であり、好ましくは10,000〜120,000であり、更に好ましくは20,000〜80,000である。本発明の1つの好ましい実施形態では、本発明の式(1)のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は20,000以上である。ここでいう分子量とは数平均分子量(Mn)である。
式(1)中のn1及びn2は、それぞれポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、通常はそれぞれ独立して45〜950であり、好ましくはそれぞれ独立して110〜690であり、更に好ましくはそれぞれ独立して220〜460である。
式(1)中のa1及びa2は、それぞれW1及びW2で示されるオリゴペプチドと結合しているポリエチレングリコール鎖の本数であり、通常はそれぞれ独立して1〜8であり、好ましくはそれぞれ独立して1または2または4または8であり、更に好ましくはそれぞれ独立して1または2または4である。
式(1)中のW1及びW2は、それぞれ独立して2〜47残基、好ましくは2〜23残基、より好ましくは2〜19残基のオリゴペプチドであり、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解するオリゴペプチドであれば特に制限はないが、分解性ペプチドとイオン性アミノ酸(グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン)または分岐骨格を有するデンドリマー様のオリゴペプチドを組み合わせることが好ましい。オリゴペプチドにポリエチレングリコール鎖を導入する際に、オリゴペプチドを構成するアミノ酸由来のアミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基などが混在すると、反応を制御できないため、アミノ基またはカルボキシル基のどちらかを保護でき、かつシステイン、セリンを有さないオリゴペプチドを用いることが好ましい。
式(1)中のQは、2〜12、好ましくは2〜8、より好ましくは2〜4の炭素原子を有した酸素原子及び/又は窒素原子を含んでも良い炭化水素鎖であれば特に制限はないが、好ましくはエーテル結合を含んでも良いアルキレン基であり、アルキレン基としては、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基、ヘプチレン基、オクチレン基が好ましく、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基がさらに好ましい。
Qの特に好ましい態様は、下記の群(I)に示されるものである。
群(I):
(q1)〜(q3)において、式中のfは2〜12の整数を示し、好ましくは2〜8の整数を示し、更に好ましくは2〜4の整数を示す。また、(q2)〜(q3)において、式中のfは同一でも、異なっていてもよい。
式(1)中のL1及びL2及びL3及びL4及びL5及びL6は、それぞれ独立して、2価のスペーサーであり、これらのスペーサーは共有結合を形成し得る基であれば特に制限は無い。
L1及びL2は、ポリエチレングリコール鎖と官能基をつなぐスペーサーであり、好ましくは、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、2級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、またはこれらの結合及び/または基を含んでいてもよいアルキレン基である。
L3及びL4は、ポリエチレングリコール鎖とオリゴペプチドをつなぐスペーサーであり、好ましくはアルキレン基;またはアミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、2級アミノ基、カルボニル基、もしくはウレア結合から選択される少なくとも一つの結合及び/または基を含むアルキレン基である。L3及びL4は、ポリエチレングリコールの繰り返しユニットに炭素原子で結合しているものが好ましい。
L5及びL6は、炭化水素鎖Qとオリゴペプチドをつなぐスペーサーであり、好ましくは、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、2級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、またはこれらの結合及び/または基を含んでいてもよいアルキレン基である。
L1及びL2及びL3及びL4及びL5及びL6の特に好ましい態様は、下記の群(II)に示されるものである。また、群(II)のスペーサーを2つから4つ組み合わせても良い。2価のスペーサーとしてエステル結合とカーボネート結合は生体内の血中で徐々に分解するため適さない。
L1及びL2は、ポリエチレングリコール鎖と官能基をつなぐスペーサーであり、好ましくは、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、2級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、またはこれらの結合及び/または基を含んでいてもよいアルキレン基である。
L3及びL4は、ポリエチレングリコール鎖とオリゴペプチドをつなぐスペーサーであり、好ましくはアルキレン基;またはアミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、2級アミノ基、カルボニル基、もしくはウレア結合から選択される少なくとも一つの結合及び/または基を含むアルキレン基である。L3及びL4は、ポリエチレングリコールの繰り返しユニットに炭素原子で結合しているものが好ましい。
L5及びL6は、炭化水素鎖Qとオリゴペプチドをつなぐスペーサーであり、好ましくは、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、2級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、またはこれらの結合及び/または基を含んでいてもよいアルキレン基である。
L1及びL2及びL3及びL4及びL5及びL6の特に好ましい態様は、下記の群(II)に示されるものである。また、群(II)のスペーサーを2つから4つ組み合わせても良い。2価のスペーサーとしてエステル結合とカーボネート結合は生体内の血中で徐々に分解するため適さない。
群(II):
(z1)〜(z11)において、式中のsは0〜10の整数を示し、好ましくは0〜6の整数を示し、更に好ましくは0〜3の整数を示す。また、(z2)〜(z11)において、式中のsは同一でも、異なっていてもよい。
式(1)中のL1及びL2は、群(II)の(z2)、(z3)、(z4)、(z6)、(z7)、(z8)、(z9)、(z10)または(z2)と(z4)との組み合わせが好ましく、(z3)、(z6)、(z9)、(z10)または(z2)と(z4)との組み合わせがより好ましい。
式(1)中のL3及びL4は、群(II)の(z1)、(z2)、(z3)、(z4)、(z5)、(z6)、(z7)、(z8)または(z11)で示される基が好ましく、(z3)、(z5)または(z11)で示される基がより好ましい。
式(1)中のL5及びL6は、群(II)の(z3)、(z4)、(z6)、(z7)、(z8)、(z9)または(z10)で示される基が好ましく、(z3)、(z6)、(z9)または(z10)で示される基がより好ましい。
式(1)中のX1及びX2は、化学修飾の対象となる生理活性タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、抗癌剤などの生体関連物質に存在する官能基と反応して共有結合を形成する官能基であれば特に制限されない。例えば、「Harris, J. M. Poly(Ethylene Glycol) Chemistry; Plenum Press: New York, 1992」、「Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques, 2nd ed.; Academic Press: San Diego, CA, 2008」及び「PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Applications; Veronese, F. M., Ed.; Birkhauser: Basel, Switzerland,2009」などに記載されている官能基が挙げられる。
式(1)中のX1及びX2で示される「生体関連物質と反応可能な官能基」は、生体関連物質が有するアミノ基、メルカプト基、アルデヒド基、カルボキシル基、不飽和結合またはアジド基などの官能基と化学結合可能な官能基であれば特に制限されない。
具体的には、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、カルボキシル基、メルカプト基、マレイミド基、置換マレイミド基、ヒドラジド基、ジチオピリジル基、置換スルホネート基、ビニルスルホニル基、アミノ基、オキシアミノ基(H2N−O−基)、ヨードアセトアミド基、アルキルカルボニル基、アルケニル基(例えば、アリル基、ビニル基)、アルキニル基、置換アルキニル基(例えば、後記の炭素数1〜5の炭化水素基で置換されたアルキニル基)、アジド基、アクリル基、スルホニルオキシ基(例えば、アルキルスルホニルオキシ基)、α−ハロアセチル基などが挙げられ、好ましくは、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、置換マレイミド基、ビニルスルホニル基、アクリル基、スルホニルオキシ基(例えば、炭素数1〜5のアルキル−スルホニルオキシ基)、置換スルホネート基、カルボキシル基、メルカプト基、ピリジルジチオ基、α−ハロアセチル基、アルキニル基、置換アルキニル基(例えば、後記の炭素数1〜5の炭化水素基で置換された炭素数2〜5のアルキニル基)、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基及びアジド基であり、より好ましくは活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、マレイミド基、カルボキシル基、オキシアミノ基及びアミノ基であり、特に好ましくはアルデヒド基、マレイミド基、カルボキシル基及びオキシアミノ基である。
具体的には、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、カルボキシル基、メルカプト基、マレイミド基、置換マレイミド基、ヒドラジド基、ジチオピリジル基、置換スルホネート基、ビニルスルホニル基、アミノ基、オキシアミノ基(H2N−O−基)、ヨードアセトアミド基、アルキルカルボニル基、アルケニル基(例えば、アリル基、ビニル基)、アルキニル基、置換アルキニル基(例えば、後記の炭素数1〜5の炭化水素基で置換されたアルキニル基)、アジド基、アクリル基、スルホニルオキシ基(例えば、アルキルスルホニルオキシ基)、α−ハロアセチル基などが挙げられ、好ましくは、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、置換マレイミド基、ビニルスルホニル基、アクリル基、スルホニルオキシ基(例えば、炭素数1〜5のアルキル−スルホニルオキシ基)、置換スルホネート基、カルボキシル基、メルカプト基、ピリジルジチオ基、α−ハロアセチル基、アルキニル基、置換アルキニル基(例えば、後記の炭素数1〜5の炭化水素基で置換された炭素数2〜5のアルキニル基)、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基及びアジド基であり、より好ましくは活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、マレイミド基、カルボキシル基、オキシアミノ基及びアミノ基であり、特に好ましくはアルデヒド基、マレイミド基、カルボキシル基及びオキシアミノ基である。
別の好適な実施形態において、かかる官能基X1及びX2は、下記の群(III)、群(IV)、群(V)、群(VI)、群(VII)及び群(VIII)に分類することができる。
群(III):生体関連物質が有するアミノ基と反応可能な官能基
下記の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(j)、または(k)で示される基が挙げられる。
下記の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(j)、または(k)で示される基が挙げられる。
群(IV):生体関連物質が有するメルカプト基と反応可能な官能基
下記の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、または(l)で示される基が挙げられる。
下記の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、または(l)で示される基が挙げられる。
群(V)):生体関連物質が有するアルデヒド基と反応可能な官能基
下記の(h)、(m)、(n)、または(p)で示される基が挙げられる。
下記の(h)、(m)、(n)、または(p)で示される基が挙げられる。
群(VI):生体関連物質が有するカルボキシル基と反応可能な官能基
下記の(h)、(m)、(n)、または(p)で示される基が挙げられる。
下記の(h)、(m)、(n)、または(p)で示される基が挙げられる。
群(VII):生体関連物質が有する不飽和結合と反応可能な官能基
下記の(h)、(m)、または(o)で示される基が挙げられる。
下記の(h)、(m)、または(o)で示される基が挙げられる。
群(VIII):生体関連物質が有するアジド基と反応可能な官能基
下記の(l)で示される基が挙げられる。
下記の(l)で示される基が挙げられる。
官能基(j)において、式中のU1は塩素原子(Cl)、臭素原子(Br)またはヨウ素原子(I)などのハロゲン原子を示し、好ましくはBr、またはI、より好ましくはIである。
また、官能基(e)及び官能基(l)において、式中のY1、Y3は、それぞれ独立して、水素原子または炭素数1〜5の炭化水素基を示し、好ましくは炭素数1〜5の炭化水素基である。炭素数1〜5の炭化水素基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、またはエチル基である。
また、官能基(k)において、式中のY2はフッ素原子を含んでいてもよい炭素数が1〜10の炭化水素基を示し、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基、ヘキシル基、ノニル基、ビニル基、フェニル基、ベンジル基、4−メチルフェニル基、トリフルオロメチル基、2,2,2−トリフルオロエチル基、4−(トリフルオロメトキシ)フェニル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、ビニル基、4−メチルフェニル基、または2,2,2−トリフルオロエチル基である。
活性エステル基とは、脱離能の高いアルコキシ基を有したエステル基である。脱離能の高いアルコキシ基としては、ニトロフェノール、N−ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノールなどから誘導されるアルコキシ基が挙げられる。活性エステル基は、好ましくはN−ヒドロキシスクシンイミドから誘導されるアルコキシ基を有したエステル基である。
活性カーボネート基とは、脱離能の高いアルコキシ基を有したカーボネート基である。脱離能の高いアルコキシ基としては、ニトロフェノール、N−ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノールなどから誘導されるアルコキシ基が挙げられる。活性カーボネート基は、好ましくはニトロフェノールまたはN−ヒドロキシスクシンイミドから誘導されるアルコキシ基を有したカーボネート基である。
置換マレイミド基とは、マレイミド基の二重結合の片方の炭素原子に炭化水素基が結合しているマレイミド基である。炭化水素基は、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、またはエチル基である。
置換スルホネート基とは、スルホネート基の硫黄原子にフッ素原子を含んでいてもよい炭化水素基が結合しているスルホネート基である。フッ素原子を含んでいてもよい炭化水素基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基、ヘキシル基、ノニル基、ビニル基、フェニル基、ベンジル基、4−メチルフェニル基、トリフルオロメチル基、2,2,2−トリフルオロエチル基、4−(トリフルオロメトキシ)フェニル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、ビニル基、4−メチルフェニル基、または2,2,2−トリフルオロエチル基である。
以下、本発明の好適な態様を示す分解性ポリエチレングリコール誘導体は、下式(2)で示される。
(式中、n3及びn4はそれぞれ独立して110〜950であり、W3及びW4はそれぞれ独立して2〜5残基のオリゴペプチドであり、Q、X1及びX2、L1及びL2及びL3及びL4及びL5及びL6は前記と同義である。)
本発明の式(2)のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は、通常は4,000〜160,000であり、好ましくは10,000〜120,000であり、更に好ましくは20,000〜80,000である。本発明の1つの好ましい実施形態では、本発明の式(2)のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は20,000以上である。ここでいう分子量とは数平均分子量(Mn)である。
式(2)中のn3及びn4は、それぞれポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、通常はそれぞれ独立して110〜950であり、好ましくはそれぞれ独立して220〜690であり、更に好ましくはそれぞれ独立して220〜460である。
式(2)中のW3及びW4は、それぞれ独立して2〜5残基のオリゴペプチドであり、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解するオリゴペプチドであれば特に制限はないが、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持つアミノ酸、具体的には、リジン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸を含まない中性アミノ酸で構成されるオリゴペプチドであることが好ましい。本発明の式(2)の分解性ポリエチレングリコール誘導体の合成においては、原料であるポリエチレングリコール誘導体とオリゴペプチドを反応にて結合させる際、オリゴペプチドのC末端のカルボキシル基をポリエチレングリコール誘導体との縮合反応に利用する。しかし、当該オリゴペプチドが側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持つアミノ酸を有する場合、縮合反応にてオリゴペプチド同士の副反応や、ポリエチレングリコール誘導体が目的であるC末端のカルボキシル基ではなく、側鎖のカルボキシル基にも導入した不純物が発生する。
この不純物は通常の抽出や晶析などの精製工程で除去することは難しいため、純度よく目的物を得るためには、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持たないアミノ酸からなるオリゴペプチドを用いることが望ましい。W3及びW4を構成するアミノ酸は、α−アミノ酸であり、また基本的にはL型である。
この不純物は通常の抽出や晶析などの精製工程で除去することは難しいため、純度よく目的物を得るためには、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持たないアミノ酸からなるオリゴペプチドを用いることが望ましい。W3及びW4を構成するアミノ酸は、α−アミノ酸であり、また基本的にはL型である。
中性アミノ酸であるシステインはメルカプト基を有しており、他のメルカプト基とジスルフィド結合を形成するため、W3及びW4は、システインを含まない中性アミノ酸からなるオリゴペプチドであることが好ましい。
加えて、W3及びW4は、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドであることが好ましい。C末端のカルボキシル基とポリエチレングリコール誘導体を反応させる際は、基本的にC末端のカルボキシル基を縮合剤などで活性化する必要がある。この活性化の工程にて、グリシン以外のアミノ酸ではエピメリ化が起こりやすく、立体異性体が副生することが知られている。オリゴペプチドのC末端のアミノ酸をアキラルなグリシンとすることで、立体異性体の副生の無い、高純度な目的物を得ることができる。
さらに、W3及びW4は、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸、具体的には、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシンを少なくとも1つ有するオリゴペプチドであることが好ましく、フェニルアラニンを有するオリゴペプチドであることが更に好ましい。Kyte と Doolittleにより作成された、アミノ酸の疎水性を定量的に示すハイドロパシー指標(hydropathy index)は、値が大きいほど疎水的なアミノ酸であることを示す(Kyte J & Doolittle RF, 1982, J Mol Biol, 157:105−132.)。
W3及びW4は、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解する性能を有し、システインを除く中性アミノ酸からなる2〜5残基のオリゴペプチドであれば特に制限は無いが、具体的な例としては、グリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、グリシン−グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−ロイシン−グリシン、バリン−シトルリン−グリシン、バリン−アラニン−グリシン、フェニルアラニン−グリシンなどであり、好ましくはグリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、グリシン−グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、バリン−シトルリン−グリシン、バリン−アラニン−グリシン、またはフェニルアラニン−グリシンであり、より好ましくはグリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、バリン−シトルリン−グリシン、またはフェニルアラニン−グリシンであり、さらにより好ましくはグリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、またはフェニルアラニン−グリシンである。
以下、本発明の好適な態様を示す分解性ポリエチレングリコール誘導体は、下式(3)で示される。
(式中、W5及びW6は、それぞれ独立してグルタミン酸を中心とした対称構造の5〜47残基のオリゴペプチドであり、b1及びb2はそれぞれ独立して2〜8であり、n1及びn2、Q、X1及びX2、L1及びL2及びL3及びL4及びL5及びL6は前記と同義である。)
式(3)中のb1及びb2は、それぞれW5及びW6で示されるオリゴペプチドと結合しているポリエチレングリコール鎖の本数であり、通常はそれぞれ独立して2〜8であり、好ましくはそれぞれ独立して2または4または8であり、更に好ましくはそれぞれ独立して2または4である。
