KR20200138336A - 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체 - Google Patents

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노부히로 니시야마
마코토 마쓰이
히로야스 다케모토
가즈키 미야우치
다카히로 노모토
게이시로 도모다
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니치유 가부시키가이샤
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Abstract

세포의 공포를 일으키지 않는 고분자량의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 제공하는 것.
하기 식 (1) :
Figure pct00130

(식 중, m은 1∼7이며, n1 및 n2는 각각 독립적으로 45∼682이며, p는 1∼4이며, R은 탄소수 1∼4의 알킬기이며, Z는 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼8 잔기의 올리고펩타이드이며, Q는 2∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 관능기이며, L1, L2, L3, L4 및 L5는 각각 독립적으로, 단결합 또는 2가의 스페이서이다.)로 표시되는 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.

Description

분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체
본 발명은, 생체 관련 물질을 수식하는 용도로 사용되는 세포 내에서 분해되는 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체에 관한 발명이다.
호르몬이나 사이토카인, 항체, 효소 등의 생체 관련 물질을 이용한 의약품은, 통상 생체 내에 투여되면 신장에 있어서의 사구체 여과나 간장이나 비장 등에 있어서의 매크로파지에 의한 흡수에 의해, 생체 내로부터 신속하게 배출되어 버린다. 그 때문에 혈중 반감기가 짧아, 충분한 약리 효과를 얻는 것이 곤란한 경우가 많다. 이 문제를 해결하기 위해, 생체 관련 물질을 당쇄나 폴리에틸렌글리콜 등의 친수성 고분자나 알부민 등에 의해 화학 수식하는 시도가 행하여지고 있다. 그 결과, 분자량의 증대나 수화층의 형성 등에 의해 생체 관련 물질의 혈중 반감기를 연장하는 것이 가능해진다. 또, 폴리에틸렌글리콜로 수식함으로써, 생체 관련 물질의 독성이나 항원성의 저하, 난수용성(難水溶性) 약제의 용해성 향상 등의 효과가 얻어지는 것도 잘 알려져 있다.
폴리에틸렌글리콜로 수식된 생체 관련 물질은, 폴리에틸렌글리콜의 에테르 결합과 물분자의 수소 결합으로 형성되는 수화층으로 덮여, 분자 사이즈가 커지는 점에서, 신장에 있어서의 사구체 여과를 회피할 수 있다. 또한 옵소닌이나 각 조직을 구성하는 세포 표면과의 상호 작용이 저하하여, 각 조직으로의 이행이 감소하는 것이 알려져 있다. 폴리에틸렌글리콜은 생체 관련 물질의 혈중 반감기를 연장시키는 우수한 소재이며, 그 성능은 분자량이 클수록 효과가 높은 것을 알 수 있다. 지금까지, 분자량 4만 이상의 고분자량의 폴리에틸렌글리콜로 수식한 생체 관련 물질의 연구가 다수 행하여지고 있고, 유의하게 그 혈중 반감기를 연장할 수 있는 결과가 얻어져 있다.
폴리에틸렌글리콜은 생체 관련 물질의 성능 개선에 이용되는 수식제 중에서 지적(至適) 기준으로 되어 있고, 현재는 폴리에틸렌글리콜 수식 제제가 복수 출시되어, 의료 현장에서 사용되고 있다. 한편으로, 2012년에 유럽 의약품청(EMA)으로부터, 분자량 4만 이상의 고분자량의 폴리에틸렌글리콜로 수식한 생체 관련 물질을 일정 투여량 이상으로 장기간 동물에 투여하면, 일부 조직의 세포 내에 공포가 발생한다는 현상이 보고되었다(비특허문헌 1). 현시점에 있어서, 공포의 발생 자체가 인체에 악영향을 준다는 보고는 없고, 또 앞서의 EMA의 보고에 있어서 이용된 투여량은, 의료 현장에 있어서 일반적으로 적용되는 투여량과 비교해 매우 고용량인 것 등을 고려하면, 현재 제조 판매되고 있는 분자량이 4만 이상인 폴리에틸렌글리콜로 수식된 치료 제제의 안전성은 문제없다고 할 수 있다. 그러나, 매우 특수한 질환(예를 들어, 소인증 등)의 치료에 있어서는, 폴리에틸렌글리콜 수식 제제를 고용량, 또한 장기간으로 환자에 투여하는 치료 프로토콜이 채용되는 것도 상정될 수 있다. 따라서, 이러한 특수한 상황에 있어서도 적용 가능한, 세포에 공포를 발생시키지 않는 폴리에틸렌글리콜 수식 제제의 개발에는 잠재적인 수요가 있다고 예상된다.
비특허문헌 2에 있어서는, 통상적인 폴리에틸렌글리콜 수식 제제의 투여량에 비해, 대과잉량의 폴리에틸렌글리콜을 단독으로 동물에 장기간 투여한 바, 분자량 2만에서는 공포는 보이지 않고, 분자량 4만에 있어서 공포의 발생이 확인되어 있다. 공포를 억제하는 수단의 하나로서, 폴리에틸렌글리콜의 분자량을 작게 하는 것이 고려되지만, 분자량을 작게 하면 생체 관련 물질의 혈중 반감기를 충분히 개선할 수 없다는 문제가 발생한다.
고분자량의 폴리에틸렌글리콜을 체내에서 저분자량의 폴리에틸렌글리콜로 분해하여, 신장으로부터의 배출을 촉진하는 기술에 대해서는 보고예가 있다.
특허문헌 1에는, 생체 내에서 절단되는 술파이드 결합이나 펩타이드 결합 부위를 가진 폴리에틸렌글리콜 유도체에 관한 기재가 되어 있다. 당해 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 생체 내에서 신장으로부터의 배출에 적합한 분자량까지 분해된다는 기재가 있다. 그러나, 구체적인 분해에 관한 데이터는 전혀 나타내어져 있지 않고, 신장으로부터의 배출이 촉진되었다는 데이터도 없다. 또한 세포의 공포에 관한 기재는 없다.
특허문헌 2에는, 생체 내의 저pH 환경하에 있어서 가수분해 가능한 아세탈 부위를 가진 폴리에틸렌글리콜 유도체에 관한 기재가 되어 있다. 당해 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 생체 내에서 신장으로부터의 배출에 적합한 분자량까지 분해된다는 기재가 있다. 그러나, 구체적으로 신장으로부터의 배출이 촉진되었다는 데이터는 없고, 또한 세포의 공포에 관한 기재도 없다. 또, 이들 가수분해가 가능한 아세탈 부위는 혈중에서도 서서히 분해되는 것이 알려져 있어, 수식한 생체 관련 물질의 혈중 반감기를 충분히 개선할 수 없다고 예상된다.
한편으로, 약물을 효과적으로 릴리스하기 위해서 분해성의 올리고펩타이드를 도입한 폴리에틸렌글리콜 유도체나 체내에서 분해되는 하이드로겔 등의 보고예는 있다.
비특허문헌 3에는, 효소에 의해 분해되는 올리고펩타이드 부위를 가진 폴리에틸렌글리콜 유도체에 관한 기재가 되어 있다. 여기서는 올리고펩타이드는 항암제와 폴리에틸렌글리콜 사이의 링커로서 도입되어 있고, 종양 주변에 특이적으로 발현하고 있는 효소에 의해 올리고펩타이드가 분해되어, 효율적으로 항암제를 릴리스하는 것이 보고되어 있다. 목적은 항암제의 릴리스이며, 세포의 공포를 억제할 목적으로 폴리에틸렌글리콜에 분해성을 부여하는 것은 아니다.
비특허문헌 4에는, 효소에 의해 분해되는 올리고펩타이드 부위를 가진 가교 분자와 다분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 이용한 하이드로겔에 관한 기재가 되어 있다. 여기서는 올리고펩타이드는 다분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 연결하는 가교 분자로서 이용되고, 또한 효소에 의한 분해성을 하이드로겔에 부여할 수 있다. 목적은 분해성의 하이드로겔의 조제이며, 세포의 공포를 억제할 목적으로 폴리에틸렌글리콜에 분해성을 부여하는 것은 아니다.
특허문헌 3에는, 올리고펩타이드를 골격으로 한 분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체에 관한 기재가 되어 있다. 여기서는 올리고펩타이드는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 기본 골격으로서 이용되고 있고, 효소에 의한 분해성을 부여하는 것은 아니다. 또, 올리고펩타이드에 리신이나 아스파라긴산 등, 측쇄에 아미노기나 카르복실기를 가진 아미노산을 포함하는 것이 특징이며, 그것들을 반응에 이용한 분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 합성하는 것이 목적이다. 세포의 공포를 억제할 목적의 폴리에틸렌글리콜 유도체는 아니다.
이상과 같이, 혈중에서는 안정적이며, 수식한 생체 관련 물질의 혈중 반감기를 충분히 개선하며, 세포에 흡수되었을 때에 세포 내에서 특이적으로 분해되어, 세포의 공포의 발생을 억제할 수 있는 고분자량의 폴리에틸렌글리콜 유도체가 요구되고 있다.
일본국 특허 공표 2009-527581호 공보 WO2005/108463 WO2006/088248
EMA/CHMP/SWP/647258/2012 Daniel G. Rudmann, et al., Toxicol. Pathol., 41, 970-983(2013) Francesco M Veronese, et al., Bioconjugate Chem., 16, 775-784(2005) Jiyuan Yang, et al., Marcomol. Biosci., 10(4), 445-454(2010)
본 발명의 과제는, 세포의 공포를 일으키지 않는 고분자량의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 제공하는 것에 있다. 보다 구체적으로는, 생체 관련 물질을 수식하는 용도로 효과적으로 이용할 수 있고, 생체 내의 혈중에서 안정적이며, 또한 세포 내에서 분해되는 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 세포 내에서 분해되는 올리고펩타이드를 가진 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 발명하였다.
즉, 본 발명은 이하에 나타내는 바와 같다.
[1] 하기 식 (1) :
Figure pct00001
(식 중, m은 1∼7이며, n1 및 n2는 각각 독립적으로 45∼682이며, p는 1∼4이며, R은 탄소수 1∼4의 알킬기이며, Z는 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼8 잔기의 올리고펩타이드이며, Q는 2∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 관능기이며, L1, L2, L3, L4 및 L5는 각각 독립적으로, 단결합 또는 2가의 스페이서이다.)
로 표시되는 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[2] Q가, 에틸렌글리콜, 리신, 아스파라긴산, 글루탐산, 글리세린, 펜타에리트리톨, 디글리세린 또는 크실리톨의 잔기인 [1]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[3] Q가, 올리고펩타이드의 잔기이며, 그 올리고펩타이드가, 리신, 아스파라긴산 및 글루탐산 중 어느 하나를 포함하고, 또한 그 이외의 아미노산이 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 4∼8 잔기의 올리고펩타이드인 [1]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[4] Q의 올리고펩타이드가, C 말단의 아미노산으로서 글리신을 갖는 올리고펩타이드인 [3]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[5] Q의 올리고펩타이드가, 하이드로퍼시(hydropathy) 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산을 적어도 하나 갖는 올리고펩타이드인 [3] 또는 [4]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[6] Z의 올리고펩타이드가, C 말단의 아미노산으로서 글리신을 갖는 올리고펩타이드인 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[7] Z의 올리고펩타이드가, 하이드로퍼시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산을 적어도 하나 갖는 올리고펩타이드인 [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[8] 총분자량이 30,000 이상인 [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[9] L1, L2, L3, L4 및 L5가 각각 독립적으로, 우레탄 결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 2급 아미노기, 우레아 결합, 또는 이들 결합 및 기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기인 [1]∼[8] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[10] X가 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데하이드기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭사이드기, 말레이미드기, 비닐술폰기, 아크릴기, 술포닐옥시기, 카르복실기, 티올기, 디티오피리딜기, α-할로아세틸기, 알키닐기, 알릴기, 비닐기, 아미노기, 옥시아미노기, 하이드라지드기 및 아지드기로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [1]∼[9] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[11] 식 (1) 중의 Z가, Z1, A 및 글리신 잔기로 구성되는, 하기 식 (2) :
Figure pct00002
(식 중, m은 1∼7이며, n1 및 n2는 각각 독립적으로 45∼682이며, p는 1∼4이며, R은 탄소수 1∼4의 알킬기이며, Z1은 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼6 잔기의 올리고펩타이드이며, A는 시스테인을 제외한 중성 아미노산이며, a 및 b는 각각 독립적으로 0 또는 1이며, 또한 (a＋b)≥1이며, Q는 2∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 관능기이며, L1, L2, L3, L4 및 L5는 각각 독립적으로, 단결합 또는 2가의 스페이서이다.)
로 표시되는 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체인, [1]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[12] Q가, 에틸렌글리콜, 리신, 아스파라긴산, 글루탐산, 글리세린, 펜타에리트리톨, 디글리세린 또는 크실리톨의 잔기인 [11]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[13] Q가, 올리고펩타이드의 잔기이며, 그 올리고펩타이드가, 리신, 아스파라긴산 및 글루탐산 중 어느 하나를 포함하고, 또한 그 이외의 아미노산이 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 4∼8 잔기의 올리고펩타이드인 [11]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[14] Q의 올리고펩타이드가, C 말단의 아미노산으로서 글리신을 갖는 올리고펩타이드인 [13]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[15] Q의 올리고펩타이드가, 하이드로퍼시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산을 적어도 하나 갖는 올리고펩타이드인 [13] 또는 [14]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[16] Z1의 올리고펩타이드가, 하이드로퍼시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산을 적어도 하나 갖는 올리고펩타이드인 [11]∼[15] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[17] A의 중성 아미노산이, 하이드로퍼시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산인 [11]∼[16] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[18] 총분자량이 30,000 이상인 [11]∼[17] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[19] L1, L2, L3, L4 및 L5가 각각 독립적으로, 우레탄 결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 2급 아미노기, 우레아 결합, 또는 이들 결합 및 기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기인 [11]∼[18] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[20] X가 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데하이드기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭사이드기, 말레이미드기, 비닐술폰기, 아크릴기, 술포닐옥시기, 카르복실기, 티올기, 디티오피리딜기, α-할로아세틸기, 알키닐기, 알릴기, 비닐기, 아미노기, 옥시아미노기, 하이드라지드기 및 아지드기로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [11]∼[19] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[21] 식 (2) 중의 m이 1인, 하기 식 (3) :
Figure pct00003
(식 중, n3 및 n4는 각각 독립적으로 45∼682이며, p는 1∼4이며, R은 탄소수 1∼4의 알킬기이며, Z1은 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼6 잔기의 올리고펩타이드이며, A는 시스테인을 제외한 중성 아미노산이며, a 및 b는 각각 독립적으로 0 또는 1이며, 또한 (a＋b)≥1이며, Q는 2∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 관능기이며, L1, L2, L3, L4 및 L5는 각각 독립적으로, 단결합 또는 2가의 스페이서이다.)
으로 표시되는 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체인, [11]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[22] Q가, 에틸렌글리콜, 리신, 아스파라긴산, 글루탐산, 글리세린, 펜타에리트리톨, 디글리세린 또는 크실리톨의 잔기인 [21]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[23] Q가, 올리고펩타이드의 잔기이며, 그 올리고펩타이드가, 리신, 아스파라긴산 및 글루탐산 중 어느 하나를 포함하고, 또한 그 이외의 아미노산이 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 4∼8 잔기의 올리고펩타이드인 [21]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[24] Q의 올리고펩타이드가, C 말단의 아미노산으로서 글리신을 갖는 올리고펩타이드인 [23]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[25] Q의 올리고펩타이드가, 하이드로퍼시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산을 적어도 하나 갖는 올리고펩타이드인 [23] 또는 [24]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[26] Z1의 올리고펩타이드가, 하이드로퍼시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산을 적어도 하나 갖는 올리고펩타이드인 [21]∼[25] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[27] A의 중성 아미노산이, 하이드로퍼시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산인 [21]∼[26] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[28] 총분자량이 30,000 이상인 [21]∼[27] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[29] L1, L2, L3, L4 및 L5가 각각 독립적으로, 우레탄 결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 2급 아미노기, 우레아 결합, 또는 이들 결합 및 기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기인 [21]∼[28] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[30] X가 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데하이드기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭사이드기, 말레이미드기, 비닐술폰기, 아크릴기, 술포닐옥시기, 카르복실기, 티올기, 디티오피리딜기, α-할로아세틸기, 알키닐기, 알릴기, 비닐기, 아미노기, 옥시아미노기, 하이드라지드기 및 아지드기로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [21]∼[29] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[31] 식 (1) 중의 Q가 에틸렌글리콜의 잔기이며, L1이 CH2CH2O이며, 또한 p가 1인, 하기 식 (4) :
Figure pct00004
(식 중, m은 1∼7이며, n5 및 n6은 각각 독립적으로 113∼682이며, R은 탄소수 1∼4의 알킬기이며, Z는 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼8 잔기의 올리고펩타이드이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 관능기이며, L2, L3, L4 및 L5는 각각 독립적으로, 단결합 또는 2가의 스페이서이다.)
로 표시되는 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체인, [1]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[32] Z의 올리고펩타이드가, C 말단의 아미노산으로서 글리신을 갖는 올리고펩타이드인 [31]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[33] Z의 올리고펩타이드가, 하이드로퍼시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산을 적어도 하나 갖는 올리고펩타이드인 [31] 또는 [32]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[34] 총분자량이 30,000 이상인 [31]∼[33] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[35] L2, L3, L4 및 L5가 각각 독립적으로, 우레탄 결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 2급 아미노기, 우레아 결합, 또는 이들 결합 및 기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기인 [31]∼[34] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[36] X가 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데하이드기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭사이드기, 말레이미드기, 비닐술폰기, 아크릴기, 술포닐옥시기, 카르복실기, 티올기, 디티오피리딜기, α-할로아세틸기, 알키닐기, 알릴기, 비닐기, 아미노기, 옥시아미노기, 하이드라지드기 및 아지드기로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [31]∼[35] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[37] 식 (2) 중의 Q가 에틸렌글리콜의 잔기이며, L1이 CH2CH2O이며, 또한 p가 1인, 하기 식 (5) :
Figure pct00005
(식 중, m은 1∼7이며, n5 및 n6은 각각 독립적으로 113∼682이며, R은 탄소수 1∼4의 알킬기이며, Z1은 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼6 잔기의 올리고펩타이드이며, A는 시스테인을 제외한 중성 아미노산이며, a 및 b는 각각 독립적으로 0 또는 1이며, 또한 (a＋b)≥1이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 관능기이며, L2, L3, L4 및 L5는 각각 독립적으로, 단결합 또는 2가의 스페이서이다.)
로 표시되는 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체인, [11]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[38] Z1의 올리고펩타이드가, 하이드로퍼시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산을 적어도 하나 갖는 올리고펩타이드인 [37]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[39] A의 중성 아미노산이, 하이드로퍼시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산인 [37] 또는 [38]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[40] 총분자량이 30,000 이상인 [37]∼[39] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[41] L2, L3, L4 및 L5가 각각 독립적으로, 우레탄 결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 2급 아미노기, 우레아 결합, 또는 이들 결합 및 기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기인 [37]∼[40] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[42] X가 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데하이드기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭사이드기, 말레이미드기, 비닐술폰기, 아크릴기, 술포닐옥시기, 카르복실기, 티올기, 디티오피리딜기, α-할로아세틸기, 알키닐기, 알릴기, 비닐기, 아미노기, 옥시아미노기, 하이드라지드기 및 아지드기로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [37]∼[41] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[43] 식 (3) 중의 Q가 에틸렌글리콜의 잔기이며, L1이 CH2CH2O이며, 또한 p가 1인, 하기 식 (6) :
Figure pct00006
(식 중, n7 및 n8은 각각 독립적으로 226∼682이며, R은 탄소수 1∼4의 알킬기이며, Z1은 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼6 잔기의 올리고펩타이드이며, A는 시스테인을 제외한 중성 아미노산이며, a 및 b는 각각 독립적으로 0 또는 1이며, 또한 (a＋b)≥1이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 관능기이며, L2, L3, L4 및 L5는 각각 독립적으로, 단결합 또는 2가의 스페이서이다.)
으로 표시되는 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체인, [21]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[44] Z1의 올리고펩타이드가, 하이드로퍼시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산을 적어도 하나 갖는 올리고펩타이드인 [43]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[45] A의 중성 아미노산이, 하이드로퍼시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산인 [43] 또는 [44]에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[46] 총분자량이 30,000 이상인 [43]∼[45] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[47] L2, L3, L4 및 L5가 각각 독립적으로, 우레탄 결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 2급 아미노기, 우레아 결합, 또는 이들 결합 및 기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기인 [43]∼[46] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[48] X가 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데하이드기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭사이드기, 말레이미드기, 비닐술폰기, 아크릴기, 술포닐옥시기, 카르복실기, 티올기, 디티오피리딜기, α-할로아세틸기, 알키닐기, 알릴기, 비닐기, 아미노기, 옥시아미노기, 하이드라지드기 및 아지드기로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [43]∼[47] 중 어느 하나에 기재된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
본 발명의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 생체 내의 혈중에서는 안정적이며, 세포 내의 효소에 의해 분해되는 올리고펩타이드를 폴리에틸렌글리콜쇄 사이에 가지고 있다. 그 때문에, 당해 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 혈중에서는 안정적이며, 종래의 분해성을 갖지 않는 폴리에틸렌글리콜 유도체와 동등의 혈중 반감기를 생체 관련 물질에 부여할 수 있다. 또한, 당해 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 세포 내에 흡수된 경우, 올리고펩타이드 부위가 신속하게 분해되기 때문에, 지금까지 과제로 되어 있던 세포의 공포의 발생을 억제할 수 있다. 또, 폴리에틸렌글리콜에 도입하는 올리고펩타이드를, C 말단의 아미노산으로서 글리신을 갖는 올리고펩타이드 등으로 한정함으로써, 제조 공정 중에 발생하는 불순물을 저감시켜, 공업적으로 제조하는 것이 가능해진다.
도 1은 실시예 1의 ME-200GLFG(L)-200PA의 GPC 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 실시예 15의 세포를 이용한 분해성 시험에 있어서, 세포 내로부터 회수한 ME-200GLFG(L)-200PA의 GPC 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 실시예 16의 방사성 동위체를 라벨화한 ME-200GLFG(L)-200PA와 메톡시 PEG 아민 40kDa의 체내 동태 결과(혈중 농도)를 나타낸다.
도 4는 실시예 16의 방사성 동위체를 라벨화한 ME-200GLFG(L)-200PA와 메톡시 PEG 아민 40kDa의 투여 후 48시간 후의 간장에의 체류량을 나타낸다.
도 5는 실시예 16의 방사성 동위체를 라벨화한 ME-200GLFG(L)-200PA와 메톡시 PEG 아민 40kDa의 투여 후 48시간 후의 신장에의 체류량을 나타낸다.
도 6은 실시예 16의 방사성 동위체를 라벨화한 ME-200GLFG(L)-200PA와 메톡시 PEG 아민 40kDa의 투여 후 48시간 후의 비장에의 체류량을 나타낸다.
도 7은 실시예 16의 방사성 동위체를 라벨화한 ME-200GLFG(L)-200PA와 메톡시 PEG 아민 40kDa의 투여 후 48시간 후의 폐에의 체류량을 나타낸다.
도 8은 실시예 17의 메톡시 PEG 아민 40kDa를 장기 투여한 마우스의 뇌 맥락총의 절편의 화상(화살표는 공포를 나타낸다)을 나타낸다.
도 9는 실시예 17의 ME-200GLFG(L)-200PA를 장기 투여한 마우스의 뇌 맥락총의 절편의 화상을 나타낸다.
도 10은 실시예 18의 PBS, 메톡시 PEG 아민 40kDa, 메톡시 PEG 아민 20kDa, ME-200GLFG(L)-200PA를 장기 투여한 마우스의 뇌 맥락총의 절편의 화상(갈색으로 염색된 부분이 PEG의 축적을 나타낸다)을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에 관련된 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 하기 식 (1)로 표시된다.
Figure pct00007
(식 중, m은 1∼7이며, n1 및 n2는 각각 독립적으로 45∼682이며, p는 1∼4이며, R은 탄소수 1∼4의 알킬기이며, Z는 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼8 잔기의 올리고펩타이드이며, Q는 2∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 관능기이며, L1, L2, L3, L4 및 L5는 각각 독립적으로, 결합 또는 2가의 스페이서이다.)
본 발명의 식 (1)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 총분자량은, 통상 20,000∼120,000이며, 바람직하게는 25,000∼80,000이며, 더욱 바람직하게는 30,000∼60,000이다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 식 (1)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 총분자량은 30,000 이상이다. 여기서 말하는 분자량이란 수평균 분자량(Mn)이다.
식 (1) 중의 n1과 n2는, 각각, 폴리에틸렌글리콜의 반복 유닛수이며, 통상 각각 독립적으로 45∼682이며, 바람직하게는 각각 독립적으로 113∼568이며, 더욱 바람직하게는 각각 독립적으로 180∼525이다. n1과 n2는, 상이해도 되고, 또 동일해도 된다.
식 (1) 중의 p는 1∼4이다. p가 1인 경우, 식 (1)의 폴리에틸렌글리콜 유도체는 직쇄형이며, p가 2∼4인 경우, 식 (1)의 폴리에틸렌글리콜 유도체는 분기형이다.
식 (1) 중의 R은, 탄소수 1∼4의 알킬기이며, 구체적인 예로서는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, t-부틸기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 탄소수 1∼3의 알킬기, 보다 바람직하게는 메틸기 또는 에틸기이며, 더욱 바람직하게는 메틸기이다.
식 (1) 중의 Z는, 생체 내의 혈중에서 안정적이며, 또한 세포 내의 효소에 의해 분해되는 올리고펩타이드이면 특별히 제한은 없지만, 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼8 잔기의 올리고펩타이드가 바람직하고, 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼6 잔기의 올리고펩타이드가 보다 바람직하고, 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼4 잔기의 올리고펩타이드가 더욱 바람직하다.
