JP7205827B2 - 分解性ポリエチレングリコール誘導体 - Google Patents
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Description
特許文献1には、生体内で切断されるスルフィド結合やペプチド結合部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。当該ポリエチレングリコール誘導体は、生体内で腎臓からの排出に適した分子量まで分解されるとの記載がある。しかし、具体的な分解に関するデータは全く示されておらず、腎臓からの排出が促進されたというデータもない。さらに細胞の空胞に関する記載はない。
[1]下式(1):
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体。
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、[1]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、[11]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、[1]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、[11]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、[21]記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
本発明に係る分解性ポリエチレングリコール誘導体は、下式(1)で示される。
また、Qの活性水素の数であるvと、式(1)のポリエチレングリコール誘導体のポリエチレングリコール鎖の本数を表すpとの関係は、好ましくはv=p+1であり、p=1の場合はv=2で、Qはエチレングリコールなどの残基であり、p=2の場合はv=3で、Qはグリセリン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの残基であり、p=3の場合はv=4で、Qはペンタエリスリトール、ジグリセリンなどの残基であり、p=4の場合はv=5で、Qはキシリトールなどの残基である。
Qがオリゴペプチドの残基である場合、該オリゴペプチドは、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解する性能を有し、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか1つを含み、かつそれ以外のアミノ酸がシステインを除く中性アミノ酸からなる4~8残基のオリゴペプチドであれば特に制限は無いが、具体的な例としては、グルタミン酸-グリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、グリシン-グルタミン酸-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、グルタミン酸-グリシン-グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グルタミン酸-フェニルアラニン-グリシン、グルタミン酸-グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グルタミン酸-グリシン-ロイシン-グリシン、グルタミン酸-バリン-シトルリン-グリシン、グルタミン酸-バリン-アラニン-グリシン、グルタミン酸-フェニルアラニン-グリシンなどであり、好ましくはグルタミン酸-グリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、グルタミン酸-グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グルタミン酸-バリン-シトルリン-グリシン、グルタミン酸-バリン-アラニン-グリシンであり、より好ましくはグルタミン酸-グリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、グルタミン酸-バリン-シトルリン-グリシンである。該オリゴペプチドはまた、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドであることが好ましい。該オリゴペプチドはさらに、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドであることが好ましい。なお、該オリゴペプチドの詳細な説明については、上記Zのオリゴペプチドの説明を参照されたい。
本発明の別の好ましい実施形態では、L1、L2、L3、L4及びL5はそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基(例、単結合、-O-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)2-O-、-(CH2)3-O-、-(CH2)2-CO-NH-、-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-、-CO-、-(CH2)5-CO-、-NH-)であり、より好ましくはL1が単結合、エーテル結合またはエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基(例、単結合、-O-、-(CH2)2-O-)であり、L2がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基(例、-CO-、-(CH2)5-CO-)であり、L3が2級アミノ基(-NH-)であり、L4がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基(例、-(CH2)3-O-)であり、L5が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基(例、単結合、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)2-CO-NH-、-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-)である。
下記の (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(j)、(k)
下記の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)
下記の(h)、(m)、(n)、(p)
下記の(h)、(m)、(n)、(p)
下記の(h)、(m)、(o)
下記の(l)
下式(4)は、式(1)のポリエチレングリコール誘導体において、Qがエチレングリコールの残基であり、L1がCH2CH2Oであり、かつpが1である、好適態様の直鎖型のポリエチレングリコール誘導体を示している。
式(1)のポリエチレングリコール誘導体のうち、pが2~4であり、かつQが3~5個の活性水素を持つ化合物の残基であるポリエチレングリコール誘導体は、好適態様の分岐型のポリエチレングリコール誘導体である。
Qの3~5個の活性水素を持つ化合物の残基は、好ましくは、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基、あるいはオリゴペプチドの残基であり、特に好ましくはリジン、グルタミン酸の残基である。ここで、該オリゴペプチドの好ましい態様は、上記の式(1)について説明した通りである。
なお、m、R、Z、X、L1、L2、L3、L4及びL5の好ましい態様は、上記の式(1)について説明した通りである。
Qの3~5個の活性水素を持つ化合物の残基は、好ましくは、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基、あるいはオリゴペプチドの残基であり、特に好ましくはリジン、グルタミン酸の残基である。ここで、該オリゴペプチドの好ましい態様は、上記の式(1)について説明した通りである。
なお、m、R、Z1、A、X、L1、L2、L3、L4及びL5の好ましい態様は、上記の式(1)および(2)について説明した通りである。
n3とn4は、それぞれ、ポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、好ましくはそれぞれ独立して226~455である。n3とn4は、異なっていても良く、また同じであっても良い。
Qの3~5個の活性水素を持つ化合物の残基は、好ましくは、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基、あるいはオリゴペプチドの残基であり、特に好ましくはリジン、グルタミン酸の残基である。ここで、該オリゴペプチドの好ましい態様は、上記の式(1)について説明した通りである。
なお、R、Z1、A、X、L1、L2、L3、L4及びL5の好ましい態様は、上記の式(1)および(2)について説明した通りである。
[ポリエチレングリコール誘導体(1-1)]
mが1~3であり;
n1及びn2がそれぞれ独立して113~568であり;
pが1または2であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Zがシステインを除く中性アミノ酸からなる2~4残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-グリシン-グリシン、バリン-シトルリン-グリシン、バリン-アラニン-グリシン、フェニルアラニン-グリシン)であり;
Qがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
L1、L2、L3、L4及びL5がそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、それぞれ独立して、
式(1)のポリエチレングリコール誘導体。
mが1~3であり;
n1及びn2がそれぞれ独立して113~568であり;
pが1または2であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Zがシステインを除く中性アミノ酸からなる2~4残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-グリシン-グリシン、バリン-シトルリン-グリシン、バリン-アラニン-グリシン、フェニルアラニン-グリシン)であり;
Qがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
L1が単結合、エーテル結合またはエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L2がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L3が2級アミノ基(-NH-)であり;
L4がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L5が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
式(1)のポリエチレングリコール誘導体。
[ポリエチレングリコール誘導体(2-1)]
mが1~3であり;
pが1または2であり;
n1及びn2がそれぞれ独立して113~568であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Z1がシステインを除く中性アミノ酸からなる2~3残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン、グリシン-フェニルアラニン、グリシン-グリシン、バリン-シトルリン、バリン-アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Qがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
L1、L2、L3、L4及びL5がそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、それぞれ独立して、
式(2)のポリエチレングリコール誘導体。
mが1~3であり;
pが1または2であり;
