KR101468268B1 - 약물 내포 액티브 타겟형 고분자 미셀, 의약 조성물 - Google Patents

약물 내포 액티브 타겟형 고분자 미셀, 의약 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 정상 세포를 손상시킬 수 있는 부적절한 약물 방출이 방지된, 약물 내포 액티브 타겟형 고분자 미셀을 제공한다. 표적 결합 부위(11)을 가지는 골격 폴리머 유닛(10)과, 약물(14)을 가지고 표적 결합 부위(11)를 갖지 않는 골격 폴리머 유닛(20)을 포함하고, 이들 유닛(10,20)이, 표적 결합 부위(11)를 외측으로 향하게 함과 더불어 약물(14)을 내측으로 향하게 한 상태에서 방사상으로 배열하고 있고, i) 방사상의 배열을 유지한 상태로 표적(40)에 결합한 경우, 엔도사이토시스에 의해 표적(40)을 공급하는 세포(50)의 내부에 끌어들여져, 세포(50) 내에서 방사상의 배열이 붕괴함으로써 약물(14)이 세포(50) 내로 방출되고, ⅱ) 표적(40)으로의 결합 이전에 혈액(60) 중에서 방사상의 배열이 붕괴한 경우, 대사(代謝)에 의해 유닛(20)이 체외로 배출됨으로써, 약물(14)이 정상세포에 손상을 줄 수 있는 것이 방지된, 고분자 미셀(100)로 한다.

Description

약물 내포 액티브 타겟형 고분자 미셀, 의약 조성물 {ACTIVE TARGETING TYPE POLYMERIC MICELLE CARRYING DRUG ENCLOSED THEREIN AND MEDICINAL COMPOSITION}
본 발명은, 종양 세포, 염증 세포, 면역 담당 세포, 신생 혈관 및 혈관 내피와 같은 투약 대상물에 지향성을 가지는, 액티브 타겟형인 약물 내포 고분자 미셀과, 당해 미셀을 이용한 의약 조성물에 관한 것이다.
경구나 정맥 내 주사에 의해 약물을 전신 투여하면, 투약 대상물로서의 병소부위뿐만 아니라, 정상 조직에도 약물이 공급된다. 이 결과, 약물 투여에 의한 부작용이 인지되어, 치료 방법의 변경이나 중단이 필요하게 되는 경우가 있다. 부작용의 저감을 목적으로 하여, 투약 대상물의 고유의 수용체, 리간드 및 효소와 같은 분자 마커(marker)에 특이적으로 결합하는 능력을 가진, 분자 표적약으로 불리는 약물이 개발되어 있다(비특허 문헌 1 참조). 그러나, 현재로서는, 이러한 분자 표적약은, 게피티니브(Gefitinib)의 투여에 의한 간질성 폐렴(interstitial pneumonitis)의 발생 사례로서 알려져 있는 바와 같이 부작용을 충분히는 저감시킬 수 없고, 나아가 병소 부위에 대한 치료 효과도 충분하지 않다.
약물을 투약 대상물에 선택적으로 공급함과 더불어, 투약 대상물의 근방에 있어서 최적의 약물 농도를 유지하는 관점에서, 약물전달시스템(drug delivery system, DDS)으로 불리는 기술이 주목받고 있다. 특허 문헌 1은, 약물 및 리간드가 합성 폴리머에 결합한 상태에 있는, 액티브 타겟형의 고분자 컨쥬게이트 DDS를 개시한다.
<특허 문헌 1> 국제 공개 제2002/087497호 팜플렛
<비특허 문헌 1> Asahina H, Yamazaki K, Kinoshita I, et al., British Journal of Cancer, 95, 2006, p.p. 998－1004
부작용을 저감시키는 관점에서는, 투약 대상물에 적절히 송달되지 않은 약물이, 정상 세포를 손상시키기 전에 체내로부터 제거되는 것이 바람직하다. 특허 문헌 1에 기재된 고분자 컨쥬게이트는, 1개의 합성 폴리머쇄에 약물과 리간드가 결합하고 있으므로, 대응하는 수용체(receptor)에 결합하면서도 투약 대상물로서의 세포내에 끌어들여지지 않은 경우, 약물이 혈중에 계속 폭로되게 된다. 이 때문에, 이러한 종래형의 액티브 타겟형 DDS에는, 부작용을 저감시키기 위해, 아직 개선의 여지가 남아 있다.
본 발명은, 표적 결합 부위를 가지는 골격 폴리머 유닛 α와, 약물을 가지고 상기 표적 결합 부위를 갖지 않는 골격 폴리머 유닛 β를 포함하고, 상기 골격 폴리머 유닛 α 및 골격 폴리머 유닛 β가, 상기 표적 결합 부위를 외측으로 향하게 함과 더불어 상기 약물을 내측으로 향하게 한 상태에서 방사상으로 배열하고 있고, i) 상기 방사상의 배열을 유지한 상태에서 표적에 결합한 경우, 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 당해 표적을 공급하는 세포의 내부에 끌어들여져, 상기 세포 내에서 상기 방사상의 배열이 붕괴함으로써 상기 약물이 당해 세포 내로 방출되고, ⅱ) 표적으로의 결합 이전에 혈중(血中)에서 상기 방사상의 배열이 붕괴한 경우, 대사(代謝)에 의해 상기 골격 폴리머 유닛 β가 체외로 배출됨으로써, 상기 약물이 정상 세포에 손상을 줄 수 있는 것이 방지된, 약물 내포 액티브 타겟형 고분자 미셀을 제공한다.
본 명세서에 있어서, 골격 폴리머 유닛 α가 함유하는 표적 결합 부위란, 생체 및 바이러스에 유래하는 물질에 대해 특이적으로 결합하여 당해 물질과 생물학적 결합쌍을 형성할 수 있는, 생물학적 인식 기능을 가지는 부위를 의미한다. 생체 및 바이러스에 유래하는 물질로는, 생체 세포, 세균, 진균 및 바이러스에 존재하는 분자를 예시할 수 있다. 생체 세포로는, 종양 세포 및 신생 혈관 세포 및 이들 주변 세포, 면역 담당 세포(예를 들면 B세포), 염증 세포(예를 들면 백혈구), 혈관 내피 세포, 각종 장기를 구성하는 세포를 예시할 수 있다. 골격 폴리머 유닛 α는, 이러한 물질과 결합쌍을 형성하는 단백질, 펩티드 및 당쇄(糖鎖)와 같은 화합물을 함유함으로써, 표적 결합 부위를 함유한 상태에 있어도 된다.
본 발명은, 다른 측면에서, 상기의 고분자 미셀과, 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물을 제공한다.
본 발명에서는, 약물과 표적 결합 부위를 각각의 폴리머 유닛에 함유시킴으로써, 투약 대상물로서의 세포에 끌어들여지기 전에 미셀 구조가 붕괴한 경우에는 약물을 대사에 의해 체외로 배출할 수 있다고 하는 안전 기구를 미셀에 도입하기로 했다. 이에 따라, 종래형의 액티브 타겟형 DDS에 비해, 부작용의 발생을 회피하기 쉬워진다.
도 1은 본 발명의 고분자 미셀에 의한 암세포의 손상 작용에 관한 데이터의 일례를 나타내기 위한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 고분자 미셀에 의한 암세포의 손상 작용에 관한 데이터의 별도예를 나타내기 위한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 고분자 미셀의 투여에 의한 종양 체적의 경시 변화에 관한 데이터를 나타내기 위한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 고분자 미셀의 투여에 의한 피검 동물의 체중의 경시 변화에 관한 데이터를 나타내기 위한 그래프이다.
도 5는 약물 비함유 액티브 타겟형 고분자 미셀에 의한 암세포의 손상 작용에 관한 데이터의 일례를 나타내기 위한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 고분자 미셀의 구조 및 작용을 설명하기 위한 개념도이다.
본 발명의 고분자 미셀(100)은, 도 6의 a)에 나타내는 바와 같이, 골격 폴리머 유닛 α(10)와 골격 폴리머 유닛 β(20)를 가지고 있다. 골격 폴리머 유닛 α(10)는, 표적 결합 부위(11)를 가지는 화합물, 폴리에틸렌글리콜 사슬로 대표되는 친수성 폴리머 세그먼트(12), 및 폴리아미노산 사슬로 대표되는 소수성 폴리머 세그먼트(13)를 가지고 있다. 또한, 이후, 폴리에틸렌글리콜을 PEG로 표시하는 경우가 있다. 표적 결합 부위(11)는, 친수성 폴리머 세그먼트(12)에 결합하고 있다. 골격 폴리머 유닛 β(20)는, 약물(14), 폴리에틸렌글리콜 사슬로 대표되는 친수성 폴리머 세그먼트(12), 및 폴리아미노산 사슬로 대표되는 소수성(疎水性) 폴리머 세그먼트(13)를 가지고 있다. 약물(14)은, 소수성 폴리머 세그먼트(13)에 에스테르 결합 또는 아미드 결합하고 있다. 이와 같이, 골격 폴리머 유닛 α(10)는, 표적 결합 부위(11)를 가지는 한편, 약물(14)을 가지지 않고, 골격 폴리머 유닛 β(20)는, 약물(14)을 가지는 한편, 표적 결합 부위(11)를 가지지 않는다. 그리고, 골격 폴리머 유닛 α(10)와 골격 폴리머 유닛 β(20)는, 표적 결합 부위(11)를 외측으로 향하게 하고, 약물(14)을 내측으로 향하게 한 상태에서 방사상으로 배열하고 있다. 고분자 미셀(100)은, 도 6의 a)에 도시하는 바와 같이, 표적 결합 부위(11)도 약물(14)도 가지지 않는, 친수성 폴리머 세그먼트(12) 및 소수성 폴리머 세그먼트(13)로 이루어지는 골격 폴리머 유닛 γ(30)를 함유하고 있어도 된다.
