JP2007503514A - グリセロールおよびポリエチレングリコールのヘテロ官能性コポリマー、そのコンジュゲートおよび組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、グリセロールおよびポリエチレングリコールのヘテロ官能性コポリマー、これらのヘテロ官能性コポリマーと生物活性剤、ナノ粒子、疎水性ポリマーおよび／または脂質のコンジュゲート；およびこれらのコンジュゲートを含む組成物に関する。

Description

発明の詳細な説明

（技術分野）
本発明は、グリセロールおよびポリエチレングリコールのヘテロ官能性コポリマー、これらのヘテロ官能性コポリマーと生物活性剤、ナノ粒子および脂質のコンジュゲート；およびこれらのコンジュゲートを含む組成物に関する。これらのコンジュゲートは、コンジュゲートされていない生物活性剤、ナノ粒子およびリポソームと比べて、ヒト体内において長い循環時間を提供し得る。

（背景技術）
水溶性ポリマーと、ナノ粒子、ミセル、ニオソームおよびリポソームなどの生物活性剤およびコロイド状キャリアーシステムのコンジュゲーションは、それらのヒト体内での循環半減期および低毒性を長くするために用いられ、このことは、順次、優れた効力、より少ない投与頻度およびよりよい患者コンプライアンスを提供する。ポリマーにコンジュゲートされた生物活性剤の優れた効力は、ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）、Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）、Ｓｏｍａｖｅｒｔ（登録商標）、Ｏｎｃｏｓｐａｒ（登録商標）、Ａｄａｇｅｎ（登録商標）およびＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）などの幾つかの市販製品により実証されており、ここで、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」と言う）は、様々な蛋白質治療剤にコンジュゲートされている。これらの製品は、循環半減期を延長するために、水溶性治療蛋白質とコンジュゲートされた水溶性ポリマーの使用を実証している。

水溶性ポリマーと水不溶性生物活性剤のコンジュゲーションが、水不溶性活性剤の溶解性を高めるために研究されている。開発中のかかるシステムの例は、ポリエチレングリコールにコンジュゲートされたカンプトテシン、ポリグルタミン酸にコンジュゲートされたパクリタキセルおよびポリヒドロキシメタクリルアミドにコンジュゲートされたパクリタキセルである。

水溶性ポリマーは、ブロック構造にある疎水性ポリマーに連結されてもよい。これらのブロックコポリマーは、水性媒体中で自然に自己集積して、高分子ミセルおよびナノ粒子を形成する。これらの高分子ミセルおよびナノ粒子は、疎水性コアおよびその周りに外側の親水性シェルを有する。疎水性の内部コアは、疎水性会合により、水不溶性疎水性薬剤を取り込み得る。故に、これらの高分子ミセルおよびナノ粒子は、ドラックデリバリーのために用いられ得る。

ポリマーにコンジュゲートされたシステムの重要な特徴は、腫瘍の脈管構造の漏出性に起因する、ｅｐｒ（透過性および滞留性の亢進）効果として知られている大きさの効果による、腫瘍部位における受動的な蓄積である。この受動的ターゲティングは、抗腫瘍剤、日本で肝硬変について認可されているＳＭＡＮＣＳの作用機序である。ＳＭＡＮＣＳは、ポリマー中に存在する無水基を介してネオカルチノスタチンにコンジュゲートされた、低分子量のスチレン無水マレイン酸コポリマーである。ＳＭＡＮＣＳの分子量は約１６−１７ｋＤａであるが、それは、血清アルブミンとより大きな集合体を形成する。コンジュゲートの集合の大きさは８０ｋＤａであり、腫瘍部位におけるＳＭＡＮＣＳの自然発生的であるが受動的な蓄積に関与していると言われる。

上記記載の受動的ターゲティングの機序は、２００ｎｍ未満の径を有するナノ粒子および高分子ミセルによっても実証されるが、ただし、それらが延長された血漿循環半減期を有する場合に限る。ナノ粒子および高分子ミセルは、本質的に親水性水溶性ポリマーでコーティングされているので、それらは、血漿循環半減期およびそれ故に腫瘍部位における受動的な蓄積を高めることが期待される。ナノ粒子および高分子ミセルと違って、リポソームは、単核食細胞系（ＭＰＳ）による取り込みを防ぐために、本質的に親水性ポリマーコーティングを有さず、その循環から、肝臓、脾臓および骨髄などの食細胞に富む器官までを速やかに通過する。

リポソームは、水性部分を覆う１またはそれ以上の同心円の脂質二重層をもつ、小さなベシクルである。大きさ、表面電荷、脂質組成、二層の流動性の点における構造的な汎用性およびほぼすべての薬をカプセル化できる能力のために、ドラックデリバリーシステムとしてのそれらの重要性は、容易に認識された。しかしながら、リポソームを静脈注射すると、これらは単核食細胞系（ＭＰＳ）により外来の粒子として認識され、その循環から、肝臓、脾臓および骨髄などの食細胞に富む器官を迅速に通過する。

この作用を軽減するための幾つかの可能性は、例えば、リポソームの粒子の大きさを減じること、およびリポソームの表面電荷を変えることによって確認された。別の開発は、特定の親水性ポリマー成分をリポソーム表面に導入することによる、リポソームの表面修飾に関連しており、導入された基は、粒子表面上の蛋白質吸着を減じる。結果として、かかるリポソームは、ＭＰＳの細胞による認識に対して保護されており、そして、一般的な循環において長い滞留時間を有する。リポソーム表面の修飾についてよく知られた例は、リポソーム組成物の調製中に、親水性ポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の脂質誘導体を取り込むことである。通常、この親水性ポリマーは、末端が疎水性部分で修飾されており、該部分は、ホスファチジルエタノールアミン誘導体または長鎖脂肪酸の残基である。ポリエチレングリコールそれ自体はかなり安定なポリマーであって、これは、蛋白質接着の忌避剤であり、かつ生理学的条件下で酵素的または加水分解性の分解にさらされていない。

血漿半減期の延長および食細胞に富む器官への蓄積の減少に関する良好な結果は、ＰＥＧをグラフトした表面を有するリポソームを、様々な動物種およびヒトに静脈投与した後に得られた（Ｓｔｏｒｍ Ｇ．，Ｂｅｌｌｉｏｔ Ｓ．Ｏ．，Ｄａｅｍｅｎ Ｔ．およびＬａｓｉｃ Ｄ．Ｄ．：Ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｔｏ ｏｐｐｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ｂｙ ｔｈｅ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１７，３１−４８，（１９９５）；Ｍｏｇｈｉｍｉ Ｓ．Ｍ．，Ｈｕｎｔｅｒ Ａ．Ｃ．およびＭｕｒｒａｙ Ｊ．Ｃ．：Ｌｏｎｇ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ｔｈｅｏｒｙ ｔｏ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５３，２８３−３１８，（２００１））。ドキソルビシン含有のかかるリポソーム調製物のための市販認可は得られている。

現在まで、ＰＥＧ−リポソームに基づく市販調製物は、水性懸濁調製物である。一般的なリポソーム水性懸濁調製物およびＰＥＧ−リポソームの有効期間はかなり限られていることがよく知られている。スプレー乾燥、ダイアフィルトレーション、回転蒸発および凍結乾燥などの、ビヒクルまたはかかる調製物の連続相を除去するための幾つかの技法が知られている。最近では、テクネチウム−キレーターヒドラジノニコチンアミド含有のＰＥＧ−リポソームを長い有効期間へと改善した凍結乾燥法が提案された（Ｌａｖｅｒｍａｎ Ｐ．，ｖａｎ Ｂｌｏｏｉｓ Ｌ．，Ｂｏｅｒｍａｎ Ｏ．Ｃ．，Ｏｙｅｎ Ｗ．Ｊ．Ｇ．，Ｃｏｒｓｔｅｎｓ Ｆ．Ｈ．Ｍ．およびＳｔｏｒｍ Ｇ．：Ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｃ−９９ｍ−ＨＹＮＩＣ ｌａｂｅｌｌｅｄ ＰＥＧ−Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｒｅｓ．１０（２＆３），ｐａｇｅ １１７−１２９（２０００））が、その結果およびリポソーム調製物に対するこの技法の適用性についてのさらなる研究が必要とされる。

ポリエチレングリコールの使用に固有の不都合は、研究者を別のポリマー探索に駆り立てた。多数のポリマーが、リポソームへの組み込みためにそれらを（ベシクル−形成）脂質で誘導体化するための適当な候補として示されてきた（例えばＥＰ−０６８８２０７を参照のこと）。親水性水溶性ポリマー、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（アクリロイルモルフォリン）、ポリ（２−（ｍ）エチル−２−オキサゾリン）、ポリアクリルアミドおよびポリグリセロールは、静脈投与後に、リポソームの循環時間をある程度まで延長することが示された。しかしながら、今に至るまで、かかる脂質ポリマーコンジュゲートは市販薬調製物に適用されておらず、それは主に、それらが既知の脂質−ＰＥＧ−コンジュゲートに勝る利点を全く示さないからである。

故に、リポソームなどのコロイド状キャリアー組成物への組み込みを可能とするように、長い循環特性を有するポリマーのごとき、脂質で誘導体化され得るポリマーを見つける必要性が依然ある。

（図の詳細な説明）
図１は、ランダムもしくは分岐コポリマーの３つの例である。例１は、グリシドールおよびエチレンオキシドのランダムコポリマーを示す。例２は、分岐ポリグリシドールを含む、ポリエチレンオキシドブロックが結合した、ブロックコポリマーを示す。例３は、実施例２と異なる構造のブロックコポリマーを示す。
図２は、カリウムビス（トリメチルシリル）アミドを用いた、エチレンオキシドの重合を示すスキームを表す。
図３は、超分岐コポリマーのスキームを表し、脱保護の後に、アルデヒドコポリマーの１つの末端にアルデヒド基、かつ他の末端にヒドロキシル基を生じる。
図４は、１つの末端にカルボキシル基および他の末端に複数のヒドロキシル基を有する、ヘテロ官能性超分岐のスキームを表す。

（発明の概要）
本発明のヘテロ官能性コポリマーは、グリセロールおよびポリエチレングリコールのコポリマーであり、ここで、該コポリマーはランダムまたはブロック構造を有する（図１を参照のこと）。本発明のコポリマーは、グリシドールおよびエチレンオキシドのモノマーから調製されてもよい。
本発明は、これらのコポリマーと生物活性剤および治療ポリペプチドのコンジュゲートにも関する。

本発明は、これらのコポリマーと疎水性ポリマーのコンジュゲートに関連し、そして得られた両親媒性コポリマーは、生物活性剤のためのデリバリーシステムとして用いられ得る、高分子ミセルを形成し得る。
本発明は、コポリマーと脂質のコンジュゲートにも関連し、そしてかかる脂質−コポリマーコンジュゲートは、生物活性剤のためのデリバリーシステムとして作用し得る、リポソームを形成し得る。これらのリポソームは長い循環半減期を示す。

