CN108530619A - 功能化氨基酸、制备方法及由其制得的功能化氨基酸水凝胶 - Google Patents

功能化氨基酸、制备方法及由其制得的功能化氨基酸水凝胶 Download PDF

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Abstract

本发明涉及功能化氨基酸、制备方法及由其制得的功能化氨基酸水凝胶。制备方法包括如下步骤：S1、合成聚氨基酸aPEG‑PELG13；S2、合成功能化聚氨基酸aPEG‑PELG‑KGN。本发明提供的制备方法可将KGN这一小分子化合连接到聚氨基酸上，制得修饰有KGN的功能化聚氨基酸。采用上述聚氨基酸可以在33℃左右形成稳定的凝胶，因此便于在低温状态和细胞混合并用于体内注射。此外，采用本发明提供的功能化聚氨基酸所形成的凝胶具有良好的生物可降解性；对于包裹其中的间充质干细胞能够促进细胞增殖，以及向软骨细胞分化。

Description

功能化氨基酸、制备方法及由其制得的功能化氨基酸水凝胶
技术领域
本发明涉及医药材料技术领域，尤其涉及功能化氨基酸、制备方法及由其制得的功能化氨基酸水凝胶。
背景技术
聚氨基酸因其具有规整的二级结构、良好的生物相容性和生物可降解性，在药物控制释放、组织工程、生物粘附、抗菌材料和免疫调节等领域具有广阔的应用前景。它一种优异的药物控制释放载体，通常以水凝胶的形式发挥药物控制释放载体的作用。
Kartogenin(即KGN)，其分子式为C20H15NO3，是一种具有极强的促进骨分化能力的小分子化合物，能有效地促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。它可明显抑制白介素1β(interleukir 1β，1L-1β)引起的细胞外质和蛋白聚糖的减少，同时对于促进软骨细胞分泌物lubricin的分泌与转化生长因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)、骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic 7，BMP-7)具有协同作用，还能促进腱骨连接处形成软骨组织。
目前，还未见将KGN与聚氨基酸结合应用的相关报道。若是能够提供一种制备方法，将KGN修饰到聚氨基酸上，则可同时扩展KGN和聚氨基酸凝胶载体相关领域的应用。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
(一)要解决的技术问题
针对现有技术中缺乏将KGN修饰到聚氨基酸上的制备技术，本发明提供了一种制备方法，利用该制备方法制得的功能化聚氨基酸连接有KGN，它可以在33℃左右形成稳定的凝胶，因此便于在低温状态和细胞混合并用于体内注射。此外，采用本发明提供的功能化聚氨基酸所形成的凝胶具有良好的生物可降解性；对于包裹其中的细胞能够促进细胞增殖，以及向软骨细胞分化。
(二)技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种功能化聚氨基酸的制备方法，包括如下步骤：
S1、合成聚氨基酸aPEG-PELG13：
合成端氨基烯丙基聚乙二醇：aPEG-NH2；
将aPEG-NH2作为引发剂引发γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐开环聚合得到烯丙基聚乙二醇-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，即聚氨基酸aPEG-PELG13；
S2、合成功能化聚氨基酸aPEG-PELG-KGN：
将aPEG-PELG13和Kartogenin分别溶于N,N-二甲基甲酰胺中，配制得到聚氨基酸溶液和KGN溶液，将KGN溶液经EDC/NHS活化，然后在冰水浴中滴加到聚氨基酸溶液中，并进行搅拌，在聚氨基酸一端修饰上KGN，得到功能化聚氨基酸aPEG-PELG-KGN。
优选地，本发明提供的制备方法还包括S3：合成功能化聚氨基酸RGD-PEG-PELG-KGN，所述S3包括如下步骤：
将aPEG-PELG-KGN、CRGD肽、偶氮二异丁腈溶于N,N-二甲基甲酰胺中，除氧后，在氮气保护下加热进行反应，aPEG-PELG-KGN的烯丙氧基参与反应，在aPEG-PELG-KGN的一端修饰上RGD，得到功能化聚氨基酸RGD-PEG-PELG-KGN。
优选地，在S2中，所述aPEG-PELG13和所述KGN的用量比为(4.3～5)：1，优选为(4.54～4.55)：1。
进一步优选地，S2中还包含纯化步骤，此时所述S2按照如下方式进行：
将2.5～3.0g aPEG-PELG13溶于25～30mL N,N-二甲基甲酰胺中，配制成聚氨基酸溶液，将0.55～0.60g Kartogenin溶于15～20mL N,N-二甲基甲酰胺中，配制成KGN溶液；
