CN106317416A - 一种双pH响应的两亲性共聚物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

一种双pH响应的两亲性共聚物，分子式为MPEG‑Dliable‑PAE‑g‑Chol，具有如式I所示结构。本发明的共聚物以亲水嵌段单甲氧基聚乙二醇、疏水胆固醇及pH响应嵌段聚(β‑氨基酯)共聚得到，在水溶液中可自组装得到内层为胆固醇修饰的疏水内核、中间为pH敏感响应PAE层、外壳为亲水嵌段MPEG，同时连接亲水外壳和pH敏感中间层的伪同样具有pH敏感性能的苯甲酰亚胺键的纳米级胶束体系，在满足疏水性药物高包载性能、体系结构稳定、较长体内循环时间和中性条件下稳定而在弱酸性条件下药物可控释放的要求下，有效提高了胶束载药体系的细胞摄取量，从而提高了药物的生物利用度、优化了肿瘤的治疗效果。

Description

一种双pH响应的两亲性共聚物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物医药用高分子聚合物材料技术领域，特别涉及一种双pH响应的两亲性共聚物及其制备方法和用途。
背景技术
肿瘤(癌症)是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控导致异常增生与分化而形成的。肿瘤一旦形成，不因病因消除而停止生长，他的生长不受机体正常生理调节，而是破坏正常组织与器官，尤其是恶性肿瘤，与良性肿瘤相比，其生长速度快，呈浸润性生长，易发生出血、坏死、溃疡等，并常有远处转移，造成人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等，最终造成患者死亡。
目前，在全球癌症每年夺去700多万人的生命，癌症已经成为一种严重威胁人类健康的疾病，是继心血管疾病的“第二号杀手”。目前已有的治疗方法，主要分为手术治疗、放射治疗和化学治疗三种，效果最好的当属化学药物疗法。但是化疗药物疗法同样存在一些弊端，虽然其在肿瘤治疗上具有良好的治疗效果，但是临床证明其在杀死肿瘤细胞的同时，也会对人体正常细胞产生很大的毒副作用。况且，现有抗癌类化学药物(例如紫杉醇、阿霉素、喜树碱等)大部分存在水溶性差、疗效低、毒副作用大、肿瘤存在耐药性等缺陷，因而对于化学药物疗法临床上的广泛应用仍面临着巨大的挑战。
针对上述化学药物疗法的不足和缺陷，为了满足抗癌药物在肿瘤细胞组织处能达到有效剂量，同时降低药物对正常组织器官的毒副作用，药物递送体系应运而生，并得到越来越多的关注和研究，特别是最近几十年，随着纳米技术的快速发展，药物递送体系得到了更加深入和全面的研究，作为药物载体的多功能型生物纳米材料(有机或无机材料)层出不穷。药物递送载体可以有效的提高疏水性药物的水溶性，延长药物在血液中的循环时间，提高药物在病灶区域的累积量，降低毒副作用与其他不良反应，实现药物的可控释放，从而达到提高药物治疗效果的目的。在众多药物递送体系中，由两亲性高分子共聚物材料制备而成的药物载体成为一个研究热点。
所谓共聚物相较均聚物(一种单体聚合而成)而言是由两种或两种以上单体聚合所形成的聚合物，其结构中具有至少两种以化学键连接的结构单元，可以通过灵活调控结构单元的种类和含量，从而实现了性能上的拓展和改进。迄今，共聚物在化工、生物、医药等领域都有着广泛的应用。两亲性共聚物在水溶液中可自组装形成具有特殊核/壳结构的胶束体系，胶束内核可通过疏水相互作用有效包载抗癌药物，胶束外壳形成亲水性的外层保护，有效防止药物的降解(水解或酶解)，其粒径大约在10～200nm之间，大小与人体内多数大蛋白粒径接近，因此可以有效避免体内免疫系统的排斥。而且，通过多种化学反应，可以对胶束载体进行多功能化修饰，例如，在外部壳层接枝具有靶向作用的功能基团(叶酸、寡糖、RGD等)，从而实现载药递送体系的主动靶向功能，此外，可以通过调整两亲性共聚物结构中的亲疏水嵌段比例，优化胶束核壳结构，提高药物递送体系的稳定性。胶束药物递送体系可有效提高药物的水溶性，避免体内网状内皮系统(RES)及肝脾等组织的排除和吸收，提高药物递送体系体内循环时间及在病灶部位的累积量，从而实现高效的药物递送和安全治疗。但是，近期研究表明，亲水性的外壳在给药物递送体系提供保护作用的同时，也抑制了肿瘤细胞对药物体系的摄取作用(胞饮作用、吞噬作用等)，降低了进入细胞内的药物量，从而弱化了药物的疗效。
综上所述，需要开发一种理想的纳米药物载体，其制备提纯简便，具有较高的药物包载效率，良好的生物相容性，能有效的提高药物的生物利用度，降低毒副作用，从而提高化学疗法治疗肿瘤的效果。
研究已经表明，癌细胞由于较快的细胞分裂，导致无氧呼吸加剧，糖酵解产生大量乳酸，而且，肿瘤过表达的碳酸酐酶能催化二氧化碳和水的反应，形成碳酸，肿瘤微环境中所产生的这些酸性物质使得癌细胞周围环境pH值相对于体内正常值(pH 7.4)偏低，大约在6.5-7.0之间，而细胞内溶酶体和内涵体的pH值更低，大约在5.0-6.5之间。肿瘤的酸性环境可以作为信号用于触发载药胶束的快速药物释放，促进胶束细胞内吞及其细胞器靶向等功能作用。pH响应聚合物胶束作为一种极具发展前景的新型药物输送载体，具有诸多优良的性能特点，如能实现抗癌药物的靶向给药、增强生物利用度、降低对正常组织的毒副作用等。但是，近期研究表明，亲水性的外壳在给药物递送体系提供保护作用的同时，也抑制了肿瘤细胞对药物体系的摄取作用(胞饮作用、吞噬作用等)，降低了进入细胞内的药物量，从而弱化了药物的疗效。综上所述，需要开发一种理想的纳米药物载体，其制备提纯工艺简便，具有较高的药物包载效率，良好的生物相容性，较低的毒副作用，能精准响应微小pH变化，并在不同环境条件下维持较高的稳定性，从而提高化学疗法治疗肿瘤的效果。