（発明の詳細な記載）
Ｉ．ヘテロ官能性コポリマー
Ａ．ヘテロ官能性コポリマーの説明
本発明のヘテロ官能性コポリマーは、グリセロールおよびポリエチレングリコールのコポリマーであり、ここで、該コポリマーはランダムまたはブロック構造を有する。本発明の一の実施態様において、コポリマーは、グリシドールおよびエチレンオキシドのモノマーから調製される。

本発明の一の態様は、構造式：

［式中、
ｌは、０ないし１０，０００の整数であり；
ｍは、０ないし１０，０００の整数であり；
ｎは、１ないし１００の整数であり；
ｐは、１ないし１００の整数であり；および
ｘは、１ないし１００である］
で示される化合物である。

本発明の別の態様は、構造式：

［式中、
ｌは、０ないし１０，０００の整数であり；
ｍは、０ないし１０，０００の整数であり；
ｎは、１ないし１００の整数であり；
ｐは、１ないし１００の整数であり；および
ｘは、１ないし１００である］
で示される化合物である。

本発明の別の態様は、構造式：

［式中、
ｌは、０ないし１０，０００の整数であり；
ｍは、０ないし１０，０００の整数であり；
ｎは、１ないし１００の整数であり；
ｐは、１ないし１００の整数であり；および
ｘは、１ないし１００である］
で示される化合物である。

本発明の別の態様は、構造式：

［式中、
Ｙは、活性剤、疎水性ポリマーまたは脂質であり；
ｌは、０ないし１０，０００の整数であり；
ｍは、０ないし１０，０００の整数であり；
ｎは、１ないし１００の整数であり；
ｐは、１ないし１００の整数であり；および
ｘは、１ないし１００である］
で示される化合物である。

本発明の別の態様は、構造式：

［式中、
Ｘは、ＮＨ_２、ＣＨＯ、ＣＯＯＨまたはそれらの修飾体であり；および
ＰＥＧは、約５００ないし約２０，０００ｍｗの分子量をもつ、ポリエチレングリコールの繰り返し単位である］
で示される化合物である。

本発明の別の態様は、構造式：

［式中、
Ｘは、ＮＨ_２、ＣＨＯ、ＣＯＯＨまたはそれらの修飾体であり；および
ＰＥＧは、約５００ないし約２０，０００ｍｗの分子量をもつ、ポリエチレングリコールの繰り返し単位である］
で示される化合物である。

本発明によれば、活性剤、疎水性ポリマーおよび脂質は、ヘテロ官能性コポリマーに化学結合している。ヘテロ官能性コポリマーと水不溶性活性剤の化学的なコンジュゲーションは、例えば、活性剤の溶解性を効果的に高め、そしてそれ故に、ヒト体内での効力を改善するだろう。

ヘテロ官能性コポリマーと活性剤などのポリペプチドの化学的なコンジュゲーションは、蛋白質治療剤のデリバリーに対処し、かつ改善することが意図される。インビボでの使用では、多数の蛋白質は循環から非常に迅速に除かれる。幾つかの蛋白質は、血流を循環する治療剤のために最適な水溶性よりも低い水溶性を有する。幾つかの蛋白質は、治療剤として用いられる際に、免疫学的な問題を生じる。化合物が相同な天然物と同じ基本構造を明らかに有する場合でさえ、免疫学的な問題が市販の蛋白質から報告されている。

インビボでの使用のために、ポリマー群は、化学攻撃から化合物を保護し、身体へ注入される場合に化合物の有害な副作用を制限し、そして、化合物の大きさを増大するために役立ち得る。このことは、ある種の医学的な利点を有する化合物を有用にするだけでなく、有用でなく、或いは生物に有害である化合物を有用なものとする可能性がある。例えば、蛋白質の周りのポリマー群は、腎排泄の速度および免疫学的な合併症を減少させ得、かつ、より単純で不活性な物質への蛋白質分解に対する蛋白質の耐性を増大し得る。

ヘテロ官能性コポリマーと疎水性かつ生体適合性ポリマーの化学的なコンジュゲーションは、水中で自然に自己集積して高分子ミセルを形成し得る、両親媒性ブロックコポリマーの形成を導く。かかる疎水性ポリマーは：ポリエステル、例えば、ポリ乳酸、ポリリンゴ酸、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリオルトエステル；親水性ポリマーとして記載されているような、ポリ（α−アミノ酸）の疎水性誘導体；ポリアルキルエーテル（例えば、ポリプロピレングリコール）；そのコポリマー；および前記の誘導体を包含するが、これらに限定されない。

本発明の別の態様において、ヘテロ官能性コポリマーと脂質、適当には両親媒性脂質の化学的なコンジュゲーションは、リポソームを形成し得るかまたはそれに組み込まれ得る両親媒性脂質−コポリマーコンジュゲートをもたらす。故に、これらの脂質−コポリマーコンジュゲートは、選択する生物活性剤のためのデリバリーシステムまたはビヒクルとして用いられ得る。リポソームは、該剤の単独投与時よりも長い循環半減期を示すことが期待される。

Ｂ．ヘテロ官能性コポリマーの製造方法
本発明のヘテロ官能性コポリマーは、グリセロールおよびポリエチレングリコールのコポリマーであり、ここで、該コポリマーはランダムまたはブロック構造を有する（図１参照のこと）。本発明のこれらのコポリマーは、グリシドールおよびエチレンオキシドモノマーから調製されてもよい。

グリシドールの制御重合が超分岐ポリグリセロールをもたらし得ることが文献で知られている。反応混合物中のエチレンオキシドの存在は、エチレンオキシドおよびグリセロールのコポリマーを生じる（Ｐｈ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，Ｐｏｌｙｍｅｒ ４３（２００２）７１７１−７１７８）。コポリマーの構造は、グリシドールとエチレンオキシドの比、ならびにモノマーを重合媒体に添加する順番、および混合物への添加速度により影響され、ここで、モノマーを連続的に加えることも含み得る。上記の典型的な例として、エチレンオキシドおよびグリシドールの混合物は、グリシドールおよびエチレンオキシドのランダムコポリマーをもたらし得る。図１の例１を参照のこと。エチレンオキシドの不在下でのグリシドールの重合開始は、高分岐ポリグリシドールをもたらし得、これは、エチレンオキシドでさらに処理される場合には、ポリグリシドールおよびポリエチレングリコールのブロックコポリマーを生じる。これらのブロックコポリマーは、ポリエチレンオキシドブロックが結合した分岐ポリグリシドールを含む。図１の例２を参照のこと。しかしながら、エチレンオキシドが初めに重合され、ついでグリシドールが加えられる場合には、得られたブロックコポリマーは、異なる構造を有するだろう。図１の例３を参照のこと。

本発明の重要な特徴は、ポリエチレンオキシドおよびポリグリシドールの超分岐コポリマーの末端に、２つの異なる型の官能基が存在することである。２つの異なる型の官能基の存在は、１またはそれ以上の治療的な生物活性剤、疎水性ポリマーおよび脂質をコンジュゲートするために、１つの型の官能基の選択的な使用を容易にする。

例えば、「コポリマー」は、１つの末端に１つのカルボキシル基およびその他の全ての末端にヒドロキシル基を有してもよい。この実施態様において、カルボキシル基は、治療的な生物活性剤、疎水性ポリマーおよび脂質にコンジュゲートするために用いられてもよい。カルボキシル基は、かかるコンジュゲーションのために、任意の適当な反応種に活性化されるかまたは変換されてもよい。

別の実施態様において、コポリマー上に少なくとも２つの異なる型の官能基を有することが可能であり、該基は、１つの末端にあるアミノ基および他の末端にあるヒドロキシル基であってもよい。ここで、アミノ基はヒドロキシル基より反応性があるので、それは、所望の生物活性剤、疎水性ポリマーおよび脂質とのコンジュゲーションのために反応され、そして用いられ得る。第３の実施態様は、生物活性剤、疎水性ポリマーおよび脂質と同様に反応し、コンジュゲートする、１つの末端にあるアルデヒド基および他の末端にあるヒドロキシル基の存在である。

本発明の別の態様として、初めの活性剤、疎水性ポリマーまたは脂質をヘテロ官能性コポリマーにコンジュゲートするために用いられる、１つの末端にある官能基に関係なく、構造の至るところに散在する遊離ヒドロキシル基のようなさらなる官能基を有する能力に起因して、活性剤などの小分子をこれらのさらなる基へ結合させ、それにより、送達されるべき活性剤のより高いローディングまたはより多様なローディングをもたらすことが可能であることも理解される。

ポリエチレンオキシドおよびポリグリシドールのヘテロ官能性超分岐コポリマーの合成は、文献に記載の方法を適用することにより実施されてもよい。アニオン重合は、これらのコポリマーの合成のために選択される１つの方法である。

例えば、米国特許第５，６７９，７６５号は、エポキシ化合物の重合における重合開始剤としてカリウムビス（トリメチルシリル）アミドならびにカリウムビス（トリメチルシリル）アミドを含むアニオン重合開始剤を用いることにより、１つの末端にアミノ基および他にヒドロキシル基を有するポリエーテルを調製するための方法を記載している。エチレンオキシドおよびグリシドールのアニオン開環重合が、ビス（アルキルシリル）アミドまたはフタルイミドのアルキル金属塩を重合開始剤として用いることにより行われる場合には、最終的なコポリマーは１つの末端に（Ｒ_３Ｓｉ）_２Ｎ基を有するだろうし、かつ、他の末端はヒドロキシル基であろう。このコポリマーは、弱酸との反応の際に、トリメチルシリル保護基を除去することにより、第一アミノ基に変換されるだろう。

１端にあるアミノ基（ＮＨ_２）は重合開始剤に由来し、その結果、アミノ基は各ポリマー鎖中に存在する。このことは、本明細書に記載するようなポリエーテルの特性でもある。ポリエーテルの別の末端は求核性の基−ＯＫであり、ここへ様々な官能基がこの末端とトシル基などの反応により導入され得る。加えて、重合開始剤に由来するビス（アルキルシリル）アミドは、適当な試薬と反応されてもよく、そしてそれ故に、第一アミノ基以外でかつ他の末端とも異なる官能基へ変換されてもよく、それにより、様々な種類の末端官能基を任意の組み合わせで有するポリエーテルが合成され得る。

図２は、カリウムビス（トリメチルシリル）アミドを用いる、エチレンオキシドの重合を示す。重合は典型的な活性アニオン種で進行し、その結果、重合の終わりはなく、非常に狭い分子量分布の直鎖ポリエチレンオキシドが得られ得る。加えて、任意の分子量をもつポリマーは、「モノマー／重合開始剤」の比を変えることにより得られ得る。すなわち、得られるポリマーの平均重合度は、「モノマーのモル数／重合開始剤のモル数」とほぼ同じである。

