CN102936337A - 聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物、功能化嵌段共聚物及制备方法 - Google Patents
聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物、功能化嵌段共聚物及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种具有聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物，具有式（I）所示结构。本发明以含伯氨基的小分子为引发剂，通过γ-炔丙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐和氨基酸-N-内羧酸酐的逐步开环反应得到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物。所得的嵌段共聚物侧链为易修饰的炔丙基，具有较高的反应活性，有利于其键合叠氮化的具有生物活性或环境响应性的功能化小分子，而且键合过程不会引起聚氨基酸主链的断裂，也不受功能化小分子分子量和空间位阻的影响。本发明得到的嵌段共聚物经功能化后生物相容性好，利于其在靶向药物传输、组织工程和蛋白分离与检测等领域的应用。
Description
技术领域
本发明涉及聚合物的技术领域，尤其涉及一种聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物、功能化嵌段共聚物及制备方法。
背景技术
聚氨基酸拥有和天然蛋白质和多肽类似的稳定结构，以及优良的降解性能和生物相容性，使其在生物医学领域具有广泛的应用前景。特别地，上世纪90年代以来，NCA可控聚合的发现，以及各类高效“点击”反应的相继发现，使获得可控结构以及功能化的聚氨基酸成为研究的热点，这也进一步推动了聚氨基酸材料的实际应用研究。
除材料本身的结构性能，侧链结构是聚氨基酸性能的重要影响因素。侧基因其沿着聚合物主链密集分布，可将自身的性能直接“映射”成材料的结构性能，如亲疏水性，电荷密度，极性以及生物活性等。因此制备侧基功能化的聚氨基酸是该类材料获得广泛应用，特别是生物医学应用的基础。
目前，聚氨基酸的功能化修饰主要通过缩合反应和侧基交换反应进行的。例如Chao Deng等（Chao Deng,Huayu Tian,Peibiao Zhang,et al..Synthesis andCharacterization of RGD Peptide Grafted Poly(ethyleneglycol)-b-Poly(L-lactide)-b-Poly(L-glutamic acid)Triblock Copolymer,Biomacromolecules,2006,7(2):590~596.）报道了一种把精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸短肽(RGD短肽)通过缩合反应接枝到聚二乙二醇单甲醚-b-聚(L-甲基丙酸酯)-b-聚(L-谷氨酸)L-谷氨酸结构单元上；Chaoliang He等（Chaoliang He,Changwen Zhao,Xinhua Guo,et al..Novel temperature-and pH-responsive graftcopolymers composed of poly(L-glutamic acid)and poly(N-isopropylacrylamide),Journal of Polymer Science PartA-Polymer Chemistry,2008,46(12):4140~4150.）报道了一种把氨基化的聚(N-异丙基丙烯酰胺)通过缩合反应接枝到聚(L-谷氨酸)上，得到具有温度和pH响应性的聚(L-谷氨酸)-g-聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚氨基酸体系；Jinshan Guo等（Jinshan Guo,Yubin Huang,Xiabin Jing,Xuesi Chen.Synthesis and characterization of functional poly(gamma-benzyl-L-glutamate) (PBLG)as a hydrophobic precursor.Polymer.2009,50(13):2847~2855.）报道了一种把多种可反应基团（氯基，叠氮基，炔基和烯烃），通过“酯交换”法接枝到聚(L-谷氨酸)上，得到多功能化的聚(L-谷氨酸)，而且酯交换后的可反应基团可通过如Cu(I)催化的“点击”化学反应制备更多功能化的聚(L-谷氨酸)材料。
上述通过缩合反应和酯交换反应两种途径制备侧基功能化的聚氨基酸，所采用的方法反应活性低，且对其侧基进行功能化时容易引起聚氨基酸主链断裂，容易受到功能化单体的分子量和空间位阻的影响，在生物医用领域应用中受到限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种一种聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物、功能化嵌段共聚物及制备方法，本发明提供的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物具有较高的反应活性，容易被具有生物活性或环境响应性的功能小分子修饰，得到的功能化聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物具有良好的生物医学的应用价值。
本发明提供了一种聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物，具有式（I）所示结构：
其中，-R1为伯胺数为1~2的伯胺基，R1的分子量为50~1000；
-R2为-H、-CH3、
H3C-CH2CH2-、
HO-CH2-、 
H3C-S-CH2CH2-、
5≤m≤250；
5≤n≤250。
优选的，所述-R1为
优选的，所述-R2为
优选的，所述聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)嵌段的数均分子量为1000~30000；
所述聚氨基酸嵌段的数均分子量为1000~30000。
本发明提供了一种聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物的制备方法，包括以下步骤：
将γ-炔丙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、氨基酸-N-内羧酸酐和伯胺引发剂在无水溶剂中进行聚合反应，得到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物；
所述伯胺引发剂的伯胺数为1~2，所述伯胺引发剂的分子量为50~1000；
所述氨基酸-N-内羧酸酐为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-2-氯乙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、甘氨酸-N-内羧酸酐、L-丙氨酸-N-内羧酸酐、L-缬氨酸-N-内羧酸酐、L-亮氨酸-N-内羧酸酐、L-异亮氨酸-N-内羧酸酐、L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐、L-脯氨酸-N-内羧酸酐、L-色氨酸-N-内羧酸酐、L-丝氨酸-N-内羧酸酐、L-酪氨酸-N-内羧酸酐、β-苄氧羰基-L-半胱氨酸-N-内羧酸酐、L-蛋氨酸-N-内羧酸酐、L-天冬酰胺-N-内羧酸酐、L-谷氨酰胺-N-内羧酸酐、L-苏氨酸-N-内羧酸酐、γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐、ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐、L-谷氨酸-5-苄酯-N-内羧酸酐、精氨酸-N-内羧酸酐、L-赖氨酸-N-内羧酸酐或组氨酸-N-内羧酸酐。
优选的，所述伯胺引发剂为正己胺、烯丙胺或炔丙胺。
优选的，所述氨基酸-N-内羧酸酐为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐和ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐、L-赖氨酸-N-内羧酸酐或L-谷氨酸-5-苄酯-N-内羧酸酐。
优选的，所述γ-炔丙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、氨基酸-N-内羧酸酐与伯胺引发剂的质量比为（5~250）:（5~250）:1。
优选的，所述将γ-炔丙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、氨基酸-N-内羧酸酐和伯胺引发剂在无水溶剂中进行聚合反应具体为：
将γ-炔丙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐和伯胺引发剂在无水溶剂中混合，进行第一反应后向其中加入氨基酸-N-内羧酸酐，进行聚合反应后得到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物。
优选的，所述第一反应的温度为20℃~40℃；
所述第一反应的时间为60小时~84小时；
所述聚合反应的温度为20℃~40℃；
所述聚合反应的时间为60小时~84小时。
本发明提供了一种功能化嵌段共聚物的制备方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物或上述技术方案所述的制备方法制备的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物溶于有机溶剂中，得到嵌段共聚物的溶液；
将所述嵌段共聚物的溶液与具有生物活性或环境响应性的功能化小分子和N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺混合，得到的混合溶液，所述功能化小分子为叠氮基团修饰的乙二醇单甲醚、二乙二醇单甲醚、三乙二醇单甲醚、单糖、多糖、抗原、抗体、生物素、抗生物、短肽或药物；
将所述混合溶液除氧后与溴化亚铜反应，得到反应液；
将所述反应液用阳离子交换树脂进行吸附后进行透析，得到功能化聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物。
优选的，所述聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物中的炔基与N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺和功能化小分子的摩尔比为1:（0.5~5）:（0.8~8）；
所述溴化亚铜与N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺等当量。
优选的，所述功能化小分子为叠氮化的三乙二醇单甲醚和半乳糖。
优选的，所述混合溶液与溴化亚铜反应的温度为30℃~50℃；
所述混合溶液与溴化亚铜反应的时间优选为18小时~30小时。
优选的，所述透析的时间为2天~5天。
本发明提供了一种功能化嵌段共聚物，由上述技术方案所述的制备方法制得的功能化聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物。
本发明提供了一种具有聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物，具有式（I）所示结构。本发明以含伯氨基的小分子为引发剂，通过γ-炔丙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐和氨基酸-N-内羧酸酐的逐步开环反应得到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物。所得的嵌段共聚物可以通过Cu(I)催化的“点击化学”反应键合叠氮化的具有生物活性或环境响应性的功能化小分子，得到具有生物活性或环境响应性的聚氨基酸嵌段共聚物。本发明提供的嵌段共聚物侧链为易修饰的炔丙基，在与功能化小分子进行反应时具有较高的反应活性；而且对本发明提供的嵌段共聚物侧链的修饰不会引起聚氨基酸主链的断裂，对其侧链的修饰不会受功能化小分子分子量和空间位阻的影响，能够制备出高接枝密度的功能化聚氨基酸，本发明提供的嵌段共聚物经功能化后生物相容性好，利于其在靶向药物传输、组织工程和蛋白分离与检测等生物医用材料领域的应用。实验结果表明，本发明提供的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物经半乳糖或三乙二醇单醚功能化后得到的功能化嵌段共聚物能够作为药物载体，实现抗肿瘤药物阿霉素的缓慢释放，具有较好的pH值响应性控制释放行为，能够有效地抑制HepG2细胞的生长。
