JP4992090B2 - 静電結合型高分子ベシクル - Google Patents
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Description
本発明は、水溶性でありかつ荷電したブロック共重合体により形成されるベシクルに関し、さらに詳しくは、薬物送達システム、各種材料として有用な機能を有するベシクルに関する。
一次構造が精密に制御された高分子は、自発的に組織化を生じ、高次構造体を形成しうることが知られている。その具体例としては、ミセル、ベシクルなどの構造体が挙げられる。このような高分子の自己組織化した構造体は、多様な分子設計が可能であり、高分子が本来有している性質に加えて、新たな機能を備えた構造体となり得る。このような高分子の自己組織化した構造体を利用することが、薬物送達システムや材料科学をはじめとする種々の分野において、従前検討されている。
また、本明細書において、特に断らない限り、基または基の一部としての「アルキル」または「アルコキシ」というという語は、基が直鎖状、分枝鎖状、または環状のアルキルまたはアルコキシを意味する。また、例えば「C1−12アルキル基」という場合の「C1−12」とは、該アルキル基の炭素数が1〜12個であることを意味する。
また、本明細書において、特に断らない限り、「アリール」とは、フェニル、ナフチル、アンスニルまたはピレニルを意味する。
また、本明細書において、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子を意味する。
また、本明細書において、アルキル基が「置換されていてもよい」とは、アルキル基上の1またはそれ以上の水素原子が1またはそれ以上の置換基(同一または異なっていてもよい)により置換されていてもよいことを意味する。置換基の最大数はアルキル上の置換可能な水素原子の数に依存して決定できることは当業者に明らかである。
またここで置換基は、ハロゲン原子、アリール基、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、シアノ基、ホルミル基、ジメチルアセタール化ホルミル基、ジエチルアセタール化ホルミル基、C1−6アルコキシカルボニル基、C2−7アシルアミド基、トリC1−6アルキルシロキシ基(ここで、C1−6アルキルは同一であっても異なっていてもよい)、シロキシ基およびシリルアミノ基からなる群から選択されるものである。
本発明によるベシクルは、水溶性でありかつ荷電した、二つのブロック共重合体の相互作用により形成される膜を含むことを一つの特徴とする。そして、ベシクルの膜を形成する二つのブロック共重合体のうち、第一のブロック共重合体は、非荷電親水性セグメントと、荷電性セグメントとを有するものであり、第二のブロック共重合体は、非荷電親水性セグメントと、第一のブロック共重合体における荷電性セグメントと反対の電荷に荷電した荷電性セグメントとを有するものである。
図1Aにおいて、第一のブロック共重合体(a)は、非荷電親水性セグメント(c)と、正に荷電した荷電性セグメント(d)とを有し、一方、第二のブロック共重合体(b)は、非荷電親水性セグメント(e)と、負に荷電した荷電性セグメント(f)とを有する。そして、第一のブロック共重合体(a)と、第二のブロック共重合体(b)とは、電荷の相互作用が生じ得る系に置かれると自己集合し、図1Bに示される通り、荷電性セグメント(d、f)からなる、イオンコンプレックスの中間層(g)と、非荷電親水性セグメント(c、e)からなる二つの親水性層(h、i)とが形成され、この構造体(B)を膜とするベシクル(C)を生じる。
また、本発明によるベシクルは、非荷電親水性セグメントから構成される内層を有することから、その中央空隙に水性媒体を含むことができる。
第一のブロック共重合体に含まれる荷電性セグメントと、第二のブロック共重合体に含まれる荷電性セグメントとは、互いに反対の電荷に荷電することができる。これら二つの荷電性セグメントは通常ポリマーブロックにより構成されるが、これら荷電性セグメントの鎖長および電荷数が同等であることは、ベシクルの構造および大きさの安定性、均一性確保の観点から有利である。したがって、二つの共重合体における荷電性セグメントの鎖長および電荷数は、同一であることが好ましい。具体的には、第一のブロック共重合体に含まれる荷電性セグメントおよび第二のブロック共重合体に含まれる荷電性セグメントがそれぞれ、一価の電荷を有する繰り返し単位から構成されるポリマーブロックである場合、第一のブロック共重合体に含まれる荷電性セグメントにおける繰り返し単位の数と、二のブロック共重合体に含まれる荷電性セグメントにおける繰り返し単位の数との比は1:1であることが好ましい。荷電性セグメントにおける繰り返し単位および電荷数は、荷電性セグメントを構成するモノマー、および荷電性セグメントを製造する際の反応条件などを適宜選択することにより、調整することができる。