この合成戦略をエチレンオキシドおよびグリシドールの共重合に適用することにより、１つの末端にアミノ基および他の末端にヒドロキシル基を有する超分岐コポリマーの形成が導かれる。

官能基の他の異なるセットが、ヒドロキシアルデヒドを用いることにより、「コポリマー」の末端に導入されてもよく、ここで、該アルデヒド基は保護されていてもよく、そしてエチレンオキシドおよびグリシドールのアニオン共重合は、ヒドロキシル基のアルカリまたはアルカリ土類金属塩により開始されてもよい。脱保護後に得られる超分岐コポリマーは、１末端にアルデヒド基および他の末端にヒドロキシル基を生じる（図３）。

ヘテロ官能性超分岐コポリマーを生じるための第３の戦略は、米国出願番号２００３／００２７９２９に記載されており、これは、アニオン重合中の官能基保護を含まない。従って、ヒドロキシカルボン酸の金属イオン塩が開始剤として用いられ得る。金属イオンは、Ｌｉ、Ｎａ、ＫおよびＣｓから選択されてもよい。エチレンオキシドおよびグリシドールの共重合は、ヒドロキシル基で開始され、１末端にカルボキシル基および他の末端に複数のヒドロキシル基をもたらす（図４）。

共重合は、不活性雰囲気下および溶媒中で実施される。一旦重合が完了したならば、酢酸、ジクロロ酢酸および塩酸などの酸を加えることにより重合を終結させる。溶媒は、テトラヒドロフラン、ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコールジメチルエーテルおよびそれらの混合物から選択されてもよい。
共重合は、適当な溶媒の存在下、約５０℃で行われてもよい。

Ｃ．コポリマーとリポソーム成分または他の生物活性分子のコンジュゲーション
化学的なコンジュゲーション法：一般的に、ヘテロ官能性コポリマーと生物活性分子またはベシクル−形成脂質の共有結合は、ベシクル−形成脂質との反応前に、１つのポリマーにある官能基を活性化することより達成される。末端のアミン基またはカルボキシル基は、とりわけＮ−ヒドロキシスクシニイミド、エチルクロロホルマート、ＤＣＣＤ、Ｗｏｏｄｗａｒｄ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋ、シアヌール酸およびトリフルオロメタンスルホニルクロライドなどの、単官能性活性化剤により、生物活性分子または脂質にカップリングするために活性化されてもよい。ある種のジイソシアナートなどの、異なる反応性を有する基をもつ多数の二官能性架橋試薬も、脂質成分へカップリングする前に、コポリマーを活性化するために用いられてもよい。

リン脂質へ結合するためにコポリマーを活性化するための本発明の別の実施態様を、図４で説明する。この反応において、ポリマー末端のカルボキシル基は、Ｎ−ヒドロキシスクシニイミドとの反応により活性化される。この活性化工程の後に、ポリマーを、ホスファチジルエタノールアミンなどのアミノ基を有するリン脂質と反応させて、本発明の組成物の一部であるコポリマーで誘導体化されたベシクル−形成脂質を生じる。

脂質−コポリマーコンジュゲートにて用いられるべき両親媒性脂質の重要な特徴は、脂質が、ヘテロ官能性コポリマー鎖へ共有結合するために適当な官能基をその極性頭部基にもつことである。極性頭部基は、例えば、第一または第二アミン基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、ハロゲンまたはカルボキシル基である。脂質の疎水性部分は、脂質−コポリマーコンジュゲートをリポソームなどの二層構造へ取り込むことを可能とし、そしてアンカーとして作用する。本発明に記載のリポソームの誘導体化された脂質成分は、ペプチド、エステルまたはジスルフィド結合などの不安定な脂質−ポリマー結合をさらに含んでもよく、該結合は、当該分野で知られており、そして、ペプチターゼまたはエステラーゼ酵素または還元剤の存在下などの特異的生理学的条件下にて分解され得る。ポリマーとリン脂質を連結するかかる結合の使用により、投与後数時間でかかるリポソームが高い血液レベルに到達すること、その後に可逆的な結合が分解されること、およびリポソームの外側二重層からポリマーが除去されることが可能となる。ついで、ポリマーの少ないリポソームはＲＥＳ系による迅速な取り込みにさらされる。例えば、米国特許第５，３５６，６３３号（Ｗｏｏｄｌｅら）を参照のこと。

ＩＩ．リポソームの調製
Ａ．リポソーム成分
脂質−コポリマーコンジュゲートにて用いられるべき両親媒性脂質は、ベシクル形成脂質および膜脂質などの、少なくとも１つの疎水性無極性尾部および親水性極性頭部基を有する、様々な合成または自然に発生する脂質であってもよい。様々な合成ベシクル−形成脂質および自然に発生するベシクル−形成脂質があり、２つの炭化水素鎖が約１４−２２個の炭素原子の長さであってもよく、そして様々な不飽和度を有するものを含む。上記した、少なくとも１つの新規のコポリマーにコンジュゲートした脂質は、本発明のリポソーム中に含まれてもよい。

適当な両親媒性脂質の例は：リン脂質、糖脂質、セラミド、コレステロールおよび誘導体、飽和または部分的に不飽和の、分岐または直鎖のＣ_５−Ｃ_８０モノ−またはジアルキルアミン、アリールアルキルアミン、シクロアルキルアミン、アルカノール、アルデヒド、ハロゲン化炭素またはアルカノイック酸およびその無水物を含むが、これらに限定されない。

これらの両親媒性脂質の典型例は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、ステアリルアミン、ミリスチルアルコール、コレステロールおよびその誘導体；およびパルミチン酸である。

両親媒性ヘテロ官能性コポリマー−脂質コンジュゲートの例は、２つの疎水性鎖、典型的にはアルキル鎖、および上記のような官能基を含む極性頭部基をもつ脂質である。ホスファチジルエタノールアミン誘導体、そして特に、ジステアリルホスファチジルエタノールアミンは、反応性アミノ基をもつようなリン脂質群である。別の適当な両親媒性脂質は、親水性極性頭部基として、１つの第一または第二アミンおよび２つの飽和または不飽和のＣ_５−Ｃ_８０分岐または直鎖の疎水性無極性部分をもつ。それらの例は、１−ヘプタデシルオクタデシルアミンおよびジステアリルアミン含有の化合物、例えば、ジステアリルアミンおよびＮ−スクシニルジオクタデシルアミン（本明細書中、ＤＯＤＡＳｕｃとも言う）である。

本明細書中用いるための典型的なリポソームは：
ＨＳＰＣ（約１０ないし約９０ｍｏｌ％）コレステロール（０ないし約６０ｍｏｌ％または３０ないし５０ｍｏｌ％）コポリマー−ＤＳＰＥコンジュゲート（０−２０ｍｏｌ％または０ないし約５ｍｏｌ％）；または

ＤＳＰＣ（約１０ないし約９０ｍｏｌ％）コレステロール（０ないし約６０ｍｏｌ％または約３０ないし５０ｍｏｌ％）コポリマー−ＤＳＰＥコンジュゲート（０ないし約２０ｍｏｌ％および０ないし約５ｍｏｌ％）；または

ＰＯＰＣ（約１０ないし約９０ｍｏｌ％）コレステロール（０ないし約６０ｍｏｌ％または約３０ないし約５０ｍｏｌ％）コポリマー−ＤＳＰＥコンジュゲート（０ないし約２０ｍｏｌ％および０ないし約５ｍｏｌ％）；または

スフィンゴミエリン（約１０ないし約９０ｍｏｌ％）コレステロール（０ないし約６０ｍｏｌ％または約３０ないし約５０ｍｏｌ％）コポリマー−ＤＳＰＥコンジュゲート（０ないし約２０ｍｏｌ％および０ないし約５ｍｏｌ％）；または

ＰＯＰＣ（約８０ないし約９９．５ｍｏｌ％）コポリマー−ＤＳＰＥコンジュゲート（０ないし約２０ｍｏｌ％または０ないし約５ｍｏｌ％）；または

ＤＳＰＣ（約１０ないし約９０ｍｏｌ％）コレステロール（０ないし約６０ｍｏｌ％または約３０ないし約５０ｍｏｌ％）コポリマー−コレステロールコンジュゲート（０ないし約２０ｍｏｌ％または０ないし約５ｍｏｌ％）を含む。

リポソーム膜は、抗酸化剤などの防腐剤、例えばトコフェノールも含み得る。リポソームは、糖および疎水性成分のコンジュゲート、例えば、デキストランのパルミチン酸またはステアリン酸エステルも含んでもよい。

別の実施態様において、リポソーム成分は、特定の程度の流動性または剛性に達するように選択されて、血清中のリポソームの安定性を制御し、および／またはリポソーム中に封入された剤の放出速度を制御する。より強剛な脂質二重層または液体結晶二重層をもつリポソームは、比較的強剛な脂質、例えば、室温より高いなどの比較的高い相転移温度、例えば、体温より高くそして８０℃に至るまでなどを有する脂質の取り込みにより達成される。強剛な、すなわち、飽和された脂質は、脂質二重層中の膜の剛性の増大に寄与する。コレステロールなどの他の脂質成分も、脂質二重層構造中の膜の剛性および安定性に寄与することが知られている。

一方で、脂質の流動性は、比較的流動的な脂質、典型的には、室温以下などの比較的低い、液体から液晶への相転移温度を有する脂質相を有する脂質の取り込みにより達成されてもよい。

主に約２℃−８０℃の相転移温度を有するベシクル−形成脂質は、本発明の組成物の主なリポソーム成分として用いられてもよい。本発明の一の実施態様において、約３７℃以上の主相転移温度を有するベシクル−形成脂質は、リポソームの主な脂質成分として用いられる。別の実施態様において、約３７−７０℃の相転移温度を有する脂質が用いられる。例えば、脂質ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）は、５５．１℃の主相転移温度を有し、そして、脂質水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）は、５８℃の相転移温度を有する。多数の脂質の相転移温度は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ ｃａｔａｌｏｇｕｅ ａｎｄ Ｌｉｐｉｄ Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｐｉｃ Ｐｈａｓｅ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＬＩＰＩＤＡＴ，ＮＩＳＴ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ３４）などの、様々な供給元においてまとめられている。

熱またはｐＨ放出特性は、所望により、熱感受性またはｐＨ感受性の脂質を、脂質二重層（例えば、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン：ジステアリルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ：ＤＳＰＣ）ベースの混合物の成分として取り込むことにより、リポソームへ与えられ得る。熱またはｐＨ感受性の脂質により、脂質ベシクル膜の分解制御が可能となる。