附图说明
图1为本发明实施例2得到的嵌段共聚物的核磁共振氢谱图；
图2为本发明实施例7得到的嵌段共聚物的核磁共振氢谱图；
图3为本发明实施例31得到的三乙二醇单甲醚功能化的嵌段共聚的核磁共振氢谱图；
图4为本发明实施例36得到的半乳糖功能化的嵌段共聚物的核磁共振氢谱图；
图5为本发明实施例89~90得到的载药纳米粒子的体外释放行为；
图6为本发明实施例91~94得到的载药纳米粒子的体外释放行为；
图7为本发明实施例95~98得到的载药纳米粒子的体外释放行为；
图8为本发明实施例99~102得到的载药纳米粒子的体外释放行为；
图9为本发明实施例99~100得到的载药纳米粒子对HepG2细胞的生长抑制行为；
图10本发明实施例99~100得到的载药纳米粒子对半乳糖处理过的HepG2细胞的生长抑制行为；
图11本发明实施例99~100得到的载药纳米粒子在HepG2细胞内的荧光强度与细胞数的关系曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物，具有式（I）所示结构：
其中，-R1为伯胺数为1~2的伯胺基，R1的分子量为50~1000，优选为
-R2为-H、-CH3、
H3C-CH2CH2-、
HO-CH2-、 H3C-S-CH2CH2-、
优选为
5≤m≤250，优选的25≤m≤200，更优选的50≤m≤180；
5≤n≤250，优选的25≤m≤200，更优选的50≤m≤180；
嵌段共聚物的分散度优选为1.1~1.5。
在本发明中，所述所述聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)嵌段的数均分子量优选为1000~30000，更优选为10000~25000，最优选为15000~20000；所述聚氨基酸嵌段的数均分子量优选为1000~30000，更优选为10000~25000，最优选为15000~20000。
本发明提供的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物具有良好的生物相容性和降解性，对人体物毒副作用；而且其能够键合具有生物活性或环境响应性的功能小分子，从而得到具有生物活性或环境响应性的嵌段共聚物，而且在于功能型小分子键合的过程中不易引起聚氨基酸主链的断裂，能够制备高接枝密度的功能化聚氨基酸，而且不会受到功能化小分子的分子量或空间位阻的影响，得得到的功能化嵌段共聚物在生物医学领域中具有较好的应用。如得到的功能化嵌段共聚物可以作为药物载体，实现靶向给药，通过调节pH值或其他环境因素来控制药物的释放，而且能够提高药物的利用效率，更有效的实现细胞内的释放，从而能够更好的抑制癌细胞的生长。
本发明提供了一种聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物的制备方法，包括以下步骤：
将γ-炔丙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、氨基酸-N-内羧酸酐和伯胺引发剂在无水溶剂中进行聚合反应，得到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物；
所述伯胺引发剂的伯胺数为1~2，所述伯胺引发剂的分子量为50~1000；
所述氨基酸-N-内羧酸酐为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-2-氯乙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、甘氨酸-N-内羧酸酐、L-丙氨酸-N-内羧酸酐、L-缬氨酸-N-内羧酸酐、L-亮氨酸-N-内羧酸酐、L-异亮氨酸-N-内羧酸酐、L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐、L-脯氨酸-N-内羧酸酐、L-色氨酸-N-内羧酸酐、L-丝氨酸-N-内羧酸酐、L-酪氨酸-N-内羧酸酐、β-苄氧羰基-L-半胱氨酸-N-内羧酸酐、L-蛋氨酸-N-内羧酸酐、L-天冬酰胺-N-内羧酸酐、L-谷氨酰胺-N-内羧酸酐、L-苏氨酸-N-内羧酸酐、γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐、ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐、L-谷氨酸-5-苄酯-N-内 羧酸酐、精氨酸-N-内羧酸酐、L-赖氨酸-N-内羧酸酐或组氨酸-N-内羧酸酐。
本发明优选在无水的条件下制备聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物，为了使聚合反应能够更顺利的进行，本发明优选在无水的条件下，先将γ-炔丙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐和伯胺引发剂在无水溶剂溶解，进行第一反应，然后再向其中加入氨基酸-N-内羧酸酐，进行聚合反应后得到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物。
本发明优选在污水条件下，首先将γ-炔丙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐用无水溶剂溶解，并在搅拌的条件下向其中加入伯胺引发剂，进行第一反应。本发明对所述搅拌的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的搅拌的技术方案即可，可以采用人工搅拌或机械搅拌的方式。在本发明中，所述无水溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺、二氧六环、三氯甲烷，其中一种或多种，更优选为N,N-二甲基甲酰胺；所述伯胺引发剂的伯胺数为1~2，所述伯胺引发剂的分子量为50~1000，所述伯胺引发剂优选为正己胺、烯丙胺和炔丙胺；
在本发明中，所述γ-炔丙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐与伯胺引发剂的质量比优选为（5~250）:1，更优选为（25~200）:1，最优选为（50~180）:1；本发明对所述无水溶剂的量没有特殊的限制，能够将γ-炔丙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐溶解即可；本发明优选在搅拌的条件下进行第一反应，所述第一反应的温度优选为20℃~40℃，更优选为25℃~30℃；所述第一反应的时间优选为60小时~84小时，更优选为65小时~80小时，更优选为70小时~75小时。
完成第一反应后，本发明优选向得到的反应液中加入氨基酸-N-内羧酸酐，进行聚合反应后，得到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物。在本发明中，所述氨基酸-N-内羧酸酐为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-2-氯乙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、甘氨酸-N-内羧酸酐、L-丙氨酸-N-内羧酸酐、L-缬氨酸-N-内羧酸酐、L-亮氨酸-N-内羧酸酐、L-异亮氨酸-N-内羧酸酐、L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐、L-脯氨酸-N-内羧酸酐、L-色氨酸-N-内羧酸酐、L-丝氨酸-N-内羧酸酐、L-酪氨酸-N-内羧酸酐、β-苄氧羰基-L-半胱氨酸-N-内羧酸酐、L-蛋氨酸-N-内羧酸酐、L-天冬酰胺-N-内羧酸酐、L-谷氨酰胺-N-内羧酸酐、L-苏氨酸-N-内羧酸酐、γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐、ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐、L-谷氨酸-5-苄酯-N-内羧酸酐、精氨酸-N-内羧酸酐、L-赖氨酸-N-内羧酸酐或组氨酸-N-内羧酸酐， 优选为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐和ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐、L-赖氨酸-N-内羧酸酐或L-谷氨酸-5-苄酯-N-内羧酸酐；所述氨基酸-N-内羧酸酐与伯胺引发剂的质量比优选为（5~250）:1，更优选为（25~200）:1，最优选为（50~180）:1；本发明优选在搅拌的条件下进行聚合反应，所述聚合反应的温度优选为20℃~40℃，更优选为25℃~30℃；所述聚合反应的时间优选为60小时~84小时，更优选为65小时~80小时，更优选为70小时~75小时。
完成上述聚合反应后，本发明优选将得到的反应液进行后处理，优选将所述反应液倒入无水溶剂5~15倍量的乙醚中进行沉降，更优选为8~12倍量的乙醚，将得到的沉降产物进行过滤和洗涤，然后将得到的固体进行干燥，得到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物。本发明对所述过滤、洗涤、干燥的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的过滤、洗涤和干燥的技术方案即可。在本发明中，所述干燥优选为真空干燥，所述干燥的温度优选为20℃~40℃，更优选为25℃~30℃；所述干燥的时间优选为18小时~30小时，更优选为21小时~27小时。
在本发明中，若得到的嵌段共聚物的聚氨基酸嵌段中含有取代基，优选将得到的嵌段共聚物进行脱保护处理，具体过程如下：
将得到的嵌段共聚物溶于有机溶剂中，得到嵌段共聚物的溶液；
向所述嵌段共聚物的溶液中加入溴化氢和冰醋酸的混合溶液，脱保护反应后，脱除了聚氨基酸嵌段中的取代基，得到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物。
本发明优选在20℃~40℃下将得到的带有保护基团的嵌段共聚物溶于有机溶剂中，更优选为25℃~30℃；然后在搅拌条件下向其中加入溴化氢和冰醋酸的混合溶液进行反应，除去保护基团，如保护基团为苄氧羰基或苯甲基。本发明对所述搅拌的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的搅拌的技术方案即可，本发明优选为搅拌子搅拌。在发明中，所述有机溶剂优选为二氯乙酸或三氯乙酸，所述溴化氢和冰醋酸的混合溶液中溴化氢的质量分数优选为25%~50%，更优选为30%~40%；所述溴化氢与嵌段共聚物中的保护基团的摩尔比优选为1:（2~10），更优选为1:（3~8）；所述反应的温度优选为20℃~40℃，更优选为25℃~30℃；所述反应的时间优选为30min~3h，更 优选为1h~2h；
完成上述反应后，本发明优选将得到的反应液用乙醚进行沉降，将得到的沉降产物进行过滤、洗涤和干燥，得到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物。本发明对所述沉降、过滤、洗涤和干燥的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的沉降、过滤、洗涤和干燥的技术方案即可，在本发明中，所述干燥优选为真空干燥，所述干燥的温度优选为20℃~40℃，更优选为25℃~30℃；所述干燥的时间优选为18小时~30小时，更优选为21小时~27小时。
得到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物后，本发明将其与具有生物活性或环境响应性的功能化小分子进行点击化学反应，得到的功能化嵌段共聚物在生物医学领域具有较高的应用价值。本发明提供一种功能化嵌段共聚物的制备方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物或上述技术方案所述的制备方法制备的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物溶于有机溶剂中，得到嵌段共聚物的溶液；