n1及びn2がそれぞれ独立して113~568であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Z1がシステインを除く中性アミノ酸からなる2~3残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン、グリシン-フェニルアラニン、グリシン-グリシン、バリン-シトルリン、バリン-アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Qがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
L1が単結合、エーテル結合またはエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L2がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L3が2級アミノ基(-NH-)であり;
L4がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L5が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
式(2)のポリエチレングリコール誘導体。
[ポリエチレングリコール誘導体(3-1)]
pが1または2であり;
n3及びn4がそれぞれ独立して340~568であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Z1がシステインを除く中性アミノ酸からなる2~3残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン、グリシン-フェニルアラニン、グリシン-グリシン、バリン-シトルリン、バリン-アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Qがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
L1、L2、L3、L4及びL5がそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、それぞれ独立して、
式(3)のポリエチレングリコール誘導体。
pが1または2であり;
n3及びn4がそれぞれ独立して340~568であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Z1がシステインを除く中性アミノ酸からなる2~3残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン、グリシン-フェニルアラニン、グリシン-グリシン、バリン-シトルリン、バリン-アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Qがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
L1が単結合、エーテル結合またはエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L2がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L3が2級アミノ基(-NH-)であり;
L4がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L5が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
式(3)のポリエチレングリコール誘導体。
[ポリエチレングリコール誘導体(4-1)]
mが1~3であり;
n5及びn6がそれぞれ独立して180~525であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Zがシステインを除く中性アミノ酸からなる2~4残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-グリシン-グリシン、バリン-シトルリン-グリシン、バリン-アラニン-グリシン、フェニルアラニン-グリシン)であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
L2、L3、L4及びL5がそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、それぞれ独立して、
式(4)のポリエチレングリコール誘導体。
mが1~3であり;
n5及びn6がそれぞれ独立して180~525であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Zがシステインを除く中性アミノ酸からなる2~4残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-フェニルアラニン-グリシン、グリシン-グリシン-グリシン、バリン-シトルリン-グリシン、バリン-アラニン-グリシン、フェニルアラニン-グリシン)であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
L2がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L3が2級アミノ基(-NH-)であり;
L4がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L5が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
式(4)のポリエチレングリコール誘導体。
[ポリエチレングリコール誘導体(5-1)]
mが1~3であり;
n5及びn6がそれぞれ独立して180~525であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Z1がシステインを除く中性アミノ酸からなる2~3残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン、グリシン-フェニルアラニン、グリシン-グリシン、バリン-シトルリン、バリン-アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
L2、L3、L4及びL5がそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、それぞれ独立して、
式(5)のポリエチレングリコール誘導体。
mが1~3であり;
n5及びn6がそれぞれ独立して180~525であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Z1がシステインを除く中性アミノ酸からなる2~3残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン、グリシン-フェニルアラニン、グリシン-グリシン、バリン-シトルリン、バリン-アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
L2がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L3が2級アミノ基(-NH-)であり;
L4がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L5が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
式(5)のポリエチレングリコール誘導体。
[ポリエチレングリコール誘導体(6-1)]
n7及びn8がそれぞれ独立して340~568であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Z1がシステインを除く中性アミノ酸からなる2~3残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン、グリシン-フェニルアラニン、グリシン-グリシン、バリン-シトルリン、バリン-アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
L2、L3、L4及びL5がそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、それぞれ独立して、
式(6)のポリエチレングリコール誘導体。
n7及びn8がそれぞれ独立して340~568であり;
Rが炭素数1~3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Z1がシステインを除く中性アミノ酸からなる2~3残基のオリゴペプチド(例、グリシン-フェニルアラニン-ロイシン、グリシン-グリシン-フェニルアラニン、グリシン-フェニルアラニン、グリシン-グリシン、バリン-シトルリン、バリン-アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Xがアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基よりなる群から選択され;
L2がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L3が2級アミノ基(-NH-)であり;
L4がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L5が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
式(6)のポリエチレングリコール誘導体。
当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、必要に応じて末端官能基を化学変換することができる。この官能基変換に用いられる反応は、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドや、前記の2価のスペーサーが分解しない条件を適切に選択しなければならない。
オリゴペプチドのN末端のアミノ基の保護基は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基およびカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびt-ブチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
縮合反応としては、特に制限は無いが、縮合剤を用いる反応が望ましい。縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)等のカルボジイミド系の縮合剤を単独で使用しても良く、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt)等の試薬と併用しても良い。また、より反応性の高いHATUやHBTU、TATU,TBTU、COMU、DMT-MM等の縮合剤を使用しても良い。また反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジン等の塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したオリゴペプチドや縮合剤などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
ポリエチレングリコール誘導体(7)は、片末端に保護基で保護されたアミノ基を有し、もう片末端に活性エステル基または活性カーボネート基などを有する。活性エステル基と活性カーボネート基の脱離基としては、スクシンイミジルオキシ基、フタルイミジルオキシ基、4-ニトロフェノキシ基、1-イミダゾリル基、ペンタフルオロフェノキシ基、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ基および7-アザベンゾトリアゾール-1-イルオキシ基などが挙げられる。また、ポリエチレングリコール誘導体(7)は、必ずしも活性化された官能基を有している必要は無く、末端にカルボキシル基を有する場合は、反応A-1と同様に、縮合剤を用いた反応を用いることができる。反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジン等の塩基を用いても良い。ポリエチレングリコール誘導体(7)の保護基は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基およびカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびt-ブチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