記載のリポソーム成分は、市販されているか、または当該分野にて知られている方法を用いて調製されてもよい。

Ｂ．リポソーム成分からのリポソームの調製
リポソームの調製は当該分野にてよく知られており、そして、かかる既知の方法は本発明にて用いられてもよい。一般に、リポソームの形成は、散剤形態にあるベシクル−形成脂質の混合物を調製し、有機溶媒中で混合物を溶解し、溶液を凍結乾燥し、残留溶媒を除去し、混合物をバッファーで復元して多重膜ベシクルを形成し、そして所望により、溶液をフィルターから押し出して、より大きなまたは小さな１枚膜ベシクルを形成することを含む。ｐＨ、温度および全脂質の割合が、脂質二重層を形成するために、当該分野にてよく知られている原則に従って選択される。本発明における使用のために適当なリポソームを形成するための方法は、例えば、Ｌ．Ｄ．Ｍａｙｅｒら．，Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｏｆ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｓｉｚｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ Ｒａｐｉｄ Ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，Ｂ．Ｂ．Ａ．８５８（ｌ）；１６１−８，１９８６；Ｓｚｏｋａ，Ｆ．，Ｊｒ．ら．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）；および米国特許第５，０７７，０５６号；第５，０１３，５５６号；第５，６３１，０１８号および第５，３９５，６１９号に記載のものを含む。

製造を容易にするために、コポリマー−脂質コンジュゲートは、その調製の間にリポソームに組み込まれてもよく、すなわち、そのコンジュゲートは、二重層の形成中に存在する。この実施態様において、コンジュゲートは、上記のようなリポソームを調製するために用いられる粉末の脂質材料の混合物中に含まれる。得られたリポソームは、脂質二重層の内側および外側表面の両方に存在する受容体アンタゴニストをもつ傾向がある。

或いは、コポリマー−脂質コンジュゲートは、その形成後にリポソームに組み込まれ得、すなわち、コポリマー−脂質コンジュゲートは、二重層形成後に二重層中に組み込まれる。この実施態様において、コポリマーは、脂質二重層の外側表面にのみ存在する傾向がある。この実施態様において、コポリマー−脂質コンジュゲートは、適当な溶媒中で溶解され、そして、得られた溶液は、穏やかに混合されながら（例えば、スティフィング（ｓｔｉｆｆｉｎｇ））、コポリマー−脂質コンジュゲートがリポソームの脂質二重層中に集まるために効果的な時間の間、リポソームと共にインキュベートされる。

別の例示的な形成操作において、薬または他の化合物などの治療活性剤は、リポソームに封入されるために、初め、超音波処理により、疎水性分子を容易に可溶化する界面活性剤（所望により、コポリマーにグラフトされた脂質を含む）中に分散される。ついで、得られた、薬または化合物のミセル状懸濁液は、適当なモルパーセントのコポリマーにグラフトされた脂質またはコレステロールを含む乾燥脂質試料を再水和するために用いられる。ついで、懸濁液は、当該分野にて知られている押し出し技法を用いてリポソームに形成され、そして、得られたリポソームは、所望により、標準的なカラム分離により、カプセル化されていない溶液から分離される。

本発明の一の態様において、リポソームは、選択した大きさの範囲にある実質的に相同な大きさを有するように調製される。一の効果的な分粒法は、選択した均一な孔径を有する一連のポリカーボネートメンブレンからリポソームの水性懸濁液を押し出すことを含み；メンブレンの孔径は、そのメンブレンから押し出されることにより形成されるリポソームの最大の大きさにほぼ相当するだろう。例えば、米国特許第４，７３７，３２３号を参照のこと。

リポソーム形成後、ベシクルは、知られている方法に従って、リポソームが０．０３ないし０．５μｍなどの選択された範囲内の大きさの分布に達するように分粒されてもよい。典型的には０．０４ないし０．０８μｍの範囲にある、小さな１枚膜ベシクル（ＳＵＶｓ）は、リポソームの広範な超音波処理または均質化により調製され得る。約０．０８ないし０．４μｍの間の選択された範囲にある大きさをもつ均質な大きさのリポソームが、例えば、０．０５、０．０８、０．１または０．２μｍなどの０．０３ないし０．５μｍの範囲の選択された均一な孔径をもつ、ポリカーボネートメンブレンまたは他の所定の孔径のメンブレンからの押し出しなどにより調製され得る。メンブレンの孔径は、特に、調製物が同じメンブレンから２回以上押し出される場合に、そのメンブレンからの押し出しにより形成されるリポソームの最大の大きさにほぼ相当する。該サイジングは、原脂質を水和するバッファー中で行われてもよく、その結果として、リポソーム内部は、初めのリポソーム加工工程を通してずっとこの媒体を保持する。

本発明に従って得られるリポソーム懸濁液は、直接的にか、またはアジュバントを加えた後か、または第一にさらに処理（例えば、凍結乾燥またはスプレー乾燥）した後に貯蔵されてもよい。

Ｃ．定義
本発明をより容易に理解するために、特定の用語が本明細書中にて定義される。さらなる定義は、その詳細な記載を通して説明される。

本明細書にて用いる、用語「抗体」は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントまたはその誘導体を言い、そして供給元、産生方法（インビトロまたはインビボ）および他の特徴に関わらず、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。該用語は、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多特異性、非特異性、ヒト化、一本鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、成熟およびＣＤＲグラフト抗体を含むが、これらに限定されない。「インタクトな抗体」でのように、用語「インタクト」により別に修飾されない限り、本開示の目的のために、用語「抗体」は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、および抗原結合機能、すなわち抗原に特異的に結合する能力を保持する他の抗体フラグメントなどの抗体フラグメントも含む。典型的には、かかるフラグメントは、抗原結合ドメインを含むだろう。用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部または全てに特異的に結合するかまたはそれと相補的な領域を含む、抗体分子の一部を言う。

「コポリマー」は、わずか１つの型の小分子（またはモノマー）を一緒に結合することより形成されるホモポリマーに対して、少なくとも２つの型の小分子（またはモノマー）を一緒に結合することより形成されるポリマーである。コポリマーは、交互、ランダム、ブロック、グラフトまたは超分岐コポリマーとして用いられてもよい。交互コポリマーにおいては、モノマーは、交互の様式で整列する。ランダムコポリマーにおいては、異なるモノマー単位は、ランダムに整列する。ブロックコポリマーにおいては、モノマー単位を、第一の型を全て一緒にして一群とし、ついでその一群を第二の型を全て一緒にした一群に連結することにより整列させる。グラフトコポリマーにおいては、一のモノマー鎖は、他のモノマーのポリマー鎖にグラフトされる。一の超分岐コポリマーにおいて、モノマー鎖は、直線単独の様式と比べると、分岐の様式で整列する。超分岐コポリマーは、ランダム超分岐コポリマー、交互超分岐コポリマーなどとしてさらに記載されてもよい。

「リポソーム」は、１またはそれ以上の、リン脂質を含む二重層から成る、人工のベシクルを意味する。

「高分子ミセル」は、両親媒性コポリマーから形成され、疎水性および親水性ポリマーセグメントからなる、自己集積型構造である。水性媒体中で両親媒性コポリマーが自己集積する間に、高分子ミセルのコアシェル構造が形成される。内部コアは疎水性ポリマーから成り、一方、外側シェルは親水性ポリマーに由来する。

「リン脂質」は、２つの脂肪酸鎖から成る疎水性尾部およびリン酸基を含む親水性極性頭部基をもつ、リン含有の脂質を意味する。

用語「核酸」は、デオキシリボ酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ、リン酸バックボーンが非電荷ペプチド−様バックボーンで置換されているＤＮＡのアナログ）を言う。該用語は、ヌクレオチドアナログおよび一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含むことも理解されるはずである。ポリヌクレオチドの例は、プラスミドＤＮＡまたはそのフラグメント、ウィルスＤＮＡまたはＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを含むが、これらに限定されない。用語「プラスミドＤＮＡ」は、環状の二本鎖ＤＮＡを言う。本明細書中用いるように、「アンチセンス」は、配列相補性に基づいて、ｍＲＮＡの領域をコードするおよび／またはコードしない部分へハイブリダイズし、それにより、ｍＲＮＡからの翻訳を妨げ得る核酸を言う。用語「ｓｉＲＮＡ」および「ＲＮＡｉ」は、ｍＲＮＡの分解を誘導し、それにより遺伝子発現を「沈黙させる（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）」能力を有する二本鎖ＲＮＡである核酸を言う。典型的には、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１５５０ヌクレオチド長、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長である。

「ターゲティング部分」は、身体の特定部位、特定の細胞もしくは組織型または特定の疾患部位へのリポソームの送達に関与する部分を言う。疾患組織、特定の細胞型、組織型に結合するかまたは身体の特定部位を対象とするターゲティング部分は、処置または診断目的のためにリポソームを所望の部位へ位置づける補助として用いられてもよい。ターゲティング部分は、抗体；化学物質；サイトカイン；酵素；ハプテン；ホルモン；リポソームに特定の酵素的または表面認識特性を与える非蛋白質分子；ペプチド；蛋白質；および小分子を含むが、これらに限定されない。

「治療活性剤」は、本明細書中に記載の薬、蛋白質、ペプチド、核酸、栄養剤を含むが、これらに限定されない。この用語は、本明細書中に記載のような医薬上許容される剤、生物活性剤、活性剤、治療剤、治療蛋白質、診断剤または薬を含み、そしてｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｎｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅのガイドラインに準じる。かかる物質は、疾患の診断、治療、緩和、処置または予防において薬理学的活性または他の直接作用をもたらすか、または身体の構造および機能に作用することが意図される。該物質は、イメージング剤および／または放射標識された化合物などの診断剤を含んでもよい。それらは、哺乳類またはヒトにおいて用いられてもよい。薬理学的活性は、疾患状態を予防または処置するためのものであってよい。本明細書中、該剤は、小分子治療剤ならびにペプチドおよび蛋白質のいずれも含む。本明細書中に記載の医薬組成物は、所望により、１またはそれ以上の医薬上許容される活性剤、生物活性剤、活性剤、治療剤、治療蛋白質、診断剤または薬、或いはその中に分布する成分を含んでもよい。

本明細書中用いるように、「ベシクル−形成脂質」は、一般的に、疎水性および頭部基部分（極性または無極性のどちらか）をもち、かつ水中で自然に二重層ベシクルを形成し得る（例えばリン脂質のような）任意の両親媒性脂質か、或いは、リン脂質などの他の脂質と組み合わさって、安定に脂質二重層へ組み込まれる脂質を意味する。ベシクルへ形成される場合には、ベシクル−形成脂質の疎水性部分は、二重層膜の内部疎水性領域に接触され、そして頭部基部分は膜の表面の方に向けられる。