R1が、−(CH2)3NH2基または−CONH(CH2)s−Xを表し、かつsが0〜20であり、ここで、Xが、−NH2、ピリジル基、モルホリル基、1−イミダゾリル基、ピペラジニル基、4−(C1−6アルキル)−ピペラジニル基、4−(アミノC1−6アルキル)−ピペラジニル基、ピロリジン−1−イル基、N−メチル−N−フェニルアミノ基、ピペリジニル基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、−(CH2)tNH2、または−(NR9(CH2)o)pNHR10からなる群から選択される少なくとも一つのものであり、ここで、R9が水素原子またはメチル基を表し、R10が水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルオキシカルボニル基またはtert―ブトキシカルボニル基を表し、oが1〜5であり、pが1〜5であり、tが0〜15であり、
R2が、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基を表し、
aが0〜5,000であり、bが0〜5,000であり、かつa+bが2〜5,000である。)
R2が、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基を表し、
R3がそれぞれ独立してメチレン基またはエチレン基を表し、
cが0〜5,000であり、dが0〜5,000であり、かつc+dが2〜5,000である。)
ブロック共重合体が含む非荷電親水性セグメントとしては、例えば、ポリエチレングリコールをはじめとするポリアルキレングリコール、ポリ(2−イソプロピル−2−オキサゾリン)、ポリサッカライド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、及びそれらの誘導体などが挙げられる。上記の非荷電親水性フラグメントを含むことにより、ブロック共重合体は、水性溶液中で会合、沈殿することなく安定に存在し、効率的にベシクルを構築することができる。さらに、上記の非荷電親水性フラグメントを含むブロック共重合体によって構築されることにより、ベシクルは水性溶液中で安定した構造を保持することができる。
また、本発明の好ましい態様によれば、正に荷電しうる荷電性セグメントを有するブロック共重合体は、下記式(III)で表されるものである。
R1が、−(CH2)3NH2または−CONH(CH2)s−Xを表し、かつsが0〜20であり、ここで、Xが、−NH2、ピリジル基、モルホリル基、ピペラジニル基、1−イミダゾリル基、4−(C1−6アルキル)−ピペラジニル基、4−(アミノC1−6アルキル)−ピペラジニル基、ピロリジン−1−イル基、N−メチル−N−フェニルアミノ基、ピペリジニル基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、−(CH2)tNH2、または−(NR9(CH2)o)pNHR10からなる群から選択される少なくとも一つのものであり、ここで、R9が水素原子またはメチル基を表し、R10が、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルオキシカルボニル基またはtert―ブトキシカルボニル基を表し、oが1〜5であり、pが1〜5であり、tが0〜15であり、
R2が、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基を表し、
R4が水素原子または置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖のC1−12アルキル基を表し、
R5が−(CH2)gNH−を表し、かつgが0〜5であり、
aが0〜5,000であり、bが0〜5,000であり、かつa+bが2〜5,000であり、
eが5〜2,500である。)
