CN102260376B

CN102260376B - 一种用作非病毒型基因载体的阳离子聚合物及其制备方法和用途

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Publication number: CN102260376B
Application number: CN 201010183750
Authority: CN
Inventors: 李亚平; 高瑜; 张志文; 顾王文
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2010-05-24
Filing date: 2010-05-24
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2030-05-24
Also published as: CN102260376A

Abstract

本发明公开了一种用作非病毒型基因载体的新型阳离子聚合物及其制备方法和用途。本发明的阳离子聚合物具有下列式I的结构。本发明的阳离子聚合物是由末端含有炔基基团的单体和末端含有叠氮基团的单体通过一价铜离子催化的炔基—叠氮环加成反应聚合并同时脱去保护基生成带有1，2，3-三唑基团结构的阳离子聚合物。本发明的聚合物既保留了与PEI相当的高转染效率，又大大降低了PEI的细胞毒性，用该聚合物制备的基因非病毒载体具有生物相容性高、毒性低、转染效率高等特点。

Description

一种用作非病毒型基因载体的阳离子聚合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种新型阳离子聚合物及其制备方法和用途，还涉及由该新型阳离子聚合物与核酸所构成的纳米复合物及其制备方法和用途。

背景技术

基因治疗是指将正常基因或有治疗作用的基因通过一定的方式导入靶细胞以纠正基因缺陷或发挥治疗作用，进而达到治疗疾病的目的。基因治疗因具有诸多独特的优势，自问世以来已经对人类重大疾病的治疗产生了深远影响。然而，基因治疗的核心问题是尚未找到理想的基因载体。迄今研究开发的基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类，其中，病毒载体，如各种逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、腺相关病毒等，虽然转染效率高，但存在着对外源基因的容纳量少(约4.5-30kbp)、稳定性差、免疫原性高、毒性大、靶向特异性差等诸多缺点；而非病毒载体由于容易大规模制备、成本低、对外源基因无大小限制、具有低免疫原性和相对安全等优点已经越来越受到国内外学者的高度重视，并被建议替代病毒载体而成为基因载体研究的主要方向。遗憾的是，迄今为止研究发现的非病毒载体的转染效率都不理想或转染效率较高但由于体内不降解导致毒性太大。因此，寻找新型的高效、低毒的基因非病毒载体已成为基因治疗研究领域最为迫切并具挑战性的课题之一。

目前，新型阳离子聚合物基因输送系统已成为基因非病毒载体设计开发的主要方向，例如，对多聚赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺-胺型树枝状高分子、聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯、壳聚糖和聚阳离子环糊精等进行结构修饰的各种衍生物，特别是因具有“质子海绵”作用而具有高转染效率的PEI的研究报道最多，但因其不能在体内降解，对细胞产生较大毒性而导致其体内应用受到限制。因此，如何在保留PEI高转染效率特性的同时，又能够降低其毒性已成为研究热点之一。迄今为止，有效的策略之一就是在聚合物中引入可水解或酶解的基团，合成生物可降解的高分子聚合物从而降低毒性。例如，被广泛用作生物材料的合成多肽，就因其所含的酰胺键而在体内降解，还有合成的聚酯也因酯键可被水解而广泛用作药物控释的载体。

在生物医药领域中，新的合成方法是制备新材料的有效途径之一，聚合物化学结构的细微变化对其生物特性产生极大影响。在聚合物的合成工艺中，聚合反应又起着极其重要的作用。最近几年，产生了一种新的聚合物合成方法，即Huisgen环加成反应或“Click”反应。Click反应就是将末端带有炔基和叠氮基团的单体通过高选择性环合耦联后形成带有三唑环结构的聚合物，其最早是由Sharpless于2001年提出的。此后，Click反应就被广泛用于合成各种材料。迄今为止，用Click化学合成的聚合物用于基因输送仅有一篇报道(S.Srinivasachari，Y.Liu，G.Zhang，et al，Trehalose click polymers inhibitnanoparticle aggregation and promote pDNA delivery in serum.J.Am.Chem.Soc.128(2006)8176-8184.)，就是将海藻二糖与乙基亚胺分子通过Click反应形成聚合物，结果发现此聚合物比不用Click反应直接形成的聚合物转染效率有很大的提高，作者认为这可能和聚合物分子中的三唑基团能有效结合DNA并阻止聚合物/DNA纳米复合物的聚集有关。