将KGN溶液经EDC/NHS活化，然后在冰水浴中滴加到聚氨基酸溶液中，搅拌3～4天后，用截留量为3000的透析袋在水中透析3天，每6小时换一次水，得到aPEG-PELG-KGN。
优选地，所述EDC/NHS活化中，EDC和NHS的用量比为(1.6～1.7)：1.2。
优选地，在S3中，所述aPEG-PELG-KGN、CRGD肽、偶氮二异丁腈的用量比为(79～82)：(58～62)：(3～4)，优选为80:60:3。
优选地，S3中还包含纯化步骤，此时所述S3按照如下方式进行:
将2.0～2.5g aPEG-PELG-KGN、1.5～1.6gCRGD肽和75～80mg偶氮二异丁腈溶于N,N-二甲基甲酰胺中，放入安全瓶中在液氮条件下冷冻后用高压油泵抽至少20min，充入氮气保护，融化后再抽至少20min，重复3次以除去其中的氧气，然后氮气保护下加热至65～70℃并进行搅拌，反应3～4天后，将产物依次进行沉降、抽滤、透析，得到RGD-PEG-PELG-KGN；优选地，所述透析采用截留量为3000的透析袋进行，透析时间为3～4天。
优选地，所述S1按照如下方式进行：
10～15g aPEG-NH2和1000mL干燥的甲苯在130℃下共沸除去aPEG-NH2中的水分，然后抽干甲苯，加入15～22.5gγ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐和150mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺，氮气保护下在25℃反应5～6天，产物经沉降、干燥得到aPEG-PELG13。
优选地，所述合成aPEG-NH2的步骤包括：
将分子量为2000的aPEG、甲苯磺酰氯和氢氧化钾混合，加入二氯甲烷后在室温下搅拌反应，然后用饱和食盐水洗涤，将下层有机相依次进行干燥、过滤、沉降、抽滤，得白色粉末固体；
将白色粉末固体、氯化铵和氨水溶解，室温下搅拌反应5天，将产物依次进行萃取、饱和食盐水洗涤、干燥、沉降，得到aPEG-NH2；优选地，所述aPEG、甲苯磺酰氯和氢氧化钾的用量比为(15～20):(7～11):(1.3～1.6)，最优选为20:9.5:1.68。
本发明还提供了一种功能化聚氨基酸，采用上述制备方法制备而成。
本发明还提供了一种功能化聚氨基酸水凝胶，采用上述功能化聚氨基酸制得；优选地，所述水凝胶的质量分数为4～10％，例如，为4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％。
(三)有益效果
本发明的上述技术方案具有如下优点：
本发明提供了一种制备方法，将KGN这一小分子化合连接到聚氨基酸上，制得功能化聚氨基酸aPEG-PELG-KGN和RGD-PEG-PELG-KGN。采用本发明制得的聚氨基酸可以在33℃左右形成稳定的凝胶，因此便于在低温状态和细胞混合并用于体内注射。此外，采用本发明提供的功能化聚氨基酸所形成的凝胶具有良好的生物可降解性；对于包裹其中的细胞能够促进细胞增殖，以及向软骨细胞分化。
附图说明
图1和图2分别是对实施例2制得的aPEG-PELG13和RGD-PEG-PELG-KGN两种聚氨基酸进行1H NMR测试所得的核磁谱图；
图3是实施例2和对比例制得的四种聚氨基酸所形成的水凝胶的相位转变图；
图4是实施例2和对比例制得的四种聚氨基酸所形成的水凝胶的流变图；
图5是实施例2制得的aPEG-PELG13和RGD-PEG-PELG-KGN两种聚氨基酸的体外降解实验结果图；
图6是实施例2制得的RGD-PEG-PELG-KGN所形成的凝胶在体外KGN的释放曲线；
图7是CCK-8检测不同功能化凝胶中的细胞增殖结果；
图8和图9分别是不同功能化凝胶中的细胞DNA和GAG含量检测结果，其中图8是DNA含量检测结果，图9是GAG含量检测结果；
图10是PBMSCs在三种功能化凝胶内经体外成软骨诱导3周后的分化状态。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种功能化聚氨基酸的制备方法，包括如下步骤：
S1、合成聚氨基酸aPEG-PELG13，这一步包括如下步骤：
S11、合成端氨基烯丙基聚乙二醇：aPEG-NH2。
在一些实施例中，S11按照如下方式进行：
将分子量为2000的aPEG、甲苯磺酰氯和氢氧化钾混合，加入二氯甲烷后在室温下搅拌反应，然后用饱和食盐水洗涤，将下层有机相依次进行干燥、过滤、沉降、抽滤，得白色粉末固体。aPEG、甲苯磺酰氯和氢氧化钾的用量比最优选为20:9.5:1.68。
将白色粉末固体、氯化铵和氨水溶解，室温下搅拌反应5天，将产物依次进行萃取、饱和食盐水洗涤、干燥、沉降，得到aPEG-NH2。为了确保反应能顺利进行，所述白色粉末固体的用量优选为15～20g，氯化铵的用量优选为15～20g，氨水的用量优选为800～1000mL。
