CN104403107A - 一种改性阳离子聚氨基酸及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种改性阳离子聚氨基酸，所述的改性阳离子聚氨基酸为将低分子量聚乙烯亚胺接枝到聚乙二醇-聚赖氨酸形成的三元共聚物，所述的低分子聚乙烯亚胺的数均分子量为0.6~1.8KD，所述的低分子量聚乙烯亚胺与聚乙二醇-聚赖氨酸的重量比为3~6:1。本发明提供的改性阳离子聚氨基酸具有良好的细胞内质子缓冲能力，可降低原有核酸载体聚乙二醇-聚赖氨酸的毒性，同时提高了细胞转染的效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种高分子生物材料，更具体地，涉及一种改性阳离子聚氨基酸及其制备方法和应用。
背景技术
基因治疗被认为是治疗癌症等致命疾病最有希望的新方法之一。在过去的二十年里得到了广泛的关注。尽管最近这几年该领域取得了比较大的进展，但人类基因治疗还是遇到了一些瓶颈，目前缺乏合适临床应用的高效安全的载体仍然是最大的挑战。迄今为止，基因传输载体研究主要集中在两大类：病毒载体，如(腺病毒，逆转录病毒，疱疹病毒等)，和非病毒载体，包括阳离子脂质体和阳离子聚合物等。值得注意的是目前最有希望用于临床基因治疗的载体是非病毒载体-阳离子聚合物，具有诸多病毒载体和非病毒型阳离子脂质体等所没有的优点，如无免疫原性，高效，结构可调并可修饰靶向配体等。这些阳离子聚合物与pDNA复合成纳米颗粒，可有效地保护pDNA免受体内外酶的降解，并通过内吞的途径将基因传输到靶细胞。
现有大多数用于基因载体的阳离子聚合物骨架在生理环境下是不可降解的，在细胞和组织中容易蓄积，引起毒性反应。聚乙烯亚胺(简称PEI)、聚赖氨酸(简称PLL)的优缺点都已经非常明确，是目前应用性较强的载体聚合物，可以用以制备合成具有多方面优良性能的基因载体：PEI组分与质粒DNA(简称pDNA)的亲和性好，有利于复合凝集DNA，同时PEI独特的“质子海绵”功能使得聚合物基因载体与DNA形成的复合物在酸性溶酶体内可以迅速发生分子链构象变化，渗透压升高导致溶酶体破坏，释放DNA分子；聚旋赖氨酸(简称PLL)的伯胺基有较强的质子化能力，高分子量PLL(Mw≥25kDa)与聚乙二醇(简称PEG)共聚得到的PLL-PEG能减少与非特异性蛋白的吸附及聚集，降低细胞毒性，加之PLL组分的可降解性使聚合物基因载体发挥传输作用后，能降解为低分子量的水溶性PEI、PEG等小分子物质经肾脏排出体外，这样就不会蓄积在体内产生毒性；PEG组分在粒子表面形成水溶性的保护壳层，从而屏蔽PEI的正电荷，降低载体的阳离子毒性，但是PEG的分子量及接枝率对PEI-g-PEG的毒性影响较大，一般情况下，PEG相对分子质量大于5000时，PEI-g-PEG与DNA的复合物毒性显著降低，当小于550时，复合物的毒性改善不明显，同时PEG组分还可以增强载体对DNA分子的保护作用使其在传输过程中不被酶类降解，提高纳米粒子在血液中的稳定性，减少聚集，延长粒子的体内循环时间，这些因素都有利于获得更好的基因传输效率，同时也提高了载体的应用安全性。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有基因输运载体材料方面的不足，提供一种在细胞内微酸环境下具有质子缓冲能力的含有非离子聚乙二醇(简称PEG)、阳离子聚合物线性聚乙烯亚胺(简称IPEI)、可降解聚赖氨酸(简称PLL)组分的三元共聚物基因载体材料以及其靶向化载体材料，用于基因质粒的细胞内高效输运。
具体方案如下：
本发明首先提供一种改性阳离子聚氨基酸，所述的改性阳离子聚氨基酸为将低分子量聚乙烯亚胺接枝到聚乙二醇-聚赖氨酸形成的三元共聚物，所述的低分子聚乙烯亚胺的数均分子量为0.6～1.8KD，所述的低分子量聚乙烯亚胺与聚乙二醇-聚赖氨酸的重量比为3～6:1。
