CN114957680A

CN114957680A - 一种氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子纳米胶束及其制备和应用

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Publication number: CN114957680A
Application number: CN202210275976.4A
Authority: CN
Inventors: 史向阳; 李锦�; 陈亮
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University
Priority date: 2022-03-21
Filing date: 2022-03-21
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2042-03-21
Also published as: CN114957680B

Abstract

本发明涉及一种氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子纳米胶束及其制备和应用。该制备方法包括：1，3‑双十二烷基‑5‑羟基间苯二甲酰胺制备；第0.5代的含磷树冠大分子制备；第1代的含磷树冠大分子制备；吡咯烷修饰的含磷树冠大分子制备；氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子纳米材料制备。该方法简单，反应过程可控性高，易于操作；制备的含磷树冠大分子纳米胶束可用做高效的基因传递载体，与已报道的含磷树状大分子相比具有更强的基因传递性能，能够有效地负载治疗性基因，拥有良好的基因治疗应用前景。

Description

一种氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子纳米胶束及其制备和应用

技术领域

本发明属于基因传递纳米材料及其制备和应用领域，特别涉及一种氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子纳米胶束及其制备和应用。

背景技术

基因治疗是指借助于一定的载体或手段将功能性外源基因导入靶细胞中，通过外源基因的表达产物或外源基因抑制靶基因的转录或翻译，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，从而介入疾病的治疗。目前基因治疗研究面临的严峻挑战之一是缺乏一种安全高效的递送载体。在基因递送载体系统中，主要包含病毒载体和非病毒载体。病毒载体转染效率高，但是生物安全性较差。相比之下，非病毒载体具备低细胞毒性、无免疫原性、高基因上载量等优点，成为了广大研究者的关注焦点。

非病毒载体中，树状大分子由于具备高度支化的三维立体结构和丰富的表面基团被广泛应用于基因传递研究。其中，含磷树状大分子由于其精准可控的三维结构和表面化学，受到了研究者的广泛关注。随着纳米生物技术的不断发展，含磷树状大分子作纳米载体，已经广泛应用于多种抗肿瘤和抗炎药物与治疗性基因递送。同时，具有独特生物活性的含磷树状大分子自身也用于抗炎和抗肿瘤治疗研究。已有研究表明，第3代氨基吡咯烷修饰的含磷树状大分子因其具有良好的酸解离常数，表现出优异的基因负载能力，可以高效负载治疗性基因(TNF-αsiRNA)用于小鼠急性肺损伤基因治疗(Bohr et al,Biomacromolecules,2017,18(8),2379-2388)。在此基础上，研究者进一步探索了含磷树状大分子的代数不同(1～3代)对于基因传递效率的影响。对于氨基吡咯烷修饰的含磷树状大分子，随着代数的增加，基因传递效率会逐步降低，且第1代含磷树状大分子的基因转染效率最高(Chen et al,Biomacromolecules,2020,21,2502-2511)。由于肿瘤和炎症类疾病治病机制极其复杂，单一的治疗方式难以达到最佳治疗效果，含磷树状大分子的刚性分子结构和有限的内部空腔限制了其对药物的负载能力。为了解决这个问题，作为含磷树状大分子家族重要成员之一的两亲性含磷树冠大分子受到了研究者的关注。两亲性含磷树冠大分子是一种具有疏水内核部分和亲水端基部分的树冠大分子，其在水溶液中能够形成尺寸均一的纳米胶束。其疏水的内部空腔结构，可以通过物理包裹负载药物(例如阿霉素)，树冠大分子表面的质子化基团可以静电吸附治疗性基因(例如miRNA21 inhibitor)，可以实现三阴性乳腺癌的基因治疗和化疗联合治疗(陈亮.一种含磷树冠大分子杂化纳米材料及其制备和应用,中国,CN202010448126.0,2020-09-04)。尽管含磷树冠大分子已被用于基因治疗研究，但其与相同代数含磷树状大分子的基因传递效率差异还未被进一步探讨。研究人员通过向含磷树状大分子的内核部分引入疏水烷基长链构建了两亲性含磷树冠大分子，其物理化学结构与性质的改变是否会影响其基因传递能力，这一点值得进一步研究。

肺泡巨噬细胞在急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征和肺炎等肺部疾病的发生发展过程中起着至关重要的作用，其中M1型巨噬细胞主导促炎作用，M2型巨噬细胞主导抑炎反应和组织修复作用。M1型肺泡巨噬细胞，一方面可以释放一氧化氮(NO)等有毒物质直接对肺组织造成损伤，另一方面分泌大量促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)等，加速机体炎症，损伤肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞，导致肺水肿和肺换气功能障碍。M2巨噬细胞可增强抑炎性细胞因子(IL-10、Arg-1和CD206)表达，限制促炎细胞因子水平,通过分泌纤连蛋白1和TGF-β促进宿主组织的修复，减少肺泡上皮细胞的损伤。这两种亚型的肺泡巨噬细胞在急性肺损伤病程中的作用并不完全孤立，在一定的条件下可以互相转化，通过调节M1与M2型的平衡可以有效清除炎症介质和细胞因子促进肺损伤的修复。因此，M1与M2型巨噬细胞的极化不平衡和相互转化为治疗炎症类疾病提供了契机。

检索国内外相关文献和专利结果表明：中国专利CN202010448126.0公开了一种含磷树冠大分子杂化纳米材料及其制备和应用，第1代氨基吡咯烷修饰的含磷树冠大分子纳米胶束可以同时负载治疗性基因和疏水性化疗药物，应用于三阴性乳腺癌的联合治疗。中国专利CN202010059060.6公开了一种含磷树状大分子基杂化纳米材料及其制备方法和应用，相比于第2代和第3代含磷树状大分子，第1代氨基吡咯烷修饰的含磷树状大分子的基因转染效率最高。然而，通过向含磷树状大分子内核部分引入疏水的脂肪酸长链得到两亲性含磷树冠大分子，其物理化学性质的改变对于基因传递能力的影响研究尚未报道。另外，第1代氨基吡咯烷修饰的含磷树状大分子具备优良的基因传递能力，同时负载两种治疗性基因通过调控巨噬细胞的极化平衡治疗炎症类疾病的研究，尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子纳米胶束及其制备和应用，以填补现有技术的空白。