Ｄ．リポソーム内部への化合物のローディング
１．リポソーム内部へのローディングのための化合物
本発明の別の実施態様において、リポソームは、所望の疾患部位へ送達するために、リポソーム中に封入された治療または診断剤を含む。もちろん、特定の剤の選択は処置または診断される疾患に依存して行われるだろう。治療または診断剤の選択は、疾患部位の性質およびその部位に対する剤の活性に基づいて行われ、該選択は、例えば、当該分野にて知られている方法に従って化学受容性試験または病歴情報および／または許容される実際の臨床に基づいて、決定されてもよい。

該剤は、所望の作用を得るために十分な量で、本発明のヘテロ官能性コポリマーにコンジュゲートされているか、またはヘテロ官能性コポリマーに由来するコロイド状キャリアー組成物に組み込まれ得る。

治療剤は、例えば、以下の活性：抗血管新生、抗関節炎、抗不整脈、抗菌、抗コリン、抗血液凝固、抗利尿、抗てんかん、抗真菌、抗炎症、抗代謝、抗片頭痛、抗悪性腫瘍、駆虫性、抗発熱、抗発作、抗血清、抗痙攣、鎮痛性、麻酔性、β−遮断、生物学的応答調節、骨代謝調節、心血管性、利尿、酵素、受胎促進、成長促進、止血性、ホルモン、ホルモン抑制、高カルシウム血症緩和、低カルシウム血症緩和、低血糖緩和、高血糖緩和、免疫抑制、免疫促進、筋肉弛緩、神経伝達物質、副交感神経作用、交感神経血漿拡張、血漿増量、向神経、血栓溶解性および血管拡張性を有する天然または合成化合物から選択されてもよい。細胞毒性治療剤は、リポソームの発明において広く利用されている剤の一類である。

本発明において送達され得るこれらの治療剤の典型例は：トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩＩ阻害剤、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、白金化合物、抗菌剤、キナゾリン・アンチホレート・チミジレート・シンターゼ・インヒビター、成長因子受容体阻害剤、メチオニンアミノペプチダーゼ−２阻害剤、血管新生阻害剤、血液凝固剤、細胞表面溶解剤、治療遺伝子、治療遺伝子含有プラスミド、Ｃｏｘ阻害剤、ＲＮＡ−ポリメラーゼ阻害剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ステロイドおよびＮＳＡＩＤｓ（非ステロイド性抗炎症剤）を含むが、これらに限定されない。

治療剤の例は：
トポイソメラーゼＩを阻害するカンプトテシンおよびそれらのアナログまたは誘導体、例えば、ＳＮ−３８（（＋）−（４Ｓ）−４，１ １−ジエチル−４，９−ジヒドロキシ−ｌＨ−ピラノ［３’，４’：６，７］−インドリジン［１，２−ｂ］キノリン−３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオン）；９−アルニノカンプトテシン；トポテカン（ｈｙｃａｍｐｔｉｎ；９−ジメチル−アミノメチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン）；イリノテカン（ＣＰＴ−１１；７−エチル−１０−［４−（ｌ−ピペラジノ）−ｌ−ピペラジノ］−カルボニルオキシ−カンプトテシン）、インビボにてＳＮ−３８）に加水分解される；７−エチルカンプトテシンおよびその誘導体（Ｓａｗａｄａ，Ｓ．ら．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４１（２）：３１０−３１３（１９９３））；７−クロロメチル−１０，１１ メチレン−ジオキシ−カンプトテシン；およびその他のもの（ＳＮ−２２，Ｋｕｎｉｍｏｔｏ，Ｔ．ら．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏｄｙｎ．，１０（３）：１４８−１５１（１９８７）；Ｎ−ホルミルアミノ−１２，１３，ジヒドロ−I，I １ ２５ジヒドロキシ−１３−（β−Ｄ−グルコピラニシル）−５Ｈ−インドロ［２，３−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５，７（６Ｈ）−ジオン（ＮＢ−５０６，Ｋａｎｚａｗａ，Ｇ．ら．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５（１３）：２８０６−２８１３（１９９５）；ＤＸ−８９５ｌｆおよびリュートテカン（ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ）（ＧＷ−２１１または７−（４−メチルピペラジノ−メチレン）−１０，１ １ エチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン）（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．，８（９）：８３７−８５５（１９９７））；および７−（２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）エチル）−（２０Ｓ）−カンプトテシン（ＣＫＤ６０２，Ｃｈｏｎｇ Ｋｕｎ Ｄａｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅｏｕｌ Ｋｏｒｅａ）、

トポイソメラーゼＩ／ＩＩを阻害する化合物、例えば、６−［［２−ジメチルアミノ）エチル］アミノ］−３−ヒドロキシ−７Ｈ−インデノ［２，１−ｃ］キノリン−７−オン ジヒドロクロライド（ＴＡＳ １０３，Ｕｔｓｕｇｉ，Ｔ．，ら．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，８８（１０）：９９２−１００２（１９９７））；３−メトキシ−１ １Ｈ−ピリド［３’．４−４，５］ピロロ［３，２−ｃ］キノリン−１，４−ジオン（ＡｚａｌＱＤ，Ｒｉｏｕ，Ｊ．Ｆ．，ら．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４０（５）：６９９−７０６（１９９１））、

アントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピラビシン、ピラルビシンおよびイダルビシン；ビンカアルカロイド、例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンリューロシン（ｖｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）、ビンロジシン、ビノレルビンおよびビンデシン、

白金化合物、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オルマプラチン、オキサリプラチン、ゼニプラチン、エンロプラチン、ロバプラチン、スピロプラチン、（（−）−（Ｒ）−２−アミノメチルピロリジン（１，１−シクロブタンジカルボキシラート）白金）、（ＳＰ−４−３（Ｒ）−１，１−シクロブタンジカルボキシラート（２−）−（２−メチル−１，４−ブタンジアミン−Ｎ，Ｎ）白金）、ネダプラチンおよび（ビス−アセタート−アミン−ジクロロ−シクロヘキシルアミン−白金（ＩＶ））、

ゲンタマイシンおよびニスタチンなどの抗菌剤；Ｈｅｎｎｅｑｕｉｎら、Ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅ Ａｎｔｉｆｏｌａｔｅｓ Ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｗｉｔｈ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｃ２−Ｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９，６９５−７０４により記載されたようなキナゾリン・アンチホレート・チミジレート・シンターゼ・インヒビター；ＳｕｎＬ．ら．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ３−［（４．５，６，７−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−ｌＨ−ｉｎｄｏｌ−２−ｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］−１，３−２０ ｄｉｈｙｄｒｏｉｎｄｏｌ−２−ｏｎｅｓ ａｓ Ｇｒｏｗｓ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ＶＥＧＦ−Ｒ２（Ｆｌｋ ｌ／ＫＤＲ），ＦＧＦ−Ｒｌ，ａｎｄ ＰＤＧＦ−Ｒｂｅｔａ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅｓ（２０００）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３：２６５５−２６６３；およびＢｒｉｄｇｅｓ ＡＪ．ら．Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ａｎ Ｕｎｕｓｕａｌｌｙ Ｓｔｅｅｐ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｆｏｒ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ４−（３−Ｂｒｏｍｏａｎｉｌｉｎｏ）−６，７ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅ（ＰＤ １５３０３５）により記載されるような成長因子受容体阻害剤：上皮成長因子受容体の潜在的な阻害剤（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：２６７−２７６、血管新生の阻害剤、例えば、アンジオスタチン、エンドスタチン、エチスタチン、トロンボスポンジン、抗血管新生蛋白質を発現する遺伝子を含むプラスミド、およびメチオニンアミノペプチダーゼ−２阻害剤、例えば、フマギリン、ＴＮＰ−１４０およびその誘導体、および他の治療化合物、例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ミトキサントロン、シクロホスホアミド、マイトマイシン、ストレプトゾエイン、メクロレタミンヒドロクロライド、メルファラン、シクロホスホアミド、トリエチレンチオホスホロアミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ヒドロキシウレア、チオグアニン、デカルバジン、プロカルバジン、ミトキサントロン、ステロイド、シトシンアラビノシド、メトトレキサート、アミノプテリン、モトミシンＣ、デメコルシン、エトプシド、ミトラマイシン、ラッセルクサリヘビ（Ｒｕｓｓｅｌｌ’ｓ Ｖｉｐｅｒ）毒、活性型第ＩＸ因子、活性型第Ｘ因子、トロンビン、ホスホリパーゼＣ、コブラ毒因子［ＣＶＦ］およびシクロホスホアミド、
を含む。

イメージング剤は、酸素などの気体状態にある化合物および３Ｈ−コレステリルオレイルエーテルなどの放射標識された賦形剤を含む。

別の実施態様において、治療剤は：抗悪性腫瘍剤、例えば、トポテカン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、カルボプラチン、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤およびそれらの組み合わせ；抗炎症剤、例えば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ステロイドおよびＮＳＡＩＤｓ；抗血管新生剤、例えば、ファマギリン、ｔｎｐ−１４０、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、アンジオスタチン、エンドスタチンおよびエチスタチン；抗感染剤；およびそれらの混合物または組み合わせから選択されてもよい。

別の実施態様において、治療活性剤は、トポテカン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、ＲＮＡ−ポリメラーゼ阻害剤およびそれらの混合物または組み合わせから選択されてもよい。ある実施態様において、治療活性剤はトポテカンである。他のカンプトテシンおよびカンプトテシンアナログも有用な治療活性剤である。

核酸も本発明のリポソームに組み込まれてよく、例えば、デオキシリボ酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド、プラスミドＤＮＡまたはそれらのフラグメント、ウィルスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ（ｍＲＮＡの分解を誘導し、それにより遺伝子発現を「沈黙させる」能力をもつ二本鎖ＲＮＡであり、かつ典型的には、少なくとも１５５０ヌクレオチド長、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長である核酸を言う）である。

本発明のリポソームへの組み込みのために適当な栄養剤は、アミノ酸、糖、蛋白質、炭化水素、水溶性または脂溶性ビタミン（ビタミンＣおよびビタミンＥなど）または脂肪を含む。栄養剤の組み合わせも適当である。

診断剤の例は、常磁性、放射性または蛍光性イオンを含む、イメージングのための造影剤を包含する。特定のイメージング剤は、放射性造影剤（例えば、ＴｃもしくはＩｎのごときラジオアイソトープ、またはヨード−オクタン、ハロカーボンおよびレノグラフィンを含むラジオアイソトープ含有の化合物）、Ｘ線イメージング剤（バリウムまたは鉛など）、光イメージング剤（発色団など）、磁気共鳴イメージング剤（常磁性イオンまたは常磁性化合物など）および超音波造影剤をさらに含む。かかる診断剤の具体例は、米国特許第５，８５５，８６６号（Ｔｈｏｒｐｅら、１９９９年１月５日公開）に記載のものを含む。