본 명세서에 있어서, 골격 폴리머 유닛 α(10)와 골격 폴리머 유닛 β(20)가 방사상으로 배열하고 있다는 것은, 표적 결합 부위(11)를 외측으로 향하게 하고 약물(14)을 내측으로 향하게 하여 응집한 상태에 있으면 되고, 각 유닛의 배열의 기점이 한 점에 집중하고 있지 않은, 약간 무너진 방사상의 배열 구조를 가지는 미셀이어도 상관없다. 고분자 미셀(100)은, 골격 폴리머 유닛 α(10)와 골격 폴리머 유닛 β(20)에 의한 고분자 응집체가 건조 상태에 있는 것이어도 상관없다.
고분자 미셀(100)은, 도 6의 b)에 도시하는 바와 같이, 방사상의 배열을 유지한 상태에서 표적(40)에 결합한 경우, 표적(40)을 공급하는 세포(50)의 내부에 엔도사이토시스에 의해 끌어들여지고(도 6의 b)에 있어서 중앙에 표시한다), 그 후, 세포(50) 내에서 방사상의 배열이 붕괴함으로써, 내포하고 있던 약물(14)을 세포(50) 내로 방출한다고 생각된다. 보다 구체적으로는, 골격 폴리머 유닛 β(20)가, 세포(50) 내의 리소좀 내로 이행(移行)하고, 에스테라아제로 대표되는 효소에 의해 에스테르 결합이 절단됨으로써 약물(14)이 방출된다고 생각된다.
분자량이 수만 이하인 고분자는, 원칙적으로, 신장을 통해 신속하게 소변 중으로 배설되는 것이 알려져 있다. 이 때문에, 고분자 미셀(100)의 방사상의 배열이 도 6의 c)에 도시하는 바와 같이 투약 대상물에 끌어들여지기 전에 붕괴하여 혈액(60) 중에 약물(14)이 폭로되는 상태가 되어도, 분자량이 수만 이하인 골격 폴리머 유닛 β(20)는, 표적(40)에 고정되어 약물(14)을 혈액(60) 중에 계속 폭로시키지 않고, 대사에 의해 신속하게 체외로 배출되게 된다. 이렇게, 고분자 미셀(100)에는, 투약 대상물에 끌어들여지기 전에 미셀 구조가 붕괴해 버린 경우에 약물이 정상 세포에 손상을 주는 것을 방지하는 안전 기구가 도입된다.
골격 폴리머 유닛 α는, 일반식 Ｉ：Z－A1―B1로 표시되는, 표적 결합 부위를 가지는 화합물과 블록 공중합체로 이루어지고, 골격 폴리머 유닛 β는, 일반식 Ⅱ：A2－B2(－D)로 표시되는, 약물과 블록 공중합체로 이루어지는 것이 바람직하다. 다만, Z는 표적 결합 부위를 가지는 화합물이고, A1 및 A2는 서로 독립된 폴리에틸렌글리콜 사슬 세그먼트이며, B1 및 B2는 서로 독립된 폴리아미노산 사슬 세그먼트이고, D는 약물이다.
골격 폴리머 유닛 α는, 폴리에틸렌글리콜 사슬 세그먼트의 α말단에 하이드록실기, 카르복실기, 알데히드기, 아미노기, 머캅토기, 말레이미드기와 같은 연결기를 가지는 블록 공중합체와, 표적 결합 부위를 가지는 화합물을, 축합 또는 부가 반응시킴으로써 형성할 수 있다.
골격 폴리머 유닛 β의 폴리에틸렌글리콜 사슬 세그먼트의 α말단은, 하이드록실기와 같은 상기의 연결기를 가지고 있어도 되지만, 탄소수가 1∼12의 범위(C1－C12)에 있는 직쇄의 혹은 분기를 가지는 알킬기 또는 알콕시기, 혹은 수산기를 가지고 있는 것이 바람직하다.
폴리아미노산 사슬 세그먼트로는, 폴리글루탐산 또는 그 에스테르 혹은 아미드 유도체, 폴리아스파라긴산 또는 그 에스테르 혹은 아미드 유도체를 예시할 수 있다. 이러한 에스테르 또는 아미드 유도체는, 소수성 유기기를 가지는 대응하는 하이드록시 화합물 또는 아미노 화합물과, 폴리글루탐산 또는 폴리아스파라긴산의 반응성 유도체(예를 들면 에스테르)를 반응시킴으로써 형성할 수 있다. 소수성 유기기로는, 탄소수가 1∼6의 범위(C1―C6)에 있는 알킬페닐, 콜레스테롤, 직쇄의 또는 분기를 가지는 탄소수가 8∼18의 범위(C8－C18)에 있는 알킬을 예시할 수 있다.
골격 폴리머 유닛 α 및 골격 폴리머 유닛 β에 있어서의 블록 공중합체는, 예를 들면, 일본국 특개평 2－300133호 공보에 기재된 방법인, Y－PEG－CH2CH2CH2－NH2(Y는 보호되어도 되는 관능기 또는 치환기를 나타낸다)를 개시제로 하고, 탈수가 끝난 유기용매 중에서, N―카르복시―γ―벤질―L―글루타메이트 또는 N―카르복시―β―벤질―L―아스파테이트를 원하는 중합도가 되도록 첨가하여 반응시킴으로써 형성할 수 있다. 벤질기보다도 부피가 더 큰 소수기를 도입하는 경우는, C4 알킬페닐기, 콜레스테롤, C8∼C18의 알킬기로 벤질기를 치환하면 된다. 이러한 소수기는, 디시클로헥실카르보디이미드 및 디이소프로필카르보디이미드와 같은 축합제를 이용하여, 탈수가 끝난 유기용매 중에서, 수산기 또는 아미노기를 가지는 소수성 화합물을 폴리글루탐산 측쇄에 도입하면 된다.
골격 폴리머 유닛 α는, 하기 일반식 Ｉ-a 또는 일반식 Ｉ-b로 표시되는 구조를 가지고, 골격 폴리머 유닛 β는, 하기 일반식 Ⅱ-a 또는 일반식 Ⅱ-b로 표시되는 구조를 가지는 것이 바람직하다.
Figure 112011047195035-pat00001
Figure 112011047195035-pat00002
다만, R1은 표적 결합 부위를 가지는 화합물이고, R2는 수산기를 말단에 가져도 되는 탄소수 1∼12의 범위에 있는 알킬기이며, L1은 O(CH2)pNH이고, L2는 0(CH2)p-CO-이며, p는 1∼5의 범위에 있는 정수이고, R은 수소 원자 또는 소수성(疎水性) 유기기이며, q는 1 또는 2이고, n1 및 n2는 서로 독립하여 40∼450의 범위에 있는 정수이며, m1 및 m2는 서로 독립하여 20∼80의 범위에 있는 정수이고, R3는 총 수 m2의 적어도 10∼70%가 연결기를 가지고 있어도 되는 약물의 잔기이며, 존재하는 경우의 나머지 기가 수소 원자 또는 소수성 유기기이다.
n1 및 n2는, 공통되게, 40∼450의 범위에 있는 정수인 것이 바람직하고, 70∼350의 범위에 있는 정수인 것이 보다 바람직하며, 110∼280의 범위에 있는 정수인 것이 특히 바람직하다. m1 및 m2는, 공통되게, 20∼80의 범위에 있는 정수인 것이 바람직하고, 25∼50의 범위에 있는 정수인 것이 보다 바람직하다. n1, n2, m1, m2의 수치는 평균치이다.
고분자 미셀(100)에서는, 골격 폴리머 유닛 α(10)와 골격 폴리머 유닛 β(20)가, 몰비로, 1:19∼19：1의 범위에 존재한다.