所述的聚乙二醇-聚赖氨酸中，聚赖氨酸段的数均分子量为5～8KD，聚乙二醇段的数均分子量为1.0～2.0KD。
本发明提供的改性阳离子聚氨基酸具有良好的细胞内质子缓冲能力，可降低原有核酸载体聚乙二醇-聚赖氨酸的毒性，同时提高了细胞转染的效率。
本发明将三元共聚物分别和报告基因质粒pEGFP、荧光素酶基因质粒pGL3复合，通过酸碱滴定实验检测了聚合物基因载体的质子缓冲能力、通过凝胶阻滞电泳实验、粒径与电位的测定、DNase-I稳定实验等方法观察了PPI/pDNA的复合效果，并且检测了复合物对人肝癌细胞系(简称HepG2)，人胶质瘤细胞系(简称U251)，仓鼠肾成纤维细胞系(简称BHK-21)细胞的毒性、转染效果及pGL3的表达情况。
本发明证实了三元共聚物基因载体PPI能高效复合凝集pDNA，选择合适的聚合物PPI3，进行叶酸靶向修饰，完成治疗基因TRAIL作用于Bel7402细胞，获得较好的细胞凋亡和细胞生长抑制效果。系统探讨了生物可降解聚合物基因载体PPI在肿瘤基因治疗中应用的可行性，有望为肿瘤基因治疗提供一个安全高效的载体技术平台。
根据需求，提供上述的改性阳离子聚氨基酸在制备核酸载体中的应用。
根据需求，提供上述的改性阳离子聚氨基酸在制备基因药物的包覆载体中的应用。
更进一步提供上述的改性阳离子聚氨基酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1.端氨基聚乙二醇单甲醚的制备，
S2.N-ε-苄氧羰基赖氨酸酸酐的制备，
S3.聚乙二醇-聚赖氨酸的合成：将S1所得的端氨基聚乙二醇单甲醚与S2所得的N-ε-苄氧羰基赖氨酸酸酐，在DMF溶剂和惰性气体的保护下，反应，提纯记得；
S4.短链线性聚乙烯亚胺的合成
S5.N-Boc保护的聚乙烯亚胺的合成及端羟基的CDI活化
S6.三元共聚物的合成：将S3所得的聚乙二醇-聚赖氨酸溶于二甲亚砜溶液中，然后将S5所得的聚乙烯亚胺溶于氯仿溶液，然后将氯仿溶液缓慢滴加如二甲亚砜溶液中，搅拌，提纯即得。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
在肿瘤基因治疗中，必须考虑以患者的可耐受毒性剂量为前提，如果载体毒性太大，就不能降解成易于排出体外的小分子，那麽就只能使用低剂量治疗，不能获得理想疗效。本专利中报道的阳离子三元共聚物载体材料具有生物可降解性、不引起累积毒性，安全性好，制备工艺简单、无污染等优良性能和相比较商用基因载体更高的转染效率。
附图说明
图1.聚乙二醇-聚赖氨酸(简称PPL)和聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇-聚赖氨酸的三元共聚物(简称PPI)以重水为溶剂的核磁氢谱图。
图2.聚乙二醇-聚赖氨酸(简称PPL)和聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇-聚赖氨酸的三元共聚物(简称PPI)以pH4.5醋酸钠/醋酸溶液为流动相的凝胶渗透色谱检测聚合物分子量分布。
图3.检测同一浓度下聚乙二醇-聚赖氨酸(简称PPL)和聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇-聚赖氨酸的三元共聚物(按照聚乙烯亚胺不同接枝量分为PPI1,PPI2,PPI3)以及商用22KDa线性聚乙烯亚胺和空白对照150mM氯化钠溶液的质子缓冲能力对比图。