萃取和沉降影响着产物的收率，在一些实施例中，萃取所用的溶剂为二氯甲烷，沉降所用的溶剂为乙醚和二氯甲烷组成的混合溶剂，并且沉降三次。按照上述方法进行萃取和沉降确保产物的收率达到了85％以上。
S12、将aPEG-NH2作为引发剂引发γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐开环聚合得到烯丙基聚乙二醇-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，即聚氨基酸aPEG-PELG13。
在一些实施例中，步骤S12按照如下方式进行：
10～15g aPEG-NH2和1000mL干燥的甲苯在130℃下共沸除去aPEG-NH2中的水分，然后抽干甲苯，加入15～22.5gγ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐(即ELG-NCA)和150mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺，氮气保护下在25℃反应5～6天，产物经沉降、干燥得到aPEG-PELG13。该步骤中的沉降所用溶剂优选为乙醚和二氯甲烷组成的混合溶剂，所述干燥的方式优选为真空干燥。经检测，产物的产率为65％～75％。
在一些实施例中，所用的γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐采用如下方法合成：
将L-谷氨酸和乙醇在冰浴条件下充分混合，再逐滴滴加浓硫酸(分析纯，购于盛阳润泽(北京)科技有限公司)，然后室温条件下搅拌过夜，直至混合液变澄清。然后再加入乙醇和三乙胺的混合溶液(混合溶液中乙醇和三乙胺的体积比为1:1)进行中和，冷却至室温后进行离心，然后将离心后得到的白色固体进行重结晶，得到白色晶体γ-乙基-L-谷氨酸酯。其中，当L-谷氨酸以g计，乙醇以mL计时，则两者的用量比为2:3；乙醇和浓硫酸的体积比为15:4。
在氮气保护下，将γ-乙基-L-谷氨酸酯和三光气加到四氢呋喃中，然后在55～60℃的油浴中进行搅拌，等体系变得澄清后，室温下继续通入氮气，然后将产物倒入正己烷中沉降，并置于-20℃使沉淀完全。沉淀完全后，弃上清液，收集底层无色粘稠液体，用乙酸乙酯溶解，再用冰的氯化钠水溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，用G4漏斗滤去无水硫酸镁，滤液转移到反应瓶中，在真空条件下抽干乙酸乙酯，得到白色晶体γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐。其中，当γ-乙基-L-谷氨酸酯和三光气均以g计，四氢呋喃以mL计时，三者的用量比为3.22:1.98:100。
S2、合成功能化聚氨基酸aPEG-PELG-KGN。
将aPEG-PELG13和Kartogenin分别溶于N,N-二甲基甲酰胺中，配制得到聚氨基酸溶液和KGN溶液，将KGN溶液经EDC/NHS活化，然后在冰水浴中滴加到聚氨基酸溶液中，并进行搅拌，在聚氨基酸一端修饰上KGN，得到功能化聚氨基酸aPEG-PELG-KGN。
在本发明中，将KGN通过酯化反应连接到aPEG-PELG13的末端氨基上，成功地将KGN修饰到aPEG-PELG13上，得到功能化聚氨基酸aPEG-PELG-KGN。连接有KGN的聚氨基酸能够促进细胞软骨表型的维持。
为了确保反应能够顺利进行，成功将KGN连接到聚氨基酸一端，本发明还对各组分的用量进行了研究。经过大量研究发现，所述aPEG-PELG13和所述KGN适宜的用量比为(4.3～5)：1，优选为(4.54～4.55)：1。
在一些实施例中，该步骤还包含纯化步骤，此时步骤S2按照如下方式进行：
将2.5～3.0g aPEG-PELG13溶于25～30mL N,N-二甲基甲酰胺中，配制成聚氨基酸溶液，将0.55～0.60g Kartogenin溶于15～20mL N,N-二甲基甲酰胺中，配制成KGN溶液；
将KGN溶液经EDC/NHS活化，然后在冰水浴中滴加到聚氨基酸溶液中，搅拌3～4天后，用截留量为3000的透析袋在水中透析3天，每6小时换一次水，得到aPEG-PELG-KGN。
在一些实施例中，所述EDC/NHS活化中，EDC和NHS的用量比为(1.6～1.7)：1.2。
在一些实施例中，本发明提供的制备方法还包括S3：合成功能化聚氨基酸RGD-PEG-PELG-KGN，所述S3包括如下步骤：
将aPEG-PELG-KGN、CRGD肽、偶氮二异丁腈溶于N,N-二甲基甲酰胺中，除氧后，在氮气保护下加热进行反应，aPEG-PELG-KGN的烯丙氧基参与反应，在aPEG-PELG-KGN的一端修饰上RGD，得到功能化聚氨基酸RGD-PEG-PELG-KGN。
