JP7205827B2 - 分解性ポリエチレングリコール誘導体 - Google Patents

分解性ポリエチレングリコール誘導体 Download PDF

Info

Publication number
JP7205827B2
JP7205827B2 JP2019068350A JP2019068350A JP7205827B2 JP 7205827 B2 JP7205827 B2 JP 7205827B2 JP 2019068350 A JP2019068350 A JP 2019068350A JP 2019068350 A JP2019068350 A JP 2019068350A JP 7205827 B2 JP7205827 B2 JP 7205827B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
ppm
polyethylene glycol
oligopeptide
glycol derivative
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2019068350A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2019173014A (ja
Inventor
宏樹 吉岡
昌樹 神谷
裕二 山本
翠 平居
明子 佐々木
伸宏 西山
誠 松井
宏泰 武元
和輝 宮内
貴大 野本
敬士郎 友田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NOF Corp
Tokyo Institute of Technology NUC
Original Assignee
NOF Corp
Tokyo Institute of Technology NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by NOF Corp, Tokyo Institute of Technology NUC filed Critical NOF Corp
Publication of JP2019173014A publication Critical patent/JP2019173014A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7205827B2 publication Critical patent/JP7205827B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08GMACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/3332Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing carboxamide group
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08GMACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/33396Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen having oxygen in addition to nitrogen
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08LCOMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L71/00Compositions of polyethers obtained by reactions forming an ether link in the main chain; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L71/02Polyalkylene oxides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08GMACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/321Polymers modified by chemical after-treatment with inorganic compounds
    • C08G65/325Polymers modified by chemical after-treatment with inorganic compounds containing nitrogen
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08GMACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08GMACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G2230/00Compositions for preparing biodegradable polymers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Polyethers (AREA)

