JP6853924B2 - 温度感受性重合体を用いた核酸の送達用ミセル組成物およびその製造方法 - Google Patents
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Description
(1)温度感受性共重合体と核酸とのポリイオンコンプレックスであって、
温度感受性共重合体は、カチオン性ブロックと温度感受性ブロックとを有し、
温度感受性共重合体の下限臨界溶液温度(LCST)以下の温度条件下で温度感受性共重合体と核酸とを混合して得ることができる、ポリイオンコンプレックス。
(2)カチオン性ブロックが、カチオン性アミノ酸ポリマーブロックである、上記(1)に記載のポリイオンコンプレックス。
(3)温度感受性共重合体が親水性ブロックを有し、親水性ブロックが、ポリエチレングリコールである、上記(1)または(2)に記載のポリイオンコンプレックス。
(4)温度感受性共重合体が、GLUT1リガンドで修飾された、上記(1)〜(3)のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
(5)核酸が、生体適合性の疎水基で修飾されている、上記(1)〜(4)のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
(6)核酸が、siRNAである、上記(1)〜(5)のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
(7)カチオン性ブロックと温度感受性ブロックとを有する温度感受性共重合体を含んでなる、ポリイオンコンプレックスを作製するための組成物。
(8)カチオン性ブロックが、カチオン性アミノ酸ポリマーブロックである、上記(7)に記載の組成物。
(9)温度感受性共重合体が親水性ブロックを有し、親水性ブロックが、ポリエチレングリコールである、上記(7)または(8)に記載の組成物。
(10)温度感受性共重合体が、グルコースで修飾された、上記(7)〜(9)のいずれかに記載の組成物。
(11)上記(1)〜(6)のいずれかに記載のポリイオンコンプレクスを該ポリイオンコンプレックスの下限臨界溶液温度(LCST)以上の温度条件下にさらして得られる、核酸を含有するミセル。
(12)上記(11)に記載のミセルを含む、核酸送達用組成物。
(13)上記(11)に記載のミセルであって、温度感受性共重合体がグルコースで修飾された、ミセル。
(14)上記(13)に記載のミセルであって、ミセル中の温度感受性共重合体のグルコース修飾率が、15〜40%である、ミセル。
(15)上記(13)に記載のミセルであって、ミセル中の温度感受性共重合体のグルコース修飾率が、50〜100%である、ミセル。
(16)上記(13)または(14)に記載のミセルを含む、脳への核酸送達用組成物。
(17)上記(13)または(15)に記載のミセルを含む、脳血管内皮細胞への核酸送達用組成物。
(18)上記(16)または(17)に記載の脳への核酸送達用組成物であって、
組成物は、投与計画に従って対象に投与するための組成物であり、
投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することと、該対象において血糖値の上昇を誘発させることとを含む、組成物。
実施例1では、ミセル形成に必要な高分子の合成を行なった。
まず、1,2−O−イソプロピリデン−3,5−O−ベンジリデン−α−D−グルコフラノース(以下、「BIG−OH」という)を合成した。具体的には、1,2−O−イソプロピリデン−α−D−グルコフラノース(以下、「MIG」という)(和光純薬工業社製)10g、ベンズアルデヒド40mLをフラスコ中で混合し、ロータリーエバポレーターで4時間回転させながら混合し、反応させた。反応後、酢酸エチル 66mLを加え、蒸留水 120mLで洗浄し、有機層(酢酸エチル層)のみを回収し、ヘキサン 500mLに加えて0℃で再結晶し、BIG−OH 9.2g(収率85%)を得た。
まず、ポリエチレングリコール−ポリ(β−ベンジル−L−アスパルテート)ブロック共重合体(PEG−PBLA)をβ−ベンジル−L−アスパルテート−N−カルボン酸無水物(BLA−NCA)(中央化製品社に製造委託して得た)の重合により得た。具体的には、BLA−NCA 18.9gをN,N'−ジメチルホルムアミド(DMF)20mLに溶解する。メトキシ基の末端とアミノエチル基の末端を有するポリエチレングリコール(PEG−NH2)(分子量2,000)2.0gをDMF 20mLに溶解し、その溶液をBLA−NCA溶液に加える。混合溶液を35℃に保ちながら40時間重合した。赤外分光(IR)分析で重合反応が終了したことを確認した後、反応混合物をジエチルエーテル2Lに滴下して沈澱したポリマーを吸引濾過により回収し、ジエチルエーテルで洗浄した後に真空乾燥してPEG−PBLA 15.51g(収率79%)を得た。