ポリエチレングリコール誘導体(8)の中から、分子量や官能基の異なるポリエチレングリコール不純物を除去する手法としては、特開2014-208786、特開2011-79934に記載の精製技術を用いることができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
ポリエチレングリコール誘導体(9):2本のポリエチレングリコール鎖が1つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(13):3本のポリエチレングリコール鎖が2つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(14):4本のポリエチレングリコール鎖が3つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(15):5本のポリエチレングリコール鎖が4つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(7)に替わるポリエチレングリコール誘導体については、例えば以下の構造のものが挙げられる。
当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、必要に応じて末端官能基を化学変換することができる。この官能基変換に用いられる反応は、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドや、前記の2価のスペーサーが分解しない条件を適切に選択しなければならない。
オリゴペプチドのN末端のアミノ基の保護基Pro3は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基およびカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基等が挙げられる。次にポリエチレングリコール誘導体(16)のカルボキシル基の保護基Pro2は、特に制限はないが、t-ブチル基などが挙げられる。
前記反応A-1と同条件で反応と精製が可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
前記反応A-1と同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジン等の塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
ポリエチレングリコール誘導体(21)の中から、分子量や官能基の異なるポリエチレングリコール不純物を除去する手法としては、特開2014-208786、特開2011-79934に記載の精製技術を用いることができる。
ポリエチレングリコール誘導体(20):2本のポリエチレングリコール鎖が1つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(22):3本のポリエチレングリコール鎖が2つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(23):4本のポリエチレングリコール鎖が3つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(24):5本のポリエチレングリコール鎖が4つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
前記反応A-1と同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジン等の塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
ポリエチレングリコール誘導体(25)の中から、分子量や官能基の異なるポリエチレングリコール不純物を除去する手法としては、特開2014-208786、特開2011-79934に記載の精製技術を用いることができる。
分解率 = (試験前のピーク面積% - 試験後のピーク面積%) ÷ 試験前のピーク面積% × 100
例えば、安定性試験前の分解性ポリエチレングリコール誘導体のGPCメインフラクションのピーク面積%が95%であり、試験後のGPCメインフラクションのピーク面積%が90%だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率 = (95-90)÷95×100 = 5.26(%)
分解性ポリエチレングリコール誘導体は、血中で分解してしまうと、目的とする血中半減期を得ることができないため、安定性試験において、96時間後の分解率は、10%以下が好ましく、5%以下がさらに好ましい。
例えば、細胞を用いた分解性試験前の分解性ポリエチレングリコール誘導体のGPCメインフラクションのピーク面積%が95%であり、試験後のGPCメインフラクションのピーク面積%が5%だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率 = (95-5)÷95×100 = 94.7(%)
分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞内で効率よく分解されないと、目的とする細胞の空胞を抑制できないため、分解性試験において、96時間後の分解率は、90%以上が好ましく、95%以上がさらに好ましい。
ポリエチレングリコール誘導体に導入した分解性ペプチドは、ポリエチレングリコールに細胞内での分解性を付与するが、そのペプチド構造によってポリエチレングリコールの体内動態を変化させる可能性が考えられる。そこで、導入したペプチド構造の体内動態への影響を確認するため、血中半減期および、その体内分布について、分解性を持たない同分子量のポリエチレングリコール誘導体と比較する必要がある。具体的には、放射性同位体でラベル化した分解性を持たないポリエチレングリコール誘導体と、分解性ポリエチレングリコール誘導体を、マウスに投与し、複数のタイムポイントで、血液、各臓器の放射線量を測定し、定量測定を行うことができる。
具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を10~250mg/mLの濃度になるように生理食塩水に溶解し、マウス尾静脈より週3回、4週間以上、20~100μL投与を続け、空胞が発生しやすいといわれている器官である脳脈絡叢や脾臓などのパラフィン切片を作製して染色後、切片画像を病理学的手法により確認し、空胞抑制の評価を行うことができる。
なお、本評価においてポリエチレングリコールの投与量は、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、大過剰のポリエチレングリコールを投与する必要がある。
なお、本評価においてポリエチレングリコールの投与量は、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、大過剰のポリエチレングリコールを投与する必要がある。
GPC分析(分子量測定)
検出器:示差屈折計
カラム:ultrahydrogel500およびultrahydrogel250(WATERS)
移動相:100mM Acetate buffer+0.02%NaN3(pH5.2)
流速:0.5mL/min
サンプル量:5mg/mL、20μL
カラム温度:30℃
HPLC分析(アミン純度測定)
検出器:示差屈折計
カラム:TSKgel SP-5PW(東ソー)
移動相:1mM Sodium phosphate buffer(pH6.5)
流速:0.5mL/min
注入量:5mg/mL、20μL
カラム温度:40℃
化合物(p1)(ME-200GLFG(L)-200PA)の合成
NMR(CDCl3):0.89ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、0.92ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.36ppm(s、9H、-NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 )、1.48ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2)、1.55ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2)、1.80ppm(m、3H)、3.13ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -C6H5)、3.21ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -C6H5)、3.33ppm(m、2H、-CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.65ppm(m、約2,000H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3)、3.91ppm(t、1H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3)2)、4.43ppm(broad、1H)、4.55ppm(q、1H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5)、5.77ppm(broad、1H)、6.76ppm(broad、1H)、6.86ppm(broad、1H)、6.90ppm(broad、1H)、7.14ppm(broad、1H)、7.20ppm(d、2H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )、7.32ppm(m、3H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.89ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.53ppm(m、2H、-NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2)、1,70ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3)2)、1.80ppm(m、2H、-CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.10ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -C6H5)、3.18ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -C6H5)、3.33ppm(m、7H)、3.74ppm(m、約1,900H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3)、4.31ppm(broad、1H)、4.55ppm(t、1H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5)、6.91ppm(broad、1H)、7.00ppm(broad、1H)、7.28ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )、7.98ppm(broad、1H)