本发明提供一种氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子，其结构式如下：

本发明还提供一种氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子材料的制备方法，包括：

(1)将1-十二胺溶于溶剂1中，加入无水硫酸钠，得到1-十二胺溶液，将5-羟基间苯二甲酸溶于溶剂2中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl活化，然后加入1-十二胺溶液反应，纯化，真空干燥，得到1，3-双十二烷基-5-羟基间苯二甲酰胺；

(2)将步骤(1)中1，3-双十二烷基-5-羟基间苯二甲酰胺溶于溶剂中，加入无水碳酸钾，冰浴，加入修饰有五个对羟基苯甲醛的环三磷腈AB₅溶液，反应，纯化，真空干燥，得到第0.5代的含磷树冠大分子；

(3)将步骤(2)中第0.5代的含磷树冠大分子溶于溶剂中，加入无水硫酸钠，冰浴，加入修饰有一个甲基肼的硫代磷酰氯MMHPSCl₂溶液，反应，纯化，真空干燥，得到第1代的含磷树冠大分子；

(4)将步骤(3)中第1代的含磷树冠大分子溶于溶剂中，逐滴加入N,N-二异丙基乙基胺，冰浴，再逐滴加入1-(2-氨基乙基)吡咯烷，搅拌反应，旋转蒸发，纯化，真空干燥，得到吡咯烷修饰的含磷树冠大分子；

(5)将步骤(4)中吡咯烷修饰的含磷树冠大分子溶于溶剂中，冰浴，逐滴加入氯化氢的乙醚溶液，搅拌反应，旋转蒸发，真空干燥，得到氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子纳米材料。

优选地，所述步骤(1)中溶剂1为甲醇；溶剂2为无水二氯甲烷。

优选地，所述步骤(1)中5-羟基间苯二甲酸、EDC·HCl和1-十二胺的摩尔比为1:4～6:1～3。

优选地，所述步骤(1)中1-十二胺溶液浓度为0.70～0.90mmol/mL。

优选地，所述步骤(1)中5-羟基间苯二甲酸的溶液浓度为0.40～0.60mmol/mL。

优选地，所述步骤(1)中活化时间为30～60分钟。

优选地，所述步骤(1)中反应温度为室温，反应时间为12～24小时。

优选地，所述步骤(1)中纯化为：采用溶剂体积比为1：19的甲醇和二氯甲烷进行柱层析纯化。

优选地，所述步骤(2)中溶剂为无水四氢呋喃。

优选地，所述步骤(2)中1，3-双十二烷基-5-羟基间苯二甲酰胺、AB₅和无水碳酸钾的摩尔比为1～2：1：3～5。

优选地，所述步骤(2)中1，3-双十二烷基-5-羟基间苯二甲酰胺的溶液浓度为0.070～0.1mmol/mL。

优选地，所述步骤(2)中AB₅溶液浓度为0.040～0.060mmol/mL，溶剂为四氢呋喃。

优选地，所述步骤(2)中修饰有五个对羟基苯甲醛的环三磷腈AB₅的制备方法包括：将六氯环三磷腈溶于无水四氢呋喃中，加入无水碳酸钾，冰浴，逐滴加入溶有对羟基苯甲醛的四氢呋喃溶液，室温反应，纯化，真空干燥，即得。

优选地，所述六氯环三磷腈、对羟基苯甲醛和无水碳酸钾的摩尔比为1：5～6：6～7。

优选地，六氯环三磷腈的四氢呋喃溶液浓度为0.40～0.60mmol/mL；对羟基苯甲醛的四氢呋喃溶液浓度为15～20mmol/mL。

优选地，所述冰浴时间为10～60分钟；室温反应时间为12～24小时。

优选地，所述纯化为：采用溶剂体积比为3：7的乙酸乙酯和正己烷进行柱层析纯化。

优选地，所述步骤(2)中冰浴时间为10～60分钟；反应温度为室温，反应时间为12～24小时。

优选地，所述步骤(2)中纯化为：采用溶剂体积比为1：1的乙酸乙酯和正己烷进行柱层析纯化。

优选地，所述步骤(3)中溶剂为无水二氯甲烷。

优选地，所述步骤(3)中第0.5代的含磷树冠大分子、无水硫酸钠和MMHPSCl₂的摩尔比为1:10～14:5～7。

优选地，所述步骤(3)中第0.5代的含磷树冠大分子的溶液浓度为0.04～0.1mmol/mL。

优选地，所述步骤(3)中MMHPSCl₂溶液浓度为0.04～0.60mmol/mL。修饰有一个甲基肼的硫代磷酰氯也可以叫做N-甲基二氯硫代磷酰肼。

优选地，所述步骤(3)中冰浴时间为10～60分钟；反应为室温搅拌反应12～24小时。

优选地，所述步骤(3)中纯化为：过滤，旋转蒸发，添加无水四氢呋喃重新溶解产物，逐滴加入至戊烷中，搅拌，移除上清后真空干燥。

优选地，所述步骤(4)中溶剂为无水四氢呋喃。

优选地，所述步骤(4)中第1代的含磷树冠大分子、N,N-二异丙基乙基胺和1-(2-氨基乙基)吡咯烷的摩尔比为1：10～15：10～15。

优选地，所述步骤(4)中第1代的含磷树冠大分子的溶液浓度为0.01～0.10mmol/mL。

优选地，所述步骤(4)中冰浴的时间为10～60分钟。

优选地，所述步骤(4)中搅拌反应为室温搅拌反应12～24小时。

优选地，所述步骤(4)中纯化为：加入少量无水四氢呋喃重新溶解产物，逐滴加入至正戊烷中，搅拌0.5～1小时，移除上清后真空干燥，其中正戊烷体积为无水四氢呋喃体积的10～15倍。