２．化合物のリポソーム内部へのローディングまたは化合物とリポソームのコンジュゲーション
治療および診断剤をリポソームへ組み込む方法は、当該分野にてよく知られており、かつ本発明において有用である。適当な方法は、水溶性の剤の水溶液で脂質フィルムを水和することによるか、または脂肪親和性の剤を含む脂質フィルムを水和することによる受動的エントラップメント、ｐＨイオン勾配ローディング／リテンション（多くの場合リモートローディングと言われ、硫酸アンモニウム勾配などの勾配を用いる）、ポリマー勾配ローディング／リテンションおよび逆相蒸発によるリポソーム調製を包含する。例えば、かかる剤の有用なローディング法が、Ｈａｒａｎ，Ｇ．ら．，Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ Ｓｔａｂｌｅ Ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ ｏｆ Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ Ｗｅａｋ Ｂａｓｅｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，Ｖｏｌ１５ １，ｐｐ２０１−２１５（１９９３）；米国特許第５，０７７，０５６号（Ｂａｌｌｙら、１９９１年１２月３１日公開）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／１７２５６（１９９８年４月３０日公開）；Ｚｈｕ，ら．，Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ−ｐｏｌｙａｎｉｏｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ＩＮ ＳＴＥＡＬＴＨ Ｌiｐｏｓｏｍｅｓ ｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９９６）３９：１３８−１４２；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２３０５２に記載されている。該剤は、１またはそれ以上のリポソームコンパートメントに組み込まれるか、またはリポソーム膜に結合され得る。

両親媒性ポリマーの末端におけるような、コンジュゲーションによる活性剤の組み込みは、Ｚａｌｉｐｓｋｙら．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｂｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９５，１６，１５７−１８２ ａｎｄ ｉｎ Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ，Ｊ．１９（１２），１１７７−１１８３（１９８３）にて見出されてもよい。Ｚｈａｎｇ，Ｙｕａｎ−Ｐｅｎｇ；Ｃｅｈ，Ｂｏｒｉｓ；Ｌａｓｉｃ，Ｄａｎｉｌｏ Ｄ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）（２００２），７８３−８２１；Ｂｅｒｇ，Ｈｅｒｍａｎｎ．Ｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｄ．Ｌａｓｉｃ，Ｄ．Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ（１９９９），４８（２），４９０；Ｌａｓｉｃ，Ｄａｎ Ｄ．Ｎｏｖｅｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８），１６（７），３０７−３２１；およびＬａｓｉｃ，Ｄａｎｉｌｏ Ｇ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ（１９９６），６２（Ｖｅｓｉｃｌｅｓｓ），４４７−４７６も参照のこと。

ａ．ローディング操作
治療および診断剤のリポソームへの組み込み法は、当該分野にてよく知られており、かつ本発明において有用である。適当な方法は、水溶性の剤の水溶液で脂質フィルムを水和することによるか、または脂肪親和性の剤を含む脂質フィルムを水和することによる受動的エントラップメント、ｐＨイオン勾配ローディング／リテンション（例えば、硫酸アンモニウム勾配）、ポリマー勾配ローディング／リテンション、および逆相蒸発によるリポソーム調製を包含する。例えば、かかる剤の有用なローディング方法は、Ｈａｒａｎ，Ｇ．ら．，Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ Ｓｔａｂｌｅ Ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ ｏｆ Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ Ｗｅａｋ Ｂａｓｅｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，Ｖｏｌ １５１，ｐｐ２０１−２１５（１９９３）；米国特許第５，０７７，０５６号（Ｂａｌｌｙら、１９９１年１２月３１日公開）；ＰＣＴ公開ＷＯ９８／１７２５６（１９９８年４月３０日公開）；Ｚｈｕ，ら．，Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ−Ｐｏｌｙａｎｉｏｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ＩＮ ＳＴＥＡＬＴＨ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９９６）３９：１３８−１４２；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２３０５２に記載されている。該剤は、１またはそれ以上のリポソームコンパートメントに組み込まれるか、またはリポソーム膜に結合され得る。

Ｅ．リポソーム中へのターゲティング部位の組み込み
１．ターゲティング部位の説明
所望により、リポソームは、身体の特定部位、特定の細胞もしくは組織型、または特定の疾患領域への送達に関与するためのターゲティング部位を含んでもよい。疾患組織、特定の細胞型、組織型に結合するかまたは特定の身体部位を対象とするターゲティング部位は、処置、診断およびイメージング目的のために、リポソームを所望の部位へ位置づける補助として用いられてもよい。ターゲティング部位は、抗体；化学物質；サイトカイン；酵素；ハプテン；ホルモン；リポソームに特定の酵素的または表面認識特性を与える非蛋白質分子；ペプチド；蛋白質；および小分子を包含するが、これらに限定されない。

かかるターゲティング部位は、腫瘍もしくは癌細胞上または腫瘍血管上皮上にあるような、癌抗原に結合することが知られている抗体を含む。これらは、ＨＥＲ２（ＰＣＴ ＷＯ９９／５５３６７に記載のような）およびα_Ｖβ_３インテグリンを認識する抗体を含む。

２．ターゲティング部位とリン脂質のコンジュゲーションおよびリポソームへの組み込み
ターゲティング部位は、共有結合または非共有結合手段により、リポソーム表面に結合されてもよい。ターゲティング部位をリポソーム表面に共有結合的に連結させるために、末端に官能基導入したポリエチレングリコール鎖をもつ誘導体化された脂質が、リポソームに組み込まれてもよい。リポソームの形成後、末端に官能基導入した基が、リポソーム表面にカップリングするためにターゲティング部位と反応し得る。

或いは、ターゲティング部位は、初めに脂質と合わされてターゲティング部位−脂質誘導体を形成し、そしてその後にリポソームに組み込まれてもよい。例えば、ターゲティング部位は、ＤＳＰＥ−コポリマー分子のマレイミド（ｍａｌｅｍｉｄｅ）基にカップリングされてもよい。得られたターゲティング部位−ＤＳＰＥ−コポリマーコンジュゲートは、リポソームを形成するために用いられてもよく、或いは予め形成したリポソームに組み合わされてもよい。

ターゲティング部位がｓｃＦｖ抗体フラグメントなどの抗体である場合には、それは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞などの適当な組換えシステムにおいて発現されてもよい。発現されたコンストラクトは、設計したＣ−末端配列：ＧＧＧＣを有していてもよい。このＣ−末端配列は、リポソームへの有用なコンジュゲーションのためにチオール基を与える。組換え発現細胞は溶解され、そしてｓｃＦｖは、蛋白質アフィニティークロマトグラフィー、末端システインの還元およびイオン交換クロマトグラフィーを用いて単離される。

精製されたｓｃＦｖ抗体フラグメントは、ついで、ｐＨ６．２および４前後のリンカー／蛋白質モル比にて、水溶液中のマレイミド−コポリマー−ＤＳＰＥリンカー分子とコンジュゲートされる。得られたコンジュゲートは、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製される。精製されたコンジュゲート（ミセル形態にある）は、予め形成した、薬剤をローディングしたリポソームと共に、１，３００−２，６００のリポソームリン脂質に対して１前後のｓｃＦｖの比で、典型的には、約１時間、５５−６５℃でインキュベートされる。

本発明の別の方法において、ターゲティング部位は、カップリングのために特別な反応基を必要することなくカップリングされ得る。スペーサーアームまたはリンカーは、最適なカップリング比率およびリポソームへのターゲティング部位の構築に達するために、調整され得る。これらの技法は当該分野にてよく認識されている。（例えば、米国特許第４，７６２，９１５号を参照のこと）。

ＩＩＩ．リポソームの使用方法
本発明のリポソームは、一の疾患または状態の診断、イメージング、および一の疾患または状態の処置を含むがこれらに限定されない、様々な目的のために用いられてもよい。例えば、薬または他の活性剤は、記載したようにリポソームに組み込まれ、そして患者に投与される。カプセル化された薬はリポソームにより保護されてもよく、および特定の場合には、カプセル化されていない薬よりも少ない用量で投与されてもよい。別の実施態様において、イメージング剤は、リポソームに組み込まれ、その後に患者に投与され得る。これらのイメージング剤は、上記したような様々な型のイメージングのために用いられ得る。イメージング剤は、一の疾患または状態を診断するために用いられ得る。一の実施態様において、イメージング剤は、ターゲティング部位がコートされたリポソームへカプセル化される。ターゲティング部位は、例えば、癌抗原に対する抗体である。かかるリポソームは、癌の特定の型のイメージングおよび検出のために用いられてもよい。リポソームの使用方法は、当該分野にてよく認識されており、かつ十分に論じられている。

ＩＶ．医薬投与形態
本発明のリポソームを用いるために、それらは、通常、標準的な薬務に従って、医薬組成物中に処方されるだろう。故に、本発明は、有効で非毒性である量の本明細書に記載のリポソームおよび医薬上許容されるキャリアーまたは希釈剤を含む医薬組成物にも関する。別の実施態様において、リポソームは、治療活性剤および医薬上許容されるキャリアーまたは希釈剤も組み入れるだろう。

本発明のリポソームおよびそれらを含む医薬組成物は、薬剤投与のために慣用的に用いられている任意の経路により有用に投与されてもよく、例えば、吸入（例えば、経気管）、皮下、筋内、病巣間（例えば、腫瘍に対して）、鼻腔内、眼内による、および器官および静脈内への直接注入による、非経口、経口、局所投与である。ある実施態様において、例えば静脈投与などの非経口投与は、本発明のリポソームおよびそれらを含む医薬組成物を投与するために用いられてもよい。リポソームが設計される、例えば抗血管新生活性を与えるよう意図される場合には、投与は、血流中にリポソームを循環させることを含む一の経路によって行われてもよく、静脈投与を含む。

リポソームは、慣用的な方法に従ってリポソームを標準的な医薬キャリアーと組み合わせることにより調製される、慣用的な投与形態にて投与されてもよい。リポソームは、１またはそれ以上の、他の治療的に有効なまたは診断的な化合物と組み合わせて、慣用的な用量で投与されてもよい。これらの手順は、所望する調製物に適切なように、成分を混和、分粒および圧縮または溶解することを含んでもよい。

医薬上許容されるキャリアーまたは希釈剤の形態および特性は、リポソームおよび組み合わされる他の活性剤の量、投与経路および他のよく知られている変数により決定づけられることが理解されるだろう。キャリアーは、処方の他の成分と適合性があり、かつそのレシピエントに有害でないという意味で、「許容される」必要がある。リポソームは、典型的には、水性生理食塩水またはバッファーなどの液体キャリアー中の懸濁形態にて提供されるだろう。一般的に、医薬形態は、リポソームまたはローディングされた化合物を所望の投与量および投与計画で送達するために十分な量のリポソームを含むだろう。

リポソームは、リポソームまたはローディングされた化合物を所望の投与計画に従って所望の用量で送達するために十分な量で投与され、処置されるべき疾患部位を回復または予防するか、または診断またはモニターされるべき疾患部位をイメージングする。