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、9H、-CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 )、1.64ppm(m、1H)、1.76ppm(m、5H)、3.20ppm(m、4H)、3.33ppm(m、2H、-CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.64ppm(m、約3,800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、2H、-NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-)、4.32ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、5.02ppm(broad、1H)、6.45ppm(broad、1H)、6.93ppm(broad、1H)、7.06ppm(broad、1H)、7.13ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.48ppm(broad、1H)、1.62ppm(t、1H)、1.71ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、3.12ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.64ppm(m、約3,800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、2H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
化合物(p5)(ME-200GLFG(L)-200AL)の合成
NMR(CDCl3):1.20ppm(t、6H、-CH2-CH2-CH(OCH2 CH 3 )2)、1.90ppm(q、2H、-CH2-CH 2 -CH(OCH2CH3)2)、2.84ppm(s、4H、-O-CO-O-NC 4 H 4 O 2 )、3.65ppm(m、約1,900H、-O-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 CH 2 O)n-CH2-)、4.46ppm(t、2H、-O-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2CH2O)n-CH2-)、4.64ppm(t、1H、-CH2-CH2-CH(OCH2CH3)2)
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.20ppm(t、6H、-CH2-CH2-CH(OCH2 CH 3 )2)、1.47ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2)、1.61ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2)、1.72ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、1.90ppm(q、2H、-CH2-CH 2 -CH(OCH2CH3)2)、2.58ppm(m、1H)、3.19ppm(d、2H、-NH-CO-CH-CH 2 -C6H5)、3.33ppm(m、2H、-CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.38ppm(-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、4.29ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、4.64ppm(t、1H、-CH2-CH2-CH(OCH2CH3)2)、6.38ppm(broad、1H)、6.89ppm(broad、1H)、6.99ppm(broad、1H)、7.10ppm(broad、1H)、7.29ppm(m、5H)
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.47ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2)、1.61ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2)、1.72ppm(m、1H)、1.84ppm(m、5H)、2.68ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H、-NH-CO-CH-CH 2 -C6H5)、3.33ppm(m、2H、-CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.38ppm(-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、4.06ppm(m、1H、-NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-)、4.12ppm(m、1H、-NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-)、4.32ppm(m、1H)、4.51ppm(q、1H)、6.36ppm(broad、1H)、6.87ppm(broad、1H)、6.99ppm(broad、2H)、7.14ppm(broad、1H)、7.29ppm(m、5H)、9.80ppm(s、1H、-CH2CH2-CHO)
化合物(p8)(ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100PA)の合成
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.48ppm(broad、1H)、1.62ppm(t、1H)、1.71ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、3.12ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.64ppm(m、約1,800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、2H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、12H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、9H、-CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 )、1.64ppm(m、2H)、1.76ppm(m、5H)、3.20ppm(m、4H)、3.33ppm(m、4H、-CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-)、3.38ppm(s、3H、-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.64ppm(m、約1,800H、-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、2H、-NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-)、4.32ppm(m、2H)、4.50ppm(q、2H)、5.02ppm(broad、2H)、6.45ppm(broad、2H)、6.93ppm(broad、2H)、7.06ppm(broad、2H)、7.13ppm(broad、2H)、7.27ppm(m、10H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.89ppm(d、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.53ppm(m、4H、-NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2)、1,70ppm(m、2H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3)2)、1.80ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-)、3.10ppm(dd、2H、-NH-CO-CH-CH 2 -C6H5)、3.18ppm(dd、2H、-NH-CO-CH-CH 2 -C6H5)、3.33ppm(m、14H)、3.74ppm(m、約1,800H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-)、4.31ppm(broad、2H)、4.55ppm(t、2H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5)、6.91ppm(broad、2H)、7.00ppm(broad、2H)、7.28ppm(m、10H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )、7.98ppm(broad、2H)
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、12H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、9H、-CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 )、1.64ppm(m、2H)、1.76ppm(m、10H)、3.20ppm(m、8H)、3.33ppm(m、6H、-CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-)、3.38ppm(s、3H、-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.64ppm(m、約2,700H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、4H、-NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-)、4.32ppm(m、2H)、4.50ppm(q、2H)、5.02ppm(broad、2H)、6.45ppm(broad、2H)、6.93ppm(broad、2H)、7.06ppm(broad、2H)、7.13ppm(broad、2H)、7.27ppm(m、10H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、12H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.48ppm(broad、2H)、1.62ppm(t、2H)、1.71ppm(m、2H)、1.82ppm(m、4H)、3.12ppm(m、4H)、3.19ppm(d、4H)、3.34ppm(m、4H)、3.38ppm(s、3H、-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.64ppm(m、約2,700H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、4H)、4.34ppm(m、2H)、4.50ppm(q、2H)、6.46ppm(broad、2H)、6.94ppm(broad、2H)、7.08ppm(broad、2H)、7.27ppm(m、10H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
化合物(p14)(ME-200G(Cit)V-200PA)の合成
NMR(d6-DMSO):0.84ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH 3 )2)、0.85ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH 3 )2)、1.37ppm(m、2H)、1.52ppm(m、1H)、1.63ppm(m、3H)、1.98ppm(m、1H、-O-CO-NH-CH-CH(CH3)2)、2.93ppm(m、4H)、3.09ppm(m、2H、-NH-CH-CH2-CH2-CH 2 -NH-CO-NH2)、3.24ppm(s、3H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.48ppm(m、約1,900H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3)、3.89ppm(m、2H)、4.25ppm(m、3H、-NH-CO-O-CH 2 -CH<)、5.35ppm(broad、2H、-NH-CH-CH2-CH2-CH2-NH-CO-NH 2 )、5.91ppm(broad、1H)、7.33ppm(t、2H、Ar)、7.41ppm(m、3H、Ar)、7.73ppm(m、3H、Ar)、7.89ppm(d、2H、Ar)、8.10ppm(d、1H)、8.20ppm(broad、1H)