上記で得られたPEG−PBLA 500mgをジメチルスルフォオキシド(DMSO) 20mLに溶解した。スルホ型Cy5−N−ヒドロキシスクシイミドエステル(Lumiprobe社製、製品番号:43320)25mgを、PEG−PBLA溶液に加え、常温で2日間反応させた。その後、0.5N水酸化ナトリウムを75mL添加し、室温でベンジルエステルを加水分解した。透析膜(分画分子量6,000−8,000)を用いてエタノール、水の順で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥してCy5−PEG−P(Asp.) 456mg(収率86%)を得た。
まず、ベンゼン凍結乾燥した1,2,5,6−ジ−O−イソプロピリデン−α−D−グルコフラノース(DIG)からDIG−PEG−OHを得た。具体的には、DIG(TCI社製) 0.72gをTHF 5mLに溶解して、DIG−OH溶液を得た。その後、0.3Mのナフタレンカリウムを含んだTHF溶液 3.5mLを得られたDIG−OH溶液に滴下し、エチレンオキシド(EO)2.5mLをアルゴン雰囲気下で添加し常温で48時間反応させた。その後、1mLのメタノールを反応液に添加し、10%メタノールを含むエーテルを寒剤でよく冷やしたもので再沈殿させDIG−PEG−OH 3.2g(収率86%)を回収した。
Cy5−PEG−P(Asp.)50mgを10mM リン酸緩衝液(PB、pH 7.4、0mM NaCl)50mLに溶解し、1mg/mLのCy5−PEG−P(Asp.)溶液を調製した。PEG−P(Asp.−AP) 50mgも同様にPB 50mLに溶解し、1mg/mLのPEG−P(Asp.−AP)溶液を調製した。2種類の水溶液Cy5−PEG−P(Asp.)とPEG−P(Asp.−AP)それぞれ4mLと7.0mLを50mLのコニカルチューブに添加し、ボルテックスで2分間撹拌した(2000rpm)。その後、水溶性の縮合剤である1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)(10mg/mL)を含有するPB溶液5.6mLを加え、一晩静置しポリイオンコンプレクスのコアを架橋した。その後、分画分子量100,000の膜のついた限外濾過チューブを用いて、ミセル形成に関与していないポリマーおよびEDCの副生成物などを除去した。
得られたCy5−PICミセルのサイズ(Z平均粒子径)および多分散指数(PDI)は、ゼータサイザー(Malvern)で測定した。サイズはブラウン運動により移動している粒子の拡散を測定し、その測定結果をストークス・アインシュタインの式を用いて粒子径と粒度分布に変換した。またミセルの形状は、透過型電子顕微鏡(TEM、JEM−1400)を用いて評価した。ここで、Z平均粒子径とは、粒子分散 物等の動的光散乱法の測定データを、キュムラント解析法を用いて解析したデータである。キュムラント解析においては、粒子径の平均値と多分散指数(PDI)が得られ、本発明においては、この平均粒子径をZ平均粒子径と定義する。厳密には、測定で得られたG1相関関数の対数に、多項式をフィットさせる作業を、キュムラント解析といい、下式:
LN(G1)=a+bt+ct2+dt3+et4+・・・における定数bが、二次キュムラントまたは、Z平均拡散係数と呼ばれる。Z平均拡散係数の値を分散媒の粘度と幾つかの装置定数を用いて粒子径に換算した値がZ平均粒子径であり、分散安定性の指標として品質管理目的に適した値である。
Glc(6)−PEG−P(Asp.)20mgとCy5−PEG−P(Asp.)40mgを10mM リン酸緩衝液(PB、pH7.4、0mM NaCl)60mLに溶解し、1mg/mLのCy5−Glc(6)−PEG−P(Asp.)とPEG−P(Asp.)混合溶液を調製した。PEG−P(Asp.−AP)50mgも同様にPB 50mLに溶解し、1mg/mLのPEG−P(Asp.−AP)溶液を調製した。2種類の水溶液、すなわち、Cy5−PEG−P(Asp.)とPEG−P(Asp.)との混合液とPEG−P(Asp.−AP)溶液のそれぞれ4mLと7.0mLを50mLのコニカルチューブに添加して、ボルテックスにより2分間撹拌した(2000rpm)。その後、水溶性の縮合剤であるEDC(10mg/mL)を含有するPB溶液 5.6mLを加え、一晩静置しポリイオンコンプレクスのコアを架橋した。その後、分画分子量100,000の膜のついた限外濾過チューブを用いて、ミセル形成に関与していないポリマー、EDCの副生成物などを除去した。