将所述嵌段共聚物的溶液与具有生物活性或环境响应性的功能化小分子和N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺混合，得到的混合溶液，所述功能化小分子为叠氮基团修饰的乙二醇单甲醚、二乙二醇单甲醚、三乙二醇单甲醚、单糖、多糖、抗原、抗体、生物素、抗生物、短肽或药物；
将所述混合溶液除氧后与溴化亚铜反应，得到反应液；
将所述反应液用阳离子交换树脂进行吸附后进行透析，得到功能化嵌段共聚物。
得到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物后，本发明将所述聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物溶于有机溶剂中，得到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物嵌段共聚物的溶液。在本发明中，所述有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺、二氧六环、三氯甲烷，其中一种或多种，更优选为N,N-二甲基甲酰胺；本发明对所述有机溶剂的量没有特殊的限制，能够将聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物充分溶解即可；
得到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物的溶液后，本发明将所述聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物溶液与具有生物活性或环 境响应性的功能化小分子和N,N,N',N',N″-五甲基二亚乙基三胺混合，得到混合溶液，所述功能化小分子为叠氮基团修饰的乙二醇单甲醚、二乙二醇单甲醚、三乙二醇单甲醚、单糖、多糖、抗原、抗体、生物素、抗生物、短肽或药物。在本发明中，所述聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物中的炔基与N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺和功能化小分子的摩尔比为1:（0.5~5）:（0.8~8），更优选为1:（1~3）:（1.05~5）；所述功能性小分子优选为叠氮化的三乙二醇单甲醚和半乳糖；
得到混合溶液后，本发明将所述混合溶液进行除氧，然后将除氧后的混合溶液与溴化亚铜反应，得到反应液。本发明对所述除氧的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的除氧的技术方案即可，如可向混合溶液中通入氮气；在本发明中，所述溴化亚铜优选与N,N,N',N',N″-五甲基二亚乙基三胺等当量；本发明优选在搅拌的条件下将所述混合溶液与溴化亚铜进行反应，所述搅拌优选为搅拌子搅拌；所述反应的温度优选为30℃~50℃，更优选为35℃~45℃；所述反应的时间优选为18小时~30小时，更优选为21小时~27小时；
所述混合溶液与溴化亚铜完成反应后，本发明将得到的反应液进行阳离子交换树脂进行吸附，除去其中的二价铜离子，然后将得到的溶液进行透析，得到功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物。本发明对所述阳离子交换树脂吸附的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的阳离子交换树脂吸附的技术方案即可；本发明对所述透析的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的透析的技术方案即可，在本发明中，优选采用透析袋对得到的溶液进行透析，所述透析袋优选为3000Da~4000Da，更优选为3200Da~3800Da；所述透析的时间优选为2天~5天，更优选为3天~4天。
完成透析后，本发明优选将得到的透析产物进行干燥，得到功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物。在本发明中，所述干燥优选为冷冻干燥。
本发明提供一种功能化嵌段共聚物，为上述技术方案所述方法制备得到的功能化聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物嵌段共聚物。
本发明得到的功能化聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物具有 较高的生物医学应用价值，在靶向药物传输、组织工程和蛋白分离与检测等生物医用材料领域具有广泛的应用前景。本发明以抗肿瘤药物，如阿霉素作为模型抗肿瘤药物，考察了得到的功能化聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物作为药物载体的性质，具体过程如下：
将上述技术方案得到的功能化聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物与抗肿瘤药物在N,N-二甲基甲酰胺中溶解，优选在室温下进行溶解，然后向得到的混合溶液中滴加超纯水，然后再用超纯水进行透析，得到载药纳米粒子；检测得到的载药纳米粒子在体外的释放行为和对HepG2细胞生长的抑制效果；
在本发明中，所述功能化聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物与抗肿瘤药物的质量比优选为（5~15）:1，更优选为（8~12）:1；本发明对所述N,N-二甲基甲酰胺的用量没有特殊的限制，能够将功能化聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物与抗肿瘤药物溶解即可；所述功能化聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物与超纯水的质量比优选为25mg:（0.5~5）g，更优选为25mg:（1~3）g；本发明对所述超纯水的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的超纯水即可，如MilliQ厂家生产的净水设备得到的超纯水；所述透析的时间优选为18小时~30小时，更优选为21小时~27小时；
完成透析后，本发明优选将得到的产物进行干燥，得到载药纳米粒子。本发明对所述干燥的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的干燥的技术方案即可，在本发明中，所述干燥优选为冷冻干燥。
得到载药纳米粒子后，本发明研究了所述载药纳米粒子的体外释放行为和对HepG2细胞生长的抑制效果，具体过程为：
本发明将得到的载药纳米粒子置于缓冲溶液中，检测随着时间变化或释放环境pH值的变化药物释放的浓度，在本发明中，所述缓冲溶液优选为磷酸盐缓冲溶液，所述缓冲溶液的pH值优选为4~8，更优选为5~7.5；所述缓冲溶液的摩尔浓度优选为0.005mol/L~0.08mol/L，更优选为0.008mol/L~0.003mol/L。结果表明，本发明提供的功能化聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物得到的载药纳米粒子能够实现药物的缓慢释放，并且具有良好的pH值响应性，具有较好的肝靶向；
本发明以HepG2细胞为模型，采用噻唑蓝法评价了得到的载药纳米粒子对细胞的生长抑制效果，具体过程如下：
本发明将HepG2细胞按照约1.0×104个细胞/孔的细胞密度接种于96孔板，向每孔中加入100μL含有质量分数为10%的胎牛血清、50IU mL-1的青霉素和50IU mL-1的链霉素的DMEM细胞培养基，在37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24h。去除培养基，接着加入系列质量浓度的载药纳米粒子，所述载药纳米粒子的质量浓度优选为0~10mg L-1DOX，同样条件下，在细胞培养箱中培养24h后进行噻唑蓝测试。本发明以未经药物处理的HepG2细胞作为对照。用酶标仪（Bio-Rad 680）测定溶液在490nm处的吸收值。根据吸收值计算经过载药纳米粒子处理后的细胞相对存活率。计算公式：细胞存活率（%）=（样品组吸收值/对照组吸收值）×100%。实验平行测试3次，数据结果取其平均值。实验结果表明，本发明提供的嵌段共聚物得到的载药纳米粒子具有更加理想的对HepG2细胞生长抑制效果和更有效的细胞内释放。
本发明提供了一种具有聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物，具有式（I）所示结构。本发明以含伯氨基的小分子为引发剂，通过γ-炔丙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐和氨基酸-N-内羧酸酐的逐步开环反应得到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物。所得的嵌段共聚物可以通过Cu(I)催化的“点击化学”反应键合叠氮化的具有生物活性或环境响应性的功能化小分子，得到具有生物活性或环境响应性的聚氨基酸嵌段共聚物。本发明提供的嵌段共聚物侧链为易修饰的炔丙基，在与功能化小分子进行反应时具有较高的反应活性；而且对本发明提供的嵌段共聚物侧链的修饰不会引起聚氨基酸主链的断裂，对其侧链的修饰不会受功能化小分子分子量和空间位阻的影响，能够制备出高接枝密度的功能化聚氨基酸，本发明提供的嵌段共聚物经功能化后具有良好的生物相容性和降解性，对人体物毒害副作用，利于其在靶向药物传输、组织工程和蛋白分离与检测等生物医用材料领域的应用。实验结果表明，本发明提供的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物经半乳糖或三乙二醇单醚功能化后得到的功能化嵌段共聚物能够作为药物载体，实现抗肿瘤药物阿霉素的缓慢释放，具有较好的pH值响应性控制释放行为，能够有效地抑制HepG2细胞的生长。
而且，本发明提供的制备聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物 的方法过程简单，利于控制，有利于其应用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物及其制备方法进行详细地说明，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中超纯水由MilliQ公司生产的水净化装置制备得到，所用到的HepG2细胞，来源于中国科学院上海细胞生物学研究所。
实施例1~5
分别称取0.1056g（0.0005mol），0.1056g（0.0005mol），0.1056g（0.0005mol），2.1117g（0.01mol），4.2234g（0.02mol）的γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐放入5个无水的反应瓶中，分别向其中加入5mL无水N,N-二甲基甲酰胺将单体溶解。然后在搅拌下分别向其中加入10.119mg（0.0001mol）正己胺，将得到的混合溶液在25℃下搅拌反应72h，然后向每个反应瓶中分别加入0.1316g(0.0005mol)，2.6325g(0.01mol)，5.265g(0.02mol)，2.6325g(0.01mol)，2.6325g(0.01mol)的γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐，继续反应72h，反应结束后，反应体系用50mL乙醚沉降，过滤，用乙醚洗涤三次后，25℃下真空干燥24h，得到反应产物。
本发明对得到的产物进行结构鉴定，结果如图1所示，图1为本发明实施例2得到的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的核磁共振氢谱图，由图1可以看出，5.17ppm~5.07ppm为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯结构单元中与苯环相连的亚甲基的信号峰（C6H5CH2-），4.75ppm~4.64ppm为聚（L-谷氨酸）的主链上次甲基（-C(O)CH(CH2-)NH-）和聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)结构单元中与炔基项链的亚甲基（CH≡CCH2-）的信号峰，2.63ppm~2.49ppm为聚（L-谷氨酸）的侧链上亚甲基（-CH2CH2C(O)-）的信号峰，2.14ppm~2.97ppm为聚（L-谷氨酸）的侧链上亚甲基（-CH2CH2C(O)-）的信号峰，1.32ppm~0.90ppm为引发剂正己胺上的信号峰，由以上分析结果可以看出，本实施例得到的反应产物为聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