优选地，所述步骤(5)中溶剂为无水四氢呋喃。

优选地，所述步骤(5)中吡咯烷修饰的含磷树冠大分子和氯化氢的摩尔比为1:10～15。

优选地，所述步骤(5)中冰浴时间为10～60分钟。

优选地，所述步骤(5)中搅拌反应为：室温搅拌反应12～24小时。

本发明还提供一种基于氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子的自组装纳米胶束。

本发明还提供一种载基因氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子纳米胶束，所述纳米胶束载体为氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子的自组装纳米胶束，载体表面负载基因。

本发明还提供一种载基因氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子纳米胶束的制备方法，包括：将氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子纳米材料用无菌水稀释，并用无菌水稀释基因，然后混合均匀，孵育，即得。

优选地，所述基因为pDNA或miRNA混合物。其中pDNA为编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒DNA。

优选地，所述孵育温度为37℃，孵育时间为20～30分钟。

优选地，所述氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子的仲胺基与pDNA骨架上磷酸基团的摩尔比(即N/P比)为1：2～1：30。

本发明还提供一种载基因氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子纳米胶束在制备炎症类疾病基因治疗药物中的应用，例如用于制备急性肺损伤基因治疗药物。

本发明还提供一种载基因氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子纳米胶束用于基因转染的方法，包括：将小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)细胞种于12孔板上，于37℃、5％CO₂培养24～36小时，加入脂多糖(LPS)溶液孵育12～24小时，更换成无血清培养基，加入载基因氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子纳米胶束，混合均匀，在培养基箱中培育4～6小时，然后将培养基换成含血清的培养基继续培养24～36小时，检测基因的转染效率。

本发明以六氯环三磷腈为核通过发散迭代的方法合成新型氨基吡咯烷修饰的含磷树冠大分子，其表面可通过静电吸附负载治疗性基因，用于急性肺损伤的基因治疗。

本发明氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子纳米胶束，其基因传递能力要优于同等代数的含磷树状大分子，可以同时负载两种治疗性基因用于炎症类疾病的基因治疗。

本发明还提供了一种氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子的基因治疗效果评价方法，包括如下步骤：

(1)按照相应的N/P比，用无菌水配置C12G1纳米胶束溶液，并用无RNA酶的水(DEPC)稀释miRNA-mixture(miRNA-429 inhibitor与miRNA-146a mimic摩尔比1：1混合)，然后混合均匀，37℃下孵育20分钟，得到不同N/P比的C12G1/miRNA-mixture复合物，分别通过凝胶阻滞实验对载体与miRNA-mixture形成复合物的能力进行表征；通过水动力学粒径与表面电势对载体/miRNA-mixture复合物的电势粒径进行分析。其中N/P比为含磷树冠大分子的仲胺与miRNA骨架上磷酸基团摩尔比，数值范围为1：2～1：30；

(2)将MH-S细胞种于96孔板，于37℃、5％CO₂环境中培养24小时，加入LPS溶液孵育24小时，更换新鲜培养基并加入C12G1/miRNA-mixture复合物与细胞共孵育24小时，利用CCK-8法评价材料的细胞毒性；

(3)将MH-S细胞种于12孔板上，于37℃、5％CO₂培养24小时，加入LPS溶液孵育24小时，更换成无血清培养基，加入所得的C12G1/miRNA-mixture复合物，混合均匀，在培养箱中培育4小时，流式细胞仪检测细胞对材料/基因复合物的内吞效率；

(4)将MH-S细胞种于12孔板上，在37℃、5％CO₂环境中培养24小时，加入LPS溶液孵育24小时，更换成无血清培养基，加入C12G1/miRNA-mixture复合物与细胞共孵育4小时，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次后，更换新鲜培养基，培养24小时，收集上清，PBS洗涤三次，胰酶消化后离心收集细胞，利用免疫印迹法(Western blot)对MH-S细胞中miRNA-mixture下游调控基因(DUSP1、IRF5和TRAF6)的表达进行分析。利用格里斯氏试剂(Griess)测定法对细胞培养基上清中炎症介质NO的分泌进行分析；

(5)分别将PBS、miRNA-mixture、C12G1/miRNA-146a mimic、C12G1/miRNA-429i和C12G1/miRNA-mixture雾化给药至5组肺损伤小鼠肺部，正常组小鼠也用PBS处理，治疗周期为24小时；

(6)治疗结束后，分别取各实验组老鼠的肺部组织，组织碾磨提取总蛋白，测定蛋白浓度后利用Western blot检测肺部织中miRNA-mixture下游调控基因(DUSP1、IRF5和TRAF6)编码蛋白表达；

(7)治疗结束后，分别取各实验组老鼠的肺部组织，清洗干净后用4％多聚甲醛浸泡，利用Micro-CT影像学技术分析肺部组织受损程度，以及组织切片后用苏木精/伊红染色法(H&E)分析肺部病理组织结构。

本发明使用核磁共振(¹H NMR、³¹P NMR和¹³C NMR)、AFM、荧光光谱法、表面电势与水合粒径表征制备的纳米材料。然后利用CCK-8法评价复合物C12G1/pDNA和C12G1/miRNA-mixture对MH-S细胞毒性。通过荧光显微镜和流式细胞仪测定纳米胶束负载pDNA后表达EGFP进而评估其基因传递效率，评价其与同代含磷树状大分子的基因传递效率差异。利用流式细胞仪和Western blot评价纳米药物体外基因治疗效果。利用Western blot、ELISA、Micro-CT成像和H&E染色评价纳米药物的基因治疗效果。