得られたGlc(6)−Cy5−PICミセルのサイズ(Z平均粒子径)および多分散指数(PDI)は、ゼータサイザー(Malvern)で測定した。その結果、平均粒径40nmであり、粒径が均一なミセルを得たことが明らかとなった(図2A)。また、ミセルの形状は、透過型電子顕微鏡(TEM、JEM−1400)を用いて、酢酸ウラニルで染色後に観察した(図2B)。
Glc(3)−PEG−P(Asp.)20mgとCy5−PEG−P(Asp.)40mgをpH7.4 10mMリン酸緩衝液 (PB、0mM NaCl)60mLに溶解し、1mg/mLのCy5−Glc(3)−PEG−P(Asp.)とPEG−P(Asp.)混合溶液を調製した。PEG−P(Asp.−AP) 50mgも同様にPB 50mLに溶解し、1mg/mLのPEG−P(Asp.−AP)溶液を調製した。2種類の水溶液Cy5−PEG−P(Asp.)、PEG−P(Asp.)混合液とPEG−P(Asp.−AP)溶液のそれぞれ4mLと4.3mLを50mLのコニカルチューブに添加して、ボルテックスで2分間撹拌した(2000rpm)。その後、水溶性の縮合剤であるEDC(10mg/mL)を含有するPB溶液5.6mLを加え、一晩静置しポリイオンコンプレクスのコアを架橋した。その後、分画分子量100,000の膜のついた限外濾過チューブを用いて、ミセル形成に関与していないポリマー、EDCの副生成物などを除去した。得られたGlc(6)−Cy5−PICミセルのサイズ(Z平均粒子径)および多分散指数(PDI)は、ゼータサイザー(Malvern)で測定した。またミセルの形状は、透過型電子顕微鏡(TEM、JEM−1400)を用いて評価した。得られたミセルは、直径32nm(PDI=0.043)であった(データ非掲載)。
実施例1で作製したミセルをマウスに静脈投与してその体内動態を調べた。ミセルを投与する際には、血糖操作の効果も加えて評価した。
直径約100nmの中空キャリアとしてPICsomeを作製し、体内動態評価により脳への標的化効果を検証した。
まず、ポリ(β−ベンジル−L−アスパルテート)(ホモPBLAポリマー)をBLA−NCAの重合により得た。具体的には、β−ベンジル−L−アスパルテート−N−カルボン酸無水物(BLA−NCA)20gをN,N'−ジメチルホルムアミド(DMF)33.3mL、ジクロロメタン300mLに溶解する。N−ブチルアミン89.0μLを上記BLA−NCA溶液に加える。混合溶液を35℃に保ちながら40時間重合した。赤外分光(IR)分析で重合反応が終了したことを確認したのち、反応混合物をヘキサン/酢酸エチル溶液(ヘキサン:酢酸エチル=6:4)1Lに滴下して沈澱したポリマーを吸引濾過により回収し、ジエチルエーテルで洗浄した後に真空乾燥してホモPBLAポリマー 14.82g(79%)を得た。
実施例1で得たGlc(6)−PEG−P(Asp.)20mgとCy5−PEG−P(Asp.)40mgを10mM リン酸緩衝液(PB、pH7.4、0mM NaCl)60mLに溶解し、1mg/mLのGlc(6)−PEG−P(Asp.)とCy5−PEG−P(Asp.)との混合溶液を調製した。また、ホモP(Asp.−AP)50mgも同様にPB 50mLに溶解し、1mg/mLのホモP(Asp.−AP)溶液を調製した。次に、2種類の水溶液、すなわち、Glc(6)−PEG−P(Asp.)とCy5−PEG−P(Asp.)との混合液およびホモP(Asp.−AP)溶液のそれぞれ4.0mLおよび5.0mLを50mLのコニカルチューブ中で混合し、ボルテックスにより2分間撹拌した(2000rpm)。その後、水溶性の縮合剤であるEDC(10mg/mL)を含有するPB溶液5.6mLを加え、一晩静置してポリイオンコンプレクスのコアを架橋した。その後、分画分子量100,000の膜のついた限外濾過チューブを用いて、PICsome形成に関与していないポリマー、EDCの副生成物などを除去した。得られたGlc(6)−Cy5−PICsomeのサイズ(Z平均粒子径)および多分散指数(PDI)は、ゼータサイザー(Malvern)で測定した。またミセルの形状は、透過型電子顕微鏡(TEM、JEM−1400)を用いて、酢酸ウラニルで染色後に観察した。すると、直径100nm(PDI=0.086)のPICsomeを得たことが明らかとなった(データ非掲載)。
