CN117843603A - 一种可电离脂质材料及其在制备核酸递送载体中的应用 - Google Patents

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崔可鑫
孔丽
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Abstract

本发明属于纳米材料技术领域，涉及一种可电离脂质材料及其在制备核酸递送载体中的应用。本发明可电离脂质包括可电离氨基头部，可电离氨基头部分别与至少一个连接臂共价连接，各个连接臂分别与疏水头部共价连接；可电离氨基头部含有至少一个叔胺结构，且含有氢键结合位点；连接臂含有化学敏感区。本发明核酸递送载体包括的可电离脂质，还包括胆固醇、结构脂质和聚乙二醇。所本发明核酸递送载体在低细胞毒性的基础上，不仅能够提供较强的核酸压缩能力，还能提高递送载体被细胞摄取以及内吞后溶酶体逃逸效率，具有较好的临床应用前景。

Description

一种可电离脂质材料及其在制备核酸递送载体中的应用
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，更具体地，涉及一种可电离脂质材料及其在制备核酸递送载体中的应用，涉及了一个应用于核酸递送载体的可电离脂质材料的合成及核酸递送载体的配方确定。
背景技术
目前，在很多疾病领域，基因治疗已被认为是一种强有力的手段，包括肿瘤、炎性疾病和病毒感染等。但是，核酸药物进入细胞面临两大挑战，一个是RNA暴露在血液中容易被血浆和组织中的RNase酶降解，而且会造成免疫原性；另一个是带负电的RNA难以跨膜进入胞内。因此，发展一种能够在体内环境保护核酸不被降解，同时又能够帮助核酸跨过细胞膜的载体十分重要。
目前核酸递送常用的载体可分为重组病毒载体和非病毒载体。病毒载体以逆转录病毒及腺病毒为代表；病毒载体转染效率高，但是制备及纯化困难，携载核酸容量小，且具有潜在致病性。因此，非病毒载体得以快速发展。非病毒载体主要以阳离子聚合物或者阳离子脂质为主，阳离子的特性使其具有较强的核酸压缩能力；但与此同时，较强的静电吸附作用也会导致核酸药物难以释放的问题，而阳离子与细胞膜的相互作用也是不容忽视的安全威胁。
新冠mRNA疫苗的成功应用让我们看到了脂质纳米颗粒更好的应用前景。可电离脂质的加入，仅通过载药前后pH的变化便可兼顾载药量和安全性之间的平衡。同时，利用静电吸附作用，质子化的可电离脂质可帮助核酸药物在酸性内体中实现成功逃逸。
因此，如何最大化降低脂质纳米粒的毒性并利用可电离脂质的优势成功向靶细胞和组织递送核酸药物是本领域期望解决的技术问题。
发明内容
本发明解决了现有技术中核酸药物在体内容易逃逸的技术问题，提供了一种可电离脂质材料及其在制备核酸递送载体中的应用，本发明中可电离脂质促进纳米粒中的核酸包封，并介导核内体膜破坏从而使核酸释放到细胞质中。本发明核酸递送载体具有较高的核酸包封率和核酸递送活性。
根据发明第一方面，提供了一种可电离脂质，所述可电离脂质包括可电离氨基头部和疏水头部，所述可电离氨基头部与至少一个连接臂共价连接，所述连接臂与疏水头部共价连接；
所述可电离氨基头部含有至少一个叔胺结构；
所述连接臂含有化学敏感键，所述化学敏感键为能在氧化还原条件下断裂的氧化还原敏感键、不同pH条件下断裂的pH敏感键、酶催化条件下断裂的酶敏感键或温度条件下断裂的温度敏感键。
优选地，所述连接臂含有碳碳单键、酰胺键或酯键。
优选地，所述可电离氨基头部还含有氢键结合位点。
优选地，所述疏水头部为维生素E、肉豆蔻醇、棕榈醇、2-辛基十二醇、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈油酸、油酸或亚油酸。
根据本发明另一方面，提供了任意一项所述的可电离脂质用于制备核酸递送载体的应用。
根据本发明另一方面，提供了一种核酸递送载体，所述核酸递送载体包括任意一项所述的可电离脂质，还包括胆固醇、结构脂质和聚乙二醇，所述结构脂质能自发地形成脂质双层结构；
所述核酸递送载体中，所述可电离脂质与结构脂质的物质的量之比为(10-1):1；可电离脂质与结构脂质的物质的量总和占比大于等于40％；所述聚乙二醇的物质的量占比小于等于2％。
优选地，所述结构脂质为1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰胆碱或双十八烷基溴化铵。
根据本发明另一方面，提供了所述的核酸递送载体在递送核酸中的应用，所述应用具体为：将所述核酸递送载体溶于有机醇中形成醇相，将待递送的核酸溶于水中形成水相，将所述醇相和水相进行混合，使所述核酸递送载体形成脂质纳米粒，所述核酸包封在该脂质纳米粒中；
优选地，所述核酸为单链DNA、双链DNA、环状DNA、siRNA、miRNA或mRNA。
优选地，所述核酸递送载体与核酸的质量比为(5-20):1。