图4.聚乙二醇-聚赖氨酸(简称PPL)和聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇-聚赖氨酸的三元共聚物(按照聚乙烯亚胺不同接枝量分为PPI1,PPI2,PPI3)与质粒DNA的纳米复合物PPL/pDNA,PPI1/pDNA,PPI2/pDNA,and PPI3/pDNA在不同氮/磷比(N/P)下的粒径(A)和zeta电位(B)。
图5聚合物/质粒DNA纳米复合物对DNase-I酶的稳定性。条带1:裸pDNA；条带2:PPI3/DNA；条带3:PPI2/DNA；条带4:PPI1/DNA；条带5:PPL/DNA；条带6:Marker。
图6.采用人肝癌细胞株Bel7402对聚乙二醇-聚赖氨酸(简称PPL)和聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇-聚赖氨酸的三元共聚物(按照聚乙烯亚胺不同接枝量分为PPI1,PPI2,PPI3)的细胞存活率检测。
图7.聚合物凝聚自杀基因质粒(叶酸靶向FA-PPI3/pCMVTRAIL、PPI3/pCMVTRAIL、PPL/pCMVTRAIL)以及聚合物凝聚绿色荧光蛋白报告基因质粒(叶酸靶向FA-PPI3/pEGFP、PPL/pEGFP)和裸自杀基因质粒(pCMVTRAIL)促进人肝癌细胞Bel7402凋亡的检测。
图8.聚合物凝聚自杀基因质粒(叶酸靶向FA-PPI3/pCMVTRAIL和PPI3/pCMVTRAIL)以及聚合物凝聚绿色荧光蛋白报告基因质粒(叶酸靶向FA-PPI3/pEGFP)和裸自杀基因质粒(pCMVTRAIL)对人肝癌细胞Bel7402存活率检测。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。本发明基于合成了不同分子量组成的lPEI、PLL和PEG的三元共聚物可降解基因载体mPEG-b-PLL-g-lPEI，分别和报告基因质粒pEGFP、荧光素酶基因质粒pGL3复合，观察在HepG2，U251和BHK-21细胞中的转染情况。聚合物基因载体mPEG-b-PLL-g-lPEI能高效复合凝集pDNA，PEI组分的“质子缓冲功能”在肿瘤细胞内能快速释放DNA分子；PLL组分的可降解性使聚合物基因载体发挥作用后，能降解为低分子量的水溶性PEI、PEG等小分子物质经肾脏排出体外，这样就不会蓄积在体内产生毒性；PEG组分可以屏蔽正电荷从而降低载体的阳离子毒性，增强载体对DNA分子的保护作用，还可提高纳米复合物在血液中的稳定性，使得DNA在传输过程中不被酶类降解，延长了纳米复合物的体内循环时间，这些因素有利于获得更好的基因传输效率，有望为肿瘤基因治疗的研究领域提供一个安全高效的载体技术平台。为了进一步研究新型基因传输载体PPI的性能，叶酸靶向配体被连接到共聚物PPI上，用来将目的基因高效传输到叶酸富集的人肝癌细胞株(简称Bel-7402)进行体外的细胞毒性实验。在本发明专利中，所设计的阳离子聚合物载体的基因传输效率不仅用报告基因进行检测，而且还被用来传输治疗基因，TNF相关的诱导凋亡配体基因(TRAIL),从而评价阳离子聚合物PPI的传输性能。TRAIL基因早已被用于临床肿瘤治疗，显示出诱导肿瘤凋亡的效果，而对正常组织没有毒性。
实施例1.三元共聚物可降解核酸载体mPEG-b-PLL-g-lPEI的制备
1.1 端氨基聚乙二醇单甲醚(mPEG-NH2)的制备：
称取20g聚乙二醇单甲醚于250mL干燥的三口瓶中,120℃抽真空干燥4h,然后加入100mL无水二氯甲烷、50mL吡啶和5g对甲苯磺酰氯(TsCl),室温下避光反应24h。反应液用3mol/L HCl萃取洗涤,有机层用5g NaHCO3洗涤、过滤；除去溶剂,得mPEG-对甲苯磺酸酯粗品,用8mL THF溶解,将溶液慢慢滴加到过量的无水乙醚中得白色沉淀,干燥,得mPEG-对甲苯磺酸酯纯品18.6g,产率为87％。将18g MPEG-对甲苯磺酸酯与250mL浓氨水置于1000mL圆底烧瓶中,于室温下反应24h。反应结束后,用同体积的CH2Cl2萃取,得mPEG-对甲苯磺酸氨盐/CH2Cl2溶液,与同体积1mol/L NaOH充分搅拌2h,有机层用水洗至中性,以得到自由氨基产物mPEG-NH2,产率为84％,用核磁计算氨基转化率为75％。