式(3)中のW5及びW6は、それぞれ独立してグルタミン酸を中心とした対称構造の5〜47残基、好ましくは5〜23残基、より好ましくは5〜19残基のオリゴペプチドであり、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解するオリゴペプチドであれば特に制限はないが、オリゴペプチドを構成するアミノ酸としては、中心部分を構成するグルタミン酸以外は、システインを除く中性アミノ酸からなることが好ましい。ここでいうグルタミン酸を中心とした対称構造のオリゴペプチドとは、グルタミン酸のα位のカルボキシル基とγ位のカルボキシル基に同一のペプチドが結合した化合物を意味し、グルタミン酸を中心に対となるペプチドが対称構造をとるオリゴペプチドである。当該オリゴペプチド中の中性アミノ酸とグルタミン酸の数の構成比(中性アミノ酸の数/グルタミン酸の数)としては、通常は2〜10であり、好ましくは2〜8であり、更に好ましくは2〜6である。W5及びW6を構成するアミノ酸は基本的にはL型である。
W5及びW6の特に好ましい態様は、下記の群(IX)に示されるものである。
群(IX):
(式中、Gluはグルタミン酸の残基であり、及びZはシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜5残基の分解性オリゴペプチドである。)
(v1)〜(v3)中のZは、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持つアミノ酸、具体的には、リジン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸を含まない中性アミノ酸で構成されるオリゴペプチドであることが好ましい。本発明の式(3)のマルチアーム型分解性ポリエチレングリコール誘導体の合成においては、原料であるポリエチレングリコール誘導体とオリゴペプチドを反応にて結合させる際、オリゴペプチドのC末端のカルボキシル基をポリエチレングリコール誘導体との縮合反応に利用する。しかし、当該オリゴペプチドが側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持つアミノ酸を有する場合、縮合反応にてオリゴペプチド同士の副反応や、ポリエチレングリコール誘導体が目的であるC末端のカルボキシル基ではなく、側鎖のカルボキシル基にも導入した不純物が発生する。
この不純物は通常の抽出や晶析などの精製工程で除去することは難しいため、純度よく目的物を得るためには、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持たないアミノ酸からなるオリゴペプチドを用いることが望ましい。Zを構成するアミノ酸は、α−アミノ酸であり、また基本的にはL型である。
この不純物は通常の抽出や晶析などの精製工程で除去することは難しいため、純度よく目的物を得るためには、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持たないアミノ酸からなるオリゴペプチドを用いることが望ましい。Zを構成するアミノ酸は、α−アミノ酸であり、また基本的にはL型である。
中性アミノ酸であるシステインはメルカプト基を有しており、他のメルカプト基とジスルフィド結合を形成するため、(v1)〜(v3)中のZは、システインを含まない中性アミノ酸からなるオリゴペプチドであることが好ましい。
加えて、(v1)〜(v3)中のZは、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドであることが好ましい。C末端のカルボキシル基とポリエチレングリコール誘導体を反応させる際は、基本的にC末端のカルボキシル基を縮合剤などで活性化する必要がある。この活性化の工程にて、グリシン以外のアミノ酸ではエピメリ化が起こりやすく、立体異性体が副生することが知られている。オリゴペプチドのC末端のアミノ酸をアキラルなグリシンとすることで、立体異性体の副生の無い、高純度な目的物を得ることができる。
さらに、(v1)〜(v3)中のZは、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸、具体的には、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシンを少なくとも1つ有するオリゴペプチドであることが好ましく、フェニルアラニンを有するオリゴペプチドであることが更に好ましい。Kyte と Doolittleにより作成された、アミノ酸の疎水性を定量的に示すハイドロパシー指標(hydropathy index)は、値が大きいほど疎水的なアミノ酸であることを示す(Kyte J & Doolittle RF, 1982, J Mol Biol, 157:105−132.)。
(v1)〜(v3)中のZは、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解する性能を有し、システインを除く中性アミノ酸からなる2〜5残基のオリゴペプチドであれば特に制限は無いが、具体的な例としては、グリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、グリシン−グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−ロイシン−グリシン、バリン−シトルリン−グリシン、バリン−アラニン−グリシン、フェニルアラニン−グリシンなどであり、好ましくはグリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、グリシン−グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、バリン−シトルリン−グリシン、バリン−アラニン−グリシン、またはフェニルアラニン−グリシンであり、より好ましくはグリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、バリン−シトルリン−グリシン、またはフェニルアラニン−グリシンであり、さらにより好ましくはグリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、またはフェニルアラニン−グリシンである。
式(3)の好ましい態様の1つは、W5及びW6がv1であり、及びb1=2、b2=2の下式(5)で示される4アーム型の分解性ポリエチレングリコール誘導体である。
(式中、Glu、Z、n1及びn2、Q、X1及びX2、L1及びL2及びL3及びL4及びL5及びL6は前記と同義である。)
式(3)の好ましい態様の1つは、W5及びW6がv2であり、及びb1=4、b2=4の下式(6)で示される8アーム型の分解性ポリエチレングリコール誘導体である。
(式中、Glu、Z、n1及びn2、Q、X1及びX2、L1及びL2及びL3及びL4及びL5及びL6は前記と同義である。)
式(3)の好ましい態様の1つは、W5及びW6がv3であり、及びb1=8、b2=8の下式(7)で示される16アーム型の分解性ポリエチレングリコール誘導体である。
(式中、Glu、Z、n1及びn2、Q、X1及びX2、L1及びL2及びL3及びL4及びL5及びL6は前記と同義である。)
以下、本発明の好適な態様を示す分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質は、下式(4)で示される。
(式中、L11及びL12はそれぞれ独立して2価のスペーサーであり、D1及びD2はそれぞれ独立して生体関連物質であり、n1及びn2、a1及びa2、Q、W1及びW2、L3及びL4及びL5及びL6は前記と同義である。)
式(4)中のL11及びL12は、それぞれ独立して、2価のスペーサーであり、これらのスペーサーは共有結合を形成し得る基であれば特に制限は無いが、好ましくはアミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、2級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアゾリル基、マレイミドとメルカプトの結合、オキシム結合、またはこれらの結合及び/または基を含んでいてもよいアルキレン基である。
L11及びL12の特に好ましい態様は、下記の群(X)に示されるものである。また、群(X)のスペーサーを2つから5つ組み合わせても良い。2価のスペーサーとしてエステル結合とカーボネート結合は生体内の血中で徐々に分解するため適さない。
L11及びL12の特に好ましい態様は、下記の群(X)に示されるものである。また、群(X)のスペーサーを2つから5つ組み合わせても良い。2価のスペーサーとしてエステル結合とカーボネート結合は生体内の血中で徐々に分解するため適さない。
群(X):
(z1)〜(z20)において、式中のsは0〜10の整数を示し、好ましくは0〜6の整数、更に好ましくは0〜3の整数を示す。また、(z2)〜(z20)において、式中のsは同一でも、異なっていてもよい。
式(4)中のL11及びL12としては、群(I)の(z3)、(z6)、(z7)〜(z20)で示される基が好ましく、(z6)、(z9)、(z10)、(z12)、(z14)、(z16)、(z18)または(z20)で示される基がより好ましく、(z10)、(z12)、(z16)または(z20)で示される基が更に好ましい。
式(4)中のDは、生体関連物質であり、特に制限はないが、ヒト又は他の動物の疾患の診断、治癒、緩和、治療または予防に関わる物質である。具体的にはタンパク質、ペプチド、核酸、細胞、ウィルスなどを含み、好適なタンパク質またはペプチドとしては、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマー、酵素などが挙げられる。
より具体的には、サイトカインとしては、免疫を調整するインターフェロンタイプI、タイプII、タイプIIIや、インターロイキンや腫瘍壊死因子、それらの受容体アンタゴニストなどが挙げられる。成長因子としては、造血因子であるエリスロポエチンや刺激因子である顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)などが挙げられ、血液凝固因子としては、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XII因子などが挙げられる。ホルモンとしては、カルシトニンやインスリン、そのアナログやエキセナチド、GLP−1、そしてソマトスタチンやヒト成長ホルモンなどが挙げられる。抗体としては、完全長抗体、また抗体フラグメントとして、FabやsvFVなどが挙げられ、アプタマーとしては、DNAアプタマー、RNAアプタマーなどが挙げられ、酵素としては、スーパーオキシドディスムターゼやウリカーゼなどが挙げられる。遺伝子工学的にアミノ酸配列を変化させ、改質したこれらタンパク質も含む。上述したタンパク質は、血中での安定性が低く、ポリエチレングリコールで修飾し、血中半減期を延長させることが望ましい。
好適なタンパク質としては、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、GCSF、第VIII因子、第IX因子、ヒト成長ホルモン、抗体フラグメントなどが挙げられ、より好ましくは、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、GCSF、エリスロポエチン、または抗体フラグメント(特にFab)が挙げられ、さらに好ましくは、ヒト成長ホルモン、またはGCSFが挙げられる。
好適なペプチドとしては、インスリン、ビバリルジン、テリパラチド、エキセナチド、エンフビルチド、デガレリクス、ミファムルチド、ネシリチド、ゴセレリン、グラチラマー、オクトレオチド、ランレオチド、イカチバント、ジコチニド、プラムリンチド、ロミプロスチム、カルシトニン、オキシトシン、リュープロレリン、グルカゴンが挙げられ、より好ましくは、インスリン、エキセナチド、カルシトニン(特にサーモンカルシトニン)が挙げられる。
より具体的には、サイトカインとしては、免疫を調整するインターフェロンタイプI、タイプII、タイプIIIや、インターロイキンや腫瘍壊死因子、それらの受容体アンタゴニストなどが挙げられる。成長因子としては、造血因子であるエリスロポエチンや刺激因子である顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)などが挙げられ、血液凝固因子としては、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XII因子などが挙げられる。ホルモンとしては、カルシトニンやインスリン、そのアナログやエキセナチド、GLP−1、そしてソマトスタチンやヒト成長ホルモンなどが挙げられる。抗体としては、完全長抗体、また抗体フラグメントとして、FabやsvFVなどが挙げられ、アプタマーとしては、DNAアプタマー、RNAアプタマーなどが挙げられ、酵素としては、スーパーオキシドディスムターゼやウリカーゼなどが挙げられる。遺伝子工学的にアミノ酸配列を変化させ、改質したこれらタンパク質も含む。上述したタンパク質は、血中での安定性が低く、ポリエチレングリコールで修飾し、血中半減期を延長させることが望ましい。
好適なタンパク質としては、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、GCSF、第VIII因子、第IX因子、ヒト成長ホルモン、抗体フラグメントなどが挙げられ、より好ましくは、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、GCSF、エリスロポエチン、または抗体フラグメント(特にFab)が挙げられ、さらに好ましくは、ヒト成長ホルモン、またはGCSFが挙げられる。
好適なペプチドとしては、インスリン、ビバリルジン、テリパラチド、エキセナチド、エンフビルチド、デガレリクス、ミファムルチド、ネシリチド、ゴセレリン、グラチラマー、オクトレオチド、ランレオチド、イカチバント、ジコチニド、プラムリンチド、ロミプロスチム、カルシトニン、オキシトシン、リュープロレリン、グルカゴンが挙げられ、より好ましくは、インスリン、エキセナチド、カルシトニン(特にサーモンカルシトニン)が挙げられる。
式(4)で示される生体関連物質の好ましい態様の1つは、下式(8)で示される生体関連物質である。
(式中、D1及びD2、n3及びn4、Q、W3及びW4、L11及びL12及びL3及びL4及びL5及びL6は前記と同義である。)
式(4)で示される生体関連物質の別の好ましい態様の1つは、下式(9)で示される生体関連物質である。
(式中、D1及びD2、n1及びn2、b1及びb2、Q、W5及びW6、L11及びL12及びL3及びL4及びL5及びL6は前記と同義である。)
式(9)の好ましい態様の1つは、W5及びW6がv1であり、及びb1=2、b2=2の下式(10)で示される4アーム型の分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である。
(式中、Glu、Z、n1及びn2、Q、D1及びD2、L11及びL12及びL3及びL4及びL5及びL6は前記と同義である。)
式(9)の好ましい態様の1つは、W5及びW6がv2であり、及びb1=4、b2=4の下式(11)で示される8アーム型の分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である。
(式中、Glu、Z、n1及びn2、Q、D1及びD2、L11及びL12及びL3及びL4及びL5及びL6は前記と同義である。)
式(9)の好ましい態様の1つは、W5及びW6がv3であり、及びb1=8、b2=8の下式(12)で示される16アーム型の分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である。
(式中、Glu、Z、n1及びn2、Q、D1及びD2、L11及びL12及びL3及びL4及びL5及びL6は前記と同義である。)
本発明の式(1)の分解性ポリエチレングリコール誘導体の好適な例としては、以下の分解性ポリエチレングリコール誘導体が挙げられる。
[分解性ポリエチレングリコール誘導体(1−1)]
n1及びn2が、それぞれ独立して220〜460であり;
W1及びW2が、それぞれ独立して2〜9残基のオリゴペプチド(例、フェニルアラニン−グリシン、グリシン−ロイシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−フェニルアラニン−グルタミン酸−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−ロイシン−フェニルアラニン−グリシン−グルタミン酸−グリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン)であり;
a1及びa2が、それぞれ独立して1、2または4であり;
Qが、アルキレン基(例、エチレン基、プロピレン基)であり;
X1及びX2が、それぞれ独立して、活性カーボネート基(例、N−スクシンイミジルカーボネート基)、マレイミド基、カルボキシル基及びアミノ基よりなる群から選択され;
L1及びL2が、それぞれ独立して、エーテル結合、あるいはアミド結合またはウレタン結合を含んでいてもよいアルキレン基(例、メチレン基、エチレン基、プロピレン基)であり;
L3及びL4が、2級アミノ基を含むアルキレン基(例、プロピレン基)であり;
L5及びL6が、カルボニル基である;
式(1)の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[分解性ポリエチレングリコール誘導体(1−1)]
n1及びn2が、それぞれ独立して220〜460であり;
W1及びW2が、それぞれ独立して2〜9残基のオリゴペプチド(例、フェニルアラニン−グリシン、グリシン−ロイシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−フェニルアラニン−グルタミン酸−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−ロイシン−フェニルアラニン−グリシン−グルタミン酸−グリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン)であり;
a1及びa2が、それぞれ独立して1、2または4であり;
Qが、アルキレン基(例、エチレン基、プロピレン基)であり;
X1及びX2が、それぞれ独立して、活性カーボネート基(例、N−スクシンイミジルカーボネート基)、マレイミド基、カルボキシル基及びアミノ基よりなる群から選択され;
L1及びL2が、それぞれ独立して、エーテル結合、あるいはアミド結合またはウレタン結合を含んでいてもよいアルキレン基(例、メチレン基、エチレン基、プロピレン基)であり;
L3及びL4が、2級アミノ基を含むアルキレン基(例、プロピレン基)であり;
L5及びL6が、カルボニル基である;
式(1)の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
本発明の式(2)の分解性ポリエチレングリコール誘導体の好適な例としては、以下の分解性ポリエチレングリコール誘導体が挙げられる。
[分解性ポリエチレングリコール誘導体(2−1)]
n3及びn4が、それぞれ独立して220〜460であり;
W3及びW4が、それぞれ独立して2〜5残基のオリゴペプチド(例、フェニルアラニン−グリシン、グリシン−ロイシン−フェニルアラニン−グリシン)であり;
Qが、アルキレン基(例、エチレン基、プロピレン基)であり;
X1及びX2が、それぞれ独立して、活性カーボネート基(例、N−スクシンイミジルカーボネート基)及びマレイミド基よりなる群から選択され;
L1及びL2が、それぞれ独立して、エーテル結合、またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基(例、エチレン基、プロレン基)であり;
L3及びL4が、2級アミノ基を含むアルキレン基(例、プロピレン基)であり;
L5及びL6が、カルボニル基である;
式(2)の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[分解性ポリエチレングリコール誘導体(2−1)]
n3及びn4が、それぞれ独立して220〜460であり;
W3及びW4が、それぞれ独立して2〜5残基のオリゴペプチド(例、フェニルアラニン−グリシン、グリシン−ロイシン−フェニルアラニン−グリシン)であり;
Qが、アルキレン基(例、エチレン基、プロピレン基)であり;
X1及びX2が、それぞれ独立して、活性カーボネート基(例、N−スクシンイミジルカーボネート基)及びマレイミド基よりなる群から選択され;
L1及びL2が、それぞれ独立して、エーテル結合、またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基(例、エチレン基、プロレン基)であり;
L3及びL4が、2級アミノ基を含むアルキレン基(例、プロピレン基)であり;
L5及びL6が、カルボニル基である;
式(2)の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
本発明の式(3)の分解性ポリエチレングリコール誘導体の好適な例としては、以下の分解性ポリエチレングリコール誘導体が挙げられる。
[分解性ポリエチレングリコール誘導体(3−1)]
n1及びn2が、それぞれ独立して220〜460であり;
W5及びW6が、それぞれ独立してグルタミン酸を中心とした対称構造の5〜9残基のオリゴペプチド(例、グリシン−フェニルアラニン−グルタミン酸−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−ロイシン−フェニルアラニン−グリシン−グルタミン酸−グリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン)であり;
b1及びb2が、それぞれ独立して2または4または8であり;
Qが、アルキレン基(例、プロピレン基)であり;
X1及びX2が、それぞれ独立して、カルボキシル基、アミノ基及びオキシアミノ基よりなる群から選択され;
L1及びL2が、それぞれ独立して、エーテル結合、またはウレタン結合を含んでいてもよいアルキレン基(例、メチレン基、エチレン基)であり;
L3及びL4が、2級アミノ基を含むアルキレン基(例、プロピレン基)であり;
L5及びL6が、カルボニル基である;
式(3)の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[分解性ポリエチレングリコール誘導体(3−1)]
n1及びn2が、それぞれ独立して220〜460であり;
W5及びW6が、それぞれ独立してグルタミン酸を中心とした対称構造の5〜9残基のオリゴペプチド(例、グリシン−フェニルアラニン−グルタミン酸−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−ロイシン−フェニルアラニン−グリシン−グルタミン酸−グリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン)であり;
b1及びb2が、それぞれ独立して2または4または8であり;
Qが、アルキレン基(例、プロピレン基)であり;
X1及びX2が、それぞれ独立して、カルボキシル基、アミノ基及びオキシアミノ基よりなる群から選択され;
L1及びL2が、それぞれ独立して、エーテル結合、またはウレタン結合を含んでいてもよいアルキレン基(例、メチレン基、エチレン基)であり;
L3及びL4が、2級アミノ基を含むアルキレン基(例、プロピレン基)であり;
L5及びL6が、カルボニル基である;
式(3)の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
本発明のマルチアーム型分解性ポリエチレングリコール誘導体は、例えば、次のような工程を経て製造することができる。
反応A
(工程中のPEGはポリエチレングリコール鎖であり、Peptideはオリゴペプチドであり、Pro1及びPro2は保護基であり、L7は2価のスペーサーであり、L1及びX1は前記と同義である。)