또, 식 (1) 중의 Z는, 측쇄에 아미노기나 카르복실기를 가지는 아미노산, 구체적으로는, 리신, 아스파라긴산, 글루탐산을 포함하지 않는 중성 아미노산으로 구성되는 올리고펩타이드인 것이 바람직하다. 본 발명의 식 (1)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 합성에 있어서는, 폴리에틸렌글리콜 유도체에 올리고펩타이드를 도입할 때, 올리고펩타이드의 N 말단의 아미노기, 또는 C 말단의 카르복실기를 폴리에틸렌글리콜 유도체와의 반응에 이용하고 있다. 그러나, 측쇄에 아미노기나 카르복실기를 가지는 아미노산이 올리고펩타이드에 포함되면, 폴리에틸렌글리콜 유도체가 목적인 N 말단의 아미노기나 C 말단의 카르복실기뿐만 아니라, 측쇄의 아미노기나 카르복실기에도 도입된 불순물이 발생한다. 이 불순물은 통상적인 추출이나 정석(晶析) 등의 정제 공정으로 제거하는 것은 어렵기 때문에, 순도 양호하게 목적물을 얻기 위해서는, 측쇄에 아미노기나 카르복실기를 가지지 않는 아미노산으로 이루어지는 올리고펩타이드를 이용하는 것이 바람직하다. 여기서 사용되는 아미노산은, α-아미노산이며, 또 기본적으로는 L형이다.
또한, 중성 아미노산인 시스테인은 티올기를 가지고 있고, 다른 티올기와 디술파이드 결합을 형성하기 때문에, 식 (1) 중의 Z는, 시스테인을 포함하지 않는 중성 아미노산으로 이루어지는 올리고펩타이드인 것이 바람직하다.
또한, 식 (1) 중의 Z는, C 말단의 아미노산으로서 글리신을 갖는 올리고펩타이드인 것이 바람직하다. C 말단의 카르복실기와 폴리에틸렌글리콜 유도체를 반응시킬 때는, 기본적으로 C 말단의 카르복실기를 축합제 등으로 활성화할 필요가 있다. 이 활성화의 공정에서, 글리신 이외의 아미노산에서는 에피메리화가 일어나기 쉬워, 입체 이성체가 부생하는 것이 알려져 있다. 올리고펩타이드의 C 말단의 아미노산을 아키랄한 글리신으로 함으로써, 입체 이성체의 부생이 없는, 고순도의 목적물을 얻을 수 있다.
또한, 식 (1) 중의 Z는, 하이드로퍼시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산, 구체적으로는 페닐알라닌, 류신, 발린, 이소류신을 적어도 하나 갖는 올리고펩타이드인 것이 바람직하고, 페닐알라닌을 갖는 올리고펩타이드인 것이 더욱 바람직하다. Kyte와 Doolittle에 의해 작성된, 아미노산의 소수성을 정량적으로 나타내는 하이드로퍼시 지표(hydropathy index)는, 값이 클수록 소수적인 아미노산인 것을 나타낸다(Kyte J & Doolittle RF, 1982, J Mol Biol, 157 : 105-132.).
식 (1) 중의 Z는, 생체 내의 혈중에서 안정적이며, 또한 세포 내의 효소에 의해 분해되는 성능을 갖고, 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼8 잔기의 올리고펩타이드이면 특별히 제한은 없지만, 구체적인 예로서는, 글리신-페닐알라닌-류신-글리신, 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신, 글리신-페닐알라닌-글리신, 글리신-류신-글리신, 발린-시트룰린-글리신, 발린-알라닌-글리신, 글리신-글리신-글리신, 페닐알라닌-글리신 등이며, 바람직하게는 글리신-페닐알라닌-류신-글리신, 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신, 글리신-페닐알라닌-글리신, 글리신-글리신-글리신, 발린-시트룰린-글리신, 발린-알라닌-글리신, 페닐알라닌-글리신이며, 보다 바람직하게는 글리신-페닐알라닌-류신-글리신, 글리신-페닐알라닌-글리신, 발린-시트룰린-글리신, 발린-알라닌-글리신, 페닐알라닌-글리신이며, 보다 더 바람직하게는 글리신-페닐알라닌-류신-글리신, 발린-시트룰린-글리신, 페닐알라닌-글리신이다.
식 (1) 중의 Q는 2∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기이다. 활성 수소로서는, 하이드록실기, 카르복실기, 아미노기 등의 수소를 들 수 있다(단, 본 발명에 있어서는, 1급 아미노기(-NH2)의 경우, 활성 수소는 1개로 센다.). 「2개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기」로서는, 에틸렌글리콜 등의 잔기를 들 수 있고, 「3개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기」로서는, 올리고펩타이드, 리신, 아스파라긴산, 글루탐산, 글리세린 등의 잔기를 들 수 있고, 「4개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기」로서는, 펜타에리트리톨, 디글리세린 등의 잔기를 들 수 있고, 「5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기」로서는, 크실리톨 등의 잔기를 들 수 있고, 바람직하게는 에틸렌글리콜, 리신, 아스파라긴산, 글루탐산, 글리세린, 펜타에리트리톨, 디글리세린 또는 크실리톨의 잔기, 혹은 올리고펩타이드의 잔기이며, 보다 바람직하게는 에틸렌글리콜, 리신, 글루탐산, 글리세린, 올리고펩타이드의 잔기이며, 특히 바람직하게는 에틸렌글리콜, 리신의 잔기이다.
또, Q의 활성 수소의 수인 v와, 식 (1)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 폴리에틸렌글리콜쇄의 개수를 나타내는 p의 관계는, 바람직하게는 v=p＋1이며, p=1인 경우에는 v=2이고, Q는 에틸렌글리콜 등의 잔기이며, p=2인 경우에는 v=3이고, Q는 글리세린, 리신, 아스파라긴산, 글루탐산 등의 잔기이며, p=3인 경우에는 v=4이고, Q는 펜타에리트리톨, 디글리세린 등의 잔기이며, p=4인 경우에는 v=5이고, Q는 크실리톨 등의 잔기이다.
Q가 올리고펩타이드의 잔기인 경우, 그 올리고펩타이드는, 생체 내의 혈중에서 안정적이며, 또한 세포 내의 효소에 의해 분해되는 성능을 갖고, 리신, 아스파라긴산 및 글루탐산 중 어느 하나를 포함하고, 또한 그 이외의 아미노산이 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 4∼8 잔기의 올리고펩타이드이면 특별히 제한은 없지만, 구체적인 예로서는, 글루탐산-글리신-페닐알라닌-류신-글리신, 글리신-글루탐산-페닐알라닌-류신-글리신, 글루탐산-글리신-글리신-페닐알라닌-글리신, 글루탐산-페닐알라닌-글리신, 글루탐산-글리신-페닐알라닌-글리신, 글루탐산-글리신-류신-글리신, 글루탐산-발린-시트룰린-글리신, 글루탐산-발린-알라닌-글리신, 글루탐산-페닐알라닌-글리신 등이며, 바람직하게는 글루탐산-글리신-페닐알라닌-류신-글리신, 글루탐산-글리신-페닐알라닌-글리신, 글루탐산-발린-시트룰린-글리신, 글루탐산-발린-알라닌-글리신이며, 보다 바람직하게는 글루탐산-글리신-페닐알라닌-류신-글리신, 글루탐산-발린-시트룰린-글리신이다. 그 올리고펩타이드는 또, C 말단의 아미노산으로서 글리신을 갖는 올리고펩타이드인 것이 바람직하다. 그 올리고펩타이드는 또한, 하이드로퍼시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산을 적어도 하나 갖는 올리고펩타이드인 것이 바람직하다. 또한, 그 올리고펩타이드의 상세한 설명에 대해서는, 상기 Z의 올리고펩타이드의 설명을 참조하길 바란다.
식 (1) 중의 L1, L2, L3, L4 및 L5는, 각각 독립적으로, 단결합 또는 2가의 스페이서이지만, 이들 스페이서는 공유 결합을 형성할 수 있는 기이면 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 단결합, 페닐렌기, 아미드 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 우레탄 결합, 2급 아미노기, 카르보닐기, 우레아 결합, 또는 이들 결합 및 기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기이며, 보다 바람직하게는, 알킬렌기, 아미드 결합, 에테르 결합, 우레탄 결합 또는 2급 아미노기, 카르보닐기와 1∼3개의 알킬렌기가 결합하여 형성되는 기이며, 특히 바람직한 양태는, 하기 군 (I)로 표시되는 것이다. 에스테르 결합과 카보네이트 결합은 생체 내의 혈중에서 서서히 분해되기 때문에 적합하지 않다.
군 (I) :
Figure pct00008
식(식 (z1)∼식 (z8))에 있어서, 식 중의 s는 0∼10의 정수를 나타내고, 바람직하게는 0∼6의 정수, 더욱 바람직하게는 0∼3의 정수를 나타낸다. 또, 식 (z2)∼식 (z8)에 있어서, 식 중의 2∼3개의 s는 동일해도 되고, 상이해도 된다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에서는, L1, L2, L3, L4 및 L5는 각각 독립적으로, 우레탄 결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 2급 아미노기, 우레아 결합, 또는 이들 결합 및 기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기이다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서는, L1, L2, L3, L4 및 L5는 각각 독립적으로, 단결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 2급 아미노기, 카르보닐기, 또는 이들 결합 및 기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기(예, 단결합, -O-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)2-O-, -(CH2)3-O-, -(CH2)2-CO-NH-, -(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-, -CO-, -(CH2)5-CO-, -NH-)이며, 보다 바람직하게는 L1이 단결합, 에테르 결합 또는 에테르 결합을 포함하고 있어도 되는 알킬렌기(예, 단결합, -O-, -(CH2)2-O-)이며, L2가 카르보닐기 또는 카르보닐기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기(예, -CO-, -(CH2)5-CO-)이며, L3이 2급 아미노기(-NH-)이며, L4가 에테르 결합을 포함하고 있어도 되는 알킬렌기(예, -(CH2)3-O-)이며, L5가 단결합 또는 아미드 결합을 포함하고 있어도 되는 알킬렌기(예, 단결합, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)2-CO-NH-, -(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-)이다.
식 (1) 중의 m은, 폴리에틸렌글리콜쇄와 올리고펩타이드의 결합체를 하나의 구성 단위로 한 반복 유닛수이며, 1∼7이 바람직하고, 1∼5가 보다 바람직하고, 1∼3이 더욱 바람직하다.
식 (1) 중의 X는, 화학 수식의 대상이 되는 생리 활성 단백질, 펩타이드, 항체, 핵산 등의 생체 관련 물질에 존재하는 관능기와 반응하여 공유 결합을 형성하는 관능기이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 「Harris, J. M. Poly(Ethylene Glycol) Chemistry ; Plenum Press : New York, 1992」, 「Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques, 2nd ed. ; Academic Press : San Diego, CA, 2008」 및 「PEGylated Protein Drugs : Basic Science and Clinical Applications ; Veronese, F. M., Ed. ; Birkhauser : Basel, Switzerland, 2009」 등에 기재되어 있는 관능기를 들 수 있다.
식 (1) 중의 X로 나타내어지는 「생체 관련 물질과 반응 가능한 관능기」는, 생체 관련 물질이 갖는 아미노기, 메르캅토기, 알데하이드기, 카르복실기, 불포화 결합 또는 아지드기 등의 관능기와 화학 결합 가능한 관능기이면 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로는, 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데하이드기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭사이드기, 카르복실기, 티올기, 말레이미드기, 치환 말레이미드기, 하이드라지드기, 디티오피리딜기, 치환 술포네이트기, 비닐술폰기, 아미노기, 옥시아미노기, 요오도아세트아미드기, 알킬카르보닐기, 알케닐기, 알키닐기, 아지드기, 아크릴기, 술포닐옥시기, α-할로아세틸기, 알릴기, 비닐기 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데하이드기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭사이드기, 말레이미드기, 비닐술폰기, 아크릴기, 술포닐옥시기, 카르복실기, 티올기, 디티오피리딜기, α-할로아세틸기, 알키닐기, 알릴기, 비닐기, 아미노기, 옥시아미노기, 하이드라지드기 및 아지드기이며, 보다 바람직하게는 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데하이드기, 말레이미드기 및 아미노기이며, 특히 바람직하게는 알데하이드기, 말레이미드기 및 아미노기이다.
바람직한 실시형태에 있어서, 이러한 관능기 X는, 하기 군 (II), 군 (III), 군 (IV), 군 (V), 군 (VI) 및 군 (VII)로 분류할 수 있다.
군 (II) : 생체 관련 물질이 갖는 아미노기와 반응 가능한 관능기
하기 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (j), (k)
군 (III) : 생체 관련 물질이 갖는 메르캅토기와 반응 가능한 관능기
하기 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l)
군 (IV) : 생체 관련 물질이 갖는 알데하이드와 반응 가능한 관능기
하기 (h), (m), (n), (p)
군 (V) : 생체 관련 물질이 갖는 카르복실기와 반응 가능한 관능기
하기 (h), (m), (n), (p)
군 (VI) : 생체 관련 물질이 갖는 불포화 결합과 반응 가능한 관능기
하기 (h), (m), (o)
군 (VII) : 생체 관련 물질이 갖는 아지드기와 반응 가능한 관능기
하기 (l)
Figure pct00009
관능기 (j)에 있어서, 식 중의 W는 염소 원자(Cl), 브롬 원자(Br) 또는 요오드 원자(I) 등의 할로겐 원자를 나타내고, 바람직하게는 Br, I, 보다 바람직하게는 I이다.
또, 관능기 (e) 및 관능기 (l)에 있어서, 식 중의 Y1, Y3은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소수 1∼5의 탄화수소기를 나타내고, 바람직하게는 탄소수 1∼5의 탄화수소기이다. 탄소수 1∼5의 탄화수소기로서는, 구체적으로는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 제3 부틸기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 메틸기, 에틸기이다.
또, 관능기 (k)에 있어서, 식 중의 Y2는 불소 원자를 포함하고 있어도 되는 탄소수가 1∼10인 탄화수소기를 나타내고, 구체적으로는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 제3 부틸기, 헥실기, 노닐기, 비닐기, 페닐기, 벤질기, 4-메틸페닐기, 트리플루오로메틸기, 2,2,2-트리플루오로에틸기, 4-(트리플루오로메톡시)페닐기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 메틸기, 비닐기, 4-메틸페닐기, 2,2,2-트리플루오로에틸기이다.
활성 에스테르기란, 탈리능이 높은 알콕시기를 가진 에스테르기이다. 탈리능이 높은 알콕시기로서는, 니트로페놀, N-하이드록시숙신이미드, 펜타플루오로페놀 등으로부터 유도되는 알콕시기를 들 수 있다. 활성 에스테르기는, 바람직하게는 N-하이드록시숙신이미드로부터 유도되는 알콕시기를 가진 에스테르기이다.
활성 카보네이트기란, 탈리능이 높은 알콕시기를 가진 카보네이트기이다. 탈리능이 높은 알콕시기로서는, 니트로페놀, N-하이드록시숙신이미드, 펜타플루오로페놀 등으로부터 유도되는 알콕시기를 들 수 있다. 활성 카보네이트기는, 바람직하게는 니트로페놀 또는 N-하이드록시숙신이미드로부터 유도되는 알콕시기를 가진 카보네이트기이다.
치환 말레이미드기란, 말레이미드기의 이중 결합의 한쪽의 탄소 원자에 탄화수소기가 결합하고 있는 말레이미드기이다. 탄화수소기는, 구체적으로는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 제3 부틸기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 메틸기, 에틸기이다.
치환 술포네이트기란, 술포네이트기의 황 원자에 불소 원자를 포함하고 있어도 되는 탄화수소기가 결합하고 있는 술포네이트기이다. 불소 원자를 포함하고 있어도 되는 탄화수소기로서는, 구체적으로는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 제3 부틸기, 헥실기, 노닐기, 비닐기, 페닐기, 벤질기, 4-메틸페닐기, 트리플루오로메틸기, 2,2,2-트리플루오로에틸기, 4-(트리플루오로메톡시)페닐기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 메틸기, 비닐기, 4-메틸페닐기, 2,2,2-트리플루오로에틸기이다.
하기 식 (2)는, 식 (1)의 폴리에틸렌글리콜 유도체에 있어서, 올리고펩타이드인 Z가 C 말단의 아미노산으로서 글리신을 갖는 올리고펩타이드인, 즉 식 (1) 중의 Z가 Z1, A 및 글리신 잔기로 구성되는, 적합 양태의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 표시하고 있다.
Figure pct00010
(식 중, Z1은 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼6 잔기의 올리고펩타이드이며, A는 시스테인을 제외한 중성 아미노산이며, a 및 b는 각각 독립적으로 0 또는 1이며, 또한 (a＋b)≥1이며, m, n1 및 n2, p, R, Q, X, L1, L2, L3, L4 및 L5는, 상기와 동일한 의미이다.)
본 발명의 식 (2)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 총분자량은, 통상 20,000∼120,000이며, 바람직하게는 25,000∼80,000이며, 더욱 바람직하게는 30,000∼60,000이다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 식 (2)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 총분자량은 30,000 이상이다. 여기서 말하는 분자량이란 수평균 분자량(Mn)이다.
식 (2) 중의 Z1은, 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼6 잔기의 올리고펩타이드이며, 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼4 잔기의 올리고펩타이드가 바람직하고, 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼3 잔기의 올리고펩타이드가 보다 바람직하고, 또 하이드로퍼시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산, 구체적으로는 페닐알라닌, 류신, 발린, 이소류신을 적어도 하나 갖는 올리고펩타이드인 것이 바람직하고, 페닐알라닌을 갖는 올리고펩타이드인 것이 더욱 바람직하다.
식 (2) 중의 Z1은, 생체 내의 혈중에서 안정적이며, 또한 세포 내의 효소에 의해 분해되는 올리고펩타이드이지만, 구체적인 예로서는, 글리신-페닐알라닌-류신, 글리신-글리신-페닐알라닌, 글리신-페닐알라닌, 발린-시트룰린, 발린-알라닌, 글리신-글리신이며, 바람직하게는 글리신-페닐알라닌-류신, 글리신-글리신-페닐알라닌, 글리신-페닐알라닌, 글리신-글리신, 발린-시트룰린, 발린-알라닌이며, 보다 바람직하게는 글리신-페닐알라닌-류신, 글리신-페닐알라닌, 발린-시트룰린, 발린-알라닌이며, 보다 더 바람직하게는 글리신-페닐알라닌-류신, 발린-시트룰린이다.
식 (2) 중의 A는, 시스테인을 제외한 중성 아미노산이며, 바람직하게는 하이드로퍼시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산이며, 구체적으로는 페닐알라닌, 류신, 발린, 이소류신이며, 보다 바람직하게는 페닐알라닌, 류신이다.
또한, m, n1 및 n2, R, Q, X, L1, L2, L3, L4 및 L5의 바람직한 양태는, 상기 식 (1)에 대해 설명한 바와 같다.
또, 하기 식 (3)은, 식 (2)의 폴리에틸렌글리콜 유도체에 있어서 m=1인, 적합 양태의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 표시하고 있다.
Figure pct00011
(식 중, n3 및 n4는 각각 독립적으로 45∼682이며, p, R, Z1, A, a, b, Q, X, L1, L2, L3, L4 및 L5는, 상기와 동일한 의미이다.)
본 발명의 식 (3)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 총분자량은, 통상 20,000∼60,000이며, 바람직하게는 25,000∼55,000이며, 더욱 바람직하게는 30,000∼50,000이다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 식 (3)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 총분자량은 30,000 이상이다. 여기서 말하는 분자량이란 수평균 분자량(Mn)이다.
식 (3) 중의 n3과 n4는, 각각, 폴리에틸렌글리콜의 반복 유닛수이며, 통상 각각 독립적으로 45∼682이며, 바람직하게는 각각 독립적으로 340∼568이다.
또한, R, Z1, A, Q, X, L1, L2, L3, L4 및 L5의 바람직한 양태는, 상기 식 (1) 및 (2)에 대해 설명한 바와 같다.
[직쇄형의 식 (1)의 폴리에틸렌글리콜 유도체]
하기 식 (4)는, 식 (1)의 폴리에틸렌글리콜 유도체에 있어서, Q가 에틸렌글리콜의 잔기이며, L1이 CH2CH2O이며, 또한 p가 1인, 적합 양태의 직쇄형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 표시하고 있다.
Figure pct00012
(식 중, n5 및 n6은 각각 독립적으로 113∼682이며, m, R, Z, X, L2, L3, L4 및 L5는, 상기와 동일한 의미이다.)
본 발명의 식 (4)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 총분자량은, 통상 20,000∼120,000이며, 바람직하게는 25,000∼80,000이며, 더욱 바람직하게는 30,000∼60,000이다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 식 (1)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 총분자량은 30,000 이상이다. 여기서 말하는 분자량이란 수평균 분자량(Mn)이다.
식 (4) 중의 n5와 n6은, 각각, 폴리에틸렌글리콜의 반복 유닛수이며, 통상 각각 독립적으로 113∼682이며, 바람직하게는 각각 독립적으로 180∼525이다. n5와 n6은, 상이해도 되고, 또 동일해도 된다.
또한, m, R, Z, X, L2, L3, L4 및 L5의 바람직한 양태는, 상기 식 (1)에 대해 설명한 바와 같다.
또, 하기 식 (5)는, 식 (2)의 폴리에틸렌글리콜 유도체에 있어서, Q가 에틸렌글리콜의 잔기이며, L1이 CH2CH2O이며, 또한 p가 1인, 적합 양태의 직쇄형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 표시하고 있다.
Figure pct00013
(식 중, n5 및 n6은 각각 독립적으로 113∼682이며, m, R, Z1, A, a, b, X, L2, L3, L4 및 L5는, 상기와 동일한 의미이다.)
식 (5) 중의 n5와 n6은, 각각, 폴리에틸렌글리콜의 반복 유닛수이며, 통상 각각 독립적으로 113∼682이며, 바람직하게는 각각 독립적으로 180∼525이다. n5와 n6은, 상이해도 되고, 또 동일해도 된다.
본 발명의 식 (5)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 총분자량은, 통상 20,000∼60,000이며, 바람직하게는 25,000∼55,000이며, 더욱 바람직하게는 30,000∼50,000이다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 식 (5)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 총분자량은 30,000 이상이다. 여기서 말하는 분자량이란 수평균 분자량(Mn)이다.
또한, m, R, Z1, A, X, L2, L3, L4 및 L5의 바람직한 양태는, 상기 식 (1) 및 (2)에 대해 설명한 바와 같다.
또, 하기 식 (6)은, 식 (3)의 폴리에틸렌글리콜 유도체에 있어서, Q가 에틸렌글리콜의 잔기이며, L1이 CH2CH2O이며, 또한 p가 1인, 적합 양태의 직쇄형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 표시하고 있다.
Figure pct00014
(식 중, n7 및 n8은 각각 독립적으로 226∼682이며, R, Z1, A, a, b, X, L2, L3, L4 및 L5는, 상기와 동일한 의미이다.)
본 발명의 식 (6)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 총분자량은, 통상 20,000∼60,000이며, 바람직하게는 25,000∼55,000이며, 더욱 바람직하게는 30,000∼50,000이다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 식 (3)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 총분자량은 30,000 이상이다. 여기서 말하는 분자량이란 수평균 분자량(Mn)이다.
식 (6) 중의 n7과 n8은, 각각, 폴리에틸렌글리콜의 반복 유닛수이며, 통상 각각 독립적으로 226∼682이며, 바람직하게는 각각 독립적으로 340∼568이다. n7과 n8은, 상이해도 되고, 또 동일해도 된다.
또한, R, Z1, A, X, L2, L3, L4 및 L5의 바람직한 양태는, 상기 식 (1) 및 (2)에 대해 설명한 바와 같다.
[분기형의 식 (1)의 폴리에틸렌글리콜 유도체]
식 (1)의 폴리에틸렌글리콜 유도체 중, p가 2∼4이며, 또한 Q가 3∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기인 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 적합 양태의 분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체이다.
Q의 3∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기는, 바람직하게는 리신, 아스파라긴산, 글루탐산, 글리세린, 펜타에리트리톨, 디글리세린 또는 크실리톨의 잔기, 혹은 올리고펩타이드의 잔기이며, 특히 바람직하게는 리신, 글루탐산의 잔기이다. 여기서, 그 올리고펩타이드의 바람직한 양태는, 상기 식 (1)에 대해 설명한 바와 같다.
또한, m, R, Z, X, L1, L2, L3, L4 및 L5의 바람직한 양태는, 상기 식 (1)에 대해 설명한 바와 같다.
또, 식 (2)의 폴리에틸렌글리콜 유도체 중, p가 2∼4이며, 또한 Q가 3∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기인 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 적합 양태의 분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체이다.
Q의 3∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기는, 바람직하게는 리신, 아스파라긴산, 글루탐산, 글리세린, 펜타에리트리톨, 디글리세린 또는 크실리톨의 잔기, 혹은 올리고펩타이드의 잔기이며, 특히 바람직하게는 리신, 글루탐산의 잔기이다. 여기서, 그 올리고펩타이드의 바람직한 양태는, 상기 식 (1)에 대해 설명한 바와 같다.
또한, m, R, Z1, A, X, L1, L2, L3, L4 및 L5의 바람직한 양태는, 상기 식 (1) 및 (2)에 대해 설명한 바와 같다.
또한, 식 (3)의 폴리에틸렌글리콜 유도체 중, n3 및 n4가 각각 독립적으로 113∼682이며, p가 2∼4이며, 또한 Q가 3∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기인 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 적합 양태의 분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체이다.
n3과 n4는, 각각, 폴리에틸렌글리콜의 반복 유닛수이며, 바람직하게는 각각 독립적으로 226∼455이다. n3과 n4는, 상이해도 되고, 또 동일해도 된다.
Q의 3∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기는, 바람직하게는 리신, 아스파라긴산, 글루탐산, 글리세린, 펜타에리트리톨, 디글리세린 또는 크실리톨의 잔기, 혹은 올리고펩타이드의 잔기이며, 특히 바람직하게는 리신, 글루탐산의 잔기이다. 여기서, 그 올리고펩타이드의 바람직한 양태는, 상기 식 (1)에 대해 설명한 바와 같다.
또한, R, Z1, A, X, L1, L2, L3, L4 및 L5의 바람직한 양태는, 상기 식 (1) 및 (2)에 대해 설명한 바와 같다.
본 발명의 식 (1)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 바람직한 예로서는, 이하의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 들 수 있다.
