CN114805410B - 一类两亲性树形分子、合成及其在核酸递送方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类两亲性树形分子、合成及其在核酸递送方面的应用，它具有如以下通式(IV)所示结构。本发明的化合物可以作为基于病理微环境特异性响应的纳米递送系统，特别是应用在核酸递送药物或制剂中。本发明的分子在水溶液中具有良好的溶解性，能与核酸药物在水溶液中自组装形成稳定的纳米复合物，并能有效将负载核酸的药物递送至疾病部位，而且能够在相应病理刺激下响应性解组装达到精准释放核酸药物的目的，可使药物大限度释放在病灶部位，是一种新型的纳米递送载体。

Description

一类两亲性树形分子、合成及其在核酸递送方面的应用
技术领域
本发明属于医学技术领域，具体涉及一类病理响应型的两亲性树形分子及其作为核酸递送系统在药学上的应用。
背景技术
基因治疗是指将外源性核酸导入患者体内靶细胞中，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到高效精准治疗目的。基因治疗技术创新和临床试验正在积极开展，多项基因治疗项目相继在美国、欧盟、中国等国家获得批准上市。基因治疗在各类重大疾病的治疗中具有十分广阔的应用前景，例如恶性肿瘤、感染性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、代谢性疾病等。
基因疗法的核心是核酸类生物大分子药物。常见的核酸药物主要有质粒DNA(plasmid DNA,pDNA)、信使RNA(message RNA,mRNA)、小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)等。其中，DNA可以携带具有特定治疗作用的核苷酸序列，在宿主的靶细胞内转录成mRNA从而翻译成具有明确生物学功能的蛋白质，通过补充体内缺失蛋白或修正异常蛋白等方式治疗疾病；siRNA则作用于靶细胞的mRNA，通过特异性剪切靶标基因的mRNA以下调其靶标蛋白的表达，从而修复或杀死病变细胞，达到疾病治疗的目的。这些核酸分子分作用位点明确，能够被用于多种疾病的治疗。但是，核酸药物一般不稳定，在体内应用时，易被血液循环中的核酸酶降解，另外，核酸分子自身携带负电荷，与同负电荷的细胞膜存在静电排斥作用，进一步增加了其入胞的难度，核酸药物存在的这些障碍很大程度上限制了其在临床应用上的转化。因此，如何克服核酸分子本身性质带来的挑战，将其安全高效地递送至靶部位是亟待解决的问题之一。
近年来，多种合成材料已被陆续开发出来以用于核酸药物的体内递送。其中树形分子因其精确可控的结构、优异的单分散性和多价协同效应，被广泛应用于核酸药物输送，如商业化的转染试剂SuperFectTM的主要成分就是聚酰胺-胺类(PAMAM)树形分子。PAMAM树形分子具有独特的结构优势：1)PAMAM表面丰富的正电荷，使得其能通过静电相互作用有效负载核酸药物分子，保护其不被核酸酶降解且有利于核酸药物制剂被细胞摄取；2)PAMAM表面大量可修饰的反应位点，可以引入不同性质的功能基团，且利用树形分子特有的多价协同放大效应可将功能性作用放大，提高递送体系的效率；3)PAMAM因内部丰富的叔胺基团具有较好的质子缓冲能力，有助于PAMAM与核酸复合物通过“质子海绵效应”从酸性细胞器中逃逸，有效释放负载的核酸药物；4)PAMAM结构中大量的酰胺结构，使其具有仿生“类蛋白”性能和良好的生物安全性。由于这些独特的结构性能，PAMAM树形分子在核酸药物输送中展现出独特的优势和巨大的潜力。自1993年首次被用于核酸分子的递送以来，研究人员开发了各类基于PAMAM树形分子的载体用于不同类型的核酸分子的输送，如siRNA、DNA等。
由于核酸分子的结构、大小和性质不同，其在输送过程中遇到的问题也不尽相同，传统的球形PAMAM树形分子很难适应不同的核酸分子的输送需求。此外核酸与树形分子形成的组装体的释放特异性和递送效率仍然需要进一步改善。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供了一系两亲性树形分子及其通过自组装形成纳米颗粒的方法。本发明的分子能够满足不同核酸分子的输送需求，实现不同核酸分子的高效递送。本发明的分子能够在病理微环境下响应性断裂，进而导致纳米颗粒解散而释放核酸药物，实现病理特异性递送。
本发明还提供了合成上述两亲性树形分子的方法。
本发明的另一目的是提供一种上述两亲性树形分子作为核酸递送系统在药物或制剂方面的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
具有如以下通式(IV)所示结构的化合物，或其药学上可接受的盐；
其中，
R1为C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤素或者
M为
n为2至16的整数；
X独立的表示为如下三种结构(I)、(II)或(III)
其中，
R2、R3、R4、R5或R6分别独立地为C2-6亚烷基基团；
R为羟基、肼基、取代或非取代的氨基、取代或非取代的C1-6烷氨基或取代或非取代的C1-6烷氧基；其取代基为卤素、氨基、C1-4烷氨基、C1-5烷基、苄基、苯基、羧基、C2-5酯基、苄酯基、
R11为氢或者取代或非取代的C1-6烷基；其取代基为卤素、氨基、羧基、C1-4烷氨基或C1-4烷氧基；
R12为C1-6烷基、C1-6烷氧基或C1-6烷氨基。
在一种优选方案中，R1为甲基、甲氧基、氟、氯、溴，且每个基团分别独立的在苯环上的不同为取代位置。
在另一种优选方案中，R1为甲基、氟或
在一种优选方案中，R1在苯环上M基团的对位。
在一种优选方案中，本发明的化合物具有如以下通式(V)所示的结构；
在一种优选方案中，M为
在一种优选方案中，R1为甲基、甲氧基、氟、氯、溴或或者
在另一种优选方案中，n为2、4、7或10；
在一种优选方案中，R2、R3、R4、R5或R6分别独立地为C2-4亚烷基。
在一种优选方案中，R为羟基、C1-3烷氧基、肼基、氨基或-NH-R7。
在一种优选方案中，R7为C1-5烷基、苄基或者R8取代的C2-6烷基；
在一种优选方案中，R为羟基、肼基、氨基、C1-4烷氧基或取代的C1-4烷氨基；其取代基为氨基、C1-4烷氨基、苄基、苯基、羧基、
在一种优选方案中，R11为C0-6烷基。
在一种优选方案中，R12为C0-6烷基、C1-6烷氧基或C1-6烷氨基。
在一种优选方案中，
R为羟基、肼基、氨基、C1-6烷氧基或-NH-R7；
R7为C1-5烷基、苄基或者R8取代的C2-6烷基；
R8为氨基、C1-6烷基单取代或双取代氨基、羧基、C2-5酯基、苄酯基、
在一种优选方案中，R为羟基、肼基、氨基、C1-4烷氧基或取代的C1-4烷氨基；其取代基为氨基、C1-4烷基单取代或双取代的氨基、
在一种优选方案中，R8为氨基、羧基、
在一种优选方案中，R8为氨基、
在另一种优选方案中，R8为氨基或
在一种优选方案中，本发明中的化合物选自：
本发明化合物的制备方法，其包括步骤(1)和(2)或者步骤(1)和(3)或者步骤(1)和(4)。
步骤(1)：
在一种优选方案中，步骤(1)的各步反应过程如下：
步骤1)：于反应瓶中依次加入化合物1、邻苯二甲酰亚胺钾盐及N,N-二甲基甲酰胺，20-50℃下搅拌至反应完全。加入二氯甲烷溶萃取，干燥过滤，除去溶剂，柱层析纯化，得到化合物2。
步骤2)：于反应瓶中依次加入化合物2、三乙胺、对甲苯磺酰氯(或者甲磺酰氯)以及二氯甲烷，在0-20℃下搅拌至反应完全。用二氯甲烷萃取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤，除去溶剂，通过柱层析分离，得到化合物3。
步骤3)：于反应瓶中加入化合物3、叠氮三甲基硅烷、氟化铯及N,N-二甲基甲酰胺。将体系置于20～50℃条件下搅拌至反应结束，用二氯甲烷萃取，用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，柱层析分离得到化合物4。
步骤4)：于反应瓶中加入化合物4、水合肼和乙醇，20～50℃下搅拌至反应结束，使用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤旋干得到化合物5。
步骤5)：于反应瓶中加入化合物6、甲醇以及氢氧化钠溶液，随后在20～50℃搅拌至反应完全。用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤除去溶剂，柱层析分离得到化合物7。
步骤6)：于反应瓶中加入化合物7、咪唑、N,N-二甲基甲酰胺以及叔丁基二甲基硅氯，随后20～50℃下搅拌至反应完全。用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤除去溶剂，柱层析分离得到化合物8。