Wang等以2-丙酸-3-甲基马来酸酐(CDM)为pH敏感小分子连接亲水嵌段聚乙二醇单甲醚(Methoxypolyethylene glycols,MPEG)和9个精氨酸形成的寡肽(R9)，末端修饰疏水嵌段聚乳酸(PCL)得到具有pH敏感性能的两亲性聚合物聚乙二醇单甲醚-b-寡肽-b-聚乳酸(PEG-Dlinkm-R9-PCL)，其中Dlinkm在肿瘤细胞外环境弱酸(pH 6.5)条件下会发生断裂，从而使MPEG逐渐脱除，所制备的两亲性聚合物可在水溶液中自组装形成纳米胶束体系，用作siRNA的递送(Tumor Acidity-Sensitive Polymeric Vector for Active TargetedsiRNA Delivery.J.Am.Chem.Soc.,2015,137(48),pp 15217–15224)。实验结果表明，在pH6.5的PBS缓冲溶液中，24h时PEG的累计脱除量接近60％，而在pH 7.4的条件下，24h时只有低于20％的PEG累计脱除量，通过生物实验证明，具有PEG脱除功能的siRNA递送体系较无PEG脱除功能的siRNA递送体系能有效抑制肿瘤的生长，提高小鼠的成活率和并延长其生存时间。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的目的之一在于提供一种双pH响应的两亲性共聚物。本发明的双pH响应的两亲性聚合物分子能在水溶液中自组装为结构稳定的纳米胶束，能有效包载水难溶性药物，通过调整聚合物中不同嵌段的比例，可有效调节其pH响应范围，使胶束不但能迅速、精确响应环境pH值的变化，而且能有效的缓解突释，控制药物释放。
为达上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种双pH响应的两亲性共聚物，分子式为MPEG-Dliable-PAE-g-Chol，具有如下式I所示结构：
其中，n＝25～100，x＝5～30。
优选地，所述共聚物的数均分子量为7752～23178g/mol，优选为10768～18043g/mol。
本发明提供的共聚物的结构为：通过反应修饰大分子单体聚乙二醇单甲醚(MPEG)，得到具有pH响应性的亲水大分子单体(MPEG-Dliable)；通过迈克尔加成反应合成大分子单体聚-β氨基酯(PAE)，得到pH响应的大分子单体；通过迈克尔加成反应合成PAE两端修饰MPEG-Dliable的共聚物；通过酰化反应，在PAE侧链修饰疏水性的胆固醇，得到两亲性双pH响应共聚物。
本发明的目的之一还在于提供一种本发明所述双pH响应的两亲性共聚物的制备方法，包括以下步骤：
通过酯化反应采用对醛基苯甲酸修饰末端带有羟基的聚乙二醇单甲醚(MPEG)，得到醛基封端的聚乙二醇单甲醚大分子单体，再通过亲核加成反应与1,3-丙二胺反应，得到具有pH响应性能(苯甲酰亚胺键)的亲水性大分子单体(MPEG-Dliable)；
通过迈克尔加成反应合成具有pH响应性能的大分子单体聚-β氨基酯(PAE)，然后，同样采用此反应在PAE两端修饰MPEG-Dliable单体，得到中间产物；
采用具有疏水性的胆固醇甲酰氯(Chol)与上述中间产物进行醇解反应制备聚乙二醇单甲醚-Dliable-聚-β氨基酯-g-胆固醇(MPEG-Dliable-PAE-g-Chol)。
作为优选，所述方法包括如下步骤：
(1)制备pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Dliable：
a)在惰性气体保护和无水条件下，将催化剂二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)、单体MPEG、小分子单体对醛基苯甲酸(FA)溶于有机溶剂中，优选在搅拌下充分溶解，反应，反应后过滤、浓缩、沉淀、清洗、干燥，得到醛基封端的大分子单体MPEG-CHO；
b)将步骤a)所得MPEG-CHO溶解在无水有机溶剂中，加入二胺，优选在搅拌的条件下充分溶解后反应，反应结束后冷却、浓缩、沉淀、干燥，得到pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Dliable；
(2)制备双pH响应共聚物的中间产物：
a)采用本体聚合的方法，将1,6-己二醇二丙烯酸酯(HDD)和3-氨基-1-丙醇(AP)在惰性气体保护和无水条件下反应，反应后冷却、沉淀、干燥，得到pH响应性嵌段PAE；
b)将步骤(1)所得的MPEG-Dliable单体和上述的PAE溶于无水有机溶剂中，优选在搅拌的条件下混合均匀，在惰性气体保护和无水条件下反应，反应后冷却、沉淀、干燥，得到双pH响应共聚物的中间产物MPEG-Dliable-PAE-Dliable-MPEG；
(3)制备双pH响应的两亲性共聚物：将步骤(2)所制得的双pH响应共聚物的中间产物溶于无水二甲基甲酰胺(DMF)中，依次加入已溶解于无水DMF的催化剂三乙胺(TEA)和DMAP，优选充分搅拌使其混合均匀，将胆固醇氯甲酸酯(Chol)的DMF溶液缓慢加入，惰性气体保护保护下反应，将反应液例如通过离心或过滤除去副产物及杂质，取上层清液透析，除去胆固醇等未反应的原料，将产物冷冻干燥，得到双pH响应的两亲性共聚物。
作为优选，步骤(1)的a)中反应物的摩尔份数如下：
优选地，所述无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿或无水二甲基亚砜中1种或2种以上的组合，优选为无水二氯甲烷(DCM)。
优选地，所述反应的温度为室温，反应的时间为6～36h，优选为24h。
作为优选，步骤(1)的b)中反应物的摩尔份数如下：
MPEG-CHO 0.8～1.3份
二胺 1～2.6份。
优选地，所述无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿或无水二甲基亚砜中1种或2种以上的组合，优选为无水二甲基亚砜(DMSO)。
优选地，所述反应的温度为30～60℃，反应的时间为0.5～6h，优选地，所述反应的温度为40℃，反应的时间为4h；
优选地，所述二胺为1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、1,5-戊二胺，优选为1,3-丙二胺。
作为优选，步骤(1)中所述过滤为采用漏斗，优选布式漏斗过滤收集液体。
优选地，所述沉淀为向浓缩后的溶液中加入10倍体积的0℃异丙醇进行沉淀。
优选地，所述洗涤为采用异丙醇和二乙醚清洗沉淀，得到固体。