有益效果

(1)本发明的方法简单，反应可控性强，易操作，成本低廉，终产物分子量均一，原料来源商业化，具有良好的推广前景；

(2)本发明制备得到的氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子可在水中自组装为纳米胶束，表面能够通过静电吸引负载基因。细胞实验结果显示，氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子在一定浓度条件下可作为安全的基因载体。同时，与已报道的含磷树状大分子相比具有更高的基因传递效率，能够在肺泡巨噬细胞中有效地传递治疗性基因。因此，此类两亲性含磷树冠大分子具备用于基因传递的优良前景；

(3)本发明的纳米材料生物实验过程易于操作，同时有具有良好的基因传递效果，在炎症类疾病基因治疗方面具有良好的应用潜力。

附图说明

图1为本发明的氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子纳米材料的合成示意图；

图2为实施例1制备的1，3-双十二烷基-5-羟基间苯二甲酰胺的核磁共振氢谱图(a)和碳谱图(b)；

图3为实施例1制备的C12-G0.5的核磁共振氢谱图(a)、磷谱图(b)和碳谱图(c)；

图4为实施例1制备的C12-G1的核磁共振氢谱图(a)、磷谱图(b)和碳谱图(c)；

图5为实施例1制备的C12-G1NC4的核磁共振氢谱图(a)、磷谱图(b)和碳谱图(c)；

图6为实施例2中用荧光染料芘测定了两亲性树冠大分子C12G1的临界胶束浓度；

图7为实施例2中的C12G1和C12G1稀释液的水合粒径；

图8为实施例3中的G1/pDNA(a)和C12G1/pDNA(b)凝胶阻滞试验电泳图；编号1为DNA marker，2～7分别表示N/P比为0.25、0.5、1、2、4和6，编号8表示裸pDNA；

图9为实施例4中的G1/pDNA和C12G1/pDNA的表面电势对比图(a)和水动力学直径对比图(b)；

图10为实施例5中制备的纳米材料G1与G1/pDNA复合物(图a和图e，图c和图g)和C12G1与C12G1/pDNA复合物(图b和图f，图d和图h)的AFM形貌图和高度轮廓图；

图11为实施例6中的G1/pDNA(a)和C12G1/pDNA(b)对MH-S的细胞毒性测试结果图；

图12为实施例7中的G1/pDNA和C12G1/pDNA在不同N/P下对MH-S细胞的EGFP基因转染的荧光显微镜图；

图13为实施例7中的G1/pDNA和C12G1/pDNA在不同N/P下对MH-S细胞的EGFP基因转染的流式细胞仪测定图；

图14为实施例8中的C12G1/miRNA-mixture凝胶阻滞试验电泳图；编号1为裸miRNA-mixture，2～8分别表示N/P比为0.125、0.25、0.5、1、2、4和6；

图15为实施例9中C12G1/miRNA-mixture的表面电势图(a)和水动力学直径图(b)；

图16为实施例10中C12G1/miRNA-mixture对MH-S的细胞毒性测试结果图；

图17为实施例11中MH-S细胞对于C12G1/miRNA-mixture复合物的内吞结果图；

图18为实施例12中的C12G1/miRNA-mixture复合物处理细胞后对于MH-S细胞极化相关细胞因子表达Western blot测试图(a-c)；

图19为实施例13中的C12G1/miRNA-mixture复合物处理细胞后对于MH-S细胞炎症介质NO分泌含量测试；

图20为实施例14中的各实验组小鼠肺泡灌洗液中促炎性细胞因子(a)TNF-α、(b)IL-1β和(c)IL-6含量的ELISA测试结果图；

图21为实施例15中各实验组小鼠肺部组织中MH-S细胞极化相关细胞因子表达Western blot测试图(a-c)；

图22为实施例16中各实验组小鼠肺部组织Micro-CT成像测试图(a)和肺部组织体积定量分析(b)；

图23为实施例17中各实验组小鼠肺部组织的组织学切片分析；其中实线箭头表示炎症细胞，虚线箭头表示肺泡壁充血，三角形表示肺泡。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

主要原料的来源及规格参数：

六氯三聚磷腈、对羟基苯甲醛、1-十二胺、5-羟基间苯二甲酸、硫代磷酰氯、甲基肼、无水碳酸钾、无水硫酸钠、无水二氯甲烷、无水氯仿、无水四氢呋喃、戊烷等有机溶剂购买自Sigma-Aldrich公司；MH-S细胞、RPMI 1640细胞培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素溶液和β-巯基乙醇溶液购买自上海中乔新舟生物科技有限公司；miRNA-429 inhibitor和miRNA-146a mimic购买来自上海吉玛制药技术有限公司。PVDF膜、Western封闭液、Western洗涤液、Western抗体稀释液、12％预制胶购买自上海麦约尔生物技术有限公司；一氧化氮检测试剂盒购买自碧云天生物技术公司。

实施例1

(1)将1-十二胺(0.02mol)溶于25mL甲醇中，加入过量无水硫酸钠，将5-羟基间苯二甲酸(0.01mol)溶于20mL无水二氯甲烷中，加入EDC·HCl(0.04mol)活化30分钟，然后加入溶有1-十二胺的甲醇溶液，室温反应24小时，纯化，真空干燥，制得1，3-双十二烷基-5-羟基间苯二甲酰胺。

(2)取六氯环三磷腈(0.03mol)溶于50mL无水四氢呋喃中，加入无水碳酸钾(0.18mol)；然后逐滴加入10mL溶有对羟基苯甲醛(0.15mol)的四氢呋喃溶液，室温反应24小时，薄层色谱分析检测反应进程，过滤去除沉淀，然后通过柱层析进行纯化(乙酸乙酯和正己烷，v：v＝3：7)得到有五个对羟基苯甲醛的环三磷腈AB₅。将1，3-双十二烷基-5-羟基间苯二甲酰胺(1mmol)溶于10mL无水四氢呋喃中，加入无水碳酸钾(1.9mmol)，冰浴30分钟，逐滴加入10mL有AB₅(0.6mmol)的四氢呋喃溶液，室温反应24小时，纯化，真空干燥，得到第0.5代的含磷树冠大分子C12-G0.5。