本发明也将实施例1、3~5得到的反应产物进行核磁共振氢谱的检测，结果表明，实施例1、3~5得到的反应产物为聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
本发明检测了得到的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯) 嵌段共聚物的数均分子量，结果如表1所示，表1为本发明实施例1~5得到的产物的测试结果。
表1本发明实施例1~5得到的产物的测试结果
表1中，A1/I为γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐与正己胺的投料摩尔比；A2/I为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐与正己胺的投料摩尔比；DP1为聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物中γ-丙炔基-L-谷氨酸酯结构单元的平均聚合度，由核磁共振氢谱（1H NMR）测得；DP2为聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物中γ-苯甲基-L-谷氨酸酯结构单元的平均聚合度，由1H NMR测得；反应产率为实际得到的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的质量与理论得到的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的质量的比值。
由表1可以看出，本发明提供的方法制得的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物具有较高的产率。
实施例6~10
分别称取实施例1~5得到的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物0.1g，将其在25℃下分别用1mL二氯乙酸溶解，然后在搅拌下向其中加入0.3mL溴化氢质量百分数为33%的溴化氢和冰醋酸的混合溶液，得到反应混合液，将得到的反应混合液在25℃下搅拌1h，得到反应液。将得到的反应液用15mL乙醚沉降，过滤，用乙醚洗涤三次，25℃下真空干燥24h，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果如图2所示，图2为本发明实施例7得到的嵌段共聚物的核磁共振氢谱图。由图2可以看出，5.17ppm~5.07ppm为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯结构单元中与苯环相连的亚甲基的信号峰（C6H5CH2-）消失，证明了聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段 共聚物的成功合成；4.78ppm~4.72ppm为聚（L-谷氨酸）的主链上次甲基（-C(O)CH(CH2-)NH-）和聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)结构单元中与炔基项链的亚甲基（CH≡CCH2-）的信号峰，2.59ppm~2.49ppm为聚（L-谷氨酸）的侧链上亚甲基（-CH2CH2C(O)-）的信号峰，2.23ppm~2.06ppm为聚（L-谷氨酸）的侧链上亚甲基（-CH2CH2C(O)-）的信号峰，1.30ppm~0.89ppm为引发剂正己胺上的信号峰。
本发明也将实施例6、8~10得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，实施例6、8~10得到的反应产物均为聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物。
本发明测试得到实施例6~10中的脱保护反应产率为86.4~90.5%。
实施例11
称取2.1117g(0.01mol)γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐放入无水的反应瓶中，向其中加入5mL无水N,N-二甲基甲酰胺将单体溶解。在搅拌下加入5.709mg(0.0001mol)烯丙胺，将溶液在25℃搅拌下反应72h，然后向反应瓶中加入2.6325g(0.01mol)γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐，继续反应72h，反应结束后，反应体系用50mL乙醚沉降，过滤，用乙醚洗涤三次后，25℃下真空干燥24h，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本实施例制备的反应产物为聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，其中γ-丙炔基-L-谷氨酸酯结构单元的平均聚合度为98，γ-苯甲基-L-谷氨酸酯结构单元的平均聚合度为102，本实施例得到的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的数均分子量为38800g mol-1。
本发明计算得到制备聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的反应产率为92.3％。
实施例12
称取实施例11得到的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物0.1g，在25℃下用1mL二氯乙酸溶解，然后在搅拌下向其中加入0.3mL溴化氢质量百分数为33%的溴化氢和冰醋酸的混合溶液，得到反应混合液，将得到的反应混合液在25℃下搅拌1h。将得到的反应体系用15mL乙醚沉降，过滤，用乙醚洗涤三次，25℃下真空干燥24h，得到反应产物。
本发明对得到的反应产物进行核磁共振氢谱的检测，结果表明，本实施 例制得的反应产物为聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物。
本发明计算得到，本实施例中的脱保护反应产率为87.6%。
实施例13
称取2.1117g(0.01mol)γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐放入无水的反应瓶中，向其中加入5mL无水N,N-二甲基甲酰胺将单体溶解。在搅拌下向其中加入5.508mg(0.0001mol)炔丙胺，将得到的溶液在25℃搅拌下反应72h，然后向反应瓶中加入2.6325g(0.01mol)γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐，继续反应72h，反应结束后，反应体系用50mL乙醚沉降，过滤，用乙醚洗涤三次后，25℃下真空干燥24h，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本实施得到的反应产物为聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，其中，γ-丙炔基-L-谷氨酸酯结构单元的平均聚合度为103，γ-苯甲基-L-谷氨酸酯结构单元的平均聚合度为105，本发明得到的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的数均分子量为40300g mol-1。
本发明计算得到本实施例制备聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的反应产率为91.7％。
实施例14
称取实施例13中所得的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物0.1g，将其在25℃下用1mL二氯乙酸溶解，然后在搅拌下向其中加入0.3mL溴化氢质量百分数为33%的溴化氢和冰醋酸的混合溶液，得到反应混合液，将得到的反应混合液在25℃下搅拌1h，结束反应。将反应体系用15mL乙醚沉降，过滤，用乙醚洗涤三次，25℃下真空干燥24h，得到反应产物。
本发明对得到的反应产物进行核磁共振氢谱的检测，结果表明，本实施例制得的反应产物为聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物。
本发明计算得到，本实施例中的脱保护反应产率为88.8%。
实施例15~19
分别称取0.1056g(0.0005mol)，0.1056g(0.0005mol)，0.1056g(0.0005mol)，2.1117g(0.01mol)，4.2234g(0.02mol)γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐放入5个无水的反应瓶中，分别向其中加入5mL无水N,N-二甲基甲酰胺将单体溶解。然后在搅拌下分别向其中加入10.119mg(0.0001mol)正己胺， 将得到的溶液在25℃搅拌下反应72h，然后向每个反应瓶中分别加入0.956g(0.0005mol)，1.9118g(0.01mol)，3.8236g(0.02mol)，1.9118g(0.01mol)，1.9118g(0.01mol)L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐，继续反应72h，反应结束后，反应体系用50mL乙醚沉降，过滤，用乙醚洗涤三次后，25℃下真空干燥24h，得到反应产物。
本发明对得到的产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，实施例15~19得到的反应产物为5种不同数均分子量的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物。
本发明检测了得到的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物的数均分子量，结果如表2所示，表2为本发明实施例15~19得到的产物的测试结果。
表2本发明实施例15~19得到的产物的测试结果
表1中，A1/I为γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐与正己胺的投料摩尔比；A2/I为L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐与正己胺的投料摩尔比；DP1为聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物中γ-丙炔基-L-谷氨酸酯结构单元的平均聚合度，由1H NMR测得；DP2为聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物中L-苯丙氨酸结构单元的平均聚合度，由1H NMR测得；反应产率为实际得到的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物的质量与理论得到的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物的质量的比值。
由表2可以看出，本发明提供的方法制得的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物具有较高的产率。
实施例20~24
分别称取0.1056g(0.0005mol)，0.1056g(0.0005mol)，0.1056g(0.0005mol)，2.1117g(0.01mol)，4.2234g(0.02mol)γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸 酐放入5个无水的反应瓶中，分别向其中加入5mL无水N,N-二甲基甲酰胺将单体溶解。然后在搅拌下分别向其中加入10.119mg(0.0001mol)正己胺，将得到的溶液在25℃搅拌下反应72h，然后向每个反应瓶中分别加入0.1532g(0.0005mol)，3.0631g(0.01mol)，6.1262g(0.02mol)，3.0631g(0.01mol)，3.0631g(0.01mol)ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐，继续反应72h，反应结束后，反应体系用50mL乙醚沉降，过滤，用乙醚洗涤三次后，25℃下真空干燥24h，得到反应产物。