PICミセルの代わりに得られたPICsomeを投与する以外は実施例2と全く同じ方法で、PICsomeをマウスに投与し、脳へのPICsomeの蓄積を観察した。すると、グルコースでその外表面が修飾されたPICsomeのみが給餌後、急激に脳内に蓄積する様子が観察された(図6)。グルコースでその外表面が修飾されたPICsomeの脳1g当りの蓄積量は約2%であった(図6)。
本実施例では、血中滞留時間が短く送達効率の低いsiRNAを用いて実施例2および3と同様に体内動態評価を行なった。より具体的には、本実施例では、グルコースをコンジュゲートしたPEG−ポリカチオンと蛍光標識siRNAからなるミセルを用いて、siRNAの脳への蓄積を評価した。
まず、実施例1に記載の方法により得たBIG−PEG−PBLAからBIG−PEG−PBLA−Cholを合成した。具体的には、BIG−PEG−PBLA 120mgをNMP 10mLに溶解し、PBLAの末端のアミノ基に対し10等量の4−コレステリルアミノ−4−ブタン酸および触媒量のジメチルアミノピリジンを添加し、その後、室温にて6時間撹拌した。反応溶液をジエチルエーテル/2−プロパノール(9:1)溶液に滴下し、目的物を沈殿させた。沈殿物をろ過後減圧乾燥させてBIG−PEG−PBLA−Cholを130mg得た(収率95%)。
Glc(6)−siRNAミセルは、図7Aのスキームに従って調製した。具体的には、10mM HEPES緩衝液中に溶解させたGlc(6)−PEG−P(Asp.−TEP)−Chol(2mg/mL) 262.5μLをHEPES緩衝液437.5μLで希釈した。北海道システム・サイエンス社製のスクランブルsiRNAであるCy5−siRNA−chol(75μM) 279μLをHEPES緩衝液1121μLで希釈した。得られた2液を混合して10回ピペッティングし、Glc(6)−siRNAミセルを得た。In vivo実験直前に2.1mLのミセル溶液に65μLの5M NaCl溶液を加え、ピペッティングすることで等張液にしてから投与に用いた。得られたGlc(6)−Cy5−siRNAミセルのサイズ(Z平均粒子径)および多分散指数(PDI)は、ゼータサイザー(Malvern)で測定した。またミセルの形状は、透過型電子顕微鏡(TEM、JEM−1400)を用いて、酢酸ウラニルで染色後に観察した。結果、直径80nm(PDI=0.104)のsiRNAミセルが得られたことが明らかとなった。
得られたGlc(6)−Cy5−siRNAミセル 200μL/2時間を静脈投与により30分または2時間にわたりシリンジポンプ(Harvard社)を用いて精密持続静注し、投与開始5分後に20%グルコース溶液を腹腔内投与した。siRNAミセルの投与終了から1時間後に脳を摘出し、マルチビーズショッカーで粉砕後に、IVISイメージングシステム(Xenogen社)をもちいてそれぞれの輝度を評価した。すると、静脈投与の時間が長くなると、脳の輝度が上昇し、2時間の静脈投与による脳への蓄積は、30分の静脈投与による脳への蓄積よりも多かった(図7B)。また、脳への蓄積量を算出すると、siRNAミセルでは、2時間の静脈投与において、その投与量の1.3%を脳(1g当り)に送達することができていることが明らかとなった。さらに、投与終了から6時間後に脳を摘出し、共焦点顕微鏡(LSM510)で観察を行い、脳実質における蛍光強度を測定した。すると、siRNAミセルは、脳細胞内に蓄積していることが明らかとなった(図8)。
本実施例では、Glc(6)−PEG−ポリアスパラギン酸をミセルを形成させずにマウスに投与してその体内動態を評価した。
本実施例では、抗体にグルコースをコンジュゲートさせ、体内動態を評価した。すると、抗体も血糖操作により脳への蓄積を示した。
次に、得られたDyLight488蛍光標識化グルコース導入ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体と抗体とをコンジュゲートさせてグルコース導入抗体を得た。具体的には以下の通りである。