步骤7)：于反应瓶中加入化合物8、碳酸钾、N,N-二甲基甲酰胺以及化合物9，0～20℃搅拌至反应完全后，使用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤除去溶剂，柱层析分离得到化合物10。
步骤8)：于反应瓶中加入化合物10和对甲苯磺酸以及甲醇，随后0～20℃下搅拌至反应完全，通过柱层析分离得到化合物11。
步骤9)：于反应瓶中加入化合物11和羰基二咪唑以及二氯甲烷，0～20℃下搅拌反应完全，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤除去溶剂，柱层析分离得化合物12。
步骤10)：取化合物12滴加到化合物17的溶液中去，20～50℃下搅拌反应完全，使用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤除去溶剂，柱层析分离得到化合物13。
亲水端的合成可参考已知合成方法制备(Yu T,Liu X,Bolcato A.L.,et al.AnAmphiphilic Dendrimer for Effective Delivery of Small Interfering RNA andGene Silencing In Vitro and In Vivo.Angew.Chem.Int.Ed.2012,51(34):8478-8484)。
两亲性树形分子的合成包括步骤(2)、步骤(3)或步骤(4)。
步骤(2)：
步骤(3)：
步骤(4)：
在一种优选方案中，步骤(2)、步骤(3)或步骤(4)反应过程如下：
步骤1)：于反应瓶中依次加入含两个叠氮基团的疏水端化合物13、含炔基的亲水端(化合物14、化合物17或化合物20)、碘化亚铜及二甲基甲酰胺。将体系置于0-40℃下避光搅拌至反应完全。用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，除去溶剂，柱层析分离，得到含有酯基末端的化合物(化合物15、化合物18或化合物21)。
在另一种优选方案中，步骤1)反应过程如下：
于反应瓶中依次加入含两个叠氮基团的疏水端化合物13、含炔基的亲水端(化合物14、化合物17或化合物20)、五水合硫酸铜、抗坏血酸钠及四氢呋喃和水。将体系置于0-40℃下避光搅拌至反应完全。用二氯甲烷萃取，用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，柱层析分离，得到含有酯基末端的末端化合物(化合物15、化合物18或化合物21)。
步骤2)：酯基末端的化合物(化合物15、化合物18、化合物21)通过酯基的水解或酯基的胺解反应得到化合物(化合物16、化合物19、化合物22)；其中酯基的水解或酯基的胺解反应在存在或不存在催化剂条件下进行；催化剂为本领域常见的酯键水解或胺解常用的催化剂，包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、乙醇钠、甲醇钠、三乙胺等。
本发明的化合物可以应用在基于病理微环境特异性响应的核酸药物纳米递送系统方面。这里的核酸药物包括但不限于siRNA、saRNA、mRNA、DNA、ASO等。它可以制成的制剂，可以根据适合于各个制剂的常规方法配置成内服制剂或外用制剂，包括但不限于粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊、悬浮剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂、栓剂、无菌注射液等。
本发明还包括一种药物组合物，它包括本发明的上述各化合物或其药学上可接受的盐。
如无特别说明，本发明中所涉及的各基团分别具有如下含义。
“卤素”，是指氟原子，氯原子，溴原子或碘原子。
“甲氧基”，是指甲基烷氧基。
“-NH2”，是指氨基基团。
“-N3”，是指叠氮基团。
“炔基”表示具有至少一个碳碳三键的不饱和烃基基团，包括直链和支链基团(本申请书中提到的数字范围，例如“2-5”，是指该基团，此时为炔基，可以含2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子等，直至包括5个碳原子)。本发明中的炔基可以为C2-8炔基、C2-6炔基、C2-5炔基、C2-4炔基、C2-3炔基等，具体的烯基包括但不限于乙炔基、丙炔基和丁炔基。
“亚烷基”表示-烷基-基团。
“烷基”，是指1-30个碳原子的饱和的脂烃基，包括直链和支链基团。具体的烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。烷基可以是取代的或未取代的。
“烷氧基”，是指由一个烷基和一个氧原子构成的脂烃氧基，烷基包括直链和支链基团。具体的烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。烷基可以是取代的或未取代的。
“烷氨基”，是指由一个或两个烷基和一个氮原子构成的脂烃氨基，，烷基包括直链和支链基团。具体的烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。烷基可以是取代的或未取代的。
“药学上可接受的盐”是包含通式(IV)的化合物与有机酸或无机酸形成的盐，表示保留母体化合物的生物有效性和性质的那些盐。这类盐包括：
(1)与酸成盐，通过母体化合物的游离碱与无机酸或有机酸的反应而得，无机酸例如(但不限于)盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、偏磷酸、硫酸、亚硫酸和高氯酸等，有机酸例如(但不限于)乙酸、丙酸、丙烯酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、富马酸、马来酸、羟基苯甲酸、γ-羟基丁酸、甲氧基苯甲酸、邻苯二甲酸、甲磺酸、乙磺酸、萘-1-磺酸、萘-2-磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、扁桃酸、琥珀酸或丙二酸等。
(2)存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子代替或者与有机碱配位化合所生成的盐，金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子，有机碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。
“药用组合物”指的是在此描述的一种或多种化合物或者它们的药学上可接受的盐和前药与其它的化学成分，例如药学上可接受的载体和赋形剂的混合物。药用组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。
本发明的化合物可以作为基于病理微环境特异性响应的纳米递送系统，特别是应用在核酸递送药物或制剂中。本发明的分子在水溶液中具有良好的溶解性，能与核酸药物在水溶液中自组装形成稳定的纳米复合物，并能有效将负载核酸的药物递送至疾病部位，而且能够在相应病理刺激下响应性解组装达到精准释放核酸药物的目的，可使药物大限度释放在病灶部位，是一种新型的纳米递送载体，具有潜在的临床应用前景。
附图说明
图1.ArBE两亲性树形分子ROS响应的1H-NMR谱图；
图2.ArBE两亲性树形分子临界聚集浓度图；
图3.ArBE两亲性树形分子pH滴定图；
图4.ArBE两亲性树形分子用于siRNA的递送活性；
图5.ArBE两亲性树形分子用于DNA的递送活性；
图6.ArBE两亲性树形分子/GFP mRNA在转染HeLa细胞后荧光蛋白表达情况；
图7.ArBE两亲性树形分子/Luc mRNA转染HeLa及RAW264.7细胞后的荧光素酶表达情况。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明的检测方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
本发明中的两亲性树形分子可以称为两亲性树形分子、ArBE两亲性树形分子或ArBE Bola树形分子，也可简称为ArBE分子。
A、分子合成实施例：
实施例1：化合物ArBE N-11 2A的制备
1.1N-11-1的制备
取11-溴十一醇于反应瓶和邻苯二甲酰亚胺钾以及N,N-二甲基甲酰胺溶解。将反应混合物在50℃下反应完全。经洗涤干燥，过滤旋干，柱层析分离，得纯品N-11-1(603mg，95％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.88–7.80(m,2H),7.74–7.67(m,2H),3.73–3.61(m,4H),1.74–1.47(m,4H),1.44–1.19(m,14H).