R1が、−(CH2)3NH2または−CONH(CH2)s−Xを表し、かつsが0〜20であり、ここで、Xが−NH2、ピリジル基、モルホリル基、1−イミダゾリル基、ピペラジニル基、4−(C1−6アルキル)−ピペラジニル基、4−(アミノC1−6アルキル)−ピペラジニル基、ピロリジン−1−イル基、N−メチル−N−フェニルアミノ基、ピペリジニル基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、−(CH2)tNH2、または−(NR9(CH2)o)pNHR10からなる群から選択される少なくとも一つのものであり、ここで、R9が水素原子またはメチル基を表し、R10が、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルオキシカルボニル基またはtert―ブトキシカルボニル基を表し、oが1〜5であり、pが1〜5であり、tが0〜15であり、
R2が、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基を表し、
R6が、水素原子または置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖のC1−12アルキル基を表し、
R7が−(CH2)hNH−を表し、かつhが0〜5であり、
R8が直鎖または分岐鎖のC1−12アルキル基を表し、
aが0〜5,000であり、bが0〜5,000であり、かつa+bが2〜5,000であり、
fが5〜2,500である。)
R2が、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基を表し、
R3がそれぞれ独立してメチレン基またはエチレン基を表し、
R4が水素原子または置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖のC1−12アルキル基を表し、
R5が−(CH2)gNH−を表し、かつgが0〜5であり、
cが0〜5,000であり、dが0〜5,000であり、かつc+dが2〜5,000であり、
iが5〜2,500である。)
R2が、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基を表し、
R3がそれぞれ独立してメチレン基またはエチレン基を表し、
R6が水素原子または置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖のC1−12アルキル基を表し、
R7が−(CH2)hNH−を表し、かつhが0〜5であり、
R8が直鎖または分岐鎖のC1−12アルキル基を表し、
cが0〜5,000であり、dが0〜5,000であり、かつc+dが2〜5,000であり、
jが5〜2,500である。)
本発明の好ましい態様によれば、第一のブロック共重合体が、ポリエチレングリコールまたはポリ(2−イソプロピル−2−オキサゾリン)から構成される非荷電親水性セグメントと、上記式(I)で表される荷電性セグメントとを有するものであり、第二のブロック共重合体が、ポリエチレングリコールまたはポリ(2−イソプロピル−2−オキサゾリン)から構成される非荷電親水性セグメントと、上記式(II)で表される荷電性セグメントとを有するものである。
本発明によるベシクルは、その中央空隙に化合物を内包することができる。本発明によるベシクルはまた、その膜に化合物を挿入することができる。上記化合物は、ベシクルの用途およびその性質に応じて適宜選択することができるが、例えば、薬物、タンパク質、蛍光色素、核酸、微粒子などが挙げられる。
ブロック共重合体の合成(1)
本発明におけるブロック共重合体の製造方法の一例として、スキームAにおいて、負に荷電しうるブロック共重合体であるポリエチレングリコール−ポリ(α,β−アスパラギン酸)ブロック共重合体(VIII)、および正に荷電しうるブロック共重合体であるポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体のアミノ化体(IX)の製造方法について説明する。
まず、負に荷電しうるブロック共重合体である、ポリエチレングリコール−ポリ(α,β−アスパラギン酸)ブロック共重合体について説明する。
β−ベンジル−L−アスパルテート−N−カルボン酸無水物を、片末端一級アミノ基のポリエチレングリコールを開始剤として重合する。次に、得られたポリエチレングリコール−ポリβ−ベンジル−アスパルテート共重合体(VII)をアルカリ処理して脱ベンジル化を行うことによりポリエチレングリコール−ポリ(α,β−アスパラギン酸)ブロック共重合体(VIII)を得る。
上記スキームAにおけるポリエチレングリコール−ポリβ−ベンジル−アスパルテート共重合体(VII)と、2HN−R−NH2(ここで、Rは−(CH2)2〜5−である)で表されるアミンとを、DMFなどの溶媒中にて反応させ、さらにHClなどを用いて酸付加させることにより、ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体のアミノ化体(IX)が得られる。