本发明对得到的产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，实施例20~24得到的反应产物为5种不同数均分子量的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)嵌段共聚物。
本发明检测了得到的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)嵌段共聚物的数均分子量，结果如表3所示，表3为本发明实施例20~24得到的产物的测试结果。
表3中，A1/I为γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐与正己胺的投料摩尔比；A2/I为ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐与正己胺的投料摩尔比；DP1为聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)嵌段共聚物中γ-丙炔基-L-谷氨酸酯结构单元的平均聚合度，由1H NMR测得；DP2为聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)嵌段共聚物中ε-苄氧羰基-L-赖氨酸结构单元的平均聚合度，由1H NMR测得；反应产率为实际得到的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)嵌段共聚物的质量与理论得到的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)嵌段共聚物的质量的比值。
由表3可以看出，本发明提供的方法制得的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)嵌段共聚物具有较高的产率。
实施例25~29
分别称取实施例20~24所得的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(ε-苄氧羰基-L- 赖氨酸)嵌段共聚物各0.1g，将其在25℃下分别用1mL三氟乙酸溶解，然后在搅拌下向其中加入0.3mL溴化氢质量百分数为33%的溴化氢和冰醋酸的混合溶液，得到反应混合液，将得到的反应混合液在25℃下搅拌1h。反应结束后将反应体系用15mL乙醚沉降，过滤，用乙醚洗涤三次，25℃下真空干燥24h，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，实施例25~29得到的反应产物均为聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-赖氨酸)嵌段共聚物。
本发明计算得到实施例6~10中的脱保护反应产率为84.3~92.6%。
实施例30~34
分别称取0.0498g(0.0003mol)，0.0058g(0.00003mol)，0.0026g(0.00002mol)，0.0507g(0.0003mol)，0.0705g(0.0004mol)叠氮化的三乙二醇单甲醚和0.0433g(0.0003mol)，0.0051g(0.00003mol)，0.0022g(0.00002mol)，0.0442g(0.0003mol)，0.0615g(0.0004mol)N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺，放入5个反应瓶中，然后分别向反应瓶中分别加入0.1g实施例1~5所制备的5种聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，该反应体系除氧后，分别再向其中加入0.0359g(0.0003mol)，0.0042g(0.00003mol)，0.0019g(0.00002mol)，0.0366g(0.0003mol)，0.0509g(0.0004mol)的溴化亚铜，将得到的混合溶液在40℃、搅拌子搅拌下的条件下反应24h，反应结束后用阳离子交换树脂吸附Cu2+，然后用3500Da透析袋透析3天，冻干后，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果如图3所示，图3为本发明实施例31得到的三乙二醇单甲醚功能化的嵌段共聚的核磁共振氢谱图，由图3可以看出，4.11ppm~3.59ppm为三乙二醇单甲醚的信号峰，证明了三乙二醇单甲醚功能化的嵌段共聚物的成功合成。
本发明也将实施例30、32~34得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本发明实施例30、32~34得到的反应产物为三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
本发明计算得到实施例30~34制备三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的反应产率为89.7~93.4%。
实施例35~39
分别称取0.0649g(0.0003mol)，0.0076g(0.00003mol)，0.0034g(0.00002mol)，0.0662g(0.0003mol)，0.0922g(0.0004mol)叠氮化的半乳糖和0.0433g(0.0003mol)，0.0051g(0.00003mol)，0.0022g(0.00002mol)，0.0442g(0.0003mol)，0.0615g(0.0004mol)N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺，放入5个反应瓶中，然后向反应瓶中分别加入0.1g实施例1~5制备的5种聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，该反应体系除氧后，分别向其中加入0.0359g(0.0003mol)，0.0042g(0.00003mol)，0.0019g(0.00002mol)，0.0366g(0.0003mol)，0.0509g(0.0004mol)溴化亚铜，将得到的混合溶液在40℃、搅拌子搅拌下的条件下反应24h，反应结束后用阳离子交换树脂吸附Cu2+，然后用3500Da透析袋透析3天，冻干后，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果如图4所示，图4为本发明实施例36得到的半乳糖功能化的嵌段共聚物的核磁共振氢谱图，由图4可以看出，4.55ppm~3.99ppm为半乳糖的信号峰，证明了半乳糖功能化的嵌段共聚物的成功合成。
本发明也将实施例35、37~39得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本发明实施例35、37~39得到的反应产物为半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
本发明计算得到实施例35~39制备半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的反应产率为90.1~94.3%。
实施例40~44
分别称取0.0498g(0.0003mol)，0.0058g(0.00003mol)，0.0026g(0.00002mol)，0.0507g(0.0003mol)，0.0705g(0.0004mol)叠氮化的三乙二醇单甲醚和0.0433g(0.0003mol)，0.0051g(0.00003mol)，0.0022g(0.00002mol)，0.0442g(0.0003mol)，0.0615g(0.0004mol)N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺，放入5个反应瓶中，然后向反应瓶中分别加入0.0783g，0.0610g，0.0599g，0.0765g，0.0834g实施例6~10制备的5种聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，该反应体系除氧后，分别向其中加入0.0359g(0.0003mol)，0.0042g(0.00003mol)，0.0019g(0.00002mol)，0.0366g(0.0003mol)，0.0509g(0.0004mol)溴化亚铜，将得到的混合溶液在40℃、搅拌子搅拌下的条件下反应24h，反应结束后用阳离子交换树脂吸附Cu2+，然后用3500Da透析袋透析3天，冻干后，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本发明实施例40~44得到的反应产物为三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物。
本发明计算得到实施例40~44制备三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物的反应产率为88.7~94.4%。
实施例45~49
分别称取0.0649g(0.0003mol)，0.0076g(0.00003mol)，0.0034g(0.00002mol)，0.0662g(0.0003mol)，0.0922g(0.0004mol)叠氮化的半乳糖和0.0433g(0.0003mol)，0.0051g(0.00003mol)，0.0022g(0.00002mol)，0.0442g(0.0003mol)，0.0615g(0.0004mol)N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺，放入5个反应瓶中，然后向反应瓶中分别加入0.0783g，0.0610g，0.0599g，0.0765g，0.0834g实施例6~10制备的5种聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物，该反应体系除氧后，分别向其中加入0.0359g(0.0003mol)，0.0042g(0.00003mol)，0.0019g(0.00002mol)，0.0366g(0.0003mol)，0.0509g(0.0004mol)溴化亚铜，将得到的混合溶液在40℃、搅拌子搅拌下的条件下反应24h，反应结束后用阳离子交换树脂吸附Cu2+，然后用3500Da透析袋透析3天，冻干后，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本发明实施例45~49得到的反应产物为半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物。
本发明计算得到实施例45~49制备半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物的反应产率为91.1~95.3%。
实施例50
称取0.0502g(0.0005mol)叠氮化的三乙二醇单甲醚和0.0438g(0.0003mol)N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺，放入反应瓶中，然后向反应瓶中加入0.1g实施例11中所制备的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，该反应体系除氧后，向其中加入0.0362g(0.0003mol)溴化亚铜，将得到的混合溶液在40℃、搅拌子搅拌下的条件下反应24h，反应结束后用阳离子交换树脂吸附Cu2+，然后用3500Da透析袋透析3天，冻干后，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本发明实 施例50得到的反应产物为三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
本发明计算得到实施例50制备三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的反应产率为86.7%。
实施例51
称取0.0656g(0.0003mol)叠氮化的半乳糖和0.0438g(0.0003mol)N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺，放入反应瓶中，然后向反应瓶中加入0.1g实施例11制备的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，该反应体系除氧后，向其中加入0.0362g(0.0003mol)溴化亚铜，将得到的混合溶液在40℃、搅拌子搅拌下的条件下反应24h，反应结束后用阳离子交换树脂吸附Cu2+，然后用3500Da透析袋透析3天，冻干后，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本发明实施例51得到的反应产物为半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物物。