优选地，所述脂质纳米粒的粒径范围为80-250nm；
优选地，所述脂质纳米粒的粒径范围为80-150nm。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)本发明的核酸递送载体含有全新的可电离脂质结构，该结构的疏水尾部被设计为维生素E，维生素E骨架中的芳香结构和较长的烷基侧链赋予其较强的核酸压缩能力，可电离脂质的可电离特性使其在增强内涵体逃逸性能的同时具有较低的免疫原性。并且本发明通过大量筛选研究发现了脂质纳米粒的四种组分比例对转染效果的显著影响并确认了适用于核酸递送的优化比例。除此之外，本发明中核酸递送载体的制备方法简单、高效，易于操作，具有较大的临床转化潜力。
(2)本发明可电离脂质有两个关键的功能：一是促进纳米粒中的核酸包封，二是介导核内体膜破坏从而使核酸释放到细胞质中；辅助脂质作为纳米粒配方的结构脂质，它们可以自发地组织成脂质双层，并且较高的相变温度可以增强纳米粒的膜稳定性；胆固醇的加入能够增加膜的刚性，减少所包载药物的药物渗漏；PEG-脂质决定了纳米粒的群体大小和分散性，有利于预防聚集以及制备和存储过程中颗粒的稳定性。
(3)由于核酸药物具有高电负性、入胞难、非肝脏组织中富集率低等问题，核酸载体对于核酸药物的递送必不可少。目前递送核酸的常用载体主要分为病毒载体和非病毒载体。虽然病毒载体具有高效性的核酸转染效率，但由于其制作工艺复杂、难以控制；有较强免疫原性，易发生整合，因此其临床应用受限。非病毒载体主要包括脂质纳米粒子、聚合物纳米粒子和无机纳米粒子等。在非病毒载体的协助下，核酸药物的稳定性和体内循环时间被大大提高。本发明中的核酸递送载体，充分考虑了免疫原性和重复给药的问题，通过大量的筛选研究确定了各组分的配比。
附图说明
图1至图13依次为为实施例1至实施例11中所涉及具体实施例中的中间产物及合成可电离脂质的核磁共振氢谱图。
图14为合成可电离脂质对应纳米粒的粒径检测数据。
图15为合成可电离脂质对应纳米粒的核酸包载效率。
图16、17为合成可电离脂质对应纳米粒的pDNA体外递送活性。
图18、19为合成可电离脂质对应纳米粒的siRNA体外递送活性。
图20、21、22为合成可电离脂质对应纳米粒的mRNA体外递送活性。
图23、24为合成可电离脂质对应纳米粒的mRNA体内递送活性。
图25为本发明可电离脂质材料的示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本申请中可电离脂质的结构主要包括疏水尾部、连接臂和可电离氨基头部三部分。考虑到低毒的前提，本发明中以维生素E作为疏水尾部为例；此外，维生素E的芳香结构和合适链长也是决定性因素。可电离氨基头部在保证pH满足8-10的基础上，赋予了氢键结合位点以进一步提高转染效率。所述可电离氨基头部含有至少一个叔胺结构，且含有氢键结合位点；所述连接臂含有含有化学敏感区，所述化学敏感键为能在氧化还原条件下断裂的氧化还原敏感键、pH条件下断裂的pH敏感键、酶催化条件下断裂的酶敏感键或温度条件下断裂的温度敏感键。图25为本发明可电离脂质材料的示意图，其中红色部分为可电离氨基头部，蓝色部分为连接臂，蓝色部分为疏水尾部。
本发明可电离脂质材料的反应方程式及结构式为：
本发明一方面，本发明以维生素E为基础，合成了一个可电离脂质材料库，并从该材料库中选取结构与胆固醇、辅助脂质、聚乙二醇2000以特定比例自组装形成了脂质纳米粒作为核酸递送载体实现核酸药物的高效递送。
所述可电离脂质材料库中结构疏水尾部、连接臂和可电离氨基头部结构具有多样性。
所述辅助脂质主要包含1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)和双十八烷基溴化铵(DDAB)。
所述聚乙二醇2000包含DMG-PEG 2000和DSPE-PEG 2000两种不同化合物。
另一方面，本发明提供一种如上所述的核酸递送载体的制备方法，所述制备方法为：维生素E与特定连接臂反应后，再与可电离氨基头部通过迈克尔加成反应或缩合反应以共价键的形式将二者连接，以此得到可电离脂质，而后可电离脂质与上述三组分以特定比例混合后自组装得到具有pH敏感特性的脂质纳米粒，即为所述核酸递送载体。
在本发明中，所述可电离脂质材料库的合成原则是：合成反应简单，易实现大规模合成。
在本发明中，维生素E与丙烯酰氯反应得到维生素E丙烯酸酯，然后按照特定的摩尔比与所述可电离氨基头部发生迈克尔加成反应，得到迈克尔加成产物VM。
优选地，所述迈克尔加成产物VM的具体制备方法包括以下步骤：
(1)将维生素E、无水三乙胺溶于有机溶剂中，在冰水浴条件下加入丙烯酰氯，搅拌反应4-8h，得到丙烯酰化维生素E；
(2)将丙烯酰化维生素E与可电离氨基头部按照特定摩尔比混合均匀，于90-95℃下搅拌反应48-72h，得到所述迈克尔加成产物VM。