표적 결합 부위(11)를 가지는 화합물로는, 상기와 같이, 생체 및 바이러스에 유래하는 물질과 결합쌍을 형성하는 단백질, 펩티드 또는 당쇄를 예시할 수 있다. 이러한 단백질로는, 생체 및 바이러스에 유래하는 물질과 결합하는 항체 및 그 단편, 트랜스페린(transferrin) 및 상피 성장 인자(EGF)를 예시할 수 있다. 항체로는, 암세포로 대표되는 투약 대상물의 표면에 고(高)발현하는 수용체나 세포 표면의 항원인, EGFR, Her2, CD20, VEGFR 및 CD52와 같은 항원을 인식하는 항체를 예시할 수 있다. 항체는 단일클론성 항체(monoclonal antibody)여도 되고 다클론성 항체(polyclonal antibody)여도 된다. 항체의 단편으로는, 항원을 특이적으로 인식할 수 있는 길이를 가지고 있는 것이면 되고, (Fab’) 2 및 Fab를 예시할 수 있다. 펩티드로는, 인슐린, LHRH, IGF 및 이들의 유도체를 예시할 수 있다. 당류로는, 글루코오스, 만노오스, 갈락토오스 및 푸코오스 잔기를 가지는 당류를 예시할 수 있다.
표적 결합 부위(11)를 가지는 화합물이 결합쌍을 형성해야할 표적(40)이 바이러스에 유래하는 물질인 경우, 당해 물질을 공급해야 하는 세포는, 감염된 바이러스에 의해 세포막이 파괴되어 세포사(細胞死)한 상태에 있으므로, 엔도사이토시스에 의해 고분자 미셀(100)을 세포 내로 끌어들일 수 없다. 따라서, 본 명세서에서는, 표적(40)이 바이러스에 유래하는 물질인 경우, 표적(40)의 주변에 존재하는 세포를, 표적(40)을 공급하는 세포로서 취급하기로 한다. 바이러스에 유래하는 물질이 세포외에 존재하는 경우, 이러한 주변의 세포도 바이러스에 감염되어 있을 가능성이 높기 때문에, 당해 주변 세포에 약물을 공급하는 의의가 있다.
약물(14)로는, 핵산 유도체, 도세탁셀(docetaxel), 캠토테신(camptothecin)류, 에포틸론(epothilone) A, 에포틸론 B, 에포틸론 C, 에포틸론 D 및 이들 에포틸론류의 유도체, 템시롤리무스(temsirolimus), 에버롤리무스(everolimus), 트라벡테딘(trabectedin), 보리노스탯(vorinostat), 아세트산 옥트레오타이드(octreotide), 미토산트론(mitoxantrone), 빈크리스틴(vincristine), 세팔렉신(cefalexin), 세파클러(cefaclor), 암피실린(ampicillin), 바캄피실린(bacampicillin), 아목시실린(amoxycillin), 카나마이신(kanamycin), 아미카신(amikacin), 아베카신(Arbekacin), 디베카신(dibekacin), 시소마이신(sisomicin), 토브라마이신(tobramycin), 에리트로마이신(erythromycin), 클래리트로마이신(clarithromycin), 로키타마이신(rokitamycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 반코마이신(vancomycin), 플루코나졸(fluconazole), 비다라빈(vidarabine), 아시클로버(acyclovir), 디다노신(didanosine), 지도부딘(zidovudine), 잘시타빈(zalcitabine), 라미부딘(lamivudine), 자나미비르(zanamivir), 오셀타미비르(oseltamivir), 로피나비르(lopinavir), 리토나비르(ritonavir)를 예시할 수 있다. 핵산 유도체로는, 젬시타빈(gemcitabine), 넬라라빈(nelarabine), 클로파라빈(clofarabine), 데시타빈(decitabine), 스트렙토조신(streptozocin), 독시플루리딘(doxifluridine), 플루다라빈(fludarabine)을 예시할 수 있다. 핵산 유도체는 염이어도 상관없지만, 에스테르 결합에 의해 골격 폴리머 유닛 β에 결합시키는 경우는, 염이 아닌 것이 바람직하다. 에포틸론류의 유도체로는, Patupilone, Ixabepilone, BMS-310705, KOS-862, ZK-EPO를 예시할 수 있다.
약물에 복수의 수산기가 존재하는 경우, 골격 폴리머 유닛 β는, 당해 수산기의 1개 이상이 폴리글루탐산 측쇄의 카르복실기에 에스테르 결합한 구조를 취할 수 있다. 본 명세서에서는, 1개의 약물이 폴리글루탐산 측쇄 중의 복수의 카르복실기에 에스테르 결합한 구조, 그리고 2개 이상의 블록 공중합체 부분이 1개의 약물을 통해 가교된 구조에 대해서도 골격 폴리머 유닛 β에 포함하여 취급하는 것으로 한다.
본 발명의 고분자 미셀은, 예를 들면, 골격 폴리머 유닛 α와 골격 폴리머 유닛 β를 수성 용액 중에서 혼합하고, 미셀상(狀)으로 자기조직화(self-assembly)시킴으로써 형성할 수 있다. 또한 예를 들면, 본 발명의 고분자 미셀은, 골격 폴리머 유닛 β와 골격 폴리머 유닛 γ를 수성 용액 중에서 혼합시켜 미셀상으로 자기조직화시킨 후, 표적 결합 부위를 가지는 화합물을 골격 폴리머 유닛 γ의 친수성 세그먼트의 α말단에 결합시킴으로써 형성할 수 있다. 수성 용액은, 예를 들면, 에탄올 및 디메틸술폭시드와 같은 수혼화성(water-compatible) 유기용매와, 공지의 완충제를 정제수에 첨가함으로써 형성할 수 있다. 서로 다른 표적 결합능을 가지는 복수종의 골격 폴리머 유닛 α와, 서로 다른 약물이 결합하고 있는 복수종의 골격 폴리머 유닛 β를 준비해 두면, 각각을 적절히 조합함으로써, 다양한 액티브 타겟형 약물 내포 고분자 미셀을 용이하게 형성할 수 있어 편리하다.
특허 문헌 1에 기재된 고분자 컨쥬게이트로 대표되는 종래형의 액티브 타겟형 DDS는, 약물이 에스테르 결합한 블록 공중합체에, 표적 결합 부위를 가지는 화합물을 결합시킴으로써 형성되어 있다. 그러나, 블록 공중합체에 약물을 결합시키는 과정에서, 블록 공중합체에 있어서의 표적 결합 부위를 가지는 화합물을 결합시켜야하는 관능기 또는 치환기가, 당해 화합물과의 결합능을 잃는 경우가 있다. 또한, 당해 화합물을 결합시키는 과정에서, 약물이 분해되어 버리는 경우가 있다. 이 때문에, 종래형의 액티브 타겟형 DDS는, 간편하게 조제하는 것이 어렵다. 한편, 상기와 같이, 본 발명의 고분자 미셀은, 약제의 실활(失活)을 회피하면서, 다양한 액티브 타겟형 약물 내포 고분자 미셀을 용이하게 형성할 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기의 고분자 미셀과, 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물을 제공할 수도 있다. 제약학적으로 허용되는 담체는, 목적으로 하는 투여제형에 따라, 당해 기술 분야에서 상용되고 있는 희석제 및 부형제여도 되지만, 비경구제인 약제, 동결 건조 제제의 조제에 적합한, 정제수, 탈이온수, 등장제 및 pH조정제가 바람직하다.
본 발명의 의약 조성물의 투여 루트는, 피하, 정맥, 동맥, 국소와 같은 비경구 투여가 바람직하고, 정맥 내 주사가 특히 바람직하다. 의약 조성물의 투여량은, 약물의 종류, 용법, 환자의 연령, 성별, 환자의 건강 상태에 따라 적절히 조정되어야 하지만, 약물 환산으로, 1일당, 0.1∼10000mg/㎡의 범위, 바람직하게는 1∼1000mg/㎡의 범위로 한다.
［실시예］
이하, 실시예에 의해, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
(실시예 1)
표적 결합 부위를 가지는 화합물로서 트랜스페린을 가지고, 약물로서 캠토테신(CPT)을 내포하는 고분자 미셀인, 트랜스페린 결합 캠토테신 미셀을, 다음과 같이 하여 형성했다.
우선, 골격 폴리머 유닛 β로서, 캠토테신 컨쥬게이트(PEG－pGlu－CPT)를, 다음과 같이 하여 형성했다. 1g의 PEG-pGlu-Ac를 80mL의 무수 디메틸포름아미드(무수 DMF)에 용해시킨 후, 387mg의 캠토테신(와코준야쿠)을 첨가했다. 또한, 이 PEG-pGlu-AC에 있어서의 PEG 사슬 길이는 12kDa이고, 아스파라긴산의 평균 잔기수는 40이며, 아스파라긴산의 측쇄는 카르복시산이다. 이어서, 823mg의 N,N’-디이소프로필카르보디이미드(고쿠산카가쿠)와, 136mg의 디메틸아미노피리딘(와코쥰야쿠)을 이 순서로 첨가하고, 4℃에서 3일간 교반하고, 실온으로 승온시켜 하룻밤 더 교반했다. 이렇게 하여 얻은 반응액을, 투석 튜브(Spectrum Laboratories, Spectra/Por(R) 분자량 컷오프 3500)로 옮겨, 정제수에 대해, 4℃에서 투석했다. 백색 침전을 제거한 후, 얻어진 황색 용액을 구멍직경 0.8㎛의 필터(밀리포어사 제 Millex(R)-AA)로 여과했다. 여과액을 동결건조시킴으로써, 담황색 분말인 1.1g의 PEG-pGlu-CPT를 얻었다. 이 PEG-pGlu-CPT는, 캠토테신이, PEG-pGlu에 에스테르 결합을 통해 결합한 상태(MeO-PEG-pGlu-CPT)에 있다. 이 PEG-pGlu-CPT는, 상기 일반식 Ⅱ－a로 표시되는 구조를 가진다. PEG의 사슬 길이는 12kDa이다.