1.2N-11-2的制备
在反应瓶中加入N-11-1、三乙胺、对甲苯磺酰氯以及二氯甲烷，30℃下反应完全。用二氯甲烷萃取，经洗涤干燥，过滤旋干，柱层析分离，得到纯品N-11-2(616mg，92％)。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ7.94–7.65(m,6H),7.35(d,J＝8.0Hz,2H),4.03(t,J＝6.5Hz,2H),3.68(t,J＝7.3Hz,2H),2.46(s,3H),1.75–1.55(m,4H),1.45–1.11(m,14H).
1.3N-11-3的制备
取N-11-2、叠氮三甲基硅烷和氟化铯于反应瓶，加入N,N-二甲基甲酰胺溶解，45℃下反应完全。用二氯甲烷萃取反应液，经洗涤干燥，过滤旋干，柱层析分离，得纯品N-11-3(650mg，95％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.89–7.77(m,2H),7.74–7.66(m,2H),3.67(t,J＝6.9Hz,2H),3.24(t,J＝6.9Hz,2H),1.76–1.49(m,4H),1.76–1.19(m,14H).
1.4N-11-N3的制备
取N-11-3和水合肼于反应瓶，加入乙醇溶解，45℃下反应完全。用乙酸乙酯萃取反应液，经洗涤干燥，过滤旋干，得纯品N-11-N3(442mg，89％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.24(t,J＝7.0Hz,2H),2.67(t,J＝7.1Hz,2H),1.66–1.52(m,2H),1.48–1.21(m,16H).
1.5ArBE 1-1的制备
取4-氟苯酚于反应瓶，用甲醇溶解，加入氢氧化钠与甲醛，25℃下反应完全，旋干反应液，用乙酸乙酯萃取，经洗涤干燥，过滤旋干，柱层析分离，得纯品ArBE 1-1(240mg，70％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.40(s,1H),6.94(d,J＝9.4Hz,2H),5.29(t,J＝5.5Hz,2H),4.52(d,J＝5.4Hz,4H).
1.6ArBE 1-2的制备
取ArBE 1-1、咪唑于反应瓶，加入叔丁基二甲基硅氯及二甲基甲酰胺，25℃下搅拌至反应完全。反应液加乙酸乙酯稀释，经洗涤干燥，过滤旋干，柱层析分离，得纯品ArBE 1-2(258mg，81％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.04(s,1H),6.82(d,J＝8.9Hz,2H),4.81(s,4H),0.94(s,18H),0.13(s,12H).
1.7ArBE 1-3的制备
取碳酸钾、ArBE-1-2和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯，加入二甲基甲酰胺溶解，25℃下反应完全。用乙酸乙酯萃取，经洗涤干燥后，过滤旋干，柱层析分离，得纯品ArBE 1-3(474mg，77％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.04(s,1H),6.82(d,J＝8.9Hz,2H),4.81(s,4H),0.94(s,18H),0.13(s,12H).
1.8ArBE 1-4的制备
取ArBE-1-3和对甲苯磺酸于反应瓶，加入甲醇溶解，25℃下反应完全，柱层析分离，得纯品ArBE 1-4(140mg，78％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.86(d,J＝8.0Hz,2H),7.42(d,J＝8.0Hz,2H),7.10(d,J＝8.6Hz,2H),4.93(s,2H),4.69(d,J＝3.3Hz,4H),1.38(s,12H).
1.9ArBE N-11-1的制备
取ArBE-1-4、N,N'-羰基二咪唑于反应瓶，加入二氯甲烷溶解，随后20℃下反应完全。接着加入N-11-N3的二氯甲烷萃取，经洗涤干燥后，过滤旋干，柱层析分离，得纯品ArBEN-11-1(310mg，72％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.84(d,J＝7.9Hz,2H),7.45(d,J＝7.7Hz,2H),7.08(d,J＝8.6Hz,2H),5.14(s,4H),4.93(s,2H),3.25(t,J＝6.9Hz,4H),3.17(q,J＝6.7Hz,4H),1.67–1.42(m,8H),1.42–1.18(m,40H).
1.10ArBE N-11 2E的制备
取ArBE N-11-1、D 2-1、五水合硫酸铜以及抗坏血酸钠于反应瓶，加入N,N’-二甲基甲酰胺溶解混合均匀，30℃下反应完全，用二氯甲烷萃取，经洗涤干燥后，过滤旋干，柱层析分离，得纯品ArBE N-11 2E(50mg，78％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.85(d,J＝7.5Hz,2H),7.46(d,J＝7.7Hz,4H),7.09(d,J＝8.5Hz,2H),5.16(s,4H),4.95(s,2H),4.34(t,J＝7.2Hz,4H),3.99–3.73(m,4H),3.69(s,12H),3.19(q,J＝6.6Hz,4H),3.00–2.73(m,6H),2.66–2.44(m,8H),2.00–1.82(m,4H),1.75–1.44(m,8H),1.44–1.17(m,40H).
1.11ArBE N-11 2A的制备
取ArBE N-11 2E于反应瓶，加入甲醇以及乙二胺，25℃下搅拌反应完全，旋干反应液后透析，冻干得纯品ArBE N-11 2A(38mg，86％)1H NMR(300MHz,CD3OD/CDCl3)δ7.75(s,2H),7.67(d,J＝7.5Hz,2H),7.42(d,J＝7.6Hz,2H),7.09(d,J＝8.7Hz,2H),5.13(s,4H),4.92(s,2H),4.37(t,J＝7.2Hz,4H),3.78(s,4H),3.27(t,J＝6.0Hz,8H),3.13(t,J＝7.1Hz,4H),2.76(td,J＝6.4,3.0Hz,16H),2.42(t,J＝6.6Hz,8H),1.93(q,J＝7.1Hz,4H),1.60–1.14(m,28H).