6週齢のBalb/C雌マウス8匹の給餌を24時間止めた。8匹のマウスをA群、B群およびコントロール群(それぞれ3匹、3匹および2匹)に分けた。A群のマウスにはGlc−polymer conjugated IgGを、B群のマウスにはCy5−IgGをそれぞれ750nMで200μLずつ静脈内注射し、その5分後に20%グルコース溶液200μLを腹腔内投与した。なお、各抗体のCy5に由来する蛍光強度は同等であった。A群およびB群のマウス3匹ずつを抗体投与から57分後にジエチルエーテル麻酔にかけ、その3分後に採血と臓器摘出(脳、肝臓、腎臓、肺、心臓、脾臓および大腿筋)を行った。コントロール群2匹も別途、採血と臓器摘出を行った。採血により得られた血液は、それぞれ4℃、15,000rpmで遠心をし、上清を回収した。8匹のマウスの摘出した臓器はまず全体の重量の測定を行った後、脳は半分、肝臓はおよそ200mgを切りとり、また、腎臓は片側を取得して、重量の測定を行い、マルチビーズショッカー用のチューブに臓器を金属のコーンとともに入れた。また、コントロール群のうちの1匹を除いた7匹の脳および肝臓のサンプルには1×Passive Lysis Bufferを600μL、脾臓、心臓および大腿筋のサンプルには300μL、腎臓および肺のサンプルには400μLずつ加えた。一方、コントロール群のうちの残った1匹のマウス(100%コントロール)の臓器のサンプルには、静脈内注射したサンプル全てが該当する臓器に集積したと仮定した時のサンプル量を計算し、その量のCy5−IgG溶液を臓器のサンプルに加え、さらに加える溶液量の合計が他の7匹のマウスと同じになるように1×Passive Lysis Bufferを加えた。全ての臓器サンプルをマルチビーズショッカーにより、2000rpmで30秒動作を5回繰り返し、臓器をホモシナイズした。臓器のチューブからコーンを除いた後、それぞれのサンプルを100μLずつマルチプレートの各ウェルに入れ、マルチプレートリーダーで励起波長643nm、蛍光波長667nmとして蛍光強度の測定を行った。コントロール群のうちCy5−IgG溶液を加えていない方をブランクとし、加えた方を100%として各臓器の抗体の集積率を計算し、血液以外は、得られた集積率を臓器の重量(g)で除した値を算出した。
上記実施例2によれば、グルコース導入率25%のミセルは3%を超える脳への蓄積を示したのに対して、グルコース導入率50%のミセルは約1.3%の脳への蓄積を示した。このことは、グルコースの導入率が増加することにより、脳血管内皮細胞に取り込まれたミセルと脳血管内皮細胞との解離が低下することを意味すると考えられた。そこで、本実施例では、グルコース導入率と脳血管内皮細胞へのミセルの蓄積との関係を確認した。
本実施例では、温度に応答してミセル化を引き起こす温度感受性共重合体を合成した。温度感受性共重合体は、親水性鎖−カチオン性鎖−温度感受性鎖を連結した三元型ブロック共重合体とした。
N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル、クロロベンゼン、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)、メタノール、アジ化ナトリウム、p−トルエンスルホン酸メチル(MeOTs)、N6−トリフルオロアセチル−L−リシン−N−カルボン酸無水物(Lys(TFA)−NCA)は、一般グレードのものを購入して適宜精製作業を行った後使用した。ノルマルプロピルオキサゾリン(nPrOx)は東京化成工業株式会社に委託大量合成したもの、またジベンジルシクロオクチン−N−ヒドロキシコハク酸エステル(DBCO−NHS)はClick Chemistry Toolsから購入したものを用いた。
開始剤p−トルエンスルホン酸メチル(MeOTs)を50μL(61.7μg)測りとり、アセトニトリル10mL、クロロベンゼン10mLを混合した溶媒に溶かした。氷冷しながらこの開始剤溶液にモノマーであるn−プロピルオキサゾリン(nPrOx)を8.5mL(8.76g,モノマー/開始剤=234)加え、42℃の水浴で12日間重合した。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法(MALDI-TOF-MS)で目標の分子量に達したことを確認し、重合停止剤としてアジ化ナトリウムを430mg(停止剤/開始剤=20)加え、70℃で2日間撹拌して重合停止を行った。全ての反応はアルゴン雰囲気下で行った。なお、アセトニトリルとnPrOxモノマーは脱水剤の水素化カルシウムを加えて蒸留、クロロベンゼンと開始剤MeOTsは脱水剤の五酸化二リンを加えて蒸留したものを用いた。反応後のサンプルは、メタノールに対して透析を3回、水に対して透析を4回行った後、凍結乾燥により回収した(収率58%)。