发明内容

基于上述研究背景，本发明人以多缩乙二醇(例如，一缩二乙二醇(也称作二乙二醇)或二缩三乙二醇(也称作三乙二醇))和多乙烯多胺(例如，二乙烯三胺或三乙烯四胺)为原料，通过Click反应合成一种具有全新结构的阳离子聚合物。此聚合物含有的仲胺基团带有正电荷，能有效压缩核酸，同时能在酸性条件下接受H⁺，具有类似PEI的“质子海绵”效应；而且该聚合物中含有醚氧基结构，这就使该聚合物具有一定的亲水性和柔软性，具有类似PEG的性质，能在一定程度上分散聚合物的正电荷，阻止阳离子聚合物/核酸纳米复合物的聚集，减少聚合物对细胞的刺激性；并且该聚合物中含有的酰胺键可生物降解，因此，与不能降解的PEI相比，该聚合物的毒性大大降低。此外，该聚合物分子中含有的三唑基团，能有效结合核酸，阻止纳米复合物聚集。

因此，本发明的目的在于提供一种高效低毒的用作非病毒型基因载体的新型阳离子聚合物及其制备方法和用途。本发明的另一目的在于提供使用该阳离子聚合物制备的阳离子聚合物/核酸纳米复合物及其制备方法和用途。

本发明提供了一种用作非病毒型基因载体的阳离子聚合物，所述阳离子聚合物具有式Ⅰ所示的结构：

式Ⅰ

式Ⅰ中，n为聚合物的重复单元的个数；x为1或2；y为1或2。

所述阳离子聚合物的重均分子量为5-50千道尔顿。

所述阳离子聚合物可为聚(叠氮基一缩二乙二醇-炔基二乙烯三胺)的Click共聚物、聚(叠氮基一缩二乙二醇-炔基三乙烯四胺)的Click共聚物、聚 (叠氮基二缩三乙二醇-炔基二乙烯三胺)的Click共聚物、聚(叠氮基二缩三乙二醇-炔基三乙烯四胺)的Click共聚物或其混合物。

本发明的阳离子聚合物是由含有保护基并在末端含有炔基基团的单体(即，炔基化单体)和末端含有叠氮基团的单体(即，叠氮化单体)通过一价铜离子催化的炔基—叠氮环加成反应(“Click”反应)聚合并同时脱去保护基生成带有1，2，3-三唑基团结构的阳离子聚合物。

本发明提供的阳离子聚合物的合成方法，反应式如下：

步骤1：含有保护基的炔基化单体(末端含有炔基基团的单体)的合成

所述末端含有炔基基团的单体可以通过将丙炔酸与含有保护基的二乙烯三胺或三乙烯四胺反应而合成，反应式如下：

反应式中，x为1或2；R为保护基。反应步骤如下：

步骤a：使二乙烯三胺或三乙烯四胺和三氟乙酸乙酯反应，先冰浴搅拌，待反应液温度升至室温后继续搅拌，得到末端的两个伯胺被三氟乙酰基保护的化合物；

步骤b：使上述末端的两个伯胺被三氟乙酰基保护的化合物与氨基保护试剂(优选为二碳酸二叔丁酯Boc₂O)反应，用三乙胺(TEA)催化，得到仲胺被保护基(优选为Boc)保护的化合物；

步骤c：使上述仲胺被保护基保护的化合物在含有K₂CO₃的甲醇/水体系中回流后脱除三氟乙酰基，得到末端两个伯胺未被保护而仲胺被保护基保护的化合物；

步骤d：使末端两个伯胺未被保护而仲胺被保护基保护的化合物与二环己基碳二亚胺(DCC)反应，得到炔基化的含有保护基的二乙烯三胺或三乙烯四胺。

步骤2：叠氮化单体(末端含有叠氮基团的单体)的合成

所述末端含有叠氮基团的单体可以通过将一缩二乙二醇(即，二乙二醇)或二缩三乙二醇(即，三乙二醇)末端叠氮化而合成，反应式如下：

上式中，y为1或2。反应步骤具体如下：

步骤e：将二乙二醇或三乙二醇与对甲苯磺酰氯反应，以三乙胺(TEA)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂，得到对甲苯磺酰基取代的二乙二醇或三乙二醇；