实施例2：化合物ArBE N-11 4A的制备
1.1–1.9N-11-1至ArBE N-11-1的制备
N-11-1的制备与实施例1中的1.1相同。N-11-2的制备与实施例1中的1.2相同。N-11-3的制备与实施例1中的1.3相同。N-11-N3的制备与实施例1中的1.4相同。ArBE 1-1的制备与实施例1中的1.5相同。ArBE 1-2的制备与实施例1中的1.6相同。ArBE 1-3的制备与实施例1中的1.7相同。ArBE 1-4的制备与实施例1中的1.8相同。ArBE N-11-1的制备与实施例1中的1.9相同。
1.10ArBE N-11 4E的制备
参考实施例1中1.10的制备方法，得到纯品ArBE N-11-4E(85mg，69％)。1H NMR(300MHz,CD3OD)δ7.88(s,2H),7.77(d,J＝8.0Hz,2H),7.49(d,J＝7.9Hz,2H),7.13(d,J＝8.8Hz,2H),5.12(s,4H),4.97(s,2H),4.38(t,J＝7.0Hz,4H),3.81(s,4H),3.65(s,24H),3.24(t,J＝6.4Hz,8H),3.09(t,J＝6.9Hz,4H),2.87–2.68(m,24H),2.54(t,J＝6.4Hz,8H),2.50–2.36(m,24H),1.96–1.83(m,4H),1.52–1.40(m,4H),1.39–1.15(m,40H).
1.11ArBE N-11 4A的制备
参考实施例1中1.11的制备方法，得到纯品ArBE N-11 4A(28mg，88％)。1H NMR(300MHz,CD3OD/CDCl3)δ7.85(s,2H),7.65(d,J＝6.9Hz,2H),7.37(d,J＝7.4Hz,2H),7.09(d,J＝8.7Hz,2H),5.11(s,4H),4.91(s,2H),4.38(t,J＝7.1Hz,4H),3.82(s,4H),3.32–3.19(m,24H),3.12(t,J＝7.0Hz,4H),2.98–2.67(m,40H),2.57(t,J＝6.7Hz,8H),2.51–2.25(m,24H),2.04–1.79(m,4H),1.60–1.41(m,4H),1.41–1.15(m,28H).
实施例3：化合物ArBE N-11 8A的制备
1.1-1.9N-11-1至ArBE N-11-1的制备
N-11-1的制备与实施例1中的1.1相同。N-11-2的制备与实施例1中的1.2相同。N-11-3的制备与实施例1中的1.3相同。N-11-N3的制备与实施例1中的1.4相同。ArBE 1-1的制备与实施例1中的1.5相同。ArBE 1-2的制备与实施例1中的1.6相同。ArBE 1-3的制备与实施例1中的1.7相同。ArBE 1-4的制备与实施例1中的1.8相同。ArBE N-11-1的制备与实施例1中的1.9相同。
1.10ArBE N-11 8E的制备
取ArBE N-11-1、D 2-5、碘化亚铜于反应瓶，加入N,N’-二甲基甲酰胺溶解混合均匀，40℃下搅拌反应完全。用二氯甲烷萃取，经洗涤干燥后，过滤旋干，柱层析分离，得纯品ArBE N-11 8E(148mg，69％)。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ7.89(s,2H),7.85–7.62(m,2H),7.53–7.41(m,2H),7.21–7.07(m,2H),5.13(s,4H),4.96(d,J＝10.1Hz,2H),4.38(t,J＝7.1Hz,4H),3.82(s,4H),3.65(s,48H),3.30–3.22(m,24H),3.13–3.07(m,4H),2.83(t,J＝7.0Hz,16H),2.76(d,J＝7.6Hz,40H),2.61(t,J＝6.6Hz,8H),2.55(t,J＝6.4Hz,17H),2.49–2.34(m,56H),1.95–1.84(m,4H),1.53–1.42(m,4H),1.38–1.19(m,40H).
1.11ArBE N-11 8A的制备
参考实施例1中1.11的制备方法，得到纯品ArBE N-11 8A(26mg，60％)。1H NMR(500MHz,CD3OD/CDCl3)δ7.85(s,2H),7.65(br,2H),7.38(d,J＝7.7Hz,2H),7.09(d,J＝8.6Hz,2H),5.11(s,4H),4.92(s,2H),4.38(t,J＝7.2Hz,4H),3.82(s,4H),3.32–3.21(m,56H),3.12(t,J＝7.1Hz,4H),2.90–2.72(m,88H),2.63–2.54(m,24H),2.47–2.31(m,56H),1.96–1.89(m,4H),1.53–1.47(m,4H),1.41–1.18(m,28H).
实施例4：化合物ArBE N-11 4Gua的制备
1.1ArBE N-11 4Gua的制备
在反应瓶中加入1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐、三乙胺，以及ArBE N-11-4A的甲醇溶液，50℃下反应完全后，经过透析冻干后得到ArBE N-11-4Gua(12mg，71％)。1H NMR(300MHz,CD3OD/CDCl3)δ7.88(s,2H),7.54(d,J＝7.4Hz,2H),7.29(d,J＝7.5Hz,2H),7.08(d,J＝8.8Hz,2H),5.11(br,4H),4.39(t,J＝6.9Hz,4H),3.81(s,4H),3.31–3.21(m,32H),3.13(t,J＝7.0Hz,4H),2.86–2.70(m,24H),2.63–2.52(m,8H),2.51–2.30(m,24H),1.98–1.82(m,4H),1.55–1.43(m,4H),1.40–1.15(m,28H).
实施例5：化合物ArBE N-8 4BiGua的制备
1.1ArBE N-8 4BiGua的制备
在反应瓶中加入N-氨基甲酰-1H-吡唑-1-甲脒、以及ArBE N-8 4A的甲醇溶液，50℃下反应完全后，经过透析冻干后得到ArBE N-8 4BiGua(11mg，70％)。1H NMR(500MHz,CD3OD/CDCl3)δ7.86(s,2H),7.50(d,J＝7.4Hz,2H),7.35(d,J＝7.3Hz,2H),7.09(d,J＝6.9Hz,2H),5.11(br,4H),4.88(s,2H),4.37(t,J＝7.5Hz,4H),3.81(s,4H),3.42–3.19(m,32H),3.11(t,J＝7.1Hz,4H),2.91–2.66(m,24H),2.63–2.50(m,8H),2.49–2.29(m,24H),1.97–1.79(m,4H),1.57–1.43(m,4H),1.39–1.20(m,28H).
实施例6：化合物ArBE N-8 4A的制备
1.1N-8-1的制备
参考实施例1中的1.1的制备方法，得到白色固体N-8-1(1.01g，92％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.84(dd,J＝5.4,3.1Hz,2H),7.70(dd,J＝5.5,3.1Hz,2H),3.76–3.57(m,4H),1.77–1.45(m,4H),1.43–1.24(m,8H).
1.2N-8-2的制备
参考实施例1中的1.2的制备方法，得到白色固体N-8-2(1.14g，91％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.91–7.80(m,2H),7.79–7.66(m,2H),4.21(t,J＝6.5Hz,2H),3.38(t,J＝7.7Hz,2H),3.00(s,3H),1.84–1.59(m,4H),1.51–1.23(m,8H).