Description

本発明は、生体関連物質を修飾する用途に使用される細胞内で分解する分解性ポリエチレングリコール誘導体に関する発明である。
ホルモンやサイトカイン、抗体、酵素などの生体関連物質を用いた医薬品は、通常生体内へ投与されると腎臓における糸球体濾過や肝臓や脾臓などにおけるマクロファージによる取り込みによって、生体内から速やかに排出されてしまう。そのため血中半減期が短く、十分な薬理効果を得ることが困難であることが多い。この問題を解決するため、生体関連物質を糖鎖やポリエチレングリコールなどの親水性高分子やアルブミンなどによって化学修飾する試みが行われている。その結果、分子量の増大や水和層の形成などにより生体関連物質の血中半減期を延長することが可能となる。また、ポリエチレングリコールで修飾することで、生体関連物質の毒性や抗原性の低下、難水溶性薬剤の溶解性向上などの効果が得られることも良く知られている。
ポリエチレングリコールで修飾された生体関連物質は、ポリエチレングリコールのエーテル結合と水分子との水素結合で形成される水和層で覆われ、分子サイズが大きくなることから、腎臓における糸球体濾過を回避することができる。さらにオプソニンや各組織を構成する細胞表面との相互作用が低下し、各組織への移行が減少することが知られている。ポリエチレングリコールは生体関連物質の血中半減期を延長させる優れた素材であり、その性能は分子量が大きいほど効果が高いことが分っている。これまで、分子量4万以上の高分子量のポリエチレングリコールで修飾した生体関連物質の研究が多数行なわれており、有意にその血中半減期を延長できる結果が得られている。
ポリエチレングリコールは生体関連物質の性能改善に用いられる修飾剤の中で至適基準とされており、現在ではポリエチレングリコール修飾製剤が複数上市され、医療現場で使用されている。一方で、2012年に欧州医薬品庁(EMA)から、分子量4万以上の高分子量のポリエチレングリコールで修飾した生体関連物質を一定の投与量以上で長期間動物に投与すると、一部の組織の細胞内に空胞が発生するとの現象が報告された(非特許文献1)。現時点において、空胞の発生自体が人体に悪影響を与えるとの報告はなく、また、先のEMAの報告において用いられた投与量は、医療現場において一般的に適用される投与量と比べて極めて高用量であること等を考慮すれば、現在製造販売されている分子量が4万以上のポリエチレングリコールで修飾された治療製剤の安全性は問題ないといえる。しかしながら、非常に特殊な疾患(例えば、小人症など)の治療においては、ポリエチレングリコール修飾製剤を高用量、且つ、長期間に患者へ投与する治療プロトコルが採用されることも想定され得る。従って、かかる特殊な状況においても適用可能な、細胞に空胞を発生させないポリエチレングリコール修飾製剤の開発には潜在的な需要があると予想される。
非特許文献2においては、通常のポリエチレングリコール修飾製剤の投与量に比べ、大過剰量のポリエチレングリコールを単独で動物に長期間投与したところ、分子量2万では空胞は見られず、分子量4万において空胞の発生が確認されている。空胞を抑制する手段の一つとして、ポリエチレングリコールの分子量を小さくすることが考えられるが、分子量を小さくすると生体関連物質の血中半減期を十分に改善することができないという問題が生じる。
高分子量のポリエチレングリコールを体内で低分子量のポリエチレングリコールに分解し、腎臓からの排出を促進する技術については報告例がある。
特許文献1には、生体内で切断されるスルフィド結合やペプチド結合部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。当該ポリエチレングリコール誘導体は、生体内で腎臓からの排出に適した分子量まで分解されるとの記載がある。しかし、具体的な分解に関するデータは全く示されておらず、腎臓からの排出が促進されたというデータもない。さらに細胞の空胞に関する記載はない。
特許文献2には、生体内の低pH環境下において加水分解可能なアセタール部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。当該ポリエチレングリコール誘導体は、生体内で腎臓からの排出に適した分子量まで分解されるとの記載がある。しかし、具体的に腎臓からの排出が促進されたというデータは無く、さらに細胞の空胞に関する記載もない。また、これら加水分解が可能なアセタール部位は血中でも徐々に分解することが知られており、修飾した生体関連物質の血中半減期を十分に改善することができないと予想される。
一方で、薬物を効果的にリリースするために分解性のオリゴペプチドを導入したポリエチレングリコール誘導体や体内で分解するハイドロゲルなどの報告例はある。
非特許文献3には、酵素によって分解するオリゴペプチド部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。ここではオリゴペプチドは抗癌剤とポリエチレングリコールの間のリンカーとして導入されており、腫瘍周辺に特異的に発現している酵素によってオリゴペプチドが分解し、効率よく抗癌剤をリリースすることが報告されている。目的は抗癌剤のリリースであり、細胞の空胞を抑制する目的でポリエチレングリコールに分解性を付与するものではない。
非特許文献4には、酵素によって分解するオリゴペプチド部位を有した架橋分子と多分岐型のポリエチレングリコール誘導体を用いたハイドロゲルに関する記載がなされている。ここではオリゴペプチドは多分岐型のポリエチレングリコール誘導体を繋ぎ合わせる架橋分子として用いられ、さらに酵素による分解性をハイドロゲルに付与することができる。目的は分解性のハイドロゲルの調製であり、細胞の空胞を抑制する目的でポリエチレングリコールに分解性を付与するものではない。
特許文献3には、オリゴペプチドを骨格とした分岐型のポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。ここではオリゴペプチドはポリエチレングリコール誘導体の基本骨格として用いられており、酵素による分解性を付与するものではない。また、オリゴペプチドにリジンやアスパラギン酸など、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を有したアミノ酸を含むことが特徴であり、それらを反応に利用した分岐型のポリエチレングリコール誘導体を合成することが目的である。細胞の空胞を抑制する目的のポリエチレングリコール誘導体ではない。
以上のように、血中では安定で、修飾した生体関連物質の血中半減期を十分に改善し、細胞に取り込まれた際に細胞内で特異的に分解し、細胞の空胞の発生を抑制することができる高分子量のポリエチレングリコール誘導体が求められている。
特表2009-527581号公報 WO2005/108463 WO2006/088248
EMA/CHMP/SWP/647258/2012 Daniel G. Rudmann, et al.,Toxicol. Pathol., 41, 970-983(2013) Francesco M Veronese, et al., Bioconjugate Chem., 16, 775-784(2005) Jiyuan Yang, et al., Marcomol. Biosci., 10(4), 445-454(2010)
本発明の課題は、細胞の空胞を引き起こさない高分子量のポリエチレングリコール誘導体を提供することにある。より具体的には、生体関連物質を修飾する用途に効果的に用いることができ、生体内の血中で安定であり、且つ細胞内で分解される分解性ポリエチレングリコール誘導体を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、細胞内にて分解するオリゴペプチドを有した分解性ポリエチレングリコール誘導体を発明した。
即ち、本発明は以下に示すとおりである。
[1]下式(1):
Figure 0007205827000001
(式中、mは1~7であり、n1及びn2はそれぞれ独立して45~682であり、pは1~4であり、Rは炭素数1~4のアルキル基であり、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2~8残基のオリゴペプチドであり、Qは2~5個の活性水素を持つ化合物の残基であり、Xは生体関連物質と反応可能な官能基であり、L、L、L、L及びLはそれぞれ独立して、単結合または2価のスペーサーである。)
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[2]Qが、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基である[1]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[3]Qが、オリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドが、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか1つを含み、かつそれ以外のアミノ酸がシステインを除く中性アミノ酸からなる4~8残基のオリゴペプチドである[1]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[4]Qのオリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである[3]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[5]Qのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[3]または[4]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[6]Zのオリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである[1]~[5]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[7]Zのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[1]~[6]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[8]総分子量が30,000以上である[1]~[7]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[9]L、L、L、L及びLがそれぞれ独立して、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、2級アミノ基、ウレア結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である[1]~[8]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[10]Xが活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、ビニルスルホン基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシル基、チオール基、ジチオピリジル基、α-ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基およびアジド基よりなる群から選択される、[1]~[9]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[11]式(1)中のZが、Z、Aおよびグリシン残基で構成される、下式(2):
Figure 0007205827000002
(式中、mは1~7であり、n1及びn2はそれぞれ独立して45~682であり、pは1~4であり、Rは炭素数1~4のアルキル基であり、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2~6残基のオリゴペプチドであり、Aはシステインを除く中性アミノ酸であり、a及びbはそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり、Qは2~5個の活性水素を持つ化合物の残基であり、Xは生体関連物質と反応可能な官能基であり、L、L、L、L及びLはそれぞれ独立して、単結合または2価のスペーサーである。)
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、[1]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[12]Qが、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基である[11]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[13]Qが、オリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドが、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか1つを含み、かつそれ以外のアミノ酸がシステインを除く中性アミノ酸からなる4~8残基のオリゴペプチドである[11]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[14]Qのオリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである[13]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[15]Qのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[13]または[14]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[16]Zのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[11]~[15]のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[17]Aの中性アミノ酸が、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸である[11]~[16]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[18]総分子量が30,000以上である[11]~[17]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[19]L、L、L、L及びLがそれぞれ独立して、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、2級アミノ基、ウレア結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である[11]~[18]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[20]Xが活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、ビニルスルホン基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシル基、チオール基、ジチオピリジル基、α-ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基およびアジド基よりなる群から選択される、[11]~[19]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[21]式(2)中のmが1である、下式(3):
Figure 0007205827000003
(式中、n3及びn4はそれぞれ独立して45~682であり、pは1~4であり、Rは炭素数1~4のアルキル基であり、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2~6残基のオリゴペプチドであり、Aはシステインを除く中性アミノ酸であり、a及びbはそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり、Qは2~5個の活性水素を持つ化合物の残基であり、Xは生体関連物質と反応可能な官能基であり、L、L、L、L及びLはそれぞれ独立して、単結合または2価のスペーサーである。)
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、[11]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[22]Qが、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基である[21]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[23]Qが、オリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドが、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか1つを含み、かつそれ以外のアミノ酸がシステインを除く中性アミノ酸からなる4~8残基のオリゴペプチドである[21]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[24]Qのオリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである[23]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[25]Qのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[23]または[24]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[26]Zのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[21]~[25]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[27]Aの中性アミノ酸が、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸である[21]~[26]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[28]総分子量が30,000以上である[21]~[27]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[29]L、L、L、L及びLがそれぞれ独立して、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、2級アミノ基、ウレア結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である[21]~[28]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[30]Xが活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、ビニルスルホン基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシル基、チオール基、ジチオピリジル基、α-ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基およびアジド基よりなる群から選択される、[21]~[29]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[31]式(1)中のQがエチレングリコールの残基であり、LがCHCHOであり、かつpが1である、下式(4):
Figure 0007205827000004
(式中、mは1~7であり、n5及びn6はそれぞれ独立して113~682であり、Rは炭素数1~4のアルキル基であり、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2~8残基のオリゴペプチドであり、Xは生体関連物質と反応可能な官能基であり、L、L、L及びLはそれぞれ独立して、単結合または2価のスペーサーである。)
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、[1]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[32]Zのオリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである[31]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[33]Zのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[31]または[32]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[34]総分子量が30,000以上である[31]~[33]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[35]L、L、L及びLがそれぞれ独立して、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、2級アミノ基、ウレア結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である[31]~[34]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[36]Xが活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、ビニルスルホン基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシル基、チオール基、ジチオピリジル基、α-ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基およびアジド基よりなる群から選択される、[31]~[35]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[37]式(2)中のQがエチレングリコールの残基であり、LがCHCHOであり、かつpが1である、下式(5):
Figure 0007205827000005
(式中、mは1~7であり、n5及びn6はそれぞれ独立して113~682であり、Rは炭素数1~4のアルキル基であり、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2~6残基のオリゴペプチドであり、Aはシステインを除く中性アミノ酸であり、a及びbはそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり、Xは生体関連物質と反応可能な官能基であり、L、L、L及びLはそれぞれ独立して、単結合または2価のスペーサーである。)
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、[11]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[38]Zのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[37]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[39]Aの中性アミノ酸が、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸である[37]または[38]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[40]総分子量が30,000以上である[37]~[39]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[41]L、L、L及びLがそれぞれ独立して、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、2級アミノ基、ウレア結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である[37]~[40]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[42]Xが活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、ビニルスルホン基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシル基、チオール基、ジチオピリジル基、α-ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基およびアジド基よりなる群から選択される、[37]~[41]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[43]式(3)中のQがエチレングリコールの残基であり、LがCHCHOであり、かつpが1である、下式(6):
Figure 0007205827000006
(式中、n7及びn8はそれぞれ独立して226~682であり、Rは炭素数1~4のアルキル基であり、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2~6残基のオリゴペプチドであり、Aはシステインを除く中性アミノ酸であり、a及びbはそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり、Xは生体関連物質と反応可能な官能基であり、L、L、L及びLはそれぞれ独立して、単結合または2価のスペーサーである。)
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、[21]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[44]Zのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[43]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[45]Aの中性アミノ酸が、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸である[43]または[44]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[46]総分子量が30,000以上である[43]~[45]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[47]L、L、L及びLがそれぞれ独立して、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、2級アミノ基、ウレア結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である[43]~[46]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
[48]Xが活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、ビニルスルホン基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシル基、チオール基、ジチオピリジル基、α-ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基およびアジド基よりなる群から選択される、[43]~[47]のいずれか1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
本発明の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、生体内の血中では安定であり、細胞内の酵素によって分解するオリゴペプチドをポリエチレングリコール鎖の間に有している。そのため、当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、血中では安定であり、従来の分解性を有さないポリエチレングリコール誘導体と同等の血中半減期を生体関連物質に付与することができる。さらに、当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞内に取り込まれた場合、オリゴペプチド部位が速やかに分解されるため、これまで課題とされていた細胞の空胞の発生を抑制することができる。また、ポリエチレングリコールに導入するオリゴペプチドを、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドなどに限定することで、製造工程中で発生する不純物を低減させ、工業的に製造することが可能となる。
実施例1のME-200GLFG(L)-200PAのGPC分析結果を示す。 実施例15の細胞を用いた分解性試験において、細胞内から回収したME-200GLFG(L)-200PAのGPC分析結果を示す。 実施例16の放射性同位体をラベル化したME-200GLFG(L)-200PAとメトキシPEGアミン40kDaの体内動態結果(血中濃度)を示す。 実施例16の放射性同位体をラベル化したME-200GLFG(L)-200PAとメトキシPEGアミン40kDaの投与後48時間後の肝臓への滞留量を示す。 実施例16の放射性同位体をラベル化したME-200GLFG(L)-200PAとメトキシPEGアミン40kDaの投与後48時間後の腎臓への滞留量を示す。 実施例16の放射性同位体をラベル化したME-200GLFG(L)-200PAとメトキシPEGアミン40kDaの投与後48時間後の脾臓への滞留量を示す。 実施例16の放射性同位体をラベル化したME-200GLFG(L)-200PAとメトキシPEGアミン40kDaの投与後48時間後の肺への滞留量を示す。 実施例17のメトキシPEGアミン40kDaを長期投与したマウスの脳脈絡叢の切片の画像(矢印は空胞を示す)を示す。 実施例17のME-200GLFG(L)-200PAを長期投与したマウスの脳脈絡叢の切片の画像を示す。 実施例18のPBS、メトキシPEGアミン40kDa、メトキシPEGアミン20kDa、ME-200GLFG(L)-200PAを長期投与したマウスの脳脈絡叢の切片の画像(茶色に染色された部分がPEGの蓄積を示す)を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る分解性ポリエチレングリコール誘導体は、下式(1)で示される。
Figure 0007205827000007
(式中、mは1~7であり、n1及びn2はそれぞれ独立して45~682であり、pは1~4であり、Rは炭素数1~4のアルキル基であり、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2~8残基のオリゴペプチドであり、Qは2~5個の活性水素を持つ化合物の残基であり、Xは生体関連物質と反応可能な官能基であり、L、L、L、L及びLはそれぞれ独立して、結合または2価のスペーサーである。)
本発明の式(1)のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は、通常20,000~120,000であり、好ましくは25,000~80,000であり、更に好ましくは30,000~60,000である。本発明の1つの好ましい実施形態では、本発明の式(1)のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は30,000以上である。ここでいう分子量とは数平均分子量(Mn)である。
式(1)中のn1とn2は、それぞれ、ポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、通常それぞれ独立して45~682であり、好ましくはそれぞれ独立して113~568であり、さらに好ましくはそれぞれ独立して180~525である。n1とn2は、異なっていても良く、また同じであっても良い。
式(1)中のpは1~4である。pが1である場合、式(1)のポリエチレングリコール誘導体は直鎖型であり、pが2~4である場合、式(1)のポリエチレングリコール誘導体は分岐型である。
式(1)中のRは、炭素数1~4のアルキル基であり、具体的な例としてはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、t-ブチル基などが挙げられ、好ましくは炭素数1~3のアルキル基、より好ましくはメチル基またはエチル基であり、更に好ましくはメチル基である。
式(1)中のZは、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解するオリゴペプチドであれば特に制限はないが、システインを除く中性アミノ酸からなる2~8残基のオリゴペプチドが好ましく、システインを除く中性アミノ酸からなる2~6残基のオリゴペプチドがより好ましく、システインを除く中性アミノ酸からなる2~4残基のオリゴペプチドが更に好ましい。
また、式(1)中のZは、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持つアミノ酸、具体的には、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸を含まない中性アミノ酸で構成されるオリゴペプチドであることが好ましい。本発明の式(1)のポリエチレングリコール誘導体の合成においては、ポリエチレングリコール誘導体にオリゴペプチドを導入する際、オリゴペプチドのN末端のアミノ基、またはC末端のカルボキシル基をポリエチレングリコール誘導体との反応に利用している。しかし、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持つアミノ酸がオリゴペプチドに含まれると、ポリエチレングリコール誘導体が目的であるN末端のアミノ基やC末端のカルボキシル基だけでなく、側鎖のアミノ基やカルボキシル基にも導入された不純物が発生する。この不純物は通常の抽出や晶析などの精製工程で除去することは難しいため、純度よく目的物を得るためには、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持たないアミノ酸からなるオリゴペプチドを用いることが望ましい。ここで使用されるアミノ酸は、α-アミノ酸であり、また基本的にはL型である。
さらに、中性アミノ酸であるシステインはチオール基を有しており、他のチオール基とジスルフィド結合を形成するため、式(1)中のZは、システインを含まない中性アミノ酸からなるオリゴペプチドであることが望ましい。
加えて、式(1)中のZは、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドであることが好ましい。C末端のカルボキシル基とポリエチレングリコール誘導体を反応させる際は、基本的にC末端のカルボキシル基を縮合剤などで活性化する必要がある。この活性化の工程にて、グリシン以外のアミノ酸ではエピメリ化が起こりやすく、立体異性体が副生することが知られている。オリゴペプチドのC末端のアミノ酸をアキラルなグリシンとすることで、立体異性体の副生の無い、高純度な目的物を得ることができる。
さらに、式(1)中のZは、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸、具体的には、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシンを少なくとも1つ有するオリゴペプチドであることが好ましく、フェニルアラニンを有するオリゴペプチドであることが更に好ましい。Kyte と Doolittleにより作成された、アミノ酸の疎水性を定量的に示すハイドロパシー指標(hydropathy index)は、値が大きいほど疎水的なアミノ酸であることを示す(Kyte J & Doolittle RF, 1982, J Mol Biol, 157:105-132.)。
式(1)中のZは、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解する性能を有し、システインを除く中性アミノ酸からなる2~8残基のオリゴペプチドであれば特に制限は無いが、具体的な例としては、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-ロイシン-グリシン、バリン-シトルリン-グリシン、バリン-アラニン-グリシン、グリシン-グリシン-グリシン、フェニルアラニン-グリシンなどであり、好ましくはグリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-グリシン-グリシン、バリン-シトルリン-グリシン、バリン-アラニン-グリシン、フェニルアラニン-グリシンであり、より好ましくはグリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、グリシン-フェニルアラニン-グリシン、バリン-シトルリン-グリシン、バリン-アラニン-グリシン、フェニルアラニン-グリシンであり、さらにより好ましくはグリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、バリン-シトルリン-グリシン、フェニルアラニン-グリシンである。
式(1)中のQは2~5個の活性水素を持つ化合物の残基である。活性水素としては、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基などの水素があげられる(但し、本発明においては、1級アミノ基(-NH)の場合、活性水素は1個と数える。)。「2個の活性水素を持つ化合物の残基」としては、エチレングリコールなどの残基が挙げられ、「3個の活性水素を持つ化合物の残基」としては、オリゴペプチド、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリンなどの残基が挙げられ、「4個の活性水素を持つ化合物の残基」としては、ペンタエリスリトール、ジグリセリンなどの残基が挙げられ、「5個の活性水素を持つ化合物の残基」としては、キシリトールなどの残基が挙げられ、好ましくはエチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基、あるいはオリゴペプチドの残基であり、より好ましくはエチレングリコール、リジン、グルタミン酸、グリセリン、オリゴペプチドの残基であり、特に好ましくはエチレングリコール、リジンの残基である。
また、Qの活性水素の数であるvと、式(1)のポリエチレングリコール誘導体のポリエチレングリコール鎖の本数を表すpとの関係は、好ましくはv=p+1であり、p=1の場合はv=2で、Qはエチレングリコールなどの残基であり、p=2の場合はv=3で、Qはグリセリン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの残基であり、p=3の場合はv=4で、Qはペンタエリスリトール、ジグリセリンなどの残基であり、p=4の場合はv=5で、Qはキシリトールなどの残基である。
Qがオリゴペプチドの残基である場合、該オリゴペプチドは、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解する性能を有し、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか1つを含み、かつそれ以外のアミノ酸がシステインを除く中性アミノ酸からなる4~8残基のオリゴペプチドであれば特に制限は無いが、具体的な例としては、グルタミン酸-グリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、グリシン-グルタミン酸-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、グルタミン酸-グリシン-グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グルタミン酸-フェニルアラニン-グリシン、グルタミン酸-グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グルタミン酸-グリシン-ロイシン-グリシン、グルタミン酸-バリン-シトルリン-グリシン、グルタミン酸-バリン-アラニン-グリシン、グルタミン酸-フェニルアラニン-グリシンなどであり、好ましくはグルタミン酸-グリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、グルタミン酸-グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グルタミン酸-バリン-シトルリン-グリシン、グルタミン酸-バリン-アラニン-グリシンであり、より好ましくはグルタミン酸-グリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、グルタミン酸-バリン-シトルリン-グリシンである。該オリゴペプチドはまた、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドであることが好ましい。該オリゴペプチドはさらに、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドであることが好ましい。なお、該オリゴペプチドの詳細な説明については、上記Zのオリゴペプチドの説明を参照されたい。