步骤f：将对甲苯磺酰基取代的二乙二醇或三乙二醇与叠氮钠反应，得到叠氮化的二乙二醇或三乙二醇。

步骤3：聚合物的合成

所述聚合物可以是通过将上述炔基化单体和上述叠氮化单体通过Click聚合反应聚合并同时脱去保护基得到的含有三唑基团的聚合物，反应式如下：

上式中，n为聚合物的重复单元的个数；x为1或2；y为1或2；R为保护基。反应步骤如下：

将上述炔基化单体和叠氮化单体按等摩尔当量(例如0.1～2mol/L)在无水CuSO₄和维生素C钠盐催化下，进行Click聚合反应(例如2～48小时)，所得聚合物在DCM/三氟乙酸中脱除保护基，然后通过透析除杂，得到产物。

更具体地，

所述炔基化单体的制备如下：

步骤a：将二乙烯三胺或三乙烯四胺溶于二氯甲烷(DCM)中，加入三氟乙酸乙酯，冰浴搅拌，待反应液温度升至室温后继续搅拌；

步骤b：向上述反应液中加入二碳酸二叔丁酯(Boc₂O)，加入催化剂三乙胺(TEA)，室温搅拌反应过夜；依次用饱和NaHCO₃和饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥；浓缩后用DCM/正己烷体系重结晶；

步骤c：将上述结晶在含有K₂CO₃的甲醇/水体系中回流后，旋干甲醇，剩余物用DCM萃取；合并有机相，用无水Na₂SO₄干燥，旋干；

步骤d：取二环己基碳二亚胺(DCC)溶于DCM中，冰浴冷却，在N₂保护下逐滴加入溶于DCM的丙炔酸，冰浴反应；后逐滴加入由步骤c所得的产物的DCM溶液，冰浴反应后再室温反应；过滤除白色沉淀物，浓缩溶剂，硅胶柱层析分离，以氯仿/甲醇进行梯度洗脱，得到炔基化单体。

所述叠氮化单体的制备如下：

步骤e：将一缩二乙二醇或二缩三乙二醇溶于DCM中，冰浴冷却；按次序加入对甲苯磺酰氯、TEA和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，冰浴下搅拌，然后室温继续搅拌；反应液依次用饱和NaHCO₃和饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥；浓缩后用DCM/正己烷体系重结晶；

步骤f：将步骤e中重结晶产物溶于丙酮中，加入叠氮钠，回流；浓缩溶剂，硅胶柱层析分离，以石油醚/乙酸乙酯进行洗脱，得到叠氮化单体。

所述聚合物的制备如下：

将炔基化单体和叠氮化单体溶于叔丁醇中，将无水CuSO₄溶于水中，混合两溶液，放入塞有胶塞的小圆底烧瓶中，充N₂保护，放入50℃油浴中，边搅拌边逐滴加入溶于水的维生素C钠盐，50℃恒温反应过夜；旋转蒸发除去叔丁醇和少部分水后，粘稠物沉于反应瓶底；吸走上层水溶液后，旋干；加入DCM/三氟乙酸，常温反应后旋干；粘稠物用水复溶，用NaOH调节pH值呈碱性后装入透析袋中，用0.01M HCl透析后用纯水透析，冻干，得到聚合物。

本发明所述的聚合反应是由CuSO₄和维生素C钠盐生成一价铜离子作为催化剂催化的。

本发明提供的聚合物是由两种炔基化单体中的任何一种和两种叠氮化单体中的任何一种通过Click聚合反应合成得到。

对于本发明合成的用作非病毒型基因载体的阳离子聚合物，聚合物的重均分子量为5-50千道尔顿。通过控制聚合反应的单体投料量，聚合反应时间以及聚合反应温度，可以控制聚合物的分子量。

本发明的阳离子聚合物用于与核酸自组装形成纳米复合物。所述的核酸可以是含有编码遗传标记的质粒DNA序列，所述的遗传标记可为绿色荧光蛋白基因。

此外，本发明还提供了一种高效低毒的由阳离子聚合物和核酸组成的阳离子聚合物/核酸纳米复合物及其制备方法。该方法包括：将本发明的阳离子聚合物和质粒DNA分别用去离子水溶解，混合，室温静置，阳离子聚合物和质粒DNA通过静电自组装成纳米复合物。具体步骤为：将本发明的阳离子聚合物用去离子水溶解，配成0.1～10毫克/毫升的溶液；将质粒DNA用去离子水溶解，配成0.1～0.2毫克/毫升的溶液；按阳离子聚合物与DNA体积比1∶1在涡旋混合仪上混合30秒，室温静置0.5～1小时，阳离子聚合物和质粒DNA通过静电自组装成纳米复合物。