CRGD肽是指含精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸的小分子环形肽，是含有二硫键的环形RGD肽。将CRGD肽和偶氮二异丁腈在DMF溶液中与aPEG-PELG-KGN的烯丙基发生反应，在修饰有KGN的聚氨基酸上又成功修饰上了RGD，得到了连接有两种功能分子的聚氨基酸：RGD-PEG-PELG-KGN。
连接上的RGD为含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的多肽。连接有RGD的聚氨基酸可以增强细胞和聚氨基酸的相互作用，促进细胞的粘附和增殖。
为了保证反应能够顺利进行，本发明还对各组分的用量进行了研究。通过大量研究发现，所述aPEG-PELG-KGN、CRGD肽、偶氮二异丁腈的用量比为(79～82)：(58～62)：(3～4)，最优选的用量比为80:60:3。
在一些实施例中，S3中还包含纯化步骤，此时所述S3按照如下方式进行:
将2.0～2.5g aPEG-PELG-KGN、1.5～1.6gCRGD肽和75～80mg偶氮二异丁腈溶于N,N-二甲基甲酰胺中，放入安全瓶中在液氮条件下冷冻后用高压油泵抽至少20min，充入氮气保护，融化后再抽至少20min，重复3次以除去其中的氧气，然后氮气保护下加热至65～70℃并进行搅拌，反应3～4天后，将产物依次进行沉降、抽滤、透析，得到RGD-PEG-PELG-KGN；优选地，所述透析采用截留量为3000的透析袋进行，透析时间为3～4天。所述沉降优选用乙醚作为溶剂。
采用上述制备方法制得的功能化聚氨基酸RGD-PEG-PELG-KGN的结构为：
本发明还提供了一种功能化聚氨基酸，采用上述制备方法制备而成。该功能化聚氨基酸有两种，一种是仅修饰有KGN的聚氨基酸aPEG-PELG-KGN，另一种是既修饰有KGN又修饰有RGD的聚氨基酸RGD-PEG-PELG-KGN。未修饰前的聚氨基酸为aPEG-PELG13，是将端氨基烯丙基聚乙二醇作为引发剂引发γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐开环聚合得到的，具体的制备方法见前面描述。
本发明还提供了一种功能化聚氨基酸水凝胶，本发明还提供了一种功能化聚氨基酸水凝胶，采用上述功能化聚氨基酸制得；优选地，所述水凝胶的质量分数为4～10％，例如，为4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％。
以下为本发明列举的实施例。
实施例1
S1、合成聚氨基酸aPEG-PELG13。
将从海安石油购买的aPEG(M＝2000)20g和甲苯磺酰氯(M＝190)，9.5g以及KOH(M＝56.1)1.68g混合，加入到500mL圆底烧瓶中，再加入250mL二氯甲烷，室温搅拌反应五天，所得产物用饱和食盐水洗涤三到五次，将下层有机相放入锥形瓶中干燥过夜，然后用G4漏斗过滤，再用乙醚/二氯甲烷沉降三次，最后用真空油泵抽干12h，得到白色粉末固体18.7g。
取15g制得的白色粉末固体和15g氯化铵加入1L圆底烧瓶中，用800mL氨水溶解，室温条件下搅拌反应5天，所得产物用二氯甲烷萃取，将萃取液用饱和食盐水洗涤3次，干燥过夜，用乙醚/二氯甲烷沉降三次，制备得到端氨基PEG(即aPEG-NH2)备用。
称取L-谷氨酸20g，量取乙醇30mL，在冰浴条件下充分混合，再逐滴滴加8mL浓硫酸。室温下搅拌过夜，直至混合液变澄清。冰浴下用乙醇42mL和三乙胺42mL的混合溶液中和反应液，冷却至室温，离心(11000rmp，5min)得到白色固体，用水和乙醇重结晶得到白色晶体γ-乙基-L-谷氨酸酯备用，产率为61％。
在缓慢通入氮气保护气的条件下，在三口瓶中加入100mL干燥的四氢呋喃，调节气流量，稳定缓慢鼓泡。然后加入3.22g的γ-乙基-L-谷氨酸酯和1.98g的三光气，放于55～60℃的油浴中搅拌反应，等体系变得澄清后，室温下继续氮气鼓泡3min，然后倒入600mL正己烷中沉降，并置于-20℃使沉淀完全。弃上清液，收集底层无色粘稠液体，用100mL乙酸乙酯溶解，再用50mL冰的氯化钠水溶液进行洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，用G4漏斗滤去无水硫酸镁，滤液转移到反应瓶中，在真空条件下抽干乙酸乙酯，得到白色晶体γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐，产率为66％。
取10g aPEG-NH2和1000mL干燥的甲苯在130℃下共沸除去aPEG-NH2中的水分，抽干甲苯后，加入γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐15.075g，溶解于150mL干燥的DMF，在氮气保护条件下在25℃反应5天，所得产物用乙醚/二氯甲烷沉降，然后在室温条件下真空干燥24小时，得到最终产物烯丙基聚乙二醇-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，即aPEG-PELG13，产率为75％。