式(1)中のL、L、L、L及びLは、それぞれ独立して、単結合または2価のスペーサーであるが、これらのスペーサーは共有結合を形成し得る基であれば特に制限は無いが、好ましくは、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、2級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基であり、より好ましくは、アルキレン基、アミド結合、エーテル結合、ウレタン結合または2級アミノ基、カルボニル基と1~3個のアルキレン基とが結合して形成される基であり、特に好ましい態様は、下記の群(I)に示されるものである。エステル結合とカーボネート結合は生体内の血中で徐々に分解するため適さない。
群(I):
Figure 0007205827000008
式(式(z1)~式(z8))において、式中のsは0~10の整数を示し、好ましくは0~6の整数、更に好ましくは0~3の整数を示す。また、式(z2)~式(z8)において、式中の2~3個のsは同一でも、異なっていてもよい。
本発明の1つの好ましい実施形態では、L、L、L、L及びLはそれぞれ独立して、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、2級アミノ基、ウレア結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である。
本発明の別の好ましい実施形態では、L、L、L、L及びLはそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基(例、単結合、-O-、-(CH-、-(CH-、-(CH-O-、-(CH-O-、-(CH-CO-NH-、-(CH-CO-NH-(CH-、-CO-、-(CH-CO-、-NH-)であり、より好ましくはLが単結合、エーテル結合またはエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基(例、単結合、-O-、-(CH-O-)であり、Lがカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基(例、-CO-、-(CH-CO-)であり、Lが2級アミノ基(-NH-)であり、Lがエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基(例、-(CH-O-)であり、Lが単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基(例、単結合、-(CH-、-(CH-、-(CH-CO-NH-、-(CH-CO-NH-(CH-)である。
式(1)中のmは、ポリエチレングリコール鎖とオリゴペプチドの結合体を1つの構成単位とした繰り返しユニット数であり、1~7が好ましく、1~5がより好ましく、1~3が更に好ましい。
式(1)中のXは、化学修飾の対象となる生理活性タンパク質、ペプチド、抗体、核酸などの生体関連物質に存在する官能基と反応して共有結合を形成する官能基であれば特に制限されない。例えば、「Harris, J. M. Poly(Ethylene Glycol) Chemistry; Plenum Press: New York, 1992」、「Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques, 2nd ed.; Academic Press: San Diego, CA, 2008」および「PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Applications; Veronese, F. M., Ed.; Birkhauser: Basel, Switzerland, 2009」などに記載されている官能基が挙げられる。
式(1)中のXで示される「生体関連物質と反応可能な官能基」は、生体関連物質が有するアミノ基、メルカプト基、アルデヒド基、カルボキシル基、不飽和結合またはアジド基などの官能基と化学結合可能な官能基であれば特に制限されない。具体的には、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、カルボキシル基、チオール基、マレイミド基、置換マレイミド基、ヒドラジド基、ジチオピリジル基、置換スルホネート基、ビニルスルホン基、アミノ基、オキシアミノ基、ヨードアセトアミド基、アルキルカルボニル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、アクリル基、スルホニルオキシ基、α-ハロアセチル基、アリル基、ビニル基等が挙げられ、好ましくは、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、ビニルスルホン基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシル基、チオール基、ジチオピリジル基、α-ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基およびアジド基であり、より好ましくは活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基であり、特に好ましくはアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基である。
好適な実施形態において、かかる官能基Xは、下記の群(II)、群(III)、群(IV)、群(V)、群(VI)および群(VII)に分類することができる。
群(II):生体関連物質が有するアミノ基と反応可能な官能基
下記の (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(j)、(k)
群(III):生体関連物質が有するメルカプト基と反応可能な官能基
下記の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)
群(IV):生体関連物質が有するアルデヒドと反応可能な官能基
下記の(h)、(m)、(n)、(p)
群(V):生体関連物質が有するカルボキシル基と反応可能な官能基
下記の(h)、(m)、(n)、(p)
群(VI):生体関連物質が有する不飽和結合と反応可能な官能基
下記の(h)、(m)、(o)
群(VII):生体関連物質が有するアジド基と反応可能な官能基
下記の(l)
Figure 0007205827000009
官能基(j)において、式中のWは塩素原子(Cl)、臭素原子(Br)またはヨウ素原子(I)などのハロゲン原子を示し、好ましくはBr、I、より好ましくはIである。
また、官能基(e)及び官能基(l)において、式中のY、Yは、それぞれ独立して、水素原子または炭素数1~5の炭化水素基を示し、好ましくは炭素数1~5の炭化水素基である。炭素数1~5の炭化水素基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基である。
また、官能基(k)において、式中のYはフッ素原子を含んでいてもよい炭素数が1~10の炭化水素基を示し、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基、ヘキシル基、ノニル基、ビニル基、フェニル基、ベンジル基、4-メチルフェニル基、トリフルオロメチル基、2,2,2-トリフルオロエチル基、4-(トリフルオロメトキシ)フェニル基等が挙げられ、好ましくはメチル基、ビニル基、4-メチルフェニル基、2,2,2-トリフルオロエチル基である。
活性エステル基とは、脱離能の高いアルコキシ基を有したエステル基である。脱離能の高いアルコキシ基としては、ニトロフェノール、N-ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノールなどから誘導されるアルコキシ基が挙げられる。活性エステル基は、好ましくはN-ヒドロキシスクシンイミドから誘導されるアルコキシ基を有したエステル基である。
活性カーボネート基とは、脱離能の高いアルコキシ基を有したカーボネート基である。脱離能の高いアルコキシ基としては、ニトロフェノール、N-ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノール等から誘導されるアルコキシ基が挙げられる。活性カーボネート基は、好ましくはニトロフェノールまたはN-ヒドロキシスクシンイミドから誘導されるアルコキシ基を有したカーボネート基である。
置換マレイミド基とは、マレイミド基の二重結合の片方の炭素原子に炭化水素基が結合しているマレイミド基である。炭化水素基は、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基である。
置換スルホネート基とは、スルホネート基の硫黄原子にフッ素原子を含んでいてもよい炭化水素基が結合しているスルホネート基である。フッ素原子を含んでいてもよい炭化水素基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基、ヘキシル基、ノニル基、ビニル基、フェニル基、ベンジル基、4-メチルフェニル基、トリフルオロメチル基、2,2,2-トリフルオロエチル基、4-(トリフルオロメトキシ)フェニル基等が挙げられ、好ましくはメチル基、ビニル基、4-メチルフェニル基、2,2,2-トリフルオロエチル基である。
下式(2)は、式(1)のポリエチレングリコール誘導体において、オリゴペプチドであるZがC末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴぺプチドである、すなわち、式(1)中のZがZ、Aおよびグリシン残基で構成される、好適態様のポリエチレングリコール誘導体を示している。
Figure 0007205827000010
(式中、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2~6残基のオリゴペプチドであり、Aはシステインを除く中性アミノ酸であり、a及びbはそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり、m、n1及びn2、p、R、Q、X、L、L、L、L及びLは、前記と同義である。)
本発明の式(2)のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は、通常20,000~120,000であり、好ましくは25,000~80,000であり、更に好ましくは30,000~60,000である。本発明の1つの好ましい実施形態では、本発明の式(2)のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は30,000以上である。ここでいう分子量とは数平均分子量(Mn)である。
式(2)中のZは、システインを除く中性アミノ酸からなる2~6残基のオリゴペプチドであり、システインを除く中性アミノ酸からなる2~4残基のオリゴペプチドが好ましく、システインを除く中性アミノ酸からなる2~3残基のオリゴペプチドがより好ましく、また、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸、具体的には、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシンを少なくとも1つ有するオリゴペプチドであることが好ましく、フェニルアラニンを有するオリゴペプチドであることが更に好ましい。
式(2)中のZは、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解するオリゴペプチドであるが、具体的な例としては、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン、グリシン-フェニルアラニン、バリン-シトルリン、バリン-アラニン、グリシン-グリシンであり、好ましくはグリシン-フェニルアラニン-ロイシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン、グリシン-フェニルアラニン、グリシン-グリシン、バリン-シトルリン、バリン-アラニンであり、より好ましくはグリシン-フェニルアラニン-ロイシン、グリシン-フェニルアラニン、バリン-シトルリン、バリン-アラニンであり、さらにより好ましくはグリシン-フェニルアラニン-ロイシン、バリン-シトルリンである。
式(2)中のAは、システインを除く中性アミノ酸であり、好ましくはハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸であり、具体的にはフェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシンであり、より好ましくはフェニルアラニン、ロイシンである。
なお、m、n1及びn2、R、Q、X、L、L、L、L及びLの好ましい態様は、上記の式(1)について説明した通りである。
また、下式(3)は、式(2)のポリエチレングリコール誘導体において、m=1である、好適態様のポリエチレングリコール誘導体を示している。
Figure 0007205827000011
(式中、n3及びn4はそれぞれ独立して45~682であり、p、R、Z、A、a、b、Q、X、L、L、L、L及びLは、前記と同義である。)
本発明の式(3)のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は、通常20,000~60,000であり、好ましくは25,000~55,000であり、更に好ましくは30,000~50,000である。本発明の1つの好ましい実施形態では、本発明の式(3)のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は30,000以上である。ここでいう分子量とは数平均分子量(Mn)である。
式(3)中のn3とn4は、それぞれ、ポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、通常それぞれ独立して45~682であり、好ましくはそれぞれ独立して340~568である。
なお、R、Z、A、Q、X、L、L、L、L及びLの好ましい態様は、上記の式(1)および(2)について説明した通りである。
[直鎖型の式(1)のポリエチレングリコール誘導体]
下式(4)は、式(1)のポリエチレングリコール誘導体において、Qがエチレングリコールの残基であり、LがCHCHOであり、かつpが1である、好適態様の直鎖型のポリエチレングリコール誘導体を示している。
Figure 0007205827000012
(式中、n5及びn6はそれぞれ独立して113~682であり、m、R、Z、X、L、L、L及びLは、前記と同義である。)
本発明の式(4)のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は、通常20,000~120,000であり、好ましくは25,000~80,000であり、更に好ましくは30,000~60,000である。本発明の1つの好ましい実施形態では、本発明の式(1)のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は30,000以上である。ここでいう分子量とは数平均分子量(Mn)である。
式(4)中のn5とn6は、それぞれ、ポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、通常それぞれ独立して113~682であり、好ましくはそれぞれ独立して180~525である。n5とn6は、異なっていても良く、また同じであっても良い。
なお、m、R、Z、X、L、L、L及びLの好ましい態様は、上記の式(1)について説明した通りである。
また、下式(5)は、式(2)のポリエチレングリコール誘導体において、Qがエチレングリコールの残基であり、LがCHCHOであり、かつpが1である、好適態様の直鎖型のポリエチレングリコール誘導体を示している。
Figure 0007205827000013
(式中、n5及びn6はそれぞれ独立して113~682であり、m、R、Z、A、a、b、X、L、L、L及びLは、前記と同義である。)
式(5)中のn5とn6は、それぞれ、ポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、通常それぞれ独立して113~682であり、好ましくはそれぞれ独立して180~525である。n5とn6は、異なっていても良く、また同じであっても良い。
本発明の式(5)のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は、通常20,000~60,000であり、好ましくは25,000~55,000であり、更に好ましくは30,000~50,000である。本発明の1つの好ましい実施形態では、本発明の式(5)のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は30,000以上である。ここでいう分子量とは数平均分子量(Mn)である。
なお、m、R、Z、A、X、L、L、L及びLの好ましい態様は、上記の式(1)および(2)について説明した通りである。
また、下式(6)は、式(3)のポリエチレングリコール誘導体において、Qがエチレングリコールの残基であり、LがCHCHOであり、かつpが1である、好適態様の直鎖型のポリエチレングリコール誘導体を示している。
Figure 0007205827000014
(式中、n7及びn8はそれぞれ独立して226~682であり、R、Z、A、a、b、X、L、L、L及びLは、前記と同義である。)
本発明の式(6)のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は、通常20,000~60,000であり、好ましくは25,000~55,000であり、更に好ましくは30,000~50,000である。本発明の1つの好ましい実施形態では、本発明の式(3)のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は30,000以上である。ここでいう分子量とは数平均分子量(Mn)である。
式(6)中のn7とn8は、それぞれ、ポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、通常それぞれ独立して226~682であり、好ましくはそれぞれ独立して340~568である。n7とn8は、異なっていても良く、また同じであっても良い。
なお、R、Z、A、X、L、L、L及びLの好ましい態様は、上記の式(1)および(2)について説明した通りである。
[分岐型の式(1)のポリエチレングリコール誘導体]
式(1)のポリエチレングリコール誘導体のうち、pが2~4であり、かつQが3~5個の活性水素を持つ化合物の残基であるポリエチレングリコール誘導体は、好適態様の分岐型のポリエチレングリコール誘導体である。
Qの3~5個の活性水素を持つ化合物の残基は、好ましくは、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基、あるいはオリゴペプチドの残基であり、特に好ましくはリジン、グルタミン酸の残基である。ここで、該オリゴペプチドの好ましい態様は、上記の式(1)について説明した通りである。
なお、m、R、Z、X、L、L、L、L及びLの好ましい態様は、上記の式(1)について説明した通りである。
また、式(2)のポリエチレングリコール誘導体のうち、pが2~4であり、かつQが3~5個の活性水素を持つ化合物の残基であるポリエチレングリコール誘導体は、好適態様の分岐型のポリエチレングリコール誘導体である。
Qの3~5個の活性水素を持つ化合物の残基は、好ましくは、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基、あるいはオリゴペプチドの残基であり、特に好ましくはリジン、グルタミン酸の残基である。ここで、該オリゴペプチドの好ましい態様は、上記の式(1)について説明した通りである。
なお、m、R、Z、A、X、L、L、L、L及びLの好ましい態様は、上記の式(1)および(2)について説明した通りである。
さらに、式(3)のポリエチレングリコール誘導体のうち、n3及びn4がそれぞれ独立して113~682であり、pが2~4であり、かつQが3~5個の活性水素を持つ化合物の残基であるポリエチレングリコール誘導体は、好適態様の分岐型のポリエチレングリコール誘導体である。
n3とn4は、それぞれ、ポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、好ましくはそれぞれ独立して226~455である。n3とn4は、異なっていても良く、また同じであっても良い。
Qの3~5個の活性水素を持つ化合物の残基は、好ましくは、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基、あるいはオリゴペプチドの残基であり、特に好ましくはリジン、グルタミン酸の残基である。ここで、該オリゴペプチドの好ましい態様は、上記の式(1)について説明した通りである。
なお、R、Z、A、X、L、L、L、L及びLの好ましい態様は、上記の式(1)および(2)について説明した通りである。
本発明の式(1)のポリエチレングリコール誘導体の好適な例としては、以下のポリエチレングリコール誘導体が挙げられる。
[ポリエチレングリコール誘導体(1-1)]
mが1~3であり;
n1及びn2がそれぞれ独立して113~568であり;
pが1または2であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Zがシステインを除く中性アミノ酸からなる2~4残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-グリシン-グリシン、バリン-シトルリン-グリシン、バリン-アラニン-グリシン、フェニルアラニン-グリシン)であり;
Qがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
、L、L、L及びLがそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、それぞれ独立して、
Figure 0007205827000015
(式中、sは0~6の整数であり、(z2)、(z3)、(z5)および(z6)中の2個のsは同一でも異なっていてもよい。)から選ばれるスペーサー](例、単結合、-O-、-(CH-、-(CH-、-(CH-O-、-(CH-O-、-(CH-CO-NH-、-(CH-CO-NH-(CH-、-CO-、-(CH-CO-、-NH-)である;
式(1)のポリエチレングリコール誘導体。
[ポリエチレングリコール誘導体(1-2)]
mが1~3であり;
n1及びn2がそれぞれ独立して113~568であり;
pが1または2であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Zがシステインを除く中性アミノ酸からなる2~4残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-グリシン-グリシン、バリン-シトルリン-グリシン、バリン-アラニン-グリシン、フェニルアラニン-グリシン)であり;
Qがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
が単結合、エーテル結合またはエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000016
(式中、sは0~6の整数であり、(z2)中の2個のsは同一でも異なっていてもよい。)](例、単結合、-O-、-(CH-O-)であり;
がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000017
(式中、2個のsは同一でも異なっていてもよく、0~6の整数である。)](例、-CO-、-(CH-CO-)であり;
が2級アミノ基(-NH-)であり;
がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000018
(式中、2個のsは同一でも異なっていてもよく、0~6の整数である。)](例、-(CH-O-)であり;
が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000019
(式中、sは0~6の整数であり、(z3)中の2個のsは同一でも異なっていてもよい。)](例、単結合、-(CH-、-(CH-、-(CH-CO-NH-、-(CH-CO-NH-(CH-)である;
式(1)のポリエチレングリコール誘導体。
本発明の式(2)のポリエチレングリコール誘導体の好適な例としては、以下のポリエチレングリコール誘導体が挙げられる。
[ポリエチレングリコール誘導体(2-1)]
mが1~3であり;
pが1または2であり;
n1及びn2がそれぞれ独立して113~568であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
がシステインを除く中性アミノ酸からなる2~3残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン、グリシン-フェニルアラニン、グリシン-グリシン、バリン-シトルリン、バリン-アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Qがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
、L、L、L及びLがそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、それぞれ独立して、
Figure 0007205827000020
(式中、sは0~6の整数であり、(z2)、(z3)、(z5)および(z6)中の2個のsは同一でも異なっていてもよい。)から選ばれるスペーサー](例、単結合、-O-、-(CH-、-(CH-、-(CH-O-、-(CH-O-、-(CH-CO-NH-、-(CH-CO-NH-(CH-、-CO-、-(CH-CO-、-NH-)である;
式(2)のポリエチレングリコール誘導体。
[ポリエチレングリコール誘導体(2-2)]
mが1~3であり;
pが1または2であり;
n1及びn2がそれぞれ独立して113~568であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
がシステインを除く中性アミノ酸からなる2~3残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン、グリシン-フェニルアラニン、グリシン-グリシン、バリン-シトルリン、バリン-アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Qがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
が単結合、エーテル結合またはエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000021
(式中、sは0~6の整数であり、(z2)中の2個のsは同一でも異なっていてもよい。)](例、単結合、-O-、-(CH-O-)であり;
がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000022
(式中、2個のsは同一でも異なっていてもよく、0~6の整数である。)](例、-CO-、-(CH-CO-)であり;
が2級アミノ基(-NH-)であり;
がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000023
(式中、2個のsは同一でも異なっていてもよく、0~6の整数である。)](例、-(CH-O-)であり;
が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000024
(式中、sは0~6の整数であり、(z3)中の2個のsは同一でも異なっていてもよい。)](例、単結合、-(CH-、-(CH-、-(CH-CO-NH-、-(CH-CO-NH-(CH-)である;
式(2)のポリエチレングリコール誘導体。
本発明の式(3)のポリエチレングリコール誘導体の好適な例としては、以下のポリエチレングリコール誘導体が挙げられる。
[ポリエチレングリコール誘導体(3-1)]
pが1または2であり;
n3及びn4がそれぞれ独立して340~568であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
がシステインを除く中性アミノ酸からなる2~3残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン、グリシン-フェニルアラニン、グリシン-グリシン、バリン-シトルリン、バリン-アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Qがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
、L、L、L及びLがそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、それぞれ独立して、
Figure 0007205827000025
(式中、sは0~6の整数であり、(z2)、(z3)、(z5)および(z6)中の2個のsは同一でも異なっていてもよい。)から選ばれるスペーサー](例、単結合、-O-、-(CH-、-(CH-、-(CH-O-、-(CH-O-、-(CH-CO-NH-、-(CH-CO-NH-(CH-、-CO-、-(CH-CO-、-NH-)である;
式(3)のポリエチレングリコール誘導体。
[ポリエチレングリコール誘導体(3-2)]
pが1または2であり;
n3及びn4がそれぞれ独立して340~568であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
がシステインを除く中性アミノ酸からなる2~3残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン、グリシン-フェニルアラニン、グリシン-グリシン、バリン-シトルリン、バリン-アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Qがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
が単結合、エーテル結合またはエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000026
(式中、sは0~6の整数であり、(z2)中の2個のsは同一でも異なっていてもよい。)](例、単結合、-O-、-(CH-O-)であり;
がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000027
(式中、2個のsは同一でも異なっていてもよく、0~6の整数である。)](例、-CO-、-(CH-CO-)であり;
が2級アミノ基(-NH-)であり;
がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000028
(式中、2個のsは同一でも異なっていてもよく、0~6の整数である。)](例、-(CH-O-)であり;
が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000029
(式中、sは0~6の整数であり、(z3)中の2個のsは同一でも異なっていてもよい。)](例、単結合、-(CH-、-(CH-、-(CH-CO-NH-、-(CH-CO-NH-(CH-)である;
式(3)のポリエチレングリコール誘導体。
本発明の式(4)のポリエチレングリコール誘導体の好適な例としては、以下のポリエチレングリコール誘導体が挙げられる。
[ポリエチレングリコール誘導体(4-1)]
mが1~3であり;
n5及びn6がそれぞれ独立して180~525であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Zがシステインを除く中性アミノ酸からなる2~4残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-グリシン-グリシン、バリン-シトルリン-グリシン、バリン-アラニン-グリシン、フェニルアラニン-グリシン)であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
、L、L及びLがそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、それぞれ独立して、
Figure 0007205827000030
(式中、sは0~6の整数であり、(z2)、(z3)、(z5)および(z6)中の2個のsは同一でも異なっていてもよい。)から選ばれるスペーサー](例、単結合、-O-、-(CH-、-(CH-、-(CH-O-、-(CH-O-、-(CH-CO-NH-、-(CH-CO-NH-(CH-、-CO-、-(CH-CO-、-NH-)である;
式(4)のポリエチレングリコール誘導体。
[ポリエチレングリコール誘導体(4-2)]
mが1~3であり;
n5及びn6がそれぞれ独立して180~525であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Zがシステインを除く中性アミノ酸からなる2~4残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-グリシン-グリシン、バリン-シトルリン-グリシン、バリン-アラニン-グリシン、フェニルアラニン-グリシン)であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000031
(式中、2個のsは同一でも異なっていてもよく、0~6の整数である。)](例、-CO-、-(CH-CO-)であり;
が2級アミノ基(-NH-)であり;
がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000032
(式中、2個のsは同一でも異なっていてもよく、0~6の整数である。)](例、-(CH-O-)であり;
が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000033
(式中、sは0~6の整数であり、(z3)中の2個のsは同一でも異なっていてもよい。)](例、単結合、-(CH-、-(CH-、-(CH-CO-NH-、-(CH-CO-NH-(CH-)である;
式(4)のポリエチレングリコール誘導体。
本発明の式(5)のポリエチレングリコール誘導体の好適な例としては、以下のポリエチレングリコール誘導体が挙げられる。
[ポリエチレングリコール誘導体(5-1)]
mが1~3であり;
n5及びn6がそれぞれ独立して180~525であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
がシステインを除く中性アミノ酸からなる2~3残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン、グリシン-フェニルアラニン、グリシン-グリシン、バリン-シトルリン、バリン-アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
、L、L及びLがそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、それぞれ独立して、
Figure 0007205827000034
(式中、sは0~6の整数であり、(z2)、(z3)、(z5)および(z6)中の2個のsは同一でも異なっていてもよい。)から選ばれるスペーサー](例、単結合、-O-、-(CH-、-(CH-、-(CH-O-、-(CH-O-、-(CH-CO-NH-、-(CH-CO-NH-(CH-、-CO-、-(CH-CO-、-NH-)である;
式(5)のポリエチレングリコール誘導体。
[ポリエチレングリコール誘導体(5-2)]
mが1~3であり;
n5及びn6がそれぞれ独立して180~525であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
がシステインを除く中性アミノ酸からなる2~3残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン、グリシン-フェニルアラニン、グリシン-グリシン、バリン-シトルリン、バリン-アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000035
(式中、2個のsは同一でも異なっていてもよく、0~6の整数である。)](例、-CO-、-(CH-CO-)であり;
が2級アミノ基(-NH-)であり;
がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000036
(式中、2個のsは同一でも異なっていてもよく、0~6の整数である。)](例、-(CH-O-)であり;
が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000037
(式中、sは0~6の整数であり、(z3)中の2個のsは同一でも異なっていてもよい。)](例、単結合、-(CH-、-(CH-、-(CH-CO-NH-、-(CH-CO-NH-(CH-)である;
式(5)のポリエチレングリコール誘導体。
本発明の式(6)のポリエチレングリコール誘導体の好適な例としては、以下のポリエチレングリコール誘導体が挙げられる。
[ポリエチレングリコール誘導体(6-1)]
n7及びn8がそれぞれ独立して340~568であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
がシステインを除く中性アミノ酸からなる2~3残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン、グリシン-フェニルアラニン、グリシン-グリシン、バリン-シトルリン、バリン-アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
、L、L及びLがそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、それぞれ独立して、
Figure 0007205827000038
(式中、sは0~6の整数であり、(z2)、(z3)、(z5)および(z6)中の2個のsは同一でも異なっていてもよい。)から選ばれるスペーサー](例、単結合、-O-、-(CH-、-(CH-、-(CH-O-、-(CH-O-、-(CH-CO-NH-、-(CH-CO-NH-(CH-、-CO-、-(CH-CO-、-NH-)である;
式(6)のポリエチレングリコール誘導体。
[ポリエチレングリコール誘導体(6-2)]
n7及びn8がそれぞれ独立して340~568であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
がシステインを除く中性アミノ酸からなる2~3残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン、グリシン-フェニルアラニン、グリシン-グリシン、バリン-シトルリン、バリン-アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000039
(式中、2個のsは同一でも異なっていてもよく、0~6の整数である。)](例、-CO-、-(CH-CO-)であり;
が2級アミノ基(-NH-)であり;
がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000040
(式中、2個のsは同一でも異なっていてもよく、0~6の整数である。)](例、-(CH-O-)であり;