NMR(d6-DMSO):0.77ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH 3 )2)、0.87ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH 3 )2)、1.35ppm(m、2H)、1.51ppm(m、1H)、1.64ppm(m、4H)、1.93ppm(m、1H、-O-CO-NH-CH-CH(CH3)2)、2.96ppm(m、4H)、3.10ppm(m、2H、-NH-CH-CH2-CH2-CH 2 -NH-CO-NH2)、3.24ppm(s、3H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 、)、3.48ppm(m、約1,900H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3)、4.21ppm(broad、1H)、5.34ppm(broad、2H、-NH-CH-CH2-CH2-CH2-NH-CO-NH 2 )、5.91ppm(broad、1H)、7.73ppm(t、1H)、8.08ppm(broad、1H)、8.23ppm(t、1H)
NMR(CDCl3):0.96ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH 3 )2)、1.01ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、9H、-CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 )、1.59ppm(m、2H)、1.76ppm(m、3H)、1.82ppm(q、2H)、1.92ppm(m、1H)、3.09ppm(m、1H)、3.23ppm(m、2H、-NH-CH-CH2-CH2-CH 2 -NH-CO-NH2)、3.38ppm(s、3H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.64ppm(m、約3,800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.07ppm(dd、1H)、4.15ppm(m、2H)、4.31ppm(m、1H)、4.38ppm(m、1H)、5.02ppm(broad、1H)、5.24ppm(broad、2H、-NH-CH-CH2-CH2-CH2-NH-CO-NH 2 )、5.74ppm(broad、1H)、5.81ppm(d、1H)、7.05ppm(broad、1H)、7.46ppm(broad、1H)、8.30ppm(broad、1H)
NMR(CDCl3):0.96ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH 3 )2)、1.01ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH 3 )2)、1.60ppm(m、2H)、1.75ppm(m、3H)、1.82ppm(m、2H)、1.93ppm(m、1H)、2.23ppm(m、1H)、2.82ppm(t、2H、-CH2-CH2-CH2-NH 2 )、3.10ppm(m、1H)、3.30ppm(m、2H)、3.38ppm(m、4H)、3.64ppm(m、約3,800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、3.95ppm(m、1H)、4.07ppm(dd、1H)、4.15ppm(m、1H)、4.31ppm(m、1H)、4.38ppm(m、1H)、5.24ppm(broad、2H、-NH-CH-CH2-CH2-CH2-NH-CO-NH 2 )、5.79ppm(broad、1H)、5.82ppm(broad、1H)、7.06ppm(broad、1H)、7.48ppm(broad、1H)、8.31ppm(broad、1H)
化合物(p18)(ME-200G(Cit)V-200MA)の合成
NMR(CDCl3):0.96ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH 3 )2)、1.01ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH(CH 3 )2)、1.59ppm(broad、2H)、1.76ppm(m、5H)、2.46ppm(t、2H、-CH2-CH2-CH 2 -NH-CO-CH2-CH2-C4NO2H2)、3.12ppm(m、1H)、3.34ppm(m、5H)、3.64ppm(m、約3,800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.02ppm(m、1H)、4.13ppm(m、1H)、4.28ppm(m、1H)、4.37ppm(m、1H)、5.86ppm(broad、1H)、6.42ppm(broad、1H)、6.68ppm(s、2H、-CH2-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-C 4 NO 2 H 2 )、7.04ppm(broad、1H)、7.46ppm(broad、1H)、8.20ppm(broad、1H)
化合物(p19)(ME-200GGG-200PA)の合成
NMR(D2O):1.45ppm(s、9H、-NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 )、3.78ppm(s、2H、-CH 2 -NH-CO-O-C(CH3)3)、3.84ppm(s、2H、-CO-NH-CH 2 -COOH)、4.00ppm(s、2H、-CO-NH-CH 2 -CO-NH-)
NMR(CDCl3):1.45ppm(s、9H、-NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 )、1.80ppm(m、2H、-CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.38ppm(m、5H)、3.64ppm(m、約1,900H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3)、3.86ppm(d、2H、-CH 2 -NH-CO-O-C(CH3)3)、3.91ppm(d、2H)、3.99ppm(d、2H)、5.69ppm(broad、1H)、7.10ppm(broad、1H)、7.44ppm(broad、2H)
NMR(CDCl3):1.53ppm(broad、1H)、1.79ppm(m、2H、-CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.38ppm(m、5H)、3.64ppm(m、約1,900H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3)、3.92ppm(d、2H)、4.01ppm(broad、1H)、7.06ppm(broad、1H)、7.24ppm(broad、1H)、7.86ppm(broad、1H)
NMR(CDCl3):1.44ppm(s、9H、-CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 )、1.78ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3、-CH2-CH 2 -CH2-NH-CO-O-C(CH3)3)、3.23ppm(m、2H、-CH2-CH2-CH 2 -NH-CO-O-C(CH3)3)、3.35ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.65ppm(m、約3,800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、3.97ppm(d、2H)、4.23ppm(broad、2H、-NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-)、5.01ppm(broad、1H)、6.21ppm(broad、1H)、7.00ppm(broad、1H)、7.47ppm(broad、1H)、7.61ppm(broad、1H)
NMR(CDCl3):1.79ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3、-CH2-CH 2 -CH2-NH2)、2.91ppm(broad、2H)、3.37ppm(m、5H)、3.65ppm(m、約3,800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、3.90ppm(t、3H)、3.97ppm(d、2H)、4.23ppm(broad、2H、-NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-)、6.19ppm(broad、1H)、7.00ppm(broad、1H)、7.45ppm(broad、1H)、7.61ppm(broad、1H)
化合物(p24)(ME-200GF-200PA)の合成
NMR(d6-DMSO):1.62ppm(m、2H、-CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、2.80ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -C6H5)、3.04ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -C6H5)、3.10ppm(m、2H、-CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.24ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.48ppm(m、約1,900H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3)、4.20ppm(m、4H)、7.33ppm(m、9H)、7.66ppm(m、4H、Ar)、7.88ppm(d、2H、Ar)、8.27ppm(t、1H)
NMR(d6-DMSO):1.62ppm(m、2H、-CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、1.64ppm(broad、1H)、2.59ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -C6H5)、2.98ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -C6H5)、3.10ppm(q、2H、-CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.24ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.48ppm(m、約1,900H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3)、7.24ppm(m、6H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 、-NH-)、7.73ppm(t、1H)、8.12ppm(broad、1H)