(3)将步骤(2)制得的C12-G0.5(1mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中，加入无水硫酸钠(12mmol)，冰浴30分钟，逐滴加入10mL修饰有一个甲基肼的硫代磷酰氯MMHPSCl₂(6mmol)氯仿溶液，室温反应24小时，纯化，真空干燥，得到第1代的含磷树冠大分子C12-G1。其中MMHPSCl₂为根据专利(陈亮.一种含磷树冠大分子杂化纳米材料及其制备和应用,中国,CN202010059060.6,2020-05-19)所述方法制备所得。

(4)将步骤(3)制得的C12-G1(0.1mmol)溶于10mL无水四氢呋喃中，逐滴加入N,N-二异丙基乙基胺(1mmol)，冰浴20分钟，逐滴加入1-(2-氨基乙基)吡咯烷(1mmol)，室温搅拌反应24小时，核磁(³¹P NMR和¹H NMR)检测反应进程，旋转蒸发有机溶剂，加入5mL无水四氢呋喃重新溶解产物，逐滴加入至50mL正戊烷中，搅拌0.5～1小时，移除上清后真空干燥，得到吡咯烷修饰的含磷树冠大分子C12-G1NC4。

(5)将步骤(4)制得的C12-G1NC4(0.4mmol)溶于10mL无水四氢呋喃中，加入过量无水硫酸钠，冰浴20分钟，逐滴加入氯化氢的乙醚溶液(4.0mmol)，室温搅拌反应24小时，旋转蒸发溶剂，真空干燥，得到氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子C12G1。

合成过程中对相关中间体分子和树冠大分子产物用核磁进行表征：

本发明使用400MHz核磁共振仪进行氢谱(¹H NMR)、磷谱(³¹P NMR)和碳谱(¹³C NMR)测试，结果如下：

1，3-双十二烷基-5-羟基间苯二甲酰胺

¹H NMRδ＝0.90(t,³J_(H-H)＝8Hz,6H,

),1.28(m,36H,

and

),1.63(m,4H,

),3.46(m,4H,

),5.32(DCM),6.43(t,³J_(H-H)＝8Hz,2H,

),7.59(s,2H,

-H),7.65(s,1H,

)ppm.

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ＝14.11(s,

),22.68(s,

),27.00(s,

),29.48(m,

),31.91(s,

),40.38(s,

),116.39(s,

),117.39(s,

),136.16(s,

),157.43(s,

),166.89(s,

)ppm.

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝0.89(t,³J_(H-H)＝6Hz,6H,

),1.27(m,36H,

-H and

),1.62(m,4H,

),3.43(m,4H,

),6.33(t,³J_(H-H)＝8Hz,2H,NH-

),7.17(m,10H,

),7.71(m,13H,

and

7,6,11),9.96(m,5H,CHO)ppm.

³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ＝7.29(m,P₀)ppm.

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ＝14.10(s,

),22.67(s,

),27.02(s,

),29.49(m,

),31.89(s,

),40.47(s,

),121.22(br s,

),121.84(s,

),122.05(s,

),131.37(s,

),133.71(m,

),136.86(s,

),150.30(m,

),154.48(br s,

),165.17(s,

),190.38(s,CHO),190.96(s,CHO)ppm.

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝0.89(t,³J_(H-H)＝6Hz,6H,

),1.26(m,36H,

-H and

),1.50(m,4H,

),3.34(m,4H,

),3.51(m,15H,CH₃-N-P₁),6.13(t,³J_(H-H)＝4Hz,2H,NH-P₁),7.03(m,10H,

),7.64(m,17H,

and CH＝N),7.97(s,1H,

),ppm.

³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ＝8.29(m,P₀),62.30,62.41(s,P₁)ppm.

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ＝14.13(s,

),22.68(s,

),26.99(s,

),29.51(m,

),31.87(s,

),31.96(m,CH₃-N-P₁),40.40(s,

),121.26(br s,

),121.99(s,

),122.11(s,

),128.62(s,

),128.69(s,

),131.39(s,

),131.47(s,

),136.78(s,

),140.60(m,CH＝N),150.65(s,

),151.55(br s,

),165.20(s,

)ppm.

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)(400MHz,CDCl₃)δ＝0.89(t,³J_(H-H)＝8Hz,6H,

),1.26(m,36H,

and

),1.55(m,4H,

),1.73(br s,40H,

),2.51(br s,40H,

-H),2.62(m,20H,

),3.05(m,20H,

),3.18(m,15H,CH₃-N-P₁),3.34(m,4H,

),4.13(m,10H,NH-P₁),6.99(m,10H,

),7.53(m,17H,

and CH＝N),8.14(s,1H,

)ppm.(lchG0765.3)

³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ＝8.39(m,P₀),68.52(m,P₁)ppm.

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ＝14.13(s,

),22.68(s,

),23.54(s,

),27.14(s,

),29.54(m,

),30.83(m,CH₃-N-P₁),31.91(s,

),39.78(s,

),39.90(s,

),40.39(s,

),53.79(s,

),56.23(m,

),121.02(br s,

),121.12(s,

),122.01(s,

),127.49(m,

),132.77(s,

),132.98(s,

),135.67(s,

),136.02(m,CH＝N),150.38(br s,

),150.78(s,

),165.07(s,

)ppm.

