CN114423776A - 非对称支链型分解性聚乙二醇衍生物 - Google Patents

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Abstract

提供不会引起细胞液泡的高分子量的支链型分解性聚乙二醇衍生物。支链型分解性聚乙二醇衍生物，其用下式(1)表示，所述支链型分解性聚乙二醇衍生物的分子内具有在细胞内发生分解的寡肽。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
(式中，k1和k2各自独立地为1~12，j1和j2各自独立地为45~950，R为氢原子、取代或未取代的碳原子数1~12的烷基、取代芳基、芳烷基或杂烷基，Z为因细胞内的酶而发生分解的寡肽，X为能够与生物相关物质发生反应的官能团，L1和L2各自独立地为单键或2价的间隔基团)。

Description

非对称支链型分解性聚乙二醇衍生物
技术领域
本发明是涉及在对生物相关物质进行修饰的用途中使用的、在细胞内发生分解的支链型分解性聚乙二醇衍生物的发明。
背景技术
使用激素、细胞因子、抗体、酶等生物相关物质得到的药品通常被投与至生物体内时，会因肾脏中的肾小球过滤、肝脏或脾脏等中的巨噬细胞的吞噬而从生物体内迅速被排出。因此，血中半衰期短、难以获得充分药理效果的情况较多。为了解决该问题，进行了用糖链、聚乙二醇等亲水性高分子、白蛋白等对生物相关物质加以化学修饰的尝试。其结果，通过增大分子量、形成水和层等而能够延长生物相关物质的血中半衰期。此外，通过用聚乙二醇进行修饰而得到降低生物相关物质的毒性或抗原性、提高水难溶性药物的溶解性等效果也广为人知。
用聚乙二醇进行了修饰的生物相关物质被由聚乙二醇的醚键与水分子的氢键形成的水和层覆盖，分子尺寸变大，因此，能够规避肾脏中的肾小球过滤。进而，已知其与调理素、构成各组织的细胞表面的相互作用降低，向各组织的移行减少。可知：聚乙二醇是使生物相关物质的血中半衰期延长的优异原材料，其性能是分子量越大则效果越好。截止至今，进行了用分子量为4万以上的高分子量的聚乙二醇修饰的生物相关物质的多种研究，得到了能够显著延长其血中半衰期的结果。
普遍认为聚乙二醇在用于改善生物相关物质的性能的修饰剂中是最适合的基准，现在已经上市有多种聚乙二醇修饰制剂，在医疗场所得以应用。另一方面，欧州药品管理局(EMA)在2012年报告了如下现象：若将用分子量为4万以上的高分子量的聚乙二醇修饰的生物相关物质以一定的投与量以上长时间对动物进行投与，则在一部分组织的细胞内产生液泡(非专利文献1)。如果考虑到现在没有报告称液泡的产生自身会对人体造成不良影响，且上述EMA的报告中使用的投与量是与医疗场所通常应用的投与量相比极高的用量等，则可以说现在制造销售的用分子量为4万以上的聚乙二醇进行了修饰的治疗制剂的安全性没有问题。然而，还设想到在非常特殊的疾病(例如侏儒症等)的治疗中以高用量且长期对患者投与聚乙二醇修饰制剂的治疗方案。因此，可预料到在该特殊的状况下也可应用的、不会使细胞产生液泡的聚乙二醇修饰制剂的开发存在潜在的需求。
非专利文献2中，将与通常的聚乙二醇修饰制剂的投与量相比明显过量的聚乙二醇单独且长期对动物进行投与，结果是，在分子量为2万时未观察到液泡，在分子量为4万时确认到液泡的产生。作为抑制液泡的一个手段，可以考虑减小聚乙二醇的分子量，但减小分子量时，产生无法充分改善生物相关物质的血中半衰期的问题。
针对将高分子量的聚乙二醇在体内分解至低分子量的聚乙二醇并促进其从肾脏中排出的技术，存在报告例。专利文献1中，存在涉及具有在生物体内被切断的硫醚键、肽键部位的聚乙二醇衍生物的记载。存在该聚乙二醇衍生物在生物体内被分解至适合于从肾脏中排出的分子量的记载。但是，完全未示出与具体分解相关的数据，也没有促进从肾脏中排出的数据。进而，没有与细胞的液泡相关的记载。
专利文献2中，存在涉及具有能够在生物体内的低pH环境下发生水解的缩醛部位的聚乙二醇衍生物的记载。存在该聚乙二醇衍生物被分解至适合于在生物体内从肾脏中排出的分子量的记载。但是，没有促进从肾脏中排出的具体数据，进而，也没有与细胞的液泡相关的记载。此外，已知这些能够水解的缩醛部位会在血中会缓缓地分解，可预料到其无法充分改善被修饰的生物相关物质的血中半衰期。
另一方面，存在为了使药物有效地释放而导入了分解性寡肽的聚乙二醇衍生物、在体内分解的水凝胶等的报告例。
非专利文献3中报告了：存在涉及具有因酶而发生分解的寡肽部位的聚乙二醇衍生物的记载。此处，寡肽作为抗癌剂与聚乙二醇之间的连接物而被导入，寡肽因在肿瘤附近特异性表达的酶而发生分解，高效地释放抗癌剂。其目的是释放抗癌剂，并不是出于抑制细胞液泡的目的而对聚乙二醇赋予分解性。
非专利文献4中，存在涉及使用具有因酶而分解的寡肽部位的交联分子和多支链型的聚乙二醇衍生物得到的水凝胶的记载。此处，寡肽被用作将多支链型的聚乙二醇衍生物连在一起的交联分子，进而，能够对水凝胶赋予利用酶的分解性。其目的是制备分解性的水凝胶，并不是出于抑制细胞液泡的目的而对聚乙二醇赋予分解性。
专利文献3中，存在涉及以寡肽作为骨架的支链型的聚乙二醇衍生物的记载。此处，寡肽被用作聚乙二醇衍生物的基本骨架，并不赋予利用酶的分解性。此外，其特征在于，寡肽中包含赖氨酸、天冬氨酸等在侧链具有氨基、羧基的氨基酸，其目的是合成将它们利用于反应的支链型的聚乙二醇衍生物。并不是用于抑制细胞液泡的聚乙二醇衍生物。
进而，在对生物相关物质进行修饰的用途中使用的聚乙二醇衍生物通常存在直链型和支链型，非专利文献5中，存在与直链型相比支链型更显著地使生物相关物质的血中半衰期延长的记载。近年来，已上市的聚乙二醇修饰制剂绝大多数采用支链型。但是，至今为止在该领域中，没有涉及抑制细胞液泡的支链型的聚乙二醇衍生物的报告。
如上所述，寻求在血中稳定且能够改善被修饰的生物相关物质的血中半衰期、在被细胞吞噬时能够在细胞内特异性分解、能够抑制细胞液泡产生的支链型的高分子量的聚乙二醇衍生物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2009-527581号公报
专利文献2：WO2005/108463
专利文献3：WO2006/088248
非专利文献
非专利文献1：EMA/CHMP/SWP/647258/2012
非专利文献2：Daniel G. Rudmann, et al., Toxicol. Pathol., 41, 970-983(2013)
非专利文献3：Francesco M Veronese, et al., Bioconjugate Chem., 16,775-784(2005)
非专利文献4：Jiyuan Yang, et al., Marcomol. Biosci., 10(4), 445-454(2010)
非专利文献5：Yulia Vugmeysterang, et al., Bioconjugate Chem., 23,1452-1462(2012)。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于，提供不会引起细胞液泡的高分子量的支链型聚乙二醇衍生物。更具体而言，课题在于，利用能够工业生产的制法来提供可有效地用于对生物相关物质进行修饰的用途、在生物体内的血中稳定且在细胞内被分解的支链型分解性聚乙二醇衍生物。
用于解决课题的手段
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发明了具有在细胞内发生分解的寡肽的支链型分解性聚乙二醇衍生物。
即，本发明提供下式(1)所示的支链型分解性聚乙二醇衍生物。
[1] 支链型分解性聚乙二醇衍生物，其用下式(1)表示，所述支链型分解性聚乙二醇衍生物的分子内具有在细胞内发生分解的寡肽。
[化1]
Figure 528301DEST_PATH_IMAGE001
(式中，k1和k2各自独立地为1~12，j1和j2各自独立地为45~950，R为氢原子、取代或未取代的碳原子数1~12的烷基、取代芳基、芳烷基或杂烷基，Z为因细胞内的酶而发生分解的寡肽，X为能够与生物相关物质发生反应的官能团，L1和L2各自独立地为单键或2价的间隔基团)。
[2] 根据[1]所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，Z的分解性寡肽是具有甘氨酸作为C末端的氨基酸的寡肽。
[3] 根据[1]~[2]中任一项所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，Z的分解性寡肽是具有至少1个亲水性指标为2.5以上的疏水性的中性氨基酸的寡肽。
[4] 根据[1]~[3]中任一项所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其总分子量为20,000以上。
[5] 根据[1]~[4]中任一项所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，L1和L2各自独立地为单键、氨基甲酸酯键、酰胺键、醚键、硫醚键、仲氨基、脲键、或者任选包含这些键和/或基团的亚烷基。
[6] 根据[1]~[5]中任一项所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，X选自活性酯基、活性碳酸酯基、醛基、异氰酸酯基、异硫代氰酸酯基、环氧基、马来酰亚胺基、乙烯基磺酰基、丙烯酰基、磺酰氧基、羧基、硫醇基、二硫代吡啶基、α-卤代乙酰基、炔基、烯丙基、乙烯基、氨基、氧基氨基、酰肼基和叠氮基。
本发明中，作为其它方式，还提供下式(2)所示的支链型分解性聚乙二醇衍生物。
[6] 支链型分解性聚乙二醇衍生物，其用下式(2)表示。
[化2]
Figure 507759DEST_PATH_IMAGE002
(式中，k1和k2各自独立地为1~12，j1和j2各自独立地为45~950，R为氢原子、取代或未取代的碳原子数1~4的烷基、取代芳基、芳烷基或杂烷基，W为以谷氨酸或赖氨酸作为中心的对称结构的5~47个残基的寡肽，a为2~8，X为能够与生物相关物质发生反应的官能团，L1和L2各自独立地为单键或2价的间隔基团)。
[7] 根据[6]所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，W的以谷氨酸或赖氨酸作为中心的对称结构的寡肽是具有以下的w1或w2的结构的寡肽。
[化3]
Figure 287496DEST_PATH_IMAGE003
[化4]
Figure 745022DEST_PATH_IMAGE004
(式中，Q为谷氨酸或赖氨酸的残基，并且，Z为由除了半胱氨酸之外的中性氨基酸形成的2~5个残基的分解性寡肽)。
[8] 根据[7]所述的分解性聚乙二醇衍生物，其中，Z的分解性寡肽是具有甘氨酸作为C末端的氨基酸的寡肽。
[9] 根据[7]或[8]中任一项所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，Z的分解性寡肽是具有至少1个亲水性指标为2.5以上的疏水性的中性氨基酸的寡肽。
[10] 根据[6]~[9]中任一项所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其总分子量为20,000以上。
[11] 根据[6]~[10]中任一项所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，L1和L2各自独立地为单键、氨基甲酸酯键、酰胺键、醚键、硫醚键、仲氨基、脲键、或者任选包含这些键和/或基团的亚烷基。