1.3N-8-3的制备
参考实施例1中的1.3的制备方法，得到白色固体N-8-3(739mg，87％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.91–7.80(m,2H),7.77–7.67(m,2H),3.68(t,J＝7.2Hz,2H),3.24(t,J＝6.9Hz,2H),1.82–1.50(m,4H),1.49–1.23(m,8H).
1.4N-8-N3的制备
参考实施例1中的1.4的制备方法，得到无色油状液体N-8-N3(255mg，75％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ3.27(t,J＝6.9Hz,2H),2.70(t,J＝6.7Hz,2H),1.70–1.54(m,2H),1.53–1.17(m,10H).
1.5-1.8ArBE 1-1至ArBE 1-4的制备
ArBE 1-1的制备与实施例1中的1.5相同。ArBE 1-2的制备与实施例1中的1.6相同。ArBE 1-3的制备与实施例1中的1.7相同。ArBE 1-4的制备与实施例1中的1.8相同。
1.9ArBE N-8-1的制备
参考实施例1中的1.9的制备方法，得到无色油状液体ArBE N-8-1(120mg，68％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.83(d,J＝7.9Hz,2H),7.44(d,J＝7.9Hz,2H),7.07(d,J＝8.6Hz,2H),5.14(s,4H),4.93(s,2H),4.75–4.61(m,2H),3.34–3.06(m,8H),1.65–1.43(m,8H),1.43–1.20(m,28H).
1.10ArBE N-8 4E的制备
参考实施例1中1.10的制备方法，得到纯品ArBE N-8 4E(90mg，57％)。
1H NMR(300MHz,CD3OD)δ7.89(s,2H),7.77(d,J＝7.7Hz,2H),7.49(d,J＝7.6Hz,2H),7.13(d,J＝8.8Hz,2H),5.12(s,4H),4.96(s,2H),4.37(t,J＝7.0Hz,4H),3.81(s,4H),3.64(s,24H),3.24(t,J＝6.3Hz,8H),3.08(t,J＝6.9Hz,4H),2.91–2.65(m,24H),2.64–2.30(m,32H),1.97–1.77(m,4H),1.58–1.40(m,4H),1.40–1.12(m,28H).
1.11ArBE N-8 4A的制备
参考实施例1中1.11的制备方法，得到纯品ArBE N-8-4A(53mg，85％)。
1H NMR(300MHz,CD3OD/CDCl3)δ7.84(s,2H),7.57(d,J＝7.5Hz,2H),7.34(d,J＝7.4Hz,2H),7.09(d,J＝8.7Hz,2H),5.10(s,4H),4.89(s,2H),4.38(t,J＝7.0Hz,4H),3.81(s,4H),3.27(q,J＝9.3,7.7Hz,26H),3.11(t,J＝7.0Hz,4H),2.98–2.64(m,40H),2.56(t,J＝6.7Hz,8H),2.49–2.18(m,24H),1.98–1.83(m,4H),1.56–1.44(m,4H),1.43–1.12(m,16H).
实施例7：化合物ArBE N-6 4A的制备
1.1N-6-1的制备
参考实施例1中的1.1的制备方法，得到白色固体N-6-1(1.93g，78％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.92–7.79(m,2H),7.76–7.66(m,2H),3.69(t,J＝7.2Hz,2H),3.64(t,J＝6.5Hz,2H),1.77–1.65(m,2H),1.63–1.50(m,2H),1.49–1.32(m,4H).
1.2N-6-2的制备
参考实施例1中的1.2的制备方法，得到白色固体N-6-2(973mg，87％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.84(dd,J＝5.5,3.0Hz,2H),7.71(dd,J＝5.4,3.1Hz,2H),4.22(t,J＝6.5Hz,2H),3.69(t,J＝7.2Hz,2H),3.00(s,3H),1.82–1.64(m,4H),1.54–1.32(m,4H).
1.3N-6-3的制备
参考实施例1中的1.3的制备方法，得到白色固体N-6-3(475mg，91％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.91–7.81(m,2H),7.78–7.66(m,2H),3.69(t,J＝7.3Hz,2H),3.26(t,J＝6.8Hz,2H),1.79–1.54(m,4H),1.52–1.30(m,4H).
1.4N-6-N3的制备
参考实施例1中的1.4的制备方法，得到无色油状液体N-6-N3(156mg，73％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ3.27(t,J＝6.9Hz,2H),2.70(t,J＝6.7Hz,2H),1.70–1.55(m,2H),1.54–1.18(m,6H).
1.5-1.8ArBE 1-1至ArBE 1-4的制备
ArBE 1-1的制备与实施例1中的1.5相同。ArBE 1-2的制备与实施例1中的1.6相同。ArBE 1-3的制备与实施例1中的1.7相同。ArBE 1-4的制备与实施例1中的1.8相同。
1.9ArBE N-6-1的制备
参考实施例1中的1.9的制备方法，得到无色油状液体ArBE N-6-1(90mg，62％)。1HNMR(300MHz,CDCl3)
δ7.83(d,J＝8.0Hz,2H),7.44(d,J＝7.9Hz,2H),7.07(d,J＝8.6Hz,2H),5.13(s,4H),4.92(s,2H),4.80(t,J＝5.3
Hz,2H),3.36–3.09(m,8H),1.70–1.45(m,8H),1.44–1.22(s,20H).
1.10ArBE N-6 4E的制备
参考实施例1中1.10的制备方法，得到纯品ArBE N-6 4E(90mg，57％)。1H NMR(300MHz,CD3OD)δ7.88(s,2H),7.77(d,J＝7.8Hz,2H),7.49(d,J＝7.8Hz,2H),7.13(d,J＝8.8Hz,2H),5.12(s,4H),4.96(s,2H),4.37(t,J＝7.0Hz,4H),3.81(s,4H),3.64(s,24H),3.24(t,J＝6.3Hz,8H),3.08(t,J＝6.7Hz,4H),2.87–2.64(m,24H),2.61–2.33(m,32H),1.96–1.78(m,4H),1.56–1.41(m,4H),1.41–1.17(m,20H).
1.11ArBE N-6 4A的制备
参考实施例1中1.11的制备方法，得到纯品ArBE N-6 4A(53mg，85％)。1H NMR(300MHz,CD3OD/CDCl3)δ7.81(s,2H),7.59(d,J＝7.3Hz,2H),7.37(d,J＝7.6Hz,2H),7.09(d,J＝8.7Hz,2H),5.12(s,4H),4.90(s,2H),4.37(t,J＝7.0Hz,4H),3.81(s,4H),3.32–3.18(m,24H),3.12(t,J＝6.9Hz,4H),3.00–2.64(m,40H),2.56(t,J＝6.7Hz,8H),2.49–2.28(m,24H),1.97–1.85(m,4H),1.56–1.44(m,5H),1.41–1.20(m,8H).
实施例8：化合物ArBE B3-11 2A的制备
1.1–1.4N-11-1至N-11-N3的制备
N-11-1的制备与实施例1中的1.1相同。N-11-2的制备与实施例1中的1.2相同。N-11-3的制备与实施例1中的1.3相同。N-11-N3的制备与实施例1中的1.4相同。
1.5AB3-1的制备
参考实施例1中1.6的制备方法，得到纯品AB3-1(1458mg，产率94％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.17(d,J＝8.5Hz,2H),6.76(d,J＝8.5Hz,2H),5.46(s,1H),4.66(s,2H),0.93(s,9H),0.09(s,6H).