が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
Figure 0007205827000041
(式中、sは0~6の整数であり、(z3)中の2個のsは同一でも異なっていてもよい。)](例、単結合、-(CH-、-(CH-、-(CH-CO-NH-、-(CH-CO-NH-(CH-)である;
式(6)のポリエチレングリコール誘導体。
本発明の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、例えば、直鎖型である場合、次のような工程図(工程図(I))に示すルートにより製造することができる。
工程図(I)
Figure 0007205827000042
(工程中、PEG1、PEG2はポリエチレングリコール誘導体であり、Peptideはオリゴペプチドであり、X1、X2、X3はポリエチレングリコール誘導体のオリゴペプチドと反応することができる官能基であり、Proは保護基であり、Rは前記と同義である。)
工程図(I)のPEG1、PEG2は、ポリエチレングリコール誘導体であり、それぞれの分子量は、前記したポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であるn1、n2で定義したとおりであり、つまりnが113~682であることから、その分子量の範囲は、5000~30000である。
工程図(I)のPeptideは、前記Zと同義のオリゴペプチドである。工程図(I)では、N末端のアミノ基が保護基で保護されたオリゴペプチド、またはC末端のカルボキシル基が保護基で保護されたオリゴペプチドを用いる。
工程図(I)のX1、X2、X3は、Peptideのカルボキシル基、またはアミノ基と反応可能なポリエチレングリコール誘導体の官能基である。
工程図(I)のProは、保護基であり、ここで保護基とは、ある反応条件下で分子中の特定の化学反応可能な官能基の反応を防止または阻止する成分である。保護基は、保護される化学反応可能な官能基の種類、使用される条件および分子中の他の官能基もしくは保護基の存在により変化する。保護基の具体的な例は多くの一般的な成書に見出すことができるが、例えば「Wuts, P. G. M.; Greene, T. W. Protective Groups in Organic Synthesis, 4th ed.; Wiley-Interscience: New York, 2007」に記載されている。また、保護基で保護された官能基は、それぞれの保護基に適した反応条件を用いて脱保護、すなわち化学反応させることで、元の官能基を再生させることができる。保護基の代表的な脱保護条件は前述の文献に記載されている。
工程図(I)のポリエチレングリコール誘導体とオリゴペプチドとの反応については、特に制限は無く、ポリエチレングリコール誘導体とオリゴペプチドは化学反応によって共有結合で結合される。オリゴペプチドとポリエチレングリコールとの結合は、反応に使用される官能基の組み合わせによって決定されるが、基本的には、前記L、L、L、L、Lで示した2価のスペーサーであるウレタン結合やアミド結合を含むアルキレン基などによる結合である。
工程図(I)の反応A-1は、片末端を保護基で保護されたオリゴペプチドと、片末端がRであるポリエチレングリコール誘導体の反応であり、続く脱保護B-1にて、片末端にR、片末端にオリゴペプチドを有したポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
工程図(I)の反応C-1は、片末端を保護基で保護されたポリエチレングリコール誘導体と、脱保護B-1にて得られた末端にオリゴペプチドを有したポリエチレングリコール誘導体との反応である。続く脱保護D-1にて、2つのポリエチレングリコール鎖と1つのオリゴペプチドが連結したポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
工程図(I)の反応A-2は、片末端を保護基で保護されたオリゴペプチドと、脱保護D-1にて得られた2つのポリエチレングリコール鎖と1つのオリゴペプチドが連結したポリエチレングリコール誘導体との反応である。続く脱保護B-2にて、末端にオリゴペプチドを有したポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
工程図(I)の反応C-2は、片末端を保護基で保護されたポリエチレングリコール誘導体と、脱保護B-2にて得られた末端にオリゴペプチドを有したポリエチレングリコール誘導体との反応である。続く脱保護D-2にて、3つのポリエチレングリコール鎖と2つのオリゴペプチドが連結したポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
工程図(I)の反応A→脱保護B→反応C→脱保護Dのサイクルを繰り返すことで、本発明の分解性ポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、必要に応じて末端官能基を化学変換することができる。この官能基変換に用いられる反応は、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドや、前記の2価のスペーサーが分解しない条件を適切に選択しなければならない。
当該分解性ポリエチレングリコール誘導体を合成する典型的な例としては、以下のような工程が挙げられる。ここでは工程図(I)の代表例として、N末端のアミノ基が保護基で保護されたオリゴペプチドを用いた合成方法を説明する。以降の工程のスペーサーL、L、L、L、L10、L11、L12は、前記L、L、L、L、Lで示した2価のスペーサーと同義である。
Figure 0007205827000043
反応A-1は、N末端のアミノ基が保護基で保護されたオリゴペプチドのカルボキシル基と、片末端がRであるポリエチレングリコール誘導体(4)のアミノ基を縮合反応にて結合させ、ポリエチレングリコール誘導体(5)を得る工程である。
オリゴペプチドのN末端のアミノ基の保護基は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基およびカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびt-ブチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
縮合反応としては、特に制限は無いが、縮合剤を用いる反応が望ましい。縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)等のカルボジイミド系の縮合剤を単独で使用しても良く、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt)等の試薬と併用しても良い。また、より反応性の高いHATUやHBTU、TATU,TBTU、COMU、DMT-MM等の縮合剤を使用しても良い。また反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジン等の塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したオリゴペプチドや縮合剤などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
Figure 0007205827000044
脱保護B-1は、反応A-1で得られたポリエチレングリコール誘導体(5)の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体(6)を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやLの2価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
Figure 0007205827000045
反応C-1は、脱保護B-1で得られたポリエチレングリコール誘導体(6)のアミノ基と、ポリエチレングリコール誘導体(7)の活性エステル基または活性カーボネート基を反応で結合させ、2本のポリエチレングリコール鎖がオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体(8)を得る工程である。
ポリエチレングリコール誘導体(7)は、片末端に保護基で保護されたアミノ基を有し、もう片末端に活性エステル基または活性カーボネート基などを有する。活性エステル基と活性カーボネート基の脱離基としては、スクシンイミジルオキシ基、フタルイミジルオキシ基、4-ニトロフェノキシ基、1-イミダゾリル基、ペンタフルオロフェノキシ基、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ基および7-アザベンゾトリアゾール-1-イルオキシ基などが挙げられる。また、ポリエチレングリコール誘導体(7)は、必ずしも活性化された官能基を有している必要は無く、末端にカルボキシル基を有する場合は、反応A-1と同様に、縮合剤を用いた反応を用いることができる。反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジン等の塩基を用いても良い。ポリエチレングリコール誘導体(7)の保護基は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基およびカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびt-ブチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
ポリエチレングリコール誘導体(8)の中から、分子量や官能基の異なるポリエチレングリコール不純物を除去する手法としては、特開2014-208786、特開2011-79934に記載の精製技術を用いることができる。
Figure 0007205827000046
脱保護D-1は、反応C-1で得られたポリエチレングリコール誘導体(8)の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体(9)を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやL、L、Lの2価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
Figure 0007205827000047
反応A-2は、N末端のアミノ基が保護基で保護されたオリゴペプチドのカルボキシル基と、脱保護B-1で得られたポリエチレングリコール誘導体(9)のアミノ基を縮合反応にて結合させ、ポリエチレングリコール誘導体(10)を得る工程である。前記反応A-1と同条件で反応と精製が可能である。
Figure 0007205827000048
脱保護B-2は、反応A-2で得られたポリエチレングリコール誘導体(10)の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体(11)を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやL、L、Lの2価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。前記脱保護B-1と同条件で反応と精製が可能である。
Figure 0007205827000049
反応C-2は、脱保護B-2で得られたポリエチレングリコール誘導体(11)のアミノ基と、ポリエチレングリコール誘導体(7)の活性エステル基または活性カーボネート基を反応で結合させ、3本のポリエチレングリコール鎖が2つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体(12)を得る工程である。前記反応C-1と同条件で反応と精製が可能である。
Figure 0007205827000050
脱保護D-2は、反応C-2で得られたポリエチレングリコール誘導体(12)の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体(13)を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやL、L、Lの2価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。前記脱保護D-1と同条件で反応と精製が可能である。
以上の反応をまとめると、以下の工程図(II)になる。反応A→脱保護B→反応C→脱保護Dのサイクルを繰り返すことで、(9)、(13)、(14)、(15)の分解性ポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
工程図(II)
Figure 0007205827000051
工程図(II)で得られた(9)、(13)、(14)、(15)の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、具体的に以下に該当する。
ポリエチレングリコール誘導体(9):2本のポリエチレングリコール鎖が1つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(13):3本のポリエチレングリコール鎖が2つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(14):4本のポリエチレングリコール鎖が3つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(15):5本のポリエチレングリコール鎖が4つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
得られた(9)、(13)、(14)、(15)の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、末端にアミノ基を有しており、これを利用して様々な官能基に変換が可能である。その反応については後述する。
また、工程図(II)の反応C-1、反応C-2、反応C-3、反応C-4において使用したポリエチレングリコール誘導体(7)のアミノ基の保護基を、例えば、アルデヒド基の保護基であるアセタール基(具体的には、3,3-ジエトキシプロピル基等)や、カルボキシル基の保護基であるアルキルエステル系保護基(具体的には、メチルエステル、t-ブチルエステル、ベンジルエステル等)などに変更することで、異なる官能基を有した分解性ポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。この場合、脱保護D-1、脱保護D-2、脱保護D-3、脱保護D-4において、それぞれの保護基に適した従来公知の方法を用いて脱保護を行うことで、目的物を得ることができる。
ポリエチレングリコール誘導体(7)に替わるポリエチレングリコール誘導体については、例えば以下の構造のものが挙げられる。
Figure 0007205827000052
Figure 0007205827000053
本発明の分解性ポリエチレングリコール誘導体の異なる製法としては、例えば次のような工程図(工程図(III))に示すルートによっても製造することができる。
工程図(III)
Figure 0007205827000054
(工程中、PEG1、PEG2、PEG3はポリエチレングリコール誘導体であり、Peptideはオリゴペプチドであり、X1、X2、X3、X4、X5はポリエチレングリコール誘導体の官能基であり、Pro、Pro2、Pro3は保護基であり、Rは前記と同義である。)
工程図(III)のPEG1、PEG2、PEG3は、ポリエチレングリコール誘導体であり、それぞれの分子量は、前記したポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であるn1、n2で定義したとおりであり、つまりnが113~682であることから、その分子量の範囲は、5000~30000である。
工程図(III)のPeptideは、前記Zと同義のオリゴペプチドである。工程図(III)では、N末端のアミノ基が保護基で保護されたオリゴペプチド、またはC末端のカルボキシル基が保護基で保護されたオリゴペプチドを用いる。
工程図(III)のX1、X2、X3、X4、X5は、Peptideのカルボキシル基、またはアミノ基と反応可能なポリエチレングリコール誘導体の官能基である。
工程図(III)のPro、Pro2、Pro3は、保護基であり、工程図(III)では、ProはPro2の脱保護条件で安定な保護基であり、また、Pro2はPro3の脱保護条件で安定な保護基である。これら保護基の組み合わせは、例えば「Wuts, P. G. M.; Greene, T. W. Protective Groups in Organic Synthesis, 4th ed.; Wiley-Interscience: New York, 2007」に記載されている保護基から選択することができる。
工程図(III)のポリエチレングリコール誘導体とオリゴペプチドとの反応については、特に制限は無く、ポリエチレングリコール誘導体とオリゴペプチドは化学反応によって共有結合で結合される。オリゴペプチドとポリエチレングリコールとの結合は、反応に使用される官能基の組み合わせによって決定されるが、基本的には、前記L、L、L、L、Lで示した2価のスペーサーであるウレタン結合やアミド結合を含むアルキレン基などによる結合である。
工程図(III)の反応Eは、片末端を保護基Pro3で保護されたオリゴペプチドと、片末端を保護基Pro2で保護されたポリエチレングリコール誘導体の反応である。続く脱保護Fにて、ペプチド側の保護基Pro3のみを脱保護して、片末端にオリゴペプチド、片末端に保護基Pro2を有したポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
工程図(III)の反応G-1は、片末端を保護基Proで保護されたポリエチレングリコール誘導体と、脱保護Fにて得られた片末端にオリゴペプチド、片末端に保護基Pro2を有したポリエチレングリコール誘導体との反応である。続く脱保護H-1にて、ポリエチレングリコール誘導体の片側の保護基Pro2のみを脱保護して、2つのポリエチレングリコール鎖と1つのオリゴペプチドが連結したポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
工程図(III)の反応G-2は、脱保護H-1にて得られた片末端を保護基Proで保護されたポリエチレングリコール誘導体と、脱保護Fにて得られた片末端にオリゴペプチド、片末端に保護基Pro2を有したポリエチレングリコール誘導体との反応である。続く脱保護H-2にて、ポリエチレングリコール誘導体の片側の保護基Pro2のみを脱保護して、3つのポリエチレングリコール鎖と2つのオリゴペプチドが連結したポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
工程図(III)の反応E後の脱保護Fによって得られた片末端にオリゴペプチド、片末端に保護基Pro2を有したポリエチレングリコール誘導体を反応G-1、G-2、G-3の工程で原料として用い、反応Gと脱保護Hの反応を繰り返すことで、本発明の分解性ポリエチレングリコール誘導体の前駆体を効率良く得ることができる。
工程図(III)の反応A-1と脱保護B-1は、前記の工程図(I)と同じであり、片末端にR、片末端にオリゴペプチドを有したポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
工程図(III)の反応Jは、反応Gと脱保護Hの反応を繰り返して得られた片末端を保護基Proで保護されたポリエチレングリコール誘導体(前駆体)と、脱保護B-1にて得られた片末端にR、片末端にオリゴペプチドを有したポリエチレングリコール誘導体との反応である。続く脱保護Kにて、本発明の分解性ポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、必要に応じて末端官能基を化学変換することができる。この官能基変換に用いられる反応は、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドや、前記の2価のスペーサーが分解しない条件を適切に選択しなければならない。
当該分解性ポリエチレングリコール誘導体を合成する典型的な例としては、以下のような工程が挙げられる。ここでは工程図(III)の代表例として、N末端のアミノ基が保護基で保護されたオリゴペプチドを用いた合成方法を説明する。
Figure 0007205827000055
反応Eは、N末端のアミノ基が保護基Pro3で保護されたオリゴペプチドのカルボキシル基と、片末端のカルボキシル基が保護基Pro2で保護されたポリエチレングリコール誘導体(16)のアミノ基を縮合反応にて結合させ、ポリエチレングリコール誘導体(17)を得る工程である。
オリゴペプチドのN末端のアミノ基の保護基Pro3は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基およびカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基等が挙げられる。次にポリエチレングリコール誘導体(16)のカルボキシル基の保護基Pro2は、特に制限はないが、t-ブチル基などが挙げられる。
前記反応A-1と同条件で反応と精製が可能である。
Figure 0007205827000056
脱保護Fは、反応Eで得られたポリエチレングリコール誘導体(17)のアミノ基の保護基Pro3を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体(18)を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、保護基Pro2やオリゴペプチドやL、L10の2価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。例えば、具体的には、Pro3が9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基、Pro2がt-ブチル基の場合、ピペリジンなどの適切な塩基化合物を用いることで、Pro3を選択的に脱保護することができる。前記脱保護B-1と同条件で反応と精製が可能である。
Figure 0007205827000057
反応G-1は、脱保護Fで得られたポリエチレングリコール誘導体(18)のアミノ基と、ポリエチレングリコール誘導体(7)の活性エステル基または活性カーボネート基を反応で結合させ、2本のポリエチレングリコール鎖が1つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体(19)を得る工程である。ポリエチレングリコール誘導体(7)は前記のとおりである。前記反応C-1と同条件で反応と精製が可能である。
Figure 0007205827000058
脱保護H-1は、反応G-1で得られたポリエチレングリコール誘導体(19)のカルボキシル基の保護基Pro2を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体(20)を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、保護基ProやオリゴペプチドやL、L、L、L10の2価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。例えば、具体的には、Proがトリフルオロアセチル基、Pro2がt-ブチル基の場合、適切な酸性化合物を用いた条件にて、Pro2を選択的に脱保護することができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
Figure 0007205827000059
反応G-2は、脱保護Fで得られたポリエチレングリコール誘導体(18)のアミノ基と、脱保護H-1で得られたポリエチレングリコール誘導体(20)のカルボキシル基を縮合反応させ、3本のポリエチレングリコール鎖が2つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体(21)を得る工程である。前記反応C-1と同条件で反応と精製が可能である。
前記反応A-1と同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジン等の塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
ポリエチレングリコール誘導体(21)の中から、分子量や官能基の異なるポリエチレングリコール不純物を除去する手法としては、特開2014-208786、特開2011-79934に記載の精製技術を用いることができる。
Figure 0007205827000060
脱保護H-2は、反応G-2で得られたポリエチレングリコール誘導体(21)のカルボキシル基の保護基Pro2を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体(22)を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、保護基ProやオリゴペプチドやL、L、L、L10の2価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。
以上の反応をまとめると以下の工程図(IV)になる。反応Eと脱保護Fで得られたポリエチレングリコール誘導体(18)を原料に用いて、反応G→脱保護Hのサイクルを繰り返すことで、例えば4本のポリエチレングリコール鎖が3つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体(23)や、5本のポリエチレングリコール鎖が4つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体(24)等、本発明の分解性ポリエチレングリコール誘導体の中間体を得ることができる。
工程図(IV)
Figure 0007205827000061
工程図(IV)で得られた(20)、(22)、(23)、(24)のポリエチレングリコール誘導体は、具体的に以下に該当する。
ポリエチレングリコール誘導体(20):2本のポリエチレングリコール鎖が1つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(22):3本のポリエチレングリコール鎖が2つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(23):4本のポリエチレングリコール鎖が3つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(24):5本のポリエチレングリコール鎖が4つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
次に、工程図(IV)で得られた(20)、(22)、(23)、(24)のポリエチレングリコール誘導体を原料に、以下の反応Jおよび脱保護Kを行うことで、分解性ポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。以下の工程は、ポリエチレングリコール誘導体(24)を用いた場合を示す。
Figure 0007205827000062
反応Jは、前記脱保護B-1で得られたポリエチレングリコール誘導体(6)のアミノ基と、脱保護H-4で得られたポリエチレングリコール誘導体(24)のカルボキシル基を縮合反応させ、6本のポリエチレングリコール鎖が5つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体(25)を得る工程である。前記反応C-1と同条件で反応と精製が可能である。
前記反応A-1と同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジン等の塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
ポリエチレングリコール誘導体(25)の中から、分子量や官能基の異なるポリエチレングリコール不純物を除去する手法としては、特開2014-208786、特開2011-79934に記載の精製技術を用いることができる。
Figure 0007205827000063
脱保護Kは、反応Jで得られたポリエチレングリコール誘導体(25)の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体(26)を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやL、L、L、L、L10の2価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。前記脱保護D-1と同条件で反応と精製が可能である。
本発明の分解性ポリエチレングリコール誘導体の異なる製法としては、例えば、分岐型である場合、次のような工程図(工程図(V))に示すル-トによって製造することができる。ここでは、工程(I)または工程(III)で得られた分解性ポリエチレングリコールと、3~5個の活性水素を持つ化合物の残基であるQとの反応により、分岐型の分解性ポリエチレングリコールを得るものである。
工程図(V)
Figure 0007205827000064
(工程中、PEG1、PEG2はポリエチレングリコール誘導体であり、Peptideはオリゴペプチドであり、Qは3~5個の活性水素を持つ化合物の残基であり、X6、X7は官能基であり、Proは保護基であり、pは2~4であり、Rは前記と同義である。)
工程図(V)のPEG1、PEG2は、ポリエチレングリコール誘導体であり、それぞれの分子量は、前記したポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であるn1、n2で定義したとおりであり、つまりnが45~682であることから、その分子量の範囲は、2000~30000である。
工程図(V)のPeptideは、前記Zと同義のオリゴペプチドである。
工程図(V)のQは、前記Qと同義の3~5個の活性水素を持つ化合物の残基である。
工程図(V)のX6は、Qの活性水素を有した官能基である水酸基、カルボキシル基、またはアミノ基などと反応可能なポリエチレングリコール誘導体の官能基であり、X7はQに結合した生体関連物質と反応可能な官能基である。
工程図(V)のQと分解性ポリエチレングリコール誘導体との反応については、特に制限は無いが、Qと分解性ポリエチレングリコール誘導体とは化学反応によって共有結合で結合される。Qと分解性ポリエチレングリコール誘導体との結合は、反応に使用される官能基の組み合わせによって決定されるが、基本的には、前記L、L、L、L、Lなどで示した2価のスペーサーであるウレタン結合やアミド結合を含むアルキレン基などによる結合である。
工程図(V)の反応Lは、3~5個の活性水素を持つ化合物の残基であるQの活性水素を有した1つの官能基を保護基Proで保護されたQと、前記工程(I)または工程(III)で得られた片末端がRである分解性ポリエチレングリコール誘導体の反応である。続く脱保護Mにて、Qの保護基Proを脱保護して、分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、必要に応じて末端官能基を化学変換することができる。この官能基変換に用いられる反応は、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドや、前記の2価のスペーサーが分解しない条件を適切に選択しなければならない。
当該分解性ポリエチレングリコール誘導体を合成する典型的な例としては、以下のような工程が挙げられる。ここでは工程図(V)の代表例として、3個の活性水素を持つ化合物であるグルタミン酸の残基をQとして用いた場合の合成方法を説明する。
Figure 0007205827000065
反応Lは、例えば、脱保護D-1で得られたポリエチレングリコール誘導体(9)のアミノ基と、アミノ基が保護基で保護されたグルタミン酸誘導体の二つのカルボキシル基を縮合反応で結合させ、2本の分解性ポリエチレングリコール鎖がグルタミン酸残基で繋がれた構造である分岐型のポリエチレングリコール誘導体(27)を得る工程である。前記反応G-2と同条件で反応と精製が可能である。
Figure 0007205827000066
脱保護Mは、反応Lで得られたポリエチレングリコール誘導体(27)の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体(28)を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやL、L、Lの2価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。前記脱保護D-1と同条件で反応と精製が可能である。
本発明の分岐型である分解性ポリエチレングリコール誘導体の異なる製法としては、例えば次のような工程図(工程図(VI))に示すル-トによって製造することができる。ここでは、工程(I)と工程(III)で得られた片末端にペプチドを有したポリエチレングリコール誘導体と、3~5個の活性水素を持つ化合物の残基であるQにポリエチレングリコールが結合した分岐型ポリエチレングリコール誘導体との反応により、分岐型の分解性ポリエチレングリコールを得るものである。
工程図(VI)
Figure 0007205827000067
(工程中、PEG1、PEG2、PEG3はポリエチレングリコール誘導体であり、Peptideはオリゴペプチドであり、Qは3~5個の活性水素を持つ化合物の残基であり、X8、X9は官能基であり、Proは保護基であり、pは2~4であり、Rは前記と同義である。)
工程図(VI)のPEG1、PEG2、PEG3は、ポリエチレングリコール誘導体であり、それぞれの分子量は、前記したポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であるn1、n2で定義したとおりであり、つまりnが45~682であることから、その分子量の範囲は、2000~30000である。
工程図(VI)のPeptideは、前記Zと同義のオリゴペプチドである。
工程図(VI)のX8は、Peptideのカルボキシル基、またはアミノ基と反応可能なポリエチレングリコール誘導体の官能基であり、X9はQに結合した生体関連物質と反応可能な官能基である。
工程図(VI)の片末端にペプチドを有したポリエチレングリコール誘導体と、3~5個の活性水素を持つ化合物の残基であるQにポリエチレングリコールが結合した分岐型ポリエチレングリコール誘導体との反応については、特に制限は無いが、これらポリエチレングリコール誘導体は化学反応によって共有結合で結合される。分岐型ポリエチレングリコール誘導体と分解性ポリエチレングリコール誘導体との結合は、反応に使用される官能基の組み合わせによって決定されるが、基本的には、前記L、L、L、L、Lなどで示した2価のスペーサーであるウレタン結合やアミド結合を含むアルキレン基などによる結合である。
工程図(VI)の反応Nは、3~5個の活性水素を持つ化合物の残基であるQの1つの官能基を保護基Proで保護された分岐型ポリエチレングリコール誘導体と、前記工程(I)または工程(III)で得られた片末端にペプチドを有し、もう片末端がRであるポリエチレングリコール誘導体の反応である。続く脱保護Pにて、Qの保護基Proを脱保護して、分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、必要に応じて末端官能基を化学変換することができる。この官能基変換に用いられる反応は、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドや、前記の2価のスペーサーが分解しない条件を適切に選択しなければならない。
当該分解性ポリエチレングリコール誘導体を合成する典型的な例としては、以下のような工程が挙げられる。ここでは工程図(VI)の代表例として、Qがグリセリン残基である分岐型のポリエチレングリコール誘導体を原料に用いた合成方法を説明する。
Figure 0007205827000068
反応Nは、例えば、特許文献特開2012-25932の実施例に従い得られる分岐型のポリエチレングリコール誘導体(29)の二つのカルボキシル基と、脱保護B-1で得られたポリエチレングリコール誘導体(6)のアミノ基を縮合反応で結合させ、分岐型のポリエチレングリコール誘導体(30)を得る工程である。前記反応G-2と同条件で反応と精製が可能である。
Figure 0007205827000069
脱保護Pは、反応Nで得られたポリエチレングリコール誘導体(30)の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体(31)を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやL、L11、L12の2価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。前記脱保護D-1と同条件で反応と精製が可能である。
次に、脱保護D、脱保護K、脱保護M、脱保護Pで得られたポリエチレングリコール誘導体は、末端にアミノ基を有しており、これを利用して様々な官能基に変換が可能である。
ポリエチレングリコール誘導体の末端のアミノ基を他の官能基に変換する工程については、特に制限は無いが、基本的には、アミノ基と反応可能な活性エステル基を有した化合物、または酸無水物、酸クロライド等の一般的な反応試薬を用いることで、様々な官能基に容易に変換することが出来る。
例えば、ポリエチレングリコール誘導体の末端のアミノ基をマレイミド基に変換したい場合は、以下のような試薬と反応させることで、目的物を得ることができる。
Figure 0007205827000070
例えば、ポリエチレングリコール誘導体の末端のアミノ基をカルボキシル基に変換したい場合は、無水コハク酸や無水グルタル酸と反応させることで、目的物を得ることができる。
これら反応試薬は、低分子量の試薬であり、ポリエチレングリコール誘導体とは大きく溶解性が異なるため、抽出や晶析等の一般的な精製方法にて容易に除去が可能である。
以上のような工程を経て、得られた分解性ポリエチレングリコールは、血中で安定であり、細胞内でのみ分解する性能を有することが求められる。その性能を適切に評価するため、例えば、以下に示すような試験を実施し、分解性ポリエチレングリコールの血中での安定性、そして細胞内での分解性を評価することができる。
分解性ポリエチレングリコール誘導体の血中での安定性を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、マウス、ラット、ヒトなどの血清を用いた試験等が挙げられる。具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を1~10mg/mLの濃度になるように血清に溶解し、37℃で96時間インキュベート後、血清中に含まれるポリエチレングリコール誘導体を回収し、GPCを測定することで分解率を評価することができる。分解率は、安定性試験前のポリエチレングリコール誘導体のGPCメインフラクションのピーク面積%と、安定性試験後のポリエチレングリコール誘導体のGPCメインフラクションのピーク面積%から算出する。具体的には以下の式を用いる。
分解率 = (試験前のピーク面積% - 試験後のピーク面積%) ÷ 試験前のピーク面積% × 100
例えば、安定性試験前の分解性ポリエチレングリコール誘導体のGPCメインフラクションのピーク面積%が95%であり、試験後のGPCメインフラクションのピーク面積%が90%だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率 = (95-90)÷95×100 = 5.26(%)
分解性ポリエチレングリコール誘導体は、血中で分解してしまうと、目的とする血中半減期を得ることができないため、安定性試験において、96時間後の分解率は、10%以下が好ましく、5%以下がさらに好ましい。
分解性ポリエチレングリコール誘導体の細胞内での分解性を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、分解性ポリエチレングリコール誘導体を含有した培地を用いて、細胞を培養させる試験等が挙げられる。ここで使用する細胞や培地については、特に制限は無いが、具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を1~20mg/mLの濃度になるように培地であるRPMI-1640に溶解し、この培地を用いて、マクロファージ細胞RAW264.7を37℃で96時間培養後、細胞中のポリエチレングリコール誘導体を回収し、GPCを測定することで分解率を評価することができる。分解率は、安定性試験と同様に、試験前後のポリエチレングリコール誘導体のGPCメインフラクションのピーク面積%を用いて算出する。