S2、合成功能化聚氨基酸aPEG-PELG-KGN。
将2.5g aPEG-PELG13溶于25mL DMF中，配制成聚氨基酸溶液；将0.55g KGN(购于Sigma)溶于15mL DMF中，配制成KGN溶液，然后用EDC/NHS(用量分别为1.66g和1.20g)活化40min，在冰水浴中滴加到聚氨基酸溶液中，搅拌反应3天，所得产物用截留量为3000的透析袋在水中透析三天，每六小时换一次水，在聚氨基酸一端修饰上KGN，得到aPEG-PELG-KGN。
实施例2
S1、同实施例中的S1。
S2、同实施例1中的S2。
S3、合成功能化聚氨基酸RGD-PEG-PELG-KGN。
将aPEG-PELG-KGN 2.0g、CRGD肽1.5g和偶氮二异丁腈75mg溶于N,N-二甲基甲酰胺中，放入安全瓶中在液氮条件下冷冻后用高压油泵抽20min，充入氮气保护，融化后再抽20min，重复3次(在液氮条件下冷冻后用高压油泵抽20min，充入氮气保护，融化后再抽20min为一个循环)以除去其中的氧气，然后氮气保护下加热至65℃并进行搅拌，反应3天后，所得产物用乙醚沉降，抽干后用截留量为3000的透析袋透析3天，得到RGD-PEG-PELG-KGN。
本发明还制得了一组对比产品，该产品为RGD-PEG-PELG13，也就是说在仅在聚氨基酸一端修饰上RGD多肽。该对比例的制备方法包括如下步骤：
步骤(1)、同实施例1的S1。
步骤(2)、将aPEG-PELG13 2.0g、CRGD肽1.5g和偶氮二异丁腈75mg溶于N,N-二甲基甲酰胺中，放入安全瓶中在液氮条件下冷冻后用高压油泵抽20min，充入氮气保护，融化后再抽20min，重复3次(在液氮条件下冷冻后用高压油泵抽20min，充入氮气保护，融化后再抽20min为一个循环)以除去其中的氧气，然后氮气保护下加热至65℃并进行搅拌，反应3天后，所得产物用乙醚沉降，抽干后用截留量为3000的透析袋透析3天，得到RGD-PEG-PELG13。
核磁检测：
对实施例2制得的aPEG-PELG13和RGD-PEG-PELG-KGN两种聚氨基酸进行1H NMR测试，使用Bruker AV 400NMR核磁共振谱仪，溶剂使用氘代三氟乙酸(TFA-d)，0.01％(v/v)四甲基硅烷(TMS)为内标。
图1为未连接RGD和KGN的聚氨基酸的核磁谱图，图2为连接有RGD和KGN的聚氨基酸的核磁谱图。聚合物的聚合度通过比较较侧链甲基和聚乙二醇上的亚甲基的积分面积得到的，计算结果表明实际得到的聚合度和投料比基本吻合，证明了聚合物的成功制备。
水凝胶相图检测：
聚合物溶液的凝胶转变温度通过试管倒置法测试。首先，配制好浓度为6wt％，8wt％，10wt％，12wt％的聚氨基酸溶液，在0℃充分溶解。然后将聚氨基酸溶液0.5mL转移到直径为11mm的小管，放置在水浴中。整个测试过程的升温速率为1℃/min，每个温度下保持10分钟。在某个温度下，倒置试管，如果聚氨基酸溶液在30秒内不发生流动，则认为其发生了凝胶转变。每个样品平行测试三次。
采用上述方法对实施例2和对比例制得的总计四种聚氨基酸分别进行检测，其水凝胶的相位转变图如图3所示。从图3中可以看出，本发明制得的aPEG-PELG-KGN和RGD-PEG-PELG-KGN以及对比例制得的RGD-PEG-PELG13都可以在不同的温度发生溶液向胶态的转变，且相转变温度随着聚氨基酸浓度的增加而降低。而且，从图中可以看出，8wt％的功能化聚氨基酸溶液具有较适宜的液-胶转变温度：33℃，因此该浓度的功能化聚氨基酸凝胶更适合生物体内应用。
注：PPG：aPEG-PELG13；PPG-K：aPEG-PELG-KGN；
R-PPG：RGD-PEG-PELG13；R-PPG-K:RGD-PEG-PELG-KGN。
动态流变学分析：
使用MCR 301流变仪(Anton Paar)，测试条件为应变幅度为1％，角频率为1rad/s，升温速率为0.5℃/min。对实施例1制得的四种聚氨基酸按照上述方法进行动态流变学分析，其分析结果如图4所示。
通过动态流变学分析可以得到储能模量G′，当储能模量随着温度骤然增大时，所对应的温度极为凝胶的相转变温度。aPEG-PELG13以及3种功能化aPEG-PELG13溶液的储能模量在20℃左右时突然增加，表明其由溶液转变为凝胶状态。而且，从图4中可以看出，8wt％四种溶液在10～50℃的升温过程中，aPEG-PELG13以及三种功能化聚氨基酸水凝胶的储能模量虽然不相同(按照从大到小的顺序依次为：aPEG-PELG13，aPEG-PELG-KGN，RGD-PEG-PELG-KGN，RGD-PEG-PELG13)，但却十分接近。这表明KGN和RGD的加入对aPEG-PELG13的凝胶强度没有显著影响。