本发明计算表明，本实施例制备半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物物的反应产率为87.3%。
实施例52
称取0.0502g(0.0005mol)叠氮化的三乙二醇单甲醚和0.0438g(0.0003mol)N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺，放入反应瓶中，然后向反应瓶中加入0.0764g实施例12中所制备的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，该反应体系除氧后，向其中加入0.0362g(0.0003mol)溴化亚铜，将得到的混合溶液在40℃、搅拌子搅拌下的条件下反应24h，反应结束后用阳离子交换树脂吸附Cu2+，然后用3500Da透析袋透析3天，冻干后，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本发明实施例52得到的反应产物为三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
本发明计算表明，本实施例制备的三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的反应产率为88.7%。
实施例53
称取0.0656g(0.0003mol)叠氮化的半乳糖和0.0438g(0.0003mol) N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺，放入反应瓶中，然后向反应瓶中加入0.0764g实施例12制备的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，该反应体系除氧后，向其中加入0.0362g(0.0003mol)溴化亚铜，将得到的混合溶液在40℃、搅拌子搅拌下的条件下反应24h，反应结束后用氧离子交换树脂吸附Cu2+，然后用3500Da透析袋透析3天，冻干后，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本发明实施例53得到的反应产物为半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
本发明计算表明，本实施例制备的半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的反应产率为87.6%。
实施例54
称取0.0507g(0.0003mol)叠氮化的三乙二醇单甲醚和0.0443g(0.0003mol)N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺，放入反应瓶中，然后向反应瓶中加入0.1g实施例13制备的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，该反应体系除氧后，向其中加入0.0367g(0.0003mol)溴化亚铜，将得到的混合溶液在40℃、搅拌子搅拌下的条件下反应24h，反应结束后用阳离子交换树脂吸附Cu2+，然后用3500Da透析袋透析3天，冻干后，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本发明实施例54得到的反应产物为三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
本发明计算表明，本实施例制备三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的反应产率为88.8%。
实施例55
称取0.0664g(0.0003mol)叠氮化的半乳糖和0.0443g(0.0003mol)N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺，放入反应瓶中，然后向反应瓶中加入0.1g实施例13制备的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，该反应体系除氧后，向其中加入0.0367g(0.0003mol)溴化亚铜，将得到的混合溶液在40℃、搅拌子搅拌下的条件下反应24h，反应结束后用阳离子交换树脂吸附Cu2+，然后用3500Da透析袋透析3天，冻干后，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本发明实施例55得到的反应产物为半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
本发明计算表明，本实施例制备半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的反应产率为88.9%。
实施例56
称取0.0507g(0.0003mol)叠氮化的三乙二醇单甲醚和0.0443g(0.0003mol)N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺，放入反应瓶中，然后向反应瓶中加入0.0766g实施例14制备的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，该反应体系除氧后，向其中加入0.0367g(0.0003mol)溴化亚铜，将得到的混合溶液在40℃、搅拌子搅拌下的条件下反应24h，反应结束后用阳离子交换树脂吸附Cu2+，然后用3500Da透析袋透析3天，冻干后，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本发明实施例56得到的反应产物为三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
本发明计算表明，本实施例制备三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的反应产率为86.7%。
实施例57
称取0.0664g(0.0003mol)叠氮化的半乳糖和0.0443g(0.0003mol)N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺，放入反应瓶中，然后向反应瓶中加入0.0766g实施例14制备的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，该反应体系除氧后，向其中加入0.0367g(0.0003mol)溴化亚铜，将得到的混合溶液在40℃、搅拌子搅拌下的条件下反应24h，反应结束后用阳离子交换树脂吸附Cu2+，然后用3500Da透析袋透析3天，冻干后，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本发明实施例57得到的反应产物为半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
本发明计算表明，本实施例制备半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的反应产率为88.4%。
实施例58~62
分别称取0.0498g(0.0003mol)，0.0058g(0.00003mol)，0.0026g(0.00002mol)，0.0507g(0.0003mol)，0.0705g(0.0004mol)叠氮化的三乙二醇单甲醚和0.0433g(0.0003mol)，0.0051g(0.00003mol)，0.0022g(0.00002mol)，0.0442g(0.0003mol)，0.0615g(0.0004mol)N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺，依次将叠氮化的三乙二醇单甲醚和N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺放入5个反应瓶中，然后向反应瓶中分别依次加入0.0625g，0.0657g，0.0667g，0.0815g，0.0875g实施例15~19制备的5种聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物，该反应体系除氧后，分别向其中依次加入0.0359g(0.0003mol)，0.0042g(0.00003mol)，0.0019g(0.00002mol)，0.0366g(0.0003mol)，0.0509g(0.0004mol)溴化亚铜，将得到的混合溶液在40℃、搅拌子搅拌下的条件下反应24h，反应结束后用阳离子交换树脂吸附Cu2+，然后用3500Da透析袋透析3天，冻干后，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本发明实施例58~62得到的反应产物均为三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物。
本发明计算表明，实施例58~62制备三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物的反应产率为86.4~93.6%。
实施例63~67
分别称取0.0649g(0.0003mol)，0.0076g(0.00003mol)，0.0034g(0.00002mol)，0.0662g(0.0003mol)，0.0922g(0.0004mol)叠氮化的半乳糖和0.0433g(0.0003mol)，0.0051g(0.00003mol)，0.0022g(0.00002mol)，0.0442g(0.0003mol)，0.0615g(0.0004mol)N,N,N',N',N″-五甲基二亚乙基三胺，依次将叠氮化的半乳糖和N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺放入5个反应瓶中，然后向反应瓶中分别依次加入0.0625g，0.0657g，0.0667g，0.0815g，0.0875g实施例15~19制备的5种聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物，该反应体系除氧后，分别向其中依次加入0.0359g(0.0003mol)，0.0042g(0.00003mol)，0.0019g(0.00002mol)，0.0366g(0.0003mol)，0.0509g(0.0004mol)溴化亚铜，将得到的混合溶液在40℃、搅拌子搅拌下的条件下反应24h，反应结束后用阳离子交换树脂吸附Cu2+，然后用3500Da透析袋透析3天，冻干后，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本发明实施例63~67得到的反应产物均为半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物。
本发明计算表明，实施例63~67制备半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物的反应产率为85.3~93.5％。
实施例68~72
分别称取0.0498g(0.0003mol)，0.0058g(0.00003mol)，0.0026g(0.00002mol)，0.0507g(0.0003mol)，0.0705g(0.0004mol)叠氮化的三乙二醇单甲醚和0.0433g(0.0003mol)，0.0051g(0.00003mol)，0.0022g(0.00002mol)，0.0442g(0.0003mol)，0.0615g(0.0004mol)N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺，依次将叠氮化的三乙二醇单甲醚和N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺放入5个反应瓶中，然后向反应瓶中分别依次加入0.1g，0.1172g，0.1181g，0.1098g，0.1074g实施例20~24制备的5种聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物，该反应体系除氧后，分别向其中依次加入0.0359g(0.0003mol)，0.0042g(0.00003mol)，0.0019g(0.00002mol)，0.0366g(0.0003mol)，0.0509g(0.0004mol)溴化亚铜，将得到的混合溶液在40℃、搅拌子搅拌下的条件下反应24h，反应结束后用阳离子交换树脂吸附Cu2+，然后用3500Da透析袋透析3天，冻干后，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本发明实施例68~72得到的反应产物为三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物。