工程中のPEGは、ポリエチレングリコール鎖であり、分子量は、前記したポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であるn1及びn2で定義したとおりであり、つまりn1及びn2がそれぞれ独立して45〜950であることから、その分子量の範囲は、2000〜42000である。
工程中のPeptideは、前記W3及びW4と同義のオリゴペプチドである。本工程ではN末端のアミノ基が保護基で保護されたオリゴペプチドを用いる。
工程中のPro1及びPro2は、保護基であり、ここで保護基とは、ある反応条件下で分子中の特定の化学反応可能な官能基の反応を防止または阻止する成分である。保護基は、保護される化学反応可能な官能基の種類、使用される条件及び分子中の他の官能基もしくは保護基の存在により変化する。保護基の具体的な例は多くの一般的な成書に見出すことができるが、例えば「Wuts, P. G. M.; Greene, T. W. Protective Groups in Organic Synthesis, 4th ed.; Wiley−Interscience: New York, 2007」に記載されている。また、保護基で保護された官能基は、それぞれの保護基に適した反応条件を用いて脱保護、すなわち化学反応させることで、元の官能基を再生させることができる。保護基の代表的な脱保護条件は前述の文献に記載されている。
工程中のL7は、前記L3及びL4と同義の2価のスペーサーである。
反応Aは、N末端のアミノ基が保護基Pro1で保護されたオリゴペプチドのカルボキシル基と、官能基X1が保護基Pro2で保護されたポリエチレングリコール誘導体のアミノ基を縮合反応にて結合させ、ポリエチレングリコール誘導体(1)を得る工程である。
オリゴペプチドのN末端のアミノ基の保護基Pro1は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基及びカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc)、tert−ブチルオキシカルボニル基などが挙げられる。
ポリエチレングリコール誘導体の官能基X1の保護基Pro2は、X1がアミノ基の場合は、トリフルオロアセチル基、Fmoc基、tert−ブチルオキシカルボニル基などが挙げられ、水酸基の場合は、テトラヒドロピラニル基、tert−ブチル基、ベンジル基などが挙げられ、カルボキシル基の場合は、メチル基、tert−ブチル基、ベンジル基などが挙げられる。ただし、保護基Pro1及びPro2は、それぞれ異なる保護基である。
縮合反応としては、特に制限は無いが、縮合剤を用いる反応が望ましい。縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)などのカルボジイミド系の縮合剤を単独で使用しても良く、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(HOAt)などの試薬と併用しても良い。また、より反応性の高いHATUやHBTU、TATU、TBTU、COMU、4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリドn水和物(DMT−MM)などの縮合剤を使用しても良い。また反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したオリゴペプチドや縮合剤などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
オリゴペプチドのN末端のアミノ基の保護基Pro1は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基及びカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc)、tert−ブチルオキシカルボニル基などが挙げられる。
ポリエチレングリコール誘導体の官能基X1の保護基Pro2は、X1がアミノ基の場合は、トリフルオロアセチル基、Fmoc基、tert−ブチルオキシカルボニル基などが挙げられ、水酸基の場合は、テトラヒドロピラニル基、tert−ブチル基、ベンジル基などが挙げられ、カルボキシル基の場合は、メチル基、tert−ブチル基、ベンジル基などが挙げられる。ただし、保護基Pro1及びPro2は、それぞれ異なる保護基である。
縮合反応としては、特に制限は無いが、縮合剤を用いる反応が望ましい。縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)などのカルボジイミド系の縮合剤を単独で使用しても良く、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(HOAt)などの試薬と併用しても良い。また、より反応性の高いHATUやHBTU、TATU、TBTU、COMU、4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリドn水和物(DMT−MM)などの縮合剤を使用しても良い。また反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したオリゴペプチドや縮合剤などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
脱保護B
脱保護Bは、反応Aで得られたポリエチレングリコール誘導体(1)の保護基Pro1を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体(2)を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、保護基Pro2、オリゴペプチドやL1及びL7の2価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。また、本工程は、反応Aの工程の一環として実施することも可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
反応C
反応Cは、脱保護Bで得られたポリエチレングリコール誘導体(2)のアミノ基と、グルタル酸の二つのカルボキシル基を縮合反応で結合させ、2本の分解性ポリエチレングリコール鎖がグルタル酸で繋がれた構造である2アーム型のポリエチレングリコール誘導体(3)を得る工程である。
ここでコア分子として使用するグルタル酸は、コハク酸、アジピン酸、セバシン酸などの他の二塩基酸を用いてもよく、またエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートで活性化された化合物を用いても良い。
前記反応Aと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
ここでコア分子として使用するグルタル酸は、コハク酸、アジピン酸、セバシン酸などの他の二塩基酸を用いてもよく、またエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートで活性化された化合物を用いても良い。
前記反応Aと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
脱保護D
脱保護Dは、反応Cで得られたポリエチレングリコール誘導体(3)の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体(4)を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやL1及びL7の2価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。また、本工程は、反応Cの工程の一環として実施することも可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、グルタル酸をコア分子とした官能基X1を二つ有した2アーム型のポリエチレングリコール誘導体(4)を得ることができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、グルタル酸をコア分子とした官能基X1を二つ有した2アーム型のポリエチレングリコール誘導体(4)を得ることができる。
反応E
(工程中のPro3は保護基であり、L8は2価のスペーサーであり、PEG、Peptide、Pro1、L2及びX2は前記と同義である。)
工程中のPro3は、前記Pro1及びPro2と同義の保護基である。
工程中のL8は、前記L3及びL4と同義の2価のスペーサーである。
反応Eは、N末端のアミノ基が保護基Pro1で保護されたオリゴペプチドのカルボキシル基と、官能基X2が保護基Pro3で保護されたポリエチレングリコール誘導体のアミノ基を縮合反応にて結合させ、ポリエチレングリコール誘導体(5)を得る工程である。
前記反応Aと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。
前記反応Aと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。
脱保護F
脱保護Fは、反応Eで得られたポリエチレングリコール誘導体(5)の保護基Pro1を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体(6)を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、保護基Pro3、オリゴペプチドやL2及びL8の2価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。また、本工程は、反応Eの工程の一環として実施することも可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
反応G
反応Gは、脱保護Fで得られたポリエチレングリコール誘導体(6)と無水グルタル酸を反応させ、カルボキシル基を有したポリエチレングリコール誘導体(7)を得る。さらに脱保護Bで得られたポリエチレングリコール誘導体(2)のアミノ基と(7)のカルボキシル基を縮合反応で結合させ、異なる2種類の2本の分解性ポリエチレングリコール鎖がグルタル酸で繋がれた構造である2アーム型のポリエチレングリコール誘導体(8)を得る工程である。
反応Gでは無水グルタル酸や無水コハク酸などの二塩基酸の無水物を用いることが好ましいが、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、セバシン酸などの二塩基酸の片方のカルボキシル基が、メチル基、tert−ブチル基、ベンジル基などで保護された化合物を用いても良い。また、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基の片方がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートなどで活性化され、もう片方の水酸基がテトラヒドロピラニル基、tert−ブチル基、ベンジル基などで保護された化合物を用いても良い。
(2)との反応では、前記反応Aと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
反応Gでは無水グルタル酸や無水コハク酸などの二塩基酸の無水物を用いることが好ましいが、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、セバシン酸などの二塩基酸の片方のカルボキシル基が、メチル基、tert−ブチル基、ベンジル基などで保護された化合物を用いても良い。また、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基の片方がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートなどで活性化され、もう片方の水酸基がテトラヒドロピラニル基、tert−ブチル基、ベンジル基などで保護された化合物を用いても良い。
(2)との反応では、前記反応Aと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
脱保護H
脱保護Hは、反応Gで得られたポリエチレングリコール誘導体(8)の保護基Pro2及びPro3を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体(9)を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやL1及びL2及びL7及びL8の2価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。また、本工程は、保護基Pro2及びPro3を同条件で脱保護しても良く、またそれぞれ別工程で脱保護しても良い。さらに反応Gの工程の一環として実施することも可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、グルタル酸をコア分子とした異なる二つの官能基X1とX2を有した2アーム型のポリエチレングリコール誘導体(9)を得ることができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、グルタル酸をコア分子とした異なる二つの官能基X1とX2を有した2アーム型のポリエチレングリコール誘導体(9)を得ることができる。
反応I
(工程中のL9及びL10は2価のスペーサーであり、PEG、Peptide、Pro1は前記と同義である。)
工程中のL9は、前記L3及びL4と同義の2価のスペーサーであり、L10は、前記L1及びL2と同義の2価のスペーサーである。
反応Iは、N末端のアミノ基が保護基Pro1で保護されたオリゴペプチドのカルボキシル基と、片末端に水酸基を有したポリエチレングリコール誘導体のアミノ基を縮合反応にて結合させ、ポリエチレングリコール誘導体(10)を得る工程である。
前記反応Aと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、特にアミノ基とカルボキシル基の縮合を選択的に促進する縮合剤DMT−MMなどを用いた反応が好ましい。反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。
前記反応Aと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、特にアミノ基とカルボキシル基の縮合を選択的に促進する縮合剤DMT−MMなどを用いた反応が好ましい。反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。
脱保護J
脱保護Jは、反応Iで得られたポリエチレングリコール誘導体(10)の保護基Pro1を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体(11)を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやL9及びL10の2価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。また、本工程は、反応Iの工程の一環として実施することも可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
反応K
反応Kは、脱保護Jで得られたポリエチレングリコール誘導体(11)のアミノ基と、アジピン酸の二つのカルボキシル基を縮合反応で結合させ、2本の分解性ポリエチレングリコール鎖がアジピン酸で繋がれた構造である2アーム型のポリエチレングリコール誘導体(12)を得る工程である。
ここでコア分子として使用するアジピン酸は、コハク酸、グルタル酸、セバシン酸などの他の二塩基酸を用いてもよく、またエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートで活性化された化合物を用いても良い。
前記反応Aと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、特にアミノ基とカルボキシル基の縮合を選択的に促進する縮合剤DMT−MMなどを用いた反応が好ましい。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
ここでコア分子として使用するアジピン酸は、コハク酸、グルタル酸、セバシン酸などの他の二塩基酸を用いてもよく、またエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートで活性化された化合物を用いても良い。
前記反応Aと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、特にアミノ基とカルボキシル基の縮合を選択的に促進する縮合剤DMT−MMなどを用いた反応が好ましい。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
反応L
反応Lは、反応Kで得られたポリエチレングリコール誘導体(12)の2つの水酸基を官能基X1に変換し、ポリエチレングリコール誘導体(13)を得る工程である。
水酸基を他の官能基に変換する反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、例えば、「Harris, J. M. Poly(Ethylene Glycol) Chemistry; Plenum Press: New York, 1992」、「Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques, 2nd ed.; Academic Press: San Diego, CA, 2008」及び「PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Applications; Veronese, F. M., Ed.; Birkhauser: Basel, Switzerland,2009」などに記載されている方法を用いることで種々の官能基に変換できる。
例えば、パラ−ニトロフェニルクロロホルメートやジスクシンイミジルカーボネートなどの反応試薬を、トリエチルアミンなどの塩基を用いて反応させることで、(12)の水酸基を活性化カーボネート基に変換できる。また、特許第5418360号に記載されている方法で(12)の水酸基をアミノ基、オキシアミノ基に変換できる。
反応Lで使用する反応試薬は、低分子量の試薬であり、高分子量のポリマーであるポリエチレングリコール誘導体とは大きく溶解性が異なるため、抽出や晶析などの一般的な精製方法にて容易に除去が可能である。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、アジピン酸をコア分子とした官能基X1を二つ有した2アーム型のポリエチレングリコール誘導体(13)を得ることができる。
水酸基を他の官能基に変換する反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、例えば、「Harris, J. M. Poly(Ethylene Glycol) Chemistry; Plenum Press: New York, 1992」、「Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques, 2nd ed.; Academic Press: San Diego, CA, 2008」及び「PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Applications; Veronese, F. M., Ed.; Birkhauser: Basel, Switzerland,2009」などに記載されている方法を用いることで種々の官能基に変換できる。
例えば、パラ−ニトロフェニルクロロホルメートやジスクシンイミジルカーボネートなどの反応試薬を、トリエチルアミンなどの塩基を用いて反応させることで、(12)の水酸基を活性化カーボネート基に変換できる。また、特許第5418360号に記載されている方法で(12)の水酸基をアミノ基、オキシアミノ基に変換できる。
反応Lで使用する反応試薬は、低分子量の試薬であり、高分子量のポリマーであるポリエチレングリコール誘導体とは大きく溶解性が異なるため、抽出や晶析などの一般的な精製方法にて容易に除去が可能である。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、アジピン酸をコア分子とした官能基X1を二つ有した2アーム型のポリエチレングリコール誘導体(13)を得ることができる。
反応M
反応Mは、脱保護Bで得られたポリエチレングリコール誘導体(2)のアミノ基と、アミノ基が保護基で保護されたグルタミン酸誘導体の二つのカルボキシル基を縮合反応で結合させ、2本の分解性ポリエチレングリコール鎖がグルタミン酸残基で繋がれた構造である分岐型のポリエチレングリコール誘導体(14)を得る工程である。
前記反応Aと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
グルタミン酸のアミノ基の保護基は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基及びカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc)、tert−ブチルオキシカルボニル基などが挙げられる。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
前記反応Aと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
グルタミン酸のアミノ基の保護基は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基及びカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc)、tert−ブチルオキシカルボニル基などが挙げられる。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
脱保護N
脱保護Nは、反応Mで得られたポリエチレングリコール誘導体(14)の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体(15)を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやL1及びL7の2価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。また、本工程は、反応Mの工程の一環として実施することも可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
反応O
反応Oは、脱保護Nで得られたポリエチレングリコール誘導体(15)のアミノ基と、グルタル酸の二つのカルボキシル基を縮合反応で結合させ、4本の分解性ポリエチレングリコール鎖がグルタル酸で繋がれた構造である4アーム型のポリエチレングリコール誘導体(16)を得る工程である。
ここでコア分子として使用するグルタル酸は、コハク酸、アジピン酸、セバシン酸などの他の二塩基酸を用いてもよく、またエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートで活性化された化合物を用いても良い。
前記反応Aと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
ここでコア分子として使用するグルタル酸は、コハク酸、アジピン酸、セバシン酸などの他の二塩基酸を用いてもよく、またエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートで活性化された化合物を用いても良い。
前記反応Aと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