また、本発明におけるブロック共重合体の別の一例である、負に荷電しうるブロック共重合体であるポリ(2−イソプロピル−2−オキサゾリン)−ポリ(α,β−アスパラギン酸)ブロック共重合体(XI)、および正に荷電しうるブロック共重合体であるポリ(2−イソプロピル−2−オキサゾリン)−ポリ(L−リシン)ブロック共重合体(XIII)の製造方法について説明する。
まず、負に荷電したブロック共重合体である、ポリ(2−イソプロピル−2−オキサゾリン)−ポリ(α,β−アスパラギン酸)ブロック共重合体についてスキームBにて説明する。
また、正に荷電したブロック共重合体である、ポリ(2−イソプロピル−2−オキサゾリン)−ポリ(L−リシン)ブロック共重合体についてスキームCにて説明する。
本発明によるベシクルは、ブロック共重合体間の静電相互作用を利用して形成されることから、第一のブロック共重合体と第二のブロック共重合体とを、水性溶液中で混合することにより、簡易に製造することができる。さらに、本発明による製造方法によれば、有機溶媒を用いなくともベシクルを製造しうることから、バイオマテリアルの分野やDDSにおいて有利に利用することができる。
pHの調整は、水性溶液における溶媒としてバッファーを用いることにより簡易に行うことができる。第一および第二の水性溶液のpHを調整して用いることは、ブロック共重合体の荷電状態を保持し、効率的にベシクルを形成するために有利である。
1−1:ポリエチレングリコール−ポリ(β−ベンジル−L−アスパルテート)(PEG−PBLA)の合成
200ml ナスフラスコにPEG−NH2(分子量2000) 250mg (0.125mmol)を加え、ベンゼンを加えて溶液を得た。この溶液の凍結乾燥を行い、水分の除去を行った。次にナスフラスコ内部をArガスにて置換し、シリンジを用いてDMF/CH2Cl2 = 1:4の混合溶媒5mlを加え、PEG−NH2溶液を得た。また、別の100ml ナスフラスコに、β−ベンジル−L−アスパラテート N−カルボン酸無水物(BLA−NCA)2.5g (10.6mmol:85eq)を加え、さらに、DMF3ml、CH2Cl2 50mlを加えて溶液を得た。この溶液を、シリンジを用いてPEG−NH2溶液の入ったナスフラスコへ撹拌しながら加えた。次に、溶液の入ったナスフラスコを35℃の恒温漕に漬け、溶液を撹拌しながら2日間反応させた。IRによりNCA固有のピークの消失を確認した後、反応液中に5倍量程度のエーテルを加えて、沈殿物を得た。この沈殿をろ過し、エーテルで数回洗浄した。次に、沈殿物をベンゼンにより凍結乾燥を行い、PEG−PBLAを得た。
PEG−PBLA 200mgを200mLナスフラスコ中にてベンゼンに溶解し、凍結乾燥行った。次に、上記ナスフラスコに DMF8mlを加え撹拌し、さらに蒸留精製した1,5−ジアミノペンタン 3.2ml (0.89mol)を加え、40℃にて2日間撹拌した。反応液を氷冷し、この溶液に10%酢酸溶液16mlを加えた。次に、この反応液を透析チューブに入れ、0.01N HClを外液として2日間透析を行った。さらに、蒸留水を外液と数回透析を行った。内液を回収した後、凍結乾燥を行い,PEG−PeDAを白色固体として得た。
10mM Tris/HCl(pH7.4)をバッファーとし、PEG−PeDAとPEG−PAspをそれぞれ、1mg/mlに調製した。PEG−PeDA溶液およびPEG−PAsp溶液中の電荷数が等しくなるように溶液を量り取りPEG−PeDA/PEG−PAsp(w/w)=1.62)、それぞれの溶液を0.22μmのメンブランフィルターにて濾過し、得られた二つの溶液を混合し、撹拌した後、室温にて静置した。
10mM Tris/HCl(pH7.4)をバッファーとし、PEG−PeDAとPEG−PAspをそれぞれ、1mg/mlに調製した。蛍光色素FITCをラベル化した分子量42000のデキストランをPEG−PAsp溶液に1.5μg/mlの濃度で加えて溶解させた。次に、PEG−PeDA溶液およびPEG−PAsp溶液中の電荷数が等しくなるように溶液を量り取り(PEG−PeDA/PEG−PAsp(w/w)=1.62)、それぞれの溶液を0.22μmのメンブランフィルターにて濾過し、得られた二つの溶液を混合し、撹拌した後、室温にて静置した。
1−4にて得られた溶液をスライドガラス上に滴下し、カバーガラスをかけそのまま暗視野顕微鏡にて観察した。結果は図2に示される通りであった。約1〜10μmの球状集合体による散乱光が観察され、その集合体は中空構造を有していた。