体外降解实验：
水凝胶在体内的降解主要是通过表面的溶蚀和聚合物的降解来实现的。体内环境除了有多种酶以及其他因子可能促进降解，因此为了更好的模拟体内降解的过程，我们在降解环境中加入蛋白酶K溶液。首先将聚氨基酸分别溶解于水中，在0℃充分溶解，制备成8wt％的聚合物溶液。然后取0.5mL置于2ml玻璃瓶中，在37℃放置10分钟，使其成胶。加入3mL浓度为4U/mL的蛋白酶K，和0.05mol的Tris-HCl缓冲溶液(pH＝8.6)；空白的Tris-HCl缓冲溶液作为对照组，然后在设定的时间间隔内，取出降解介质后对凝胶进行称重，然后加入新的降解介质。实验平行进行三次。
采用上述方法对实施例2制得的未修饰的聚氨基酸aPEG-PELG13和功能化聚氨基酸RGD-PEG-PELG-KGN分别进行检测，其检测结果如图5所示。从图5中可以看出，不含蛋白酶K，仅用Tris-HCl缓冲溶液作为降解液的aPEG-PELG13和RGD-PEG-PELG-KGN凝胶组仅分别有15.1％和14.5％的质量损失，而蛋白酶K处理组在第16天，aPEG-PELG13和RGD-PEG-PELG-KGN凝胶组的质量损失高达85.5％和76.4％。这和蛋白酶K能有效促进酰胺键和酯键的降解有关，同时也说明聚氨基酸水凝胶在不加入细胞培养或者体外无酶环境中具有良好的稳定性。
其次，水凝胶必须具有合适的降解时间，降解太快不利于包裹的种子细胞增殖和分化，降解太慢不利于新生组织的长入，修饰了KGN和RGD的聚氨基酸的降解速度大大减缓，比未修饰的聚氨基酸更适宜体内使用。
体外释放能力检测：
本发明研究了实施例2制得的功能化聚氨基酸RGD-PEG-PELG-KGN所形成的凝胶在体外KGN的释放行为，以此说明本发明制得的功能化聚氨基酸的结构对药物释放速率的影响。
检测方法为超微量紫外光分光光度计法，控制凝胶浓度在8.0wt％。
对照组：未加蛋白酶K；实验组：加入蛋白酶K。
如图6所示，随着时间的推移，对照组和实验组检测出的KGN的含量均持续上升，这说明对照组和实验组都表现出持续的释放KGN能力，从而证明本发明制得的功能化聚氨基酸以凝胶形式应用时能持续释放KGN，从而起到治疗作用。
对比对照组和实验组的数据可以看出，实验组的释放速度和释放出的KGN总量都显著优于对照组。若是将KGN简单地包裹于聚氨基酸凝胶中，那么KGN和凝胶之间的作用力是简单的分子间的束缚力，它是一种低水平的作用力，释放速度一定快。而本发明是将KGN通过共价键结合到聚氨基酸上，作用力强，因此凝胶中KGN的释放需要破坏酰胺键和酯键，加入蛋白酶K可以破坏聚氨基酸的结构，故对照组和实验组的数据有显著差别。
生物相容性检测：
准备工作：PBMSCs与聚氨基酸水凝胶复合。
低温(4℃)配置aPEG-PELG-KGN，RGD-PEG-PELG13，RGD-PEG-PELG-KGN的聚氨基酸水凝胶，然后向三种水凝胶中分别加入PBMSCs细胞，磁力搅拌器搅拌直至水凝胶溶液均匀，得到5×106/mL的PBMSCs细胞悬液，混匀后，取100ul放置于微型培养皿中，放置于37℃培养箱15分钟，待成胶后加入10％FBS的α-MEM培养基3ml，后续培养按照下述方案进行。
(1)、PBMSCs在聚氨基酸水凝胶中的增殖。
培养方案：用含10％FBS的α-MEM培养基培养，培养第三天换液，继续用同种培养基继续培养。
采用CCK-8法(Cell Counting Kit-8)测定细胞增殖：在体外培养的不同时间点，如1，5，7天时，吸净培养基，PBS轻柔浸洗2min；每个培养皿中加入100μl CCK-8以及900μl同种培养基，37℃孵育3h；孵育液移入96孔板，酶标仪设定450nm波长测定孵育液吸光度。
如图7所示，细胞在在三种不同成分聚氨基酸水凝胶体外培养1周期间均保持良好增殖，从而说明本发明制得的聚氨基酸具有良好的生物相容性。
通过将三者数据分别进行对比则可以看出，每次检测时，RGD-PEG-PELG-KGN凝胶中的细胞数量明显多于aPEG-PELG-KGN凝胶中的细胞数量，说明细胞在这两种凝胶中的增殖速率与在aPEG-PELG-KGN凝胶中的增殖速率有明显差异(统计分析结果也显示n＝3，p<0.05)，但RGD-PEG-PELG-KGN凝胶和RGD-PEG-PELG13凝胶中的细胞数量相差不大，说明细胞在这两种凝胶中的增殖速率无明显差异(统计分析结果也显示n＝3，p>0.05)。这一结果说明RGD肽链能促进细胞增殖。
注：统计分析方法为t-检测。
(2)、PBMSCs在聚氨基酸凝胶中成软骨能力检测
培养方案：用含10％FBS的α-MEM培养基培养，接种次日换液；培养第三天改用兔成软骨诱导培养基(RASMX-90041；Cyagen Biosciences Inc.)进行成软骨诱导培养，每三天更换培养基。