(3)将上述迈克尔加成产物VM溶于有机溶剂后，通过柱层析技术得到纯化的迈克尔加成产物VM。
优选地，步骤(1)所述有机溶剂为无水二氯甲烷和/或无水三氯甲烷。
优选地，步骤(1)所述无水三乙胺与丙烯酰氯的摩尔比为(1.5-2):1。
优选地，步骤(1)所述丙烯酰氯与维生素E的投入摩尔比为(1.2-1.5):1，加入方法为在冰水浴条件下通过恒压滴液漏斗逐滴加入。
优选地，步骤(1)所得反应液经抽滤除去三乙胺盐酸盐后，通过柱层析技术，以石油醚:氯仿＝5:1的洗脱剂比例洗脱，收集第一组分，得到纯化后的丙烯酰化维生素E。
优选地，步骤(2)所述可电离氨基头部均含一至多个伯胺/仲胺结构，此外，还包括含有羟基结构、胺基之间通过二硫键连接的头部。
优选地，步骤(2)所述特定摩尔比是根据伯胺/仲胺结构的个数来决定的。伯胺对应两个疏水尾部，仲胺对应一个疏水尾部，以上述标准投料。
优选地，步骤(2)所述特定摩尔比的范围为(2-4):1。
优选地，为了尽可能降低非目标产物的比例，步骤(2)所述反应应保持绝对无氧条件，在氮气保护环境下反应。
优选地，步骤(3)所述有机溶剂为无水二氯甲烷和/或无水三氯甲烷。
优选地，步骤(3)所述柱层析技术采用干法过柱的方式，以石油醚:乙酸乙酯＝3:1的洗脱剂比例除去丙烯酰化维生素E；以二氯甲烷:甲醇＝10:1的洗脱剂比例洗脱，该比例下的第一组分即为纯化的迈克尔加成产物VM。
优选地，步骤(3)中得到的迈克尔加成产物VM经旋蒸除去溶剂冻干后置于4℃保存。
在本发明中，维生素E与酸酐反应得到具有羧基端修饰的维生素E：VE-COOH；之后VE-COOH与可电离氨基头部的氨基或羟基发生缩合反应分别得到以酰胺键连接的可电离脂质VN和以酯键连接的可电离脂质VO。
(1)将维生素E、酸酐溶于有机溶剂中，搅拌混合至完全溶解后，加入无水三乙胺，于70-75℃条件下搅拌反应36-48h。
(2)将(1)中的反应液通过旋蒸除去有机溶剂，利用柱层析技术得到纯化后的VE-COOH。
(3)将(2)中得到的VE-COOH、含有亲核基团可电离氨基头部、催化剂4-二甲氨基吡啶以及催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于有机溶剂，于25-37℃下搅拌反应16-24h，得到以酰胺键连接的可电离脂质VN和/或以酯键连接的可电离脂质VO的粗产物。
(4)将(3)中的反应液旋蒸除去有机溶剂，利用柱层析技术得到纯化后的可电离脂质VN和/或可电离脂质VO。
优选地，步骤(1)所述有机溶剂为无水二氯甲烷和/或无水三氯甲烷。
优选地，步骤(3)中所述亲核基团为羟基和/或氨基结构。
优选地，步骤(3)中所述VE-COOH和可电离氨基头部的反应摩尔比为(2-4):1。
在本发明中，该脂质纳米粒的自组装是通过乙醇注入法实现的，具体包括以下步骤：
(1)将可电离脂质、胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇2000溶于乙醇相中，之后将所述乙醇相在搅拌条件下快速注入溶有核酸药物的水相中，挥发除去有机溶剂乙醇。
(2)将步骤(1)中得到的脂质纳米粒混悬液置于透析袋中，以TBS为外相，透析处理过夜后得到可注射用脂质纳米粒混悬液。
所述脂质纳米粒是由在受控环境中快速混合两种混相引起的介质极性快速增加而形成的，快速混合诱导脂质分子的过饱和，从而导致脂质纳米粒的自组装。
优选地，所述核酸递送载体的粒径为80-250nm；优选地，粒径范围在80-150nm。
优选地，所述核酸包括单链DNA、双链DNA、环状DNA、siRNA、miRNA或mRNA。
优选地，步骤(1)中所述水相与乙醇相的体积比为(3-5):1。
优选地，步骤(1)所述乙醇相中的磷脂浓度为5-20mg/mL。
优选地，步骤(1)所述搅拌条件即：搅拌速率800r/min，搅拌时间8-12h。
优选地，步骤(2)中所述透析袋的截留分子量为3.5kb
优选地，步骤(2)中所述TBS为：20mM的Tris，0.9％氯化钠，pH＝7.4本发明制备所述脂质纳米粒的方法简单、高效、易于操作。
另一方面，本发明提供了如上所述的核酸递送载体在递送各种核酸药物中的应用。
优选地，所述应用中，脂质纳米粒自组装时乙醇相中总磷脂与水相中核酸药物的质量比为(5-20):1；更优选地质量比为10:1。
本发明提供一种具有较好的核酸递送效果的四种组分配比范围，具有较好的核酸包封率、内涵体逃逸效率以及核酸递送系统本身的稳定性。
优选地，可电离脂质与辅助脂质的摩尔比为(10-1):1；
优选地，可电离脂质与辅助脂质的占比总和大于等于40％；
优选地，聚乙二醇2000的含量小于等于2％；更优选地，大于等于0.5％。
以下为具体实施例
实施例1
VM-A的合成
根据方法1按照以下步骤制备得到化合物VM-A：
步骤1