1.2 N-ε-苄氧羰基赖氨酸酸酐(简称Lys(Z)-NCA)
10.0g Lys(Z)悬浮到80mL四氢呋喃中，氩气保护，加热到55℃。5.6g(0.019mol)三聚光气溶解在20mL四氢呋喃中，在20min内慢慢滴加到反应瓶中。等反应混合物变透明后，在55℃使反应熟化1小时，通入干燥的氩气鼓泡2小时，除去生成的HCl。过滤除去少量不溶物，把滤液沉淀至大量四氢呋喃/石油醚(1/3)的混合中。把Lys(Z)-NCA在四氢呋喃/石油醚混合物中重结晶三次。得晶体状产物，产率90％。
1.3 聚乙二醇-聚赖氨酸的合成
4.0g(0.013mol)Lys(z)-NCA溶解在20mL无水DMF中。1.0g氨基-聚乙二醇(0.4mmol)溶解在10mL无水DMF中，加入到盛有NCA的三口烧瓶内。氩气保护，在40℃下反应72h，。沉淀至大量无水乙醚中，过滤，室温真空干燥。得固体产物，产率85％。
3.0g PEG60-P(Lys(Z))溶解到15mL冰醋酸中，加入15mL HBr/AcOH(40％HBr)。搅拌1小时，沉淀至大量的无水乙醚中，过滤，室温真空干燥，得淡黄色粉末。
1.4 短链线性聚乙烯亚胺的合成
把1g对甲苯磺酸甲酯加入三口瓶中，室温下真空干燥8h，加入15mL新蒸馏的乙腈溶解，加入6mL 2-乙基-唑啉(EOX)，在氩气保护下，80-82℃回流搅拌反应72h；旋转蒸发抽干乙腈后溶于10mL三氯甲烷中在沉淀在50mL冷乙醚中，得到油状沉淀，过滤干燥得淡黄色结晶状固体聚(2-乙基-唑啉)。把4g聚(2-乙基-唑啉)加入到三口瓶中，加入20mL10％盐酸，在氮气保护下100℃搅拌回流12h，反应体系逐渐变为乳白色；冷却后用氢氧化钠把pH值调至12，乳白色悬浮物在由澄清又恢复成乳白色的悬浮物，在12000rpm转速下离心5min，取下沉淀，用蒸馏水重复洗涤三次并离心得沉淀，经冻干后得淡黄色的固体1.2g。(产率71％)
1.5 N-Boc保护的聚乙烯亚胺的合成及端羟基的CDI活化
将一定量的线性聚乙烯亚胺溶于干燥的二氯甲烷中，加入三乙胺(相当于线性聚乙烯亚胺中仲胺的1.1倍量)并在室温搅拌30min，之后缓慢滴加叔丁氧羰基酸酐(Boc2O，相当于线性聚乙烯亚胺中仲胺的1.1倍量)的二氯甲烷溶液。滴毕后，反应物在室温搅拌过夜，旋转蒸发除去溶剂，粗产物复溶于少量二氯甲烷中并沉淀在无水乙醚中。过滤后，产物真空干燥得到白色粉末固体Boc-lPEI(产率50％)。
Boc-lPEI的氯仿溶液在氮气氛下缓慢滴加到N,N’-羰基二咪唑(CDI，过量)的氯仿溶液中，室温搅拌7h后，将氯仿部分蒸干，沉淀于无水乙醚中，得到CDI活化的Boc-lPEI。产物直接用于下步反应。
1.6 三元共聚物(mPEG-b-PLL-g-lPEI)的合成
将CDI活化的Boc-lPEI溶解在10mL的氯仿中，此溶液用恒压滴液漏斗缓慢滴加到二元嵌段共聚物0.1g PEG-P(Lys)-AC的二甲亚砜溶液中，然后在室温下搅拌过夜，此溶液沉淀在无水乙醚中，过滤并用无水乙醚洗涤三次，将得到黄色固体产物溶于少量氯仿中用3500Da透析袋透析24h，得到最终的产物。
将产物溶于无水乙酸乙酯中，搅拌使得反应物分散在体系中后通入氯化氢气体2h，反应结束后将反应物滴加到大量无水乙醚中，过滤沉淀物并溶解在水中，滴加三乙胺调节pH值至中性。用3500Da透析袋在水中透析48h，产物冻干后，将产物放于-20℃备用。如图1和2所示，阳离子三元共聚物结构表征清晰。