作为优选，步骤(2)的a)中反应物的摩尔份数如下：
1,6-己二醇二丙烯酸酯 1～1.1份
3-氨基-1-丙醇 0.9～1份。
优选地，所述反应的温度为80-120℃，优选为100℃；反应的时间为12-48h，优选为24h。
作为优选，步骤(2)的b)中反应物的摩尔份数如下：
PAE 1～1.1份
MPEG-Dliable 0.9～1份。
优选地，所述无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿或无水二甲基亚砜中1种或2种以上的组合，优选为无水二甲基亚砜(DMSO)。
优选地，所述反应的温度为40-80℃，优选为60℃，反应的时间为12～48h，优选为24h。
优选地，步骤(2)中所述沉淀为向冷却后的溶液中加入10倍体积的0℃正己烷进行沉淀。
作为优选，步骤(3)反应物的摩尔份数配方如下：
优选地，所述反应的温度为室温，反应的时间为12～48h，优选为24h。
步骤(3)所述的离心是除去不可溶的三乙胺盐酸盐等杂质，离心条件优选为转速14000rpm、时间2min。步骤(3)所述的透析指将离心所得的上清液置于透析袋中，在介质DMF中透析48h，继而将介质换成去离子水，继续透析48h。
所述的MPEG和Chol其结构式分别如下：
本发明的目的之一还在于提供本发明所述的双pH响应的两亲性共聚物在装载水难溶性药物胶束系统中的用途。
优选地，所述装载水难溶性药物胶束系统由以下方法制备得到：将水难溶性药物溶于有机溶剂中，同时将双pH响应的两亲性共聚物溶于同一种有机溶剂中，待聚合物完全溶解后，将此聚合物溶液与水难溶性药物溶液混合；透析；过滤、冷冻干燥，得到装载水难溶性药物胶束系统。
优选地，所述水难溶性药物指在1L水中溶解度小于或等于1g的药物。
优选地，所述有机溶剂为二甲基亚砜和/或二甲基甲酰胺。
优选地，将水难溶性药物溶于有机溶剂中过夜。
优选地，共聚物溶液与水难溶性药物溶液混合后室温下搅拌，优选搅拌1h以上，更优选搅拌4～6h。
优选地，所述透析采用去离子水进行。
优选地，所述透析的时间为12h以上，优选为24h。
所述的装载水难溶性药物胶束系统可控制装载的药物在正常组织(pH 7.4)处缓慢释放，且长时间累计释放量较低，在肿瘤细胞外弱酸性环境(pH 6.5～7.0)下，亲水性的外壳逐渐脱除，在肿瘤细胞内弱酸性条件(pH 5.0～6.5)处实现快速可控释放，且药物累计释放量较大。
本发明的机理为：
胶束外层亲水性的MPEG具有无毒、无免疫原性和无抗原性等优点，在增加胶束稳定性的同时，延长胶束在血液中的循环时间；疏水胆固醇内核能够增强对难溶药物的包载性能；中间层的PAE在pH 7.4时表现为疏水性，可与胆固醇共同组成胶束的疏水内核，这不仅可以防止药物突释，同时可以增强胶束内核的稳定性；在肿瘤组织处(pH 6.5～7.0)，连接外层MPEG与中间层PAE的苯甲酰亚胺键逐步断裂，使得亲水外壳MPEG逐步脱除，促进药物递送体系通过细胞内吞等作用进入肿瘤细胞，使得细胞摄取量增大；在肿瘤细胞内弱酸性(pH 5.0～6.5)条件下，PAE嵌段中的叔胺基发生质子化作用而表现为亲水性，胶束开始出现一定程度的溶胀；载药胶束若进入具有更低pH的内涵体和溶酶体中，PAE将完全质子化，此时胶束溶胀程度变大，胶束开始出现聚集甚至解离行为，通过“质子海绵效应”将所包载的药物释放到肿瘤细胞中。通过调节聚合物中各嵌段的比例，可以调控药物的释放速率，满足不同药物的释放要求。
本发明相对于现有技术具有如下优点：
(1)本发明的聚合物分子能在水溶液中自组装为结构稳定的纳米胶束，能有效包载水难溶性药物，通过调整聚合物中不同嵌段的比例，可有效调节其pH响应范围，使胶束不但能迅速、精确响应环境pH值的变化，而且能有效的缓解突释，控制药物释放。
(2)本发明的双pH响应的两亲性聚合物分子，能精确响应体内循环过程中环境pH值的变化，在维持药物递送体系结构稳定、延长体内循环时间、增大药物递送体系在病灶部位的累积量的同时，也能有效的提高细胞摄取量，增大药物的生物利用度，优化肿瘤的治疗效果。
(3)经疏水胆固醇修饰后的共聚物对水难溶性药物的包载能力增强，包载效率提高。
(4)本发明制备得到的双pH响应的两亲性共聚物，易于调控各嵌段的比例，应用于制备装载水难溶性药物胶束系统，可满足不同药物的释放要求。
附图说明
图1为实施例1中MPEG-CHO和MPEG-Dliable的1H-NMR图，溶剂为d-CDCl3；
图2其中(A)为实施例1中MPEG-CHO的傅里叶转换红外谱；(B)为实施例1中MPEG-Dliable的傅里叶转换红外谱；
图3为实施例1中PAE的GPC洗脱曲线；
图4为实施例1中PAE的1H-NMR图，溶剂为d-CDCl3；
图5其中(A)为实施例1中PAE的傅里叶转换红外谱；(B)为实施例1中MPEG-Dliable-PAE-Dliable-MPEG的傅里叶转换红外谱；
图6为实施例1中MPEG-Dliable-PAE-Dliable-MPEG的GPC洗脱曲线；
图7为实施例1中MPEG-Dliable-PAE-Dliable-MPEG的1H-NMR图，溶剂为d-CDCl3；
图8为实施例1中MPEG-Dliable-PAE-g-Chol的GPC洗脱曲线；
图9为实施例1中MPEG-Dliable-PAE-g-Chol的1H-NMR图，溶剂为d-CDCl3；
图10为实施例1中MPEG-Dliable-PAE-g-Chol的傅里叶转换红外谱；
图11为实施例1中MPEG-Dliable-PAE-g-Chol在不同pH值条件下的临界胶束浓度测试曲线；
图12为实施例1中MPEG-Dliable-PAE-g-Chol的pKb值的测试曲线；
图13其中(A)和(B)分别为实施例6中MPEG-Dliable-PAE-g-Chol自组装胶束的粒径、zeta电位与pH的关系；
图14为实施例1中MPEG和MPEG-Dliable-PAE-g-Chol在弱酸性条件下孵育不同时间后的GPC洗脱曲线；
图15为实施例6中载阿霉素胶束的体外释放曲线；