NMR(CDCl3):1.44ppm(s、9H、-CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 )、1.77ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3、-CH2-CH 2 -CH2-NH-CO-O-C(CH3)3)、3.02ppm(m、1H)、3.21ppm(m、3H)、3.36ppm(m、4H)、3.65ppm(m、約3,800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.18ppm(m、2H、-NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-)、4.39ppm(q、1H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5)、5.03ppm(broad、1H)、5.55ppm(d、1H)、6.86ppm(broad、1H)、7.02ppm(broad、1H)、7.25ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):1.77ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3、-CH2-CH 2 -CH2-NH2)、2.87ppm(m、2H)、3.07ppm(m、1H)、3.30ppm(m、3H)、3.38ppm(s、3H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.64ppm(m、約3,800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.18ppm(m、2H、-NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-)、4.32ppm(q、1H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5)、5.56ppm(broad、1H)、6.83ppm(broad、1H)、6.96ppm(broad、1H)、7.25ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
化合物(p28)(ME-200GAV-200PA)の合成
NMR(d6-DMSO):0.82ppm(dd、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.21ppm(d、3H、-NH-CO-CH(CH3)-)、1.62ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3、-CH2-CH 2 -CH2-NH2)、1.95ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.60ppm(m、約3,800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.05ppm(m、2H)、4.22ppm(m、1H)、7.24ppm(broad、1H)、7.69ppm(broad、1H)、8.10ppm(broad、2H)
化合物(p29)(ME-200GFGG-200PA)の合成
NMR(d6-DMSO):1.62ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3、-CH2-CH 2 -CH2-NH2)、2.80ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.60ppm(m、約3,800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.05ppm(m、2H)、4.47ppm(m、1H)、7.20ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )、7.43ppm(broad、1H)、7.62ppm(broad、1H)、8.00ppm(broad、1H)、8.12ppm(broad、1H)、8.24ppm(broad、1H)
化合物(p30)(ME-200GFG-200PA)の合成
NMR(d6-DMSO):1.62ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3、-CH2-CH 2 -CH2-NH2)、2.80ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.60ppm(m、約3,800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.05ppm(m、2H)、4.47ppm(m、1H)、7.20ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )、7.34ppm(broad、1H)、7.64ppm(broad、1H)、8.10ppm(broad、1H)、8.30ppm(broad、1H)
化合物(p31)(ME-200GF-200PA(amide))の合成
NMR(d6-DMSO):1.11ppm(m、2H、-NH-CO-CH2-CH2-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-)、1.38ppm(m、2H、-NH-CO-CH2-CH 2 -CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-)、1.62ppm(m、6H、-NH-CO-CH2-CH2-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-、-CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3、-CH2-CH 2 -CH2-NH2)、2.02ppm(m、2H、-NH-CO-CH 2 -CH2-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-)、2.80ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.60ppm(m、約3,800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.47ppm(m、1H)、7.20ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )、7.26ppm(broad、1H)、7.64ppm(broad、1H)、8.10ppm(broad、1H)、8.30ppm(broad、1H)
化合物(p32)(ME-200GLFG(D)-200PA)の合成
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.48ppm(broad、1H)、1.62ppm(t、1H)、1.71ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、3.12ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.64ppm(m、約3,800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、2H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
化合物(p34)(LY-(ME-100GLFG(L)-100) 2 -PA)の合成
NMR(CDCl3):0.89ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、0.92ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.36ppm(s、9H、-NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 )1.48ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2)、1.55ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2)、1.80ppm(m、3H)、3.13ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -C6H5)、3.21ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -C6H5)、3.33ppm(m、2H、-CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.65ppm(m、約820H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3)、3.91ppm(t、1H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3)2)、4.43ppm(broad、1H)、4.55ppm(q、1H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5)、5.77ppm(broad、1H)、6.76ppm(broad、1H)、6.86ppm(broad、1H)、6.90ppm(broad、1H)、7.14ppm(broad、1H)、7.20ppm(d、2H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )、7.32ppm(m、3H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.89ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、3H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.53ppm(m、2H、-NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2)、1,70ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH3)2)、1.80ppm(m、2H、-CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.10ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -C6H5)、3.18ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH 2 -C6H5)、3.33ppm(m、7H)、3.74ppm(m、約820H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3)、4.31ppm(broad、1H)、4.55ppm(t、1H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5)、6.91ppm(broad、1H)、7.00ppm(broad、1H)、7.28ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )、7.98ppm(broad、1H)
NMR(CDCl3):1.52ppm(m、2H、-tetrahydropyranyl)、1.59ppm(m、2H、-tetrahydropyranyl)、1.73ppm(m、1H、-tetrahydropyranyl)、1.85ppm(m、1H、-tetrahydropyranyl)、2.85ppm(t、4H、-succinimide)、3.64ppm(m、約820H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、3.80ppm(m、2H)、3.88ppm(m、2H、-tetrahydropyranyl)、4.47ppm(m、2H)、4.64ppm(t、1H、-tetrahydropyranyl)