丙烯酰化维生素E(VE-AC)的合成：将12g维生素E(1eq，分子量416.68，28.8mmol，)、4.8mL三乙胺(1.2eq，分子量101.19，34.56mmol)溶于无水二氯甲烷中，在冰水浴条件下，于通风橱内用恒压滴液漏斗缓慢滴入4.8mL丙烯酰氯(2eq，分子量90.5，57.6mmol)。
VE-AC核磁氢谱图如图1所示，1HNMR(400MHz，CDCl3)δ6.61(d,J＝17.3Hz,1H),6.35(dd,J＝17.3,10.4Hz,1H),5.99(d,J＝10.5Hz,1H),2.58(t,J＝6.8Hz,2H),2.08(s,3H),2.00(s,3H),1.95(s,3H),1.83–1.70(m,2H),1.55–1.21(m,18H),1.15–1.02(m,6H),0.87–0.80(m,12H).
步骤2
称取82mg N-(3-氨基丙基)二乙醇胺(1eq，76μL，分子量162.23，0.5mmol)和458mgVE-AC(2eq，分子量456.7110，1mmol，)置于圆底烧瓶中，反应不加有机溶剂，氮气保护条件下高温90–95℃反应，得到浅褐色油状物VM-A-1。将粗产物VM-A-1通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇＝10:1)进行纯化，得到最终的油状产物VM-A。
VM-A核磁氢谱图如图2所示，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.60(s,2H),2.94–2.82(m,4H),2.74–2.63(m,8H),2.59–2.46(m,8H),2.00(s,6H),1.93(s,6H),1.89(s,6H),1.75–1.67(m,6H),1.48–1.40(m,6H),1.35–1.27(m,8H),1.21–0.97(m,38H),0.81–0.73(m,24H).
实施例2
VM-B的合成
称取47.4mg 1-(2-氨乙基)吡咯烷(分子量114.19，0.943g/ml，0.415mmol)和458mg VE-AC(2eq，分子量456.7110，1mmol，)置于圆底烧瓶中，反应不加有机溶剂，氮气保护条件下高温90–95℃反应，得到浅褐色油状物VM-B-1。将粗产物VM-B-1通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇＝10:1)进行纯化，得到最终的油状产物VM-B。
VM-B核磁氢谱图如图3所示，1HNMR(400MHz，CDCl3)δ2.99(t,J＝6.9Hz,4H),2.89–2.75(m,8H),2.56(t,J＝6.6Hz,4H),2.06(s,6H),1.98(s,6H),1.94(s,6H),1.90–1.69(m,2H),1.55–1.46(m,6H),1.43–1.00(m,45H),0.87–0.80(m,24H).
实施例3
VM-C的合成
称取47.87mg N,N-二乙基乙二胺(分子量116.2，0.412mmol)和458mg VE-AC(2eq，分子量456.7110，1mmol，)置于圆底烧瓶中，反应不加有机溶剂，氮气保护条件下高温90–95℃反应，得到浅褐色油状物VM-C-1。将粗产物VM-C-1通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇＝10:1)进行纯化，得到最终的油状产物VM-C。
VM-C核磁氢谱图如图4所示，1HNMR(400MHz，CDCl3)δ3.00(t,J＝7.1Hz,4H),2.81–2.53(m,16H),2.06(s,6H),1.99(s,6H),1.95(s,6H),1.85–1.67(m,6H),1.56–1.45(m,6H),1.43–1.32(m,8H),1.28–1.20(m,18H),1.15–1.02(m,18H),0.87–0.81(m,24H).
实施例4
VM-D的合成
称取53.65mg 3-二乙胺基丙胺(分子量130.23，0.412mmol)和458mg VE-AC(2eq，分子量456.7110，1mmol，)置于圆底烧瓶中，反应不加有机溶剂，氮气保护条件下高温90–95℃反应，得到浅褐色油状物VM-D-1。将粗产物VM-D-1通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇＝10:1)进行纯化，得到最终的油状产物VM-D。
VM-D核磁氢谱图如图5所示，1HNMR(400MHz，CDCl3)δ3.00(t,J＝7.1Hz,4H),2.78(t,J＝7.1Hz,4H),2.72–2.53(m,12H),2.08(s,6H),2.01(s,6H),1.97(s,6H),1.85–1.71(m,8H),1.60–1.46(m,8H),1.39–1.07(m,44H),0.89–0.82(m,24H).