1−5にて得られた溶液をガラスプレート上に滴下し、共焦点顕微鏡にて観察したところ、結果は図3に示される通りであった。約1〜10μmの球状集合体が観察された。さらに、その球状集合体の内相にFITCによる蛍光発光が観察され、集合体は中空構造を有し、かつ内水相の空間にFITC−デキストランが存在することが確認された。
2−1: ポリ(2−イソプロピル−2−オキサゾリン)−ポリ(ε(ベンジルオキシカルボニル)−L−リシン)(PiPrOx−PLys(Z))の合成
ポリ(2−イソプロピル−2−オキサゾリン)−NH2(PiPrOx−NH2)20mg (0.44 x 10−2mmol)をナスフラスコに量り取り、ベンゼンに溶解し、凍結乾燥した。次に、ナスフラスコをAr置換し、DMF1mlを加えた。また、別のナスフラスコに、PiPrOx−NH2に対し80ユニット相当量(107.8mg, 0.352mmol)のε(ベンジルオキシカルボニル)−L−リシン N−カルボキン酸無水物(Lys(Z)−NCA)を、Ar下にて量り取り、DMFを加え(1ml)溶解させた。得られた溶液を、シリンジを用いてPiPrOx-NH2の入ったナスフラスコへ撹拌しながら加えた。次に、溶液の入ったナスフラスコを37.5 ℃の恒温槽に浸け、溶液を撹拌しながら4日反応させた。IRにてNCA固有のピークの消失を確認した後、反応液を10倍量程度のへキサン中に滴下し、沈殿物を得た。この沈殿を濾過し、へキサンで数回洗浄した。次に、沈殿物をナスフラスコに移し、真空乾燥した後、ベンゼンを用いて凍結乾燥を行い、PiPrOx−PLys(Z)を得た。
2−1にて得られたPiPrOx−PLys(Z)100 mgにトリフルオロ酢酸(TFA)5mlを加え攪拌して溶液を得た。次に、この溶液に30% HBr/AcOH 10 mlを加え、1.5時間攪拌した。得られた溶液を、その15倍量程度のヘキサン中に滴下し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を濾過し、ヘキサンにて洗浄した。次に、沈殿物を水に溶解し、透析チューブ(MWCO 3500)に入れ、蒸留水を外液として透析を行った。外液を数回交換し、外液のpHがほぼ中性になった後、内液を回収し、凍結乾燥を行い、PiPrOx−P(Lys)を得た。
PiPrOx-NH2 20 mg(0.44× 10-2 mmol)をナスフラスコに量り取り、ベンゼンに溶解し凍結乾燥した。このナスフラスコをArにて置換し、CH2Cl2 1mLを加えた。次に、PiPrOx-NH2に対し80ユニット相当量(88 mg, 3.2 x 10-4 mol)のBLA−NCAを、Ar下にて別のナスフラスコに量り取り、CH2Cl2 1mLを加え、溶解した。得られた溶液をシリンジでPiPrOx-NH2のナスフラスコへ撹拌しながら加えた。このナスフラスコを37.5 ℃の恒温槽に浸け、溶液を撹拌しながら3日反応させた。IRでNCA固有のピークの消失を確認した後、反応液を10倍量程度のへキサン中に滴下し、沈殿物を得た。沈殿物を濾過し、へキサンにて数回洗浄した。さらに、沈殿物をナスフラスコに移し、真空乾燥した後、ベンゼンを用いて凍結乾燥を行い、PiPrOx−PBLAを得た。
1−2と同様の手法により、ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸(PEG-PAsp)を得た。
PiPrOx-P(lys)およびPEG-PAspを用い、1−4と同様の手法により、ベシクルを製造した。
2−5にて得られた溶液をスライドガラス上に滴下し、カバーガラスをかけそのまま観察した。暗視野顕微鏡にて観察したところ、結果は図4に示される通りであった。約1〜10μmの球状集合体が存在し、その集合体は中空構造を有していた。
2−5にて得られた溶液をホルムバール支持膜を張ったCuグリッド上に滴下し、さらに酢酸ウランを微量滴下し、余分な水分を濾紙により吸い取った後に乾燥させグリッドを作製した。透過型電子顕微鏡にて観察したところ、結果は図5に示される通りであった。約100nm〜10μmの球状集合体が存在し、その集合体は膜を有した中空構造を有していた。
3−1:生理食塩水濃度のNacl存在下におけるPEG−PeDAとPEG−PAspによるベシクルの形成