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.48ppm(broad、1H)、1.62ppm(t、1H)、1.71ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.64ppm(m、約820H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、2H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、9H、-CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 )、1.64ppm(m、1H)、1.76ppm(m、5H)、2.85ppm(t、4H、-succinimide)、3.20ppm(m、4H)、3.33ppm(m、2H、-CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3)、3.38ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.64ppm(m、約820H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、2H、-NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-)、4.32ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、5.02ppm(broad、1H)、6.45ppm(broad、1H)、6.93ppm(broad、1H)、7.06ppm(broad、1H)、7.13ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.28ppm(t、3H、-CO-O-CH2-CH 3 )、1.36ppm(m、2H)、1.48ppm(broad、1H)、1.52ppm(m、2H)、1.62ppm(t、1H)、1.70ppm(m、2H)、1.82ppm(m、3H)、3.15ppm(q、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、6H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.64ppm(m、約1,600H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、2H)、4.21ppm(m、6H)、4.34ppm(m、2H)、4.50ppm(q、1H)、4.90ppm(broad、1H)、5.37ppm(d、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.36ppm(m、2H)、1.48ppm(broad、1H)、1.52ppm(m、2H)、1.62ppm(t、1H)、1.70ppm(m、2H)、1.82ppm(m、3H)、3.15ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、6H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.64ppm(m、約1,600H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、2H)、4.21ppm(m、4H)、4.34ppm(m、2H)、4.50ppm(q、1H)、4.90ppm(broad、1H)、5.37ppm(d、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.36ppm(m、2H)、1.44ppm(s、9H)、1.48ppm(broad、1H)、1.52ppm(m、2H)、1.62ppm(m、3H)、1.70ppm(m、2H)、1.82ppm(m、3H)、3.15ppm(m、4H)、3.19ppm(d、2H)、3.29ppm(m、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、6H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.64ppm(m、約1,600H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、3H)、4.21ppm(m、4H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、5.08ppm(broad、1H)、5.56ppm(d、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、-NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2)、1.37ppm(m、2H)、1.48ppm(broad、1H)、1.52ppm(m、2H)、1.62ppm(m、3H)、1.70ppm(m、2H)、1.82ppm(m、3H)、2.84ppm(m、2H)、3.15ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、6H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.64ppm(m、約1,600H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、4.10ppm(m、3H)、4.21ppm(m、4H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、5.58ppm(broad、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
化合物(p33)(ME-200F-200PA)の合成
NMR(d6-DMSO):1.62ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3、-CH2-CH 2 -CH2-NH2)、2.80ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 )、3.60ppm(m、約3,800H、-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3、-NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-)、3.95ppm(m、2H)、4.13ppm(m、1H)、7.20ppm(m、5H、-NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )、7.38ppm(broad、1H)、7.91ppm(broad、1H)
血清中での安定性試験
1.5mLのエッペンドルフチューブに、マウスまたはヒト血清1mLを加え、各種ポリエチレングリコール誘導体を5.0mg/mLの濃度になるように添加した。37℃で96時間インキュベーション後、200μLをサンプリングし、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、血清中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸等の疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、血清中からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。その後、GPC分析を行い、分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
分解率は以下の式にて算出した。
分解率 = (試験前の40kDaのピーク面積% - 試験後の40kDaのピーク面積%) ÷ (試験前の40kDaのピーク面積%) × 100
結果を以下の表2に示す。
細胞を用いた分解性試験
培地RPMI-1640(10%FBS Pn/St)10mLを用いて、100mmディッシュにRAW264.7を10×106cell播種し、37℃で24時間培養後、各種ポリエチレングリコール誘導体を10mg/mLの濃度になるよう溶解した培地に交換し、37℃で96時間培養した。培養後、細胞を1%SDS溶液にて溶解し、PBSにて希釈し、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、細胞溶解液中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸等の疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、細胞内からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
また、細胞培養に使用した培地中での分解を確認するため、各種ポリエチレングリコール誘導体を10mg/mLの濃度になるよう溶解した培地のみで37℃で96時間培養し、上記と同操作にてポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
その後、回収した各種ポリエチレングリコール誘導体のGPC分析を行い、実施例14と同じ計算式にて分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
結果を以下の表3に示す。また、細胞実験の前後のGPCチャートを図1と図2に示す。
動物実験による体内動態試験(放射性同位体)
末端にアミノ基を有した分子量4万である分解性ポリエチレングリコール誘導体であるME-200GLFG(L)-200PAと、非分解性であるメトキシPEGアミン40kDaを、それぞれ0.1mg/mLの濃度になるように50mM炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解し、そこにBolton-Hunter試薬(0.4625MBq)を添加し、ボルテックスにて撹拌後、室温で一晩反応させた。反応溶液をPD-10カラムにて分画し、各フラクションをポリエチレングリコール呈色試薬(チオシアン酸アンモニウムと硝酸コバルト)とガンマカウンターを用いて、125Iの含まれるフラクションを確認し、回収した。
得られた放射性同位体をラベル化したポリエチレングリコール誘導体を用いて、体内動態を動物実験にて評価した。マウス種はBalb/c(8週齢、雄)、ポリエチレングリコール溶液は、生理食塩水を用いてラベル化していないポリエチレングリコール誘導体を50mg/mLの濃度になるように調製し、放射性同位体をラベル化したポリエチレングリコール誘導体を微量添加し、マウス尾静脈より20μL投与した。その後、1、3、6、48時間でマウスから血液、各臓器を取り出し、ガンマカウンターを用いてラベル化したポリエチレングリコール誘導体の滞留量を測定した。
放射性同位体をラベル化した分解性ポリエチレングリコール誘導体であるME-200GLFG(L)-200PAと分解性を持たないポリエチレングリコール誘導体であるメトキシPEGアミン40kDaの体内動態試験の結果として、図3に血中濃度、図4~7に投与後48時間後の各臓器への滞留量を示す。
この結果より、分解性ポリエチレングリコール誘導体は、通常の分解性を有さないポリエチレングリコール誘導体と比較して、同程度の血中半減期を示し、また体内における分布も同じ傾向にあることを証明できた。
動物実験による空胞形成評価試験
末端にアミノ基を有した分子量4万である分解性ポリエチレングリコール誘導体であるME-200GLFG(L)-200PAと、非分解性であるメトキシPEGアミン40kDaを用いて、動物実験による空砲形成評価を行った。マウス種はBalb/c(8週齢、雄)、ポリエチレングリコール溶液は、生理食塩水を用いてポリエチレングリコール誘導体を100mg/mLの濃度になるように調製し、マウス尾静脈より20μL投与した。週3回、4週間連続投与を続け、投与終了後、マウスを4%パラホルムアルデヒド水溶液で灌流固定し、パラフィン切片を作製した。HE染色、および抗PEG抗体による免疫染色を行い、脳の脈絡叢上皮細胞における空胞形成を評価した。免疫染色としては、免疫染色キット(BOND Refine Polymer Detection Kit、ライカ社製)と抗PEG抗体(B-47抗体、アブカム社製)を用いて実施した。抗PEG抗体による免疫染色を行った脳の脈絡叢切片の画像を図8と図9に示す。
その結果、メトキシPEGアミン40kDaに比べ、分解性ポリエチレングリコールであるME-200GLFG(L)-200PAは有意に空胞の形成を抑制した。
なお、本実施例において投与したポリエチレングリコールの量は、あくまで空胞化を評価するために最適化した量であり、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、極めて多量である。
動物実験によるポリエチレングリコールの蓄積性評価試験