[12] 根据[6]~[11]中任一项所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，X选自活性酯基、活性碳酸酯基、醛基、异氰酸酯基、异硫代氰酸酯基、环氧基、马来酰亚胺基、取代马来酰亚胺基、乙烯基磺酰基、丙烯酰基、取代磺酸盐基、磺酰氧基、羧基、巯基、吡啶基二硫基、α-卤代乙酰基、烷基羰基、碘代乙酰胺基、烯基、炔基、取代炔基、氨基、氧基氨基、酰肼基和叠氮基。
发明效果
本发明的支链型分解性聚乙二醇衍生物在生物体内的血中是稳定的，其结构内具有因细胞内的酶而发生分解的寡肽。因此，该支链型分解性聚乙二醇衍生物在血中是稳定的，能够对生物相关物质赋予与以往的不具有分解性的聚乙二醇衍生物同等的血中半衰期。进而，该支链型分解性聚乙二醇衍生物被吞噬至细胞内的情况下，寡肽部位迅速被分解，因此，能够抑制至今为止成为课题的细胞液泡的产生。此外，通过将对聚乙二醇导入的寡肽限定至具有甘氨酸作为C末端的氨基酸的寡肽等，从而能够降低在制造工序中产生的杂质，能够工业制造。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本发明所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物用下式(1)表示。
[化5]
Figure 559394DEST_PATH_IMAGE005
式(1)中，k1和k2各自独立地为1~12，j1和j2各自独立地为45~950，R为氢原子、取代或未取代的碳原子数1~12的烷基、取代芳基、芳烷基或杂烷基，Z为因细胞内的酶而发生分解的寡肽，X为能够与生物相关物质发生反应的官能团，L1和L2各自独立地为单键或2价的间隔基团。
本发明的式(1)的聚乙二醇衍生物的总分子量通常为4,000~160,000，优选为10,000~120,000，进一步优选为20,000~80,000。本发明的一个优选实施方式中，本发明的式(1)的聚乙二醇衍生物的总分子量为20,000以上。此处提及的分子量是指数均分子量(Mn)。
式(1)中的k1和k2通常各自独立地为1~12，优选各自独立地为1~6，进一步优选各自独立地为1~2。
式(1)中的j1和j2分别为聚乙二醇的重复单元数，通常各自独立地为45~950，优选各自独立地为110~690，进一步优选各自独立地为220~480。
式(1)中的R为氢原子、取代或未取代的碳原子数1~12的烷基、取代芳基、芳烷基或杂烷基。“杂烷基”是指包含选自氮原子、氧原子和硫原子中的1~5个杂原子的烷基。R优选为氢原子或碳原子数1~3的烷基，更优选为氢原子、甲基或乙基，进一步优选为氢原子。
式(1)中的L1和L2各自独立地为单键或2价的间隔基团，这些间隔基团只要是能够形成共价键的基团即可，没有特别限定，优选为亚苯基、酰胺键、醚键、硫醚键、氨基甲酸酯键、仲氨基、羰基、脲键、或者任选包含这些键和/或基团的亚烷基，更优选为亚烷基、酰胺键、醚键、氨基甲酸酯键、仲氨基、或者羰基与亚烷基键合而形成的基团，特别优选的方式用下述组(I)表示。此外，可以将组(I)的间隔基团组合2个~5个。由于酯键和碳酸酯键会在生物体内的血中缓缓分解，因此不适合作为2价的间隔基团。
组(I)：
[化6]
Figure 444174DEST_PATH_IMAGE006
(z1)~(z11)中，式中的s表示0~10的整数，优选表示0~6的整数，进一步优选表示0~3的整数。此外，(z2)~(z11)中，式中的s可以相同或不同。
式(1)中的L1优选为单键或者组(I)的(z2)、(z3)、(z4)、(z6)、(z7)、(z8)、(z9)、(z10)、(z2)与(z6)的组合，更优选为单键、(z3)、(z6)、(z9)、(z10)、(z2)与(z6)的组合。
式(1)中的L2优选为组(I)的(z1)、(z2)、(z3)、(z4)、(z5)、(z6)、(z7)、(z8)、(z11)，更优选为(z3)、(z5)、(z11)。
式(1)中的Z只要是在生物体内的血中稳定且因细胞内的酶而发生分解的寡肽即可，没有特别限定，优选为由除了半胱氨酸之外的中性氨基酸形成的2~8个残基的寡肽，更优选为由除了半胱氨酸之外的中性氨基酸形成的2~6个残基的寡肽，进一步优选为由除了半胱氨酸之外的中性氨基酸形成的2~4个残基的寡肽。
此外，式(1)中的Z优选为由侧链具有氨基、羧基的氨基酸构成的寡肽，具体而言，优选为由不包括赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸在内的中性氨基酸构成的寡肽。此处，所使用的氨基酸为α-氨基酸，且基本为L型。
进而，作为中性氨基酸的半胱氨酸具有硫醇基，与其它硫醇基形成二硫醚键，因此，式(1)中的Z是由不包括半胱氨酸在内的中性氨基酸形成的寡肽是理想的。
并且，式(1)中的Z优选为具有甘氨酸作为C末端的氨基酸的寡肽。使C末端的羧基与聚乙二醇衍生物发生反应时，基本上需要用缩合剂等对C末端的羧基进行活化。已知的是：该活化工序中，除了甘氨酸之外的氨基酸容易发生差向异构化，会副产立体异构体。通过将寡肽的C末端的氨基酸设为手性的甘氨酸，从而能够得到不副产立体异构体的高纯度目标物。
进而，式(1)中的Z优选为具有至少1个亲水性指标为2.5以上的疏水性的中性氨基酸、具体为苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸的寡肽，进一步优选为具有苯丙氨酸的寡肽。由Kyte和Doolittle制作的定量表示氨基酸的疏水性的亲水性指标(hydropathyindex)表示：值越大则越是疏水的氨基酸(Kyte J & Doolittle RF, 1982, J Mol Biol,157:105-132.)。
式(1)中的Z只要是在生物体内的血中稳定且具有因细胞内的酶而发生分解的性能，且由除了半胱氨酸之外的中性氨基酸形成的2~8个残基的寡肽即可，没有特别限定，作为具体例，为甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-亮氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸-甘氨酸、缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸、苯丙氨酸-甘氨酸等，优选为甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸-甘氨酸、缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸、苯丙氨酸-甘氨酸，更优选为甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸-甘氨酸、缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸，更进一步优选为甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸-甘氨酸。
式(1)中的X只要是与成为化学修饰对象的生理活性蛋白质、肽、抗体、核酸等生物相关物质中存在的官能团发生反应而形成共价键的官能团即可，没有特别限定。可列举出例如“Harris, J. M. Poly(Ethylene Glycol) Chemistry; Plenum Press: New York,1992”、“Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques, 2nd ed.; Academic Press: SanDiego, CA, 2008”和“PEGylated Protein Drugs: Basic Science and ClinicalApplications; Veronese, F. M., Ed.; Birkhauser: Basel, Switzerland,2009”等中记载的官能团。
式(1)中的X所示的“能够与生物相关物质发生反应的官能团”只要是能够与生物相关物质所具有的氨基、巯基、醛基、羧基、不饱和键或叠氮基等官能团形成化学键的官能团即可，没有特别限定。
具体而言，可列举出活性酯基、活性碳酸酯基、醛基、异氰酸酯基、异硫代氰酸酯基、环氧基、羧基、巯基、马来酰亚胺基、取代马来酰亚胺基、酰肼基、二硫代吡啶基、取代磺酸盐基、乙烯基磺酰基、氨基、氧基氨基(H2N-O-基)、碘乙酰胺基、烷基羰基、烯基(例如烯丙基、乙烯基)、炔基、取代炔基(例如后述被碳原子数1~5的烃基取代的炔基)、叠氮基、丙烯酰基、磺酰氧基(例如烷基磺酰氧基)、α-卤代乙酰基等，优选为活性酯基、活性碳酸酯基、醛基、异氰酸酯基、异硫代氰酸酯基、环氧基、马来酰亚胺基、取代马来酰亚胺基、乙烯基磺酰基、丙烯酰基、磺酰氧基(例如碳原子数1~5的烷基-磺酰氧基)、取代磺酸盐基、羧基、巯基、吡啶基二硫基、α-卤代乙酰基、炔基、取代炔基(例如后述被碳原子数1~5的烃基取代的碳原子数2~5的炔基)、烯丙基、乙烯基、氨基、氧基氨基、酰肼基和叠氮基，更优选为活性酯基、活性碳酸酯基、醛基、马来酰亚胺基、氧基氨基和氨基，特别优选为活性酯基、活性碳酸酯基、醛基、马来酰亚胺基和氧基氨基。
在其它的适合实施方式中，该官能团X可分类为下述的组(II)、组(III)、组(IV)、组(V)、组(VI)和组(VII)。
组(II)：能够与生物相关物质所具有的氨基发生反应的官能团。
可列举出下述的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(j)或(k)所示的基团。
组(III)：能够与生物相关物质所具有的巯基发生反应的官能团。
可列举出下述的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)或(l)所示的基团。
组(IV)：能够与生物相关物质所具有的醛基发生反应的官能团。
可列举出下述的(h)、(m)、(n)或(p)所示的基团。
组(V)：能够与生物相关物质所具有的羧基发生反应的官能团。
可列举出下述的(h)、(m)、(n)或(p)所示的基团。
组(VI)：能够与生物相关物质所具有的不饱和键发生反应的官能团。
可列举出下述的(h)、(m)或(o)所示的基团。
组(VII)：能够与生物相关物质所具有的叠氮基发生反应的官能团。
可列举出下述的(l)所示的基团。
[化7]
Figure DEST_PATH_IMAGE007
官能团(j)中，式中的W1表示氯原子(Cl)、溴原子(Br)或碘原子(I)等卤素原子，优选为Br或I，更优选为I。
此外，官能团(e)和官能团(l)中，式中的Y1、Y3各自独立地表示氢原子或碳原子数1~5的烃基，优选为碳原子数1~5的烃基。作为碳原子数1~5的烃基，具体而言，可列举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基等，优选为甲基或乙基。
此外，官能团(k)中，式中的Y2表示任选包含氟原子且碳原子数为1~10的烃基，具体而言，可列举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、己基、壬基、乙烯基、苯基、苄基、4-甲基苯基、三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-(三氟甲氧基)苯基等，优选为甲基、乙烯基、4-甲基苯基或2,2,2-三氟乙基。
活性酯基是指具有脱离能力高的烷氧基的酯基。作为脱离能力高的烷氧基，可列举出由硝基苯酚、N-羟基琥珀酰亚胺、五氟苯酚等衍生的烷氧基。活性酯基优选为具有由N-羟基琥珀酰亚胺衍生的烷氧基的酯基。