生理食塩水濃度である150mMのNaClを含む10mM Tris/HCl(pH7.4)のバッファーを用いて、PEG−PeDAとPEG−PAspをそれぞれ、1mg/mlに調製した。次に、蛍光色素FITCをラベル化した分子量42000のデキストランをPEG−PAsp溶液に1mg/mlの濃度で加えて溶解させた。次に、PEG−PeDA溶液およびPEG−PAsp溶液中の電荷数が等しくなるように溶液を量り取り(PEG−PeDA/PEG−PAsp(w/w)=1.62)、それぞれの溶液を0.22μmのメンブランフィルターにて濾過し、得られた二つの溶液を混合し、撹拌した。次に、得られた溶液を20分間の超音波処理した後、室温にて静置した。次に、この溶液をバッファーで100倍に希釈して溶液を得た。
3−1にて得られた溶液をガラスプレート上に滴下し、共焦点顕微鏡にて観察した。その結果、図6に示される通り、約1〜10μmの球状集合体が観察された。また、球状集合体の内相にはFITCによる蛍光発光が観察された。
さらに、上記溶液を室温で三ヶ月以上静置した後、共焦点顕微鏡による観察を行ったところ、上記球状集合体はその形態を保持していた。この結果から、上記球状集合体は約10μMOsmのコロイド浸透圧の存在下、その構造を室温で三ヶ月以上保持することが確認された。
分子量の異なる蛍光色素を用いたベシクルの膜透過性の確認
4−1:蛍光色素溶液のベシクルへの添加
分子量443.5の蛍光色素テトラメチルローダミンイソシアネート(TRITC)およびTRITCをラベル化した分子量約70000のデキストランをそれぞれ、150mMのNaClを含む10mM Tris/HCl(pH7.4)のバッファーに溶解させた。次に、得られた2種類の溶液900μLをそれぞれ、3−1にて得られたFITCを内包する球状集合体を含む溶液100μLに加えた。
4−1にて得られた溶液をそれぞれガラスプレート上に滴下し、共焦点顕微鏡にて観察した。
TRITCをラベル化したデキストランの溶液を加えた場合、図7に示される画像が得られた。図7において、球状集合体の内相ではFITCの緑色の蛍光が観察され、球状集合体の外相ではTRITCの赤色の蛍光が観察された。一方、TRITCの溶液を加えた場合、図8に示される画像が得られた。図8において、球状集合体の内相ではFITCの緑色とTRITCの赤色とが重なった黄色の蛍光が観察された。
図7および図8に示される通り、TRITCをラベル化したデキストランは球状集合体の内相へ透過せず、上記デキストランより低分子量のTEITCは球状集合体の内相へ透過しており、球状集合体の膜は半透過性を示すことが確認された。
血清存在下におけるPEG−PeDAおよびPEG−PAspからなるベシクルの安定性の確認
6−1:ベシクルの調製および血清の添加
生理食塩水濃度である150mMのNaClを含む10mM Tris/HCl(pH7.4)のバッファーを用い、PEG−PeDAとPEG−PAspをそれぞれ、1mg/mlに調製した。PEG−PeDA溶液およびPEG−PAsp溶液中の電荷数が等しくなるように溶液を量り取った(PEG−PeDA/PEG−PAsp(w/w)=1.62)。次に、それぞれの溶液を0.22μmのメンブランフィルターにて濾過し、得られた二つの溶液を混合し、撹拌した後、室温にて静置した。この混合溶液90μLに10μLのウシ胎児血清を加え、再び撹拌した後、37℃にて静置した。
6−1にて得られた溶液を1日静置した後、ガラスプレート上に滴下し、暗視野顕微鏡にて観察した。図9に示される通り、約1〜5μmの球状集合体が存在し、その集合体は中空構造を有していた。この結果、10%の血清が存在する溶液中において、球状集合体は中空構造を保持することが確認された。
Claims (21)
- 非イオン性の非荷電親水性セグメントと、正イオンに荷電した荷電性セグメントとを有する第一のブロック共重合体と、非イオン性の非荷電親水性セグメントと、負イオンに荷電した荷電性セグメントとを有する第二のブロック共重合体とにより形成された膜を含む、ベシクル。
- 前記膜が、外層、中間層、および内層からなる三層構造を有し、前記第一のブロック共重合体の荷電性セグメントと、前記第二のブロック共重合体の荷電性セグメントとが静電相互作用により結合し、該荷電性セグメントが中間層を構成し、前記非荷電親水性セグメントが前記外層および内層を構成する、請求項1に記載のベシクル。
- 第一のブロック共重合体または第二のブロック共重合体のいずれかの非荷電親水性セグメントが前記外層を形成し、該外層を形成していない、他方のブロック共重合体の非荷電親水性セグメントが前記内層を形成する、請求項2に記載のベシクル。
- 前記第一のブロック共重合体の非荷電親水性セグメントおよび第二のブロック共重合体の非荷電親水性セグメントが、ポリエチレングリコールおよび/またはポリ(2−イソプロピル−2−オキサゾリン)である、請求項1に記載のベシクル。