例えば、細胞を用いた分解性試験前の分解性ポリエチレングリコール誘導体のGPCメインフラクションのピーク面積%が95%であり、試験後のGPCメインフラクションのピーク面積%が5%だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率 = (95-5)÷95×100 = 94.7(%)
分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞内で効率よく分解されないと、目的とする細胞の空胞を抑制できないため、分解性試験において、96時間後の分解率は、90%以上が好ましく、95%以上がさらに好ましい。
分解性ポリエチレングリコール誘導体の血中半減期や体内分布を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、放射性同位体や蛍光物質をラベル化し、マウスやラットに投与して、モニタリングする試験等が挙げられる。
ポリエチレングリコール誘導体に導入した分解性ペプチドは、ポリエチレングリコールに細胞内での分解性を付与するが、そのペプチド構造によってポリエチレングリコールの体内動態を変化させる可能性が考えられる。そこで、導入したペプチド構造の体内動態への影響を確認するため、血中半減期および、その体内分布について、分解性を持たない同分子量のポリエチレングリコール誘導体と比較する必要がある。具体的には、放射性同位体でラベル化した分解性を持たないポリエチレングリコール誘導体と、分解性ポリエチレングリコール誘導体を、マウスに投与し、複数のタイムポイントで、血液、各臓器の放射線量を測定し、定量測定を行うことができる。
分解性ポリエチレングリコール誘導体の細胞の空胞抑制を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、非特許文献2に記載があるように、長期間、高頻度、高投与量でマウスやラットに投与を続け、空胞が発生しやすいといわれている臓器や器官の切片画像を確認する試験等が挙げられる。
具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を10~250mg/mLの濃度になるように生理食塩水に溶解し、マウス尾静脈より週3回、4週間以上、20~100μL投与を続け、空胞が発生しやすいといわれている器官である脳脈絡叢や脾臓などのパラフィン切片を作製して染色後、切片画像を病理学的手法により確認し、空胞抑制の評価を行うことができる。
なお、本評価においてポリエチレングリコールの投与量は、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、大過剰のポリエチレングリコールを投与する必要がある。
非特許文献2では、高分子量のポリエチレングリコールによる細胞の空胞化は、ポリエチレングリコールの組織への蓄積と関係があるとの記載がある。分解性ポリエチレングリコール誘導体の細胞への蓄積性を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、上記の空胞の評価と同じ方法で作成した切片画像より評価することができる。ポリエチレングリコールが蓄積しやすいといわれている器官である脳脈絡叢や脾臓などの染色した切片画像を病理学的手法により確認し、ポリエチレングリコールの蓄積性の評価を行うことができる。
なお、本評価においてポリエチレングリコールの投与量は、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、大過剰のポリエチレングリコールを投与する必要がある。
下記実施例で得られたH-NMRは、日本電子データム(株)製JNM-ECP400またはJNM-ECA600から得た。測定にはφ5mmチューブを用い、重水素化溶媒には、DOまたは内部標準物質としてテトラメチルシラン(TMS)を含有するCDClおよびd-DMSOを用いた。得られたポリエチレングリコール誘導体の分子量およびアミン純度は、液体クロマトグラフィー(GPCおよびHPLC)を用いて算出した。液体クロマトグラフィーのシステムは、GPCには東ソー(株)製「HLC-8320GPC EcoSEC」を用い、HPLCにはWATERS社製「ALLIANCE」を用いた。以下、GPCおよびHPLCの分析条件を示す。
GPC分析(分子量測定)
検出器:示差屈折計
カラム:ultrahydrogel500およびultrahydrogel250(WATERS)
移動相:100mM Acetate buffer+0.02%NaN(pH5.2)
流速:0.5mL/min
サンプル量:5mg/mL、20μL
カラム温度:30℃
HPLC分析(アミン純度測定)
検出器:示差屈折計
カラム:TSKgel SP-5PW(東ソー)
移動相:1mM Sodium phosphate buffer(pH6.5)
流速:0.5mL/min
注入量:5mg/mL、20μL
カラム温度:40℃
[実施例1]
化合物(p1)(ME-200GLFG(L)-200PA)の合成
Figure 0007205827000071
[実施例1-1]
Figure 0007205827000072
N末端をtert-ブトキシカルボニル基(Boc基)で保護したグリシル-L-フェニルアラニル-L-ロイシル-グリシン(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)(0.197g、4.0×10-4モル、GenScript Biotech社製)とN-ヒドロキシスクシンイミド(57.5mg、5.0×10-4モル、みどり化学(株)製)を脱水N,N’-ジメチルホルムアミド(1.0g)に溶解後、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド(0.103g、5.0×10-4モル、タマ化学工業(株)製)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で1時間反応させた。脱水N,N’-ジメチルホルムアミド(3.0g)を添加して希釈した後、末端にプロピルアミノ基を有するメトキシPEG(2.0g、9.5×10-5モル、平均分子量=約21,000、日油株式会社製「SUNBRIGHT MEPA-20T」)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で1時間反応させた。その後、酢酸エチル(20g)を加えて反応液を希釈し、LS100ろ紙を敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。ろ液に酢酸エチル(30g)を加えて、均一になるように攪拌した後、ヘキサン(25g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル(50g)に溶解し、ヘキサン(25g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン(25g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p2)(ME-200GLFG(L)-Boc)を得た。収量1.8g。
NMR(CDCl):0.89ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、0.92ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.36ppm(s、9H、-NH-CO-O-C(CH )、1.48ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH -CH(CH)、1.55ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH -CH(CH)、1.80ppm(m、3H)、3.13ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH -C)、3.21ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH -C)、3.33ppm(m、2H、-CO-NH-CH -CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.65ppm(m、約2,000H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH)、3.91ppm(t、1H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH)、4.43ppm(broad、1H)、4.55ppm(q、1H、-NH-CO-CH-CH-C)、5.77ppm(broad、1H)、6.76ppm(broad、1H)、6.86ppm(broad、1H)、6.90ppm(broad、1H)、7.14ppm(broad、1H)、7.20ppm(d、2H、-NH-CO-CH-CH )、7.32ppm(m、3H、-NH-CO-CH-CH
[実施例1-2]
Figure 0007205827000073
実施例1-1で得られたME-200GLFG(L)-Boc(1.8g、8.6×10-5モル)をジクロロメタン(9.0g)に溶解し、メタンスルホン酸(584μL、9.0×10-3モル、関東化学(株)製)を加えて、室温にて窒素雰囲気下で2時間反応させた。その後、反応液をトルエン(18g)で希釈し、イオン交換水(18g)を加えて、室温にて15分攪拌し、水層に生成物を抽出した。得られた水層に1mol/L水酸化ナトリウム水溶液を適量添加し、pHを12に調整した後、塩化ナトリウム(4.5g)を溶解した。そこに、クロロホルム(18g)を添加し、室温にて15分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。水層と有機層を分離した後、水層に再度クロロホルム(18g)を添加し、室温にて15分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出1回目と2回目で得られた有機層を40℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル(36g)を添加した。得られた酢酸エチル溶液に、硫酸ナトリウム(0.90g)を加えて、30℃で15分撹拌した後、5Aろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン(18g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン(18g)で析出物を洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p3)(ME-200GLFG(L)-NH )を得た。収量1.4g。
NMR(CDCl):0.89ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、0.91ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.53ppm(m、2H、-NH-CO-CH-CH -CH(CH)、1,70ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CHCH(CH)、1.80ppm(m、2H、-CO-NH-CHCH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH)、3.10ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH -C)、3.18ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH -C)、3.33ppm(m、7H)、3.74ppm(m、約1,900H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH)、4.31ppm(broad、1H)、4.55ppm(t、1H、-NH-CO-CH-CH-C)、6.91ppm(broad、1H)、7.00ppm(broad、1H)、7.28ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH )、7.98ppm(broad、1H)
[実施例1-3]
Figure 0007205827000074
実施例1-2で得られたME-200GLFG(L)-NH(1.2g、5.7×10-5モル)をクロロホルム(14.4g)に溶解した後、トリエチルアミン(10μL、7.1×10-5モル、関東化学(株))と、片末端にtert-ブトキシカルボニル基で保護したプロピルアミノ基を有し、もう片末端に炭酸スクシンイミジル基を有するヘテロ二官能PEG(1.3g、6.2×10-5モル、平均分子量=約19,000、日油株式会社製「SUNBRIGHT BO-200TS」)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で2時間反応させた。反応後、40℃にて濃縮し、得られた濃縮物に酢酸エチル(48g)を添加して溶解した後、ヘキサン(24g)を加えて室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した。得られた析出物を再度酢酸エチル(48g)に溶解し、ヘキサン(24g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した。析出物を回収後、ヘキサン(24g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p4)(ME-200GLFG(L)-200Boc)を得た。収量2.0g。
NMR(CDCl):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.44ppm(s、9H、-CH-CH-CH-NH-CO-O-C(CH )、1.64ppm(m、1H)、1.76ppm(m、5H)、3.20ppm(m、4H)、3.33ppm(m、2H、-CO-NH-CH -CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.64ppm(m、約3,800H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.10ppm(m、2H、-NH-CO-O-CH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH-CH-)、4.32ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、5.02ppm(broad、1H)、6.45ppm(broad、1H)、6.93ppm(broad、1H)、7.06ppm(broad、1H)、7.13ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH
[実施例1-4]
Figure 0007205827000075
実施例1-3で得られたME-200GLFG(L)-200Boc(1.8g、4.3×10-5モル)をジクロロメタン(9.0g)に溶解し、メタンスルホン酸(292μL、4.5×10-3モル、関東化学(株)製)を加えて、室温にて窒素雰囲気下で2時間反応させた。その後、反応液をトルエン(18g)で希釈し、イオン交換水(18g)を加えて、室温にて15分攪拌し、水層に生成物を抽出した。特開2014-208786に記載の条件に従い、1mol/L塩酸を用いて水層のpHを2.0に調整し、トルエンとクロロホルム混合溶液で水層を洗浄して、アミノ基を持たないポリエチレングリコール不純物を除去した。続いて水層に1mol/L水酸化ナトリウム水溶液を適量添加し、pH12に調整した後、塩化ナトリウム(4.5g)を溶解した。そこに、クロロホルム(18g)を添加し、室温にて15分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。水層と有機層を分離した後、水層に再度クロロホルム(18g)を添加し、室温にて15分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出1回目と2回目で得られた有機層を40℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル(27g)を添加した。得られた酢酸エチル溶液に、硫酸ナトリウム(0.90g)を加えて、30℃で30分撹拌した後、5Aろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン(18g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン(18g)で析出物を洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p1)(ME-200GLFG(L)-200PA)を得た。収量1.5g。分子量は表1に示す。HPLC:アミン純度91%。
NMR(CDCl):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.48ppm(broad、1H)、1.62ppm(t、1H)、1.71ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、3.12ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.64ppm(m、約3,800H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.10ppm(m、2H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH
[実施例2]
化合物(p5)(ME-200GLFG(L)-200AL)の合成
Figure 0007205827000076
[実施例2-1]
Figure 0007205827000077
特許第3508207号などに記載の製法を用いて合成した片末端に3,3-ジエトキシプロピル基、片末端に水酸基を有するヘテロ二官能PEG(15.0g、7.5×10-4モル、平均分子量=約20,000)を脱水ジクロロメタン(75g)に溶解した後、N,N’-ジスクシンイミジルカーボネート(1.2g、4.7×10-3モル、東京化成工業(株)製)とトリエチルアミン(836μL,6.0×10-3モル、関東化学(株))を添加し、室温にて窒素雰囲気下で5時間反応させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過した後、40℃でろ液を濃縮し、得られた濃縮物に酢酸エチル(150g)と2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(30mg)を添加して均一になるまで攪拌した。ヘキサン(75g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した後、析出物を回収し、再度酢酸エチル(150g)と2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(30mg)を添加して溶解した。ヘキサン(75g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した。同様の操作を4回行った後、得られた析出物をヘキサン(90g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した後、真空乾燥して、上記化合物(p6)を得た。収量11.8g。
NMR(CDCl):1.20ppm(t、6H、-CH-CH-CH(OCH CH )、1.90ppm(q、2H、-CHCH -CH(OCHCH)、2.84ppm(s、4H、-O-CO-O-NC )、3.65ppm(m、約1,900H、-O-CO-O-CH-CH-O-(CH CH O)n-CH-)、4.46ppm(t、2H、-O-CO-O-CH -CH-O-(CHCHO)n-CH-)、4.64ppm(t、1H、-CH-CHCH(OCHCH
[実施例2-2]
Figure 0007205827000078
実施例1-2で得られたME-200GLFG(L)-NH(1.9g、9.0×10-5モル)をクロロホルム(18g)に溶解した後、トリエチルアミン(13μL、9.3×10-5モル、関東化学(株))と、実施例2-1で得られたスクシンイミジル基-PEG-3,3-ジエトキシプロピル基(1.5g、7.5×10-5モル、平均分子量=約21,000)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で2時間反応させた。反応後、40℃にて濃縮し、特開2011-79934に記載の条件に従い、得られた濃縮物をトルエンとクロロホルム混合溶液に溶解し、5%食塩水で有機層を洗浄して、分子量約21,000のポリエチレングリコール不純物を除去した。有機層を40℃にて濃縮し、得られた濃縮物に酢酸エチル(60g)を添加して溶解した後、ヘキサン(30g)を加えて室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した。得られた析出物を再度酢酸エチル(60g)に溶解し、ヘキサン(30g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した。析出物を回収後、ヘキサン(30g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p7)(ME-200GLFG(L)-200DE)を得た。収量3.1g。
NMR(CDCl):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.20ppm(t、6H、-CH-CH-CH(OCH CH )、1.47ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH -CH(CH)、1.61ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH -CH(CH)、1.72ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、1.90ppm(q、2H、-CHCH -CH(OCHCH)、2.58ppm(m、1H)、3.19ppm(d、2H、-NH-CO-CH-CH -C)、3.33ppm(m、2H、-CO-NH-CH -CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH)、3.38ppm(-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、4.29ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、4.64ppm(t、1H、-CH-CHCH(OCHCH)、6.38ppm(broad、1H)、6.89ppm(broad、1H)、6.99ppm(broad、1H)、7.10ppm(broad、1H)、7.29ppm(m、5H)
[実施例2-3]
Figure 0007205827000079
実施例2-2で得られたME-200GLFG(L)-200DE(1.0g、2.4×10-5モル)を注射用蒸留水(20g)に溶解した後、85%リン酸(0.46g)でpHを1.50に調整し、20~25℃で2時間反応させた。反応後、400g/Lの水酸化ナトリウム水溶液を0.69g添加し、pHを6.70に調整した後、塩化ナトリウム(4.0g)を添加し溶解した。得られた溶液に1Mの水酸化ナトリウム水溶液(1.76g)を滴下し、pHを7.05に調整した後、予め2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(1.5mg)を溶解したクロロホルム(15g)を添加して、室温で20分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。有機層と水層を分離し、有機層を回収した後、水層に再度予め2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(1.5mg)を溶解したクロロホルム(15g)を添加して、室温で20分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出1回目と2回目で得られた有機層を50℃で濃縮し、得られた濃縮物に酢酸エチル(10g)を添加して、均一になるまで攪拌した後、硫酸マグネシウム(0.25g)を加えて、30℃で15分攪拌し、5Aろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過し、酢酸エチル(10g)で洗浄した。得られたろ液にヘキサン(15g)を添加し、室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した後、予め2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(1.0mg)を溶解したヘキサン(10g)で析出物を洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p5)(ME-200GLFG(L)-200AL)を得た。収量0.65g。分子量は表1に示す。アルデヒド純度は86%(H-NMR)。
NMR(CDCl):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.47ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH -CH(CH)、1.61ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH -CH(CH)、1.72ppm(m、1H)、1.84ppm(m、5H)、2.68ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H、-NH-CO-CH-CH -C)、3.33ppm(m、2H、-CO-NH-CH -CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH)、3.38ppm(-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、4.06ppm(m、1H、-NH-CO-O-CH -CH-O-(CHCHO)n-CHCH-)、4.12ppm(m、1H、-NH-CO-O-CH -CH-O-(CHCHO)n-CHCH-)、4.32ppm(m、1H)、4.51ppm(q、1H)、6.36ppm(broad、1H)、6.87ppm(broad、1H)、6.99ppm(broad、2H)、7.14ppm(broad、1H)、7.29ppm(m、5H)、9.80ppm(s、1H、-CHCHCHO
[実施例3]
化合物(p8)(ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100PA)の合成
Figure 0007205827000080
[実施例3-1]
Figure 0007205827000081
実施例1と同製法にて、N末端をtert-ブトキシカルボニル基(Boc基)で保護したグリシル-L-フェニルアラニル-L-ロイシル-グリシン(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)、末端にプロピルアミノ基を有するメトキシPEG(平均分子量=約10,000、日油株式会社製「SUNBRIGHT MEPA-10T」)、片末端にtert-ブトキシカルボニル基で保護したプロピルアミノ基を有し、もう片末端に炭酸スクシンイミジル基を有するヘテロ二官能PEG(平均分子量=約10,000、日油株式会社製「SUNBRIGHT BO-100TS」)を原料に用いて、上記化合物(p9)(ME-100GLFG(L)-100PA)を得た。収量1.0g。
NMR(CDCl):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.48ppm(broad、1H)、1.62ppm(t、1H)、1.71ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、3.12ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.64ppm(m、約1,800H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.10ppm(m、2H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH
[実施例3-2]
Figure 0007205827000082
実施例3-1で得られたME-100GLFG(L)-100PA(1.0g、5.0×10-5モル)とBoc-Gly-Phe-Leu-Gly(0.99g、2.0×10-4モル、GenScript Biotech社製)に脱水N,N’-ジメチルホルムアミド(10g)を添加し、30℃で加温溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン(65μL、3.8×10-4モル、関東化学(株)製)と(1-シアノ-2-エトキシ-2-オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ-モルホリノ-カルベニウムヘキサフルオロリン酸塩(COMU)(0.106g、2.5×10-4モル、シグマアルドリッチ社製)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で1時間反応させた。反応終了後、クロロホルム(100g)で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(50g)を添加し、室温にて15分攪拌して洗浄を行った。水層と有機層を分離後、再度、有機層に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(50g)を添加し、室温にて15分攪拌して洗浄を行い、有機層を回収した。得られた有機層に硫酸マグネシウム(1.0g)を添加し、30分攪拌して脱水した後、5Aろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を40℃にて濃縮し、濃縮物に酢酸エチル(50g)を添加して均一になるように攪拌した後、ヘキサン(25g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル(50g)に溶解し、室温にてヘキサン(25g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン(25g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p10)(ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-Boc)を得た。収量0.9g。
NMR(CDCl):0.90ppm(t、12H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.44ppm(s、9H、-CH-CH-CH-NH-CO-O-C(CH )、1.64ppm(m、2H)、1.76ppm(m、5H)、3.20ppm(m、4H)、3.33ppm(m、4H、-CO-NH-CH -CH-CH-O-(CH-CH-O)n-)、3.38ppm(s、3H、-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.64ppm(m、約1,800H、-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.10ppm(m、2H、-NH-CO-O-CH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH-CH-)、4.32ppm(m、2H)、4.50ppm(q、2H)、5.02ppm(broad、2H)、6.45ppm(broad、2H)、6.93ppm(broad、2H)、7.06ppm(broad、2H)、7.13ppm(broad、2H)、7.27ppm(m、10H、-NH-CO-CH-CH
[実施例3-3]
Figure 0007205827000083
実施例3-2で得られたME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-Boc(0.9g、4.5×10-5モル)を、実施例1-2と同製法にて、Boc基の脱保護を行い、上記化合物(p11)(ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-NH )を得た。収量0.8g。
NMR(CDCl):0.89ppm(d、6H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、0.91ppm(d、6H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.53ppm(m、4H、-NH-CO-CH-CH -CH(CH)、1,70ppm(m、2H、-NH-CO-CH-CHCH(CH)、1.80ppm(m、4H、-CO-NH-CHCH -CH-O-(CH-CH-O)n-)、3.10ppm(dd、2H、-NH-CO-CH-CH -C)、3.18ppm(dd、2H、-NH-CO-CH-CH -C)、3.33ppm(m、14H)、3.74ppm(m、約1,800H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-)、4.31ppm(broad、2H)、4.55ppm(t、2H、-NH-CO-CH-CH-C)、6.91ppm(broad、2H)、7.00ppm(broad、2H)、7.28ppm(m、10H、-NH-CO-CH-CH )、7.98ppm(broad、2H)
[実施例3-4]
Figure 0007205827000084
実施例3-3で得られたME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-NH(0.8g、4.0×10-5モル)を、実施例1-3と同製法にて、片末端にtert-ブトキシカルボニル基で保護したプロピルアミノ基を有し、もう片末端に炭酸スクシンイミジル基を有するヘテロ二官能PEG(平均分子量=約10,000、日油株式会社製「SUNBRIGHT BO-100TS」)と反応させ、上記化合物(p12)(ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100Boc)を得た。収量1.0g。
NMR(CDCl):0.90ppm(t、12H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.44ppm(s、9H、-CH-CH-CH-NH-CO-O-C(CH )、1.64ppm(m、2H)、1.76ppm(m、10H)、3.20ppm(m、8H)、3.33ppm(m、6H、-CO-NH-CH -CH-CH-O-(CH-CH-O)n-)、3.38ppm(s、3H、-(CH-CH-O)n-CH )、3.64ppm(m、約2,700H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.10ppm(m、4H、-NH-CO-O-CH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH-CH-)、4.32ppm(m、2H)、4.50ppm(q、2H)、5.02ppm(broad、2H)、6.45ppm(broad、2H)、6.93ppm(broad、2H)、7.06ppm(broad、2H)、7.13ppm(broad、2H)、7.27ppm(m、10H、-NH-CO-CH-CH
[実施例3-5]
Figure 0007205827000085
実施例3-4で得られたME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100Boc(1.0g、3.3×10-5モル)を、実施例1-4と同製法にて、Boc基の脱保護を行った。得られた粗生成物を、陽イオン交換樹脂であるSP Sepharose FF(GEヘルスケア製)を充填したイオン交換クロマトグラフィーにて精製し、上記化合物(p13)(ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100PA)を得た。収量0.8g。
NMR(CDCl):0.90ppm(t、12H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.48ppm(broad、2H)、1.62ppm(t、2H)、1.71ppm(m、2H)、1.82ppm(m、4H)、3.12ppm(m、4H)、3.19ppm(d、4H)、3.34ppm(m、4H)、3.38ppm(s、3H、-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.64ppm(m、約2,700H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.10ppm(m、4H)、4.34ppm(m、2H)、4.50ppm(q、2H)、6.46ppm(broad、2H)、6.94ppm(broad、2H)、7.08ppm(broad、2H)、7.27ppm(m、10H、-NH-CO-CH-CH
[実施例3-6]
Figure 0007205827000086
実施例3-5で得られたME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100PA(0.8g、2.7×10-5モル)を原料に用いて、実施例3-2、実施例3-3、実施例3-4、実施例3-5の順に同製法にて反応を繰り返すことで、上記化合物(p8)(ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100PA)を得た。収量0.4g。分子量は表1に示す。HPLC:アミン純度90%。NMR(CDCl):0.90ppm(t、18H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.48ppm(broad、3H)、1.62ppm(t、3H)、1.71ppm(m、3H)、1.82ppm(m、6H)、3.12ppm(m、6H)、3.19ppm(d、6H)、3.34ppm(m、6H)、3.38ppm(s、3H、-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.64ppm(m、約3,600H、-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.10ppm(m、8H)、4.34ppm(m、3H)、4.50ppm(q、3H)、6.46ppm(broad、3H)、6.94ppm(broad、3H)、7.08ppm(broad、3H)、7.27ppm(m、15H、-NH-CO-CH-CH
[実施例4]
化合物(p14)(ME-200G(Cit)V-200PA)の合成
Figure 0007205827000087
[実施例4-1]
Figure 0007205827000088
N末端を9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc基)で保護したL-バリル-L-シトルリル-グリシン(Fmoc-Val-(Cit)-Gly)(0.299g、5.4×10-4モル、GenScript Biotech社製)と末端にプロピルアミノ基を有するメトキシPEG(2.7g、1.3×10-4モル、平均分子量=約21,000、日油株式会社製「SUNBRIGHT MEPA-20T」)に脱水N,N’-ジメチルホルムアミド(27g)を添加し、30℃で加温溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン(172μL、1.0×10-3モル、関東化学(株)製)と(1-シアノ-2-エトキシ-2-オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ-モルホリノ-カルベニウムヘキサフルオロリン酸塩(COMU)(0.289g、6.810-4モル、シグマアルドリッチ社製)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で1時間反応させた。反応終了後、クロロホルム(270g)で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(108g)を添加し、室温にて15分攪拌して洗浄を行った。水層と有機層を分離後、再度、有機層に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(108g)を添加し、室温にて15分攪拌して洗浄を行い、有機層を回収した。得られた有機層に硫酸マグネシウム(2.7g)を添加し、30分攪拌して脱水した後、5Aろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を40℃にて濃縮し、濃縮物に酢酸エチル(108g)を添加して均一になるように攪拌した後、ヘキサン(54g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル(108g)に溶解し、室温にてヘキサン(54g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン(54g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p15)(ME-200G(Cit)V-Fmoc)を得た。収量2.3g。
