CN106866960B - 一种细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医用高分子材料领域，公开了一种细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料及其制备方法与应用。本发明载体材料结构如通式(1)所示：其中，R1为苄基、烷基或聚乙二醇，n为聚合度，x为侧链不含双键的重复单元的聚合度，且x<n。本发明载体材料，其侧链含伯胺阳离子，能有效地与siRNA形成聚电解质纳米复合胶束，向肿瘤细胞内传递siRNA，转染效率非常好，可与高效率载体PEI相媲美，但细胞毒性比PEI低的多，甚至没有细胞毒性。本发明还提供了一种上述载体材料的制备方法，可低成本、大批量地制备转染效率高、细胞毒性低的非病毒类基因载体，在肿瘤和多种免疫疾病的基因治疗方面有广阔的应用前景。

Description

一种细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料及 其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医用高分子材料领域，特别涉及一种细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料及其制备方法与应用。
背景技术
近二十年来，基因疗法是被认为是一种治疗肿瘤和多种免疫疾病的有效方法。它是将正常基因或具有修复作用的质粒(pDNA)通过一定的方式导入靶细胞来纠正基因缺陷，从而达到治疗目的；或者是通过特定方式将具有沉默功能的小干扰RNA(siRNA)导入靶细胞来沉默致病基因的表达，从而达到治疗的目的。要达到这样的目标，必需将外源基因负载到合适载体上，然后将基因递送至靶细胞，载体起到保护基因的目的，否则其将被核酸酶降解，以至于导致基因治疗失败。因此，对能够负载并保护基因的载体材料的选择，就变得非常关键。病毒具有携带基因转染细胞的天然生物功能，因此可以高效率的将外源基因导入到靶细胞，效率非常高。常用的病毒载体主要有腺病毒，逆转录病毒和慢病毒等，虽然转染效率高，但病毒载体的致命缺陷是能够引发免疫响应而导致患者死亡(N.S.Templeton,Bioscience Reports,2002,22,283-295)。此外，病毒也具有不能够大批量制备、成本高、运载基因容量有限等缺点(D. Ibraheem,A.Elaissari,H.Fessi,International Journal ofPharmaceutics,2014,459: 70–83)。针对此缺点，研究者根据基因自身带负电的结构特点，使带阳离子的化合物与基因通过静电吸引作用来形成纳米尺度的复合物胶束，从而保护基因，安全性比病毒载体大大增加。非病毒载体主要有阳离子脂质体、阳离子聚合物以及阳离子无机化合物等。阳离子脂质体的应用最为广泛，但阳离子脂质体为小分子物质，带正电荷较少，与基因结合能力不够强，转染效率也不高。更为关键的是，脂质体每个分子带正电荷数少，因此完全中和基因的负电荷时的投料量就很大，这大大增加了脂质体类载体的细胞毒性。事实上，载体的安全性一直是困扰基因疗法的瓶颈，例如，1999年，一例患肝病的18岁病人Jesse Gelsinger在使用基因疗法的过程中死亡，这次事件导致全球基因疗法的临床试验基本停止(N.S.Templeton,Bioscience Reports,2002,22,283-295)，这是基因疗法发展历史上的重大挫折。病人死亡的原因是腺病毒载体(AV)使病人的免疫系统过度反应，引发患者多器官衰竭和脑死亡。尽管基因治疗一直在曲折中前进，今年的麻省理工学院技术评论仍将基因治疗技术评为“2017年十大技术突破”之一(E.Mulin,MIT technologyreview,2017,March/April)，这直接得益于2012年以来更为安全的腺相关病毒载体(AAV)的使用。尽管如此，病毒载体由于自身本性的限制，安全性仍是无法避免的问题。由此看来，开发更为安全、低细胞毒性以及高转染效率的新型非病毒类聚合物载体，无疑仍旧是解决基因疗法瓶颈的关键。
发明内容
为了克服上述现有技术非病毒载体的细胞毒性的缺点与不足并保证转染的高效性，本发明的首要目的在于提供一种基于阳离子多肽类的细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料。
本发明的载体材料为侧链含有伯胺离子的多肽类载体，可有效地和siRNA 结合形成纳米复合物胶束，可向靶细胞中传递siRNA，细胞毒性低，甚至无细胞毒性；转染效率好，可与经典的高效率转染载体聚乙烯亚胺(PEI)相媲美。
本发明另一目的在于提供一种上述非病毒基因转染载体材料的制备方法。
本发明再一目的在于提供上述非病毒基因转染载体材料在siRNA递送中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种基于阳离子多肽类的细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料，其结构如通式(1)所示：