本发明的阳离子聚合物/核酸纳米复合物可用于将核酸递送到细胞中。

使用本发明的阳离子聚合物/核酸的纳米复合物体外转染细胞的方法步骤为：用制备好的纳米复合物转染人胚肾细胞(Human Epidermal Kidney)HEK 293或人乳腺癌细胞MDA-MB-468，细胞培养48小时后，在荧光显微镜下观察转染结果，若细胞发出绿色荧光，即为转染成功。

本发明通过凝胶阻滞实验验证了载体(本发明的阳离子聚合物)对质粒DNA的包载效果。

本发明测试了载体的细胞毒性。用MTT法测定载体的细胞毒性。

本发明所合成的新型阳离子聚合物，含有的仲胺基团带有正电荷，能有效压缩DNA，同时能在酸性条件下接受H⁺，具有类似PEI的“质子海绵”效应；而且该聚合物中含有醚氧基结构，这就使该聚合物具有一定的亲水性和柔软性，具有类似PEG的性质，能在一定程度上分散聚合物的正电荷，阻止阳离子聚合物/核酸复合物纳米粒的聚集，减少聚合物对细胞的刺激性；并且该聚合物中含有的酰胺键可生物降解，从而使聚合物的毒性比不能降解的PEI大大降低。此外，该聚合物分子中含有的三唑基团，能有效结合核酸，阻止纳米复合物聚集。本发明的聚合物既保留了PEI的高转染效率，又大大降低了PEI的细胞毒性，用该聚合物制备的基因非病毒载体具有生物相容性高、毒性低、转染效率高等特点。

附图说明

图1为本发明实施例7中凝胶阻滞实验电泳图片；

图2为本发明实施例8中细胞毒性实验结果示意图；以及

图3为本发明实施例9中体外转染实验结果照片。

具体实施方式

下面，将通过实施例，对本发明进行进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例，在本发明权利要求所阐明的范围内，可进行各种改变或等同替换。

实施例1含有Boc的炔基化二乙烯三胺单体(编号A)的合成

将二乙烯三胺(1.03g，10mmol)溶于二氯甲烷DCM(50mL)溶液中，冰浴冷却后，将三氟乙酸乙酯(2.95g，21mmol)逐滴加入其中，冰浴搅拌1h。待反应液温度升至室温后再搅拌1h后，逐滴加入溶在适量DCM中的二碳酸二叔丁酯Boc₂O(3.28g，15mmol)溶液和三乙胺TEA(1.52g，15mmol)溶液，室温搅拌反应过夜。依次用饱和NaHCO₃和饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥。浓缩后用DCM/正己烷体系重结晶。将重结晶物(2.00g)在含有K₂CO₃(1.80g)的甲醇/水(体积比20∶1)体系中回流4h后，旋干甲醇，剩余物用DCM萃取(3×100mL)。合并有机相，用无水Na₂SO₄干燥，旋干得粘稠物。取二环己基碳二亚胺DCC(1.25g，6mmol)溶于DCM(100mL)中，冰浴冷却，在N₂保护下逐滴加入溶于DCM(10mL)的丙炔酸(0.38g，5.4mmol)，冰浴反应2h。后逐滴加入粘稠物(0.50g，2.4mmol)的DCM溶液，冰浴反应2h后再室温反应24h。过滤除白色沉淀物，浓缩溶剂，硅胶柱层析分离，以氯仿/甲醇进行梯度洗脱，得单体A(¹H NMR(CDCl₃)：6.86(bs，2H)，3.41-3.49(m，8H)，2.78-2.84(m，2H)，1.49(s，9H))。单体A的结构式如下：

实施例2含有Boc的炔基化三乙烯四胺单体(编号B)的合成

将三乙烯四胺(1.46g，10mmol)溶于DCM(50mL)溶液中，冰浴冷却后，将三氟乙酸乙酯(2.95g，21mmol)逐滴加入其中，冰浴搅拌1h。待反应液温度升至室温后再搅拌1h后，逐滴加入溶在适量DCM中的Boc₂O(5.68g，26mmol)溶液和TEA(2.63g，26mmol)溶液，室温搅拌反应过夜。依次用饱和NaHCO₃和饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥。浓缩后用DCM/正己烷体系重结晶。将重结晶物(2.00g)在含有K₂CO₃(1.80g)的甲醇/水(体积比20∶1)体系中回流4h后，旋干甲醇，剩余物用DCM萃取(3×100mL)。合并有机相，用无水Na₂SO₄干燥，旋干得粘稠物。取DCC(1.25g，6 mmol)溶于DCM(100mL)中，冰浴冷却，在N₂保护下逐滴加入溶于DCM(10mL)的丙炔酸(0.38g，5.4mmol)，冰浴反应2h。后逐滴加入粘稠物(0.83g，2.4mmol)的DCM溶液，冰浴反应2h后再室温反应24h。过滤除白色沉淀物，浓缩溶剂，柱层析分离，以氯仿/甲醇(体积比50∶1和25∶1)进行梯度洗脱，得单体B(¹H NMR(CDCl₃)：8.14(bs，2H)，3.22-3.48(m，8H)，2.75(s，2H)，1.49(s，18H))。单体B的结构式如下：