DNA含量测定：体外培养3、14、21天后，吸净培养液，PBS浸洗5min，吸净PBS；加木瓜蛋白酶裂解液(木瓜蛋白酶125μg/ml，0.1M乙酸钠，5mM L-半胱氨酸盐酸，0.05M EDTA；pH＝6.0)入培养皿中，移去裂解液入EP管中；60℃水浴裂解48小时；取20μl裂解液，加200μlHoechst-33258(2μg/ml)，37℃避光孵育1h；多酶标仪设定360nm，发射光460nm测定裂解液荧光强度；用小牛胸腺DNA标准品(Sigma)作DNA浓度与荧光强度的标准曲线；根据标准曲线计算裂解液的DNA含量；
GAG含量测定：取上述裂解液20μl，加入200μl DMMB(1，9-二甲基亚甲蓝)，室温孵育30min；酶标仪设定525nm波长测定孵育液吸光度；用硫酸软骨素标准品(Sigma)作出浓度与吸光度的标准曲线；根据标准曲线算出待测支架裂解液的GAG含量；GAG含量与同一样本的DNA含量的比值作为细胞分泌GAG含量。
如图8所示，在体外成软骨诱导培养21天后凝胶中细胞DNA含量较第14天增多。其中，RGD-PEG-PELG13凝胶的细胞DNA含量为最高，RGD-PEG-PELG-KGN次之，而aPEG-PELG-KGN凝胶的DNA含量最少。这是由于RGD被引入聚氨基酸后增加了细胞增殖速度，但是KGN被加入RGD-PEG-PELG13后，即RGD-PEG-PELG-KGN的DNA含量反而减少，这可能与KGN诱导PBMSCs向软骨细胞分化有关，因为处于分化功能状态的细胞其细胞增殖是减弱的。
与此同时，DMMB法检测GAG发现(如图9所示)，在体外培养21天时，RGD-PEG-PELG-KGN和aPEG-PELG-KGN凝胶所产生的GAG随着时间软骨诱导时间增加而增多，且RGD-PEG-PELG-KGN和aPEG-PELG-KGN凝胶所产生的GAG在各时间点都多于RGD-PEG-PELG13。同样，我们注意到RGD-PEG-PELG-KGN和aPEG-PELG-KGN凝胶产生的GAG含量无显著差异(n＝3,P>0.05)。结合同时间点的DNA含量检测结果，不含KGN的RGD-PEG-PELG13组的DNA含量最高而GAG却最少，这与前述的原因相同，RGD-PEG-PELG13组的PBMSCs无明显基质分泌，因此非软骨细胞状态，而是处于细胞增殖状态。相比之下，KGN的加入增加了软骨基质GAG的分泌。
综合DNA和GAG的结果分析，RGD-PEG-PELG-KGN同时具有最佳的促进细胞增殖以及软骨诱导能力，因此是一种理想的组织工程凝胶。
(3)、免疫荧光检测
培养方案同(2)。
固定：成软骨诱导培养3周后，取出支架PBS浸洗，4％多聚甲醛固定60min；封闭：PBS冲洗30min；10％FBS封闭2h；一抗孵育：小鼠抗兔Ⅱ型胶原抗体(1:200稀释)4℃过夜孵育，PBS浸洗20min×3次；二抗孵育：Alexa 488标记的羊抗小鼠二抗孵育(1:800稀释)，室温4h，PBS浸泡，避光4℃过夜；PBS冲洗10min×3次；复染细胞核：Hoechst-33258工作液1500μl，室温30min；检测：PBS冲洗10min×2次，激光共聚焦显微镜观测。
如图10所示，体外成软骨诱导3周后，三组细胞均显示高强度COL2表达，细胞核(蓝色)，COL2(红色)，叠加图(紫色)，PBMSCs为类圆形，其周围发现均匀的高强度细胞外COL2表达。RGD-PEG-PELG-KGN组和aPEG-PELG-KGN组的COL2荧光强度显著强于RGD-PEG-PELG13组，后者几乎无明显COL2表达。同时我们还发现体外培养三周后，RGD-PEG-PELG-KGN组的细胞数多于aPEG-PELG-KGN组，细胞均匀分布。
这些结果提示RGD-PEG-PELG-KGN具有良好的支持PBMSCs成软骨分化并维持软骨表型的生物活性。
实施例2至实施例4的制备步骤与实施例1基本相同，区别仅在于工艺参数有所差别，如表1至表3所示。
表1各实施例S1的工艺参数
表2各实施例S2的工艺参数
表3各实施例S3的工艺参数
综上所述，本发明提供了一种连接有KGN的聚氨基酸，它可以在33℃左右形成稳定的凝胶，因此便于在低温状态和细胞混合并用于体内注射。该凝胶具有良好的生物可降解性，适宜体内使用。对于包裹其中的间充质干细胞能够促进细胞增殖，以及向软骨细胞分化。因此，本发明制得的功能化聚氨基酸所形成的凝胶是一种优良的软骨诱导因子缓释结构和种子细胞载体。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.功能化聚氨基酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、合成聚氨基酸aPEG-PELG13：
合成端氨基烯丙基聚乙二醇：aPEG-NH2；