ベンゼン凍結乾燥をした片末端メトキシ基片末端3−アミノプロピル基のポリエチレングリコール(PEG−NH2)(分子量2,200)433mgを、1Mチオウレアを含むN,N’−ジメチルホルムアミド(DMF)10mLに溶解し、開始剤溶液とした。N6−トリフルオロアセチル−L−リシン−N−カルボン酸無水物(Lys(TFA)−NCA)2.37gを、1Mチオウレアを含むDMF20mLに溶解させモノマー溶液とした。このモノマー溶液を開始剤溶液に加え、35℃で3日間重合反応を行った。赤外分光(IR)分析で重合反応が終了したことを確認したのち、反応混合物をジエチルエーテル2Lに滴下して沈澱したポリマーを吸引濾過により回収し、ジエチルエーテルで洗浄した後に真空乾燥してポリエチレングリコール−ポリ(N6−トリフルオロアセチル−L−リシン)ブロック共重合体(PEG−PLys(TFA))2.39g(収率85.1%)を得た。重合度は1H−NMRにより40(TFA基脱保護後、1分子のsiRNAと同等の電荷数を持つ重合度)であることを確認した。
PEG−PLys(TFA)120mgを5mLのDMFに溶解した。これにジベンジルシクロオクチンNHSエステル(DBCO−NHS)を34mg加え、4時間撹拌した。その後N,N−ジイソプロピルアミン(DIEA)を11μL加え、37℃で24時間撹拌した。反応後のサンプルは、ジエチルエーテル150mLに滴下して沈澱したポリマーを吸引濾過に供し、ジエチルエーテルで洗浄した後に真空乾燥して回収した。PEG−PLys(TFA)−DBCOを105mg(収率84.6%)得た。
まず、PEG−PLys(TFA)−DBCOとPnPrOx−N3のカップリング反応を行った。100mgのPEG−PLys(TFA)−DBCOと550mgのPnPrOx−N3を10mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、4℃で一晩かけてポリマー溶液を凍結させた。その後室温で凍結させたポリマー溶液を融解させた。続いてTFA保護基の脱保護を行うため、この反応溶液に40mLのメタノールと0.84mLの6M NaOH水溶液を加え、35℃で12時間撹拌した。反応後のポリマー溶液は、0.01M塩酸水溶液を外液として3回透析し、さらに純水を外液として4回透析した後に凍結乾燥により回収した。
PEG−PLys−PnPrOx共重合体は、温度依存的にミセル形成の進行を制御できる。本実施例ではこの温度感受性共重合体を用いてsiRNAとのポリイオンコンプレックスを作製した。
具体的には、まず、PEG−PLys−PnPrOxを15μMの濃度で10mM HEPESバッファー(pH7.4、150mM NaCl)に溶解させ、37℃で30分間静置させた。その後このポリマー溶液と37℃とした15μMのsiRNA溶液を同様の体積だけ混合して(ポリマーとsiRNAの電荷比1)、コンプレックス形成を行った。この方法で調製した高分子ミセルをsiRNA−cPIC/ミセルと名付ける。同様に、疎水的な分子であるコレステロールが導入されたsiRNA(chol−siRNA)を用いて高分子ミセル、chol−siRNA−cPIC/ミセルを調製した。
本実施例では、PLysとsiRNAが1対1会合体(uPIC)を形成することに着目して、まずuPICを形成させた後にPnPrOxの温度応答疎水化によりuPICを束ねる形で高分子ミセルを形成させることを思いついた。この方法では、従来のように高次構造を作った後にPIC形成を行うのではなく、PIC形成を行った後に高次構造を形成するため、最終的な構造が従来型より秩序だったものになっていると予想され、安定な構造体であると期待される。
本実施例では、実施例2で得られたuPIC/ミセルとcPIC/ミセルの物性や生理的安定性を分析した。
まず、siRNAが高分子ミセルに封入されているかをアガロースゲル電気泳動により確認した。7.5μMの濃度のsiRNA−cPIC/ミセル、siRNA−uPIC/ミセル、chol−siRNA−cPIC/ミセルおよびchol−siRNA−uPIC/ミセル溶液をそれぞれ20μLずつアガロースゲルにロードし、100Vで30分間電気泳動を行った。泳動後はエチジウムブロマイドによりsiRNAを染色した。PIC中に取り込まれたsiRNAは、電荷が中和されているため、siRNAのバンドは開始点より動かない。一方で、会合体の形成が起きていないsiRNAは、マイナスの電荷を有し、siRNAのバンドは電気泳動により移動するはずである。