G1含磷树状大分子作为C12G1含磷树冠大分子的对照材料，为根据专利(陈亮.一种含磷树冠大分子杂化纳米材料及其制备和应用,中国,CN202010059060.6,2020-05-19)所述方法制备所得。C12G1与G1的结构式如下所示：

实施例2

将9mg的C12G1溶于3mL超纯水中配制3mg/mL的母液，随后梯度稀释成1mL且浓度为0.001-3mg/mL的工作液。每份工作液中加入10μL浓度为4.0×10^-4M芘(Py)的丙酮溶液，超声30分钟后室温保存过夜。设置稳态荧光仪入射狭缝宽度1.0mm，接收狭缝宽度1.2mm，在激发波长为333nm下，扫描每份溶液在350nm～435nm范围内的荧光曲线。取373nm与394nm处的荧光值比值I₃₇₃/I₃₉₄作纵坐标，工作液浓度lg值为横坐标，拟合曲线，曲线的拐点处横坐标即为C12G1临界胶束浓度的lg值(附图6)。结果显示，随着C12G1浓度的升高I₃₇₃/I₃₉₄的荧光强度比值在185μM处有一个明显的下降，这说明材料C12G1能够形成胶束，且临界胶束浓度为185μM。配制材料浓度为1mg/mL的C12G1水溶液，并且稀释至低于CMC的C12G1稀释液(0.1mg/mL)，通过马尔文激光粒度仪(Malvern,UK，633nm激光)对C12G1及C12G1稀释液的水动力学粒径进行测定。结果显示，相较于C12G1水合粒经(168.4nm)，胶束形成后将溶液稀释至CMC以下，胶束形态不会被破坏，此时的水合粒径为198.1nm，基本维持不变(附图7)。

实施例3

根据实施例1的方法制备的C12G1纳米胶束和G1含磷树状大分子分别与pDNA形成复合物，进行琼脂糖凝胶阻滞实验。配制8孔含有溴化乙锭(1mg/mL)的琼脂糖凝胶(1.0％w/v)，室温放置待琼脂糖凝胶凝固。按照不同N/P比0.25、0.5、1、2、4和6，pDNA量为1μg/孔，配制载体/pDNA复合物，孵育20分钟，并以裸pDNA为对照，然后将对应的载体/pDNA复合物分别加到琼脂糖凝胶孔中，电压100V，电泳时间35分钟。使用凝胶成像仪对pDNA在凝胶中的迁移进行分析。结果如图8所示，C12G1和G1都能够在N/P比为2及以上时与pDNA完全复合，将pDNA完全阻滞，说明这两种载体均具有很好的基因负载能力。

实施例4

根据实施例1的方法制备的C12G1纳米胶束和G1含磷树状大分子分别与5μg pDNA(N/P＝2、5、10、20和30)复合后，在室温下孵育20分钟，然后加入1mL蒸馏水。采用马尔文激光粒度仪(Malvern,MK,633nm激光)对其粒径和电势进行表征，结果如图9所示：载体/基因复合物的大小和电势都在合适转染的范围内。在同等N/P条件下(N/P＝2、5、10、20和30)，C12G1/pDNA复合物粒径略低于G1/pDNA复合物，二者电势相差不大。两种载体的电势均在37mV以下，水合粒径均在125～280nm之间，这非常有利于复合物与细胞间进行静电相互作用，易于细胞吸附和内吞，非常适合用于基因传递应用。

实施例5

配制2mg/mL的C12G1和G1溶液样品超声处理5分钟并稳定2小时，然后按照N/P＝10制备G1/pDNA和C12G1/pDNA复合物。纯纳米载体样本用超纯水稀释至0.2mg/mL。将样品溶液滴在原子力显微镜(AFM)专用硅片上，室温静置2小时，随后用氮气将液体吹离硅片，将样品置于AFM中进行观察和AFM图片拍摄。通过粒径分布分析，树状大分子G1、G1/pDNA复合物、树冠大分子纳米胶束C12G1(附图10a和10c)和C12G1/pDNA(附图10b和10d)的高度分别为：C12G1(28.1nm)、C12G1/pDNA复合物(42.7nm)、G1(17.9nm)和G1/pDNA复合物(31.6nm)，通过AFM测试高度变化可以这说明已成功制备了含磷树冠大分子/基因和含磷树状大分子/基因复合物。

实施例6

收集对数生长期的MH-S细胞，按照8000个细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，置于5％CO₂，37℃条件下孵育过夜，添加2μg/mL LPS孵育细胞24小时，弃掉培养基后，每孔更换90μL无血清(FBS)培养基，并添加10μL含不同浓度的材料(最终材料浓度为0、93.5、187.5、375、750、1500、3000nM)及其与pDNA复合物(pDNA用量为1μg)。之后将细胞培养板继续放置在5％CO₂，37℃继续孵育24小时。随后弃掉原培养基，加入含100μL含有10％CCK-8的无血清培养基，继续培养3小时后，放置在多功能酶标仪中于测试波长450nm下测试吸光值，结果如图11所示。与对照组(材料浓度为0，PBS溶液)相比，C12G1和G1在试验浓度范围内对MH-S细胞略有毒性，浓度为3000nM时细胞存活率为60％左右，负载pDNA后，C12G1和G1与基因复合物各浓度的细胞存活率较C12G1和G1相比有了明显的增加，说明负载基因后减少了表面电荷有助于增强材料的细胞生物相容性。

实施例7

将每孔1×10⁵MH-S细胞种植于12孔板中，加入LPS孵育24小时，替换成含10％FB S的培养基，分别加入不同N/P的C12G1/pDNA和G1/pDNA复合物与细胞共培养4小时。然后更换为含10％FBS的RPMI 1640培养基，继续培养24小时。利用荧光显微镜(图12)和流式细胞仪(图13)检测EGFP的表达情况。测试结果显示，含磷树状大分子G1的基因转染效率在N/P＝20时最高，含磷树冠大分子C12G1的基因转染效率在N/P＝10时最高且基因转染效率比G1的更高。实验结果表明含磷树冠大分子C12G1的基因转染效率要明显高于含磷树状大分子G1，且含磷树冠大分子C12G1能够在更低的N/P下达到最佳基因转染效率。