其中，R1可以为苄基、烷基或聚乙二醇，n为聚合度，x为侧链不含双键的重复单元的聚合度，且x<n。
本发明的载体材料为侧链含有伯胺离子的多肽类载体，可有效地和siRNA 结合形成纳米复合物胶束，可向靶细胞中传递siRNA，细胞毒性低，甚至无细胞毒性；转染效率好，可与经典的高效率转染载体聚乙烯亚胺(PEI)相媲美。
一种上述基于阳离子多肽类的细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料的制备方法，包括四步合成反应：(1)L-半胱氨酸与溴丙炔的亲核取代反应制备S-炔丙基-L-半胱胺酸；(2)制备S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基环内酸酐单体；(3)引发S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基环内酸酐单体开环聚合，得到聚(S-炔丙基-L-半胱胺酸)；(4)通过光化学点击技术将聚(S-炔丙基-L- 半胱胺酸)侧链改性，制备水溶性的阳离子多肽。
上述制备方法具体包括以下四个步骤：
(1)L-半胱氨酸与溴丙炔发生取代反应，生成侧链含有C≡C键的S-炔丙基-L-半胱氨酸；
(2)步骤(1)得到的S-炔丙基-L-半胱氨酸和三光气在乙酸乙酯中发生闭环反应，生成S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基环内酸酐；
(3)利用端基为伯氨基的引发剂引发步骤(2)的S-炔丙基-L-半胱氨酸 -N-羧基环内酸酐单体开环聚合，得到侧链含C≡C键的多肽聚(S-炔丙基-L- 半胱胺酸)；
(4)利用“巯基-炔”光化学点击技术，将半胱胺盐酸盐接枝到步骤(3) 的多肽聚(S-炔丙基-L-半胱胺酸)的侧链，得到阳离子多肽。
具体地，步骤(1)的过程和产物结构如下式(一)所示。
其中溴丙炔与L-半胱氨酸的摩尔比优选为1:1.1～1:2.0；反应时间优选为 2～3h。上述反应优选在冰浴条件下进行，具体为向溶有L-半胱氨酸的氨水溶液中滴加溴丙炔进行反应；氨水的浓度优选为3.0～4.0M；。产物用水和乙醇混合溶剂重结晶两次。
步骤(2)的过程和产物结构如下式(二)所示。
其中，S-炔丙基-L-半胱氨酸和三光气的反应摩尔比例为3:1；所述反应温度控制在80～90℃，优选为80～85℃；反应时间为3～6h，优选为4～6h。上述反应优选在回流状态下进行。反应后，将含有产物的乙酸乙酯溶液用冰冷的 0.5％碳酸氢钠水溶液萃取以除掉副产物HCl，无水硫酸钠吸干燥，过滤后旋蒸干有机溶液，得到白色的固体物S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基环内酸酐。
步骤(3)的过程和产物结构如下式(三)所示。
所选用的引发剂可以是苄胺、丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺、端基为伯氨基的聚乙二醇中的至少一种。所述聚合温度控制在0～25℃，优选为0～5℃；聚合时间优选为36～72h。所述聚合的反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，产物在乙醚或甲醇中沉淀，真空干燥得到浅红褐色产物聚(S-炔丙基-L-半胱胺酸)。
步骤(4)的过程和产物结构如下式(四)所示。
所述多肽侧链的炔基和半胱胺盐酸盐的巯基的摩尔比为1:2～1:4，优选为 1:2.5～1:3。具体为将步骤(3)中的多肽和半胱胺盐酸盐分别溶于二甲基亚砜 (DMSO)中，混合后加入光引发剂安息香双甲醚，在紫外光的照射下反应。紫外光的最大吸收波长为365nm，光强为4mW·cm-2，功率为4W，光照时间为10～30min。引发剂用量占所有反应物总质量的5％。
本发明的基于聚(L-半胱氨酸)主链的阳离子多肽，可以用做非病毒基因递送载体，能有效地和siRNA结合形成纳米复合物胶束，可向靶细胞中传递 siRNA，细胞毒性低，甚至无细胞毒性；转染效率好，可与经典的高效率转染载体聚乙烯亚胺(PEI)相媲美，特别适用于siRNA递送。
具体为：
(1)载体的细胞毒性检测(MTS法)：将HeLa细胞以每孔6000个的密度种于96孔板，培养24h后吸出培养基；将载体用DMEM培养液按照不同浓度梯度配成溶液，加入96孔板中；培养箱中培养24小时后，每孔加入20uL 的MTS，2h后，用酶标仪测量OD值。并将PEI(分子量为25000g/mol)作为阳性对照，结果显示其几乎没有细胞毒性，而PEI的细胞毒性非常大。