[폴리에틸렌글리콜 유도체 (1-1)]
m이 1∼3이며 ;
n1 및 n2가 각각 독립적으로 113∼568이며 ;
p가 1 또는 2이며 ;
R이 탄소수 1∼3의 알킬기(예, 메틸기)이며 ;
Z가 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼4 잔기의 올리고펩타이드(예, 글리신-페닐알라닌-류신-글리신, 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신, 글리신-페닐알라닌-글리신, 글리신-글리신-글리신, 발린-시트룰린-글리신, 발린-알라닌-글리신, 페닐알라닌-글리신)이며 ;
Q가 에틸렌글리콜의 잔기 또는 리신의 잔기이며 ;
X가 알데하이드기, 말레이미드기 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택 되고 ;
L1, L2, L3, L4 및 L5가 각각 독립적으로, 단결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 2급 아미노기, 카르보닐기, 또는 이들 결합 및 기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는, 각각 독립적으로,
Figure pct00015
(식 중, s는 0∼6의 정수이며, (z2), (z3), (z5) 및 (z6) 중의 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 된다.)으로부터 선택되는 스페이서](예, 단결합, -O-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)2-O-, -(CH2)3-O-, -(CH2)2-CO-NH-, -(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-, -CO-, -(CH2)5-CO-, -NH-)인 ;
식 (1)의 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[폴리에틸렌글리콜 유도체 (1-2)]
m이 1∼3이며 ;
n1 및 n2가 각각 독립적으로 113∼568이며 ;
p가 1 또는 2이며 ;
R이 탄소수 1∼3의 알킬기(예, 메틸기)이며 ;
Z가 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼4 잔기의 올리고펩타이드(예, 글리신-페닐알라닌-류신-글리신, 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신, 글리신-페닐알라닌-글리신, 글리신-글리신-글리신, 발린-시트룰린-글리신, 발린-알라닌-글리신, 페닐알라닌-글리신)이며 ;
Q가 에틸렌글리콜의 잔기 또는 리신의 잔기이며 ;
X가 알데하이드기, 말레이미드기 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택되고 ;
L1이 단결합, 에테르 결합 또는 에테르 결합을 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00016
(식 중, s는 0∼6의 정수이며, (z2) 중의 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 된다.)](예, 단결합, -O-, -(CH2)2-O-)이며 ;
L2가 카르보닐기 또는 카르보닐기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00017
(식 중, 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 되고, 0∼6의 정수이다.)](예, -CO-, -(CH2)5-CO-)이며 ;
L3이 2급 아미노기(-NH-)이며 ;
L4가 에테르 결합을 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00018
(식 중, 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 되고, 0∼6의 정수이다.)](예, -(CH2)3-O-)이며 ;
L5가 단결합 또는 아미드 결합을 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00019
(식 중, s는 0∼6의 정수이며, (z3) 중의 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 된다.)](예, 단결합, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)2-CO-NH-, -(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-)인 ;
식 (1)의 폴리에틸렌글리콜 유도체.
본 발명의 식 (2)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 바람직한 예로서는, 이하의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 들 수 있다.
[폴리에틸렌글리콜 유도체 (2-1)]
m이 1∼3이며 ;
p가 1 또는 2이며 ;
n1 및 n2가 각각 독립적으로 113∼568이며 ;
R이 탄소수 1∼3의 알킬기(예, 메틸기)이며 ;
Z1이 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼3 잔기의 올리고펩타이드(예, 글리신-페닐알라닌-류신, 글리신-글리신-페닐알라닌, 글리신-페닐알라닌, 글리신-글리신, 발린-시트룰린, 발린-알라닌)이며 ;
A가 페닐알라닌 또는 류신이며 ;
a 및 b가 각각 독립적으로 0 또는 1이며, 또한 (a＋b)≥1이며 ;
Q가 에틸렌글리콜의 잔기 또는 리신의 잔기이며 ;
X가 알데하이드기, 말레이미드기 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택 되고 ;
L1, L2, L3, L4 및 L5가 각각 독립적으로, 단결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 2급 아미노기, 카르보닐기, 또는 이들 결합 및 기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는, 각각 독립적으로,
Figure pct00020
(식 중, s는 0∼6의 정수이며, (z2), (z3), (z5) 및 (z6) 중의 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 된다.)으로부터 선택되는 스페이서](예, 단결합, -O-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)2-O-, -(CH2)3-O-, -(CH2)2-CO-NH-, -(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-, -CO-, -(CH2)5-CO-, -NH-)인 ;
식 (2)의 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[폴리에틸렌글리콜 유도체 (2-2)]
m이 1∼3이며 ;
p가 1 또는 2이며 ;
n1 및 n2가 각각 독립적으로 113∼568이며 ;
R이 탄소수 1∼3의 알킬기(예, 메틸기)이며 ;
Z1이 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼3 잔기의 올리고펩타이드(예, 글리신-페닐알라닌-류신, 글리신-글리신-페닐알라닌, 글리신-페닐알라닌, 글리신-글리신, 발린-시트룰린, 발린-알라닌)이며 ;
A가 페닐알라닌 또는 류신이며 ;
a 및 b가 각각 독립적으로 0 또는 1이며, 또한 (a＋b)≥1이며 ;
Q가 에틸렌글리콜의 잔기 또는 리신의 잔기이며 ;
X가 알데하이드기, 말레이미드기 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택 되고 ;
L1이 단결합, 에테르 결합 또는 에테르 결합을 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00021
(식 중, s는 0∼6의 정수이며, (z2) 중의 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 된다.)](예, 단결합, -O-, -(CH2)2-O-)이며 ;
L2가 카르보닐기 또는 카르보닐기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00022
(식 중, 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 되고, 0∼6의 정수이다.)](예, -CO-, -(CH2)5-CO-)이며 ;
L3이 2급 아미노기(-NH-)이며 ;
L4가 에테르 결합을 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00023
(식 중, 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 되고, 0∼6의 정수이다.)](예, -(CH2)3-O-)이며 ;
L5가 단결합 또는 아미드 결합을 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00024
(식 중, s는 0∼6의 정수이며, (z3) 중의 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 된다.)](예, 단결합, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)2-CO-NH-, -(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-)인 ;
식 (2)의 폴리에틸렌글리콜 유도체.
본 발명의 식 (3)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 바람직한 예로서는, 이하의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 들 수 있다.
[폴리에틸렌글리콜 유도체 (3-1)]
p가 1 또는 2이며 ;
n3 및 n4가 각각 독립적으로 340∼568이며 ;
R이 탄소수 1∼3의 알킬기(예, 메틸기)이며 ;
Z1이 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼3 잔기의 올리고펩타이드(예, 글리신-페닐알라닌-류신, 글리신-글리신-페닐알라닌, 글리신-페닐알라닌, 글리신-글리신, 발린-시트룰린, 발린-알라닌)이며 ;
A가 페닐알라닌 또는 류신이며 ;
a 및 b가 각각 독립적으로 0 또는 1이며, 또한 (a＋b)≥1이며 ;
Q가 에틸렌글리콜의 잔기 또는 리신의 잔기이며 ;
X가 알데하이드기, 말레이미드기 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택 되고 ;
L1, L2, L3, L4 및 L5가 각각 독립적으로, 단결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 2급 아미노기, 카르보닐기, 또는 이들 결합 및 기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는, 각각 독립적으로,
Figure pct00025
(식 중, s는 0∼6의 정수이며, (z2), (z3), (z5) 및 (z6) 중의 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 된다.)으로부터 선택되는 스페이서](예, 단결합, -O-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)2-O-, -(CH2)3-O-, -(CH2)2-CO-NH-, -(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-, -CO-, -(CH2)5-CO-, -NH-)인 ;
식 (3)의 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[폴리에틸렌글리콜 유도체 (3-2)]
p가 1 또는 2이며 ;
n3 및 n4가 각각 독립적으로 340∼568이며 ;
R이 탄소수 1∼3의 알킬기(예, 메틸기)이며 ;
Z1이 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼3 잔기의 올리고펩타이드(예, 글리신-페닐알라닌-류신, 글리신-글리신-페닐알라닌, 글리신-페닐알라닌, 글리신-글리신, 발린-시트룰린, 발린-알라닌)이며 ;
A가 페닐알라닌 또는 류신이며 ;
a 및 b가 각각 독립적으로 0 또는 1이며, 또한 (a＋b)≥1이며 ;
Q가 에틸렌글리콜의 잔기 또는 리신의 잔기이며 ;
X가 알데하이드기, 말레이미드기 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택 되고 ;
L1이 단결합, 에테르 결합 또는 에테르 결합을 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00026
(식 중, s는 0∼6의 정수이며, (z2) 중의 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 된다.)](예, 단결합, -O-, -(CH2)2-O-)이며 ;
L2가 카르보닐기 또는 카르보닐기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00027
(식 중, 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 되고, 0∼6의 정수이다.)](예, -CO-, -(CH2)5-CO-)이며 ;
L3이 2급 아미노기(-NH-)이며 ;
L4가 에테르 결합을 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00028
(식 중, 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 되고, 0∼6의 정수이다.)](예, -(CH2)3-O-)이며 ;
L5가 단결합 또는 아미드 결합을 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00029
(식 중, s는 0∼6의 정수이며, (z3) 중의 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 된다.)](예, 단결합, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)2-CO-NH-, -(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-)인 ;
식 (3)의 폴리에틸렌글리콜 유도체.
본 발명의 식 (4)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 바람직한 예로서는, 이하의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 들 수 있다.
[폴리에틸렌글리콜 유도체 (4-1)]
m이 1∼3이며 ;
n5 및 n6이 각각 독립적으로 180∼525이며 ;
R이 탄소수 1∼3의 알킬기(예, 메틸기)이며 ;
Z가 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼4 잔기의 올리고펩타이드(예, 글리신-페닐알라닌-류신-글리신, 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신, 글리신-페닐알라닌-글리신, 글리신-글리신-글리신, 발린-시트룰린-글리신, 발린-알라닌-글리신, 페닐알라닌-글리신)이며 ;
X가 알데하이드기, 말레이미드기 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택 되고 ;
L2, L3, L4 및 L5가 각각 독립적으로, 단결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 2급 아미노기, 카르보닐기, 또는 이들 결합 및 기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는, 각각 독립적으로,
Figure pct00030
(식 중, s는 0∼6의 정수이며, (z2), (z3), (z5) 및 (z6) 중의 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 된다.)으로부터 선택되는 스페이서](예, 단결합, -O-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)2-O-, -(CH2)3-O-, -(CH2)2-CO-NH-, -(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-, -CO-, -(CH2)5-CO-, -NH-)인 ;
식 (4)의 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[폴리에틸렌글리콜 유도체 (4-2)]
m이 1∼3이며 ;
n5 및 n6이 각각 독립적으로 180∼525이며 ;
R이 탄소수 1∼3의 알킬기(예, 메틸기)이며 ;
Z가 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼4 잔기의 올리고펩타이드(예, 글리신-페닐알라닌-류신-글리신, 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신, 글리신-페닐알라닌-글리신, 글리신-글리신-글리신, 발린-시트룰린-글리신, 발린-알라닌-글리신, 페닐알라닌-글리신)이며 ;
X가 알데하이드기, 말레이미드기 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택 되고 ;
L2가 카르보닐기 또는 카르보닐기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00031
(식 중, 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 되고, 0∼6의 정수이다.)](예, -CO-, -(CH2)5-CO-)이며 ;
L3이 2급 아미노기(-NH-)이며 ;
L4가 에테르 결합을 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00032
(식 중, 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 되고, 0∼6의 정수이다.)](예, -(CH2)3-O-)이며 ;
L5가 단결합 또는 아미드 결합을 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00033
(식 중, s는 0∼6의 정수이며, (z3) 중의 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 된다.)](예, 단결합, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)2-CO-NH-, -(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-)인 ;
식 (4)의 폴리에틸렌글리콜 유도체.
본 발명의 식 (5)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 바람직한 예로서는, 이하의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 들 수 있다.
[폴리에틸렌글리콜 유도체 (5-1)]
m이 1∼3이며 ;
n5 및 n6이 각각 독립적으로 180∼525이며 ;
R이 탄소수 1∼3의 알킬기(예, 메틸기)이며 ;
Z1이 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼3 잔기의 올리고펩타이드(예, 글리신-페닐알라닌-류신, 글리신-글리신-페닐알라닌, 글리신-페닐알라닌, 글리신-글리신, 발린-시트룰린, 발린-알라닌)이며 ;
A가 페닐알라닌 또는 류신이며 ;
a 및 b가 각각 독립적으로 0 또는 1이며, 또한 (a＋b)≥1이며 ;
X가 알데하이드기, 말레이미드기 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택 되고 ;
L2, L3, L4 및 L5가 각각 독립적으로, 단결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 2급 아미노기, 카르보닐기, 또는 이들 결합 및 기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는, 각각 독립적으로,
Figure pct00034
(식 중, s는 0∼6의 정수이며, (z2), (z3), (z5) 및 (z6) 중의 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 된다.)으로부터 선택되는 스페이서](예, 단결합, -O-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)2-O-, -(CH2)3-O-, -(CH2)2-CO-NH-, -(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-, -CO-, -(CH2)5-CO-, -NH-)인 ;
식 (5)의 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[폴리에틸렌글리콜 유도체 (5-2)]
m이 1∼3이며 ;
n5 및 n6이 각각 독립적으로 180∼525이며 ;
R이 탄소수 1∼3의 알킬기(예, 메틸기)이며 ;
Z1이 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼3 잔기의 올리고펩타이드(예, 글리신-페닐알라닌-류신, 글리신-글리신-페닐알라닌, 글리신-페닐알라닌, 글리신-글리신, 발린-시트룰린, 발린-알라닌)이며 ;
A가 페닐알라닌 또는 류신이며 ;
a 및 b가 각각 독립적으로 0 또는 1이며, 또한 (a＋b)≥1이며 ;
X가 알데하이드기, 말레이미드기 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택 되고 ;
L2가 카르보닐기 또는 카르보닐기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00035
(식 중, 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 되고, 0∼6의 정수이다.)](예, -CO-, -(CH2)5-CO-)이며 ;
L3이 2급 아미노기(-NH-)이며 ;
L4가 에테르 결합을 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00036
(식 중, 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 되고, 0∼6의 정수이다.)](예, -(CH2)3-O-)이며 ;
L5가 단결합 또는 아미드 결합을 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00037
(식 중, s는 0∼6의 정수이며, (z3) 중의 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 된다.)](예, 단결합, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)2-CO-NH-, -(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-)인 ;
식 (5)의 폴리에틸렌글리콜 유도체.
본 발명의 식 (6)의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 바람직한 예로서는, 이하의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 들 수 있다.
[폴리에틸렌글리콜 유도체 (6-1)]
n7 및 n8이 각각 독립적으로 340∼568이며 ;
R이 탄소수 1∼3의 알킬기(예, 메틸기)이며 ;
Z1이 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼3 잔기의 올리고펩타이드(예, 글리신-페닐알라닌-류신, 글리신-글리신-페닐알라닌, 글리신-페닐알라닌, 글리신-글리신, 발린-시트룰린, 발린-알라닌)이며 ;
A가 페닐알라닌 또는 류신이며 ;
a 및 b가 각각 독립적으로 0 또는 1이며, 또한 (a＋b)≥1이며 ;
X가 알데하이드기, 말레이미드기 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택 되고 ;
L2, L3, L4 및 L5가 각각 독립적으로, 단결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 2급 아미노기, 카르보닐기, 또는 이들 결합 및 기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는, 각각 독립적으로,
Figure pct00038
(식 중, s는 0∼6의 정수이며, (z2), (z3), (z5) 및 (z6) 중의 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 된다.)으로부터 선택되는 스페이서](예, 단결합, -O-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)2-O-, -(CH2)3-O-, -(CH2)2-CO-NH-, -(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-, -CO-, -(CH2)5-CO-, -NH-)인 ;
식 (6)의 폴리에틸렌글리콜 유도체.
[폴리에틸렌글리콜 유도체 (6-2)]
n7 및 n8이 각각 독립적으로 340∼568이며 ;
R이 탄소수 1∼3의 알킬기(예, 메틸기)이며 ;
Z1이 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼3 잔기의 올리고펩타이드(예, 글리신-페닐알라닌-류신, 글리신-글리신-페닐알라닌, 글리신-페닐알라닌, 글리신-글리신, 발린-시트룰린, 발린-알라닌)이며 ;
A가 페닐알라닌 또는 류신이며 ;
a 및 b가 각각 독립적으로 0 또는 1이며, 또한 (a＋b)≥1이며 ;
X가 알데하이드기, 말레이미드기 및 아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택 되고 ;
L2가 카르보닐기 또는 카르보닐기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00039
(식 중, 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 되고, 0∼6의 정수이다.)](예, -CO-, -(CH2)5-CO-)이며 ;
L3이 2급 아미노기(-NH-)이며 ;
L4가 에테르 결합을 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00040
(식 중, 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 되고, 0∼6의 정수이다.)](예, -(CH2)3-O-)이며 ;
L5가 단결합 또는 아미드 결합을 포함하고 있어도 되는 알킬렌기[바람직하게는,
Figure pct00041
(식 중, s는 0∼6의 정수이며, (z3) 중의 2개의 s는 동일해도 되고 상이해도 된다.)](예, 단결합, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)2-CO-NH-, -(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-)인 ;
식 (6)의 폴리에틸렌글리콜 유도체.
본 발명의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 예를 들어, 직쇄형인 경우, 다음과 같은 공정도(공정도 (I))로 표시하는 루트에 의해 제조할 수 있다.
공정도 (I)
Figure pct00042
(공정 중, PEG1, PEG2는 폴리에틸렌글리콜 유도체이며, Peptide는 올리고펩타이드이며, X1, X2, X3은 폴리에틸렌글리콜 유도체의 올리고펩타이드와 반응할 수 있는 관능기이며, Pro는 보호기이며, R은 상기와 동일한 의미이다.)
공정도 (I)의 PEG1, PEG2는, 폴리에틸렌글리콜 유도체이며, 각각의 분자량은, 상기한 폴리에틸렌글리콜의 반복 유닛수인 n1, n2로 정의한 바와 같고, 즉 n이 113∼682인 점에서, 그 분자량의 범위는, 5000∼30000이다.
공정도 (I)의 Peptide는, 상기 Z와 동일한 의미의 올리고펩타이드이다. 공정도 (I)에서는, N 말단의 아미노기가 보호기로 보호된 올리고펩타이드, 또는 C 말단의 카르복실기가 보호기로 보호된 올리고펩타이드를 이용한다.
공정도 (I)의 X1, X2, X3은, Peptide의 카르복실기, 또는 아미노기와 반응 가능한 폴리에틸렌글리콜 유도체의 관능기이다.
공정도 (I)의 Pro는, 보호기이며, 여기서 보호기란, 어느 반응 조건하에서 분자 중의 특정 화학 반응 가능한 관능기의 반응을 방지 또는 저지하는 성분이다. 보호기는, 보호되는 화학 반응 가능한 관능기의 종류, 사용되는 조건 및 분자 중의 다른 관능기 혹은 보호기의 존재에 의해 변화한다. 보호기의 구체적인 예는 많은 일반적인 문헌에서 발견할 수 있지만, 예를 들어 「Wuts, P. G. M. ; Greene, T. W. Protective Groups in Organic Synthesis, 4th ed. ; Wiley-Interscience : New York, 2007」에 기재되어 있다. 또, 보호기로 보호된 관능기는, 각각의 보호기에 적합한 반응 조건을 이용하여 탈보호, 즉 화학 반응시킴으로써, 원래의 관능기를 재생시킬 수 있다. 보호기의 대표적인 탈보호 조건은 전술한 문헌에 기재되어 있다.
공정도 (I)의 폴리에틸렌글리콜 유도체와 올리고펩타이드의 반응에 대해서는, 특별히 제한은 없고, 폴리에틸렌글리콜 유도체와 올리고펩타이드는 화학 반응에 의해 공유 결합으로 결합된다. 올리고펩타이드와 폴리에틸렌글리콜의 결합은, 반응에 사용되는 관능기의 조합에 의해 결정되지만, 기본적으로는 상기 L1, L2, L3, L4, L5로 나타낸 2가의 스페이서인 우레탄 결합이나 아미드 결합을 포함하는 알킬렌기 등에 의한 결합이다.
공정도 (I)의 반응 A-1은, 편말단이 보호기로 보호된 올리고펩타이드와, 편말단이 R인 폴리에틸렌글리콜 유도체의 반응이며, 이어지는 탈보호 B-1에서, 편말단에 R, 편말단에 올리고펩타이드를 가진 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻을 수 있다.
공정도 (I)의 반응 C-1은, 편말단이 보호기로 보호된 폴리에틸렌글리콜 유도체와, 탈보호 B-1에서 얻어진 말단에 올리고펩타이드를 가진 폴리에틸렌글리콜 유도체의 반응이다. 이어지는 탈보호 D-1에서, 2개의 폴리에틸렌글리콜쇄와 1개의 올리고펩타이드가 연결된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻을 수 있다.
공정도 (I)의 반응 A-2는, 편말단이 보호기로 보호된 올리고펩타이드와, 탈보호 D-1에서 얻어진 2개의 폴리에틸렌글리콜쇄와 1개의 올리고펩타이드가 연결된 폴리에틸렌글리콜 유도체의 반응이다. 이어지는 탈보호 B-2에서, 말단에 올리고펩타이드를 가진 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻을 수 있다.
공정도 (I)의 반응 C-2는, 편말단이 보호기로 보호된 폴리에틸렌글리콜 유도체와, 탈보호 B-2에서 얻어진 말단에 올리고펩타이드를 가진 폴리에틸렌글리콜 유도체의 반응이다. 이어지는 탈보호 D-2에서, 3개의 폴리에틸렌글리콜쇄와 2개의 올리고펩타이드가 연결된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻을 수 있다.
공정도 (I)의 반응 A→탈보호 B→반응 C→탈보호 D의 사이클을 반복함으로써, 본 발명의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻을 수 있다.
당해 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 필요에 따라 말단 관능기를 화학 변환할 수 있다. 이 관능기 변환에 이용되는 반응은, 종래 공지된 방법을 이용할 수 있지만, 올리고펩타이드나, 상기 2가의 스페이서가 분해되지 않는 조건을 적절히 선택해야 한다.
당해 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 합성하는 전형적인 예로서는, 이하와 같은 공정을 들 수 있다. 여기서는 공정도 (I)의 대표예로서, N 말단의 아미노기가 보호기로 보호된 올리고펩타이드를 이용한 합성 방법을 설명한다. 이후의 공정의 스페이서 L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12는, 상기 L1, L2, L3, L4, L5로 나타낸 2가의 스페이서와 동일한 의미이다.
Figure pct00043
반응 A-1은, N 말단의 아미노기가 보호기로 보호된 올리고펩타이드의 카르복실기와, 편말단이 R인 폴리에틸렌글리콜 유도체 (4)의 아미노기를 축합 반응으로 결합시켜, 폴리에틸렌글리콜 유도체 (5)를 얻는 공정이다.
올리고펩타이드의 N 말단의 아미노기의 보호기는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 아실계 보호기 및 카르바메이트계 보호기를 들 수 있고, 구체적으로는 트리플루오로아세틸기, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기 및 t-부틸옥시카르보닐기 등을 들 수 있다.
축합 반응으로서는, 특별히 제한은 없지만, 축합제를 이용하는 반응이 바람직하다. 축합제로서는, 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(EDC) 등의 카르보디이미드계의 축합제를 단독으로 사용해도 되고, N-하이드록시숙신이미드(NHS), 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt), 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) 등의 시약과 병용해도 된다. 또, 보다 반응성이 높은 HATU나 HBTU, TATU, TBTU, COMU, DMT-MM 등의 축합제를 사용해도 된다. 또 반응을 촉진하기 위해, 트리에틸아민이나 디메틸아미노피리딘 등의 염기를 이용해도 된다.
반응에서 부생한 불순물, 또는 반응에서 소비되지 않고 잔존한 올리고펩타이드나 축합제 등은, 정제 제거를 행하는 것이 바람직하다. 정제는, 특별히 제한되지 않지만, 추출, 재결정, 흡착 처리, 재침전, 컬럼 크로마토그래피, 초임계 추출 등으로 정제할 수 있다.
Figure pct00044
탈보호 B-1은, 반응 A-1에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (5)의 보호기를 탈보호하여, 폴리에틸렌글리콜 유도체 (6)을 얻는 공정이다. 탈보호 반응으로서는, 종래 공지된 방법을 이용할 수 있지만, 올리고펩타이드나 L6의 2가의 스페이서가 분해되지 않는 조건을 이용할 필요가 있다.
탈보호 반응에서 부생한 불순물 등은, 정제 제거를 행하는 것이 바람직하다. 정제는, 특별히 제한되지 않지만, 추출, 재결정, 흡착 처리, 재침전, 컬럼 크로마토그래피, 초임계 추출 등으로 정제할 수 있다.
Figure pct00045
반응 C-1은, 탈보호 B-1에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (6)의 아미노기와, 폴리에틸렌글리콜 유도체 (7)의 활성 에스테르기 또는 활성 카보네이트기를 반응으로 결합시켜, 2개의 폴리에틸렌글리콜쇄가 올리고펩타이드로 연결된 구조인 폴리에틸렌글리콜 유도체 (8)을 얻는 공정이다.
폴리에틸렌글리콜 유도체 (7)은, 편말단에 보호기로 보호된 아미노기를 갖고, 다른 편말단에 활성 에스테르기 또는 활성 카보네이트기 등을 갖는다. 활성 에스테르기와 활성 카보네이트기의 탈리기로서는, 숙신이미딜옥시기, 프탈이미딜옥시기, 4-니트로페녹시기, 1-이미다졸릴기, 펜타플루오로페녹시기, 벤조트리아졸-1-일옥시기 및 7-아자벤조트리아졸-1-일옥시기 등을 들 수 있다. 또, 폴리에틸렌글리콜 유도체 (7)은, 반드시 활성화된 관능기를 가지고 있을 필요는 없고, 말단에 카르복실기를 갖는 경우에는, 반응 A-1과 동일하게, 축합제를 이용한 반응을 이용할 수 있다. 반응을 촉진하기 위해, 트리에틸아민이나 디메틸아미노피리딘 등의 염기를 이용해도 된다. 폴리에틸렌글리콜 유도체 (7)의 보호기는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 아실계 보호기 및 카르바메이트계 보호기를 들 수 있고, 구체적으로는 트리플루오로아세틸기, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기 및 t-부틸옥시카르보닐기 등을 들 수 있다.