NMR(d-DMSO):0.84ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH )、0.85ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH )、1.37ppm(m、2H)、1.52ppm(m、1H)、1.63ppm(m、3H)、1.98ppm(m、1H、-O-CO-NH-CH-C(CH)、2.93ppm(m、4H)、3.09ppm(m、2H、-NH-CH-CH-CHCH -NH-CO-NH)、3.24ppm(s、3H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.48ppm(m、約1,900H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH)、3.89ppm(m、2H)、4.25ppm(m、3H、-NH-CO-O-CH -CH<)、5.35ppm(broad、2H、-NH-CH-CH-CH-CH-NH-CO-NH )、5.91ppm(broad、1H)、7.33ppm(t、2H、Ar)、7.41ppm(m、3H、Ar)、7.73ppm(m、3H、Ar)、7.89ppm(d、2H、Ar)、8.10ppm(d、1H)、8.20ppm(broad、1H)
[実施例4-2]
Figure 0007205827000089
実施例4-1で得られたME-200G(Cit)V-Fmoc(2.1g、1.0×10-4モル)にN,N’-ジメチルホルムアミド(12.6g)を添加し、30℃で加温溶解した。ピペリジン(0.66g、7.8×10-3モル、和光純薬工業(株)製)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で2時間反応させた。反応終了後、酢酸エチル(150g)を加えて均一になるまで攪拌し、ヘキサン(75g)を添加して、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル(150g)に溶解し、ヘキサン(75g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン(75g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p16)(ME-200G(Cit)V-NH )を得た。収量1.8g。
NMR(d-DMSO):0.77ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH )、0.87ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH )、1.35ppm(m、2H)、1.51ppm(m、1H)、1.64ppm(m、4H)、1.93ppm(m、1H、-O-CO-NH-CH-C(CH)、2.96ppm(m、4H)、3.10ppm(m、2H、-NH-CH-CH-CHCH -NH-CO-NH)、3.24ppm(s、3H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH 、)、3.48ppm(m、約1,900H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH)、4.21ppm(broad、1H)、5.34ppm(broad、2H、-NH-CH-CH-CH-CH-NH-CO-NH )、5.91ppm(broad、1H)、7.73ppm(t、1H)、8.08ppm(broad、1H)、8.23ppm(t、1H)
[実施例4-3]
Figure 0007205827000090
実施例4-2で得られたME-200G(Cit)V-NH(1.2g、5.7×10-5モル)をクロロホルム(7.2g)に溶解した後、トリエチルアミン(9.2μL、6.7×10-5モル、関東化学(株)製)と、片末端にtert-ブトキシカルボニル基で保護したプロピルアミノ基を有し、もう片末端に炭酸スクシンイミジル基を有するヘテロ二官能PEG(1.2g、5.2×10-5モル、平均分子量=約23,000、日油株式会社製「SUNBRIGHT BO-200TS」)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で2時間反応させた。反応後、40℃にて濃縮し、得られた濃縮物に酢酸エチル(120g)を添加して溶解した後、ヘキサン(60g)を加えて室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した。得られた析出物をヘキサン(12g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p17)(ME-200G(Cit)V-200Boc)を得た。収量2.1g。
NMR(CDCl):0.96ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH )、1.01ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH )、1.44ppm(s、9H、-CH-CH-CH-NH-CO-O-C(CH )、1.59ppm(m、2H)、1.76ppm(m、3H)、1.82ppm(q、2H)、1.92ppm(m、1H)、3.09ppm(m、1H)、3.23ppm(m、2H、-NH-CH-CH-CHCH -NH-CO-NH)、3.38ppm(s、3H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.64ppm(m、約3,800H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.07ppm(dd、1H)、4.15ppm(m、2H)、4.31ppm(m、1H)、4.38ppm(m、1H)、5.02ppm(broad、1H)、5.24ppm(broad、2H、-NH-CH-CH-CH-CH-NH-CO-NH )、5.74ppm(broad、1H)、5.81ppm(d、1H)、7.05ppm(broad、1H)、7.46ppm(broad、1H)、8.30ppm(broad、1H)
[実施例4-4]
Figure 0007205827000091
実施例4-3で得られたME-200G(Cit)V-200Boc(2.0g、4.5×10-5モル)をジクロロメタン(10g)に溶解し、メタンスルホン酸(291μL、4.5×10-3モル、関東化学(株)製)を加えて、室温にて窒素雰囲気下で2時間反応させた。その後、反応液をトルエン(20g)で希釈し、イオン交換水(20g)を加えて、室温にて15分攪拌し、水層に生成物を抽出した。特開2014-208786に記載の条件に従い、1mol/L塩酸を用いて水層のpHを2.0に調整し、トルエンとクロロホルム混合溶液で水層を洗浄して、アミノ基を持たないポリエチレングリコール不純物を除去した。続いて水層に1mol/L水酸化ナトリウム水溶液を適量添加し、pH12に調整した後、塩化ナトリウム(5.0g)を溶解した。そこに、クロロホルム(10g)を添加し、室温にて15分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。水層と有機層を分離した後、水層に再度クロロホルム(10g)を添加し、室温にて15分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出1回目と2回目で得られた有機層を40℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル(100g)を添加した。得られた酢酸エチル溶液に、硫酸ナトリウム(2.0g)を加えて、30℃で15分撹拌した後、5Aろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン(50g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン(20g)で析出物を洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p14)(ME-200G(Cit)V-200PA)を得た。収量1.7g。分子量は表1に示す。HPLC:アミン純度92%。
NMR(CDCl):0.96ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH )、1.01ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH )、1.60ppm(m、2H)、1.75ppm(m、3H)、1.82ppm(m、2H)、1.93ppm(m、1H)、2.23ppm(m、1H)、2.82ppm(t、2H、-CH-CH-CHNH )、3.10ppm(m、1H)、3.30ppm(m、2H)、3.38ppm(m、4H)、3.64ppm(m、約3,800H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、3.95ppm(m、1H)、4.07ppm(dd、1H)、4.15ppm(m、1H)、4.31ppm(m、1H)、4.38ppm(m、1H)、5.24ppm(broad、2H、-NH-CH-CH-CH-CH-NH-CO-NH )、5.79ppm(broad、1H)、5.82ppm(broad、1H)、7.06ppm(broad、1H)、7.48ppm(broad、1H)、8.31ppm(broad、1H)
[実施例5]
化合物(p18)(ME-200G(Cit)V-200MA)の合成
Figure 0007205827000092
実施例4-4で得られたME-200G(Cit)V-200PA(0.2g、4.5×10-6モル)にトルエン(1.1g)とアセトニトリル(0.16g)を添加し40℃で加温溶解した。得られた溶液にN-メチルモルホリン(2.5μL、2.2×10-5モル、関東化学(株)製)とN-スクシンイミジル-3-マレイミドプロピオネート(1.8mg、6.8×10-6モル、(株)大阪合成有機化学研究所製)を添加し、40℃、窒素雰囲気下で1時間反応させた。反応溶液に酢酸エチル(6.0g)を添加し、均一になるまで攪拌した後、17℃でヘキサン(8.0g)を加えて、17℃にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン(8.0g)で析出物を洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p18)(ME-200G(Cit)V-200MA)を得た。収量0.12g。分子量は表1に示す。マレイミド純度は88%(H-NMR)。
NMR(CDCl):0.96ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH )、1.01ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH )、1.59ppm(broad、2H)、1.76ppm(m、5H)、2.46ppm(t、2H、-CH-CHCH -NH-CO-CH-CH-CNO)、3.12ppm(m、1H)、3.34ppm(m、5H)、3.64ppm(m、約3,800H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.02ppm(m、1H)、4.13ppm(m、1H)、4.28ppm(m、1H)、4.37ppm(m、1H)、5.86ppm(broad、1H)、6.42ppm(broad、1H)、6.68ppm(s、2H、-CH-CH-CH-NH-CO-CH-CH NO )、7.04ppm(broad、1H)、7.46ppm(broad、1H)、8.20ppm(broad、1H)
[実施例6]
化合物(p19)(ME-200GGG-200PA)の合成
Figure 0007205827000093
[実施例6-1]
Figure 0007205827000094
グリシル-グリシル-グリシン(2.0g、1.1×10-2モル、関東化学(株)製)にイオン交換水(60g)と炭酸水素ナトリウム(4.5g)を加えて溶解した後、テトラヒドロフラン(60g)とジ-tert-ブチルジカーボネート(BocO)(4.6g、2.1×10-2モル、東京化成工業(株)製)を添加し、40℃で23時間反応させた。反応溶液に水(120g)を添加し、5℃まで冷却した後、リン酸を適量加えて、pHを7に調整し、ヘキサン(120g)を加えて室温で15分攪拌した。有機層と水層を分離後、水層に再度ヘキサン(120g)を加えて室温で15分攪拌した。水層を回収後、エタノール(100g)を加えて50℃で濃縮し、再度エタノール(100g)を加えて50℃で濃縮した。得られた濃縮物にエタノール(100g)を添加し、50℃で加温溶解した後、5Aろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を50℃で濃縮した後、真空乾燥し、Boc-グリシル-グリシル-グリシンを得た。収量1.5g。
NMR(DO):1.45ppm(s、9H、-NH-CO-O-C(CH )、3.78ppm(s、2H、-CH -NH-CO-O-C(CH)、3.84ppm(s、2H、-CO-NH-CH -COOH)、4.00ppm(s、2H、-CO-NH-CH -CO-NH-)
[実施例6-2]
Figure 0007205827000095
Boc-グリシル-グリシル-グリシン(0.174g、6.0×10-4モル)と末端にプロピルアミノ基を有するメトキシPEG(3.0g、1.4×10-4モル、平均分子量=約21,000、日油株式会社製「SUNBRIGHT MEPA-20T」)に脱水N,N’-ジメチルホルムアミド(27g)を添加し、30℃で加温溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン(191μL、1.1×10-3モル、関東化学(株)製)と(1-シアノ-2-エトキシ-2-オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ-モルホリノ-カルベニウムヘキサフルオロリン酸塩(COMU)(0.321g、7.5×10-4モル、シグマアルドリッチ社製)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で1時間反応させた。反応終了後、クロロホルム(300g)で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(120g)を添加し、室温にて15分攪拌して洗浄を行った。水層と有機層を分離後、再度、有機層に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(120g)を添加し、室温にて15分攪拌して洗浄を行った後、有機層を回収した。得られたクロロホルム溶液に硫酸マグネシウム(3.0g)を添加し、30分攪拌して脱水した後、5Aろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を40℃にて濃縮し、濃縮物に酢酸エチル(120g)を添加して均一になるように攪拌した後、ヘキサン(60g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル(120g)に溶解し、ヘキサン(60g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン(60g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p21)(ME-200GGG-Boc)を得た。収量2.6g。
NMR(CDCl):1.45ppm(s、9H、-NH-CO-O-C(CH )、1.80ppm(m、2H、-CO-NH-CHCH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH)、3.38ppm(m、5H)、3.64ppm(m、約1,900H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH)、3.86ppm(d、2H、-CH -NH-CO-O-C(CH)、3.91ppm(d、2H)、3.99ppm(d、2H)、5.69ppm(broad、1H)、7.10ppm(broad、1H)、7.44ppm(broad、2H)
[実施例6-3]
Figure 0007205827000096
実施例6-2で得られたME-200GGG-Boc(2.4g、1.1×10-4モル)をジクロロメタン(12g)に溶解し、メタンスルホン酸(723μL、1.1×10-2モル、関東化学(株)製)を加えて、室温にて窒素雰囲気下で2時間反応させた。その後、反応液をトルエン(24g)で希釈し、イオン交換水(24g)を加えて、室温にて15分攪拌し、水層に生成物を抽出した。得られた水層に1mol/L水酸化ナトリウム水溶液を適量添加し、pHを12に調整した後、塩化ナトリウム(6.0g)を溶解した。そこに、クロロホルム(12g)を添加し、室温にて15分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。水層と有機層を分離した後、水層に再度クロロホルム(12g)を添加し、室温にて15分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出1回目と2回目で得られた有機層を40℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル(120g)を添加した。得られた酢酸エチル溶液に、硫酸ナトリウム(2.4g)を加えて、30℃で15分撹拌した後、5Aろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン(60g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン(24g)で析出物を洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p22)(ME-200GGG-NH )を得た。収量2.2g。
NMR(CDCl):1.53ppm(broad、1H)、1.79ppm(m、2H、-CO-NH-CHCH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH)、3.38ppm(m、5H)、3.64ppm(m、約1,900H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH)、3.92ppm(d、2H)、4.01ppm(broad、1H)、7.06ppm(broad、1H)、7.24ppm(broad、1H)、7.86ppm(broad、1H)
[実施例6-4]
Figure 0007205827000097
実施例6-3で得られたME-200GGG-NH(1.5g、7.1×10-5モル)をクロロホルム(7.5g)に溶解した後、トリエチルアミン(11.6μL、8.4×10-5モル、関東化学(株)製)と、片末端にtert-ブトキシカルボニル基で保護したプロピルアミノ基を有し、もう片末端に炭酸スクシンイミジル基を有するヘテロ二官能PEG(1.8g、7.8×10-5モル、平均分子量=約23,000、日油株式会社製「SUNBRIGHT BO-200TS」)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で2時間反応させた。反応後、40℃にて濃縮し、得られた濃縮物に酢酸エチル(150g)を添加して溶解した後、ヘキサン(75g)を加えて室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した。得られた析出物をヘキサン(75g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p23)(ME-200GGG-200Boc)を得た。収量3.0g。
NMR(CDCl):1.44ppm(s、9H、-CH-CH-CH-NH-CO-O-C(CH )、1.78ppm(m、4H、-CO-NH-CHCH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH、-CHCH -CH-NH-CO-O-C(CH)、3.23ppm(m、2H、-CH-CHCH -NH-CO-O-C(CH)、3.35ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.65ppm(m、約3,800H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、3.97ppm(d、2H)、4.23ppm(broad、2H、-NH-CO-O-CH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH-CH-)、5.01ppm(broad、1H)、6.21ppm(broad、1H)、7.00ppm(broad、1H)、7.47ppm(broad、1H)、7.61ppm(broad、1H)
[実施例6-5]
Figure 0007205827000098
実施例6-4で得られたME-200GGG-200Boc(2.5g、5.8×10-5モル)をジクロロメタン(12.5g)に溶解し、メタンスルホン酸(365μL、5.6×10-3モル、関東化学(株)製)を加えて、室温にて窒素雰囲気下で2時間反応させた。その後、反応液をトルエン(25g)で希釈し、イオン交換水(25g)を加えて、室温にて15分攪拌し、水層に生成物を抽出した。特開2014-208786に記載の条件に従い、1mol/L塩酸を用いて水層のpHを2.0に調整し、トルエンとクロロホルム混合溶液で水層を洗浄して、アミノ基を持たないポリエチレングリコール不純物を除去した。続いて水層に1mol/L水酸化ナトリウム水溶液を適量添加し、pH12に調整した後、塩化ナトリウム(6.3g)を溶解した。そこに、クロロホルム(12.5g)を添加し、室温にて15分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。水層と有機層を分離した後、水層に再度クロロホルム(12.5g)を添加し、室温にて15分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出1回目と2回目で得られた有機層を40℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル(125g)を添加した。得られた酢酸エチル溶液に、硫酸ナトリウム(2.5g)を加えて、30℃で15分撹拌した後、5Aろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン(62.5g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン(25g)で析出物を洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p19)(ME-200GGG-200PA)を得た。収量2.4g。分子量は表1に示す。HPLC:アミン純度91%。
NMR(CDCl):1.79ppm(m、4H、-CO-NH-CHCH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH、-CHCH -CH-NH)、2.91ppm(broad、2H)、3.37ppm(m、5H)、3.65ppm(m、約3,800H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、3.90ppm(t、3H)、3.97ppm(d、2H)、4.23ppm(broad、2H、-NH-CO-O-CH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH-CH-)、6.19ppm(broad、1H)、7.00ppm(broad、1H)、7.45ppm(broad、1H)、7.61ppm(broad、1H)
[実施例7]
化合物(p24)(ME-200GF-200PA)の合成
Figure 0007205827000099
[実施例7-1]
Figure 0007205827000100
N末端を9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc基)で保護したL-フェニルアラニル-グリシン(Fmoc-Phe-Gly)(0.533g、1.2×10-3モル、渡辺化学工業(株)製)と末端にプロピルアミノ基を有するメトキシPEG(6.0g、2.9×10-4モル、平均分子量=約21,000、日油株式会社製「SUNBRIGHT MEPA-20T」)に脱水N,N’-ジメチルホルムアミド(60g)を添加し、30℃で加温溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン(383μL、2.3×10-3モル、関東化学(株)製)と(1-シアノ-2-エトキシ-2-オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ-モルホリノ-カルベニウムヘキサフルオロリン酸塩(COMU)(0.642g、1.5×10-3モル、シグマアルドリッチ社製)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で1時間反応させた。反応終了後、クロロホルム(600g)で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(240g)を添加し、室温にて15分攪拌して洗浄を行った。水層と有機層を分離後、再度、有機層に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(240g)を添加し、室温にて15分攪拌して洗浄を行い、有機層を回収した。得られたクロロホルム溶液に硫酸マグネシウム(2.4g)を添加し、30分攪拌して脱水した後、5Aろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を40℃にて濃縮し、濃縮物に酢酸エチル(240g)を添加して均一になるように攪拌した後、ヘキサン(120g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル(240g)に溶解し、ヘキサン(120g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン(120g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p25)(ME-200GF-Fmoc)を得た。収量5.1g。
NMR(d-DMSO):1.62ppm(m、2H、-CO-NH-CHCH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH)、2.80ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH -C)、3.04ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH -C)、3.10ppm(m、2H、-CO-NH-CH -CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH)、3.24ppm(s、3H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.48ppm(m、約1,900H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH)、4.20ppm(m、4H)、7.33ppm(m、9H)、7.66ppm(m、4H、Ar)、7.88ppm(d、2H、Ar)、8.27ppm(t、1H)
[実施例7-2]
Figure 0007205827000101
実施例7-1で得られたME-200GF-Fmoc(4.9g、2.3×10-4モル)にN,N’-ジメチルホルムアミド(29.4g)を添加し、30℃で加温溶解した。ピペリジン(1.55g、1.8×10-2モル、和光純薬工業(株)製)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で2時間反応させた。反応終了後、酢酸エチル(300g)を加えて均一になるまで攪拌し、ヘキサン(150g)を添加して、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル(300g)に溶解し、ヘキサン(150g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン(150g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p26)(ME-200GF-NH )を得た。収量3.9g。
NMR(d-DMSO):1.62ppm(m、2H、-CO-NH-CHCH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH)、1.64ppm(broad、1H)、2.59ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH -C)、2.98ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH -C)、3.10ppm(q、2H、-CO-NH-CH -CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH)、3.24ppm(s、3H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.48ppm(m、約1,900H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH)、7.24ppm(m、6H、-NH-CO-CH-CH 、-NH-)、7.73ppm(t、1H)、8.12ppm(broad、1H)
[実施例7-3]
Figure 0007205827000102
実施例7-2で得られたME-200GF-NH(0.98g、4.7×10-5モル)をクロロホルム(4.9g)に溶解した後、トリエチルアミン(7.5μL、5.4×10-5モル、関東化学(株)製)と、片末端にtert-ブトキシカルボニル基で保護したプロピルアミノ基を有し、もう片末端に炭酸スクシンイミジル基を有するヘテロ二官能PEG(1.3g、6.2×10-5モル、平均分子量=約23,000、日油株式会社製「SUNBRIGHT BO-200TS」)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で2時間反応させた。反応後、40℃にて濃縮し、得られた濃縮物に酢酸エチル(98g)を添加して溶解した後、ヘキサン(49g)を加えて室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した。得られた析出物をヘキサン(49g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p27)(ME-200GF-200Boc)を得た。収量2.0g。
NMR(CDCl):1.44ppm(s、9H、-CH-CH-CH-NH-CO-O-C(CH )、1.77ppm(m、4H、-CO-NH-CHCH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH、-CHCH -CH-NH-CO-O-C(CH)、3.02ppm(m、1H)、3.21ppm(m、3H)、3.36ppm(m、4H)、3.65ppm(m、約3,800H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.18ppm(m、2H、-NH-CO-O-CH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH-CH-)、4.39ppm(q、1H、-NH-CO-CH-CH-C)、5.03ppm(broad、1H)、5.55ppm(d、1H)、6.86ppm(broad、1H)、7.02ppm(broad、1H)、7.25ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH
[実施例7-4]
Figure 0007205827000103
実施例7-3で得られたME-200GF-200Boc(1.8g、4.1×10-5モル)をジクロロメタン(9.0g)に溶解し、メタンスルホン酸(262μL、4.3×10-3モル、関東化学(株)製)を加えて、室温にて窒素雰囲気下で2時間反応させた。その後、反応液をトルエン(18g)で希釈し、イオン交換水(18g)を加えて、室温にて15分攪拌し、水層に生成物を抽出した。特開2014-208786に記載の条件に従い、1mol/L塩酸を用いて水層のpHを2.0に調整し、トルエンとクロロホルム混合溶液で水層を洗浄して、アミノ基を持たないポリエチレングリコール不純物を除去した。続いて水層に1mol/L水酸化ナトリウム水溶液を適量添加し、pH12に調整した後、塩化ナトリウム(4.5g)を溶解した。そこに、クロロホルム(18g)を添加し、室温にて15分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。水層と有機層を分離した後、水層に再度クロロホルム(18g)を添加し、室温にて15分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出1回目と2回目で得られた有機層を40℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル(90g)を添加した。得られた酢酸エチル溶液に、硫酸ナトリウム(1.8g)を加えて、30℃で15分撹拌した後、5Aろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン(45g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン(18g)で析出物を洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p24)(ME-200GF-200PA)を得た。収量1.7g。分子量は表1に示す。HPLC:アミン純度87%。
NMR(CDCl):1.77ppm(m、4H、-CO-NH-CHCH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH、-CHCH -CH-NH)、2.87ppm(m、2H)、3.07ppm(m、1H)、3.30ppm(m、3H)、3.38ppm(s、3H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.64ppm(m、約3,800H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.18ppm(m、2H、-NH-CO-O-CH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH-CH-)、4.32ppm(q、1H、-NH-CO-CH-CH-C)、5.56ppm(broad、1H)、6.83ppm(broad、1H)、6.96ppm(broad、1H)、7.25ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH
[実施例8]
化合物(p28)(ME-200GAV-200PA)の合成
Figure 0007205827000104
実施例4と同製法にて、N末端を9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc基)で保護したL-バリン-L-アラニン-グリシン(Fmoc-Val-Ala-Gly)を原料に使用し、上記化合物(p28)(ME-200GAV-200PA)を得た。収量1.0g。分子量は表1に示す。HPLC:アミン純度90%。
NMR(d-DMSO):0.82ppm(dd、6H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.21ppm(d、3H、-NH-CO-CH(CH)-)、1.62ppm(m、4H、-CO-NH-CHCH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH、-CHCH -CH-NH)、1.95ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.60ppm(m、約3,800H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.05ppm(m、2H)、4.22ppm(m、1H)、7.24ppm(broad、1H)、7.69ppm(broad、1H)、8.10ppm(broad、2H)
[実施例9]
化合物(p29)(ME-200GFGG-200PA)の合成
Figure 0007205827000105
実施例4と同製法にて、N末端を9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc基)で保護したグリシン-グリシン-L-フェニルアラニン-グリシン(Fmoc-Gly-Gly-Phe-Gly)を原料に使用し、上記化合物(p29)(ME-200GFGG-200PA)を得た。収量1.2g。分子量は表1に示す。HPLC:アミン純度91%。
NMR(d-DMSO):1.62ppm(m、4H、-CO-NH-CHCH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH、-CHCH -CH-NH)、2.80ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.60ppm(m、約3,800H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.05ppm(m、2H)、4.47ppm(m、1H)、7.20ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH )、7.43ppm(broad、1H)、7.62ppm(broad、1H)、8.00ppm(broad、1H)、8.12ppm(broad、1H)、8.24ppm(broad、1H)
[実施例10]
化合物(p30)(ME-200GFG-200PA)の合成
Figure 0007205827000106
実施例4と同製法にて、N末端を9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc基)で保護したグリシン-L-フェニルアラニン-グリシン(Fmoc-Gly-Phe-Gly)を原料に使用し、上記化合物(p30)(ME-200GFG-200PA)を得た。収量1.1g。分子量は表1に示す。HPLC:アミン純度89%。
NMR(d-DMSO):1.62ppm(m、4H、-CO-NH-CHCH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH、-CHCH -CH-NH)、2.80ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.60ppm(m、約3,800H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.05ppm(m、2H)、4.47ppm(m、1H)、7.20ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH )、7.34ppm(broad、1H)、7.64ppm(broad、1H)、8.10ppm(broad、1H)、8.30ppm(broad、1H)