PEG 말단에 말레이미드기를 가지는 폴리머(Maleimide－PEG－PBLA)를 준비했다. 당해 폴리머에 있어서의 PEG의 사슬 길이는 12kDa이다. 10mg의 PEG-pGlu-CPT와, 10mg의 Maleimide-PEG-PBLA를, 샘플 바이알에 정밀 칭량하고, 정제수를 1mL 첨가했다. 4℃에서 하루낮밤 교반한 후, 바이오디스럽터(biodisruptor)(니혼세이키세이사쿠쇼 High Power Unit)를 이용하여, 빙냉 하에서 10분간 초음파 처리하고, 0.22㎛의 필터(밀리포어사 제 Millex(R)GPPES)로 여과하고, 여과액을 회수했다. 여과액을 겔 여과［GE 사이언스사 제 PD-10, 용리액: 20mM 인산나트륨 완충액(pH7.0)］하여, 미셀 화분(micelle fraction)(1.5mL)을 회수했다. 당해 미셀 화분에는, PEG-pGlu-CPT와 Maleimide-PEG-PBLA가 방사상으로 배열한, 미셀이 함유되어 있다.
인간 유래의 트랜스페린(시그마-알드리치 사)(이후, 트랜스페린을 Tf로 표시하는 경우가 있다) 40mg에, 0.2M의 붕산 완충액(pH8.0)과 100mM의 에틸렌디아민 4아세트산(EDTA)과 정제수를 첨가하여 Tf를 용해했다. 이어서, 붕산 완충액의 최종 농도가 50mM이 되고 EDTA의 최종 농도가 2mM이 되도록, 10mg/mL의 트라우트 시약(Traut's reagent)(피어스사)을 138μL 더 첨가하여, 합계 1mL의 혼합액으로 한 후, 30℃에서 45분간 정치(靜置)했다. 이렇게 하여 얻은 반응액을 겔 여과［GE 사이언스사 제 PD-10, 용리액：20mM 인산나트륨 완충액(pH7.0), 2mM EDTA］하여, 고분자 화분(1.5mL)을 회수했다.
이 회수액 0.75mL과, 상기의 미셀 화분 0.75mL를 혼합하여, 30℃에서 2시간 정치함으로써, Maleimide-PEG-PBLA의 말레이미드기와 Tf를 반응시켜, 골격 폴리머 유닛 α로서의 트랜스페린 결합 폴리머를 함유하는 미셀을 형성했다. 이 트랜스페린 결합 폴리머는, 상기 일반식 Ｉ-a로 표시되는 구조를 가진다. PEG의 사슬 길이는 12kDa이다. 이 반응액에 있어서의 인산나트륨 완충액의 최종 농도는 20mM이고, EDTA의 최종 농도는 1mM이다. 이어서, 반응액에 200mM의 포름산 암모늄 완충액을 첨가하고, pH를 5로 조정한 후, 겔 여과 정제［Sepharose CL-4B(1φ×30cm), 용리액：20mM 아세트산나트륨 완충액(pH5.0)］함으로써, 미반응의 Tf를 제거했다.
회수한 미셀 화분을 한외여과(밀리포어사 제 Amicon Ultra-15)함으로써 약 2mL로 농축한 후, NaHCO3－Na2CO3 완충액(pH9.6)을 첨가하여 pH를 7로 조정하고, 다시 100mM의 시스테인 용액을 20μL 첨가한 상태로, 실온에서 10분간 정치했다. 이렇게하여 얻은 반응액을 겔 여과［GE 사이언스사 제 PD-10, 용리액 : 20mM 인산 나트륨 완충액(pH7.4)］하여, 고분자 화분(3mL)을 회수했다. 이 고분자 화분에, 1M의 FeCl3와, 100mM의 Na2CO3를 (100mM의 구연산으로 pH7.0으로 조정한 것) 각각 30μL씩 첨가했다. 이렇게 하여 얻은 혼합액을, 4℃에서 하룻밤 정치한 후, 한외여과(밀리포어사 제 Amicon Ultra-15)하고, 20mM의 인산나트륨 완충액(pH 7.4)에 의한 희석과 철이온의 제거를 반복함으로써, 최종적으로 약 2mL로 농축했다. 이 농축액을, 0.22μm의 필터(밀리포어사 제 Millex(R)GV)로 여과하고, 여과액을 회수함으로써, 트랜스페린 결합 캠토테신 미셀을 함유하는 용액을 얻었다.
(실시예 2)
약물로서 도세탁셀(DTX)을 사용함으로써, 골격 폴리머 유닛 β를 도세탁셀 컨쥬게이트(PEG-pGlu-DTX)로 한 것 이외는, 실시예 1과 동일하게 하여, 표적 결합 부위를 가지는 화합물로서 트랜스페린을 가지고, 약물로서 도세탁셀을 내포하는 고분자 미셀인, 트랜스페린 결합 도세탁셀 미셀을 형성했다. 또한, 골격 폴리머 유닛 α 및 골격 폴리머 유닛 β의 블록 공중합체 부분을 구성하는 PEG의 사슬 길이는, 모두 10kDa로 했다. PEG-pGlu-DTX는, 도세탁셀이 PEG-pGlu에 에스테르 결합을 통해 결합한 상태(MeO-PEG-pGlu-DTX)에 있고, 상기 일반식 Ⅱ-a로 표시되는 구조를 가진다.
골격 폴리머 유닛 β로서의 PEG-pGlu-DTX는, 다음과 같이 하여 형성했다. 폴리글루탐산의 한쪽 말단이 아세틸화된 상태에 있는, 500mg의 폴리에틸렌글리콜-폴리글루탐산 블록 공중합체(PEG-pGlu-Ac)를, 10mL의 무수 DMF(칸토카가쿠)에 용해시킨 후, 1.06g의 도세탁셀(ScinoPharm Taiwan, Ltd)을 더 첨가했다. 또한, 이 PEG-pGlu-Ac에 있어서의 PEG의 평균 분자량은 10000이고, 글루탐산의 평균 잔기수는 40이며, 글루탐산의 측쇄는 카르복시산이다. 이어서, 160mg의 4-디메틸아미노피리딘(와코쥰야쿠)과, 210μL의 N,N’-디이소프로필카르보디이미드(코쿠산카가쿠)를 이 순서로 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반했다. 이렇게 하여 얻은 반응액을, 헥산과 아세트산에틸의 혼합 용액(체적비 1：1) 500mL에 적하하여 폴리머를 정석(晶析)시킨 후, 당해 폴리머를 감압 여집(濾集)했다. 여집에 의해 얻은 폴리머를, 100mL의 정제수에 현탁하여 고분자 미셀로 하고 한외여과(밀리포어사 제 랩스케일 TFF 시스템, 분자량 컷오프치：100000, 5배 희석 후, 100mL로 농축)을 행했다. 이 한외여과의 조작을 5회 반복하여 행한 후, 동결 건조를 행했다. 동결 건조에 의해 얻은 폴리머를, 10mL의 무수 DMF에 용해시킨 상태로, 헥산과 아세트산에틸의 혼합 용액(체적비 1 : 1) 500mL에 적하하여 폴리머를 정석시킨 후, 당해 폴리머를 감압 여집했다. 여집에 의해 얻은 폴리머를, 분말상태인 채로 헥산과 아세트산에틸의 혼합 용액(체적비 1：1) 100mL에 첨가함으로써 세정한 후, 감압 여집했다. 여집한 폴리머를, 실온에서 하룻밤 감압 건조시킴으로써, 담황색 분말인 530mg의 PEG-pGlu-DTX를 얻었다.
1mg의 PEG-pGlu-DTX를, 정제수와 에탄올의 혼합 용액(체적비 1：1) 10mL에 용해시키고, 파장 233㎚의 광선에 대한 흡광도로부터 도세탁셀의 함유량을 측정한 바, 1폴리머당 14.3분자였다. 이 PEG-pGlu-DTX는, 도세탁셀이 PEG-pGlu-Ac에 에스테르 결합을 통해 결합한 상태(MeO-PEG-pGlu-EVE)에 있다. 이 PEG-pGlu-EVE는, 상기 일반식 Ⅱ-a로 표시되는 구조를 가진다. PEG의 사슬 길이는 10kDa이다.
(실시예 3)
표적 결합 부위를 가지는 화합물로서 상피 성장 인자(EGF)를 가지고, 약물로서 도세탁셀(DTX)를 내포하는 고분자 미셀인, EGF 결합 도세탁셀 미셀을, 다음과 같이 하여 형성했다.
골격 폴리머 유닛 β로서의 DTX 컨쥬게이트(PEG-pGlu-DTX)를, 실시예 2와 동일하게 하여 형성했다.