반응에서 부생한 불순물, 또는 반응에서 소비되지 않고 잔존한 폴리에틸렌글리콜 유도체 등은, 정제 제거를 행하는 것이 바람직하다. 정제는, 특별히 제한되지 않지만, 추출, 재결정, 흡착 처리, 재침전, 컬럼 크로마토그래피, 초임계 추출 등으로 정제할 수 있다.
폴리에틸렌글리콜 유도체 (8) 중으로부터, 분자량이나 관능기가 상이한 폴리에틸렌글리콜 불순물을 제거하는 수법으로서는, 일본국 특허 공개 2014-208786, 일본국 특허 공개 2011-79934에 기재된 정제 기술을 이용할 수 있다.
Figure pct00046
탈보호 D-1은, 반응 C-1에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (8)의 보호기를 탈보호하여, 폴리에틸렌글리콜 유도체 (9)를 얻는 공정이다. 탈보호 반응으로서는, 종래 공지된 방법을 이용할 수 있지만, 올리고펩타이드나 L6, L7, L8의 2가의 스페이서가 분해되지 않는 조건을 이용할 필요가 있다.
탈보호 반응에서 부생한 불순물 등은, 정제 제거를 행하는 것이 바람직하다. 정제는, 특별히 제한되지 않지만, 추출, 재결정, 흡착 처리, 재침전, 컬럼 크로마토그래피, 초임계 추출 등으로 정제할 수 있다.
Figure pct00047
반응 A-2는, N 말단의 아미노기가 보호기로 보호된 올리고펩타이드의 카르복실기와, 탈보호 B-1에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (9)의 아미노기를 축합 반응으로 결합시켜, 폴리에틸렌글리콜 유도체 (10)을 얻는 공정이다. 상기 반응 A-1과 동일 조건으로 반응과 정제가 가능하다.
Figure pct00048
탈보호 B-2는, 반응 A-2에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (10)의 보호기를 탈보호하여, 폴리에틸렌글리콜 유도체 (11)을 얻는 공정이다. 탈보호 반응으로서는, 종래 공지된 방법을 이용할 수 있지만, 올리고펩타이드나 L6, L7, L8의 2가의 스페이서가 분해되지 않는 조건을 이용할 필요가 있다. 상기 탈보호 B-1과 동일 조건으로 반응과 정제가 가능하다.
Figure pct00049
반응 C-2는, 탈보호 B-2에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (11)의 아미노기와, 폴리에틸렌글리콜 유도체 (7)의 활성 에스테르기 또는 활성 카보네이트기를 반응으로 결합시켜, 3개의 폴리에틸렌글리콜쇄가 2개의 올리고펩타이드로 연결된 구조인 폴리에틸렌글리콜 유도체 (12)를 얻는 공정이다. 상기 반응 C-1과 동일 조건으로 반응과 정제가 가능하다.
Figure pct00050
탈보호 D-2는, 반응 C-2에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (12)의 보호기를 탈보호하여, 폴리에틸렌글리콜 유도체 (13)을 얻는 공정이다. 탈보호 반응으로서는, 종래 공지된 방법을 이용할 수 있지만, 올리고펩타이드나 L6, L7, L8의 2가의 스페이서가 분해되지 않는 조건을 이용할 필요가 있다. 상기 탈보호 D-1과 동일 조건으로 반응과 정제가 가능하다.
이상의 반응을 정리하면, 이하의 공정도 (II)가 된다. 반응 A→탈보호 B→반응 C→탈보호 D의 사이클을 반복함으로써, (9), (13), (14), (15)의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻을 수 있다.
공정도 (II)
Figure pct00051
공정도 (II)에서 얻어진 (9), (13), (14), (15)의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 구체적으로 이하에 해당한다.
폴리에틸렌글리콜 유도체 (9) : 2개의 폴리에틸렌글리콜쇄가 1개의 올리고펩타이드로 연결된 구조인 폴리에틸렌글리콜 유도체
폴리에틸렌글리콜 유도체 (13) : 3개의 폴리에틸렌글리콜쇄가 2개의 올리고펩타이드로 연결된 구조인 폴리에틸렌글리콜 유도체
폴리에틸렌글리콜 유도체 (14) : 4개의 폴리에틸렌글리콜쇄가 3개의 올리고펩타이드로 연결된 구조인 폴리에틸렌글리콜 유도체
폴리에틸렌글리콜 유도체 (15) : 5개의 폴리에틸렌글리콜쇄가 4개의 올리고펩타이드로 연결된 구조인 폴리에틸렌글리콜 유도체
얻어진 (9), (13), (14), (15)의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 말단에 아미노기를 가지고 있고, 이것을 이용하여 여러 가지 관능기로 변환이 가능하다. 그 반응에 대해서는 후술한다.
또, 공정도 (II)의 반응 C-1, 반응 C-2, 반응 C-3, 반응 C-4에 있어서 사용한 폴리에틸렌글리콜 유도체 (7)의 아미노기의 보호기를, 예를 들어 알데하이드기의 보호기인 아세탈기(구체적으로는, 3,3-디에톡시프로필기 등)나, 카르복실기의 보호기인 알킬에스테르계 보호기(구체적으로는, 메틸에스테르, t-부틸에스테르, 벤질에스테르 등) 등으로 변경함으로써, 상이한 관능기를 가진 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻을 수 있다. 이 경우, 탈보호 D-1, 탈보호 D-2, 탈보호 D-3, 탈보호 D-4에 있어서, 각각의 보호기에 적합한 종래 공지된 방법을 이용하여 탈보호를 행함으로써, 목적물을 얻을 수 있다.
폴리에틸렌글리콜 유도체 (7)을 대신하는 폴리에틸렌글리콜 유도체에 대해서는, 예를 들어 이하의 구조의 것을 들 수 있다.
Figure pct00052
Figure pct00053
본 발명의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 상이한 제법으로서는, 예를 들어 다음과 같은 공정도(공정도 (III))로 표시하는 루트에 의해서도 제조할 수 있다.
공정도 (III)
Figure pct00054
(공정 중, PEG1, PEG2, PEG3은 폴리에틸렌글리콜 유도체이며, Peptide는 올리고펩타이드이며, X1, X2, X3, X4, X5는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 관능기이며, Pro, Pro2, Pro3은 보호기이며, R은 상기와 동일한 의미이다.)
공정도 (III)의 PEG1, PEG2, PEG3은, 폴리에틸렌글리콜 유도체이며, 각각의 분자량은, 상기한 폴리에틸렌글리콜의 반복 유닛수인 n1, n2로 정의한 바와 같고, 즉 n이 113∼682인 점에서, 그 분자량의 범위는, 5000∼30000이다.
공정도 (III)의 Peptide는, 상기 Z와 동일한 의미의 올리고펩타이드이다. 공정도 (III)에서는, N 말단의 아미노기가 보호기로 보호된 올리고펩타이드, 또는 C 말단의 카르복실기가 보호기로 보호된 올리고펩타이드를 이용한다.
공정도 (III)의 X1, X2, X3, X4, X5는, Peptide의 카르복실기, 또는 아미노기와 반응 가능한 폴리에틸렌글리콜 유도체의 관능기이다.
공정도 (III)의 Pro, Pro2, Pro3은, 보호기이며, 공정도 (III)에서는, Pro는 Pro2의 탈보호 조건에서 안정적인 보호기이며, 또, Pro2는 Pro3의 탈보호 조건에서 안정적인 보호기이다. 이들 보호기의 조합은, 예를 들어 「Wuts, P. G. M. ; Greene, T. W. Protective Groups in Organic Synthesis, 4th ed. ; Wiley-Interscience : New York, 2007」에 기재되어 있는 보호기로부터 선택할 수 있다.
공정도 (III)의 폴리에틸렌글리콜 유도체와 올리고펩타이드의 반응에 대해서는, 특별히 제한은 없고, 폴리에틸렌글리콜 유도체와 올리고펩타이드는 화학 반응에 의해 공유 결합으로 결합된다. 올리고펩타이드와 폴리에틸렌글리콜의 결합은, 반응에 사용되는 관능기의 조합에 의해 결정되지만, 기본적으로는 상기 L1, L2, L3, L4, L5로 나타낸 2가의 스페이서인 우레탄 결합이나 아미드 결합을 포함하는 알킬렌기 등에 의한 결합이다.
공정도 (III)의 반응 E는, 편말단이 보호기 Pro3으로 보호된 올리고펩타이드와, 편말단이 보호기 Pro2로 보호된 폴리에틸렌글리콜 유도체의 반응이다. 이어지는 탈보호 F에서, 펩타이드 측의 보호기 Pro3만을 탈보호하여, 편말단에 올리고펩타이드, 편말단에 보호기 Pro2를 가진 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻을 수 있다.
공정도 (III)의 반응 G-1은, 편말단이 보호기 Pro로 보호된 폴리에틸렌글리콜 유도체와, 탈보호 F에서 얻어진 편말단에 올리고펩타이드, 편말단에 보호기 Pro2를 가진 폴리에틸렌글리콜 유도체의 반응이다. 이어지는 탈보호 H-1에서, 폴리에틸렌글리콜 유도체의 편측의 보호기 Pro2만을 탈보호하여, 2개의 폴리에틸렌글리콜쇄와 1개의 올리고펩타이드가 연결된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻을 수 있다.
공정도 (III)의 반응 G-2는, 탈보호 H-1에서 얻어진 편말단이 보호기 Pro로 보호된 폴리에틸렌글리콜 유도체와, 탈보호 F에서 얻어진 편말단에 올리고펩타이드, 편말단에 보호기 Pro2를 가진 폴리에틸렌글리콜 유도체의 반응이다. 이어지는 탈보호 H-2에서, 폴리에틸렌글리콜 유도체의 편측의 보호기 Pro2만을 탈보호하여, 3개의 폴리에틸렌글리콜쇄와 2개의 올리고펩타이드가 연결된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻을 수 있다.
공정도 (III)의 반응 E 후의 탈보호 F에 의해 얻어진 편말단에 올리고펩타이드, 편말단에 보호기 Pro2를 가진 폴리에틸렌글리콜 유도체를 반응 G-1, G-2, G-3의 공정에서 원료로서 이용하고, 반응 G와 탈보호 H의 반응을 반복함으로써, 본 발명의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 전구체를 효율적으로 얻을 수 있다.
공정도 (III)의 반응 A-1과 탈보호 B-1은, 상기 공정도 (I)과 동일하고, 편말단에 R, 편말단에 올리고펩타이드를 가진 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻을 수 있다.
공정도 (III)의 반응 J는, 반응 G와 탈보호 H의 반응을 반복하여 얻어진 편말단이 보호기 Pro로 보호된 폴리에틸렌글리콜 유도체(전구체)와, 탈보호 B-1에서 얻어진 편말단에 R, 편말단에 올리고펩타이드를 가진 폴리에틸렌글리콜 유도체의 반응이다. 이어지는 탈보호 K에서, 본 발명의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻을 수 있다.
당해 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 필요에 따라 말단 관능기를 화학 변환할 수 있다. 이 관능기 변환에 이용되는 반응은, 종래 공지된 방법을 이용할 수 있지만, 올리고펩타이드나, 상기 2가의 스페이서가 분해되지 않는 조건을 적절히 선택해야 한다.
당해 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 합성하는 전형적인 예로서는, 이하와 같은 공정을 들 수 있다. 여기서는 공정도 (III)의 대표예로서, N 말단의 아미노기가 보호기로 보호된 올리고펩타이드를 이용한 합성 방법을 설명한다.
Figure pct00055
반응 E는, N 말단의 아미노기가 보호기 Pro3으로 보호된 올리고펩타이드의 카르복실기와, 편말단의 카르복실기가 보호기 Pro2로 보호된 폴리에틸렌글리콜 유도체 (16)의 아미노기를 축합 반응으로 결합시켜, 폴리에틸렌글리콜 유도체 (17)을 얻는 공정이다.
올리고펩타이드의 N 말단의 아미노기의 보호기 Pro3은, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 아실계 보호기 및 카르바메이트계 보호기를 들 수 있고, 구체적으로는 트리플루오로아세틸기, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기 등을 들 수 있다. 다음으로 폴리에틸렌글리콜 유도체 (16)의 카르복실기의 보호기 Pro2는, 특별히 제한은 없지만, t-부틸기 등을 들 수 있다.
상기 반응 A-1과 동일 조건으로 반응과 정제가 가능하다.
Figure pct00056
탈보호 F는, 반응 E에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (17)의 아미노기의 보호기 Pro3을 탈보호하여, 폴리에틸렌글리콜 유도체 (18)을 얻는 공정이다. 탈보호 반응으로서는, 종래 공지된 방법을 이용할 수 있지만, 보호기 Pro2나 올리고펩타이드나 L9, L10의 2가의 스페이서가 분해되지 않는 조건을 이용할 필요가 있다. 예를 들어, 구체적으로는, Pro3이 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기, Pro2가 t-부틸기인 경우, 피페리딘 등의 적절한 염기 화합물을 이용함으로써, Pro3을 선택적으로 탈보호할 수 있다. 상기 탈보호 B-1과 동일 조건으로 반응과 정제가 가능하다.
Figure pct00057
반응 G-1은, 탈보호 F에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (18)의 아미노기와, 폴리에틸렌글리콜 유도체 (7)의 활성 에스테르기 또는 활성 카보네이트기를 반응으로 결합시켜, 2개의 폴리에틸렌글리콜쇄가 1개의 올리고펩타이드로 연결된 구조인 폴리에틸렌글리콜 유도체 (19)를 얻는 공정이다. 폴리에틸렌글리콜 유도체 (7)은 상기와 같다. 상기 반응 C-1과 동일 조건으로 반응과 정제가 가능하다.
Figure pct00058
탈보호 H-1은, 반응 G-1에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (19)의 카르복실기의 보호기 Pro2를 탈보호하여, 폴리에틸렌글리콜 유도체 (20)을 얻는 공정이다. 탈보호 반응으로서는, 종래 공지된 방법을 이용할 수 있지만, 보호기 Pro나 올리고펩타이드나 L7, L8, L9, L10의 2가의 스페이서가 분해되지 않는 조건을 이용할 필요가 있다. 예를 들어, 구체적으로는 Pro가 트리플루오로아세틸기, Pro2가 t-부틸기인 경우, 적절한 산성 화합물을 이용한 조건으로, Pro2를 선택적으로 탈보호할 수 있다.
탈보호 반응에서 부생한 불순물 등은, 정제 제거를 행하는 것이 바람직하다. 정제는, 특별히 제한되지 않지만, 추출, 재결정, 흡착 처리, 재침전, 컬럼 크로마토그래피, 초임계 추출 등으로 정제할 수 있다.
Figure pct00059
반응 G-2는, 탈보호 F에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (18)의 아미노기와, 탈보호 H-1에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (20)의 카르복실기를 축합 반응시켜, 3개의 폴리에틸렌글리콜쇄가 2개의 올리고펩타이드로 연결된 구조인 폴리에틸렌글리콜 유도체 (21)을 얻는 공정이다. 상기 반응 C-1과 동일 조건으로 반응과 정제가 가능하다.
상기 반응 A-1과 동일하게, 축합제를 이용한 반응이 바람직하고, 반응을 촉진하기 위해, 트리에틸아민이나 디메틸아미노피리딘 등의 염기를 이용해도 된다.
반응에서 부생한 불순물, 또는 반응에서 소비되지 않고 잔존한 폴리에틸렌글리콜 유도체 등은, 정제 제거를 행하는 것이 바람직하다. 정제는, 특별히 제한되지 않지만, 추출, 재결정, 흡착 처리, 재침전, 컬럼 크로마토그래피, 초임계 추출 등으로 정제할 수 있다.
폴리에틸렌글리콜 유도체 (21) 중에서, 분자량이나 관능기가 상이한 폴리에틸렌글리콜 불순물을 제거하는 수법으로서는, 일본국 특허 공개 2014-208786, 일본국 특허 공개 2011-79934에 기재된 정제 기술을 이용할 수 있다.
Figure pct00060
탈보호 H-2는, 반응 G-2에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (21)의 카르복실기의 보호기 Pro2를 탈보호하여, 폴리에틸렌글리콜 유도체 (22)를 얻는 공정이다. 탈보호 반응으로서는, 종래 공지된 방법을 이용할 수 있지만, 보호기 Pro나 올리고펩타이드나 L7, L8, L9, L10의 2가의 스페이서가 분해되지 않는 조건을 이용할 필요가 있다.
이상의 반응을 정리하면 이하의 공정도 (IV)가 된다. 반응 E와 탈보호 F에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (18)을 원료로 사용하여, 반응 G→탈보호 H의 사이클을 반복함으로써, 예를 들어 4개의 폴리에틸렌글리콜쇄가 3개의 올리고펩타이드로 연결된 구조인 폴리에틸렌글리콜 유도체 (23)이나, 5개의 폴리에틸렌글리콜쇄가 4개의 올리고펩타이드로 연결된 구조인 폴리에틸렌글리콜 유도체 (24) 등, 본 발명의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 중간체를 얻을 수 있다.
공정도 (IV)
Figure pct00061
공정도 (IV)에서 얻어진 (20), (22), (23), (24)의 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 구체적으로 이하에 해당한다.
폴리에틸렌글리콜 유도체 (20) : 2개의 폴리에틸렌글리콜쇄가 1개의 올리고펩타이드로 연결된 구조인 폴리에틸렌글리콜 유도체
폴리에틸렌글리콜 유도체 (22) : 3개의 폴리에틸렌글리콜쇄가 2개의 올리고펩타이드로 연결된 구조인 폴리에틸렌글리콜 유도체
폴리에틸렌글리콜 유도체 (23) : 4개의 폴리에틸렌글리콜쇄가 3개의 올리고펩타이드로 연결된 구조인 폴리에틸렌글리콜 유도체
폴리에틸렌글리콜 유도체 (24) : 5개의 폴리에틸렌글리콜쇄가 4개의 올리고펩타이드로 연결된 구조인 폴리에틸렌글리콜 유도체
다음으로, 공정도 (IV)에서 얻어진 (20), (22), (23), (24)의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 원료로, 이하의 반응 J 및 탈보호 K를 행함으로써, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻을 수 있다. 이하의 공정은, 폴리에틸렌글리콜 유도체 (24)를 이용한 경우를 나타낸다.
Figure pct00062
반응 J는, 상기 탈보호 B-1에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (6)의 아미노기와, 탈보호 H-4에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (24)의 카르복실기를 축합 반응시켜, 6개의 폴리에틸렌글리콜쇄가 5개의 올리고펩타이드로 연결된 구조인 폴리에틸렌글리콜 유도체 (25)를 얻는 공정이다. 상기 반응 C-1과 동일 조건으로 반응과 정제가 가능하다.
상기 반응 A-1과 동일하게, 축합제를 이용한 반응이 바람직하고, 반응을 촉진하기 위해, 트리에틸아민이나 디메틸아미노피리딘 등의 염기를 이용해도 된다.
반응에서 부생한 불순물, 또는 반응에서 소비되지 않고 잔존한 폴리에틸렌글리콜 유도체 등은, 정제 제거를 행하는 것이 바람직하다. 정제는, 특별히 제한되지 않지만, 추출, 재결정, 흡착 처리, 재침전, 컬럼 크로마토그래피, 초임계 추출 등으로 정제할 수 있다.
폴리에틸렌글리콜 유도체 (25) 중에서, 분자량이나 관능기가 상이한 폴리에틸렌글리콜 불순물을 제거하는 수법으로서는, 일본국 특허 공개 2014-208786, 일본국 특허 공개 2011-79934에 기재된 정제 기술을 이용할 수 있다.
Figure pct00063
탈보호 K는, 반응 J에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (25)의 보호기를 탈보호하여, 폴리에틸렌글리콜 유도체 (26)을 얻는 공정이다. 탈보호 반응으로서는, 종래 공지된 방법을 이용할 수 있지만, 올리고펩타이드나 L6, L7, L8, L9, L10의 2가의 스페이서가 분해되지 않는 조건을 이용할 필요가 있다. 상기 탈보호 D-1과 동일 조건으로 반응과 정제가 가능하다.
본 발명의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 상이한 제법으로서는, 예를 들어, 분기형인 경우, 다음과 같은 공정도(공정도 (V))로 표시되는 루트에 의해 제조할 수 있다. 여기서는, 공정 (I) 또는 공정 (III)에서 얻어진 분해성 폴리에틸렌글리콜과, 3∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기인 Q의 반응에 의해, 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜을 얻는 것이다.
공정도 (V)
Figure pct00064
(공정 중, PEG1, PEG2는 폴리에틸렌글리콜 유도체이며, Peptide는 올리고펩타이드이며, Q는 3∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기이며, X6, X7은 관능기이며, Pro는 보호기이며, p는 2∼4이며, R은 상기와 동일한 의미이다.)
공정도 (V)의 PEG1, PEG2는, 폴리에틸렌글리콜 유도체이며, 각각의 분자량은, 상기한 폴리에틸렌글리콜의 반복 유닛수인 n1, n2로 정의한 바와 같고, 즉 n이 45∼682인 점에서, 그 분자량의 범위는, 2000∼30000이다.
공정도 (V)의 Peptide는, 상기 Z와 동일한 의미의 올리고펩타이드이다.
공정도 (V)의 Q는, 상기 Q와 동일한 의미의 3∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기이다.
공정도 (V)의 X6은, Q의 활성 수소를 가진 관능기인 수산기, 카르복실기, 또는 아미노기 등과 반응 가능한 폴리에틸렌글리콜 유도체의 관능기이며, X7은 Q에 결합한 생체 관련 물질과 반응 가능한 관능기이다.
공정도 (V)의 Q와 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 반응에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, Q와 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는 화학 반응에 의해 공유 결합으로 결합된다. Q와 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 결합은, 반응에 사용되는 관능기의 조합에 의해 결정되지만, 기본적으로는 상기 L1, L2, L3, L4, L5 등으로 나타낸 2가의 스페이서인 우레탄 결합이나 아미드 결합을 포함하는 알킬렌기 등에 의한 결합이다.
공정도 (V)의 반응 L은, 3∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기인 Q의 활성 수소를 가진 1개의 관능기가 보호기 Pro로 보호된 Q와, 상기 공정 (I) 또는 공정 (III)에서 얻어진 편말단이 R인 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 반응이다. 이어지는 탈보호 M에서, Q의 보호기 Pro를 탈보호하여, 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻을 수 있다. 당해 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 필요에 따라 말단 관능기를 화학 변환할 수 있다. 이 관능기 변환에 이용되는 반응은, 종래 공지된 방법을 이용할 수 있지만, 올리고펩타이드나, 상기 2가의 스페이서가 분해되지 않는 조건을 적절히 선택해야 한다.
당해 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 합성하는 전형적인 예로서는, 이하와 같은 공정을 들 수 있다. 여기서는 공정도 (V)의 대표예로서, 3개의 활성 수소를 가지는 화합물인 글루탐산의 잔기를 Q로서 이용한 경우의 합성 방법을 설명한다.
Figure pct00065
반응 L은, 예를 들어, 탈보호 D-1에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (9)의 아미노기와, 아미노기가 보호기로 보호된 글루탐산 유도체의 2개의 카르복실기를 축합 반응으로 결합시켜, 2개의 분해성 폴리에틸렌글리콜쇄가 글루탐산 잔기로 연결된 구조인 분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체 (27)을 얻는 공정이다. 상기 반응 G-2와 동일 조건으로 반응과 정제가 가능하다.
Figure pct00066
탈보호 M은, 반응 L에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (27)의 보호기를 탈보호하여, 폴리에틸렌글리콜 유도체 (28)을 얻는 공정이다. 탈보호 반응으로서는, 종래 공지된 방법을 이용할 수 있지만, 올리고펩타이드나 L6, L7, L8의 2가의 스페이서가 분해되지 않는 조건을 이용할 필요가 있다. 상기 탈보호 D-1과 동일 조건으로 반응과 정제가 가능하다.
본 발명의 분기형인 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 상이한 제법으로서는, 예를 들어 다음과 같은 공정도(공정도 (VI))로 표시하는 루트에 의해 제조할 수 있다. 여기서는, 공정 (I)과 공정 (III)에서 얻어진 편말단에 펩타이드를 가진 폴리에틸렌글리콜 유도체와, 3∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기인 Q에 폴리에틸렌글리콜이 결합한 분기형 폴리에틸렌글리콜 유도체의 반응에 의해, 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜을 얻는 것이다.
공정도 (VI)
Figure pct00067
(공정 중, PEG1, PEG2, PEG3은 폴리에틸렌글리콜 유도체이며, Peptide는 올리고펩타이드이며, Q는 3∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기이며, X8, X9는 관능기이며, Pro는 보호기이며, p는 2∼4이며, R은 상기와 동일한 의미이다.)
공정도 (VI)의 PEG1, PEG2, PEG3은, 폴리에틸렌글리콜 유도체이며, 각각의 분자량은, 상기한 폴리에틸렌글리콜의 반복 유닛수인 n1, n2로 정의한 바와 같고, 즉 n이 45∼682인 점에서, 그 분자량의 범위는, 2000∼30000이다.
공정도 (VI)의 Peptide는, 상기 Z와 동일한 의미의 올리고펩타이드이다.
공정도 (VI)의 X8은, Peptide의 카르복실기, 또는 아미노기와 반응 가능한 폴리에틸렌글리콜 유도체의 관능기이며, X9는 Q에 결합한 생체 관련 물질과 반응 가능한 관능기이다.
공정도 (VI)의 편말단에 펩타이드를 가진 폴리에틸렌글리콜 유도체와, 3∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기인 Q에 폴리에틸렌글리콜이 결합한 분기형 폴리에틸렌글리콜 유도체의 반응에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, 이들 폴리에틸렌글리콜 유도체는 화학 반응에 의해 공유 결합으로 결합된다. 분기형 폴리에틸렌글리콜 유도체와 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 결합은, 반응에 사용되는 관능기의 조합에 의해 결정되지만, 기본적으로는 상기 L1, L2, L3, L4, L5 등으로 나타낸 2가의 스페이서인 우레탄 결합이나 아미드 결합을 포함하는 알킬렌기 등에 의한 결합이다.