脱保護P
脱保護Pは、反応Oで得られたポリエチレングリコール誘導体(16)の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体(17)を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやL1及びL7の2価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。また、本工程は、反応Oの工程の一環として実施することも可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、グルタル酸をコア分子とした官能基X1を4つ有した4アーム型のポリエチレングリコール誘導体(17)を得ることができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、グルタル酸をコア分子とした官能基X1を4つ有した4アーム型のポリエチレングリコール誘導体(17)を得ることができる。
反応Q
反応Qは、脱保護Nで得られたポリエチレングリコール誘導体(15)のアミノ基と、アミノ基が保護基で保護されたグルタミン酸誘導体の二つのカルボキシル基を縮合反応で結合させ、4本の分解性ポリエチレングリコール鎖がグルタミン酸残基で繋がれた構造である分岐型のポリエチレングリコール誘導体(18)を得る工程である。
前記反応Mと同条件で反応と精製が可能である。
ポリエチレングリコール誘導体(18)の中から、分子量や官能基の異なるポリエチレングリコール不純物を除去する手法としては、特開2014−208786号公報、または特開2011−79934号公報に記載の精製技術を用いることができる。
前記反応Mと同条件で反応と精製が可能である。
ポリエチレングリコール誘導体(18)の中から、分子量や官能基の異なるポリエチレングリコール不純物を除去する手法としては、特開2014−208786号公報、または特開2011−79934号公報に記載の精製技術を用いることができる。
脱保護R
脱保護Rは、反応Qで得られたポリエチレングリコール誘導体(18)の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体(19)を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやL1及びL7の2価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。前記脱保護Nと同条件で反応と精製が可能である。また、本工程は、反応Qの工程の一環として実施することも可能である。
反応S
反応Sは、脱保護Rで得られたポリエチレングリコール誘導体(19)のアミノ基と、グルタル酸の二つのカルボキシル基を縮合反応で結合させ、8本の分解性ポリエチレングリコール鎖がグルタル酸で繋がれた構造である8アーム型のポリエチレングリコール誘導体(20)を得る工程である。
ここでコア分子として使用するグルタル酸は、コハク酸、アジピン酸、セバシン酸などの他の二塩基酸を用いてもよく、またエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートで活性化された化合物を用いても良い。
前記反応Aと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
ここでコア分子として使用するグルタル酸は、コハク酸、アジピン酸、セバシン酸などの他の二塩基酸を用いてもよく、またエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオールなどの二つの水酸基がニトロフェニルカーボネートやスクシンイミジルカーボネートで活性化された化合物を用いても良い。
前記反応Aと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
脱保護T
脱保護Tは、反応Sで得られたポリエチレングリコール誘導体(20)の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体(21)を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやL1及びL7の2価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。また、本工程は、反応Sの工程の一環として実施することも可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、グルタル酸をコア分子とした官能基X1を8つ有した8アーム型のポリエチレングリコール誘導体(21)を得ることができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
以上の工程により、グルタル酸をコア分子とした官能基X1を8つ有した8アーム型のポリエチレングリコール誘導体(21)を得ることができる。
脱保護D、脱保護H、脱保護P及び脱保護Tで得られたポリエチレングリコール誘導体(4)、(9)、(17)及び(21)は、官能基X1及びX2を有しており、これら官能基を利用して様々な官能基に変換が可能である。
例えば、官能基X1及びX2がアミノ基の場合、特に制限は無いが、基本的には、アミノ基と反応可能な活性エステル基を有した化合物、または酸無水物、酸クロライドなどの一般的な反応試薬を用いることで、様々な官能基に容易に変換することが出来る。
具体的には、アミノ基をマレイミド基に変換したい場合は、以下のような試薬と反応させることで、目的物を得ることができる。
例えば、ポリエチレングリコール誘導体の末端のアミノ基をカルボキシル基に変換したい場合は、無水コハク酸や無水グルタル酸と反応させることで、目的物を得ることができる。
例えば、ポリエチレングリコール誘導体の末端のアミノ基を水酸基に変換したい場合は、カプロラクトンなどの環状エステルの開環物と縮合反応させることで、目的物を得ることができる。
これら反応試薬は、低分子量の試薬であり、高分子量のポリマーであるポリエチレングリコール誘導体とは大きく溶解性が異なるため、抽出や晶析などの一般的な精製方法にて容易に除去が可能である。
以上のような工程を経て、得られた分解性ポリエチレングリコールは、血中で安定であり、細胞内でのみ分解する性能を有することが求められる。その性能を適切に評価するため、例えば、以下に示すような試験を実施し、分解性ポリエチレングリコールの血中での安定性、そして細胞内での分解性を評価することができる。
なお、これらの評価においてポリエチレングリコール誘導体が有する官能基の種類による影響を考慮し、評価試料はすべて、アミノ基を1つ有したポリエチレングリコール誘導体に統一して試験を実施した。
なお、これらの評価においてポリエチレングリコール誘導体が有する官能基の種類による影響を考慮し、評価試料はすべて、アミノ基を1つ有したポリエチレングリコール誘導体に統一して試験を実施した。
分解性ポリエチレングリコール誘導体の血中での安定性を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、マウス、ラット、ヒトなどの血清を用いた試験などが挙げられる。具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を1〜10mg/mLの濃度になるように血清に溶解し、37℃で96時間インキュベート後、血清中に含まれるポリエチレングリコール誘導体を回収し、GPCを測定することで分解率を評価することができる。分解率は、安定性試験前のポリエチレングリコール誘導体のGPCメインフラクションのピーク面積%と、安定性試験後のポリエチレングリコール誘導体のGPCメインフラクションのピーク面積%から算出する。具体的には以下の式を用いる。
分解率 = (試験前のピーク面積% − 試験後のピーク面積%) ÷ 試験前のピーク面積% × 100
例えば、安定性試験前の分解性ポリエチレングリコール誘導体のGPCメインフラクションのピーク面積%が95%であり、試験後のGPCメインフラクションのピーク面積%が90%だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率 = (95−90)÷95×100 = 5.26(%)
分解性ポリエチレングリコール誘導体は、血中で分解してしまうと、目的とする血中半減期を得ることができないため、安定性試験において、96時間後の分解率は、10%以下が好ましく、5%以下がさらに好ましい。
分解率 = (試験前のピーク面積% − 試験後のピーク面積%) ÷ 試験前のピーク面積% × 100
例えば、安定性試験前の分解性ポリエチレングリコール誘導体のGPCメインフラクションのピーク面積%が95%であり、試験後のGPCメインフラクションのピーク面積%が90%だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率 = (95−90)÷95×100 = 5.26(%)
分解性ポリエチレングリコール誘導体は、血中で分解してしまうと、目的とする血中半減期を得ることができないため、安定性試験において、96時間後の分解率は、10%以下が好ましく、5%以下がさらに好ましい。
分解性ポリエチレングリコール誘導体の細胞内での分解性を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、分解性ポリエチレングリコール誘導体を含有した培地を用いて、細胞を培養させる試験などが挙げられる。ここで使用する細胞や培地については、特に制限は無いが、具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を1〜20mg/mLの濃度になるように培地であるRPMI−1640に溶解し、この培地を用いて、マクロファージ細胞RAW264.7を37℃で96時間培養後、細胞中のポリエチレングリコール誘導体を回収し、GPCを測定することで分解率を評価することができる。分解率は、安定性試験と同様に、試験前後のポリエチレングリコール誘導体のGPCメインフラクションのピーク面積%を用いて算出する。
例えば、細胞を用いた分解性試験前の分解性ポリエチレングリコール誘導体のGPCメインフラクションのピーク面積%が95%であり、試験後のGPCメインフラクションのピーク面積%が5%だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率 = (95−5)÷95×100 = 94.7(%)
分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞内で効率よく分解されないと、目的とする細胞の空胞を抑制できないため、分解性試験において、96時間後の分解率は、90%以上が好ましく、95%以上がさらに好ましい。
例えば、細胞を用いた分解性試験前の分解性ポリエチレングリコール誘導体のGPCメインフラクションのピーク面積%が95%であり、試験後のGPCメインフラクションのピーク面積%が5%だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率 = (95−5)÷95×100 = 94.7(%)
分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞内で効率よく分解されないと、目的とする細胞の空胞を抑制できないため、分解性試験において、96時間後の分解率は、90%以上が好ましく、95%以上がさらに好ましい。
分解性ポリエチレングリコール誘導体の血中半減期や体内分布を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、放射性同位体や蛍光物質をラベル化し、マウスやラットに投与して、モニタリングする試験などが挙げられる。
ポリエチレングリコール誘導体に導入した分解性ペプチドは、ポリエチレングリコールに細胞内での分解性を付与するが、そのペプチド構造によってポリエチレングリコールの体内動態を変化させる可能性が考えられる。そこで、導入したペプチド構造の体内動態への影響を確認するため、血中半減期及び、その体内分布について、分解性を持たない同分子量のポリエチレングリコール誘導体と比較する必要がある。具体的には、放射性同位体でラベル化した分解性を持たないポリエチレングリコール誘導体と、分解性ポリエチレングリコール誘導体を、マウスに投与し、複数のタイムポイントで、血液、各臓器の放射線量を測定し、定量測定を行うことができる。
ポリエチレングリコール誘導体に導入した分解性ペプチドは、ポリエチレングリコールに細胞内での分解性を付与するが、そのペプチド構造によってポリエチレングリコールの体内動態を変化させる可能性が考えられる。そこで、導入したペプチド構造の体内動態への影響を確認するため、血中半減期及び、その体内分布について、分解性を持たない同分子量のポリエチレングリコール誘導体と比較する必要がある。具体的には、放射性同位体でラベル化した分解性を持たないポリエチレングリコール誘導体と、分解性ポリエチレングリコール誘導体を、マウスに投与し、複数のタイムポイントで、血液、各臓器の放射線量を測定し、定量測定を行うことができる。
分解性ポリエチレングリコール誘導体の細胞の空胞抑制を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、非特許文献2に記載があるように、長期間、高頻度、及び高投与量でマウスやラットに投与を続け、空胞が発生しやすいといわれている臓器や器官の切片画像を確認する試験などが挙げられる。
具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を10〜250mg/mLの濃度になるように生理食塩水に溶解し、マウス尾静脈より週3回、4週間以上、20〜100μL投与を続け、空胞が発生しやすいといわれている器官である脳脈絡叢や脾臓などのパラフィン切片を作製して染色後、切片画像を病理学的手法により確認し、空胞抑制の評価を行うことができる。
なお、本評価においてポリエチレングリコールの投与量は、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、大過剰のポリエチレングリコールを投与する必要がある。
具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を10〜250mg/mLの濃度になるように生理食塩水に溶解し、マウス尾静脈より週3回、4週間以上、20〜100μL投与を続け、空胞が発生しやすいといわれている器官である脳脈絡叢や脾臓などのパラフィン切片を作製して染色後、切片画像を病理学的手法により確認し、空胞抑制の評価を行うことができる。
なお、本評価においてポリエチレングリコールの投与量は、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、大過剰のポリエチレングリコールを投与する必要がある。
非特許文献2では、高分子量のポリエチレングリコールによる細胞の空胞化は、ポリエチレングリコールの組織への蓄積と関係があるとの記載がある。分解性ポリエチレングリコール誘導体の細胞への蓄積性を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、上記の空胞の評価と同じ方法で作成した切片画像より評価することができる。ポリエチレングリコールが蓄積しやすいといわれている器官である脳脈絡叢や脾臓などの染色した切片画像を病理学的手法により確認し、ポリエチレングリコールの蓄積性の評価を行うことができる。
なお、本評価においてポリエチレングリコールの投与量は、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、大過剰のポリエチレングリコールを投与する必要がある。
なお、本評価においてポリエチレングリコールの投与量は、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、大過剰のポリエチレングリコールを投与する必要がある。
下記実施例で得られた1H−NMRは、日本電子データム(株)製JNM−ECP400またはJNM−ECA600から得た。測定にはφ5mmチューブを用い、重水素化溶媒には、D2Oまたは内部標準物質としてテトラメチルシラン(TMS)を含有するCDCl3及びd6−DMSOを用いた。得られたポリエチレングリコール誘導体の分子量及びアミン純度は、液体クロマトグラフィー(GPC及びHPLC)を用いて算出した。液体クロマトグラフィーのシステムは、GPCには東ソー(株)製「HLC−8320GPC EcoSEC」を用い、HPLCにはWATERS製「ALLIANCE」を用いた。以下、GPC及びHPLCの分析条件を示す。
GPC分析(分子量測定)
検出器:示差屈折計
カラム:ultrahydrogel500及びultrahydrogel250(WATERS製)
移動相:100mM Acetate buffer+0.02%NaN3(pH5.2)
流速:0.5mL/min
サンプル量:5mg/mL、20μL
カラム温度:30℃
HPLC分析(アミン純度測定)
検出器:示差屈折計
カラム:TSKgel SP−5PW(東ソー(株)製)
移動相:1mM Sodium phosphate buffer(pH6.5)
流速:0.5mL/min
注入量:5mg/mL、20μL
カラム温度:40℃
GPC分析(分子量測定)
検出器:示差屈折計
カラム:ultrahydrogel500及びultrahydrogel250(WATERS製)
移動相:100mM Acetate buffer+0.02%NaN3(pH5.2)
流速:0.5mL/min
サンプル量:5mg/mL、20μL
カラム温度:30℃
HPLC分析(アミン純度測定)
検出器:示差屈折計
カラム:TSKgel SP−5PW(東ソー(株)製)
移動相:1mM Sodium phosphate buffer(pH6.5)
流速:0.5mL/min
注入量:5mg/mL、20μL
カラム温度:40℃
[実施例1]
化合物(p3)の合成
化合物(p3)の合成
[実施例1−1]
化合物(p1)の合成
化合物(p1)の合成
N末端を9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc基)で保護したL−フェニルアラニル−グリシン(Fmoc−Phe−Gly)(400mg)と平均分子量=20,000、日油株式会社製「SUNBRIGHT HO−200PA」(15g)にアセトニトリル(60g)を添加して溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン(233mg)と4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリドn水和物(DMT−MM)(311mg)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で1時間反応させた。その後、ピペリジン(639mg)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で2時間反応させた。反応終了後、反応液をトルエン(500g)で希釈した後、ヘキサン(300g)を加えて、室温にて30分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度トルエン(300g)に溶解し、ヘキサン(150g)を加えて、室温にて30分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、2,6−ジ−tert−ブチル−p−クレゾ−ル(BHT)(20mg)を含有したヘキサン(100g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p1)を得た。収量13g。
1H−NMR(d6−DMSO):1.73ppm(m、2H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−(O−CH2−CH2)n−OH)、2.59ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、2.98ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.10ppm(q、2H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−(O−CH2−CH2)n−OH)、3.48ppm(m、約1,900H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−OH)、7.24ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.73ppm(t、1H)、8.12ppm(broad、1H)
1H−NMR(d6−DMSO):1.73ppm(m、2H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−(O−CH2−CH2)n−OH)、2.59ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、2.98ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.10ppm(q、2H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−(O−CH2−CH2)n−OH)、3.48ppm(m、約1,900H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−OH)、7.24ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.73ppm(t、1H)、8.12ppm(broad、1H)
[実施例1−2]
化合物(p2)の合成
化合物(p2)の合成
実施例1−1で得られた化合物(p1)(1.0g)、グルタル酸(3.2mg)をアセトニトリル(4.0g)に溶解し、その後、ジイソプロピルエチルアミン(8.4mg)とDMT−MM(22mg)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で3時間反応させた。反応終了後、反応液を酢酸エチル(60g)で希釈した後、ヘキサン(40g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度、酢酸エチル(60g)に溶解し、ヘキサン(30g)を加えて、室温にて30分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(6mg)を含有したヘキサン(30g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p2)を得た。収量734mg。
1H−NMR(d6−DMSO):1.73ppm(m、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−(O−CH2−CH2)n−OH)、2.05ppm(m、6H、−NH−CO−CH 2 CH 2 CH 2 −CO−NH−)、2.59ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、2.98ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.10ppm(q、4H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−(O−CH2−CH2)n−OH)、3.48ppm(m、約3,800H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−OH)、7.24ppm(m、10H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.73ppm(t、2H)、8.12ppm(broad、2H)