PEG 사슬 길이가 10kDa이고 PEG 말단에 말레이미드기를 가지는 폴리머(Maleimide-PEG-PBLA)를 준비했다. 5mg의 당해 폴리머와, 5mg의 PEG-pGlu-DTX를, 샘플 바이알에 정밀 칭량하고, 정제수를 1mL 첨가한 후, 실시예 1과 동일하게 처리하여, 미셀 화분(1.5mL)을 회수했다. 당해 미셀 화분에는, PEG-pGlu-DTX와 Maleimide-PEG-PBLA가 방사상으로 배열한, 미셀이 함유되어 있다.
1mg의 재조합 인간 EGF(R＆D Systems사)가 로딩된 바이알에, 정제수 1mL를 첨가하여, 1mg/mL의 EGF 용액을 조제했다. 이 EGF 용액 0.5mL에 대해, 0.2M의 붕산 완충액(pH8.0)과 100mM의 에틸렌디아민 4아세트산(EDTA)과 정제수를 첨가하고, 붕산 완충액의 최종 농도가 50mM로 되고 EDTA의 최종 농도가 2mM이 되도록, 10mg/mL의 트라우트 시약(피어스사)을 138μL 더 첨가하여, 합계 1mL의 혼합액으로 한 후, 30℃에서 45분간 정치했다. 이어서, 이렇게 하여 얻은 반응액을 겔 여과［GE 사이언스사 제 PD-10, 용리액：20mM 인산나트륨 완충액(pH7.0), 2mM EDTA］하여, 고분자 화분(1.5mL)을 회수했다.
이 회수액 1.5mL과, 상기의 미셀 화분 0.5mL를 혼합하고, 30℃에서 2시간 정치함으로써, Maleimide-PEG-PBLA의 말레이미드기와 EGF를 반응시켜, 골격 폴리머 유닛 α로서의 EGF 결합 폴리머를 함유하는 미셀을 형성했다. 이 EGF 결합 폴리머는, 상기 일반식 Ｉ-a로 표시되는 구조를 가진다. 이렇게 하여 얻은 반응액을 겔 여과 정제［Sepharose CL-4B(1φ×30cm), 용리액：20mM 아세트산나트륨 완충액(pH7.4)］함으로써, 미반응의 EGF를 제거했다.
회수한 미셀 화분을 한외여과(밀리포어사 제 Amicon Ultra-15)함으로써 약 2mL로 농축하여, EGF 결합 도세탁셀 미셀을 함유하는 용액을 얻었다.
(실시예 4)
표적 결합 부위를 가지는 화합물로서 항RANKL 항체를 가지고, 약물로서 에버롤리무스(EVE)를 내포하는 고분자 미셀인, 항RANKL 항체 결합 에버롤리무스 미셀을, 다음과 같이 하여 형성했다.
우선, 골격 폴리머 유닛 β로서의 에버롤리무스 컨쥬게이트(PEG-pGlu-EVE)를, 다음과 같이 하여 형성했다. 폴리글루탐산의 한쪽 말단이 아세틸화된 상태에 있는, 140mg의 폴리에틸렌글리콜-폴리글루탐산 블록 공중합체(PEG-pGlu-Ac)를, 10mL의 무수 DMF(칸토카가쿠)에 용해시킨 후, 142mg의 에버롤리무스(MOLCAN. Co. )를 더 첨가했다. 또한, 이 PEG-pGlu-Ac에 있어서의 PEG의 평균 분자량은 10000이고, 글루탐산의 평균 잔기수는 40이며, 글루탐산의 측쇄는 카르복시산이다. 이어서, 16.9mg의 4-디메틸아미노피리딘(와코쥰야쿠)과, 22.0μL의 N,N’-디이소프로필카르보디이미드(고쿠산카가쿠)를 이 순서로 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반했다. 이렇게 하여 얻은 반응액을, 헥산과 아세트산에틸의 혼합 용액(체적비 3：1) 100mL에 적하하여 폴리머를 정석시킨 후, 당해 폴리머를 감압 여집했다. 여집에 의해 얻은 폴리머를, 무수 DMF에 용해시킨 상태에서, 증류수 1리터에 대해서 2일간 투석［화분 분자량(MWCO)＝3500, 증류수를 4회 교환］한 후, 동결 건조했다. 동결 건조에 의해 얻은 폴리머를, 10mL의 무수 DMF에 용해시킨 상태에서, 헥산과 아세트산에틸의 혼합 용액(체적비 3：1) 100mL에 적하하여 폴리머를 정석시킨 후, 당해 폴리머를 감압 여집했다. 여집에 의해 얻은 폴리머를, 분말 상태인 채로 헥산과 아세트산에틸의 혼합 용액(체적비 3：1) 100mL에 첨가함으로써 세정한 후, 감압 여집했다. 여집한 폴리머를, 실온에서 하룻밤 감압 건조시킴으로써, 담황색 분말인 180mg의 PEG-pGlu-EVE를 얻었다.
1mg의 PEG-pGlu-EVE를, 정제수와 메탄올의 혼합 용액(체적비 1：1) 25mL에 용해시켜, 파장 278㎚의 광선에 대한 흡광도로부터 에버롤리무스의 함유량을 측정한 바, 1폴리머당 12.6 분자였다. 이 PEG-pGlu-EVE는, 에버롤리무스가, PEG-pGlu에 에스테르 결합을 통해 결합한 상태(MeO-PEG-pGlu-EVE)에 있다. 이 PEG-pGlu-EVE는, 상기 일반식 Ⅱ-a로 표시되는 구조를 가진다. PEG의 사슬 길이는 10kDa이다.
5mg의 PEG-pGlu-EVE를 샘플 바이알에 정밀 칭량하고, 정제수를 1mL 첨가했다. 4℃에서 하룻밤 교반한 후, 바이오디스럽터(니혼세이키세이사쿠쇼 제 High Power Unit)를 이용하여, 빙냉 하에서 10분간 초음파 처리하고, 0.22μm의 필터(밀리포어사 제 Millex(R)GPPES)로 여과하여, 여과액을 회수했다. 당해 여과액에는, 골격 폴리머 유닛 β로서의 PEG-pGlu-EVE가 함유되어 있다.
골격 폴리머 유닛 α로서의 항RANKL 항체 결합 폴리머를, 다음과 같이 하여 형성했다. PEG 말단에 말레이미드기를 가지는 폴리머(Maleimide-PEG-PBLA)를 준비했다. 당해 폴리머에 있어서의 PEG의 사슬 길이는 10kDa이다. 5mg의 Maleimide-PEG-PBLA를, 샘플 바이알에 정밀 칭량하고, 20mM의 인산나트륨 완충액(pH7.0)을 1mL 첨가했다. 4℃에서 하룻밤 교반한 후, 바이오디스럽터(니혼세이키세이사쿠쇼 제 High Power Unit)를 이용하여, 빙냉 하에서 10분간 초음파 처리하고, 0.22μm의 필터(밀리포어사 제 Millex(R)GP PES)로 여과하여, Maleimide-PEG-PBLA를 함유하는 여과액을 회수했다.
500㎍의 항RANKL 항체(R&D Syst㎝s사)가 로딩된 바이알에, 0.5mL의 PBS를 첨가하고, 1mg/mL의 항RANKL 항체 용액을 조제했다. 이 항RANKL 항체 용액 0.4mL에 대해, 0.2M의 붕산 완충액(pH8.0)과 100mM의 EDTA와 정제수를 첨가하여, 붕산 완충액의 최종 농도가 50mM이 되고 EDTA의 최종 농도가 2mM이 되도록, 10mg/mL의 트라우트 시약(피어스 사)을 2μL 더 첨가하여, 합계 0.6mL의 혼합액으로 한 후, 30℃에서 45분간 정치했다. 이어서, 이렇게 하여 얻은 반응액을 겔 여과［GE 사이언스사 제 PD-10, 용리액：20mM 인산나트륨 완충액(pH7.0), 2mM EDTA］하여, 고분자 화분(1.5mL)을 회수했다.
이 회수액 1.5mL과, 상기의 Maleimide-PEG-PBLA를 함유하는 여과액 38μL를 혼합하고, 30℃에서 2시간 정치하고, 다시 4℃에서 철야 정치함으로써, Maleimide-PEG-PBLA의 말레이미드기와 항RANKL 항체를 반응시켜, 골격 폴리머 유닛 α로서의 항RANKL 항체 결합 폴리머를 형성했다. 이 항RANKL 항체 결합 폴리머는, 상기 일반식 Ｉ-a로 표시되는 구조를 가진다. 이렇게 하여 얻은 반응액을 겔 여과 정제［Sepharose CL-4B(1φ×30㎝), 용리액 : 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4)］함으로써, 미반응의 SH화 항체를 제거했다.
회수한 미셀 화분을 한외여과(밀리포어사 제 Amicon Ultra-15, 분자량 컷오프치：100000)함으로써 약 1mL로 농축하고, 항RANKL 항체 결합 폴리머를 함유하는 용액을 얻었다.