活性碳酸酯基是指具有脱离能力高的烷氧基的碳酸酯基。作为脱离能力高的烷氧基，可列举出由硝基苯酚、N-羟基琥珀酰亚胺、五氟苯酚等衍生的烷氧基。活性碳酸酯基优选为具有由硝基苯酚或N-羟基琥珀酰亚胺衍生的烷氧基的碳酸酯基。
取代马来酰亚胺基是指在马来酰亚胺基的双键的单个碳原子上键合有烃基的马来酰亚胺基。具体而言，烃基可列举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基等，优选为甲基或乙基。
取代磺酸盐基是指在磺酸盐基的硫原子上键合有任选包含氟原子的烃基的磺酸盐基。作为任选包含氟原子的烃基，具体而言，可列举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、己基、壬基、乙烯基、苯基、苄基、4-甲基苯基、三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-(三氟甲氧基)苯基等，优选为甲基、乙烯基、4-甲基苯基或2,2,2-三氟乙基。
作为本发明的式(1)的支链型分解性聚乙二醇衍生物的适合例子，可列举出以下的支链型分解性聚乙二醇衍生物。
[支链型分解性聚乙二醇衍生物(1-1)]
式(1)的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，
k1和k2各自独立地为1~2；
j1和j2各自独立地为220~480；
R为氢原子；
Z为由除了半胱氨酸之外的中性氨基酸形成的2~8个残基的寡肽(例如苯丙氨酸-甘氨酸)；
X选自活性酯基(例如N-琥珀酰亚胺基氧基羰基)、醛基(例如N-(甲酰基乙基)氨甲酰基)、羧基、马来酰亚胺基(例如N-(N-马来酰亚胺基乙基羰基氨基乙基)氨甲酰基)和氨基(例如N-(氨基乙基)氨甲酰基)；
L1和L2各自独立地为任选包含仲氨基和/或羰基的亚烷基(例如亚丙基)。
式(1)所示的支链型分解性聚乙二醇衍生物可通过例如下述那样的工序来制造。
反应1
[化8]
Figure 711207DEST_PATH_IMAGE008
反应1中的A为脱离基团，R、j1、k1、k2与前述含义相同。
式(3)中的A为脱离基团，只要是在偶联反应中具有反应性的脱离基团即可，没有特别限定，可列举出例如氯基、溴基、碘基、甲磺酸盐基、甲苯磺酸盐基、氯甲烷磺酸盐基等。
反应1是使式(3)所示的聚乙二醇衍生物与式(4)所示的化合物在无水溶剂中、在强碱催化剂的存在下发生偶联反应，从而得到式(5)所示的聚乙二醇衍生物的工序。
作为前述偶联反应中的强碱催化剂，只要是进行反应的强碱催化剂即可，没有特别限定，可列举出例如氢氧化钾、氢氧化钠、甲醇钠、乙醇钠等。
作为前述偶联反应中的无水溶剂，只要是不与式(3)和式(4)所示的化合物发生反应的溶剂即可，没有特别限定，可列举出例如四氢呋喃、乙腈、DMF、二氯甲烷、氯仿等非质子性极性溶剂、以及它们的混合物。
优选对在反应中副产的杂质或者未被反应消耗而残留的化合物、强碱催化剂进行纯化去除。纯化没有特别限定，可利用萃取、重结晶、吸附处理、再沉淀、柱色谱法、超临界萃取等进行纯化。
反应2
[化9]
Figure DEST_PATH_IMAGE009
反应2中的Pro为保护基，Peptide为寡肽，L3为与前述L1和L2含义相同的单键或2价的间隔基团，并且，j2与前述含义相同。
反应2中的Pro为保护基，此处，保护基是指在某种反应条件下防止或阻止分子中的特定的可发生化学反应的官能团发生反应的成分。保护基根据要保护的能够发生化学反应的官能团的种类、所使用的条件和分子中的其它官能团或保护基的存在而变化。保护基的具体例可以在多种一般性书籍中找到，例如记载于“Wuts, P. G. M.; Greene, T. W.Protective Groups in Organic Synthesis, 4th ed.; Wiley-Interscience: NewYork, 2007”。此外，被保护基保护的官能团通过使用适合于各自保护基的反应条件进行脱保护，即发生化学反应，从而能够再生出原本的官能团。保护基的代表性的脱保护条件记载于前述文献中。
反应2是通过缩合反应使式(6)所示的N末端的氨基被保护基保护的寡肽的羧基与式(7)所示的单个末端为甲氧基的聚乙二醇衍生物的氨基进行键合，从而得到式(8)所示的聚乙二醇衍生物的工序。
寡肽的N末端的氨基的保护基没有特别限定，可列举出例如酰基系保护基和氨基甲酸酯系保护基，具体而言，可列举出三氟乙酰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基等。
作为缩合反应，没有特别限定，理想的是使用缩合剂的反应。作为缩合剂，可以单独使用二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)等碳二亚胺系的缩合剂，也可以与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)等试剂组合使用。此外，可以使用反应性更高的HATU、HBTU、TATU、TBTU、COMU、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物n水合物(DMT-MM)等缩合剂。此外，为了促进反应，也可以使用三乙胺、二甲基氨基吡啶等碱。
优选对在反应中副产的杂质或者未被反应消耗而残留的寡肽、缩合剂等进行纯化去除。纯化没有特别限定，可利用萃取、重结晶、吸附处理、再沉淀、柱色谱法、超临界萃取等进行纯化。
脱保护3
[化10]
Figure 972424DEST_PATH_IMAGE010
Peptide、L3和j2与上述含义相同。
脱保护3是对反应2中得到的式(8)所示的聚乙二醇衍生物的保护基进行脱保护，从而得到式(9)所示的聚乙二醇衍生物的工序。作为脱保护反应，可以使用以往公知的方法，需要使用寡肽、L3的2价的间隔基团不会分解的条件。此外，本工序也可以作为反应2的工序的一环来实施。
优选对在脱保护反应中副产的杂质等进行纯化去除。纯化没有特别限定，可利用萃取、重结晶、吸附处理、再沉淀、柱色谱法、超临界萃取等进行纯化。
反应4
[化11]
Figure DEST_PATH_IMAGE011
反应4中的k3为1~6的整数，Peptide、j2和L3与上述含义相同。
式(8)中的k3为1~6的整数，优选为2~4的整数。
反应4是使脱保护3中得到的式(9)所示的聚乙二醇衍生物的末端氨基在碱催化剂的存在下与式(10)所示的化合物反应而转化成羧基的工序。
优选对反应4中副产的杂质等进行纯化去除。纯化没有特别限定，可利用萃取、重结晶、吸附处理、再沉淀、柱色谱法、超临界萃取等进行纯化。
反应5
[化12]
Figure 969199DEST_PATH_IMAGE012
反应5中的Peptide、L3、k3和j2与上述含义相同。
反应5是使反应4中得到的式(11)所示的聚乙二醇衍生物与式(12)所示的化合物在碱催化剂的存在下发生反应，从而得到导入有活性酯基的式(13)所示的聚乙二醇衍生物的工序，本工序也可作为反应4的工序的一环来实施。
反应6
[化13]
Figure DEST_PATH_IMAGE013
反应6中的Peptide、R、L3、j1、j2、k1、k2和k3与上述含义相同。
反应6是使反应1中得到的式(5)所示的聚乙二醇衍生物的氨基与反应5中得到的式(13)所示的聚乙二醇衍生物的活性酯基通过反应而键合，从而得到式(14)所示的支链型分解性聚乙二醇衍生物的工序。
优选对反应中副产的杂质或者未被反应消耗而残留的聚乙二醇衍生物等进行纯化去除。纯化没有特别限定，可利用萃取、重结晶、吸附处理、再沉淀、柱色谱法、超临界萃取等进行纯化。
针对将式(14)所示的聚乙二醇衍生物的末端羧基转化成其它官能团的工序，以下说明典型例子，但转化方法不限定于此。
例如，想要将式(15)所示的聚乙二醇衍生物的末端羧基转化成马来酰亚胺基时，通过在碱催化剂的存在下与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺发生缩合反应，从而能够得到目标物。
例如，想要将式(14)所示的聚乙二醇衍生物的末端羧基转化成氨基时，可通过在碱催化剂的存在下与N-(9-H-芴-9-基甲氧基羰基)-1,2-乙二胺发生缩合反应后，再发生脱保护反应来获得。
这些反应试剂是低分子量的试剂，其溶解性与作为高分子量聚合物的聚乙二醇衍生物明显不同，因此，可利用萃取、晶析等一般的纯化方法来容易地去除。
作为本发明的其它方式，提供下式(2)所示的支链型分解性聚乙二醇衍生物。
[化14]
Figure 759300DEST_PATH_IMAGE014
式(2)中，k1和k2各自独立地为1~12，j1和j2各自独立地为45~950，R为氢原子、取代或未取代的碳原子数1~4的烷基、取代芳基、芳烷基或杂烷基，W为以谷氨酸或赖氨酸作为中心的对称结构的5~47个残基的寡肽，a为2~8，X为能够与生物相关物质发生反应的官能团，L1和L2各自独立地为单键或2价的间隔基团。
本发明的式(2)的聚乙二醇衍生物的总分子量通常为4,000~160,000，优选为10,000~120,000，进一步优选为20,000~80,000。本发明的一个优选实施方式中，本发明的式(2)的聚乙二醇衍生物的总分子量为20,000以上。此处提及的分子量是指数均分子量(Mn)。
式(2)中的k1和k2通常各自独立地为1~12，优选各自独立地为1~6，进一步优选各自独立地为1~2。
式(2)中的j1和j2分别为聚乙二醇的重复单元数，通常各自独立地为45~950，优选各自独立地为110~690，进一步优选各自独立地为220~480。
式(2)中的W只要是以谷氨酸或赖氨酸作为中心的对称结构的5~47个残基、优选5~27个残基、更优选5~19个残基的寡肽，是在生物体内的血中稳定且因细胞内的酶而发生分解的寡肽即可，没有特别限定，作为构成寡肽的氨基酸，优选的是：除了构成中心部分的谷氨酸或赖氨酸之外，由除了半胱氨酸之外的中性氨基酸形成。此处提及的以谷氨酸或赖氨酸作为中心的对称结构的寡肽是指：谷氨酸的α位羧基和γ位羧基或者赖氨酸的α位氨基和ε位氨基上键合有同一个肽的化合物，且以谷氨酸或赖氨酸作为中心而成对的肽呈现对称结构的寡肽。作为该寡肽中的中性氨基酸与谷氨酸或赖氨酸的数量的构成比(中性氨基酸的数量/谷氨酸的数量)，通常为2~10，优选为2~8，进一步优选为2~6。构成W的氨基酸基本为L型。
W的特别优选方式用下述组(VIII)表示。
组(VIII)：
[化15]
Figure DEST_PATH_IMAGE015
[化16]
Figure 575947DEST_PATH_IMAGE016
(式中，Q为谷氨酸或赖氨酸的残基，Z为由除了半胱氨酸之外的中性氨基酸形成的2~5个残基的分解性寡肽)。
式(2)中的a为与W所示的寡肽键合的聚乙二醇链的条数，通常为2~8，优选为2或4或8，进一步优选为2或4。
需要说明的是，R、X、L1、L2和(w1)~(w2)中的Z的优选方式如针对前述式(1)而说明的那样。
式(2)的优选方式之一是W为w1、a=2的下式(15)所示的三支链型分解性聚乙二醇衍生物。
[化17]
Figure DEST_PATH_IMAGE017
(式中，Q、Z、R、k1、k2、j1、j2、X、L1和L2与前述含义相同)。
式(2)的优选方式之一是W为w2、a=4的下式(16)所示的五支链型分解性聚乙二醇衍生物。
[化18]
Figure 312958DEST_PATH_IMAGE018
(式中，Q、R、Z、k1、k2、j1、j2、X、L1和L2与前述含义相同)。
作为本发明的式(2)的支链型分解性聚乙二醇衍生物的适合例子，可列举出以下的支链型分解性聚乙二醇衍生物。
[支链型分解性聚乙二醇衍生物(2-1)]