实施例3叠氮化一缩二乙二醇单体(编号1)的合成

将一缩二乙二醇(2.12g，20mmol)溶于DCM(250mL)中，冰浴冷却。按次序加入对甲苯磺酰氯(7.62g，42mmol)、TEA(4.25g，42mmol)和4-二甲氨基吡啶DMAP(0.12g，0.1mmol)，冰浴下搅拌1h，后室温搅拌12h。反应液依次用饱和NaHCO₃(2×300mL)和饱和食盐水(300mL)洗涤，无水Na₂SO₄干燥。浓缩后用DCM/正己烷体系重结晶。将重结晶物(4.1g，10mmol)溶于丙酮中，加入叠氮钠(1.9g，30mmol)，回流48h。浓缩溶剂，硅胶柱层析分离，以石油醚/乙酸乙酯(体积比2∶1)进行洗脱，得单体1(¹HNMR(DMSO-d₆)：2.87(s，4H)，2.70(s，4H))。单体1的结构式如下：

实施例4 叠氮化二缩三乙二醇单体(编号2)的合成

将二缩三乙二醇(3.00g，20mmol)溶于DCM(250mL)中，冰浴冷却。按次序加入对甲苯磺酰氯(7.62g，42mmol)、TEA(4.25g，42mmol)和DMAP(0.12g，0.1mmol)，冰浴下搅拌1h，后室温搅拌12h。反应液依次用饱和NaHCO₃(2×300mL)和饱和食盐水(300mL)洗涤，无水Na₂SO₄干燥。浓缩后用DCM/正己烷体系重结晶。将重结晶物(4.6g，10mmol)溶于丙酮中，加入叠氮钠(1.9g，30mmol)，回流48h。浓缩溶剂，柱层析分离，以石油醚/乙酸乙酯(体积比2∶1)进行洗脱，得单体2(¹H NMR(CDCl₃)：3.65-3.69(m，8H)，3.37(t，J＝5.2Hz，4H))。单体2的结构式如下：

实施例5四种聚合物的合成

四种聚合物根据所用的单体不同，依次编号为A1、A2、B1和B2。

A1的具体合成方法为：将单体A(0.31g，1mmol)和单体1(0.16g，1mmol)溶于叔丁醇(1mL)中，将无水CuSO₄(0.032g，0.2mmol)溶于水中(0.5mL)，混合两溶液，放入塞有胶塞的小圆底烧瓶中，充N₂保护，放入50℃油浴中，边搅拌边用一细针筒逐滴加入溶于水(0.5mL)的维生素C钠盐(0.079g，0.4mmol)，50℃恒温反应24h。旋转蒸发除去叔丁醇和少部分水后，粘稠物沉于反应瓶底。吸走上层水溶液后，旋干。加入DCM/三氟乙酸TFA(体积比1∶1)10mL，常温反应3h后旋干。粘稠物用水复溶，用NaOH调节pH值呈碱性后装入透析袋中(截流分子量Mw7000)，用0.01MHCl透析24h后用纯水透析3天，冻干。得到产物A1(¹H NMR(D₂O)：7.94 (s，2H)，4.34-4.29(m，4H)，3.70(bs，4H)，3.39-3.45(m，4H)，2.75-2.87(m，4H))。