图16其中(A)为实施例6中MPEG-Dliable-PAE-g-Chol空白胶束对MDA-MB-231细胞的毒性曲线图；(B)为实施例6中MPEG-Dliable-PAE-g-Chol载药胶束以及有利阿霉素对MDA-MB-231细胞作用24h后的毒性曲线图；(C)为实施例6中MPEG-Dliable-PAE-g-Chol载药胶束以及有利阿霉素对MDA-MB-231细胞作用48h后的毒性曲线图。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1：双pH响应的两亲性共聚物MPEG-Dliable-PAE-g-Chol的制备
(1)制备pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Dliable：在50mL三口圆底烧瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，在一个侧口中接入氮气，另外一个侧口出气，在惰性气体保护和无水条件下，依次将溶剂DCM(15mL)、催化剂DCC(41mg，0.2mmol)、DMAP(6.1mg，0.05mmol)、单体MPEG(80mg，0.02mmol)、小分子单体FA(45mg，0.3mmol)加入瓶中，在搅拌的条件下充分溶解，室温条件下反应24h后，将反应液过滤除去其中沉淀，收集滤液旋转蒸发浓缩后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷异丙醇中，置于冰箱中静止2h，收集沉淀，用异丙醇和二乙醚清洗沉淀，得到固体，在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到醛基封端的大分子单体MPEG-CHO。合成反应式见公式(1)，利用核磁与红外进行检测，见图1中(A)和图2中(A)，产率为95％；于50mL干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，依次用注射器将MPEG-CHO(41.32mg，0.01mmol)和DAP(1.04mL，0.0125mmol)的DMSO溶液(20mL)加入瓶中，在搅拌的条件下充分溶解，在40℃下反应4h，将反应液旋转蒸发浓缩后冷却至室温，将其缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Dliable。合成反应式见公式(1)，利用核磁和红外分析，见图1中(B)和图2中(B)，产率为95％。
(2)制备双pH响应共聚物的中间产物：于50mL干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，冷冻-抽真空-通氮气三次，依次用注射器将HDD(24.6mL，110mmol)和AP(7.61mL，100mmol)加入到反应瓶中，在搅拌的条件下，100℃，反应24h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH响应性嵌段PAE，合成反应式见公式(2)，利用GPC测定其分子量，见图3，利用核磁和红外分析，见图4和图5(A)，产率为90％，Mn＝3300，Mw/Mn＝1.28；将步骤(1)所制得的单体MPEG-Dliable(41.98mg，0.01mmol)加入50mL单口反应瓶中，密封后冷冻-抽真空-通氮气三次，将单体PAE(33mg，0.011mmol)加入无水DMSO(20mL)中充分溶解，用注射器加入到反应瓶中，在搅拌的条件下，60℃，反应24h。将反应液冷却至室温后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到双pH响应共聚物的中间产物MPEG-Dliable-PAE-Dliable-MPEG。合成反应式见公式(2)，利用GPC测定其分子量，见图6，并进行核磁和红外分析，见图7和图5(B)。产率为85％，Mn＝12089，Mw/Mn＝1.36。
(3)制备双pH响应的两亲性共聚物：于50mL的干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通单气-抽真空三次，排除其中氧气。用注射器将步骤(2)所制得的双pH响应共聚物的中间产物(2.217g，0.2mmol)二甲基甲酰胺溶液迅速注入到反应瓶中，加入催化剂TEA(0.42mL，3mmol)和DMAP(61mg，0.5mmol)，搅拌1h使其中分混合均匀。将胆固醇(0.9g，2mmol)二甲基甲酰胺溶液用注射器缓慢滴加到反应瓶中。在室温、氮气保护下反应24h。反应结束后，将反应液在14000rpm转速下离心2min，除去副产物与未反应的原料，取上层清液置于透析袋中(MWCO 3500Da)，透析液采用DMF，透析48h，换液4次，除去胆固醇等杂质，继而将透析液换成去离子水，继续透析48h，换液8次，除去有机溶剂和水溶性杂质，然后收集透析后的溶液，冷冻干燥，得到双pH响应的两亲性共聚物。合成反应式见公式(3)，利用GPC测定其分子量，见图8，并进行核磁和红外分析，见图9和图10。产率为87％，Mn＝14986，Mw/Mn＝1.44。
实施例2：双pH响应的两亲性共聚物MPEG-Dliable-PAE-g-Chol的制备
(1)制备pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Dliable：在50mL三口圆底烧瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，在一个侧口中接入氮气，另外一个侧口出气，在惰性气体保护和无水条件下，依次将溶剂DCM(15mL)、催化剂DCC(51.25mg，0.25mmol)、DMAP(12.2mg，0.1mmol)、单体MPEG(40mg，0.01mmol)、小分子单体FA(75mg，0.5mmol)加入瓶中，在搅拌的条件下充分溶解，室温条件下反应24h后，将反应液过滤除去其中沉淀，收集滤液旋转蒸发浓缩后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷异丙醇中，置于冰箱中静止2h，收集沉淀，用异丙醇和二乙醚清洗沉淀，得到固体，在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到醛基封端的大分子单体MPEG-CHO，产率为90％；于50mL干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，依次用注射器将MPEG-CHO(53.716mg，0.013mmol)和DAP(0.83mL，0.01mmol)的DMSO溶液(20mL)加入瓶中，在搅拌的条件下充分溶解，在40℃下反应4h，将反应液旋转蒸发浓缩后冷却至室温，将其缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Dliable，产率为90％。