式(2)的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，
k1和k2各自独立地为1~2；
j1和j2各自独立地为220~480；
R为氢原子；
W为以谷氨酸或赖氨酸作为中心的对称结构的5~9个残基的寡肽(例如甘氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸)；
a为2或4；
X为羧基；
L1和L2各自独立地为任选包含醚键、仲氨基和/或羰基的亚烷基(例如亚丙基、亚戊基)。
本发明的支链型分解性聚乙二醇衍生物在Q为谷氨酸残基的情况下，可通过例如下述那样的工序来制造。
反应7
[化19]
Figure DEST_PATH_IMAGE019
反应7中的Pro、Peptide、L3和j2与上述含义相同。
反应7是通过缩合反应使脱保护3中得到的式(9)所示的聚乙二醇衍生物的氨基与式(17)所示的氨基被保护基保护的谷氨酸衍生物的两个羧基进行键合，从而得到2条分解性聚乙二醇链借助谷氨酸残基而相连的结构的式(18)所示的支链型的聚乙二醇衍生物的工序。
与前述反应2同样，理想的是使用缩合剂的反应，为了促进反应，可以使用三乙胺、二甲基氨基吡啶等碱。
谷氨酸的氨基的保护基没有特别限定，可列举出例如酰基系保护基和氨基甲酸酯系保护基，具体而言，可列举出三氟乙酰基、9-芴基甲氧基羰基和叔丁氧基羰基等。
优选对反应中副产的杂质或者未被反应消耗而残留的聚乙二醇衍生物等进行纯化去除。纯化没有特别限定，可利用萃取、重结晶、吸附处理、再沉淀、柱色谱法、超临界萃取等进行纯化。
脱保护8
[化20]
Figure 901590DEST_PATH_IMAGE020
脱保护8中的Peptide、L3和j2与上述含义相同。
脱保护8是对反应7中得到的式(18)所示的聚乙二醇衍生物的保护基进行脱保护，从而得到式(19)所示的聚乙二醇衍生物的工序。其能够在与前述脱保护3相同的条件下进行反应和纯化。
作为从式(19)所示的聚乙二醇衍生物中去除分子量、官能团不同的聚乙二醇杂质的方法，可以使用日本特开2014-208786、日本特开2011-79934中记载的纯化技术。
反应9
[化21]
Figure DEST_PATH_IMAGE021
反应9中的Pro、Peptide、L3和j2与上述含义相同。
反应9是通过缩合反应使脱保护8中得到的式(19)所示的聚乙二醇衍生物的氨基与式(17)所示的氨基被保护基保护的谷氨酸衍生物的两个羧基进行键合，从而得到4条分解性聚乙二醇链借助谷氨酸残基而相连的结构的式(20)所示的支链型的聚乙二醇衍生物的工序。其能够在与前述反应2相同的条件下进行反应和纯化。
脱保护10
[化22]
Figure 393752DEST_PATH_IMAGE022
脱保护10中的Peptide、L3和j2与上述含义相同。
脱保护10是对反应9中得到的式(20)所示的聚乙二醇衍生物的保护基进行脱保护，从而得到式(21)所示的聚乙二醇衍生物的工序。其能够在与前述脱保护8相同的条件下进行反应和纯化。此外，本工序也可以通过反应9的一系列工序来实施。
反应11
[化23]
Figure DEST_PATH_IMAGE023
反应11中的Peptide、L3、j2和k3与上述含义相同。
反应11是使脱保护8中得到的式(19)所示的二支链型聚乙二醇衍生物的末端氨基在碱催化剂的存在下与式(22)所示的化合物发生反应而转化成羟基，从而得到式(23)所示的二支链型聚乙二醇衍生物的工序。其能够在与前述反应4相同的条件下进行反应和纯化。
进而，代替反应11中的式(19)所示的二支链型聚乙二醇衍生物，通过将脱保护10中得到的式(21)所示的四支链型聚乙二醇衍生物作为原料，从而能够得到下式(24)所示的四支链型聚乙二醇衍生物。
[化24]
Figure 963273DEST_PATH_IMAGE024
式(24)的Peptide、L3、j2和k3与上述含义相同。
反应12
[化25]
Figure DEST_PATH_IMAGE025
反应12中的Peptide、L3、j2和k3与上述含义相同。
反应12是使反应11中得到的式(23)所示的二支链型聚乙二醇衍生物的羟基与式(25)所示的化合物发生反应，从而得到导入有活性碳酸酯基的式(26)所示的二支链型的聚乙二醇衍生物的工序，本工序也可作为反应11的工序的一环来实施，其能够在与前述反应5相同的条件下进行反应和纯化。
进而，代替反应12中的式(23)所示的二支链型的聚乙二醇衍生物，通过将式(24)所示的四支链型聚乙二醇衍生物作为原料，从而能够得到下式(27)所示的四支链型聚乙二醇衍生物。
[化26]
Figure 238397DEST_PATH_IMAGE026
式(27)的Peptide、L3、j2和k3与上述含义相同。
反应13
[化27]
Figure DEST_PATH_IMAGE027
反应13中的Peptide、R、L3、j1、j2、k1、k2和k3与上述含义相同。
反应13是使反应1中得到的式(5)所示的聚乙二醇衍生物的氨基与反应12中得到的式(26)所示的聚乙二醇衍生物的活性酯基经反应而键合，从而得到式(28)所示的三支链型分解性聚乙二醇衍生物的工序，其能够在与前述反应6相同的条件下进行反应和纯化。
进而，代替反应13中的式(26)所示的二支链型的聚乙二醇衍生物，通过将式(27)所示的四支链型的聚乙二醇衍生物作为原料，从而能够得到下式(29)所示的五支链型聚乙二醇衍生物。
[化28]
Figure 678605DEST_PATH_IMAGE028
式(29)的Peptide、R、L3、j1、j2、k1、k2和k3与上述含义相同。
针对将式(28)或式(29)所示的支链型的聚乙二醇衍生物的末端羧基转化成其它官能团的工序，以下说明典型例子，但转化方法不限定于此。
例如，想要将式(28)或式(29)所示的支链型的聚乙二醇衍生物的末端羧基转化成马来酰亚胺基时，通过在碱催化剂的存在下与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺发生缩合反应，从而能够得到目标物。
例如，想要将式(28)或式(29)所示的聚乙二醇衍生物的末端羧基转化成氨基时，可通过在碱催化剂的存在下与N-(9-H-芴-9-基甲氧基羰基)-1,2-乙二胺发生缩合反应后，再发生脱保护反应来获得。
这些反应试剂是低分子量的试剂，其溶解性与作为高分子量聚合物的聚乙二醇衍生物明显不同，因此，可利用萃取、晶析等一般的纯化方法来容易地去除。
要求历经以上那样的工序而得到的支链型的分解性聚乙二醇在血中稳定，且具有仅在细胞内发生分解的性能。为了适当评价其性能，例如，可以实施以下所示那样的试验，来评价支链型的分解性聚乙二醇在血中的稳定性和在细胞内的分解性。
需要说明的是，在这些评价中考虑由聚乙二醇衍生物所具有的官能团种类带来的影响，将评价试样全部统一成具有1个氨基的聚乙二醇衍生物来实施试验。
针对用于评价支链型分解性聚乙二醇衍生物在血中的稳定性的试验方法，没有特别限定，可列举出例如使用小鼠、大鼠、人等的血清进行的试验等。具体而言，可通过将聚乙二醇衍生物以浓度达到1~10mg/mL的方式溶解于血清，在37℃下培养96小时后，回收血清中包含的聚乙二醇衍生物，并测定GPC来评价分解率。分解率由稳定性试验前的聚乙二醇衍生物的GPC主级分的峰面积%和稳定性试验后的聚乙二醇衍生物的GPC主级分的峰面积%来计算。具体而言，使用以下的式子。
分解率 = (试验前的峰面积% - 试验后的峰面积%) ÷ 试验前的峰面积% ×100
例如，若稳定性试验前的支链型分解性聚乙二醇衍生物的GPC主级分的峰面积%为95%，试验后的GPC主级分的峰面积%为90%，则分解率如下那样地计算。
分解率 = (95-90)÷95×100 = 5.26(%)
若支链型分解性聚乙二醇衍生物在血中发生分解，则无法获得目标的血中半衰期，因此，在稳定性试验中，96小时后的分解率优选为10%以下，进一步优选为5%以下。
针对用于评价支链型分解性聚乙二醇衍生物在细胞内的分解性的试验方法，没有特别限定，可列举出例如使用含有支链型分解性聚乙二醇衍生物的培养基来培养细胞的试验等。针对此处使用的细胞、培养基，没有特别限定，具体而言，可通过将聚乙二醇衍生物以浓度达到1~20mg/mL的方式溶解于作为培养基的RPMI-1640，使用该培养基将巨噬细胞RAW264.7在37℃下培养96小时后，回收细胞中的聚乙二醇衍生物，并测定GPC来评价分解率。分解率与稳定性试验同样地，使用试验前后的聚乙二醇衍生物的GPC主级分的峰面积%来计算。
例如，若使用细胞进行分解性试验前的支链型分解性聚乙二醇衍生物的GPC主级分的峰面积%为95%，试验后的GPC主级分的峰面积%为5%，则分解率如下那样地计算。
分解率 = (95-5)÷95×100 = 94.7(%)
若支链型分解性聚乙二醇衍生物在细胞内未被有效分解，则无法抑制作为目标的细胞液泡，因此，在分解性试验中，96小时后的分解率优选为90%以上，进一步优选为95%以上。
非专利文献2中，存在由高分子量的聚乙二醇导致的细胞液泡化与聚乙二醇在组织中的蓄积有关的记载。针对用于评价分解性聚乙二醇衍生物在细胞内的蓄积性的试验方法，没有特别限定，可通过上述在细胞内的分解性来评价。
实施例
以下，基于实施例更具体地说明本发明，但本发明不受以下实施例的限定。
下述实施例中得到的1H-NMR由日本电子データム公司制的JNM-ECP400或JNM-ECA600来获得。测定中使用φ5mm管，氘代溶剂使用D2O或含有四甲基硅烷(TMS)作为内标物质的CDCl3和d6-DMSO。所得聚乙二醇衍生物的分子量和末端官能团纯度使用液相色谱仪(GPC和HPLC)来计算。关于液相色谱仪的系统，GPC使用东曹公司制的“HLC-8320GPCEcoSEC”，HPLC使用WATERS公司制的“ALLIANCE”。
[实施例1]
[化29]
Figure DEST_PATH_IMAGE029
[实施例1-1]
[化30]
Figure 76089DEST_PATH_IMAGE030
将平均分子量=20,000、日油公司制的“SUNBRIGHT MEH-20T”)(10g)溶解于甲苯(40g)，在110℃下进行1小时的回流脱水后，冷却至40℃，添加三乙胺(80mg)、甲磺酰氯(84mg)，在40℃下使其反应3小时。反应结束后，用甲苯(100g)稀释后，添加己烷(100g)，在室温下搅拌30分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，将析出物回收后，溶解于乙酸乙酯(200g)，添加己烷(100g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用己烷(100g)洗涤，使用5A滤纸进行抽滤，进行真空干燥而得到化合物(p1)。收量为8.9g。
1H-NMR(CDCl3)：3.08ppm(s、3H、-O-SO2-CH3 )3.38ppm(s、3H、-O-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)j-O-CH3 )、3.64ppm(m、约1,900H、-O-CH2-CH2-(O-CH2-CH2 )j-O-CH3)。
[实施例1-2]
[化31]
Figure DEST_PATH_IMAGE031
将盐酸甘氨酸(5g)溶解于离子交换水(50g)。将NaOH(3.0g)添加至前述甘氨酸水溶液中，将pH调整至10.8。其后，将实施例1-1中得到的化合物(p1)(8g)添加至前述水溶液中，将该溶液在40℃下反应72小时。反应后，用盐酸溶液将反应液的pH中和至约7。中和后，添加氯仿(50g)，在室温下搅拌15分钟后，回收有机层。将有机层浓缩，再溶解于乙酸乙酯(100g)，添加己烷(50g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用己烷(50g)洗涤，使用5A滤纸进行抽滤，进行真空干燥而得到化合物(p2)。收量为6.8g。