聚合物A1的结构式如下：

A2的具体合成方法为：将单体A(0.31g，1mmol)和单体2(0.20g，1mmol)溶于叔丁醇(1mL)中，将无水CuSO₄(0.032g，0.2mmol)溶于水中(0.5mL)，混合两溶液，放入塞有胶塞的小圆底烧瓶中，充N₂保护，放入50℃油浴中，边搅拌边用一细针筒逐滴加入溶于水(0.5mL)的维生素C钠盐(0.079g，0.4mmol)，50℃恒温反应24h。旋转蒸发除去叔丁醇和少部分水后，粘稠物沉于反应瓶底。吸走上层水溶液后，旋干。加入DCM/TFA(体积比1∶1)10mL，常温反应3h后旋干。粘稠物用水复溶，用NaOH调节pH值呈碱性后装入透析袋中(截流分子量Mw7000)，用0.01M HCl透析24h后用纯水透析3天，冻干。得到产物A2(¹H NMR(D₂O)：8.05(s，2H)，4.50(bs，4H)，3.82(bs，4H)，3.61(bs，8H)，3.20(bs，4H))。聚合物A2的结构式如下：

B1的具体合成方法为：将单体B(0.45g，1mmol)和单体1(0.16g，1mmol)溶于叔丁醇(1mL)中，将无水CuSO₄(0.032g，0.2mmol)溶于水中(0.5mL)，混合两溶液，放入塞有胶塞的小圆底烧瓶中，充N₂保护，放入50℃油浴中，边搅拌边用一细针筒逐滴加入溶于水(0.5mL)的维生素C钠盐(0.079g，0.4mmol)，50℃恒温反应24h。旋转蒸发除去叔丁醇和少部分水后，粘稠物沉于反应瓶底。吸走上层水溶液后，旋干。加入DCM/TFA(体积比1∶1)10mL，常温反应3h后旋干。粘稠物用水复溶，用NaOH调节pH值呈碱性后装入透析袋中(截流分子量Mw7000)，用0.01M HCl透析24h后用纯水透析3天，冻干。得到产物B1(¹H NMR(D₂O)：8.07(s，2H)，4.53(bs，4H)，3.91(bs，4H)，3.61(bs，4H)，2.17-3.22(m，8H))。聚合物B1的结构式如下：

B2的具体合成方法为：将单体B(0.45g，1mmol)和单体2(0.20g，1mmol)溶于叔丁醇(1mL)中，将无水CuSO₄(0.032g，0.2mmol)溶于水中(0.5mL)，混合两溶液，放入塞有胶塞的小圆底烧瓶中，充N₂保护，放入50℃油浴中，边搅拌边用一细针筒逐滴加入溶于水(0.5mL)的维生素C钠盐(0.079g，0.4mmol)，50℃恒温反应24h。旋转蒸发除去叔丁醇和少部分水后，粘稠物沉于反应瓶底。吸走上层水溶液后，旋干。加入DCM/TFA(体积比1∶1)10mL，常温反应3h后旋干。粘稠物用水复溶，用NaOH调节pH值呈碱性后装入透析袋中(截流分子量Mw7000)，用0.01M HCl透析24h后用纯水透析3天，冻干。得到产物B2(¹H NMR(D₂O)：8.23(s，2H)，4.54-4.60(m，4H)，3.88(s，4H)，3.53-3.63(m，8H)，3.14-3.20(m，8H))。聚合物B2的结构式如下：

聚合物的重均分子量随着聚合反应时间延长而增加，也随着单体投料量增加而增加。

以聚合物B2为例。选择单体投料量为0.5mol/L，聚合物重均分子量随聚合反应时间变化趋势如下表所示，结果经GPC(Waters凝胶色谱仪)测定。

表1聚合物重均分子量随反应时间的变化趋势

反应时间(小时) Mw(千道尔顿)

2 5.43

8 7.25

16 15.38

24 19.32

48 20.13

注：Mw代表聚合物的重均分子量。

确定聚合反应时间为24小时，聚合物B2重均分子量随单体投料量变化趋势如下表：

表2聚合物重均分子量随单体投料量的变化趋势

单体投料量(mol/L) Mw(千道尔顿)

0.1 5.06

0.25 10.49

0.5 19.32

1 32.15

2 50.76

从表1中可以看出，聚合物重均分子量随聚合反应时间增加而提高，但聚合反应24小时后，聚合物分子量基本不再提高。从表2中可以看出，聚合物重均分子量随单体投料量的增加而提高。

实施例6由实施例5制备的四种阳离子聚合物和DNA组成的纳米复合物的制备

将实施例5制备的四种阳离子聚合物分别用去离子水溶解，配成0.1～10毫克/毫升的溶液；将质粒DNA(为含有绿色荧光蛋白基因的质粒DNA，质粒编号为pEGFP-N1 vector，GenBank Accession #U55762)用去离子水溶解，得到浓度为0.2毫克/毫升的DNA溶液；按阳离子聚合物与质粒DNA体积比1∶1在涡旋混合仪上混合30秒，室温静置0.5～1小时，阳离子聚合物和质粒DNA通过静电自组装成纳米复合物。