实施例5
VM-E的合成
称取42.10mg 3-二甲胺基丙胺(分子量102.18，0.412mmol)和458mg VE-AC(2eq，分子量456.7110，1mmol，)置于圆底烧瓶中，反应不加有机溶剂，氮气保护条件下高温90–95℃反应，得到浅褐色油状物VM-E-1。将粗产物VM-E-1通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇＝10:1)进行纯化，得到最终的油状产物VM-E。
VM-E核磁氢谱图如图6所示，1HNMR(400MHz，CDCl3)δ2.97(t,J＝7.1Hz,4H),2.76(t,J＝7.1Hz,4H),2.62–2.53(m,6H),2.29(s,6H),2.06(s,6H),1.99(s,6H),1.95(s,6H),1.81–1.70(m,8H),1.55–1.46(m,6H),1.41–1.19(m,30H),1.14–1.02(m,12H),0.86–0.81(m,24H).
实施例6
VM-F的合成
称取52.82mg N-乙基-2-氨甲基吡咯烷(分子量128.2190，0.412mmol)和458mgVE-AC(2eq，分子量456.7110，1mmol，)置于圆底烧瓶中，反应不加有机溶剂，氮气保护条件下高温90–95℃反应，得到浅褐色油状物VM-F-1。将粗产物VM-F-1通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇＝10:1)进行纯化，得到最终的油状产物VM-F。
VM-F核磁氢谱图如图7所示，1HNMR(400MHz，CDCl3)δ3.08–2.87(m,4H),2.76(t,J＝7.0Hz,4H),2.61–2.54(m,5H),2.45(s,3H),2.06(s,6H),1.99(s,6H),1.94(s,6H),1.82–1.67(m,10H),1.57–1.45(m,8H),1.26(dd,J＝35.4,23.6Hz,32H),1.14–1.03(m,12H),0.85–0.81(m,24H).
实施例7
VM-G的合成
称取36.3178mg N,N-二甲基乙二胺(分子量88.15，0.412mmol)和458mg VE-AC(2eq，分子量456.7110，1mmol，)置于圆底烧瓶中，反应不加有机溶剂，氮气保护条件下高温90–95℃反应，得到浅褐色油状物VM-G-1。将粗产物VM-G-1通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇＝10:1)进行纯化，得到最终的油状产物VM-G。
VM-G核磁氢谱图如图8所示，1HNMR(400MHz，CDCl3)δ3.01(t,J＝7.2Hz,4H),2.77(t,J＝7.2Hz,4H),2.71–2.66(m,2H),2.56(t,J＝6.6Hz,4H),2.48–2.43(m,2H),2.25(s,6H),2.06(s,6H),1.99(s,6H),1.95(s,6H),1.83–1.68(m,6H),1.55–1.46(m,6H),1.37–1.20(m,28H),1.14–1.03(m,12H),0.85–0.81(m,24H).
实施例8
VM-H的合成
称取53.63mg N,N-二甲基亚二丙基三胺(分子量159.27，0.333mmol)和458mg VE-AC(3eq，分子量456.7110，1mmol，)置于圆底烧瓶中，反应不加有机溶剂，氮气保护条件下高温90–95℃反应，得到浅褐色油状物VM-H-1。将粗产物VM-H-1通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇＝10:1)进行纯化，得到最终的油状产物VM-H。
VM-H核磁氢谱图如图9所示，1HNMR(400MHz，CDCl3)δ3.01–2.88(m,6H),2.78–2.68(m,6H),2.59–2.39(m,14H),2.28(s,6H),2.05(s,9H),1.99(s,9H),1.95(s,9H),1.79–1.67(m,9H),1.56–1.45(m,9H),1.38–1.02(m,64H),0.86–0.81(m,36H).
实施例9
VN-A的合成
根据方法2按照以下步骤制备得到化合物VN-A：
步骤1
称取4.3g维生素E(VE)、1.5g丁二酸酐(SA)和3.15g的三乙胺置于100mL圆底烧瓶中，加入50mL二氯甲烷。70℃搅拌溶解后，继续回流反应24h。旋蒸浓缩溶剂，得到黄色油状的粗产物VE-COOH-1。将上述粗产物通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)进行纯化，得到纯化后的油状产物VE-COOH。
VE-COOH核磁氢谱图如图10所示，1HNMR(600MHz，CDCl3)δ2.86(t,J＝6.6Hz),2.76(t,J＝6.6Hz),2.51(t,J＝6.7Hz),2.01(s),1.94(s),1.90(s),1.76–1.65(m),1.53–1.42(m),1.37–1.15(m),1.08–0.97(m),0.80–0.76(m).