1H−NMR(d6−DMSO):1.73ppm(m、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−(O−CH2−CH2)n−OH)、2.05ppm(m、6H、−NH−CO−CH 2 CH 2 CH 2 −CO−NH−)、2.59ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、2.98ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.10ppm(q、4H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−(O−CH2−CH2)n−OH)、3.48ppm(m、約3,800H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−OH)、7.24ppm(m、10H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.73ppm(t、2H)、8.12ppm(broad、2H)
[実施例1−3]
化合物(p3)の合成
化合物(p3)の合成
実施例1−2で得られた化合物(p2)(500mg)、をジクロロメタン(3.5g)に溶解し、その後、炭酸ジ(N−スクシンイミジル)(26mg)とピリジン(10mg)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で8時間反応させた。反応終了後、5%食塩水(5g)で反応液を洗浄し、硫酸マグネシウム(100mg)を加えて、室温にて30分撹拌した後、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を濃縮後、濃縮物にBHT(6mg)含有の酢酸エチル(30g)を添加して溶解した後、ヘキサン(15g)を加えて室温にて30分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(6mg)含有のヘキサン(30g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p3)を得た。収量378mg。スクシンイミジルカーボネート化率は94%(1H−NMR)であった。
1H−NMR(d6−DMSO):1.73ppm(m、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−OCO−Succinimide)、2.05ppm(m、6H、−NH−CO−CH 2 −CH 2 −CH 2 −CO−NH−)、2.59ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、2.83ppm(s、8H、−CO−CH 2 −CH 2 −CO−)、2.98ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.10ppm(q、4H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−(O−CH2−CH2)n−OCO−Succinimide)、3.48ppm(m、約3,800H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−OCO−Succinimide)、7.24ppm(m、10H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.73ppm(t、2H)、8.12ppm(broad、2H)
1H−NMR(d6−DMSO):1.73ppm(m、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−OCO−Succinimide)、2.05ppm(m、6H、−NH−CO−CH 2 −CH 2 −CH 2 −CO−NH−)、2.59ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、2.83ppm(s、8H、−CO−CH 2 −CH 2 −CO−)、2.98ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.10ppm(q、4H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−(O−CH2−CH2)n−OCO−Succinimide)、3.48ppm(m、約3,800H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−OCO−Succinimide)、7.24ppm(m、10H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.73ppm(t、2H)、8.12ppm(broad、2H)
[実施例2]
化合物(p8)の合成
化合物(p8)の合成
[実施例2−1]
化合物(p4)の合成
化合物(p4)の合成
平均分子量=20,000、日油株式会社製「SUNBRIGHT DE−200PA」(20g)をトルエン(80g)に溶解し、二炭酸ジ−tert−ブチル(107mg)を添加し、40℃にて窒素雰囲気下で3時間反応させた。反応終了後、トルエン(100g)を添加し、攪拌して均一にした後、ヘキサン(100g)を加えて室温にて30分間攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、生成物を真空乾燥した。その後、生成物をイオン交換クロマトグラフィーにて精製し、回収した水溶液にクロロホルム(500g)を添加し、室温にて30分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。得られた有機層に硫酸ナトリウム(10g)を添加し、室温にて30分攪拌して脱水した後、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した。得られたろ液を濃縮し、トルエン(200g)に再溶解し、ヘキサン(100g)を添加し、室温で30分攪拌して結晶を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収し、ヘキサン(100g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p4)を得た。収量9.1g。HPLC:アミン純度は98%であった。
1H−NMR(d6−DMSO):1.44ppm(s、9H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.64ppm(m、1H)、1.73ppm(m、4H)、2.68ppm(t、2H、−(CH2−CH2−O)n−CH2−CH2−CH 2 −NH2)、3.18ppm(t、2H、−CH2−CH2−CH 2 −NH−CO−O−C(CH3)3)、3.35ppm(m、4H)、3.64ppm(m、約1,900H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−)、6.76ppm(broad、1H)
1H−NMR(d6−DMSO):1.44ppm(s、9H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.64ppm(m、1H)、1.73ppm(m、4H)、2.68ppm(t、2H、−(CH2−CH2−O)n−CH2−CH2−CH 2 −NH2)、3.18ppm(t、2H、−CH2−CH2−CH 2 −NH−CO−O−C(CH3)3)、3.35ppm(m、4H)、3.64ppm(m、約1,900H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−)、6.76ppm(broad、1H)
[実施例2−2]
化合物(p5)の合成
化合物(p5)の合成
N末端を9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc基)で保護したL−グリシル−ロイシル−フェニルアラニル−グリシン(Fmoc−Gly−Leu−Phe−Gly)(313mg)と実施例2−1で得られた化合物(p4)(8.5g)にアセトニトリル(34g)を添加して溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン(132mg)とDMT−MM(353mg)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で1時間反応させた。その後、ピペリジン(361mg)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で2時間反応させた。反応終了後、反応液をトルエン(400g)で希釈した後、ヘキサン(250g)を加えて、室温にて30分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度トルエン(400g)に溶解し、ヘキサン(200g)を加えて、室温にて30分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン(200g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p5)を得た。収量7.6g。
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、9H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.48ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、6H)、2.68ppm(t、2H、−(CH2−CH2−O)n−CH2−CH2−CH 2 −NH2)、3.18ppm(t、2H、−CH2−CH2−CH 2 −NH−CO−O−C(CH3)3)、3.35ppm(m、4H)、3.64ppm(m、約1,900H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−)、4.09ppm(s、2H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−CH 2 −NH−)、4.44ppm(m、1H)、4.92ppm(m、1H)、6.76ppm(broad、1H)、7.20ppm(d、2H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.32ppm(m、3H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.01ppm(broad、1H)、8.32ppm(broad、2H)、8.70ppm(broad、2H)、9.04ppm(broad、1H)
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、9H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.48ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、6H)、2.68ppm(t、2H、−(CH2−CH2−O)n−CH2−CH2−CH 2 −NH2)、3.18ppm(t、2H、−CH2−CH2−CH 2 −NH−CO−O−C(CH3)3)、3.35ppm(m、4H)、3.64ppm(m、約1,900H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−)、4.09ppm(s、2H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−CH 2 −NH−)、4.44ppm(m、1H)、4.92ppm(m、1H)、6.76ppm(broad、1H)、7.20ppm(d、2H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.32ppm(m、3H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.01ppm(broad、1H)、8.32ppm(broad、2H)、8.70ppm(broad、2H)、9.04ppm(broad、1H)
[実施例2−3]
化合物(p6)の合成
化合物(p6)の合成
実施例2−2で得られた化合物(p5)(1.3g)、コハク酸(3.8mg)をアセトニトリル(5.2g)に溶解し、その後、ジイソプロピルエチルアミン(11mg)とDMT−MM(29mg)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で3時間反応させた。反応終了後、反応液を酢酸エチル(100g)で希釈した後、ヘキサン(60g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(20mg)を含有した酢酸エチル(100g)に溶解し、ヘキサン(50g)を加えて、室温にて30分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(10mg)を含有したヘキサン(50g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p6)を得た。収量889mg。1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、18H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.48ppm(m、2H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、12H)、2.34ppm(m、4H)、2.68ppm(t、4H、−(CH2−CH2−O)n−CH2−CH2−CH 2 −)、3.18ppm(t、4H、−CH2−CH2−CH 2 −NH−CO−O−C(CH3)3)、3.35ppm(m、8H)、3.64ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−)、4.09ppm(s、12H)、4.44ppm(m、2H)、4.92ppm(m、2H)、6.76ppm(broad、1H)、7.20ppm(d、4H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.32ppm(m、6H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.01ppm(broad、2H)、8.32ppm(broad、4H)、9.04ppm(broad、4H)
[実施例2−4]
化合物(p7)の合成
化合物(p7)の合成
実施例2−3で得られた化合物(p6)(800mg)をイオン交換水(3.3g)に溶解し、6N塩酸(0.7g)を添加して、室温にて窒素雰囲気下で3時間反応させた。反応終了後、1N水酸化ナトリウム水溶液を添加し、pH6.5に調整した後、塩化ナトリウム(1.0g)を添加し溶解した。得られた溶液に1N水酸化ナトリウム水溶液を添加し、pHを7.10に調整した後、BHT(2mg)含有のクロロホルム(10g)を添加して室温にて20分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。有機層と水層を分離し、有機層を回収した後、水層に再度BHT(2mg)含有のクロロホルム(10g)を添加して、室温で20分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出1回目と2回目で得られた有機層を合わせて40℃で濃縮し、得られた濃縮物をトルエン(50g)に溶解し、硫酸ナトリウム(1.0g)を添加し、室温にて30分攪拌して脱水した。その後、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、ろ液にヘキサン(30g)を加えて室温にて30分攪拌して生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(6mg)を含有したヘキサン(30g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p7)を得た。収量675mg。HPLC:アミン純度は91%であった。
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.48ppm(m、2H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、12H)、2.34ppm(m、4H)、2.68ppm(t、4H、−(CH2−CH2−O)n−CH2−CH2−CH 2 −)、3.18ppm(t、4H、−CH2−CH2−CH 2 −NH−CO−O−C(CH3)3)、3.35ppm(m、8H)、3.64ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−)、4.09ppm(s、12H)、4.44ppm(m、2H)、4.92ppm(m、2H)、6.76ppm(broad、1H)、7.20ppm(d、4H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.32ppm(m、6H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.01ppm(broad、2H)、8.32ppm(broad、4H)、9.04ppm(broad、4H)
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.48ppm(m、2H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、12H)、2.34ppm(m、4H)、2.68ppm(t、4H、−(CH2−CH2−O)n−CH2−CH2−CH 2 −)、3.18ppm(t、4H、−CH2−CH2−CH 2 −NH−CO−O−C(CH3)3)、3.35ppm(m、8H)、3.64ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−)、4.09ppm(s、12H)、4.44ppm(m、2H)、4.92ppm(m、2H)、6.76ppm(broad、1H)、7.20ppm(d、4H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.32ppm(m、6H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.01ppm(broad、2H)、8.32ppm(broad、4H)、9.04ppm(broad、4H)
[実施例2−5]
化合物(p8)の合成
化合物(p8)の合成
実施例2−4で得られた化合物(p7)(400mg)をアセトニトリル(320mg)及びトルエン(2.1g)に溶解した。その後、N−メチルモルホリン(10mg)と3−マレイミドプロピオン酸 N−スクシンイミジル(27mg)を添加し、室温にて窒素雰囲気下及び遮光下で6時間反応させた。反応終了後、反応液をBHT(10mg)含有の酢酸エチル(50g)で希釈した後、ヘキサン(30g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(6mg)含有のヘキサン(30g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p8)を得た。収量227mg。マレイミド化率は96%(1H−NMR)であった。
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.48ppm(m、2H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、12H)、2.34ppm(m、4H)、2.68ppm(t、4H、−(CH2−CH2−O)n−CH2−CH2−CH 2 −)、3.18ppm(t、4H、−CH2−CH2−CH 2 −NH−CO−O−C(CH3)3)、3.35ppm(m、8H)、3.64ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−)、4.09ppm(s、12H)、4.44ppm(m、2H)、4.76ppm(m、4H、−NH−CO−CH2−CH 2 −Maleimide)、4.92ppm(m、2H)、6.76ppm(broad、1H)、6.68ppm(s、4H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−CH2−CH2−C 4 NO 2 H 2 )、7.20ppm(d、4H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.32ppm(m、6H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.01ppm(broad、2H)、8.32ppm(broad、4H)、9.04ppm(broad、4H)
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.48ppm(m、2H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、12H)、2.34ppm(m、4H)、2.68ppm(t、4H、−(CH2−CH2−O)n−CH2−CH2−CH 2 −)、3.18ppm(t、4H、−CH2−CH2−CH 2 −NH−CO−O−C(CH3)3)、3.35ppm(m、8H)、3.64ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−)、4.09ppm(s、12H)、4.44ppm(m、2H)、4.76ppm(m、4H、−NH−CO−CH2−CH 2 −Maleimide)、4.92ppm(m、2H)、6.76ppm(broad、1H)、6.68ppm(s、4H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−CH2−CH2−C 4 NO 2 H 2 )、7.20ppm(d、4H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.32ppm(m、6H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.01ppm(broad、2H)、8.32ppm(broad、4H)、9.04ppm(broad、4H)
[実施例3]
化合物(p13)の合成
化合物(p13)の合成
[実施例3−1]
化合物(p9)の合成
化合物(p9)の合成
実施例1−1で得られた化合物(p1)(2.0g)、酢酸ナトリウム(82mg)、無水グルタル酸(132mg)をトルエン(6.0g)に溶解し、窒素雰囲気下で40℃にて7時間反応させた。反応終了後、酢酸エチル(100g)で希釈し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、得られたろ液にヘキサン(50g)を添加して室温にて15分攪拌し、生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した。得られた析出物を酢酸エチル(100g)に溶解し、ヘキサン(50g)を添加して室温にて30分攪拌し、生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収し、ヘキサン(50g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p9)を得た。収量1.8g。