PEG-pGlu-EVE를 함유하는 여과액 36μL와, 항RANKL 항체 결합 폴리머를 함유하는 용액 500μL를 혼합하고, 4℃에서 3일간 정치함으로써, 항RANKL 항체 결합 에버롤리무스 미셀을 함유하는 용액을 얻었다. Zetasizer(Malvern Instruments사)를 이용하여 측정한, 항RANKL 항체 결합 에버롤리무스 미셀의 평균 입자 직경은 119㎚였다.
(실시예 5)
표적 결합 부위를 가지는 화합물로서 트랜스페린을 가지고, 약물로서 에버롤리무스(EVE)를 내포하는 고분자 미셀인, 트랜스페린 결합 에버롤리무스 미셀을, 다음과 같이 하여 형성했다.
실시예 4와 동일하게 하여, 골격 폴리머 유닛 β로서의 PEG-pGlu-EVE가 함유된, 여과액을 얻었다.
골격 폴리머 유닛 α로서의 트랜스페린 결합 폴리머를, 다음과 같이 하여 형성했다. 우선, 실시예 4와 동일하게 하여, Maleimide-PEG-PBLA를 함유하는 여과액을 얻었다. 10mg의 인간 트랜스페린(시그마-알드리치)을 1mL의 정제수에 용해시켜, 트랜스페린 용액을 조제했다. 이 트랜스페린 용액 696μL에 대해서, 0.2M의 붕산 완충액(pH8.0)과 100mM의 EDTA와 정제수를 첨가하여, 붕산 완충액의 최종 농도가 50mM이 되고 EDTA의 최종 농도가 2mM이 되도록, 10mg/mL의 트라우트 시약(피어스사)을 34μL 더 첨가하여, 합계 1mL의 혼합액으로 한 후, 30℃에서 45분간 정치했다. 이어서, 이렇게 하여 얻은 반응액을 겔 여과［GE 사이언스사 제 PD-10, 용리액：20mM 인산나트륨 완충액(pH7.0), 2mM EDTA］하여, 고분자 화분(1.5mL)을 회수했다.
이 회수액 1.5mL과, 상기의 Maleimide-PEG-PBLA를 함유하는 여과액 0.9mL(폴리머 농도 5mg/mL)를 혼합하고, 30℃에서 2시간 정치하고(인산나트륨 완충액(pH7.0)의 최종 농도：20mM, EDTA의 최종 농도 : 1mM), 다시 4℃에서 철야 정치함으로써, Maleimide-PEG-PBLA의 말레이미드기와 트랜스페린을 반응시켜, 골격 폴리머 유닛 α로서의 트랜스페린 결합 폴리머를 형성했다. 이 트랜스페린 결합 폴리머는, 상기 일반식 Ｉ-a로 표시되는 구조를 가진다.
이렇게 하여 얻은 반응액을 겔 여과 정제［Sepharose CL-4B(1φ×30㎝), 용리액 : 2OmM 인산나트륨 완충액(pH7.4)］함으로써, 미반응의 SH화 트랜스페린을 제거했다. 회수한 미셀 화분을 한외여과(밀리포어사 제 Amicon Ultra-15, 분자량 컷오프치：100000)함으로써 약 2mL로 농축한 후, NaHCO3-Na2CO3 완충액(pH9.6)을 첨가하여 pH를 7로 조정하고, 100mM의 시스테인 용액을 20μL 더 첨가한 상태로, 실온에서 10분간 정치했다. 이렇게 하여 얻은 반응액을 겔 여과［GE 사이언스사 제 PD-10, 용리액：20mM 인산나트륨 완충액(pH7.4)］하여, 고분자 화분(3mL)을 회수했다. 이 고분자 화분에, 1M의 FeCl3과, 100mM의 Na2CO3를 (100mM의 구연산으로 pH7.O으로 조정한 것) 각각 30μL씩 첨가했다. 이렇게 하여 얻은 혼합액을, 4℃에서 하룻밤 정치한 후, 한외여과(밀리포어사 제 Amicon Ultra-15, 분자량 컷오프치 : 100000)하고, 20mM의 인산나트륨 완충액(pH7.4)에 의한 희석과 철이온의 제거를 반복함으로써, 최종적으로 약 3mL로 농축하여, 트랜스페린 결합 폴리머를 함유하는 용액을 얻었다.
PEG-pGlu-EVE를 함유하는 여과액 200μL와, 트랜스페린 결합 폴리머를 함유하는 용액 500μL를 혼합하고, 4℃에서 3일간 정치함으로써, 트랜스페린 결합 에버롤리무스 미셀을 함유하는 용액을 얻었다. Zetasizer(Malvern Instruments사)를 이용하여 측정한, 트랜스페린 결합 에버롤리무스 미셀의 평균 입자 직경은 106㎚였다.
(비교예 1)
표적 결합 부위를 가지는 화합물을 가지지 않고 약물로서 도세탁셀을 내포하는 고분자 미셀(이하, 설명을 용이하게 하기 위해서, Tf 비결합 DTX 미셀로 부른다)을, 다음과 같이 하여 형성했다. 실시예 2에서 형성한 PEG-pGlu-DTX를 10mg, 샘플 바이알에 정밀 칭량하고, 20mM의 인산나트륨 완충액(pH7.0)을 1mL 첨가하여 현탁했다. 4℃에서 하루낮밤 교반한 후, 바이오디스럽터(니혼세이키세이사쿠쇼 제 High Power Unit)를 이용하여, 빙냉 하에서 10분간 초음파 처리하고, 구멍 직경 0.22㎛의 필터［밀리포어사 제 Millex(R)GP PES］로 여과하여, 여과액을 회수했다. 이 여과액을 겔 여과(GE사이언스사 제 PD-10, 용리액：10% 수크로오스 용액)함으로써, Tf 비결합 DTX 미셀을 함유하는 고분자 화분을 얻었다.
(비교예 2)
표적 결합 부위를 가지는 화합물을 가지지 않고 약물로서 캠토테신을 내포하는 고분자 미셀(이후, 설명을 용이하게 하기 위해서, Tf 비결합 CPT 미셀로 부른다)을, 다음과 같이 하여 형성했다. 실시예 1에서 형성한 PEG-pGlu-CPT를 10mg, 샘플 바이알에 정밀 칭량하고, 정제수를 1mL 첨가하여 현탁했다. 4℃에서 하루낮밤 교반한 후, 바이오디스럽터(니혼세이키세이사쿠쇼 제 High Power Unit)를 이용하여, 빙냉 하에서 10분간 초음파 처리하고, 구멍직경 0.22㎛의 필터［밀리포어사 제 Millex(R)GP PES]로 여과하고, 여과액을 회수했다. 그 여과액을 겔 여과(GE 사이언스사 제 PD-10, 용리액 : 20mM 인산나트륨 완충액(pH7.0))함으로써, Tf 비결합 CPT 미셀을 함유하는 고분자 화분을 얻었다.
(비교예 3)
표적 결합 부위를 가지는 화합물로서 Tf를 가지는 한편, 약물을 내포하지 않는 고분자 미셀(이후, 설명을 용이하게 하기 위해서, Tf 결합 엠프티(empty) 미셀로 부른다)을, 다음과 같이 하여 형성했다.
PEG 말단에 말레이미드기를 가지는 폴리머(Maleimide-PEG-PBLG)를 준비했다. 당해 폴리머에 있어서의 PEG의 사슬 길이는 10kDa이다. 5mg의 Maleimide-PEG-PBLG를, 샘플 바이알에 정밀 칭량하고, 20mM의 인산나트륨 완충액(pH7.0)을 1mL 첨가했다. 4℃에서 하루낮밤 교반한 후, 바이오디스럽터(니혼세이키세이사쿠쇼 제 High Power Unit)를 이용하여, 빙냉 하에서 10분간 초음파 처리하고, 0.22㎛의 필터(밀리포어사 제 Millex(R)GP PES)로 여과함으로써, Maleimide-PEG-PBLG를 함유하는 여과액을 회수했다.
인간 유래의 Tf(와코쥰야쿠) 10mg에, O.2M의 붕산 완충액(pH8.0)과 100mM의 에틸렌디아민 4아세트산(EDTA)과 정제수를 첨가하여 Tf를 용해했다. 이어서, 붕산 완충액의 최종 농도가 50mM이 되고 EDTA의 최종 농도가 2mM이 되도록, 10mg/mL의 트라우트 시약(피어스사)을 34μL 더 첨가하여, 합계 1mL의 혼합액으로 한 후, 30℃에서 45분간 정치했다. 이렇게 하여 얻은 반응액을 겔 여과［GE 사이언스사 제 PD-10, 용리액 : 20mM 인산나트륨 완충액(pH7.0), 2mM EDTA］하여, 고분자 화분(1.5mL)을 회수했다.
이 회수액 1.5mL과, 상기의 Maleimide-PEG-PBLG를 함유하는 여과액 O.9mL를 혼합하고, 30℃에서 2시간 정치하고, 다시 4℃에서 철야 정치함으로써, Maleimide-PEG-PBLG의 말레이미드기와 Tf를 반응시켰다. 이렇게 하여 얻은 반응액을 겔 여과 정제［Sepharose CL-4B(2φ×30㎝), 용리액：20mM 인산나트륨 완충액(pH7.0)］함으로써, 미반응의 SH화 Tf를 제거했다.