1H-NMR(d6-DMSO)：2.72ppm(t、2H、-NH-CH2 -CH2-(O-CH2-CH2)j-O-CH3)3.24ppm(s、3H、-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)j-O-CH3 )、3.48ppm(m、约1,900H、-CH2 -NH-CH2-CH2 -(O-CH2- CH2 )j-O-CH3)、5.52ppm(broad、1H、-NH-CH2-COOH)。
[实施例1-3]
[化32]
Figure 132906DEST_PATH_IMAGE032
向N末端被9-芴基甲氧基羰基(Fmoc基)保护的L-苯基丙氨酰基-甘氨酸(Fmoc-Phe-Gly)(0.44g)和平均分子量=20,000、日油公司制的“SUNBRIGHT MEPA-20T”(10g)中添加乙腈(40g)而进行溶解。其后，添加二异丙基乙胺(1.56g)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物n水合物(DMT-MM)(0.22g)，在室温下、在氮气气氛下反应1小时。反应结束后，在40℃下进行浓缩，向浓缩物中添加甲苯(100g)，搅拌至均匀后，使用5A滤纸进行抽滤。向所得滤液中添加己烷(100g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，再次溶解于甲苯(100g)，添加己烷(100g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用己烷(50g)洗涤，使用5A滤纸进行抽滤，进行真空干燥，得到上述化合物(p3)。收量为8.6g。
1H-NMR(d6-DMSO)：1.62ppm(m、2H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3)、2.80ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.04ppm(m、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.10ppm(m、2H、-CO-NH-CH2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3)、3.24ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3 )、3.48ppm(m、约1,900H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)j-CH3)、4.20ppm(m、4H)、7.33ppm(m、9H)、7.66ppm(m、4H、Ar)、7.88ppm(d、2H、Ar)、8.27ppm(t、1H)。
[实施例1-4]
[化33]
Figure DEST_PATH_IMAGE033
将化合物(p3)(8.0g)溶解于乙腈(40g)。其后，添加哌啶(0.86g)，在室温下、在氮气气氛下反应2小时。反应结束后，添加20%食盐水(80g)，在室温下搅拌15分钟，进行洗涤。将有机层与水层分离后，再次向有机层中添加20%食盐水(80g)，在室温下搅拌15分钟，进行洗涤，回收有机层。将所得有机层在40℃下进行浓缩，向浓缩物中添加甲苯(200g)、硫酸镁(10g)，在室温下搅拌30分钟，进行脱水后，使用5A滤纸进行抽滤。向所得滤液中添加己烷(100g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用己烷(100g)洗涤，使用5A滤纸进行抽滤，进行真空干燥，得到上述化合物(p4)。收量为7.2g。
HPLC：胺纯度为92%。
1H-NMR(d6-DMSO)：1.62ppm(m、2H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3)、1.64ppm(broad、1H)、2.59ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、2.98ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.10ppm(q、2H、-CO-NH-CH2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3)、3.24ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3 )、3.48ppm(m、约1,900H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2- CH2 -O)j-CH3)、7.24ppm(m、6H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 、-NH-)、7.73ppm(t、1H)、8.12ppm(broad、1H)。
[实施例1-5]
[化34]
Figure 8458DEST_PATH_IMAGE034
将实施例1-4中得到的化合物(p4)(6.0g)、乙酸钠(49mg)、戊二酸酐(51mg)溶解于甲苯(25g)，在氮气气氛下在40℃下反应7小时。反应结束后，用甲苯(20g)稀释，使用5A滤纸进行抽滤，向所得滤液中添加己烷(30g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物。将所得析出物溶解于乙酸乙酯(100g)，添加己烷(50g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物，用己烷(50g)洗涤，使用5A滤纸进行抽滤，进行真空干燥，得到上述化合物(p5)。收量为4.8g。
1H-NMR(d6-DMSO)：1.62ppm(m、2H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3)、1.64ppm(broad、1H)、2.05ppm(dd、2H、-NH-CO-CH2-CH2 -CH2-COOH)2.30ppm(m、4H、-NH-CO-CH2 -CH2-CH2 -COOH)、2.59ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、2.98ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.10ppm(q、2H、-CO-NH-CH2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3)、3.24ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3 )、3.48ppm(m、约1,900H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2- CH2 -O)j-CH3)、7.24ppm(m、6H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 、-NH-)、7.73ppm(t、1H)、8.12ppm(broad、1H)。
[实施例1-6]
[化35]
Figure DEST_PATH_IMAGE035
将实施例1-5中得到的化合物(p5)(4.5g)和N-羟基琥珀酰亚胺(103mg)溶解于甲苯(25g)。其后，添加二环己基碳二亚胺(139mg)，在40℃下、在氮气气氛下反应3小时。反应结束后，添加甲苯(50g)来进行稀释，使用5A滤纸进行抽滤，向所得滤液中添加己烷(50g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，溶解于乙酸乙酯(100g)，添加己烷(50g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用己烷(50g)洗涤，使用5A滤纸进行抽滤，进行真空干燥，得到上述化合物(p6)。收量为3.5g。
活性酯纯度为98%(1H-NMR)。
1H-NMR(d6-DMSO)：1.62ppm(m、2H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3)、1.64ppm(broad、1H)、2.05ppm(dd、2H、-NH-CO-CH2-CH2 -CH2-CO-)、2.30ppm(m、4H、-NH-CO-CH2 -CH2-CH2 -COO-)、2.59ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、2.72ppm(s、4H、-CO-CH2-CH2 -CO-)、2.98ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.10ppm(q、2H、-CO-NH-CH2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3)、3.24ppm(s、3H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3 )、3.48ppm(m、约1,900H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)j-CH3)、7.24ppm(m、6H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 、-NH-)、7.73ppm(t、1H)、8.12ppm(broad、1H)。
[实施例1-7]
[化36]
Figure 506436DEST_PATH_IMAGE036
将实施例1-2中得到的化合物(p2)(3.0g)和实施例1-6中得到的化合物(p6)(3.0g)溶解于二氯甲烷(60g)后，添加三乙胺(95mg)，在室温下反应8小时。反应后，添加20%食盐水(50g)，在室温下搅拌15分钟，洗涤反应液后，回收有机层。向有机层中添加硫酸镁(10g)，在室温下搅拌15分钟后，使用5A滤纸进行抽滤。将所得滤液浓缩后，将浓缩物溶解于乙酸乙酯(100g)，添加己烷(50g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，再次溶解于乙酸乙酯(100g)，添加己烷(50g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用含有2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)(10mg)的己烷(50g)洗涤，使用5A滤纸进行抽滤，进行真空干燥，得到上述化合物(p7)。收量为4.2g。
HPLC：羧酸纯度为95%。