リポソームの個々の投与の最適な量および間隔は、処置、診断またはモニターされるべき状態の性質および程度、投与の形態、経路および部位、ならびに処置されるべき特定の患者により決定されるということ、およびかかる最適条件は、慣用的な技法により決定され得るということが、当業者により理解されよう。処置の最適な過程、すなわち、所定の日数の間、１日あたりに与えられるリポソームの用量数は、処置決定試験の慣用的な過程を用いて当業者により確認されることも、当業者により理解されよう。

一旦投与されると、リポソームは、標的組織に結合するか、または循環系により標的組織へもたらされ、そこでその組織と結合する。標的組織部位では、受容体アンタゴニストはそれ自身が臨床効力を示してもよく、すなわち、リポソームはそれ自体が、標的受容体を提示する疾患の治療において有用であってもよい。当業者により理解されるように、リポソームの選択は、患者の疾患細胞上にあるコンジュゲートの同種受容体の発現に基づいてもよく、該選択は、知られている方法により決定され得るか、またはその疾患に関する病歴情報に基づいてもよい。

加えてまたは或いは、リポソームに関連する治療または診断剤は、該剤が意図された機能を遂行する標的組織に放出または拡散される。

Ｖ．調製方法
実施例１
アルデヒド保護方法によるα−ホルミル−ω−ヒドロキシルポリエチレンオキシド−コ−ポリグリシドールの調製
ポリマーの合成は：アルコールを含む、保護されたアルデヒドを用いる重合、および保護基を除去してアルデヒドを得ることを含む。

ａ）ＴＨＦ ２０ｍｌ、３，３−ジエトキシプロパノール ０．１５ｇおよびカリウムナフタレン ０．５ｍｏｌ／Ｌ−テトラヒドロフラン溶液 ２ｍｌを、反応容器へ加え、アルゴン雰囲気下で、３分間攪拌して；３，３−ジエトキシプロパノールのカリウム化合物（カリウム３，３−ジエトキシプロパンオキシド）を得る。

ｂ）エチレンオキシド ８．８ｇおよびグリシドールの混合物をこの溶液混合物へ加え、室温および１ａｔｍで攪拌する。約１２時間反応させた後、反応混合物を冷石油エーテルへ注ぎ、コポリマーを沈殿させる。

ｃ）２．０ｍｏｌ／Ｌ−ＨＣｌ ５０ｍｌをＴＨＦ ５０ｍｌに加え、ここで、工程ｂ）のコポリマー試料は溶解しており、そして、この混合物を室温で約１時間攪拌する。この溶液をＮａＯＨ水溶液で中和した後に、透析（分別分子量１０００）を、２０倍量の水に対して４時間行い、そして、これを凍結乾燥により精製する。

実施例２
α−カルボキシル−ω−ヒドロキシルポリエチレンオキシド−コ−ポリグリシドールの調製
開始剤：４−ヒドロキシ酪酸−ナトリウム／カリウム塩
（Ｋ／ＮａＯＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＫ／Ｎａ）
１工程のポリマー合成：

ａ）エチレンオキシドおよびグリシドールの共重合を、マグネチック駆動の機械式スターラー装着の高圧リアクター（Ｐａｒリアクター）中で行う。リアクターに乾燥アルゴンを通気する。

ｂ）開始剤は、マグネチックスターラー装着の１Ｌの３口フラスコおよび三方活栓付のコンデンサー中で別々に調製する。４−ヒドロキシ酪酸−ナトリウム塩（５．７ｇ ０．０４５ｍｏｌ）（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）をフラスコへ加え、ついで、切りたてのカリウム（１．８ｇ ０．０４６ｍｏｌ）を加える。固形分を加えた後に、フラスコを脱気し、ついで、アルゴンで加圧（３０ｐｓｉ）する。乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ） ４００ｍｌを加え、溶液を約１２時間還流する。不均一な溶液が形成される。この溶液を、１２ゲージダブルチップステンレススチールニードルを用いて、アルゴン流中で、高圧Ｐａｒリアクターに移す。リアクター温度を−１０℃に下げる。蒸留したてのエチレンオキシド（５０ｍｌ）（ｎ−ブチルリチウムで蒸留）およびグリシドール（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）を、ステンレススチールキャピラリーを用いて加える。溶液を５０℃で約２４時間攪拌する。リアクター温度は水浴温度に冷やしておき、そしてリアクターの内容物を、ＨＣｌ（３５％水溶液の５ｍｌ）を含むガラスビーカーへ注ぐ。微黄色液体が塩（ＫＣｌ）の沈殿を伴って形成される。溶液を濾過し、濾液を２０％ヘキサン含有の冷２−プロパノール中で沈殿させ、所望の産物を淡黄色沈殿として得、それを一晩真空乾燥する。

ｃ）マグネチックスターラーバー装着のエルレンマイヤーフラスコ中で、前工程（工程ｂ）から得られたポリマーを、５００ｍｌの脱イオン蒸留水へ加え、攪拌して溶解し、ついで、ジクロロメタンを加えてポリマーを抽出し、そして、存在する未反応の開始剤および残留量の塩を除く。溶液を脱イオン水で２回洗浄し、ついで、ジクロロメタン溶液をロータベーパー（ｒｏｔａｖａｐｏｒ）中で濃縮する。

コポリマーの分子量は、移動相としてＴＨＦを用いる、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定される。検出は、Ｄａｗｎ１８角度光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて行われる。

コポリマーのカルボキシ量は、０．０２Ｎ水酸化ナトリウムを用いる、酸−塩基滴定により決定され得る。

実施例３
α−カルボキシリックω−ヒドロキシルポリエチレンオキシド−コ−ポリグリシドールの調製
開始剤：４−ヒドロキシ酪酸−ナトリウム／カリウム塩
（Ｋ／ＮａＯＣＯ−−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＫ／Ｎａ）

ａ）エチレンオキシドおよびグリシドールの共重合を、上記実施例２の説明に従い実施する。４−ヒドロキシ酪酸ナトリウム塩のカリウムアルコラートに基づく開始剤および４−ヒドロキシ酪酸（４．２ｇ ０．０３３ｍｏｌ）を乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ） ４００ｍｌ中で攪拌し、ついで溶液を４０℃にする。溶液をカリウム １．３ｇ（０．０３３ｍｏｌ）で処理し、ついで、溶液を約１２時間還流する。不均一な溶液が形成されるだろう。この溶液を、１２ゲージダブルチップステンレススチールニードルを用いて、アルゴン流中で、高圧Ｐａｒリアクターへ移す。リアクター温度を−１０℃に下げる。蒸留したてのエチレンオキシド（８０ｍｌ ７０ｇ）（ｎ−ブチルリチウムで蒸留）およびグリシドールを、ステンレススチールキャピラリーを用いて加える。溶液を５０℃で約２４時間攪拌する。リアクター温度を水浴温度に冷やしておき、そして、リアクターの内容物を、ＨＣｌ（３５％水溶液の５ｍｌ）を含むガラスビーカーへ注ぐ。微黄色溶液が、塩（ＫＣｌ）の沈殿を伴って形成される。溶液を濾過し、ついで濾液を２０％ヘキサン含有の冷２−プロパノール中で沈殿させ、所望の産物を淡黄色沈殿として得、それを一晩真空乾燥する。

実施例４
α−カルボキシリックω−ヒドロキシルポリエチレンオキシド−コ−ポリグリシドールの調製

ａ）エチレンオキシドおよびグリシドールの共重合を、上記実施例２の説明に従い実施する。開始剤は、４ヒドロキシ酪酸ナトリウム塩のカリウムアルコラートに基づき、そして、４−ヒドロキシ酪酸（４．２ｇ ０．０３３ｍｏｌ）を乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ） ４００ｍｌ中で攪拌し、１８クラウンエーテル６（８．７ｇ ０．０３３ｍｏｌ）およびカリウム（１．３ｇ ０．０３３ｍｏｌ）と混合し、そして、溶液を４０℃にして、攪拌する。深い青紫色が形成され、同時に消失するだろう。最終的に、不均一な溶液が形成され、そしてカリウム金属は完全に消失するだろう。

ｂ）パートａ）の溶液を、１２ゲージダブルチップステンレススチールニードルを用いて、アルゴン流中で、高圧ｐａｒリアクターへ移す。リアクター温度を−１０℃に下げる。蒸留したてのエチレンオキシド（９５ｍｌ ８３．６ｇ）（ｎ−ブチルリチウムで蒸留）を、ステンレススチールキャピラリーを用いて加える。溶液を５０℃で約２４時間攪拌する。リアクター温度を水浴温度へ冷やし、そして、リアクターの内容物を、ＨＣｌ（３５％水溶液の５ｍｌ）を含むガラスビーカーへ注ぐ。微黄色溶液が、塩（ＫＣｌ）の沈殿を伴って形成される。溶液を濾過し、ついで濾液を２０％ヘキサン含有の冷２−プロパノール中で沈殿させ、所望の産物を淡黄色沈殿として得、それを一晩真空乾燥する。

実施例５
α−カルボキシリックω−ヒドロキシルポリエチレンオキシド−コ−ポリグリシドール（初めに超分岐ポリグリシドールの形成および続くエチレンオキシドの重合）
ａ）上記実施例２由来の開始剤を調製し、そして１２ゲージダブルチップステンレススチールニードルを用いて、アルゴン流中で、高圧Ｐａｒリアクターへ移す。リアクター温度を−１０℃に下げる。ＴＨＦ中のグリシドールを、ステンレススチールキャピラリーを用いて徐々に加える。溶液を５０℃で約１２時間攪拌する。ついで、蒸留したてのエチレンオキシド（９５ｍｌ ８３．６ｇ）（ｎ−ブチルリチウムで蒸留）を、ステンレススチールキャピラリーを用いて加える。溶液を５０℃で約２４時間攪拌する。リアクター温度を水浴温度に冷やしておき、そして、リアクターの内容物を、ＨＣｌ（３５％水溶液の５ｍｌ）を含むガラスビーカーへ注ぐ。微黄色溶液が、塩（ＫＣｌ）の沈殿を伴って形成される。溶液を濾過し、ついで濾液を２０％ヘキサン含有の冷２−プロパノール中で沈殿させ、所望の産物を淡黄色沈殿として得、それを一晩真空乾燥する。