겔 여과로 회수한 고분자 화분을 한외여과(밀리포어사 제 Amicon Ultra-15, 분자량 컷오프치 : 100000)하고, 고분자 화분(4mL)을 회수했다. 0.5mL의 이 고분자 화분에, 100mM의 FeCl3(100mM 구연산, pH7.0이 되도록 1M의 Na2CO3로 조정한 것)를 50μL 혼합했다. 이렇게 하여 얻은 혼합액을, 4℃에서 2시간 정치한 후, 겔 여과［GE 사이언스사 제 PD-10, 용리액 : 20mM 인산나트륨 완충액(pH7.0)］하고, 잉여의 철이온을 제거함으로써, Tf 결합 엠프티 미셀을 함유하는 용액을 얻었다.
〔세포 장해성(障害性) 시험 1〕
실시예 2의 Tf 결합 DTX 미셀에 의한 세포 장해성을, 비교예 1의 Tf 비결합 DTX 미셀에 의한 세포 장해성과 비교했다. 각 미셀에 의한 세포 장해성을, DS 파머바이오메디컬 주식회사를 통해 ECACC(European Collection of Cell Culture)로부터 구입한 인간 유방암 MDA－MB－231 세포를 이용하여, WST법에 의거하여 다음과 같이 평가했다.
96웰 플레이트에, 1웰당 약 5000개의 인간 유방암 MDA-MB-231 세포가 함유되도록, 당해 세포를 90μL의 배지에 현탁한 상태로 뿌려, 37℃, 5% CO2의 분위기 하에서 하룻밤 배양했다. 이 배지는, RPMI1640(GibcoTM, Invitrogen)과 10% FBS(Fetal Bovine Serum, biowest)로 형성했다. 이어서, 실시예 2의 미셀 용액과 비교예 1의 미셀 용액을 다양한 DTX 농도가 되도록 배지로 희석한 샘플액을 각 웰에 첨가하고(1웰당 10μL), 37℃, 5% CO2의 분위기 하에서 2시간 배양했다. 그 후, 웰 내에서 배지를 제거하고, 인산 완충 생리 식염수(PBS)로 웰 내를 2회 세정한 후, 신선한 배지를 첨가하고(1웰당 100μL), 총 배양 시간이 72시간이 되기까지 계속 배양했다. 그 후, WST Reagent(도진)를 첨가하고(1웰당 10μL), 37℃, 5% CO2의 분위기 하에서 약 2시간 배양을 계속했다. 각 웰로부터, 파장 450㎚의 광선에 대한 흡광도(Abs450)를 측정하고, 하기의 수식에 의거하여 세포 증식율(% cell growth)을 산출했다. 또한, 당해 수식 중의 컨트롤의 Abs450값이란, DTX를 함유하지 않은 배양액을 사용하여 상기의 배양을 실시한 웰로부터 얻은 흡광도를 의미한다.
Figure 112011047195035-pat00003
도 1은, 도세탁셀 농도에 대한 MDA-MB-231 세포의 세포 증식율을 나타내는 그래프이다. 당해 그래프의 가로축은 샘플액 중의 미셀의 양을 도세탁셀 농도로 환산한 값을 나타낸다. 검은 사각은 Tf 비결합 DTX 미셀을 첨가한 경우의 데이터이고, 검은 삼각은 Tf 결합 DTX 미셀을 첨가한 경우의 데이터이다. 각 데이터에 있어서의 에러 바(error bar)는 표준 편차(SD)이다. 도 1의 그래프에 나타내는 바와 같이, MDA-MB-231 세포에 대한 Tf 결합 DTX 미셀의 세포 상해성(傷害性)은, Tf 비결합 DTX 미셀에 비해, 현저하게 낮은 DTX 농도에서 발휘되었다.
〔세포 장해성 시험 2〕
세포 장해성 시험 2에서는, 샘플액을 첨가하여 실시하는 배양 시간을 72시간으로 변경하고, 그 직후에 WST Reagent를 1웰당 10μL씩 첨가하고, 37℃, 5% CO2의 분위기 하에서 약 2시간 배양을 계속한 것 이외는, 세포 장해 시험 1과 동일하게 하여, 실시예 2의 Tf 결합 DTX 미셀과 비교예 1의 Tf 비결합 DTX 미셀에 의한 세포 장해성을 조사했다.
또한, 각 미셀에 있어서의 DTX 농도는, 파장 233㎚의 광선에 대한 흡광도에 의거하여 산출했다. 다만, Tf 결합 DTX 미셀에 대해서는, 파장 233㎚의 광선에 대한 흡광도에 있어서의 Tf(아포체(apo type))의 기여분을 뺐다.
도 2는, 도세탁셀 농도에 대한 MDA－MB－231 세포의 생존률을 나타내는 그래프이다. 당해 그래프에 있어서의 세로축, 가로축, 검은 사각 및 검은 삼각 표시의 의미는, 도 1의 그래프에 있어서의 것과 동일하다. 각 데이터에 있어서의 에러 바는 표준 편차(SD)이다. 도 2의 그래프에 나타내는 바와 같이, MDA－MB－231 세포에 대한 Tf 결합 DTX 미셀의 세포 상해성은, Tf 비결합 DTX 미셀에 비해, 현저하게 낮은 DTX 농도에서 발휘되었다.
〔세포 장해성 시험 3〕
세포 장해성 시험 3에서는, 세포로서, 스밋 파마슈티컬스 인터내셔널 주식회사를 통해 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입한 인간 전립선암 DU145 세포를 이용하고, 미셀로써, 실시예 1의 Tf 결합 CPT 미셀과, 비교예 2의 Tf 비결합 CPT 미셀을 이용하고, 샘플액을 첨가하여 실시하는 배양 시간을 8시간으로 변경한 것 이외는, 세포 장해 시험 1과 동일하게 하여, 각 미셀에 의한 세포 장해성을 조사했다.
〔세포 장해성 시험 4〕
세포 장해성 시험 4에서는, 세포로서, DS 파마바이오메디칼 주식회사를 통해 ECACC로부터 구입한 인간 간암 HepG2 세포를 이용한 것 이외는, 세포 장해 시험 3과 동일하게 하여, 각 미셀에 의한 세포 장해성을 조사했다.
〔세포 장해성 시험 5]
세포 장해성 시험 5에서는, 세포로서 인간 유방암 MDA－MB－231 세포를 이용한 것 이외는, 세포 장해 시험 3과 동일하게 하여, 각 미셀에 의한 세포 장해성을 조사했다.
세포 장해 시험 3∼5의 결과를 표 1에 표시한다. 표 1의 「용액」에 관한 데이터는, CPT를 미셀에 내포시키지 않고 배양액에 직접 첨가하여 조제한 샘플액에 관한 데이터이다.
[표 1]
Figure 112011047195035-pat00004
또한, 각 미셀에 있어서의 CPT 농도는 다음과 같이 하여 측정했다.
a) CPT 농도의 측정 방법
미셀 샘플 100μL에 대해, 6N의 HCl를 200μL 첨가하고, 크라이오튜브(cryotube)(이에다카가쿠)에서 100℃에서 1시간 가열했다. 얻어진 반응액을 75μL회수하고, 6N의 NaOH를 50μL 첨가하여 중화한 후, 0.22㎛ 필터(밀리포어사 제 MILLEX(R)-GV)로 여과했다. 여과액을 25mM의 포름산 암모늄 완충액(pH3.0)으로 10배 희석하고, 이 처리 샘플액을 HPLC 샘플 바이알에 충전하고, 하기의 분석 조건으로 HPLC 분석함으로써, CPT 농도를 측정했다.
b) HPLC 분석 조건
시스템：Waters Alliance System
칼럼：Tosoh TSK－gel ODS-80TM(4.6φ×150㎜)(40℃)
이동상 : 25mM의 포름산 암모늄(pH3.0)/아세토니트릴＝70/30
유속：1mL/min
검출：형광(Ex : 370㎚, Em：420㎚)
인젝션 체적：20μL
〔세포 장해성 시험 6〕
세포 장해성 시험 6에서는, 세포로서, DS 파마바이오메디칼 주식회사를 통해 ECACC로부터 구입한 인간 유방암 MDA-MB-231 세포를 이용하고, 미셀로써, 비교예 3의 Tf 결합 엠프티 미셀을 이용한 것, 및 약제와 세포의 접촉 시간을 72시간으로 연장하는 것 이외는, 세포 장해 시험 3과 동일하게 하여, 각 미셀에 의한 세포 장해성을 조사했다.