实施例2.质子缓冲能力检测
如图3所示，三元共聚物(mPEG-b-PLL-g-lPEI)基因载体在pH值11-3范围内质子化而形成正电荷的能力由酸碱滴定检测。通常的方法如下，10mg的聚合物和25k聚乙烯亚胺(做对照)溶解于10mL的150mM的氯化钠溶液，用1N氢氧化钠溶液滴定至溶液呈pH值为11，然后此溶液用1.5N氯化氢水溶液滴定至pH值为3，并用全自动电位滴定仪记录加酸的体积以及对应的pH值。
实施例3.聚合物/质粒DNA复合物的制备
如图4所示，质粒DNA(5μg)和适量的载体聚合物(PEG-b-PLL-g-lPEI或PEG-b-PLL)分别溶解在0.9％的氯化钠溶液中。按照聚合物中氨基与质粒DNA磷酸根的摩尔比为1:1、2:1、4:1、5:1、8:1、10:1、20:1、30:1比例混合。用去离子水补至实验所需体积，混匀后在摇床上振荡30min，静置10min，即得到不同比例的复合物溶液。
取不同N/P的纳米复合物，用去离子水稀释至1.5mL，在激光衍射纳米粒度分析仪测量粒径和Zeta电位，入射激光波长λ＝532nm，入射角θ＝90°，温度为25℃，所得数值为3次测量的平均值。
实施例4.聚合物/质粒DNA复合物对DNase-I的稳定性
在N/P＝20时，将聚合物载体分别与1μg质粒DNA(pGL3)溶于pH7.4的PBS缓冲液中，混匀，室温静止30min；加入1unit DNase-I溶液，缓冲液成分是10mM pH 7.6Tri-Cl，2.5mMMgCl2，0.5mM CaCl2，37℃孵育10min；加入5μL 250mM EDTA(pH 8.0)，终止反应10min；加入含1wt％SDS的0.1M NaOH(pH 7.2)溶液，室温2h；1％琼脂糖凝胶，100V电泳1h，结果如图5所示。
实施例5.基因转染
倒掉细胞培养瓶中的培养液，加入1-3ml胰酶消化贴壁细胞，将消化后的细胞转入离心管1000rpm离心8分钟，弃上清，加入10ml无血清DMEM培养基，轻柔吹打细胞，取10μl稀释液进行细胞计数；在24孔培养板中接种DRGs细胞5.0×104/孔，37℃过夜培养，当细胞密度达到70～80％时可进行转染实验；吸除培养基，用D-PBS清洗细胞两次，用适量Opti-MEMI medium稀释不同N/P比(0、1、5、10、20、30)的PEG-PEI/pDNA和Lipo/pDNA，充分混匀，加入到培养孔中，在37℃，5％CO2培养箱中孵育4h；去除转染体系，每孔加入1ml新鲜培养基置于37℃、5％CO2培养箱；在48h时，用倒置荧光显微镜观察报告基因EGFP的表达情况；用D-PBS清洗细胞两次，收获细胞，通过流式细胞仪(FACScan)定量检测EGFP的转染效率。
实施例6.载体聚合物的细胞毒性
将生长状态良好的细胞以8000个/孔的密度接种到96孔板，每孔100μl，37℃，5％CO2过夜培养。第二天用DMEM培养液调整聚合物浓度梯度为100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml，0.01μg/ml，0.001μg/ml，然后分别加入到每孔的细胞中；阴性对照组只接种细胞，不加聚合物；空白对照组只加培养基，不接种细胞；每个浓度3个复孔，在37℃，5％CO2培养箱中继续培养48h。每孔加入10μl MTT溶液，37℃孵育4h。用酶联免疫检测仪监测各孔在OD570nm的吸光度值。取3孔平均值。与正常细胞相比，吸光值高，存活细胞数量多。以空白对照组为基准，计算细胞增殖率，结果如图6所示。
实施例7.叶酸靶向纳米复合物的细胞内吞检测