(2)制备双pH响应共聚物的中间产物：于50mL干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，冷冻-抽真空-通氮气三次，依次用注射器将HDD(24.6mL，110mmol)和AP(8.371mL，110mmol)加入到反应瓶中，在搅拌的条件下，100℃，反应24h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH响应性嵌段PAE，产率为88％，Mn＝1091，Mw/Mn＝1.30；将步骤(1)所制得的单体MPEG-Dliable(41.98mg，0.01mmol)加入50mL单口反应瓶中，密封后冷冻-抽真空-通氮气三次，将单体PAE(10.91mg，0.01mmol)加入无水DMSO(20mL)中充分溶解，用注射器加入到反应瓶中，在搅拌的条件下，60℃，反应24h。将反应液冷却至室温后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到双pH响应共聚物的中间产物MPEG-Dliable-PAE-Dliable-MPEG，产率为85％，Mn＝9870，Mw/Mn＝1.44。
(3)制备双pH响应的两亲性共聚物：于50mL的干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通单气-抽真空三次，排除其中氧气。用注射器将步骤(2)所制得的双pH响应共聚物的中间产物(1.974g，0.2mmol)二甲基甲酰胺溶液迅速注入到反应瓶中，加入催化剂TEA(0.14mL，1mmol)和DMAP(122mg，1.0mmol)，搅拌1h使其中分混合均匀。将胆固醇(0.9g，2mmol)二甲基甲酰胺溶液用注射器缓慢滴加到反应瓶中。在室温、氮气保护下反应24h。反应结束后，将反应液在14000rpm转速下离心2min，除去副产物与未反应的原料，取上层清液置于透析袋中(MWCO 3500Da)，透析液采用DMF，透析48h，换液4次，除去胆固醇等杂质，继而将透析液换成去离子水，继续透析48h，换液8次，除去有机溶剂和水溶性杂质，然后收集透析后的溶液，冷冻干燥，得到双pH响应的两亲性共聚物，产率为87％，Mn＝10768，Mw/Mn＝1.51。
实施例3：双pH响应的两亲性共聚物MPEG-Dliable-PAE-g-Chol的制备
(1)制备pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Dliable：在50mL三口圆底烧瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，在一个侧口中接入氮气，另外一个侧口出气，在惰性气体保护和无水条件下，依次将溶剂DCM(15mL)、催化剂DCC(10.25mg，0.05mmol)、DMAP(18mg，0.15mmol)、单体MPEG(200mg，0.05mmol)、小分子单体FA(112.5mg，0.75mmol)加入瓶中，在搅拌的条件下充分溶解，室温条件下反应24h后，将反应液过滤除去其中沉淀，收集滤液旋转蒸发浓缩后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷异丙醇中，置于冰箱中静止2h，收集沉淀，用异丙醇和二乙醚清洗沉淀，得到固体，在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到醛基封端的大分子单体MPEG-CHO，产率为93％；于50mL干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，依次用注射器将MPEG-CHO(53.716mg，0.013mmol)和DAP(2.158mL，0.026mmol)的DMSO溶液(20mL)加入瓶中，在搅拌的条件下充分溶解，在40℃下反应4h，将反应液旋转蒸发浓缩后冷却至室温，将其缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Dliable，产率为93％。
(2)制备双pH响应共聚物的中间产物：于50mL干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，冷冻-抽真空-通氮气三次，依次用注射器将HDD(24.6mL，110mmol)和AP(6.849mL，90mmol)加入到反应瓶中，在搅拌的条件下，100℃，反应24h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH响应性嵌段PAE，产率为90％，Mn＝3126，Mw/Mn＝1.45；将步骤(1)所制得的单体MPEG-Dliable(37.782mg，0.009mmol)加入50mL单口反应瓶中，密封后冷冻-抽真空-通氮气三次，将单体PAE(31.26mg，0.01mmol)加入无水DMSO(20mL)中充分溶解，用注射器加入到反应瓶中，在搅拌的条件下，60℃，反应24h。将反应液冷却至室温后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到双pH响应共聚物的中间产物MPEG-Dliable-PAE-Dliable-MPEG，产率为89％，Mn＝11965，Mw/Mn＝1.52。