1H-NMR(d6-DMSO)：1.62ppm(m、2H、CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3)、1.64ppm(broad、1H)、2.05ppm(dd、2H、-NH-CO-CH2-CH2 -CH2-CO-)、2.30ppm(m、4H、-NH-CO-CH2 -CH2-CH2 -CO-)、2.59ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、2.98ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.24ppm(s、3H、-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)j-O-CH3 )、3.48ppm(m、约3,800H、-CH2-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2 )j-O-CH3)、4.61ppm(-CH2 -COOH)、7.24ppm(m、6H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 、-NH-)、7.73ppm(t、1H)、8.12ppm(broad、1H))。
[实施例2]
[化37]
Figure DEST_PATH_IMAGE037
将实施例1-7中得到的化合物(p7)(2.0g)和N-Fmoc-乙二胺(32mg)溶解于乙腈(5.0g)。其后，添加二异丙基乙胺(16mg)和DMT-MM(415mg)，在室温下、在氮气气氛下反应2小时。其后，添加哌啶(107mg)，在室温下、在氮气气氛下反应2小时。反应结束后，进行浓缩，将浓缩物再溶解于氯仿(50g)，添加20%食盐水(25g)，在室温下搅拌15分钟，进行洗涤，回收有机层。向所得有机层中添加硫酸镁(10g)，在室温下搅拌30分钟，进行脱水后，使用5A滤纸进行抽滤。将所得滤液在40℃下进行浓缩，向浓缩物中添加甲苯(100g)而进行溶解，添加己烷(50g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用含有6mg BHT的己烷(30g)洗涤，使用5A滤纸进行抽滤，进行真空干燥，得到上述化合物(p8)。收量为1.3g。
HPLC：胺纯度为93%。
1H-NMR(d6-DMSO)：1.62ppm(m、2H、CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3)、1.64ppm(broad、1H)、2.05ppm(dd、2H、-NH-CO-CH2-CH2 -CH2-CO-)、2.30ppm(m、4H、-NH-CO-CH2 -CH2-CH2 -CO-)、2.59ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、2.76ppm(m、2H、-NH-CH2-CH2 -NH2)、2.98ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.24ppm(s、3H、-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)j-O-CH3 )、3.48ppm(m、约3,800H、-CH2-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2 )j-O-CH3)、7.24ppm(m、6H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 、-NH-)、7.73ppm(t、1H)、7.80ppm(broad、1H)、8.12ppm(broad、1H)。
[实施例3]
[化38]
Figure 605979DEST_PATH_IMAGE038
将实施例1-7中得到的化合物(p7)(300mg)溶解于乙腈(2g)。其后，添加N-羟基琥珀酰亚胺(6mg)和二环己基碳二亚胺(6mg)，在40℃下、在氮气气氛下反应3小时。其后，添加三乙胺(3mg)和N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐(5mg)，在40℃下、在氮气气氛下反应3小时。反应结束后，进行浓缩，将浓缩物溶解于乙酸乙酯(50g)，添加己烷(30g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，再次溶解于乙酸乙酯(50g)，添加己烷(30g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用含有BHT(6mg)的己烷(30g)洗涤，使用5A滤纸进行抽滤，进行真空干燥，得到上述化合物(p9)。收量为264mg。马来酰亚胺纯度为92%(1H-NMR)。
1H-NMR(d6-DMSO)：1.62ppm(m、2H、CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3)、1.64ppm(broad、1H)、2.05ppm(dd、2H、-NH-CO-CH2-CH2 -CH2-CO-)、2.30ppm(m、4H、-NH-CO-CH2 -CH2-CH2 -CO-)、2.59ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、2.66ppm(t、2H、-NH-CO-CH2 -CH2-马来酰亚胺)、2.98ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.24ppm(s、3H、-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)j-O-CH3 )、3.48ppm(m、约3,800H、-CH2-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2 )j-O-CH3)、4.76ppm(t、2H、-NH-CO-CH2-CH2 -马来酰亚胺)、6.98ppm(s、2H、-CO-CH-CH-CO-)、7.24ppm(m、6H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 、-NH-)、7.73ppm(t、1H)、7.80ppm(broad、1H)、8.01ppm(broad,1H)、8.12ppm(broad、1H)。
[实施例4]
[化39]
Figure DEST_PATH_IMAGE039
向实施例1-7中得到的化合物(p7)(1.2g)中添加甲苯(6g)，在40℃下进行加热溶解。其后，添加N-羟基琥珀酰亚胺(24mg)和二环己基碳二亚胺(24mg)，在40℃下、在氮气气氛下反应3小时。反应结束后，使用5A滤纸进行抽滤，将所得滤液用乙酸乙酯(100g)稀释，添加己烷(50g)，在室温下搅拌30分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用含有BHT(10mg)的己烷(50g)洗涤，使用5A滤纸进行抽滤，进行真空干燥，得到上述化合物(p10)。收量为1.0g。活性酯纯度为91%(1H-NMR)。
1H-NMR(d6-DMSO)：1.62ppm(m、2H、CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3)、1.64ppm(broad、1H)、2.05ppm(dd、2H、-NH-CO-CH2-CH2 -CH2-CO-)、2.30ppm(m、4H、-NH-CO-CH2 -CH2-CH2 -CO-)、2.59ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、2.72ppm(s、4H、-CO-CH2-CH2 -CO-)、2.98ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.24ppm(s、3H、-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)j-O-CH3 )、3.48ppm(m、约3,800H、-CH2-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2 )j-O-CH3)、4.61ppm(-CH2 -OCO-琥珀酰亚胺)、7.24ppm(m、6H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 、-NH-)、7.73ppm(t、1H)、8.12ppm(broad、1H)。
[实施例5]
[化40]
Figure 350425DEST_PATH_IMAGE040
[实施例5-1]
[化41]
Figure DEST_PATH_IMAGE041
将实施例1-7中得到的化合物(p7)(800mg)在40℃下加热溶解于甲苯(7g)后，添加3-氨基丙醛二乙基缩醛(9mg)，在50℃下、在氮气气氛下反应2小时。反应结束后，添加乙酸乙酯(100g)，搅拌至均匀，添加己烷(50g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用含有BHT(10mg)的己烷(50g)洗涤，使用5A滤纸进行抽滤，进行真空干燥，得到上述化合物(p11)。收量为684mg。
1H-NMR(d6-DMSO)：1.20ppm(t、6H(CH3 -CH2-O)2-CH-)1.62ppm(m、2H、CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3)、1.64ppm(broad、1H)、1.85ppm(dd、2H、-NH-CH2-CH2 -CH-(O-CH2-CH3)2)、2.05ppm(dd、2H、-NH-CO-CH2-CH2 -CH2-CO-)、2.30ppm(m、4H、-NH-CO-CH2 -CH2-CH2 -CO-)、2.59ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、2.98ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.24ppm(s、3H、-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)j-O-CH3 )、3.48ppm(m、约3,800H、-CH2-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2 )j-O-CH3)、3.91ppm(-CH2 -CO-NH-CH2-CH2-CH-(O-CH2-CH3)2)、4.55ppm(t、1H、-CH-(O-CH2-CH3)2)7.24ppm(m、6H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 、-NH-)、7.73ppm(t、1H)、8.12ppm(broad、1H)。
[实施例5-2]
[化42]
Figure 295248DEST_PATH_IMAGE042
将实施例5-1中得到的化合物(p11)(600mg)溶解于pH调整至1.90的磷酸缓冲液(6.0g)中，在室温下、在氮气气氛下反应3小时。反应后，添加0.1N氢氧化钠水溶液，将pH调整至6.5后，添加氯化钠(1.5g)，进行溶解。向所得溶液中添加0.1N氢氧化钠水溶液，将pH调整至7.10后，添加含有BHT(2mg)的氯仿(10g)，在室温下搅拌20分钟，向有机层中萃取产物。将有机层与水层分离，回收有机层后，向水层中再次添加含有BHT(4mg)的氯仿(20g)，在室温下搅拌20分钟，向有机层中萃取产物。将第1次和第2次萃取中得到的有机层合并，在40℃下进行浓缩，将所得浓缩物溶解于乙酸乙酯(50g)，添加己烷(30g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用含有BHT(6mg)的己烷(30g)洗涤，使用5A滤纸进行抽滤，进行真空干燥，得到上述化合物(p12)。收量为457mg。醛纯度为90%(1H-NMR)。