1H−NMR(d6−DMSO):1.73ppm(m、2H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−(O−CH2−CH2)n−OH)、2.05ppm(m、4H、−NH−CO−CH 2 −CH 2 −CH2−COOH)、2.30ppm(t、2H、−NH−CO−CH2−CH2−CH 2 −COOH)、2.59ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、2.98ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.10ppm(q、2H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−(O−CH2−CH2)n−OH)、3.48ppm(m、約1,900H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−OH)、7.24ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.12ppm(broad、1H)、9.04ppm(broad、1H)
1H−NMR(d6−DMSO):1.73ppm(m、2H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−(O−CH2−CH2)n−OH)、2.05ppm(m、4H、−NH−CO−CH 2 −CH 2 −CH2−COOH)、2.30ppm(t、2H、−NH−CO−CH2−CH2−CH 2 −COOH)、2.59ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、2.98ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.10ppm(q、2H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−(O−CH2−CH2)n−OH)、3.48ppm(m、約1,900H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−OH)、7.24ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.12ppm(broad、1H)、9.04ppm(broad、1H)
[実施例3−2]
化合物(p10)の合成
化合物(p10)の合成
実施例3−1で得られた化合物(p9)(1.6g)と実施例2−2で得られた化合物(p5)(1.6g)をアセトニトリル(10g)に溶解し、その後、ジイソプロピルエチルアミン(25mg)とDMT−MM(66mg)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で3時間反応させた。反応終了後、反応液を酢酸エチル(150g)で希釈した後、ヘキサン(80g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度、酢酸エチル(100g)に溶解し、ヘキサン(50g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(16mg)を含有したヘキサン(80g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p10)を得た。収量2.6g。
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、3H、−NH−CO−CH2−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、3H、−NH−CO−CH2−CH2−CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、9H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.48ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、8H)、2.05ppm(m、4H、−NH−CO−CH 2 −CH 2 −CH2−CO−NH−)、2.30ppm(t、2H、−NH−CO−CH2−CH2−CH 2 −CO−NH−)、2.59ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、2.98ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.10ppm(m、10H)、3.48ppm(m、約3,800H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−)、4.09ppm(s、6H)、6.76ppm(broad、1H)、7.24ppm(m、10H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.12ppm(broad、2H)、8.32ppm(broad、3H)、9.04ppm(broad、3H)
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、3H、−NH−CO−CH2−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、3H、−NH−CO−CH2−CH2−CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、9H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.48ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、8H)、2.05ppm(m、4H、−NH−CO−CH 2 −CH 2 −CH2−CO−NH−)、2.30ppm(t、2H、−NH−CO−CH2−CH2−CH 2 −CO−NH−)、2.59ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、2.98ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.10ppm(m、10H)、3.48ppm(m、約3,800H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−)、4.09ppm(s、6H)、6.76ppm(broad、1H)、7.24ppm(m、10H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.12ppm(broad、2H)、8.32ppm(broad、3H)、9.04ppm(broad、3H)
[実施例3−3]
化合物(p11)の合成
化合物(p11)の合成
実施例3−2で得られた化合物(p10)(2.3g)をイオン交換水(9.4g)に溶解し、6N塩酸(2.1g)を添加して、室温にて窒素雰囲気下で3時間反応させた。反応終了後、1N水酸化ナトリウム水溶液を添加し、pH6.5に調整した後、塩化ナトリウム(2.5g)を添加し溶解した。得られた溶液に1N水酸化ナトリウム水溶液を添加し、pHを7.10に調整した後、BHT(4mg)含有のクロロホルム(20g)を添加して室温にて20分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。有機層と水層を分離し、有機層を回収した後、水層に再度BHT(4mg)含有のクロロホルム(20g)を添加して、室温で20分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出1回目と2回目で得られた有機層を合わせて40℃で濃縮し、得られた濃縮物をトルエン(150g)に溶解し、硫酸ナトリウム(5.0g)を添加し、室温にて30分攪拌し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した。ろ液にヘキサン(80g)を加えて室温にて30分攪拌して生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(10mg)を含有したヘキサン(50g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p11)を得た。収量1.7g。HPLC:アミン純度は90%であった。
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、3H、−NH−CO−CH2−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、3H、−NH−CO−CH2−CH2−CH(CH 3 )2)、1.48ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、8H)、2.05ppm(m、4H、−NH−CO−CH 2 −CH 2 −CH2−CO−NH−)、2.30ppm(t、2H、−NH−CO−CH2−CH2−CH 2 −CO−NH−)、2.59ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、2.68ppm(t、2H、NH2−CH 2 −CH2−CH2−(O−CH2−CH2)n−)、2.98ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.48ppm(m、約3,800H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−)、4.09ppm(s、6H)、7.24ppm(m、10H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.12ppm(broad、2H)、8.32ppm(broad、3H)、9.04ppm(broad、3H)
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、3H、−NH−CO−CH2−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、3H、−NH−CO−CH2−CH2−CH(CH 3 )2)、1.48ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、8H)、2.05ppm(m、4H、−NH−CO−CH 2 −CH 2 −CH2−CO−NH−)、2.30ppm(t、2H、−NH−CO−CH2−CH2−CH 2 −CO−NH−)、2.59ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、2.68ppm(t、2H、NH2−CH 2 −CH2−CH2−(O−CH2−CH2)n−)、2.98ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.48ppm(m、約3,800H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−)、4.09ppm(s、6H)、7.24ppm(m、10H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.12ppm(broad、2H)、8.32ppm(broad、3H)、9.04ppm(broad、3H)
[実施例3−4]
化合物(p12)の合成
化合物(p12)の合成
実施例3−3で得られた化合物(p11)(1.5g)をアセトニトリル(1.2g)及びトルエン(7.8g)に溶解した。その後、N−メチルモルホリン(19mg)と3−マレイミドプロピオン酸 N−スクシンイミジル(21mg)を添加し、室温にて窒素雰囲気下及び遮光下で3時間反応させた。反応終了後、反応液をBHT(10mg)含有の酢酸エチル(50g)で希釈した後、ヘキサン(30g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(4mg)含有のヘキサン(20g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p12)を得た。収量1.3g。マレイミド化率は92%(1H−NMR)であった。
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、3H、−NH−CO−CH2−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、3H、−NH−CO−CH2−CH2−CH(CH 3 )2)、1.48ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、8H)、2.05ppm(m、4H、−NH−CO−CH 2 −CH 2 −CH2−CO−NH−)、2.30ppm(t、2H、−NH−CO−CH2−CH2−CH 2 −CO−NH−)、2.59ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、2.68ppm(t、2H、C4NO2H2−CH2−CH2−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−)、2.98ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.48ppm(m、約3,800H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−)、4.09ppm(s、6H)、6.68ppm(s、2H、−NH−CO−CH2−CH2−C 4 NO 2 H 2 )、7.24ppm(m、10H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.12ppm(broad、3H)、8.32ppm(broad、3H)、9.04ppm(broad、3H)
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、3H、−NH−CO−CH2−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、3H、−NH−CO−CH2−CH2−CH(CH 3 )2)、1.48ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、8H)、2.05ppm(m、4H、−NH−CO−CH 2 −CH 2 −CH2−CO−NH−)、2.30ppm(t、2H、−NH−CO−CH2−CH2−CH 2 −CO−NH−)、2.59ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、2.68ppm(t、2H、C4NO2H2−CH2−CH2−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−)、2.98ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.48ppm(m、約3,800H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−)、4.09ppm(s、6H)、6.68ppm(s、2H、−NH−CO−CH2−CH2−C 4 NO 2 H 2 )、7.24ppm(m、10H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.12ppm(broad、3H)、8.32ppm(broad、3H)、9.04ppm(broad、3H)
[実施例3−5]
化合物(p13)の合成
化合物(p13)の合成
実施例3−4で得られた化合物(p12)(800mg)をジクロロメタン(5.6g)に溶解し、その後、炭酸ジ(N−スクシンイミジル)(20mg)とピリジン(8mg)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で8時間反応させた。反応終了後、5%食塩水(5g)で反応液を洗浄し、硫酸マグネシウム(100mg)を加えて、25℃で30分撹拌した後、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を濃縮後、濃縮物にトルエン(100g)を添加して溶解した後、ヘキサン(50g)を加えて室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(10mg)含有のヘキサン(50g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p13)を得た。収量653mg。スクシンイミジルカーボネート化率は93%(1H−NMR)であった。
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、3H、−NH−CO−CH2−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、3H、−NH−CO−CH2−CH2−CH(CH 3 )2)、1.48ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、8H)、2.05ppm(m、4H、−NH−CO−CH 2 −CH 2 −CH2−CO−NH−)、2.30ppm(t、2H、−NH−CO−CH2−CH2−CH 2 −CO−NH−)、2.59ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、2.68ppm(t、2H、C4NO2H2−CH2−CH2−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−)、2.83ppm(s、4H、−CO−CH 2 −CH 2 −CO−)、2.98ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.48ppm(m、約3,800H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−)、4.09ppm(s、6H)、6.68ppm(s、2H、−NH−CO−CH2−CH2−C 4 NO 2 H 2 )、7.24ppm(m、10H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.12ppm(broad、3H)、8.32ppm(broad、3H)、9.04ppm(broad、3H)
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、3H、−NH−CO−CH2−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、3H、−NH−CO−CH2−CH2−CH(CH 3 )2)、1.48ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、8H)、2.05ppm(m、4H、−NH−CO−CH 2 −CH 2 −CH2−CO−NH−)、2.30ppm(t、2H、−NH−CO−CH2−CH2−CH 2 −CO−NH−)、2.59ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、2.68ppm(t、2H、C4NO2H2−CH2−CH2−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−)、2.83ppm(s、4H、−CO−CH 2 −CH 2 −CO−)、2.98ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.48ppm(m、約3,800H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−)、4.09ppm(s、6H)、6.68ppm(s、2H、−NH−CO−CH2−CH2−C 4 NO 2 H 2 )、7.24ppm(m、10H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.12ppm(broad、3H)、8.32ppm(broad、3H)、9.04ppm(broad、3H)
[実施例4]
化合物(p17)の合成
化合物(p17)の合成
[実施例4−1]
化合物(p14)の合成
化合物(p14)の合成
実施例1−1と同製法にて、N末端を9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc基)で保護したL−フェニルアラニル−グリシン(Fmoc−Phe−Gly)(400mg)と平均分子量=10,000、日油株式会社製「SUNBRIGHT HO−100PA」(7.5g)を原料として用いて、上記化合物(p14)を得た。収量6.5g。HPLC:アミン純度は98%であった。
1H−NMR(d6−DMSO):1.73ppm(m、2H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−(O−CH2−CH2)n−OH)、2.59ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、2.98ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.10ppm(q、2H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−(O−CH2−CH2)n−OH)、3.48ppm(m、約950H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−OH)、7.24ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.73ppm(t、1H)、8.12ppm(broad、1H)
1H−NMR(d6−DMSO):1.73ppm(m、2H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−(O−CH2−CH2)n−OH)、2.59ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、2.98ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.10ppm(q、2H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−(O−CH2−CH2)n−OH)、3.48ppm(m、約950H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−OH)、7.24ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.73ppm(t、1H)、8.12ppm(broad、1H)
[実施例4−2]
化合物(p15)の合成
化合物(p15)の合成
N末端を9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc基)で保護したL−グルタミン酸(Fmoc−Glu−OH)(93mg)と実施例4−1で得られた化合物(p14)(5.5g)にアセトニトリル(24g)を添加し、30℃で加温溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン(86mg)とDMT−MM(232mg)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で1時間反応させた。その後、ピペリジン(1.1g)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で2時間反応させた。反応終了後、反応液をトルエン(150g)で希釈した後、ヘキサン(80g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度トルエン(150g)に溶解し、ヘキサン(80g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(10mg)を含有したヘキサン(50g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p15)を得た。収量4.6g。HPLC:アミン純度は92%であった。