(2)载体与siRNA的缩合：首先制备琼脂糖凝胶。将2g琼脂糖溶于100mL 的TAE溶液，于微波炉中加热溶解并倒胶，冷却后取出，置于装有TAE缓冲液的电泳槽中。将载体水溶液和siRNA水溶液按照不同的质量比例混合以形成复合物溶液，漩涡振荡30s。每孔加入浓度为0.264μg/μL的siRNA水溶液 5μL，加入的载体与基因的质量比为0.5:1，1:1，2:1，4:1，6:1，8:1，12:1，24:1。静置孵育10min。将9个比例梯度按照顺序加入琼脂糖凝胶的每个孔中，在电压为100V的条件下电泳30min后取出。用凝胶成像仪观测基因条带的信号。用同样的方法制备复合物溶液，用动态光散射和Zeta电位联用仪分析其粒径大小和表面电荷。
(3)向HeLa细胞内递送siRNA：将HeLa细胞种于6孔板，24h后待汇合率约70％，把由羧基荧光素标记的siRNA(FAM-siRNA)(0.264μg/μL)和载体试剂的水溶液用DMEM培养液分别稀释。按照载体/基因的质量比为24:1 的比例，把siRNA溶液缓慢加入到上述含有载体的DMEM溶液中，siRNA的浓度A每孔固定为50nmol/L，培养液总体积为1mL；加完后，漩涡20s，静置30min孵育，待复合物的形成后加入完全培养基至1mL，漩涡20s。将复合物溶液加入到6孔板细胞中，避光培养4h后，将六孔板中的复合物溶液吸掉，并用PBS洗涤3次，每次2min。在共聚焦显微镜下观察发出绿色荧光的细胞在总细胞中所占的比例，同时以PEI为对照。
本发明的阳离子多肽，其侧链含伯胺阳离子，可用于基因转染，能有效地与siRNA形成聚电解质纳米复合胶束，可向肿瘤细胞内传递siRNA，转染效率非常好，可以和高效率载体PEI相媲美(见图5)，但细胞毒性比PEI低的多，甚至没有细胞毒性(见图4)。本发明制备方法结合了N-羧基环内酸酐开环聚合技术和点击化学技术，多肽的侧链接枝非常高效，侧链炔基的转化率接近100％。通过本发明方法，可以低成本、大批量地制备一类转染效率高、细胞毒性低的非病毒类基因载体，在肿瘤和多种免疫疾病的基因治疗方面有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例2中的聚(S-炔丙基-L-半胱氨酸)的1H NMR图。
图2为实施例3中的阳离子多肽的1H NMR图。
图3为实施例4中的纳米复合物的粒径和Zeta电位。
图4为实施例4中阳离子多肽/siRNA复合物的琼脂糖凝胶电泳照片。
图5为实施例5中阳离子多肽和PEI对HeLa细胞的细胞毒性评估。
图6为实施例6中的经FAM-siRNA转染4h后的HeLa细胞的共聚焦显微镜照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中使用的试剂均可从商业渠道获得。
实施例1：S-炔丙基-L-半胱氨酸及其环状单体的合成
将0.10mol的L-半胱氨酸置于圆底烧瓶中，加50mL、浓度为0.4M的氨水溶解，冰盐浴冷却至0℃。将0.30mol溴丙炔缓慢滴加到反应瓶中，2h后结束反应，将沉淀物过滤，用乙醇和水重结晶。产物为淡黄色晶体，产率为86％。
将0.15mol的S-炔丙基-L-半胱氨酸用干燥的乙酸乙酯悬浮，升温至80℃使，加入0.05mol的三光气，80℃回流反应5h。反应结束后将反应溶液冷却至室温，用冰水洗涤一次，再用0.5％的碳酸氢钠洗涤一次，再用冰水洗涤一次，直至pH接近中性。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后将乙酸乙酯旋蒸干。产物为白色絮状晶体，产率45％。
实施例2：聚(S-炔丙基-L-半胱氨酸)的合成
将实施例1中得到的N-羧基环内酸酐单体用DMF溶解，将单体和引发剂的摩尔比设置为10:1。待单体溶解后，用注射器注入苄胺引发单体聚合，室温反应72h，整个过程持续通氮气。反应结束后，将DMF溶液滴入乙醚中沉淀出聚合物，过滤后真空干燥，得到聚(S-炔丙基-L-半胱氨酸)的1H NMR图见图1。
实施例3：聚(S-炔丙基-L-半胱氨酸)的侧链接枝
取0.1g聚(S-炔丙基-L-半胱氨酸)溶于3mL的DMSO中，再按照炔基和半胱胺盐酸盐的摩尔比1:4，将半胱胺盐酸盐溶解在聚合物溶液中，然后加入0.2％的安息香双甲醚。待光引发剂溶解后，在紫外光下照射15min，紫外灯的最大吸收波长365nm。光照结束后，取出含有DMSO的产物溶液，用水透析二天，每个半天换一次水，冷冻干燥后得到黄色固体产物，产率为58％。得到的阳离子多肽的1H NMR图见图2。
实施例4：多肽/siRNA纳米复合物胶束的形成
首先分别将siRNA和阳离子多肽载体溶于去离子水。按照一定的质量比，将载体水溶液加入siRNA水溶液中，用漩涡振荡仪振荡20s，充分混匀后在室温条件下放置30min，两种物质依靠静电引力作用自动组装成纳米复合物胶束。每孔加入浓度为0.264μg/μL的siRNA水溶液体积为5μL。纳米复合物的粒径和Zeta电位见图3。琼脂糖凝胶电泳照片见图4。
实施例5：MTS法测定阳离子多肽和PEI的细胞毒性
将HeLa细胞以每孔6000个的密度种于96孔板，培养24h后吸出培养基；将载体用DMEM培养液按照不同浓度梯度配成溶液，然后加入96孔板中；在培养箱中培养24小时后，每孔加入20μL的MTS，2h后用酶标仪测量OD 值。将PEI(分子量为25000g/mol)作为阳性对照，细胞毒性评估见图5。