实施例7凝胶阻滞实验

按实施例6的方法，制得一系列不同N/P比的四种聚合物和质粒DNA的纳米复合物。分别取每种配比的样品20微升，用10微升纯质粒作参照，1％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，经凝胶成像系统(UVP公司BioimagingSystems)拍摄。结果如图1所示。

图1中(A)、(B)、(C)和(D)分别为聚合物A1、A2、B1和B2与质粒DNA形成的纳米复合物的凝胶电泳图。各图中，第一电泳道为纯质粒对照，第二到第八道分别为聚合物与质粒DNA的N/P比为1，2，4，8，16，32，64。从图1中可以看出，聚合物可以很好地压缩DNA，在N/P为2时即可完全阻滞DNA的迁移。

实施例8细胞毒性实验

以人乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞为测试细胞系(细胞购自美国标准生物品收藏中心(ATCC))。

细胞培养方法：取出液氮中冻存的细胞，在37℃的温水中解冻，将细胞悬液移入15ml离心管中，加5ml 1640完全培养液，轻轻吹打均匀，置于离心机中，3000rpm离心5min，弃去上清液，加入2ml 1640完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞悬液加入培养皿中，补加6ml 1640完全培养液，将培养皿置于5％CO₂，37℃培养箱中培养。

细胞毒性实验：将MDA-MB-468细胞以2×10⁴个细胞/孔的密度接种到96孔培养板中，培养24h后，更换培养液为新鲜血清培养液，并加入不同浓度的聚合物A1、A2、B1和B2，不加聚合物的孔设为空白对照。孵育24h后，吸弃孔中溶液，用PBS洗涤3遍，加入新鲜培养液180μl，同时每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，继续在37℃、5％CO₂(相对湿度90％)培养箱中培养4h后，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入150μl DMSO，避光振荡10min使结晶物充分溶解。以酶标仪检测570nm处的吸收度(A)，按照以下公式计算：细胞存活率％＝(试验组平均A值/空白对照组平均A值)×100％。

四种聚合物的细胞毒性结果如图2所示(图中，各浓度下从左至右依次为A1、A2、B1和B2)。从图2中可以看出，聚合物对细胞毒性很小，在100微克/毫升浓度下，细胞存活率依然能高达75％。

实施例9体外转染实验

以人胚肾细胞HEK 293细胞(细胞购自美国标准生物品收藏中心(ATCC))和人乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞为测试细胞系(细胞购自美国标准生物品收藏中心(ATCC))。

HEK293细胞培养方法：取出液氮中冻存的细胞，在37℃的温水中解冻，将细胞悬液移入15ml离心管中，加5ml 1640完全培养液，轻轻吹打均匀，置于离心机中，3000rpm离心5min，弃去上清液，加入2ml DMEM完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞悬液加入培养皿中，补加6ml DMEM完全培养液，将培养皿置于5％CO₂，37℃培养箱中培养。

MDA-MB-468细胞培养方法：取出液氮中冻存的细胞，在37℃的温水中解冻，将细胞悬液移入15ml离心管中，加5ml 1640完全培养液，轻轻吹打均匀，置于离心机中，3000rpm离心5min，弃去上清液，加入2ml 1640完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞悬液加入培养皿中，补加6ml 1640完全培养液，将培养皿置于5％CO₂，37℃培养箱中培养。

纳米复合物制备方法：参照实施例6的方法，制备N/P为16、32和64的四种聚合物/DNA的纳米复合物。

转染方法：将细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种到24孔培养板中，置5％CO₂，37℃培养箱中。培养24h后，更换新鲜完全培养基，分别加入纳米复合物，孵育24h后，吸弃孔中溶液，加入新鲜完全培养基，继续培养24h。以w/w 3∶1的PEI/DNA纳米粒(PENs)作为阳性对照，在无血清条件下培养2h后换新鲜完全培养基。培养结束后，荧光显微镜(Olympus公司IX71型)观察并拍照。