本发明计算表明，实施例68~72制备三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物的反应产率为87.8~96.6%。
实施例73~77
分别称取0.0649g(0.0003mol)，0.0076g(0.00003mol)，0.0034g(0.00002mol)，0.0662g(0.0003mol)，0.0922g(0.0004mol)叠氮化的半乳糖和0.0433g(0.0003mol)，0.0051g(0.00003mol)，0.0022g(0.00002mol)，0.0442g(0.0003mol)，0.0615g(0.0004mol)N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺，依次将叠氮化的半乳糖和N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺放入5个反应瓶中，然后向反应瓶中分别依次加入0.1g，0.1172g，0.1181g，0.1098g，0.1074g实施例20~24制备的5种聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物，该反应体系 除氧后，分别向其中依次加入0.0359g(0.0003mol)，0.0042g(0.00003mol)，0.0019g(0.00002mol)，0.0366g(0.0003mol)，0.0509g(0.0004mol)溴化亚铜，将得到的混合溶液在40℃、搅拌子搅拌下的条件下反应24h，反应结束后用阳离子交换树脂吸附Cu2+，然后用3500Da透析袋透析3天，冻干后，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本发明实施例73~77得到的反应产物为半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物。
本发明计算表明，实施例73~77制备半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物的反应产率为89.8~95.5%。
实施例78~82
分别称取0.0498g(0.0003mol)，0.0058g(0.00003mol)，0.0026g(0.00002mol)，0.0507g(0.0003mol)，0.0705g(0.0004mol)叠氮化的三乙二醇单甲醚和0.0433g(0.0003mol)，0.0051g(0.00003mol)，0.0022g(0.00002mol)，0.0442g(0.0003mol)，0.0615g(0.0004mol)N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺，依次将叠氮化的三乙二醇单甲醚和N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺放入5个反应瓶中，然后向反应瓶中分别依次加入0.0727g，0.0600g，0.0589g，0.0750g，0.0830g实施例25~29制备的5种聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物，该反应体系除氧后，分别向其中依次加入0.0359g(0.0003mol)，0.0042g(0.00003mol)，0.0019g(0.00002mol)，0.0366g(0.0003mol)，0.0509g(0.0004mol)溴化亚铜，将得到的混合溶液在40℃、搅拌子搅拌下的条件下反应24h，反应结束后用阳离子交换树脂吸附Cu2+，然后用3500Da透析袋透析3天，冻干后，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本发明实施例78~82得到的反应产物为三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物。
本发明计算表明，实施例78~82制备三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物的反应产率为88.8~96.7%。
实施例83~87
分别称取0.0649g(0.0003mol)，0.0076g(0.00003mol)，0.0034g(0.00002mol)，0.0662g(0.0003mol)，0.0922g(0.0004mol)叠氮化的半乳糖和0.0433g (0.0003mol)，0.0051g(0.00003mol)，0.0022g(0.00002mol)，0.0442g(0.0003mol)，0.0615g(0.0004mol)N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺，依次将叠氮化的半乳糖和N,N,N',N',N″-五甲基二亚乙基三胺放入5个反应瓶中，然后向反应瓶中分别依次加入0.0727g，0.0600g，0.0589g，0.0750g，0.0830g实施例25~29制备的5种聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物，该反应体系除氧后，分别向其中依次加入0.0359g(0.0003mol)，0.0042g(0.00003mol)，0.0019g(0.00002mol)，0.0366g(0.0003mol)，0.0509g(0.0004mol)溴化亚铜，将得到的混合溶液在40℃、搅拌子搅拌下的条件下反应24h，反应结束后用阳离子交换树脂吸附Cu2+，然后用3500Da透析袋透析3天，冻干后，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本发明实施例83~87得到的反应产物为半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物。
本发明计算表明，实施例83~87制备半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-苯丙氨酸)嵌段共聚物的反应产率为87.7~95.5%。
实施例88
称取0.0254g(0.00015mol)叠氮化的三乙二醇单甲醚、0.0331g(0.00015mol)叠氮化的半乳糖和0.0442g(0.0003mol)N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺，放入反应瓶中，然后向反应瓶中加入0.1g实施例4制备的数均分子量为40000的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，该反应体系除氧后，向其中加入0.0366g(0.0003mol)溴化亚铜，将得到的混合溶液在40℃、搅拌子搅拌下的条件下反应24h，反应结束后用阳离子交换树脂吸附Cu2+，然后用3500Da透析袋透析3天，冻干后，得到反应产物。
本发明将得到的反应产物进行核磁共振氢谱检测，结果表明，本发明实施例88得到的反应产物为三乙二醇单甲醚和半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
本发明计算表明，实施例88制备三乙二醇单甲醚和半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的反应产率为94.6%。
实施例89~90
分别称取实施例31得到的三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨 酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物和实施例36得到的半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物各50mg，将其分别与5mg阿霉素混合，然后向其中分别加入5mL N,N-二甲基甲酰胺，将得到的混合溶液在室温下搅拌6h使体系完全溶解后，然后向其中缓慢滴加2mL超纯水后，上述混合溶液用超纯水透析24h，冻干后得到载药纳米粒子。
本发明将得到的载药纳米粒子进行体外释放行为的检测，将其在37℃下置于pH值7.4的摩尔浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液中，观察其释放浓度，结果如图5所示，图5为本发明89~90得到的载药纳米粒子的体外释放行为，由图5可以看出，本发明得到的载药纳米粒子可以实现对阿霉素的缓慢释放，使药物能够较长时间内作用于病灶部位，有利于药效的长期发挥。
实施例91~94
按照实施例90所述的方法，将实施例40得到的三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物、实施例45、47、49得到的半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物与阿霉素复合，得到载药纳米粒子，并考察了其在体外的释放行为，释放条件为37℃，pH值为5.3的摩尔浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液。结果如图6所示，图6为本发明实施例91~94得到的载药纳米粒子的体外释放行为，其中曲线1为实施例40得到的三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物复合阿霉素得到的载药纳米粒子的体外释放行为，曲线2~3分别为实施例45、47、49得到的半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物与阿霉素复合得到的载药纳米粒子的体外释放行为。
实施例95~98
分别将实施例94~98得到的载药纳米粒子在37℃下，置于pH值为6.8、摩尔浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液中，考察了载药纳米粒子的体外释放行为，结果如图7所示，图7为本发明实施例95~98得到的载药纳米粒子的体外释放行为，其中曲线1为实施例40得到的三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物复合阿霉素得到的载药纳米粒子的体外释放行为，曲线2~3分别为实施例45、47、49得到的半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物与阿霉素复合得到的载药纳米粒子的体外释放行为。
实施例99~102
分别将实施例94~98得到的载药纳米粒子在37℃下，置于pH值为7.4、摩尔浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液中，考察了载药纳米粒子的体外释放行为，结果如图8所示，图8为本发明实施例99~102得到的载药纳米粒子的体外释放行为，其中曲线1为实施例40得到的三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物复合阿霉素得到的载药纳米粒子的体外释放行为，曲线2~3分别为实施例45、47、49得到的半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物与阿霉素复合得到的载药纳米粒子的体外释放行为，通过比较图6~8的结果可以看出，本发明得到的载药纳米粒子具有良好的pH值响应性的控制释放，通过调整pH值实现对药物的可控释放。
本发明研究了实施例40得到的三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物复合阿霉素得到的载药纳米粒子和实施例45得到的半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物与阿霉素复合得到的载药纳米粒子对HepG2细胞生长的抑制作用，具体过程如下