[実施例11]
化合物(p31)(ME-200GF-200PA(amide))の合成
Figure 0007205827000107
実施例7と同製法にて、N末端を9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc基)で保護したL-フェニルアラニル-グリシン(Fmoc-Phe-Gly)、片末端にtert-ブトキシカルボニル基で保護したプロピルアミノ基、もう片末端にヘキサン酸N-スクシンイミジル活性エステルを有するヘテロ二官能PEG(平均分子量=約21,000、日油株式会社製「SUNBRIGHT BO-200HS」)を原料に使用し、実施例7のウレタン結合ではなく、アミド結合でヘテロ二官能PEGを導入した上記化合物(p31)(ME-200GF-200PA(amide))を得た。収量1.0g。分子量は表1に示す。HPLC:アミン純度91%。
NMR(d-DMSO):1.11ppm(m、2H、-NH-CO-CH-CHCH -CH-CH-O-(CH-CH-O)n-)、1.38ppm(m、2H、-NH-CO-CHCH -CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-)、1.62ppm(m、6H、-NH-CO-CH-CH-CHCH -CH-O-(CH-CH-O)n-、-CO-NH-CHCH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH、-CHCH -CH-NH)、2.02ppm(m、2H、-NH-CO-CH -CH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-)、2.80ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.60ppm(m、約3,800H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.47ppm(m、1H)、7.20ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH )、7.26ppm(broad、1H)、7.64ppm(broad、1H)、8.10ppm(broad、1H)、8.30ppm(broad、1H)
[実施例12]
化合物(p32)(ME-200GLFG(D)-200PA)の合成
Figure 0007205827000108
実施例1と同製法にて、N末端をtert-ブトキシカルボニル基(Boc基)で保護したグリシン-D-フェニルアラニン-D-ロイシン-グリシンを原料に使用し、光学異性体であるD型のアミノ酸を有した上記化合物(p32)(ME-200GLFG(D)-200PA)を得た。収量1.1g。分子量は表1に示す。HPLC:アミン純度93%。
NMR(CDCl):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.48ppm(broad、1H)、1.62ppm(t、1H)、1.71ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、3.12ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.64ppm(m、約3,800H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.10ppm(m、2H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH
[実施例13]
化合物(p34)(LY-(ME-100GLFG(L)-100) -PA)の合成
Figure 0007205827000109
[実施例13-1]
Figure 0007205827000110
N末端をtert-ブトキシカルボニル基(Boc基)で保護したグリシル-L-フェニルアラニル-L-ロイシル-グリシン(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)(0.438g、8.8×10-4モル、GenScript Biotech社製)とN-ヒドロキシスクシンイミド(0.128g、1.1×10-3モル、みどり化学(株)製)を脱水N,N’-ジメチルホルムアミド(1.0g)に溶解後、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド(0.229g、1.1×10-3モル、タマ化学工業(株)製)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で1時間反応させた。脱水N,N’-ジメチルホルムアミド(3.0g)を添加して希釈した後、末端にプロピルアミノ基を有するメトキシPEG(2.0g、2.2×10-4モル、平均分子量=約9,000、日油株式会社製「SUNBRIGHT MEPA-10T」)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で1時間反応させた。その後、酢酸エチル(20g)を加えて反応液を希釈し、LS100ろ紙を敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。ろ液に酢酸エチル(30g)を加えて、均一になるように攪拌した後、ヘキサン(25g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル(50g)に溶解し、ヘキサン(25g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させた。5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン(25g)で洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物(p35)(ME-100GLFG(L)-Boc)を得た。収量1.8g。
NMR(CDCl):0.89ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、0.92ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.36ppm(s、9H、-NH-CO-O-C(CH )1.48ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH -CH(CH)、1.55ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH -CH(CH)、1.80ppm(m、3H)、3.13ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH -C)、3.21ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH -C)、3.33ppm(m、2H、-CO-NH-CH -CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.65ppm(m、約820H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH)、3.91ppm(t、1H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH)、4.43ppm(broad、1H)、4.55ppm(q、1H、-NH-CO-CH-CH-C)、5.77ppm(broad、1H)、6.76ppm(broad、1H)、6.86ppm(broad、1H)、6.90ppm(broad、1H)、7.14ppm(broad、1H)、7.20ppm(d、2H、-NH-CO-CH-CH )、7.32ppm(m、3H、-NH-CO-CH-CH
[実施例13-2]
Figure 0007205827000111
実施例13-1で得られたME-100GLFG(L)-Boc(1.8g、2.0×10-4モル)をジクロロメタン(9.0g)に溶解し、メタンスルホン酸(1.3mL、2.0×10-2モル、関東化学(株)製)を加えて、室温にて窒素雰囲気下で2時間反応させた。その後、反応液をトルエン(18g)で希釈し、イオン交換水(18g)を加えて、室温にて15分攪拌し、水層に生成物を抽出した。得られた水層に1mol/L水酸化ナトリウム水溶液を適量添加し、pHを12に調整した後、塩化ナトリウム(4.5g)を溶解した。そこに、クロロホルム(18g)を添加し、室温にて15分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。水層と有機層を分離した後、水層に再度クロロホルム(18g)を添加し、室温にて15分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出1回目と2回目で得られた有機層を40℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル(36g)を添加した。得られた酢酸エチル溶液に、硫酸ナトリウム(0.90g)を加えて、30℃で15分撹拌した後、5Aろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン(18g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン(18g)で析出物を洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p36)(ME-100GLFG(L)-NH )を得た。収量1.4g。
NMR(CDCl):0.89ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、0.91ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.53ppm(m、2H、-NH-CO-CH-CH -CH(CH)、1,70ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CHCH(CH)、1.80ppm(m、2H、-CO-NH-CHCH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH)、3.10ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH -C)、3.18ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH -C)、3.33ppm(m、7H)、3.74ppm(m、約820H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH)、4.31ppm(broad、1H)、4.55ppm(t、1H、-NH-CO-CH-CH-C)、6.91ppm(broad、1H)、7.00ppm(broad、1H)、7.28ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH )、7.98ppm(broad、1H)
[実施例13-3]
Figure 0007205827000112
非特許文献(Bioconjugate Chem.,21(2010),pp.248-254)などに記載の製法を用いて合成した片末端にテトラヒドロピラニル基、片末端にヒドロキシ基を有するヘテロ二官能PEG(5g、6.0×10-5モル)をジクロロメタン(12g)に溶解後、炭酸ジ(N-スクシンイミジル)(0.513g、2.0×10-3モル、東京化成工業(株)製)とピリジン(243μL、3.0×10-3モル、関東化学(株)製)を添加し、27℃にて窒素雰囲気下で7時間反応させた。その後、反応液をジクロロメタン(20g)で希釈して5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、得られたろ液に2,6-ジtertブチル-p-クレゾール(4.3mg)を加えて5分間攪拌した。その後、5wt% 塩化ナトリウム水溶液(6g、pH5)を加えて、室温にて15分攪拌して洗浄を行った。水層と有機層に分離した後、有機層に硫酸マグネシウム(1.0g)を加えて、室温で30分撹拌した後、5Aろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を35℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル(50g)を添加して溶解した。溶解後、ヘキサン(25g)を加えて、室温にて30分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した。得られた析出物にヘキサン(25g)を加えて30分間攪拌し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p37)(THP-10TS)を得た。収量4.3g。
NMR(CDCl):1.52ppm(m、2H、-tetrahydropyranyl)、1.59ppm(m、2H、-tetrahydropyranyl)、1.73ppm(m、1H、-tetrahydropyranyl)、1.85ppm(m、1H、-tetrahydropyranyl)、2.85ppm(t、4H、-succinimide)、3.64ppm(m、約820H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、3.80ppm(m、2H)、3.88ppm(m、2H、-tetrahydropyranyl)、4.47ppm(m、2H)、4.64ppm(t、1H、-tetrahydropyranyl
[実施例13-4]
Figure 0007205827000113
実施例13-2で得られたME-100GLFG(L)-NH(3.64g、3.4×10-4モル)をクロロホルム(17g)に溶解した後、トリエチルアミン(56.5μL、4.1×10-4モル、関東化学(株))と、実施例13-3で得られたTHP-10TS(2.80g、3.1×10-4モル)を添加し、室温にて窒素雰囲気下で2時間反応させた。反応後、40℃にて濃縮し、得られた濃縮物に0.1mol/Lクエン酸ナトリウム水溶液(120g、pH2.5)を加えて溶解した後、室温にて窒素雰囲気下で4時間反応させた。反応後、クロロホルム(50g)と2,6-ジtertブチル-p-クレゾール(5.0mg)を加えて10分間攪拌した。水層と有機層に分離した後、有機層に硫酸マグネシウム(3.2g)を加えて、40℃で30分撹拌した後、5Aろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル(50g)を添加して溶解した。溶解後、ヘキサン(25g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した。得られた析出物にヘキサン(25g)を加えて15分間攪拌し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p38)(ME-100GLFG(L)-100HO)を得た。収量5.30g。
NMR(CDCl):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.48ppm(broad、1H)、1.62ppm(t、1H)、1.71ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.64ppm(m、約820H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.10ppm(m、2H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH
[実施例13-5]
Figure 0007205827000114
実施例13-4で得られたME-100GLFG(L)-100HO(5.0g、2.8×10-4モル)をジクロロメタン(12g)に溶解後、炭酸ジ(N-スクシンイミジル)(0.285g、1.1×10-3モル、東京化成工業(株)製)とピリジン(135μL、1.7×10-3モル、関東化学(株)製)を添加し、27℃にて窒素雰囲気下で7時間反応させた。その後、反応液をジクロロメタン(20g)で希釈して5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、得られたろ液に2,6-ジtertブチル:4-p-クレゾール(4.3mg)を加えて5分間攪拌した。その後、5wt% 塩化ナトリウム水溶液(6g、pH5)を加えて、室温にて15分攪拌して洗浄を行った。水層と有機層に分離した後、有機層に硫酸マグネシウム(1.0g)を加えて、室温で30分撹拌した後、5Aろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を35℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル(50g)を添加して溶解した。溶解後、ヘキサン(25g)を加えて、室温にて30分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した。得られた析出物にヘキサン(25g)を加えて30分間攪拌し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p39)(ME-100GLFG(L)-100TS)を得た。収量4.2g。
NMR(CDCl):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.44ppm(s、9H、-CH-CH-CH-NH-CO-O-C(CH )、1.64ppm(m、1H)、1.76ppm(m、5H)、2.85ppm(t、4H、-succinimide)、3.20ppm(m、4H)、3.33ppm(m、2H、-CO-NH-CH -CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.64ppm(m、約820H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.10ppm(m、2H、-NH-CO-O-CH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH-CH-)、4.32ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、5.02ppm(broad、1H)、6.45ppm(broad、1H)、6.93ppm(broad、1H)、7.06ppm(broad、1H)、7.13ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH
[実施例13-6]
Figure 0007205827000115
実施例13-5で得られたME-100GLFG(L)-100TS(3.6g、2.0×10-4モル)をN,N’-ジメチルホルムアミド(7.0g)に溶解し、L-リシンエチルエステル・2塩酸塩(26mg、1.1×10-4モル、シグマアルドリッチ社製)、トリエチルアミン(73mg、7.2×10-4モル)を加えて、窒素雰囲気下で40℃、5時間反応させた。反応液を酢酸エチル(36g)で希釈した後、5Aろ紙を敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン(18g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン(18g)で析出物を洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p40)(LY-(ME-100GLFG(L)-100) -CE)を得た。収量3.1g。
NMR(CDCl):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.28ppm(t、3H、-CO-O-CHCH )、1.36ppm(m、2H)、1.48ppm(broad、1H)、1.52ppm(m、2H)、1.62ppm(t、1H)、1.70ppm(m、2H)、1.82ppm(m、3H)、3.15ppm(q、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、6H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.64ppm(m、約1,600H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.10ppm(m、2H)、4.21ppm(m、6H)、4.34ppm(m、2H)、4.50ppm(q、1H)、4.90ppm(broad、1H)、5.37ppm(d、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH
[実施例13-7]
Figure 0007205827000116
実施例13-6で得られたLY-(ME-100GLFG(L)-100)-CE(1.8g、5.0×10-5モル)を0.13mol/L水酸化ナトリウム水溶液(18g)に溶解し、窒素雰囲気下で室温、3時間反応させた。反応液に塩化ナトリウム(4.5g)を溶解した後、85%りん酸を用いて水層のpHを8.5に調整し、そこに、ジクロロメタン(11g)を添加し、室温にて15分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。水層と有機層を分離した後、水層に再度ジクロロメタン(11g)を添加し、室温にて15分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出1回目と2回目で得られた有機層を40℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル(36g)を添加した。得られた酢酸エチル溶液に、硫酸マグネシウム(0.90g)を加えて、30℃で30分撹拌した後、5Aろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン(18g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン(18g)で析出物を洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p41)(LY-(ME-100GLFG(L)-100) -C2)を得た。収量1.4g。
NMR(CDCl):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.36ppm(m、2H)、1.48ppm(broad、1H)、1.52ppm(m、2H)、1.62ppm(t、1H)、1.70ppm(m、2H)、1.82ppm(m、3H)、3.15ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、6H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.64ppm(m、約1,600H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.10ppm(m、2H)、4.21ppm(m、4H)、4.34ppm(m、2H)、4.50ppm(q、1H)、4.90ppm(broad、1H)、5.37ppm(d、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH
[実施例13-8]
Figure 0007205827000117
実施例13-7で得られたLY-(ME-100GLFG(L)-100)-C2(1.5g、4.0×10-5モル)および2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(1.2mg)をトルエン(6.0g)に溶解し、N-ヒドロキシスクシンイミド(16mg、1.4×10-4モル)、1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(20mg、1.0×10-4モル)を加えて、窒素雰囲気下で40℃、4時間反応させた。次に、N-(tert-ブトキシカルボニル)-1,3-ジアミノプロパンを加えて、窒素雰囲気下で40℃、4時間反応させた。反応液をトルエン(12g)で希釈した後、5Aろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を酢酸エチル(18g)で希釈した後、ヘキサン(18g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン(18g)で析出物を洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p42)(LY-(ME-100GLFG(L)-100) -Boc)を得た。収量1.1g。
NMR(CDCl):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.36ppm(m、2H)、1.44ppm(s、9H)、1.48ppm(broad、1H)、1.52ppm(m、2H)、1.62ppm(m、3H)、1.70ppm(m、2H)、1.82ppm(m、3H)、3.15ppm(m、4H)、3.19ppm(d、2H)、3.29ppm(m、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、6H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.64ppm(m、約1,600H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.10ppm(m、3H)、4.21ppm(m、4H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、5.08ppm(broad、1H)、5.56ppm(d、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH
[実施例13-9]
Figure 0007205827000118
実施例13-8で得られたLY-(ME-100GLFG(L)-100)-Boc(0.90g、2.5×10-5モル)をジクロロメタン(4.5g)に溶解し、メタンスルホン酸(162μL、2.5×10-3モル)を加えて、窒素雰囲気下で室温、2時間反応させた。反応液をトルエン(9.0g)で希釈した後、イオン交換水(23g)を加えて、室温にて15分攪拌し、水層に生成物を抽出した。その後、トルエンとクロロホルム混合溶液で水層を洗浄して、アミノ基を持たないポリエチレングリコール不純物を除去した。続いて水層に1mol/L水酸化ナトリウム水溶液を適量添加し、pH12に調整した後、塩化ナトリウム(2.3g)を溶解した。そこに、クロロホルム(9.0g)を添加し、室温にて15分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。水層と有機層を分離した後、水層に再度クロロホルム(9.0g)を添加し、室温にて15分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出1回目と2回目で得られた有機層を40℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル(36g)を添加した。得られた酢酸エチル溶液に、硫酸ナトリウム(0.90g)を加えて、30℃で30分撹拌した後、5Aろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン(18g)を加えて、室温にて15分攪拌し生成物を析出させ、5Aろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン(18g)で析出物を洗浄し、5Aろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物(p34)(LY-(ME-100GLFG(L)-100) -PA)を得た。収量0.8g。分子量は表1に示す。HPLC:アミン純度92%。
NMR(CDCl):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH-CH(CH )、1.37ppm(m、2H)、1.48ppm(broad、1H)、1.52ppm(m、2H)、1.62ppm(m、3H)、1.70ppm(m、2H)、1.82ppm(m、3H)、2.84ppm(m、2H)、3.15ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、6H、-CO-NH-CH-CH-CH-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.64ppm(m、約1,600H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、4.10ppm(m、3H)、4.21ppm(m、4H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、5.58ppm(broad、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH
[比較例1]
化合物(p33)(ME-200F-200PA)の合成
Figure 0007205827000119
実施例4と同製法にて、N末端を9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc基)で保護したL-フェニルアラニン(Fmoc-Phe)を原料に使用し、上記化合物(p33)(ME-200F-200PA)を得た。収量1.8g。分子量は表1に示す。HPLC:アミン純度92%。
NMR(d-DMSO):1.62ppm(m、4H、-CO-NH-CHCH -CH-O-(CH-CH-O)n-CH、-CHCH -CH-NH)、2.80ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、-O-(CH-CH-O)n-CH )、3.60ppm(m、約3,800H、-NH-CH-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH、-NH-CO-O-CH-CH-O-(CH -CH -O)n-CH-CH-)、3.95ppm(m、2H)、4.13ppm(m、1H)、7.20ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH )、7.38ppm(broad、1H)、7.91ppm(broad、1H)
以上、実施例1~13と比較例1で得られたポリエチレングリコール誘導体の平均分子量を示す。
Figure 0007205827000120
[実施例14]
血清中での安定性試験
1.5mLのエッペンドルフチューブに、マウスまたはヒト血清1mLを加え、各種ポリエチレングリコール誘導体を5.0mg/mLの濃度になるように添加した。37℃で96時間インキュベーション後、200μLをサンプリングし、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、血清中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸等の疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、血清中からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。その後、GPC分析を行い、分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
分解率は以下の式にて算出した。
分解率 = (試験前の40kDaのピーク面積% - 試験後の40kDaのピーク面積%) ÷ (試験前の40kDaのピーク面積%) × 100
結果を以下の表2に示す。
Figure 0007205827000121
本試験より、どの分解性ポリエチレングリコール誘導体も96時間後の分解率が20%以下であり、特にGLFG(L)やG(cit)Vなどは分解率が低く、血中では安定であることを示した。
[実施例15]
細胞を用いた分解性試験
培地RPMI-1640(10%FBS Pn/St)10mLを用いて、100mmディッシュにRAW264.7を10×10cell播種し、37℃で24時間培養後、各種ポリエチレングリコール誘導体を10mg/mLの濃度になるよう溶解した培地に交換し、37℃で96時間培養した。培養後、細胞を1%SDS溶液にて溶解し、PBSにて希釈し、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、細胞溶解液中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸等の疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、細胞内からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
また、細胞培養に使用した培地中での分解を確認するため、各種ポリエチレングリコール誘導体を10mg/mLの濃度になるよう溶解した培地のみで37℃で96時間培養し、上記と同操作にてポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
その後、回収した各種ポリエチレングリコール誘導体のGPC分析を行い、実施例14と同じ計算式にて分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
結果を以下の表3に示す。また、細胞実験の前後のGPCチャートを図1と図2に示す。
Figure 0007205827000122
分解性リンカーとしてオリゴペプチドを有したポリエチレングリコール誘導体においては、細胞内にて効果的に分解し、分子量4万から2万に分解することが確認できた。また、天然に多く存在しないD型のアミノ酸を用いたME-200GLFG(D)-200PAにおいても、分解率は低いが、分解することを確認した。一方で、比較例1のフェニルアラニンをリンカーとして用いたポリエチレングリコール誘導体、および非分解性のメトキシPEGアミン40kDaは、細胞内での分解が確認できなかった。
[実施例16]
動物実験による体内動態試験(放射性同位体)
末端にアミノ基を有した分子量4万である分解性ポリエチレングリコール誘導体であるME-200GLFG(L)-200PAと、非分解性であるメトキシPEGアミン40kDaを、それぞれ0.1mg/mLの濃度になるように50mM炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解し、そこにBolton-Hunter試薬(0.4625MBq)を添加し、ボルテックスにて撹拌後、室温で一晩反応させた。反応溶液をPD-10カラムにて分画し、各フラクションをポリエチレングリコール呈色試薬(チオシアン酸アンモニウムと硝酸コバルト)とガンマカウンターを用いて、125Iの含まれるフラクションを確認し、回収した。
得られた放射性同位体をラベル化したポリエチレングリコール誘導体を用いて、体内動態を動物実験にて評価した。マウス種はBalb/c(8週齢、雄)、ポリエチレングリコール溶液は、生理食塩水を用いてラベル化していないポリエチレングリコール誘導体を50mg/mLの濃度になるように調製し、放射性同位体をラベル化したポリエチレングリコール誘導体を微量添加し、マウス尾静脈より20μL投与した。その後、1、3、6、48時間でマウスから血液、各臓器を取り出し、ガンマカウンターを用いてラベル化したポリエチレングリコール誘導体の滞留量を測定した。
放射性同位体をラベル化した分解性ポリエチレングリコール誘導体であるME-200GLFG(L)-200PAと分解性を持たないポリエチレングリコール誘導体であるメトキシPEGアミン40kDaの体内動態試験の結果として、図3に血中濃度、図4~7に投与後48時間後の各臓器への滞留量を示す。
この結果より、分解性ポリエチレングリコール誘導体は、通常の分解性を有さないポリエチレングリコール誘導体と比較して、同程度の血中半減期を示し、また体内における分布も同じ傾向にあることを証明できた。
[実施例17]
動物実験による空胞形成評価試験
末端にアミノ基を有した分子量4万である分解性ポリエチレングリコール誘導体であるME-200GLFG(L)-200PAと、非分解性であるメトキシPEGアミン40kDaを用いて、動物実験による空砲形成評価を行った。マウス種はBalb/c(8週齢、雄)、ポリエチレングリコール溶液は、生理食塩水を用いてポリエチレングリコール誘導体を100mg/mLの濃度になるように調製し、マウス尾静脈より20μL投与した。週3回、4週間連続投与を続け、投与終了後、マウスを4%パラホルムアルデヒド水溶液で灌流固定し、パラフィン切片を作製した。HE染色、および抗PEG抗体による免疫染色を行い、脳の脈絡叢上皮細胞における空胞形成を評価した。免疫染色としては、免疫染色キット(BOND Refine Polymer Detection Kit、ライカ社製)と抗PEG抗体(B-47抗体、アブカム社製)を用いて実施した。抗PEG抗体による免疫染色を行った脳の脈絡叢切片の画像を図8と図9に示す。
その結果、メトキシPEGアミン40kDaに比べ、分解性ポリエチレングリコールであるME-200GLFG(L)-200PAは有意に空胞の形成を抑制した。
なお、本実施例において投与したポリエチレングリコールの量は、あくまで空胞化を評価するために最適化した量であり、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、極めて多量である。
[実施例18]
動物実験によるポリエチレングリコールの蓄積性評価試験
末端にアミノ基を有した分子量4万である分解性ポリエチレングリコール誘導体であるME-200GLFG(L)-200PAと、非分解性であるメトキシPEGアミン20kDa、メトキシPEGアミン40kDa、コントロールであるPBSを用いて、動物実験によるポリエチレングリコールの蓄積性評価を行った。マウス種はBalb/c(8週齢、雄)、ポリエチレングリコール溶液は、生理食塩水を用いてポリエチレングリコール誘導体を62.5mg/mLの濃度になるように調製し、マウス尾静脈より100μL投与した。週3回、4週間連続投与を続け、投与終了後、マウスを4%パラホルムアルデヒド水溶液で灌流固定し、パラフィン切片を作製した。抗PEG抗体による免疫染色を行い、脳の脈絡叢上皮細胞における蓄積性を評価した。免疫染色を行ったそれぞれの脳の脈絡叢切片の画像を図10に示す。
ポリエチレングリコールが含まれないPBSを投与したマウスの脈絡叢切片では染色されないのに対し、非分解性であるメトキシPEGアミン40kDaでは、切片の広範囲で茶色に染色される結果となった。この染色部分はPEGが蓄積していることを示す。その一方で、分解性ポリエチレングリコールであるME-200GLFG(L)-200PAの切片においては、茶色に染色された部分が少なく、分子量が半分のメトキシPEGアミン20kDaと同等の蓄積を示した。結果として、分解性ポリエチレングリコールはその分解性により、同分子量の非分解性であるメトキシPEGアミン40kDaに比べ、有意に組織へのポリエチレングリコールの蓄積を抑制した。
これらの蓄積を定量化するため、以下の解析ソフトを用いて画像解析を行い、スコアを算出した。
装置:All in one microscopy BZ-X710
解析ソフト:BZ-X Analyzer
具体的には、画像中の脈絡叢組織の面積、そして蓄積を示す茶色の染色部分の面積を解析ソフトで抽出し、以下の計算式にてスコアリングを実施した。算出したスコアを表4に示す。
蓄積率 = 茶色の染色部分の面積 / 脈絡叢組織の面積
スコア = 蓄積率 / PBSの蓄積率
その結果、分解性ポリエチレングリコールは有意に組織へのポリエチレングリコールの蓄積を抑制できることが示された。
なお、本実施例において投与したポリエチレングリコールの量は、あくまで蓄積性を評価するために最適化した量であり、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、極めて多量である。
Figure 0007205827000123
本発明の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞の空胞を引き起こさない高分子量のポリエチレングリコール誘導体であり、生体関連物質を修飾する用途に効果的に用いることができ、生体内の血中で安定であり、且つ細胞内で分解される。