도 5는, Tf 농도에 대한 MDA-MB-231 세포의 세포 증식율을 나타내는 그래프이다. 당해 그래프의 가로축은 샘플액 중의 미셀의 양을 Tf 농도로 환산한 값을 나타낸다. 검은 사각은 Tf 결합 엠프티 미셀을 첨가한 경우의 데이터이고, 검은 삼각은 Tf 결합 DTX 미셀을 첨가한 경우의 데이터이며, 흰 원은 Tf 용액을 첨가한 경우의 데이터이다. 각 데이터에 있어서의 에러 바는 표준 편차(SD)이다. 도 5의 그래프에 나타내는 바와 같이, Tf 결합 도세탁셀 미셀은 MDA-MB-231 세포에 대해서 뛰어난 세포 상해성을 나타냈지만, Tf 용액 및 Tf 결합 엠프티 미셀은 세포 상해성을 가지지 않았다.
〔약효 평가 시험〕
인간 유방암 MDA-MB-231 세포를, RPMI1640과 10% FBS로 형성한 배지를 이용하고, 37℃, 5% CO2의 분위기 하에서, 이식에 필요한 세포수로 증식할 때까지 배양했다. 그 후, 이 세포를, 100μL의 생리 식염수에 현탁한 상태로, 자성(雌性) 누드마우스［Balb nu/nu, 5주령, 일본 찰스·리버 주식회사 제］의 등부 피하에 접종했다. 1마리당 접종한 세포는 3×106개이다. 그 후, 21일간 누드마우스를 사육함으로써, 종양 체적이 70.8±3.7㎣(Average±SE)로 된 바, 약물 내포 미셀의 투여를 개시했다.
투여 스케줄은 4일 간격으로 합계 3회의 꼬리 정맥 내 투여로 하고, 이하의 3군에 대해서, 종양 체적 및 마우스의 체중을, 주 3회 측정했다. 각 군당 마우스수는 8마리이다.
(1) 컨트롤(무처리)
(2) 비교예 1의 Tf 비결합 DTX 미셀(1회당의 DTX의 투여량：마우스의 체중 1kg당 10mg)
(3) 실시예 2의 Tf 결합 DTX 미셀(1회당의 DTX의 투여량：마우스의 체중 1kg당 10mg)
도 3은 종양 체적의 경시 변화를 나타내는 그래프이다. 당해 그래프의 세로축은, 시험 개시 시의 종양 체적에 대한 상대치를 나타내고, 가로축은 시험 개시부터의 경과 시간(Days)을 나타낸다. 당해 그래프 중의 화살표는, 약물 내포 미셀을 투여한 타이밍을 나타낸다. 검은 원은 컨트롤군의 데이터이고, 검은 삼각은 Tf 비결합 DTX 미셀군의 데이터이며, 검은 사각은 Tf 결합 DTX 미셀군의 데이터이다. 도 4는 마우스의 체중 변화를 나타내는 그래프이다. 도 4의 그래프의 세로축은, 시험 개시 시의 마우스의 체중에 대한 상대치를 나타낸다. 도 4의 그래프에 있어서의 가로축, 화살표, 검은 원, 검은 삼각 및 검은 사각의 표시의 의미는, 도 3의 그래프에 있어서의 것과 동일하다. 각 데이터에 있어서의 에러 바는 표준오차(SE)이다.
도 3 및 도 4의 그래프에 나타내는 바와 같이, Tf 결합 DTX 미셀을 투여하면, 컨트롤 및 Tf 비결합 DTX 미셀을 투여한 경우에 비해, 마우스의 체중 변화에 차이가 없는 상태를 실현하면서, 인간 유방암 MDA-MB-231 세포의 증식을 현저하게 억제할 수 있었다. 또한, 도 3의 그래프에는 나타내지 않지만, Tf 결합 DTX 미셀을 투여한 경우, 투여 29일째에서 T/C값(약물 투여군(T)과 컨트롤군(C)의 종양 체적비)을 0.33까지 저하시킬 수 있었다.

Claims (20)

  1. 하기 일반식 Ｉ로 표시되는 폴리머 α：
    Z－A1―B1 (I); 및
    하기 일반식 Ⅱ로 표시되는 폴리머 β：
    A2－B2(－D) (Ⅱ)
    를 포함하는, 약물을 내포하는 고분자 미셀로서,
    여기서, Z는 표적 결합 부위를 가지는 화합물의 잔기이고; A1 및 A2는 각각 독립적으로 폴리에틸렌글리콜 사슬의 친수성 세그먼트이고; B1 및 B2는 각각 독립적으로 폴리아미노산 사슬의 소수성 세그먼트이고; D는 약물이고 하나 이상의 약물은 각각 폴리머 β의 폴리아미노산 사슬의 하나 이상의 측쇄에 공유결합되어 있고,
    상기 폴리머 α 및 상기 폴리머 β가, 상기 표적 결합 부위를 외측으로 향하게 함과 더불어 상기 약물을 내측으로 향하게 한 상태에서 방사상으로 배열되어 있고, 상기 방사상의 배열을 유지한 상태에서 표적에 결합한 경우, 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 당해 표적을 공급하는 세포의 내부에 끌어들여져, 상기 세포 내에서 상기 방사상의 배열이 붕괴함으로써 상기 약물이 당해 세포 내로 방출되고, 고분자 미셀의 방사상의 배열이 표적으로의 결합 이전에 혈중에서 붕괴한 경우, 폴리머 β가 대사에 의해 배출됨으로써, 정상 세포가 약물에 의해서 손상되는 것이 방지된, 고분자 미셀.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 폴리머 α는 하기 일반식 Ｉ-a 또는 일반식 Ｉ-b로 표시되고, 상기 폴리머 β는 하기 일반식 Ⅱ-a 또는 일반식 Ⅱ-b로 표시되는, 고분자 미셀:
    Figure 112014039881547-pat00005


    Figure 112014039881547-pat00006

    여기서, R1은 표적 결합 부위를 가지는 화합물의 잔기이고; R2는 수산기를 말단에 가져도 되는 C1－C12의 알킬기이며; L1은 0(CH2)pNH이고; L2는 O(CH2)p-CO-이며; p는 1∼5의 범위에 있는 정수이고; R은 수소 원자 또는 소수성 유기기이며; q는 1 또는 2이고; n1 및 n2는 각각 독립적으로 40∼450의 범위에 있는 정수이며; m1 및 m2는 각각 독립적으로 20∼80의 범위에 있는 정수이고; R3는 총 수 m2의 10∼70%가 연결기를 가지고 있어도 되는 상기 약물의 잔기이며; 나머지 기가 존재하는 경우, 그 나머지 기가 수소 원자 또는 소수성 유기기이다.
  3. 청구항 1에 기재된 고분자 미셀과, 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 하기 일반식 Ⅲ로 표시되는 폴리머 γ를 추가로 포함하는 고분자 미셀：
    A3－B3 (Ⅲ)
    여기서, A3은 폴리에틸렌글리콜 사슬의 친수성 세그먼트이고, B3은 폴리아미노산 사슬의 소수성 세그먼트이고, 폴리머 γ는 표적 결합 부위 및 약물을 가지지 않는다.
  5. 청구항 1에 있어서, 고분자 미셀은 유리된 약물(free drug)을 함유하지 않는 것인, 고분자 미셀.
  6. 청구항 1에 있어서, 표적 결합 부위는 트랜스페린(transferrin)을 포함하고 약물은 도세탁셀(docetaxel)인, 고분자 미셀.
  7. 청구항 1에 있어서, 폴리머 α 및 폴리머 β의 폴리아미노산 사슬은 각각 개별적으로 폴리글루탐산, 폴리아스파라긴산, 이들의 에스테르 유도체, 이들의 아미드 유도체 및 이들의 염으로부터 선택되는, 고분자 미셀.
  8. 청구항 2에 있어서, n1 및 n2는 70∼350인, 고분자 미셀.
  9. 청구항 8에 있어서, n1 및 n2는 110∼280이고 m1 및 m2는 25∼50인, 고분자 미셀.
  10. 청구항 9에 있어서, 폴리머 α의 폴리아미노산 사슬은 폴리(β―벤질―L―아스파테이트)로 구성되고, 폴리머 β의 폴리아미노산 사슬은 폴리(α―글루탐산)으로 구성되는, 고분자 미셀.
  11. 청구항 10에 있어서, 고분자 미셀은 유리된 약물을 함유하지 않는 것인, 고분자 미셀.
  12. 청구항 10에 있어서, 표적 결합 부위는 트랜스페린을 포함하고 약물은 도세탁셀인, 고분자 미셀.
  13. 삭제
  14. 청구항 1에 있어서, 약물은 핵산 유도체, 템시롤리무스(temsirolimus) 및 에버롤리무스(everolimus)로 구성되는 군으로부터 선택되는, 고분자 미셀.
  15. 청구항 14에 있어서, 약물은 젬시타빈(gemcitabine)인, 고분자 미셀.
  16. 삭제
  17. 청구항 1에 있어서, 약물은 에포틸론(epothilone) A, 에포틸론 B, 에포틸론 C, 에포틸론 D 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는, 고분자 미셀.
  18. 청구항 17에 있어서, 약물은 에포틸론 B인, 고분자 미셀.
  19. 삭제
  20. 청구항 1에 있어서, 약물은 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 통해 폴리아미노산 사슬에 결합되는, 고분자 미셀.
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