所制备的载药纳米粒子的细胞增殖抑制采用噻唑蓝法进行评价。本发明将HepG2细胞按照约1.0×104个细胞/孔的细胞密度接种于96孔板，向每孔中加入100μL含有质量分数为10%的胎牛血清、50IU mL-1的青霉素和50IUmL-1的链霉素的DMEM细胞培养基，在37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24h。去除培养基，接着加入不同浓度的载药纳米粒子（0~10mg L-1DOX），同样条件下，在细胞培养箱中培养24h后进行噻唑蓝测试。用未经药物处理的细胞作为对照。用酶标仪（Bio-Rad 680）测定溶液在490nm处的吸收值。根据吸收值计算经过载药纳米粒子处理后的细胞相对存活率。计算公式：细胞存活率（%）=（样品组吸收值/对照组吸收值）×100%。实验平行测试3次，数据结果取其平均值。
结果如图9所示，图9为本发明实施例99~100得到的载药纳米粒子对HepG2细胞的生长抑制行为，其中曲线1为实施例99得到的载药纳米粒子对HepG2细胞的生长抑制行为，曲线2为实施例100得到的载药纳米粒子对HepG2细胞的生长抑制行为，由图9可以看出，本发明提供的载药纳米粒子具有理想的HepG2细胞生长抑制效果。
本发明先将HepG2细胞用摩尔浓度为20mmol/L的半乳糖进行处理，然后再研究了实施例40得到的三乙二醇单甲醚功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物复合阿霉素得到的载药纳米粒子和实施例45得到的半乳糖功能化的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物与阿霉素复合得到的载药纳米粒子对半乳糖处理过的HepG2细胞生长的抑制作用，具体过程如下：
所制备的载药纳米粒子的细胞增殖抑制采用噻唑蓝法进行评价。将HepG2细胞按照约1.0×104个细胞/孔的细胞密度接种于96孔板，向每孔中加入100μL含有质量分数为10%的胎牛血清、50IU mL-1的青霉素和50IUmL-1的链霉素的DMEM细胞培养基，在37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24h。去除培养基，接着加入不同浓度的载药纳米粒子（0~10mg L-1DOX），同样条件下，在细胞培养箱中培养24h后进行噻唑蓝测试。用未经药物处理的细胞作为对照。用酶标仪（Bio-Rad 680）测定溶液在490nm处的吸收值。根据吸收值计算经过载药纳米粒子处理后的细胞相对存活率。计算公式：细胞存活率（%）=（样品组吸收值/对照组吸收值）×100%。实验平行测试3次，数据结果取其平均值。
结果如图10所示，图10为本发明实施例99~100得到的载药纳米粒子对半乳糖处理过的HepG2细胞的生长抑制行为，其中曲线1为本发明实施例99得到的载药纳米粒子对半乳糖处理过的HepG2细胞的生长抑制行为，曲线2为实施例100得到的载药纳米粒子对半乳糖处理过的HepG2细胞的生长抑制行为，图10中的曲线1和曲线2重合在一起，由图10可以看出，本发明提供的载药纳米粒子具有理想的HepG2细胞生长抑制效果。
本发明在考察载药纳米粒子对HepG2细胞生长的抑制作用的过程中，采用荧光光度法检测了载药纳米粒子在HepG2细胞内的荧光强度，结果如图11所示，图11为本发明实施例99~100得到的载药纳米粒子在HepG2细胞内的荧光强度与细胞数的关系曲线，其中曲线1为实施例99得到的载药纳米粒子在HepG2细胞内的荧光强度与细胞数的关系曲线，曲线2为实施例100得到的载药纳米粒子在HepG2细胞内的荧光强度与细胞数的关系曲线，由图11可以看出，本发明提供的功能化嵌段共聚物载药纳米粒子具有更有效的细胞内释放。
由以上实施例可以看出，本发明提供了一种具有聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸 酯)-聚氨基酸嵌段共聚物，具有式（I）所示结构。本发明以含伯氨基的小分子为引发剂，通过γ-炔丙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐和氨基酸-N-内羧酸酐的逐步开环反应得到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物。所得的嵌段共聚物可以通过Cu(I)催化的“点击化学”反应键合叠氮化的具有生物活性或环境响应性的功能化小分子，得到具有生物活性或环境响应性的聚氨基酸嵌段共聚物。本发明提供的嵌段共聚物侧链为易修饰的炔丙基，在与功能化小分子进行反应时具有较高的反应活性；而且对本发明提供的嵌段共聚物侧链的修饰不会引起聚氨基酸主链的断裂，对其侧链的修饰不会受功能化小分子分子量和空间位阻的影响，能够制备出高接枝密度的功能化聚氨基酸，本发明提供的嵌段共聚物经功能化后具有良好的生物相容性和降解性，对人体物毒害副作用，利于其在靶向药物传输、组织工程和蛋白分离与检测等生物医用材料领域的应用。实验结果表明，本发明提供的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物经半乳糖或三乙二醇单醚功能化后得到的功能化嵌段共聚物能够作为药物载体，实现抗肿瘤药物阿霉素的缓慢释放，具有较好的pH值响应性控制释放行为，能够有效地抑制HepG2细胞的生长。
而且，本发明提供的制备聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物的方法过程简单，利于控制，有利于其应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (16)
1.聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物，具有式（I）所示结构：
其中，-R1为伯胺数为1~2的伯胺基，R1的分子量为50~1000；
-R2为-H、-CH3、 
H3C-CH2CH2-、
HO-CH2-、
5≤m≤250；
5≤n≤250。
2.根据权利要求1所述的嵌段共聚物，其特征在于，所述-R1为
3.根据权利要求1所述的嵌段共聚物，其特征在于，所述-R2为
4.根据权利要求1所述的嵌段共聚物，其特征在于，所述聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)嵌段的数均分子量为1000~30000；
所述聚氨基酸嵌段的数均分子量为1000~30000。
5.聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物的制备方法，包括以下步骤：
将γ-炔丙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、氨基酸-N-内羧酸酐和伯胺引发剂在无水溶剂中进行聚合反应，得到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物；
所述伯胺引发剂的伯胺数为1~2，所述伯胺引发剂的分子量为50~1000；
所述氨基酸-N-内羧酸酐为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-2-氯乙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、甘氨酸-N-内羧酸酐、L-丙氨酸-N-内羧酸酐、L-缬氨酸-N-内羧酸酐、L-亮氨酸-N-内羧酸酐、L-异亮氨酸-N-内羧酸酐、L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐、L-脯氨酸-N-内羧酸酐、L-色氨酸-N-内羧酸酐、L-丝氨酸-N-内羧酸酐、L-酪氨酸-N-内羧酸酐、β-苄氧羰基-L-半胱氨酸-N-内羧酸酐、L-蛋氨酸-N-内羧酸酐、L-天冬酰胺-N-内羧酸酐、L-谷氨酰胺-N-内羧酸酐、L-苏氨酸-N-内羧酸酐、γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐、ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐、L-谷氨酸-5-苄酯-N-内羧酸酐、精氨酸-N-内羧酸酐、L-赖氨酸-N-内羧酸酐或组氨酸-N-内羧酸酐。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述伯胺引发剂为正己胺、烯丙胺或炔丙胺。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述氨基酸-N-内羧酸酐为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐和ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐、L-赖氨酸-N-内羧酸酐或L-谷氨酸-5-苄酯-N-内羧酸酐。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述γ-炔丙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、氨基酸-N-内羧酸酐与伯胺引发剂的质量比为（5~250）:（5~250）:1。
9.根据权利要求5~8任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述将γ-炔丙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、氨基酸-N-内羧酸酐和伯胺引发剂在无水溶剂中进行聚合反应具体为：
将γ-炔丙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐和伯胺引发剂在无水溶剂中混合，进行第一反应后向其中加入氨基酸-N-内羧酸酐，进行聚合反应后得到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述第一反应的温度为20℃~40℃；
所述第一反应的时间为60小时~84小时；
所述聚合反应的温度为20℃~40℃；
所述聚合反应的时间为60小时~84小时。
11.一种功能化嵌段共聚物的制备方法，包括以下步骤：
将权利要求1~4任意一项所述的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物或权利要求5~10任意一项所述的制备方法制备的聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物溶于有机溶剂中，得到嵌段共聚物的溶液；
将所述嵌段共聚物的溶液与具有生物活性或环境响应性的功能化小分子和N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺混合，得到的混合溶液，所述功能化小分子为叠氮基团修饰的乙二醇单甲醚、二乙二醇单甲醚、三乙二醇单甲醚、单糖、多糖、抗原、抗体、生物素、抗生物、短肽或药物；
将所述混合溶液除氧后与溴化亚铜反应，得到反应液；
将所述反应液用阳离子交换树脂进行吸附后进行透析，得到功能化聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物中的炔基与N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺和功能化小分子的摩尔比为1:（0.5~5）:（0.8~8）；
所述溴化亚铜与N,N,N',N',N''-五甲基二亚乙基三胺等当量。
13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述功能化小分子为叠氮化的三乙二醇单甲醚和半乳糖。
14.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶液与溴化亚铜反应的温度为30℃~50℃；
所述混合溶液与溴化亚铜反应的时间优选为18小时~30小时。
15.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述透析的时间为2天~5天。
16.一种功能化嵌段共聚物，由权利要求11~15任意一项所述的制备方法制得的功能化聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物。
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| CN102936337B (zh) | 2014-10-22 |
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