공정도 (VI)의 반응 N은, 3∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기인 Q의 1개의 관능기가 보호기 Pro로 보호된 분기형 폴리에틸렌글리콜 유도체와, 상기 공정 (I) 또는 공정 (III)에서 얻어진 편말단에 펩타이드를 갖고, 다른 편말단이 R인 폴리에틸렌글리콜 유도체의 반응이다. 이어지는 탈보호 P에서, Q의 보호기 Pro를 탈보호하여, 분기형의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻을 수 있다. 당해 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 필요에 따라 말단 관능기를 화학 변환할 수 있다. 이 관능기 변환에 이용되는 반응은, 종래 공지된 방법을 이용할 수 있지만, 올리고펩타이드나, 상기 2가의 스페이서가 분해되지 않는 조건을 적절히 선택해야 한다.
당해 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 합성하는 전형적인 예로서는, 이하와 같은 공정을 들 수 있다. 여기서는 공정도 (VI)의 대표예로서, Q가 글리세린 잔기인 분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 원료로 이용한 합성 방법을 설명한다.
Figure pct00068
반응 N은, 예를 들어, 특허문헌 일본국 특허 공개 2012-25932의 실시예에 따라 얻어지는 분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체 (29)의 2개의 카르복실기와, 탈보호 B-1에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (6)의 아미노기를 축합 반응으로 결합시켜, 분기형의 폴리에틸렌글리콜 유도체 (30)을 얻는 공정이다. 상기 반응 G-2와 동일 조건으로 반응과 정제가 가능하다.
Figure pct00069
탈보호 P는, 반응 N에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체 (30)의 보호기를 탈보호하여, 폴리에틸렌글리콜 유도체 (31)을 얻는 공정이다. 탈보호 반응으로서는, 종래 공지된 방법을 이용할 수 있지만, 올리고펩타이드나 L6, L11, L12의 2가의 스페이서가 분해되지 않는 조건을 이용할 필요가 있다. 상기 탈보호 D-1과 동일 조건으로 반응과 정제가 가능하다.
다음으로, 탈보호 D, 탈보호 K, 탈보호 M, 탈보호 P에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 말단에 아미노기를 가지고 있고, 이것을 이용하여 여러 가지 관능기로 변환이 가능하다.
폴리에틸렌글리콜 유도체의 말단의 아미노기를 다른 관능기로 변환하는 공정에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, 기본적으로는 아미노기와 반응 가능한 활성 에스테르기를 가진 화합물, 또는 산무수물, 산클로라이드 등의 일반적인 반응 시약을 이용함으로써, 여러 가지 관능기로 용이하게 변환할 수 있다.
예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 유도체의 말단의 아미노기를 말레이미드기로 변환하고 싶은 경우는, 이하와 같은 시약과 반응시킴으로써, 목적물을 얻을 수 있다.
Figure pct00070
예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 유도체의 말단의 아미노기를 카르복실기로 변환하고 싶은 경우는, 무수 숙신산이나 무수 글루타르산과 반응시킴으로써, 목적물을 얻을 수 있다.
이들 반응 시약은, 저분자량의 시약이며, 폴리에틸렌글리콜 유도체와는 크게 용해성이 상이하므로, 추출이나 정석 등의 일반적인 정제 방법으로 용이하게 제거가 가능하다.
이상과 같은 공정을 거쳐, 얻어진 분해성 폴리에틸렌글리콜은, 혈중에서 안정적이며, 세포 내에서만 분해되는 성능을 가질 것이 요구된다. 그 성능을 적절히 평가하기 위해, 예를 들어, 이하에 나타내는 바와 같은 시험을 실시하여, 분해성 폴리에틸렌글리콜의 혈중에서의 안정성, 그리고 세포 내에서의 분해성을 평가할 수 있다.
분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 혈중에서의 안정성을 평가하기 위한 시험 방법에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 마우스, 래트, 인간 등의 혈청을 이용한 시험 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 폴리에틸렌글리콜 유도체를 1∼10㎎/mL의 농도가 되도록 혈청에 용해하고, 37℃에서 96시간 인큐베이트 후, 혈청 중에 포함된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 회수하고, GPC를 측정함으로써 분해율을 평가할 수 있다. 분해율은, 안정성 시험 전의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 GPC 메인 프랙션의 피크 면적%와, 안정성 시험 후의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 GPC 메인 프랙션의 피크 면적%로부터 산출한다. 구체적으로는 이하의 식을 이용한다.
분해율=(시험 전의 피크 면적%-시험 후의 피크 면적%)÷시험 전의 피크 면적%×100
예를 들어, 안정성 시험 전의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 GPC 메인 프랙션의 피크 면적%가 95%이며, 시험 후의 GPC 메인 프랙션의 피크 면적%가 90%였다고 하면, 분해율은 이하와 같이 산출된다.
분해율=(95-90)÷95×100=5.26(%)
분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 혈중에서 분해되어 버리면, 목적으로 하는 혈중 반감기를 얻을 수 없기 때문에, 안정성 시험에 있어서, 96시간 후의 분해율은, 10% 이하가 바람직하고, 5% 이하가 더욱 바람직하다.
분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 세포 내에서의 분해성을 평가하기 위한 시험 방법에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를 함유한 배지를 이용하여, 세포를 배양시키는 시험 등을 들 수 있다. 여기서 사용하는 세포나 배지에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, 구체적으로는 폴리에틸렌글리콜 유도체를 1∼20㎎/mL의 농도가 되도록 배지인 RPMI-1640에 용해하고, 이 배지를 이용하여, 매크로파지 세포 RAW264.7을 37℃에서 96시간 배양 후, 세포 중의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 회수하고, GPC를 측정함으로써 분해율을 평가할 수 있다. 분해율은, 안정성 시험과 동일하게, 시험 전후의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 GPC 메인 프랙션의 피크 면적%를 이용하여 산출한다.
예를 들어, 세포를 이용한 분해성 시험 전의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 GPC 메인 프랙션의 피크 면적%가 95%이며, 시험 후의 GPC 메인 프랙션의 피크 면적%가 5%였다고 하면, 분해율은 이하와 같이 산출된다.
분해율=(95-5)÷95×100=94.7(%)
분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 세포 내에서 효율적으로 분해되지 않으면, 목적으로 하는 세포의 공포를 억제할 수 없기 때문에, 분해성 시험에 있어서 96시간 후의 분해율은, 90% 이상이 바람직하고, 95% 이상이 더욱 바람직하다.
분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 혈중 반감기나 체내 분포를 평가하기 위한 시험 방법에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 방사성 동위체나 형광 물질을 라벨화하고, 마우스나 래트에 투여하여, 모니터링하는 시험 등을 들 수 있다.
폴리에틸렌글리콜 유도체에 도입한 분해성 펩타이드는, 폴리에틸렌글리콜에 세포 내에서의 분해성을 부여하지만, 그 펩타이드 구조에 의해 폴리에틸렌글리콜의 체내 동태를 변화시킬 가능성이 생각된다. 그래서, 도입한 펩타이드 구조의 체내 동태에의 영향을 확인하기 위해, 혈중 반감기 및, 그 체내 분포에 대해, 분해성을 가지지 않는 동일 분자량의 폴리에틸렌글리콜 유도체와 비교할 필요가 있다. 구체적으로는, 방사성 동위체로 라벨화한 분해성을 가지지 않는 폴리에틸렌글리콜 유도체와, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체를, 마우스에 투여하고, 복수의 타임 포인트에, 혈액, 각 장기의 방사선량을 측정하여, 정량 측정을 행할 수 있다.
분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 세포의 공포 억제를 평가하기 위한 시험 방법에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 비특허문헌 2에 기재가 있는 바와 같이, 장기간, 고빈도, 고투여량으로 마우스나 래트에 투여를 계속하고, 공포가 발생하기 쉽다고 일컬어지고 있는 장기나 기관의 절편 화상을 확인하는 시험 등을 들 수 있다.
구체적으로는, 폴리에틸렌글리콜 유도체를 10∼250㎎/mL의 농도가 되도록 생리 식염수에 용해하고, 마우스 꼬리 정맥으로부터 주3회, 4주간 이상, 20∼100μL 투여를 계속하고, 공포가 발생하기 쉽다고 일컬어지고 있는 기관인 뇌 맥락총이나 비장 등의 파라핀 절편을 제작하여 염색 후, 절편 화상을 병리학적 수법에 의해 확인하여, 공포 억제의 평가를 행할 수 있다.
또한, 본 평가에 있어서 폴리에틸렌글리콜의 투여량은, 당해 기술 분야에 있어서의 일반적인 폴리에틸렌글리콜의 투여량과 비교해, 대과잉의 폴리에틸렌글리콜을 투여할 필요가 있다.
비특허문헌 2에서는, 고분자량의 폴리에틸렌글리콜에 의한 세포의 공포화는, 폴리에틸렌글리콜의 조직에의 축적과 관계가 있다는 기재가 있다. 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 세포에의 축적성을 평가하기 위한 시험 방법에 대해서는, 특별히 제한은 없지만, 상기 공포의 평가와 동일한 방법으로 제작한 절편 화상으로부터 평가할 수 있다. 폴리에틸렌글리콜이 축적되기 쉽다고 일컬어지고 있는 기관인 뇌 맥락총이나 비장 등의 염색한 절편 화상을 병리학적 수법에 의해 확인하여, 폴리에틸렌글리콜의 축적성의 평가를 행할 수 있다.
또한, 본 평가에 있어서 폴리에틸렌글리콜의 투여량은, 당해 기술 분야에 있어서의 일반적인 폴리에틸렌글리콜의 투여량과 비교해, 대과잉의 폴리에틸렌글리콜을 투여할 필요가 있다.
실시예
하기 실시예에서 얻어진 1H-NMR은, 일본 전자 데이텀(주)제 JNM-ECP400 또는 JNM-ECA600으로부터 얻었다. 측정에는 φ5mm 튜브를 이용하고, 중수소화 용매에는, D2O 또는 내부 표준 물질로서 테트라메틸실란(TMS)을 함유하는 CDCl3 및 d6-DMSO를 이용하였다. 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체의 분자량 및 아민 순도는, 액체 크로마토그래피(GPC 및 HPLC)를 이용하여 산출하였다. 액체 크로마토그래피의 시스템은, GPC에는 토소(주)제 「HLC-8320GPC EcoSEC」를 이용하고, HPLC에는 WATERS사제 「ALLIANCE」를 이용하였다. 이하, GPC 및 HPLC의 분석 조건을 나타낸다.
GPC 분석(분자량 측정)
검출기 : 시차 굴절계
컬럼 : ultrahydrogel500 및 ultrahydrogel250(WATERS)
이동상 : 100mM Acetate buffer＋0.02% NaN3(pH5.2)
유속 : 0.5mL/min
샘플량 : 5㎎/mL, 20μL
컬럼 온도 : 30℃
HPLC 분석(아민 순도 측정)
검출기 : 시차 굴절계
컬럼 : TSKgel SP-5PW(토소)
이동상 : 1mM Sodium phosphate buffer(pH6.5)
유속 : 0.5mL/min
주입량 : 5㎎/mL, 20μL
컬럼 온도 : 40℃
[실시예 1]
화합물 (p1)(ME-200GLFG(L)-200PA)의 합성
Figure pct00071
[실시예 1-1]
Figure pct00072
N 말단을 tert-부톡시카르보닐기(Boc기)로 보호한 글리실-L-페닐알라닐-L-류실-글리신(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)(0.197g, 4.0×10-4몰, GenScript Biotech사제)과 N-하이드록시숙신이미드(57.5㎎, 5.0×10-4몰, 미도리 화학(주)제)를 탈수 N,N'-디메틸포름아미드(1.0g)에 용해 후, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(0.103g, 5.0×10-4몰, 타마 화학 공업(주)제)를 첨가하고, 실온에서 질소 분위기하에서 1시간 반응시켰다. 탈수 N,N'-디메틸포름아미드(3.0g)를 첨가하여 희석한 후, 말단에 프로필아미노기를 갖는 메톡시 PEG(2.0g, 9.5×10-5몰, 평균 분자량=약 21,000, 니치유 주식회사제 「SUNBRIGHT MEPA-20T」)를 첨가하고, 실온에서 질소 분위기하에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 아세트산에틸(20g)을 첨가하여 반응액을 희석하고, LS100 여과지를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 여과액에 아세트산에틸(30g)을 첨가하여, 균일하게 되도록 교반한 후, 헥산(25g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 석출물을 회수한 후, 재차 아세트산에틸(50g)에 용해하고, 헥산(25g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 석출물을 회수한 후, 헥산(25g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p2)(ME-200GLFG(L)-Boc)를 얻었다. 수량 1.8g.
NMR(CDCl3) : 0.89ppm(d, 3H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 0.92ppm(d, 3H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.36ppm(s, 9H, -NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 ), 1.48ppm(m, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2), 1.55ppm(m, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2), 1.80ppm(m, 3H), 3.13ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.21ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.33ppm(m, 2H, -CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3), 3.38ppm(s, 3H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.65ppm(m, 약 2,000H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3), 3.91ppm(t, 1H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH3)2), 4.43ppm(broad, 1H), 4.55ppm(q, 1H, -NH-CO-CH-CH2-C6H5), 5.77ppm(broad, 1H), 6.76ppm(broad, 1H), 6.86ppm(broad, 1H), 6.90ppm(broad, 1H), 7.14ppm(broad, 1H), 7.20ppm(d, 2H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 ), 7.32ppm(m, 3H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
[실시예 1-2]
Figure pct00073
실시예 1-1에서 얻어진 ME-200GLFG(L)-Boc(1.8g, 8.6×10-5몰)를 디클로로메탄(9.0g)에 용해하고, 메탄술폰산(584μL, 9.0×10-3몰, 칸토 화학(주)제)을 첨가하여, 실온에서 질소 분위기하에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 톨루엔(18g)으로 희석하고, 이온 교환수(18g)를 첨가하여, 실온에서 15분 교반하고, 수층에 생성물을 추출하였다. 얻어진 수층에 1mol/L 수산화나트륨 수용액을 적당량 첨가하고, pH를 12로 조정한 후, 염화나트륨(4.5g)을 용해하였다. 거기에, 클로로포름(18g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 수층과 유기층을 분리한 후, 수층에 재차 클로로포름(18g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 추출 1회째와 2회째에서 얻어진 유기층을 40℃에서 농축한 후, 얻어진 농축물에 아세트산에틸(36g)을 첨가하였다. 얻어진 아세트산에틸 용액에, 황산나트륨(0.90g)을 첨가하여, 30℃에서 15분 교반한 후, 5A 여과지 상에 옵라이트를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여과액에 헥산(18g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과한 후, 헥산(18g)으로 석출물을 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p3)(ME-200GLFG(L)-NH 2 )을 얻었다. 수량 1.4g.
NMR(CDCl3) : 0.89ppm(d, 3H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 0.91ppm(d, 3H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.53ppm(m, 2H, -NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2), 1.70ppm(m, 1H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH3)2), 1.80ppm(m, 2H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3), 3.10ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.18ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.33ppm(m, 7H), 3.74ppm(m, 약 1,900H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3), 4.31ppm(broad, 1H), 4.55ppm(t, 1H, -NH-CO-CH-CH2-C6H5), 6.91ppm(broad, 1H), 7.00ppm(broad, 1H), 7.28ppm(m, 5H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 ), 7.98ppm(broad, 1H)
[실시예 1-3]
Figure pct00074
실시예 1-2에서 얻어진 ME-200GLFG(L)-NH2(1.2g, 5.7×10-5몰)를 클로로포름(14.4g)에 용해한 후, 트리에틸아민(10μL, 7.1×10-5몰, 칸토 화학(주))과, 편말단에 tert-부톡시카르보닐기로 보호한 프로필아미노기를 갖고, 다른 편말단에 탄산숙신이미딜기를 갖는 헤테로 이관능 PEG(1.3g, 6.2×10-5몰, 평균 분자량=약 19,000, 니치유 주식회사제 「SUNBRIGHT BO-200TS」)를 첨가하고, 실온에서 질소 분위기하에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 40℃에서 농축하고, 얻어진 농축물에 아세트산에틸(48g)을 첨가하여 용해한 후, 헥산(24g)을 첨가하여 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하였다. 얻어진 석출물을 재차 아세트산에틸(48g)에 용해하고, 헥산(24g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하였다. 석출물을 회수 후, 헥산(24g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p4)(ME-200GLFG(L)-200Boc)를 얻었다. 수량 2.0g.
NMR(CDCl3) : 0.90ppm(t, 6H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.44ppm(s, 9H, -CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 ), 1.64ppm(m, 1H), 1.76ppm(m, 5H), 3.20ppm(m, 4H), 3.33ppm(m, 2H, -CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3), 3.38ppm(s, 3H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.64ppm(m, 약 3,800H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.10ppm(m, 2H, -NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-), 4.32ppm(m, 1H), 4.50ppm(q, 1H), 5.02ppm(broad, 1H), 6.45ppm(broad, 1H), 6.93ppm(broad, 1H), 7.06ppm(broad, 1H), 7.13ppm(broad, 1H), 7.27ppm(m, 5H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
[실시예 1-4]
Figure pct00075
실시예 1-3에서 얻어진 ME-200GLFG(L)-200Boc(1.8g, 4.3×10-5몰)를 디클로로메탄(9.0g)에 용해하고, 메탄술폰산(292μL, 4.5×10-3몰, 칸토 화학(주)제)을 첨가하여, 실온에서 질소 분위기하에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 톨루엔(18g)으로 희석하고, 이온 교환수(18g)를 첨가하여, 실온에서 15분 교반하고, 수층에 생성물을 추출하였다. 일본국 특허 공개 2014-208786에 기재된 조건에 따라, 1mol/L 염산을 이용하여 수층의 pH를 2.0으로 조정하고, 톨루엔과 클로로포름 혼합 용액으로 수층을 세정하여, 아미노기를 가지지 않는 폴리에틸렌글리콜 불순물을 제거하였다. 이어서 수층에 1mol/L 수산화나트륨 수용액을 적당량 첨가하고, pH12로 조정한 후, 염화나트륨(4.5g)을 용해하였다. 거기에, 클로로포름(18g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 수층과 유기층을 분리한 후, 수층에 재차 클로로포름(18g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 추출 1회째와 2회째에서 얻어진 유기층을 40℃에서 농축한 후, 얻어진 농축물에 아세트산에틸(27g)을 첨가하였다. 얻어진 아세트산에틸 용액에, 황산나트륨(0.90g)을 첨가하여, 30℃에서 30분 교반한 후, 5A 여과지 상에 옵라이트를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여과액에 헥산(18g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과한 후, 헥산(18g)으로 석출물을 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p1)(ME-200GLFG(L)-200PA)을 얻었다. 수량 1.5g. 분자량은 표 1에 나타낸다. HPLC : 아민 순도 91%.
NMR(CDCl3) : 0.90ppm(t, 6H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.48ppm(broad, 1H), 1.62ppm(t, 1H), 1.71ppm(m, 1H), 1.82ppm(m, 2H), 3.12ppm(m, 2H), 3.19ppm(d, 2H), 3.34ppm(m, 2H), 3.38ppm(s, 3H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.64ppm(m, 약 3,800H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.10ppm(m, 2H), 4.34ppm(m, 1H), 4.50ppm(q, 1H), 6.46ppm(broad, 1H), 6.94ppm(broad, 1H), 7.08ppm(broad, 1H), 7.27ppm(m, 5H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
[실시예 2]
화합물 (p5)(ME-200GLFG(L)-200AL)의 합성
Figure pct00076
[실시예 2-1]
Figure pct00077
일본국 특허 제3508207호 등에 기재된 제법을 이용하여 합성한 편말단에 3,3-디에톡시프로필기, 편말단에 수산기를 갖는 헤테로 이관능 PEG(15.0g, 7.5×10-4몰, 평균 분자량=약 20,000)를 탈수 디클로로메탄(75g)에 용해한 후, N,N'-디숙신이미딜카보네이트(1.2g, 4.7×10-3몰, 토쿄 화성 공업(주)제)와 트리에틸아민(836μL, 6.0×10-3몰, 칸토 화학(주))을 첨가하고, 실온에서 질소 분위기하에서 5시간 반응시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과한 후, 40℃에서 여과액을 농축하고, 얻어진 농축물에 아세트산에틸(150g)과 2,6-디-tert-부틸-p-크레졸(30㎎)을 첨가하여 균일하게 될 때까지 교반하였다. 헥산(75g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과한 후, 석출물을 회수하고, 재차 아세트산에틸(150g)과 2,6-디-tert-부틸-p-크레졸(30㎎)을 첨가하여 용해하였다. 헥산(75g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하였다. 동일한 조작을 4회 행한 후, 얻어진 석출물을 헥산(90g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과한 후, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p6)을 얻었다. 수량 11.8g.
NMR(CDCl3) : 1.20ppm(t, 6H, -CH2-CH2-CH(OCH2 CH 3 )2), 1.90ppm(q, 2H, -CH2-CH 2 -CH(OCH2CH3)2), 2.84ppm(s, 4H, -O-CO-O-NC 4 H 4 O 2 ), 3.65ppm(m, 약 1,900H, -O-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 CH 2 O)n-CH2-), 4.46ppm(t, 2H, -O-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2CH2O)n-CH2-), 4.64ppm(t, 1H, -CH2-CH2-CH(OCH2CH3)2)
[실시예 2-2]
Figure pct00078
실시예 1-2에서 얻어진 ME-200GLFG(L)-NH2(1.9g, 9.0×10-5몰)를 클로로포름(18g)에 용해한 후, 트리에틸아민(13μL, 9.3×10-5몰, 칸토 화학(주))과, 실시예 2-1에서 얻어진 숙신이미딜기-PEG-3,3-디에톡시프로필기(1.5g, 7.5×10-5몰, 평균 분자량=약 21,000)를 첨가하고, 실온에서 질소 분위기하에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 40℃에서 농축하고, 일본국 특허 공개 2011-79934에 기재된 조건에 따라, 얻어진 농축물을 톨루엔과 클로로포름 혼합 용액에 용해하고, 5% 식염수로 유기층을 세정하여, 분자량 약 21,000의 폴리에틸렌글리콜 불순물을 제거하였다. 유기층을 40℃에서 농축하고, 얻어진 농축물에 아세트산에틸(60g)을 첨가하여 용해한 후, 헥산(30g)을 첨가하여 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하였다. 얻어진 석출물을 재차 아세트산에틸(60g)에 용해하고, 헥산(30g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하였다. 석출물을 회수 후, 헥산(30g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p7)(ME-200GLFG(L)-200DE)을 얻었다. 수량 3.1g.
NMR(CDCl3) : 0.90ppm(t, 6H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.20ppm(t, 6H, -CH2-CH2-CH(OCH2 CH 3 )2), 1.47ppm(m, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2), 1.61ppm(m, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2), 1.72ppm(m, 1H), 1.82ppm(m, 2H), 1.90ppm(q, 2H, -CH2-CH 2 -CH(OCH2CH3)2), 2.58ppm(m, 1H), 3.19ppm(d, 2H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.33ppm(m, 2H, -CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3), 3.38ppm(-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 4.29ppm(m, 1H), 4.50ppm(q, 1H), 4.64ppm(t, 1H, -CH2-CH2-CH(OCH2CH3)2), 6.38ppm(broad, 1H), 6.89ppm(broad, 1H), 6.99ppm(broad, 1H), 7.10ppm(broad, 1H), 7.29ppm(m, 5H)
[실시예 2-3]
Figure pct00079
실시예 2-2에서 얻어진 ME-200GLFG(L)-200DE(1.0g, 2.4×10-5몰)를 주사용 증류수(20g)에 용해한 후, 85% 인산(0.46g)으로 pH를 1.50으로 조정하고, 20∼25℃에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 400g/L의 수산화나트륨 수용액을 0.69g 첨가하고, pH를 6.70으로 조정한 후, 염화나트륨(4.0g)을 첨가하여 용해하였다. 얻어진 용액에 1M의 수산화나트륨 수용액(1.76g)을 적하하여, pH를 7.05로 조정한 후, 미리 2,6-디-tert-부틸-p-크레졸(1.5㎎)을 용해한 클로로포름(15g)을 첨가하여, 실온에서 20분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 유기층과 수층을 분리하고, 유기층을 회수한 후, 수층에 재차 미리 2,6-디-tert-부틸-p-크레졸(1.5㎎)을 용해한 클로로포름(15g)을 첨가하여, 실온에서 20분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 추출 1회째와 2회째에서 얻어진 유기층을 50℃에서 농축하고, 얻어진 농축물에 아세트산에틸(10g)을 첨가하여, 균일하게 될 때까지 교반한 후, 황산마그네슘(0.25g)을 첨가하여, 30℃에서 15분 교반하고, 5A 여과지 상에 옵라이트를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과하고, 아세트산에틸(10g)로 세정하였다. 얻어진 여과액에 헥산(15g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과한 후, 미리 2,6-디-tert-부틸-p-크레졸(1.0㎎)을 용해한 헥산(10g)으로 석출물을 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p5)(ME-200GLFG(L)-200AL)를 얻었다. 수량 0.65g. 분자량은 표 1에 나타낸다. 알데하이드 순도는 86%(1H-NMR).
NMR(CDCl3) : 0.90ppm(t, 6H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.47ppm(m, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2), 1.61ppm(m, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2), 1.72ppm(m, 1H), 1.84ppm(m, 5H), 2.68ppm(m, 2H), 3.19ppm(d, 2H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.33ppm(m, 2H, -CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3), 3.38ppm(-CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 4.06ppm(m, 1H, -NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-), 4.12ppm(m, 1H, -NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-), 4.32ppm(m, 1H), 4.51ppm(q, 1H), 6.36ppm(broad, 1H), 6.87ppm(broad, 1H), 6.99ppm(broad, 2H), 7.14ppm(broad, 1H), 7.29ppm(m, 5H), 9.80ppm(s, 1H, -CH2CH2-CHO)
[실시예 3]
화합물 (p8)(ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100PA)의 합성
Figure pct00080
[실시예 3-1]
Figure pct00081
실시예 1과 동일 제법으로, N 말단을 tert-부톡시카르보닐기(Boc기)로 보호한 글리실-L-페닐알라닐-L-류실-글리신(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly), 말단에 프로필아미노기를 갖는 메톡시 PEG(평균 분자량=약 10,000, 니치유 주식회사제 「SUNBRIGHT MEPA-10T」), 편말단에 tert-부톡시카르보닐기로 보호한 프로필아미노기를 갖고, 다른 편말단에 탄산숙신이미딜기를 갖는 헤테로 이관능 PEG(평균 분자량=약 10,000, 니치유 주식회사제 「SUNBRIGHT BO-100TS」)를 원료로 이용하여, 상기 화합물 (p9)(ME-100GLFG(L)-100PA)를 얻었다. 수량 1.0g.