1H−NMR(d6−DMSO):1.54ppm(m、2H、−NH−CO−CH(NH2)−CH 2 −CH2−)、1.62ppm(m、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−)、1.97ppm(m、2H、−NH−CO−CH(NH2)−CH2−CH 2 −)、2.74ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、2.81ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、3.11ppm(m、11H)、3.64ppm(m、約1,900H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−OH)、4.49ppm(m、4H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、4.57ppm(m、2H、−CO−NH−CH−CH2−C6H5)、7.25ppm(m、10H、−CO−NH−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.74ppm(m、2H)、8.44ppm(m、2H)、8.61ppm(m、2H)
1H−NMR(d6−DMSO):1.54ppm(m、2H、−NH−CO−CH(NH2)−CH 2 −CH2−)、1.62ppm(m、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−)、1.97ppm(m、2H、−NH−CO−CH(NH2)−CH2−CH 2 −)、2.74ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、2.81ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、3.11ppm(m、11H)、3.64ppm(m、約1,900H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−OH)、4.49ppm(m、4H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、4.57ppm(m、2H、−CO−NH−CH−CH2−C6H5)、7.25ppm(m、10H、−CO−NH−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.74ppm(m、2H)、8.44ppm(m、2H)、8.61ppm(m、2H)
[実施例4−3]
化合物(p16)の合成
化合物(p16)の合成
実施例4−2で得られた化合物(p15)(1.0g)、グルタル酸(3.3mg)をアセトニトリル(8.0g)に溶解し、その後、ジイソプロピルエチルアミン(8.4mg)とDMT−MM(22.6mg)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で3時間反応させた。反応終了後、反応液をトルエン(100g)で希釈した後、ヘキサン(60g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度、トルエン(100g)に溶解し、ヘキサン(50g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(10mg)を含有したヘキサン(50g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p16)を得た。収量683mg。
1H−NMR(d6−DMSO):1.54ppm(m、4H、−NH−CO−CH(NH)−CH 2 −CH2−)、1.62ppm(m、8H)、1.97ppm(m、4H、−NH−CO−CH(NH)−CH2−CH 2 −)、2.05ppm(m、4H、−NH−CO−CH 2 −CH 2 −CH2−CO−NH−)、2.30ppm(t、2H、−NH−CO−CH2−CH2−CH 2 −CO−NH−)、2.74ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、2.81ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、3.11ppm(m、22H)、3.64ppm(m、約3,800H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−OH)、4.49ppm(m、8H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、4.57ppm(m、4H、−CO−NH−CH−CH2−C6H5)、7.25ppm(m、20H、−CO−NH−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.74ppm(m、4H)、8.44ppm(m、4H)、8.61ppm(m、4H)
1H−NMR(d6−DMSO):1.54ppm(m、4H、−NH−CO−CH(NH)−CH 2 −CH2−)、1.62ppm(m、8H)、1.97ppm(m、4H、−NH−CO−CH(NH)−CH2−CH 2 −)、2.05ppm(m、4H、−NH−CO−CH 2 −CH 2 −CH2−CO−NH−)、2.30ppm(t、2H、−NH−CO−CH2−CH2−CH 2 −CO−NH−)、2.74ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、2.81ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、3.11ppm(m、22H)、3.64ppm(m、約3,800H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−OH)、4.49ppm(m、8H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、4.57ppm(m、4H、−CO−NH−CH−CH2−C6H5)、7.25ppm(m、20H、−CO−NH−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.74ppm(m、4H)、8.44ppm(m、4H)、8.61ppm(m、4H)
[実施例4−4]
化合物(p17)の合成
化合物(p17)の合成
実施例4−3で得られた化合物(p16)(500mg)をトルエン(10g)に30℃で加温溶解し、減圧にて共沸脱水した。その後、濃縮物をクロロホルム(3.0g)に溶解し、N−ヒドロキシフタルイミド(7.2mg)とトリフェニルホスフィン(36mg)とアゾジカルボン酸ジイソプロピル(24mg)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で4時間反応させた。反応終了後、反応液にメタノール(10mg)を添加し25℃で30分撹拌した後、エチレンジアミン一水和物(20mg)を添加し、40℃にて窒素雰囲気下で1時間反応させた。反応終了後、反応液をトルエン(50g)で希釈した後、ヘキサン(30g)を加えて室温にて30分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(4mg)を含有したヘキサン(20g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p17)を得た。収量263mg。HPLC:オキシアミン純度は90%であった。
1H−NMR(d6−DMSO):1.54ppm(m、4H、−NH−CO−CH(NH)−CH 2 −CH2−)、1.62ppm(m、8H)、1.97ppm(m、4H、−NH−CO−CH(NH)−CH2−CH 2 −)、2.05ppm(m、4H、−NH−CO−CH 2 −CH 2 −CH2−CO−NH−)、2.30ppm(t、2H、−NH−CO−CH2−CH2−CH 2 −CO−NH−)、2.74ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、2.81ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、3.11ppm(m、22H)、3.64ppm(m、約3,800H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−ONH2)、4.49ppm(m、8H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、4.57ppm(m、4H、−CO−NH−CH−CH2−C6H5)、7.25ppm(m、20H、−CO−NH−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.74ppm(m、4H)、8.44ppm(m、4H)、8.61ppm(m、4H)
1H−NMR(d6−DMSO):1.54ppm(m、4H、−NH−CO−CH(NH)−CH 2 −CH2−)、1.62ppm(m、8H)、1.97ppm(m、4H、−NH−CO−CH(NH)−CH2−CH 2 −)、2.05ppm(m、4H、−NH−CO−CH 2 −CH 2 −CH2−CO−NH−)、2.30ppm(t、2H、−NH−CO−CH2−CH2−CH 2 −CO−NH−)、2.74ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、2.81ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、3.11ppm(m、22H)、3.64ppm(m、約3,800H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−ONH2)、4.49ppm(m、8H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、4.57ppm(m、4H、−CO−NH−CH−CH2−C6H5)、7.25ppm(m、20H、−CO−NH−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.74ppm(m、4H)、8.44ppm(m、4H)、8.61ppm(m、4H)
[実施例5]
化合物(p23)の合成
化合物(p23)の合成
[実施例5−1]
化合物(p18)の合成
化合物(p18)の合成
N末端を9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc基)で保護したL−グルタミン酸(Fmoc−Glu−OH)(18mg)と実施例2−2で得られた化合物(p5)(4.0g)にアセトニトリル(16g)を添加し、30℃で加温溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン(17mg)とDMT−MM(36mg)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で1時間反応させた。その後、ピペリジン(212mg)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で2時間反応させた。反応終了後、反応液をトルエン(150g)で希釈した後、ヘキサン(90g)を加えて、室温にて30分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(40mg)を含有したトルエン(200g)に溶解し、ヘキサン(100g)を加えて、室温にて30分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(30mg)を含有したヘキサン(150g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p18)を得た。収量2.7g。HPLC:アミン純度は91%であった。
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、18H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.48ppm(m、2H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、12H)、2.05ppm(m、4H)、3.18ppm(t、4H、−CH2−CH2−CH 2 −NH−CO−O−C(CH3)3)、3.64ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−)、4.09ppm(s、8H)、4.44ppm(m、2H)、4.92ppm(m、2H)、6.76ppm(broad、2H)、7.25ppm(m、20H、−CO−NH−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.01ppm(broad、2H)、8.32ppm(broad、4H)、8.70ppm(broad、2H)、9.04ppm(broad、4H)
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、18H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.48ppm(m、2H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、12H)、2.05ppm(m、4H)、3.18ppm(t、4H、−CH2−CH2−CH 2 −NH−CO−O−C(CH3)3)、3.64ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−)、4.09ppm(s、8H)、4.44ppm(m、2H)、4.92ppm(m、2H)、6.76ppm(broad、2H)、7.25ppm(m、20H、−CO−NH−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.01ppm(broad、2H)、8.32ppm(broad、4H)、8.70ppm(broad、2H)、9.04ppm(broad、4H)
[実施例5−2]
化合物(p19)の合成
化合物(p19)の合成
実施例4−2と同製法にて、N末端を9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc基)で保護したL−グルタミン酸(Fmoc−Glu−OH)(18mg)と実施例1−1で得られた化合物(p1)(4.0g)を原料として用いて、上記化合物(p19)を得た。収量3.2g。HPLC:アミン純度は90%であった。
1H−NMR(d6−DMSO):1.54ppm(m、2H、−NH−CO−CH(NH2)−CH 2 −CH2−)、1.62ppm(m、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−)、1.97ppm(m、2H、−NH−CO−CH(NH2)−CH2−CH 2 −)、2.74ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、2.81ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、3.11ppm(m、11H)、3.64ppm(m、約1,900H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−OH)、4.49ppm(m、4H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、4.57ppm(m、2H、−CO−NH−CH−CH2−C6H5)、7.25ppm(m、10H、−CO−NH−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.74ppm(m、2H)、8.44ppm(m、2H)、8.61ppm(m、2H)
1H−NMR(d6−DMSO):1.54ppm(m、2H、−NH−CO−CH(NH2)−CH 2 −CH2−)、1.62ppm(m、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−)、1.97ppm(m、2H、−NH−CO−CH(NH2)−CH2−CH 2 −)、2.74ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、2.81ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、3.11ppm(m、11H)、3.64ppm(m、約1,900H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−OH)、4.49ppm(m、4H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、4.57ppm(m、2H、−CO−NH−CH−CH2−C6H5)、7.25ppm(m、10H、−CO−NH−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.74ppm(m、2H)、8.44ppm(m、2H)、8.61ppm(m、2H)
[実施例5−3]
化合物(p20)の合成
化合物(p20)の合成
実施例5−2で得られた化合物(p19)(3.0g)、酢酸ナトリウム(60mg)、無水グルタル酸(86mg)をトルエン(10g)に溶解し、窒素雰囲気下で40℃にて6時間反応させた。反応終了後、トルエン(150g)で希釈し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、得られたろ液にヘキサン(100g)を添加して室温にて30分攪拌し、生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した。得られた析出物をトルエン(200g)に溶解し、ヘキサン(100g)を添加して室温にて15分攪拌し、生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収し、BHT(30mg)を含有したヘキサン(150g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p20)を得た。収量2.3g。
1H−NMR(d6−DMSO):1.62ppm(m、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−(O−CH2−CH2)n−OH)、1.97ppm(m、2H、−NH−CO−CH(NH2)−CH2−CH 2 −)、2.02ppm(m、8H)、2.30ppm(t、2H、−CH2−CH2−CH 2 −COOH)、2.74ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、2.81ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、3.64ppm(m、約3,800H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−OH)、4.57ppm(m、2H、−CO−NH−CH−CH2−C6H5)、7.25ppm(m、10H、−CO−NH−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.74ppm(m、2H)、8.44ppm(m、3H)、8.61ppm(m、2H)
1H−NMR(d6−DMSO):1.62ppm(m、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−(O−CH2−CH2)n−OH)、1.97ppm(m、2H、−NH−CO−CH(NH2)−CH2−CH 2 −)、2.02ppm(m、8H)、2.30ppm(t、2H、−CH2−CH2−CH 2 −COOH)、2.74ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、2.81ppm(dd、2H、−CO−NH−CH−CH 2 −C6H5)、3.64ppm(m、約3,800H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−OH)、4.57ppm(m、2H、−CO−NH−CH−CH2−C6H5)、7.25ppm(m、10H、−CO−NH−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.74ppm(m、2H)、8.44ppm(m、3H)、8.61ppm(m、2H)
[実施例5−4]
化合物(p21)の合成
化合物(p21)の合成
実施例5−1で得られた化合物(p18)(1.8g)と実施例5−3で得られた化合物(p20)(1.8g)をアセトニトリルに溶解し、その後、ジイソプロピルエチルアミン(14mg)とDMT−MM(373mg)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で3時間反応させた。反応終了後、反応液をトルエン(200g)で希釈した後、ヘキサン(100g)を加えて、室温にて30分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(40mg)を含有したトルエン(200g)に溶解し、ヘキサン(100g)を加えて、室温にて30分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(20mg)を含有したヘキサン(100g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p21)を得た。収量2.4g。
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、18H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.48ppm(m、2H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、16H)、2.05ppm(m、14H)、3.64ppm(m、約7,600H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−)、4.09ppm(s、12H)、4.44ppm(m、4H)、4.57ppm(m、4H、−CO−NH−CH−CH2−C6H5)、6.76ppm(broad、2H)、7.25ppm(m、20H、−CO−NH−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.01ppm(broad、4H)、8.32ppm(broad、8H)、9.04ppm(broad、6H)
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、18H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.48ppm(m、2H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、16H)、2.05ppm(m、14H)、3.64ppm(m、約7,600H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−(O−CH 2 −CH 2 )n−)、4.09ppm(s、12H)、4.44ppm(m、4H)、4.57ppm(m、4H、−CO−NH−CH−CH2−C6H5)、6.76ppm(broad、2H)、7.25ppm(m、20H、−CO−NH−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.01ppm(broad、4H)、8.32ppm(broad、8H)、9.04ppm(broad、6H)