実施例６
α−カルボキシリックω−ヒドロキシルポリエチレンオキシド−コ−ポリグリシドール（初めにポリエチレンブロックの形成および続くポリグリシドールの重合）

ａ）上記実施例２由来の開始剤を調製し、そして、１２ゲージダブルチップステンレススチールニードルを用いて、アルゴン流中で、高圧Ｐａｒリアクターに移す。リアクター温度を−１０℃に下げ、ついで、蒸留したてのエチレンオキシド（９５ｍｌ ８３．６ｇ）（ｎ−ブチルリチウムで蒸留）を、ステンレススチールキャピラリーを用いて加える。溶液を５０℃で約２４時間攪拌する。ＴＨＦ中のグリシドールを、ステンレススチールキャピラリーを用いて徐々に加える。溶液を５０℃で約１２時間攪拌する。リアクター温度を水浴温度に冷やしておき、そして、リアクターの内容物を、ＨＣｌ（３５％水溶液の５ｍｌ）を含むガラスビーカーへ注ぐ。微黄色溶液が、塩（ＫＣｌ）の沈殿を伴って形成される。溶液を濾過し、ついで濾液を２０％ヘキサン含有の冷２−プロパノール中で沈殿させ、所望の産物を淡黄色沈殿として得、それを一晩真空乾燥する。

実施例７
α−ヒドロキシ−ω−スクシニミジル−ＰＥＧ−コ−ポリグリシドールの合成

ａ）マグネチックスターラーバーおよびゴム栓付きの三方活栓を装着し、窒素ラインおよびバブラーにつないだ、丸底フラスコ中で、実施例６由来のコポリマー（１０．００ｇ；０．０１１ｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．５倍；３．６４ｇ；０．０１７６ｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシニイミド（１．５倍；２．０３ｇ；０．０１７６ｍｏｌ）を１５０ｍｌのジクロロメタン中で溶解する。フラスコを室温に保ち、溶液を一晩攪拌する。濁った不均一な白色が沈殿するだろう。反応混合物を濾過し、ついで濾液を減圧下で濃縮し、濾過し、冷ジエチルエーテルで沈殿し、そして最終的に得た溶液を乾燥エタノールから結晶化する。

実施例８
α−ヒドロキシ−ω−スクシニミジル−ＰＥＧ−コ−ポリグリシドールと蛋白質のコンジュゲーション

固体αヒドロキシωスクシニミジルＰＥＧ−コ−ポリグリシドール（実施例７より得られる）をＤｕｌｂｅｃｃｕ’ｓリン酸バッファー（ＤＰＢＳ）ｐＨ７．０中のＧｒｏｂ−ｔの２．５ｍｇ／ｍＬ溶液へ加える。ＮＨＳ−コポリマーを、ＮＨＳ−コポリマーと蛋白質の比を２：１、４：１または１０：１のモル比で、蛋白質溶液に加える。約３時間、反応を４０℃で進行させておく。反応の終わりに、過剰量のグリシン（０．５Ｍ）を加えて、反応をクエンチし、そして、反応混合物のｐＨを３Ｎ ＨＣｌで約ｐＨ４．５に調節する。表題化合物／産物をダイアフィルトレーションにより精製する。

実施例９
α−ヒドロキシ−ω−スクシニミジル−ＰＥＧ−コ−ポリグリシドールと脂質のコンジュゲーション

Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルコポリマー（０．８ｍｍｏｌｅ）のクロロホルム溶液（１０ｍｌ）を、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、トリエチルアミン（０．２ｍｌ、１．４ｍｍｏｌｅ）含有のＤＳＰＥ（０．５２ｇ、０．７０ｍｍｏｌｅ）に加える。混合物を油浴中に保持し、２時間、４０−４５℃に加温する。反応が完了したら、表題化合物／産物を単離して、ダイアフィルトレーションにより精製する。

実施例１０
コポリマーにコンジュゲートした脂質のリポソームへの取り込み：

実施例９のコポリマー−脂質コンジュゲートを含むリポソームを以下のように調製する。脂質材料の組成を下の表１に示す。
表１

脂質材料の重さを個々にはかり、そして適当な大きさの容器に入れる。脂質を、ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ ９５／５ 容量／容量、ベンゼン：ＭｅＯＨ ７０／３０ 容量／容量またはエタノールなどの有機溶媒中で完全に溶解する。溶媒を蒸発させて除き（または、ベンゼン：メタノールの場合には凍結乾燥する）、そして、微量の溶媒を高真空下で除く。脂質フィルムを２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有の水性バッファー、ｐＨ７．４（ＨＢＳ）に、摂氏６５度で、ボルテックスを用いて、再懸濁する。脂質懸濁液を２−１００ｎｍ径のポリカーボネートフィルターからの押し出しにより分粒し、１００ｎｍ径のベシクルを形成する。

さらなるリポソームが、表１に示される成分から調製されてもよく、これは、用いる各成分の目標モル％組成および目標重量を反映する。

本明細書および請求の範囲において用いられる、成分の量、反応条件などを表す全ての数は、全ての場合において、「約」という用語で修飾されていることが理解されるはずである。従って、別記しない限り、明細書および添付の請求の範囲にて示される数値は、本発明により得られるべき所望の性質に依存して変化してもよい、おおよそのものである。最低限、一の試みとして、特許請求の範囲に均等論を適用することを制限するものではなく、数値は、各々、有効数字の数および通常の丸め付け方法を考慮して解釈されるべきである。

本明細書にて引用される特許、特許出願を含め、全ての文献は、出典明示により、そのすべてを本明細書の一部をなす。

上記記載は、その好ましい実施態様を含めて、本発明を十分に開示する。本明細書中にて特に開示される実施態様の修飾および改良もまた添付の特許請求の範囲の範囲内である。さらなる記載がなくても、当業者は、前記記載を用いて、本発明を最大限に利用し得ると考えられる。故に、本明細書の実施例は、単なる例示であって、決して本発明の範囲を限定するものではないと、解釈されるべきである。独占的な性質および特権が求められる本発明の実施態様は、添付の特許請求の範囲のように定義される。

図１は、ランダムもしくは分岐コポリマーの３つの例である。 図２は、カリウムビス（トリメチルシリル）アミドを用いた、エチレンオキシドの重合を示すスキームを表す。 図３は、超分岐コポリマーのスキームを表し、脱保護の後に、アルデヒドコポリマーの１つの末端にアルデヒド基、かつ他の末端にヒドロキシル基を生じる。 図４は、１つの末端にカルボキシル基および他の末端に複数のヒドロキシル基を有する、ヘテロ官能性超分岐のスキームを表す。

Claims (19)

1. 構造式：
   

   

   ［式中、
   ｌは、０ないし１０，０００の整数であり；
   ｍは、０ないし１０，０００の整数であり；
   ｎは、１ないし１００の整数であり；
   ｐは、１ないし１００の整数であり；および
   ｘは、１ないし１００の整数である］
   で示される化合物。
2. 構造式：
   

   

   ［式中、
   ｌは、０ないし１０，０００の整数であり；
   ｍは、０ないし１０，０００の整数であり；
   ｎは、１ないし１００の整数であり；
   ｐは、１ないし１００の整数であり；および
   ｘは、１ないし１００の整数である］
   で示される化合物。
3. 構造式：
   

   

   ［式中、
   ｌは、０ないし１０，０００の整数であり；
   ｍは、０ないし１０，０００の整数であり；
   ｎは、１ないし１００の整数であり；
   ｐは、１ないし１００の整数であり；および
   ｘは、１ないし１００の整数である］
   で示される化合物。
4. 構造式：
   

   

   ［式中、
   Ｙは、活性剤、疎水性ポリマーまたは脂質であり；
   ｌは、０ないし１０，０００の整数であり；
   ｍは、０ないし１０，０００の整数であり；
   ｎは、１ないし１００の整数であり；
   ｐは、１ないし１００の整数であり；および
   ｘは、１ないし１００の整数である］
   で示される化合物。
5. 構造式：
   

   

   
   ［式中、
   Ｘは、ＮＨ_２、ＣＯＯＨ、ＣＨＯまたはそれらの修飾体であり；および
   ＰＥＧは、約５００ないし約２０，０００ｍｗの分子量をもつ、ポリエチレングリコールの繰り返し単位である］
   で示される化合物。
6. 構造式：
   

   

   ［式中、
   Ｘは、ＮＨ_２、ＣＨＯ、ＣＯＯＨまたはそれらの修飾体であり；および
   ＰＥＧは、約５００ないし約２０，０００ｍｗの分子量をもつ、ポリエチレングリコールの繰り返し単位である］
   で示される化合物。
7. 活性剤、蛋白質、診断剤、イメージング剤およびポリペプチドから選択される少なくとも１つの剤と共に、請求項１ないし３、５または６いずれか１項に記載の化合物を含む、コンジュゲート。
8. 少なくとも１つの脂質と共に、請求項１ないし３、５または６いずれか１項に記載の化合物を含む、コンジュゲート。
9. 高分子ミセルの形成能を有する両親媒性コポリマーをもたらす少なくとも１つの疎水性ポリマーと共に、請求項１ないし３、５または６いずれか１項に記載の化合物を含む、コンジュゲート。
10. 高分子ミセルの形成能を有する両親媒性コポリマーをもたらす疎水性ポリマーをもつ、請求項１ないし３、５または６いずれか１項に記載の化合物を含む、コンジュゲート。
11. 治療活性剤をその必要のある動物に送達する、請求項８記載の少なくとも１つのコンジュゲートを含む、デリバリービヒクル。
12. 治療活性剤をその必要のある動物に送達する、請求項９記載の少なくとも１つのコンジュゲートを含む、デリバリービヒクル。
13. 活性剤、蛋白質、診断剤、イメージング剤およびポリペプチドから選択される少なくとも１つの剤をその必要のあるヒトへ送達する、請求項７記載の少なくとも１つのコンジュゲートを含む、デリバリービヒクル。
14. ａ）請求項１ないし３、５または６いずれか１項に記載の少なくとも１つの組成物；
    ｂ）脂質を形成する少なくとも１つのベシクル；
    ｃ）所望により、少なくとも１つのターゲティング部分；
    ｄ）および所望により、薬剤、蛋白質、ペプチド、イメージング剤、放射性剤および核酸から選択される、少なくとも１つの治療活性剤：
    を含む、リポソーム。
15. 誘導体化されたヘテロ官能性ランダム構造コポリマーの製造方法であって、グリシドールおよびエチレンオキシドのモノマー比を互いに調節し；および／またはそのモノマーを重合媒体に添加する順番を調節し；および／またはグリシドールおよびエチレンオキシドのモノマーを重合混合物に添加する速度を調節して、得られるポリエチレンオキシドおよびポリグリシドールの超分岐コポリマーの末端に２つの異なる官能基を生じることを含んでなる、方法。
16. 末端官能基の１つが、任意の適当なまたは所望の反応種に変換され得るカルボキシル基である、請求項１５記載の方法。
17. 末端官能基の１つがアミノ基である、請求項１５記載の方法。
18. 末端官能基の１つがアルデヒドである、請求項１５記載の方法。
19. 末端官能基の１つがヒドロキシル基である、請求項１５ないし１８いずれか１項に記載の方法。
    

Images