NMR(CDCl3) : 0.90ppm(t, 6H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.48ppm(broad, 1H), 1.62ppm(t, 1H), 1.71ppm(m, 1H), 1.82ppm(m, 2H), 3.12ppm(m, 2H), 3.19ppm(d, 2H), 3.34ppm(m, 2H), 3.38ppm(s, 3H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.64ppm(m, 약 1,800H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.10ppm(m, 2H), 4.34ppm(m, 1H), 4.50ppm(q, 1H), 6.46ppm(broad, 1H), 6.94ppm(broad, 1H), 7.08ppm(broad, 1H), 7.27ppm(m, 5H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
[실시예 3-2]
Figure pct00082
실시예 3-1에서 얻어진 ME-100GLFG(L)-100PA(1.0g, 5.0×10-5몰)와 Boc-Gly-Phe-Leu-Gly(0.99g, 2.0×10-4몰, GenScript Biotech사제)에 탈수 N,N'-디메틸포름아미드(10g)를 첨가하고, 30℃에서 가온 용해하였다. 그 후, 디이소프로필에틸아민(65μL, 3.8×10-4몰, 칸토 화학(주)제)과 (1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)디메틸아미노-모르폴리노-카르베늄헥사플루오로인산염(COMU)(0.106g, 2.5×10-4몰, 시그마 알드리치사제)을 첨가하고, 실온에서 질소 분위기하에서 1시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 클로로포름(100g)으로 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액(50g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여 세정을 행하였다. 수층과 유기층을 분리 후, 재차, 유기층에 포화 탄산수소나트륨 수용액(50g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여 세정을 행하고, 유기층을 회수하였다. 얻어진 유기층에 황산마그네슘(1.0g)을 첨가하고, 30분 교반하여 탈수한 후, 5A 여과지 상에 옵라이트를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여과액을 40℃에서 농축하고, 농축물에 아세트산에틸(50g)을 첨가하여 균일하게 되도록 교반한 후, 헥산(25g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 석출물을 회수한 후, 재차 아세트산에틸(50g)에 용해하고, 실온에서 헥산(25g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 석출물을 회수한 후, 헥산(25g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p10)(ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-Boc)을 얻었다. 수량 0.9g.
NMR(CDCl3) : 0.90ppm(t, 12H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.44ppm(s, 9H, -CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 ), 1.64ppm(m, 2H), 1.76ppm(m, 5H), 3.20ppm(m, 4H), 3.33ppm(m, 4H, -CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-), 3.38ppm(s, 3H, -O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.64ppm(m, 약 1,800H, -O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.10ppm(m, 2H, -NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-), 4.32ppm(m, 2H), 4.50ppm(q, 2H), 5.02ppm(broad, 2H), 6.45ppm(broad, 2H), 6.93ppm(broad, 2H), 7.06ppm(broad, 2H), 7.13ppm(broad, 2H), 7.27ppm(m, 10H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
[실시예 3-3]
Figure pct00083
실시예 3-2에서 얻어진 ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-Boc(0.9g, 4.5×10-5몰)를, 실시예 1-2와 동일 제법으로, Boc기의 탈보호를 행하여, 상기 화합물 (p11)(ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-NH 2 )을 얻었다. 수량 0.8g.
NMR(CDCl3) : 0.89ppm(d, 6H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 0.91ppm(d, 6H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.53ppm(m, 4H, -NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2), 1.70ppm(m, 2H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH3)2), 1.80ppm(m, 4H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-), 3.10ppm(dd, 2H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.18ppm(dd, 2H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.33ppm(m, 14H), 3.74ppm(m, 약 1,800H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-), 4.31ppm(broad, 2H), 4.55ppm(t, 2H, -NH-CO-CH-CH2-C6H5), 6.91ppm(broad, 2H), 7.00ppm(broad, 2H), 7.28ppm(m, 10H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 ), 7.98ppm(broad, 2H)
[실시예 3-4]
Figure pct00084
실시예 3-3에서 얻어진 ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-NH2(0.8g, 4.0×10-5몰)를, 실시예 1-3과 동일 제법으로, 편말단에 tert-부톡시카르보닐기로 보호한 프로필아미노기를 갖고, 다른 편말단에 탄산숙신이미딜기를 갖는 헤테로 이관능 PEG(평균 분자량=약 10,000, 니치유 주식회사제 「SUNBRIGHT BO-100TS」)와 반응시켜, 상기 화합물 (p12)(ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100Boc)를 얻었다. 수량 1.0g.
NMR(CDCl3) : 0.90ppm(t, 12H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.44ppm(s, 9H, -CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 ), 1.64ppm(m, 2H), 1.76ppm(m, 10H), 3.20ppm(m, 8H), 3.33ppm(m, 6H, -CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-), 3.38ppm(s, 3H, -(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.64ppm(m, 약 2,700H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.10ppm(m, 4H, -NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-), 4.32ppm(m, 2H), 4.50ppm(q, 2H), 5.02ppm(broad, 2H), 6.45ppm(broad, 2H), 6.93ppm(broad, 2H), 7.06ppm(broad, 2H), 7.13ppm(broad, 2H), 7.27ppm(m, 10H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
[실시예 3-5]
Figure pct00085
실시예 3-4에서 얻어진 ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100Boc(1.0g, 3.3×10-5몰)를, 실시예 1-4와 동일 제법으로, Boc기의 탈보호를 행하였다. 얻어진 조(粗)생성물을, 양이온 교환 수지인 SP Sepharose FF(GE 헬스케어제)를 충전한 이온 교환 크로마토그래피로 정제하여, 상기 화합물 (p13)(ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100PA)을 얻었다. 수량 0.8g.
NMR(CDCl3) : 0.90ppm(t, 12H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.48ppm(broad, 2H), 1.62ppm(t, 2H), 1.71ppm(m, 2H), 1.82ppm(m, 4H), 3.12ppm(m, 4H), 3.19ppm(d, 4H), 3.34ppm(m, 4H), 3.38ppm(s, 3H, -O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.64ppm(m, 약 2,700H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.10ppm(m, 4H), 4.34ppm(m, 2H), 4.50ppm(q, 2H), 6.46ppm(broad, 2H), 6.94ppm(broad, 2H), 7.08ppm(broad, 2H), 7.27ppm(m, 10H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
[실시예 3-6]
Figure pct00086
실시예 3-5에서 얻어진 ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100PA(0.8g, 2.7×10-5몰)를 원료로 이용하여, 실시예 3-2, 실시예 3-3, 실시예 3-4, 실시예 3-5의 순서로 동일 제법으로 반응을 반복함으로써, 상기 화합물 (p8)(ME-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100GLFG(L)-100PA)을 얻었다. 수량 0.4g. 분자량은 표 1에 나타낸다. HPLC : 아민 순도 90%.
NMR(CDCl3) : 0.90ppm(t, 18H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.48ppm(broad, 3H), 1.62ppm(t, 3H), 1.71ppm(m, 3H), 1.82ppm(m, 6H), 3.12ppm(m, 6H), 3.19ppm(d, 6H), 3.34ppm(m, 6H), 3.38ppm(s, 3H, -O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.64ppm(m, 약 3,600H, -O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.10ppm(m, 8H), 4.34ppm(m, 3H), 4.50ppm(q, 3H), 6.46ppm(broad, 3H), 6.94ppm(broad, 3H), 7.08ppm(broad, 3H), 7.27ppm(m, 15H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
[실시예 4]
화합물 (p14)(ME-200G(Cit)V-200PA)의 합성
Figure pct00087
[실시예 4-1]
Figure pct00088
N 말단을 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc기)로 보호한 L-발릴-L-시트룰릴-글리신(Fmoc-Val-(Cit)-Gly)(0.299g, 5.4×10-4몰, GenScript Biotech사제)과 말단에 프로필아미노기를 갖는 메톡시 PEG(2.7g, 1.3×10-4몰, 평균 분자량=약 21,000, 니치유 주식회사제 「SUNBRIGHT MEPA-20T」)에 탈수 N,N'-디메틸포름아미드(27g)를 첨가하고, 30℃에서 가온 용해하였다. 그 후, 디이소프로필에틸아민(172μL, 1.0×10-3몰, 칸토 화학(주)제)과 (1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)디메틸아미노-모르폴리노-카르베늄헥사플루오로인산염(COMU)(0.289g, 6.810-4몰, 시그마 알드리치사제)을 첨가하고, 실온에서 질소 분위기하에서 1시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 클로로포름(270g)으로 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액(108g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여 세정을 행하였다. 수층과 유기층을 분리 후, 재차, 유기층에 포화 탄산수소나트륨 수용액(108g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여 세정을 행하고, 유기층을 회수하였다. 얻어진 유기층에 황산마그네슘(2.7g)을 첨가하고, 30분 교반하여 탈수한 후, 5A 여과지 상에 옵라이트를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여과액을 40℃에서 농축하고, 농축물에 아세트산에틸(108g)을 첨가하여 균일하게 되도록 교반한 후, 헥산(54g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 석출물을 회수한 후, 재차 아세트산에틸(108g)에 용해하고, 실온에서 헥산(54g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 석출물을 회수한 후, 헥산(54g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p15)(ME-200G(Cit)V-Fmoc)를 얻었다. 수량 2.3g.
NMR(d6-DMSO) : 0.84ppm(d, 3H, -NH-CO-CH-CH(CH 3 )2), 0.85ppm(d, 3H, -NH-CO-CH-CH(CH 3 )2), 1.37ppm(m, 2H), 1.52ppm(m, 1H), 1.63ppm(m, 3H), 1.98ppm(m, 1H, -O-CO-NH-CH-CH(CH3)2), 2.93ppm(m, 4H), 3.09ppm(m, 2H, -NH-CH-CH2-CH2-CH 2 -NH-CO-NH2), 3.24ppm(s, 3H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.48ppm(m, 약 1,900H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3), 3.89ppm(m, 2H), 4.25ppm(m, 3H, -NH-CO-O-CH 2 -CH＜), 5.35ppm(broad, 2H, -NH-CH-CH2-CH2-CH2-NH-CO-NH 2 ), 5.91ppm(broad, 1H), 7.33ppm(t, 2H, Ar), 7.41ppm(m, 3H, Ar), 7.73ppm(m, 3H, Ar), 7.89ppm(d, 2H, Ar), 8.10ppm(d, 1H), 8.20ppm(broad, 1H)
[실시예 4-2]
Figure pct00089
실시예 4-1에서 얻어진 ME-200G(Cit)V-Fmoc(2.1g, 1.0×10-4몰)에 N,N'-디메틸포름아미드(12.6g)를 첨가하고, 30℃에서 가온 용해하였다. 피페리딘(0.66g, 7.8×10-3몰, 와코 순약 공업(주)제)을 첨가하고, 실온에서 질소 분위기하에서 2시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 아세트산에틸(150g)을 첨가하여 균일하게 될 때까지 교반하고, 헥산(75g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 석출물을 회수한 후, 재차 아세트산에틸(150g)에 용해하고, 헥산(75g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 석출물을 회수한 후, 헥산(75g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p16)(ME-200G(Cit)V-NH 2 )을 얻었다. 수량 1.8g.
NMR(d6-DMSO) : 0.77ppm(d, 3H, -NH-CO-CH-CH(CH 3 )2), 0.87ppm(d, 3H, -NH-CO-CH-CH(CH 3 )2), 1.35ppm(m, 2H), 1.51ppm(m, 1H), 1.64ppm(m, 4H), 1.93ppm(m, 1H, -O-CO-NH-CH-CH(CH3)2), 2.96ppm(m, 4H), 3.10ppm(m, 2H, -NH-CH-CH2-CH2-CH 2 -NH-CO-NH2), 3.24ppm(s, 3H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ,), 3.48ppm(m, 약 1,900H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3), 4.21ppm(broad, 1H), 5.34ppm(broad, 2H, -NH-CH-CH2-CH2-CH2-NH-CO-NH 2 ), 5.91ppm(broad, 1H), 7.73ppm(t, 1H), 8.08ppm(broad, 1H), 8.23ppm(t, 1H)
[실시예 4-3]
Figure pct00090
실시예 4-2에서 얻어진 ME-200G(Cit)V-NH2(1.2g, 5.7×10-5몰)를 클로로포름(7.2g)에 용해한 후, 트리에틸아민(9.2μL, 6.7×10-5몰, 칸토 화학(주)제)과, 편말단에 tert-부톡시카르보닐기로 보호한 프로필아미노기를 갖고, 다른 편말단에 탄산숙신이미딜기를 갖는 헤테로 이관능 PEG(1.2g, 5.2×10-5몰, 평균 분자량=약 23,000, 니치유 주식회사제 「SUNBRIGHT BO-200TS」)를 첨가하고, 실온에서 질소 분위기하에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 40℃에서 농축하고, 얻어진 농축물에 아세트산에틸(120g)을 첨가하여 용해한 후, 헥산(60g)을 첨가하여 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하였다. 얻어진 석출물을 헥산(12g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p17)(ME-200G(Cit)V-200Boc)을 얻었다. 수량 2.1g.
NMR(CDCl3) : 0.96ppm(d, 3H, -NH-CO-CH-CH(CH 3 )2), 1.01ppm(d, 3H, -NH-CO-CH-CH(CH 3 )2), 1.44ppm(s, 9H, -CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 ), 1.59ppm(m, 2H), 1.76ppm(m, 3H), 1.82ppm(q, 2H), 1.92ppm(m, 1H), 3.09ppm(m, 1H), 3.23ppm(m, 2H, -NH-CH-CH2-CH2-CH 2 -NH-CO-NH2), 3.38ppm(s, 3H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.64ppm(m, 약 3,800H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.07ppm(dd, 1H), 4.15ppm(m, 2H), 4.31ppm(m, 1H), 4.38ppm(m, 1H), 5.02ppm(broad, 1H), 5.24ppm(broad, 2H, -NH-CH-CH2-CH2-CH2-NH-CO-NH 2 ), 5.74ppm(broad, 1H), 5.81ppm(d, 1H), 7.05ppm(broad, 1H), 7.46ppm(broad, 1H), 8.30ppm(broad, 1H)
[실시예 4-4]
Figure pct00091
실시예 4-3에서 얻어진 ME-200G(Cit)V-200Boc(2.0g, 4.5×10-5몰)를 디클로로메탄(10g)에 용해하고, 메탄술폰산(291μL, 4.5×10-3몰, 칸토 화학(주)제)을 첨가하여, 실온에서 질소 분위기하에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 톨루엔(20g)으로 희석하고, 이온 교환수(20g)를 첨가하여, 실온에서 15분 교반하고, 수층에 생성물을 추출하였다. 일본국 특허 공개 2014-208786에 기재된 조건에 따라, 1mol/L 염산을 이용하여 수층의 pH를 2.0으로 조정하고, 톨루엔과 클로로포름 혼합 용액으로 수층을 세정하여, 아미노기를 가지지 않는 폴리에틸렌글리콜 불순물을 제거하였다. 이어서 수층에 1mol/L 수산화나트륨 수용액을 적당량 첨가하여, pH12로 조정한 후, 염화나트륨(5.0g)을 용해하였다. 거기에, 클로로포름(10g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 수층과 유기층을 분리한 후, 수층에 재차 클로로포름(10g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 추출 1회째와 2회째에서 얻어진 유기층을 40℃에서 농축한 후, 얻어진 농축물에 아세트산에틸(100g)을 첨가하였다. 얻어진 아세트산에틸 용액에, 황산나트륨(2.0g)을 첨가하여, 30℃에서 15분 교반한 후, 5A 여과지 상에 옵라이트를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여과액에 헥산(50g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과한 후, 헥산(20g)으로 석출물을 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p14)(ME-200G(Cit)V-200PA)를 얻었다. 수량 1.7g. 분자량은 표 1에 나타낸다. HPLC : 아민 순도 92%.
NMR(CDCl3) : 0.96ppm(d, 3H, -NH-CO-CH-CH(CH 3 )2), 1.01ppm(d, 3H, -NH-CO-CH-CH(CH 3 )2), 1.60ppm(m, 2H), 1.75ppm(m, 3H), 1.82ppm(m, 2H), 1.93ppm(m, 1H), 2.23ppm(m, 1H), 2.82ppm(t, 2H, -CH2-CH2-CH2-NH 2 ), 3.10ppm(m, 1H), 3.30ppm(m, 2H), 3.38ppm(m, 4H), 3.64ppm(m, 약 3,800H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 3.95ppm(m, 1H), 4.07ppm(dd, 1H), 4.15ppm(m, 1H), 4.31ppm(m, 1H), 4.38ppm(m, 1H), 5.24ppm(broad, 2H, -NH-CH-CH2-CH2-CH2-NH-CO-NH 2 ), 5.79ppm(broad, 1H), 5.82ppm(broad, 1H), 7.06ppm(broad, 1H), 7.48ppm(broad, 1H), 8.31ppm(broad, 1H)
[실시예 5]
화합물 (p18)(ME-200G(Cit)V-200MA)의 합성
Figure pct00092
실시예 4-4에서 얻어진 ME-200G(Cit)V-200PA(0.2g, 4.5×10-6몰)에 톨루엔(1.1g)과 아세토니트릴(0.16g)을 첨가하고 40℃에서 가온 용해하였다. 얻어진 용액에 N-메틸모르폴린(2.5μL, 2.2×10-5몰, 칸토 화학(주)제)과 N-숙신이미딜-3-말레이미도프로피오네이트(1.8㎎, 6.8×10-6몰, (주)오사카 합성 유기 화학 연구소제)를 첨가하고, 40℃, 질소 분위기하에서 1시간 반응시켰다. 반응 용액에 아세트산에틸(6.0g)을 첨가하고, 균일하게 될 때까지 교반한 후, 17℃에서 헥산(8.0g)을 첨가하여, 17℃에서 15분 교반해 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과한 후, 헥산(8.0g)으로 석출물을 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p18)(ME-200G(Cit)V-200MA)을 얻었다. 수량 0.12g. 분자량은 표 1에 나타낸다. 말레이미드 순도는 88%(1H-NMR).
NMR(CDCl3) : 0.96ppm(d, 3H, -NH-CO-CH-CH(CH 3 )2), 1.01ppm(d, 3H, -NH-CO-CH-CH(CH 3 )2), 1.59ppm(broad, 2H), 1.76ppm(m, 5H), 2.46ppm(t, 2H, -CH2-CH2-CH 2 -NH-CO-CH2-CH2-C4NO2H2), 3.12ppm(m, 1H), 3.34ppm(m, 5H), 3.64ppm(m, 약 3,800H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.02ppm(m, 1H), 4.13ppm(m, 1H), 4.28ppm(m, 1H), 4.37ppm(m, 1H), 5.86ppm(broad, 1H), 6.42ppm(broad, 1H), 6.68ppm(s, 2H, -CH2-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-C 4 NO 2 H 2 ), 7.04ppm(broad, 1H), 7.46ppm(broad, 1H), 8.20ppm(broad, 1H)
[실시예 6]
화합물 (p19)(ME-200GGG-200PA)의 합성
Figure pct00093
[실시예 6-1]
Figure pct00094
글리실-글리실-글리신(2.0g, 1.1×10-2몰, 칸토 화학(주)제)에 이온 교환수(60g)와 탄산수소나트륨(4.5g)을 첨가하여 용해한 후, 테트라하이드로푸란(60g)과 디-tert-부틸디카보네이트(Boc2O)(4.6g, 2.1×10-2몰, 토쿄 화성 공업(주)제)를 첨가하고, 40℃에서 23시간 반응시켰다. 반응 용액에 물(120g)을 첨가하고, 5℃까지 냉각한 후, 인산을 적당량 첨가하여, pH를 7로 조정하고, 헥산(120g)을 첨가하여 실온에서 15분 교반하였다. 유기층과 수층을 분리 후, 수층에 재차 헥산(120g)을 첨가하여 실온에서 15분 교반하였다. 수층을 회수 후, 에탄올(100g)을 첨가하여 50℃에서 농축하고, 재차 에탄올(100g)을 첨가하여 50℃에서 농축하였다. 얻어진 농축물에 에탄올(100g)을 첨가하고, 50℃에서 가온 용해한 후, 5A 여과지 상에 옵라이트를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여과액을 50℃에서 농축한 후, 진공 건조하여, Boc-글리실-글리실-글리신을 얻었다. 수량 1.5g.
NMR(D2O) : 1.45ppm(s, 9H, -NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 ), 3.78ppm(s, 2H, -CH 2 -NH-CO-O-C(CH3)3), 3.84ppm(s, 2H, -CO-NH-CH 2 -COOH), 4.00ppm(s, 2H, -CO-NH-CH 2 -CO-NH-)
[실시예 6-2]
Figure pct00095
Boc-글리실-글리실-글리신(0.174g, 6.0×10-4몰)과 말단에 프로필아미노기를 갖는 메톡시 PEG(3.0g, 1.4×10-4몰, 평균 분자량=약 21,000, 니치유 주식회사제 「SUNBRIGHT MEPA-20T」)에 탈수 N,N'-디메틸포름아미드(27g)를 첨가하고, 30℃에서 가온 용해하였다. 그 후, 디이소프로필에틸아민(191μL, 1.1×10-3몰, 칸토 화학(주)제)과 (1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)디메틸아미노-모르폴리노-카르베늄헥사플루오로인산염(COMU)(0.321g, 7.5×10-4몰, 시그마 알드리치사제)을 첨가하고, 실온에서 질소 분위기하에서 1시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 클로로포름(300g)으로 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액(120g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여 세정을 행하였다. 수층과 유기층을 분리 후, 재차, 유기층에 포화 탄산수소나트륨 수용액(120g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여 세정을 행한 후, 유기층을 회수하였다. 얻어진 클로로포름 용액에 황산마그네슘(3.0g)을 첨가하고, 30분 교반하여 탈수한 후, 5A 여과지 상에 옵라이트를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여과액을 40℃에서 농축하고, 농축물에 아세트산에틸(120g)을 첨가하여 균일하게 되도록 교반한 후, 헥산(60g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 석출물을 회수한 후, 재차 아세트산에틸(120g)에 용해하고, 헥산(60g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 석출물을 회수한 후, 헥산(60g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p21)(ME-200GGG-Boc)을 얻었다. 수량 2.6g.
NMR(CDCl3) : 1.45ppm(s, 9H, -NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 ), 1.80ppm(m, 2H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3), 3.38ppm(m, 5H), 3.64ppm(m, 약 1,900H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3), 3.86ppm(d, 2H, -CH 2 -NH-CO-O-C(CH3)3), 3.91ppm(d, 2H), 3.99ppm(d, 2H), 5.69ppm(broad, 1H), 7.10ppm(broad, 1H), 7.44ppm(broad, 2H)
[실시예 6-3]
Figure pct00096
실시예 6-2에서 얻어진 ME-200GGG-Boc(2.4g, 1.1×10-4몰)를 디클로로메탄(12g)에 용해하고, 메탄술폰산(723μL, 1.1×10-2몰, 칸토 화학(주)제)을 첨가하여, 실온에서 질소 분위기하에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 톨루엔(24g)으로 희석하고, 이온 교환수(24g)를 첨가하여, 실온에서 15분 교반하고, 수층에 생성물을 추출하였다. 얻어진 수층에 1mol/L 수산화나트륨 수용액을 적당량 첨가하여, pH를 12로 조정한 후, 염화나트륨(6.0g)을 용해하였다. 거기에, 클로로포름(12g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 수층과 유기층을 분리한 후, 수층에 재차 클로로포름(12g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 추출 1회째와 2회째에서 얻어진 유기층을 40℃에서 농축한 후, 얻어진 농축물에 아세트산에틸(120g)을 첨가하였다. 얻어진 아세트산에틸 용액에, 황산나트륨(2.4g)을 첨가하여, 30℃에서 15분 교반한 후, 5A 여과지 상에 옵라이트를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여과액에 헥산(60g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과한 후, 헥산(24g)으로 석출물을 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p22)(ME-200GGG-NH 2 )를 얻었다. 수량 2.2g.
NMR(CDCl3) : 1.53ppm(broad, 1H), 1.79ppm(m, 2H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3), 3.38ppm(m, 5H), 3.64ppm(m, 약 1,900H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3), 3.92ppm(d, 2H), 4.01ppm(broad, 1H), 7.06ppm(broad, 1H), 7.24ppm(broad, 1H), 7.86ppm(broad, 1H)
[실시예 6-4]
Figure pct00097
실시예 6-3에서 얻어진 ME-200GGG-NH2(1.5g, 7.1×10-5몰)를 클로로포름(7.5g)에 용해한 후, 트리에틸아민(11.6μL, 8.4×10-5몰, 칸토 화학(주)제)과, 편말단에 tert-부톡시카르보닐기로 보호한 프로필아미노기를 갖고, 다른 편말단에 탄산숙신이미딜기를 갖는 헤테로 이관능 PEG(1.8g, 7.8×10-5몰, 평균 분자량=약 23,000, 니치유 주식회사제 「SUNBRIGHT BO-200TS」)를 첨가하고, 실온에서 질소 분위기하에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 40℃에서 농축하고, 얻어진 농축물에 아세트산에틸(150g)을 첨가하여 용해한 후, 헥산(75g)을 첨가하여 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하였다. 얻어진 석출물을 헥산(75g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p23)(ME-200GGG-200Boc)을 얻었다. 수량 3.0g.