[実施例5−5]
化合物(p22)の合成
化合物(p22)の合成
実施例5−4で得られた化合物(p20)(2.0g)をアセトニトリル(20g)に溶解し、p−ニトロフェニルクロロホルメート(20mg)、N−フェニルモルホリン(20mg)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で3時間反応させた。その後、イオン交換水(7mg)、N−フェニルモルホリン(41mg)を添加し、攪拌した後、3−アミノプロパン酸水溶液(36mg)、10N水酸化ナトリウム水溶液(2.5mL)を添加して室温にて3時間反応させた。反応終了後、トルエン(100g)を添加した後、濃縮して共沸脱水した。その後、濃縮液をトルエン(30g)で希釈し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、ろ液にヘキサン(30g)を添加して室温にて30分攪拌して生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(10mg)を含有したトルエン(50g)に再溶解し、ヘキサン(30g)を添加して室温にて30分攪拌した。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(6mg)を含有したヘキサン(30g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p22)を得た。収量1.3g。
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、18H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.48ppm(m、2H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、16H)、2.05ppm(m、14H)、2.49ppm(t、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −COOH)3.64ppm(m、約7,600H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−)、4.09ppm(s、12H)、4.44ppm(m、4H)、4.57ppm(m、4H、−CO−NH−CH−CH2−C6H5)、6.76ppm(broad、2H)、7.25ppm(m、20H、−CO−NH−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.01ppm(broad、4H)、8.32ppm(broad、8H)、9.04ppm(broad、6H)
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、18H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.48ppm(m、2H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、16H)、2.05ppm(m、14H)、2.49ppm(t、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −COOH)3.64ppm(m、約7,600H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−)、4.09ppm(s、12H)、4.44ppm(m、4H)、4.57ppm(m、4H、−CO−NH−CH−CH2−C6H5)、6.76ppm(broad、2H)、7.25ppm(m、20H、−CO−NH−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.01ppm(broad、4H)、8.32ppm(broad、8H)、9.04ppm(broad、6H)
[実施例5−6]
化合物(p23)の合成
化合物(p23)の合成
実施例5−5で得られた化合物(p22)(1.0g)をイオン交換水(4.5g)に溶解し、6N塩酸(0.46g)を添加して、室温にて窒素雰囲気下で3時間反応させた。反応終了後、1N水酸化ナトリウム水溶液を添加し、pH6.5に調整した後、塩化ナトリウム(1.0g)を添加し溶解した。得られた溶液に1N水酸化ナトリウム水溶液を添加し、pHを7.10に調整した後、BHT(6mg)含有のクロロホルム(30g)を添加して室温にて20分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。有機層と水層を分離し、有機層を回収した後、水層に再度BHT(6mg)含有のクロロホルム(30g)を添加して、室温で20分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出1回目と2回目で得られた有機層を合わせて40℃で濃縮し、得られた濃縮物をトルエン(100g)に溶解し、ヘキサン(50g)を加えて室温にて15分攪拌して生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、BHT(10mg)を含有したヘキサン(50g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p23)を得た。収量532mg。HPLC:アミン純度は84%であった。
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.48ppm(m、2H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、16H)、2.05ppm(m、14H)、2.49ppm(t、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −COOH)、2.68ppm(t、4H、−CH2−CH2−CH 2 −NH2)、3.64ppm(m、約7,600H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−)、4.09ppm(s、12H)、4.44ppm(m、4H)、4.57ppm(m、4H、−CO−NH−CH−CH2−C6H5)、6.76ppm(broad、2H)、7.25ppm(m、20H、−CO−NH−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.01ppm(broad、4H)、8.32ppm(broad、8H)、9.04ppm(broad、6H)
1H−NMR(d6−DMSO):0.89ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.48ppm(m、2H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.73ppm(m、16H)、2.05ppm(m、14H)、2.49ppm(t、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −COOH)、2.68ppm(t、4H、−CH2−CH2−CH 2 −NH2)、3.64ppm(m、約7,600H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−)、4.09ppm(s、12H)、4.44ppm(m、4H)、4.57ppm(m、4H、−CO−NH−CH−CH2−C6H5)、6.76ppm(broad、2H)、7.25ppm(m、20H、−CO−NH−CH−CH2−C 6 H 5 )、8.01ppm(broad、4H)、8.32ppm(broad、8H)、9.04ppm(broad、6H)
[実施例6]
血清中での安定性試験
1.5mLのエッペンドルフチューブに、マウスまたはヒト血清1mLを加え、各種ポリエチレングリコール誘導体を5.0mg/mLの濃度になるように添加した。37℃で96時間インキュベ−ション後、200μLをサンプリングし、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、血清中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸などの疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、血清中からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。その後、GPC分析を行い、分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
分解率は以下の式にて算出した。
分解率 = (試験前のメインフラクションのピーク面積% − 試験後のメインフラクションのピーク面積%) ÷ (試験前メインフラクションのピーク面積%) × 100
結果を以下の表2に示す。
血清中での安定性試験
1.5mLのエッペンドルフチューブに、マウスまたはヒト血清1mLを加え、各種ポリエチレングリコール誘導体を5.0mg/mLの濃度になるように添加した。37℃で96時間インキュベ−ション後、200μLをサンプリングし、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、血清中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸などの疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、血清中からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。その後、GPC分析を行い、分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
分解率は以下の式にて算出した。
分解率 = (試験前のメインフラクションのピーク面積% − 試験後のメインフラクションのピーク面積%) ÷ (試験前メインフラクションのピーク面積%) × 100
結果を以下の表2に示す。
表2によれば、分解性ポリエチレングリコール誘導体である化合物(p2)、(p16)は、非分解性のポリエチレングリコール誘導体であるメトキシPEG40kDaと同様に、血清中において分解はみられなかった。つまり、当該分解性ポリエチレングリコール誘導体が血中では安定であることが示された。
[実施例7]
細胞を用いた分解性試験
培地RPMI−1640(10%FBS Pn/St)10mLを用いて、100mmディッシュにRAW264.7を10×106cell播種し、37℃で24時間培養後、各種ポリエチレングリコール誘導体を10mg/mLの濃度になるよう溶解した培地に交換し、37℃で96時間培養した。培養後、細胞を1%SDS溶液にて溶解し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)にて希釈し、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、細胞溶解液中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸などの疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、細胞内からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
また、細胞培養に使用した培地中での分解を確認するため、各種ポリエチレングリコール誘導体を10mg/mLの濃度になるよう溶解した培地のみで37℃で96時間培養し、上記と同操作にてポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
その後、回収した各種ポリエチレングリコール誘導体のGPC分析を行い、実施例7と同じ計算式にて分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
結果を以下の表3に示す。
細胞を用いた分解性試験
培地RPMI−1640(10%FBS Pn/St)10mLを用いて、100mmディッシュにRAW264.7を10×106cell播種し、37℃で24時間培養後、各種ポリエチレングリコール誘導体を10mg/mLの濃度になるよう溶解した培地に交換し、37℃で96時間培養した。培養後、細胞を1%SDS溶液にて溶解し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)にて希釈し、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、細胞溶解液中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸などの疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、細胞内からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
また、細胞培養に使用した培地中での分解を確認するため、各種ポリエチレングリコール誘導体を10mg/mLの濃度になるよう溶解した培地のみで37℃で96時間培養し、上記と同操作にてポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
その後、回収した各種ポリエチレングリコール誘導体のGPC分析を行い、実施例7と同じ計算式にて分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
結果を以下の表3に示す。
表3によれば、分解性ポリエチレングリコール誘導体である化合物(p2)及び(p16)は、細胞内にて効果的に分解し(分解率99%)、(p2)においては分子量4万から2万に、(p16)においては分子量4万から1万に分解することが確認できた。これら分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞培養で用いた培地では分解しないことから、細胞内で特異的に分解されたことが確認できた。一方で、非分解性のポリエチレングリコール誘導体であるメトキシPEG40kDaにおいては、いずれも細胞内での分解はみられなかった。
[実施例8]
サーモンカルシトニン(sCT)のPEG化
アミノ酸配列:
CSNLSTCVLG KLSQELHKLQ TYPRTNTGSG TP(配列番号:1)
であるサーモンカルシトニン(sCT)(0.5mg、1.5×10−7モル、株式会社ピーエイチジャパン製)に100mMほう酸ナトリウム緩衝液(pH9.0)を添加して、sCT濃度が2.0mg/mLに調整し、実施例1で得られた化合物(p3)(0.6mg、1.5×10−8モル)を加え、4℃にて24時間反応させた。その後、反応液を10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)を用いて透析し、HiTrap SP HP(5mL、GEヘルスケア製)を用いたイオン交換クロマトグラフィーにて精製することにより、PEG化sCTを得た。モル収率は39%であった。
サーモンカルシトニン(sCT)のPEG化
アミノ酸配列:
CSNLSTCVLG KLSQELHKLQ TYPRTNTGSG TP(配列番号:1)
であるサーモンカルシトニン(sCT)(0.5mg、1.5×10−7モル、株式会社ピーエイチジャパン製)に100mMほう酸ナトリウム緩衝液(pH9.0)を添加して、sCT濃度が2.0mg/mLに調整し、実施例1で得られた化合物(p3)(0.6mg、1.5×10−8モル)を加え、4℃にて24時間反応させた。その後、反応液を10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)を用いて透析し、HiTrap SP HP(5mL、GEヘルスケア製)を用いたイオン交換クロマトグラフィーにて精製することにより、PEG化sCTを得た。モル収率は39%であった。
RP−HPLC分析
装置:WATERS社製「ALLIANCE」
検出器:UV(280nm)
カラム:Inertsil WP300 C18(GLサイエンス)
移動相A:0.05%TFA−H2O
移動相B:0.05%TFA−ACN
グラジエント:B30%(0min)、B40%(5min)、B50%(15min)、B100%(16min)、B100%(20min)の順に変更
流速:1.0mL/min
カラム温度:40℃
上記RP−HPLC分析条件にて、PEG化sCTの純度を算出した。
PEG化sCTのRPLC純度:98%
装置:WATERS社製「ALLIANCE」
検出器:UV(280nm)
カラム:Inertsil WP300 C18(GLサイエンス)
移動相A:0.05%TFA−H2O
移動相B:0.05%TFA−ACN
グラジエント:B30%(0min)、B40%(5min)、B50%(15min)、B100%(16min)、B100%(20min)の順に変更
流速:1.0mL/min
カラム温度:40℃
上記RP−HPLC分析条件にて、PEG化sCTの純度を算出した。
PEG化sCTのRPLC純度:98%
MALDI−TOF−MS分析
装置:Bruker社製「autoflex3」
サンプル:0.5mg/mL、PBS溶液
マトリクス:α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)飽和溶液(0.01%TFA−H2O:ACN=2:1)
サンプル(1μL)とマトリクス(19μL)を混合し、1μLをターゲットにスポット
上記MALDI−TOF−MS分析条件にて、PEG化sCTの分子量を測定した。
PEG化sCTの分子量:48,585
マルチアーム型ポリエチレングリコール誘導体である化合物(p3)は2つの活性カーボネート基を有していることから、2分子のsCTを結合することができる。PEG化sCTの分子量は、原料である化合物(p3)の分子量に比べ、おおよそsCTの2分子の分子量の分だけ増加していることが確認できた。
装置:Bruker社製「autoflex3」
サンプル:0.5mg/mL、PBS溶液
マトリクス:α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)飽和溶液(0.01%TFA−H2O:ACN=2:1)
サンプル(1μL)とマトリクス(19μL)を混合し、1μLをターゲットにスポット
上記MALDI−TOF−MS分析条件にて、PEG化sCTの分子量を測定した。
PEG化sCTの分子量:48,585
マルチアーム型ポリエチレングリコール誘導体である化合物(p3)は2つの活性カーボネート基を有していることから、2分子のsCTを結合することができる。PEG化sCTの分子量は、原料である化合物(p3)の分子量に比べ、おおよそsCTの2分子の分子量の分だけ増加していることが確認できた。
SDS−PAGE分析
キット:Thermo Fisher Scientific社製 NuPAGE(登録商標) Bis−Tris Precast Gel(ゲル濃度4−12%)
染色液:クマシーブリリアントブルー溶液(CBB溶液)またはヨウ素染色溶液(BaCl2+I2溶液)
上記SDS−PAGEキットの推奨測定条件に従い、PEG化sCTの評価を行った。PEG化sCTにおいては、タンパク質やペプチドを選択的に染色させるCBB染色でバンドがみられ、さらに、ポリエチレングリコールを染色させるヨウ素染色においてもバンドが見られた。両方の染色でバンドがみられたことから、ポリエチレングリコール誘導体である化合物(p3)がsCTに結合していることを確認できた。
キット:Thermo Fisher Scientific社製 NuPAGE(登録商標) Bis−Tris Precast Gel(ゲル濃度4−12%)
染色液:クマシーブリリアントブルー溶液(CBB溶液)またはヨウ素染色溶液(BaCl2+I2溶液)
上記SDS−PAGEキットの推奨測定条件に従い、PEG化sCTの評価を行った。PEG化sCTにおいては、タンパク質やペプチドを選択的に染色させるCBB染色でバンドがみられ、さらに、ポリエチレングリコールを染色させるヨウ素染色においてもバンドが見られた。両方の染色でバンドがみられたことから、ポリエチレングリコール誘導体である化合物(p3)がsCTに結合していることを確認できた。
本発明の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞の空胞を引き起こさない高分子量のポリエチレングリコール誘導体であり、生体関連物質を修飾する用途に効果的に用いることができ、生体内の血中で安定であり、且つ細胞内で分解される。
Claims (15)
- W1及びW2のオリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである請求項1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
- W1及びW2のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである請求項1〜2のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
- W3及びW4のオリゴペプチドが、中性アミノ酸のみで構成され、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである請求項4記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
- W3及びW4のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである請求項4〜5のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
- Zの分解性オリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである請求項8記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
- Zの分解性オリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである請求項7〜9のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
- 総分子量が20,000以上である請求項1〜10のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
- X1及びX2が、それぞれ独立して、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、ビニルスルホニル基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシル基、チオール基、ジチオピリジル基、α−ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基及びアジド基よりなる群から選択される、請求項1〜11のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
- L11及びL12がそれぞれ独立して、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアゾリル基、マレイミドとメルカプトの結合、オキシム結合、またはこれらの結合及び基を含んでいてもよいアルキレン基である請求項13記載の生体関連物質。
- Dの生体関連物質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素である、請求項13〜14のいずれか1項記載の生体関連物質。
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