末端にアミノ基を有した分子量4万である分解性ポリエチレングリコール誘導体であるME-200GLFG(L)-200PAと、非分解性であるメトキシPEGアミン20kDa、メトキシPEGアミン40kDa、コントロールであるPBSを用いて、動物実験によるポリエチレングリコールの蓄積性評価を行った。マウス種はBalb/c(8週齢、雄)、ポリエチレングリコール溶液は、生理食塩水を用いてポリエチレングリコール誘導体を62.5mg/mLの濃度になるように調製し、マウス尾静脈より100μL投与した。週3回、4週間連続投与を続け、投与終了後、マウスを4%パラホルムアルデヒド水溶液で灌流固定し、パラフィン切片を作製した。抗PEG抗体による免疫染色を行い、脳の脈絡叢上皮細胞における蓄積性を評価した。免疫染色を行ったそれぞれの脳の脈絡叢切片の画像を図10に示す。
ポリエチレングリコールが含まれないPBSを投与したマウスの脈絡叢切片では染色されないのに対し、非分解性であるメトキシPEGアミン40kDaでは、切片の広範囲で茶色に染色される結果となった。この染色部分はPEGが蓄積していることを示す。その一方で、分解性ポリエチレングリコールであるME-200GLFG(L)-200PAの切片においては、茶色に染色された部分が少なく、分子量が半分のメトキシPEGアミン20kDaと同等の蓄積を示した。結果として、分解性ポリエチレングリコールはその分解性により、同分子量の非分解性であるメトキシPEGアミン40kDaに比べ、有意に組織へのポリエチレングリコールの蓄積を抑制した。
これらの蓄積を定量化するため、以下の解析ソフトを用いて画像解析を行い、スコアを算出した。
装置:All in one microscopy BZ-X710
解析ソフト:BZ-X Analyzer
具体的には、画像中の脈絡叢組織の面積、そして蓄積を示す茶色の染色部分の面積を解析ソフトで抽出し、以下の計算式にてスコアリングを実施した。算出したスコアを表4に示す。
蓄積率 = 茶色の染色部分の面積 / 脈絡叢組織の面積
スコア = 蓄積率 / PBSの蓄積率
その結果、分解性ポリエチレングリコールは有意に組織へのポリエチレングリコールの蓄積を抑制できることが示された。
なお、本実施例において投与したポリエチレングリコールの量は、あくまで蓄積性を評価するために最適化した量であり、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、極めて多量である。
Claims (11)
- 下式(1):
(式中、mは1~7であり、n1及びn2はそれぞれ独立して45~682であり、pは1~4であり、Rは炭素数1~4のアルキル基であり、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2~8残基のオリゴペプチドであり、Zのオリゴペプチドは、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドであり、Qは、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基であるか、またはオリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドは、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか1つを含み、かつそれ以外のアミノ酸はシステインを除く中性アミノ酸からなる4~8残基のオリゴペプチドであり、Xは生体関連物質と反応可能な官能基であり、L1、L2、L3、L4及びL5はそれぞれ独立して、
(式(z1)~式(z8)において、式中のsは0~10の整数を示し、また、式(z2)~式(z8)において、式中の2~3個のsは同一でも、異なっていてもよい。)である。)
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体。 - Qのオリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである請求項1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
- Qのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである請求項1または2記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
- Zのオリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである請求項1~3のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
- 総分子量が30,000以上である請求項1~4のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
- Xが活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、ビニルスルホン基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシル基、チオール基、ジチオピリジル基、α-ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基およびアジド基よりなる群から選択される、請求項1~5のいずれか1項記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
- 式(1)中のZが、Z1、Aおよびグリシン残基で構成される、下式(2):
(式中、mは1~7であり、n1及びn2はそれぞれ独立して45~682であり、pは1~4であり、Rは炭素数1~4のアルキル基であり、Z1はシステインを除く中性アミノ酸からなる2~6残基のオリゴペプチドであり、Aはシステインを除く中性アミノ酸であり、Z 1 およびAの中性アミノ酸の少なくとも1つはハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸であり、a及びbはそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり、Qは、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基であるか、またはオリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドは、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか1つを含み、かつそれ以外のアミノ酸はシステインを除く中性アミノ酸からなる4~8残基のオリゴペプチドであり、Xは生体関連物質と反応可能な官能基であり、L1、L2、L3、L4及びL5はそれぞれ独立して、
(式(z1)~式(z8)において、式中のsは0~10の整数を示し、また、式(z2)~式(z8)において、式中の2~3個のsは同一でも、異なっていてもよい。)である。)
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、請求項1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。 - 式(2)中のmが1である、下式(3):
(式中、n3及びn4はそれぞれ独立して45~682であり、pは1~4であり、Rは炭素数1~4のアルキル基であり、Z1はシステインを除く中性アミノ酸からなる2~6残基のオリゴペプチドであり、Aはシステインを除く中性アミノ酸であり、Z 1 およびAの中性アミノ酸の少なくとも1つはハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸であり、a及びbはそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり、Qは、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基であるか、またはオリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドは、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか1つを含み、かつそれ以外のアミノ酸はシステインを除く中性アミノ酸からなる4~8残基のオリゴペプチドであり、Xは生体関連物質と反応可能な官能基であり、L1、L2、L3、L4及びL5はそれぞれ独立して、
(式(z1)~式(z8)において、式中のsは0~10の整数を示し、また、式(z2)~式(z8)において、式中の2~3個のsは同一でも、異なっていてもよい。)である。)
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、請求項7記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。 - 式(1)中のQがエチレングリコールの残基であり、L1がCH2CH2Oであり、かつpが1である、下式(4):
(式中、mは1~7であり、n5及びn6はそれぞれ独立して113~682であり、Rは炭素数1~4のアルキル基であり、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2~8残基のオリゴペプチドであり、Zのオリゴペプチドは、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドであり、Xは生体関連物質と反応可能な官能基であり、L2、L3、L4及びL5はそれぞれ独立して、
(式(z1)~式(z8)において、式中のsは0~10の整数を示し、また、式(z2)~式(z8)において、式中の2~3個のsは同一でも、異なっていてもよい。)である。)
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、請求項1記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。 - 式(2)中のQがエチレングリコールの残基であり、L1がCH2CH2Oであり、かつpが1である、下式(5):
(式中、mは1~7であり、n5及びn6はそれぞれ独立して113~682であり、Rは炭素数1~4のアルキル基であり、Z1はシステインを除く中性アミノ酸からなる2~6残基のオリゴペプチドであり、Aはシステインを除く中性アミノ酸であり、Z 1 およびAの中性アミノ酸の少なくとも1つはハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸であり、a及びbはそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり、Xは生体関連物質と反応可能な官能基であり、L2、L3、L4及びL5はそれぞれ独立して、
(式(z1)~式(z8)において、式中のsは0~10の整数を示し、また、式(z2)~式(z8)において、式中の2~3個のsは同一でも、異なっていてもよい。)である。)
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、請求項7記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。 - 式(3)中のQがエチレングリコールの残基であり、L1がCH2CH2Oであり、かつpが1である、下式(6):
(式中、n7及びn8はそれぞれ独立して226~682であり、Rは炭素数1~4のアルキル基であり、Z1はシステインを除く中性アミノ酸からなる2~6残基のオリゴペプチドであり、Aはシステインを除く中性アミノ酸であり、Z 1 およびAの中性アミノ酸の少なくとも1つはハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸であり、a及びbはそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり、Xは生体関連物質と反応可能な官能基であり、L2、L3、L4及びL5はそれぞれ独立して、
(式(z1)~式(z8)において、式中のsは0~10の整数を示し、また、式(z2)~式(z8)において、式中の2~3個のsは同一でも、異なっていてもよい。)である。)
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体である、請求項8記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
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