NMR(CDCl3) : 1.44ppm(s, 9H, -CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 ), 1.78ppm(m, 4H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3, -CH2-CH 2 -CH2-NH-CO-O-C(CH3)3), 3.23ppm(m, 2H, -CH2-CH2-CH 2 -NH-CO-O-C(CH3)3), 3.35ppm(m, 2H), 3.38ppm(s, 3H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.65ppm(m, 약 3,800H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 3.97ppm(d, 2H), 4.23ppm(broad, 2H, -NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-), 5.01ppm(broad, 1H), 6.21ppm(broad, 1H), 7.00ppm(broad, 1H), 7.47ppm(broad, 1H), 7.61ppm(broad, 1H)
[실시예 6-5]
Figure pct00098
실시예 6-4에서 얻어진 ME-200GGG-200Boc(2.5g, 5.8×10-5몰)를 디클로로메탄(12.5g)에 용해하고, 메탄술폰산(365μL, 5.6×10-3몰, 칸토 화학(주)제)을 첨가하여, 실온에서 질소 분위기하에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 톨루엔(25g)으로 희석하고, 이온 교환수(25g)를 첨가하여, 실온에서 15분 교반하고, 수층에 생성물을 추출하였다. 일본국 특허 공개 2014-208786에 기재된 조건에 따라, 1mol/L 염산을 이용하여 수층의 pH를 2.0으로 조정하고, 톨루엔과 클로로포름 혼합 용액으로 수층을 세정하여, 아미노기를 가지지 않는 폴리에틸렌글리콜 불순물을 제거하였다. 이어서 수층에 1mol/L 수산화나트륨 수용액을 적당량 첨가하여, pH12로 조정한 후, 염화나트륨(6.3g)을 용해하였다. 거기에, 클로로포름(12.5g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 수층과 유기층을 분리한 후, 수층에 재차 클로로포름(12.5g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 추출 1회째와 2회째에서 얻어진 유기층을 40℃에서 농축한 후, 얻어진 농축물에 아세트산에틸(125g)을 첨가하였다. 얻어진 아세트산에틸 용액에, 황산나트륨(2.5g)을 첨가하여, 30℃에서 15분 교반한 후, 5A 여과지 상에 옵라이트를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여과액에 헥산(62.5g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과한 후, 헥산(25g)으로 석출물을 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p19)(ME-200GGG-200PA)를 얻었다. 수량 2.4g. 분자량은 표 1에 나타낸다. HPLC : 아민 순도 91%.
NMR(CDCl3) : 1.79ppm(m, 4H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3, -CH2-CH 2 -CH2-NH2), 2.91ppm(broad, 2H), 3.37ppm(m, 5H), 3.65ppm(m, 약 3,800H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 3.90ppm(t, 3H), 3.97ppm(d, 2H), 4.23ppm(broad, 2H, -NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-), 6.19ppm(broad, 1H), 7.00ppm(broad, 1H), 7.45ppm(broad, 1H), 7.61ppm(broad, 1H)
[실시예 7]
화합물 (p24)(ME-200GF-200PA)의 합성
Figure pct00099
[실시예 7-1]
Figure pct00100
N 말단을 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc기)로 보호한 L-페닐알라닐-글리신(Fmoc-Phe-Gly)(0.533g, 1.2×10-3몰, 와타나베 화학 공업(주)제)과 말단에 프로필아미노기를 갖는 메톡시 PEG(6.0g, 2.9×10-4몰, 평균 분자량=약 21,000, 니치유 주식회사제 「SUNBRIGHT MEPA-20T」)에 탈수 N,N'-디메틸포름아미드(60g)를 첨가하고, 30℃에서 가온 용해하였다. 그 후, 디이소프로필에틸아민(383μL, 2.3×10-3몰, 칸토 화학(주)제)과 (1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)디메틸아미노-모르폴리노-카르베늄헥사플루오로인산염(COMU)(0.642g, 1.5×10-3몰, 시그마 알드리치사제)을 첨가하고, 실온에서 질소 분위기하에서 1시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 클로로포름(600g)으로 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액(240g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여 세정을 행하였다. 수층과 유기층을 분리 후, 재차, 유기층에 포화 탄산수소나트륨 수용액(240g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하여 세정을 행하고, 유기층을 회수하였다. 얻어진 클로로포름 용액에 황산마그네슘(2.4g)을 첨가하고, 30분 교반하여 탈수한 후, 5A 여과지 상에 옵라이트를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여과액을 40℃에서 농축하고, 농축물에 아세트산에틸(240g)을 첨가하여 균일하게 되도록 교반한 후, 헥산(120g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 석출물을 회수한 후, 재차 아세트산에틸(240g)에 용해하고, 헥산(120g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 석출물을 회수한 후, 헥산(120g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p25)(ME-200GF-Fmoc)를 얻었다. 수량 5.1g.
NMR(d6-DMSO) : 1.62ppm(m, 2H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3), 2.80ppm(m, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.04ppm(m, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.10ppm(m, 2H, -CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3), 3.24ppm(s, 3H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.48ppm(m, 약 1,900H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3), 4.20ppm(m, 4H), 7.33ppm(m, 9H), 7.66ppm(m, 4H, Ar), 7.88ppm(d, 2H, Ar), 8.27ppm(t, 1H)
[실시예 7-2]
Figure pct00101
실시예 7-1에서 얻어진 ME-200GF-Fmoc(4.9g, 2.3×10-4몰)에 N,N'-디메틸포름아미드(29.4g)를 첨가하고, 30℃에서 가온 용해하였다. 피페리딘(1.55g, 1.8×10-2몰, 와코 순약 공업(주)제)을 첨가하고, 실온에서 질소 분위기하에서 2시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 아세트산에틸(300g)을 첨가하여 균일하게 될 때까지 교반하고, 헥산(150g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 석출물을 회수한 후, 재차 아세트산에틸(300g)에 용해하고, 헥산(150g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 석출물을 회수한 후, 헥산(150g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p26)(ME-200GF-NH 2 )을 얻었다. 수량 3.9g.
NMR(d6-DMSO) : 1.62ppm(m, 2H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3), 1.64ppm(broad, 1H), 2.59ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 2.98ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.10ppm(q, 2H, -CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3), 3.24ppm(s, 3H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.48ppm(m, 약 1,900H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3), 7.24ppm(m, 6H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 , -NH-), 7.73ppm(t, 1H), 8.12ppm(broad, 1H)
[실시예 7-3]
Figure pct00102
실시예 7-2에서 얻어진 ME-200GF-NH2(0.98g, 4.7×10-5몰)를 클로로포름(4.9g)에 용해한 후, 트리에틸아민(7.5μL, 5.4×10-5몰, 칸토 화학(주)제)과, 편말단에 tert-부톡시카르보닐기로 보호한 프로필아미노기를 갖고, 다른 편말단에 탄산숙신이미딜기를 갖는 헤테로 이관능 PEG(1.3g, 6.2×10-5몰, 평균 분자량=약 23,000, 니치유 주식회사제 「SUNBRIGHT BO-200TS」)를 첨가하고, 실온에서 질소 분위기하에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 40℃에서 농축하고, 얻어진 농축물에 아세트산에틸(98g)을 첨가하여 용해한 후, 헥산(49g)을 첨가하여 실온에서 15분 교반하여 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하였다. 얻어진 석출물을 헥산(49g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p27)(ME-200GF-200Boc)을 얻었다. 수량 2.0g.
NMR(CDCl3) : 1.44ppm(s, 9H, -CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 ), 1.77ppm(m, 4H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3, -CH2-CH 2 -CH2-NH-CO-O-C(CH3)3), 3.02ppm(m, 1H), 3.21ppm(m, 3H), 3.36ppm(m, 4H), 3.65ppm(m, 약 3,800H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.18ppm(m, 2H, -NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-), 4.39ppm(q, 1H, -NH-CO-CH-CH2-C6H5), 5.03ppm(broad, 1H), 5.55ppm(d, 1H), 6.86ppm(broad, 1H), 7.02ppm(broad, 1H), 7.25ppm(m, 5H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
[실시예 7-4]
Figure pct00103
실시예 7-3에서 얻어진 ME-200GF-200Boc(1.8g, 4.1×10-5몰)를 디클로로메탄(9.0g)에 용해하고, 메탄술폰산(262μL, 4.3×10-3몰, 칸토 화학(주)제)을 첨가하여, 실온에서 질소 분위기하에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 톨루엔(18g)으로 희석하고, 이온 교환수(18g)를 첨가하여, 실온에서 15분 교반하고, 수층에 생성물을 추출하였다. 일본국 특허 공개 2014-208786에 기재된 조건에 따라, 1mol/L 염산을 이용하여 수층의 pH를 2.0으로 조정하고, 톨루엔과 클로로포름 혼합 용액으로 수층을 세정하여, 아미노기를 가지지 않는 폴리에틸렌글리콜 불순물을 제거하였다. 이어서 수층에 1mol/L 수산화나트륨 수용액을 적당량 첨가하여, pH12로 조정한 후, 염화나트륨(4.5g)을 용해하였다. 거기에, 클로로포름(18g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 수층과 유기층을 분리한 후, 수층에 재차 클로로포름(18g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 추출 1회째와 2회째에서 얻어진 유기층을 40℃에서 농축한 후, 얻어진 농축물에 아세트산에틸(90g)을 첨가하였다. 얻어진 아세트산에틸 용액에, 황산나트륨(1.8g)을 첨가하여, 30℃에서 15분 교반한 후, 5A 여과지 상에 옵라이트를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여과액에 헥산(45g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과한 후, 헥산(18g)으로 석출물을 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p24)(ME-200GF-200PA)를 얻었다. 수량 1.7g. 분자량은 표 1에 나타낸다. HPLC : 아민 순도 87%.
NMR(CDCl3) : 1.77ppm(m, 4H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3, -CH2-CH 2 -CH2-NH2), 2.87ppm(m, 2H), 3.07ppm(m, 1H), 3.30ppm(m, 3H), 3.38ppm(s, 3H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.64ppm(m, 약 3,800H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.18ppm(m, 2H, -NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-), 4.32ppm(q, 1H, -NH-CO-CH-CH2-C6H5), 5.56ppm(broad, 1H), 6.83ppm(broad, 1H), 6.96ppm(broad, 1H), 7.25ppm(m, 5H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
[실시예 8]
화합물 (p28)(ME-200GAV-200PA)의 합성
Figure pct00104
실시예 4와 동일 제법으로, N 말단을 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc기)로 보호한 L-발린-L-알라닌-글리신(Fmoc-Val-Ala-Gly)을 원료로 사용하여, 상기 화합물 (p28)(ME-200GAV-200PA)을 얻었다. 수량 1.0g. 분자량은 표 1에 나타낸다. HPLC : 아민 순도 90%.
NMR(d6-DMSO) : 0.82ppm(dd, 6H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.21ppm(d, 3H, -NH-CO-CH(CH3)-), 1.62ppm(m, 4H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3, -CH2-CH 2 -CH2-NH2), 1.95ppm(m, 1H), 3.10ppm(m, 2H), 3.23ppm(s, 3H, -O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.60ppm(m, 약 3,800H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.05ppm(m, 2H), 4.22ppm(m, 1H), 7.24ppm(broad, 1H), 7.69ppm(broad, 1H), 8.10ppm(broad, 2H)
[실시예 9]
화합물 (p29)(ME-200GFGG-200PA)의 합성
Figure pct00105
실시예 4와 동일 제법으로, N 말단을 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc기)로 보호한 글리신-글리신-L-페닐알라닌-글리신(Fmoc-Gly-Gly-Phe-Gly)을 원료로 사용하여, 상기 화합물 (p29)(ME-200GFGG-200PA)를 얻었다. 수량 1.2g. 분자량은 표 1에 나타낸다. HPLC : 아민 순도 91%.
NMR(d6-DMSO) : 1.62ppm(m, 4H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3, -CH2-CH 2 -CH2-NH2), 2.80ppm(m, 1H), 3.10ppm(m, 2H), 3.23ppm(s, 3H, -O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.60ppm(m, 약 3,800H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.05ppm(m, 2H), 4.47ppm(m, 1H), 7.20ppm(m, 5H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 ), 7.43ppm(broad, 1H), 7.62ppm(broad, 1H), 8.00ppm(broad, 1H), 8.12ppm(broad, 1H), 8.24ppm(broad, 1H)
[실시예 10]
화합물 (p30)(ME-200GFG-200PA)의 합성
Figure pct00106
실시예 4와 동일 제법으로, N 말단을 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc기)로 보호한 글리신-L-페닐알라닌-글리신(Fmoc-Gly-Phe-Gly)을 원료로 사용하여, 상기 화합물 (p30)(ME-200GFG-200PA)을 얻었다. 수량 1.1g. 분자량은 표 1에 나타낸다. HPLC : 아민 순도 89%.
NMR(d6-DMSO) : 1.62ppm(m, 4H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3, -CH2-CH 2 -CH2-NH2), 2.80ppm(m, 1H), 3.10ppm(m, 2H), 3.23ppm(s, 3H, -O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.60ppm(m, 약 3,800H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.05ppm(m, 2H), 4.47ppm(m, 1H), 7.20ppm(m, 5H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 ), 7.34ppm(broad, 1H), 7.64ppm(broad, 1H), 8.10ppm(broad, 1H), 8.30ppm(broad, 1H)
[실시예 11]
화합물 (p31)(ME-200GF-200PA(amide))의 합성
Figure pct00107
실시예 7과 동일 제법으로, N 말단을 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc기)로 보호한 L-페닐알라닐-글리신(Fmoc-Phe-Gly), 편말단에 tert-부톡시카르보닐기로 보호한 프로필아미노기, 다른 편말단에 헥산산 N-숙신이미딜 활성 에스테르를 갖는 헤테로 이관능 PEG(평균 분자량=약 21,000, 니치유 주식회사제 「SUNBRIGHT BO-200HS」)를 원료로 사용하여, 실시예 7의 우레탄 결합이 아니라, 아미드 결합으로 헤테로 이관능 PEG를 도입한 상기 화합물 (p31)(ME-200GF-200PA(amide))을 얻었다. 수량 1.0g. 분자량은 표 1에 나타낸다. HPLC : 아민 순도 91%.
NMR(d6-DMSO) : 1.11ppm(m, 2H, -NH-CO-CH2-CH2-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-), 1.38ppm(m, 2H, -NH-CO-CH2-CH 2 -CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-), 1.62ppm(m, 6H, -NH-CO-CH2-CH2-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3, -CH2-CH 2 -CH2-NH2), 2.02ppm(m, 2H, -NH-CO-CH 2 -CH2-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-), 2.80ppm(m, 1H), 3.10ppm(m, 2H), 3.23ppm(s, 3H, -O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.60ppm(m, 약 3,800H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.47ppm(m, 1H), 7.20ppm(m, 5H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 ), 7.26ppm(broad, 1H), 7.64ppm(broad, 1H), 8.10ppm(broad, 1H), 8.30ppm(broad, 1H)
[실시예 12]
화합물 (p32)(ME-200GLFG(D)-200PA)의 합성
Figure pct00108
실시예 1과 동일 제법으로, N 말단을 tert-부톡시카르보닐기(Boc기)로 보호한 글리신-D-페닐알라닌-D-류신-글리신을 원료로 사용하여, 광학 이성체인 D형의 아미노산을 가진 상기 화합물 (p32)(ME-200GLFG(D)-200PA)를 얻었다. 수량 1.1g. 분자량은 표 1에 나타낸다. HPLC : 아민 순도 93%.
NMR(CDCl3) : 0.90ppm(t, 6H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.48ppm(broad, 1H), 1.62ppm(t, 1H), 1.71ppm(m, 1H), 1.82ppm(m, 2H), 3.12ppm(m, 2H), 3.19ppm(d, 2H), 3.34ppm(m, 2H), 3.38ppm(s, 3H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.64ppm(m, 약 3,800H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.10ppm(m, 2H), 4.34ppm(m, 1H), 4.50ppm(q, 1H), 6.46ppm(broad, 1H), 6.94ppm(broad, 1H), 7.08ppm(broad, 1H), 7.27ppm(m, 5H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
[실시예 13]
화합물 (p34)(LY-(ME-100GLFG(L)-100) 2 -PA)의 합성
Figure pct00109
[실시예 13-1]
Figure pct00110
N 말단을 tert-부톡시카르보닐기(Boc기)로 보호한 글리실-L-페닐알라닐-L-류실-글리신(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)(0.438g, 8.8×10-4몰, GenScript Biotech사제)과 N-하이드록시숙신이미드(0.128g, 1.1×10-3몰, 미도리 화학(주)제)를 탈수 N,N'-디메틸포름아미드(1.0g)에 용해 후, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(0.229g, 1.1×10-3몰, 타마 화학 공업(주)제)를 첨가하고, 실온에서 질소 분위기하에서 1시간 반응시켰다. 탈수 N,N'-디메틸포름아미드(3.0g)를 첨가하여 희석한 후, 말단에 프로필아미노기를 갖는 메톡시 PEG(2.0g, 2.2×10-4몰, 평균 분자량=약 9,000, 니치유 주식회사제 「SUNBRIGHT MEPA-10T」)를 첨가하고, 실온에서 질소 분위기하에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 아세트산에틸(20g)을 첨가하여 반응액을 희석하고, LS100 여과지를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 여과액에 아세트산에틸(30g)을 첨가하여, 균일하게 되도록 교반한 후, 헥산(25g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 석출물을 회수한 후, 재차 아세트산에틸(50g)에 용해하고, 헥산(25g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시켰다. 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 석출물을 회수한 후, 헥산(25g)으로 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하고, 진공 건조하여 상기 화합물 (p35)(ME-100GLFG(L)-Boc)를 얻었다. 수량 1.8g.
NMR(CDCl3) : 0.89ppm(d, 3H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 0.92ppm(d, 3H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.36ppm(s, 9H, -NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 ), 1.48ppm(m, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2), 1.55ppm(m, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2), 1.80ppm(m, 3H), 3.13ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.21ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.33ppm(m, 2H, -CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3), 3.38ppm(s, 3H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.65ppm(m, 약 820H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3), 3.91ppm(t, 1H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH3)2), 4.43ppm(broad, 1H), 4.55ppm(q, 1H, -NH-CO-CH-CH2-C6H5), 5.77ppm(broad, 1H), 6.76ppm(broad, 1H), 6.86ppm(broad, 1H), 6.90ppm(broad, 1H), 7.14ppm(broad, 1H), 7.20ppm(d, 2H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 ), 7.32ppm(m, 3H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
[실시예 13-2]
Figure pct00111
실시예 13-1에서 얻어진 ME-100GLFG(L)-Boc(1.8g, 2.0×10-4몰)를 디클로로메탄(9.0g)에 용해하고, 메탄술폰산(1.3mL, 2.0×10-2몰, 칸토 화학(주)제)을 첨가하여, 실온에서 질소 분위기하에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 톨루엔(18g)으로 희석하고, 이온 교환수(18g)를 첨가하여, 실온에서 15분 교반하고, 수층에 생성물을 추출하였다. 얻어진 수층에 1mol/L 수산화나트륨 수용액을 적당량 첨가하여, pH를 12로 조정한 후, 염화나트륨(4.5g)을 용해하였다. 거기에, 클로로포름(18g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 수층과 유기층을 분리한 후, 수층에 재차 클로로포름(18g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 추출 1회째와 2회째에서 얻어진 유기층을 40℃에서 농축한 후, 얻어진 농축물에 아세트산에틸(36g)을 첨가하였다. 얻어진 아세트산에틸 용액에, 황산나트륨(0.90g)을 첨가하여, 30℃에서 15분 교반한 후, 5A 여과지 상에 옵라이트를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여과액에 헥산(18g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과한 후, 헥산(18g)으로 석출물을 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p36)(ME-100GLFG(L)-NH 2 )을 얻었다. 수량 1.4g.
NMR(CDCl3) : 0.89ppm(d, 3H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 0.91ppm(d, 3H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.53ppm(m, 2H, -NH-CO-CH-CH 2 -CH(CH3)2), 1.70ppm(m, 1H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH3)2), 1.80ppm(m, 2H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3), 3.10ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.18ppm(dd, 1H, -NH-CO-CH-CH 2 -C6H5), 3.33ppm(m, 7H), 3.74ppm(m, 약 820H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3), 4.31ppm(broad, 1H), 4.55ppm(t, 1H, -NH-CO-CH-CH2-C6H5), 6.91ppm(broad, 1H), 7.00ppm(broad, 1H), 7.28ppm(m, 5H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 ), 7.98ppm(broad, 1H)
[실시예 13-3]
Figure pct00112
비특허문헌(Bioconjugate Chem., 21(2010), pp.248-254) 등에 기재된 제법을 이용하여 합성한 편말단에 테트라하이드로피라닐기, 편말단에 하이드록시기를 갖는 헤테로 이관능 PEG(5g, 6.0×10-5몰)를 디클로로메탄(12g)에 용해 후, 탄산디(N-숙신이미딜)(0.513g, 2.0×10-3몰, 토쿄 화성 공업(주)제)과 피리딘(243μL, 3.0×10-3몰, 칸토 화학(주)제)을 첨가하고, 27℃에서 질소 분위기하에서 7시간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 디클로로메탄(20g)으로 희석하여 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 얻어진 여과액에 2,6-디tert부틸-p-크레졸(4.3㎎)을 첨가하여 5분간 교반하였다. 그 후, 5wt% 염화나트륨 수용액(6g, pH5)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반하여 세정을 행하였다. 수층과 유기층으로 분리한 후, 유기층에 황산마그네슘(1.0g)을 첨가하여, 실온에서 30분 교반한 후, 5A 여과지 상에 옵라이트를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여과액을 35℃에서 농축한 후, 얻어진 농축물에 아세트산에틸(50g)을 첨가하여 용해하였다. 용해 후, 헥산(25g)을 첨가하여, 실온에서 30분 교반해 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하였다. 얻어진 석출물에 헥산(25g)을 첨가하여 30분간 교반하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p37)(THP-10TS)을 얻었다. 수량 4.3g.
NMR(CDCl3) : 1.52ppm(m, 2H, -tetrahydropyranyl), 1.59ppm(m, 2H, -tetrahydropyranyl), 1.73ppm(m, 1H, -tetrahydropyranyl), 1.85ppm(m, 1H, -tetrahydropyranyl), 2.85ppm(t, 4H, -succinimide), 3.64ppm(m, 약 820H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 3.80ppm(m, 2H), 3.88ppm(m, 2H, -tetrahydropyranyl), 4.47ppm(m, 2H), 4.64ppm(t, 1H, -tetrahydropyranyl)
[실시예 13-4]
Figure pct00113
실시예 13-2에서 얻어진 ME-100GLFG(L)-NH2(3.64g, 3.4×10-4몰)를 클로로포름(17g)에 용해한 후, 트리에틸아민(56.5μL, 4.1×10-4몰, 칸토 화학(주))과, 실시예 13-3에서 얻어진 THP-10TS(2.80g, 3.1×10-4몰)를 첨가하고, 실온에서 질소 분위기하에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 40℃에서 농축하고, 얻어진 농축물에 0.1mol/L 시트르산나트륨 수용액(120g, pH2.5)을 첨가하여 용해한 후, 실온에서 질소 분위기하에서 4시간 반응시켰다. 반응 후, 클로로포름(50g)과 2,6-디tert부틸-p-크레졸(5.0㎎)을 첨가하여 10분간 교반하였다. 수층과 유기층으로 분리한 후, 유기층에 황산마그네슘(3.2g)을 첨가하여, 40℃에서 30분 교반한 후, 5A 여과지 상에 옵라이트를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여과액을 농축한 후, 얻어진 농축물에 아세트산에틸(50g)을 첨가하여 용해하였다. 용해 후, 헥산(25g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하였다. 얻어진 석출물에 헥산(25g)을 첨가하여 15분간 교반하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p38)(ME-100GLFG(L)-100HO)을 얻었다. 수량 5.30g.
NMR(CDCl3) : 0.90ppm(t, 6H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.48ppm(broad, 1H), 1.62ppm(t, 1H), 1.71ppm(m, 1H), 1.82ppm(m, 2H), 3.19ppm(d, 2H), 3.34ppm(m, 2H), 3.38ppm(s, 3H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.64ppm(m, 약 820H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.10ppm(m, 2H), 4.34ppm(m, 1H), 4.50ppm(q, 1H), 6.46ppm(broad, 1H), 6.94ppm(broad, 1H), 7.08ppm(broad, 1H), 7.27ppm(m, 5H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
[실시예 13-5]
Figure pct00114
실시예 13-4에서 얻어진 ME-100GLFG(L)-100HO(5.0g, 2.8×10-4몰)를 디클로로메탄(12g)에 용해 후, 탄산디(N-숙신이미딜)(0.285g, 1.1×10-3몰, 토쿄 화성 공업(주)제)과 피리딘(135μL, 1.7×10-3몰, 칸토 화학(주)제)을 첨가하고, 27℃에서 질소 분위기하에서 7시간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 디클로로메탄(20g)으로 희석하여 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 얻어진 여과액에 2,6-디tert부틸:4-p-크레졸(4.3㎎)을 첨가하여 5분간 교반하였다. 그 후, 5wt% 염화나트륨 수용액(6g, pH5)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 세정을 행하였다. 수층과 유기층으로 분리한 후, 유기층에 황산마그네슘(1.0g)을 첨가하여, 실온에서 30분 교반한 후, 5A 여과지 상에 옵라이트를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여과액을 35℃에서 농축한 후, 얻어진 농축물에 아세트산에틸(50g)을 첨가하여 용해하였다. 용해 후, 헥산(25g)을 첨가하여, 실온에서 30분 교반해 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과하였다. 얻어진 석출물에 헥산(25g)을 첨가하여 30분간 교반하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p39)(ME-100GLFG(L)-100TS)를 얻었다. 수량 4.2g.
NMR(CDCl3) : 0.90ppm(t, 6H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.44ppm(s, 9H, -CH2-CH2-CH2-NH-CO-O-C(CH 3 ) 3 ), 1.64ppm(m, 1H), 1.76ppm(m, 5H), 2.85ppm(t, 4H, -succinimide), 3.20ppm(m, 4H), 3.33ppm(m, 2H, -CO-NH-CH 2 -CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3), 3.38ppm(s, 3H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.64ppm(m, 약 820H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.10ppm(m, 2H, -NH-CO-O-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-), 4.32ppm(m, 1H), 4.50ppm(q, 1H), 5.02ppm(broad, 1H), 6.45ppm(broad, 1H), 6.93ppm(broad, 1H), 7.06ppm(broad, 1H), 7.13ppm(broad, 1H), 7.27ppm(m, 5H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
[실시예 13-6]
Figure pct00115
실시예 13-5에서 얻어진 ME-100GLFG(L)-100TS(3.6g, 2.0×10-4몰)를 N,N'-디메틸포름아미드(7.0g)에 용해하고, L-리신에틸에스테르·2염산염(26㎎, 1.1×10-4몰, 시그마 알드리치사제), 트리에틸아민(73㎎, 7.2×10-4몰)을 첨가하여, 질소 분위기하에서 40℃, 5시간 반응시켰다. 반응액을 아세트산에틸(36g)로 희석한 후, 5A 여과지를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여과액에 헥산(18g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과한 후, 헥산(18g)으로 석출물을 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p40)(LY-(ME-100GLFG(L)-100) 2 -CE)을 얻었다. 수량 3.1g.