- 前記第一のブロック共重合体の荷電性セグメントが、下記式(I)で表されるものである、請求項1に記載のベシクル。
R1が、−(CH2)3NH2または−CONH(CH2)s−Xを表し、かつsが0〜20であり、ここで、Xが、−NH2、ピリジル基、モルホリル基、1−イミダゾリル基、、ピペラジニル基、4−(C1−6アルキル)−ピペラジニル基、4−(アミノC1−6アルキル)−ピペラジニル基、ピロリジン−1−イル基、N−メチル−N−フェニルアミノ基、ピペリジニル基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、−(CH2)tNH2、または−(NR9(CH2)o)pNHR10からなる群から選択される少なくとも一つのものであり、ここで、R9が水素原子またはメチル基を表し、R10が、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルオキシカルボニル基またはtert―ブトキシカルボニル基を表し、oが1〜5であり、pが1〜5であり、tが0〜15であり、
R2が、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基を表し、
aが0〜5,000であり、bが0〜5,000であり、かつa+bが2〜5,000である。) - R1が−CONH(CH2)S−NH2を表し、かつsが2〜5であり、
R2が水素原子を表し、
aが0〜200であり、bが0〜200であり、かつa+bが10〜200である、請求項5に記載のベシクル。 - 前記第二のブロック共重合体の荷電性セグメントが、下記式(II)で表されるものである、請求項1に記載のベシクル。
R2が、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基を表し、
R3がそれぞれ独立してメチレン基またはエチレン基を表し、
cが0〜5,000であり、dが0〜5,000であり、かつc+dが2〜5,000である。) - R2が水素原子を表し、
R3がメチレン基を表し、
cが0〜200であり、dが0〜200であり、かつc+dが10〜200である、請求項7に記載のベシクル。 - 第一のブロック共重合体が、下記式(III)で表されるものである、請求項1に記載のベシクル。
R1が、−(CH2)3NH2または−CONH(CH2)s−Xを表し、かつsが0〜20であり、ここで、Xが、−NH2、ピリジル基、モルホリル基、1−イミダゾリル基、ピペラジニル基、4−(C1−6アルキル)−ピペラジニル基、4−(アミノC1−6アルキル)−ピペラジニル基、ピロリジン−1−イル基、N−メチル−N−フェニルアミノ基、ピペリジニル基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、−(CH2)tNH2、または−(NR9(CH2)o)pNHR10からなる群から選択される少なくとも一つのものであり、かつR9が水素原子またはメチル基を表し、R10が、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルオキシカルボニル基またはtert―ブトキシカルボニル基を表し、oが1〜5であり、pが1〜5であり、tが0〜15であり、
R2が、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基を表し、
R4が水素原子または置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖のC1−12アルキル基を表し、
R5が−(CH2)gNH−を表し、かつgが0〜5であり、
aが0〜5,000であり、bが0〜5,000であり、かつa+bが2〜5,000であり、
eが5〜2,500である。) - R1が−CONH(CH2)S−NH2を表し、かつsが2〜5であり、
R2が水素原子を表し、
R4がメチル基を表し、
aが0〜200であり、bが0〜200であり、かつa+bが10〜200であり、
eが10〜300である、請求項9に記載のベシクル。 - 第一のブロック共重合体が、下記式(IV)で表されるものである、請求項1に記載のベシクル。