続いて、得られたuPIC/ミセルおよびcPIC/ミセルの粒径と粒径分布(PDI)を動的光散乱(DLS)測定で調べた。その結果、図19に示されるように、いずれのミセルも50nm程度の粒径を有しており、PDIもすべて0.20以下となった。特筆すべき点として、uPIC/ミセルの方が小さいPDI(図19中の折れ線)を示した。PDIが小さいことは得られたミセルが均一な粒径を有することを意味し、本発明のuPIC/ミセルは形状において均一であると言える。おそらく、温度感受性共重合体とsiRNAとの複合体を形成させてからミセルを形成させると、秩序だった構造を形成しやすいからであると思われる。
uPIC/ミセルについては、37℃での静置前にuPIC(すなわち、温度感受性共重合体とsiRNAとのイオン性結合による会合分子)を形成していることの確認実験を行った。蛍光分子Alexa−647を担持したsiRNAおよびchol−siRNA溶液をそれぞれ20nMで用意した。共重合体とsiRNAでさまざまな正電荷/負電荷比(+/−比)となるよう、PEG−PLys−PnPrOx溶液の濃度を調節し150μLずつsiRNA溶液150μLに加えた。調製したそれぞれのサンプルについて、蛍光相関分光法(FCS)でsiRNAまたはchol−siRNAが担持しているAlexa−647の拡散時間を調べた。共重合体とsiRNAとが会合すると、見かけの粒径が大きくなるため、FCSで観測されるAlexa−647の拡散時間は大きくなる。実際に共重合体を添加すると拡散時間が大きくなり、イオンコンプレックスの形成が確認された(図20)。また、拡散時間は共重合体とsiRNAの+/−比が1以上では一定であることから、共重合体とsiRNAは1対1の比で会合していることが分かる。
生体内には数多くのポリアニオン性分子が存在する。これらのポリアニオン性分子は、PICミセルを形成しているポリアニオン性分子と置き換わりPICのミセル構造を崩壊させ、ミセルの標的への送達効率を低下させるため、PICミセルにおいては、ポリアニオンに対する安定性は重要な因子である。ここでは、ポリアニオンとして、細胞膜表面に多く存在する生体由来成分であるヘパリンのナトリウム塩を用いた。
cPIC/ミセルとuPIC/ミセルとの構造の違いを1H−NMR測定により明らかにした。図22(a)に示されるようにChol−siRNAは、2ppm付近にコレステロール基に由来するピークを有する。cPICでは、図22(b)に示されるように、このコレステロール基に由来するピークが見いだされたが、uPIC/ミセルでは、コレステロール基に由来するピークが見いだされなかった。このことは、cPIC/ミセルでは、コレステロール基がPIC/ミセルの表面の露出している(図22(d))一方で、uPIC/ミセルでは、コレステロール基がミセルのコアの内部に格納されている(図22(e))ことを意味する。
本実施例では、生体内におけるcPIC/ミセルとuPIC/ミセルの安定性を調べた。
標的組織は、特に限定されないが、本実施例では脳を標的としたsiRNAの送達を試みた。脳は、血液脳関門(BBB)の存在により、最も薬剤の送達が困難な臓器であると考えられている。
実施例1におけるPEG−PLys(TFA)の合成と同様に行った。149mgのBIG−PEG−HN2と764mgのLys(TFA)−NCAから、BIG−PEG−PLys(TFA)を得た。
実施例1と同様の手順で、200mgのBIG−PEG−PLys(TFA)と30mgのDBCO−NHSからBIG−PEG−PLys(TFA)−DBCOを180mg(収率87.0%)得た。
170mgのBIG−PEG−PLys(TFA)−DBCOと、実施例1で合成した840gmのPnPrOx−N3から、実施例1と同様の手順で、BIG−PEG−PLys−PnPrOxを得た。その後、BIG−PEG−PLys−PnPrOxのBIG部分の保護基をトリフルオロ酢酸を用いて脱保護して、Glc(6)−PEG−PLys−PnPrOxを90mg(収率25.0%)得た。
24時間給餌しなかった絶食マウス(Balb/c雌6週齢)に20v/v%のグルコース溶液を腹腔内投与(i.p.投与)し、i.p.投与から30分後にCy5−siRNA−Chol(BACE1)を封入した各ミセル溶液(uPIC/ミセル、10%Glc(6)−Cy5−uPIC/ミセル、25%Glc(6)−Cy5−uPIC/ミセル、50%Glc(6)−Cy5−uPIC/ミセル 50μg/マウス、200μL)を200μL微静脈投与(i.v.投与)した。i.v.投与から6時間後に脳を摘出し、脳の固定および染色を行なった。