NMR(CDCl3) : 0.90ppm(t, 6H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.28ppm(t, 3H, -CO-O-CH2-CH 3 ), 1.36ppm(m, 2H), 1.48ppm(broad, 1H), 1.52ppm(m, 2H), 1.62ppm(t, 1H), 1.70ppm(m, 2H), 1.82ppm(m, 3H), 3.15ppm(q, 2H), 3.19ppm(d, 2H), 3.34ppm(m, 2H), 3.38ppm(s, 6H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.64ppm(m, 약 1,600H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.10ppm(m, 2H), 4.21ppm(m, 6H), 4.34ppm(m, 2H), 4.50ppm(q, 1H), 4.90ppm(broad, 1H), 5.37ppm(d, 1H), 6.46ppm(broad, 1H), 6.94ppm(broad, 1H), 7.08ppm(broad, 1H), 7.27ppm(m, 5H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
[실시예 13-7]
Figure pct00116
실시예 13-6에서 얻어진 LY-(ME-100GLFG(L)-100)2-CE(1.8g, 5.0×10-5몰)를 0.13mol/L 수산화나트륨 수용액(18g)에 용해하고, 질소 분위기하에서 실온, 3시간 반응시켰다. 반응액에 염화나트륨(4.5g)을 용해한 후, 85% 인산을 이용하여 수층의 pH를 8.5로 조정하고, 거기에, 디클로로메탄(11g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 수층과 유기층을 분리한 후, 수층에 재차 디클로로메탄(11g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 추출 1회째와 2회째에서 얻어진 유기층을 40℃에서 농축한 후, 얻어진 농축물에 아세트산에틸(36g)을 첨가하였다. 얻어진 아세트산에틸 용액에, 황산마그네슘(0.90g)을 첨가하여, 30℃에서 30분 교반한 후, 5A 여과지 상에 옵라이트를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여과액에 헥산(18g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과한 후, 헥산(18g)으로 석출물을 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p41)(LY-(ME-100GLFG(L)-100) 2 -C2)을 얻었다. 수량 1.4g.
NMR(CDCl3) : 0.90ppm(t, 6H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.36ppm(m, 2H), 1.48ppm(broad, 1H), 1.52ppm(m, 2H), 1.62ppm(t, 1H), 1.70ppm(m, 2H), 1.82ppm(m, 3H), 3.15ppm(m, 2H), 3.19ppm(d, 2H), 3.34ppm(m, 2H), 3.38ppm(s, 6H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.64ppm(m, 약 1,600H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.10ppm(m, 2H), 4.21ppm(m, 4H), 4.34ppm(m, 2H), 4.50ppm(q, 1H), 4.90ppm(broad, 1H), 5.37ppm(d, 1H), 6.46ppm(broad, 1H), 6.94ppm(broad, 1H), 7.08ppm(broad, 1H), 7.27ppm(m, 5H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
[실시예 13-8]
Figure pct00117
실시예 13-7에서 얻어진 LY-(ME-100GLFG(L)-100)2-C2(1.5g, 4.0×10-5몰) 및 2,6-디-tert-부틸-p-크레졸(1.2㎎)을 톨루엔(6.0g)에 용해하고, N-하이드록시숙신이미드(16㎎, 1.4×10-4몰), 1,3-디시클로헥실카르보디이미드(20㎎, 1.0×10-4몰)를 첨가하여, 질소 분위기하에서 40℃, 4시간 반응시켰다. 다음으로, N-(tert-부톡시카르보닐)-1,3-디아미노프로판을 첨가하여, 질소 분위기하에서 40℃, 4시간 반응시켰다. 반응액을 톨루엔(12g)으로 희석한 후, 5A 여과지 상에 옵라이트를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여과액을 아세트산에틸(18g)로 희석한 후, 헥산(18g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과한 후, 헥산(18g)으로 석출물을 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p42)(LY-(ME-100GLFG(L)-100) 2 -Boc)를 얻었다. 수량 1.1g.
NMR(CDCl3) : 0.90ppm(t, 6H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.36ppm(m, 2H), 1.44ppm(s, 9H), 1.48ppm(broad, 1H), 1.52ppm(m, 2H), 1.62ppm(m, 3H), 1.70ppm(m, 2H), 1.82ppm(m, 3H), 3.15ppm(m, 4H), 3.19ppm(d, 2H), 3.29ppm(m, 2H), 3.34ppm(m, 2H), 3.38ppm(s, 6H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.64ppm(m, 약 1,600H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.10ppm(m, 3H), 4.21ppm(m, 4H), 4.34ppm(m, 1H), 4.50ppm(q, 1H), 5.08ppm(broad, 1H), 5.56ppm(d, 1H), 6.46ppm(broad, 1H), 6.94ppm(broad, 1H), 7.08ppm(broad, 1H), 7.27ppm(m, 5H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
[실시예 13-9]
Figure pct00118
실시예 13-8에서 얻어진 LY-(ME-100GLFG(L)-100)2-Boc(0.90g, 2.5×10-5몰)를 디클로로메탄(4.5g)에 용해하고, 메탄술폰산(162μL, 2.5×10-3몰)을 첨가하여, 질소 분위기하에서 실온, 2시간 반응시켰다. 반응액을 톨루엔(9.0g)으로 희석한 후, 이온 교환수(23g)를 첨가하여, 실온에서 15분 교반하고, 수층에 생성물을 추출하였다. 그 후, 톨루엔과 클로로포름 혼합 용액으로 수층을 세정하여, 아미노기를 가지지 않는 폴리에틸렌글리콜 불순물을 제거하였다. 이어서 수층에 1mol/L 수산화나트륨 수용액을 적당량 첨가하여, pH12로 조정한 후, 염화나트륨(2.3g)을 용해하였다. 거기에, 클로로포름(9.0g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 수층과 유기층을 분리한 후, 수층에 재차 클로로포름(9.0g)을 첨가하고, 실온에서 15분 교반하고, 유기층에 생성물을 추출하였다. 추출 1회째와 2회째에서 얻어진 유기층을 40℃에서 농축한 후, 얻어진 농축물에 아세트산에틸(36g)을 첨가하였다. 얻어진 아세트산에틸 용액에, 황산나트륨(0.90g)을 첨가하여, 30℃에서 30분 교반한 후, 5A 여과지 상에 옵라이트를 깐 키리야마 깔때기를 이용하여 흡인 여과를 행하였다. 얻어진 여과액에 헥산(18g)을 첨가하여, 실온에서 15분 교반해 생성물을 석출시키고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과한 후, 헥산(18g)으로 석출물을 세정하고, 5A 여과지를 이용하여 흡인 여과를 행하고, 진공 건조하여, 상기 화합물 (p34)(LY-(ME-100GLFG(L)-100) 2 -PA)를 얻었다. 수량 0.8g. 분자량은 표 1에 나타낸다. HPLC : 아민 순도 92%.
NMR(CDCl3) : 0.90ppm(t, 6H, -NH-CO-CH-CH2-CH(CH 3 )2), 1.37ppm(m, 2H), 1.48ppm(broad, 1H), 1.52ppm(m, 2H), 1.62ppm(m, 3H), 1.70ppm(m, 2H), 1.82ppm(m, 3H), 2.84ppm(m, 2H), 3.15ppm(m, 2H), 3.19ppm(d, 2H), 3.34ppm(m, 2H), 3.38ppm(s, 6H, -CO-NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.64ppm(m, 약 1,600H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 4.10ppm(m, 3H), 4.21ppm(m, 4H), 4.34ppm(m, 1H), 4.50ppm(q, 1H), 5.58ppm(broad, 1H), 6.46ppm(broad, 1H), 6.94ppm(broad, 1H), 7.08ppm(broad, 1H), 7.27ppm(m, 5H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 )
[비교예 1]
화합물 (p33)(ME-200F-200PA)의 합성
Figure pct00119
실시예 4와 동일 제법으로, N 말단을 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc기)로 보호한 L-페닐알라닌(Fmoc-Phe)을 원료로 사용하여, 상기 화합물 (p33)(ME-200F-200PA)을 얻었다. 수량 1.8g. 분자량은 표 1에 나타낸다. HPLC : 아민 순도 92%.
NMR(d6-DMSO) : 1.62ppm(m, 4H, -CO-NH-CH2-CH 2 -CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH3, -CH2-CH 2 -CH2-NH2), 2.80ppm(m, 1H), 3.10ppm(m, 2H), 3.23ppm(s, 3H, -O-(CH2-CH2-O)n-CH 3 ), 3.60ppm(m, 약 3,800H, -NH-CH2-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH3, -NH-CO-O-CH2-CH2-O-(CH 2 -CH 2 -O)n-CH2-CH2-), 3.95ppm(m, 2H), 4.13ppm(m, 1H), 7.20ppm(m, 5H, -NH-CO-CH-CH2-C 6 H 5 ), 7.38ppm(broad, 1H), 7.91ppm(broad, 1H)
이상, 실시예 1∼13과 비교예 1에서 얻어진 폴리에틸렌글리콜 유도체의 평균 분자량을 나타낸다.
Figure pct00120
[실시예 14]
혈청 중에서의 안정성 시험
1.5mL의 에펜도르프 튜브에, 마우스 또는 인간 혈청 1mL를 넣고, 각종 폴리에틸렌글리콜 유도체를 5.0㎎/mL의 농도가 되도록 첨가하였다. 37℃에서 96시간 인큐베이션 후, 200μL를 샘플링하고, 거기에 아세토니트릴을 첨가하고, 보르텍스로 1분간 교반하여, 혈청 중의 단백질을 석출시키고, 원심 분리 후, 상청을 회수하였다. 다음으로 지방산 등의 소수성 물질을 제거하기 위해, 회수액에 헥산을 첨가하고, 보르텍스로 1분간 교반하고, 원심 분리 후, 하층을 회수하였다. 이 용액을 진공 조건으로 농축하고, 혈청 중으로부터 폴리에틸렌글리콜 유도체의 회수를 행하였다. 그 후, GPC 분석을 행하여, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 분해율을 산출하였다.
분해율은 이하의 식으로 산출하였다.
분해율=(시험 전의 40kDa의 피크 면적%-시험 후의 40kDa의 피크 면적%)÷(시험 전의 40kDa의 피크 면적%)×100
결과를 이하의 표 2에 나타낸다.
Figure pct00121
본 시험으로부터, 어느 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체도 96시간 후의 분해율이 20% 이하이며, 특히 GLFG(L)이나 G(cit)V 등은 분해율이 낮고, 혈중에서는 안정적인 것을 나타냈다.
[실시예 15]
세포를 이용한 분해성 시험
배지 RPMI-1640(10% FBS Pn/St) 10mL를 이용하여, 100mm 디시에 RAW264.7을 10×106cell 파종하고, 37℃에서 24시간 배양 후, 각종 폴리에틸렌글리콜 유도체를 10㎎/mL의 농도가 되도록 용해한 배지로 교환하고, 37℃에서 96시간 배양하였다. 배양 후, 세포를 1% SDS 용액으로 용해하고, PBS로 희석하고, 거기에 아세토니트릴을 첨가하고, 보르텍스로 1분간 교반하여, 세포 용해액 중의 단백질을 석출시키고, 원심 분리 후, 상청을 회수하였다. 다음으로 지방산 등의 소수성 물질을 제거하기 위해, 회수액에 헥산을 첨가하고, 보르텍스로 1분간 교반하고, 원심 분리 후, 하층을 회수하였다. 이 용액을 진공 조건으로 농축하고, 세포 내로부터 폴리에틸렌글리콜 유도체의 회수를 행하였다.
또, 세포 배양에 사용한 배지 중에서의 분해를 확인하기 위해, 각종 폴리에틸렌글리콜 유도체를 10㎎/mL의 농도가 되도록 용해한 배지만으로 37℃에서 96시간 배양하고, 상기와 동일 조작으로 폴리에틸렌글리콜 유도체의 회수를 행하였다.
그 후, 회수한 각종 폴리에틸렌글리콜 유도체의 GPC 분석을 행하고, 실시예 14와 동일한 계산식으로 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체의 분해율을 산출하였다.
결과를 이하의 표 3에 나타낸다. 또, 세포 실험 전후의 GPC 차트를 도 1과 도 2에 나타낸다.
Figure pct00122
분해성 링커로서 올리고펩타이드를 가진 폴리에틸렌글리콜 유도체에 있어서는, 세포 내에서 효과적으로 분해되어, 분자량 4만으로부터 2만으로 분해되는 것을 확인할 수 있었다. 또, 천연에 많이 존재하지 않는 D형의 아미노산을 이용한 ME-200GLFG(D)-200PA에 있어서도, 분해율은 낮지만, 분해되는 것을 확인하였다. 한편으로, 비교예 1의 페닐알라닌을 링커로서 이용한 폴리에틸렌글리콜 유도체, 및 비분해성의 메톡시 PEG 아민 40kDa는, 세포 내에서의 분해를 확인할 수 없었다.
[실시예 16]
동물 실험에 의한 체내 동태 시험(방사성 동위체)
말단에 아미노기를 가진 분자량 4만인 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체인 ME-200GLFG(L)-200PA와, 비분해성인 메톡시 PEG 아민 40kDa를, 각각 0.1㎎/mL의 농도가 되도록 50mM 탄산수소나트륨 수용액에 용해하고, 거기에 Bolton-Hunter 시약(0.4625MBq)을 첨가하고, 보르텍스로 교반 후, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 반응 용액을 PD-10 컬럼으로 분획하고, 각 프랙션을 폴리에틸렌글리콜 정색 시약(티오시안산암모늄과 질산코발트)과 감마 카운터를 이용하여, 125I가 포함된 프랙션을 확인하고, 회수하였다.
얻어진 방사성 동위체를 라벨화한 폴리에틸렌글리콜 유도체를 이용하여, 체내 동태를 동물 실험으로 평가하였다. 마우스종은 Balb/c(8주령, 수컷), 폴리에틸렌글리콜 용액은, 생리 식염수를 이용하여 라벨화되어 있지 않은 폴리에틸렌글리콜 유도체를 50㎎/mL의 농도가 되도록 조제하고, 방사성 동위체를 라벨화한 폴리에틸렌글리콜 유도체를 미량 첨가하고, 마우스 꼬리 정맥으로부터 20μL 투여하였다. 그 후, 1, 3, 6, 48시간에 마우스로부터 혈액, 각 장기를 꺼내고, 감마 카운터를 이용하여 라벨화한 폴리에틸렌글리콜 유도체의 체류량을 측정하였다.
방사성 동위체를 라벨화한 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체인 ME-200GLFG(L)-200PA와 분해성을 가지지 않는 폴리에틸렌글리콜 유도체인 메톡시 PEG 아민 40kDa의 체내 동태 시험의 결과로서, 도 3에 혈중 농도, 도 4∼7에 투여 후 48시간 후의 각 장기에의 체류량을 나타낸다.
이 결과로부터, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 통상적인 분해성을 갖지 않는 폴리에틸렌글리콜 유도체와 비교해, 동일 정도의 혈중 반감기를 나타내고, 또 체내에 있어서의 분포도 동일한 경향이 있는 것을 증명할 수 있었다.
[실시예 17]
동물 실험에 의한 공포 형성 평가 시험
말단에 아미노기를 가진 분자량 4만인 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체인 ME-200GLFG(L)-200PA와, 비분해성인 메톡시 PEG 아민 40kDa를 이용하여, 동물 실험에 의한 공포 형성 평가를 행하였다. 마우스종은 Balb/c(8주령, 수컷), 폴리에틸렌글리콜 용액은, 생리 식염수를 이용하여 폴리에틸렌글리콜 유도체를 100㎎/mL의 농도가 되도록 조제하고, 마우스 꼬리 정맥으로부터 20μL 투여하였다. 주 3회, 4주간 연속 투여를 계속하고, 투여 종료 후, 마우스를 4% 파라포름알데하이드 수용액으로 관류 고정하여, 파라핀 절편을 제작하였다. HE 염색, 및 항PEG 항체에 의한 면역 염색을 행하고, 뇌의 맥락총 상피 세포에 있어서의 공포 형성을 평가하였다. 면역 염색으로서는, 면역 염색 키트(BOND Refine Polymer Detection Kit, 라이카사제)와 항PEG 항체(B-47 항체, 아브캄사제)를 이용하여 실시하였다. 항PEG 항체에 의한 면역 염색을 행한 뇌의 맥락총 절편의 화상을 도 8과 도 9에 나타낸다.
그 결과, 메톡시 PEG 아민 40kDa에 비해, 분해성 폴리에틸렌글리콜인 ME-200GLFG(L)-200PA는 유의하게 공포의 형성을 억제하였다.
또한, 본 실시예에 있어서 투여한 폴리에틸렌글리콜의 양은, 어디까지나 공포화를 평가하기 위해서 최적화한 양이며, 당해 기술 분야에 있어서의 일반적인 폴리에틸렌글리콜의 투여량과 비교해, 매우 다량이다.
[실시예 18]
동물 실험에 의한 폴리에틸렌글리콜의 축적성 평가 시험
말단에 아미노기를 가진 분자량 4만인 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체인 ME-200GLFG(L)-200PA와, 비분해성인 메톡시 PEG 아민 20kDa, 메톡시 PEG 아민 40kDa, 컨트롤인 PBS를 이용하여, 동물 실험에 의한 폴리에틸렌글리콜의 축적성 평가를 행하였다. 마우스종은 Balb/c(8주령, 수컷), 폴리에틸렌글리콜 용액은, 생리 식염수를 이용하여 폴리에틸렌글리콜 유도체를 62.5㎎/mL의 농도가 되도록 조제하고, 마우스 꼬리 정맥으로부터 100μL 투여하였다. 주 3회, 4주간 연속 투여를 계속하고, 투여 종료 후, 마우스를 4% 파라포름알데하이드 수용액으로 관류 고정하여, 파라핀 절편을 제작하였다. 항PEG 항체에 의한 면역 염색을 행하고, 뇌의 맥락총 상피 세포에 있어서의 축적성을 평가하였다. 면역 염색을 행한 각각의 뇌의 맥락총 절편의 화상을 도 10에 나타낸다.
폴리에틸렌글리콜이 포함되지 않은 PBS를 투여한 마우스의 맥락총 절편에서는 염색되지 않는데 반해, 비분해성인 메톡시 PEG 아민 40kDa에서는, 절편의 광범위에서 갈색으로 염색되는 결과가 되었다. 이 염색 부분은 PEG가 축적되어 있는 것을 나타낸다. 그 한편으로, 분해성 폴리에틸렌글리콜인 ME-200GLFG(L)-200PA의 절편에 있어서는, 갈색으로 염색된 부분이 적고, 분자량이 절반인 메톡시 PEG 아민 20kDa와 동등의 축적을 나타냈다. 결과적으로, 분해성 폴리에틸렌글리콜은 그 분해성에 의해, 동일 분자량의 비분해성인 메톡시 PEG 아민 40kDa에 비해, 유의하게 조직에의 폴리에틸렌글리콜 축적을 억제하였다.
이들 축적을 정량화하기 위해, 이하의 해석 소프트를 이용하여 화상 해석을 행하고, 스코어를 산출하였다.
장치 : All in one microscopy BZ-X710
해석 소프트 : BZ-X Analyzer
구체적으로는, 화상 중의 맥락총 조직의 면적, 그리고 축적을 나타내는 갈색의 염색 부분의 면적을 해석 소프트로 추출하고, 이하의 계산식으로 스코어링을 실시하였다. 산출한 스코어를 표 4에 나타낸다.
축적률=갈색의 염색 부분의 면적/맥락총 조직의 면적
스코어=축적률/PBS의 축적률
그 결과, 분해성 폴리에틸렌글리콜은 유의하게 조직에의 폴리에틸렌글리콜의 축적을 억제할 수 있는 것이 나타났다.
또한, 본 실시예에 있어서 투여한 폴리에틸렌글리콜의 양은, 어디까지나 축적성을 평가하기 위해서 최적화한 양이며, 당해 기술 분야에 있어서의 일반적인 폴리에틸렌글리콜의 투여량과 비교해, 매우 다량이다.
Figure pct00123
[산업상 이용가능성]
본 발명의 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 세포의 공포를 일으키지 않는 고분자량의 폴리에틸렌글리콜 유도체이며, 생체 관련 물질을 수식하는 용도로 효과적으로 이용할 수 있고, 생체 내의 혈중에서 안정적이며, 또한 세포 내에서 분해된다.
본 출원은, 일본에서 출원된 일본국 특허 출원 2018-064305를 기초로 하고 있고, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.

Claims (15)

  1. 하기 식 (1) :
    Figure pct00124

    (식 중, m은 1∼7이며, n1 및 n2는 각각 독립적으로 45∼682이며, p는 1∼4이며, R은 탄소수 1∼4의 알킬기이며, Z는 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼8 잔기의 올리고펩타이드이며, Q는 2∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 관능기이며, L1, L2, L3, L4 및 L5는 각각 독립적으로, 단결합 또는 2가의 스페이서이다.)
    로 표시되는, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  2. 청구항 1에 있어서,
    Q가, 에틸렌글리콜, 리신, 아스파라긴산, 글루탐산, 글리세린, 펜타에리트리톨, 디글리세린 또는 크실리톨의 잔기인, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  3. 청구항 1에 있어서,
    Q가, 올리고펩타이드의 잔기이며, 그 올리고펩타이드가, 리신, 아스파라긴산 및 글루탐산 중 어느 하나를 포함하고, 또한 그 이외의 아미노산이 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 4∼8 잔기의 올리고펩타이드인, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  4. 청구항 3에 있어서,
    Q의 올리고펩타이드가, C 말단의 아미노산으로서 글리신을 갖는 올리고펩타이드인, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  5. 청구항 3 또는 청구항 4에 있어서,
    Q의 올리고펩타이드가, 하이드로퍼시(hydropathy) 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산을 적어도 하나 갖는 올리고펩타이드인, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    Z의 올리고펩타이드가, C 말단의 아미노산으로서 글리신을 갖는 올리고펩타이드인, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    Z의 올리고펩타이드가, 하이드로퍼시 지표가 2.5 이상인 소수성의 중성 아미노산을 적어도 하나 갖는 올리고펩타이드인, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    총분자량이 30,000 이상인, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    L1, L2, L3, L4 및 L5가 각각 독립적으로, 우레탄 결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 2급 아미노기, 우레아 결합, 또는 이들 결합 및 기를 포함하고 있어도 되는 알킬렌기인, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    X가 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알데하이드기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 에폭사이드기, 말레이미드기, 비닐술폰기, 아크릴기, 술포닐옥시기, 카르복실기, 티올기, 디티오피리딜기, α-할로아세틸기, 알키닐기, 알릴기, 비닐기, 아미노기, 옥시아미노기, 하이드라지드기 및 아지드기로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  11. 청구항 1에 있어서,
    식 (1) 중의 Z가, Z1, A 및 글리신 잔기로 구성되는, 하기 식 (2) :
    Figure pct00125

    (식 중, m은 1∼7이며, n1 및 n2는 각각 독립적으로 45∼682이며, p는 1∼4이며, R은 탄소수 1∼4의 알킬기이며, Z1은 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼6 잔기의 올리고펩타이드이며, A는 시스테인을 제외한 중성 아미노산이며, a 및 b는 각각 독립적으로 0 또는 1이며, 또한 (a＋b)≥1이며, Q는 2∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 관능기이며, L1, L2, L3, L4 및 L5는 각각 독립적으로, 단결합 또는 2가의 스페이서이다.)
    로 표시되는 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체인, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  12. 청구항 11에 있어서,
    식 (2) 중의 m이 1인, 하기 식 (3) :
    Figure pct00126

    (식 중, n3 및 n4는 각각 독립적으로 45∼682이며, p는 1∼4이며, R은 탄소수 1∼4의 알킬기이며, Z1은 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼6 잔기의 올리고펩타이드이며, A는 시스테인을 제외한 중성 아미노산이며, a 및 b는 각각 독립적으로 0 또는 1이며, 또한 (a＋b)≥1이며, Q는 2∼5개의 활성 수소를 가지는 화합물의 잔기이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 관능기이며, L1, L2, L3, L4 및 L5는 각각 독립적으로, 단결합 또는 2가의 스페이서이다.)
    으로 표시되는 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체인, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  13. 청구항 1에 있어서,
    식 (1) 중의 Q가 에틸렌글리콜의 잔기이며, L1이 CH2CH2O이며, 또한 p가 1인, 하기 식 (4) :
    Figure pct00127

    (식 중, m은 1∼7이며, n5 및 n6은 각각 독립적으로 113∼682이며, R은 탄소수 1∼4의 알킬기이며, Z는 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼8 잔기의 올리고펩타이드이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 관능기이며, L2, L3, L4 및 L5는 각각 독립적으로, 단결합 또는 2가의 스페이서이다.)
    로 표시되는 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체인, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  14. 청구항 11에 있어서,
    식 (2) 중의 Q가 에틸렌글리콜의 잔기이며, L1이 CH2CH2O이며, 또한 p가 1인, 하기 식 (5) :
    Figure pct00128

    (식 중, m은 1∼7이며, n5 및 n6은 각각 독립적으로 113∼682이며, R은 탄소수 1∼4의 알킬기이며, Z1은 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼6 잔기의 올리고펩타이드이며, A는 시스테인을 제외한 중성 아미노산이며, a 및 b는 각각 독립적으로 0 또는 1이며, 또한 (a＋b)≥1이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 관능기이며, L2, L3, L4 및 L5는 각각 독립적으로, 단결합 또는 2가의 스페이서이다.)
    로 표시되는 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체인, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
  15. 청구항 12에 있어서,
    식 (3) 중의 Q가 에틸렌글리콜의 잔기이며, L1이 CH2CH2O이며, 또한 p가 1인, 하기 식 (6) :
    Figure pct00129

    (식 중, n7 및 n8은 각각 독립적으로 226∼682이며, R은 탄소수 1∼4의 알킬기이며, Z1은 시스테인을 제외한 중성 아미노산으로 이루어지는 2∼6 잔기의 올리고펩타이드이며, A는 시스테인을 제외한 중성 아미노산이며, a 및 b는 각각 독립적으로 0 또는 1이며, 또한 (a＋b)≥1이며, X는 생체 관련 물질과 반응 가능한 관능기이며, L2, L3, L4 및 L5는 각각 독립적으로, 단결합 또는 2가의 스페이서이다.)
    으로 표시되는 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체인, 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체.
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