1.6AB3-2的制备
参考实施例1中1.5的制备方法，得到纯品AB3-2(1519mg，产率76％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ6.95(s,2H),4.69(s,4H),4.59(s,2H),0.93(s,10H),0.10(s,6H).
1.7AB3-3的制备
参考实施例1中1.6的制备方法，得到纯品AB3-3(2345mg，产率89％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.18(s,1H),7.08(s,2H),4.86(s,4H),4.65(s,2H),0.95(d,J＝4.4Hz,27H),0.13(s,12H),0.10(s,6H).
1.8AB3-4的制备
参考实施例1中1.7的制备方法，得到纯品AB3-4(624mg，产率84％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(d,J＝8.0Hz,2H),7.33(d,J＝8.0Hz,2H),7.17(s,2H),4.74(s,2H),4.53(s,4H),4.38(s,2H),1.33(s,12H).
1.9AB3-5的制备
参考实施例1中1.8的制备方法，得到纯品AB3-5(101mg，产率82％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.29–7.96(m,3H),7.84(d,J＝7.7Hz,2H),7.65(s,2H),7.51–7.34(m,5H),7.07(s,3H),5.53–5.37(m,6H),5.09(s,2H),1.36(s,12H).
1.10ArBE N-11AB3-1的制备
参考实施例1中1.9的制备方法，得到纯品ArBE N-11AB3-1(89mg，产率58％)。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ7.83(d,J＝7.8Hz,2H),7.46(d,J＝7.8Hz,2H),7.39(s,2H),5.16(s,4H),5.05(s,2H),4.95(s,2H),3.31–3.06(m,12H),1.70–1.42(m,34H),1.31(d,J＝24.9Hz,53H).
1.11ArBE N-11AB3-2E的制备
参考实施例1中1.10的制备方法，得到纯品ArBE N-11AB3-2E(88mg，产率78％)。1HNMR(300MHz,CD3OD)δ7.85(s,3H),7.79–7.60(m,2H),7.58–7.24(m,4H),7.06–6.73(m,1H),5.20–4.89(m,8H),4.37(t,J＝7.0Hz,6H),3.88–3.68(m,6H),3.63(s,18H),3.15–3.01(m,6H),2.91–2.61(m,12H),2.57–2.41(m,12H),1.97–1.81(m,6H),1.60–1.38(m,6H),1.38–1.09(m,54H).
1.12ArBE N-11AB3-2A的制备
参考实施例1中1.11的制备方法，得到纯品ArBE N-11AB3-2A(33mg，产率85％)。1HNMR(300MHz,CD3OD/CDCl3)δ7.82(s,3H),7.59(d,J＝7.1Hz,2H),7.44–7.33(m,4H),5.20–4.90(m,6H),4.37(t,J＝7.1Hz,6H),3.78(s,6H),3.32–3.22(m,12H),3.17–3.07(m,6H),2.92–2.60(m,24H),2.43(t,J＝6.5Hz,12H),1.98–1.82(m,6H),1.57–1.44(m,6H),1.40–1.16(m,42H).
实施例9：化合物ArBE B3-11 4A的制备
1.1-1.10N-11-1至ArBE N-11AB3-1的制备
N-11-1的制备与实施例1中的1.1相同。N-11-2的制备与实施例1中的1.2相同。N-11-3的制备与实施例1中的1.3相同。N-11-N3的制备与实施例7中的1.4相同。AB3-1的制备与实施例7中的1.5相同。AB3-2的制备与实施例7中的1.6相同。AB3-3的制备与实施例7中的1.7相同。AB3-4的制备与实施例7中的1.8相同。AB3-5的制备与实施例7中的1.9相同。ArBEN-11AB3-1的制备与实施例7中的1.10相同。
1.11ArBE N-11AB3-4E的制备
参考实施例1中1.10制备方法，得到纯品ArBE N-11AB3-4E(88mg，产率78％)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.88–7.74(m,8H),7.52–7.28(m,6H),5.45(d,J＝2.3Hz,2H),5.16–4.98(m,8H),4.37(q,J＝7.0Hz,6H),3.81(s,6H),3.66(s,32H),3.25(t,J＝6.4Hz,12H),3.14–3.04(m,6H),2.85–2.68(m,36H),2.55(t,J＝6.4Hz,12H),2.50–2.36(m,36H),1.96–1.85(m,6H),1.53–1.42(m,6H),1.40–1.16(m,54H).
1.12ArBE N-11AB3-4A的制备
参考实施例1中1.11制备方法，得到纯品ArBE N-11AB3-4A(34mg，产率83％)。
1H NMR(300MHz,CD3OD/CDCl3)δ7.84(s,3H),7.59(d,J＝7.4Hz,2H),7.47–7.33(m,4H),5.20–4.89(m,8H),4.38(t,J＝7.0Hz,6H),3.82(s,6H),3.32–3.17(m,32H),3.12(t,J＝7.3Hz,6H),2.99–2.64(m,60H),2.57(t,J＝6.8Hz,12H),2.49–2.27(m,36H),1.97–1.83(m,6H),1.56–1.42(m,6H),1.40–1.17(m,42H).