实施例8

根据实施例1的方法制备的C12G1与miRNA-mixture(miRNA-429inhibitor与miRNA-146a mimic摩尔比1：1混合)形成复合物，进行琼脂糖凝胶阻滞实验。配制8孔含有溴化乙锭(1mg/mL)的琼脂糖凝胶(1.0％w/v)，室温放置待琼脂糖凝胶凝固。按照不同N/P比0.125、0.25、0.5、1、2、4和6，miRNA-mixture量为1μg/孔，配制载体/miRNA-mixture复合物，孵育20分钟，并以裸miRNA-mixture为对照，然后将对应的载体/miRNA-mixture复合物分别加到琼脂糖凝胶孔中，电压100V，电泳时间35分钟。使用凝胶成像仪对miRN A-mixture在凝胶中的迁移进行分析。结果如图14所示，C12G1可以在N/P＝2时与miRN A-mixture完全复合，将miRNA-mixture完全阻滞，说明C12G1纳米胶束具有很好的miRNA-mixture负载能力。

实施例9

根据实施例1的方法制备的C12G1与5μg miRNA-mixture(N/P比为2、5、10、20和30)复合后，在室温下孵育20分钟，然后加入1mL蒸馏水。采用马尔文激光粒度仪(Mal vern,MK,633nm激光)对其粒径进行表征，结果如图15所示。C12G1/miRNA-mixture复合物的电势均在31～39mV之间，水合粒径均在130～240nm之内，这非常有利于复合物与细胞间进行静电相互作用，易于细胞吸附和内吞，非常适合用于基因传递应用。

实施例10

收集对数生长期MH-S细胞，按照8000个细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，置于5％CO₂，37℃条件下孵育过夜，添加2μg/mL LPS孵育细胞24小时，弃掉培养基后，每孔更换90μL无血清(FBS)培养基，并添加10μL含不同浓度的材料(最终材料浓度为0、93.5、187.5、375、750、1500、3000nM)及其与miRNA-mixture复合物(miRNA-mixt ure为1μg)。之后将细胞培养板继续放置在5％CO₂，37℃继续孵育24小时。随后弃掉原培养基，加入含100μL含有10％CCK-8的无血清培养基，继续培养3小时后，放置在多功能酶标仪中于测试波长450nm下测试吸光值，结果如图16所示。与对照组(材料浓度为0，PBS溶液)相比，C12G1在试验浓度范围内对MH-S细胞略有毒性，浓度为3000nM时细胞存活率为60％左右，负载miRNA-mixture后，C12G1与miRNA-mixture复合物各浓度的细胞存活率较C12G1相比有了明显的增加，说明负载基因后减少了表面电荷有助于增强材料的细胞生物相容性。

实施例11

将每孔1×10⁵MH-S细胞种植于12孔板中，加入LPS孵育24小时，替换成不含FBS的培养基，加入一定浓度(N/P为2～30，miRNA-mixture为1μg)的C12G1/miRNA-mixture和G1/miRNA-mixture复合物与细胞共培养4小时。孵育结束后，将培养基和材料弃去，并用PBS清洗3遍以除去残留物质，利用胰酶消化并收集细胞，利用流式细胞术分析细胞内吞情况。实验结果表明(图17)，经过细胞转染4小时后，材料能够成功被细胞内吞，C12G1/miRNA-mixture的细胞吞噬效率要明显高于G1/miRNA-mixture，且细胞吞噬效率在N/P＝10时最高。说明N/P＝10为C12G1用于基因转染的最佳N/P比，材料能够将基因完全压缩，形成的复合物被MH-S细胞吞噬量最高。

实施例12

将每孔1×10⁵MH-S细胞种植于12孔板中，培养过夜后加入LPS孵育24小时建立细胞模型，以不添加LPS的作为对照组。弃去培养基，替换成不含FBS的培养基，分别加入100μL的C12G1、miRNA-mixture、C12G1/miRNA 429i+scramble、C12G1/miRNA 146a mimic+scramble和C12G1/miRNA-mixture(N/P＝10，miRNA-mixture为1μg，scramble是乱序的miRNA序列，序列长度分别与miRNA 429i和miRNA 146a保持一致)与细胞共培养4小时。弃去培养基，用PBS洗3遍，更换新鲜培养基培养24小时。用胰酶消化并收集细胞，随后进行Western blot实验，具体实验步骤如下：

将细胞样本冰浴裂解，制作标准曲线对蛋白质含量进行检测。临时保存蛋白质样本，快速完成SDS-PAGE电泳清洗和灌胶等准备工作，上样后连接80V电压电泳5～6小时。转膜后，配制好一抗和二抗稀释液进行免疫反应，随后进行显影和定影工作，最后扫描胶片进行凝胶图像分析以及灰度分析。结果显示(附图18)，C12G1对于巨噬细胞的极化并无调节作用，裸miRNA-mixture几乎没有明显的基因表达抑制，C12G1/miRNA 146a mimic+scramble处理能够有效地抑制IRF5和TRAF6的蛋白表达，C12G1/miRNA 429i+scramble处理能够有效地促进DUSP1的蛋白表达，而C12G1/miRNA-mixture处理可以实现有效的联合基因治疗效果。

实施例13

按实施例12中相同的方法处理细胞，随后进行培养基上清中NO含量测定实验，具体实验步骤如下：利用孔板离心机将12孔板在1700rpm，5分钟条件下离心，吸取培养上清液。加待检样品50μL于96孔板的反应孔中，依次按照50μL/孔加入室温Griess Reagent I和室温Griess Reagent II溶液，充分混匀后避光室温放置5分钟。最后，利用酶标仪上，测定535nm处各孔OD值。结果显示(附图19)：相对于LPS处理组，裸miRNA-mixture几乎没有明显的炎症介质表达抑制效果，C12G1/miRNA 429i+scramble和C12G1/miRNA 146a mim ic+scramble处理组能在一定程度上抑制肺泡巨噬细胞分泌炎症介质NO，C12G1/miRNA-mixture可以增强NO的抑制效果。这说明C12G1/miRNA-mixture处理可以实现有效的联合基因治疗从而高效抑制炎症介质的表达。