将aPEG-NH2作为引发剂引发γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐开环聚合得到烯丙基聚乙二醇-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，即聚氨基酸aPEG-PELG13；
S2、合成功能化聚氨基酸aPEG-PELG-KGN：
将aPEG-PELG13和Kartogenin分别溶于N,N-二甲基甲酰胺中，配制得到聚氨基酸溶液和KGN溶液，将KGN溶液经EDC/NHS活化，然后在冰水浴中滴加到聚氨基酸溶液中，并进行搅拌，在聚氨基酸一端修饰上KGN，得到功能化聚氨基酸aPEG-PELG-KGN。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括S3：合成功能化聚氨基酸RGD-PEG-PELG-KGN，所述S3包括如下步骤：
将aPEG-PELG-KGN、CRGD肽、偶氮二异丁腈溶于N,N-二甲基甲酰胺中，除氧后，在氮气保护下加热进行反应，aPEG-PELG-KGN的烯丙氧基参与反应，在aPEG-PELG-KGN的一端修饰上RGD，得到功能化聚氨基酸RGD-PEG-PELG-KGN。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在S2中，
所述aPEG-PELG13和所述KGN的用量比为(4.3～5)：1，优选为(4.54～4.55)：1。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，S2中还包含纯化步骤，此时所述S2按照如下方式进行：
将2.5～3.0g aPEG-PELG13溶于25～30 mL N,N-二甲基甲酰胺中，配制成聚氨基酸溶液，将0.55～0.60g Kartogenin溶于15～20 mL N,N-二甲基甲酰胺中，配制成KGN溶液；
将KGN溶液经EDC/NHS活化，然后在冰水浴中滴加到聚氨基酸溶液中，搅拌3～4天后，用截留量为3000的透析袋在水中透析3天，每6小时换一次水，得到aPEG-PELG-KGN；优选地，所述EDC/NHS活化中，EDC和NHS的用量比为(1.6～1.7)：1.2。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在S3中，所述aPEG-PELG-KGN、CRGD肽、偶氮二异丁腈的用量比为(79～82)：(58～62)：(3～4)，优选为80:60:3。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，S3中还包含纯化步骤，此时所述S3按照如下方式进行:
将2.0～2.5g aPEG-PELG-KGN、1.5～1.6gCRGD肽和75～80mg偶氮二异丁腈溶于N,N-二甲基甲酰胺中，放入安全瓶中在液氮条件下冷冻后用高压油泵抽至少20min，充入氮气保护，融化后再抽至少20min，重复3次以除去其中的氧气，然后氮气保护下加热至65～70℃并进行搅拌，反应3～4天后，将产物依次进行沉降、抽滤、透析，得到RGD-PEG-PELG-KGN；优选地，所述透析采用截留量为3000的透析袋进行，透析时间为3～4天。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S1按照如下方式进行：
10～15g aPEG-NH2和1000mL干燥的甲苯在130℃下共沸除去aPEG-NH2中的水分，然后抽干甲苯，加入15～22.5gγ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐和150mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺，氮气保护下在25℃反应5～6天，产物经沉降、干燥得到aPEG-PELG13。
8.根据权利要求1～7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述合成aPEG-NH2的步骤包括：
将分子量为2000的aPEG、甲苯磺酰氯和氢氧化钾混合，加入二氯甲烷后在室温下搅拌反应，然后用饱和食盐水洗涤，将下层有机相依次进行干燥、过滤、沉降、抽滤，得白色粉末固体；
将白色粉末固体、氯化铵和氨水溶解，室温下搅拌反应5天，将产物依次进行萃取、饱和食盐水洗涤、干燥、沉降，得到aPEG-NH2；优选地，所述aPEG、甲苯磺酰氯和氢氧化钾的用量比为(15～20):(7～11):(1.3～1.6)，最优选为20:9.5:1.68。
9.一种功能化聚氨基酸，其特征在于，采用权利要求1～8任一项所述制备方法制备而成。
10.一种功能化聚氨基酸水凝胶，其特征在于，采用权利要求9所述的功能化聚氨基酸制得；优选地，所述水凝胶的质量分数为4～10％。
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