步骤2
称取424.632mg VE-COOH(分子量530.79；0.8mmol)、115mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl；分子量191.7；0.6mmol)、25mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP；分子量122.17，0.2mmol)于10mL圆底烧瓶中，1mL二氯甲烷溶解；活化1h后加入23.44mgN-甲基-2,2'-二氨基二乙胺(分子量117.19，0.515mmol)和111μL三乙胺(分子量101.19，0.8mmol)，反应24h后得到黄色油状粗产物VN-A-1。将上述粗产物VN-A-1通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)进行纯化，得到纯化后的淡黄色油状产物VN-A。
VN-A核磁氢谱图如图11所示，1HNMR(600MHz，CDCl3)δ3.38(s),2.93(t,J＝6.2Hz),2.68(s),2.57(t,J＝6.8Hz),2.36(s),2.07(s),1.99(s),1.95(s),1.81–1.72(m),1.58–1.48(m),1.44–1.21(m),1.16–1.02(m),0.87–0.83(m).
实施例10
VN-B的合成
称取424.632mg VE-COOH(分子量530.79；0.8mmol)、115mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl；分子量191.7；0.6mmol)、25mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP；分子量122.17，0.2mmol)于10mL圆底烧瓶中，1mL二氯甲烷溶解；活化1h后加入29mg N'N-双(3-氨丙基)甲胺(32.24μl，分子量145.25，0.2mmol)和111μL三乙胺(分子量101.19，0.8mmol)，反应24h后得到黄色油状粗产物VN-B-1。将上述粗产物VN-B-1通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)进行纯化，得到纯化后的淡黄色油状产物VN-B。
VN-B核磁氢谱图如图12所示，1HNMR(400MHz，CDCl3)δ6.79(s,2H),3.30–3.17(m,1H),2.97–2.88(m,4H),2.63–2.41(m,12H),2.28(s,3H),2.05(s,6H),1.97(s,6H),1.93(s,6H),1.77–1.66(m,8H),1.59–1.43(m,8H),1.36–1.05(m,7H),0.88–0.77(m,24H).
实施例11
VN-C的合成
称取424.632mg VE-COOH(分子量530.79；0.8mmol)、115mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl；分子量191.7；0.6mmol)、25mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP；分子量122.17，0.2mmol)于10mL圆底烧瓶中，1mL二氯甲烷溶解；活化1h后加入31.85mg N,N-二甲基亚二丙基三胺(分子量159.27，0.2mmol)和111μL三乙胺(分子量101.19，0.8mmol)，反应24h后得到黄色油状粗产物VN-C-1。将上述粗产物VN-C-1通过硅胶柱色谱法(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)进行纯化，得到纯化后的淡黄色油状产物VN-C。
VN-C核磁氢谱图如图13所示，1HNMR(400MHz，CDCl3)δ3.41–3.27(m),2.97(t),2.74(t,J＝11.4,5.9Hz),2.69–2.66(m),2.63(t,J＝6.9Hz),2.56(d,J＝12.8Hz),2.07(s),2.00(s),1.97(s),1.88–1.84(m),1.80–1.77(m),1.75–1.72(m),1.54–1.50(m),1.39–1.36(m),1.28–1.24(m),1.23–1.21(m),1.15–1.12(m),1.10–1.04(m),0.87–0.83(m).
实施例12
按照物质的量之比，可电离脂质(VM-D):双十八烷基溴化铵(DDAB)＝200:1/100:1/50:1/10:1/1:1的比例，按照物质的量占比，可电离脂质VM-D+DDAB＝20％/40％/60％/80％的占比，以及物质的量之比，胆固醇(Chol):聚乙二醇(DMG-PEG)＝500:1/100:1/10:1的比例，根据以上三个因子及其不同水平，通过正交实验设计(附表1)，经乙醇注入法制备了不同配方对应的脂质纳米粒。
表1含合成可电离脂质的四组分配方占比优化
具体实施方法为：将所需的磷脂组分及用量溶于乙醇中并混匀，快速注入三倍体积的pH＝4.0的乙酸钠缓冲液(含pDNA)中；以TBS为外相透析过夜，即得最终可应用脂质纳米粒；对其进行粒径表征(附图14)，除LNP4和LNP7之外，其他配方条件下制备的纳米粒粒径均在250nm以下。