1.4℃、4%パラホルムアルデヒドを含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で一晩静置して脳を固定する。
2.4℃、20%スクロース溶液を含有するPBS中で一晩静置(置換1)する。
3.4℃、30%スクロース溶液を含有するPBS中で一晩静置(置換2)する。
4.全脳をOCT compound(商標)に包埋し、低温ヘキサンにて凍結する。−80℃にて保存する。
5.凍結ミクロトームで凍結した脳を10〜100μmにスライスする。
6.PBS−T(PBS+0.1%tween20)に5分間浸してスライスを洗浄する。
7.スライスにブロッキング液(2%BSAを含有するPBS−T)を1時間接触させる。
8.ブロッキング液を除去し、洗わずに1次抗体溶液を加え室温で2時間静置する。
9.PBS−Tでスライスを10分間洗浄する。この洗浄を3回繰り返す。
10.2次抗体溶液を加え、スライスを室温で1時間処理する。
11.PBS−Tでスライスを10分間洗浄する。この洗浄を3回繰り返す。
本実施例では、送達したsiRNAが脳細胞内で標的であるβセクレターゼ遺伝子(BACE1)の発現を抑制しているかを確認した。
Claims (18)
- 温度感受性共重合体と核酸とのポリイオンコンプレックスであって、
核酸は、生体適合性の疎水基で置換されており、
温度感受性共重合体は、親水性ブロックとカチオン性ブロックと温度感受性ブロックとをこの順番で有し、温度感受性共重合体の下限臨界溶液温度(LCST)以下の温度
条件下で温度感受性共重合体と核酸とを混合して得られる、
ポリイオンコンプレックス。 - カチオン性ブロックが、カチオン性アミノ酸ポリマーブロックである、請求項1に記載のポリイオンコンプレックス。
- 親水性ブロックが、ポリエチレングリコールである、請求項1または2に記載のポリイオンコンプレックス。
- 温度感受性共重合体が、GLUT1リガンドで修飾された、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックス。
- 核酸が、生体適合性の疎水基で修飾されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックス。
- 核酸が、siRNAである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックス。
- 親水性ブロックとカチオン性ブロックと温度感受性ブロックとをこの順番で有する温度感受性共重合体を含んでなる、ポリイオンコンプレックスを作製するための組成物。
- カチオン性ブロックが、カチオン性アミノ酸ポリマーブロックである、請求項7に記載の組成物。
- 親水性ブロックが、ポリエチレングリコールである、請求項7または8に記載の組成物。
- 温度感受性共重合体が、グルコースで修飾された、請求項7〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスを該ポリイオンコンプレックス中の温度感受性共重合体の下限臨界溶液温度(LCST)以上の温度条件下にさらして得られる、核酸を含有するミセル。
- 請求項11に記載のミセルを含む、核酸送達用組成物。
- 請求項11に記載のミセルであって、温度感受性共重合体がグルコースで修飾された、ミセル。
- 請求項13に記載のミセルであって、ミセル中の温度感受性共重合体のグルコース修飾率が、15〜40%である、ミセル。
- 請求項13に記載のミセルであって、ミセル中の温度感受性共重合体のグルコース修飾率が、50〜100%である、ミセル。
- 請求項13または14に記載のミセルを含む、脳実質への核酸送達用組成物。
- 請求項13または15に記載のミセルを含む、脳血管内皮細胞への核酸送達用組成物。
- 請求項16または17に記載の脳への核酸送達用組成物であって、
組成物は、投与計画に従って対象に投与するための組成物であり、
投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することと、該対象において血糖値の上昇を誘発させることとを含む、組成物。
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