(3)制备双pH响应的两亲性共聚物：于50mL的干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通单气-抽真空三次，排除其中氧气。用注射器将步骤(2)所制得的双pH响应共聚物的中间产物(2.393g，0.2mmol)二甲基甲酰胺溶液迅速注入到反应瓶中，加入催化剂TEA(0.28mL，2.0mmol)和DMAP(24.4mg，0.2mmol)，搅拌1h使其中分混合均匀。将胆固醇(0.45g，1.0mmol)二甲基甲酰胺溶液用注射器缓慢滴加到反应瓶中。在室温、氮气保护下反应24h。反应结束后，将反应液在14000rpm转速下离心2min，除去副产物与未反应的原料，取上层清液置于透析袋中(MWCO 3500Da)，透析液采用DMF，透析48h，换液4次，除去胆固醇等杂质，继而将透析液换成去离子水，继续透析48h，换液8次，除去有机溶剂和水溶性杂质，然后收集透析后的溶液，冷冻干燥，得到双pH响应的两亲性共聚物，产率为82％，Mn＝13685，Mw/Mn＝1.48。
实施例4：双pH响应的两亲性共聚物MPEG-Dliable-PAE-g-Chol的制备
(1)制备pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Dliable：在50mL三口圆底烧瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，在一个侧口中接入氮气，另外一个侧口出气，在惰性气体保护和无水条件下，依次将溶剂DCM(15mL)、催化剂DCC(32.8mg，0.25mmol)、DMAP(18mg，0.15mmol)、单体MPEG(80mg，0.02mmol)、小分子单体FA(22.5mg，0.15mmol)加入瓶中，在搅拌的条件下充分溶解，室温条件下反应24h后，将反应液过滤除去其中沉淀，收集滤液旋转蒸发浓缩后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷异丙醇中，置于冰箱中静止2h，收集沉淀，用异丙醇和二乙醚清洗沉淀，得到固体，在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到醛基封端的大分子单体MPEG-CHO，产率为94％；于50mL干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，依次用注射器将MPEG-CHO(41.32mg，0.01mmol)和DAP(2.7mL，0.0325mmol)的DMSO溶液(20mL)加入瓶中，在搅拌的条件下充分溶解，在40℃下反应4h，将反应液旋转蒸发浓缩后冷却至室温，将其缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Dliable，产率为91％。
(2)制备双pH响应共聚物的中间产物：于50mL干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，冷冻-抽真空-通氮气三次，依次用注射器将HDD(22.36mL，100mmol)和AP(6.849mL，90mmol)加入到反应瓶中，在搅拌的条件下，100℃，反应24h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH响应性嵌段PAE，产率为97％，Mn＝4524，Mw/Mn＝1.55；将步骤(1)所制得的单体MPEG-Dliable(37.782mg，0.009mmol)加入50mL单口反应瓶中，密封后冷冻-抽真空-通氮气三次，将单体PAE(38.76mg，0.011mmol)加入无水DMSO(20mL)中充分溶解，用注射器加入到反应瓶中，在搅拌的条件下，60℃，反应24h。将反应液冷却至室温后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到双pH响应共聚物的中间产物MPEG-Dliable-PAE-Dliable-MPEG，产率为87％，Mn＝13553，Mw/Mn＝1.60。
(3)制备双pH响应的两亲性共聚物：于50mL的干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通单气-抽真空三次，排除其中氧气。用注射器将步骤(2)所制得的双pH响应共聚物的中间产物(2.71mg，0.2mmol)二甲基甲酰胺溶液迅速注入到反应瓶中，加入催化剂TEA(0.42mL，3mmol)和DMAP(122mg，1.0mmol)，搅拌1h使其中分混合均匀。将胆固醇(0.9g，2mmol)二甲基甲酰胺溶液用注射器缓慢滴加到反应瓶中。在室温、氮气保护下反应24h。反应结束后，将反应液在14000rpm转速下离心2min，除去副产物与未反应的原料，取上层清液置于透析袋中(MWCO 3500Da)，透析液采用DMF，透析48h，换液4次，除去胆固醇等杂质，继而将透析液换成去离子水，继续透析48h，换液8次，除去有机溶剂和水溶性杂质，然后收集透析后的溶液，冷冻干燥，得到双pH响应的两亲性共聚物，产率为81％，Mn＝18043，Mw/Mn＝1.43。
实施例5：双pH响应的两亲性共聚物的临界胶束浓度CMC值
利用荧光探针法测试实施例1制备得到的双pH响应的两亲性共聚物MPEG-Dliable-PAE-g-Chol在不同pH条件下的临界胶束浓度。
(1)芘溶液的配置：用丙酮溶解芘(Sigma-Aldrich)，配置浓度为12×10-5M的芘溶液。
(2)样品溶液的配置：称取5mg MPEG-Dliable-PAE-g-Chol溶于10mL丙酮中，快速将溶液加入到50mL不同pH(7.4、6.0、5.0)的PBS缓冲溶液中，搅拌24h以挥发掉丙酮，得到浓度为0.1mg/mL的聚合物母液，稀释成一系列浓度(浓度范围为0.0001～0.1mg/mL)。取20支10mL容量瓶，分别加入0.1mL步骤(1)配置的芘溶液，然后分别加入上述不同浓度的共聚物溶液定容，摇匀，得到样品溶液。样品溶液中芘的浓度为12×10-7M。