实施例13
按照实施例12对应的60个配方，我们同时测定了60个配方对应的pDNA的包封情况(附图15)，结果显示，在该正交实验设计对应的60个配方中，大部分可实现对核酸药物的完全包封。
纳米粒具体制备方法同实施例12。
实施例14
通过正交分析(同实施例12)，以VM-C为例，利用体外细胞转染实验结果，在HEK293T细胞中筛选出可用于pDNA递送的最优配方。
具体实施方法为：
步骤1：细胞培养。人胚肾细胞(HEK293T)以含10～30％胎牛血清(FBS)的培基培养，并在37℃下含5％二氧化碳的条件下孵育。
步骤2：细胞铺板。转染前24～48h，将细胞接种在细胞培养板中，并在含有10％FBS的200～1000μL新鲜培养基中培养。
步骤3：纳米粒制备。具体制备方法同实施例12。
步骤4：转染。弃去原培基，将步骤3制得的纳米粒与细胞共孵育，孵育后验证基因表达效果。
步骤5：验证GFP的表达水平。1)使用荧光显微镜拍照；2)收集细胞：加入50～150μL的胰酶消化细胞，显微镜下观察细胞变圆时，加入100～300μL的含血清的培养基终止消化，并将细胞收集到EP管中，离心；3)洗涤：弃去上述步骤的上清，加入200～600μL PBS进行洗涤，离心，弃上清，重复2～4次；4)流式细胞仪检测：加入150～300μL的PBS重悬细胞，涡旋混匀，随后进行上机测试。
结果显示，LNP14和LNP29显示出了与市售转染试剂lip3000相当的表达水平(附图16)。
实施例15
根据上述筛选出的最优配方比(LNP29)，进一步考察了纳米粒组分与核酸的质量比对转染效果的影响。
细胞转染实验具体实施方法同实施例14。
结果显示，当纳米粒组分与核酸的质量比大于10:1时，均呈现出较好的转染效果(附图17中的A)。
实施例16
按照上述筛选出的最优配方比(LNP29)和最优质量比(10:1)，验证了实施例1-7不同合成可电离脂质递送pGFP的转染效果。
细胞转染实验具体实施方法同实施例14。
结果显示，VM-B、VM-C和VM-E的转染效果与市售转染试剂Lip3000的转染水平相当(附图17中的B)。
实施例17
通过正交分析(同实施例12)，以VM-C为例，选取稳转荧光素酶的小鼠结肠癌细胞系(MC38-Luc)和稳转荧光素酶的小鼠乳腺癌细胞系(4T1-Luc)，利用体外荧光素酶的沉默结果筛选出可用于siRNA递送的最优配方。
具体实施方法为：
步骤1：细胞培养。稳转荧光素酶的小鼠结肠癌细胞系(MC38-Luc)和稳转荧光素酶的小鼠乳腺癌细胞系(4T1-Luc)以含10～30％胎牛血清(FBS)的培基培养，并在37℃下含5％二氧化碳的条件下孵育
步骤2：细胞铺板。转染前24～48h，将细胞接种在细胞培养板中，并在含有10％FBS的100～1000μL新鲜培养基中培养。
步骤3：纳米粒制备。除将pDNA缓冲液更换为siLuc缓冲液外，其他同实施例12。
步骤4：转染。弃去原培基，将步骤3制得的纳米粒与细胞共孵育，孵育后验证基因表达效果。
步骤5：验证荧光素酶的表达水平。1)洗涤：弃上清，用100～500μL PBS洗涤，用吸液泵吸去上清，重复3次；2)裂解细胞：随后加入50～200μL的细胞裂解液，取20～100μL的细胞悬液于96孔板中；3)向细胞悬液中加入等体积的荧光素酶底物，于酶标仪下进行检测荧光素酶的表达。
结果显示，在两种细胞系上，绝大部分配方均显示出优于市售转染试剂lip3000的沉默效果(附图18)。
实施例18
按照上述筛选出的最优配方比(LNP60)，选取MC38-Luc细胞系和4T1-Luc细胞系，验证了实施例1-7和实施例10共8个不同合成可电离脂质的沉默效果。
细胞转染实验具体实施方法同实施例17。
结果显示，所有实施例涵盖结构均显示出了优于市售转染试剂Lip3000的沉默效果(附图19)。
实施例19
通过正交分析(同实施例12)，以VM-C为例，选取小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系(RAW264.7)和小鼠树突状细胞系(DC2.4)，递送表达荧光素酶的mRNA(mLuc)，筛选出可用于mRNA递送的最优配方。
具体实施方法为：
步骤1：细胞培养。选取小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系(RAW264.7)和小鼠树突状细胞系(DC2.4)以含10～30％胎牛血清(FBS)的培基培养，并在37℃下含5％二氧化碳的条件下孵育
步骤2：细胞铺板。转染前24～48h，将细胞接种在细胞培养板中，并在含有10％FBS的100～1000μL新鲜培养基中培养。
步骤3：纳米粒制备。除将pDNA缓冲液更换为mLuc缓冲液外，其他同实施例12。
步骤4：转染。弃去原培基，将步骤3制得的纳米粒与细胞共孵育，孵育后验证基因表达效果。
步骤5：验证荧光素酶的表达水平。1)洗涤：弃上清，用100～500μL PBS洗涤，用吸液泵吸去上清，重复3次；2)裂解细胞：随后加入50～200μL的细胞裂解液，取20～100μL的细胞悬液于96孔板中；3)向细胞悬液中加入等体积的荧光素酶底物，于酶标仪下进行检测荧光素酶的表达。