实施例14

所有动物实验均经过东华大学伦理委员会批准，并严格按照标准进行。实验用的6周龄雄性BALB/c小白鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国，上海)。利用雾化给药器支气管喷雾给药LPS(5mg/kg)，24小时后将白鼠随机分为6组(对照组、LPS处理组、C12G1处理组、miRNA-mixture处理组、C12G1/miRNA 429i+scramble处理组、C12G1/miRNA 146a mi mic+scramble处理组和C12G1/miRNA-mixture处理组)。其中，miRNA 429i+scramble、miR NA146a mimic+scramble和miRNA-mixture最终剂量均为20μg，N/P比为10。通过雾化给药器给药到各组白鼠肺部。在治疗后第24小时，从6组实验组中各挑选一只小鼠，利用PB S灌注肺部，抽提肺泡灌洗液，4℃条件下4000转速，离心5分钟，将上层清液转移到新的离心管中，存于-80℃。随后利用ELISA法检测肺泡灌洗液中促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的含量。实验结果显示(附图20)，相对于LPS处理的对照组，裸miRNA-mixt ure处理组无明显治疗效果，而C12G1/miRNA 429i+scramble、C12G1/miRNA 146a mimic+s cramble和C12G1/miRNA-mixture处理组小鼠肺泡灌洗液中的促炎性细胞因子含量明显降低，呈现为C12G1/miRNA 429i+scramble治疗组≈C12G1/miRNA 146a mimic+scramble治疗组＜C12G1/miRNA-mixture治疗组，说明C12G1/miRNA-mixture复合物表现出了优良的基因治疗联合抗炎效果。

实施例15

在治疗后第24小时，从6组实验组中各挑选一只小鼠，取其肺部组织于液氮中快速碾磨，提取肺部组织蛋白。测定蛋白质浓度，随后依次进行SDS-PAGE电泳、转膜、免疫反应、ECL化学显影剂定影实验，并对凝胶图像进行分析。实验结果显示(附图21)，对于单独LPS处理组而言，裸miRNA-mixture几乎没有明显的基因治疗效果，C12G1/miRNA 429i+scrambl e和C12G1/miRNA 146a mimic+scramble均能够表现出良好的基因治疗效果，而C12G1/miRNA-mixture能够同时抑制IRF5和TRAF6的表达，促进DUSP1的表达，有效促进肺部肺泡巨噬细胞的M2型极化从而实现抗炎治疗效果。

实施例16

在治疗后第24小时，从6组实验组中各挑选一只小鼠，取其肺部组织于组织固定液中浸泡24～48小时，利用Micro-CT成像技术分析肺部组织损伤程度。实验结果显示(附图22)，相对于LPS处理的对照组，裸miRNA-mixture处理对于肺损伤无明显治疗效果，C12G1/miRNA 429i+scramble和C12G1/miRNA 146a mimic+scramble处理组小鼠，肺部损伤程度均有所降低。在C12G1/miRNA-mixture的联合基因治疗下，肺部组织损伤程度得到了明显改善，基本上恢复至正常。

实施例17

在治疗后第24小时，从6组实验组中各挑选一只小鼠，取其肺部组织于组织固定液中浸泡24小时，运用H&E染色分析肺部组织损伤恢复程度。实验结果显示(附图23)，相对于LPS处理的对照组，裸miRNA-mixture处理对于肺损伤病灶部位无明显治疗效果，C12G1/miRNA 429i+scramble和C12G1/miRNA 146a mimic+scramble处理组小鼠，肺泡壁充血程度和炎症细胞浸润程度均有所降低。在C12G1/miRNA-mixture的联合基因治疗下，肺泡壁充血和肺部炎症浸润程度有明显改善，基本上恢复至正常。综上所述，本发明制备的氨基吡咯烷修饰的含磷树冠大分子共递送miRNA 429 inhibitor和miRNA 146a mimic可以实现双重基因治疗调节M2巨噬细胞，抗炎治疗急性肺损伤。

Claims

1.一种氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子，其结构式如下：

2.一种如权利要求1所述氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子材料的制备方法，包括：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中溶剂1为甲醇；溶剂2为无水二氯甲烷；5-羟基间苯二甲酸、EDC·HCl和1-十二胺的摩尔比为1:4～6:1～3；活化时间为30～60分钟；反应温度为室温，反应时间为12～24小时。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中溶剂为无水四氢呋喃；1，3-双十二烷基-5-羟基间苯二甲酰胺、AB₅和无水碳酸钾的摩尔比为1～2：1：3～5；冰浴时间为10～60分钟；反应温度为室温，反应时间为12～24小时。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中溶剂为无水二氯甲烷；第0.5代的含磷树冠大分子、无水硫酸钠和MMHPSCl₂的摩尔比为1:10～14:5～7；冰浴时间为10～60分钟；反应为室温搅拌反应12～24小时。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中溶剂为无水四氢呋喃；第1代的含磷树冠大分子、N,N-二异丙基乙基胺和1-(2-氨基乙基)吡咯烷的摩尔比为1：10～15：10～15；冰浴时间为10～60分钟，搅拌反应为室温搅拌反应12～24小时。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中溶剂为无水四氢呋喃；吡咯烷修饰的含磷树冠大分子和氯化氢的摩尔比为1:10～15；冰浴时间为10～60分钟；搅拌反应为：室温搅拌反应12～24小时。

8.一种基于权利要求1所述氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子的自组装纳米胶束。

9.一种载基因氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子纳米胶束，其特征在于，所述纳米胶束载体为权利要求1所述氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子的自组装纳米胶束，载体表面负载基因。

10.一种如权利要求9所述载基因氨基吡咯烷修饰的两亲性含磷树冠大分子纳米胶束在制备炎症类疾病基因治疗药物中的应用。