R1が、−(CH2)3NH2または−CONH(CH2)s−Xを表し、かつsが0〜20であり、ここで、Xが−NH2、ピリジル基、モルホリル基、1−イミダゾリル基、ピペラジニル基、4−(C1−6アルキル)−ピペラジニル基、4−(アミノC1−6アルキル)−ピペラジニル基、ピロリジン−1−イル基、N−メチル−N−フェニルアミノ基、ピペリジニル基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、−(CH2)tNH2、または−(NR9(CH2)o)pNHR10からなる群から選択される少なくとも一つのものであり、ここで、R9が水素原子またはメチル基を表し、R10が、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルオキシカルボニル基またはtert―ブトキシカルボニル基を表し、oが1〜5であり、pが1〜5であり、tが0〜15であり、
R2が、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基を表し、
R6が、水素原子または置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖のC1−12アルキル基を表し、
R7が−(CH2)hNH−を表し、かつhが0〜5であり、
R8が直鎖または分岐鎖のC1−12アルキル基を表し、
aが0〜5,000であり、bが0〜5,000であり、かつa+bが2〜5,000であり、
fが5〜2,500である。) - R1が−(CH2)3NH2を表し、
R2が水素原子を表し、
R6がメチル基を表し、
R8が−CH(CH3)2を表し、
aが0〜200であり、bが0〜200であり、かつa+bが10〜200であり、
fが10〜300である、請求項11に記載のベシクル。 - 第二のブロック共重合体が、下記式(V)で表されるものである、請求項1に記載のベシクル。
R2が、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基を表し、
R3がそれぞれ独立してメチレン基またはエチレン基を表し、
R4が水素原子または置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖のC1−12アルキル基を表し、
R5が−(CH2)gNH−を表し、かつgが0〜5であり、
cが0〜5,000であり、dが0〜5,000であり、かつc+dが2〜5,000であり、
iが5〜2,500である。) - R2が水素原子を表し、
R3がメチレン基を表し、
R4がメチル基を表し、
cが0〜200であり、dが0〜200であり、かつc+dが10〜200であり、
iが10〜300である、請求項13に記載のベシクル。 - 第二のブロック共重合体が、下記式(VI)で表されるものである、請求項1に記載のベシクル。
R2が、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基を表し、
R3がそれぞれ独立してメチレン基またはエチレン基を表し、
R6が水素原子または置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖のC1−12アルキル基を表し、
R7が−(CH2)hNH−を表し、かつhが0〜5であり、
R8が直鎖または分岐鎖のC1−12アルキル基を表し、
cが0〜5,000であり、dが0〜5,000であり、かつc+dが2〜5,000であり、
jが5〜2,500である。) - R2が水素原子を表し、
R3がメチレン基を表し、
R6がメチル基を表し、
R8が−CH(CH3)2を表し、
cが0〜200であり、dが0〜200であり、かつc+dが10〜200であり、
jが10〜300である、請求項15に記載のベシクル。 - 前記第一のブロック共重合体が請求項9に記載の式(III)で表されるブロック共重合体であり、前記第二のブロック共重合体が請求項13に記載の式(V)で表されるブロック共重合体である、請求項1に記載のベシクル。
- 前記第一のブロック共重合体が請求項11に記載の式(IV)で表されるブロック共重合体であり、前記第二のブロック共重合体が請求項13に記載の式(V)で表されるブロック共重合体である、請求項1に記載のベシクル。
- 前記第一のブロック共重合体が請求項9に記載の式(III)で表されるブロック共重合体であり、前記第二のブロック共重合体が請求項15に記載の式(VI)で表されるブロック共重合体である、請求項1に記載のベシクル。
- 前記第一のブロック共重合体が請求項11に記載の式(IV)で表されるブロック共重合体であり、前記第二のブロック共重合体が請求項15に記載の式(VI)で表されるブロック共重合体である、請求項1に記載のベシクル。
- 化合物を内包するものである、請求項1に記載のベシクル。
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