(3)荧光光谱测试：以373nm为发射波长，在300～350nm扫描样品溶液的荧光激发光谱。取波长为338nm和334nm的强度比值(I338/I334)对聚合物浓度对数作图，如图11所示，曲线突变点所对应的横坐标即为lg(CMC)。测得实施例1制备得到的MPEG-Dliable-PAE-g-Chol在不同pH(7.4、6.0、5.0)值的PBS缓冲液中的临界胶束浓度分别为7.3mg/L、14.7mg/L和20.5mg/L。
实施例6：双pH响应的两亲性共聚物载药和空白胶束的制备
采用透析法制备载阿霉素(DOX)的聚合物胶束，具体方法如下：称取10mg DOX·HCl溶于20mL DMSO中，加入2倍摩尔当量的TEA，搅拌过夜得到DOX碱。取40mg实施例1制备得到的MPEG-Dliable-PAE-g-Chol溶于20mL DMSO中，待聚合物完全溶解后，将聚合物溶液加入到之前已制备好的DOX溶液中，继续搅拌6h后，转入透析袋进行透析，每2h更换一次去离子水，12h后每6h更换一次，共透析24h。透析完成后，将透析液用0.45μm过滤膜进行过滤，过滤液冷冻干燥后，得到红色粉末状固体即为DOX载药胶束。
空白胶束的制备方法与此相同。
采用动态光散射法(DLS)测定空白胶束和载药胶束的粒径、分布和zeta电位。空白胶束的粒径Dh为155.6nm，PDI为0.29，zeta电位为21.1mV。载药胶束的粒径Dh为178.5nm，PDI为0.31，zeta电位为19.7mV。
实施例7：双pH响应的两亲性共聚物的pH响应行为研究
取20mg实施例6制备的MPEG-Dliable-PAE-g-Chol空白胶束溶于pH 6.5的PBS缓冲溶液中，置于恒温振荡仪中，孵育12h，冷冻干燥，得到固体粉末。分别取5mg所制备的固体粉末、实施例6制备的聚合物空白胶束、MPEG单体溶于1mL的DMF中，采用凝胶渗透色谱(GPC)检测其分子量分布，如图12所示。由图可知，在弱酸性条件下(pH 6.5)，聚合物分子结构发生变化，主要是由于连接MPEG和PAE嵌段的苯甲酰亚胺键发生断裂，使得MPEG链段逐渐脱除。
分别取20mg实施例6中制备的聚合物空白胶束溶于pH 9.2、8.1、7.4、7.0、6.8、6.5、6.0、5.5和5.0的PBS缓冲溶液中，采用动态光散射法(DLS)测定空白胶束在不同pH值条件下的粒径、分布和zeta电位，如图13所示。由图可知，随着pH值的降低(9.2～7.4)，聚合物胶束粒径和zeta电位变化较小，颗粒体系较为稳定，随着pH的继续降低(7.4～5.0)，胶束大小和zeta电位快速增大，主要是由于pH敏感嵌段PAE的质子化作用，使其由疏水性嵌段逐渐变为亲水性嵌段，胶束颗粒溶胀，粒径和zeta电位增大。
采用电位滴定法确定实施例1聚合物中PAE嵌段的pKb值，具体步骤如下：50mg实施例1制备的MPEG-Dliable-PAE-g-Chol充分溶解于20mL丙酮中，在快速搅拌下快速加入到50mL去离子水中，室温下搅拌24h以挥发掉丙酮，得到最终浓度为1mg/mL的聚合物胶束溶液。用NaOH或HCl溶液(0.1M)调节胶束溶液的pH值，搅拌平衡一段时间至pH稳定，读取各pH值，如图14所示。
实施例8：载药胶束的体外释放
分别称取5mg实施例6中制备的MPEG-Dliable-PAE-g-Chol载药胶束分散于5mLPBS缓冲液中，缓冲液pH值分别为7.4、6.8、6.5、6.0和5.0。将上述溶液置于透析袋中，转入40mL相同pH值的缓冲液中，置于药物溶出仪，在37℃，110rpm转速下进行体外释放。定时取样4mL进行紫外分析，并同时补加4mL新鲜缓冲液。用紫外分光光度法测定不同时间释放液中DOX浓度，绘制体外释放曲线，如图15所示。
由图15可知，载药胶束在正常组织环境(pH 7.4)下，DOX的释放速率非常慢，24h的累积释放量不超过30％，随后的释放速率基本趋于平稳，160h累计释放量低于40％。而在肿瘤组织的微酸性(pH 6.5)条件下，DOX的释放速率加快，24h的累积释放量达到50％以上，160h累计释放量超过60％。随着pH值的继续降低(5.0)，DOX的释放速率明显加快，24h的累积释放量接近70％，160h累计释放量接近90％。说明随着pH值的降低，药物从载药胶束中释放的速率和累计释放量明显加快。
实施例9
利用实施例6制备得到的MPEG-Dliable-PAE-g-Chol空白胶束和载药胶束进行细胞毒性评价。将MDA-MB-231细胞(购买于ATCC)按1×104的密度平铺在96孔板上，加入200μL培养液，培养24h。将一定浓度的游离阿霉素(DOX)，空白胶束和载药胶束添加进入孔板中，更新培养介质。每个浓度平行重复3个。将孔板放入卵化器中，5％CO2和37℃，分别维持24h和48h。用180μL新鲜培养液和20μL MTT溶液替换孔板中介质，继续卵化4h，用200μL DMSO替换孔板介质。将孔板放在37℃摇床中振荡15min，然后利用酶标仪测定490nm出每个孔的吸光度A，计算细胞存活率，评价其细胞毒性。
图16中(A)是空白MPEG-Dliable-PAE-g-Chol的细胞毒性图。由图可知，随着聚合物浓度的增大，细胞存活率仍维持在较高水平，当聚合物浓度为200μg/mL时，细胞存活率仍在97％以上，可见次双pH响应两亲性共聚物材料对细胞的毒性较低，说明材料本身几乎不具有毒副作用。图16(B和C)分别是游离阿霉素和聚合物载药胶束在24h和48h后的细胞毒性图。由图可知，随着时间和载药胶束浓度的增大，细胞成活率均呈现明显降低的趋势，特别是在48h、载药胶束浓度为20μg/mL时，细胞的成活率接近50％。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种双pH响应的两亲性共聚物，分子式为MPEG-Dliable-PAE-g-Chol，具有如下式I所示结构：
其中，n＝25～100，x＝5～30。
2.根据权利要求1所述的共聚物，其特征在于，所述共聚物的数均分子量为7752～23178g/mol，优选为10768～18043g/mol。