Claims (11)

  1. 下式(1):
    Figure 0007205827000124

    (式中、mは1~7であり、n1及びn2はそれぞれ独立して45~682であり、pは1~4であり、Rは炭素数1~4のアルキル基であり、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2~8残基のオリゴペプチドであり、Zのオリゴペプチドは、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドであり、Qは、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基であるか、またはオリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドは、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか1つを含み、かつそれ以外のアミノ酸はシステインを除く中性アミノ酸からなる4~8残基のオリゴペプチドであり、Xは生体関連物質と反応可能な官能基であり、L、L、L、L及びLはそれぞれ独立して、
    Figure 0007205827000125

    (式(z1)~式(z8)において、式中のsは0~10の整数を示し、また、式(z2)~式(z8)において、式中の2~3個のsは同一でも、異なっていてもよい。)である。)
    で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体。
  2. Qのオリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである請求項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
  3. Qのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである請求項または記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
  4. Zのオリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである請求項1~のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
  5. 総分子量が30,000以上である請求項1~のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
  6. Xが活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、ビニルスルホン基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシル基、チオール基、ジチオピリジル基、α-ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基およびアジド基よりなる群から選択される、請求項1~のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
  7. 式(1)中のZが、Z、Aおよびグリシン残基で構成される、下式(2):
    Figure 0007205827000126

    (式中、mは1~7であり、n1及びn2はそれぞれ独立して45~682であり、pは1~4であり、Rは炭素数1~4のアルキル基であり、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2~6残基のオリゴペプチドであり、Aはシステインを除く中性アミノ酸であり、 およびAの中性アミノ酸の少なくとも1つはハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸であり、a及びbはそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり、Qは、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基であるか、またはオリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドは、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか1つを含み、かつそれ以外のアミノ酸はシステインを除く中性アミノ酸からなる4~8残基のオリゴペプチドであり、Xは生体関連物質と反応可能な官能基であり、L、L、L、L及びLはそれぞれ独立して、
    Figure 0007205827000127

    (式(z1)~式(z8)において、式中のsは0~10の整数を示し、また、式(z2)~式(z8)において、式中の2~3個のsは同一でも、異なっていてもよい。)である。)
    で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、請求項1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
  8. 式(2)中のmが1である、下式(3):
    Figure 0007205827000128

    (式中、n3及びn4はそれぞれ独立して45~682であり、pは1~4であり、Rは炭素数1~4のアルキル基であり、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2~6残基のオリゴペプチドであり、Aはシステインを除く中性アミノ酸であり、 およびAの中性アミノ酸の少なくとも1つはハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸であり、a及びbはそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり、Qは、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基であるか、またはオリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドは、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか1つを含み、かつそれ以外のアミノ酸はシステインを除く中性アミノ酸からなる4~8残基のオリゴペプチドであり、Xは生体関連物質と反応可能な官能基であり、L、L、L、L及びLはそれぞれ独立して、
    Figure 0007205827000129

    (式(z1)~式(z8)において、式中のsは0~10の整数を示し、また、式(z2)~式(z8)において、式中の2~3個のsは同一でも、異なっていてもよい。)である。)
    で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、請求項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
  9. 式(1)中のQがエチレングリコールの残基であり、LがCHCHOであり、かつpが1である、下式(4):
    Figure 0007205827000130

    (式中、mは1~7であり、n5及びn6はそれぞれ独立して113~682であり、Rは炭素数1~4のアルキル基であり、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2~8残基のオリゴペプチドであり、Zのオリゴペプチドは、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドであり、Xは生体関連物質と反応可能な官能基であり、L、L、L及びLはそれぞれ独立して、
    Figure 0007205827000131

    (式(z1)~式(z8)において、式中のsは0~10の整数を示し、また、式(z2)~式(z8)において、式中の2~3個のsは同一でも、異なっていてもよい。)である。)
    で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、請求項1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
  10. 式(2)中のQがエチレングリコールの残基であり、LがCHCHOであり、かつpが1である、下式(5):
    Figure 0007205827000132

    (式中、mは1~7であり、n5及びn6はそれぞれ独立して113~682であり、Rは炭素数1~4のアルキル基であり、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2~6残基のオリゴペプチドであり、Aはシステインを除く中性アミノ酸であり、 およびAの中性アミノ酸の少なくとも1つはハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸であり、a及びbはそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり、Xは生体関連物質と反応可能な官能基であり、L、L、L及びLはそれぞれ独立して、
    Figure 0007205827000133

    (式(z1)~式(z8)において、式中のsは0~10の整数を示し、また、式(z2)~式(z8)において、式中の2~3個のsは同一でも、異なっていてもよい。)である。)
    で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、請求項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
  11. 式(3)中のQがエチレングリコールの残基であり、LがCHCHOであり、かつpが1である、下式(6):
    Figure 0007205827000134

    (式中、n7及びn8はそれぞれ独立して226~682であり、Rは炭素数1~4のアルキル基であり、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2~6残基のオリゴペプチドであり、Aはシステインを除く中性アミノ酸であり、 およびAの中性アミノ酸の少なくとも1つはハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸であり、a及びbはそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり、Xは生体関連物質と反応可能な官能基であり、L、L、L及びLはそれぞれ独立して、
    Figure 0007205827000135

    (式(z1)~式(z8)において、式中のsは0~10の整数を示し、また、式(z2)~式(z8)において、式中の2~3個のsは同一でも、異なっていてもよい。)である。)
    で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、請求項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
JP2019068350A 2018-03-29 2019-03-29 分解性ポリエチレングリコール誘導体 Active JP7205827B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018064305 2018-03-29
JP2018064305 2018-03-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2019173014A JP2019173014A (ja) 2019-10-10
JP7205827B2 true JP7205827B2 (ja) 2023-01-17

Family

ID=68060590

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019068350A Active JP7205827B2 (ja) 2018-03-29 2019-03-29 分解性ポリエチレングリコール誘導体

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20210147624A1 (ja)
EP (1) EP3778705A4 (ja)
JP (1) JP7205827B2 (ja)
KR (1) KR102668424B1 (ja)
CN (1) CN111936550B (ja)
CA (1) CA3095618A1 (ja)
WO (1) WO2019189854A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7249591B2 (ja) * 2018-03-29 2023-03-31 日油株式会社 分解性ポリエチレングリコール結合体
CN112843242B (zh) * 2019-11-28 2024-03-01 重庆阿普格雷生物科技有限公司 一种聚乙二醇偶联药物、其制备方法及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006088248A1 (ja) 2005-02-18 2006-08-24 Nof Corporation ポリオキシアルキレン誘導体

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3514017A (en) 1969-03-03 1970-05-26 Afa Corp Pressure regulating structure for piston pump
WO2003037915A1 (en) * 2001-10-31 2003-05-08 Biopolymed Inc. Biocompatible polymers including peptide spacer
US8562965B2 (en) 2004-05-03 2013-10-22 Nektar Therapeutics Polymer derivatives comprising an acetal or ketal branching point
CN100475837C (zh) * 2004-06-11 2009-04-08 北京键凯科技有限公司 多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽及其活性衍生物和药物结合物
JPWO2006088245A1 (ja) * 2005-02-18 2008-07-10 国立大学法人徳島大学 ポリオキシアルキレン鎖含有脂質誘導体及び該誘導体を含有する脂質膜構造体
EP1986695B1 (en) * 2006-02-21 2015-06-03 Nektar Therapeutics Segmented degradable polymers and conjugates made therefrom
CN101168594B (zh) * 2006-10-24 2011-07-27 北京键凯科技有限公司 寡肽为骨架的聚乙二醇活性衍生物、其制备方法及与药物分子的结合物
CA2702945C (en) * 2007-10-23 2016-08-23 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydroxyapatite-targeting multiarm polymers and conjugates made therefrom
JP5618248B2 (ja) 2009-10-06 2014-11-05 日油株式会社 カルボキシル基含有ポリオキシエチレン誘導体の精製方法
JP5825507B2 (ja) 2010-06-25 2015-12-02 日油株式会社 分岐型ヘテロポリエチレングリコール
JP5949037B2 (ja) * 2011-03-30 2016-07-06 日油株式会社 末端に複数の水酸基を有するポリオキシエチレン誘導体
WO2014157117A1 (ja) 2013-03-27 2014-10-02 日油株式会社 アミノ基を一つ有するポリエチレングリコールの精製方法
JP6784932B2 (ja) * 2015-03-31 2020-11-18 日油株式会社 生体機能性分子または薬物キャリアの化学修飾用生分解性ポリエチレングリコール誘導体
JP6475373B2 (ja) 2018-01-30 2019-02-27 日本電気株式会社 信号構成装置、信号構成システム、信号構成方法、および信号構成用プログラム

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006088248A1 (ja) 2005-02-18 2006-08-24 Nof Corporation ポリオキシアルキレン誘導体

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019173014A (ja) 2019-10-10
US20210147624A1 (en) 2021-05-20
CN111936550B (zh) 2023-11-28
KR20200138336A (ko) 2020-12-09
WO2019189854A1 (ja) 2019-10-03
CN111936550A (zh) 2020-11-13
KR102668424B1 (ko) 2024-05-23
EP3778705A4 (en) 2022-01-05
EP3778705A1 (en) 2021-02-17
CA3095618A1 (en) 2019-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7249591B2 (ja) 分解性ポリエチレングリコール結合体
JP2010503706A (ja) リジン系ポリマーリンカー
JP7205827B2 (ja) 分解性ポリエチレングリコール誘導体
JP7411189B2 (ja) 分岐型分解性ポリエチレングリコール結合体
JP7411188B2 (ja) 分岐型分解性ポリエチレングリコール誘導体
CN114423776A (zh) 非对称支链型分解性聚乙二醇衍生物
WO2021060441A1 (ja) マルチアーム型分解性ポリエチレングリコール誘導体
JP2018172651A (ja) ジスルフィドリンカーを有する分解性ポリエチレングリコール誘導体

Legal Events

Date Code Title Description
RD01 Notification of change of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426

Effective date: 20190416

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20190416

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210928

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20220729

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220816

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220914

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20221213

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20221221

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7205827

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150