实施例6：用阳离子多肽向HeLa细胞内递送siRNA
将HeLa细胞种于6孔板中，待汇合率约为70％～80％时，取浓度为0.264 μg/μL的FAM-siRNA水溶液2.5μL溶于1mL的DMEM培养基中。然后按照载体/基因24:1的质量比，将载体水溶液也溶于1mL的DMEM培养基中，把siRNA溶液缓慢加入到含有载体的DMEM溶液中，边加边吹打，漩涡20s，静置孵育30min。每孔固定siRNA的浓度为50nmol/L，终体积为1mL。避光培养4h后，将六孔板中的复合物溶液吸掉，用PBS洗涤3次，每次2min。在共聚焦显微镜下观察发出细胞个数占所有细胞数目的百分比，同时以PEI载体为对照组，共聚焦显微镜照片见图6。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料，其特征在于其结构如通式(1)所示：
其中，R1为苄基、烷基或聚乙二醇，n为聚合度，x为侧链不含双键的重复单元的聚合度，且x<n。
2.一种权利要求1所述的细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料的制备方法，其特征在于包括四步合成反应：(1)L-半胱氨酸与溴丙炔的亲核取代反应制备S-炔丙基-L-半胱氨酸；(2)制备S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基环内酸酐单体；(3)引发S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基环内酸酐单体开环聚合，得到聚(S-炔丙基-L-半胱氨酸)；(4)通过光化学点击技术将聚(S-炔丙基-L-半胱氨酸)侧链改性，制备水溶性的阳离子多肽。
3.根据权利要求2所述的细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料的制备方法，其特征在于具体包括以下四个步骤：
(1)L-半胱氨酸与溴丙炔发生取代反应，生成侧链含有C≡C键的S-炔丙基-L-半胱氨酸；
(2)步骤(1)得到的S-炔丙基-L-半胱氨酸和三光气在乙酸乙酯中发生闭环反应，生成S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基环内酸酐；
(3)利用端基为伯氨基的引发剂引发步骤(2)的S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基环内酸酐单体开环聚合，得到侧链含C≡C键的多肽聚(S-炔丙基-L-半胱氨酸)；
(4)利用“巯基-炔”光化学点击技术，将半胱胺盐酸盐接枝到步骤(3)的多肽聚(S-炔丙基-L-半胱氨酸)的侧链，得到阳离子多肽。
4.根据权利要求3所述的细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料的制备方法，其特征在于：步骤(1)中溴丙炔与L-半胱氨酸的摩尔比为1:1.1～1:2.0；所述反应时间为2～3h。
5.根据权利要求3所述的细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料的制备方法，其特征在于：步骤(1)具体为向溶有L-半胱氨酸的氨水溶液中滴加溴丙炔进行反应；氨水的浓度为3.0～4.0M。
6.根据权利要求3所述的细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述S-炔丙基-L-半胱氨酸和三光气的反应摩尔比例为3:1；所述反应温度控制在80～90℃；反应时间为3～6h。
7.根据权利要求3所述的细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的引发剂为苄胺、丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺和端基为伯氨基的聚乙二醇中的至少一种；所述聚合温度控制在0～25℃，聚合时间为36～72h。
8.根据权利要求3所述的细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述多肽侧链的炔基和半胱胺盐酸盐的巯基的摩尔比为1:2～1:4。
9.根据权利要求3所述的细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料的制备方法，其特征在于：步骤(4)具体为将步骤(3)中的多肽和半胱胺盐酸盐分别溶于二甲基亚砜中，混合后加入光引发剂安息香双甲醚，在紫外光的照射下反应；紫外光的最大吸收波长为365nm，光强为4mW·cm-2，功率为4W，光照时间为10～30min。
10.权利要求1所述的细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料在siRNA递送中的应用。
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