实施例10：化合物ArBE N-11 2TA的制备
1.1ArBE N-11 2TA的制备
使用实施例1中的ArBE N-11 2E为原料，参考实施例1中1.11的制备方法，将乙二胺用N,N-二甲基乙二胺代替，得到纯品ArBE N-11 2TA(34mg，产率85％)。HR-MS:1462.0047[M+H]+(3.0ppm)。
实施例11：化合物ArBE N-11 4TA的制备
1.1ArBE N-11 4TA的制备
使用实施例2中的ArBE N-11 4E为原料，参考实施例10中1.1制备方法，得到纯品ArBE N-11 4TA(42mg，产率81％)。HR-MS:2486.7655[M+H]+(2.2ppm)。
实施例12：化合物ArBE N-11 8TA的制备
1.1ArBE N-11 8TA的制备
使用实施例3中的ArBE N-11 8E为原料，参考实施例10中1.1制备方法，得到纯品ArBE N-11 8TA(45mg，产率86％)。HR-MS:2268.6366[M+2H]2+(-3.0ppm)。
实施例13：化合物ArBE N-8 4TA的制备
1.1ArBE N-8 4TA的制备
参考实施例11中1.1制备方法，将ArBE N-11 4E用实施例6中ArBE N-8 4E替换，得到纯品ArBE N-8 4TA(55mg，产率87％)。HR-MS:2402.6696[M+H]+(1.5ppm)。
实施例14：化合物ArBE N-6 4TA的制备
1.1ArBE N-6 4TA的制备
参考实施例13中1.1制备方法，将ArBE N-8 4E用实施例7中ArBE N-6 4E替换，得到纯品ArBE N-6 4TA(55mg，产率87％)。HR-MS:2346.6125[M+H]+(3.8ppm)。
实施例15：化合物ArBE B3-11 2TA的制备
1.1ArBE B3-11 2TA的制备
参考实施例10中1.1制备方法，将ArBE N-11 2E用实施例8中ArBE B3-11 2E替换，得到纯品ArBE B3-112TA(33mg，产率84％)。HR-MS:2051.4675[M+H]+(2.1ppm)。
实施例16：化合物ArBE B3-11 4TA的制备
1.1ArBE B3-11 4TA的制备
参考实施例11中1.1制备方法，将ArBE B3-11 4E用实施例9中ArBE B3-11 4E替换，得到纯品ArBE B3-114TA(48mg，产率87％)。HR-MS:1794.8095[M+2H]2+(2.5ppm)。
B、理化性质表征部分：
实施例17、两亲性类树形分子的活性氧(ROS)响应性能的核磁氢谱表征
两亲性类树形分子的ROS响应性能通过核磁氢谱进行表征。首先配置化合物浓度为100～2000μM的溶液，将样品置于核磁管中，使用核磁检测。然后在样品中加入H2O2溶液，孵育后再次核磁检测。
结果表明，加入H2O2溶液后，ArBE N-11-4A两亲性树形分子的芳环上的H信号发生变化，最后发生完全转变，说明ArBE N-11-4A能在ROS条件下响应性断裂(附图1)。实施例中的其他分子均能通过此方法表征其ROS响应性，说明这一类的ArBE两亲性树形分子均具有较好的ROS响应性能。
实施例18、ArBE两亲性类树形分子的临界聚集浓度的测定
两亲性类树形分子的临界聚集浓度通过尼罗红荧光探针光谱法进行测定。首先，配制不同浓度的两亲性树形分子的水溶液，加入尼罗红溶液，将上述溶液超声后静置。通过多功能酶标仪测定荧光发射光谱，计算，绘制临界聚集浓度的曲线，计算两亲性树形分子的临界聚集浓度。
结果表明，两亲性树形分子ArBE N-11-4A，ArBE N-8-4A和ArBE N-6-4A具有一定的临界聚集浓度值，说明ArBE两亲性类树形分子均能在水溶液中自组装形成纳米粒，具有用于药物递送的潜力(附图2)。实施例中的其他分子通过该方法测定也能够在水溶液中自组装形成纳米粒。
实施例19、ArBE两亲性类树形分子的pH滴定实验
将样品溶于水中，向其中加入适量盐酸溶液将调节至酸。随后向溶液中逐次滴加氢氧化钠溶液，通过pH测定pH变化直至碱性不再有明显变化，以加入的氢氧化钠溶液体积和pH值作图得到pH滴定曲线。
结果表明，两亲性树形分子ArBE N-11-4A，ArBE N-8-4A，ArBE N-6-4A，ArBE N-11-4Gua和ArBE N-8-4BiGua具有pH缓冲能力，说明ArBE两亲性类树形分子均能在酸性内涵体中发挥质子海绵效应，增强核酸药物的内涵体逃逸，有助于药物递送(附图3)。实施例中的其他分子通过该方法测定也具有pH缓冲能力。
C、作为siRNA药物载体活性测试实例
实施例20、siRNA/ArBE两亲性树形分子复合物的制备
取0.5～2.5mg ArBE树形分子化合物溶于双蒸水中，制备成100～400μM的储备液。取1～25μL的储备液与siRNA按照N/P＝1～10(N/P为树形分子中氨基与核苷酸中磷酸基团的比例)的条件混匀，使siRNA终浓度为5～50nM，室温孵育30min，即得siRNA/ArBE树形分子纳米复合物。
实施例21、siRNA/ArBE两亲性树形分子细胞转染实验实施例
步骤1)细胞培养：人卵巢癌细胞(SKOV-3)以含10％胎牛血清(FBS)的Myccoy’5A培基培养，并在37℃下含5％二氧化碳的条件下孵育。
步骤2)细胞铺板：转染前24h，将细胞接种在6孔细胞培养板中，并在含有10％FBS的2mL新鲜培养基中培养。
步骤3)复合物的制备：按实施例20的制备方法，以N/P＝1～10的条件制备AKT2siRNA/ArBE树形分子的复合物溶液。
步骤4)转染：弃去原培基，将步骤3制得的复合物与细胞共孵育，孵育后验证基因沉默效果。
实施例22、siRNA/ArBE两亲性树形分子复合物基因沉默效果评价实施例
在实施例21后采用蛋白质印迹法(WB)验证AKT2蛋白的表达情况，根据目的条带的颜色深浅来观察AKT2 siRNA/ArBE树形分子复合物的基因沉默效果。
步骤1)蛋白质的提取：取上述与复合物共孵育的细胞，加入一定体积的细胞裂解液裂解，离心，取上清液，即得蛋白质溶液；
步骤2)蛋白质浓度的测定：BCA法测蛋白质浓度；
步骤3)取等量的蛋白质，制备成蛋白质样品；
步骤4)电泳过程：85V恒压电泳至溴酚蓝进入下层胶，再用135V恒压电泳至溴酚蓝到达胶底端附近处，停止电泳；
步骤5)转膜过程：恒流280mA，冰浴条件下转膜2h，即可得到蛋白膜；
步骤6)封闭：室温下，使用5％的脱脂牛奶溶液封闭1～2h；
步骤7)一抗的孵育：用稀释1000～50000倍的抗兔靶标蛋白(如AKT2)抗体，稀释1000～5000倍的抗鼠内参蛋白抗体孵育蛋白膜；
步骤8)二抗的孵育：用稀释2000～5000倍的辣根过氧化物酶标记的抗兔单克隆抗体和稀释2000～10000倍的辣根过氧化物酶标记的抗鼠单克隆抗体孵育蛋白膜；
步骤9)用化学发光成像系统拍照保存，即可观察到基因沉默效果。
结果表明：哑铃型两亲性聚酰胺-胺树形分子ArBE N-11 4A、ArBE B3-11 2A和ArBE B3-11 4A与siRNA的复合物表现出较好的基因沉默效果，基因沉默效果达到60％以上(见图4)。实施例中的ArBE N-11 2A、ArBE N-118A、ArBE N-11 4Gua、ArBE N-8 4BiGua、ArBE N-8 4A、ArBE N-6 4A、ArBE B3-11 2A、ArBE B3-11 4A、ArBE N-11 2TA、ArBE N-114TA、ArBE N-11 8TA、ArBE N-8 4TA、ArBE N-6 4TA、ArBE B3-11 2TA、ArBE B3-11
4TA分子均具有50％以上的基因沉默效果。说明该类两亲性聚酰胺-胺树形分子是一类有效的基因递送系统。
D、作为DNA药物载体活性测试实施例
实施例23、DNA/ArBE树形分子复合物的制备
取0.5～2.5mg的ArBE树形分子化合物溶于双蒸水中，制备成100～400μM的储备液。取1～25μL的储备液与DNA按照N/P＝1～10(N/P为树形分子中氨基与核苷酸中磷酸基团的比例)的条件混匀，使DNA终浓度为1～20ng/μL，室温孵育30min，即得DNA/ArBE树形分子纳米复合物。
实施例24、DNA/ArBE树形分子复合物细胞转染实验实施例