1H-NMR(d6-DMSO)：1.62ppm(m、2H、CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3)、1.64ppm(broad、1H)、2.05ppm(dd、2H、-NH-CO-CH2-CH2 -CH2-CO-)、2.30ppm(m、4H、-NH-CO-CH2 -CH2-CH2 -CO-)、2.59ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、2.66ppm(dd、2H、-CO-NH-CH2-CH2 -CHO)、2.98ppm(dd、1H、-NH-CO-CH-CH2 -C6H5)、3.24ppm(s、3H、-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)j-O-CH3 )、3.48ppm(m、约3,800H、-CH2-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2 )j-O-CH3)、3.91ppm(s、2H、-CH2 -CO-NH-CH2-CH2-CHO)7.24ppm(m、6H、-NH-CO-CH-CH2-C6H5 、-NH-)、7.73ppm(t、1H)、8.12ppm(broad、1H)、9.72ppm(s、1H、-CO-NH-CH2-CH2-CHO)。
[实施例6]
[化43]
Figure DEST_PATH_IMAGE043
。
[实施例6-1]
[化44]
Figure 975628DEST_PATH_IMAGE044
向N末端被9-芴基甲氧基羰基(Fmoc基)保护的L-谷氨酸(Fmoc-Glu-OH)(16.0mg)和实施例1-4中得到的化合物(p4)(2.0g)中添加乙腈(10g)，在30℃下进行加热溶解。其后，添加二异丙基乙胺(15mg)和DMT-MM(39.0mg)，在室温下、在氮气气氛下反应1小时。其后，添加哌啶(111mg)，在室温下、在氮气气氛下反应2小时。反应结束后，将反应液用甲苯(80g)稀释后，添加己烷(40g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，再次溶解于甲苯(100g)，添加己烷(50g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用含有BHT(10mg)的己烷(50g)洗涤，使用5A滤纸进行抽滤，进行真空干燥，得到上述化合物(p13)。收量为1.6g。
HPLC：胺纯度为92%。
1H-NMR(d6-DMSO)：1.54ppm(m、2H、-NH-CO-CH(NH2)-CH2 -CH2-)、1.62ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-)、1.97ppm(m、2H、-NH-CO-CH(NH2)-CH2-CH2 -)、2.74ppm(dd、1H、-CO-NH-CH-CH2 -C6H5)、2.81ppm(dd、1H、-CO-NH-CH-CH2 -C6H5)、3.11ppm(m、11H)、3.24ppm(s、6H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3 )、3.64ppm(m、约3,800H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)j-CH3)、4.49ppm(m、1H、-CO-NH-CH-CH2-C6H5)、4.57ppm(m、1H、-CO-NH-CH-CH2-C6H5)、7.25ppm(m、10H、-CO-NH-CH-CH2-C6H5 )、7.74ppm(m、2H)、8.44ppm(m、2H)、8.61ppm(m、2H)。
[实施例6-2]
[化45]
Figure DEST_PATH_IMAGE045
将ε-己内酯(114mg)溶解于1N NaOH(0.8mL)，使其反应2小时，制备6-羟基己酸水溶液(0.88M)。此外，将实施例6-1中得到的化合物(p13)(1.5g)溶解于乙腈(6g)。其后，添加上述6-羟基己酸水溶液(80μL)、二异丙基乙胺(15mg)和DMT-MM(16mg)，在室温下、在氮气气氛下反应1小时。反应结束后，将反应液在40℃下进行浓缩，向所得浓缩物中添加氯仿(30g)，进行溶解。添加饱和碳酸氢钠水溶液(15g)，在室温下搅拌15分钟，进行洗涤。将水层与有机层分离后，再次向有机层中添加饱和碳酸氢钠水溶液(15g)，在室温下搅拌15分钟，进行洗涤，回收有机层。向所得氯仿溶液中添加硫酸镁(5g)，搅拌30分钟并进行脱水后，使用5A滤纸进行抽滤。将所得滤液在40℃下进行浓缩，向浓缩物中添加乙酸乙酯(50g)，搅拌至均匀后，添加己烷(25g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，再次溶解于乙酸乙酯(50g)，添加己烷(25g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用含有BHT(10mg)的己烷(50g)洗涤，使用5A滤纸进行抽滤，进行真空干燥，得到上述化合物(p14)。收量为1.2g。
1H-NMR(CDCl3)：1.37ppm(m、2H、HO-CH2-CH2-CH2 -CH2-CH2-CO-NH-)、1.55ppm(m、4H、HO-CH2-CH2 -CH2-CH2 -CH2-CO-NH-)、1.77ppm(m、4H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3)、1.85ppm(m、1H)、2.01ppm(m、2H、HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2 -CO-NH-)、3.01ppm(m、1H)、3.24ppm(m、8H)、3.38ppm(s、6H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3 )、3.64ppm(m、约3,800H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)j-CH3)、4.03ppm(m、4H)、4.14ppm(m、1H)、4.48ppm(m、2H、-CO-NH-CH-CH2-C6H5)、6.95ppm(broad、1H)、7.00ppm(broad、1H)、7.26ppm(m、10H、-CO-NH-CH-CH2-C6H5 )、7.66ppm(broad、1H)、8.29ppm(broad、1H)。
[实施例6-3]
[化46]
Figure 918176DEST_PATH_IMAGE046
将实施例6-2中得到的化合物(p14)(500mg)溶解于二氯甲烷(3.5g)。其后，添加碳酸二(N-琥珀酰亚胺基)酯(51mg)和吡啶(20mg)，在室温下、在氮气气氛下反应8小时。反应结束后，用5%食盐水(5g)洗涤反应液，添加硫酸镁(0.1g)，在25℃下搅拌30分钟后，使用5A滤纸进行抽滤。将所得滤液浓缩后，向浓缩物中添加乙酸乙酯(100g)，进行溶解后，添加己烷(50g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用含有BHT(5mg)的己烷(25g)洗涤，使用5A滤纸进行抽滤，进行真空干燥，得到上述化合物(p15)。收量为286mg。
活性碳酸酯纯度为91%(1H-NMR)。
1H-NMR(CDCl3)：1.38ppm(m、2H、琥珀酰亚胺-OCO-CH2-CH2-CH2 -CH2-CH2-CO-NH-)、1.59ppm(m、2H、琥珀酰亚胺-OCO-CH2-CH2-CH2-CH2 -CH2-CO-NH-)、1.75ppm(m、6H)、1.85ppm(m、1H)、2.13ppm(m、2H、琥珀酰亚胺-OCO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2 -CO-NH-)、2.83ppm(s、4H、-CO-CH2-CH2 -CO-)、3.01ppm(m、1H)、3.19ppm(m、6H)、3.38ppm(s、6H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3 )、3.64ppm(m、约3,800H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)j-CH3)、4.03ppm(m、3H)、4.18ppm(m、1H)、4.31ppm(t、2H、琥珀酰亚胺-OCO-CH2 -CH2-CH2-CH2-CH2-CO-NH-)、4.50ppm(m、2H、-CO-NH-CH-CH2-C6H5)、6.98ppm(broad、1H)、7.15ppm(broad、1H)、7.26ppm(m、10H、-CO-NH-CH-CH2-C6H5 )、7.81ppm(broad、1H)、8.37ppm(broad、1H)。
[实施例6-4]
[化47]
Figure DEST_PATH_IMAGE047
将实施例1-2中得到的化合物(p2)(125mg)和实施例6-3中得到的化合物(p15)(250mg)溶解于二氯甲烷(50g)后，添加三乙胺(0.5g)，在室温下反应8小时。反应后，添加20%食盐水(20g)，在室温下搅拌15分钟，洗涤反应液后，回收有机层。向有机层中添加硫酸镁(5g)，在室温下搅拌15分钟后，使用5A滤纸进行抽滤。将所得滤液浓缩后，将浓缩物溶解于乙酸乙酯(100g)，添加己烷(50g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用含有BHT(4mg)的己烷(20g)洗涤，使用5A滤纸进行抽滤，进行真空干燥，得到上述化合物(p16)。收量为242mg。
HPLC：羧酸纯度为90%。
1H-NMR(d6-DMSO)：1.29ppm(m、2H、-NH-CO-CH2-CH2-CH2 -CH2-CH2-OCO-)、1.58ppm(m、4H、-NH-CO-CH2-CH2 -CH2-CH2 -CH2-OCO-)、1.75ppm(m、6H)、1.85ppm(m、1H)、2.13ppm(m、2H、-NH-CO-CH2 -CH2-CH2-CH2-CH2-OCO-)、3.01ppm(m、1H)、3.19ppm(m、6H)、3.38ppm(s、6H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)j-CH3 )、3.64ppm(m、约5,700H、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2 -O)j-CH3)、3.90ppm(t、2H、-NH-CO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2 -OCO-)4.03ppm(m、3H)、4.18ppm(m、1H)、4.37ppm(s、2H、-CH2 -COOH)4.50ppm(m、2H、-CO-NH-CH-CH2-C6H5)、6.98ppm(broad、1H)、7.15ppm(broad、1H)、7.26ppm(m、10H、-CO-NH-CH-CH2-C6H5 )、7.81ppm(broad、1H)、8.37ppm(broad、1H)。