结果显示，LNP17在两种细胞系中的表达，均优于市售转染试剂Lip3000介导的mLuc的表达水平(附图20)。
实施例20
按照上述筛选出的最优配方比LNP17，选取RAW264.7细胞系和DC2.4细胞系，验证了实施例1-6和实施例10共7个不同合成可电离脂质的mLuc的递送效果。
细胞转染实验具体实施方法同实施例19。
结果显示，VM-D、VM-F和VM-G在两种细胞系上均显示出了优于市售转染试剂Lip3000的递送效果(附图21)。
实施例21
为了探究不同的辅助脂质和不同的PEG占比对mRNA递送效果的影响，通过正交实验设计，以RAW264.7细胞系为例，我们同时考察了阳离子辅助脂质DDAB和两种不同的中性辅助脂质DOPE和DSPC以及不同的PEG水平下eGFP mRNA的表达水平。结果显示，DDAB的加入有利于增强mRNA的体外递送效果，其次是DSPC，在以上两种辅助脂质的配方中，大部分的配方表现出了优于商用脂质的递送效果(附图22)。
具体实施方法：除将步骤3中的mLuc缓冲液更换为mGFP缓冲液外，细胞转染实验其他具体实施方法同实施例19。
实施例22
为了探究不同的辅助脂质类型及占比对体内递送mRNA效果的影响，确保PEG脂质摩尔占比保持在1.2％，我们同时考察了阳离子辅助脂质DDAB和两种不同的中性辅助脂质DOPE和DSPC在两种不同的占比条件下，对mRNA体内递送效果的影响。具体实施方法为：
步骤1：纳米粒制备。具体制备方法同实施例19中的步骤3。
步骤2：小鼠体内基因表达活性检测。将纳米粒混悬液以每只小鼠5μg mLuc的量向6周龄的雌性C57小鼠进行大腿肌肉注射，注射后4-6h，每只小鼠腹腔注射3mg荧光素酶底物，并使用小动物活体成像仪成像。由取得的图像计算出了小鼠腿部的亮度，并以photons/sec/cm2/sr算出，将其作为基因表达活性的指标。
结果显示，辅助脂质类型为DSPC，摩尔占比保持在10.4％时，体内的表达效果最好(附图23)
实施例23
为了探究实施例1-6中合成可电离脂质对体内递送mRNA效果的影响，确保四组分占比为：合成可电离脂质摩尔占比保持在49.2％、中性辅助脂质DSPC摩尔占比保持在10.8％、胆固醇摩尔占比保持在38.8％、PEG脂质摩尔占比保持在1.2％。
小鼠体内基因表达活性检测实验具体实施方法同实施例22。
结果显示，VM-E对应的脂质纳米粒的表达水平优于其他结构，包括商用脂质(附图24)。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可电离脂质，其特征在于，所述可电离脂质包括可电离氨基头部和疏水头部，所述可电离氨基头部与至少一个连接臂共价连接，所述连接臂与疏水头部共价连接；
所述可电离氨基头部含有至少一个叔胺结构；
所述连接臂含有化学敏感键，所述化学敏感键为能在氧化还原条件下断裂的氧化还原敏感键、不同pH条件下断裂的pH敏感键、酶催化条件下断裂的酶敏感键或温度条件下断裂的温度敏感键。
2.如权利要求1所述的可电离脂质，其特征在于，所述连接臂含有碳碳单键、酰胺键或酯键。
3.如权利要求1所述的可电离脂质，其特征在于，所述可电离氨基头部还含有氢键结合位点。
4.如权利要求1所述的可电离脂质，其特征在于，所述疏水头部为维生素E、肉豆蔻醇、棕榈醇、2-辛基十二醇、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈油酸、油酸或亚油酸。
5.如权利要求1-4任意一项所述的可电离脂质用于制备核酸递送载体的应用。
6.一种核酸递送载体，其特征在于，所述核酸递送载体包括权利要求1-3任意一项所述的可电离脂质，还包括胆固醇、结构脂质和聚乙二醇，所述结构脂质能自发地形成脂质双层结构；
所述核酸递送载体中，所述可电离脂质与结构脂质的物质的量之比为(10-1):1；可电离脂质与结构脂质的物质的量总和占比大于等于40％；所述聚乙二醇的物质的量占比小于等于2％。
7.如权利要求6所述的核酸递送载体，其特征在于，所述结构脂质为1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰胆碱或双十八烷基溴化铵。
8.如权利要求6或7所述的核酸递送载体在递送核酸中的应用，其特征在于，所述应用具体为：将所述核酸递送载体溶于有机醇中形成醇相，将待递送的核酸溶于水中形成水相，将所述醇相和水相进行混合，使所述核酸递送载体形成脂质纳米粒，所述核酸包封在该脂质纳米粒中；
优选地，所述核酸为单链DNA、双链DNA、环状DNA、siRNA、miRNA或mRNA。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述核酸递送载体与核酸的质量比为(5-20):1。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述脂质纳米粒的粒径范围为80-250nm；
优选地，所述脂质纳米粒的粒径范围为80-150nm。
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