3.权利要求1或2所述双pH响应的两亲性共聚物的制备方法，包括以下步骤：
通过酯化反应采用对醛基苯甲酸修饰末端带有羟基的聚乙二醇单甲醚，得到醛基封端的聚乙二醇单甲醚大分子单体，再通过亲核加成反应与1,3-丙二胺反应，得到具有pH响应性能的亲水性大分子单体MPEG-Dliable；
通过迈克尔加成反应合成具有pH响应性能的大分子单体聚-β氨基酯，然后，同样采用此反应在PAE两端修饰MPEG-Dliable单体，得到中间产物；
采用具有疏水性的胆固醇甲酰氯与上述中间产物进行醇解反应制备聚乙二醇单甲醚-Dliable-聚-β氨基酯-g-胆固醇。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Dliable：
a)在惰性气体保护和无水条件下，将催化剂二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶、单体MPEG、小分子单体对醛基苯甲酸溶于有机溶剂中，优选在搅拌下充分溶解，反应，反应后过滤、浓缩、沉淀、清洗、干燥，得到醛基封端的大分子单体MPEG-CHO；
b)将步骤a)所得MPEG-CHO溶解在无水有机溶剂中，加入二胺，优选在搅拌的条件下充分溶解后反应，反应结束后冷却、浓缩、沉淀、干燥，得到pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Dliable；
(2)制备双pH响应共聚物的中间产物：
a)采用本体聚合的方法，将1,6-己二醇二丙烯酸酯和3-氨基-1-丙醇在惰性气体保护和无水条件下反应，反应后冷却、沉淀、干燥，得到pH响应性嵌段PAE；
b)将步骤(1)所得的MPEG-Dliable单体和上述的PAE溶于无水有机溶剂中，优选在搅拌的条件下混合均匀，在惰性气体保护和无水条件下反应，反应后冷却、沉淀、干燥，得到双pH响应共聚物的中间产物MPEG-Dliable-PAE-Dliable-MPEG；
(3)制备双pH响应的两亲性共聚物：将步骤(2)所制得的双pH响应共聚物的中间产物溶于无水二甲基甲酰胺中，依次加入已溶解于无水DMF的催化剂三乙胺和DMAP，优选充分搅拌使其混合均匀，将胆固醇氯甲酸酯的DMF溶液缓慢加入，惰性气体保护保护下反应，将反应液除去副产物及杂质，取上层清液透析，除去未反应的原料，将产物冷冻干燥，得到双pH响应的两亲性共聚物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)的a)中反应物的摩尔份数如下：
优选地，所述无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿或无水二甲基亚砜中1种或2种以上的组合，优选为无水二氯甲烷；
优选地，所述反应的温度为室温，反应的时间为6～36h，优选为24h；
作为优选，步骤(1)的b)中反应物的摩尔份数如下：
MPEG-CHO 0.8～1.3份
二胺 1～2.6份；
优选地，所述无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿或无水二甲基亚砜中1种或2种以上的组合，优选为无水二甲基亚砜；
优选地，所述反应的温度为30～60℃，反应的时间为0.5～6h，优选地，所述反应的温度为40℃，反应的时间为4h；
优选地，所述二胺为1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、1,5-戊二胺，优选为1,3-丙二胺；
优选地，步骤(1)中所述过滤为采用漏斗，优选布式漏斗过滤收集液体；
优选地，所述沉淀为向浓缩后的溶液中加入10倍体积的0℃异丙醇进行沉淀；
优选地，所述洗涤为采用异丙醇和二乙醚清洗沉淀，得到固体。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)的a)中反应物的摩尔份数如下：
1,6-己二醇二丙烯酸酯 1～1.1份
3-氨基-1-丙醇 0.9～1份；
优选地，所述反应的温度为80-120℃，优选为100℃；反应的时间为12-48h，优选为24h；
优选地，步骤(2)的b)中反应物的摩尔份为向冷却后数如下：
PAE 1～1.1份
MPEG-Dliable 0.9～1份；
优选地，所述无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿或无水二甲基亚砜中1种或2种以上的组合，优选为无水二甲基亚砜；
优选地，所述反应的温度为40-80℃，优选为60℃，反应的时间为12～48h，优选为24h；
优选地，步骤(2)中所述沉淀为向冷却后的溶液中加入10倍体积的0℃正己烷进行沉淀。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)反应物的摩尔份数配方如下：
优选地，所述反应的温度为室温，反应的时间为12～48h，优选为24h。
8.权利要求1或2所述的双pH响应的两亲性共聚物在装载水难溶性药物胶束系统中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述装载水难溶性药物胶束系统由以下方法制备得到：将水难溶性药物溶于有机溶剂中，同时将双pH响应的两亲性共聚物溶于同一种有机溶剂中，待聚合物完全溶解后，将此聚合物溶液与水难溶性药物溶液混合；透析；过滤、冷冻干燥，得到装载水难溶性药物胶束系统。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述水难溶性药物指在1L水中溶解度小于或等于1g的药物；
优选地，所述有机溶剂为二甲基亚砜和/或二甲基甲酰胺；
优选地，将水难溶性药物溶于有机溶剂中过夜；
优选地，共聚物溶液与水难溶性药物溶液混合后室温下搅拌，优选搅拌1h以上，更优选搅拌4～6h；
优选地，所述透析采用去离子水进行；
优选地，所述透析的时间为12h以上，优选为24h。
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