图3中列出四种聚合物与质粒DNA在最优化配比转染结果图片。(A)为N/P比为32的A1/DNA纳米复合物在HEK293细胞中的转染；(B)为N/P比为32的A1/DNA纳米复合物在MDA-MB-468细胞中的转染；(C)为N/P比为32的A2/DNA纳米复合物在HEK293细胞中的转染；(D)为N/P比为32的A2/DNA纳米复合物在MDA-MB-468细胞中的转染；(E)为N/P比为32的B1/DNA纳米复合物在HEK293细胞中的转染；(F)为N/P比为32的 B1/DNA纳米复合物在MDA-MB-468细胞中的转染；(G)为N/P比为32的B2/DNA纳米复合物在HEK293细胞中的转染；(H)为N/P比为32的B2/DNA纳米复合物在MDA-MB-468细胞中的转染；(I)为阳性对照PENs在HEK293细胞中的转染；(J)为阳性对照PENs在MDA-MB-468细胞中的转染。

从图3中可以看出，四种聚合物在最优化配比下均能有效转染HEK293和MDA-MB-468两个细胞株。

综上所述，本发明的Click聚合物合成方便，结构可调，用该聚合物制备的基因非病毒载体具有生物相容性高、毒性低、转染效率高等特点。

Claims

1.一种阳离子聚合物，其具有式I所示的结构：

式I中，n为聚合物的重复单元的个数；x为1或2；y为1或2。

2.根据权利要求1所述的阳离子聚合物，其中，所述阳离子聚合物的重均分子量为5-50千道尔顿。

3.根据权利要求1所述的阳离子聚合物，其中，所述阳离子聚合物为聚[1-(一缩二乙二醇)-4-(1,7-二甲酰胺基二乙烯三胺)-三氮唑]、聚[1-(一缩二乙二醇)-4-(1,10-二甲酰胺基三乙烯四胺)-三氮唑]、聚[1-(二缩三乙二醇)-4-(1,7-二甲酰胺基二乙烯三胺)-三氮唑]、聚[1-(二缩三乙二醇)-4-(1,10-二甲酰胺基三乙烯四胺)-三氮唑]或其混合物。

4.权利要求1所述的阳离子聚合物的制备方法，该方法包括以下步骤：

步骤1：含有保护基的炔基化单体的合成，包括以下步骤：

其中，x为1或2，R为保护基，

步骤a：使二乙烯三胺或三乙烯四胺和三氟乙酸乙酯反应，先冰浴搅拌，待反应液温度升至室温后继续搅拌，得到末端的两个伯胺被三氟乙酰基保护的化合物，

步骤b：使上述末端的两个伯胺被三氟乙酰基保护的化合物与氨基保护试剂反应，用三乙胺催化，得到仲胺被保护基保护的化合物，

步骤c：使上述仲胺被保护基保护的化合物在含有K₂CO₃的甲醇/水体系中回流后脱除三氟乙酰基，得到末端两个伯胺未被保护而仲胺被保护基保护的化合物，

步骤d：使末端两个伯胺未被保护而仲胺被保护基保护的化合物与二环己基碳二亚胺和丙炔酸反应，得到炔基化的含有保护基的二乙烯三胺或三乙烯四胺；

步骤2：叠氮化单体的合成，包括以下步骤：

其中，y为1或2，

步骤e：将二乙二醇或三乙二醇与对甲苯磺酰氯反应，以三乙胺和4-二甲氨基吡啶为催化剂，得到对甲苯磺酰基取代的二乙二醇或三乙二醇，

步骤f：将对甲苯磺酰基取代的二乙二醇或三乙二醇与叠氮钠反应，得到叠氮化的二乙二醇或三乙二醇；

步骤3：聚合物的合成，包括以下步骤：

其中，n为聚合物的重复单元的个数；x为1或2；y为1或2；R为保护基，

将上述炔基化单体和上述叠氮化单体按等摩尔当量在无水CuSO₄和维生素C钠盐催化下，进行Click聚合反应，所得聚合物在DCM/三氟乙酸中脱除保护基，然后通过透析除杂，得到产物。

5.一种根据权利要求1所述的阳离子聚合物/核酸的纳米复合物。

6.权利要求5所述的纳米复合物的制备方法，该方法包括：将权利要求1所述的阳离子聚合物和质粒DNA分别用去离子水溶解，混合，室温静置，阳离子聚合物和质粒DNA通过静电自组装成纳米复合物。

7.权利要求5所述的纳米复合物用于将核酸递送到细胞中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述核酸为含有编码遗传标记的质粒DNA序列，所述遗传标记为绿色荧光蛋白基因。

9.权利要求1所述的阳离子聚合物用于非病毒型基因载体的用途。