293T和Bel7402细胞作为叶酸受体过表达细胞，而非叶酸受体HepG2细胞作为负对照，复苏传代4～6代后,生长良好的细胞种植于24孔板(5×104个细胞/孔),24h后转染，分为叶酸靶向组、非靶向组和游离叶酸竞争抑制组3组。转染前换上无叶酸无血清新鲜培养基，游离叶酸竞争抑制组转染前半个小时加入大量游离叶酸(10mmol/L)与细胞共孵育，每细胞孔按NP＝10，将2μg pEGFP-C1质粒、3.6μg叶酸靶向载体(fa-p-p)(靶向组和竞争抑制组)/非靶向载体(p-p)(非靶向组)在0.9％的NaCl溶液中室温复合30min，加入与细胞共孵育。转染6h后，每细胞孔加入100ul正常1640培养基(有叶酸)和10％胎牛血清(FBS)，继续培养72h，倒置荧光显微镜下观察GFP的表达情况，发射强而均匀绿色荧光者为GFP阳性细胞。用0.25％胰酶消化细胞，PBS悬浮洗2次，流式细胞技术分析各组细胞GFP阳性率(％)。结果如图7所示。
实施例8.负载TRAIL基因的纳米复合物诱导细胞凋亡和细胞毒性检测
如图8所示，TUNEL检测方法用来研究TRAIL基因诱导过表达叶酸受体的Bel7402细胞凋亡检测。Bel7402细胞复苏传代4～6代后,生长良好的Bel7402细胞种植于96孔板(1×104个细胞/孔),24h后换成新鲜无叶酸无血清培养基。继续培养24h后转染，每细胞孔按NP＝10，将0.5μg TRAIL基因质粒、0.9μg叶酸靶向载体(Fa-PPI)/非靶向载体(PPI)在0.9％的NaCl溶液中室温复合30min，加入与细胞共孵育，其中以质粒pEGFP-C1为阴性DNA，游离TRAIL基因组直接将0.5μg TRAIL基因质粒加入细胞培养上清。转染6h后，每细胞孔加入50ul正常1640培养基(有叶酸)和10％胎牛血清(FBS)，继续培养36-48h。弃上清，每孔加入MTT液10μL与100μL培养基混合液，同时设置3孔本底，置37℃、5％CO2培养箱中继续孵育4h，弃上清液，加入100μL二甲亚砜(DMSO)溶解，显微镜下观察结晶紫完全溶解后立即用酶标仪在570nm波长处测A值并计算细胞存活率。细胞存活率＝[(实验孔A值-本底孔A值)/(对照孔A值-本底孔A值)]×100％。
Claims (5)
1.一种改性阳离子聚氨基酸，其特征在于，所述的改性阳离子聚氨基酸为将低分子量聚乙烯亚胺接枝到聚乙二醇-聚赖氨酸形成的三元共聚物，所述的低分子聚乙烯亚胺的数均分子量为0.6~1.8KD，所述的低分子量聚乙烯亚胺与聚乙二醇-聚赖氨酸的重量比为3~6:1。
2.根据权利要求1所述的改性阳离子聚氨基酸，其特征在于，所述的聚乙二醇-聚赖氨酸中，聚赖氨酸段的数均分子量为5~8KD，聚乙二醇段的数均分子量为1.0~2.0KD。
3.一种权利要求1所述的改性阳离子聚氨基酸在制备核酸载体中的应用。
4.一种权利要求1所述的改性阳离子聚氨基酸在制备基因药物的包覆载体中的应用。
5.一种权利要求1所述的改性阳离子聚氨基酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1. 端氨基聚乙二醇单甲醚的制备，
S2. N-ε-苄氧羰基赖氨酸酸酐的制备，
S3. 聚乙二醇-聚赖氨酸的合成：将S1所得的端氨基聚乙二醇单甲醚与S2所得的N-ε-苄氧羰基赖氨酸酸酐，在DMF溶剂和惰性气体的保护下，反应，提纯记得；
S4. 短链线性聚乙烯亚胺的合成
S5. N-Boc 保护的聚乙烯亚胺的合成及端羟基的CDI活化
S6. 三元共聚物的合成：将S3所得的聚乙二醇-聚赖氨酸溶于二甲亚砜溶液中，然后将S5所得的聚乙烯亚胺溶于氯仿溶液，然后将氯仿溶液缓慢滴加如二甲亚砜溶液中，搅拌，提纯即得。
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