[比较例1]
[化48]
Figure 480744DEST_PATH_IMAGE048
[比较例1-1]
[化49]
Figure DEST_PATH_IMAGE049
将实施例1-2中得到的化合物(1g)和平均分子量为20,000的日油公司制的“SUNBRIGHT ME-200GS3”(1g)溶解于二氯甲烷(20g)后，添加三乙胺(0.2g)，在室温下反应8小时。反应后，添加20%食盐水(10g)，在室温下搅拌15分钟，洗涤反应液后，回收有机层。向有机层中添加硫酸镁(3g)，在室温下搅拌15分钟后，使用5A滤纸进行抽滤。将所得滤液浓缩后，将浓缩物溶解于乙酸乙酯(100g)，添加己烷(50g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用含有BHT(6mg)的己烷(30g)洗涤，使用5A滤纸进行抽滤，进行真空干燥，得到上述化合物(p17)。收量为1.2g。
HPLC：羧酸纯度为93%。
1H-NMR(d6-DMSO)：1.73ppm(m、2H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-(O-CH2-CH2)j-)、2.03ppm(m、2H、-NH-CO-CH2-CH2 -CH2-CO-N-)、2.34ppm(t、4H、-NH-CO-CH2 -CH2-CH2 -CO-N-)、3.40ppm(s、6H、-(O-CH2-CH2)j-O-CH3 )、3.55ppm(m、约3,800H、-CH2-(O-CH2-CH2 )j-O-CH3)、4.61ppm(s、2H、-CH2 -COOH)、7.70ppm(broad、1H、-CH2-NH-CO-CH2-CH2-CH2-CO-)。
[比较例1-2]
[化50]
Figure 963678DEST_PATH_IMAGE050
将比较例1-1中得到的化合物(p17)(1.0g)和N-Fmoc-乙二胺(16mg)溶解于乙腈(2.5g)。其后，添加二异丙基乙胺(8mg)和DMT-MM(208mg)，在室温下、在氮气气氛下反应2小时。其后，添加哌啶(107mg)，在室温下、在氮气气氛下反应2小时。反应结束后，进行浓缩，将浓缩物再溶解于氯仿(50g)，添加20%食盐水(25g)，在室温下搅拌15分钟，进行洗涤，回收有机层。向所得有机层中添加硫酸镁(10g)，在室温下搅拌30分钟，进行脱水后，使用5A滤纸进行抽滤。将所得滤液在40℃下进行浓缩，向浓缩物中添加甲苯(100g)，进行溶解，添加己烷(50g)，在室温下搅拌15分钟而使产物析出。使用5A滤纸进行抽滤，回收析出物后，用含有6mg BHT的己烷(30g)洗涤，使用5A滤纸进行抽滤，进行真空干燥，得到上述化合物(p8)。收量为581mg。
HPLC：胺纯度为90%。
1H-NMR(d6-DMSO)：1.73ppm(m、2H、-CO-NH-CH2-CH2 -CH2-(O-CH2-CH2)j-)、2.03ppm(m、2H、-NH-CO-CH2-CH2 -CH2-CO-N-)、2.34ppm(t、4H、-NH-CO-CH2 -CH2-CH2 -CO-N-)、2.76ppm(m、2H、-CH2-CO-NH-CH2-CH2 -NH2)、3.40ppm(s、6H、-(O-CH2-CH2)j-O-CH3 )、3.55ppm(m、约3,800H、-CH2-(O-CH2-CH2 )j-O-CH3)、3.66ppm(m、2H、-CH2-CO-NH-CH2 -CH2-NH2)、3.91ppm(s、2H、-N-CH2 -CO-NH-)、7.70ppm(broad、1H、-CH2-NH-CO-CH2-CH2-CH2-CO-)、7.83ppm(broad、1H、-CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH2)。
[实施例8]
血清中的稳定性试验
向1.5mL的EPPENDORF管中添加小鼠或人的血清1mL，分别以浓度达到5.0mg/mL的方式添加实施例2中得到的作为支链型分解性聚乙二醇衍生物的化合物(p8)、比较例1-2中得到的作为非分解性聚乙二醇衍生物的化合物(p18)和甲氧基PEG胺40kDa。在37℃下培养96小时后，取样200μL，向其中添加乙腈，用漩涡式搅拌器搅拌1分钟，使血清中的蛋白质析出，在离心分离后，回收上清液。接着，为了去除脂肪酸等疏水性物质而向回收液中添加己烷，用漩涡式搅拌器搅拌1分钟，在离心分离后，回收下层。将该溶液在真空条件下浓缩，从血清中回收聚乙二醇衍生物。其后，进行GPC分析，算出分解性聚乙二醇衍生物的分解率。
分解率利用以下的式子来计算。
分解率 = (试验前的40kDa的峰面积% - 试验后的40kDa的峰面积%) ÷ (试验前的40kDa的峰面积%) × 100
将结果示于表1。
[表1]
样品名 小鼠血清中的分解率 人血清中的分解率
实施例2 化合物(p8) 1% 1%
比较例1 化合物(p18) 0% 1%
非分解性 甲氧基PEG胺 40kDa 0% 0%
根据表1，作为支链型分解性聚乙二醇衍生物的化合物(p8)与作为非分解性聚乙二醇衍生物的化合物(p18)、甲氧基PEG胺40kDa同样地，未观察到其在血清中的分解。换言之，表示该分解性聚乙二醇衍生物在血中是稳定的。
[实施例9]
使用细胞进行的分解性试验
使用培养基RPMI-1640(10%FBS Pn/St)10mL，在100mm培养皿中接种RAW264.7 10×106cell，在37℃下培养24小时后，分别更换成以浓度达到10mg/mL的方式溶解有实施例2中得到的作为支链型分解性聚乙二醇衍生物的化合物(p8)、比较例1-2中得到的作为非分解性聚乙二醇衍生物的化合物(p18)和甲氧基PEG胺40kDa的培养基，在37℃下培养96小时。培养后，将细胞用1%SDS溶液溶解，并用PBS稀释，向其中添加乙腈，用漩涡式搅拌器搅拌1分钟，使细胞溶解液中的蛋白质析出，在离心分离后，回收上清液。接着，为了去除脂肪酸等疏水性物质而向回收液中添加己烷，用漩涡式搅拌器搅拌1分钟，在离心分离后，回收下层。将该溶液在真空条件下浓缩，从细胞内回收聚乙二醇衍生物。
此外，为了确认其在细胞培养所使用的培养基中的分解，仅用以浓度达到10mg/mL的方式溶解有各种聚乙二醇衍生物的培养基，在37℃下培养96小时，通过与上述相同的操作来进行聚乙二醇衍生物的回收。
其后，进行所回收的各种聚乙二醇衍生物的GPC分析，利用与实施例8相同的计算式，算出支链型分解性聚乙二醇衍生物的分解率。
将结果示于表2。
[表2]
样品名 在培养基中的分解率 在细胞内的分解率
实施例2 化合物(p8) 0% 99%
比较例1 化合物(p18) 0% 0%
非分解性 甲氧基PEG胺 40kDa 0% 0%
根据表2可确认：作为支链型分解性聚乙二醇衍生物的化合物(p8)在细胞内有效地分解(分解率为99%)，从分子量4万分解成分子量2万。支链型分解性聚乙二醇衍生物在细胞培养所使用的培养基中不分解，因此，可确认其在细胞内特异性地分解。另一方面，对于作为非分解性聚乙二醇衍生物的化合物(p18)和甲氧基PEG胺40kDa，均未观察到在细胞内的分解。
产业实用性
本发明的支链型分解性聚乙二醇衍生物是不会引起细胞液泡的高分子量的聚乙二醇衍生物，可有效地用于对生物相关物质进行修饰的用途，其在生物体内的血中是稳定的，且在细胞内被分解。
本申请以在日本申请的日本特愿2019-176251作为基础，将其内容全部包含在本说明书中。

Claims (12)

1.支链型分解性聚乙二醇衍生物，其用下式(1)表示，所述支链型分解性聚乙二醇衍生物的分子内具有在细胞内发生分解的寡肽，
Figure 209362DEST_PATH_IMAGE002
式(1)中，k1和k2各自独立地为1~12，j1和j2各自独立地为45~950，R为氢原子、取代或未取代的碳原子数1~12的烷基、取代芳基、芳烷基或杂烷基，Z为因细胞内的酶而发生分解的寡肽，X为能够与生物相关物质发生反应的官能团，L1和L2各自独立地为单键或2价的间隔基团。
2.根据权利要求1所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，Z的寡肽为由除了半胱氨酸之外的中性氨基酸形成的2~8个残基的分解性寡肽。
3.根据权利要求1~2中任一项所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，Z的寡肽为在C末端的氨基酸具有甘氨酸的肽。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，Z的寡肽是具有至少1个亲水性指标为2.5以上的疏水性氨基酸的寡肽。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，L1和L2各自独立地为单键、氨基甲酸酯键、酰胺键、醚键、硫醚键、仲氨基、脲键、或者包含这些键和/或基团的亚烷基。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，X选自活性酯基、活性碳酸酯基、醛基、异氰酸酯基、异硫代氰酸酯基、环氧基、马来酰亚胺基、乙烯基磺酰基、丙烯酰基、磺酰氧基、羧基、硫醇基、二硫代吡啶基、α-卤代乙酰基、炔基、烯丙基、乙烯基、氨基、氧基氨基、酰肼基和叠氮基。
7.支链型分解性聚乙二醇衍生物，其用下式(2)表示，
Figure 595344DEST_PATH_IMAGE004
式(2)中，k1和k2各自独立地为1~12，j1和j2各自独立地为45~950，R为氢原子、取代或未取代的碳原子数1~4的烷基、取代芳基、芳烷基或杂烷基，W为以谷氨酸或赖氨酸作为中心的对称结构的5~47个残基的寡肽，a为2~8，X为能够与生物相关物质发生反应的官能团，L1和L2各自独立地为单键或2价的间隔基团。
8.根据权利要求7所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，W的以谷氨酸或赖氨酸作为中心的对称结构的寡肽是具有以下的w1或w2的结构的寡肽，
Figure DEST_PATH_IMAGE005
Figure 575414DEST_PATH_IMAGE006
式中，Q为谷氨酸或赖氨酸的残基，Z为由除了半胱氨酸之外的中性氨基酸形成的2~5个残基的分解性寡肽。
9.根据权利要求8的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，Z的分解性寡肽是具有甘氨酸作为C末端的氨基酸的寡肽。
10.根据权利要求8~9中任一项所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，Z的分解性寡肽是具有至少1个亲水性指标为2.5以上的疏水性的中性氨基酸的寡肽。
11.根据权利要求7~10中任一项所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，L1和L2各自独立地为单键、氨基甲酸酯键、酰胺键、醚键、硫醚键、仲氨基、脲键、或者任选包含这些键和/或基团的亚烷基。
12.根据权利要求7~11中任一项所述的支链型分解性聚乙二醇衍生物，其中，X选自活性酯基、活性碳酸酯基、醛基、异氰酸酯基、异硫代氰酸酯基、环氧基、马来酰亚胺基、乙烯基磺酰基、丙烯酰基、磺酰氧基、羧基、硫醇基、二硫代吡啶基、α-卤代乙酰基、炔基、烯丙基、乙烯基、氨基、氧基氨基、酰肼基和叠氮基。
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