步骤1)细胞培养：人宫颈癌细胞(HeLa)以含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培基培养，并在37℃下含5％二氧化碳的条件下孵育。
步骤2)细胞铺板：转染前24h，将细胞接种在24孔细胞培养板中，并在含有10％FBS的500μL新鲜培养基中培养。
步骤3)复合物的制备：按实施例23的制备方法，以N/P＝1～10的条件制备pEGFP/ArBE树形分子的复合物溶液。
步骤4)转染：弃去原培基，将步骤3制得的复合物与细胞共孵育，孵育后验证基因表达效果。
实施例25、基因表达效果评价实施例
在实施例24转染结束后通过荧光显微镜观察细胞中EGFP蛋白表达效果并拍照。另外通过流式细胞仪对EGFP平均荧光值进行定量，以此评估递送效果。具体步骤如下：
步骤1)拍照：使用荧光显微镜进行拍照；
步骤2)收集细胞：加入50～150μL的胰酶消化细胞，显微镜下观察细胞变圆时，加入100～300μL的含血清的培养基终止消化，并将细胞收集到EP管中，离心；
步骤3)洗涤：弃去上述步骤的上清，加入100～500μL PBS进行洗涤，离心，弃上清，重复3～5次；
步骤4)流式细胞仪检测：加入100～500μL的PBS重悬细胞，涡旋混匀，随后进行上机测试。
结果表明：哑铃型两亲性聚酰胺-胺树形分子ArBE N-11 4A、ArBE B3-11 2A和ArBE B3-11 4A与DNA的复合物能够将pEGFP递送至细胞中并产生EGFP蛋白的表达(附图5)，其中它们介导的绿色荧光蛋白表达量是Control组的10000～100000倍。另外，实施例中的ArBE N-11 2A、ArBE N-11 8A、ArBE N-11 4Gua、ArBE N-84BiGua、ArBE N-8 4A、ArBE N-64A、ArBE N-11 2TA、ArBE N-11 4TA、ArBE N-11 8TA、ArBE N-8 4TA、ArBE N-6 4TA、ArBEB3-11 2TA、ArBE B3-11 4TA分子介导的绿色荧光蛋白表达量是Control组的5000～15000倍。说明该类两亲性聚酰胺-胺树形分子均能成功递送DNA。
E、作为mRNA药物递送实施例
实施例26、mRNA/ArBE N-11 4A复合物的制备
取0.5～2.5mg的ArBE N-11 4A化合物溶于双蒸水中，制备成100～800μM的储备液。取1～25μL的储备液与mRNA按照N/P＝1～10的条件配制复合物，使mRNA的终浓度为1～20ng/μL，室温孵育30～60min，即得mRNA/ArBE N-11 4A纳米复合物。
实施例27：mRNA/ArBE N-11 4A复合物细胞转染实验实施例
步骤1)细胞培养：人宫颈癌细胞(HeLa)及小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)以含10～30％胎牛血清(FBS)的培基培养，并在37℃下含5％二氧化碳的条件下孵育。
步骤2)细胞铺板：转染前24～48h，将细胞接种在细胞培养板中，并在含有10％FBS的200～1000μL新鲜培养基中培养。
步骤3)复合物的制备：按实施例26的制备方法，以N/P＝1～10的条件制备mRNA/ArBE N-11 4A的复合物溶液。
步骤4)转染：弃去原培基，将步骤3制得的复合物与细胞共孵育，孵育后验证基因表达效果。
实施例28、EGFP基因表达效果评价实施例
在进行实施例27转染孵育后，采用荧光显微镜及流式细胞仪进行评价EGFP基因表达效果。
步骤1)拍照：使用荧光显微镜进行拍照；
步骤2)收集细胞：加入50～150μL的胰酶消化细胞，显微镜下观察细胞变圆时，加入100～300μL的含血清的培养基终止消化，并将细胞收集到EP管中，离心；
步骤3)洗涤：弃去上述步骤的上清，加入100～500μL PBS进行洗涤，离心，弃上清，重复3～5次；
步骤4)流式细胞仪检测：加入100～500μL的PBS重悬细胞，涡旋混匀，随后进行上机测试。
结果表明，EGFP mRNA/ArBE N-11 4A复合物可以成功地将EGFP mRNA递送至HeLa细胞中并表达荧光蛋白，而裸露的mRNA无法转运至细胞内，因此无法表达(附图6)。实施例中的其他分子采用本法进行GFP mRNA递送效果评价也具有与ArBE N-11 4A相似的效果，其绿色荧光蛋白表达量在20～50倍。说明该类Bola两亲性树形分子均能成功递送GFP mRNA。
实施例29、Luciferase基因表达效果评价实施例
在进行实施例27转染孵育后，采用酶标仪检测荧光素酶的表达。
步骤1)洗涤：弃上清，用100～500μL PBS洗涤，用吸液泵吸去上清，重复3次；
步骤2)裂解细胞：随后加入50～200μL的细胞裂解液，取20～200μL的细胞悬液于96孔板中；
步骤3)向细胞悬液中加入等体积的Luciferase底物，于酶标仪下进行检测荧光素酶的表达。
结果表明，ArBE N-11 4A也能成功递送Luciferase mRNA并成功表达荧光素酶(附图7)。实施例中的其他分子采用上述方法进行mRNA递送效果评价也具有与ArBE N-11 4A相似的效果，其表达的荧光值是Control组的30～50倍。说明该类Bola两亲性树形分子均能成功递送Luc mRNA。
实施例30、两亲性类树形分子用于基因递送的无菌注射液
步骤1)制备两亲性树形分子的储备液：在无菌条件下操作，将两亲性树形分子溶于无菌水中，超声，静置，制备成储备液；
步骤2)两亲性树形分子与siRNA复合物的制备：在无菌条件下操作，将一定量两亲性树形分子的储备液与siRNA水溶液迅速混匀，其中含氨基树形分子与含磷酸核苷酸的比例(N/P)为1～10。混匀后，将复合物溶液用无菌的缓冲盐溶液(pH 7.4)稀释至siRNA的终浓度为5～50nM，即得复合物溶液；
步骤3)灌装：在无菌条件下操作，将单剂量的复合物溶液灌装到安瓿瓶中，密封。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明保护范围之内。

Claims (8)

1.具有如以下通式(V)所示结构的化合物，或其药学上可接受的盐；
式中，
R1为C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤素或者
M为
n为2至16的整数；
X独立的表示为如下三种结构(I)、(II)或(III)
其中，
R2、R3、R4、R5或R6分别独立地为C2-6亚烷基基团；
R为羟基、取代或非取代的氨基或者取代或非取代的C1-6烷氨基或取代或非取代的C1-6烷氧基；其取代基为卤素、氨基、C1-4烷氨基、C1-5烷基、苄基、苯基、羧基、C2-5酯基、苄酯基、
2.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中M为R1为甲基、甲氧基、氟、氯、溴或者R2、R3、R4、R5或R6分别独立地为C2-5亚烷基。
3.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中
R为羟基、氨基、C1-4烷氧基或取代的C1-4烷氨基；其取代基为氨基、C1-4烷氨基、苄基、苯基、羧基、
4.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中
R为羟基、氨基、C1-6烷氧基或-NH-R7；
R7为C1-5烷基、苄基或者R8取代的C2-6烷基；
R8为氨基、C1-6烷基单取代或双取代氨基、羧基、C2-5酯基、苄酯基、
5.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中R为羟基、氨基、C1-4烷氧基或取代的C1-4烷氨基；其取代基为氨基、C1-4烷基单取代或双取代的氨基、
6.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中化合物为：
7.一种药物组合物，它包括权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐。
8.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备核酸递送药物或制剂方面的应用。
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